CN111050789A - 用于诱导针对肿瘤和癌症的体液免疫和细胞免疫的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了使受试者中与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症对体液免疫和细胞免疫反应的诱导物敏感的方法。在一些实施方式中，方法涉及向受试者施用具有抑制胃泌素基因产物表达的抗胃泌素抗体、胃泌素肽和/或核酸的组合物。还提供了用于预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症相关的纤维化的形成的方法，以及用于治疗与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的方法，方法包括向有此需要的受试者施用第一试剂和第二试剂，所述第一试剂在受试者中提供和/或诱导抗胃泌素的体液或细胞免疫反应，所述第二试剂包括一种或多种针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物。

Description

用于诱导针对肿瘤和癌症的体液免疫和细胞免疫的组合物和 方法
相关申请的引用
本申请要求2017年6月15日提交的美国临时专利申请序列号62/520,267的权益，其公开内容以其整体通过引用结合于此。
技术领域
本公开的主题涉及用于诱导针对肿瘤和癌症的体液免疫和细胞免疫的组合物和方法。在一些实施方式中，本公开的主题涉及向有此需要的受试者施用针对胃泌素肽的体液或细胞免疫反应的治疗诱导剂和/或与针对肿瘤或癌症的细胞免疫反应的诱导剂结合。
背景技术
胰腺癌，通常称为胰腺导管腺癌(PDAC)，是一种复杂的疾病，涉及多种细胞生长调节途径中的遗传突变的连续积累。其以在胰腺上皮内瘤样病变中相对良性的病变开始(PanIN；Hruban等人，2008)，发展为多种异常的基因表达模式、基因组不稳定以及最终对治疗具有抵抗力的浸润性癌症。
从组织学上讲，PDAC通常分化良好，主要由腺泡导管化生、免疫抑制性炎症细胞的存在、细胞毒性T细胞的缺乏和致密的纤维化基质的存在来定义。这些表现在程度上可以有很大的不同，并且可以在没有明显的临床症状的情况下发生，这使得PDAC的早期诊断非常罕见。PDAC肿瘤间质由间充质细胞(例如，成纤维细胞和胰腺星形细胞(PSC))、细胞外基质蛋白、瘤周神经纤维、内皮细胞和免疫细胞组成。影响间质细胞产生丰富的促结缔织增生作用的特定机制涉及生长因子激活、胶原蛋白和细胞外基质合成和分泌(Zhang等人，2007)，以及许多血管和细胞因子介导过程的调节子的表达(Hidalgo等人，2012)。
侵袭性PDAC占导管谱系癌的绝大多数(>85％)。PDAC的特征是不受控制的浸润和早期转移。假定的导管腺癌前体是PanIN显微病变，其发生导管内增生性变化，并最终发生一系列从PanIN-1A到PanIN-3的致瘤性转化和完全型恶性肿瘤。
PDAC的重要特征是胃泌素/胆囊收缩素受体(CCK-B)在肿瘤细胞表面的异常表达(Smith等人，1994)，以及肿瘤的胃泌素的高水平表达(Prasad等人，2005)。胃泌素(Smith，1995)和胆囊收缩素(Smith等人，1990；Smith等人，1991)蛋白均通过自身内分泌机制刺激胰腺肿瘤生长(Smith等人，1996a；Smith等人，1998b)，并且抑制胃泌素表达(Matters等人，2009)或阻断CCK-B受体功能(Fino等人，2012；Smith&Solomon，2014)都抑制癌症生长。
尽管多年来在许多癌症治疗上取得了令人瞩目的成功，但可悲的是，市场上对于PDAC突破性疗法的认可几乎没有成功(参见Hidalgo，2010；Ryan等人，2014)，这预示着所有胃肠道恶性肿瘤的预后最差(Siegel等人，2016)。当前PDAC的五年生存率为约6％，是任何癌症中最低的(Siegel等人，2016)。
PDAC的预后不良在过去30年中没有发生变化。一线治疗方法是多学科诊断，然后手术以及化学疗法和放射疗法。然而，基于小分子化学疗法吉西他滨和5-氟尿嘧啶的疗法未产生令人满意的结果并且这些方案的平均生存期不到一年(Hoff等人，2011；Conroy等人，2011)。
生存率低的影响因素包括无法在早期诊断出该病、细胞和解剖肿瘤细胞的异质性、高转移率以及抑制药物渗透和暴露的adense纤维化微环境的存在(Neesse等人，2013)。肿瘤的不可及性导致PDAC对标准化学疗法和免疫疗法药物产生相对耐药性(Templeton&Brentnall，2013)，并导致这种致命疾病的预后不良。
宿主免疫反应是导致PDAC顽强和侵袭性的另一个关键因素。在PDAC的微环境中如此突出的免疫细胞不支持抗肿瘤免疫力(Zheng等人，2013)。相反，实际上这些细胞(包括巨噬细胞，T调节(Treg)细胞和中性粒细胞)促进肿瘤生长和侵袭。实际上，PDAC的标志之一就是其逃避免疫破坏的能力(Hanahan&Weinberg，2011)。
包括PDAC在内的癌症都采用了许多工具来逃避和/或抵抗来自患者免疫系统的攻击(Pardoll，2012；Weiner&Lotze，2012)。肿瘤代谢环境的成分已显示出调节这些反应的能力(Feig等人，2012；Quante等人，2013)。癌症治疗方法的一项重大突破是发现了通常由肿瘤细胞调节的免疫检查点途径作为免疫抵抗(Leach等人，1996)。已开发在检查点途径中靶向蛋白质的抗体，例如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，并已证明临床上在某些癌症(例如黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和肾癌)中可有效逆转免疫抵抗力(Pardoll，2012)。然而，PDAC特征在于肿瘤微环境，其具有免疫抑制T调节(Treg)细胞的优势，缺乏CD8+肿瘤浸润效应T细胞(Feig等人，2012；Vonderheide&Bayne，2013；Zheng等人，2013)，并且血管化不良。致密基质环境的纤维化性质以及缺乏通过血液的可及性部分地解释了以下观察结果：PDAC最多仅对抗PD-1和抗PD-L1抗体适度反应(Brahmer等人，2012，Zhang，2018)。
认为PDAC细胞表面上检查点配体PD-L1的表达水平是对免疫检查点抑制剂免疫疗法反应的另一个决定因素(Zheng，2017)。一些研究表明，PD-L1表达水平低与对免疫检查点抑制剂的反应缺乏有关(Soares等人，2015)，并且刺激PD-1或PD-L1表达可以帮助促进抗检查点蛋白抗体的有效性(Lutz等人，2014)。在PDAC的其他研究中，发现PD-L1在大多数肿瘤细胞以及许多肿瘤样品中高表达(Lu等人，2017)。因此，通过考虑肿瘤中PD-L1的状态并寻求调节PD-L1表达的方法以伴随PDAC靶向治疗，可以潜在地提高免疫检查点抑制剂治疗的有效性。
目前，治疗PDAC的临床试验包括将抗体免疫检查点抑制剂与化学疗法、放射、趋化因子失活(olaptesed)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制作用(abemaciclib)、TGF-β受体I激酶抑制剂(galunisertib)、粘着斑激酶抑制剂(defactinib)、CSF1R抑制剂(Pexidartinib)、维生素D和聚ADP核糖聚合酶抑制剂(niraparib)结合。这些研究旨在结合可能改善PDAC肿瘤微环境中的物理渗透和/或免疫细胞存在以及提高免疫检查点抑制剂治疗效果的药物。在最近的报告中(Smith等人，2018)，抑制CCK-B受体功能降低了PDAC纤维化，并提高使用抗PD-1抗体(Ab)和抗CTLA-4Ab进行抗体治疗的有效性。
鉴于PDAC肿瘤的复杂性，需要深入了解如何使用新策略来改变患者异质性中PDAC微环境的免疫表型，并使肿瘤对基于化学和免疫疗法的反应更加敏感。
胃癌是另一种毁灭性癌症，尤其是胃腺癌是所有癌症中最差的预后之一，其5年生存率高达30％(Ferlay等人，2013)。该恶性肿瘤很难早期发现并且需要不常用的有目的的筛查实践。大多数诊断已经进入晚期阶段，中位生存期为9-10个月(Wagner等人，2010；Ajani等人，2017)。当前胃癌的护理标准包括在适当时候手术，然后进行放射和/或化学疗法与DNA合成抑制剂(如5-氟尿嘧啶)和/或DNA破坏剂(如顺铂)的结合。
针对某些胃癌的靶向治疗也已开始出现。表达人类表皮生长因子受体2(EGFR2)的肿瘤可用曲妥珠单抗(由Genentech,Inc.以商品名
Figure BDA0002384271360000051
出售，South SanFrancisco,California,United States of America)联合化学疗法治疗。一些胃癌也对抗血管生成药物有反应，例如雷莫芦单抗(由Eli Lilly and Company(Indianapolis,Indiana,United States of America)以商品名
Figure BDA0002384271360000052
出售)。迫切需要其他靶向治疗以改善这种常见恶性肿瘤的不良预后。
胃腺癌通常过度表达胃泌素以及胃泌素受体，称为CCK-B受体(Smith等人，1998a；McWilliams等人，1998)，而胃泌素介导的与CCK-B结合时的增殖作用导致这些肿瘤中生长和表达的不受控制的自分泌周期。阻断胃泌素作为该癌症的治疗手段的功能一直是多年来研究的重点(在Rai等人，2012年进行了综述)。在靶向治疗的候选中，胃泌素疫苗多克隆抗体刺激剂(PAS)在改善胃癌2期临床试验以及胰腺癌2期和3期临床试验中显示出明显的前景。PAS疫苗已证明可引起体液免疫反应，如通过产生针对胃泌素的中和抗体所证实的。通过消除胃泌素，疫苗可以减缓肿瘤的生长，并具有提供长期杀伤肿瘤的潜力。
当靶抗原的免疫介导的固定或失活在身体其他部位没有有害作用时，引起针对特定肿瘤抗原的免疫反应的癌症疫苗是一种有吸引力的治疗策略。肽疫苗具有缩小免疫反应特异性的潜在优势，但它们有时可能具有引发弱免疫原性的缺点。仔细选择肽组成以及掺入佐剂分子和递送系统对于确保稳健的反应以及引发所需免疫途径的诱导可能是必需的。短至9-11个氨基酸的肽可以产生特定的CD8+T细胞介导的反应，尽管表位中甚至一个氨基酸的变化都可以阻止该反应(Gershoni等人，2007)。
选择要包含在肽上的表位需要考虑所需的免疫反应类型，包括MHC Ii类表位以诱导CD4+辅助T细胞和MHC I类CD8表位以诱导辅助T细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞(Li等人，2014年)。
胃泌素肽疫苗(如PAS)与免疫检查点抑制剂的组合代表了一种改善受胃泌素肽激素进行生长刺激的癌症预后的新方法。
发明内容
本概述列出了本发明公开的主题的几个实施方式，并且在许多情况下，列出了这些实施方式的变化和置换。该概述仅仅是众多变化的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提到的特征。同样，这些特征可以应用于本发明公开的主题的其他实施方式，无论是否在本概述中列出。为了避免过多的重复，该概述未列出或建议此类功能的所有可能组合。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了药物组合物，其包含诱导和/或提供针对胃泌素肽和/或CCK-B受体以及免疫检查点抑制剂的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂。在一些实施方式中，第一试剂选自胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。在一些实施方式中，第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。
在一些实施方式中，胃泌素肽可选地通过接头与免疫原性载体缀合。在一些实施方式中，免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明公开的药物组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗(Tremelimumab)、纳武单抗(Nivolumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗(Atezolizumab)、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗(Avelumab)和度伐鲁单抗(Durvalumab)。
在一些实施方式中，胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
在本发明公开的药物组合物的一些实施方式中，第一试剂包含一定量的胃泌素肽，其包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自有效诱导抗胃泌素体液反应的EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ IDNO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，并且第二试剂包含一定量的免疫检查点抑制剂，当施用给患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者时，该免疫检查点抑制剂有效地诱导或增强针对胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。
在本发明公开的药物组合物的一些实施方式中，第一试剂包含一种或多种抗CCK-B受体抗体，并且当施用给患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者时，以足以减少或抑制经由胃泌素相关的肿瘤或癌症上存在的CCK-B受体的胃泌素信号转导的量存在于药物组合物中。
在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了用于治疗受试者中胃泌素相关的肿瘤或癌症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含诱导和/或提供针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂；且第二试剂可诱导和/或提供针对胃泌素相关肿瘤或癌症的细胞免疫反应。在一些实施方式中，第一试剂选自胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。在一些实施方式中，第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，胃泌素肽可选地通过接头与免疫原性载体缀合，其在一些实施方式中可以选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。在一些实施方式中，组合物进一步包含佐剂，可选地基于油的佐剂。在一些实施方式中，针对与胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
在本发明公开的方法的一些实施方式中，胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，该组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。在一些实施方式中，该组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了用于治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向有此需要的受试者施用直接或间接抑制肿瘤和/或癌症中胃泌素的一种或多种生物学活性的第一试剂和包含针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物的第二试剂。在一些实施方式中，第一试剂通过提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液免疫反应而直接或间接抑制胃泌素在肿瘤和/或癌症中的一种或多种生物学活性，可选地其中所述试剂选自抗胃泌素抗体和胃泌素肽，其在受试者中诱导产生中和性抗胃泌素抗体；和/或包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸。在一些实施方式中，抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。在一些实施方式中，表位存在于以下各项中：氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)或EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)。在一些实施方式中，胃泌素肽包含选自以下各项的氨基酸序列：EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ IDNO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，第一试剂包含缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，可选地选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白的免疫原性载体。在一些实施方式中，胃泌素肽通过接头、可选地包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯的接头与免疫原性载体缀合。在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。在一些实施方式中，第一试剂还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。在一些实施方式中，第二试剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736和阿维鲁单抗。
在本发明公开的方法的一些实施方式中，胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，第一试剂诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
在一些实施方式中，本发明公开的主题提供了用于抑制受试者中胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的生长的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用包含第一试剂和第二试剂的组合物，所述第一试剂包含胃泌素免疫原、一种或多种抗胃泌素抗体，一种或多种抗CCK-B受体抗体或其任何组合，并且所述第二试剂包含免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，第一试剂选自胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。在一些实施方式中，第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ IDNO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，胃泌素肽缀合至免疫原性载体，可选地其中免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，胃泌素肽通过接头与免疫原性载体缀合，可选地，其中接头包括ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。在一些实施方式中，方法采用进一步包含佐剂，可选地基于油的佐剂的组合物。在一些实施方式中，针对与胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
