SK44399A3

SK44399A3 - Reconstituted human anti-hm1.24 antibody

Info

Publication number: SK44399A3
Application number: SK443-99A
Authority: SK
Inventors: Koichiro Ono; Toshihiko Ohtomo; Masayuki Tsuchiya; Yasushi Yoshimura; Yasuo Koishihara; Masaaki Kosaka
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2000-05-16
Also published as: EP0960936B1; CN1271205C; WO1998014580A1; US6699974B2; US20030129185A1; NO991591L; HK1024261A1; CN1235639A; TW530064B; TR199900722T2; CZ296790B6; CA2267072C; US20030045691A1; PL332742A1; EP0960936A4; ATE512224T1; EP0960936A1; ZA978865B; NO991591D0; CA2267072A1

Description

Chimérny L reťazec, chimérny H reťazec, chiméma protilátka a spôsob jej prípravy, pozmenená ľudská protilátka a spôsob jej prípravy, DNA, vektor, hostiteľská bunka, farmaceutický prostriedok a liečebné činidlo

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka pozmenených ľudských anti-HM 1.24 protilátok a chimérnych anti-HM 1.24 protilátok, génov, ktoré ich kódujú, spôsobov prípravy *týchto protilátok a využitia uvedených protilátok. Pozmenené ľudské protilátky anti-HM 1.24 a chiméme protilátky, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, sú užitočné ako liečebné činidlá, napr. pre myelóm.

Doteraiží stav techniky

Ľudské bunky prechádzajú radom procesov, ktoré sú klasifikované na základe druhu exprimovaných povrchových antigénov a nakoniec dozrievajú na plazmatické bunky, ktoré produkujú protilátky. V konečnom stupni ich diferenciácie získavajú bunky B na jednej strane schopnosť produkovať cytoplazmatické imunoglobulíny a na druhej strane sa s B bunkami strácajú asociované antigény, ako sú povrchové bunkové imunoglobulíny, HLA-DR, CD20, Fc receptory, receptory C3 komplementu a podobné (Ling, N. R. a kol., Leucocyte Typing III (1986) str. 320, Oxford, UK, Oxford).

Doteraz boli publikované práce o monoklonálnych protilátkach, ako sú PCA-1 (Anderson, K. C., a kol., J. Immunol. (1983) 130,1132), anti-PC-1 (Anderson, K C., a kol., J. Immunol. (1983) 132, 3172), anti-MM4 (Tong, A. M. W. a kol., Blood (1987) 69, 238) a podobných, ktoré rozoznávajú antigény na bunkovej membráne plazmatických buniek. Avšak anti-CD38 monoklonálnej protilátky sú stále používané na detekciu plazmatických a myelómových buniek (Epstein, J. a kol., N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L W. M. M. a kol., Blood (1990) 76, 1739, Leo,

R. a kol., Am. Hematol. (1992) 64,132, Shimazali, C. a kol., Am. J. Hematol. (1992)

39, 159, Hata, H. a kol. Biood (1993) 81, 3357, Harada, H. a kol., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. a kol., J. Exp. Med. (1993) 178,1023).

Anti-CD38 monoklonálna protilátka je antigén spojený skôr s aktiváciou T buniek než antigén spojený s diferenciáciou B buniek a je exprimovaný spolu s B bunkami aj na rôznych iných bunkách. Naviac, aj keď CD38 nie je exprimovaný na niektorých lymfoplazmatických bunkách, je silne exprimovaný na prekurzoroch buniek krvotvorby. Z týchto dôvodov sa usudzuje, že anti-CD38 monoklonálna protilátka nie je vhodná na výskum diferenciácie a dozrievania ľudských B buniek, alebo na liečenie ochorení plazmatických buniek.

Goto, T. a kol. popísali myšaciu anti-HM 1.24 monoklonálnu protilátku, ktorá rozoznáva antigén s molekulovou hmotnosťou 29 až 33 kDa, ktorý je exprimovaný špecificky na líniách B buniek (Blood (1994) 84, 1922-1930). Pretože sa usudzuje, že antigén rozoznávaný anti-HM monoklonálnou protilátkou súvisí s konečnou diferenciáciou B buniek (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691) a že podanie anti-HM 1.24 monoklonálnej protilátky myši s transplantovaným plazmocytómom má za následok špecifické hromadenie protilátok na nádore, (Shuji Ozaki a kol., The Program of General Assembly of the 19* Japan Myeloma Study Meeting, General Presentation 3), bolo predpokladané, že anti-HM 1.24 monoklonálne protilátka označená rádioizotopom môže byť použitá na určenie umiestnenia nádoru, pre miestne cielenú terapiu, ako je rádioimunoterapia a podobne.

Ďalej tu vyššieuvedený časpopis Blood popisuje, že anti-HM 1.24 monoklonálna protilátka vykazuje cytotoxickú aktivitu k bunkám myelómovej bunkovej línie RPMI8226, závislú na komplemente.

Myelóm je neoplastické ochorenie, charakterizované hromadením monoklonálnych plazmatických buniek (myelómové bunky) v kostnej dreni. Myelóm je ochorenie, u ktorého koncovo diferencované B bunky, produkujúce a sekretujúce imunoglobulíny alebo plazmatické bunky, majú monoklonálne zvýšený počet hlavne v kostnej dreni a v súhlase stým v sú séra zistené monoklonálne imunoglobulíny alebo ich zložky, L reťazce a H reťazce (Masaaki Kosaka a kol., Nippon Rinsho (1995) 53, 91-99).

Na liečbu myelómu boli používané bežné chemoterapeutické prostriedky, ale neboli nájdené efektívne liečebné prostriedky, ktoré by viedli k vymiznutiu myelómu a predĺženiu doby prežívania pacientov smyelómom. Preto je dlho pociťovaná potreba zavedenia liekov, ktoré by mali liečebný účinok na myelóm.

Myšacie monoklonálne protilátky majú u ľudí vysokú imunogenicitu (niekedy označované ako antigenicita”). Tým je pre človeka lekárska liečebná hodnota myšacích monoklonálnych protilátok obmedzená. Napr. myšacie protilátky podané človeku môžu byť metabolizované ako cudzorodá látka tak, že ich polčas v človeku je relatívne krátky a teda nemôžu celkom dokázať svoje očakávanú účinky. Naviac, proti podaným myšacím protilátkam vytvárané anti-myšacie protilátky môžu spustiť imunologické odozvy, ktoré sú pre pacientov nežiadúca a nebezpečné, ako je sérové ochorenie, iné alergické reakcie a podobne. Preto nemôžu byť myšacie monoklonálne protilátky podávané ľudom často.

Pre rozriešenie týchto problémov bola vyvinutá metóda na zníženie imunogenicity protilátok iného než ľudského pôvodu, ako sú napr. monoklonálne protilátky odvodené od myší. Príkladom takejto metódy je spôsob, ako konštruovať chimému protilátku, ktorej variabilná oblasť (V oblasť) je odvodená od pôvodnej myšacej protilátky a konštantná oblasť (C oblasť) je odvodená od vhodnej ľudskej protilátky.

Pretože takto získané chiméme protilátky obsahujú variabilnú oblasť pôvodnej myšacej protilátky v neporušenej podobe, dá sa očakávať, že sa budú viazať k antigénu so špecifickosťou, ktorá sa zhoduje so špecifickosťou pôvodnej myšacej protilátky. Naviac, vchimémej protilátke je podiel aminokyselinových sekvencií, odvodených od nie ľudského” zdroja podstatne redukovaný a tak sa dá očakávať, že protilátka bude mať v porovnaní s pôvodnou myšacou protilátkou nízku imunogenicitu. Chiméma protilátka sa môže viazať k antigénu rovnakým spôsobom ako pôvodná myšacia monoklonálna protilátka a môže tiež vyvolať imunologické odpovede proti myšacej variabilnej oblasti, i keď je imunogenicita znížená (LoBuglio, A. F. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4226,1989).

Druhý spôsob zníženia imunogenicity myšacích protilátok, aj keď je komplikovanejší, môže znížiť potenciálnu imunogenicitu myšacích protilátok ešte ďaleko výraznejšie. Pri tomto spôsobe je prenesená do variabilnej oblasti ľudskej oblasti len oblasť určujúca komplementaritu (CDR - complemetarity determining región) z myšacej protilátky a vznikne tak pozmenená (reshaped”) variabilná oblasť ľudskej protilátky.

Avšak, aby vzniknutá štruktúra oblasti určujúcej komplementaritu pozmenenej variabilnej oblasti ľudskej protilátky bola čo možno najpodobnejšia variabilnej oblasti pôvodnej myšacej protilátky, keď je to nevyhnutné, môže byť z variabilnej oblasti myšacej protilátky do variabilnej oblasti ľudskej protilátky prenesená i časť aminokyselinovej sekvencie podpornej oblasti (FR - framework región), ktorá podporuje CDR. Následkom toho je táto V oblasť zušľachtenej pozmenenej ľudskej protilátky viazaná ku konštantnej oblasti ľudskej protilátky. Časť, ktorá je odvodená od nie ľudskej” aminokyselinovej sekvencie v konečnej forme pozmenenej zušľachtenej ľudskej protilátky, je CDR a len časť FR. CDR sa skladá z hypervariabilných aminokyselinových sekvencií, ktoré neobsahujú druhovo špecifické sekvencie. Preto zušľachtená protilátka, nesúca myšacie CDR, by nemala mať silnejšiu imunogenicitu, než prirodzená ľudská protilátka obsahujúca CDR ľudskej protilátky.

Pre informácie, týkajúce sa zušľachtených protilátok, viď Riechmann, L. a kol., Náture, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. a kol., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettlenborough, C. A. a kol., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Maeda, H. a kol., Human Antobodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Groman, S. D. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181- 4185, 1991; Tempest, P. R. a kol., Bio-Technology, 9,266-271,1991; Co, M. S. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873,1991; Carter, P. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289,1992; Co, M. S. a kol., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992 a Seto, K. a kol., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Quaen a kol., (International Application Publication No. WO 90-07861) popisuje spôsob prípravy zušľachtených protilátok proti IL-2 receptoru Anti-Tac. Avšak je veľmi obtiažne zušľachtiť všetky protilátky postupom uverejneným vo WO 90-07861. WO 90-07861 nepopisuje všeobecný spôsob zušľachtovania protilátok, ale popisuje len spôsob zušľachťovania protilátok Anti-Tac, ktoré sú jednými z protilátok proti receptoru IL-2. Naviac, aj keď je postup uverejnený vo WO 90-07861 presne reprodukovaný, je obtiažne konštruovať zušľachtené protilátky, ktoré majú aktivitu celkom totožnú s pôvodnými myšacími protilátkami.

Všeobecne sa aminokyselinové sekvencie CDR/FR jednotlivých protilátok od seba líšia. Súčasne i určenie aminokyselinového zvyšku, ktorý má byť zamenený pri konštrukcii zušľachtených protilátok a výber aminokyselinového zvyšku, ktorým má byť vyššieuvedený zvyšok zamenený, sa u jednotlivých protilátok líši. Preto postup zušľachťovania protilátok uverejnený vo WO 90-07861 nemožno uplatniť pre zušľachťovanie všetkých protilátok.

V práci Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, (1989) 86, 10029-10033 je uverejnené podobné zistenie, ako týkajúce sa WO 90-07861. Je tu popísané, že zušľachtené protilátky, získané postupom, popísaným vo WO 90-07861, mali len tretinovú aktivitu pôvodných myšacích protilátok. Inými slovami to ukazuje, že postupom uverejneným vo WO 90-07861 nemožno pripraviť zušľachtenú protilátku, s aktivitou zhodnou s pôvodnou myšacou protilátkou.

Práca Co a kol., Cancer Research (1996) 56, 1118-11125 bola publikovaná vyššie uvedenou skupinou Queen a kol. Táto práca popisuje, že zušľachtené protilátky s aktivitou rovnajúcou sa pôvodným myšacím protilátkam nemožno konštruovať ani spôsobom urôeným pre tvorbu zušľachtených protilátok, uverejneným vo WO 90-07861. Teda sa nielen ukazuje, že samotným spôsobom podľa WO 90-07861 nemožno pripraviť zušľachtenú protilátku s aktivitou totožnou s pôvodnou myšacou protilátkou, ale že i tento spôsob konštrukcie zušľachtených protilátok uverejnený vo WO 90-07861 nemožno aplikovať pri zušľachťovaní všetkých protilátok.

Ohtomo a kol., Molecular Immunology (1955) 32, 407-416 popisuje zušľachťovanie myšacích protilátok ONS-M21. V tejto práci je ukázané, že aminokyselinový zvyšok, ktorý bol navrhovaný pre zušľachtenie protilátok Anti-Tac vo WO 90-07861, nemá vzťah k aktivite, a spôsob uverejnený vo WO 90-07861 nemožno použiť.

Kettlenborough a kol., Protein Eng. (1991) 4, 773-783 popisuje, že niekoľko zušľachtených protilátok bolo konštruovaných z myšacej protilátky zámenou aminokyselinových zvyškov. Avšak bolo potrebné zameniť viac aminokyselinových zvyškov, než bolo navrhnuté v spôsobe zušľachťovania Anti-Tac, popísanom vo WO 90-07861.

Tieto uvedené práce naznačujú, že spôsob tvorby zušľachtených protilátok uverejnený vo WO 90-07861 je technika použiteľná len pre Anti-Tac protilátku tam popísanú a že dokonca použitie uvedenej technôlógie nevedie k aktivite, ktorá by sa rovnala aktivite pôvodnej myšacej protilátky.

Pôvodné myšacie protilátky, popísané v týchto prácach, majú aminokyselinové sekvencie odlišné od sekvencie Anti-Tac protilátky, popísanej vo WO 90-07861.

Súčasne i spôsob konštrukcie zušľachtených protilátok, ktorý bolo možné použiť pre Anti-Tac protilátku, nemožno použiť pre protilátky iné. Podobne, pretože myšacia protilátka tohto vynálezu, má aminokyselinovú sekvenciu odlišnú od sekvencie Anti-Tac protilátky, spôsob konštrukcie zušľachtenej protilátky, použitý pre Anti-Tac protilátku, nemožno použiť. Naviac, úspešne konštruovaná zušľachtená protilátka, ktorá je predmetom tohto vynálezu, má aminokyselinovú sekvenciu odlišnú od sekvencie zušľachtenej Anti-Tac protilátky, popísanej vo WO 90-07861. Táto skutočnosť tiež ukazuje, že rovnaký spôsob nemožno použiť pre zušľachťovanie protilátok, ktoré majú odlišné CDR-FR sekvencie.

Teda, aj keď je pôvodná myšacia protilátka pre zušľachťovanie známa, zhoda CDR-FR sekvencie zušľachtenej protilátky majúcej aktivitu, je potvrdená len metódou pokusu a omylu. Vo WO 90-07861 nie je zmienka o FR sekvencii, ktorá je pripojená k zušľachtenej protilátke, konštruovanej podľa predkladaného vynálezu, ani otom, že aktívna zušľachtená protilátka môže byť pripravená pripojením FR sekvencie, ktorá je oveľa menšia než sekvencia CDR.

Ako je tu vyššie uvedené, očakáva sa, že zušľachtené protilátky budú užitočné na liečebné účely, ale zušľachtená anti-HM 1.24 protilátka nie je známa, ani dokonca predpokladaná. Naviac nie je dostupný štandardizovaný spôsob, ktorý by bol všeobecne použiteľný u ktorejkoľvek protilátky na prípravu zušľachtenej protilátky, ktorá by vykazovala dostatočnú väzbovú aktivitu, väzbovú inhibičnú aktivitu a neutralizačnú aktivitu (napr. Sato, K. a kol., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález popisuje pozmenené anti-HM 1.24 protilátky. Ďalej predkladaný vynález popisuje chiméme protilátky človek/myš, ktoré sú užitočné v priebehu konštrukcie uvedených pozmenených látok. Predkladaný vynález ďalej popisuje fragmenty pozmenených protilátok. Ďalej predkladaný vynález popisuje expresný systém na prípravu chimérnych protilátok, pozmenených protilátok a ich fragmentov. Predkladaný vynález ďalej popisuje spôsoby prípravy chimérnych anti-HM 1.24 protilátok a ich fragmentov, a taktiež pozmenených anti-HM 1.24 protilátok a ich fragmentov.

Presnejšie povedané, predkladaný vynález popisuje chiméme protilátky a pozmenené protilátky, ktoré špecificky rozoznajú poplypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 103. cDNA, kódujúca uvedený polypeptid, bola vložená medzi štiepne miesta pre Xbal vo vektore pUC19, čím bol pripravený plazmid pRS38-pUC19. Escherichia coli, obsahujúca tento plazmid pRS38-pUC19 bola uložená pre medzinárodné použitie 5. októbra 1993 v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki Prefecture, Japan) ako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) pod prístupovým číslom FERM BP-4434 podľa ustanovení Budapeštianskej zmluvy (viď Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694).

Ako konkrétne uskutočnenie takých chimémych protilátok alebo pozmenených protilátok ja uvedená chiméma protilátka anti-HM 1.24 alebo pozmenená ľúdská protilátka anti-HM 1.24. Podrobný popis chimémaj protilátky anti-HM 1.24 alebo pozmenenej ľudskej protilátky anti-HM 1.24 bude podaný ďalej.

Tu predpokladaný vynález tiež popisuje chiméme L reťazce, obsahujúce konštantnú oblasť (C oblasť) ľudského ľahkého (L) reťazca a variabilnú (V) oblasť L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a chimémy H reťazec, obsahujúci konštatnú oblasť ťažkého (H) reťazca a V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Tu predkladaný vynález ďalej popisuje chiméme protilátky obsahujúce (1) L reťazec, obsahujúci C oblasť ľúdského reťazca a V oblasť L reťazca antiHM 1.24 protilátky, a (2) H reťazec, obsahujúci C oblasť ľudského H reťazca a V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Tu predkladaný vynález ďalej popisuje V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, ktorá obsahuje:

(1) podpornú oblasť (FR) z V oblasti ľúdského L reťazca, a (2) CDR z V oblasti L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca anti-HM 1.24 protilátky, obsahujúcu:

(1) FR z V oblasti ľudského H reťazca, a (2) CDR z V oblasti H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Tu predkladaný vynález ďalej popisuje pozmenený ľúdský L reťazec anti-HM

1.24 protilátky, ktorý obsahuje:

(1) C oblasť z ľudského L reťazca, a (2) V oblasť L reťazca, obsahujúcu FR z ľudského L reťazca a CDR z L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a pozmenený ľudský H reťazec anti-HM 1.24 protilátky, obsahujúci:

(1) C oblasť z ľudského H reťazca, a (2) V oblasť H reťazca, obsahujúcu FR z Ľudského H reťazca a CDR z H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Tu predkladaný vynález ďalej popisuje pozmenenú ľudskú protilátku anti-HM 1.24, ktorá obsahuje:

(A) L reťazec obsahujúci (1) C oblasť z ľudského L reťazca, a (2) V oblasť L reťazca, obsahujúcu FR zľúdského L reťazca a CDR z L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a (B) H reťazec obsahujúci (1) C oblasť z ľúdského H reťazca, a (2) V oblasť H reťazca, obsahujúceho FR z ľudského H reťazca a CDR z H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Predkladaný vynález ďalej popisuje DNA kódujúcu V oblasť L reťazca anti-HM

1.24 protilátky a DNA, kódujúcu V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Predkladaný vynález ďalej popisuje DNA kódujúcu chimérny L reťazec, obsahujúci:

(1) C oblasť z ľudského L reťazca, a (2) V oblasť L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a DNA kódujúcu chimérny H reťazec, obsahujúci:

(1) C oblasť z ľudského H reťazca, a (2) V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Predkladaný vynález ďalej popisuje DNA kódujúcu V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca anti-HM 1.24, obsahujúcu:

(1) FR z V oblasti ľudského L reťazca, a (2) CDR z V oblasti L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a DNA kódujúcu V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca anti-HM 1.24 protilátky obsahujúcu:

(1) FR z V oblasti ľudského H reťazca, a (2)CDR z V oblasti H reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a

Predkladaný vynález ďalej popisuje DNA kódujúcu pozmenený ľudský L reťazec anti-HM 1.24 protilátky, obsahujúci:

(1) C oblasť z ľudského L reťazca, a (2) V oblasť z L reťazca, obsahujúcu FR z ľudského L reťazca a CDR z L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, a

DNA kódujúcu pozmenený ľudský H reťazec anti-HM 1.24 protilátky, obsahujúci:

(1) C oblasť z ľudského H reťazca, a (2) V oblasť z H reťazca, obsahujúcu FR z ľudského H reťazca a CDR z H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.

Predkladaný vynález ďalej popisuje vektor, obsahujúci ktorúkoľvek z rôznych DNA uvedených vyššie.

Predkladaný vynález ďalej popisuje hostiteľské bunky, tranformované vyššie uvedeným vektorom.

Predkladaný vynález tiež popisuje spôsoby prípravy chimémych anti-HM 1.24 protilátok, ktoré sa skladajú z pestovania hostiteľských buniek, ktoré boli kotransfekované expresným vektorom, obsahujúcim DNA, kódujúcu vyššie uvedený chimémy L reťazec a expresným vektorom, obsahujúcim DNA, kódujúcu vyššie uvedený H reťazec a získanie požadovanej protilátky.

Predkladaný vynález ďalej popisuje spôsoby prípravy pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, ktoré sa skladajú z pestovania hostiteľských buniek, ktoré boli kotransfekované expresným vektorom, obsahujúcim DNA, kódujúcu uvedený pozmenený ľudský L reťazec a expresným vektorom, obsahujúcim DNA, kódujúcu uvedený pozmenený ľudský H reťazec a získanie požadovanej protilátky.

Predkladaný vynález dalej popisuje farmaceutické prostriedky, zvlášť liečebné prípravky pre myelóm, obsahujúce uvedenú chimému protilátku alebo pozmenenú ľúdskú protilátku.

Predkladaný vynález ďalej popisuje farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú ako aktívnu zložku chimérnu protilátku, ktorá špecificky rozoznáva polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu publikovanú v SEQ ID NO: 103 a farmaceutické prostriedky, obsahujúce ako aktívnu zložku pozmenenú ľudskú protilátku, ktorá špecificky rozoznáva polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou publikovanou v SEQ ID NO: 103. Ako farmaceutický prostriedok je tu publikované liečebné činidlo pre myelóm.

Spôsob uskutočnenia vynálezu

1) Konštrukcia chimérnej protilátky (1) Klonovanie DNA, kódujúcej V oblasť myšacej anti-HM 1.24 monoklonálnej protilátky

Príprava mRNA

Pre klonovanie DNA, kódujúcej V oblasť myšacej anti-HM 1.24 monoklonálnej protilátky bola zo získaného hybridómu s pomocou bežnej metódy, ako je ultracetrífugová metóda, používajúca guanidín (Chirgwin, J.M. a kol., Biochewmistry (1979), 18, 5294-5299), alebo metódy AGPC (Chomczinski, P. a kol., (1987), 162, 156-159) pripravená celková RNA a z nej pripravená mRNA pomocou stĺpcov s Oligo(dT)-celulózou, ktoré sú súčasťou súpravy pre izoláciu mRNA (vyrábané firmou Pharmacia). Naviac pomocou súpravy QuickPrep mRNA Purification Kit (vyrábané firmou Pharmacia) možno pripraviť bez extračného stupňa celkové RNA.

Príprava a amplifikácia cDNA

Z mRNA, získanej vo vyššie uvedenom odseku 'Príprava mRNA” bola pomocou reverznej transkriptázy syntetizovaná DNA ako V oblasti L reťazca, tak aj H reťazca. cDNA V oblasti L reťazca je syntetizovaná pomocou súpravy AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit. Pre amplifikáciu syntetizovanej cDNA bol použitý vhodný prímer, ktorý hybrídizuje s leader sekvenciou a C oblasťou protilátkového génu (napr. MKV primár, majúci sekvenciu báz uvedenú v SEQ ID NO: 29 až 39 a MKC prímer, majúci sekvenciu báz uvedenú v SEQ ID NO: 40).

Syntéza a amplifikácia cDNA V oblasti H reťazca môže byť uskutočnená pomocou PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) metódou 5'-RACE (Frohman, M. A. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988, Belyavsky, A. a kol., Nucl. Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) pomocou súpravy 5'-Ampli FINDER RACE Kit (CLONTECH). K 5' koncu cDNA syntetizovanej ako je uvedené vyššie, bol ligovaný Ampli FINDER Anchor, a ako prímer pre amplifikáciu V oblasti H reťazca môže byť použitý prímer, ktorý špecificky hybrídizuje s Anchor primerom (SEQ ID NO: 77) a s konštantnou oblasťou (oblasť Cy) myšacieho H reťazca (napr. prímer MHC2a, majúci sekvenciu báz uvedenú v SEQ ID NO: 42).

