CN1997669A - 抗胃泌素激素单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了对胃泌素激素形式的N－末端和C－末端，即胃泌素－17(G17)、甘氨酸延伸型胃泌素－17(G17－Gly)、胃泌素－34(G34)和甘氨酸延伸型胃泌素－34(G34－Gly)具选择性的单克隆抗体(MAb)；以及产生这些MAb的杂交瘤。本发明还提供了用于检测和定量测定G17、G17－Gly、G34及G34－Gly的MAb组。这些测定法可用于监测胃泌素介导的疾病或状况，或监测治疗的进展过程。本发明还提供了用于对固体样品(如活检样品或组织切片)中的胃泌素类型进行检测和显像的固相测定法，包括免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)测定法。本发明还提供了本发明的MAb的药物组合物，以及胃泌素介导的疾病或状况的诊断、预防和治疗方法。本发明还公开了对胃泌素激素阻断治疗进行评估的方法。可通过本发明提供的测定方法对患者的胃泌素介导的疾病或状况的过程进行监测。

Description

抗胃泌素激素单克隆抗体

相关申请

本申请要求申请号为60/557,759的美国临时申请的优先权，该申请于2004年3月29日与申请号为10/813,336的美国专利申请“胃泌素激素免疫测定法”一同提交，在此通过引用将两者说明书的全文并入本申请。

发明领域

本发明涉及针对胃泌素激素的特定部位的抗体以及动物(尤其是人)体内不同形式胃泌素激素。本发明还进一步涉及这些单克隆抗体(MAb)在检测、诊断和监测胃泌素介导的疾病和状况方面的应用，以及使用本发明中的MAb对胃泌素介导的疾病和状况进行预防和治疗的方法。

发明背景

尽管胃泌素激素在100年前就被首次发现，并在20世纪60年代进行了提纯，但它对不同正常和患病组织的作用仍未能被完全了解。难以对各种不同形式的胃泌素激素分别进行检测和定量测定一直是造成人们对胃泌素系统认知缺乏的一个主要原因。

哺乳动物体内的多肽类激素胃泌素以几种形式存在，根据其肽链上氨基酸残基的数量，主要可归为两大类：“小”胃泌素和“大”胃泌素。“小”胃泌素包括成熟胃泌素-17(G17)和甘氨酸延伸型胃泌素G17(G17-Gly)；而“大”胃泌素包括胃泌素-34(G34)和甘氨酸延伸型G34(G34-Gly)。成熟形式的G17是胃酸分泌的一个主要效应物，其作用估计比G34强6倍多。不同形式的胃泌素在体内由前体肽、前胃泌素经过断裂，或者，在有的情况下，由断裂物修饰而生成。人G34在其C-末端具有G17完整的17个氨基酸的序列，并且，可预见地，与G17发生交叉免疫反应。

成熟G17的氨基端和羧基端残基均经过修饰：N-末端(氨基末端)的谷氨酸被环化形成焦谷氨酸(pGlu)，而C-末端(羧基末端)苯丙氨酸残基的游离羧基被肽基α-酰胺化单氧化酶(PAM)酰胺化形成C-末端苯丙氨酸-NH₂。成熟G34的C-末端被同样酰胺化形成C-末端苯丙氨酸-NH₂(见Dockray et al.，Ann.Rev.Physiol.(2001)63：119-139)。

人类“小”胃泌素的主要形式--成熟G17的氨基酸序列为pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：1)。在健康人体中发现的次要形式的“小”胃泌素G17-Gly是一种未加工完全的胃泌素，其氨基酸序列为pegpwlEeeeeaygwmdfg(seq id no：2)。

人类“大”胃泌素的主要形式--胃泌素-34的氨基酸序列为pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH₂ (SEQ ID NO：3)，而甘氨酸延伸型胃泌素34(G34-Gly)具有额外的C-末端甘氨酸残基，氨基酸序列为pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO：4)。

胃泌素由胃幽门窦-G细胞在胃泌素释放肽(GRP)的作用下分泌，受胃酸和几种多肽类激素(最主要的是生长激素抑制素)的旁分泌作用的抑制。人们很早已发现胃泌素肽能刺激健康人体胃的胃酸分泌，但是，直到最近才发现这些肽还控制着胃肠(GI)系统不同类型细胞的增殖、分化和成熟。

除在胃肠(GI)系统的局部作用外，G17、G17-Gly(更少些)，还被释放入血液中，并被发现在罹患胃肠道疾病(如胃癌、结肠直肠癌和胰腺癌)的患者的血清中有所增加。最近还发现这几种类型的胃泌素与其它与胃肠道无关的疾病相关，包括小细胞肺癌(SCLC)和肝转移瘤。例子参见″Gastrin and Colon Cancer：a unifying hypothesis″S.N.Joshi etal.，DigestiveDiseases(1996)14：334-344；和″Gastrin and Colorectal Cancer″Smith，A.M.and Watson，S.A.Alimentary Pharmacology and Therapeutics(2000)14(10)：1231-1247。

抗体是医学、兽医学和其它领域所用的许多测定技术中的关键试剂。这类测试包括许多常规使用的免疫测定技术，例如：酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)测定法。

单克隆抗体(MAb)具有独特的特性，使得它们在被用于多种这类测定时，在许多方面均优于多克隆抗血清和多克隆抗血清提纯所得抗体。这些特性包括：对靶抗原的单抗原决定簇特异性(即，对单一表位的特异性)、在多种抗体制备中不变的特异性、以及长时间不变的亲和力和化学组成。而且，MAb可通过体外方法无限期地并不受数量限制地进行生产。这些特性与多克隆抗体的特性形成了鲜明对比，后者需要用到体内免疫法，不可避免地具有生物变异性和免疫动物寿命所决定的有限的抗体生产能力。

尽管有这些优点，即使是对同一表位具特异性的各个单克隆抗体之间也存在差异。例如：由单一抗原表位部位免疫诱导的单克隆抗体可能因为以下一种或所有特性而出现差异：1)对表位分子组成和三级结构的精确特异性；2)抗体个体基因型；3)抗体亲和力；4)抗体同种异型；和5)抗体同种型。这些特性上的差异能影响单克隆抗体在特定免疫测定中的表现，使得针对同一抗原部位的不同单克隆抗体分离物在一给定的测定中具有不同的表现。作为结果，在被作为试剂用于特定的免疫测定中时，一些单克隆抗体将优于其它与同样表位结合的抗体。

免疫测定法可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫扩散测定或免疫检测测定，如酶联免疫斑点法(ELISPOT)、槽印迹(slot-blot)、或蛋白质斑迹法。作为这些技术的一个总的指导，参见例如Ausubel et al.(eds)(1987)in″Current Protocols in MolecularBiology″John Wiley and Sons，New York，N.Y。或者，免疫测定法也可以是为使组织样品中的某种胃泌素激素显像所用的免疫组织化学(IHC)染色法或免疫荧光(IF)操作。例子参见″Principles and Practice ofImmunoassay″(1991)Christopher P.Price and David J.Neoman(eds)，Stockton Press，New York，N.Y。

对G17的N末端部位和C-末端部位具选择性的单克隆抗体已进行了描述。例子参见Azuma et al.，Gastroenterologica Japonica(1986)21(4)：319-324；Ohning et al.，Peptides(1994)15(3)：417-423；Fuerle et al.，Pancreas(1995)10(3)：281-286；Kovacs et al.，Peptides(1996)17(4)：583-587；Ohning et al.，Am.J.Physiol.(1996)271(3 Pt 1)：G470-476；Sipponen et al.，(2002)Scand.J.Gastroenterol.37(7)：785-791。但是，不论这些抗体的单独形式或组合，都未被发现能对正常和病变生物学液体中的一种以上的不同形式胃泌素激素进行识别和定量分析。

抗胃泌素多克隆抗体已被证明可抑制胃泌素的活性(″Inhibition ofgastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide ofgastrin″Jaffe et al.，Surgery(1969)65(4)：633-639)；而且非人类抗胃泌素多克隆抗体已被用于治疗罹患Zollinger-Ellison综合征(在无进食刺激的情况下胃泌素过度分泌)的患者。见Hughes et al.，″Therapy with GastrinAntibody in the Zollinger-Ellison Syndrome″Hughes et al.，DigestiveDiseases(1976)21(3)：201-204。但是，这些兔抗胃泌素抗体“最多能对患者起到短期治疗作用。”(Hughes at p.204)。美国专利5,886,128和5,785,970揭示了一种通过使用胃泌素肽缀合物免疫对生长依赖于或受胃泌素激素刺激的溃疡或肿瘤进行治疗的方法。

最近，血清中的酰胺化胃泌素激素与非酰胺化胃泌素激素的比率被建议作为衡量个体发生十二指肠溃疡或胃萎缩风险的指标。见已公开的T.C.Wang的美国专利申请2003/0049689，名为″Diagwlosis and Treatmentof Gastrointestinal Disease″。另一组使用的方法包括测量禁食G17水平，将禁食G17的阳性判别值与胃蛋白酶原I/II和幽门螺旋杆菌标志物水平相比较，作为评估胃酸相关疾病风险的基础。见WO0423148，公开日2004年3月18日。

直到现在，还未能获得能对G17、G17-Gly、G34和G34-Gly进行灵敏检测和准确分辨的单克隆抗体(MAb)。而且，直至本发明为止，还无法准确测量生物学液体样品中每种形式的胃泌素激素的含量。使用本发明中的单克隆抗体(MAb)进行临床检验测定能更准确地说明正常和患病情况下的胃泌素激素生物学。使用本发明中的单克隆抗体还能提供药学单克隆抗体成分以及预防和治疗胃泌素相关疾病和状况的方法。

发明概要

本发明提供了选择性与胃泌素-17(G17)或甘氨酸延伸型G17(G17-Gly)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(对应G17的氨基酸1-6，SEQ ID NO：5)中的表位结合的单克隆抗体(MAb)。还提供了产生这些选择性与胃泌素-17(G17)或G17-Gly的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO：5)中的表位结合的单克隆抗体的杂交瘤。

本发明还提供了选择性与胃泌素-17(G17)或胃泌素-34的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位结合的单克隆抗体(MAb)。本发明还提供了产生这些选择性与胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位结合的单克隆抗体的杂交瘤。

本发明进一步提供了选择性与人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO：7)中的表位结合的单克隆抗体(MAb)。本发明还提供了产生这些选择性与胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO：7)中的表位结合的单克隆抗体的杂交瘤。

本发明还进一步提供了选择性与甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列ygwmdfg(SEQ ID NO：8)中的表位结合的单克隆抗体(MAb)。本发明还提供了产生这些选择性与甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列ygwmdfg(SEQ ID NO：8)中的表位结合的单克隆抗体(MAb)的杂交瘤。

本发明中两种或两种以上抗体的组合可被用于选择性与胃泌素激素的G17、G17-Gly、G34和G34-Gly等各种形式的N-末端或C-末端相结合的单克隆抗体组中。

另外本发明还提供了选择性与以下之一相结合的单克隆抗体的药物组合物：(1)胃泌素-17(G17)或甘氨酸延伸型G17(G17-Gly)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(对应G17的氨基酸1-6，SEQ ID NO：5)中的表位：(2)胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位；(3)人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO：7)中的表位；或(4)甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO：8)中的表位；以及药用可接受的载体。