在本发明公开的方法的一些实施方式中，胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，本发明公开的方法中使用的组合物诱导与胰腺癌有关的纤维化的减少和/或预防其发展。在一些实施方式中，该组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了用于诱导和/或增强针对受试者中与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过存在于胃泌素相关的肿瘤或癌症上的CCK-B受体减少或抑制胃泌素信号传导的试剂。在一些实施方式中，试剂包含胃泌素肽、抗胃泌素抗体、抗CCK-B受体抗体或其任何组合。在一些实施方式中，胃泌素肽包含胃泌素-17(G17)肽或其免疫原性片段。在一些实施方式中，胃泌素肽或其免疫原性片段包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，所述试剂包含缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，可选地其中免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，胃泌素肽通过接头，可选地包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯的接头，与免疫原性载体缀合。在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。在一些实施方式中，本发明公开的方法中使用的组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了用于使受试者中与胃泌素和/或CCK-B受体信号转导相关的肿瘤和/或癌症对针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导剂敏感的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含诱导和/或提供针对胃泌素肽的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂和诱导和/或提供针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的第二试剂，或它们的组合，可选地，其中第一试剂和第二试剂分别选自胃泌素肽和/或其片段和/或衍生物，其诱导受试者中的细胞免疫反应或产生中和性抗胃泌素抗体，和中和性抗胃泌素抗体和/或其片段和/或衍生物；以及和/或组合物，其包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸；和/或包含在CCK-B受体处阻断胃泌素生物学功能的试剂的组合物。在一些实施方式中，抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。在一些实施方式中，表位存在于氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)或EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)或EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)或EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)中。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，所述组合物包含缀合至免疫原性载体的胃泌素肽。在一些实施方式中，胃泌素肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，胃泌素肽经由接头缀合至免疫原性载体。在一些实施方式中，接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。在一些实施方式中，本发明公开的方法中使用的组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。在一些实施方式中，针对与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
在本发明公开的方法的一些实施方式中，胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，该组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。在一些实施方式中，该组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了用于预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症相关的纤维化的形成的方法。在一些实施方式中，该方法包括使肿瘤和/或癌症的细胞与直接或间接抑制胃泌素在肿瘤和/或癌症中的一种或多种生物学活性的试剂接触。在一些实施方式中，所述试剂提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液免疫反应，可选地，其中所述试剂选自抗胃泌素抗体和/或其片段和/或衍生物，以及在受试者中诱导产生中和性抗胃泌素抗体的胃泌素；和/或包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸；和/或包含阻断胃泌素激素功能的小分子化合物。在一些实施方式中，抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。在一些实施方式中，表位存在于氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)或EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)中。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，所述试剂包含胃泌素肽，其诱导缀合至免疫原性载体的中和性抗胃泌素抗体的产生。在一些实施方式中，胃泌素肽包含选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸1上的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，胃泌素肽通过接头，可选地包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯的接头，与免疫原性载体缀合。在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。在一些实施方式中，所述试剂还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。在一些实施方式中，本发明公开的方法进一步包括使肿瘤和/或癌症与第二试剂接触，该第二试剂包含针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物。在一些实施方式中，第二试剂是免疫检查点抑制剂。Isae，免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736和阿维鲁单抗。在本发明公开的方法的一些实施方式中，肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了本文公开的药物组合物在制备用于治疗与胃泌素相关的肿瘤或癌症的药物中的用途。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了本发明公开的药物组合物在治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症中的用途。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了本发明公开的药物组合物用于通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用一定量的本文所公开的药物组合物来预防、减少和/或消除与胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移的用途，该量足以增加受试者中对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的CD4–/CD8–TEMRA细胞的数量。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了本发明公开的药物组合物用于增加受试者中对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的TEMRA细胞的数量的用途。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了包含免疫检查点抑制剂和胃泌素免疫原的组合物在治疗胃泌素相关的肿瘤或癌症中的用途。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了包含免疫检查点抑制剂和胃泌素免疫原的组合物在制备治疗胃泌素相关的肿瘤或癌症的药物中的用途。
本发明公开的主题在一些实施方式中还提供了本发明公开的药物组合物在预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的用途。在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以增强CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的量的本文公开的药物组合物。在一些实施方式中，与未接受本文公开的药物组合物的受试者中所观察到的相比，该用途导致存活率提高、肿瘤生长减少和/或化疗和/或免疫检查点疗法的功效增强。
根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物在预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的用途，通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以减少FoxP3+抑制性T调节细胞的量的权利要求1-13中任一项所述的药物组合物。
因此，本发明公开主题的目的是提供一种用于治疗胃泌素相关的或含有CCK-B受体的肿瘤和/或癌症的方法。
已经在上文中陈述了本公开主题的一个目的，并且该目的通过本发明公开的组合物和方法全部或部分地实现，当结合在下文中最佳描述的附图进行描述时，其他目的将变得明显。
附图说明
图1是用于测试有或没有免疫检查点抑制剂的专利申请影响小鼠胰腺细胞肿瘤生长的能力的示例性实验策略的示意图。在一个特定的实施方式中，在治疗前-1周通过向C57BL/6小鼠注射5x 105鼠科动物mT3胰腺癌细胞(C57BL/6与mT3细胞同基因)来产生皮下肿瘤。每组10只小鼠(共40只)在t＝0、1和3周使用PAS治疗，和/或在t＝0、4、8、15和21天使用抗PD-1抗体(PD1-1 Ab；Bio X cell,West Lebanon,New Hampshire,United States ofAmerica)治疗。测量两次治疗之间的肿瘤体积。研究结束，从脾脏中收集PBMC，从小鼠中切除肿瘤并进行分析。
图2是条形图，显示了在用对照(仅磷酸盐缓冲盐水；PBS)、单独的PAS(每次给药100μg；PAS100)、单独的PD-1Ab(每次给药150μg；PD-1)或PAS(每次给药100μg)和PD-1Ab(每次给药150μg；PAS100+PD-1)的组合处理后，携带mT3的小鼠的以克为单位的平均肿瘤重量。NS：p≥0.05(即，不显著)；*与PBS相比和与PAS100相比，p<0.05；#与PD-1相比，p＝0.0017。误差条为±SEM。
图3A和图3B是用PBS、单独的PD-1Ab(每次给药150μg；PD1)，单独的PAS(每次给药100μg；PAS)，或PAS(每次给药100μg)和PD-1Ab(每次给药150μg；PAS/PD1)的组合治疗后，在CD3终末分化T细胞中存在的一系列CD4–/CD8–和CD4–/CD8–TEMRA细胞的图。图3A显示了经过各种处理的小鼠中CD3+/CD4–/CD8–和CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–(即，TEMRA)细胞的百分比。图3B显示了CD3+/CD4–/CD8–细胞中CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–TEMRA细胞的部分。通过在CD4–/CD8–淋巴细胞/10000中使CD3+/CD4–/CD8–淋巴细胞的百分比乘以CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–TEMRA细胞的百分比来计算细胞部分以计算CD3+T细胞分数中CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–TEMRA细胞的部分(参见图3B)。*p<0.05；**p<0.01。误差条为±1标准偏差。
图4A和图4B是一系列条形图，总结了在使用PAS100处理后在没有(图4A)和有(图4B)胃泌素重新刺激的各种T细胞亚群中针对TNFα、颗粒酶B、穿孔素和INFγ的细胞因子激活测定。图4A显示从用PAS100处理的小鼠的脾脏分离的T细胞确实被激活。当这些相同的细胞在培养中用胃泌素再刺激6小时时(图4B)，它们被再次刺激并释放出更多的每种细胞因子。黑色条：INFγ。浅灰色条：颗粒酶B。深灰色条：穿孔素。阴影灰色条：TNFα。
图5A和图5B是一系列条形图，比较了用PAS100单一疗法(图5A)或PAS100+PD-1联合疗法(图5B)处理的CD4–/CD8–(每个图中的左组)、CD8+(每个图中的中间组)和CD4+(每个图中的右组)T细胞亚群中相对于TNFα、颗粒酶B、穿孔素和INFγ的细胞因子释放。与来自PBS处理的小鼠的淋巴细胞相比，激活的T淋巴细胞释放增加的细胞因子。联合治疗小鼠的淋巴细胞释放明显更高水平的细胞因子，表明联合治疗在刺激激活的T细胞方面表现更好。PAS+PD-1Ab联合疗法尤其使TNFα升高2倍以上。黑色条：INFγ。浅灰色条：颗粒酶B。深灰色条：穿孔素。阴影灰色条：TNFα。
图6A和图6B显示了PBS对照、PD-1单一疗法、PAS100单一疗法以及PAS100&PD-1联合疗法对小鼠mT3胰腺癌细胞肿瘤中纤维化发展的结果。图6A描绘了用Masson三色染色法染色的mT3肿瘤，其可将胶原蛋白染成蓝色，并提供纤维化指示。图6B是总结图6A所示染色结果的条形图。值得注意的是，尽管用PD-1单一疗法和PAS100单一疗法治疗的肿瘤的整合密度与阴性对照PBS治疗无明显差异，PAS+PD-1Ab联合疗法导致密度(因此纤维化)降低，其与单独的PBS(p<0.005)和单独的PAS100(p<0.001)相比，具有统计学意义。***与PBS相比，p<0.005，且与PAS100相比，p<0.001。黑色条：PBS.浅灰色条：单独的PD-1。白色条：单独的PAS100。阴影灰色条：PAS100+PD-1。
图7A和图7B显示了PBS对照、PD-1单一疗法、PAS100单一疗法以及PAS100&PD-1联合疗法对小鼠中CD8+细胞浸润进入mT3胰腺癌细胞瘤中的结果。图7A描述了在被PBS、PD-1Ab(PD-1)单一疗法、PAS100单一疗法(专利申请)和PAS100&PD-1联合疗法治疗后，被结合至CD8的抗体染色的示例性mT3肿瘤对小鼠中CD8+细胞浸润进入mT3胰腺癌细胞肿瘤的影响。图7B是总结了图7A所示的数据的条形图。与阴性对照PBS治疗相比，使用PD-1(PD-1Ab)单一疗法或单独的PAS100治疗可显著提高肿瘤中CD8+细胞的水平(分别为p＝0.0019和p＝0.0026)。与单独的PBS(p＝4.7x 10-5)以及与单独的PD-1(p＝0.042)相比并且与单独的PAS100(p＝0.039)相比时，PAS+PD-1Ab联合疗法在肿瘤中产生甚至更高水平的CD8+细胞。单独的PD-1与单独的PAS100相比无显著差异(p>0.05)。与PBS相比，**p＝0.0026；***p＝0.0019；****p＝4.7x 10-5。误差条为±SEM。
图8A和图8B描述了mT3肿瘤中Foxp3+细胞的分析。图8A描述了用与Treg的标志物Foxp3蛋白结合的抗体染色的示例性的mT3肿瘤。领域比较显示，与PBS(左上图)、PD-1单一疗法(右上图)或PAS100单一疗法(左下图)相比，PAS100&PD-1联合疗法导致瘤内Treg的存在减少，表明PAS100+PD-1联合治疗可能会改变肿瘤内环境，使肿瘤内微环境可能特征在于与单独的单一疗法相比，其基于Treg的免疫抑制程度较低。图8B是总结图8A所例示的数据的条形图。与PBS相比，用PD-1单一疗法或PAS100单一疗法治疗的肿瘤中Foxp3+细胞的数量没有显著差异。用PAS100+PD-1Ab联合疗法治疗的肿瘤的Foxp3+细胞明显少于阴性对照。*p<0.038。黑色条：PBS.浅灰色条：单独的PD-1Ab。白色条：单独的PAS100。阴影灰色条：PAS100+PD-1Ab.误差条为±SEM。
具体实施方式
本文包含标题以供参考并有助于定位某些部分。这些标题无意限制下面描述的概念的范围，并且这些概念可以在整个说明书中的其他部分中应用。
I.一般考虑
在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用共同产生体液免疫抗肿瘤作用和细胞免疫抗肿瘤作用的治疗组合来治疗人和动物癌症的方法和系统。更具体地，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用以下药物的特定组合：(1)诱导免疫体液B细胞反应，其产生针对肿瘤和/或循环肿瘤生长因子的抗体；和(2)诱导或否则增强针对肿瘤的免疫细胞T细胞反应，以引起细胞毒T淋巴细胞反应。更具体地，本发明公开的主题在一些实施方式中涉及使用抗胃泌素癌疫苗与引起免疫检查点阻断的第二药物组合来治疗人类癌症的方法和系统。甚至更具体地，本发明公开的主题在一些实施方式中涉及用一种或多种设计用于引发对生长因子胃泌素活性形式的B细胞抗体反应的癌症疫苗治疗特定人类癌症。如本文首次公开的，在一些实施方式中，抗胃泌素疫苗可导致人类肿瘤开始对免疫检查点抑制剂的治疗产生反应，从而产生意想不到的累加或甚至协同联合治疗效果，从而增强总体抗肿瘤功效。
在一些实施方式中，本发明公开的主题还涉及使用方法的组合来治疗肿瘤和/或癌症的方法，所述方法既产生体液抗体免疫反应(胃泌素癌症疫苗)又产生细胞T细胞免疫反应(免疫检查点阻断)。在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用新的和独特的药物类别组合产生治疗人和动物胃肠道肿瘤中的新颖、出乎意料、加和和/或协同功效的组合物和方法，其产生体液免疫抗肿瘤作用加上细胞免疫抗肿瘤作用。在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用以下药物的特定组合，其：(1)诱导对肿瘤生长因子和/或循环肿瘤生长因子的免疫性体液B细胞反应；和(2)引起和/或增强针对肿瘤的免疫细胞T细胞反应，以引起细胞毒T淋巴细胞反应。在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用胃泌素癌症疫苗和一种或多种引起免疫检查点阻断的第二种药物的组合治疗人和动物癌症的方法和系统。在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及用一种或多种设计为引起B细胞抗体对生长因子胃泌素活性形式反应的癌症疫苗治疗特定的人类癌症，如本文公开的，这出乎意料地还导致人类肿瘤对使用免疫检查点抑制剂的治疗更加敏感，因此，产生了增强抗肿瘤功效的出乎意料的、加成的或甚至协同的联合治疗效果。在一些实施方式中，本发明公开的主题因此涉及与免疫检查点抑制剂一起使用PAS。在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用PAS作为癌症疫苗来诱导体液免疫和细胞免疫反应。
II.定义
本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明公开的主题。
尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。
除非下文另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文所用技术的引用旨在指代本领域中通常理解的技术，包括对那些技术的变型或对本领域技术人员显而易见的等效技术的替代。尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。
在描述本发明公开的主题时，将理解，公开了许多技术和步骤。这些中的每一个都有各自的益处，并且每个也可以与一种或多种或在一些情况下所有其他公开技术结合使用。