Purifikácia DNA a určenie jej sekvencie báz

Bola uskutočnená agarová gelová elektroforézy PCR produktu a známym postupom bol vyrezaný požadovaný DNA fragment a z neho bola DNA izolovaná a vyčistená a potom ligovaná do vektorovej DNA. DNA možno čistiť pomocou dodávanej súpravy (napr. GENECLEAN II; BIO101). Na ligovanie DNA fragmentov možno použiť niektorú známu vektorovú DNA (napr. pUC19 Bluescript a pod.).

Vyššie uvedená DNA a vyššie uvedená vektorová DNA môžu byť ligovaná bežnou ligačnou súpravou (vyrábaná Takara Shuzo), čím je získaný rekombinantný vektor. Získaný rekombinantný vektor je potom vnesený do Escherichia coli JM109, potom sú vybrané kolónie rezistentné k ampicilínu a vektorová DNA je pripravená na základe známeho postupu (J. Sambrook, a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Po štiepení vyššie uvedenej vektorovej DNA reštrikčnými enzýmami je známou metódou určená sekvencia báz požadovanej DNA (napr. dideoxynukleotidovou metódou) (J. Sambrook, a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Pri realizácii predkladaného vynálezu možno použiť automatický sekvenčný systém (DNA Sequencer 373A vyrábaný ABI Co. Ltd.)

Oblasť určujúca komplementaritu

V oblasť z H reťazca a V oblasť z L reťazca tvoria väzbové miesto pre antigén a ich spoločné štruktúry majú podobné vlastnosti. Tak bola každá zo štyroch podporných oblastí (FR) ligovaná s troma hypervariabilnými oblasťami, t.j. oblasťami určujúcimi komplementaritu (CDR). Aminokyselinové sekvencie FR boli relatívne dobre zachované, zatiaľčo medzi aminokyselinovými sekvenciami oblastí CDR je extrémne vysoká variabilita (Kabat, E. A. a kol., Sequenee of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Mnohé časti vyššieuvedených štyroch oblastí FR zaujímajú štruktúru β-listu (βsheet) a následkom toho tri CDR vytvárajú slučky. CDR môžu niekedy tvoriť časť βlistu. Tri CDR sa v priestore nachádzajú vo vzájomne tesnej blízkosti a tvoria väzbové miesto pre antigén s troma CDR v páriacej oblasti. Na základe týchto skutočností sa aminokyselinové sekvencia variabilnej oblasti myšacej anti-HM 1.24 protilátky porovnáva s databázou aminokyselinových sekvencií protilátok, pripravenou Kabat, E. A. a koľ, Sequenee of Proteins of Immunological Interest”,

US Dept. Health and Human Services, 1983, aby sa zistila homológia, a tým sa našli oblasti CDR.

(2) Konštrukcia expresného vektoru pre chimérnu protilátku

Akonáhle je fragment, kódujúcou V oblasťou myšacieho L reťazca a H reťazca myšacej monoklonálnej protilátky klonovaný, chimérnu anti-HM 1.24 protilátku je možno získať pripojením týchto myšacích V oblastí k DNA kódujúcej konštantnú oblasť ľudskej protilátky a potom ju exprimovať.

Základná metóda na konštrukciu chimérnej protilátky zahrňuje väzbu myšacej leader sekvencie a sekvencie V oblasti, ktorá je prítomná v klonovanej cDNA, k sekvencii kódujúcej C oblasť ľudskej protilátky, už prítomnej v expresnom vektore pre savóie bunky. Táto metóda prípadne zahrňuje väzbu myšacej leader sekvencie a sekvencie V oblasti, ktorá ja prítomná v klonovanej cDNA, k sekvencii kódujúcej C oblasť ľudskej protilátky a potom ligovanie do expresného vektoru pre savóie bunky.

C oblasťou ľudskej protilátky môže byť C oblasť ktoréhokoľvek H reťazca a C oblasť ktoréhokoľvek L reťazca. Ako príklad môžu byť uvedené Cy1, Cy2, Cy3 alebo Cy4 ľudského H reťazca, alebo CX alebo Ck L reťazca.

Pre produkciu chimérnej protilátky sú konštruované dva typy expresných vektorov: sú to expresný vektor obsahujúci DNA V oblasti myšacieho L reťazca a C oblasť ľudského L reťazca pod kontrolou expresná regulačnej oblasti, ako je systém enhancer/promótor a ďalej expresný vektor obsahujúci DNA V oblasti myšacieho H reťazca a C oblasť ľudského H reťazca pod kontrolou expresná regulačnej oblasti, ako je systém enhancer/promótor. Potom sú s použitím týchto expresných vektorov kotransfekované hostiteľské bunky, ako napr. savčie bunky, a transformované bunky sú pestované in vitro alebo in vivo a produkujú chimerické protilátky (napr. WO 9116928).

Prípadne sú DNA kódujúca myšaciu leader sekvenciu a V oblasť z L reťazca a C oblasť z ľudského L reťazca a DNA kódujúca myšaciu leader sekvenciu a V oblasť z H reťazca a C oblasť z ľudského H reťazca, prítomné v klonovanej DNA, vnesené do jedného expresného vektora (viď International Application Publication No. WO 94-11523) a hostiteľská bunka je transformovaná s použitím takéhoto vektora. Transformovaný hostiteľ je potom pestovaný in vitro alebo in vivo a produkuje požadované chimérna protilátky.

(1) Konštrukcia chimémeho H reťazca

Expresný vektor pre H reťazec chimémej protilátky môže byť získaný vnesením cDNA kódujúcej V oblasť myšacieho H reťazca do vhodného vektora, obsahujúceho genomickú DNA alebo cDNA, kódujúcu C oblasť H reťazca ľudskej protilátky. Ako príklad C oblasti H reťazca je možno uviesť napr. Cy1, Cy2, Cy3 alebo Cy4.

Konštrukcia expresného vektoru pre chimérny H reťazec obsahujúci Cy1 genomickú DNA

Ako expresný vektor, obsahujúci genomickú DNA pre Cy1 ako C oblasť H reťazca môže byť použitý napr. HFE-PMh-gy1 (International Application Publication No. WO 92/19759) alebo DHFR-ÁE-RVh-PM1f (International Application Publication No. WO 92/19759).

Aby bolo možné vložiť cDNA kódujúcu V oblasť myšacieho H reťazca do týchto expresných vektorov, môžu tam byť metódou PCR zavedené vhodné bázové sekvencie. Tieto vhodné bázové sekvencie môžu byť zavedené metódou PCR s použitím PCR primeru navrhnutého tak, aby obsahoval na 5’ konci rozoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a Kozákovu konvenčnú sekvenciu bezprostredne pred štartovným kodónom, a PCR primeru navrhnutého tak, aby obsahoval na 3' konci rozoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a donorové miesto zostrihu, kde je primárny transkript genomickej DNA vhodne zostrihnutý pri vzniku mRNA.

Na takto konštruovanú DNA, kódujúcu V oblasť myšacieho H reťazca je pôsobené vhodnými reštrikčnými enzýmami, potom je vnesená do expresného vektora, a tak môže byť skonštruovaný vektor, obsahujúci Cy1 DNA a exprimujúci chimérny H reťazec.

Konštrukcia expresného vektoru pre cDNA chimémeho H reťazca

Expresný vektor, obsahujúci cDNA z Cy1 ako C oblasť z H reťazca, môže byť konštruovaný nasledovne. Môže byť konštruovaný pripravením z mRNA z buniek CHO, v ktorých bol integrovaný expresný vektor DHFR-AE-RVh-PM1f (International Application Publication No. WO 92-19759), kódujúci genomickú DNA V oblasti H reťazca zušľachtenej PM1 protilátky a C oblasť Cy1 H reťazca ľudskej protilátky (N. Takahashi, a kol., Celí 29, 671-679, 1982) a expresný vektor RV1-PM1a (International Application Publication No. WO 92-19759), kódujúci genomickú DNA

V oblasti L reťazca zušľachtenej PM1 protilátky a C oblasť κ reťazca ľudského L reťazca protilátky; dalej klonovaním cDNA, obsahujúcej V oblasť z H reťazca zušľachtenej PM1 protilátky a C oblasť Cy1 z H reťazca ľudskej protilátky pomocou RT-PCR metódy a ligovaním do vhodného expresného vektora pre živočíšne bunky, pri použití miest pre vhodné reštrikčné enzýmy.

Aby bolo možné priamo ligovať cDNA, kódujúcu V oblasť myšacieho H reťazca k cDNA, obsahujúcej C oblasť Cy1 z H reťazca ľudskej protilátky, môžu byť pomocou PCR metódy zavedené vhodné bázové sekvencie. Napr. tieto vhodné bázové sekvencie môžu byť zavedené metódou PCR primeru navrhnutého tak, aby obsahoval na 5' konci rozoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný režim a Kozákovu konvenčnú sekvenciu bezprostredne pred štartovným kodónom, a PCR primeru navrhnutého tak, aby obsahoval na 3' konci rozoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný režim, použitý pre priamu ligáciu C oblasti Cy1 z H reťazca.

Expresný vektor, obsahujúci cDNA chimémeho H reťazca, môže byť konštruovaný tak, že na takto konštruovanú DNA, kódujúcu V oblasť myšacieho H reťazca je pôsobené vhodným reštrikčným enzýmom, potom je ligované k vyššie uvedenej cDNA, obsahujúcej C oblasti Cy1 H reťazca a nakoniec vložená do expresného vektora, ako je pCOS1 alebo pCHO1.

(2) Konštrukcia L reťazca chimémej protilátky

Expresný vektor pre L reťazec chimémej protilátky môže byť získaný spojením cDNA kódujúcej V oblasť myšacieho L reťazca sgenomickou DNA alebo cDNA kódujúcou C oblasť L reťazca ľúdskej protilátky, a potom vnesením do vhodného expresného vektora. Ako príklad C oblasti L reťazca je možno uviesť κ reťazec alebo λ reťazec.

Konštrukcia expresného vektoru pre κ reťazec cDNA chimémeho L reťazca

Aby bolo možné konštruovať expresný vektor, obsahujúci cDNA kódujúcu

V oblasť myšacieho L reťazca, môžu byť pomocou PCR metódy zavedené vhodné bázové sekvencie. Napr. tieto vhodné bázové sekvencie môžu byť zavedené metódou PCR pri použití PCR primeru navrhnutého tak, aby obsahoval na 5' konci rozoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný režim a Kozákovu konvenčnú sekvenciu a PCR primeru navrhnutého tak, aby obsahoval na 3' konci rozoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný režim.

Kappa reťazec (κ) C oblasti ľudského L reťazca pre väzbu k V oblasti myšacieho L reťazca, môže byť vytvorený napr. zHEF-PM1k-g< (International Application Publication No. WO 92-19759), obsahujúceho genomickú DNA. Expresný vektor pre κ reťazec L reťazca cDNA chimérnej protilátky môže byť konštruovaný vnesením rozoznávacích sekvencií pre vhodné reštrikčné enzýmy pomocou metódy PCR na 5* koniec alebo 3* koniec DNA, kódujúcej κ reťazec C oblasti L reťazca a potom vložením do expresného vektora, ako je pCOS1 alebo pCHO1.

2) Konštrukcia pozmenenej ľudskej protilátky (1) Navrhnutie V oblasti pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky

Aby bolo možné konštruovať pozmenenú ľúdskú protilátku, v ktorej by CDR z myšacej monoklonálnej protilátky bola pripojená k ľúdskej protilátke je žiadúce, aby existovala vysoká homológia medzi FR myšacej monoklonálnej protilátky a FR ľúdskej protilátky. V oblasti z L reťazca a H reťazce myšacej anti-HM 1.24 monoklonálnej protilátky boli teda pomocou Protein Data Bank porovnané s V oblasťami všetkých známych protilátok, ktorých štruktúry boli objasnené.

V oblasť z L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky je najviac podobná konvenčnej sekvencií podskupiny IV V oblasti z L reťazca ľúdskej protilátky (HSGIV). pričom homológia je 66,4%. Na druhej strane vykazuje 56,9% homológiu s HSGI, 55,8% homológiu s HSGII a 61,5% homológiu s HSGIII.

Ak je V oblasť z L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky porovnaná s V oblasťami z L reťazca známych ľúdských protilátok, vykazuje 67,0% homológiu s V oblasťou z L reťazca ľúdskej protilátky REI, jednej z I podskupiny V oblastí L reťazca ľudskej protilátky. Preto bola FR z REI použitá ako východiskový materiál pre konštrukciu V oblastí L reťazca pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky.

Bola navrhnutá verzia V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky. V tejto verzii bola FR ľudskej protilátky vytvorená totožné s FR oblasťou odvodenou z REI, ktorá je už prítomná v pozmenenej ľúdskej CAMPATH-1H protilátke (viď Riechmann, L. a kol., Náture 322, 21-25, (1988), sFR oblasťou, obsiahnutou vo verzii V oblasti L reťazca pozmenenej ľúdskej PM-1 protilátky popísanej v International Application Publication No. WO 92-19759, a myšacia CDR bola vytvorená zhodne s CDR z V oblasti L reťazca myšacej anti-Hm 1.24 protilátky.

Oblasť V z H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky je najviac podobná konvenčnej sekvencii V oblasti z H reťazca ľudskej protilátky (HSGI) s homológiou s HSGIII. Keď je V oblasť z H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky porovnávaná s V oblasťou z H reťazca známych ľudských protilátok, FR1 až FR3 boli najviac podobné V oblasti H reťazca ľudskej protilátky HG3, jednej z I podskupiny V oblasti ľudského H reťazca (Rechavi, G. A kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), keď homológia je 67,3%.

Preto bola FR ľudskej protilátky HG3 použitá ako východiskový materiál pre konštrukciu V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti.HM 1.24 protilátky.

Avšak, pretože aminokyselinová sekvencia FR4 ľudskej protilátky HG3 nebola popísaná, aminokyselinová sekvencia FR4 z ľudskej protilátky JH6 (Ravetch, J. V. a kol., Celí, 27, 583-591), ktorá vykazuje najvyššiu homológiu s FR4 myšacej anti-HM

1.24 protilátky, bola použitá ako FR4. FR4 z JH6 má okrem jednej aminokyseliny sekvenciu zhodnú s FR4 z H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

V prvej verzii a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti.HM 1.24 protilátky boli FR1 až FR3 vytvorené zhodne s FR1 až FR3 z ľudskej protilátky HG3 okrem toho, že aminokyseliny v pozícii 30 v ľudskej FR1 a v pozícii 71 v ľudskej FR3 boli zhodné s aminokyselinami myšacej anti-HM 1.24 protilátky a CDR bola vytvorená zhodne s CDR V oblasti H reťazca myšacej anti-Hm 1.24 protilátky.

(2) Konštrukcia V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

Reťazec L pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky je konštruovaný pripojením CDR oblasti pomocou PCR metódy. Postup je schematicky znázornený na Obr. 4. Pri konštrukcii pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky (verzia a), ktorá má FR odvodenú z ľudskej protilátky REI, bolo použitých osem PCR primerov. Vonkajšie primery A (SEQ ID NO: 47) a H (SEQ ID NO: 48) sú navrhnuté tak, aby hybridizovali s DNA sekvenciou HEF expresného vektora HAF-VL-gic.

Primery ĽIS (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) a L3s (SEQ ID NO: 51) majú negatívnu DNA sekvenciu. Primery L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53) al3A (SEQ ID NO: 54) majú pozitívnu DNA sekvenciu, pričom každý má komplementárnu DNA sekvenciu (20 až 23 bázových párov) s DNA na 5' konci primerov L1S, L2S a L3S.

V prvom stupni PCR boli uskutočnené 4 PCR A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A a L3SS-H a každý PCR produkt bol vyčistený. Štyrom PCR produktom z prvých PCR bolo umožnené vzájomné zostavenie na základe ich vlastnej komplementárny (viď WO 92-19759). Potom boli pridané vonkajšie priméry AaH a bola amplifikovaná celková dĺžka DNA kódujúca V oblasť L reťazca pozmenenej Ľudskej anti-HM 1.24 protilátky (druhá PCR). Vo vyššie uvedenej PCR môže byť ako matrica použitý plazmid HEF-RVL-M21a (viď International Application Publication No. WO 9514041), kódujúci verziu a V oblasti z L reťazca pozmenenej ľudskej ONS-M21 protilátky, založené na FR odvodenej z ľudskej protilátky REI.

V prvom stupni PCR bola použitá matricová DNA a každý z primérov.

PCR produkty A-L1A (215 bázových párov), L1S-L2A (98 bázových párov), L2SL3A (140 bázových párov) a L3S-H (98 bázových párov) boli čistené s použitím 1,5% gélu z agarózy s nízkou teplotou topenia boli zostavené v priebehu druhej PCR.

V druhej PCR boli použité všetky produkty prvej reakcie a oba vonkajšie priméry (A a H).

Fragment dlhý 515 bázových párov, ktorý je výsledkom druhej PCR bol čistený s použitím 1,5% gélu z nízko topiacej sa agarózy, štiepený BamHI a Hindlll, a takto získané DNA fragmenty boli klonované do expresného vektora HEF-VL-gK. Po určení DNA sekvencie bol plazmid, obsahujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu

V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky označený ako HEFRVLa-AHM-gx. Aminokyselinové sekvencia asekvencia báz V oblasti L reťazca obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVLa-AHM-gx sú uvedené v SEQ ID NO: 9.

Verzia b V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky môže byť vytvorená mutagenézou pomocou PCR. Mutačné priméry FTY-1 (SEQ ID NO: 55) a FTY-2 (SEQ ID NO: 56) sú navrhnuté tak, aby mutovali fenylalanín v pozícii 71 na tyrozín.

Po amplifikácií vyššie uvedených primárov použitím plazmidu HEF-RVLa-AHMgx ako matrice bol získaný produkt vyčistený. Po štiepení BamHI a Hindlll boli získané DNA fragmenty klonované do expresného vektora HEF-VL-gK a bol tak získaný plazmid HEF-RVLb-AHM-gK. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti L reťazca obsiahnutých v tomto plazmide HEF-RVLb-AHM-gK sú uvedené v SEQ ID NO: 10.

(3) Konštrukcia V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

3-1. Konštrukcia verzií a až e V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky

DNA kódujúca V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky môže byť navrhnutá nasledujúcim spôsobom. Pripojením DNA sekvencie kódujúcej FR1 až FR3 z ľudskej protilátky HG3 a FR4 z ľudskej protilátky JH6 k DNA sekvencií kódujúcej CDR z V oblasti H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky môže byť získaná úplná dĺžka DNA, kódujúcej V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky.

Potom je na 5' koniec pripojené cieľové miesto pre Hindlll spolu s Kozákovou konvenčnou sekvenciou, na 3* koniec je pripojené cieľové miesto pre BamHI spolu s donorovou sekvenciou pre zostrih tak, aby bolo umožnené pripojenia do HEF expresného vektora.

Takto usporiadaná DNA sekvencia bola rozdelená do štyroch oligonukleotidov. Potom boli oligonukleotidy, ktoré by potenciálne mohli brániť zostaveniu týchto oligonukleotidov, podrobené počítačovej analýze sekundárnych štruktúr.

Sekvencie štyroch oligonukleotidov RVH1 až RVH4 sú uvedené v SEQ ID NO: 57 až SEQ ID NO: 60. Tieto oligonukleotidy majú dĺžku 119 až 144 báz a obsahujú 25 až 26 bázových párov dlhej prekrývajúcej sa oblasti. Z týchto oligonukleotidov majú RVH2 (SEQ ID NO: 58) a RV4 (SEQ ID NO.60) negatívnu DNA sekvenciu, zatiaľčo RVH1 (SEQ ID NO: 57) a RVH3 (SEQ ID NO: 59) majú pozitívnu DNA sekvenciu. Postup pre zostavenie týchto štaroch oligonukleotidov pomocou metódy PCR je ukázaný na obrázku (viď Obr. 5).

PCR bola uskutočnená použitím štyroch oligonukleotidov a RHP1 (SEQ ID NO: 61) a RHP2 (SEQ ID NO: 62) ako vonkajších primerov.

Amplifikovaný, 438 bázových párov dlhý DNA fragment bol čistený, štiepený Hindlll a BamHI a potom klonovaný do HEF expresného vektora HEF-VH-gy1. Po určení sekvencie báz bol plazmid, ktorý obsahuje DNA fragment, kódujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu V oblasti H reťazca označený ako HEF-RVHa-AHM-gy1. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHa-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 11.

Jednotlivé verzie b, c, d a e V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky sú konštruované nasledovne. Pri konštruovaní verzie b a ďalších verzií V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky možno konštruovať trojrozmerný štrukturálny model V oblasti myšacej anti-HM 1.24 protilátky, aby bolo možné predpovedať polohy aminokyselinových zvyškov, ktoré budú v molekule protilátky zamenené.

S použitím mutačných primerov BS (SEQ ID NO: 63) a BA (SEQ ID NO: 64) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 66 na lyzín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia b amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHb-AHM-gy1. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHb-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 12.

S použitím mutačných primerov CS (sekvencie 65) a CA (SEQ ID NO: 66) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 73 na lyzín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia c amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHc-AHM-gy1. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHc-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 13.

S použitím mutačných primerov DS (SEQ ID NO: 67) a DA (SEQ ID NO: 68) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 66 na lyzín a threonín v polohe 73 na lyzín, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia d amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHd-AHM-gy1. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHd-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 14.

S použitím mutačných primerov ES (SEQ ID NO: 69) a EA (SEQ ID NO: 70) navrhnutých tak, aby mutovali valín v polohe 67 na alanín a methionín v polohe 69 na leucín, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia e amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHe-AHM-gy1. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHe-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 15.

3-2. Konštrukcia H reťazca hybridnej V oblasti

Konštruovaním H reťazca hybridnej V oblasti je možné skúmať, ktorá FR

V oblasti zušľachtenej protilátky prispieva k väzbovej aktivite a ktorá prispieva kinhibovaniu väzbovej aktivity, u dvoch, ktoré boli skonštruované, mala jedna aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky (hybridná anti-HM 1.24 protilátka myš/človek), zatiaľčo druhá mala aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a

V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM 1.24 protilátky (hybridná anti-HM 1.24 protilátka človék/myš). Aminokyselinové sekvencie COR oblastí sú celé odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

Dva H reťazce hybridných V oblastí boli skonštruované pomocou metódy PCR. Metóda je schematicky ukázaná na Obr. 6 a Obr. 7. Pre konštrukciu dvoch H reťazcov hybridných V oblastí môžu byť použité štyri primery. Vonkajšie primery a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) sú navrhnuté tak, aby hybrídizovali s DNA sekvenciou HEF expresného vektora HEF-VH-gy1. Konštrukčný primer HYS (SEQ ID NO: 73) hybridného H reťazca je navrhnutý tak, že má negatívnu DNA sekvenciu a hybridný primer HYA (SEQ ID NO: 74) H reťazca má pozitívnu DNA sekvenciu tak, že oba DNA sú vzájomne komplementárne.

Pre konštrukciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 sú verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky boli v prvom stupni PCR použitá PCR metóda s plazmidom HEF-1.24H-gy1 ako matricou, vonkajší primer a, a hybridný primer HYA pre H, a ďalej potom PCR metóda, používajúca ako matricu plazmid HEF-RVHaAHM-gy1, hybridný primár pre H reťazec HYA a vonkajší primer h, a produkty oboch PCR reakcií boli vyčistené.

Dva produkty z PCR reakcií prvého stupňa boli ponechané zostaviť sa na základe vzájomnej komplementarity (viď International Application Publication No. WO 92-19759). Potom bola po pridaní vonkajších primárov a a h v PCR reakcii druhého stupňa syntetizovaná DNA s úplnou dĺžkou, kódujúca H reťazec hybridnej

V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

Pre konštrukciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencia FR1 a FR2 odvodené z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM

1.24 protilátky bola v prvom stupni PCR použitá PCR metóda splazmidom HEFRVHa-AHM-gy1 ako matricou, vonkajší primer a, a hybridný primer HYA pre H reťazec, a ďalej potom PCR metóda, používajúca ako matricu plazmid HEF-1.24Hγ1, hybridný primer pre H reťazec HYS a vonkajší primer h, a produkty oboch PCR reakciou boli vyčistené.