患者的胃泌素介导的疾病或状况可通过测定患者生物学液体样品中一种形式的胃泌素激素水平，并将样品中的胃泌素激素水平与健康人生物学液体样品中的胃泌素激素正常水平相比较来进行诊断。

这类胃泌素介导的疾病或状况可通过给予患者含有选择性与以下之一相结合的单克隆抗体(MAb)的药物组合物进行预防或治疗：(1)胃泌素-17(G17)或甘氨酸延伸型G17(G17-Gly)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(对应G17的氨基酸1-6，SEQ ID NO：5)中的表位；(2)胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位；(3)人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO：7)中的表位；或(4)甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO：8)中的表位。

本发明还提供了一种对患者胃泌素介导的疾病或状况的过程进行监测的方法。该方法包括：在初始时间点测定患有胃泌素介导的疾病或状况或存在患胃泌素介导的疾病或状况的风险的患者的生物学液体样品中的胃泌素激素水平；在不同时间点测定患者的一个或多个生物学液体样品中的胃泌素激素水平；并以此监测胃泌素介导的疾病或状况的过程。

本发明还提供了一种对患胃泌素介导的疾病或状况的患者的胃泌素激素阻断治疗进行评估的方法。该方法包括步骤(a)-(j)：

a)在治疗前或在治疗早期获取患者的第一个生物学液体样品；

b)通过免疫测定法测定第一个样品中的胃泌素激素水平；

c)在待治疗疾病或状况以及第一个样品中的胃泌素激素水平的基础上进行诊断；

d)给予患者药物治疗，包括施用能与胃泌素激素相结合以调整其与体内靶受体的结合的第一药剂或能产生该第一药剂的物质；

e)在治疗起效所需的合适时间后获取患者的第二个生物学液体样品；

f)通过免疫测定法测定第二个样品第一部分中的总胃泌素激素(包括结合和游离胃泌素激素)水平，其中第二个样品的第一部分与以下物质孵育(i)置换任何与第一药剂的胃泌素激素结合的第二药剂，和(ii)固定化抗胃泌素激素抗体，其中固定化抗体未与第二药剂结合；洗涤除去第二药剂并加入一种可检测的抗体，所述抗体与胃泌素激素相结合且不与固定化抗体相竞争，形成免疫复合物，其含有与胃泌素激素相结合的固定化抗体，而同时胃泌素激素也与可检测的抗体相结合；

g)检测免疫复合物中可检测的抗体的量并由此确定第二个样品中总胃泌素激素的量；

h)以第二种样品第二部分重复步骤f)和g)测定其中的游离胃泌素激素水平，其中步骤f)中的孵育过程未加入第二药剂；及

j)比较第一个样品中测得的游离胃泌素激素的量和第二个样品中游离胃泌素激素和总胃泌素激素的量，以确定对患者进行胃泌素激素阻断治疗的效果。

本发明进一步提供了一种进行免疫测定用的试剂盒，包括一种抗胃泌素激素单克隆抗体(MAb)和一种适当的容器。抗胃泌素单克隆抗体(MAb)优选以下单克隆抗体组中的抗体：400-1、400-2、400-3、400-4、401-2、445-1、445-2和458-1。

图形简述

图1：使用人G17-BSA包被板进行的ELISA测定。以405nm的吸光度(A405)对下列血清滴度作图：方块代表测试样品血清。菱形代表免疫前采血血清(pre-bleed)。三角形代表参考标准血清。确定阳性标准血清在滴度2×105(1)处的吸光度值(2)。测试样品曲线与该吸光度值的交叉点即为测试样品的滴定度(3)。在本例子中，测试样品的滴度为2.8×104。

图2：一条代表性总胃泌素-17校准曲线，显示了与450nm的吸光度(A450)相对应的胃泌素浓度(以皮摩尔标绘)，并使用四甲基联苯胺(TMBS)发色团来显示酶的变化。

图3：一条代表性游离胃泌素-17校准曲线，显示了如上所述的与450nm的吸光度(A450)相对应的胃泌素浓度(以皮摩尔标绘)。

发明详述

以下提供了本说明书中使用的术语和短语的定义：

此处交替使用的“胃泌素激素”或“胃泌素激素形式”指的是任何具有生物活性和/或交叉免疫反应的胃泌素肽。胃泌素激素的主要形式包括但不局限于：胃泌素-17(G17)，无论其带有酰胺化羧基端或带有游离羧基端；甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)；胃泌素-34(G34)，包括羧基端酰胺化形式和带游离羧基端的形式；甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)，和前胃泌素。

此处使用的样品中的胃泌素激素“总量”指的是游离(非结合)胃泌素激素的量与复合(结合)胃泌素激素的量之和。复合胃泌素激素可能是与样品中的抗体或其它结合部分相结合而成。

此处使用的“生物学液体”指的是任何含有生物起源物质的液体。用于本发明的优选生物学液体包括动物(尤其是哺乳动物，优选人)的体液。体液可以是任何体液，包括但不局限于血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液(CSF)等等。

此处使用的“防腐剂”指的是任何可减少生物学液体样品或含有生物成分的液体样品中的胃泌素随时间的降解的药剂、补充物或添加剂。能用于本发明实践的防腐剂包括任何工艺上已熟知的防腐剂，包括但不局限于：普通化学防腐剂，如叠氮化钠、乙二胺四乙酸(EDTA)；蛋白酶抑制剂，如苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和胰蛋白酶抑制剂(如：特斯乐(Trasylol))；或生物防腐剂，如肝素。

新的抗-胃泌素单克隆抗体

优选通过评估每种候选单克隆抗体在最终应用中的表现来进行最适用于某特定应用的单克隆抗体(MAb)的选择。基于此原因，对候选单克隆抗体在预期最终应用中的最佳功能性的测试是生成最适用于预期应用的单克隆抗体的选择步骤的一部分。除了通常所用的生成单克隆抗体的选择步骤(包括与靶抗原结合，对产生单克隆抗体的杂交瘤进行系列克隆以保证杂交瘤细胞株基本特性的稳定(包括持续的细胞生长和分裂，以及无限期地不受限制地产生抗体))外，还要进行这项选择步骤。

此处使用的术语，对某特定形式的胃泌素激素的“选择性”指的是抗体由于对某特定形式的胃泌素激素的特定靶表位具特异性，而可与每种含有这种靶表位的胃泌素激素相结合。例如：成熟G17和G34均具有成熟(酰胺化)G17的C-末端，因此，对在成熟G17的C-末端发现的靶C-末端表位具特异性的单克隆抗体对G17(以及G34)具有选择性。

本发明还具体说明了一种鉴别对各种生物活性形式的胃泌素激素、酰胺化胃泌素-17(G17)、酰胺化胃泌素-34(G34)、甘氨酸延伸型胃泌素17(G17-Gly)、甘氨酸延伸型胃泌素34(G34 Gly)和前胃泌素的N-末端和C-末端具选择性的单克隆抗体(单克隆抗体具有更好的特性)的方法。这些单克隆抗体尤其适合被用于测量生物学液体中特定形式胃泌素激素所用的免疫酶分析(通常称为“ELISA”或酶联免疫吸附分析)中。本发明中的单克隆抗体也适合被用于免疫检测(如酶联免疫斑点/ELISPOT、放射性免疫测定、抗体三明治捕捉试验、点印迹法、槽印迹法和蛋白质斑迹法)中对胃泌素激素进行检测和/或定量测定。

一方面，本发明提供了选择性与胃泌素-17(G17)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO：5)中的表位结合的单克隆抗体。这些对胃泌素-17(G17)的N-末端具有选择性的单克隆抗体与肽pEGPWLEEEE(SEQ ID NO：11)的BSA-缀合物的结合受人G17、马G17或人G17-Gly的抑制。

另一方面，本发明还提供了选择性与胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位结合的单克隆抗体。

另一方面，本发明还提供了选择性与人胃泌素-34(hG34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO：7)中的表位结合的单克隆抗体。

在又一方面，本发明还提供了选择性与甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列ygwmdfg(SEQ ID NO：8)中的表位结合的单克隆抗体。

在又一方面，本发明还提供了选择性与前胃泌素相结合的单克隆抗体。这些单克隆抗体与前胃泌素相结合，但不与加工后的胃泌素激素形式(G17、G17、G17-Gly或G34-Gly)结合。本发明中对前胃泌素具选择性的单克隆抗体包括与人前胃泌素的C-末端相结合的单克隆抗体。这些单克隆抗体也将与含有101氨基酸肽链(随后被加工生成前胃泌素和胃泌素)的前胃泌素原相结合。但是，对前胃泌素原的加工很快并且发生在合成其的内质网(ER)中。本发明中与前胃泌素相结合的单克隆抗体可用于此处所述的测定中，对样品中的前胃泌素进行检测和定量测定。

对于本发明中的单克隆抗体优选结合的胃泌素形式，所述抗体对其具有选择结合性，结合常数(Ka)为10⁶至约10⁷LM^-1，优选约10⁷至约10⁸LM^-1，更优选约10⁸至10⁹LM^-1，更优选约10⁹至约10¹⁰LM^-1，更优选约10¹⁰至约10¹¹LM^-1，最优选10¹¹至10¹²LM^-1。

抗胃泌素单克隆抗体组

本发明首次提供了能对G17，G17-Gly，G34和G34-Gly胃泌素激素形式进行明确鉴定和定量测定的抗胃泌素激素单克隆抗体组。例如，含有对G34的N-末端具选择性的单克隆抗体和对G17/G34(G34的C-末端与G17的C-末端完全相同)的C-末端具选择性的单克隆抗体的单克隆抗体组，可通过众多常规免疫分析测定法中的任何一种对样品中的G34进行特异性鉴定和定量测定。可能用到本发明中的单克隆抗体的常规免疫测定包括但不局限于：酶联免疫吸附测定(ELISAs)、放射性免疫测定(RIAs)、免疫荧光测定(IFs)、免疫组织化学测定(IHCs)、免疫扩散测定等等。这类常规诊断测定方法的例子参见美国专利5,932,412，名为″Syntheticpeptides in human papilloma virus 1，5，6，8，11，16，18，31，33 and 56 usefulin immunoassay for diagnostic purposes″，Dillner et al。

往单克隆抗体组中补加一种或多种额外的本发明中的单克隆抗体可对样品中更多的胃泌素激素种类进行鉴定和定量测定。例如：往上述抗体组中加入对G17的N-末端具选择性的单克隆抗体可进一步实现通过以下所述的本发明中的方法对样品中的游离和总(结合+游离)G17激素进行特异性鉴定和定量测定。

类似地，含有对G34的N-末端具选择性的单克隆抗体和对甘氨酸延伸型G34的C-末端(与甘氨酸延伸型胃泌素G17的C-末端相同)具选择性的单克隆抗体的单克隆抗体组可实现对样品中的甘氨酸延伸型G34的鉴定和定量测定。另外，按此处所描述的，往单克隆抗体组中补加对G17的N-末端具选择性的单克隆抗体可实现对样品中的游离和总(结合+游离)甘氨酸延伸型胃泌素G17的鉴定和定量测定。

