CN111150842B - 一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒，包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP5多肽、SYNZIP6多肽、核酸分子CpG、免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP5多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP6多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供了一种快速的高效的激活免疫系统产生免疫应答的方法，提高机体对胃泌素多肽刺激的免疫应答，可以产生高滴度的抗胃泌素抗体，具有潜在肿瘤治疗的作用。

Description

一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及疫苗制剂领域，特别是涉及一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和应用。
背景技术
2019年2月，国家癌症中心发布的最新全国癌症统计数据显示：恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿，统计显示(由于全国肿瘤登记中心的数据一般滞后3年，数据为全国肿瘤登记中心收集汇总全国肿瘤登记处2015年登记资料。)，2015年全国新发恶性肿瘤病例数约为392.9万例，恶性肿瘤发病率为285.83/10万。2015年全国恶性肿瘤死亡例数约为233.8万例，其中男性约为148.0万例，女性约为85.8万例。2015年我国新发肺癌病例约为78.7万例，发病率为57.26/10万。其他高发恶性肿瘤依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌等，前10位恶性肿瘤发病约占全部恶性肿瘤发病的76.70％。其中男性发病首位为肺癌，每年新发病例约52.0万，其他高发恶性肿瘤依次为胃癌、肝癌、结直肠癌和食管癌等，前10位恶性肿瘤发病约占男性全部恶性肿瘤发病的82.20％；女性发病首位为乳腺癌，每年发病约为30.4万，其他主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、甲状腺癌和胃癌等，恶性肿瘤已经成为威胁我国居民健康的头号杀手，而目前临床上肿瘤治疗的方法有限，并且疗效不佳。
癌症治疗性疫苗是利用肿瘤细胞相关抗原来激活人体针对癌症的免疫系统。治疗性疫苗不同于传统放化疗和靶向治疗，副作用小，具有个体化和安全性好的特点，可用于手术后预防复发、或根治性治疗，有可能会更早更快让癌症患者受益，可以达到预防和治疗的双重作用，癌症疫苗是肿瘤治疗的新方向和热点。目前肿瘤治疗性疫苗也存在一些缺点：1.目前可用的肿瘤特异性抗原有限，肿瘤细胞的异质性造成了难以筛选有效的特异性靶点，如何筛选肿瘤特异性抗原是肿瘤治疗性疫苗的关键，2.肿瘤病人的机体的免疫耐受营造的免疫抑制微环境大大的限制了免疫治疗的效果，3.抗原的免疫原性低，产生免疫应答弱，产生的抗体滴度低，并且所需周期长。
胃泌素(Gastrin)为一类胃肠道激素，胃泌素包括酰胺化胃泌素34(G34)、甘氨酸延伸型胃泌素34、酰胺化胃泌素17(G17)、甘氨酸延伸型胃泌素17等不同长度的多肽，在人体中含量最多的是G17多肽，其中80％～90％是G17多肽。正常情况下胃泌素通过结合相应受体发挥促进胃酸分泌与胃肠道粘膜生长作用；近来越来越多的研究表明，过量表达的胃泌素可通过自分泌、旁分泌或内分泌方式导致多种肿瘤(包括胃癌、肠癌、胰腺癌、食管癌等)的发生发展，临床研究也发现血清G17的表达水平与胃黏膜和胃黏膜癌变有关，血清胃泌素检测联合胃蛋白酶原(PG)以及幽门螺旋杆菌(Hp)抗体作为早期筛查胃癌和萎缩性胃炎的血清学标志物。抗胃泌素已成为治疗相关胃肠道肿瘤的有效手段，其具体方法包括分泌抑制法、受体拮抗法、抗胃泌素抗体法等，抗胃泌素抗体法包括被动免疫法及主动免疫法。被动免疫法包括抗G17多抗或单抗的应用，该方法需长期注射，费用高，抗体中和作用不具有及时性，且存在异种抗体免疫原性问题；主动免疫法包括利用G17、胃泌素原制备的免疫疫苗疗法，但是目前G17疫苗存在免疫原性低，刺激产生的免疫应答弱、发挥作用慢、机体已免疫耐受等问题，如何克服免疫耐受，发现免疫原性强的肿瘤抗原，激活免疫系统是进一步提升胃泌素相关恶性肿瘤治疗效果的重要方向。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供第一方面提供一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP5多肽、SYNZIP6多肽、核酸分子CpG、免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP5多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP6多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第二方面提供用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP6-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP5分别与免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；
3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP6-CpG-微载体颗粒混合，获得所述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒。
本发明第三方面提供前述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒在制备细胞因子促进剂或胃泌素依赖性肿瘤的治疗药物中的用途。
如上所述，本发明的一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
本发明中制备的纳米级别的主动免疫微球中融合了多种免疫刺激分子和免疫细胞靶向分子，可以克服肿瘤微环境造成免疫抑制环境，打破免疫耐受，快速高效的激活肿瘤特异性B细胞和T细胞的免疫应答。本发明中还融合了诱导抗原提呈细胞DC细胞成熟的CD40L分子，有利于促进免疫细胞的成熟，提高治疗的效果。CpG分子可以提高整个机体的免疫应答，FcOP分子通过与免疫细胞表明的分子FcR CD32/16/64分子的特异性结合，介导免疫微球的高效内吞，同时本发明中的制备的免疫微球是纳米级别的，可以通过皮下注射的方式给药，并且可以通过毛细血管的吸收被动靶向到肿瘤组织内部，迅速的靶向肿瘤细胞和免疫细胞完成细胞的内吞。总之，本发明提供了一种快速的高效的激活免疫系统产生免疫应答的方法，提高机体对胃泌素多肽刺激的免疫应答，可以产生高滴度的抗胃泌素抗体，具有潜在肿瘤治疗的作用。
附图说明