Dva produkty z PCR reakcií prvého stupňa boli ponechané zostaviť sa na základe vzájomnej komplementarity (viď International Application Publication No. WO 92-19759). Potom bola po pridaní vonkajších primerov a a h v PCR reakcii druhého stupňa syntetizovaná DNA s úplnou dĺžkou, kódujúca H reťazec hybridnej _ V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a

V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

PCR reakcia prvého stupňa, čistenie PCR produktov, zostavenie PCR produktov, PCR reakcia druhého stupňa a klonovanie do HEF expresného vektora HEF-VH-g1 boli uskutočnené podľa postupu uvedeného v Príklade 9. Konštrukcie

V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky”. Po určení DNA sekvencie bol plazmid, ktorý obsahuje DNA fragment, kódujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky HEF-MH-RVH-AHM-g1.

Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-MH-RVH-AHM-gyl sú uvedené v SEQ ID NO: 75. Tiež plazmid, ktorý obsahuje DNA fragment, kódujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM 1.24 protilátky nazvaný HEF-HM-RVH-AHM-gyl. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-HM-ŔVH-AHM-gyl sú uvedené v SEQ ID NO: 76.

3-3. Konštrukcia verzií f až s V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky

Každá z verzií f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, r a s V oblasti H reťazca zušľachtenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky je konštruovaná nasledujúcim spôsobom. Pri konštruovaní verzie f a ďalších verzií V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky možno skonštruovať trojrozmerný štukturálny model V oblasti myšacej anti-HM 1.24 protilátky ako bolo uvedené vyššie, aby bolo možné predpovedať polohy aminokyselinových zvyškov, ktoré budú v molekule protilátky zamenené.

S použitím mutačných primérov FS (SEQ ID NO: 78) a FA (SEQ ID NO: 79) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 75 na serín a valín v polohe 78 na alanín, a DNA plazmidu HEF-RVHe-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia f amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHf-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHf-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 16.

S použitím mutačných primérov GS (SEQ ID NO: 80) a GA (SEQ ID NO: 81) navrhnutých tak, aby mutovali alanín v polohe 40 na arginín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia g amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHg-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHg-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 17.

S použitím mutačných primárov FS a FA a DNA plazmidu HEF-RVHb-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia h amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHh-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 18.

S použitím mutačných primérov IS (SEQ ID NO: 82) a IA (SEQ ID NO: 83) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 83 na alanín a serín v polohe 84 na fenylalanín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia i amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHi-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHi-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 19.

S použitím mutačných primerov JS (SEQ ID NO: 84) a JA (SEQ ID NO: 85) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 66 na lyzín, a DNA plazmidu HEFRVHf-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia j amplifikovaná a bol získaný piazmid HEF-RVHj-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHj-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 20.

S použitím mutačných primerov KS (SEQ ID NO: 86) a KA (SEQ ID NO: 87) navrhnutých tak, aby mutovali kyselinu glutámovú v polohe 81 na glutamín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia k amplifikovaná a bol získaný piazmid HEF-RVHk-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHk-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 21.

S použitím mutačných primerov LS (SEQ ID NO: 88) a LA (SEQ ID NO: 89) navrhnutých tak, aby mutovali kyselinu glutámovú v polohe 81 na glutamín a serín v polohe 82B na izoleucín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia I amplifikovaná a bol získaný piazmid HEF-RVHI-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHI-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 22.

S použitím mutačných primerov MS (SEQ ID NO: 90) a LA (SEQ ID NO: 91) navrhnutých tak, aby mutovali kyselinu glutámovú v polohe 81 na glutamín, serín v polohe 82b na izoleucín a threonín v polohe 87 na serín, a DNA plazmidu HEFRVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia m amplifikovaná a bol získaný piazmid HEF-RVHm-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHm-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 23.

S použitím mutačných primerov NS (SEQ ID NO: 92) a NA (SEQ ID NO: 93) navrhnutých tak, aby mutovali serín v polohe 82b na izoleucín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia m amplifikovaná a bol získaný piazmid HEF-RVHn-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHn-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 24.

S použitím mutačných primerov OS (SEQ ID NO: 94) a OA (SEQ ID NO: 95) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 87 na serín, a DNA plazmidu HEFRVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia o amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHo-AHM-gy1. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHo-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 25.

S použitím mutačných primárov PS (SEQ ID NO: 96) a PA (SEQ ID NO: 97) navrhnutých tak, aby mutovali valín v polohe 78 na alanin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia p amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHp-AHM-gYl sú uvedené v SEQ ID NO: 26.

S použitím mutačných primerov QS (SEQ ID NO: 98) a QA (SEQ ID NO: 99) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 75 na serín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl ako matrica pre PCR metódu, bola verzia q amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHq-AHM-gy1. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHq-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 27.

S použitím mutačných primerov CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia r amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHr-AHM-gy1. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHr-AHM-gyl sú uvedené v SEQ ID NO: 28.

S použitím mutačných primerov SS (SEQ ID NO: 100) a SA (SEQ ID NO: 101) navrhnutých tak, aby mutovali metionín v polohe 69 na izoleucín, a DNA plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 ako matrica pre PCR metódu, bola verzia s amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHs-AHM-gy1. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHs-AHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 102.

Aminokyselinové sekvencie V oblasti konštruovaného L reťazca sú uvedené v Tabuľke 1 a aminokyselinové sekvencie V oblasti H reťazca sú uvedené v Tabuľkách 2 až 4.

Tabuľka 1

Aminokyselinová sekvencia V oblasti L reťazca

AHM HuSG I REI RVLa RVLb

FRl

2

12345678901234567890123 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITC

CDR1 FR2

4

45678901234 567890123456789 KASQDVNTAVA WZQQKPGQSPKLLIY

WYQQKPGKAPKLLIY

AHM HuSG I REI RVLa RVLb

AHM HUSG I REI RVLa RVLb

CDR FR3

6 7 8

0123456 78901234567890123456789012345678 SASNRYT GVPDRITGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYC

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

GVPSRFSGSGSGDTFTFTISSLQPEDIATYYC

CDR3 FR4

10

901234567 8901234567 QQHYSTPFT FGSGTKLEIK

FGQGTKVEIK

Tabuľka 2

Aminokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca (D

AHM

HuSG I

HG3

RVHa

RVHb

RVHc

RVHd

RVHe

RVHf

RVHg

RVHh

RVHi

RVHj

RVHk

RVHI

RVHm

RVHn

RVHo

RVHp

RVHq

RVHr

RVHs

FR1 CDR1 FR2

3 4

123456789012345678901234567890 12345 67890123456789 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT PYWMQ WYKQRPGQGLEWIG EYQLVQSGADVKKPGXSYXVSCKASGYTFS WYRQAPGXGLDWVG

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN WYRQAPGQGLEWMG

-----------------------------_T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------_T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T----R-------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------T------------------------------------------------_T------------------------------------------------T------------------------------------------------T-------------------27

Tabuľka 3

Amínokyselinová sekvencia V oblasti H reťazca (2)

CDR2 FR3

6 7 8 9

012A3456789012345 67890123456789012ABC345678901234

AHM SIFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKS S S TAYMQLSILAFEDSAVYYCAR

HuSG I RVTXTXDXSXNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

HG3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR

RVHa ----------------------A-------------------------RVHb -----------------K----A-------------------------RVHc ----------------------A-K-----------------------RVHd -----------------K----A-K-----------------------RVHe ------------------A-L-A-------------------------RVHf ------------------A-L-A—S—A------------------RVHg ----------------------A-------------------------RVHh -----------------K----A---S—A------------------RVHi -----------------K----A—S—A-------AF---------RVHj -----------------KA-L-A---S—A------------------RVHk -----------------K----A---S—A--Q---------------RVHi -----------------K----A---S—A—Q—I------------RVHm -----------------K----A—S—A—Q--I-----S------RVHn -----------------K----A---S~A-----1------------RVHo -----------------K----A S—A-----------S------RVHp ----------------------A------A------------------RVHq ----------------------A---S---------------------RVHr ----------------------A-K----A------------------RVHs --------------------I-A-K----A------------------28

Tabuľka 4

Aminokyselinové sekvencia V oblasti H reťazca (3)

AHM

HuSG

JH6

RVHa

RVHb

RVHc

RVHd

RVHe

RVHf

RVHg

RVHh

RVHi

RVHj

RVHk

RVHI

RVHm

RVHn

RVHo

RVHp

RVHq

RVHr

RVHs

CDR3 FR4

11

57890ABJK12 34567890123 GLRRGGYYFDY WGQGTTLTVSS

WGQGTLVTVSS

WGQGTTVTVSS

3) Produkcia chimémych protilátok a pozmenených ľudských protilátok

Pre produkciu chimérických protilátok alebo pozmenených ľudských protilátok boli skonštruované vždy dva expresné vektdľy, ktoré obsahujú DNA kódujúcu V oblasť myšacieho H reťazca a C oblasť ľudského H reťazca, pod kontrolou oblasti regulujúcej expresiu, ako je systém zosilovač transkripcia/promótor, a DNA kódujúca

V oblasť myšacieho L reťazca a C oblasť ľudského L reťazca, pod kontrolou oblasti regulujúcej expresiu, ako je systém zosilovač transkripcia/promótor, alebo expresný vektor, obsahujúci DNA kódujúcu V oblasť zušľachteného H reťazca a C oblasť ľudského H reťazca, pod kontrolou oblasti regulujúcej expresiu, ako je systém zosilovač transkripcia/promótor, a DNA kódujúcu V oblasť zušľachteného L reťazca a C oblasť ľudského L reťazca, pod kontrolou oblasti regulujúcej expresiu, ako je systém zosilovač transkripcia/promótor.

Potom je hostiteľská bunka, ako je savčia bunka, transformovaná spolu týmito dvoma vektormi, transformované bunky sú pestované in vitro alebo in vivo a produkujú chiméme protilátky alebo pozmenené ľudské protilátky (napr. International Application Publication No. WO 91-16928). Naviac je protilátkový gén vnesený do savcov, ako napr. koza, a je tak vytvorený transgénny živočích, z ktorého mlieka je potom možné získať chiméma protilátky alebo pozmenené ľudské protilátky.

Taktiež V oblasť H reťazca a C oblasť H reťazca, a V oblasť L reťazca a C oblasť L reťazca sú ligované do jedného vektora, ktorým je transformovaná vhodná hostiteľská bunka, a tým je navodená produkcia protilátok. Teda pre expresiu chimémych protilátok sú DNA kódujúca myšaciu leader sekvenciu, V oblasť H reťazca a ľudský H reťazec C oblasti, prítomné v klonovanej cDNA, a DNA kódujúca myšaciu leader sekvenciu a L reťazec V oblasti a ľudský Ľ reťazec C oblasti vnesené do jedného expresného vektora (viď International Application Publication No. WO 94-11523).

Pre expresiu pozmenenej ľúdskej protilátky sú DNA kódujúca V oblasť zušľachteného H reťazca a C oblasť ľudského H reťazca, a DNA kódujúca V oblasť zušľachteného L reťazca a C oblasť ľudského L reťazca vnesené do jedného expresného vektora (viď International Application Publication No. WO 94-11523). Pomocou uvedeného vektora sú hostiteľské bunky transformované a transformované bunky sú pestované in vivo alebo in vitro a produkujú požadovanú chimému protilátku alebo pozmenenú ľudskú protilátku.

Bunky, vyššieuvedeným postupom transformované génom kódujúcim požadovanú chimému protilátku aiebo pozmenenú ľudskú protilátku, sú pestované a produkovaná chiméma protilátka alebo pozmenená ľudská protilátka môže byť izolovaná buď zvnútra bunky alebo z okolitého média a vyčistená do homogénneho stavu.

Izolácia a purifikácia požadovaného proteínu uvedeného v tomto vynáleze, chimérne protilátky alebo pozmenené ľudské protilátky môžu byť uskutočnené pomocou afinitného stĺpca. Ako stĺpec, ktorý využíva protein A, možno uviesť Hyper D, POROS, Sepharose F atď. Ako alternatívne možnosti možno použiť bežné izolácie a purofikácie používané pre proteíny, výber metód nie je akýmkoľvek spôsobom obmedzený. Napr. kombinácia rozličných chromatografických metód, ultrafiltrácie, vyizolovania, dialýzy a podobne podľa potreby, umožní izoláciu a purifikáciu chimérnej protilátky alebo pozmenenej ľudskej protilátky.

Pre produkciu chimérnej anti-HM 1.24 protilátky alebo pozmenenej ľudskej antiHM 1.24 protilátky, uvedenej v tomto vynáleze, možno použiť akúkoľvek expresnú metódu, vrátane napr. eukaryotických buniek, ako sú živočíšne bunky zavedených systémov savčích bunkových línií, bunkových systémov buniek hmyzu, systémov buniek húb, kvasinkových bunkových systémov a prokaryotických buniek, ako sú bakteriálne bunky, napr. bunky Escherichia coli a pod. Je výhodné produkovať chimérne protilátky alebo pozmenené ľúdské protilátky, uvedené v tomto vynáleze, vCOS bunkách, HeLa bunkách, Vera bunkách, bunkách myelómu alebo BHK bunkách.

V takýchto prípadoch môžu byť použité všeobecné promótory, používané pre expresiu vsavších bunkách. Napr. s výhodou môže byť použitý bezperostredne skorý promótor ľudského cytomegalovfru (HCMV). Príklady expresných vektorov, obsahujúcich HCMV promótor sú napr. HCMV-VH-Hcy1, HCMV-VL-HCk, atď., ktoré sú odvodené z pSV2neo (International Application Publication No. WO 92-19759).

Naviac ako promótory pre expresiu génu v savčích bunkách v predkladanom vynáleze možno použiť vírové promótory, napr. retrovíru, polyomavíru, adenovíru, opičieho víru (SV40) atď. a promótory odvodené zo savčích buniek, ako sú ľúdský faktor pre elongáciu polypeptidového reťazca 1a (HEF-1a) atď. Napr., keď je použitý promótor SV40, expresia môže byť ľahko dosiahnutá pri použití metódy Mulligan a kol., (Náture 277, 108 (1079)), a keď je použitý promótor HEf-1a, možno použiť metódu Mizushima, S. a kol., (Nucleic Acids Research, 18, 5322,1990).

Pre replikáciu možno použiť systémy, ktoré sú odvodené od víru SV40, polyomavíru, adenovíru, hovädzieho papillomavíru (BPV), adenovíru alebo podobne a pre zvýšenie počtu kópií génov v hostiteľskom bunkovom systéme môže expresný vektor obsahovať, ako selektívny marker, gén pre aminoglykosyl fosforibosyltransferázu (ΑΡΗ), gén pre thymidín kinázu (TK), gén pre xanthínquanidín fosforibosyltransferázu z Escherichia coli Ecogpt), gén pre dihydrofolát reduktázu (DHFR) a podobne.

4) Väzbová inhibičná aktivita chimérnej protilátky alebo pozmenenej ľudskej protilátky (1) Meranie koncentrácie protilátok

Koncentrácia čistených protilátok môže byť meraná ELISA testom alebo pomocou merania absorbancie.

ELISA doštičky pre meranie koncentrácie protilátok môžu byť pripravené nasledujúcim postupom. V každej z 96 jamiek ELISA doštičky (napr. Maxisorb, vyrobené NUNC) bolo imobilizované 100 μΙ kozej protilátky proti ľudskému IgG pri koncentrácii 1 pg/ml.

Po blokovaní pomocou 100 pg/ml zriaďovacieho pufru (napr. 50mM Tris-HCl, 1mM MgCh.0,15 M NaCI, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃.1% hovädzí sérumalbumín (BSA), pH 8,1), je ku každej jamke pridané sériové zriedenie supematantu z kultúr buniek, v ktorých je exprimovaná chiméma protilátka, hybridná protilátka alebo pozmenená ľudská protilátka, napr. supernatant kultúr COS buniek alebo CHO buniek, alebo čistená chiméma protilátka, hybridná protilátka alebo pozmenená ľudská protilátka. Potom je pridané 100 μΙ kozej protilátky proti ľúdskému IgG, konjugované s alkalickou fosfatázou, roztok substrátu s koncentráciou 1 mg/ml (Sigma104, p-nitrofenylfosfát, vyrobené SIGMA) a na prístroji pre odpočítanie mikrodoštičiek (Bio Rad) je meraná absorbancia pri 405 nm. Ako štandard pre meranie koncentrácie sa môže používať ľúdský IgGIie (vyrobené The Binding Site). Koncentrácia čistenej protilátky sa získa meraním absorbancia pri 280 nm a vypočítaním za predpokladu, že 1 mg/ml zodpovedá absorbancii 1,35 OD.

(2) Väzbová aktivita

Väzbovú aktivitu možno merať bunkovým” ELISA testom s použitím línie ľudských amniotických buniek WISH (ATCC CC25). Doštičky pre bunkový” ELISA test môžu byť pripravené nasledujúcim postupom. Bunky WISH, pripravené vo vhodnej koncentrácii v médiu PRMI 1640, doplnenom 10 % hovädzieho fetálneho séra, sú pridané do 96 jamkovej doštičky, inkubované cez noc a po dvojitom premytí a PBS(-) sú fixované 0,1 % glutaraldehydom (vyrobené Nakalai tesque).

Po blokovaní je ku každej jamke pridané 100 μΙ sériových zriedení supernatantu z kultúr buniek, v ktorých je exprimovaná chimérna anti-HM 1.24 protilátka, hybridná anti-HM 1.24 protilátka alebo pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, napr. supernatant kultúr COS buniek alebo CHO buniek, alebo čistená chimérna anti-HM

1.24 protilátka, hybridná anti-HM 1.24 protilátka alebo pozmenená ľudská anti-HM

1.24 protilátka, a inkubované 2 hodiny pri teplote miestnosti a potom je pridaná králičia protilátka proti ľudskému IgG, označená peroxidázou (vyrobené DÁKO).

Po inkubácii 1 hodinu pri teplote miestnosti je pridaný roztok substrátu a ďalej je inkubované. Potom je reakcia zastavená 50 μΙ 6 N kyseliny sírovej a je meraná absorbancia pri 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad).

(3) Meranie väzbovej inhibičnej aktivity

Väzbová inhibičná aktivita biotinylovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátky je meraná bunkovým ELISA testom s pomocou línie ľudských amniotických buniek WISH (ATCC CCL25). Doštičky pre bunkový” ELISA test môžu byť pripravené vyššie uvedeným postupom (2). Bunky WISH, pripravené vo vhodnej koncentrácii v médiu PRMI 1640, doplnenom 10% hovädzieho fetálneho séra, sú pridané do 96 jamkovej doštičky, inkubované cez noc a po dvojitom premytí a PBS(-) sú fixované 0,1 % glutaraldehydom (varobené Nakalai tesque).

Po blokovaní je ku každej jamke pridané 50 μΙ sériových zriedení supernatantu z kultúr buniek, v ktorých je exprimovaná chiméma anti-HM 1.24 protilátka, hybridná anti-HM 1.24 protilátka alebo pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, napr. supernatant kultúr COS buniek alebo CHO buniek, alebo čistená chiméma anti-HM

1.24 protilátka, hybridná anti-HM 1.24 protilátka alebo pozmenená ľúdská anti-HM

1.24 protilátka súčasne s 50 μΙ 2 μς^Ι biotinylovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátky, inkubované 2 hodiny pri teplote miestnosti a po premytí je pridaný streptavidin, označený peroxidázou (vyrobené DÁKO).

Po inkubácii 1 hodinu pri teplote miestnosti a nasledujúcom premytí je pridaný roztok substrátu a ďalej je inkubované. Potom je reakcia zastavená 50 μΙ 6 N kyseliny sírovej a je meraná absorbancia pri 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad).

Meranie ADCC aktivity

ADCC aktivita chimérnej protilátky alebo pozmenenej ľudskej protilátky, ktorá je predmetom tohoto vynálezu, môže byť meraná nasledujúcim spôsobom. Po prvé sú z ľudskej periférnej krvi alebo kostnej drene oddelené pomocou hustotovej centrifugácie mononukleárne bunky a sú z nich pripravené bunky efektorové. Bunky ľudského myelómu sú pripravené ako bunky cieľové tým, že bunky RPMI 8226 sú označené pomocou ⁵¹ Cr. Potom je k takto označeným cieľovým bunkám pridaná chimérna protilátka alebo pozmenená ľudská protilátka, u ktorej je meraná ADCC aktivita, inkubuje sa a potom sú k cieľovým bunkám pridané efektorové bunky a ďalej sa inkubuje.

Po inkubácii je odobraný supernatant a zmeraná jeho rádioaktivita na merači žiarenia gama. Súčasne môže byť pre zistenie maxima uvoľnenej rádioaktivity použitý 1 % NP-40. Cytotoxicita (v %) môže byť vypočítaná ako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je rádioaktivita (cpm), uvoľnená v prítomnosti protilátky, B je rádioaktivita (cpm), uvoľnená v prítomnosti NP-40 a C je rádioaktivita (cpm), uvoľnená v samotnom kultivačnom roztoku bez protilátok.

Keď sa očakáva, že C oblasť protilátky bude vykazovať ADCC aktivitu alebo CDC aktivitu, možno použiť Ľudskú Cy1 alebo ľudskú Cy3. Naviac , buď pridaním, zmenou alebo úpravou časti aminokyselín C oblasti protilátky možno navodiť vyššiu ADCC aktivitu alebo CDC aktivitu.

Napríklad existuje polymerizácia IgG pripomínajúca IgM, spôsobená náhradou aminokyselín (Smith, R. I. F. & Morrison, S. L, BIO-TECHNOLOGY (1994) 12, 683688), ďalej polymerizácia IgG pripomínajúca IgG, spôsobená pridaním aminokyselín (Smith, R. I. F. a kol., J. Immunol. (1995) 154, 2226-2236), expresia tandemovo usporiadaných génov kódujúcich L reťazec (Shuford, W. a kol., Science (1991) 252, 724-727), dimerizácia IgG, spôsobená zámenou aminokyselín (Caron, P. C. a kol., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B. J. Immunology (1992) 148, 29182922, dimerizácia IgG, spôsobená chemickou modifikáciou (Wolff, E. A. a koľ, Cancer res. (1993) 53, 2560-2565) a navodenie efektorovej funkcie, spôsobená zmenou aminokyselín v kĺbovej oblasti protilátky (Norderhaug, L. a kol., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384). Môžu sa dosiahnuť cielenou mutagenézou pomocou primerov, pridaním sekvencie báz s využitím štiepnych miest pre reštrikčné enzýmy a chemickými modifikačnými činidlami, ktoré indukujú kovalentné väzby.

in vivo diagnostické činidlo pre myelóm

Chimérna anti-HM 1.24 protilátka alebo pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, ktorá je predmetom tohto vynálezu, môže byť použitá ako in vivo diagnotické činidlo pre myelóm tým, že je pripojená k označenej zlúčenine, ako je rádioaktívny izotop alebo podobne.

Naviac fragmenty chimérnej anti-HM 1.24 protilátky alebo pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, ako sú Fab, F(ab')2, Fv alebo jednotlivý reťazec Fv (scFv), kde Fv alebo Fv H reťazec a L reťazec sú spojené vhodným linkerom, ktorý je pripojený k označenej zlúčenine ako je rádioaktívny izotop alebo podobne, môžu byť použité ako in vivo diagnostické činidlo pre myelóm.

Špecificky možno tieto myelómové fragmenty získať skonštruovaním génu, kódujúceho tieto protilátkové fragmenty, vnesením do expresného vektora a potom exprimovaním vo vhodných hostiteľských bunkách, alebo štiepením chimérnej antiHM 1.24 protilátky alebo pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky vhodným enzýmom.

Vyššie uvedená in vivo diagnostiká pre myelóm môžu byť systémovo podávané parenterálnym spôsobom.

Farmaceutický prostriedok a liečebné činidlo pre myelóm

Aby boli potvrdené liečebné účinky chimérnej anti-HM 1.24 protilátky alebo zušľachtenej anti-HM 1.24 protilátky, ktorá je predmetom tohto vynálezu, uvedené protilátky boli podávané živočíchom s transplantovanými myelómovými bunkami a boli hodnotené ich protinádorové účinky.

Ako myelómové bunky, ktoré sú transplantované živočíchom, bolo preferované ľúdské myelómové bunky, z ktorých možno uviesť napr. KPMM2 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475), RPMI8226 (ATCC CCL155), ARH-77 (ATCC CRL 1621) a S6B45 (Suzuki, H. a kol., Eur. J. Immunol. (1992) 22, 1989-1993). Ako živočíchy, ktorým sú uvedené bunky transplantované, sú s výhodou používané také, u ktorých sú imunologické funkcie potlačené alebo chýbajú, tu možno uviesť ako príklad nahé myši, myši SCID, béžové myši a nahé krysy.

