CN116359509A - 一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用 - Google Patents
一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用，本发明利用单细胞测序技术对胃癌组织进行全外显子(基因组)测序和单细胞多组学(转录组)相结合的大分析，利用生物信息学算法工具对胃癌组织和胃癌的癌旁组织的全外显子和单细胞多组学测序数据进行分析，获得了一组对胃癌治疗有潜力新抗原候选序列，并利用主动免疫靶向激活技术平台(Active checkpoint targeted activated immunotherapy,ACTI)的纳米佐剂系统作为递送系统对新抗原进行改造，获得全新的主动免疫靶向激活技术的纳米治疗性疫苗ACTI，该疫苗可以高效的将免疫激活剂和肿瘤新抗原靶向递送到专职的抗原提呈细胞pDCs细胞中，精准激活机体的特异性免疫应答，启动体液免疫和细胞免疫进行胃癌治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
肿瘤免疫疗法近年来逐渐应用于胃癌的治疗中，该疗法是应用免疫学的原理和方法，通过激活机体免疫系统提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤治疗性疫苗(Tumor Therapeutic Vaccine)是目前最热门的肿瘤免疫治疗疗法之一，肿瘤治疗性疫苗是一类多肽或者是重组蛋白片段，可以高效特异性的激活免疫系统，能够打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答，从而起到治疗肿瘤的效果，其基本原理是通过靶向肿瘤相关或肿瘤特异性的抗原肽，提升免疫系统对于含此类抗原肽的癌细胞的识别与杀伤能力，肿瘤治疗性疫苗能在有效避免健康细胞损伤的前提下激活免疫系统，具有很好的应用和开发前景。
发现和鉴定特异性的肿瘤抗原是肿瘤治疗性疫苗开发成功的关键，新抗原(neoantigen)是一类癌细胞在发生发展过程中产生的基因突变，这类突变可以激活免疫系统(能被免疫细胞所识别)、由癌细胞基因突变所产生的异常蛋白质(异常/特异性抗原)，新抗原的发现为肿瘤治疗性的疫苗的研发提供了新的方向。肿瘤免疫组学是指利用免疫基因组学、免疫蛋白质组学、免疫生物信息学等反映肿瘤免疫状态的多组学数据对TME进行的综合研究，它依赖于下一代测序技术的快速发展。高通量基因组和转录组数据可用于计算免疫细胞的丰度和预测肿瘤抗原，然而，由于批量测序代表了异质细胞群的平均特征，因此无法区分不同的细胞亚型。
另外治疗性疫苗的开发中选择合适的佐剂至关重要，免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能够增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的制剂，免疫佐剂是一种免疫调节剂，可增强抗原的免疫原性、提高免疫效果。佐剂作用机制是通过改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解和排出，从而延长抗原在体内的滞留时间，促进机体产生针对抗原特异性的体液与细胞免疫应答，涉及到抗原递呈细胞对抗原的摄取、抗原的处理以及抗原的递呈等方面。选择合适的免疫佐剂有效的递送新抗原是肿瘤治疗性疫苗开发成功的关键技术之一。佐剂可以根据其来源(天然、合成或内源性)、作用机制、物理或化学性质来进行分类。美国FDA在其发布的“Regulatory Considerations in the Safety Assessmentof Adjuvants and Adjuvanted Preventive Vaccines”中将佐剂分3类:①增强抗原向抗原呈递细胞和/或淋巴结的传递，从而改善免疫反应，例如铝盐和油包水乳剂，如诺华公司的MF59、葛兰素史克公司的AS03系统以及其他脂质体；②免疫刺激剂或免疫增强剂，主要通过受体介导的信号通路来调节免疫反应的质量，如单磷酸脂质(MPL)、QS21、CpG、细胞因子等；③由①和②组合而成，称为佐剂系统(adjuvant system)，如葛兰素史克公司的AS04和AS01。目前研究较多的佐剂包括寡聚核苷酸CpG、佐剂系统、活病毒载体和乳剂等。尽管各种新型的佐剂被陆续应用于临床，但是它们对免疫系统的作用机理到目前为止仍未完全明确。纳米医学的兴起为肿瘤疫苗的研发带来新的契机，纳米佐剂系统在抗原的靶向递送与可控缓释中发挥重要作用；同时也为免疫活化提供共刺激信号，发挥协同活化作用。通过纳米药物递送系统将抗原与佐剂精准递送至特异性免疫细胞已成为可能。结合纳米医学、结构生物学及免疫学前沿成果开发有效、安全，且易于生产的纳米载体疫苗是未来疫苗研发的最有前景的方向之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，它解决了现有的批量测序代表了异质细胞群的平均特征，无法区分不同的细胞亚型的问题。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，包括：胃癌患者肿瘤组织样本的收集、全外显子组测序(WES)、RNA测序、多肽序列表位的预测、新抗原预测、新抗原免疫原性的体外评估、流式细胞技术检测细胞因子的情况和IFN-γELISPOT测定。