图1：用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒模式图。
图2：SYNZIP5/SYNZIP6螺旋拉链结构示意图。
图3：纯化后的SYNZIP5-FcOP蛋白电泳图。
图4：CD40L-SYNZIP5纯化后的蛋白电泳图。
图5：免疫纳米微球刺激人的PBMC产生细胞因子的分泌情况。
图6：PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17免疫小鼠后小鼠血清中抗G17抗体滴度的变化。
图7：PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17免疫微球治疗小鼠肿瘤体积的变化。
图8：第6周时不同浓度的PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17免疫小鼠后产生的特异性抗G17抗体的效价。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
如图1所示，本发明一实施例的用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒，包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP5多肽、SYNZIP6多肽、核酸分子CpG、免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP5多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP6多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，所述SYNZIP5多肽和SYNZIP6多肽组成二聚体。
SYNZIP螺旋拉链结构(synthetic coiled-coiled peptides)为一段多肽氨基酸序列，SYNZIP分子之间具有天然的亲和力，通过coil-coil螺旋形成二聚体结构，利用这两个多肽作为接头融合不同的蛋白片段或者是核酸分子，可以实现多种不同类型的分子天然配对组合。如图2所示，本发明中采用了SYNZIP5/SYNZIP6组合为各个融合蛋白分子的接头，通过SYNZIP5/SYNZIP6与多种蛋白融合表达或者是偶联可以完成多种蛋白的自组装，如图示可以通过顺式/反式的方式，形成卡扣的结构简单高效的完成多种不同类型的免疫调控剂药物的组装。
所述SYNZIP5多肽的氨基酸序列具体为：
NTVKELKNYIQELEERNAELKNLKEHLKFAKAELEFELAAHKFE。(SEQ ID NO：1)
所述SYNZIP5多肽的核苷酸序列具体为：
AACACCGTTAAAGAACTGAAAAACTACATCCAGGAGCTGGAAGAGCGTAACGCTGAACTCAAAAACCTGAAGGAACACCTGAAATTCGCAAAAGCGGAACTGGAATTCGAACTGGCGGCTCACAAATTCGAGTGATAA。(SEQID NO：8)
所述SYNZIP6多肽的氨基酸序列具体为：
QKVAQLKNRVAYKLKENAKLENIVARLENDNANLEKDIANLEKDIANLERDVAR。(SEQ ID NO：2)。
所述SYNZIP6多肽的核苷酸序列具体为：
CAAAAAGTTGCGCAGCTGAAAAACCGTGTTGCGTACAAACTGAAAGAAAACGCGAAGCTGGAGAACATCGTGGCGCGTCTGGAAAACGACAATGCGAACCTGGAGAAAGACATTGCGAATCTCGAAAAGGACATCGCAAATCTGGAACGTGACGTTGCGCGTTGATAA。
(SEQ ID NO：9)
在一种实施方式中，所述二聚体连接于所述微载体表面。
进一步的，所述免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原通过所述二聚体分别偶联到所述微载体上。
具体的，所述免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原分别与所述二聚体中的SYNZIP5多肽相连，所述微载体与所述二聚体中的SYNZIP6多肽相连。
所述免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原分别与SYNZIP1多肽的连接，可以为直接连接，或者可通过接头序列连接。
接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
所述核酸分子CpG负载于所述载体内部。
核酸分子CpG可以为CpG ODN BW006和/或CpG-SH ODN 2395。
CpG ODN BW006的序列为TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC，(SEQ ID NO：4)
CpG-SH ODN 2395的序列为TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG。(SEQ ID NO：5)
在一种实施方式中，所述免疫细胞活化剂选自CD40L细胞因子。
CD40属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，广泛表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞等免疫细胞及内皮细胞、血小板等非免疫细胞表面。其配体CD40L与CD40是一对互补的蛋白质分子，属于TNF超家族成员。CD40L与CD40相似，也广泛表达于许多免疫类细胞，提供T、B细胞活化所必需的协同刺激信号。CD40L与CD40分子结合后，能使膜CD40分子交联和配基化，继而使CD40分子多聚化，构成CD40信号传导的结构基础和始动因素。CD40/CD40L分子在特异性免疫应答中居于重要的上游位置，主要功能包括：促进B细胞的分化、发育、增殖、成熟，参与免疫球蛋白的分泌及类型转换：CD4+T细胞表面的CD40L与B细胞表面的CD40分子结合后，为B细胞活化提供第二信号，在B细胞应答、生发中心生成、抗体类别转换、成熟以及记忆B细胞生成等过程中起重要作用。促进T细胞的激发和定向分化：在细胞免疫反应中，以抗原提呈细胞(APC)表面的主要组织相容复合物(MHC)与T细胞受体(TCR)结合为第一信号；刺激T细胞表达CD40L，后者与APC表面的CD40结合，激活T细胞的第二信号，放大免疫应答并促进CD4+T细胞活化，同时促进白细胞介素(IL)-12分泌，而IL-12的分泌增强可以加快APC的成熟，使其抗原呈递能力大大加强，在抗原信号及其他共刺激分子(如B7-1/B7-2)的协同作用下，T细胞被激活、扩增并成熟，成熟活化的T细胞进一步表达CD40L，反过来作用于APC，形成良性循环。CD40L还参与DC的分化及功能调节：CD40的配基化促进DC的成熟，上调DC表面共刺激分子和MHC类分子的表达，提高DC的抗原提呈能力，从而发挥激发辅助性T细胞(Th细胞)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能，而CD40L激发的DC可以不依赖Th细胞的辅助直接激活CTL，并且可以延长DC的生存期，提高拮抗肿瘤微环境中IL-10的能力。因此在本发明中选用CD40L分子作为免疫微球的一个元件，提高免疫细胞的活性。