Naviac protinádorové účinky môžu byť potvrdené zmenami v hladinách ľudských imunoglobulínov v séra, meraním objemu alebo hmotnosti nádoru, zmenami v množstve Bence Jonesových proteinov v moči, dobou prežitia pokusných zvierat a podobne.

Farmaceutické prostriedky alebo liečebné činidlá, ktoré obsahujú ako aktívnu zložku chimérnu anti-HM 1.24 protilátku alebo pozmenenú ľudskú anti-HM 1.24 protilátku, ktorá je predmetom tohto vynálezu, môžu byť podávané parentálnym spôsobom, buď systémovo alebo lokálne. Napríklad si možno vybrať intravenózne injekcie, ako sú kvapkajúce infúzie, intramuskuláme injekcie, intraperitoneálne injekcie alebo subkutánne injekcie a dávkový režim možno vybrať v závislosti na veku a zdravotnom stave pacientov.

Účinné dávkovanie je obyčajne vybrané v oblasti 0,01 až 1000 mg/kg telesnej hmotností na dávku. Inou možnosťou je zvoliť dávkovanie 5 mg na jedinca, výhodnejšie 50 až 100 mg na jedinca.

Farmaceutické prostriedky alebo liečebné činidlá pre myelóm, ktoré obsahujú ako aktívnu zložku chimérnu anti-HM 1.24 protilátku alebo pozmenenú ľudskú antiHM 1.24 protilátku, ktorá je predmetom tohto vynálezu, môžu obsahovať farmaceutický prijateľné nosiče alebo prímesy, závisiace na spôsobe podania.

Ako príklady takých nosičov alebo prímesí tu môžu byť uvedená voda, farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlá, kolagén, polyvinylalkohol, polyvinyl pyrolidon, karboxyvinylový polymér, sodná soľ karboxymetylcelulózy, polyakrylát sodný, alginát sodný, vo vode rozpustný dextrán, sodná soľ karboxylmetylového škrobu, pektín, metylcelulóza, etylcelulóza, xantánová klovatina, arabská guma, kazeín, želatína, agar, diglycarín, glycerín, propylénglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, kyselina stearová, ľudský sérumalbumín (HSA), manitol, sorbitol, laktóza, farmaceutický prijateľné zmáčadlá a podobne. Použité prímesy môžu byť vybrané z vyššie uvedených príkladov alebo ich kombinácií, ale nielen z nich.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je graf znázorňujúci ako je pri FCM analýze, používajúcej líniu ľudských myelómových buniek KPMM2 intenzita fluorescencie chimérnej anti-HM

1.24 protilátky posunutá v porovnaní s kontrolnou protilátkou podobným spôsobom, ako u myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 2 je graf znázorňujúci ako pri bunkovom ELISA teste používajúcom bunky WISH chimérna anti-HM 1.24 protilátka, podobne ako myšacia anti-HM 1.24 protilátka, inhibuje väzbu biotinylovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátky na WISH bunky v miere, ktorá je úmerná koncentrácii.

Obrázok 3 je graf znázorňujúci, že kontrolná ľudská lgG1 alebo myšacia antiHM 1.24 protilátka nevykazujú cytotoxicitu, zatiaľ čo chimérna anti-HM 1.24 protilátka vykazuje pri zvýšenom pomere E/T zvýšenú cytotoxicitu k bunkám RPMI 8226.

Obrázok 4 je diagram, predstavujúci spôsob konštrukcie L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky zostavením úseku CDR oblasti pomocou PCR metódy.

Obrázok 5 je diagram predstavujúci spôsob zostavenia oligonukleotidov RVH1, RVH2, RVH3 a RVH 4 pomocou PCR metódy pri príprave H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 6 je diagram predstavujúci spôsob konštrukcie V oblasti H reťazca hybridnej anti-Hm 1.24 protilátky človek/myš pomocou PCR metódy.

Obrázok 7 je diagram predstavujúci spôsob konštrukcie V oblasti H reťazca hybridnej anti-HM 1.24 protilátky človek/myš pomocou PCR metódy.

Obrázok 8 je graf ukazujúci, že verzia a L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky má rovnakú väzbovú schopnosť pre ako chimérny anti-HM 1.24 protilátka. Indexy -1 a -2 ukazujú, že sa jedná o rôzne šarže.

Obrázok 9 je graf ukazujúci schopnosť viazať antoigén u pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, v ktorej bola kombinovaná verzia a L reťazca a verzia a, b, f alebo h H reťazca a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 10 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky, v ktorej bola kombinovaná verzia b L reťazca a verzia a, b, f alebo h H reťazca a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 11 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, v ktorej bola kombinovaná verzia a L reťazca a verzia a, b, f alebo h H reťazca a chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 12 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, v ktorej bola kombinovaná verzia b L reťazca a verzia a, b, f alebo h H reťazca a chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 13 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzie a, b, c a d H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 14 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzie a a e H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky. Indexy -1 a -2 ukazujú, že sa jedná o rôzne šarže.

Obrázok 15 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť u verzií reťazca a, b, p a r H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM

1.24 protilátky.

Obrázok 16 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u hybridnej anti-HM 1.24 protilátky človek/myš, u hybridnej anti-HM 1.24 protilátky myš/človek a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 17 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií a, b, c af H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 18 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií a a g H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 19 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť u verzií aag H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 20 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií h a i H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 21 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií f, h a j H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 22 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť u verzií h a i H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 23 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť u verzií f, h a j H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 24 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií h, k, I, m, n a o H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a uchimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 25 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií a, h, p a q H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a uchimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 26 je graf ukazujúci inhibíciu schopnosti viazať sa k bunkám WISH u verzií h, k, I, m, n a H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a u chimémej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 27 je graf ukazujúci väzbovú inhibičnú schopnosť u verzií a, h, p a q H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a uchimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 28 je graf ukazujúci schopnosť viazať antigén u verzií a, c, p a r H reťazca pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky a uchimérnej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 29 je graf ukazujúci, že verzia z pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky má rovnakú väzbovú schopnosť pre antigén ako verzia r pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 30 je graf ukazujúci, že verzia z pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky má rovnakú väzbovú inhibičnú schopnosť ako verzia r pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázok 31 je graf ukazujúci, že purifikovaná ľudská anti- HM 1.24 protilátka má rovnakú schopnosť viazať antigén ako chiméma anti-HM 1.24 protilátka.

Obrázok 32 je graf ukazujúci, že purifikovaná ľudská anti-HM 1.24 protilátka má rovnakú väzbovú inhibičnú schopnosť ako chiméma anti-HM 1.24 protilátka.

Obrázok 34 je graf ukazujúci, že keď sú bunky odvodené z periférnej krvi zdravého človeka použité ako bunky efektorové, potom kontrolný ľudský lgG1 nevykazuje cytotoxicitu pre bunky KPMM2 a myšacia anti-HM 1.24 protilátka má tiež slabú cytotoxicitu, zatiaľ či pozmenená ľúdská anti-Hm 1.24 protilátka vykazuje pre bunky KPMM2 silnú cytotoxicitu.

Obrázok 35 je graf ukazujúci, že keď sú bunky odvodené z periférnej krvi zdravého človeka použité ako bunky efektorové, potom kontrolný ľúdský lgG1 nevykazuje cytotoxicitu pre bunky ARH-77 a myšacia anti-HM 1.24 protilátka má tiež slabú cytotoxicitu, zatiaľ či pozmenená ľudská anti-Hm 1.24 protilátka vykazuje pre bunky ARH-77 silnú cytotoxicitu.

Obrázok 36 je graf ukazujúci, že keď sú bunky odvodené z kostnej drene myši SCID použité ako bunky efektorové, potom kontrolný ľudský lgG1 nevykazuje cytotoxicitu pre bunky KPMM2, zatiaľ čo pozmenená ľudská anti-Hm 1.24 protilátka vykazuje pri zvýšení koncentrácie protilátok zvýšenú cytotoxicitu pre bunky KPMM2.

Obrázok 37 je graf ukazujúci, že hladina ľudského IgG v sére myší s transplantovanými ľudskými myelómovými bunkami je zvýšená po podaní kontrolného ľlidského IgG v porovnaní s jeho hladinou pred podaním, zatiaľ čo ľudské anti-HM 1.24 protilátky inhibuje toto zvýšenie hladiny ľudského IgG v sáre.

Obrázok 38 je graf ukazujúci, že podanie pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky myšiam s transplantovaným ľudskými myelómovými bunkami spôsobí v porovnaní s podaním kontrolného ľudského IgG predĺženie obdobia prežitia.

Obrázok 39 je graf ukazujúci, že hladina ľudského IgG v sére myší s transplantovanými ľudskými myelómovými bunkami je zvýšená po podaní melphalanu a kontrolného ľudského lgG1 v porovnaní s jeho hladinou pred podaním, zatiaľ čo podanie pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky inhibuje toto zvýšenie hladiny ľudského IgG v sére.

Obrázok 40 je graf ukazujúci, že podanie pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky myšiam s transplantovanými ľudskými myelómovými bunkami spôsobí v porovnaní s podaním melphalanu kontrolného ľudského lgG1 predĺženie obdobia prežitia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Ďalej bude predkladaný vynález vysvetlený na špecifických príkladoch.

Príklad 1. Klonovanie cDNA kódujúcej V oblasť myšacej anti-HM 1.24 protilátky

1. Izolácia mediátorovej RNA (mRNA)

Mediátorová RNA bola izolovaná s použitím súpravy Fast Track mRNA Isolation Kit Version 3.2 (vyrobená Invitrogen) podľa priloženého návodu z 2 x 10* hybridómových buniek (FERM BP-5233), ktoré produkujú myšacie anti-HM 1.24 protilátky.

2. Amplifikácia génu kódujúceho variabilnú oblasť protilátky PCR metódou PCR bola uskutočnená na termocykléri firmy Perkin Elmer Cetus.

2-1. Amplifikácia a fragmentácia génu kódujúceho V oblasť myšacieho reťazca

Podľa takto izolovanej RNA bola syntetizovaná cDNA za použitie súpravy AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (výrobca Life Science) a použitá pre PCR. Ako primery pre PCR boli použité MKV (Mouse Kappa Variable) primery (Jones, S. T. a kol., Bio-Technology, 9, 88-89, (1991)), ktoré sú uvedené v SEQ ID NO: 29 až 39 a ktoré hybridizujú s leader sekvenciou myšieho kappa typu L reťazca.

100 μΙ roztoku PCR, obsahujúci 10mM Tris-HCI (pH 8,3), 50mM KCI, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dTTP), 1,5 mM MgCI₂ , 5 jednotiek DNA polymerázy Ampli Taq (vyrobené Perkin Elmer Cetus), 0,25 mM primery MKV, uvedené v SEQ ID NO: 29 až 39, 3 mM primer MKV, uvedený v SEQ ID NO: 40 a 100 ng jednoreťazcovej cDNA bolo prevrstvené 50 μΙ minerálneho oleja, potom zahriate na začiatočnú teplotu 94°C na 3 minúy, potom na 94°C na 1 minútu, na 55 °C na 1 minútu a na 72 °C na 1 minútu, v uvedenom poradí. Po opakovaní tohto cyklu tridsaťkrát, bola reagujúca zmes inkubované pri 72 °C na 10 minút. Amplifikovaný DNA fragment bol vyčistený v nízkotajúcej agaróze (vyrobil Sigma) a štiepaný Xmai (vyrobil New England Biolabs) a Sali (vyrobil Takara Shuzo) pri 37 °C.

2-1. Amplifikácia a fragmetácia cDNA kódujúca V oblasť myšacieho H reťazca Gén kódujúci V oblasť myšacieho H reťazca bol amplifikovaný metodou

5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends; Frohman, M. A. a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, (1988), Edwards, J. B. D. M. a kol., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232, (1991)). Potom ako bola syntetizovaná pomocou primeru P1 (SEQ ID NO: 41), ktorý hybridizuje špecificky s konštantnou oblasťou myšacieho lgG2, cDNA kódujúca V oblasť myšacieho H reťazca bola amplifikovaná pomocou súpravy 5*-Ampii FINDER RAČE KIT (vyrobené CLONTECH) s použitím primeru MHC2a (SEQ ID NO: 77), ktorý je súčasťou súpravy. Amplifikovaný DNA fragment bol vyčistený v agaróze s nízkou teplotou topenia (vyrobené Sigma) aštiepený EcoRI (vyrobené Takara Shuzo New Angland Biolabs) a Xmal (vyrobené Shuzo New England Biolabs) pri 37°C.

3. Spojenie a tranformácia

DNA fragment obsahujúci gel kódujúci V oblasť myšacieho H raťazca typu Kappa, pripravený vyššie uvedeným spôsobom, bol ligovaný do vektora pUC19 (pripraveného štiepením Sali a Xmal) v reakčnej zmesi obsahujúcej 50mM Tris-Hci (pH 7,6), 10 mM MgCfe, 10 mM dithiothreoil, 1mM ATP, 50 mg/ml polyetylénglykolu (8000) a jednu jednotku t4 DNA ligázy (vyrobené GIBCO-BRL) pri teplote 16°C po dobu 2,5 hodiny. Podobne bol pripravený a ligovaný do vektora pUC19 (pripraveného štiepením EcoRI a Xmal) pri teplote 16°C po dobu 3 hodín.

Potom bolo 10 μΙ vyššie uvedenej ligačnej zmesi pridané k 50 50 μΙ kompetentných buniek Escherichia coli DH5a, ponechané na ľade 30 minút, na 42°C jednu minútu a znovu jednu minútu na ľade. Po pridaní 400 μΙ média 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratotry Press, (1989)) boli bunky inkubované pri 37°C jednu hodinu a potom boli E. coli vysiate na agar s 2xYT médiom (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), obsahujúce 50 pg/ml ampicilínu a inkubované cez noc pri 37°C, aby boli získané tranformanty E. coli.

Transformanty boli pestované cez noc pri 37°C v 10 ml média 2xYT obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu a z tejto kultúry bola alkalickou metódou pripravená plazmidová DNA (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

Takto získaný plazmid, obsahujúci gén kódujúci V oblasť myšacieho L reťazca typu kappa, odvodený zhybridómu, ktorý produkuje anti-HM 1.24 protilátku, bol nazvaný pUCHMVL9. Plazmid, získaný vyššie uvedeným postupom a obsahujúci gén kódujúci V oblasť myšacieho H reťazca, odvodený z hybridómu, ktorý produkuje anti-HM 1.24 protilátku, bol nazvaný pUCHMVHR16.

Príklad 2. Určenia sekvencie báz DNA

Sekvencia báz cDNA kódujúcej oblasti vo vyššie uvedenom plazmide bola určená použitím automatického DNA sekvenátora (vyrobené Applied Biosystem Inc.) a súpravy Taq Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequening Kit (vyrobené Applied Biosystem Inc.) postupom, ktorý uvádza výrobca.

Sekvencia báz génu kódujúceho V oblasť L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky obsiahnutá v plazmide pUCHMVL9 je uvedená v SEQ ID NO: 1. Sekvencia báz génu kódujúceho V oblasť L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky obsiahnutá v plazmide pUCHMVHR16 je uvedená v SEQ ID NO: 2.

Príklad 3. Určenie CDR

Základné štruktúry V oblastí L reťazca a H reťazca sa navzájom podobajú, keď štyri podporné časti sú spojené troma hypervariabilnými oblasťami, t.j. oblasťami určujúcimi komplementaritu (complementarity determining región - CDR). Aminokyselinové sekvencie podpornej oblasti sú relatívne dosť stále, ale variabilita v aminokyselinovej oblasti je extrémne vysoká (Kabat, E. A. a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interesť, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Na základe týchto skutočností bola aminokyselinová sekvencia variabilnej oblasti anti-HM 1.24 protilátky porovnaná s aminokyselinovými sekvenciami protilátok v databáze, aby bola zistená homológia a bola tak určená oblasť CDR, ako je uvedená v Tabuľke 5.

Tabuľka 5

Plazmid	Sekvencia No.	CDR(l)	CDR(2)	CDR(3)
PUCHMVL9	3 až 5	24 až 34	50 až 56	89 až 97
PUCHMVHR16	6 až 8	31 až 35	50 až 66	99 až 100

Príklad 4. Potvrdenie expresie klonovanej cDNA (konštrukcia chimémej anti-HM

1.24 protilátky)

1. Konštrukcia expresného vektora

Aby bolo možné skonštruovať expresný vektor, ktorý exprímuje chimému antiHM 1.24 protilátku, cDNA klonov pUCHMVL9 a pUCHMVHR16, kódujúce V oblasti L reťazca a H reťazca anti-HM 1.24 protilátky, boli modifikované PCR metódou a potom vnesené do expresného hef vektora (International Application Publication No. WO 92-19759).

Spätný primár ONS-L722S (SEQ ID NO: 43) pre V oblasť L reťazca a spätný primár VHR16S (SEQ ID NO: 44) pre V oblasť H reťazca boli navrhnuté tak, aby hybridizovali s DNA kódujúcou začiatok leader sekvencie príslušnej V oblasti a obsahujú Kozákovu konvenčnú sekvenciu (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol., 196,947950,(1987)) a rozoznávacie miesto pre reštrikčný enzým HindlII. Priamy primer VL9A (SEQ ID NO: 45) pre V oblasť L reťazca a priamy primer VHR16A (SEQ ID NO: 46) pre V oblasť H reťazca boli navrhnuté tak, aby hybridizovali s DNA kódujúcou koniec J oblasti a obsahujú donorovú sekvenciu pre zostrih a rozoznávacie miesti pre reštrikčný enzým BamHI.

100 μΙ PCR reakčnej zmesi, obsahujúcej 10mM Tris-HCl (pH 8,3), 50mM KCI, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1,5 mM MgCI₂, 100 pM každého primeru, 100 ng matricovej DNA (pUCHMVĽ9 alebo pUCHMVHR16) a 5 jednotiek enzýmu Ampli Taq bolo prevrstvené 50 μΙ minerálneho oleja, a po začiatočnej denaturácii pri 94°C, zahriate na 94 °C na 1 minútu, na 55⁰ C na 1 minútu, na 72 °C na 1 minútu a po opakovaní tohto cyklu tridsaťkrát bola reakčná zmes inkubovaná pri 72 °C po dobu 10 minút

PCR produkt bol vyčistený v 1,5% agarózovom gele s nízkou teplotou topenia a štiepaný HindlII a BamHI, potom bol klonovaný do HEF-VL-gK pre V oblasť L reťazca a do HEF-VH-gy1 v prípade V oblasti H reťazca. Po určení DNA sekvencie boli plazmidy, ktoré obsahujú DNA fragment so správnou DNA sekvenciou označené HEF-1.24L-g_K, príp. HEF-1.24H-gy1.

Oblasti kódujúce príslušné variabilné oblasti boli z vyššie uvedených plazmidov vyštiepené reštrikčnými enzýmami HindlII a BamHI a boli tak vytvorené reštrikčné fragmenty, ktoré boli vložené do HindlII alebo do BamHI miesta plazmidového vektora pUC19 a boli označené pUC19-1.24L-gK, príp. pUC19-1.24H-gy1.

Bunky Escherichia coli, obsahujúce príslušné plazmidy pUC19-1.24L-gic a pUC19-1.24H-gy1 boli označené Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1) a boli 29. Augusta 1996 uložené pre medzinárodné použitie v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod prístupovými číslami FERM BP-5646, príp. FERM BP-5644, pri dodržaní ustanovení Budapeštianskej zmluvy.

2. Tranformácia buniek COS-7

Aby mohla byť pozorovaná prechodná expresia chimérnych anti-HM 1.24 protilátok, boli vyššie uvedené expresné vektory testované na bunkách COS-7 (ATCC CRL-1651). HEF-1.24L-gx a HEF-1.24H-gy1 boli spoločne transformované do buniek COS-7 elektroporáciou pomocou prístroja Gene Pulser (vyrobené Bio Rad). Každá DNA (10 pg) bola pridaná k 0,8 ml PBS, obsahujúceho 1 x 10⁷buniek/ml a podrobené pulzom 1500 V s kapacitou 25 pF.

Po zotavovacej perióde 10 minút pri teplote miestnosti boli elektroporované bunky pridané do 30 ml kultivačného média DMEM (vyrobené GIBCO), obsahujúceho 10% fetálneho séra bez γ-globulínu. Po inkubácii 72 hodín v CO2 inkubátore BNA120D (vyrobené TABAI) bol supematant z kultúr odobraný, zvyšky buniek boli odstráneneé centrifugáciou a použité pre nasledujúce pokusy.

3. FCM analýza

Schopnosť chimérnych anti-HM 1.24 protilátok viazať antigén bola skúmaná prietokovou cytometriou (FCM - flow cytometry) pri použití buniek KPMM2. Po premytí 4,7 x 10^s buniek KPMM2 (Japan Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475) v PBS(-) bolo k nim pridané 50 pl kultúry COS-7 buniek, ktoré produkujú vyššie uvedené chiméme anti-HM 1.24 protilátky a 50 pl pufru FACS (PBS(-) obsahujúceho 2% hovädzieho fetálneho séra a 0,1% azid sodný), alebo 5 pl purifikovaných myšacích anti-HM 1.24 protilátok s koncentráciou 500 pg/ml a 95 pl pufru FACS a inkubované na ľade po dobu 1 hodiny.

Ako kontrola bolo použité 50 pl 2 pg/ml chimérnej SK2 (International Application Publication No. WO 94-28159) a 50 pl pufru FACS, alebo 5 pl 500 pg/ml purifikovaného myšacieho lgG2ax (UPC10) (vyrobené CAPPEL) namiesto purifikovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátky a 95 pl pufru FACS a podobne inkubované. Po premytí pufrom FACS bolo pridané 100 pl 25 pg/ml kozej protiľúdskej protilátky (GAH), konjugovanej s FITC(vyrobené CAPPEL) alebo 10 pg/ml kozej protimyšacaj protilátky (GAM), konjugovanej s FITC (vyrobené Becton Dickinson) a inkubované na ľade po dobu 30 minút. Po premytí pufrom FACS bolo suspendované v 1 ml pufru FACS a intenzita fluorescencie každej bunky bola meraná prístrojom FACSan (varobené Becton Dickinson).

Ako je uvedené na Obr. 1, bolo zistené, že chiméme anti-HM 1.24 protilátky sa viažu k bunkám KPMM2, pretože vrchol intenzity fluorescencie sa posunul v systéme doprava, kde boli k bunkám pridané myšacie anti-HM 1.24 protilátky v porovnaní s kontrolou, podobne ako v prípade, keď boli pridané myšacie anti-HM

1.24 protilátky. To potvrdilo, že kionovaná cDNA kóduje variabilnú oblasť myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

Príklad 5. Príprava bunkovej línie CHO, ktorá stabilne produkuje chimérnu anti-HM

1.24 protilátku

1. Konštrukcia expresného venktoru pre chimérne H reťazec

Po štiepení vyššie uvedeného plazmidu a HEF-1.24H-gy1 reštrikčnými enzýmami Pvul a BamHI bol fragment dlhý 2,8 kbp, obsahujúci EF1 promótor a DNA kódujúcu V oblasť H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky vyčistený na 1,5% agarózovom géle s nízkou teplotou topenia. Potom bol vyššie uvedený fragment vložený do 6 kbp fragmentu, pripraveného štiepením expresného vektora použitého pre ľúdský H reťazec, DHFR-AE-Rvh-PM1f (viď International Application Publication No. WO 92/19759), obsahujúceho DHFR gén a gén kódujúci konštantnú oblasť ľudského H reťazca, reštrikčné enzýmy Pvul a BamHI, a bol skonštruovaný tak expresný vektor DHFR-AE-HEF-1.24H-gy1 pre H reťazec chimémej anti-HM 1.24 protilátky.

2. Vnesenie génu do buniek CHO

Aby bol pre chimérnu anti-HM 1.24 protilátku vytvorený stabilný produkčný systém, boli gény vyššie uvedených expresných vektorov HEF-1.24H-gy1 a DHFRAE-HEF-1.24H-gy1, ktoré boli linearizované štiepením Pvul, súčasne vnesené elektroporačnou metódou do buniek CHO DXB11 (venované z Medical Research Council Collaboration Center) pri podmienkach podobných vyššie uvedeným (vyššie uvedená trasfekcia buniek COS-7).