作为优选实例，在新抗原免疫原性的体外评估步骤中，包括将冷冻的人PBMC解冻并在添加有10％ FCS的AIM-V培养基中培养，在培养基中加入25ng mL-1IL-7(PeproTech)在第2天加入20U ml-1IL-2(PeproTech)，每3天更换一半含有细胞因子的培养基，将2×105个PBMC接种在含有单个肽(25μg mL-1)的96孔细胞培养板中并孵育过夜，使用无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作阴性和阳性对照，对于抗原特异性T细胞的体外刺激，刺激1天后，收集细胞用于进一步的免疫分析，检测细胞因子的变化。
作为优选实例，在流式细胞技术检测细胞因子的步骤中，包括根据流式多因子检测技术(CBA)产品说明书(BD Biosciences)在体外刺激研究的培养物上清液中的IFN-γ浓度，无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作空白(阴性)和阳性对照，将样品使用CytoFLEX LX流式细胞仪(Beckman Coulter)检测并分析数据，将合成的突变肽混合在一起刺激PBMC，对PBMC样品中的CD8+和IFN-γ的变化进行检测和分析。
作为优选实例，在IFN-γELISPOT测定步骤中，对于体外预刺激的PBMC，在用载有相应多肽的经辐照的自体PBMC过夜刺激后，使用IFN-γELISPOT试剂盒(达科为)评估T细胞释放的IFN-γ的分泌，包括预刺激PBMC(每孔105个)和装载有相应肽(1-20μg mL-1)的经辐照自体PBMC以一式三份添加到孔中，在AIM-V培养基中孵育18-20小时，洗涤后，加入稀释的检测抗体，37℃孵育1小时，然后将链霉亲和素-HRP(1:100稀释)和3-氨基-9-乙基咔唑溶液混合物依次加入每个孔中，在室温下将培养板在黑暗中保持约20分钟后，加入去离子水以终止反应，在ELISPOT读取器(Cellular Technology Inc)下扫板，并使用ELISPOT软件(AID)分析数据。
本发明的有益效果是：本发明中利用单细胞测序技术和下一代测序技术(Next-generation sequencing technology,NGS)对胃癌组织进行全外显子和肿瘤单细胞免疫组学相结合的测序分析，利用我们自建的生物信息学算法工具对胃癌组织和癌旁组织的全外显子和肿瘤单细胞免疫组学测序数据进行大数据分析和比对，获得了一组对胃癌的治疗有潜力的新抗原的候选序列。
另外，提供一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，作为一种具有主动免疫靶向激活的作用的纳米佐剂，实现了将筛选获得的新抗原疫苗高效的递送到免疫提呈细胞，同时可以高效的激活免疫系统的效果。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括：连接肽的选择、PLGA纳米微球制备、纳米微球负载的蛋白的制备、SYNZIP1-neoantigen特异性多肽的合成、ACTI新型纳米疫苗的制备、ACTI新型纳米疫苗的活性验证。
作为优选实例，所述连接肽为SYNZIP1/SYNZIP2组合，所述SYNZIP1核酸序列如SEQID NO：1所示，所述SYNZIP1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述SYNZIP2核酸序列如SEQID NO：3所示，所述SYNZIP2氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
作为优选实例，在PLGA纳米微球制备步骤中，包括20mg SYNZIP2(sulfo-SMCC)交联活化反应、核酸分子CpG(CpG ODN1018)10mg与sulfo-SMCC交联反应、将CpG核酸分子和SYNZIP2接头偶联于PLGA纳米微球。
作为优选实例，在纳米微球负载的蛋白的制备步骤中，包括负载蛋白的选择SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1表达、SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1基因克隆、IL-21-SYNZIP1和SYNZIP1-Fc的转染和蛋白表达。
作为优选实例，在ACTI新型纳米疫苗的活性验证步骤中，包括U937荧光素报告基因法检测ACTI的激活活性、ACTI与PBMC细胞共培养后细胞因子的变化、ACTI新型纳米疫苗的小鼠胃癌肿瘤模型中的免疫治疗试验。
本发明的有益效果是：本发明中采用单细胞测序和全外显子测序相结合的方法，同时结合新抗原的预测和试验的验证，建立了一套筛选胃癌肿瘤新抗原的筛选方法，进一步的利用主动免疫靶向激活技术的纳米佐剂系统作为递送系统对筛选到的新抗原进行改造，获得了全新的主动免疫靶向激活技术的纳米治疗性疫苗(Active checkpointtargeted activated immunotherapy,ACTI)，ACTI新型纳米微球疫苗可以高效的免疫激活剂和肿瘤新抗原靶向递送到专职的抗原提呈细胞pDCs细胞中，精准的激活机体的特异性免疫应答，进行胃癌的治疗。