因此，为了清楚起见，该描述将避免以不必要的方式重复各个步骤的每种可能的组合。然而，应当在理解这样的组合完全在本文公开的和要求保护的主题的范围内的情况下阅读说明书和权利要求。
根据长期存在的专利法惯例，术语“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”在本申请包括权利要求中使用时指的是“一个或多个”。例如，短语“抑制剂”是指一种或多种抑制剂，包括多种相同的抑制剂。类似地，短语“至少一个”在本文中用于指代实体时指的是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多的该实体，包括但不限于1至100以及大于100的整数值。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的数量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。如本文所用，术语“约”在涉及诸如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的可测量值时，意在涵盖在一些实施方式中从指定量的±20％，在一些实施方式中±10％，在一些实施方式中±5％，在一些实施方式中±1％，在一些实施方式中±0.5％，在一些实施方式中±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法和/或采用公开的组合物。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据寻求通过本发明公开的主题获得的所需性质而变化。
如本文所用，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指单独或组合存在的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”分别包括A、B、C和D，但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合。
如本文所用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”是指包含基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因通常包括kappa(κ)、lambda(λ)、alpha(α)、gamma(γ)、delta(δ)、epsilon(ε)和mu(μ)恒定区基因，以及无数免疫球蛋白变量区域基因。轻链分为κ或λ。在哺乳动物中，重链分为γ、μ、α、δ或ε，其反过来定义了免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。其他物种具有其他轻链和重链基因(例如，某些禽类产生了所谓的IgY，这是一种母鸡沉积在其卵黄中的免疫球蛋白类型)，其类似地也被本发明公开的主题涵盖。在一些实施方式中，术语“抗体”是指与胃泌素基因产物上存在的表位特异性结合的抗体，包括但不限于存在于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列内的表位。
已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(平均分子量为约25道尔顿(kDa))和一条“重”链(平均分子量为约50-70kDa)。两条相同的多肽链对通过重链区域内存在的二硫键以二聚体形式结合在一起。每条链的N端定义了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体通常以完整的免疫球蛋白形式存在，或者以许多可以通过各种肽酶消化产生的充分表征的片段形式存在。例如，用木瓜蛋白酶消化抗体分子在二硫键的N-末端位置切割抗体。这产生三个片段：两个相同的“Fab”片段，其具有轻链和重链的N端，以及“Fc”片段，其包含由二硫键连接在一起的重链的C端。另一方面，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键的抗体C末端以产生称为“F(ab)'2”片段的片段，该片段是通过二硫键连接的Fab片段的二聚体。F(ab)’2片段可在温和条件下还原，以破坏铰链区的二硫键，从而将F(ab’)2二聚体转化为两个Fab'单体。Fab’单体本质上是具有部分铰链区的Fab片段(参见例如Paul，1993，以获得其他抗体片段的更详细描述)。关于这些各种片段，Fab、F(ab’)2和Fab’片段包括至少一个完整的抗原结合结构域，因此能够与抗原结合。
尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可以化学或通过重组DNA方法从头合成这些片段中的各种片段(包括但不限于Fab'片段)。因此，本文所用的术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。在一些实施方式中，术语“抗体”包括具有至少一个抗原结合结构域的片段。
抗体可以是多克隆或单克隆的。如本文所用，术语“多克隆”是指衍生自在给定抗体集合中一起存在的不同产生抗体的细胞(例如，B细胞)的抗体。示例性的多克隆抗体包括但不限于与特定抗原结合并且在该动物产生针对该抗原的免疫反应后在动物的血液中发现的那些抗体。然而，应理解，抗体的多克隆制剂也可以通过混合至少两种不同的抗体人工制备。因此，多克隆抗体通常包括针对(即，结合)任何给定抗原的不同表位(有时称为“抗原决定簇”或仅称为“决定簇”)的不同抗体。
如本文所用，术语“单克隆”是指单一抗体种类和/或单一抗体种类的基本同质的群体。换句话说，“单克隆”是指个体抗体或个体抗体群体，其中所述抗体在特异性和亲和力上相同，除了可能的天然发生的突变或可以少量存在的转译后修饰。通常，单克隆抗体(mAb)由单个B细胞或其后代细胞产生(尽管本发明公开的主题还涵盖通过本文所述的分子生物学技术产生的“单克隆”抗体)。单克隆抗体(mAb)具有高度特异性，通常针对单个抗原位点。此外，与多克隆抗体制剂相反，给定的mAb通常针对抗原上的单个表位。
除了其特异性外，mAb出于某些目的可能是有利的，因为它们可以被合成而不受其他抗体的污染。然而，修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，在一些实施方式中，使用Kohler等人，1975首先描述的杂交瘤方法制备本发明公开的主题的mAb，并且在一些实施方式中，使用重组DNA方法在细菌或真核动物或植物细胞中制备(参见例如，美国专利号4,816,567，其全部内容通过引用并入本文)。例如，也可以使用Clackson等人，1991和Marks等人，1991中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离mAb。
本发明公开的主题的抗体、片段和衍生物也可包括嵌合抗体。如本文在抗体的上下文中所使用的，术语“嵌合”及其语法变体是指这样的抗体衍生物，其具有基本上或仅来源于一种物种的抗体恒定区的恒定区和基本上或仅来自于另一物种的可变区的序列的可变区。特定类型的嵌合抗体是“人源化”抗体，其中通过用例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)替代人抗体的CDR来生产抗体(参见例如，PCT国际专利申请公开号WO 1992/22653)。因此，在一些实施方式中，人源化抗体具有恒定区和可变区，而不是基本上或仅来自相应人抗体区的CDR，以及基本上或仅来自人以外的哺乳动物的CDR。
本发明公开的主题的抗体、片段和衍生物也可以是单链抗体和单链抗体片段。单链抗体片段含有氨基酸序列，其具有本文所述的完整抗体的可变区和/或CDR中的至少一个，但是缺少那些抗体的一些或全部恒定结构域。这些恒定结构域对于抗原结合不是必需的，但构成完整抗体结构的主要部分。
单链抗体片段可以克服与使用包含部分或全部恒定结构域的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于没有生物分子与重链恒定区之间的不期望的相互作用，或其他不需要的生物学活性。另外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此比全抗体具有更大的毛细血管通透性，从而使单链抗体片段更有效地定位并结合至靶抗原结合位点。同样，可以在原核细胞中大规模产生抗体片段，从而促进它们的产生。此外，单链抗体片段相对较小的尺寸使其比全抗体更不可能在受体中引起免疫反应。本发明公开的主题的单链抗体片段包括但不限于单链片段可变(scFv)抗体及其衍生物，例如但不限于串联双scFv、串联三scFv、双体抗体(diabodies)和三体抗体(triabodies)、四体抗体(tetrabodies)、微型抗体(minibodies)和微抗体(minibodies)。
Fv片段对应于免疫球蛋白重链和轻链N末端的可变片段。Fv片段似乎比Fab片段的两条链具有更低的相互作用能。为了稳定VH和VL结构域的缔合，它们已与肽连接(参见Bird等人，1988；Huston等人，1988)、二硫键(Glockshuber等人，1990)和“孔内旋钮”(Zhu等人，1997)。ScFv片段可以通过本领域技术人员众所周知的方法产生(参见，例如Whitlow等人，1991和Huston等人，1993)。
scFv可以在细菌细胞如大肠杆菌中或在真核细胞中产生。scFv的一个潜在缺点是产品的单价性，由于多价结合及其短半衰期，其可以排除增加的亲合力。克服这些问题的尝试包括通过化学偶联(Adams等人，1993；McCartney等人，1995)或通过含有未配对的C端半胱氨酸残基的scFv的自发位点特异性二聚化(参见Kipriyanov等人，1995)，由含有额外C端半胱氨酸的scFv产生的二价(scFv’)2。
可替代地，可以通过将肽接头缩短至3至12个残基来迫使scFv形成多聚体，以形成“双体抗体”(参见Holliger等人，1993)。进一步降低接头可以产生scFv三聚体(“三体抗体”；参见Kortt等人，1997)和四聚体(“四体抗体”；参见Le Gall等人，1999)。二价scFv分子的构建也可以通过与蛋白质二聚化基序的遗传融合形成“微型抗体”(参见Pack等人，1992)和“微抗体”(参见Hu等人，1996)来实现。scFv-scFv串联((scFv)2)可以通过第三个肽接头连接两个scFv单元来生产(参见Kurucz等人，1995)。
可以通过两个单链融合产物的非共价结合产生双特异性双体抗体，所述两个单链融合产物由通过短接头连接的一种抗体的VH结构域与另一种抗体的VL结构域组成(参见Kipriyanov等人，1998)。可以通过如上所述引入二硫键或“孔内旋钮”突变或通过形成单链双体抗体(scDb)(其中两个杂合scFv片段通过肽接头连接)来增强此类双特异性双体抗体的稳定性(参见Kontermann等人，1999)。
例如，可以通过将scFv片段通过铰链区融合至IgG分子的CH3结构域或至Fab片段来产生四价双特异性分子(参见Coloma等人，1997)。可替代地，已经通过双特异性单链双体抗体的融合产生了四价双特异性分子(参见Alt等人，1999)。较小的四价双特异性分子也可以通过将scFv-scFv串联与含有螺旋-环-螺旋基序的接头(DiBi微型抗体；参见Muller等人，1998)或包含四个抗体可变结构域的单链分子(VH和VL)在防止分子内配对的方向上(串联双体抗体；参见Kipriyanov等人，1999)二聚化而形成。
双特异性F(ab’)2片段可以通过Fab'片段的化学偶联或通过亮氨酸拉链的异源二聚作用产生(参见Shalaby等人，1992；Kostelny等人，1992)。分离的VH和VL结构域也是可用的(参见美国专利号6,172,197；6,248,516和6,291,158)。
本发明公开的主题还包括抗胃泌素抗体的功能等同物。如本文所用，短语“功能等同物”如其是指抗体，是指具有与给定抗体的结合特征相当的结合特征的分子。在一些实施方式中，嵌合、人源化和单链抗体及其片段被认为是它们所基于的相应抗体的功能等同物。
功能等同物还包括氨基酸序列与本发明公开的主题的抗体的可变区或高变区的氨基酸序列基本相同的多肽。如本文关于氨基酸序列所使用的，短语“基本上相同”是指与另一氨基酸序列在一些实施方式中具有至少80％，在一些实施方式中具有至少85％，在一些实施方式中具有至少约90％，在一些实施方式中具有至少91％，在一些实施方式中具有至少92％，在一些实施方式中具有至少93％，在一些实施方式中具有至少94％，在一些实施方式具有至少95％，在一些实施方式具有至少96％，在一些实施方式具有至少97％，在一些实施方式具有至少98％，在一些实施方式中具有至少约99％的序列同一性的序列，如根据Pearson&Lipman，1988的FASTA搜索方法所确定的。在一些实施方式中，在本发明公开的主题的抗体的氨基酸序列的全长上进行同一性百分比计算。
功能等同物还包括与本发明公开主题的完整抗体具有相同或相当结合特性的抗体片段。此类片段可包含一个或两个Fab片段、F(ab′)2片段、F(ab’)片段、Fv片段或包含至少一个抗原结合结构域的任何其他片段。在一些实施方式中，抗体片段包含本发明公开的主题的完整抗体的所有六个CDR，尽管包含少于所有这些区域的片段，例如三个、四个或五个CDR，也可以是本文定义的功能等同物。此外，功能等同物可以是或可以结合以下免疫球蛋白类别中的任何一种的成员：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE及其子类，以及可能适用于非哺乳动物受试者的其他子类(例如，鸡和其他禽类物种的IgY)。
功能等同物还包括具有与本发明公开的主题的整个蛋白质的特征相同或相当的特征的肽。这种肽可以包含整个蛋白质的一种或多种抗原，其可以在被治疗的受试者中引发免疫反应。
功能等同物还包括适体和其他非抗体分子，只要这些分子具有与本发明公开的主题的完整抗体的结合特性相同或相当的结合特性。
术语“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。“包括”是本领域的术语，意味着存在所命名的要素和/或步骤，但是可以添加其他要素和/或步骤，并且仍然落入相关主题的范围内。
如本文所使用的，短语“由...组成”不包括未具体列举的任何要素、步骤或成分。应当指出，当在权利要求书的正文中出现短语“由……组成”时，而不是紧跟在序言之后时，其仅限制该条款中规定的要素；其他要素作为整体不排除在权利要求之外。
如本文所用，短语“基本上由......组成”将相关公开内容或权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及不会实质上影响所公开和/或所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些材料或步骤。例如，药物组合物可以“基本上”由药物活性剂或多种药物活性剂组成，这意味着所列举的药物活性剂是药物组合物中存在的唯一药物活性剂。然而，应注意，载体、赋形剂和/或其他非活性剂可以并且可能存在于这种药物组合物中，并且被包括在短语“基本上由...组成”的性质内。
关于术语“包含(comprising)”，“由......组成(consisting of)”和“基本上由......组成(consisting essentially of)”，其中本文使用这三个术语之一，本发明公开和要求保护的主题可包括使用其他两个术语中的任一项。例如，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及包含抗体的组合物。在回顾本公开之后，本领域的普通技术人员将理解，本发明公开的主题因此包括基本上由本发明公开的主题的抗体组成的组合物，以及由本发明公开的主题的抗体的组成的组合物。
如本文所用，短语“免疫细胞”是指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒T细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助性T细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和T细胞。
如本文所用，短语“免疫反应”是指包括但不限于先天免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫、炎性反应、获得性(适应性)免疫、自身免疫和/或过度活跃免疫的免疫。
如本文所用，短语“胃泌素相关的癌症”是肿瘤或癌症或其细胞，其中当外源性应用于肿瘤和/或癌细胞以及通过自分泌和旁分泌机制体内存活时，胃泌素基因产物充当促激素以刺激肿瘤和/或癌细胞生长。胃泌素相关的癌症的实例包括胰腺癌、胃癌、胃食管癌和结肠直肠癌。
如本文所用，术语“多核苷酸”包括但不限于DNA、RNA、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、短核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。
如本文所用，短语“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”和“scFv”抗体是指抗体的形式，该抗体仅包含通过接头肽连接的重链和轻链的可变区。
如本文所用，术语“受试者”是指任何无脊椎动物或脊椎动物物种的成员。因此，术语“受试者”在一些实施方式中旨在涵盖动物界的任何成员，包括但不限于脊索动物门(例如，硬骨鱼类(硬骨鱼)、两栖动物(两栖动物类)、爬行纲(爬行动物)、鸟纲(鸟类)和哺乳纲(哺乳动物)的成员，以及其中包含的所有目和家系。
本发明公开的主题的组合物和方法对于温血脊椎动物特别有用。因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及哺乳动物和鸟类。更具体地提供了来源于和/或用于哺乳动物的组合物和方法，所述哺乳动物例如人类和其他灵长类，以及由于濒临灭绝(例如西伯利亚虎)而重要的那些哺乳动物、而对人类具有重要经济意义(在农场饲养以供人类食用的动物)和/或社交重要性(作为宠物或动物园饲养的动物)，例如人类以外的食肉动物(如猫和狗)、猪(猪、生猪和野猪)、反刍动物(如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和兔子)、有袋类动物和马。还提供了公开的方法和组合物对鸟类的用途，包括濒临灭绝的那些鸟类种类或在动物园饲养的，以及家禽，更特别是家养家禽，例如家禽，例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了所公开的方法和组合物在牲畜上的用途，包括但不限于驯养的猪(猪和生猪)、反刍动物、马、家禽等。
如本文所用，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的并且可同义使用。实例包括但不限于初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、细胞毒T细胞、T调节细胞、辅助T细胞及其组合。
如本文所用，短语“治疗剂”是指用于例如治疗、抑制、预防、减轻疾病或病症作用、降低疾病或病症严重性、降低疾病或病症发展的可能性、减缓疾病或病症发展和/或治愈疾病或病症的试剂，疾病或病症例如但不限于胃泌素相关的肿瘤和/或癌症。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目的是预防或减慢(减轻)目标病理状况，预防病理状况，追求或获得有益结果，和/或降低个体形成病况、疾病或病症的机会，即使治疗最终是失败的。需要治疗的那些包括已经患有该病况的那些以及那些容易患有或倾向于患有一种病况、疾病或病症的那些，或者是要预防该病况的那些。
如本文所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长和/或增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌变前和癌变细胞和组织的转移的起始、进展、生长、维持直接或间接受胃泌素的自分泌和/或旁分泌作用影响。术语“癌症”和“肿瘤”在本文可互换使用，并且可以指受试者中任何组织的原发性和转移性实体瘤以及癌，包括但不限于胰腺癌、胃癌、胃食管癌和结肠直肠癌(本文统称为“胃泌素相关的”肿瘤和/或癌症)。如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”还旨在指多细胞肿瘤以及单个肿瘤或肿瘤前期细胞。在一些实施方式中，癌症或肿瘤包括上皮组织的癌症或肿瘤，例如但不限于癌。在一些实施方式中，肿瘤是腺癌，其在一些实施方式中是胰腺、肝、胃、食道、结肠或直肠的腺癌，和/或从其衍生的转移性细胞。在一些实施方式中，肿瘤和/或癌症与纤维化有关，这意味着作为肿瘤和/或癌症的发展的直接或间接结果，一个或多个纤维化区域通常在肿瘤和/或癌症区域内发展。