3. Génová amplifikácia MTX

Medzi CHO bunkami s vnesenými génmi môžu prežiť v beznukleozidovom aMEM kultivačnom roztoku (vyrobené GIBCO-BRL), ku ktorému bolo pridané 500 pg/ml G418 (výrobca GIBCO-BRL) a 10% hovädzieho fekálneho séra, len tie bunky, do ktorých boli súčasne vnesené oba expresné vektory, ako pre L reťazec, tak i pre H reťazec, atak je možné selektovať. Potom nasledovalo pridanie 10 nm MTX (vyrobené Sigma) k vyššie uvedenému kultivačnému roztoku. Spomedzi klonov, ktoré sa rozmnožili, boli vybrané také, ktoré produkovali chimému anti-HM 1.24 protilátku vo veľkom množstve. Výsledkom boli klony #8 až #13, ktoré vykazovali účinnosť produkcie chimerickej protilátky asi 20pg/ml a boli označené ako bunkové línie, produkujúce chiméme anti-HM 1.24 protilátky.

Príklad 6. Konštrukcia chimémej anti-HM 1.24 protilátky

Chimérna anti-HM 1.24 protilátka bola skonštruovaná nasledujúcim spôsobom. Vyššie uvedené bunky CHO, produkujúce chiméme anti-HM 1.24 protilátku boli nepretržite kultivované 30 dní pri použití Dulbeccovho média modifikovaného podľa Iscoveho (vyrobené GIBCO-BRL), obsahujúceho 5% bezgamaglobulínové sérum novonarodených teliat (vyrobené GIBCO-BRL) v zariadení pre kultiváciu buniek do vysokej hustoty Verax systém 20 (vyrobené CELLEX BIOSCIENCE Inc.).

V dňoch 13,20,23,26 a 30 po založení kultúry bol kultivačný roztok odobraný pomocou tlakovej filtračnej jednotky SARTOBRAN (vyrobené Sartoríus) a otom bola chiméma anti-HM 1.24 protilátka čistená afinitnou metódou pomocou veľkoobjemového stĺpca zberného systému Afi-Prep System (vyrobené Nippon Gaishi) a stĺpce Super proteín A (objem náplne: 100 ml, vyrobené Nippon Gaishi) s použitím PBS ako absorpčného a premývacieho pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 3) ako elučného pufru podľa priloženého návodu. U eluovaných frakcií bolo pH okamžite upravené na pH 7,4 pridaním 1 M Tris-HCI (pH 8,0). Koncentrácia protilátok meraná absorbanciou pri 280 nm a vypočítaná za predpokladu, že 1,35 OD zodpovedá 1 gg/ml.

Príklad 7. Zisťovanie aktivity chimémej anti-HM 1.24 protilátky

Chiméma anti-HM 1.24 protilátka bola hodnotená nasledujúcimi testami väzbovej inhibičnej aktivity.

1. Meranie väzbovej inhibičnej aktivity

1-1. Konštrukcia biotinylovanej anti-HM 1.24 protilátky

Po nariadení myšacej anti-Hm 1.24 protilátky v 0,1 M hydrouhličitanovom pufri na koncentráciu 4 mg/ml boli pridané 4 μΙ 50 mg/ml biotín-N-hydroxy-sukcfnimidu (vyrobené EY LABS Inc.) a ponechané reagovať 3 hodiny pri teplote miestnosti. Potom bolo pridané 1,5 ml 0,2 M glycínového roztoku, inkubované pri teplote miestnosti po dobu 30 minút, aby došlo k zastaveniu reakcie a potom boli odobrané frakcie biotinylovaného IgG pri použití stĺpca PD-10 (vyrobené Pharmacia Biotech).

1-2. Merania väzbovej inhibičnej aktivity

Väzbová inhibičná aktivita biotinylovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátky bola meraná bunkovým” ELISA testom pri použití línie ľudských amniotických buniek WISH (ATCC CCL 25). Doštičky pre bunkový” ELISA test boli pripravené nasledujúcim postupom. Bunky WISH, pripravené v koncentrácii 4 x 10⁵ buniek/ml v médiu PRM11640, doplnenom 10% hovädzieho fetálneho séra, boli pridané do 96 jamkovej doštičky, inkubované cez noc a po dvojitom premytí PBS(-) boli fixované 0,1% glutaraldehydom (vyrobené Nakalai tesque).

Po blokovaní je ku každej jamke pridané 50 μΙ sériových riedení chimémej anti-HM 1.24 protilátky alebo myšacej anti-HM 1.24 protilátky, získanej afinitnou purifikáciou, a súčasne 50 μΙ 2 ug/ml biotinylovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátky, inkubované 2 hodiny pri teplota miestnosti a potom je pridaný streptavidin, označený peroxidázou (vyrobené DÁKO). Po inkubácii 1 hodinu pri teplote miestnosti nasledovalo premytie a bol pridaný roztok substrátu. Po zastavení reakcie pridaním 50 μΙ 6 N kyseliny sírovej je meraná absorbancia pri 490 nm na MICRIPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad).

Výsledok uvedený na Obr. 2 ukázal, že chiméma anti-HM 1.24 protilátka má k biotinylovanej myšacej anti-HM 1.24 protilátke totožnú väzbovú inhibičnú aktivitu ako myšacia anti-HM 1.24 protilátka. To znamená, že chiméma protilátka má tú istú V oblasť ako myšacia anti-HM 1.24 protilátka.

Príklad 8. Meranie ADCC aktivity chimémej anti-HM 1.24 protilátky

ADCC aktivita (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity - bunková cytotoxicita závislá na protilátkach) bola meraná podľa metódy uverejnenej v Current Protocols of Immunology, kap. 7 Immunoiogické štúdie u ľudí, Editor, John E, Colligan a kol., John Wiley&Sons, Inc., 1993.

1. Príprava efektorových buniek

Monocyty boli oddelené z periférnej krvi alebo kostnej drene zdravých ľudských jedincov a pacientov s mnohopočetným myelómom pomocou metódy hustotovej centrifugácie. Kperifíémej krvi alebo kostnej dreni zdravých ľudských jedincov a pacientov s mnohopočetným myelómom bolo vtedy pridané také isté

PBS(-), zmes bola navrstvená na Ficoll (vyrobené Pharmacia)-Conrey (vyrobené Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd.)(špecifická hustota 1,077) a centrifugované pri 400 g po dobu 30 minút. Vrstva monocytov bola odobraná, dvakrát premytá médiom RPMI 1640 (vyrobené Sigma), doplneným 10 % fetálneho hovädzieho séra (vyrobené Witaker) a ich koncentrácia upravená na 5 x 10® buniek/ml vtom istom kultivačnom médiu.

2. Príprava cieľových buniek

Bunky ľudskej myelómovej línie RPMI 8226 (ATCC CCL 155) boli rádioaktívne označené inkubáciou v médiu RPMI 1640 (vyrobené Witaker) a 0,1 mCi⁵¹Crchrómanu sodného pri 37 °C po dobu 60 minút. Po rádioaktívnom označení boli bunky trikrát premyté Hanksovým balancovaným soľným roztokom (HBSS) a upravené na koncentráciu 2 x 10⁵ buniek/ml.

3. Test ADCC

Do jednotlivých jamiek 96 jamkovej doštičky (dno v tvare U - vyrobil Corning) bolo pridané 50 μΙ 2 x 10⁵ cieľových buniek/ml, 1 pg/ml afinitne purifikovanej chimérnej anti-HM 1.24 protilátky a myšacej anti-HM 1.24 protilátky, alebo kontrolného ľudského IgG (vyrobené Serotec) a ponechané reagovať pri 4°C po dobu 15 minút.

Potom bolo pridané 100 μΙ 5 x 10® efektorových buniek/ml tak, aby bol pomer (E:T) efektorových buniek (E) k cieľovým bunkám (0:1, 5:1, 20:1 alebo 50:1 a kultivované v CO₂ inkubátore 4 hodiny.

Bolo odobrané 100 μΙ supernatantu a rádioaktivita uvoľhaná do supematantu kultúry bola zisťovaná na merači žiarenia gama (AR361, vyrobené Aloka). Po zmeraní maximálnej rádioaktivity bol použitý 1% NP-40 (vyrobené BRL). Cytotoxicita (v %) bola vypočítaná ako /A-C)/(B-C) x 100, kde A je rádioaktivita (cpm), uvoľnená v prítomnosti protilátky, B je rádioaktivita (cpm), uvoľhená v prítomnosti NP-40 a C je rádioaktivita (cpm), uvoľhená v samotnom kultivačnom roztoku bez protilátky.

Ako je ukázané na Obr. 3, keď bola pridaná chimérna anti-HM 1.24 protilátka, v porovnaní s kontrolným lgG1 sa cytotoxicita zvyšovala s rastúcim pomerom E:T, čo znamená, že táto chimérna anti-HM 1.24 protilátka má ADCC aktivitu. Pretože cytotoxicita nebola pozorovaná ani po pridaní myšacej anti-HM 1.24 protilátky, ukázalo sa teda, že keď efektorová bunka je ľudského pôvodu, je po získaní ADCC aktivity potrebná Fc časť ľúdskej protilátky.

Príklad 9. Konštrukcia pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

1. Navrhnutie V oblasti pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

Aby bolo možné skonštruovať pozmenenú ľudskú protilátku, v ktorej by

CDR z myšacej monoklonálnej protilátky bola vnesená do ľudskej protilátky, je žiadúce, aby existovala vysoká homológia medzi FR myšacej protilátky a FR ľudskej protilátky. Tak boli V oblasti L reťazcov a H reťazcov myšacej anti-HM 1.24 protilátky pomocou Protein Data Bank porovnané s V oblasťami všetkých známych protilátok, ktorých štruktúra bola objasňovaná.

V oblasť L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky je najviac podobná konvenčnej sekvencií podskupiny IV (HSGIV) V oblasti L reťazca ľudskej protilátky, pričom homológia je 66,4%. Na druhej strane vykazuje 56,9% homológiu s HSGI, 55,8% homológiu s HSGII a 61,5% hopmológiu s HSGIII.

Ak je V oblasť L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky porovnaná s V oblasťou L reťazca známych ľudských protilátok, vykazuje 67,0% homológiu s V oblasťou L reťazca ľudskej protilátky REI, jednej z I podskupiny V oblastí L reťazca ľudskej protilátky. Preto bola FR z REI použitá ako východiskový materiál pre konštrukciu V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

Bola navrhnutá verzia a V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky. V tejto verzii bola FR ľudskej protilátky vytvorená totožné s FR oblasťou odvodenou z REI, ktorá je prítomná v pozmenenej ľudskej CAMPATH-1H protilátke (viď Riechmann, L. a kol., Náture 322, 21-25, (1988), FR obsiahnutá vo verzii a V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej PM-1 protilátky popísanej v International Application Publication No. WO 92-19759) a myšacia CDR vytvorená zhodne s CDR vo V oblasti L reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

V oblasť H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky je najviac podobná konvenčnej sekvencií HSGI V oblasti H reťazca ľudskej protilátky shomológiou 54,7%. Na druhej strane vykazuje 34,6% homológiu s HSGII a 48,1% homológiu s HSGIII. Ak je V oblasť H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky porovnaná s V oblasťou H reťazca známych ľudských protilátok, FR 1 až FR3 boli najviac podobné V oblasti H reťazca ľudskej protilátky HG3, jednej z podskupiny V oblastí ľudského H reťazca (Rechavi, G. a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855.859), pričom homológia je 67,3%.

Preto bola FR ľudskej protilátky HG3 použitá ako výhodiskový materiálpre konštrukciu V oblastí H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky. Avšak, pretože aminokyselinová sekvencia FR4 iudskej protilátky HG3 nebola popísaná, bola použitá aminokyselinová sekvencia FR4 z ľudskej protilátky JH6 (Ravetch, j. V. a kol., Celí, 27, 583-591), ktorá vykazuje najvyššiu homológiu s FR4 H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky. FR4 zJH6 má okrem jednej aminokyseliny sekvenciu zhodnú s FR4 z H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

V prvej verzii a V oblasti reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky boli FR1 až FR3 vytvorené zhodne s FR1 až FR3 z ľudskej protilátky HG3 a CDR bola vytvorená zhodne s CDR V oblasti H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky okrem toho, že aminokyseliny v pozícii 30 v ľudskej FR1 a v pozícii 71 v ľudskej FR3 boli zhodné s aminokyselinami myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

2. Konštrukcia V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

L reťazec pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bol skonštruovaný vnesením CDR oblasti pomocou PCR metódy. Postup je znázornený na Obr. 4. Pri konštrukcii pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky (verzia a), ktorá má FR odvodenú z ľudskej protilátky REI, bolo použitých osem primerov. Vonkajšie primery A (SEQ ID NO: 47) a H (SEQ ID NO: 48) boli navrhnuté tak, aby hybridizovali s DNA sekvenciou expresného vektora HAF-VL-gx.

Primery ĽIS (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) a L3S (SEQ ID NO: 51) majú negatívnu DNA sekvenciu. Primery L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53), L3A (SEQ ID NO: 54) majú pozitívnu DNA sekvenciu, pričom každý majú komplementárnu DNA sekvenciu (20 až 30 bázových párov( k DNA na 5-konci primerov L1S, L2S a L3S.

V prvom stupni PCR boli uskutočnené 4 PCR A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A a L3S-H a každý PCR produkt bol vyčistený. Štyrom PCR produktom z prvých PCR bolo umožnené vzájomné zostavenie na základe ich vlastnej komplentarite (viď International Application Publication No. WO 92-19759). Pre vyššie uvedené PCR môže byť ako matrica použité plazmid HEF-RVL-M21a (viď International Application Publication No. WO 95-14041), kódujúci verziu a V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej ONS-M21 protilátky, založenej na FR odvodenej z ľudskej protilátky REI.

V prvom stupni PCR bola použitá PCR zmes, obsahujúca 10 mM Tris- HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1,5 mM MgCI₂, 100 ng matricové DNA, 100 pM každého primeru a 5 jednotiek Ampli Taq. Každá reakcia bola prevrstvená 50 μί minerálneho oleja. Po začiatočnej denaturácii zahriatím na teplotu 94°C, bol uskutočnený reakčný cyklus 94°C 1 minútu, 55°C 1 minútu a 72°C minútu, potom bola reakčná zmes inkubovaná pri 72°C po dobu 10 minút.

PCR produkty A-L1A (215 bázových párov), L1S-L2A (98 bázových párov), L2S-L3A (140 bázových párov) a L3S-H (98 bázových párov) boli vyčistené s použitím 1,5% gélu z agarózy s nízkou teplotou topenia boli zostavené v priebehu

2. PCR. V druhej PCR bolo 98 μί PCR zmesi obsahujúcej 1 μς každého produktu z 1. reakcie a 5 jednotiek Ampli Taq inkubované v dvoch cykloch 94°C 2 minúty, 55°C minúty a 72°C 2 minúty, potom bolo pridané 100 pM každého vonkajšieho primeru (A a H). PCR reakcia bola prevstvená 50 μί minerálneho oleja a uskutočnených 30 cyklov pri podmienkach uvedených vyššie.

Fragment dlhý 515 bázových párov, ktorý je výsledkom druje PCR bol vyčistený s použitím 1,5% gélu z agarózy s nízkou teplotou topenia, štiepaný BamHI a Hindlll, a takto získané DNA fragmenty boli klonované do oblasti HEF expresného vektora HEF-VL-gic. Po určení DNA sekvencie bol plazmid, obsahujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky označený ako HEF-RVLa-AHM-gic. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti L reťazca, obsiahnuté v tomnto plazmide HEF-RVLa-AHMgx, sú uvedené v SEQ ID NO: 9.

Verzia b V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola konštruovaná mutagenézou pomocou PCR. Mutagénne primery FTY-1 (SEQ ID NO: 55) a FTY-2 (SEQ ID NO: 56) boli navrhnuté tak, aby mutovali fenylalanín v pozícii 71 natyrozín.

Po amplifikácii vyššie uvedených primerov s použitím plazmidu HEF-RVLaAHM-gx ako matrice bol získaný produkt vyčistený a štiepený BamHI a Hindlll. Získané DNA fragmenty boli klonované do HEF expresného vektora HEF-VL-gK, a získaný tak plazmid HEF-RVLb-AHM-gx. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti L reťazca, obsaiahnuté v tomto plazmide HEF-RVLb-AHM-gic, sú uvedené v SEQ ID NO: 10.

3. Konštrukcia V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

1.24 protilátky

DNA kódujúca V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky môže byť navrhnutá nasledujúcim spôsobom. Pripojením DNA sekvencie kódujúcej FR1 až FR3 z ľudskej protilátky HG3 a FR4 z ľudskej protilátky JH6 k DNA sekvencii kódujúcej CDR z V oblasti H reťazca myšacej anti-HM 1.24 protilátky, bola navrhnutá zodpovedajúco dlhá DNA, kódujúca V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky.

Potom bolo na 5* koniec pripojené cieľové miesto pre Hindlll/Kozakova konvenčná sekvencia, na 3'koniec bolo pripojené cieľové miesto pre BamHl/donorová sekvencia pre zostrih tak, aby bolo umožnené pripojenie do HEF expresného vektora.

Takto usporiadaná DNA sekvencia bola rozdelená do štyroch oligonukleotidov. Potom boli oligonukleotidy, ktoré by potenciálne mohli brániť zostaveniu týchto oligonukleotidov, podrobené počítačovej analýze sekundárnych štruktúr. Sekvencie štyroch oligonukleotidov RVH1 až RVH4 sú uvedené v SEQ ID NO: 57 až SEQ ID NO: 60. Tieto oligonukleotidy majú dĺžku 119 až 144 báz a obsahujú 25 až 26 bázových párov dlhej prekrývajúcej sa oblasti. Z týchto oligonukleotidov majú RVH2 (SEQ ID NO: 58) a RV4 (SEQ ID N0:60) negatívnu DNA sekvenciu, zatiaľčo RVH1 (SEQ ID NO: 57) a RVH3 (SEQ ID NO: 59) majú pozitívnu DNA sekvenciu. Postup pre zostavenie týchto štaroch oligonukleotidov pomocou metódy PCR je ukázaný na obrázku (viď Obr. 5).

PCR zmes (98 μΙ) obsahujúca 100 ng každého zo štaroch nukleotidov a 5 jednotiek Ampli Taq bola najprv denaturovaná zahriatím na teplotu 94°C 2 minúty a potom boli uskutočnené dva cykly inkubácie, obsahujúce 55°C 2 minúty a 72°C 2 minúty. Potom bolo pridané 100 pM každého externého primeru RHP1 (SEQ ID NO: 61) a RHP2 (SEQ ID NO: 62) a reakcia bola prevrstvená 50 μΙ minerálneho oleja. Po začiatočnej denaturácii 94°C 1 minútu bolo uskutočnených 38 cyklov 94°C 1 minútu, 55°C 1 minútu a 72°C 1 minútu a na záver bola reakcia inkubovaná 10 minút pri 72°C.

Amplifikovaný, 438 bázových párov dlhý DNA fragment bol vyčistený na 1,5% agaróze s nízkou teplotou topenia, štiepený Hindlll a BamHI a potom klonovaný do HEF expresného vektora HEF-VH-gy1. Po určení sekvencie báz bol plazmid, ktorý obsahuje DNA fragment, kódujúci aminokyselinovú sekvenciu správnej V oblasti H reťazca označený ako HEF-RVHa-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHa-AHMgy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 11.

Jednotlivé verzie b, c, d a e V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky sú konštruované nasledovne.

S použitím mutačných primerov BS (SEQ ID NO: 63) a BA (SEQ ID NO: 64) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 66 na lyzín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia b amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHb-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHb-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 12.

S použitím mutačných primárov CS (sekvencie 65) a CA (SEQ ID NO: 66) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 73 na lyzín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia c amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHc-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHc-AHM-gyl, sú uvedené v SEQ ID NO: 13.

S použitím mutačných primerov DS (SEQ ID NO: 67) a DA (SEQ ID NO: 68) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 66 na lyzín, a threonín v polohe 73 na lyzín, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia d amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHd-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHd-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 14.

S použitím mutačných primerov ES (SEQ ID NO: 69) a EA (SEQ ID NO: 70) navrhnutých tak, aby mutovali valín v polohe 67 na alanín a methionín v polohe 69 na leucín, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia e amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHe-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHe-AHM-g_Y1, sú uvedené v SEQ ID NO: 15.

3-2. Konštrukcia H reťazca hybridnej V oblasti

Boli koštruované dva H reťazce hybridnej V oblasti. Jeden je hybridná anti-HM

1.24 protilátka myš/človek, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 aFR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, zatiaľ čo druhý je hybridná anti-HM 1.24 protilátka človek/myš, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM 1.24 protilátky. Aminokyselinové sekvencie CDR oblastí sú celé odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

Dva H reťazce hybridných V oblastí boli skonštruované pomocou metódy PCR. Metóda je schematicky ukázaná na Obr. 6 a Obr. 7. Pre konštrukciu dvoch H reťazcov hybridných V oblastí môžu byť použité štyri primery. Vonkajšie primery a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) boli navrhnuté tak, aby hybridizovaii s DNA sekvenciou HEF expresného vektora HEF-VH-gy1. Konštrukčný primer HYS (SEQ ID NO: 73) hybridného H reťazca je navrhnutý tak, že má negatívnu DNA sekvenciu a hybridný primer HYA (SEQ ID NO: 74) H reťazca má pozitívnu DNA sekvenciu tak, že obe DNA sú navzájom komplementárne.

Pre konštrukciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola v prvom stupni PCR použitá PCR metóda s plazmidom HEF-1.24H-gy1 ako matricou, vonkajší primer a, a hybridný primer HYA H reťazca, a ďalej potom PCR metóda, používajúca ako matricu plazmid HEF-RVHaAHM-gy1, hybridný primer HYS H reťazca (SEQ ID NO: 73) a vonkajší primer h (SEQ ID NO: 72), a produkty oboch PCR reakcií boli vyčistené. Dva produkty z PCR reakcií prvého stupňa boli ponechané zostaviť sa na základe vzájomnej komplementarity (viď International Application Publication No. WO 92-19759).

Potom bola po pridaní vonkajších primerov a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) v PCR reakcii druhého stupňa amplifikovaná DNA s úplnou dĺžkou, kódujúca H reťazec hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 sú z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

Pre konštrukciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM

1.24 protilátky bola v prvom stupni PCR použitá PCR metóda s plazmidom HEFRVHa-AHM-gy1 ako matricou, vonkajší primér a, a hybridný primér HYA H reťazca, a ďalej potom PCR metóda, používajúca ako matricu plazmid HEF-1.24H-gy1, hybridný primér HYS H reťazca a vonkajší primér h, a produkty oboch PCR reakciou boli vyčistené. Dva produkty z PCR reakcií prvého stupňa boli ponechané zostaviť sa na základe vzájomnej komplementarity (viď International Application Publication No. WO 92-19759).

Potom bola po pridaní vonkajších primerov a a h v PCR reakcii druhého stupňa amplifikovaná DNA s úplnou dĺžkou, kódujúca H reťazec hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM 1.24 protilátky.

PCR reakcia prvého stupňa, čistenie PCR produktov, zostavenie PCR produktov, PCR reakcia druhého stupňa a klonovanie do HEF expresného vektora HEF-VH-gy1 boli uskutočnené podľa postupov uvedených v Príklade 9. Konštrukcie V oblasti L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky”.

Po určení DNA sekvencie bol plazmid, ktorý obsahuje DNA fragment, kódujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky HEF-HM-RVH-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-MH-RVHAHM-gy1 sú uvedené v SEQ ID NO: 75. Tiež plazmid, ktorý obsahuje DNA fragment, kódujúci správnu aminokyselinovú sekvenciu H reťazca hybridnej V oblasti, v ktorej sú aminokyselinové sekvencie FR1 a FR2 odvodené z verzie a V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvencie FR3 a FR4 z myšacej anti-HM 1.24 protilátky bol nazvaný HEF-HM-RVH-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-HM-RVH-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 76.

1.24 protilátky

Každá z verzií f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, r a s V oblasti H reťazca zušľachtenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky je konštruovaná nasledujúcim spôsobom.

S použitím mutačných primerov FS (SEQ ID NO: 78) a FA (SEQ ID NO: 79) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 75 na serín a valín v polohe 78 na alanín, a DNA plazmidu HEF-RVHe-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia f amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHf-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHf-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 16.