所述CD40L的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：
ATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCTGCGGCCACTGGACTGCCCATCAGCATGAAAATTTTTATGTATTTACTTACTGTTTTTCTTATCACCCAGATGATTGGGTCAGCACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTTCATGAAGATTTTGTATTCATGAAAACGATACAGAGATGCAACACAGGAGAAAGATCCTTATCCTTACTGAACTGTGAGGAGATTAAAAGCCAGTTTGAAGGCTTTGTGAAGGATATAATGTTAAACAAAGAGGAGACGAAGAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGGTGATCAGAATCCTCAAATTGCGGCACATGTCATAAGTGAGGCCAGCAGTAAAACAACATCTGTGTTACAGTGGGCTGAAAAAGGATACTACACCATGAGCAACAACTTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGTTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAGTCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTTCGAGTCAAGCTCCATTTATAGCCAGCCTCTGCCTAAAGTCCCCCGGTAGATTCGAGAGAATCTTACTCAGAGCTGCAAATACCCACAGTTCCGCCAAACCTTGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGGAGTATTTGAATTGCAACCAGGTGCTTCGGTGTTTGTCAATGTGACTGATCCAAGCCAAGTGAGCCATGGCACTGGCTTCACGTCCTTTGGCTTACTCAAACTC。
所述CD40L的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，具体为：
IFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLK。(SEQ ID NO：15)
在一种实施方式中，所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。为抗体的恒定区，抗体发挥作用主要是通过Fc区与免疫细胞表面的CD16/32/64结合来募集免疫细胞，激发免疫反应来发挥作用，本发明中通过对Fc区氨基酸位点结合进行预测和定点突变获得了优化的Fc片段FCOP序列，获得的FcOP与CD16/32/64比正常的Fc片段具有更强的亲和力，CD16/32/64为多种免疫细胞表面的分子标记，FcOP可以募集更多的免疫细胞。
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。(SEQID NO：3)
所述抗体Fc段的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示：
CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACGCCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGCCGCAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA。(SEQ ID NO：14)
在一种实施方式中，所述抗原选自胃泌素G17多肽。所述抗原的氨基酸序列为SEQID NO：6。具体为：PEGPWLEEEEEAY。
在一种实施方式中，所述微载体选自聚乳酸(PLA)。
所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。
本发明一实施例的用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP6-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP5分别与免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；
3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP6-CpG-微载体颗粒混合，获得所述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒。
可选的，所述SYNZIP6-CpG-微载体颗粒的制备方法包括如下步骤：
1)将SYNZIP6与活化剂混合进行活化；将活化后的SYNZIP6与交联剂混合，进行交联活化反应，得到混合物I；
2)将核酸分子CpG与活化剂混合进行活化；将活化后的核酸分子CpG与交联剂混合，得到混合物II；
3)将微载体溶于有机溶剂，获得混合物III，将混合物I、混合物II混合，形成有机相，以混合物III作为水相，将有机相加入到水相中，去除有机溶剂，得到SYNZIP6-CpG-微载体颗粒。
在一种实施方式中，所述免疫细胞活化剂选自CD40L细胞因子。
在一种实施方式中，所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
在一种实施方式中，所述抗原选自胃泌素G17多肽。所述抗原的氨基酸序列为SEQID NO：6。
所述核酸分子CpG的选自如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的任一种或多种。
所述免疫细胞活化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
胃泌素原正常情况下通过结合相应受体发挥促进胃酸分泌与胃肠道粘膜生长作用，过量表达的胃泌素可通过自分泌、旁分泌或内分泌方式导致多种肿瘤(包括胃癌、肠癌、胰腺癌、食管癌等)的发生发展，近年研究发现胃肠道等多种肿瘤中可检测到gly-G17、amidated-G17的分泌异常升高，其可通过自分泌、旁分泌或内分泌作用方式发挥“生长因子”样作用促进肿瘤发生发展，胃泌素升高常见于胃泌素瘤、恶性贫血、胃癌等，而胃泌素降低常见于胃窦萎缩性胃炎、多灶胃萎缩、胃切除后等。本发明中利用胃泌素为特异性的免疫原，刺激机体高效产生抗胃泌素的G17抗体，利用抗G17抗体来治疗消化系统癌症。
步骤3)中，所述SYNZIP6-CpG-微载体颗粒、连接物I、连接物II和连接物III的摩尔比为3:1:1:1。