本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于适用于本文公开的组合物和方法的任何物种的同系物和/或直系同源物。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应当理解，当公开了来自特定物种的基因或基因产物时，本公开仅意图是示例性的，并且不应解释为限制性的，除非其出现的上下文明确指出。因此，例如，对于
Figure BDA0002384271360000321
生物序列数据库登录号：NP_000796.1中显示的胃泌素基因产物，公开的人氨基酸序列旨在涵盖来自其他动物的同源和直系胃泌素基因和基因产物，包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类。还涵盖编码所公开的氨基酸序列的任何和所有核苷酸序列，包括但不限于在相应的
Figure BDA0002384271360000331
条目中公开的那些(即，分别为NP_000796.1和NM_000805.4)。
III.抗胃泌素疫苗的研发
通过利用胃泌素作为PC和其他胃肠道癌的关键自分泌和旁分泌生长因子的参与，已经采取了一种独特的方法来进行与肿瘤相关的基于抗原的疫苗。这种方法涉及通过使用称为“多克隆抗体刺激物”或PAS的化合物针对胃泌素17(G17)的主动体液免疫来中和胃泌素的向生体性效应。PAS包含9个氨基酸胃泌素表位，其来源于G17的N端序列，在小鼠和人类中相同，并通过接头分子与白喉类毒素(DT)缀合。该化合物已配置在基于油的佐剂中以产生PAS。PAS刺激特异性和高亲和力的多克隆抗G17抗体的产生，而单独的DT没有效果(Watson等人，1996)。在几种胃泌素反应的胃肠道(GI)动物模型中进行了临床前研究，包括结肠癌(Singh等人，1986；Smith&Solomon，1988；Upp等人，1989；Smith等人，1996b)、胃癌(Smith等人，1998a；Watson等人，1989)、肺癌(Rehfeld等人，1989)和胰腺癌(Smith等人，1990；Smith等人，1991；Smith等)等人，1995；Segal等人，2014)。
在动物中，已显示PAS生成的抗G17抗体可减少胃肠道肿瘤的生长和转移(Watson等人，1995；Watson等人，1996；Watson等人，1999)。在胃肠道癌的动物模型中，PAS主动免疫和PAS产生的抗G17抗体被动免疫均已证实肿瘤生长(Watson等人，1998；Watson等人，1999)。
在患有晚期胰腺癌的人类受试者中进行了一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照组的PAS治疗晚期胰腺癌的序贯试验。这项研究的主要目的是比较单一疗法PAS与安慰剂对患者生存的影响。总体而言，65％的患者产生了针对PAS的抗体反应。PAS治疗组的受试者生存时间比安慰剂组更长(分别为平均150天和84天；p＝0.016)。然而，如果根据患者对PAS产生免疫反应(即PAS反应者)还是未产生免疫反应(即PAS无反应者)进行分层，则反应者的生存率将显著提高(p＝0.003)。
迄今为止，在临床试验中已经用PAS治疗了469名PDAC患者。这些受试者中约90％引起保护性抗体滴度。来自四项研究(PC1、PC2、PC3和PC6；Brett等人，2002；Gilliam等人，2012)的汇总数据显示，与无反应患者相比，有反应的患者中值生存天数(191天)显著增加(106天；p＝0.0003)。重要的是，这些患者均未显示出任何自身免疫型反应对胃泌素正常水平和功能产生负面影响的证据。
已知PAS会引发B细胞反应，并产生针对胃泌素的中和抗体。然而，临床研究表明，还有长期的存活者，这表明抗肿瘤免疫的其他机制也可能负责。
IV.PAS+检查点抑制剂联合疗法
IV.A.通常
PAS施用产生针对癌胚胎蛋白胃泌素的体液抗体反应和细胞免疫反应，其在PDAC中表达不当(即，过表达)。PDAC中这种不合适的胃泌素表达会导致自分泌和旁分泌的生长促进作用。PAS施用及其随后产生的针对胃泌素的体液抗体，将有助于消除这种促进病理生长的作用。此外，对胃泌素的PAS介导的体液免疫反应也将有助于逆转与不适当的胃泌素表达相关的血管生成的促进、细胞凋亡的规避、细胞迁移的增加以及侵袭性酶表达的增加(Watson等人，2006)。
PAS包含3个亚基。第一个亚基是胃泌素表位，在一些实施方式中，其是包含人G17的氨基末端氨基酸残基1-9的肽，具有在半胱氨酸残基终止的羧基末端七(7)个氨基酸间隔序列。该第一亚基的示例性序列是EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)。
PAS的第二亚基是将第一亚基与第三亚基共价连接的接头。在一些实施方式中，接头是ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰胺酯(eMCS)，尽管任何接头，包括非肽接头，例如但不限于聚乙二醇接头，可用于该目的。
PAS的第三亚基是白喉类毒素，其被用作载体蛋白以增强针对第一亚基的体液反应(特别是针对胃表位的体液反应)。然而，应注意，在一些实施方式中，可以使用除白喉类毒素以外的载体蛋白，例如但不限于破伤风类毒素或牛血清白蛋白。
在一些实施方式中，配制了三个亚基用于肌内(i.m.)注射，并且该制剂具有优异的物理、化学和药学性质。PAS还引起B细胞反应，并产生针对胃泌素的中和抗体。这在PDAC中是相关的，因为胃泌素增加细胞增殖、促进血管生成、促进细胞凋亡的规避、增加细胞迁移、增加侵袭性酶表达，并与PDAC微环境上的纤维化有关。根据本公开主题的一些方面，如果胃泌素的作用被阻断，则CD8+淋巴细胞流入PDAC，使其更可能对免疫检查点疗法产生反应(例如，T细胞介导的反应)。如本文公开的。PAS还引发T细胞反应和CD8+细胞，其响应胃泌素刺激而产生细胞因子。
PAS可设计为治疗性疫苗或免疫治疗剂。PAS诱导的体液抗体具有高度特异性，通常特征在于对G17和Gly-G17的高度亲和力。
PAS持续诱导针对激素G17及其前体G17-Gly的抗体的治疗有效水平。已经完成了22个临床研究，总共1,542名患者。重要的是，用PAS进行治疗表现出优异的安全性和耐受性特性，并进一步提高了结直肠癌、胃癌和胰腺癌患者的生存益处。用作单一疗法时，示例性剂量和时间表被确定为在0、1、3周给药250μg/0.2ml。
综上所述，可以从22项研究和大于1,500例接受PAS治疗的患者中得出的结论如下：
(a)非临床数据证明抗G17抗体具有体外和体内抗肿瘤功效，在包括人胰腺癌在内的各种癌症模型中具有广泛的治疗指数。
(b)PAS可以非常安全且耐受良好的剂量施用，可以有效引起针对胃泌素的B细胞抗体反应，而无不良反应，也不会诱导自身免疫反应不良；和
(c)大量的临床研究表明，包括胰腺癌在内的胃肠道肿瘤均具有生存优势，并且抗G17抗体反应的产生与生存率的提高之间具有相关性。
然而，临床研究也表明存在长期的生存者，这表明从PAS施用还可带来其他治疗益处。尽管不希望受到任何特定的操作理论的束缚，但PAS治疗也可能已经诱导了特征在于这些受试者中细胞毒T细胞和记忆细胞激活的T细胞免疫反应。
在PDAC中，检查点抑制剂的使用受到限制，并且仅证明了适度的结果。在许多临床试验中，CTLA-4、PD-1和PD-L1抑制剂已在患有局部晚期或转移性PDAC的患者中进行了研究(Royal等人，2010；Brahmer等人，2012；Segal等人，2014)。度伐鲁单抗(MEDI 4736)在2014年美国临床肿瘤学会(Segal等人，2014)进行的初步分析中产生了8％的部分缓解率。
未知为何胰腺肿瘤已被证明对靶向检查点抑制剂的基于单克隆抗体(mAb)的免疫疗法具有相对抗性。抗免疫检查点抑制剂免疫疗法的失败可能与免疫抑制白细胞的大量浸润有关，其实际上可以抑制抗肿瘤免疫反应。这可能与RAS致癌基因的表达有关，其驱动一种炎症程序，有助于在胰腺肿瘤微环境中建立免疫赦免(Zheng等人，2013)。
IV.B.检查点抑制剂产生细胞毒T细胞反应
免疫系统在区分自身(即“正常”细胞)和“非自身”或“外源”细胞(无论这是感染中发现的细菌还是通常在肿瘤和癌症中发现的改变和/或转化的细胞)中起关键的核心作用。关于此过程，免疫系统需要精确的调节才能在识别“自身”时“关闭”，因此它不会对正常的人体细胞产生自身免疫反应，而在识别外源和/或转化的细胞时也需要“打开”。实际上，细胞转化是一个相对普遍的事件，但是免疫系统对此保持高效和有效的监视，以高效和有效地消除外源和/或转化的细胞。肿瘤形成和癌症是相对罕见的事件，因为只有在极少数情况下，转化的细胞才会发展出可以破坏正常免疫系统检查点的机制，从而导致免疫系统无法将其识别为已转化，从而避免了免疫攻击，通过例如，细胞毒T淋巴细胞附着于转化的肿瘤细胞。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1；也称为CD279)是一种细胞表面受体，可作为T细胞表面上的检查点。PD-1似乎起着“关闭开关”的作用，因此T细胞不会对体内正常细胞产生细胞毒T淋巴细胞攻击。人PD-1是作为288个氨基酸前体蛋白生产的，其示例性氨基酸序列提供为
Figure BDA0002384271360000371
生物序列数据库的登录号NP_005009.2(由
Figure BDA0002384271360000372
登录号NM_005018.2编码)。288个氨基酸前体包括信号肽作为
Figure BDA0002384271360000373
登录号NP_005009.2的氨基酸1-20，将其去除以生成成熟的肽(即，
Figure BDA0002384271360000374
登录号NP_005009.2的氨基酸21-288)。存在于
Figure BDA0002384271360000375
生物序列数据库中的其他物种的人类PD-1直系同源物的氨基酸序列包括但不限于登录号NP_032824.1(小家鼠(Mus musculus))、NP_001100397.1(大家鼠(Rattus norvegicus))、NP_001301026.1(家犬(Canis lupus familiaris))、NP_001138982.1(家猫(Felis catus))、NP_001076975.1(家牛(Bos taurus))、XP_004033550.1(大猩猩(Gorilla gorilla gorilla))、NP_001107830.1(恒河猴(Macacamulatta))、NP_001271065.1(食蟹猴(Macaca fascicularis))和XP_003776178.1(苏门答腊猩猩(Pongo abelii))。
PD-1受体的配体称为程序性死亡配体1(PD-L1)。它也称为CD274或B7同系物1(B7-H1)。在人类中，PD-L1蛋白有几种同种型，其中最大的同种型产生作为290个氨基酸前体。人PD-L1前体蛋白的示例性氨基酸序列作为
Figure BDA0002384271360000381
生物序列数据库的登录号NP_054862.1提供(由
Figure BDA0002384271360000382
登录号NM_014143.3编码)。290个氨基酸前体包括信号肽作为
Figure BDA0002384271360000383
登录号NP_054862.1的氨基酸1-18，其被去除以产生成熟的肽(即
Figure BDA0002384271360000384
登录号NP_054862.1的氨基酸19-290)。存在于
Figure BDA0002384271360000385
生物序列数据库中的其他物种的人类PD-L1直系同源物的氨基酸序列包括但不限于登录号NP_068693.1(小家鼠)、NP_001178883.1(大家鼠)、NP_001278901.1(家犬)、XP_006939101.1(家猫)、NP_001156884.1(家牛)、XP_018889139.1(大猩猩)、NP_001077358.1(恒河猴)、XP_015292694.1(食蟹猴)和XP_009454557.1(苏门答腊猩猩)。
PD-L1主要存在于正常细胞上，当表达PD-1的T细胞通过PD-L1与正常细胞结合时，它会向T细胞发出信号，表明这是正常细胞(即“自身”)，并且针对(正常)细胞的细胞毒T细胞反应受到抑制。由于大多数转化的细胞通常不表达PD-L1，因此通常会被淘汰，这意味着表达PD-1的T细胞在遇到此类细胞时不会被“关闭”，而会被“激活”，从而消除了该转化的细胞。然而，在极少数情况下，转化的细胞确实表达了PD-L1配体，导致T细胞对转化的细胞的反应停止。因此，表达PD-L1的转化的细胞可以逃避细胞毒T细胞反应。发生这种情况时，无法识别的转化的细胞可以扩增、获得其他突变，并长成恶性转移性肿瘤。
抑制PD-1/PD-L1检查点(称为“免疫检查点抑制剂”)可干扰PD-1/PD-L1结合，从而使T淋巴细胞将肿瘤和/或癌细胞识别为非自身细胞，导致针对肿瘤和/或癌细胞的细胞毒T淋巴细胞反应。这可以通过靶向T细胞上的PD-1或肿瘤和/或癌细胞上的PD-L1的药物有效阻断PD-1/PD-L1相互作用来实现。对该过程的关键至少有两个要求：首先，免疫检查点抑制剂必须到达肿瘤和/或癌症的部位以阻断PD-1和PD-L1之间的任何相互作用；其次，肿瘤和/或癌症本身必须可接近细胞毒T细胞。
另一个检查点蛋白是细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4；也称为CD152)蛋白。像PD-1一样，CTLA-4是一种细胞表面受体，其可以下调免疫反应。Treg表达CTLA-4，如激活的T细胞一样。当CTLA-4受体与抗原呈递细胞(APC)(如PD-1)表面上存在的CD80或CD86结合时，它就成为免疫反应的“关闭开关”。
人CTLA4-TM同种型是一种223个氨基酸前体蛋白，其具有在
Figure BDA0002384271360000391
登录号NP_005205.2(由
Figure BDA0002384271360000392
登录号NM_005214.4编码)中列出的氨基酸序列。该蛋白质包括35个氨基酸信号肽，其在去除时产生188个氨基酸成熟肽。存在于
Figure BDA0002384271360000393
生物序列数据库中的其他物种的人类CTLA-4直系同源物的氨基酸序列包括但不限于登录号NP_033973.2(小家鼠)、NP_113862.1(大家鼠)、NP_001003106.1(家犬)、NP_001009236.1(家猫)、NP_776722.1(家牛)、XP_004033133.1(大猩猩)、XP_009181095.2(恒河猴)、XP_005574073.1(食蟹猴)和XP_526000.1(黑猩猩)。
这样，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及与一种或多种免疫检查点抑制剂一起施用PAS。更具体地，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及靶向CTLA-4、PD-1和/或PD-L1的免疫检查点抑制剂的用途。抑制这些免疫检查点抑制剂的示例性化合物包括下列。对于CTLA-4：伊匹单抗(
Figure BDA0002384271360000401
品牌；Bristol-Myers Squibb,New York,NewYork)和替西木单抗(原名Ticilimumab；Medimmune,LLC，Gaithersburg,Maryland)。对于PD-1：纳武单抗(
Figure BDA0002384271360000402
品牌；Bristol-Myers Squibb,New York,New York)、匹地利珠单抗(Medivation，San Francisco,California)、派姆单抗(
Figure BDA0002384271360000403
品牌；Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,New Jersey)、MEDI0680(AMP514；Medimmune,LLC,Gaithersburg,Maryland)和AUNP-12(Aurigene Discovery Technologies Limited/Laboratoires Pierre Fabre SA)。对于PD-L1：BMS-936559/MDX-1105(Bristol MyersSquibb,New York,New York)、阿特珠单抗(
Figure BDA0002384271360000404
品牌；Genentech/Roche,South San Francisco,California)、度伐鲁单抗(MEDI4736；Medimmune,LLC,Gaithersburg,Maryland)和阿维鲁单抗(
Figure BDA0002384271360000405
品牌；EMD Serono,Inc.,Rockland,Maryland,and Pfizer Inc.,New York,New York)。
有证据有力地表明，当比较PD-1和PD-L1抑制剂时，存在更多的与功效和毒性相关的共通性而不是分歧。实际上，在交叉试验元类型分析中，纳武单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗和MDX1105在毒性和功效方面显示出非常相似(但不完全相同)的特征。尽管对于各种PD-1和PD-L1抑制剂，亲和力和当前给药方案可能有所不同，但通常所有治疗剂都有非常宽的治疗窗。与此广泛的治疗窗相关的是观察结果，大多数这些检查点抑制剂在I期都不会失败，并且许多临床开发计划正朝着统一剂量方案而非计量给药方案发展。
尽管靶向PD-1和PD-L1的药物具有相似的作用方式、功效概况和毒性概况，但总体上它们之间还是存在一些细微的差异。阿维鲁单抗与其他PD-L1靶向药物相比可能具有一些优势，因为它能够以抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADDC)反应补充专利申请衍生的B细胞反应。阿维鲁单抗还具有天然的Fc受体，因此可以引发“正常”ADCC反应，而阿特珠单抗在Fc区具有修饰，其有望减少ADCC响应(至少在人类中)。
比较不同的PD-1和PD-L1靶向药物时要注意的另一个区别是，某些是人源化mAb，而另一些是完全人源mAb。当将人源化mAb施用给人时，预期人源化mAb的特征在于与完全人源mAb相比，诱导“过敏”型反应的可能性增加。
V.组合物
V.A.药物组合物
在一些实施方式中，本发明公开的主题提供了药物组合物，其在一些实施方式中可用于本发明公开的主题的方法中。
如本文所用，“药物组合物”是指将被用作治疗或其他方法的一部分的组合物，其中药物组合物将被施用于需要其的受试者。在一些实施方式中，需要其的受试者是患有肿瘤和/或癌症的受试者，其至少一种症状、特征或结果预期至少部分由于药物组合物的生物学活性而得到改善，直接和/或间接在肿瘤和/或癌症和/或与之相关的细胞上起作用。
制备药物组合物的技术是本领域已知的，并且在一些实施方式中，药物组合物是基于要施用药物组合物的受试者来配制的。例如，在一些实施方式中，配制药物组合物以用于人类受试者。因此，在一些实施方式中，药物组合物是用于人类的药学上可接受的。
在一些实施方式中，本发明公开的主题的药物组合物包含第一试剂，其诱导和/或提供针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应；和免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，第一试剂选自胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。在一些实施方式中，第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ IDNO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸位置1的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，胃泌素肽缀合至免疫原性载体，可选地其中免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。在一些实施方式中，胃泌素肽通过接头与免疫原性载体缀合，可选地，其中接头包括ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