选自本发明的单克隆抗体中的，用于鉴定、定量测定和监测其它形式胃泌素激素的单克隆抗体组中的成对单克隆抗体的组合对本领域人员来说也就显而易见了。本发明包括了所有这类本发明中的单克隆抗体对以及本发明中单克隆抗体对的组合以及本发明中的单克隆抗体对的任何其它集合。

本发明中的单克隆抗体提供了准确测定胃泌素激素形式的量及比率的方法，用于对胃泌素介导的疾病和状况的易感性进行评估，以及对患者的这类疾病和状况进行检测和诊断。例如，本发明中的抗胃泌素单克隆抗体可被用于ELISA测定中，对患者血清或其它生物学液体中的任何或全部G17、G34、G17-Gly和G34-Gly胃泌素激素形式进行大范围筛选。

本发明中的单克隆抗体、选自本发明中的单克隆抗体的单克隆抗体对的组合以及本发明中的单克隆抗体组在高流通量方法中尤其有用。这类方法包括胃泌素激素抗原检测用微芯片和微点阵方法，即可在一微量培养板或载玻片或其它测定基层(如具有有效孔的平板，如Garyantes etal的美国专利6,565,813所描述那样)上对多个样品进行检查。对结合的检测可通过任何一种现有的形式化检测系统进行。对结合的检测可通过，例如，特定生物分子反应(如抗原-抗体结合)引起的表面细胞质基因组抵抗力变化来进行。这种技术在酶测定中的应用的例子参见Taremi et al的美国专利5,981,167。这种技术可被应用于持续恒流模式，也可用于对抗体与表面固定化肽或蛋白质(如胃泌素激素)的结合进行检测，或被用于胃泌素抗体复合物的检测。后一种复合物可通过与对不受复合物抗体立体阻碍的胃泌素激素(G17，G34，G17-Gly或G34-Gly)的表位具特异性的表面固定化抗体的结合进行检测。另外，这项技术还具有高处理能力和高灵敏性的优点，不需用到放射标记。

本发明中的单克隆抗体还可用于组织样品(例如，活检材料)的免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)测定。这类测定可被用于检测个体胃泌素激素形式的异常水平，并由此对胃泌素介导的疾病和状况进行诊断。

本发明中的单克隆抗体可根据已有的熟知技术进行人源化。例子参见Waldman et al的美国专利6,689,869，名为″Labeled humanizedanti-CD-18 antibodies and fragments and kits″及Carter et al的美国专利6,639,055，名为“Method for making humanized antibodies″。人源化抗体可被调整为与原始小鼠单克隆抗体的亲和力更加吻合。例子参见，Ono et al的美国专利6,699,974，名为″Re-shaped human anti-HM1.24 antibody″。

本发明中的单克隆抗体还可被用于预防和治疗胃泌素介导的疾病和状况。本发明中的抗胃泌素单克隆抗体可被制成药剂用于对特定胃泌素激素形式的被动免疫。例子参见Blackburn et al的美国专利6,391,299(下文称′299专利)，名为″Anti-factor IX/IXa antibodies″。本发明中的单克隆抗体的功能片段，例如，Fab片段(抗原结合片段)、F(ab′)2片段和任何具有与对应的胃泌素激素形式相结合的能力的片段(对片段的描写见′299专利)，也可被用于药剂中用于治疗。(有用的药物组合物参见′299专利。)本发明中的优选给药途径包括胃肠道外给药途径，如皮下、肌内和静脉内途径。或者，也可通过鼻内途径给药。这类药剂在有效量给予的情况下对预防或治疗存在高此类疾病风险的患者的胃泌素介导的疾病或状况，或治疗已患有此类疾病或状况的患者尤其有用。

含有抗胃泌素单克隆抗体，尤其是本发明中用于治疗胃泌素介导的疾病或状况的人源化抗胃泌素单克隆抗体的完整或功能片段的药物的有效量被定义为能预防疾病发作或减缓疾病或状况发展的量；更优选的有效量为能稳定疾病或状况的量；更优选的有效量为能使疾病或状况消退的量；最优选的有效量为能完全治愈疾病或状况的量。

另外，本发明中的单克隆抗体还可被应用于监测胃泌素介导的疾病和状况进展的免疫测定中，其中特定胃泌素激素形式(或游离、结合或总胃泌素形式)的水平或量可对治疗的成功，或胃泌素介导的疾病或状况的进展提供指示。

另外，本发明中的单克隆抗体可被用于对患胃泌素介导的疾病或状况的患者的胃泌素激素阻断治疗进行评估的方法中。该方法包括以下步骤：

a)在治疗前或治疗早期自患者取得第一个生物学液体样品；

b)通过免疫测定法测定第一个样品中的胃泌素激素水平；

c)基于待治疗疾病或状况和第一个样品中的胃泌素激素水平进行诊断；

d)对患者进行治疗，包括施用与胃泌素激素结合以调整其与体内靶受体的结合的第一药剂或能生成该第一药剂的物质；

e)在治疗起效所需的适当时间之后，自患者取得第二个生物学液体样品；

f)通过免疫测定法测定第二个样品的第一部分中的总胃泌素激素水平，所述总胃泌素激素包括结合胃泌素激素和游离胃泌素激素，其中将第二个样品的第一部分与以下物质孵育：(i)置换任何与第一药剂相结合的胃泌素激素的第二药剂，和(ii)固定化的抗胃泌素激素抗体，其中所述固定化抗体不与第二药剂结合；洗涤除去第二药剂并加入一种可检测的抗体，所述可检测的抗体与胃泌素激素结合且不与所述固定化抗体相竞争，由此形成一种免疫复合物，所述免疫复合物包含与胃泌素激素相结合的固定化抗体，而该胃泌素激素同时与所述可检测的抗体相结合；

g)检测免疫复合物中可检测的抗体的量并由此确定所述第二个样品中总胃泌素激素的量；

h)使用第二个样品的第二部分重复步骤f)和g)以测定游离胃泌素激素水平，其中进行步骤f)中的孵育过程时未加入所述第二药剂；和

j)比较在第一个样品中测得的游离胃泌素激素的量和第二个样品中的游离胃泌素激素和总胃泌素激素的量，以确定对患者进行胃泌素激素阻断治疗的效果。

上述用于对患者胃泌素激素阻断治疗进行评估的方法在临床实践中尤其具有价值，其中对开始一种或另一种治疗方案时机的确定对患者的治疗效果很关键。本发明中的方法提供了为这些重要决定作基础的信息。这种方法提供了治疗前或治疗早期的胃泌素激素测量数据(例如，在使用胃泌素肽结合疫苗进行免疫后不久，如美国专利5,622,702)所描述那样)，还提供了在估计治疗开始生效后的一个或多个总和/或游离胃泌素激素测量数据。

胃泌素激素阻断治疗可以是自动免疫，其中生成对抗胃泌素抗体的免疫原是按照上述方法给入患者体内的。或者，胃泌素激素阻断物质也可以是被动给予患者的。胃泌素激素阻断物质可以是任何以下胃泌素激素阻断物质，包括但不局限于：抗胃泌素激素抗体，尤其是人源化单克隆抗胃泌素激素抗体；或者胃泌素激素阻断物质也可以是胃泌素激素受体或胃泌素激素受体模拟物。胃泌素激素受体模拟物可以是任何仿与胃泌素激素相结合的胃泌素激素受体的分子，例如，可溶胃泌素激素受体或可溶胃泌素激素受体片段，或任何其它具有与胃泌素激素相结合能力的分子。

本发明还提供了对怀疑含有胃泌素激素的样品进行筛选的药物、方法和试剂盒。这种筛选可在患者样品或怀疑含有或产生这种多肽的实验室样品中进行。试剂盒可含有本发明中的一种抗体。试剂盒可含有检测样品与本发明中的抗体之间的相互作用的试剂。提供的试剂可以是放射性的、荧光的、或酶示踪的。试剂盒可含有一种已知的，能与本发明中的抗体结合或反应的放射示踪试剂。

试剂盒中的试剂可以液体溶液、附于固体载体或以干燥粉末的形式提供。当试剂以液体溶液形式提供时，优选水溶液。当试剂附于固体载体提供时，固体载体优选层析介质，如带有多孔的测试板，或载玻片。当试剂以干粉形式提供时，粉末可通过加入合适的溶剂(可能提供)进行重新配制。

本发明中的试剂盒置于容器中提供，通常包括放置抗体、抗原或检测试剂的药瓶(优选分装为合适的量)。本发明中的典型试剂盒还包括一种放置抗体、抗原和试剂的用于商业销售的容器。这些容器可以是放置所需药瓶和一种或多种必需化学品(如色谱材料、溶剂和洗脱剂、试管、去污剂、抗体和检测反应用的化学物质)的塑料容器。

在进一步实施例中，本发明还涉及免疫检测法及相关试剂盒。建议可采用此处的胃泌素激素或肽片段来检测具有活性的抗体；或者，可采用根据本发明所制备的抗体来检测胃泌素激素或含胃泌素激素介导表位的肽。总的来说，这些方法将包括首先获取怀疑含有这类激素、肽或抗体的样品，在适于免疫复合物形成的环境下，将样品与符合本发明的抗体或肽相接触，然后检测生成的免疫复合物。

一般来说，对免疫复合物结构的检测在技术上已熟知，并可通过无数的方法实现。例如，本发明考虑的是酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫印迹(如点印迹法、槽印迹法、蛋白质斑迹法等)，间接免疫荧光技术等等。通常，免疫复合物的结构将通过使用标记(如放射性标记或酶标记(如碱性磷酸(酯)酶、辣根过氧化物酶等))进行检测。根据熟知的方法，使用第二结合配体(如第二抗体或者生物素/抗生物素蛋白的配体结合)，还能产生更多的收益。

实施例1.制备抗人G17C-末端的单克隆抗体

通过标准固相肽合成法，商业化合成肽CSSEEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：10)，其含有接头(-Cys-Ser-Ser-)序列以及包括人G17和G34C-末端表位(-EEAYGWMDF-NH₂，SEQ ID NO：6)氨基酸序列。

将肽按以下步骤结合入免疫原中以诱导产生针对G17/G34C-末端的抗体：首先将肽与白喉类毒素(“DT”)进行共价连接生成肽-载体缀合物。每个DT载体上的肽单位数量为确定值，最终缀合物被制成免疫原。使用的技术在美国专利5,622,702中进行了描述。

简单地说，肽与载体的化学结合通过异基双功能交联剂epsilon-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide(ε-MCS)进行。缀合物通过在0.1M pH7.3的磷酸钠缓冲溶液(PBS)中透析进行纯化，并通过Lowry测定法测定蛋白质浓度。DT上的肽置换水平取决于缀合物氨基酸分析的摩尔组成。通过将缀合物溶液与Montanide ISA703油(SEPPIC，France)按30/70的比率(缀合物：佐剂质量比)混合，将溶解后的缀合物制成以Montanide ISA703作佐剂的免疫原。吸取适当体积的每种液体到注射器中，然后通过一个连接中心将溶液在两个注射器间快速来回推动，完成混合。