在一种实施方式中，所述微载体选自PLA。
所述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。
在一种实施方式中，所述活化剂选自三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
在一种实施方式中，所述交联剂选自4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)。
在一种实施方式中，所述有机溶剂选自二氯甲烷。
前述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒可用于制备细胞因子促进剂或胃泌素依赖性肿瘤的治疗药物。
所述肿瘤可选自胃癌、肠癌、胰腺癌或食管癌。
实施例1用于中和胃泌素的主动免疫调节微粒组件的构建过程
1.SYNZIP-5-FcOP蛋白
1.1SYNZIP-5-FcOP基因克隆
SYNZIP-5-FcOP在两端设计酶切位点EcoRI和NotI，采用全基因通合成的方式委托苏州金维智生物科技有限公司合成，获得PUC19-SYNZIP-5-FcOP克隆质粒。
将获得的PUC19-SYNZIP-5-FcOP克隆质粒与PTT5质粒分别采用EcoRI和NotI双酶切，电泳回收SYNZIP-5-FcOP和PTT5酶切后片段，将回收纯化后的FCOP-SYNZIP5和PTT5片段使用T4连接酶16℃连接2h，获得的PTT5-SYNZIP-5-FcOP连接产物转化TOP10感受态细菌，挑取阳性菌落，采用菌落PCR和双酶切方法鉴定，筛选出阳性克隆PTT5-SYNZIP-5-FcOP阳性菌，测序确认克隆序列的正确，扩增阳性菌落，使用质粒无内毒素大抽试剂盒提取PTT5-SYNZIP-5-FcOP质粒备用。
SYNZIP-5-FcOP核酸序列(EcoRI+KOZAK+信号肽+SYNZIP5+linker+FcOP+NotI)
GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTAACACCGTTAAAGAACTGAAAAACTACATCCAGGAGCTGGAAGAGCGTAACGCTGAACTCAAAAACCTGAAG GAACACCTGAAATTCGCAAAAGCGGAACTGGAATTCGAACTGGCGGCTCACAAATTCGAGGAGATCAAAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACGCCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGCCGCAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGAGCGGCCGC SEQ ID NO：10。
1.2PTT5-SYNZIP-5-FcOP的转染和表达
按照LipofectamineTM 2000操作说明书转染293细胞，以6孔板中的1孔为例，简要步骤如下：向该孔接种4×105细胞，37℃、5％CO2培养18h后换液，12h后开始转染,贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95％。将4μg质粒DNA和10μl LipofectamineTM 2000分别用无抗生素、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置15min形成脂质体复合物。连续培养3天后离心后收集上清，采用间接ELISA方法检测目的蛋白的表达情况。获得的细胞上清液通过ProteinA柱进行纯化，获得SYNZIP-5-FcOP蛋白，纯化后的蛋白在10％SDS-凝胶电泳(图3)，确定其纯度，BCA法检测蛋白浓度120mg/ml。
2.CD40L-SYNZIP5蛋白
2.1CD40L-SYNZIP5基因克隆
在CD40L-SYNZIP5两端设计酶切位点EcoR I和Not I采用全基因通合成的方式委托苏州金维智生物科技有限公司合成，获得PUC19-CD40L-SYNZIP5克隆质粒。
将获得的PUC19-CD40L-SYNZIP5克隆质粒与PTT5质粒分别采用EcoR I和Not I双酶切，电泳回收CD40L-SYNZIP5和PTT5双酶切后片段，将回收纯化后的CD40L-SYNZIP5和PTT5片段使用T4连接酶16℃连接2h，获得的PTT5-CD40L-SYNZIP5连接产物转化TOP10感受态细菌，挑取阳性菌落，采用菌落PCR方法和双酶切进行鉴定，筛选出阳性克隆PTT5-CD40L-SYNZIP5阳性菌，扩增阳性菌落，测序确认克隆序列的正确，使用质粒无内毒素大抽试剂盒提取PTT5-CD40L-SYNZIP5质粒备用。
CD40L-SYNZIP5基因序列
CD40L-对应的氨基酸序列33KD
2.2PTT5-CD40L-SYNZIP5的转染和表达
细胞瞬时转染和纯化：293细胞转染按LipofectamineTM 2000操作说明书进行，以6孔板中的1孔为例，简要步骤如下：向该孔接种4×105细胞，37℃、5％CO2培养18h后换液1次，12h后开始转染,贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95％。将4μg质粒DNA和10μlLipofectamineTM 2000分别用无抗生素、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置15min形成脂质体复合物。连续培养三天后收取上清，采用间接ELISA方法检测目的蛋白的表达情况。获得的细胞上清液使用亲和层析镍柱纯化，获得CD40L-SYNZIP5蛋白，纯化后的蛋白在10％SDS-凝胶电泳(图4)，鉴定蛋白的纯度，BCA检测蛋白浓度，蛋白的表达量为155mg/L。
3.SYNZIP5-G17特异性多肽
利用基因合成技术，多肽序列的氮端(N端)连接上SYNZIP5。命名为SYNZIP5-G17。
SYNZIP5-G17抗原多肽(SYNZIP5-linker-G17)
NTVKELKNYIQELEERNAELKNLKEHLKFAKAELEFELAAHKFE(GGGGS)3 PEGPWLEEEEEAY(SEQID NO：13)
实施例2用于中和胃泌素的主动免疫治疗性纳米微球的制备
1).PLGA纳米微球制备
(一)、20mg SYNZIP6(sulfo-SMCC)交联活化反应：首先是SYNZIP6活化，用10mlPBS溶解SYNZIP6，加入TCEP，打开二硫键；透析去除TCEP，得到活化的SYNZIP6。再加入sulfo-SMCC，交联后透析去除多余的sulfo-SMCC，冷冻干燥后得到20mg SYNZIP6-sulfo-SMCC固体粉末。
(二)、核酸分子CpG BW006和ODN 2395(简称CpG分子)10mg分别进行sulfo-SMCC交联反应：首先是CpG活化，用WFI溶解CpG，加入TCEP，打开二硫键；然后脱盐去除TCEP，得到活化的CpG。再加入sulfo-SMCC，交联后醇沉离心，得到粉末状的CpG-sulfo-SMCC。CpG ODNBW006的序列为(TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC)，(SEQ ID NO：4)。CpG-SH ODN 2395的序列为(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG)(SEQ ID NO：5)。