在一些实施方式中，被设计为引起体液免疫反应的本发明公开的主题的药物组合物可以进一步包含佐剂，可选地基于油的佐剂。示例性佐剂包括但不限于褐煤胺ISA-51(Seppic,Inc.)；QS-21(Aquila Pharmaceuticals,Inc.)；Arlacel A；油酸；破伤风辅助肽；GM-CSF；环磷酰胺；卡介苗(BCG)；短小棒状杆菌；左旋咪唑；azimezone；isoprinisone；二硝基氯苯(DNCB)；钥孔戚血蓝蛋白(KLH)，包括弗氏佐剂(完全和不完全)；矿物凝胶；氢氧化铝(明矾)；溶血卵磷脂；复合多元醇；聚阴离子；肽；油乳剂；核酸(例如，dsRNA)二硝基苯酚；白喉毒素(DT)；Toll样受体(TLR，例如TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9)激动剂(例如，内毒素，例如脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；聚肌苷酸-聚胞苷酸(
Figure BDA0002384271360000421
Oncovir,Inc.,Washington,DC,United States of America)；IMO-2055，吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)、QS-21–从皂皮树的树皮中提取的皂苷，又称皂皮树或皂树皮；瑞喹莫德(TLR7/8激动剂)、CDX-1401–一种融合蛋白，由对与NY-ESO-1肿瘤抗原连接的树突状细胞受体DEC-205有特异性的完全人类单克隆抗体组成；Juvaris的阳离子脂质DNA复合物；Vaxfectin；及其组合。
在一些实施方式中，本发明公开的主题的药物组合物可以包含免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂是抑制靶标多肽生物活性的一类化合物，该靶标多肽选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
在本发明公开的药物组合物的一些实施方式中，第一试剂包含一定量的胃泌素肽，其包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自有效诱导抗胃泌素体液反应的EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ IDNO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，并且第二试剂包含一定量的检查点抑制剂，当施用给患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者时，该免疫检查点抑制剂有效地诱导或增强针对胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应。
在本发明公开的药物组合物的一些实施方式中，第一试剂包含一种或多种抗CCK-B受体抗体，并且当施用给患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者时，以足以减少或抑制经由胃泌素相关的肿瘤或癌症上存在的CCK-B受体的胃泌素信号转导的量存在于药物组合物中。
在一些实施方式中，本发明公开的主题的药物组合物用于治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症。在一些实施方式中，本发明公开的主题的药物组合物旨在治疗胰腺癌。
V.B.核酸
术语“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、具有双链和单链区域的RNA、分离的RNA(例如，部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及经过改变的RNA或类似RNA，其通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变与天然RNA有所不同。此类改变可包括在siRNA末端或内部(例如在RNA的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。本发明公开的主题的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为天然存在的RNA的类似物或类似物。
术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”、“小发夹RNA”、“siRNA”和shRNA可互换使用并且是指能够介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默的任何核酸分子。参见例如，Bass,Nature 411:428-429,2001；Elbashir等人，Nature 411:494-498,2001a；和PCT国际公开号WO 00/44895、WO 01/36646、WO 99/32619、WO 00/01846、WO 01/29058、WO 99/07409和WO 00/44914。在一个实施方式中，siRNA包含双链多核苷酸分子，其包含互补的有义和反义区，其中反义区包含与靶核酸分子(例如，编码胃泌素基因产物的核酸分子)的区域互补的序列。在另一个实施方式中，siRNA包括具有自我互补的有义和反义区的单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列。在另一个实施方式中，siRNA包含具有一个或多个环结构的单链多核苷酸和包含自我互补的有义和反义区的茎，其中反义区包含与靶核酸分子区域互补的序列，并且其中核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。如本文所用，siRNA分子不必限于仅包含RNA的那些分子，而且还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
本发明公开的主题利用短的双链RNA分子引起细胞基因的下调的能力，该过程称为RNA干扰。如本文所用，“RNA干扰”是指由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。一般参见Fire等人，Nature 391:806-811,1998。转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，已经进化以防止外源基因的表达(Fire,Trends Genet15:358-363,1999)。
RNAi可能已经进化为保护细胞和生物体免受某些病毒(尤其是双链RNA病毒或生命周期包括双链RNA中间体的那些病毒)感染而产生的双链RNA(dsRNA)分子的侵害，或转座因子通过特异性降解与双链RNA物种同源的单链RNA或病毒基因组RNA的机制随机整合到宿主基因组中。
细胞中的长dsRNA的存在刺激Dicer酶(一种核糖核酸酶III)的活性。Dicer催化dsRNA降解为短片段的dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA；Bernstein等人，Nature 409:363-366,2001)。由Dicer介导的降解产生的小干扰RNA通常长度为约21-23个核苷酸，并包含约19个碱基对双链体。降解后，将siRNA掺入被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物中。RISC能够介导与siRNA双链体的反义链互补的细胞内存在的单链RNA的切割。根据Elbashir等人，靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的单链RNA区域RNA中间附近(Elbashir等人，Genes Dev 15:188-200,2001b)。
RNAi已在几种细胞类型和生物体中进行了描述。Fire等人，1998描述了在秀丽线虫(C.Elegans)中)中的RNAi。Wianny&Zernicka-Goetz,Nature Cell Biol 2:70-75,1999公开了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人，Nature 404:293-296,2000能够通过将dsRNA转染到这些细胞中来诱导果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等人，Nature 411:494-498,2001a证明了通过引入合成的21个核苷酸RNA的双链体在包括人胚胎肾和HeLa细胞的培养的哺乳动物细胞中存在RNAi。
其他研究表明，siRNA双链体的靶互补链上的5'-磷酸促进siRNA活性，并且ATP用于维持siRNA上的5'-磷酸部分(Nykanen等人，Cell 107:309-321,2001)。当引入siRNA分子时可能容忍的其他修饰包括糖磷酸主链的修饰或核苷被氮或硫杂原子中的至少一个取代(PCT国际公开号WO 00/44914和WO 01/68836)和某些核苷酸修饰，这些修饰可能会抑制双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)的激活，特别是2'-氨基或2'-O-甲基核苷酸和含有2'-O的核苷酸或4’-C亚甲基桥的核苷酸(加拿大专利申请号2,359,180)。
公开了使用dsRNA和RNAi的其他参考文献包括PCT国际公开号WO 01/75164(使用果蝇细胞的体外RNAi系统，以及将特定的siRNA分子用于某些功能基因组和某些治疗应用)；WO 01/36646(使用dsRNA分子抑制哺乳动物细胞中特定基因表达的方法)；WO 99/32619(将dsRNA分子引入细胞中以抑制基因表达的方法)；WO 01/92513(通过使用增强RNAi的因子介导基因抑制的方法)；WO 02/44321(合成的siRNA构建体)；WO 00/63364和WO 01/04313(抑制多核苷酸序列功能的方法和组合物)；和WO 02/055692和WO 02/055693(使用RNAi抑制基因表达的方法)。
在一些实施方式中，本发明公开的主题利用RNAi至少部分地抑制至少一种胃泌素基因产物的表达。抑制优选地是正常表达量的至少约10％。在一些实施方式中，该方法包括将RNA以足以抑制胃泌素基因产物表达的量引入到靶细胞中，其中RNA包含对应于目的基因的编码链的核糖核苷酸序列。在一些实施方式中，靶细胞存在于受试者中，并且RNA引入到受试者中。
RNA可以具有双链区，该双链区包括第一链和第二链，该第一链包含与编码靶蛋白的基因(例如，胃泌素基因产物)的编码链相对应的核糖核苷酸序列，该第二链包含与第一链互补的核糖核苷酸序列。第一链和第二链彼此杂交形成双链分子。双链区的长度可以是至少15个碱基对，并且在一些实施方式中，长度可以在15至50个碱基对之间，在一些实施方式中，双链区的长度为15至30个碱基对。
在一些实施方式中，RNA包含通过分子内自杂交形成双链区的一条链，其优选在至少19个碱基上互补。在一些实施方式中，RNA包含两条独立的链，其通过在至少19个碱基上互补的分子间杂交形成双链区。
本领域技术人员将认识到，可以使用许多合适的通用技术将RNA引入靶细胞。在一些实施方式中，将编码RNA的载体引入靶细胞。例如，可将编码RNA的载体转染到靶细胞中，然后通过细胞聚合酶转录RNA。
在一些实施方式中，可以产生包含编码RNA的核酸的重组病毒。然后将RNA引入靶细胞中包括用重组病毒感染靶细胞。细胞聚合酶转录RNA，导致RNA在靶细胞内表达。工程重组病毒是本领域普通技术人员众所周知的。技术人员将容易地认识到涉及选择合适的病毒和载体组分所涉及的多个因素，需要所述合适的病毒和载体组分以优化重组病毒生产以用于本发明公开的主题，而无需在本文进一步详细讨论。作为一个非限制性实例，可以工程改造包含编码siRNA的DNA的重组腺病毒。可以将该病毒工程化成复制缺陷的，使得细胞可以被重组腺病毒、转录的siRNA感染，并在感染的靶细胞中瞬时表达。重组病毒产生和使用的详细信息可以在PCT国际专利申请公开号WO 2003/006477中找到，其全部内容通过引用并入本文。可替代地，可以使用用于产生重组病毒的商业试剂盒，诸如例如pSILENCER ADENO1.0-CMV SYSTEMTM品牌病毒生产套件(Ambion,Austin,Texas,United States ofAmerica)。
V.C.基因编辑
基因产物的下调也可以使用CRISPR-Cas基因编辑系统完成，如在授予Zhang的美国专利号8,945,839及其中引用的参考文献(Al-Attar等人，2011；Makarova等人，2011；LeCong等人，2013；Seung Woo Cho等人，2013a，b；Carroll,2012；Gasiunas等人，2012；Hale等人，2012；和Jinek等人，2012)中所述，其所有内容均通过引用其全部内容并入本文。在一些实施方式中，用于CRISPR-Cas基因编辑系统的方法和组合物包括靶向胃泌素基因序列的核酸，其在一些实施方式是肿瘤和/或癌症中的胃泌素基因序列。
V.D.制剂
在一些实施方式中，本文所述的组合物包括包含药学上可接受的载体的组合物。合适的制剂包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和溶质的水性和非水性无菌注射溶液，其使制剂与预期受试者的体液等渗；和可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。在一些实施方式中，本发明公开的主题的制剂包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
该方法中使用的组合物可以采取诸如在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。该方法中使用的组合物可以采取包括但不限于口周、静脉内、腹膜内、肌内和肿瘤内制剂的形式。可替代地或另外地，活性成分可以是粉末形式，以在使用前与合适的介质(例如，无菌无热原的水)一起构造。
制剂可以单位剂量或多剂量容器形式存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件中储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体。
对于口服给药，该组合物可以采用例如片剂或胶囊剂的形式，该片剂或胶囊剂是通过常规技术与药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)制成。可以通过本领域已知的方法将片剂包衣。例如，可以将神经活性类固醇与氢氯噻嗪联合配制，并制成具有肠溶或延迟释放包衣的pH稳定核，其保护神经活性类固醇直至其到达结肠。
用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂的形式，或者它们可以干燥产品的形式存在，以在使用前用水或其他合适的载体构建。可以通过常规技术用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸甲酯或山梨酸)制备这种液体制剂。该制剂还可适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以适当地配制用于口服给药的制剂以提供活性化合物的控制释放。对于颊给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
这些化合物也可以配制成用于植入或注射的制剂。因此，例如，可以将化合物与合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶的衍生物(例如，作为微溶的盐)配制。
化合物还可以油形式配制，其以油包水乳液、水包油乳液或水包油包水乳液形式施用。
化合物还可以配制成直肠组合物(例如，含有常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯的栓剂或保留灌肠剂)、乳膏剂或洗剂或透皮贴剂。
在一些实施方式中，本发明公开的主题采用药学上可接受的用于人类的组合物。本领域普通技术人员理解可以存在于药学上可接受的用于人类的组合物中的那些组分的性质，以及应当从药学可接受的用于人类的组合物中排除那些组分。
V.E.剂量
如本文所用，短语“治疗有效量”、“治疗有效量”、“治疗量”和“有效量”可互换使用，并且是指足以产生可测量的反应的治疗组合物的量(例如，与被治疗的受试者的生物学或临床相关反应)。可以改变本发明公开的主题的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便施用有效地实现针对特定受试者的所需治疗反应的活性化合物(多个)的量。所选剂量水平可取决于治疗组合物的活性、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗疾病的严重程度、受治疗的受试者的疾病状态和病史等。然而，在本领域技术范围内以低于实现所需治疗效果所需的剂量开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。
治疗组合物的效力可以变化，因此“治疗有效量”可以变化。然而，本领域技术人员可以容易地评估本发明公开的主题的候选调节剂的效力和功效，并相应地调整治疗方案。
在阅读本文公开的主题的公开内容之后，本领域普通技术人员可以考虑特定的制剂、与组合物一起使用的施用方法和其他因素。剂量的进一步计算可以考虑受试者的身高和体重、症状的严重程度和阶段以及是否存在其他有害的身体状况。这种调整或变化，以及何时以及如何进行这种调整或变化的评估，是药学领域的普通技术人员所熟知的。
因此，在一些实施方式中，术语“有效量”在本文中是指包含提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液或细胞免疫反应的试剂和/或包含抑制胃泌素基因产物、其药学上可接受的盐、其衍生物或它们的组合的表达的核酸的的量组合物，其足以产生可测量的抗肿瘤和/或抗癌生物学活性。可以改变本发明公开的主题的组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便施用有效地实现针对特定受试者和/或应用的所需反应的活性化合物(多个)的量。选择的剂量水平可取决于多种因素，包括组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗疾病的严重程度以及所治疗的受试者的身体状况和既往病史。在一些实施方式中，给予最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量增加至最小有效量。有效剂量的确定和调节以及何时和如何进行这种调节的评估是本领域普通技术人员已知的。
为了施用本文公开的组合物，可以使用本领域普通技术人员已知的技术来进行基于向鼠科动物模型施用的剂量推断人的剂量的常规方法。药物剂量也可以每平方米身体表面积的毫克数表示，因为这种方法而非体重与某些代谢和排泄功能实现良好的相关性。此外，如Freireich等人(1966)所述，体表面积可以用作成人和儿童以及不同动物物种中药物剂量的共同指标。简而言之，要将任何给定物种中的mg/kg剂量表示为等效的mg/m2剂量，请将剂量乘以适当的km系数。在成人中，100mg/kg相当于100mg/kg×37kg/m2＝3700mg/m2。
有关制剂和剂量的其他指导，请参见美国专利号5,326,902；5,234,933；PCT国际公开号WO 93/25521；Remington等人，1975；Goodman等人，1996；Berkow等人，1997；Speight等人，1997；Ebadi,1998；Duch等人，1998；Katzung,2001；Gerbino,2005。
V.F.施用途径
本发明公开的组合物可以任何形式和/或通过任何施用途径施用给受试者。在一些实施方式中，制剂是缓释制剂、控释制剂或设计用于缓释和控释的制剂。如本文所用，术语“持续释放”是指活性剂的释放，使得随着时间的流逝，大约恒定量的活性剂可用于受试者。术语“控释”范围更广，是指活性剂随时间的释放可能会或可能不会保持恒定水平。特别地，“控释”涵盖其中活性成分不一定以恒定速率释放，而是可以包括随时间增加释放、随时间减少释放和/或随着一个或多个增加释放、减少释放或它们的组合的时间而恒定释放的情况和制剂。因此，尽管“持续释放”是“控释”的形式，但后者还包括采用在不同时间递送的活性剂的量变化的递送方式。
在一些实施方式中，持续释放制剂、控释制剂或它们的组合选自口服制剂、经口制剂、颊制剂、肠内制剂、肺部制剂、直肠制剂、阴道制剂、鼻制剂、舌制剂、舌下制剂、静脉内制剂、动脉内制剂、心内制剂、肌内制剂、腹膜内制剂、透皮制剂、颅内制剂、皮内制剂、皮下制剂、雾化制剂、眼用制剂、可植入制剂、积存注射制剂、透皮制剂及其组合。在一些实施方式中，施用途径选自口服、经口、颊、肠、肺、直肠、阴道、鼻、舌、舌下、静脉内、动脉内、心内、肌内、腹膜内、经皮、颅内、皮内、皮下、眼部、通过植入物以及通过贮存注射。如果适用，连续输注可增强药物在靶部位的累积(参见，例如，美国专利号6,180,082)。也参见美国专利号3,598,122；5,016,652；5,935,975；6,106,856；6,162,459；6,495,605；和6,582,724；和美国专利申请公开号2006/0188558关于透皮制剂和组合物的递送方法。在一些实施方式中，施用通过选自经口、静脉内、腹膜内、吸入和肿瘤内的途径进行。