S použitím mutačných primerov GS (SEQ ID NO: 80) a GA (SEQ ID NO: 81) navrhnutých tak, aby mutovali alanín v polohe 40 na arginín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia g amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHg-AHM-g/1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHg-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 17.

S použitím mutačných primerov FS (SEQ ID NO: 78) a FA )SEQ ID NO: 79) a DNA plazmidu HEF-RVHb-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia h amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHh-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 18.

S použitím mutačných primerov IS (SEQ ID NO: 82) a IA (SEQ ID NO: 83) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v poloha 83 na alanín a serín v polohe 84 na fenylalanín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia i amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHi-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHi-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 19.

S použitím mutačných primerov JS (SEQ ID NO: 84) a JA (SEQ ID NO: 85) navrhnutých tak, aby mutovali arginín v polohe 66 na lyzín, a DNA plazmidu HEFRVHf-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia j amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHj-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHj-AHM-gyl, sú uvedené v SEQ ID NO: 20.

S použitím mutačných primerov KS (SEQ ID NO: 86) a KA (SEQ ID NO: 87) navrhnutých tak, aby mutovali kyselinu glutámovú v polohe 81 na glutamín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia k amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHk-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHk-AHM-gyl, sú uvedené v SEQ ID NO: 21.

S použitím mutačných primerov LS (SEQ ID NO: 88) a LA (SEQ ID NO: 89) navrhnutých tak, aby mutovali kyslinu glutámovú v polohe 81 na glutamín a serín v polohe 82B na izoleucín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia I amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHI-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHI-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 22.

S použitím mutačných primerov MS (SEQ ID NO: 90) a LA (SEQ ID NO: 91) navrhnutých tak, aby mutovali kyslinu glutámovú v polohe 81 na glutamín, serín v polohe 82b na izoleucín a threonín v polohe 87 na serín, a DNA plazmidu HEFRVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia m amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHm-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHm-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 23.

S použitím mutačných primerov NS (SEQ ID NO: 92) a NA (SEQ ID NO: 93) navrhnutých tak, aby mutovali serín v polohe 82b na izoleucín, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia m amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHn-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHn-AHM-ygl, sú uvedené v SEQ ID NO: 24.

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHo-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 25.

S použitím mutačných primerov PS (SEQ ID NO: 96) a PA (SEQ ID NO: 97) navrhnutých tak, aby mutovali valín v polohe 78 na alanin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia p amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHp-AHM-gYl, sú uvedené v SEQ ID NO: 26.

S použitím mutačných primerov QS (SEQ ID NO: 98) a QA (SEQ ID NO: 99) navrhnutých tak, aby mutovali threonín v polohe 75 na serín, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia q amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHq-AHM-gyl. Amínokyselinová sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHq-AHM-gyl, sú uvedené v SEQ ID NO: 27.

S použitím mutačných primárov CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 ako matrice pre PCR metódu, bola verzia r amplifikovaná a bol získaný plazmid HEF-RVHr-AHM-gyl. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEFRVHr-AHM-gYl, sú uvedené v SEQ ID NO: 28.

Verzia s V oblasťou H reťazca pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky bola konštruovaná mutagenézou pomocou PCR. Mutaóné primery SS (SEQ ID NO: 100) a SA (SEQ ID NO: 101) boli navrhnuté tak, aby mutovali methionín v polohe 69 na izoleucín.

Potom, či vyššie uvedený primer bol amplifikovaný s použitím HEF-RVHr-AHMgyl ako matrica, výsledný produkt bol vyčistený, štiepený BamHI a Hindlll a získaný DNA fragment bol klonovaný do HEF expresného vektora HEF-VH-gy1 a získaný bol plazmid HEF-RVHs-AHM-gy1. Aminokyselinové sekvencia a sekvencia báz

V oblasti H reťazca, obsiahnuté v tomto plazmide HEF-RVHs-AHM-gy1, sú uvedené v SEQ ID NO: 102.

Oblasti kódujúce variabilnú oblasť z vyššie uvedených plazmidov HEF-RVLaAHM-gx a HEF-RVHr-AHM-gy1 boli vyštiepené ako reštrikčné fragmenty reštrikčnými enzýmami Hindlll a BamHI. Boli vložené do Hindlll alebo do BamHI miesta plazmidového vektora pUC19 a získané plazmidy boli označené pUC19RVLa-AHM-gK, príp. pUC19-RVHr-AHM-g_Y1.

Bunky Escherichia coli, obsahujúce príslušné plazmidy pUC19-RVLa-AHM-gic a pUC19-1RVHr-AHM-gy1 boli označené Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHMg<) príp. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1) a boli 9. augusta 1996 uložené pre medzinárodné použitie v National Inštitúte of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome

1-3, Tsukuba City, Ibalaki Prefecture, Japan) pod prístupovými číslami FERM BP5645, príp. FERM BP-5643, pri dodržaní ustanovení Budapeštianskej zmluvy.

Oblasti kódujúce variabilnú oblasť vo vyššie uvedenom plazmide HEF-RVHsAHM-gy1 boli vyštiepené ako reštrikčné fragmenty reštrikčnými enzýmami Hindlll a BamHI. Boli vložené do Hindlll alebo do BamHI miesta plazmidového vektora pUC19 a získaný plazmid bol označený pUC19-RVHs-AHM-gy1.

Bunky Escherichia coli, obsahujúce príslušné plazmidy pUC19-RVHs-AHM-gy1 boli označené Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1) a boli 29. septembra 1997 uložené pre medzinárodné použitie v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki Prefecture, Japan) pod prístupovým číslom FERM BP-6127, pri dodržaní ustanovení Budapeštianskej zmluvy.

4. Konštrukcia pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky, chimémej anti-HM 1.24 protilátky a H reťazca hybridnej protilátky

Aby bolo možné zhodnotiť každý reťazec pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka achimérna anti-HM 1.24 protilátka ako pozitívna kontrolná protilátka boli exprimované. Pri konštrukcii každej z verzií b a ďalších V oblasti H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bol exprimovaný H reťazec hybridnej protilátky, aby bolo možné posúdiť, ktorá aminokyselinová sekvencia v FR by mala byť nahradená. Naviac, bola exprimovaná v kombinácii s chimérnym H reťazcom, aby bolo možné zhodnotiť verziu a L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

4-1. Expresia pozmenenej ľudskej anti-Hm 1.24 protilátky (1)

Desať pg každého z expresných vektorov (HEF-RVHa-AHM-gy1 až HEF-RVHrAHM-gy1) pre H reťazec pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresných vektorov (HEF-RVLa-AHM-gic alebo HEF-RVLb-AHM-gic) pre L reťazec pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bolo spolu transformované do buniek COS-7 elektroporáciou prístroja Gene Pulser (vyrobené Bio Rad). Každá DNA (10 pg) bola pridaná k 0,8 ml alikvótom, obsahujúcim 1 x 10⁷ buniek/ml v PBS a podrobená pulzom 1500 V s kapacitou 25 pF.

Po zotavovacej perióde 10 minút pri teplote miestnosti boli elektroporované bunky pridané do 30 ml kultivačného média DMEM (vyrobené GIBCO), obsahujúceho 10% fetálneho séra bez γ-globulínu. Po inkubácii 72 hodín vCO₂inkubátore BNA120D (vyrobené TABAI) bol supenatant z kultúr odobraný, zvyšky buniek boli odstránené centrifugáciou pri 1000 ot./min po dobu 5 minút v centrifúge 15PR-22 (vyrobené HITACHI) vybavenej rotorom 03 (vyrobené HITACHI), uskutočnená ultrafiltrácia na mikrokoncentrátore (Centricon 100, vyrobené Amicon) pri použití centrifúgy J2-21 (vyrobené BECKMAN) vybavenej rotorom JA-20.1 (vyrobené BECKMAN) a použitý pre bunkový” ELISA test.

Expresia pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky (2)

Desať pg expresného vektoru (HEF-RVHs-AHM-gy1) pre verziu s” H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresného vektoru (HEFRVLa-AHM-gx) pre L reťazec pozmenenej Itidskej anti-HM 1.24 protilátky bolo spolu transformované do buniek COS-7 elektroporáciou prístroja Gene Pulser (vyrobené Bio Rad). Každá DNA (10 pg) bola pridaná k 0,8 ml alikvótom, obsahujúcim 1 x 10⁷buniek/ml v PBS a podrobená pulzom 1500 V s kapacitou 25 pF.

Po zotavovacej perióde 10 minút pri teplote miestnosti boli elektroporované bunky pridané do 30 ml kultivačného média DMEM (vyrobené GIBCO), obsahujúceho 10% fetálneho séra bez γ-globulínu. Po inkubácii 72 hodín vCO₂ inkubátore BNA120D (vyrobené TABAI) pri teplote 37°C a 5% CO₂ bol supernatant z kultúr odobraný, zvyšky buniek boli odstránené centrifugáciou pri 1000 ot./min po dobu 5 minút v centrifúge 05PR-22 (vyrobené HITACHI) vybavenej rotorom 03 (vyrobené HITACHI), uskutočnená ultrafiltrácia na mikrokoncentrátore (Centricon 100, vyrobené Amicon) pri použití centrifúgy J2-21 (vyrobené BECKMAN) vybavenej rotorom JA-20.1 (vyrobené BECKMAN) a sterilizovaný pri použití filtra Millex GV13mm (vyrobené Millipore) a použitý pre bunkový” ELISA test.

4-3. Expresia anti-HM 1.24 protilátky obsahujúcej verziu a zušľachteného L reťazca a chimárny H reťazec

Pri použití 10 pg každého z expresných vektorov HEF-1.24H-gy1 pre H reťazec chimérnej anti-HM 1.24 protilátky a HEF-RVLa-AHM-gx pre verziu a L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola anti-HM 1.24 protilátka pre použitie v bunkovom” ELISA teste a obsahujúca verziu a zušľachteného L reťazca a chimárny H reťazec, pripravená pomocou vyššie uvedenej metódy pre expresiu pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

4-4. Expresia H reťazca hybridnej protilátky

Pri použití 10 pg každého z expresných vektorov (HEF-MH-RVH-AHM-gyl alebo HEF-HM-RVH-AHM-gy1) pre V oblasť hybridného H reťazca a expresného vektora HEF-RVLa-AHM-gx pre L reťazec pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bol pripravený pomocou vyššie uvedenej metódy pre expresiu pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky H reťazec hybridnej protilátky pre použitie v bunkovom” ELISA teste.

4-5. Meranie koncentrácie protilátok

Koncentrácia získaných protilátok bola meraná testom ELISA. Každá jamka v 96 jamkovej ELISA doštičke (Maxisorb, vyrobené NUNC) bola imobilizovaná pridaním 100 pl kozej protilátky proti ľudskému IgG (vyrobené BIO SOURCE) s koncentráciou 1 pg/ml pufru (0,1 M NaHCO₃, 0,02% NaN₃, pH 9,6) a inkubovaním pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny. Po blokovaní so 100 pl zrieďovacieho pufru (50 mM Tris-HCI, 1 mM MgCI₂. 0,15 M NaCI, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃. 1% hovädzí sérumalbumín (BSA) pH 8,1) bolo ku každej jamke pridané 10 pl sériového zriedenia supernatantu z kultúr buniek COS-7, ktoré sekrétujú pozmenenú ľudskú anti-HM

1.24 protilátku, chimérnu anti-HM 1.24 protilátku alebo H reťazec hybridnej protilátky, ktorý bol koncentrovaný ultrafiltráciou a inkubované pri teplote miestnosti po dobu 1 hodniny. Po premytí bolo pridané 100 μΙ kozej protilátky proti ľudskému IgG, konjugovanej s alkalickou fosfatázou (vyrobené DÁKO).

Po inkubácii pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny a premytí bolo pridané 100 μΙ roztoku substrátu s koncentráciou 1 p.g/ml (Sigma 104, p-nitrofenylfosfát, SIGMA), rozpusteného v substrátovom pufre (50 mM NaHCO_3| 10 mM MgCI_2l pH 9,8) a na prístroji pre odčítanie mikrodoštičiek MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad) bola meraná absorbancia pri 405 nm. Ako štandard pre meranie koncentrácie bol použitý ľudský lgG1x (vyrobené The binding Site).

5. Príprava bunkovej línie CHO, ktorá stabilne produkuje pozmenenú ľudskú anti-HM 1.24 protilátku

5-1. Konštrukcia expresného vektora pre H reťazec pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky

Po štiepení vyššie uvedeného plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 reštrikčnými enzýmami Pvul a BamHI bol fragment dlhý 2,8 kbp, obsahujúci DNA kódujúcu EF1 promótor a DNA kódujúcu V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky vyčistený na 1,5% na agarózovom gele s nízkou teplotou topenia. Potom bol vyššie uvedený fragment vložený do 6 kbp fragmentu, pripraveného štiepením expresného vektora, použitého pre ľudský H reťazec, DHFR-AE-RVh-PMf1 (International Application Publication No. WO 92-19759), obsahujúceho DHFR gén a gén kódujúci konštantnú oblasť ľudského H reťazca, reštrikčnými enzýmami Pvul a BamHI, a skonštruovaný tak expresný vektor DHFR-AE-HEF-RVHr-AHM-gy1 pre H reťazec pozmenenej anti-Hm 1.24 protilátky.

5-2. Vnesenie génu do buniek CHO

Aby bol vytvorený stabilný produkčný systém pre pozmenenú ľudskú anti-HM

1.24 protilátku, boli gény vyššie uvedených expresných vektorov DHFR-AE-HEFRVHr-AHM-gy1 a HEF-RVLa-AHM-gx, ktoré boli linearizované štiepením Pvul, súčasne vnesené do buniek CHO DXB-11 elektroporačnou metódou, pri podmienkach podobných vyššie uvedeným (transfekcia do vyššie uvedených buniek COS-7).

5-3. Génová amplifikácia pomocou MTX

Spomedzi CHO buniek s vnesenými génmi môžu prežiť v beznukleozidovom α-MEM kultivačnom roztoku (vyrobené GIBCO-BRL), ku ktorému bolo pridané 500 pg/ml G418 (vyrobené GIBCO-BRL) a 10% hovädzieho fetálneho séra len tie bunky, do ktorých boli vnesené oba expresné vektory, ako pre L reťazec, tak pre H reťazec, a týmto spôsobom boli selektované. Potom nasledovalo pridanie 10 nM MTX (vyrobené Sigma) k vyššie uvedenému kultivačnému médiu. Spomedzi klonov, ktoré sa rozmnožili, boli vybrané také, ktoré produkovali pozmenenú ľudskú anti-HM

1.24 protilátku vo veľkom množstve. Výsledkom bol kloň 1, ktorý vykazoval účinnosť produkcie pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky asi 3 pg/ml a boli označené ako bunkové línie, produkujúce pozmenené ľudské anti-HM 1.24 protilátky.

5-4. Konštrukcia pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

Pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka bola skonštruovaná nasledujúcim spôsobom. Vyššie uvedené bunky CHO, produkujúce pozmenenú ľudskú anti-HM

1.24 protilátku, boli kultivované 10 dní v beznukleozidovom α-MEM kultivačnom médiu (vyrobené GIBCO-BRL), ku ktorému bolo pridané 500 pg/ml G418 (vyrobené GIBCO-BRL) a 10% bezgamaglobulínového hovädzieho fetálneho séra, vCO₂inkubátore BNAS120D (vyrobené TABAI) pri 37°C v 5% CO₂. V dňoch 8 a 10 po založení kultúry bol kultivačný roztok odoberaný, zvyšky buniek boli odstránené pomocou centrifugácie pri 2000 ot/min po dobu 10 minút na centrifúge RL-500SP (vyrobené Tomy Seiko) vybavenej rotorom TS-9 a potom sterilizovaný filtráciou pri použití filtra (vyrobené FALCON) s membránou s pórami sspriemerom 0,45 pm.

Po pridaní rovnakého objemu PBS(-) ku kultivačnému roztoku z buniek CHO, ktoré produkujú pozmenenú ľudskú anti-HM 1.24 protilátku, bola pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka čistená afinitnou metódou pomocou vysokorýchlostného purifikačného systému ConSep LC100 (vyrobené MILLIPORE) a stĺpce Hyper D Protein A (vyrobené Nippon Gaishi) pri použití PBS(-) ako absorpčného a premývacieho pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 3) ako elučného pufru podľa priloženého návodu. U eluovaných frakcií bolo pH okamžite upravené na pH 7,4 pridaním 1 M Tris-HCl (pH 8,0), potom boli frakcie koncentrované centrifugačnou ultrafiltráciou na koncentrátore Centriprep-10 (vyrobené MILLIPORE), bola uskutočnená koncentrácia a náhrada za PBS(-) a nakoniec sterilizované filtráciou pomocou filtra MILLEX-GV (vyrobené MILLIPORE) s veľkosťou pórov 0,22 pm a získané tak čistené pozmenené ľudské anti-HM 1.24 protilátky. Koncentrácia protilátok bola meraná absorbanciou pri 280 nm a vypočítaná za predpokladu, že

1,35 OD zodpovedná 1 gg/ml.

U pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená väzbová aktivita k antigénu a väzbové inhibičné aktivity.

1. Metóda merania väzbovej aktivity k antigénu a väzbovej inhibičnej aktivity

1-1. Meranie väzbovej aktivity k antigénu

Väzbová aktivita k antigénu bola meraná bunkovým” ELISA testom pri použití buniek WISH. Doštičky pre bunkový” ELISA test boli pripravené ako bolo popísané vyššie v Príklade 7.1-2.

Po blokovaní bolo ku každej jamke pridané 100 μΙ sériových zriedení pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, získanej z koncentrátu supernatantu kultúr buniek COS-7 alebo čistené zo supernatantu kultúr buniek CHO. Po inkubácii 2 hodiny pri teplote miestnosti boli premyté a potom bola pridaná králičia protilátka proti ľudskému IgG, označená peroxidázou (vyrobené DÁKO). Po inkubácii 1 hodinu pri teplote miestnosti nasledovalo premytie a ku každej jamke bolo pridané 100 μΙ roztoku substrátu. Po inkubácii bola reakcia zastavená pridaním 50 μΙ 6 N kyseliny sírovej a bola zmeraná absorbancia pri 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad).

1-2. Meranie väzbovej inhibičnej aktivity

Väzbová inhibičná aktivita biotinylom označenej myšacej anti-HM 1.24 protilátky bola meraná bunkovým” ELISA testom pri použití buniek WISH. Doštičky pre bunkový” ELISA test boli pripravené ako bolo uvedené vyššie v Príklade 7.1-2. Po blokovaní bolo ku každej jamke pridané 50 μΙ sériových zriedení pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, získanej z koncentrátu supernatantu kultúr buniek COS-7 alebo čistené zo supernatantu kultúr buniek CHO spolu s 50 μΙ biotinylom označenej myšacej anti-HM 1.24 protilátky. Po inkubácii 2 hodiny pri teplote miestnosti a premytí bol pridaný streptavidin označený peroxidázou (vyrobené DÁKO). Po inkubácii 1 hodinu pri teplote miestnosti nasledovalo premytie a bolo pridané 100 μΙ roztoku substrátu. Po inkubácii bola reakcia zastavená pridaním 50 μΙ 6 N kyseliny sírovej a bola zmeraná absorbancia pri 490 nm na prístroji MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad).

2. Hodnotenie pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

2-1. L reťazec

Verzia b L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená rovnako, ako je uvedené u meraní väzbovej aktivity pre antigén. Ako je uvedené na Obr. 8, keď je verzia a L reťazca exprimovaná v kombinácii schimerickým H reťazcom, prejavoval podobnú úroveň väzbovej aktivity pre antigén. S očakávaním ďalšieho zvýšenia aktivity a kompatibility s H reťazcom bola konštruovaná verzia b L reťazca. U verzií a a b L reťazca boli hodnotené spolu väzbová aktivita pre antigén a väzbová inhibičná aktivita pri ich kombinácii s verziami a, b, f alebo h H reťazca. Ako je uvedené na Obr. 9, 10, 11 a 12, verzia a L reťazca má oproti verzii b vyššie oba tieto druhy aktivity pri všetkých verziách a, b, f alebo h H reťazca. Preto bola pre nasledujúce pokusy použitá verzia a L reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

2-2. Verzia a až e H reťazca

Verzie a až e H reťazca pozmenenej ľudksje anti-HM 1.24 protilátky boli hodnotené v kombinácii s verziou a L reťazca, ako bolo uvedené pre meranie aktivity pre antigén a väzbovej inhibičnej aktivity. Výsledok uvedený na Obr. 11, 12, 13 a 14 ukázal, že všetky verzie boli v porovnaní schimérnou anti-HM 1.24 protilátkou v oboch hodnotených aktivitách slabší, čo naznačuje, že je vyžadovaná substitúcia ďalšej aminkyseliny.

2-3. H reťazec hybridnej protilátky

H reťazec hybridnej protilátky bol hodnotený rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén. Výsledok uvedený na Obr. 16 ukázal, že hybridný antiHM 1.24 protilátka človék/myš vykazuje podobnú aktivitu ako chimérna anti-HM 1.24 protilátka, pokiaľ ide o väzbovú aktivitu pre antigén, zataiľ čo hybridná anti-HM 1.24 protilátka myš/človék má slabšiu aktivitu než chimérna anti-HM 1.24 protilátka. To ukazuje, že pre konštrukciu pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, ktorá by mala väzbovú aktivitu pre antigén podobnú ako chimérna anti-HM 1.24 protilátka, je nevyhnutné zameniť aminokyseliny obsiahnuté v FR3 alebo FR4.

2-4. Verzie f až r H reťazca

Verzia f H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén. Výsledok uvedený na Obr. 17 ukázal, že jej väzbová aktivita pre antigén ja znížená v porovnaní s chimérnou anti-HM 1.24 protilátkou.ale je vyšší v porovnaní s uvedenými verziami a až c, čo znamená, že ktorákoľvek zo štyroch aminokyselín v pozíciách 67, 69, 75 a 78, ktoré boli novo zamenené v tejto verzii, je zodpovedná za aktivitu pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

Verzia g H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén. Výsledok uvedený na Obr. 18 a 19 ukázal, že táto verzia vykazovala nanajvýš podobnú úroveň aktivity ako vyššie uvedená verzia a, čo ukazuje, že ako je ukázané pre vyššie uvedený H reťazec hybridnej protilátky človek/myš, aminokyselina v pozícii 40, ktorá bola zamenená v tejto verzii, nie je zodpovedná za zvýšenie aktivity pozmenenej ľudskej protilátky.

Verzia h až j H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky boli hodnotené rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén a väzbovej inhibičnej aktivity. Výsledok uvedený na Obr. 20, 21, 22 a 23 ukázal, že všetky verzie mali obe merané aktivity v porovnaní s chimérnou anti-HM 1.24 protilátkou slabšie, ale boli podobné s vyššie uvedenou verziou f, čo znamená, že aminokyseliny v pozíciách 67 a 69, patriace medzi štyri aminokyseliny, ktoré boli novo zamenené vo verzii f, nie sú zodpovedné za zvýšenie aktivity pozmenenej ľúdskej protilátky.

Verzia k až p H reťazca pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky boli hodnotené rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén a väzbovej inhibičnej aktivity. Výsledok uvedený na Obr. 24, 25, 26 a 27 ukázal, že všetky verzie mali obe merané aktivity v porovnaní s chimérnou anti-HM 1.24 protilátkou slabšie, ale boli podobné s vyššie uvedenou verziou h, čo znamená, že aminokyseliny v pozícii 80, ktoré boli novo zamenené v týchto šiestich verziách, nie sú zodpovedné za zvýšenie aktivity pozmenenej ľudskej protilátky.

Verzia q H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén a väzbovej inhibičnej aktivity. Výsledok uvedený na Obr. 25 a 27 ukázal, že táto verzia mala obe merané aktivity v porovnaní s vyššie uvedenou verziou h alebo p slabšie, ale bola podobná vyššie uvedenej verzii a, čo znamená, že aminokyseliny v pozícii 78 sú podstatné pre zvýšenie aktivity pozmenenej ľudskej protilátky.

Verzia r H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená vyššie uvedenou metódou. Výsledok uvedený na Obr. 15 a 28 ukázal, že verzia r má podobnú úroveň väzbovej aktivity pre antigén a väzbovej inhibičnej aktivity ako chiméma ľudská anti-HM 1.24 protilátka.

Vyššie uvedené výsledky ukázali, že minimálne zámeny, vyžadované k tomu, aby pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka mala podobnú úroveň väzbovej aktivity pre antigén a väzbovú inhibičnú aktivitu ako myšacia anti-HM 1.24 protilátka alebo chiméma anti-HM 1.24 protilátka, sú aminokyseliny v pozíciách 30, 71 a 78 a ďalej 73.