首先通过腹腔注射0.1mL 0.1mg肽-DT缀合物免疫原/Montanide ISA703对小鼠进行免疫。首次注射3个星期后进行相同剂量的二次注射。

为制备产生对G17/G34的C-末端具选择性的单克隆抗体的杂交瘤，使用熟知的标准技术将免疫小鼠的脾细胞与标准小鼠骨髓瘤融合配体细胞株进行融合。这些方法在许多综述和实验室手册中均进行了描述，例子参见美国专利4,196,265，Method of producing antibodies to Kaprowski etal；″Selected Methods in Cellular Immunology″(Chapter 17：ImmunoglobulinProducing Hybrid Cell Lines，B.Mishell and S.Shiigi，W.H.Freeman andCo.，San Francisco，1980)；Harlowe and Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1987。在收集用于细胞融合的小鼠脾细胞的四天前，通过腹腔注射对免疫小鼠追加0.1mg溶于PBS的上述肽-DT缀合物。按Mishell和Shiig所描述那样，使用次黄嘌呤-氨喋呤-脱氧胸腺嘧啶核苷补充培养基进行杂交细胞的初次筛选。这种融合体被命名为F458。

分离产生针对G17C-末端的单克隆抗体的杂交瘤的初次筛选包括筛选能产生针对靶肽抗体，并能保持杂交细胞系稳定性的细胞。通过对含有能产生针对G17/34C-末端抗体的单一克隆细胞的组织培养皿细胞培养基进行筛查，以筛选出能产生抗体的细胞。这种筛选通过使用含有酰胺化合成肽(G34的氨基酸序列16-34-NH₂)缀合物的ELISA方法进行实现，该合成肽靠16-赖氨酸以一个半胱氨酸与免疫载体牛血清白蛋白(BSA)连接。专业人员都知道合适的ELISA技术，以下对几个例子进行了特别描述。通过对每种能产生在ELISA试验中与人G34(16-34)NH₂-BSA缀合物相结合的抗体的杂交细胞进行两次克隆以获取稳定的细胞株。通过这些方法，获得了15种能产生抗G17和G34C-末端的单克隆抗体的杂交细胞系。

实施例2.选择在总(结合及游离)G17免疫酶测定中表现优秀的单克隆抗体

测量生物学液体(如可能含有抗胃泌素抗体的人血浆)样品中G17总量的方法已被发现并在2004年3月29日归档的美国专利10/813,336中进行了描述。简单说，这种方法包括往生物学液体测试样品中加入过量的含人G17中1-8位氨基酸(人G17(1-8)置换肽)的肽，以置换任何可能存在的胃泌素激素而通过其N-末端表位与可能存在于测试样品中的对G17N-末端表位特异的抗体结合。在孵育期后，将含有置换肽的样品混合物加入包被有针对G17C-末端的捕获抗体的96孔ELISA板。孵育后，洗涤ELISA板除去置换肽，随后加入与G17N-末端结合的酶联抗体，检测并定量测定结合的G17。再进行洗涤步骤除去未结合的酶联抗体，加入能通过与抗体相连的酶的作用产生可检测产物的显色或其他底物，产生可检测到的信号。例如，当酶为辣根过氧化酶(HRP)时，底物为四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)。当检测用的酶为碱性磷酸酶时，对硝基苯酚磷酸盐可被用来作为产生有色复合对硝基苯酚的显色底物。颜色的程度，读作吸收单位(AU，对硝基苯酚在405nm处，三硝基苯磺酸在450nm处读取)指示了试验样品中的G17的量，而实际浓度由以所读取的试验样品的吸收度参照不同已知浓度G17制成的标准曲线而确定。

采用这种测定方法进行了预试验，使用加入了预定浓度的G17的患者血浆样品，并使用抗G17的C-末端表位的多克隆兔抗体作为捕获抗体包被在检测板孔上进行免疫测定。从这些测定中得到的结果和数据不具一致性，不能提供可接受的敏感度水平。因此，具C-末端选择性的单克隆抗体被用于包被检测板并作为测定中的捕获抗体。

为在总G17测定中检测融合体458中对G17的C-末端具选择性的各种单克隆抗体，首先通过G蛋白亲和色谱法对15种单独的抗G17的C-末端的单克隆抗体进行纯化。这通过使用一种商业化试剂盒(HiTrapProtein G HP，1mL，Amersham Biosciences)按照生产商的说明完成。每种单克隆抗体的浓度通过波长280nm处的吸光度(A280)测定。A280除以浓度系数1.4mL/mg得到浓度值。调整浓度降至0.1-1.0mg/mL范围内。然后使用ELISA测定法对每种溶液(未稀释)进行再次测定，准确确定单克隆抗体与G17C-末端的结合。

然后按以上所述，使用人G17(1-8)置换肽对这15种单克隆抗体、1种阴性对照单克隆抗体和3种纯化单克隆抗体的混合物在总G17免疫酶测定中的表现进行测试。每种测定包被缓冲液中的单克隆抗体浓度被稀释至10μg/mL(1瓶Convol pH8.0浓缩缓冲液(BDH product 18052 1U)，加入2.5L水；加入2.5g叠氮化钠并溶解)，然后如上述测定总G17的方法所述，移至96孔ELISA检测板的包被孔里。

将一部分已知浓度的G17加入除去了天然G17(通过在室温下培养过夜，使得内源性血清蛋白酶消化掉任何存在的G17)的血清样品中。对这种″G17-spiked″血清进行稀释以制备已知G17浓度的标准溶液。标准G17的浓度为0、4.1、64和800pM。往样品中加入含有G17N-末端的人G17(1-8)置换肽，将其作为测定中的测试样品使用。然后将每种G17溶液加到包被有G17C-末端选择性单克隆抗体的检测板孔中，按上述步骤进行总G17的测定。

表1列出了这些测定的结果，即使用包被在检测板孔上的15种单克隆抗体作为捕获抗体所测得每个G17浓度下的A280吸光度值。

表1.测试每种抗G17C-末端单克隆抗体在总G17 ELISA测定中的表现

标准值(pM)	包被抗体ID，平均应答(AU)
						F458-4 10H 6A 3G	F458-4 7E 1H 4D	F458-3 7G 7D 11B	F458-4 12A 4H 8C	F458-2-5F 8A 1A
	04.164800	0.0160.0140.0150.017	0.0920.1460.3992.705	0.0970.1310.3132.678	0.1430.2150.7193.596						0.0220.0280.0630.484

标准值(pM)	包被抗体ID，平均应答(AU)
						F458-2-11A 8D 8C	F458-1-1E 7B	F458-3-8G 1H 3C	F456-1-8E 7C 5G	F458-4-7C 9B 8B
	04.164800	0.0650.0880.4593.135	0.1080.1910.3272.649	0.0990.2040.6053.642	0.1340.2100.4923.439						0.1500.2660.6813.784

标准值(pM)	包被抗体ID，平均应答(AU)
						F458-4-12G 7E 3E	F458-4-6E 4C4A	F458-1-7A 3H 1D	F458-3-1G 9C 12A	F458-4-5E 4H 10A
	04.164800	0.0200.0250.0420.109	0.0860.2080.5803.229	0.1560.1680.2913.260	0.0700.0420.0790.864						0.1080.1750.3162.950

标准值(pM)	包被抗体ID，平均应答(AU)
					F458-2-11B 7A 11H	F458 Pool #1	F458-Pool #2	F458 Pool #3
	04.164800	0.0230.0280.0670.415	0.1290.2120.4233.027	0.2940.1620.3822.999					0.2110.2490.6403.799

在对每种单克隆抗体在测定中的表现的测试的结果的基础上筛选出最合适的单克隆抗体。比较单克隆抗体所使用的标准如下：

1)加入0.0pM G17时的吸光值低(基线值，优选≤0.1AU)；

2)4.1pM G17时吸光值为基线值的两倍；

3)从4.1pM到64pM G17(测定的主要工作范围)的吸光值出现最高增长(倾斜)；以及

4)G17浓度为800pM时吸光值(AU)最高。

根据这些标准，表现最好的单克隆抗体是F458-3-8G 1H 3C。这种抗体被重命名为MAb 458-1，并作为最合适的选择性与G17的C-末端相结合的单克隆抗体用于随后的测定中。这些标准和类似测定也同样被用于筛选针对以下例证的G17，G34，G17-Gly及G34-Gly的末端表位的单克隆抗体。

使用具有合适的氨基酸序列的置换肽以置换结合激素，可被结合入其它形式胃泌素肽的测定中以测定样品中的游离和总(结合+游离)胃泌素激素的量。如果能得到肽结合区域的氨基酸序列，置换肽的使用也可被应用于任何肽激素总量的测定中。

实施例3抗人G34 N-末端的单克隆抗体的分离及特征描述

除对脾细胞供体小鼠进行抗G34N-末端表位免疫和筛选对G34N-末端表位具特异性的单克隆抗体所用的肽组分以外，按实施例1中关于制备抗G17和G34C-末端的单克隆抗体的描述制备产生抗G34氨基端的单克隆抗体的杂交瘤。为诱发对G34的N-末端表位的抗体反应，将肽pELGPQGRPPPPC(SEQ ID NO：12)与DT相结合形成免疫原。将这种肽与BSA进行类似连接形成ELISA中用的靶抗原，以识别抗G34N-末端表位的单克隆抗体。这种融合体被命名为F401。

F401产生单克隆抗体401-2。抑制ELISA测定证实了G34的特异性，如表2所示，只有G34肽抑制了单克隆抗体401-2与G34 N-末端仿免疫肽(SEQ ID NO：12)的结合。

表2.抗-G34单克隆抗体对胃泌素异构体1的特异性
								单克隆抗体		抑制物浓度(nmol/ml)抑制率50％3
hG17	eG172	hG170Gly	hG343	CCK(26-33)未硫酸化	GnRH
						401-2				NI	NI	NI	0.7	NI	NI
1.使用hG34靶抗原对单克隆抗体进行抑制酶联免疫吸附测定(ELISA)
								2.eG17＝马G17；除lys7(Glu)和Ala10(Glu)外，序列与人G17相同。
3.NI＝无抑制
								4.测试的抑制物浓度范围为0.01至100pM。

其它形式的胃泌素，包括G17，G17-Gly和马G17，以及CCK8(未硫酸化)和阴性对照品GnRH，均不能抑制单克隆抗体401-2的结合(如表2所示)。

实施例4.抗G17N-末端的单克隆抗体的分离及特征描述

除对脾细胞供体小鼠进行G17N-末端表位免疫和筛选对G17N-末端表位具特异性的单克隆抗体所用的肽组成以外，按实施例1中关于制备抗G17和G34C-末端的单克隆抗体的描述，制备产生抗G17氨基端的单克隆抗体的杂交瘤。为诱发对G17N-末端表位的抗体应答，将肽pEGPWLERPPPPC(SEQ ID NO：5)与DT相结合制成免疫原。将这种肽与BSA进行类似连接制成靶抗原，用于ELISA中对抗G17N-末端表位的单克隆抗体进行确定。另外，肽pEGPWLEEEEAAPPC(SEQ ID NO：16)还被与BSA相连制成制成针对G17N-末端表位的ELISA靶抗原。这种融合体被命名为F400。F400产生4种抗G17N-末端表位的单克隆抗体。这些抗体被命名为单克隆抗体400-1至-4。