根据本文公开的方法使用的本发明公开的主题的组合物的特定施用方式可以取决于多种因素，包括但不限于所采用的制剂、待治疗病症的严重性、组合物中的活性剂(例如，PAS)是否意图局部或全身地起作用，以及在施用后代谢或去除活性剂的机制。
VI.方法和用途
在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及在与治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症有关的各种方法和/或用途的背景下使用药物组合物、产生用于治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的药物、抑制胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的生长、诱导和/或增强针对胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的体液和/或细胞免疫反应、使受试者中与胃泌素和/或CCK-B受体信号转导相关的肿瘤和/或癌症对针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导物敏感，特别是在胰腺癌的情况下，预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症相关的纤维化的形成；预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的转移；增加肿瘤和/或癌症中肿瘤浸润的CD8+淋巴细胞的数量；减少存在于肿瘤和/或癌症中的FoxP3+抑制性T调节细胞的数量；和增加对与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症有反应的受试者的TEMRA细胞的数量。这些方法和/或用途的每一种在下文中更详细地描述。
VI.A.治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的方法
在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及用于治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的方法。在一些实施方式中，该方法包括向需要其的受试者(例如，患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受试者)施用有效量的组合物，该组合物包含诱导和/或提供针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂；和诱导和/或提供针对胃泌素相关肿瘤或癌症的细胞免疫反应的第二试剂。因此，在一些实施方式中，本发明公开的方法依赖于具有一种或多种活性剂的药物组合物的用途，所述活性剂共同提供两种不同的免疫治疗活性：提供和/或诱导针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应，并诱导和/或提供针对胃泌素相关肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应。
关于提供和/或诱导针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应，存在于本公开主题的药物组合物中的第一试剂选自：由设计以诱导针对胃泌素的主动体液反应的胃泌素肽和/或抗胃泌素抗体和/或设计以提供针对胃泌素和/或CCK-B受体的被动体液反应的抗CCK-R抗体，在一些实施方式中，CCK-B受体存在于胃泌素相关的肿瘤和/或癌症上。尽管不希望受到任何特定的作用理论的束缚，但针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应被设计为通过CCK-B受体部分或完全抑制胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的胃泌素信号传导，通过减少受试者中存在的循环胃泌素的量和/或通过中和和/或封闭抗体干扰胃泌素与CCK-B受体的结合来减少胃泌素与CCK-B受体的结合。
因此，在一些实施方式中，第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:1-4中任一项的氨基酸位置1处的谷氨酸残基是焦谷氨酸残基。在一些实施方式中，在药物组合物中，胃泌素肽可选地通过接头，进一步可选地包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯的接头，与免疫原性载体缀合。免疫原性载体的非限制性实例包括白喉类毒素、破伤风类毒素、钥孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。上文中更详细地描述了第一试剂的结构，但是在一些实施方式中，接头和胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
如本领域的普通技术人员在考虑了本公开后将理解的，在一些实施方式中，药物组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂，以当需要主动抗胃泌素体液免疫反应时，增强胃泌素肽和/或胃泌素肽缀合物的免疫原性。
为了诱导针对胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应，本发明公开的主题的方法采用了包含一种或多种检查点抑制剂的药物组合物。众所周知，检查点抑制剂抑制具有免疫检查点活性的靶标多肽的一种或多种生物活性。示例性的此类多肽包括细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)多肽、程序性细胞死亡1受体(PD-1)多肽和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)多肽。在一些实施方式中，检查点抑制剂包含通过抑制或阻止PD-1多肽与PD-L1多肽之间的相互作用而结合和/或干扰T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用的抗体或小分子。示例性这种抗体和小分子包括但不限于伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
本发明公开的主题的药物组合物可以包括各种量的第一和第二试剂，条件是在受试者中诱导和/或提供体液和细胞反应，以及为了最大程度地提高治疗效果和/或最小化其不希望的副作用，可以调节药物组合物中存在的第一和第二试剂的量。然而，在一些实施方式中，本发明公开的主题的药物组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
在一些实施方式中，用于治疗本发明公开的主题的胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的方法包括向有此需要的受试者施用直接或间接抑制肿瘤和/或癌症中胃泌素的一种或多种生物学活性的第一试剂和包含针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物的第二试剂。因此，在一些实施方式中，第一试剂通过提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液免疫反应而直接或间接抑制胃泌素在肿瘤和/或癌症中的一种或多种生物学活性，可选地其中所述试剂选自抗胃泌素抗体和胃泌素肽，其在受试者中诱导产生中和性抗胃泌素抗体；和/或包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸。在考虑了本公开之后，本领域普通技术人员将理解抑制胃泌素基因产物表达的核酸，并且本文在上文中讨论了实例。
抗胃泌素抗体是本领域已知的，并描述于美国专利号5,607,676；5,609,870；5,622,702；5,785,970；5,866,128；和6,861,510中。也参见PCT国际专利申请公开号WO 2003/005955和WO 2005/095459。这些美国专利和PCT国际专利申请公开中的每一个的内容都全文结合在此。在一些实施方式中，抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。在一些实施方式中，表位存在于一个或多个氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)中。
在一些实施方式中，向受试者施用本发明公开的主题的药物组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
在一些实施方式中，本发明公开的治疗方法被设计为抑制受试者中胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的生长和/或存活。在一些实施方式中，本发明公开的方法因此包括向受试者施用包含第一试剂和第二试剂的组合物，所述第一试剂包含胃泌素免疫原、一种或多种抗胃泌素抗体，一种或多种抗CCK-B受体抗体或其任何组合，并且所述第二试剂包含检查点抑制剂。
因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题提供了本文公开的药物组合物在制备治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的药物中的用途，以及本文公开的药物组合物在治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症中的用途。
在一些实施方式中，与单独用任何一种试剂治疗相似受试者相比，本文公开的多试剂药物组合物提供增强、更有效和/或更成功的与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的治疗。
VI.B.诱导和/或增强针对胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的方法
本发明公开的主题还提供了用于诱导和/或增强针对受试者中与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过存在于胃泌素相关的肿瘤或癌症上的CCK-B受体减少或抑制胃泌素信号传导的试剂，从而诱导和/或增强针对受试者的胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应。如本文所用，短语“诱导和/或增强针对与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应”及语法变体是指由于向患有胃泌素相关的受试者施用有效量的组合物而导致的情况，所述组合物包含通过胃泌素相关的肿瘤或癌症上存在的CCK-B受体减少或抑制胃泌素信号传导的试剂，在给药后的相关时间时间，在受试者中基于T细胞的免疫反应水平比在没有治疗的情况下在受试者中出现的更高。通过存在于与胃泌素相关的肿瘤或癌症上的CCK-B受体减少或抑制胃泌素信号转导的试剂包括本文公开的可干扰胃泌素肽与CCK-B受体相互作用的试剂，包括但不限于胃泌素肽和/或免疫原、抗胃泌素抗体、抗CCK-B受体抗体、胃泌素/CCK-B信号转导的小分子抑制剂及其组合。
VI.C.使肿瘤和/或癌症对细胞免疫反应的诱导物敏感的方法
在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了用于使受试者中与胃泌素和/或CCK-B受体信号转导相关的肿瘤和/或癌症对针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导剂敏感的方法。如本文所用，短语“使受试者中与胃泌素和/或CCK-B受体信号转导相关的肿瘤和/或癌症对细胞免疫反应的诱导物敏感”是指与在没有治疗的情况下，向受试者中施用一种或多种细胞免疫反应的诱导物时受试者中的细胞免疫水平相比，向受试者施用一种或多种细胞免疫反应的诱导物时，在受试者中产生细胞免疫反应水平的治疗。
在一些实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含诱导和/或提供针对胃泌素肽的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂和诱导和/或提供针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的第二试剂，或它们的组合，可选地，其中第一试剂和第二试剂分别选自胃泌素肽和/或其片段和/或衍生物，其诱导受试者中的细胞免疫反应或产生中和性抗胃泌素抗体，和中和性抗胃泌素抗体和/或其片段和/或衍生物；以及和/或组合物，其包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸；和/或包含在CCK-B受体处阻断胃泌素生物学功能的试剂的组合物。在一些实施方式中，抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。
因此，在一些实施方式中，用于使受试者中与胃泌素和/或CCK-B受体信号转导相关的肿瘤和/或癌症对细胞免疫反应的诱导物敏感的本发明方法包括向受试者施用本文公开的药物组合物以诱导和/或向受试者提供针对受试者中胃泌素肽的主动和/或被动体液免疫反应，以及诱导和/或提供针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应。
VI.D.预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症相关的纤维化的方法
PC还特征在于致密的纤维化环境(Neesse等人，2011)，其帮助促进血管生成并形成物理屏障，可抑制化疗治疗剂和免疫治疗剂渗透到胰腺肿瘤部位(Templeton&Brentnall，2013)。本文公开了出乎意料和令人惊讶的观察，即通过PAS施用，可选地与一种或多种免疫检查点抑制剂组合，可以降低作为PC纤维化的标志的纤维化性质。尽管不希望受到任何特定的操作理论的束缚，但纤维化的减少可以促进其他药物的更大渗透，包括但不限于大分子，如检查点mAbs。这可以解释为什么迄今为止，检查点抑制剂的特征是非常适度的功效，这可能是由于检查点mAbs无法穿透PDAC细胞。因此，本发明公开的主题的一个方面是，当作为单一疗法给予时，PAS加免疫检查点抑制剂分别具有抗PDAC肿瘤活性，但是当作为本文公开的组合疗法给予时，它们具有更大的活性。
根据本发明公开的主题，提供了具有多样但互补甚至协同作用机制的新颖和创新的药物组合，以解决PDAC固有的纤维化性质，并有利于允许更大范围进入大型单克隆抗体(mAbs)的肿瘤环境，例如但不限于抗免疫检查点抑制剂mAbs。虽然不希望受到任何特定的操作理论的束缚，但PAS加上免疫检查点抑制剂作为联合疗法的一部分一起施用时，可以产生协同作用以通过减少与PDAC相关的纤维化使肿瘤更可接近化学治疗剂和免疫检查点抑制剂药物，从而使抗肿瘤治疗剂靶向PD-1和PD-L1的相互作用，从而诱导针对胃泌素相关肿瘤的细胞免疫反应。
用PAS的治疗导致对自分泌和旁分泌肿瘤/癌生长因子胃泌素的体液免疫反应(即抗体反应)。这样，PAS通过影响细胞增殖、凋亡、血管生成、侵袭和转移来影响肿瘤/癌症(例如，PDAC)表型。如本文所公开的，PAS在减少与PDAC有关的纤维化方面也有效。尽管不希望受到任何特定的操作理论的束缚，但认为这可以增强大分子(例如但不限于免疫检查点抑制剂mAbs)获得更多进入胰腺肿瘤部位的能力，这反过来将有望促进更大的细胞免疫作用。PAS还导致对胃泌素的细胞免疫反应。因此，本文公开了通过PAS施用结合免疫检查点抑制剂例如抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4mAb的施用来治疗肿瘤和/或癌症的方法，以解决对需要进入肿瘤以取得疗效的治疗剂具有抗性的PDAC固有的纤维化和顽固性。
因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题提供了通过使肿瘤和/或癌症的细胞与直接或间接抑制胃泌素在肿瘤和/或癌症中的一种或多种生物学活性的试剂接触来预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症，可选地胰腺癌有关的纤维化的形成的方法。上文在本文中公开了直接或间接抑制胃泌素的一种或多种生物学活性的试剂，包括提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液免疫反应的试剂(例如但不限于抗胃泌素抗体和/或片段和/或其衍生物)，以及在受试者中诱导产生中和性抗胃泌素抗体的胃泌素肽；抑制胃泌素基因产物表达的抑制性核酸；阻断胃泌素激素功能的小分子化合物及其任何组合。在一些实施方式中，抗胃泌素抗体包含针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体，在一些实施方式中，该表位存在于一个或多个氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)中。
与本文公开的胃泌素和胃泌素肽的其他免疫原性形式一样，在一些实施方式中，胃泌素肽与免疫原性载体缀合，可选地免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
在一些实施方式中，用于预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症，可选地胰腺癌有关的纤维化的形成的方法还包括使肿瘤和/或癌症与第二试剂接触，该第二试剂包含针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物。细胞免疫反应的示例性刺激物包括免疫检查点抑制剂，例如抑制靶标多肽的生物学活性的那些抑制剂，所述靶标多肽选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)，包括但不限于伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736和阿维鲁单抗。
在一些实施方式中，在其中预防、减少和/或消除纤维化形成的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
VI.E.调节受试者和其中存在的肿瘤中的T细胞亚群的方法
如本文所公开的，观察到向患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受试者施用本发明公开的主题的药物组合物以改变存在于患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受治疗的受试者中的循环T细胞亚群以及肿瘤和/或癌症本身中存在的T细胞亚群。
在一些实施方式中，向患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受试者施用本发明公开的主题的药物组合物导致存在于胃泌素相关的肿瘤和/或癌症中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的数量增加。本领域中公认的是，TIL具有抗肿瘤和抗癌活性，因此增加肿瘤和/或癌症中TIL的数目可以导致单独使用本发明公开的主题的药物组合物或与其他一线和/或二次治疗组合的各种治疗策略的抗肿瘤和/或抗癌功效更高。
在一些实施方式中，向患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受试者施用本发明公开的主题的药物组合物导致存在于胃泌素相关的肿瘤和/或癌症中的FoxP3+抑制性T调节细胞(Treg)的数量减少。在本领域中公认的是，Treg具有免疫抑制活性，特别是肿瘤和癌症特异性的免疫抑制活性，因此减少肿瘤和/或癌症中FoxP3+抑制性Treg的数目可以导致单独使用本发明公开的主题的药物组合物或与其他一线和/或二次治疗组合的各种治疗策略的抗肿瘤和/或抗癌功效更高。在一些实施方式中，减少肿瘤和/或癌症中FoxP3+抑制性Treg的数量可导致一线化疗的更高疗效。