Väzbová aktivita pre antigén a väzbová inhibičná aktivita pre verzie H reťazca a až r pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky sú uvedené súhrnne v Tabuľke 6.

Tabuľka 6

Verzia H reťazca	Väzbová aktivita pre antigén	Väzbová inhibičná aktivita
a	+	+
b	+	+
c	+	+
d	+	nemerané
e	+	nemerané
f	++	++
g	+	+
h	++	++
i	++	++
j	++	++
k	++	++
1	++	++
m	++	++
n	++	++
P	++	++
q	+	+
r	+++	+++

2-5. Verzia s H reťazca

Verzia s H reťazca pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená v kombinácii s vyššie uvedenou verziou a L reťazca rovnako, ako je uvedené u merania väzbovej aktivity pre antigén a väzbovej inhibičnej aktivity. Výsledok uvedený na Obr. 29 a 30 ukázal, že verzia s mala obe merané aktivity podobné ako verzia r.

Ako bolo uvedené vyššie, pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, ktorá je predmetom tohoto vynálezu, si udržuje svoju schopnosť väzby k antigénu dokonca aj keď bol jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov zamenený inými aminokyselinami. V súhlase s tým, predkladaný vynález zahrňuje pozmenenú ľudskú anti-HM 1.24 protilátku, v ktorej bol jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov zamenený inou aminkyselinou vo variabilnej oblasti H reťazca alebo L reťazca, pokiaľ si udrží svoju pôvodné vlastnosti.

3. Hodnotenie purifikovanej pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky

U purifikovanej pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bola hodnotená vyššie uvedená väzbová aktivita pre antigén a väzbová inhibičná aktivita. Výsledok uvedený na Obr. 31 a 32 ukázal, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka mala obe marané aktivity na podobnej úrovni, ako je väzbová aktivita pre antigén a väzbová inhibičná aktivita chimérnej anti-HM 1.24 protilátky. Táto skutočnosť znamená, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka má rovnakú väzbovú aktivitu pre antigén ako myšacia anti-HM 1.24 protilátka.

Príklad 12. Protinádorový účinok chimerickej anti-HM 1.24 protilátky proti myšaciemu modelu ľudského myelómu

1. Príprava protilátok na podávanie

1-1. Príprava chimérnej anti-HM 1.24 protilátky Purifikovaná chimérna anti-HM 1.24 protilátka získaná vo vyššie uvedenom

Príklade 6 bola koncentrovaná a pufor bol zamenený za PBS(-) pomocou centrifugačnej ultrafilrácie na koncentrátore Centriprep-10 (vyrobené Amicon). Ďalej bola sterilizovaná filtráciou pomocou membránového filtra MILLEX-GV (vyrobené MILLIPORE) s veľkosťou pórov 0,22 μπι. Filtrát bol upravený na koncentráciu 200

M.g/ml pomocou filtrácie sterilizovaného PBS(-) a takto bol použitý v nasledujúcich pokusoch. Koncentrácia protilátok bola meraná absorbanciou pri 280 nm a vypočítaná za predpokladu, že 1,35 OD zodpovedá 1 mg/ml.

1.2. Purifikácia kontrolného ľudského lgG1

Ľudský lgG1, ktorý bol použitý ako kontrola pre chimérne anti-HM 1.24 protilátky bol čistený nasledujúcim spôsobom. Po pridaní rovnakého objemu PBS(-) k Hu lgG1 Kappa Purified (vyrobené BINDING SITES) bol čistený afinitnou metódou pomocou vysokorýchlostného purifikačného systému pre protilátky ConSep LC100 (vyrobené MILLIPORE) a stĺpce Hyper Hyper D Protein A (vyrobené Nippon Gaishi) pri použití PBS(-) ako absorpčného pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 3) ako elučného pufru podľa priloženého návodu. U eluovaných frakcií bolo pH okamžite upravené na pH 7,4 pridaním 1 M Tris-HCI (pH 8,0), potom boli frakcie koncentrované centrifugačnou ultrafiltráciou na koncentrátore Centriprep-10 (vyrobené MILLIPORE), bola uskutočnená koncentrácia a náhrada za PBS(-) a nakoniec sterilizované filtráciou pomocou filtra MILLEX-GV (vyrobené MILLIPORE) s veľkosťou pórov 0,22 μιτι. Filtrát bol upravený na koncentráciu 200 pg/ml pomocou filtrácie sterilizovaného PBS(-) a použitý v nasledujúcich pokusoch. Koncentrácia protilátok bola meraná absorbanciou pri 280 nm a vypočítaná za predpokladu, že

1,35 OD zodpovedná 1 pg/ml.

2. Spôsob kvantifikácie ľudského sérového IgG v myšacom sáre

Ľudský IgG, obsiahnutý v myšacom sáre bol kvantifikovaný nasledujúcim ELISA testom. Do jamiek 96 jamkovej ELISA doštičky (vyrobené NUNC) bolo pridané 100 μΙ kozieho protiľúdského IgG, zriedeného na koncentráciu 1 pg/ml pufru pomocou 0,1 M hydrouhličitanového pufru a inkubované cez noc pri 4°C, aby došlo k imobilizácii protilátok. Po blokovaní bolo pridané 100 μΙ sériovo zriedeného myšacieho séra alebo ľudského IgG ako štandardu (varobené CAPPEL) a bolo inkubované pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny. Po premytí bolo pridané 100 μΙ 2000krát zriedeného protiľúdského IgG označeného alkalickou fosfatázou a inkubovalo sa pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny. Po premytí bol pridaný roztok substrátu, inkubovalo sa, a na prístroji po odčítaní mikrodoštičiek MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobené Bio Rad) bola meraná absorbancia pri 405 nm.

3. Protinádorový účinok chimérnej anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným ľudským myelómom

3-1. Príprava myší s transplantovaným ľudským myelómom

Myši s transplantovaným ľudským myelómom boli pripravené nasledujúcim spôsobom. Bunky KPMM2 pasážované in vivo na myšiach SCID (pestované v Nihon CLEA( boli pripravené v koncentrácii 3 x 10⁷ buniek/ml v médiu RPMI 1640, doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (vyrobené GIBCO BRL). Dvesto μί vyššie uvedenej suspenzie buniek KPMM2 bolo injektované do chvostovej žily SCID (samci, vek 8 týždňov, pestované v Nihon CLEA), ktoré deň predtým intraperitonálne dostali 100 μί anti-asialo GM1 (vyrobené Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.).

3-2. Podávanie protilátok

Dvanásty deň po transplantácii buniek KPMM2 bolo odobrané sérum vyššie uvedených myší s transplantovaným ľudským myelómom a ľudský IgG v sére bol kvantifikovaný pomocou ELISA testu, uvedeného vyššie v bode 2. Usadenie buniek KPMM2 v kostnej dreni bolo potvrdené zvýšením hladiny ľudského IgG v sére. V dňoch 14, 21 a 28 po transplantácii buniek KPMM2 bolo týmto myšiam intraperitonálne podané 100 μί protilátok, pripravených ako bolo uvedené vyššie v bode 1.

3-3. Hodnotenie protinádorového účinku chimérnej anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným ľudským myelómom

Protinádorový účinok chimérnej anti-HM 1.24 protilátky bol hodnotený na základe doby prežitia myší. Ako je ukázané na Obr. 33, tie myši, ktoré dostali chimému anti-HM 1.24 protilátku, vykazovali predĺženú dobu prežitia v porovnaní s tými, ktoré dostali kontrolný ľudský IgG. Bolo teda potvrdené, že chimérna anti-HM

1.24 protilátka má protinádorový účinok proti ľudskému myelómu, transplantovanému myšiam.

Príklad 13. Meranie ADCC aktivity pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky

ADCC aktivita (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity - bunková cytotoxicita závislá na protilátkach) bola meraná podľa metódy uverejnenej v Current Protocols of Immunology, kap. 7. Imunologická štúdia u ľudí, Editor, John E, Colligan a kol., John WileysSons, Inc., 1993.

1. Príprava efektorových buniek

Monocyty boli oddelené z periférnej krvi zdravých ľudských jedincov pomocou metódy centrifugácie. K periférnej krvi zdravých ľudských jedincov bolo teda pridané rovnaké množstvo PBS(-), zmes bola navrstvená na Ficoll-Paque Plus (vyrobené Pharmacia) a centrifugované pri 400 g po dobu 40 minút. Vrstva mononukleárnych buniek bola odobraná, štyrikrát premytá médiom RPMI 1640 (vyrobené GIBCO BRL), doplneným 10% fetálneho hovädzieho séra (vyrobené GIBCO BRL) a ich hustota upravená na 2 x 10⁵ buniek/ml vtom istom kultivačnom médiu. Tieto boli inkubované s 50 ng/ml rekombinantného ľudského IL-2 (vyrobené R & D SYSTEMS) a 10 ng/ml rekombinantného myšacieho GM-CSF (vyrobené R & D SYSTEMS) v CO₂ inkubátore (vyrobené TABAI) po dobu 7 dní. Počet buniek bol upravený na 2 x 10⁶ buniek/ml v tomto kultivačnom médiu.

2. Príprava cieľových buniek

Ľudská myelómová bunková línia KPMM2 (Japanese Unexamined Patent Publication (kokai) No. 7-236475) alebo z leukémie odvodené plazmatické bunky ARH-77 (ATCC CCL-1621) boli rádioaktívne označené inkubáciou v médiu RPMI 1640 (vyrobené GIBCO BRL), doplneným 10% fetálneho hovädzieho séra (vyrobené GIBCO BRL) spolu s 0,1 mCi⁵¹Cr-chrómanu sodného (vyrobené ICN) pri 37°C po dobu 60 minút. Po rádioaktívnom označení boli bunky trikrát premyté tým istým kultivačným médiom a upravené na koncentráciu 2 x 10⁵/ml.

3. Test ADCC

Do jednotlivých buniek 96 jamkovej doštičky (dno v tvare U) (vyrobené Becton Dickinson) bolo pridané 50 μΙ 2 x 10⁵ cieľových buniek/ml, 50 μΙ pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky, myšacej anti-HM 1,24 protilátky, kontrolného ľudského IgG (vyrobené THE BINDING SITES) alebo kontrolného myšacieho lgG2a (UPC10, vyrobené CAPPEL) a ponechané reagovať pri 4°C po dobu 15 minút.

Sto μΙ efektorových buniek bolo kultivované v CO₂ inkubátore 4 hodiny, keď pomer (E:T) efektorových buniek (E) k cieľovým bunkám (T) bol nastavený 0:1, 3,2:1,8:1,20:1 alebo 50:1.

Sto μΙ supernatantu bolo odobrané a rádioaktivita uvoľnená so supernatantu kultúry bola zisťovaná na merači žiarenia gama (ARC-300, vyrobené Aloka). Pre zmeranie maximálnej rádioaktivity bol použitý 1% NP-40 (vyrobené Nakalai).

Cytotoxicita (v %) bola vypočítaná ako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je rádioaktivita (cpm) uvoľnená v prítomnosti protilátky, B je rádioaktivita (cpm) uvoľnená v prítomnosti NP40 a C je rádioaktivita (cpm) uvoľnená v samotnom kultivačnom médiu bez protilátky.

Obr. 34 ukazuje výsledok získaný, keď bunky pripravené z periférnej krvi zdravého ľudského jedinca boli použité ako efektorové bunky a bunky KPMM2 boli použité ako cieľové bunky. Obr. 35 ukazuje výsledok získaný, keď bunky pripravené z periférnej krvi zdravého ľudského jedinca boli použité ako efektorové bunky a bunky ARH-77 boli použité ako cieľové bunky. Keď bola pridaná pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, cytotoxicita sa zvyšovala so zvýšením koncentrácie protilátok v porovnaní s kontrolným ľudským lgG1, čo ukazuje, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu.

Keď bola pridaná pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, cytotoxicita sa zvýšila v porovnaní s myšacou anti-HM 1.24 protilátkou, čo ukazuje, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje vyššiu ADCC aktivitu než myšacia anti-HM

1.24 protilátka. Ďalej, keď boli bunky KPMM2 použité ako cieľové bunky, pridanie pozmenenej ľudskejá anti-HM 1.24 protilátky v koncentrácii 0,1 pg/ml alebo vyššej nespôsobilo zmeny v cytotoxicite, čo ukazuje, že koncentrácia 0,1 pg/ml alebo vyššia má dostatočnú ADCC aktivitu. Keď boli bunky ARH-77 použité ako cieľové bunky, pridanie pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky v koncentrácii 0,1 pg/ml alebo vyššej nespôsobilo zmeny v cytotoxicite, čo ukazuje, že koncentrácia 0,1 pg/ml alebo vyššia má dostatočnú ADCC aktivitu.

Obr. 36 ukazuje výsledok získaný, keď boli bunky pripravené z kostnej drene myší SCID použité ako efektorové bunky. Keď bola pridaná pozmenená ľudská antiHM 1.24 protilátka, cytotoxicita sa zvyšovala so zvýšením koncentrácie protilátok v porovnaní s kontrolným ľudským lgG1, čo ukazuje, že pozmenená ľudská anti-HM

1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu. Ďalej, pridanie pozmenenej ľudskej anti-HM

1.24 protilátky v koncentrácii 0,1 pg/ml alebo vyššej nespôsobilo zmeny v cytotoxicite, čo ukazuje, že koncentrácia 0,1 pg/ml alebo vyššia má dostatočnú ADCC aktivitu.

Tieto výsledky ukazujú, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu aj keď sú efektorové bunky odvodené z človeka alebo z myši.

Príklad 14. Protinádorový účinok pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky proti ľudskému myelómu na myšacom modeli

1. Príprava protilátok na podanie

Pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka získaná vnesením plazmidu HEFRVLa-AHM-gx a plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 do buniek CHO bola pripravená v koncentráciách 40, 200 a 1000 pg/ml vo filtráciou sterilizovanom PBS(-) a kontrolný ľudský lgG1 získaný v Príklade 12.1-2 bol pripravený v koncentrácii 200 pg/ml vo filtráciou sterilizovanom PBS(-) a tieto boli použité ako podávané protilátky.

2. Protinádorový účinok pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky proti ľudským myelómovým bunkám transplantovaným myšiam

2-1. Príprava myší s transplantovanými bunkami ľudského myelómu

Myši s transplantovanými bunkami ľudského myelómu boli pripravené tak, ako je popísané v Príklade 12.3-1. Boli použité myši SCID (päť týždňov staré, pestované v Nihon CLEA):

2-2. Podávanie protilátok

Deviaty deň po transplantácii buniek KPMM2 bolo odobrané sérum myší s transplantovanými bunkami ľudského myelómu, pripravených vo vyššie uvedenom bode 2-1 a bol v ňom kvantifikovaný obsah ľudského IgG pomocou testu ELISA, ktorý bol popísaný skôr v bode 12.2. Usadenie buniek KPMM2 v kostnej dreni bolo potvrdené zvýšenín hladiny ľúdského IgG v sére.

Desiaty deň po transplantácii buniek KPMM2 bolo týmto myšiam intravenózne podané 100 μΙ každej protilátky, pripravenej vyššie v bode 1.

2-3. Hodnotenie protinádorového účinku pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky proti ľudským myelómovým bunkám transplantovaným myšiam

Protinádorový účinok pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bol hodnotený podľa zmeny množstva ľúdského IgG v myšacom sére a podľa doby prežitia myší.

Zmeny v množstve ľúdského IgG v myšacom sére boli kvantifíkované u séra odobraného 35. deň po transplantácii buniek KPMM2 tak, že bol zisťovaný ľudský IgG pomocou ELISA testu, uvedeného v Príklade 12.2. Výsledok uvedený na Obr. 37 ukazuje, že v skupine, ktorej bol podaný kontrolný ľudský IgG, bolo množstvo ľudského IgG 35. deň po transplantácii buniek KPMM2 zvýšené asi 1000-krát, v porovnaní s 9. dňom (deň pred podaním protilátok), zatiaľ čo v skupine, ktorej bola podaná pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, bolo toto množstvo takmer rovnaké alebo nižšie než 9. deň, to platilo pre ktorúkoľvek podanú dávku protilátok, čo ukazuje, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka potláča rast buniek KPMM2. Na druhej strane u doby prežitia, ako je uvedené na Obr. 38, bolo pozorované jej predĺženie v skupine, ktorej bola podaná pozmenená ľudská anti-HM

1.24 protilátka, oproti kontrolnej skupine s kontrolným ľudským IgG. Toto ukazuje, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinok proti ľudským myelómovým bunkám transplantovaným myšiam.

Príklad 15. Porovnanie protinádorového účinku u pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky a používaného lieku melphalan proti ľudskému myelómu na myšacom modeli

1. Príprava lieku na podanie

1-1. Príprava protilátok na podanie

Pozmenená anti-HM 1.24 protilátka získaná vnesením plazmidu HEF-RVLaAHM-gx a plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 do buniek CHO bola pripravená v koncentráciách 40, 200 a 1000 pg/ml vo filtráciou sterilizovanom PBS(-) a kontrolný ľudský lgG1 získaný v Príklade 12.1-2 bol pripravený v koncentrácii 200 pg/ml vo filtráciou sterilizovanom PBS(-) a tieto boli použité ako podávané protilátky.

1- 2. Príprava melphalanu

Melphalan (vyrobené SIGMA), ktorý je súčasným liekom proti myelómu, bol pripravený v koncentrácii 0,1 mg/ml pri použití 0,2% karboxymetylcelulózy(CMC)(vyrobené Daicel Chemical Industries, Ltd.).

2. Protinádorový účinok pozmenenej ľúdskej anti-HM 1.24 protilátky a melphalanu proti bunkám ľudského myelómu transplantovaným myšiam

2- 1. Príprava myší s transplantovanými bunkami ľudského myelómu

Myši s transplantovaným! bunkami ľudského myelómu boli pripravené podľa Príkladu 14.2-1.

2-2. Podávanie liekov

Deviaty deň po transplantácii buniek KPMM2 bolo odobrané sérum uvedených myší s transplantovaným! bunkami ľudského myelómu, pripravených vo vyššie uvedenom bode 2-1 a bol v ňom kvantifikovaný obsah ľudského IgG pomocou testu

ELISA, ktorý bol popísaný skôr v bode 12.2. Usadenie buniek KPMM2 v kostnej dreni bolo potvrdené zvýšenín hladiny ľudského IgG vsére. Desiaty deň po transplantácii buniek KPMM2 bolo týmto myšiam intravenózne podané 100 μΙ každej protilátky, pripravenej vyššie v bode 1-1. Ďalej bolo od 10. Dňa po transplantácii myšiam podávané orálne jedenkrát denne po dobu 5 dní 200 μΙ 0,2% roztoku CMC. Na druhej strane v skupine, ktorá dostávala melphalan, bol melphalanový roztok pripravený vyššie v odseku 1-2 podávaný v množstve 100 μΙ na 10 gramov telesnej váhy (1 mg melphalanu/kg) po dobu 5 dní od 10. dňa po transplantácii buniek KPMM2.

Protinádorový účinok pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky bol hodnotený podľa zmeny množstva ľudského IgG v myšacom sére a podľa doby prežitia myší.

Zmeny v množstve ľudského IgG v myšacom sére boli kvantifikované u séra odobraného 35. deň po transplantácii buniek KPMM2 tak, že bol zisťovaný ľudský IgG pomocou ELISA testu, uvedeného v Príklade 12.2. Výsledok uvedený na Obr. 39 ukázal, že v skupine, ktorej bol podaný kontrolný ľudský IgG, bofo množstvo ľudského IgG 35. deň po transplantácii buniek KPMM2 zvýšené asi 1000-krát, v porovnaní s 9. dňom (deň pred podaním protilátok), zatiaľ čo sa zdalo, že bunky KPMM2 v týchto myšiach rástli. V skupine, ktorej bol podaný melphalan, bolo množstvo ľudského IgG v sére zvýšené oproti stavu pred podaním lieku, hoci nie toľkokrát, ako v skupine s kontrolným ľudským IgG. Na druhej strane v skupine, ktorej bola podaná pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, bolo množstvo ľudského IgG v sére v tomto dni menšie, než 9. deň po transplantácii, to platilo pre ktorúkoľvek podanú dávku protilátok, čo ukazuje, že pozmenená ľudská anti-HM

1.24 protilátka potláča rast buniek KPMM2.

Na druhej strane u doby prežitia bolo tiež pozorované, ako je uvedené na Obr. 40, jej predĺženie v skupine, ktorej bola podaná pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, oproti kontrolnej skupine s kontrolným ľudským IgG alebo oproti skupine s melphalanom. Z predošlého vyplýva, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinok proti ľudským myelómovým bunkám transplantovaným myšiam a že protinádorový účinok tu predstavovaných protilátok je silnejší, než u používaného lieku melphalanu.

Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že ak boli použité efektorové bunky odvodené z ľudského organizmu, myšacia anti-HM 1.24 protilátka mala cytotoxický účinok na ľudské myelómové bunky, zatiaľ čo pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka a chimérna anti-HM 1.24 protilátka vykazovali silnú cytotoxicitu. Táto skutočnosť ukazuje dôležitosť zušľachtenia protilátky a poskytuje nádej na užitočnosť používania pozmenenej ľudskáej anti-HM 1.24 protilátky u človeka.

Pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka vykazovala veľmi silný protinádorový účinok u myší SCID s transplantovanými ľudskými myelómovými bunkami. Pretože u človeka sú efektorové bunky ľudského pôvodu a lymfocyty sú normálne prítomné, je očakávaný ešte silnejší protinádorový účinok pozmenenej ľudskej anti-HM 1.24 protilátky.

U modelu myelómu vykazovala pozmenená ľúdská anti-HM 1.24 protilátka v porovnaní s existujúcim liekom silný protinádorový účinok a preto sa očakáva, že pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka pomôže vytvoriť liek novej generácie na liečenie myelómu.

Referenčný príklad 1. Konštrukcia hybridómu produkujúceho myšaciu anti-HM 1.24 monoklonálnu protilátku

Hybridóm, ktorý produkuje myšaciu anti-HM 1.24 monoklonálnu protilátku, bol pripravený pomocou metódy popísanej v Goto, T. a kol., Blood (1994) 84, 19921930.

Bunková línia plazmatických buniek KPC-32 (1 x 10⁷ buniek), negatívna na jadrový antigén víru Epsteina a Baarovej, odvodená z kostnej drene ľudského pacienta s mnohopočetným myelómom (Goto, T. a kol., Jpn, J. Clin. Hematol. (1991) 32,1400) bola dvakrát intraperitonálne podaná myšiam BALB/c (pestované Charles River) každých 6 týždňov.

Aby sa ďalej zvýšil titer vytvorených protilátok, bolo injektované 1,5 x 10⁶ buniek KPC-32 do sleziny myši tri dni pred jej utratením (Goto, T. a kol, Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Po usmrtení myši jej bola odobraná slezina a slezinové bunky odobrané podľa Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) boli použité na bunkovú fúziu s myelómovými bunkami SP2/0.

Protilátky v supernatante hybridómových kultúr boli vyšetrované testom ELISA (Posner, M. R. a kol., J. Immunol. Methods (1982), 48, 23) s použitím doštičiek pokrytých bunkami KPC-32. Päťdesiat tisíc buniek KPC-32 bolo suspendované v 50 ml PBS a naplnené do doštičiek s 96 jamkami (dno tvaru U, Corning, vyrobené Iwaki). Po blokovaní pomocou PBS, obsahujúceho 1 % hovädzí séroalbumín (BSA), bol pridaný supernatant zhybridómu a inkubovalo sa 2 hodiny pri 4°C. Potom reagoval s kozou protilátkou proti myšaciemu IgG (vyrobené Zymed), označenou peroxidázou 1 hodinu pri 4°C, jedenkrát bol premytý a nakoniec bola uskutočnená reakcia s roztokom substrátu (o-fenyldiamín) (vyrobené Sumimoto Bakelite) pri teplote miestnosti 30 minút.

Po ukončení reakcie pridaním 2 N kyseliny sírovej bola meraná absorbancia pri 492 nm pomocou prístroja na čítanej doštičiek ELISA (vyrobené Bio-Rad). Aby sa vylúčili hybridómy produkujúce protilátky proti ľudskému imunoglobulínu, boli supernatanty pozitívnych hybridómových kultúr vopred absorbované sľúdským sérom a bola vyšetrovaná ich reaktivita s inými subcelulárnymi zložkami. Pozitívne hybridómy boli vybrané a metódou prietokovej cytometríe bola zisťovaná ich reaktivita s rôznymi bunkovými líniami a ľudskými vzorkami. Hybridómové klony, ktoré boli nakoniec vybrané, boli dvakrát klonované, injektované do brušnej dutiny myší BALB/c, ktorým bol podaný pristaň, a nakoniec bola z týchto myší získaná ascitická tekutina.