单克隆抗体通过标准技术在小鼠体内以腹水的形式生成。每种F400单克隆抗体腹水以同等量混和制成试验用的上述抗体库。抗体库的抗-G17单克隆抗体滴定度通过ELISA确定，如表3所示。

采用技术人员熟知的标准放射免疫测定技术，通过抑制放射性免疫测定的Scatchard分析法测量四种单克隆抗体的亲和力，其中每种单克隆抗体与放射性碘化G17的结合受升高未标记的G17浓度抑制。表4显示了单克隆抗体400-1至4的亲和力(Ka)。抑制ELISA测定证明了对G17N-末端表位的特异性，据显示，仅G17、G17-Gly和马G17肽抑制了单克隆抗体400-1至-4与G17N-末端仿免疫肽(SEQ ID NO：11)的结合；而G34，和CCK8(为硫酸化)以及阴性对照品GnRH均为对400-1至-4单克隆抗体的结合造成抑制(如表5所示)。

抗G17单克隆抗体特征描述

表3.抗-G17单克隆抗体库滴度1，lot012502
				Mab	ELISA滴度	特异性
400-1+2+3+4	374,767	hG17N-末端
				1.针对hG17(1-9)-“Ala”-BSA靶抗原通过固相ELISA测定构建

表4.抗-G17单克隆抗体的亲和力，#400-1，-2，-3和-41
				Mab	Ka(L/mol)2	ABC(pmol/ml)2
400-1	1.648×108	19,745
				400-2	1.146×1010	8,579
400-3	2.820×107	8,841
				400-4	1.925×109	33,650
1.使用与制备抗体群(lot#012502)不同批次的腹水建立。
				2.使用125I-hG17进行RIA(Scatchard分析)：使用人G17抑制

表5.抗G17Mab对胃泌素异构体1的特异性
										产生50％抑制4的抑制浓度(nmol/ml)
MAb	Ab亚型	hG17	eG172	hG17-Gly	G343	CCK(26-33)未硫酸化	GnRH
								400-1	IgG2a	2.03	1.65	1.79	NI	NI	NI
400-2	IgG1	0.085	0.086	0.077	NI	NI	NI
								400-3	IgG1	1.08	0.12	1.39	NI	NI	NI
400-4	IgG1	0.62	1.69	0.699	NI	NI	NI
								1.使用hG17(1-9)-″Ala″-BSA靶抗原进行单克隆抗体抑制ELISA测定。
2.eG17＝马G17；除Lys7(Glu)和Ala10(Glu)外，其序列与人G17一样。
								3.NI＝无抑制
4.测试的抑制物浓度范围为0.01至100pM。

实施例5.抗甘氨酸延伸型G17/G34C-末端的单克隆抗体的分离及特征描述

除对脾细胞供体小鼠进行G17-Gly羧基末端表位进行免疫和筛选对G17-Gly羧末端表位具特异性的单克隆抗体所用的肽组成外，按实施例1中关于制备抗G17和G34C-末端的单克隆抗体的描述，制备产生抗G17-Gly羧基末端表位的单克隆抗体的杂交瘤。为诱发对G17-Gly羧末端表位的抗体应答，将肽CPPPPSSYGWMDFG(SEQ ID NO：14)与DT相结合制成免疫原。

将肽CGGSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO：15)与BSA连接制成用于ELISA中抗G17-Gly羧基末端的单克隆抗体的靶抗原。为筛选与G17-Gly结合但不与G17或G34相结合的单克隆抗体，本融合中采用了额外的证明对G17-Gly(SEQ ID NO：2)具单克隆抗体抑制但对G17(SEQ ID NO：1)不具抑制的选择步骤。这种融合体被命名为F445。

F445生成两种对甘氨酸延伸型G17具特异性的单克隆抗体。被命名为单克隆抗体445-1和445-2。这两种单克隆抗体的制备尤其困难，需要进行约14次融合才能成功。通常，一次融合就足以获得一种抗肽激素(如此处描述的其它胃泌素激素)的单克隆抗体。

[0102]抑制ELISA证明了对G17-Gly的特异性，其中显示只有G17-Gly肽(SEQ ID NO：2)和免疫原肽CPPPPSSYGWMDFG(SEQ ID NO：14)抑制了MAb 445-1和445-2与G17-Gly C-末端表位目标抗原(SEQ IDNO：14)BSA缀合物的结合，而其它形式的胃泌素，包括G17、G34和马G17，和CCK8(未硫酸化)和阴性对照GnRH，都不能抑制445-1和445-2单克隆抗体的结合(如表6所示)。

抗-G17-Gly(C末端)单克隆抗体(445-1，2)抗-G17-Gly单克隆抗体鉴定
								表6抗-G17-Gly单克隆抗体对胃泌素异构体的特异性1
		抑制物浓度(nmol/ml)抑制50％
								MAb	Ab亚型	hG17-Gly	hG17(12-17)-Gly18	hG172	hG34	CCK(26-33)未硫酸化	GnRH
445-1	未测定	0.7	4	NI	NI	NI	NI
								445-2	未测定	5	13	NI	NI	NI	NI
1.使用hG34(16-34)-Gly35-BSA(″Gly16″-BSA)靶抗原进行单克隆抗体抑制ELISA测定。
								2.NI＝无抑制
3.测试的抑制物浓度范围为0.01至100pM。

实施例6抗G34C-末端的单克隆抗体的分离及特征描述

人G34和G17具有相同的C-末端表位；实施例1中的结合号F458中生成的单克隆抗体，生成了与G34和G17的C-末端表位相结合的单克隆抗体。这种结合中生成的单克隆抗体称为458-1至-5。

抑制ELISA证明了单克隆抗体458-1至5对G17和G34的C-末端表位的特异性，其中显示仅G17肽(SEQ ID NO：1)、G34肽(SEQ ID NO：3)和CCK8肽(SEQ ID NO：13)(也表达C-末端表位)抑制了单克隆抗体MAb458-1至5与G17/34C末端表位肽(SEQ ID NO：11)BSA缀合物的结合；而其它形式的胃泌素，包括G17-Gly、G17(1-9)的N末端和阴性对照组GnRH，不能抑制458-1至5单克隆抗体的结合(如表7所示)。

表7.抗-G17、G34(CCK8)单克隆抗体的特征描述

		10nmol/ml(250pmole/孔)下的抑制百分比3
								MAb	Ab亚型	hG17	hG1734	CCK(26-33)未硫酸化	hG17-Gly	hG17(9)	GnRH
458-1	IgG1	94.3	93.5	93.8	2.1	NI	1.1
								458-2	未测试	86.0	84.5	84.8	NI	NI	NI
458-3	未测试	92.4	90.7	84.8	NI	1.2	1.1
								458-4	IgG1	88.4	86.7	83.4	NI	NI	NI
458-5	未测试	91.9	91.5	92.0	NI	NI	NI
								1.使用hG34(16-34)-Gly35-BSA(″Gly16″-BSA)靶抗原进行单克隆抗体抑制ELISA测定。
2.NI＝无抑制
								3.测试的抑制物浓度范围为0.000001至10pM。

实施例7.F400单克隆抗体在体外对胰、胃和结肠癌细胞的抗-肿瘤细胞效果的说明

对抗G17N-末端的单克隆抗体群(实施例4中图3所示)的抑制取自人胰腺、胃和结肠癌的肿瘤细胞株生长的能力进行测试。每种器官来源的细胞株取两种进行体外研究。测试的这六种单独肿瘤细胞株都能产生自己的G17激素，可能引起自分泌效应(可通过抗G17中和单克隆抗体抵消)。

为制备针对细胞的体外试验用的F400单克隆抗体混合物，使用层析仪按照Sulfo-Link工具盒提供的方法，对与琼脂糖(Sulfo-Link，Pierce)相连的表达G17N-末端表位(SEQ ID NO：12)的肽的抗体进行亲和力纯化。单克隆抗体用PBS透析，使用A280测量法确定它们的浓度。

在标准环境中(37℃，5％CO₂，增湿孵育器)培养细胞。培养基包括含有10％(v/v)热灭活胎牛血清(FBS，Sigma)的完全RPMI 1640培养基(Gibco)。

为收获试验用细胞，使用0.025％乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma)收获半汇合状态的单层细胞。将细胞在培养基中清洗，并用培养基重悬，使浓度为1×105个活细胞/mL，并放于96孔培养板上(0.1mL/孔)。孵育过夜后，吸去培养基，加入含500ug/mL F400单克隆抗体混合物或含正常小鼠免疫球蛋白(NMIg)的新鲜培养液。将细胞再孵育48小时，然后通过四甲基偶氮唑盐MTT测定法(哺乳动物细胞培养中常用的细胞生长评估方法)对细胞增殖进行评估。从MTT测定中得到的每孔的吸光度被按组进行平均(n＝5)。然后计算出F400单克隆抗体相对于NMIg抑制细胞生长的百分比。

表8给出了这些试验的结果，说明抗-G17单克隆抗体混合物抑制了每种试验肿瘤细胞株的生长。抑制程度从19.5％(对于胰腺肿瘤株)至52.0％(对于胃细胞株)。

因此，表明本发明中的单克隆抗体在体外对三种常见胃肠道恶性肿瘤具有抗生长的治疗作用。

表8.抗-G17单克隆抗体400-1，-2，-3，-4混合物对六种人类肿瘤细胞株的基础生长抑制。

癌症类型	胰腺癌		胃癌		结肠癌
							细胞株	BxPC3	PAN-1	MGLVA1	ST16	C170HM2	HCT116
F400单克隆抗体混合物对细胞生长的抑制百分比	19.5	22.0	40.0	52.0	50.0	41.0

实施例8.F400单克隆抗体在体内对胃癌细胞的抗癌疗效的说明

对抗G17N-末端的单克隆抗体群(该抗体群含有相等量的含单克隆抗体400-1至-4的腹水混合物)的抑制来自人胃癌细胞MGLVA1的肿瘤细胞株生长的能力进行测试。MGLVA1细胞能产生其自身G17激素，潜在造成自分泌效应(可能被抗G17单克隆中和抗体抵消)。

为制备体内试验用F400单克隆抗体腹水混合物，将腹水在56℃加热30分钟除去腹水中的补体。对购买自Sigma的阴性对照腹水进行类似处理。

在雌性裸小鼠中以皮下肿瘤的形式培育MGLVA1胃癌细胞。为在试验小鼠身上植入肿瘤，通过手术从肿瘤携带小鼠身上取得肿瘤并切成约1mm³的小块。随后将这些小块皮下植入本研究所用裸小鼠的侧腹，使得肿瘤可摘取。观察肿瘤部位并使用测径器测量肿瘤的生长情况。当观察到肿瘤可以摘取时，将小鼠随机分为待测试单克隆抗体(F400mix)处理组或待阴性对照腹水处理组。研究中每组12只小鼠。

第一周，对小鼠进行腹膜内注射0.2mL腹水(F400混合物或阴性对照)，一周两次。第一周后将注射量减至0.1mL，一周两次。每周测量肿瘤3次。研究共进行27天。在研究结束时，处死小鼠，切取肿瘤并称重。