在一些实施方式中，向患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受试者施用本发明公开的主题的药物组合物导致受试者的抗胃泌素TEMRA细胞的增加。TEMRA细胞是在外周循环和组织中发现的效应记忆T细胞。TEMRA细胞似乎具有哨兵活性，因为它们可能参与识别转移。这样，增加受试者中的抗胃泌素TEMRA细胞可以预防、减少和/或消除与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症相关的转移。因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及通过用本文公开的药物组合物治疗受试者增加识别胃泌素相关的肿瘤和/或癌抗原和表达它们的细胞的TEMRA细胞的方法。
概括地，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及包含免疫检查点抑制剂和胃泌素免疫原的本发明公开的组合物用于单独作为一线治疗、或与其他一线疗法组合、或与适合用于患有胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的受试者的任何其他疗法组合地治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的用途。
VII.结论
因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及用于使用单独或共同产生体液抗体免疫反应(例如，使用胃泌素癌症疫苗PAS)和细胞T细胞免疫反应的方法的组合来治疗癌症的联合疗法(例如，使用胃泌素癌疫苗PAS或免疫检查点抑制剂)。更具体地，描述了使用本发明描述的产生体液免疫和细胞免疫抗肿瘤反应的药物类别结合细胞免疫抗肿瘤作用来治疗人和动物胃肠道肿瘤的出乎意料的累加和/或协同功效。
更具体地，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及使用以下药物的特定组合：(i)诱导针对肿瘤生长因子或循环肿瘤生长因子的体液B细胞免疫反应；(ii)诱导和/或增强针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应(即，抗肿瘤和/或癌症T细胞反应)以引起细胞毒T淋巴细胞反应。
这样，在一些实施方式中，本文公开的是使用胃泌素癌疫苗与克服免疫检查点失败的第二种药物的组合来治疗人和动物肿瘤和癌症的方法。因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及用针对引起生长因子胃泌素的活性形式的B细胞和/或抗体免疫反应和细胞免疫反应的癌症疫苗治疗特定人类癌症，具有意想不到的观察结果，这种疫苗治疗还使肿瘤对免疫检查点抑制剂的治疗更具反应性，从而产生了意想不到的、累加的或甚至协同的联合治疗效果，从而增强了抗肿瘤功效。
另外，通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以增加CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量的量的权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，可以将本发明公开的主题的药物组合物用于预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移。
根据权利要求104所述的用途，其中与未施用药物组合物已经发生的那些相比，所述施用导致所述受试者的存活率提高、肿瘤生长降低、和/或化学治疗剂和/或免疫检查点治疗的功效增强。
根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物在预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的用途，通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以减少FoxP3+抑制性T调节细胞的量的权利要求1-13中任一项所述的药物组合物。
实施例
以下实施例提供了说明性实施方式。鉴于本公开和本领域的一般技术水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅旨在是示例性的，并且在不脱离本发明公开的主题的范围的情况下可以采用许多变化、修改和变更。
实施例的材料和方法
细胞系：鼠科动物mT3胰腺癌细胞是从David Tuveson博士的实验室(Cold SpringHarbor Laboratories,Cold Spring Harbor,New York,United States of America；seealso Boj et al.,2015)获得。这些细胞已显示出表达CCK-B受体产生胃泌素，并被用作肿瘤模型。这些细胞在同基因C57BL/6小鼠中产生肿瘤(Smith等人，2018)。
研究设计：所有动物研究均按照乔治城大学(Washington,D.C.,United Statesof America))的机构动物管理及使用委员会(IACUC)批准的协议以道德的方式进行。40名雄性(6周龄)C57BL-小鼠皮下注射了500,000个细胞到胁部。接种后第6天，100％的小鼠具有可触及的肿瘤，并分成四(4)组，每组n＝10只小鼠，以使所有组的基线肿瘤体积相等。小组如下：
1.PBS对照(PBS)
2.PAS 100μg(PAS100)
3.PD-1Ab 150μg(PD-1)
4.PD-1抗体(150μg)+PAS 100μg(PD-1+PAS100)
注射mT3细胞后一周(7天)，非对照组的小鼠按以下方式接受专利申请和/或PD-1Ab的施用：如果小鼠属于接受PAS的组，则PAS为从随机化开始(基线时间＝0)注射作为ip注入100μl并且在第1周和第3周再注射。将PD-1抗体(Bio X细胞，West Lebanon,NewHampshire,United States of America)以150μg腹腔注射的剂量给予适当的小鼠(在研究期间t＝0、4、8、15和21天五次)。对照小鼠在给予PAS的同一天接受PBS。每周用卡尺测量肿瘤体积，并计算为L x(w)2x 0.5。
组织学：在生长31天后，通过CO2窒息和颈椎脱位对小鼠进行道德上安乐死。将小鼠称重，切除胰腺肿瘤，然后将它们称重。将肿瘤分开，将肿瘤的一半固定在4％的石蜡的甲醛中进行组织学检查，另一半在液氮中速冻。通过Masson的三色染色法评估了与肿瘤相关的纤维化。Masson三色分析使用ImageJ图像处理和分析软件(由美国国立卫生研究院(NIH)的Wayne Rasband开发，Bethesda,Maryland,United States of America；可以通过NIH网站获得的)由对治疗不知情的技术人员完成。
为了进行免疫组织化学，从石蜡包埋的块(10μm)上切下肿瘤，并固定在载玻片上。将肿瘤切片用抗CD8抗体(1:75；eBioscienceTM,San Diego,California,United States ofAmerica)或抗Foxp3抗体(1:30；eBioscienceTM)染色。对免疫反应性细胞进行手动计数。
脾T细胞分离。取下每只动物的脾脏，称重，并置于含有5ml RPMI1640培养基的60mm培养皿中。用剃须刀将脾脏机械切碎。将含有脾脏组织的培养基通过100μM细胞过滤器过滤至50ml试管中，并用培养基冲洗几次，直至最终体积为40ml。然后用40μM细胞过滤器再次将脾组织过滤到50ml试管中，并在4℃下以1500rpm离心以沉淀细胞5分钟。除去上清液，并将细胞沉淀重悬于40ml PBS中，然后通过在4℃下以1500rpm离心5分钟使细胞沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3ml的洗涤缓冲液(含2mM EDTA和0.5％牛血清白蛋白的PBS)中，然后缓慢加入到15ml试管中的5ml Ficoll培养基的顶部上。在减速度设为零的情况下以2100rpm离心20分钟后，从缓冲液和Ficoll之间的白色层收集淋巴细胞。将淋巴细胞洗涤另外两次，重悬于培养基中并计数。
流式细胞术。将一百万个淋巴细胞添加到5ml的透明试管中(目录号352054；BDFalcon,Bedford,Massachusetts,United States of America)，用PBS平衡体积，并将细胞以1500rpm沉淀5分钟。用PBS洗涤后，将50μl的预稀释的Zombie NIRTM品牌可固定活力溶液(
Figure BDA0002384271360000663
San Diego,California,United States of America)添加到细胞中，然后在室温下于黑暗中孵育20分钟。洗涤细胞，然后通过加入5μl纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32(小鼠BD Fc BlockTM品牌试剂；BD Biosciences,San Jose,California,UnitedStates of America)封闭并孵育20分钟。
将表1中列出的抗体与淋巴细胞反应，并使用FACSARIATMIIu品牌细胞分选仪(BDBiosciences)以375nm、405nm、488nm和633nm激光线进行流式细胞术。
表1
用于流式细胞仪T细胞染色的采用抗体
Figure BDA0002384271360000661
用于重新刺激。将1或200万个分离和洗涤的淋巴细胞添加至用于两个重复板的6孔板的每个孔中，并将每个的体积调至相同(2或3ml)。将布雷菲德菌素A溶液(
Figure BDA0002384271360000662
1000X Catalogue No.420601)以1μl/ml添加到每个孔中。1μM的胃泌素-14(Sigma Aldrich目录号SCP0152，氨基酸序列为pEGPWLEEEEEAYGW；SEQ ID NO:5)以1μl/ml添加到每个孔中，每个板的最终胃泌素浓度为1nM。另一复制板不用胃泌素-14处理并用作对照。将6孔板置于37℃的细胞培养箱中6小时。然后使用细胞内固定和透化缓冲液套件(eBioscienceTM目录号88-8824-00)去除、洗涤和透化细胞。添加包含表2中列出的四(4)种抗体的细胞因子抗体预混液(4种抗体用于8个样品，因此每种抗体10μl即可制成预混液)，并在4℃下孵育过夜。
表2
用于重新刺激分析的抗体
荧光标记 靶 供应商
PE/Dazzle594 TNFα eBioscience<sup>TM</sup>
APC IFNγ eBioscience<sup>TM</sup>
PE 颗粒酶-B eBioscience<sup>TM</sup>
FITC 穿孔素 eBioscience<sup>TM</sup>
进行流式细胞术以分析用胃泌素或PBS重新刺激的细胞中的细胞因子。流式细胞术数据的分析是使用FCSExpress-6软件(De Novo Software,Glendale,California,United States of America)进行。
实施例1
在小鼠中产生肿瘤
为了确定PAS治疗是否既诱导体液免疫反应又诱导细胞免疫反应，并为免疫检查点抗体治疗提供协同作用，通过将5 x 105鼠科动物mT3胰腺癌细胞的0.1ml的PBS溶液皮下引入肋部，在免疫能力强的小鼠(例如与鼠科动物mT3胰腺癌细胞同基因的C57BL/6小鼠)中产生肿瘤。待肿瘤形成一周后，用PAS和一种或多种免疫检查点抑制剂治疗小鼠，如图1所示。
在mT3胰腺癌细胞接种后一周开始对动物进行治疗，因为此时间范围可确保研究中的所有动物均患有可触及的皮下肿瘤，并且该治疗不会干扰肿瘤启动。主要终点是肿瘤的生长和生存。每周用卡尺测量肿瘤的生长，并计算肿瘤的体积为L x W2 x 0.5。切除肿瘤并通过免疫组织化学对免疫细胞进行组织学检查，所述免疫细胞包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和T调节细胞(Treg)。还检查了肿瘤中通常与PDAC相关的纤维化发展的存在和程度。除去脾脏，分离T细胞，并用胃泌素重新刺激。用一组针对细胞因子的相关抗体标记细胞，并通过流式细胞术表征。
每个实验使用40只小鼠(每组n＝10；见图1)，并植入5x105胰腺鼠科动物癌细胞。用PBS(阴性对照)、PAS单一疗法(在肿瘤细胞接种后0、1、2和3周，每次给药100μg)治疗具有mT3鼠科动物胰腺肿瘤的免疫能力强的同基因小鼠组，抗PD-1抗体(PD1-1 Ab；Bio X cell,West Lebanon,New Hampshire,United States of America)作为免疫检查点抑制剂(第一次PAS疫苗接种后0、4、8、15和21天，每次给药150μg)，或PAS疫苗接种(在肿瘤细胞接种后0、1、2和3周，每次给药100μg)和免疫检查点抑制剂(在第一PAS免疫接种后0、4、8、15和21天，每次给药150μg)的组合。腹膜内施用对程序性细胞死亡蛋白1(PD1-1 Ab；Bio X cell,WestLebanon,New Hampshire,United States of America)特异的免疫检查点封锁抗体。数据汇总在下表3和图2中。
表3
每个治疗组的平均小鼠体重
Figure BDA0002384271360000681
Figure BDA0002384271360000691
NS：不显著
在PBS对照小鼠和PD-1和PAS100治疗组的小鼠中，最终肿瘤重量(以克为单位)之间无统计学差异。相反，与PBS(p＝0.014)和PD-1对照(p＝0.0017)相比，用PD-1和PAS100组合治疗的小鼠的肿瘤明显更小。此外，PD-1和PAS100的联合治疗所产生的肿瘤也明显小于PAS100单一治疗(p<0.05)。
实施例2
终末分化的CD3中的TEMRA CD4–/CD8–细胞的分析
T细胞亚群
如实施例1所述在小鼠中诱导肿瘤。从脾脏外周血单核细胞(PBMC)中分离出T淋巴细胞，这些细胞是从用PBS、PD-1Ab、PAS100或PAS100+PD-1Ab治疗的小鼠中分离出来的。使用表1中列出的抗体通过流式细胞仪鉴定T细胞的各种亚群。特别地，分离出第一个T细胞亚群，即CD3+/CD4–/CD8–，然后从该亚群中分离出代表CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–的TEMRA细胞的另一亚群。已确定了已使用PBS、PD-1Ab、PAS100或PAS100+PD-1Ab治疗的小鼠中存在的这些各种亚群中的百分比和比例，并且结果显示在图3A和图3B中。
图3A显示了用PBS、PD-1Ab、PAS100或PAS100/PD-1处理的小鼠中CD3+T细胞中的TEMRA细胞(CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–)的百分比。图3B显示了是TEMRA细胞的每个治疗组中的CD3+/CD4–/CD8–细胞的比例。
各治疗组之间最显著的差异是，PAS100的CD4–/CD8–TEMRA细胞比PBS低，而PAS100+PD-1治疗产生与PBS相比相似的CD4–/CD8–TEMRA细胞。用PAS100/PD1治疗的小鼠的T细胞中的T细胞中的TEMRA细胞的部分(CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–)比使用单独的PBS或PAS100治疗的小鼠高出2倍以上，这表明TEMRA细胞(CD3+/CD4–/CD8–/CD44–/CD62L–)很好地防御和抵抗与胃泌素相关的肿瘤和癌症。
实施例3
PAS100的细胞因子激活测定
从脾脏外周血单核细胞(PBMC)中分离出T淋巴细胞，这些细胞是从用PAS100治疗的小鼠中分离出来的。通过流式细胞术评估这些细胞，以确定它们是否确实是通过细胞因子激活干扰素-γ(INFG)、颗粒酶-B(颗粒酶)、穿孔素和肿瘤坏死因子-α(TNFα)激活的T细胞。结果在图4A和图4B中提供。
图4A显示从用PAS100处理的小鼠分离的T细胞确实被激活。当用胃泌素在培养物中再刺激这些相同的细胞6小时(参见图4B)时，它们被再次刺激并释放更多的细胞因子，从而证实免疫接种PAS100刺激的T细胞并进一步证实这些T细胞与胃泌素发生了特异性反应。
实施例4
PAS100与PAS和PD-1联合疗法的比较
从脾PBMC中分离出T淋巴细胞，所述脾PBMC从用PAS100或PAS100和PD-1的组合治疗的小鼠中分离。通过流式细胞术评估C细胞，以确定它们是否确实是通过细胞因子激活干扰素-γ(INFG)、颗粒酶-B(颗粒酶)、穿孔素和肿瘤坏死因子-α(TNFα)激活的T细胞。结果在图5A和图5B中提供。
与来自PBS治疗的小鼠的淋巴细胞相比，用单独的PAS100治疗的小鼠的激活的T淋巴细胞释放的细胞因子增加(参见图5A)。然而，联合治疗小鼠的淋巴细胞释放出明显更多的细胞因子(参见图5B)，表明联合疗法在刺激激活的T细胞方面表现更好。与使用单独的PAS100的治疗相比，使用PAS100+PD-1Ab联合治疗的TNFα尤其增加了2倍以上(比较图5A和5B)。
实施例5
PD-1单一疗法、PAS100单一疗法和PD-1+PAS100联合疗法对纤维化的疗效分析
将用PBS、单独的PD-1、PAS100或PAS100+PD-1处理的小鼠的肿瘤固定在4％多聚甲醛中，石蜡包埋，并切成8μm的切片并固定。组织切片用Masson三色法染色进行纤维化。
图6A显示了被Masson三色法染色的代表性切片。使用ImageJimage处理和分析软件通过计算机程序分析纤维化的定量评分，结果如图6B所示。然而，值得注意的是尽管用PD-1单一疗法和PAS100单一疗法治疗的肿瘤的整合密度与阴性对照PBS治疗无明显差异，但PAS+PD-1Ab联合疗法导致密度(因此纤维化)降低，其与单独的PBS(p<0.005)和单独的PAS100(p<0.001)相比，具有统计学意义。
实施例6
PD-1单一疗法、PAS100单一疗法和PD-1+PAS100联合疗法对CD8+T细胞浸润的效果 分析
将肿瘤固定在4％多聚甲醛中，石蜡包埋，并切成8μm的切片，并固定。CD8+淋巴细胞在肿瘤微环境中用CD8抗体(1:75滴度；EBIOSCIENCETM,San Diego,California,U1SA)染色，并以盲法手动计数CD8+细胞。结果显示在图7A和图7B中。
如图7A和图7B所示，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)用单独的PAS100和PD-1增加，但在联合疗法下显著增加。组合的PAS100+PD-1CD8+细胞显著大于单独的PD-1(p＝0.042)并且大于单独的PAS100(p＝0.039)。
实施例7
PD-1单一疗法、PAS100单一疗法和PD-1+PAS100联合疗法对Foxp3+Treg浸润的效果 分析
将肿瘤固定在4％多聚甲醛中，石蜡包埋，并切成8μm的切片，并固定。肿瘤与抗Foxp3抗体(1:30；eBioscienceTM)反应，并使用ImageJ软件手动计数免疫反应性细胞。结果显示在图8A和8B中。
图8A描述了用与Treg的标志物Foxp3蛋白结合的抗体染色的示例性的mT3肿瘤。领域比较显示，与PBS(左上图)、PD-1单一疗法(右上图)或PAS100单一疗法(左下图)相比，PAS100&PD-1联合疗法导致瘤内Treg的存在减少，表明PAS100+PD-1联合治疗可能会改变肿瘤内环境，使肿瘤内微环境可能特征在于与单独的单一疗法相比，其基于Treg的免疫抑制程度较低。
图8B是总结图8A所例示的数据的条形图。与PBS相比，用PD-1单一疗法或PAS100单一疗法治疗的肿瘤中Foxp3+细胞的数量没有显著差异。用PAS100+PD-1联合疗法治疗的肿瘤的Foxp3+细胞明显少于阴性对照。
参考文献
本公开中列出的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其出版物、科学期刊文章和数据库条目(包括但不限于
Figure BDA0002384271360000731
生物序列数据库条目，包括其中所有可用的注释)，均通过引用其全部内容并入本文，程度如同它们补充、解释、提供本文所采用的方法、技术和/或组成的背景和/或教导这些方法、技术和/或组成。参考文献的讨论仅旨在总结其作者提出的主张。没有承认任何参考文献(或任何参考文献的一部分)是相关的现有技术。申请人保留质疑任何引用文献的准确性和相关性的权利。
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应当理解，在不脱离本公开主题的范围的情况下，可以改变本发明公开的主题的各种细节。此外，前面的描述仅用于说明的目的，而不是为了限制的目的。
序列表
<110> 癌症进展有限公司(Cancer Advances Inc.)