附图说明
图1为本发明一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法的新抗原筛选技术流程图；
图2为本发明一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法的筛选出的HLA分型频率和对应的新抗原的基因名称图；
图3为本发明一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法的筛选出的预测新抗原体外刺激PBMC产生细胞因子的情况图；
图4为本发明一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法的流式细胞仪检测细胞因子的表达情况图；
图5为本发明一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法的体外刺激PBMC产生IFN-γELISPOT的效果图；
图6为本发明一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法的SYNZIP1/SYNZIP2螺旋肽结合和亲和力示意图；
图7为本发明一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法的U937报告基因细胞系检测ACTI活性图；
图8为本发明一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法的ACTI刺激PBMC产生细胞因子的情况图；
图9为本发明一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法的ACTI新型纳米疫苗杀伤肿瘤试验结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例一：胃癌新抗原的预测、筛选和验证
1、样本数据的收集
如图1所示，收集确诊了胃腺癌患者的55名患者的癌组织其生存期50.3个月(中位数)，同时从ENA、TCGA、CPTAC下载了1099例胃癌患者的外显子组和RNA测序BAM文件，同时还获得了441个TCGA 胃腺癌(STAD)样本的肿瘤特异性新抗原数据SNAdb(http://biopharm.zju.edu.cn/tsnadb)，然后我们从免疫表位数据库(IEDB)下载了与MHC I类分子结合的胃腺癌新表位列表其中835例具有患者种族、BRCA亚型、免疫亚型、9个肿瘤分期等临床变量信息，纳入本研究。
2、全外显子组测序(WES)
如图1，从患者身上收集血液和肿瘤组织，并提取gDNA用于文库制备，首先处理使用福尔马林固定后石蜡包埋(FFPE)的肿瘤切片和相应的血液，使用超声处理将50-50ng双链DNA片段化至约250bp，然后使用KAPA Hyper Prep Kit(KAPA Biosystems)构建文库。委托CRO公司设计的探针覆盖了20000多个人类的外显子区域编码基因以及具有高致病性融合频率的内含子被用于检测突变。在Illumina NovaSeq 6000平台(Illumina)上，对捕获后的文库进行测序，冰冻切片(FFPE)样品的平均覆盖率为900倍，匹配血液样品的平均覆盖率为300倍。
3、RNA测序。
根据试剂盒说明书，使用miRNeasy FFPE试剂盒(目录号217504，Qiagen)从未染色的FFPE切片中提取RNA.分别使用QubitTM(Thermo Fisher Scientific)和LabChip GXTouch HT核酸分析仪(Perkin Elmer)评估提取RNA的产量和质量。在NEBNex rRNADepletion试剂盒(cat#E6310L，New England Biolabs)去除掉核糖体RNA后，使用M-MLV RTRNase(H-)(Ct#M3683，Promega)和NEB Second Strand mRNA合成试剂盒(at#E6111L，NewEngland Biolabs)库。使用KAPA Hyper Prep Kit(KAPA Biosystems)进行样品库制备，并根据说明书在NovaSeq 6000平台上以2×151bp配对末端读数进行测序。每个注释转录本的相对丰度在分析前报告为百万分之一的转录本和log2转换，测序和数据分析委托及智医学完成。
4、表位预测
选择表达的突变如下：FPKM≥30和RNA变异等位基因频率(VAF)≥0.04。然后使用NetMHCpan2.8和NetMHCpan4.1检查含有突变氨基酸的8-、9-和10-mer表位，以预测IC50和洗脱配体(EL)等级至H-2Db和H-2Kb。MHCflurry(ver.2.0.1)的呈现百分位数是使用中间带有突变氨基酸的21聚体序列预测的。选择NetMHCpan的IC50≤250nM、NetMHCpan的EL等级≤0.5和MHCflurry的呈递百分位数≤0.5的表位。如前所述，使用Syro I(Biotage，Uppsala,Sweden)通过标准固相合成新抗原多肽.