使用F400测样单克隆抗体混合物处理的小鼠体内的MGLVA1胃癌肿瘤平均重量为0.75g，而携带MGLVA1胃癌肿瘤，并使用腹水作为阴性对照处理的小鼠的肿瘤平均重量为1.5g。因此，F400测验混合物中的抗-G17单克隆抗体表现出很强的对胃癌细胞生长抑制作用，使肿瘤重量减小了50％。

实施例9.确定抗G17和G34C-末端抗体滴度的ELISA测定

本分析方法的目的是为了通过ELISA测定确定测验血清中抗-hG17抗体的滴度。简单地说，本发明中的抗-hG17抗体ELISA测定基于抗体(Ab，多克隆或单克隆)与hG17(1-9)-AAPPC-BSA缀合物(通过交联剂SEQ ID NO：16与BSA偶联的人胃泌素肽的氨基酸1-9)所表达的hG17表位的特异性结合。

第一步，将缀合物与96孔ELISA板的孔相结合。使用96孔板洗涤器洗去游离缀合物。然后加入测试(或对照)抗血清。测试血清中的抗-hG17Ab通过抗原中的hG17肽表位与缀合物相结合。然后通过加入抗-IgG-碱性磷酸酶试剂对抗体进行检测，这种试剂对所测的抗-hG17抗体具特异性。例如，使用与兔抗hG17Ab结合的山羊抗-兔IgG-碱性磷酸酶缀合物(″GAR-AP″)对兔抗-hG17抗体进行检测。随后抗-lg-AP缀合物的AP部分催化底物转变为有色产物(p-硝基酚)。使用ELISA板阅读器测量405nm处的吸光度对颜色变化进行测量。

使用取自与测试样品相同种类的动物的，含混合抗hG17血清的标准血清或含具给定参考滴度的抗-hG17单克隆抗体的腹水作为阳性对照品。使用取自与测试样品相同种类的动物的血清(如正常血清、免疫前血清等)作为阴性对照品。

线形范围内的颜色变化值与与靶抗原相结合的抗-hG17Ab的量直接成比例。使用阳性标准(抗-hG17)血清系列稀释曲线对比吸光度值制成标准曲线。然后根据产生与阳性标准(如兔抗-hG17阳性标准1∶200,000稀释液)参考滴度相同吸光度的稀释液确定测试样品中抗-hG17Ab的滴度。

试剂溶液：本分析方法中规定的试剂及溶液的量仅供方便参考。实际的量可根据要求进行称量。

1.含0.02％NaN₃的碳酸盐缓冲液(“碳酸盐缓冲液”)：使用磁力搅拌器将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶解于约750ml蒸馏水中。加入4ml 5％的NaN₃溶液，搅动。加入水至1.0公升。测量溶液pH值(应为9.6±0.2)(如需要，使用1.0M NaOH或1.0M HCl调节溶液pH值)。储存于冰箱中待用。

2.含0.05％吐温-20和0.02％NaN3的FTA(PBS)(″FTA/吐温″)：将9.23g FTA溶于约750ml净化水中。加入0.5ml吐温-20和4ml 5％NaN₃。加入水调至1.000公升。

3.含1％BSA的FTA/吐温(“BSA/FTA/吐温”)：将10g BSA溶解于1000ml FTA/吐温中。

4.底物缓冲液：将50mg MgCl₂ ^*6H₂O溶于448ml净化水中。加入50ml DEA和2ml 5％NaN₃。使用浓缩HCl将溶液pH值调至9.8。于室温避光保存。

5.PBS，pH值7.2：可使用固体FTA(FTA血凝缓冲(“FTA”)(BectonDickenson Microbiology Systems，Cockeysville，MD))制备。

ELISA测定步骤：抗原包被：于碳酸盐缓冲液中制备含1ug/ml hG17(1-9)-AAPPC-BSA缀合物(通过交联剂SEQ ID NO：16与BSA偶联的人胃泌素肽的氨基酸1-9)的溶液。每张板包被需要至少5.2ml抗原溶液。使用碳酸盐缓冲液对1mg/ml的缀合物储备液进行1∶1000的稀释制备抗原溶液。板可以是任何适用于ELISA测定的板，例如：Microtiter^免疫测定板、硬苯乙烯板(如Immulon^2“U”底96孔板，Dynatech Laboratories，Inc.，VA；或平底96孔板，聚苯乙烯：如微孔板，NUNC，vendor VWR)。往每孔中加入50μl抗原溶液对Immulon^2“U”底板进行包被。将板储存于保湿腔(如，带湿巾的封闭容器)中防止水份流失，并置于冰箱(2-8℃)中孵育过夜。

制备血清稀释液：如表9所示制备1/100.5的阳性标准、阴性对照及测试血清的系列稀释液。在平底96孔板(12-道加液器可同时进行最多12种血清的稀释)使用BSA/FTA/吐温溶液对血清进行稀释。

表9如表所示制备从1∶1000开始的系列稀释液

96孔板	血清	滴度1
			行号#	稀释度	(＝1/稀释度)
A	1∶1,000＝10-3	103
			B	1∶3,162＝3.16×10-4＝10-3.5	3.16×103
C	1∶10,000＝10-4	104
			D	1∶31,623＝3.16×10-5＝10-4.5	3.16×104
E	1∶100,000＝10-5	105
			F	1∶316,230＝3.16×10-6＝10-5.5	3.16×105
G	1∶1,000,000＝10-6	106
			H	1∶3,163,300＝3.16×10-7＝10-6.5	3.16×106

¹稀释度的倒数为每次稀释的滴度。

制备足够量的每种血清稀释液(最小工作容量为200μl)。根据血清滴度，从1/100(对于低滴度血清)或1/1000(对于高滴度血清)开始对A行中的每种血清进行稀释，然后向下对每列进行系列稀释直至H行(见表9)，生成共计8种不同的样品稀释液。阴性对照品的稀释系列从1/100开始。阳性标准血清和免疫前采血/阴性对照血清的系列稀释液样品在每板上设置双份。

洗涤板：使用板洗涤器(如：Ultrawash Plus；或DynaWasher II(Dynatech Laboratories，Inc.，VA)或等同物)和FTA/吐温将每块包被板洗涤四次，然后将板在纸巾上“拍击”除去残留溶液。

抗体结合：按照下表10所示的板稀释系列示例，将稀释血清转移至抗原包被“U”板的对应的孔中(50μl/孔)。将板置于保湿腔中室温孵育1小时。

表10：96孔板ELISA测定方案示例

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	样品稀释度
														A	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-3
B	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-3.5
														C	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-4
D	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-4.5
														E	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-5
F	Neg.	Neg.	Pos	pos	TS1	TS9	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-5.5
														G	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-6
H	Neg.	Neg.	Pos.	Pos.	TS1	TS2	TS3	TS4	TS5	TS6	TS7	TS8	10-6 5

缩写：

Pos.＝阳性标准血清；

Neg.＝免疫前采血/阴性对照血清；

TS1-TS8＝测试血清

抗体检测试剂：在FTA/吐温中制备合适的抗-Ig-碱性磷酸酶缀合物稀释液。本测定中每张板需要至少5.2ml。按上述说明对板进行洗涤。往“U”板的每个孔中加入50μl/孔的GAR-AP溶液(抗-Ig-碱性磷酸酶缀合物，如，测试兔抗-hG17抗体用的山羊抗-兔IgG(H+L)-碱性磷酸酶(Antibodies Inc.，Davis，CA))，并置于保湿腔中室温孵育1小时。

要检测取自兔以外的动物的血清中的抗-hG17抗体，必须使用对产生测试血清的动物具特异性的抗-Ig-AP缀合物进行检测。(例如：人抗-hG17抗体需使用抗-人IgG-AP试剂(在每批试剂规定的稀释度下使用)进行检测)。阳性标准血清和阴性对照血清应取自与测试血清同样的同种动物。

底物溶液：将p-NPP片剂(p-对硝基苯酚磷酸盐，以磷酸酶底物片剂的形式提供，Sigma 104(″p-NPP″)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO))从冷冻柜中取出并使其恢复至室温。在即将使用前，往5ml DEA底物缓冲液中加入1片p-NPP片剂制备1mg/ml的p-NPP溶液(室温)。每1测试板用5-ml底物溶液即足够。将底物溶液储存于黑暗环境中待用。

底物添加：按上述说明对板进行洗涤。从1列A排开始，使用8(或12)道加液器往所有孔中同时加入p-NPP溶液(50μl/孔)。

监测反应：当最接近参考滴度的阳性标准稀释液的吸光度达到ELISA板阅读器最大线性读数范围的10-30％时，终止底物溶液的反应。使用ELISA板阅读器(如MRX自动板阅读器；或MR 580 MicroELISA自动阅读器(Dynatech Laboratories，Inc.，VA)或等同物)对阳性标准稀释液的吸光度进行监测以确定与参考滴度相对应的稀释达到阅读器范围的10-30％的时间(通常为反应开始后10-30分钟)。ELISA读数器被设置为在A405nm波长对对硝基苯酚进行测量。

终止反应：当上述所选的阳性标准稀释液的吸光度值达到阅读器线性范围的10-30％时，使用8(或12)道加液器往每个孔中加入50μl 1.0MNaOH终止反应。往孔中添加NaOH溶液的顺序及时间与底物溶液的相同。小心摇动计数器顶上的板，轻轻对试剂进行混合。

测量吸光度：使用一个ELISA阅读器对整张板进行阅读。

数据分析：按以下所述对每种血清的滴度进行确定：将阴性对照血清的吸光度值从每种对应阳性标准血清和测试血清稀释液的吸光度中减去。(取每种阳性标准和阴性对照稀释液吸光度的平均值。)以纵轴(线性标度)为吸光度，横坐标为(I/稀释度)，对每种血清(包括阳性标准)进行半对数作图。通过标绘稀释逆转，滴度可直接在X-轴上读取。有的时候，吸光度值明显在某特定血清的结合曲线以下(溢出点)；这类值被排除曲线以外。每种血清的滴度被确定产生与阳性标准参考滴度相同吸光度值的稀释度的倒数(例如，兔抗-hG17阳性标准的稀释度1∶200,000)。图1提供了一个数据分析的例子。

实施例10通过抑制ELISA测定确定抗体特异性

除以下描述外，按上述实施例中同样的方法进行肽抑制ELISA测定：

制备抑制物：使用合适的靶激素肽(此例中为hG17)制备1μmol/ml(1000μM)工作储备溶液。使用工作储备溶液制备抑制稀释液系列，稀释率为1∶2至1∶10，根据板的设计，生成共计8种或12种稀释液。

制备样品稀释液：在抑制测定前对样品进行系列稀释以制备最大结合率为50％的抗体样品稀释液。然后将样品制备为2倍50％结合浓度，用于与等量的肽抑制物及缓冲液相混合，作为抑制测定中的对照品。将样品混合物置于保湿腔中孵育约30分钟，然后加入洗涤过的包被ELISA板中，在保湿腔中孵育约1小时。

根据吸光度读数(从本底中减去)确定结合百分率：用带抑制物的样品的吸光度值除以不带抑制物的对照样品的吸光度值，并将得到的值乘以100。最后，用100％减去结合百分率得到抑制百分率。