(三)、将15mg聚乳酸(PLA)溶于15mL二氯甲烷中得溶液1，加入20mg SYNZIP6-sulfo-SMCC和10mg CpG-sulfo-SMCC，完成SYNZIP6-CpG与PLGA的偶联，得到聚乳酸-CpG溶液，将聚乳酸-CpG溶液与浓度为1.5wt％的聚乙烯醇水溶液混合(所述聚乳酸溶液中的聚乳酸与聚乙烯醇溶液中聚乙烯醇的体积比为1：10)，在冰浴条件下进行3000r/min高速剪切5min得到乳浊液，接着将乳浊液与超纯水混合，混合后的溶液进行磁力1500r/min搅拌8h，将磁力搅拌后的乳浊液3000r/min离心10min，然后用超纯水进行洗涤，沉淀后，得到聚乳酸微球，保存备用。采用激光粒度仪检测纳米粒粒径为200.3±1.5(nm)，冻干后粒径223.2±1.9(nm)，将获得的纳米颗粒溶解在PBS中。
2).主动免疫治疗性纳米微球的制备
将制备的SYNZIP6-CpG-PLA纳米微球与SYNZIP5-FcOP，CD40L-SYNZIP5和SYNZIP5-G17多肽按照摩尔比(3:1:1:1)进行混合后溶解于PBS磷酸缓冲液。通过SYNZIP5/SYNZIP6组合，最终获得包含多个免疫刺激和激活功能的主动免疫治疗性纳米微球PLA-CpG-FcOP-G17，组合完成的主动免疫治疗性纳米微球冷冻干燥，获得主动免疫治疗性纳米微球PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17，在显微镜下观察颗粒的均匀度，可以观察到微球颗粒均匀分布，没有聚团现象。
实施例3主动免疫治疗性纳米微球的免疫激活活性鉴定试验
1)免疫纳米微球刺激人的PBMC产生细胞因子的检测
抽取健康人的外周血，采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque分离人外周血中的单核细胞PBMC，使用终浓度为5μg/ml的CD3抗体和CD28抗体预先包被的T175培养瓶培养PBMC，维持PBMC细胞浓度在0.5～1×106细胞/ml。将主动免疫治疗性纳米微球PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17使用PBS缓冲液溶解，终浓度为1mg/ml。将实验组分为三组：PBMC+PLGA微球组，PBMC+50ug/ml PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17组，PBMC+100ug/ml PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17组，PBMC+500ug/ml PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17组，将对应的免疫微球加入到PBMC培养液中，培养48小时后收集细胞上清使用ELISA检测试剂盒检测IFN-alpha，IFN-gamma和IL-6细胞因子的分泌表达情况。
试验结果如图5所示，表明不同浓度的PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17可以刺激PBMC产生高浓度的细胞因子，并且随着不同浓度的微球刺激产生的细胞因子具有浓度梯度变化效应。
2)免疫微球免疫小鼠刺激机体产生高效价的特异性抗G17抗体和抗肿瘤活性的检测
人胃癌细胞BGC823是一类胃泌素依赖性生长的肿瘤，本发明中采用BCG823在Balb/c小鼠皮下种植肿瘤模型来检测PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17免疫微球的治疗效果，
制备肿瘤的过程如下：常规培养BGC823(37℃、5％CO2)于DMEM培养基(10％FBS)，待细胞长至对数生长期，胰酶消化收集，PBS清洗两次(1400rpm×5min)并调节细胞浓度至1×108cells/mL，置冰浴中备用。取适应饲养环境约一周的Balb/c小鼠(雌性、6～8周、17～20g)，无菌皮下接种上述肿瘤细胞悬液(5.0×107cells/只)，待皮下肿瘤长至100mm3左右时，将成瘤的小鼠进行分组。
分别使用50ug和150ug的PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17皮下注射方式治疗Balb/c小鼠，每2周免疫一次，每周通过眼眶采血留样检测抗体的含量，并且使用游标卡尺测量肿瘤的大小，6周后停止免疫，在第8周终止试验，收集小鼠的外周血中的血清，采用间接ELISA的方法检测血清中抗G17抗体的效价。
G17抗体含量检测方法：
采用G17抗原包被ELISA板，加入采集的血清4℃过夜孵育，次日PBST洗板5-10次后，加入HRP标记的羊抗鼠的IgG二抗37℃孵育30min，最后加入TMB显色，终止显色后450nm检测吸光度。根据OD450读数确定蛋白的含量。
G17抗体效价检测方法：
采用G17抗原包被ELISA板，加入系列稀释的采集的血清(1-260000倍稀释)4℃过夜孵育，次日PBST洗板5-10次后，加入HRP标记的羊抗鼠的IgG二抗37℃孵育30min，最后加入TMB显色，终止显色后450nm检测吸光度，根据稀释倍数的OD450的数值确定抗体的滴度。
试验结果如图6至图8所示，表明50ug和150ug的PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17免疫Balb/c小鼠6周后抗体的效价为1：32000和1：256000。同时通过联系的检测可知50ug和150ug PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17免疫小鼠后分别在第6周和第4周达到抗G17抗体的峰值，并且50ug和150ug PLA-CpG-FcOP-CD40L-G17都可以有效抑制荷瘤小鼠中人胃癌细胞BGC823肿瘤的生长。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 优锐生物医药科技（深圳）有限公司
上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒及其制备方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Thr Val Lys Glu Leu Lys Asn Tyr Ile Gln Glu Leu Glu Glu Arg
1 5 10 15
Asn Ala Glu Leu Lys Asn Leu Lys Glu His Leu Lys Phe Ala Lys Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Phe Glu Leu Ala Ala His Lys Phe Glu
35 40
<210> 2