林德·萨顿(Sutton, Lynda)
吉尔·P·史密斯(Smith, Jill P.)
尼古拉斯·奥斯本(Osborne, Nicholas)
布赖·E·胡贝尔(Huber, Brian E.)
艾伦·卡托(Cato, Allen)
<120> 用于诱导针对肿瘤和癌症的体液免疫和细胞免疫的组合物和方法
<130> 1734/10/22 PCT
<150> US 62/520,267
<151> 2017-06-15
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
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<400> 1
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Pro Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种使受试者中与胃泌素信号转导相关的肿瘤和/或癌症对针对所述肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导物敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含通过接头缀合至免疫原性载体的胃泌素肽的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃泌素肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中针对与所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
11.根据权利要求10述的方法，其中所述组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
13.一种用于预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症相关的纤维化的形成的方法，所述方法包括使所述肿瘤和/或癌症的细胞与第一组合物和第二组合物接触，所述第一组合物包含通过接头缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，所述第二组合物包含免疫检查点抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述胃泌素肽包含选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736和阿维鲁单抗。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
22.一种增加对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的TEMRA细胞的数量的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含通过接头缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，所述第二组合物包含免疫检查点抑制剂，其中，对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的TEMRA细胞的数量增加。
23.一种在受试者增强对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含通过接头缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，所述第二组合物包含免疫检查点抑制剂，由此，存在于所述受试者中的对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量增加。
24.根据权利要求23所述的方法，其中与未施用药物组合物已经发生的那些相比，所述施用导致所述受试者的存活率提高、肿瘤生长降低、和/或化学治疗剂和/或免疫检查点治疗的功效增强。
25.一种用于预防、减少和/或消除受试者中胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的方法，所述方法包括向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用有效量的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含通过接头缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，所述第二组合物包含免疫检查点抑制剂，其中，所述有效量足以减少所述受试者中的FoxP3+抑制性T调节细胞的量。

Claims (106)

1.一种药物组合物，包含(i)第一试剂，其诱导和/或提供针对胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应；和(ii)免疫检查点抑制剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述第一试剂选自由以下各项组成的组：胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述胃泌素肽可选地经由接头与免疫原性载体缀合。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
7.根据权利要求4或权利要求6所述的药物组合物，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述第一试剂包含有效诱导抗胃泌素的体液反应的量的胃泌素肽，所述胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ IDNO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，并且所述第二试剂包含一定量的免疫检查点抑制剂，当施用给患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者时，所述免疫检查点抑制剂有效地诱导或增强针对胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应。
13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述第一试剂包含一种或多种抗CCK-B受体抗体，并且当施用给患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者时，以足以减少或抑制经由胃泌素相关的肿瘤或癌症上存在的CCK-B受体的胃泌素信号转导的量存在于药物组合物中。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其用于生产用于治疗与胃泌素相关的肿瘤或癌症的药物。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其用于治疗胃泌素相关的肿瘤或癌症。
16.一种用于治疗受试者中与胃泌素相关的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含(i)诱导和/或提供针对所述胃泌素肽和/或CCK-B受体的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂；和(ii)诱导和/或提供针对所述胃泌素相关肿瘤或癌症的细胞免疫反应的第二试剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一试剂选自胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述胃泌素肽可选地经由接头与免疫原性载体缀合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
22.根据权利要求19或权利要求21所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
24.根据权利要求16所述的方法，其中针对与所述胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
27.根据权利要求16所述的方法，其中所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
28.根据权利要求27述的方法，其中所述组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
29.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
30.用于治疗胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用直接或间接抑制肿瘤和/或癌症中胃泌素的一种或多种生物学活性的第一试剂和包含针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物的第二试剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一试剂：
(i)通过提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液免疫反应而直接或间接抑制胃泌素在肿瘤和/或癌症中的一种或多种生物学活性，可选地其中所述试剂选自抗胃泌素抗体和胃泌素肽，其在受试者中诱导产生中和性抗胃泌素抗体；和/或
(ii)包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。
33.根据权利要求30所述的方法，其中表位存在于氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)或EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)中。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包括缀合至免疫原性载体的胃泌素肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述胃泌素肽包含选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述胃泌素肽经由接头与所述免疫原性载体缀合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
40.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述第一试剂还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
41.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述第二试剂是免疫检查点抑制剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736和阿维鲁单抗。
44.根据权利要求30-43中任一项所述的方法，其中所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
45.根据权利要求44述的方法，其中所述第一试剂诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
46.一种在受试者中抑制与胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的生长的方法，所述方法包括向受试者施用包含第一试剂和第二试剂的组合物，所述第一试剂包含胃泌素免疫原、一种或多种抗胃泌素抗体，一种或多种抗CCK-B受体抗体或其任何组合，并且所述第二试剂包含免疫检查点抑制剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一试剂选自胃泌素肽、抗胃泌素抗体和抗CCK-R抗体。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一试剂包含胃泌素肽，可选地胃泌素肽包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述胃泌素肽可选地经由接头与免疫原性载体缀合。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
52.根据权利要求19或权利要求51所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
54.根据权利要求46所述的方法，其中针对与所述胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
57.根据权利要求46所述的方法，其中所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
58.根据权利要求57述的方法，其中所述组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
59.根据权利要求46所述的方法，其中所述组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
60.一种用于在受试者中诱导和/或增强针对胃泌素相关的肿瘤或癌症的细胞免疫反应的方法，所述方法包括向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过存在于胃泌素相关的肿瘤或癌症上的CCK-B受体减少或抑制胃泌素信号传导的试剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述试剂包含胃泌素肽、抗胃泌素抗体、抗CCK-B受体抗体或其任何组合。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述胃泌素肽包含胃泌素-17(G17)肽或其免疫原性片段。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述胃泌素肽或其免疫原性片段包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成：选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述试剂包含缀合至免疫原性载体的胃泌素肽，可选地其中免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述胃泌素肽通过接头，可选地包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯的接头，与免疫原性载体缀合。
66.根据权利要求64所述的方法，其中接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
67.根据权利要求60所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
68.一种使受试者中与胃泌素和/或CCK-B受体信号转导相关的肿瘤和/或癌症对针对所述肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导物敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包括：
(a)诱导和/或提供针对胃泌素肽的主动和/或被动体液免疫反应的第一试剂，和诱导和/或提供针对肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的第二试剂，或它们的组合，可选地，其中所述第一试剂和所述第二试剂分别选自胃泌素肽和/或其片段和/或衍生物，其诱导受试者中的细胞免疫反应或产生中和性抗胃泌素抗体，和中和性抗胃泌素抗体和/或其片段和/或衍生物；和/或
(b)包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸的组合物；和/或
(c)包含在所述CCK-B受体处阻断所述胃泌素生物学功能的试剂的组合物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述表位存在于氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ IDNO:1)或EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)或EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)或EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ ID NO:4)中。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述组合物包括缀合至免疫原性载体的所述胃泌素肽。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述胃泌素肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述胃泌素肽经由接头与所述免疫原性载体缀合。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
76.根据权利要求74或权利要求75所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
77.根据权利要求68至76中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
78.根据权利要求68至77中任一项所述的方法，其中针对与所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的诱导物包括免疫检查点抑制剂。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
81.根据权利要求68所述的方法，其中所述胃泌素相关的肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
82.根据权利要求81述的方法，其中所述组合物诱导与胰腺癌相关的纤维化的减少和/或预防其发展。
83.根据权利要求68所述的方法，其中所述组合物以选自约50μg至约1000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约200μg至约1000μg和约250μg至约500μg的剂量施用，并且可选地其中剂量重复一次、两次或三次，可选地其中第二剂量在第一剂量后1周施用，而第三剂量，如果施用的话，在第二剂量后1或2周施用。
84.一种用于预防、减少和/或消除与肿瘤和/或癌症相关的纤维化的形成的方法，所述方法包括使所述肿瘤和/或癌症的细胞与直接或间接抑制胃泌素在所述肿瘤和/或癌症中的一种或多种生物学活性的试剂接触。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述试剂：
(i)提供和/或诱导针对胃泌素肽的体液免疫反应，可选地其中所述试剂选自抗胃泌素抗体、和/或其片段和/或衍生物，和在受试者中诱导产生中和性抗胃泌素抗体的胃泌素肽；和/或
(ii)包含抑制胃泌素基因产物表达的核酸；和/或
(iii)包含阻断所述胃泌素激素功能的小分子化合物。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述抗胃泌素抗体是针对胃泌素17(G17)内存在的表位的抗体。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述表位存在于氨基酸序列EGPWLEEEEE(SEQ IDNO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)或EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQID NO:4)中。
88.根据权利要求84-87中任一项所述的方法，其中所述试剂包含胃泌素肽，其诱导缀合至免疫原性载体的中和性抗胃泌素抗体的产生。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述胃泌素肽包含选自EGPWLEEEEE(SEQ ID NO:1)、EGPWLEEEE(SEQ ID NO:2)、EGPWLEEEEEAY(SEQ ID NO:3)和EGPWLEEEEEAYGWMDF(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述免疫原性载体选自由以下各项组成的组：白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述胃泌素肽经由接头与所述免疫原性载体缀合。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述接头包含ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰胺酯。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述接头和所述胃泌素肽被氨基酸间隔子分开，可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为1至10个氨基酸，进一步可选地其中所述氨基酸间隔子的长度为7个氨基酸。
94.根据权利要求84-93中任一项所述的方法，其中所述试剂还包含佐剂，可选地基于油的佐剂。
95.根据权利要求84-94中任一项所述的方法，其进一步包括使所述肿瘤和/或癌症与第二试剂接触，所述第二试剂包含针对所述肿瘤和/或癌症的细胞免疫反应的刺激物。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述第二试剂是免疫检查点抑制剂。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1受体(PD-1)和程序性细胞死亡1受体配体(PD-L1)的靶标多肽的生物活性。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下各项组成的组：伊匹单抗、替西木单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、派姆单抗、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、阿特珠单抗、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736和阿维鲁单抗。
99.根据权利要求84至98中任一项所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症是胰腺癌。
100.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物在预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的用途，通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以增强对所述胃泌素相关的肿瘤或癌症反应的受试者中的CD4–/CD8–TEMRA细胞的数量的量的权利要求1-13中任一项所述的药物组合物。
101.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物用于增加对胃泌素相关的肿瘤或癌症有反应的受试者中的TEMRA细胞的数量的用途。
102.包含免疫检查点抑制剂和胃泌素免疫原的组合物在治疗胃泌素相关的肿瘤或癌症中的用途。
103.包含免疫检查点抑制剂和胃泌素免疫原的组合物在制备治疗胃泌素相关的肿瘤或癌症的药物中的用途。
104.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物在预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的用途，通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以增强CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量的量的权利要求1-13中任一项所述的药物组合物。
105.根据权利要求104所述的用途，其中与未施用药物组合物已经发生的那些相比，所述施用导致所述受试者的存活率提高、肿瘤生长降低、和/或化学治疗剂和/或免疫检查点治疗的功效增强。
106.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物在预防、减少和/或消除胃泌素相关的肿瘤或癌症的转移中的用途，其通过向患有胃泌素相关的肿瘤或癌症的受试者施用足以减少FoxP3+抑制性T调节细胞的量的权利要求1-13中任一项所述的药物组合物。
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