测试样品可以是血清、细胞培养液上清中的单克隆抗体、腹水或亲和力纯化抗体(Ab)。对于抗除G17氨基端以外的靶抗原的亲和力纯化抗体(Abs)，使用合适的靶激素抗原和抑制物。将无关的肽作为阴性对照。

ELISA测定：数据分析

图1显示了一个从上述ELISA测定中获得的数据的例子。用平均阳性标准和测试血清吸光度值减去平均阴性对照血清吸光度值得到每次稀释的净吸光度值。将净吸光度值对应滴度进行标绘。(在本实施例中，阴性对照值也被进行了标绘以显示典型值。)

胃泌素-17的稳定性

通过上述总胃泌素测定对胃泌素在室温下(约22℃)的稳定性进行评估：在样品制备好后立即测量总G17以获得已知G17浓度：15、100和600pM，并在2小时后在室温下在实验台上再次测量。下表11中显示的测量结果表明每种样品中的G17浓度出现大量下降。

表11总胃泌素17测定

室温(ca 22℃)下人血浆中的胃泌素17的稳定性

		测得的胃泌素17的浓度(pM)
					15	100	600
		0a小时	平均值SdCV(％)RE(％)	11.6				89.4	605.5
2.8	4.3				25.0
				23.8		4.8	4.1
-22.7	-10.6				0.9
				2小时		平均值SdCV(％)RE(％)	5.5	59.1	400.5
3.1	2.0	19.7
			55.2		3.5		4.9
-63.3	-40.9	-33.3

a作为基线的平均结果

sd标准差

CV变异系数(rounding前计算)

RE相对误差(rounding后计算)

实施例11.抗HG17抗血清的抑制放射性免疫测定(RIA)-用于确定抗人胃泌素17(hG17)抗血清的抗原结合能力(ABC)的血清滴定和抗原抑制RIA测定。

稀释缓冲液：

1.磷酸盐缓冲盐水，pH值7.2(PBS)+0.02％叠氮化钠(NaN₃)。可溶性固体物的商业销售用制剂，“FTA血凝缓冲液”可被溶于蒸馏水中生成PBS(9.23g/l对用的溶液pH值为7.2+0.1)。

2.含1％牛血清蛋白(BSA)和0.02％NaN₃的FTA。

3.补充小牛血清(SCS；GIBCO)，分成50ml或更少量冷冻储存。

4.PEG，MW8000，配制为25％溶液，(250g/公升；缓慢溶解)。于4℃储存。

5.人胃泌素17(15-Leu)(Research Plus，#07-027-002)；FTA/1％BSA/叠氮化合物中浓度为5-10ug/ml的一次用量。于-70℃储存。

6.人胃泌素17-¹²⁵I(NEN)。

方法

首先对试验血清进行一系列量的hG17-¹²⁵I的滴定以建立抑制RIA中待测的每种抗血清溶液量，并通过Scatchard分析计算抗原结合能力(ABC)。

滴定RIA测定实验规范

1.对于阳性对照抗血清和所有测试抗血清，为每种待测抗血清稀释液配置双份试管；优选5种10倍稀释的血清，以使测试管中的最终稀释度为1∶40至1∶400,000。这等同于往每支试管中加入10μl至0.001μl的抗血清。

2.将300μl稀释缓冲液分装入两支作为试剂空白的试管中；将200μl稀释缓冲液加入所有余下试管中。

3.将100μl稀释抗血清转移至双份血清试管(需要2×100μl每种稀释液)。使用30μl抗血清开始系列稀释(生成300μl 1∶10稀释液)足以弥补转移中的损耗。

4.将至少一种阴性血清稀释液(1∶40，测试血清的最低稀释度)作为非特异性结合对照品。

5.在RIA缓冲液中稀释至约10,000cpm/0.1ml的¹²⁵I-标记抗原(Ag)。稀释步骤见下。

6.将100μl标记胃泌素加入所有试管中。将100μl标记hG17加入10个闪烁瓶或γ-计数管中以确立加入的总计数。

7.通过摇动或涡旋对试管内物质进行混合并用石蜡膜封口。

8.将试管在4℃孵育，过夜，～18小时。这是最短的孵育期：滴定RIA中也可以进行更长时间的孵育，但通常不需要。

9.将100μl SCS加入所有试管中并摇晃试管。

10.将500μl 25％PEG(4℃或RT)加入所有试管中并进行漩涡混合。

11.将试管于在4-12℃，2000 Xg离心30分钟。

12.吸出并丢弃所有试管中的上清。

13.按以下所述，在γ-计数器中对测试管中的沉淀物进行计数或将沉淀物制备用于进行如下所述的闪烁计数。

计算

取双份样品每分钟计数的平均值。非特异性本底结合未被减去。对数据进行标绘：hG17-¹²⁵I结合％vs.加入的血清量。选取结合了加入每种样品中的总cpm35％的量的每种血清用于抑制RIA测定。

抑制RIA测定

1.如滴度RIA的测定一样，每种抑制系列使用一种抗血清稀释液。需要配置的试管对的数量由待测抑制物稀释液(包括未抑制对照品)的数量决定。典型情况下，每种抗血清需要8种抑制物稀释液(16支试管)加2未抑制试管。

2.将300μl稀释缓冲液分装入两支试管中作为倒数时间空白(为建立天然本底计数)。

3.将200μl缓冲液分装入六支试管中以接收阴性对照血清(用于本底非特异性结合)；其中两支在测定结束时使用。将200μl缓冲液分装入每种血清的两支试管中(用于总计数结合)。这些试管中未加入任何hG17抑制物。

4.将100μl稀释缓冲液加入所有余下试管中。

5.将100μl稀释至适当最终浓度(见下)的未标记hG17(抑制物)分装入每种测试血清和对照血清的试管对中。这些系列建立了每种抗血清的hG17抑制曲线。hG17抑制物在FTA/叠氮化钠中从5120pg/0.1ml开始以1∶1系列稀释配制。

8.将试管混合。

9.将RIA缓冲液中的¹²⁵I-标记抗原稀释至约10,000cpm/0.1ml。

10.将100μl hG17-¹²⁵I加入所有试管(包括12支或更多测定的各处试管)中，以建立总计数。

11.最后，将100μl适当稀释的抗-hG17对照血清、阴性对照或测试血清加入合适的试管对的每支试管中。

12.将试管进行混合并封口(如，用石蜡膜)。

表12.方案概要

系列	管号#	体积(μl)/管
							缓冲液	hG17-125I	hG17抑制物	测试抗血清或阳性对照血清	阴性对照血清
		A	2	200	100	-						-	-
B	2n						200	100	-	100	-
		C	6	200	100	-						-	100
D	2i						100	100	100	100	-

A.小含血清的非特异性本底对照

B.总计数结合数＝抗血清的数量

C.含阴性对照血清的非特异性本底

D.hG17抑制系列.i＝抑制物浓度数

13.将试管在4℃孵育～42小时(两天)。

14.将100μl SCS加入所有试管中并混合。

15.将500μl 25％的PEG加入所有试管中并混合。

16.将试管于4℃，2,000 Xg离心30分钟。

17.吸出并丢弃所有试管中的上清。

18.使用γ-计数器对测验管中的沉淀物进行计数或对沉淀物进行闪烁计数。为进行闪烁计数，将250μl dH₂O加入所有测试管中；将水加热至90-100℃加速片剂的溶解(需要2-3小时)。然后将3ml闪烁液加入每个闪烁瓶中。将所有溶解了的片剂从单管中转移至闪烁瓶中，并置于支架上计数。

计算

1.取两份样品cpm平均值，并减去非特异性本底结合数(通过阴性血清对照的平均值确定)。

2.将总计数相加，并使用基线本底对照以确保未抑制抗-HG17抗体结合的总计数在预期的范围内。

3.使用总计数和每种数量的抑制物的计数结合，通过Scatchard分析(结合/游离vs结合抗原)对ABC及抗血清的亲和常数进行确定。对于每种抗血清个体，选择达到最佳线性回归线的点，删去其余点。这通过观察标绘及标注回归常数完成。曲线的较低部分通常不被使用。ABC和亲和常数通过表格程序设置被自动相加。

稀释HG17-¹²⁵I

hG17-¹²⁵I的来源为NEN。放射示踪激素(15μCi)在运输时的比放射性为2200μCi/mmole。按照包装所附的说明，在衰变天数的基础上，使用dH2O将亲液物稀释至50μCi/ml。溶解后，制成50μl分包装并置于铅容器中-70℃储存。

稀释至10,000CPM

往每支测试管(0.1ml)中加入大约10,000cpm的标记复合物。(通常为10,000-10,400cpm/管)。当确定所需的稀释hG17-¹²⁵I的量时，额外加入3-4ml用于进行总计数的确定和转移及发泡过程中的损耗的补充。

注意：本测定中使用的测试样品可以是血清、细胞培养液上清中的单克隆抗体、腹水或亲和力纯化抗体(Ab)。对于抗除G17氨基端以外的靶抗原的抗体，使用合适的¹²⁵I-标记的靶激素抗原和抑制物。将无关的肽作为测试的阴性对照。

实施例12：使用兔a-GRE 11抗体对石蜡包埋组织上的CCK2受体进行检测

将组织切片浸入3次分开的二甲苯浴(5-6浸，每次)中去石蜡，然后在100％工业用甲醇化酒精(IMS)(5-6浸，每次)中孵育进行再水化。用蒸馏水对切片冲洗5分钟。将切片在15％的醋酸中孵育20分钟，阻断内生碱性磷酸酶活性。用蒸馏水对切片冲洗5分钟。将切片两两相隔置于塑料载玻片支架上，在pH值为6的柠檬酸盐缓冲液(2.1g柠檬酸一水化合物，约＝12.5mL 2M NaOH/1 L)中微波(600W)处理10分钟，确保在整个处理期间，缓冲液足够覆盖切片。然后立即将切片转移至冷的、流动的蒸馏水中放置3-4分钟。小心勿使切片变干。

用疏水笔对切片进行标记，将切片置于保湿腔并浸渍于TRIS缓冲盐水(TBS)中，pH7.6，5分钟，(0.66g TRIS-(羧甲基)钾胺，8.75g NaCl，#4.15mL HCL)，室温(″RT″)。将切片置于10％的正常山羊血清中，在TBS中室温孵育20分钟，阻断第二抗体(“Ab”)的非特异性结合。将切片弄干，往每片切片上加入第一抗体(200μl/片)，在室温下在保湿腔中放置1小时。先使用TBS轻轻冲洗切片，(在喷瓶中；注意不要将水流直接对准组织切片)，然后将切片放入缓冲液中浸泡5分钟。

将碱性磷酸酶结合山羊抗-兔第二抗体(或适当的针对测试抗体源的抗体)在TBS中的稀释液(1/50稀释度)加入切片(200μl/片)。将切片在室温下孵育1小时，然后放入TBS中清洗5分钟。

在即将使用前制备快速红底物(Vector Red，Vector Labs/Fast Red，Sigma)，并将其加入每片切片上，最长时间为20分钟(Vector)或30分钟(Sigma)。将切片在TBS和蒸馏水中漂洗，然后在Mayer′s苏木紫中进行复染(时间不定)。染色后，将切片转移至蒸馏水中。