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Lys Val Ala Gln Leu Lys Asn Arg Val Ala Tyr Lys Leu Lys Glu
1 5 10 15
Asn Ala Lys Leu Glu Asn Ile Val Ala Arg Leu Glu Asn Asp Asn Ala
20 25 30
Asn Leu Glu Lys Asp Ile Ala Asn Leu Glu Lys Asp Ile Ala Asn Leu
35 40 45
Glu Arg Asp Val Ala Arg
50
<210> 3
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Pro Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgaaacat acaaccaaac ttctccccga tctgcggcca ctggactgcc catcagcatg 60
aaaattttta tgtatttact tactgttttt cttatcaccc agatgattgg gtcagcactt 120
tttgctgtgt atcttcatag aaggttggac aagatagaag atgaaaggaa tcttcatgaa 180
gattttgtat tcatgaaaac gatacagaga tgcaacacag gagaaagatc cttatcctta 240
ctgaactgtg aggagattaa aagccagttt gaaggctttg tgaaggatat aatgttaaac 300
aaagaggaga cgaagaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa aaggtgatca gaatcctcaa 360
attgcggcac atgtcataag tgaggccagc agtaaaacaa catctgtgtt acagtgggct 420
gaaaaaggat actacaccat gagcaacaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480
accgttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgcccaag tcaccttctg ttccaatcgg 540
gaagcttcga gtcaagctcc atttatagcc agcctctgcc taaagtcccc cggtagattc 600
gagagaatct tactcagagc tgcaaatacc cacagttccg ccaaaccttg cgggcaacaa 660
tccattcact tgggaggagt atttgaattg caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720
actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780
<210> 8
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacaccgtta aagaactgaa aaactacatc caggagctgg aagagcgtaa cgctgaactc 60
aaaaacctga aggaacacct gaaattcgca aaagcggaac tggaattcga actggcggct 120
cacaaattcg agtgataa 138
<210> 9
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaaaagttg cgcagctgaa aaaccgtgtt gcgtacaaac tgaaagaaaa cgcgaagctg 60
gagaacatcg tggcgcgtct ggaaaacgac aatgcgaacc tggagaaaga cattgcgaat 120
ctcgaaaagg acatcgcaaa tctggaacgt gacgttgcgc gttgataa 168
<210> 10
<211> 917
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60
ggtgtgcagt gtaacaccgt taaagaactg aaaaactaca tccaggagct ggaagagcgt 120
aacgctgaac tcaaaaacct gaaggaacac ctgaaattcg caaaagcgga actggaattc 180
gaactggcgg ctcacaaatt cgaggagatc aaaggaggag gaggatcagg aggaggagga 240
tcaggaggag gaggatcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 300
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 360
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 420
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacgcca cgtaccgggt ggtcagcgtc 480
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 540
aaagccctcc cagcccccat cgccgcaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 600
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 660
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 720
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 780
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 840
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 900
ggtaaatgag cggccgc 917
<210> 11
<211> 1061
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60
ggtgtgcagt gtatcgaaac atacaaccaa acttctcccc gatctgcggc cactggactg 120
cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt 180
gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat agaaggttgg acaagataga agatgaaagg 240
aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga 300
tccttatcct tactgaactg tgaggagatt aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat 360
ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat 420
cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg 480
ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat 540
gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga ctctattata tctatgccca agtcaccttc 600
tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc 660
cccggtagat tcgagagaat cttactcaga gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct 720
tgcgggcaac aatccattca cttgggagga gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg 780
tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg agccatggca ctggcttcac gtcctttggc 840
ttactcaaac tcggaggagg aggatcagga ggaggaggat caggaggagg aggatcaaac 900
accgttaaag aactgaaaaa ctacatccag gagctggaag agcgtaacgc tgaactcaaa 960
aacctgaagg aacacctgaa attcgcaaaa gcggaactgg aattcgaact ggcggctcac 1020
aaattcgagc atcatcatca tcatcatcat taagcggccg c 1061
<210> 12
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val
35 40 45
Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu
50 55 60
His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp
65 70 75 80
Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser
85 90 95
Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe
100 105 110
Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser
115 120 125
Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
130 135 140
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
145 150 155 160
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
165 170 175
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
180 185 190
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
195 200 205
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
210 215 220
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
225 230 235 240
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
245 250 255
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
260 265 270
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Thr Val Lys Glu Leu Lys Asn Tyr Ile
290 295 300
Gln Glu Leu Glu Glu Arg Asn Ala Glu Leu Lys Asn Leu Lys Glu His
305 310 315 320
Leu Lys Phe Ala Lys Ala Glu Leu Glu Phe Glu Leu Ala Ala His Lys
325 330 335
Phe Glu His His His His His His
340
<210> 13
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asn Thr Val Lys Glu Leu Lys Asn Tyr Ile Gln Glu Leu Glu Glu Arg
1 5 10 15
Asn Ala Glu Leu Lys Asn Leu Lys Glu His Leu Lys Phe Ala Lys Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Phe Glu Leu Ala Ala His Lys Phe Glu Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Glu Gly Pro Trp
50 55 60
Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr
65 70
<210> 14
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 60
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 120
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 180
cgggaggagc agtacaacgc cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 240
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 300
atcgccgcaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 360
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 420
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 480
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 540
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 600
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 651
<210> 15
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln
35 40 45
Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys
65 70 75 80
Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln
85 90 95
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr
100 105 110
Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn
115 120 125
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
130 135 140
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
145 150 155 160
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro
165 170 175
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
180 185 190
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
195 200 205
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
210 215 220
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
225 230 235

Claims (4)

1.一种用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP5多肽、SYNZIP6多肽、核酸分子CpG、免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP5多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP6多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
其中，所述SYNZIP5多肽和SYNZIP6多肽组成二聚体，所述免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原通过所述二聚体分别偶联到所述微载体上，所述免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原分别与所述二聚体中的SYNZIP5多肽相连，所述微载体与所述二聚体中的SYNZIP6多肽相连；
所述免疫细胞活化剂选自CD40L细胞因子，所述免疫细胞活化剂的核苷酸序列如SEQID NO：7所示；
所述抗原选自胃泌素G17多肽，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述二聚体连接于所述微载体表面；
所述核酸分子CpG负载于所述载体内部；
所述微载体选自聚乳酸；
所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm；
所述核酸分子CpG选自如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的任一种或多种。
2.一种制备权利要求1所述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒的方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP6-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP5分别与免疫细胞活化剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；
3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP6-CpG-微载体颗粒混合，获得所述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒；
其中，所述SYNZIP6-CpG-微载体颗粒的制备方法包括如下步骤：
将SYNZIP6与活化剂混合进行活化；将活化后的SYNZIP6与交联剂混合，进行交联活化反应，得到混合物I；
将核酸分子CpG与活化剂混合进行活化；将活化后的核酸分子CpG与交联剂混合，得到混合物II；
将微载体溶于有机溶剂，获得混合物III，将混合物I、混合物II混合，形成有机相，以混合物III作为水相，将有机相加入到水相中，去除有机溶剂，得到SYNZIP6-CpG-微载体颗粒；
所述免疫细胞活化剂选自CD40L细胞因子；
所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述抗原选自胃泌素G17多肽；
步骤3)中，所述SYNZIP6-CpG-微载体颗粒、连接物I、连接物II和连接物III的摩尔比为3:1:1:1；
所述微载体选自PLA；
所述用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm；
所述核酸分子CpG选自如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的任一种或多种。
3.如权利要求2所述的制备用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒的方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述活化剂选自TCEP；
b.所述交联剂选自sulfo-SMCC；
c.所述有机溶剂选自二氯甲烷。
4.如权利要求1所述的用于中和胃泌素的主动免疫调控微粒在制备细胞因子促进剂或胃癌的治疗药物中的用途。
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