Monoklonálna protilátka z myšacích ascitov bola čistená zrážaním síranom amónnym a pomocou afinitnej chromatografickej súpravy s Proteinom A (Ampure PA, vyrobené Amersham). Vyčistená protilátka bola konjugovaná sfluorescein izotiokyanátom (FITC) pomocou súpravy Quick Tag FITC konjugačnej súpravy (vyrobené Boehringer Mannheim).

Výsledkom bolo, že monoklonálne protilátky, produkované 30 hybridómovými klonmi, reagovali s bunkami KPC-32 a RPMI 8226. Po klonovaní bola testovaná reaktivita supernatantu z týchto hybridómov s inými bunkovými líniami a mononukleárnymi bunkami odvodenými z periférnej krvi.

Medzi nimi boli tri klony, ktoré produkovali monoklonálne protilátky špecificky reagujúce s plazmatickými bunkami. Z týchto troch bol vybraný hybridómový kloň produkujúci monoklonálnu protilátku, ktorá je najužitočnejšia pre prietokovú cytometrickú analýzu a ktorá má na komplemente závislú cytotoxicitu proti bunkám

RPUI 8226 a bol nazvaný HM1.24. Podtrieda monoklonálnej protilátky, produkovanej týmto hybridómom bola určená testom ELISA pri použití králičích protimyšacích protilátok, špecifických k jednotlivým podtriedam (vyrobené Zymed). Anti-HM 1.24 protilátka bola podtriedy lgG2a. Hybridom, ktorý produkuje anti-HM 1.24 protilátku, bol uložený pre medzinárodné použitie 14. septembra 1995 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MÍTI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki Prefecture, Japan) pod prístupovým číslom FERM BP-5233 za podmienok Budapeštianskej zmluvy.

Referenčný príklad 2. Klonovanie cDNA kódujúcej polypeptid HM 1.24 antigénu

1) Príprava celkovej RNA cDNA kódujúca HM 1.24 antigén, čo je polypeptid špecificky rozoznávaný myšacou anti-HM 1.24 monoklonálnou protilátkou, bola pripravená nasledujúcim spôsobom.

Z ľudskej bunkovej línie KPMM2 odvodenej z mnohopočetného myelómu bola pripravená celková RNA pomocou metódy Chirgwin a kol., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). Teda 2,2 x 10⁸ buniek KPMM2 bolo kompletne homogenizované v 20 ml 4 M quanidín tiokyanáte (vyrobené Nakalai tesque).

Homogenát bol nanesený na vrstvu 5,3 M chloridu celzného v centrifugačnej skúmavke a potom centrifugovaný v rotore Beckman SW40 pri 31 000 ot/min pri teplote 20°C po dobu 24 hodín, aby došlo k vyzrážaniu RNA. Zrazenina RNA bola premytý 70% etanolom, rozpustená v 300 μ110 mM Tris-HCI (pH 7,4), obsahujúceho 1 mM EDTA a 5% SDS. Po pridaní Pronazy (vyrobené Boahringer) do koncentrácie 0,5 mg/ml, bolo inkubované 30 minút pri teplote 37°C. Zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a RNA vyzrážaná. Potom bola zrazenina RNA rozpustená v 200 μ110 mM Tris-HCI (pH 7,4), obsahujúceho 1 mM EDTA.

2) Príprava poly (A)+RNA

Pri použití 500 μΙ celkovej RNA, pripravenej ako bolo popísané vyššie, ako východiskového materiálu, poly(Aň+RNA bola čistená pomocou súpravy Fast Track 2.0m RNA Isolation Kit (vyrobené Invitrogenj postupom uvedeným v návode súpravy.

3) Konštrukcia knihovne cDNA

Pri použití 10 μΙ preparátu poly(A)+RNA, pripraveného ako bolo uvedené vyššie, ako východiskového materiálu, bola syntetizovaná dvojreťazcová cDNA pomocou súpravy pre syntézu cDNA TimeSaver cDNA Synthesis Kit (vyrobené Pharmacia) postupom uvedeným v návode k súprave, a pri použití súpravy Directional Cloning Toolbox (vyrobené Pharmacia) bol k nej priligovaný EcoRI adaptér postupom uvedeným v návode k súprave. Kinázovanie a štiepenie ECoRI adaptéru pomocou reštrikčného enzýmu Notl bolo uskutočnené podľa návodu priloženého k súprave. Ďalej bola dvojreťazcová cDNA s adaptérom, ktorá mala veľkosť 500 bp alebo vyššiu, izolovaná a vyčistená pomocou 1,5% agarózy s nízkou teplotou topenia (vyrobené Sigma) a nakoniec bolo získané 40 μΙ dvojreťazcovej cDNA s pripojeným adaptérom.

Takto pripravená dvojreťazcová cDNA s pripojeným adaptérom bola ligovaná pomocou T 4 DNA ligázy (vyrobené GIBCO BRL) do vektora pCOS1 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-255196), ktorý bol vopred spracovaný reštrikčnými enzýmami EcoRI a NotL a alkalickou fasfatázou (vyrobené Takara Shuzo), a tým skonštruovaná knihovňa cDNA. Skonštruovaná knihovňa cDNA bola transdukovaná do kmeňa Escherichia coli DH5a (vyrobené GIBCO BRL) a celkový počet nezávislých klonov bol odhadnutý na 2,5 x 10®.

2. Klonovanie priamou expresiou

1) Transfekcia do buniek COS-7 cDNA bola amplifikovaná pestovaním 5 x 10⁵ klonov Escherichia coli, pripravených ako bolo uvedené vyššie, v médiu 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), obsahujúcom 50 pg/ml ampicilínu a plazmidová DNA bola získaná z Escherichia coli alkalickou izolačnou metódou (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a koľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Získaná plazmidová DNA bola transfekovaná do buniek COS-7 elektroporáciou s pomocou prístroja Gene Pulsar (vyrobené Bio Rad).

pg čistenej plazmidovaj DNA bolo pridané do 0,8 ml buniek COS-7, ktoré boli suspendované v PBS na koncentráciu 1 x 10⁷ buniek/ml a bolo na na pôsobené elektrickými pulzami s napätím 1500 V a kapacitou 25 pF. Po 10 minútovom zotavovacom období pri teplote miestnosti, boli elektroporézované bunky pestované po doňu troch dní pri 37°C a 5% CO₂ v médiu DMEM (vyrobené GIBCO BRL), doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom.

2) Príprava adsobčnej platne

Adsorbčná platňa pokrytá myšacou anti-HM 1.24 protilátkou bola pripravená metódou podlá B. Seed a kol., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Myšacia anti-HM 1.24 protilátka bola pridaná do 50 mM Tris-HCI, pH 9,5, v koncentrácii 10 pg/ml. Tri ml takto pripraveného roztoku protilátok boli pridané na platňu pre tkanivovú kultiváciu s priemerom 60 mm a inkubované pri teplote miestnosti po dobu 2 hodín. Potom bola platňa trikrát premytá roztokom 0,15 M NaCI, blokovaná PBS, obsahujúcim 5% fetálne hovädzie sérum, 1 mM EDTA, 0,02% NaN₃ a takto pripravené platne boli použité pre nasledujúce klonovanie.

3) Klonovanie cDNA knihovne

Bunky COS-7 transfekované tak, ako je popísané vyššie, boli rozptýlené v PBS, obsahujúcom 5 mM EDTA a potom jedenkrát premyté PBS, obsahujúcim 5% fetálne hovädzie sérum. Bunky boli potom suspendované v PBS, obsahujúcom 5% fetálne hovädzie sérum a 0,02% NaN₃, plazmidová DNA bola izolovaná z buniek viazaných kadsorčnej platni, pri použití roztoku obsahujúceho 0,6% SDS a 10 mM EDTA.

Získaná plazmidová DNA bola opäť transdukovaná do buniek Escherichia coli DH5a. Po amplifikácii plazmidovej DNA bola transfekované elektroporačnou metódou do buniek COS-7 a plazmidová DNA izolovaná z adsorbovaných buniek, ako je popísané vyššie. Rovnaký postup bol opakovaný ešte jedenkrát a získaná plazmidová DNA bola štiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a NotL. Na záver bola potvrdená koncentrácia inzertu o veľkosti 0,9 kbp. Bunky Escherichia coli, transdukované časťou získanej plazmidovej DNA boli naočkované na platne s agarom 2-YT, obsahujúcom ampicilín s koncentráciou 50 pg/ml. Po kultivácii cez noc bola z jednej kolónie izolovaná DNA. Tá bola štiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a NOtl a bol získaný kloň p3.19 nesúci inzert 0,9 kbp.

Sekvencia báz tohoto klonu bola určená pomocou sekvenačnej súpravy PRISM, Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit (vyrobené Perkin Elmer) podlá návodu, priloženého k súprave a DNA sekvenátoru ABI 373A (vyrobené Perkin

Elmer). Jeho aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz sú ukázané v SEQ ID NO: 103.

Komplementárna DNA, ktorá kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 103 bola vnesená do Xbal štiepiaceho miesta vo vektore pUC19 a pripravená ako piazmid pRS38-pUC19. Escherichia coli, obsahujúca tento piazmid pRS38-pUC19 bola uložená pre medzinárodné použitie 5. októbra 1993 ako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MÍTI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki Prefecture, Japan) pod prístupovým číslom FERM BP-4434 za podmienok Budapeštianskej zmluvy (viď Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694).

Priemyselná využiteľnosť

Pretože anti-HM 1.24 protilátka je zložená z variabilnej oblasti, ktorá pochádza z myšacej anti-HM 1.24 protilátky a konštantnej oblasti, pochádzajúcej z ľudskej protilátky a pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka je zložená z oblasti určujúcej komplementaritu, ktorá pochádza z myšacej anti-HM 1.24 protilátky, podpornej oblasti pochádzajúcej z ľudskej protilátky a konštantnej oblasti pochádzajúcej z ľudskej protilátky, má pre človeka nízku antigenicitu, a preto sa očakáva, že bude používaná ako liečebný prostriedok, najmä pre liečenie myelómu.

Zoznam organizmov, uložených pre medzinárodné použitie Názov: National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Industrial Science and Technology, MITI

Adresa: Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan

1. Escherichia coli DH5ot (pRS 38-pUC19)

Prístupové číslo: FERM BP-4434 Dátum uloženia: 5. októbra 1993

2. Hybridom myš-myš HM1.24 Prístupové číslo: FERM BP-5233 Dátum uloženia: 27. apríla 1995

3. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1)

Prístupové číslo: FERM BP-5643

Dátum uloženia: 29. augusta 1996

4. Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1)

Prístupové číslo: FERM BP-5644

Dátum uloženia: 29. augusta 1996

5. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gic)

Prístupové číslo: FERM BP-5645

Dátum uloženia: 29. augusta 1996

6. Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK)

Prístupové číslo: FERM BP-5646 Dátum uloženia: 29. augusta 1996

7. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1)

Prístupové číslo: FERM BP-6127

Dátum uloženia: 29. septembra 1997

Agency of

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chimémy L reťazec, vyznačujúci sa tým, že obsahuje konštantnú oblasť (C oblasť) ľudského ľahkého (L) reťazca a variabilnú (V) oblasť L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
2. Chimémy L reťazec podľa nároku 1, kde uvedená V oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 1.
3. Chimémy reťazec podľa nároku 1, kde uvedená C oblasť ľudského L reťazca je Ck.
4. Chimérny H reťazec, vyznačujúci sa tým, že obsahuje konštantnú oblasť ľudského ťažkého (H) reťazca a V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
5. Chimémy H reťazec podľa nároku 4, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 2.
6. Chimérny H reťazec podľa nároku 4, kde uvedená C oblasť ľudského H reťazca jeCy.
7. Chiméma protilátka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) L reťazec, obsahujúci C oblasť ľudského L reťazca a V oblasť L reťazca antiHM 1.24 protilátky, a (2) H reťazec, obsahujúci C oblasť H reťazca a V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
8. Chiméma protilátka podľa nároku 7, kde uvedená V oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 1 a uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 2.
9. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúca sa t ý m, že obsahuje:

(1) podpornú oblasť (FR) V oblasti ľudského L reťazca, a (2) CDR oblasť V oblasti L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
10. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 9, kde uvedená CDR oblasť má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku v niektorej z nasledujúcich sekvencii:

CDR1: Lys Ala Ser Gin Asp Val Asp Thr Ala Val Ala (SEQ ID NO: 3)

CDR2: Ser Ala Ser Asn Arg Ty r Thr (SEQ ID NO: 4)

CDR3: Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr (SEQ ID NO: 5).
11. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 10, kde uvedená FR oblasť je odvodená z FR ľudskej protilátky podskupiny I (HSGI).
12. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 11, kde uvedená FR oblasť je odvodená z FR ľudskej protilátky REI.
13. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 11, kde uvedená FR oblasť je v podstate zhodná s FR ľudskej protilátky REI.
14. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 11, kde uvedená V oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Tabuľke 1 ako RVLa.
15. Oblasť V pozmeneného ľudského H reťazca anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) FR V oblasti ľudského H reťazca, a (2) CDR oblasť V oblasti H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
16. Oblasť V pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 15, kde uvedená CDR oblasť má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku v niektorej z nasledujúcich sekvencii:

CDR1: Pro Tyr Trp Met Gin (SEQ ID NO: 6)

CDR2: Ser lle Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe

Lys Gly (SEQ ID NO: 7)

CDR3: Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO: 8).
17. Oblasť V pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 16, kde uvedená FR oblasť je odvodená z FR ľudskej protilátky HSGI.
18. Oblasť V pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 16, kde uvedené oblasti FR 1 až 3 sú odvodené z FR 1 až 3 ľudskej protilátky HG3.
19. Oblasť V pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 16, kde uvedené FR oblasti 1 až 3 sú v podstate zhodné s oblasťami FR 1 až 3 ľudskej protilátky HG3 a uvedená FR4 je v podstate zhodná s oblasťou FR4 ľudskej protilátky JH6.
20. Reťazec H pozmenenej ľtidskej protilátky podlá nároku 16, kde aminokyselina v pozícii 30 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR1 je threonín, aminokyselina v pozícii 71 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je alanín a aminokyselina v pozícii 78 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je alanín.
21. Reťazec H pozmenenej ľudskej protilátky podľa nároku 16, kde aminokyselina v pozícii 73 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je lyzín.
22. Oblasť V pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 17, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr alebo RVHs v Tabuľkách 2 až 4.
23. Pozmenený ľudský L reťazec anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje:

(1) C oblasť ľudského L reťazca, a (2) V oblasť H reťazca, obsahujúcu FR ľudského L reťazca a CDR L reťazca antiHM 1.24 protilátky.
24. Pozmenený ľudský L reťazec podľa nároku 23, kde uvedená C oblasť ľudského L reťazca je ľudská Ck oblasť, uvedená FR oblasť ľudského L reťazca je odvodená z FR ľudskej protilátky HSGI a uvedená CDR oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku 10.
25. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 23, kde uvedená FR oblasť je odvodená z FR ľudskej protilátky REI.
26. Oblasť V pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 23, kde uvedená FR oblasť je v podstate zhodná s FR oblasťou ľudskej protilátky REI.
27. Pozmenený ľudský L reťazec podľa nároku 23, kde uvedená V oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Tabuľke 3 ako RVLa.
28. Pozmenený ľudský H reťazec anti-HM 1.24 protilátky, vyzná-čujúci sa t ý m, že obsahuje:

(1) C oblasť ľudského H reťazca, a (2) V oblasť H reťazca, obsahujúcu FR ľudského H reťazca a CDR H reťazca antiHM 1.24 protilátky.
29. Pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 28, kde uvedená C oblasť ľudského H reťazca je ľúdská Cy1 oblasť, uvedená FR oblasť ľudského H reťazca je odvodená zFR ľudskej protilátky HSGI a uvedená CDR H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku 16.
30. Pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 28, kde uvedené FR 1 až 3 sú odvodené zFR 1-3 ľudskej protilátky HG3 a uvedená FR4 je odvodená zFR4 ľudskej protilátky JH6.
31. Pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 28, kde uvedené FR 1 až 3 sú v podstate zhodné s FR 1 až 3 ľudskej protilátky HG3 a uvedená FR4 je v podstate zhodná s FR4 ľudskej protilátky JH6.
32. H reťazec pozmenenej ľudskej protilátky podľa nároku 28, kde aminokyselina v pozícii 30 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR1 je threonín, aminokyselina v pozícii 71 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je alanín, aminokyselina v pozícii 78 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je alanín.
33. H reťazec pozmenenej ľudskej protilátky podľa nároku 28, kde aminokyselina v pozícii 73 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je lyzín.
34. Pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 28, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr alebo RVHs v Tabuľkách 2 až 4.
35. Pozmenená ľudská anti-HM 1.24 protilátka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(A) L reťazec obsahujúci (1) C oblasť ľudského L reťazca, a (2) V oblasť L reťazca, obsahujúcu FR ľudského L reťazca a CDR L reťazca antiHM 1.24 protilátky, a (B) H reťazec obsahujúci (1) C oblasť ľudského H reťazca (2) V oblasť H reťazca, obsahujúcu FR Ľudského H reťazca a CDR H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
36. Pozmenená Ľudská protilátka podľa nároku 35, kde uvedená CDR oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku 10 a uvedená CDR oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku 16.
37. Pozmenená ľudská protilátka podľa nároku 35, kde uvedená CDR oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku 10; uvedená CDR oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v nároku 16; uvedená FR oblasť ľudského L reťazca je odvodená z FR protilátky HSGI; uvedená FR oblasť ľudského

H reťazca je odvodená z FR protilátky HSGI; uvedená C oblasť ľudského L reťazca je ľudská oblasť Ck; a uvedená C oblasť ľudského H reťazca je ľudská oblasť Cy1.
38. Pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 35, kde uvedená FR L reťazca je odvodená z FR ľudskej protilátky REI, uvedená FR 1 až 3 H reťazca je odvodená z ľudskej protilátky HG3 a uvedená FR4 H reťazca je odvodená zFR4 ľudskej protilátky JH6.
39. Pozmenená ľudská protilátka podľa nároku 35, kde uvedená V oblasť L reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Tabuľke 1 ako RVLa.
40. Pozmenená ľudská protilátka podľa nároku 35, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr alebo RVHs v Tabuľkách 2 až 4.
41. DNA kódujúca V oblasť L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
42. DNA podľa nároku 41, kde uvedená V oblasť L reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 1.
43. DNA podľa nároku 41, kde DNA kódujúca uvedenú V oblasť L reťazca má nukleotidovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 1.
44. DNA kódujúca V oblasť H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
45. DNA podľa nároku 44, kde uvedená V oblasť H reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 2.
46. DNA podľa nároku 44, kde DNA kódujúca uvedenú V oblasť H reťazca má nukleotidovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 2.
47. DNA kódujúca chimérny L reťazec, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) C oblasť ľudského L reťazca, a (2) V oblasť L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
48. DNA podľa nároku 47, kde uvedená V oblasť L reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 1.
49. DNA podľa nároku 47, kde uvedená V oblasť L reťazca má nukleotidovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 1.
50. DNA kódujúca chimérny H reťazec, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) FR V oblasti ľudského L reťazca, a (2) CDR V oblasti L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
51. DNA podľa nároku 50, kde uvedená V oblasť H reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 2.
52. DNA podľa nároku 50, kde uvedená V oblasť H reťazca má nukleotidovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 2.
53. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) FR V oblasti ľudského L reťazca, a (2) CDR V oblasti L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
54. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 53, kde uvedená CDR má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v nároku 10.
55. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 53, kde uvedená FR je odvodená z FR ľudskej protilátky HSGI.
56. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 53, kde uvedená FR je odvodená z FR ľudskej protilátky REI.
57. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 53, kde uvedená FR je v podstate zhodná s FR ľudskej protilátky REI.
58. DNA podľa nároku 51, kde uvedená V oblasť L reťazca kóduje aminokysel inovú sekvenciu uvedenú v Tabuľke 1 ako RVLa.
59. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského L reťazca podľa nároku 53, ktorý má nukleotidovú sekvenciu v SEQ ID NO: 9.
60. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) FR V oblasti ľudského H reťazca, a (2) CDR V oblasti H reťazca antti-HM 1.24 protilátky.
61. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 60, kde uvedená CDR má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v nároku 16.
62. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľúdského H reťazca podľa nároku 60, kde uvedená FR je odvodená z FR ľúdskej protilátky HSGI.
63. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 60, kde uvedené FR1 až 3 sú odvodené z FR1 až 3 ľudskej protilátky HG3.
64. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 60, kde uvedené FR 1 až 3 sú v podstate zhodné s FR 1 až 3 ľudskej protilátky HG3.
65. DNA kódujúca V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej protilátky podľa nároku 60, kde aminokyselina v pozícii 30 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR1 je threonín, aminokyselina v pozícii 71 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je alanín a aminokyselina v pozícii 78 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je alanín.
66. DNA kódujúca V oblasť H reťazca pozmenenej ľudskej protilátky podľa nároku 60, kde aminokyselina v pozícii 73 podľa Kabátových definícií v uvedenej FR3 je lyzín.
67. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 60, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr alebo RVHs v Tabuľkách 2 až 4.
68. DNA kódujúca V oblasť pozmeneného ľudského H reťazca podľa nároku 60, ktorá má nukleotidovúsekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25,26, 28 alebo 102.
69. DNA kódujúca pozmenený ľudský L reťazec anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

(1) C oblasť ľudského L reťazca a (2) V oblasť L reťazca, obsahujúcu FR a CDR L reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
70. DNA podľa nároku 69, kde uvedená V oblasť L reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú V Tabuľke 1 ako RVLa.
71. DNA podľa nároku 69, kde uvedená V oblasť L reťazca má nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 9.
72. DNA podľa nároku 69, kde uvedená C oblasť L reťazca je oblasť Ck Ľudského L reťazca.
73. DNA kódujúca pozmenený ľudský H reťazec anti-HM 1.24 protilátky, vyznáčújúca sa tým, že obsahuje:

(1) C oblasť ľudského H reťazca a (2) V oblasť H erťazca obsahujúcu FR ľudského H reťazca a CDR H reťazca anti-HM 1.24 protilátky.
74. DNA kódujúca pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 73, kde uvedená V oblasť H reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr alebo RVHs v Tabuľkách 2 až 4.
75. DNA kódujúca pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 73, kde uvedená V oblasť H reťazca má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO: 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 alebo 102.
76. DNA kódujúca pozmenený ľudský H reťazec podľa nároku 73, kde uvedená C oblasť ľudského H reťazca je oblasť Cy1 z ľudského H reťazca.
77. Vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 a 76.
78. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že je transformovaná vektorom, ktorý obsahuje DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73,74, 75 a 76.
79. Spôsob prípravy chomémej formy anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuke kroky: pestovanie hostiteľských buniek transformovaných súčasne expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 41, 42, 43, 47, 48 a 49, a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 44, 45, 46, 50, 51 a 52; a získavanie požadovanej protilátky.
80. Spôsob prípravy pozmenenej ľudskej protilátky anti-HM 1.24 protilátky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky: pestovanie hostiteľských buniek transformovaných súčasne expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 69, 70, 71 a 72, a expresným vektorom, ktorý obsahuje DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 a 76; a získavanie požadovanej protilátky.
81. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako aktívnu zložku chimérnu protilátku, ktorá špecificky rozoznáva polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 103.
82. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako aktívnu zložku chimérnu anti-HM 1.24 protilátku.
83. Liečebné činidlo pre myelóm, obsahujúce ako aktívnu zložku chimérnu protilátku, ktorá špecificky rozoznáva polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 103.
84. Liečebné činidlo pre myelóm, obsahujúce ako aktívnu zložku chimérnu anti-HM

1.24 protilátku.
85. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako aktívnu zložku pozmenenú ľudskú protilátku, ktorá špecificky rozoznáva polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 103.
86. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako aktívnu zložku pozmenenú ľudskú anti-HM 1.24 protilátku.
87. Liečebné činidlo pre myelóm, obsahujúce ako aktívnu zložku pozmenenú ľudskú protilátku, ktorá špecificky rozoznáva polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 103.
88. Liečebné činidlo pre myelóm, obsahujúce ako aktívnu zložku pozmenenú ľudskú anti-HM 1.24 protilátku.