然后将切片浸泡于1％的酸性酒精中(10mL conc HCL，700mLIMS，290mL蒸馏水/公升)除去多余的复染剂，(如果使用的是快速红底物(Sigma)则除外)，然后将切片转移至蒸馏水中。将切片在0.5％硼砂溶液(用水稀释)中浸泡数次。在这一步中建议在显微镜下对一片切片进行检查看细胞核是否被染成蓝色而不是紫色。然后将染色后的切片转移至蒸馏水中，然后放入IMS中，最后放入二甲苯中，之后使用DPX(xylenemontant)封片。

使用系列稀释来建立合适的测试和对照血清/纯化抗体稀释液。使用碱性磷酸酶试剂系统对胃肠切片进行染色效果最好。尽管ABC更具特异性，由于其高度灵敏性会产生许多非特异性染色。可使用左旋咪唑(Levamisole)(Vector labs)对肠内碱性磷酸酶进行阻断，左旋咪唑在制备切片时被加入底物溶液中。Vector红底物比Sigma底物存在的问题少。但是，需要在制备好的底物溶液中加入一滴左旋咪唑(Vector Labs)。

用于本免疫组织化学方法中的初级抗体(Ab)可以是血清、单克隆抗体、细胞培养液上清中的Ab、腹水或亲和力纯化Ab。

本领域人员将马上意识到此处以上所描述的步骤可用于分离适用于其它肽(尤其是其它激素肽，包括其它形式的胃泌素激素)的免疫检测和免疫酶分析的最佳单克隆抗体。本发明包括此处所教导及通过非限制性实施例进行说明的全部范围的单克隆抗体。所有本发明书中所引用的专利及出版物均通过引用将其全文并入本文中。

杂交瘤细胞系的保藏

产生本发明中的特定单克隆抗体的以下杂交瘤于2004年3月25日被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)：

1.产生单克隆抗体400-1的杂交瘤400-1，指定保藏号为PTA-5889。

2.产生单克隆抗体400-2的杂交瘤400-2，指定保藏号为PTA-5890。

3.产生单克隆抗体400-3的杂交瘤400-3，指定保藏号为PTA-5891。

4.产生单克隆抗体400-4的杂交瘤400-4，指定保藏号为PTA-5892。

5.产生单克隆抗体401-2的杂交瘤401-2，指定保藏号为PTA-5893。

6.产生单克隆抗体445-1的杂交瘤445-1，指定保藏号为PTA-5894。

7.产生单克隆抗体445-2的杂交瘤445-2，指定保藏号为PTA-5895。

8.产生单克隆抗体458-1的杂交瘤458-1，指定保藏号为PTA-5896。

序列表

<110>RECEPTOR BIOLOGIX，INC.

<120>抗胃泌素激素单克隆抗体

<130>1102865-0076

<150>US 60/557,759

<151>2004-03-29

<150>10/813,336

<151>2004-03-29

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>17

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<220>

<221>MOD_RES

<222>(17)..(17)

<223>AMIDATION

<400>1

Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp

1               5                   10                   15

Phe

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400>2

Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp

1               5                   10                  15

Phe Gly

<210>3

<211>34

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>AMIDATION

<400>3

Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys

1               5                   10                  15

Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met

            20                  25                  30

Asp Phe

<210>4

<211>35

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>AMIDATION

<400>4

Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys

1               5                   10                  15

Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met

            20                  25                  30

Asp Phe Gly

        35

<210>5

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400>5

Glu Gly Pro Trp Leu Glu

1               5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(9)..(9)

<223>AMIDATION

<400>6

Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe

1               5

<210>7

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400>7

Glu Leu Gly Pro Gln Gly

1               5

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly

1               5

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Lys-Lys-linked G17-Gly

<400>9

Lys Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp

1               5                   10                  15

Met Asp Phe Gly

            20

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Spacer copupled to G17 C terminus

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)..(12)

<223>AMIDATION

<400>10

Cys Ser ser Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe

1               5                   10

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>11

Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu

1               5

<210>12

<211>12

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>G34 N terminal peptide coupled to spacer

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400>12

Glu Leu Gly Pro Gln Gly Arg Pro Pro Pro Pro Cys

1               5                   10

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)..(8)

<223>AMIDATION

<400>13

Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe

1               5

<210>14

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Spacer coupled to C terminal peptide of G17-Gly

<400>14

Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly

1               5                   10

<210>15

<211>24

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Spacer coupled to G34-Gly peptide

<400>15

Cys Gly Gly Ser Lys Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu

1               5                   10                  15

Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly

            20

<210>16

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>G17 N terminal peptide plus spacer

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400>16

Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Pro Pro Cys

1               5                   10

Claims (21)

1.一种单克隆抗体，其与胃泌素激素形式选择性结合于：

(i)胃泌素-17(G17)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO：5)中的表位；

(ii)胃泌素-17(G17)的C-末端和胃泌素-34(G34)的氨基酸序列KKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位；

(iii)人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ IDNO：7)中的表位；或

(iv)甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO：8)中的表位。

2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体具有由选自以下一组的杂交瘤所产生的单克隆抗体的结合特性：杂交瘤400-1(ATCC保藏号PTA-5889)、杂交瘤400-2(ATCC保藏号PTA-5890)、杂交瘤400-3(ATCC保藏号PTA-5891)和杂交瘤400-4(ATCC保藏号PTA-5892)。

3.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体具有由杂交瘤458-1(ATCC保藏号PTA-5896)产生的单克隆抗体的结合特性。

4.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体具有由杂交瘤401-2(ATCC保藏号PTA-5893)产生的单克隆抗体的结合特性。

5.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体具有由杂交瘤445-1(ATCC保藏号PTA-5894)或445-2(ATCC保藏号PTA-5895)产生的单克隆抗体的结合特性。

6.权利要求1-5中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人源化的。

7.包括两种或多种以下抗体的单克隆抗体组：

(i)一种选择性与胃泌素-17(G17)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO：5)中的表位结合的抗体；

(ii)一种选择性与胃泌素-17(G17)的C-末端或胃泌素-34(G34)的氨基酸序列KKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH₂(SEQ ID NO：6)中的表位结合的抗体；

(iii)一种选择性与人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO：7)中的表位结合的抗体；和/或

(iv)一种选择性与甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO：8)中的表位结合的抗体。

8.一种产生权利要求2的抗体的杂交瘤，其具有杂交瘤400-1(ATCC保藏号PTA-5889)；杂交瘤400-2(ATCC保藏号PTA-5890)；杂交瘤400-3(ATCC保藏号PTA-5891)或杂交瘤400-4(ATCC保藏号PTA-5892)的特性。

9.一种产生权利要求3的抗体的杂交瘤，其具有杂交瘤401-2(ATCC保藏号PTA-5893)的特性。

10.一种产生权利要求4的抗体的杂交瘤，其具有杂交瘤445-1(ATCC保藏号PTA-5894)或杂交瘤445-2(ATCC保藏号PTA-5895)的特性。

11.一种产生权利要求2的抗体的杂交瘤，其具有杂交瘤458-1(ATCC保藏号PTA-5896)的特性。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的单克隆抗体和药用可接受载体。

13.权利要求1-6中任一项的单克隆抗体在制备用于预防或治疗胃泌素介导的疾病或状况的药物中的应用。

14.一种诊断患者的胃泌素介导的疾病或状况的方法，所述方法包括测定患者生物学液体样品中的胃泌素激素形式的水平，并将该样品中的胃泌素激素形式的水平与一组健康个体的生物学液体样品中的该胃泌素激素形式的正常水平相比较。

15.一种监测患者的胃泌素介导的疾病或状况的过程的方法，所述方法包括在初始时间点测定患有胃泌素介导的疾病或状况或存在患胃泌素介导的疾病或状况的风险的患者的生物学液体样品中的胃泌素激素形式的水平；在不同时间点测定患者的一个或多个生物学液体样品中的该胃泌素激素形式的水平；并由此对胃泌素介导的疾病或状况的过程进行监测。

16.一种进行免疫测定用的试剂盒，所述试剂盒包括一种单克隆抗体和一种合适的容器，所述单克隆抗体具有由选自400-1、400-2、400-3、400-4、401-2、445-1、445-2、458-1的杂交瘤所产生的单克隆抗体的特性。

17.一种对患有胃泌素激素介导的疾病或状况的患者的胃泌素激素阻断治疗进行评估的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在治疗前或治疗早期自患者取得第一个生物学液体样品；

b)通过免疫测定法测定第一个样品中的胃泌素激素水平；

c)基于待治疗疾病或状况和第一个样品中的胃泌素激素水平进行诊断；

d)对患者进行治疗，包括施用与胃泌素激素结合以调整其与体内靶受体的结合的第一药剂或能生成该第一药剂的物质；

e)在治疗起效所需的适当时间之后，自患者取得第二个生物学液体样品；

f)通过免疫测定法测定第二个样品的第一部分中的总胃泌素激素水平，所述总胃泌素激素包括结合胃泌素激素和游离胃泌素激素，其中将第二个样品的第一部分与以下物质孵育：(i)置换任何与第一药剂相结合的胃泌素激素的第二药剂，和(ii)固定化的抗胃泌素激素抗体，其中所述固定化抗体不与第二药剂结合；洗涤除去第二药剂并加入一种可检测的抗体，所述可检测的抗体与胃泌素激素结合且不与所述固定化抗体相竞争，由此形成一种包含与胃泌素激素相结合的固定化抗体的免疫复合物，所述免疫复合物，其中该胃泌素激素与所述可检测的抗体相结合；

g)检测免疫复合物中可检测的抗体的量并由此确定所述第二个样品中总胃泌素激素的量；

h)使用第二个样品的第二部分重复步骤f)和g)以测定游离胃泌素激素水平，其中进行步骤f)中的孵育过程时未加入所述第二药剂；和

j)比较在第一个样品中测得的游离胃泌素激素的量和第二个样品中的游离胃泌素激素和总胃泌素激素的量，以确定对患者进行胃泌素激素阻断治疗的效果。

18.权利要求17的方法，其中所述生物学液体为血清。

19.权利要求17的方法，其中所述第一药剂是针对G17的N-末端的抗体或是G17受体模拟物，而第二药剂为N-末端G17肽。

20.权利要求17的方法，其中所述固定化抗胃泌素激素抗体或所述可检测的抗体为单克隆抗体，或两者均为单克隆抗体。

21.权利要求17的方法，所述方法包括以下一项或多项：

(i)其中所述固定化的抗胃泌素激素抗体与G17的C-末端结合，而所述可检测的抗体与G17的N-末端结合；

(ii)其中所述第一药剂为针对G34的N-末端的抗体，而所述第二药剂为N-末端G34肽；

(iii)其中所述固定化的抗体与G17或G34的C-末端结合；

(iv)其中所述可检测的抗体与G34的N-末端结合；

(v)其中所述第一药剂是针对G17-Gly的N-末端的抗体或是G17-Gly受体模拟物，而所述第二药剂为N-末端G17肽；

(vi)其中所述可检测的抗体与G17-Gly的N-末端结合；

(vii)其中所述第一药剂为针对G34-Gly的C-末端的抗体，而所述第二药剂为N-末端G34肽；

(viii)其中所述可检测的抗体与G34-Gly的N-末端结合。