5、新抗原预测
如图1-2所示，使用FASTQ格式的血液样本或肿瘤邻近正常组织的WES数据来执行人类白细胞抗原(HLA)分型。OptiType(v1.3.5)用于预测具有默认设置的I类HLA分型。FASTQ格式的肿瘤组织原始RNA测序(RNA-seq)数据由Kallisto(v0.46.0)处理以获得具有GRCh38 v78坐标的表达值(TPM)。肿瘤特异性体细胞变异调用、RNA-seq表达值和I类HLA基因分型作为输入提供给MuPeXI pipeline(v1.2)来预测新抗原多肽。使用NetMHCpan(v4.0)算法预测了突变多肽与患者主要组织相容性复合体I类(MHC-I)分子的结合亲和力。界定洗脱配体百分位数(EL％level)得分≤2％且RNA表达水平(TPM)>0.1的突变肽被预测为新抗原。百分等级得分<0.5％的新抗原被认为是高亲和力新抗原，具体如下表所示。
6、新抗原免疫原性的体外评估。
将冷冻的人PBMC解冻并在添加有10％ FCS的AIM-V培养基中培养，在培养基中加入25ng mL-1IL-7(PeproTech)在第2天加入20U ml-1IL-2(PeproTech)，每3天更换一半含有细胞因子的培养基，将2×105个PBMC接种在含有单个肽(25μg mL-1)的96孔细胞培养板中并孵育过夜，使用无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作阴性和阳性对照，对于抗原特异性T细胞的体外刺激，刺激1天后，收集细胞用于进一步的免疫分析，检测细胞因子的变化，结果如图3所示。
7、流式细胞计数检测细胞因子的情况
如图4所示，根据流式多因子检测技术(CBA)产品说明书(BD Biosciences)在体外刺激研究的培养物上清液中的IFN-γ浓度，无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作空白(阴性)和阳性对照。将样品使用CytoFLEX LX流式细胞仪(Beckman Coulter)检测并分析数据。将合成的突变肽混合在一起刺激PBMC，对PBMC样品中的CD8+和IFN-γ的变化进行检测和分析。
8、IFN-γELISPOT测定
对于体外预刺激的PBMC，在用载有相应多肽的经辐照的自体PBMC过夜刺激后，使用IFN-γELISPOT试剂盒(达科为)评估T细胞释放的IFN-γ的分泌。步骤如下：预刺激PBMC(每孔105个)和装载有相应肽(1-20μg mL-1)的经辐照自体PBMC以一式三份添加到孔中，在AIM-V培养基中孵育18-20小时。洗涤后，加入稀释的检测抗体，37℃孵育1小时。然后将链霉亲和素-HRP(1:100稀释)和3-氨基-9-乙基咔唑溶液混合物依次加入每个孔中。在室温下将板在黑暗中保持约20分钟后，加入去离子水以终止反应。在ELISPOT读取器(CellularTechnology Inc)下扫板，并使用ELISPOT软件(AID)分析数据。当斑点大于阴性对照的两倍大时，对阳性PBMC反应性进行评分，结果如图5所示。
实施例二：ACTI新型纳米疫苗的制备
1、连接肽的选择
参照J.AM.CHEM.SOC.2010,132,6025–6031，如图6所示，SYNZIP1多肽或SYNZIP2多肽为螺旋拉链结构。SYNZIP多肽分子之间具有天然的亲和力，通过coil-coil螺旋形成二聚体结构，利用这两个多肽作为接头融合不同的蛋白片段或者是核酸分子，可以获得多种不同类型的分子。
如图1和图2所示，本发明中采用了SYNZIP1/SYNZIP2组合为各个分子的接头完成多种蛋白的组合，通过SYNZIP1/SYNZIP2与多种蛋白融合表达或者是偶联可以完成多种蛋白的自组装，可以快速简单的组装获得多种不同类型的免疫调控剂药物。
SYNZIP1核酸序列：
AACCTGGTTGCGCAGCTCGAAAACGAAGTTGCGTCTCTGGAAAATGAGAACGAAACCCTGAAGAAAAAGAACCTGCACAAAAAAGACCTGATCGCGTACCTGGAGAAAGAAATCGCGAATCTGCGTAAGAAAATCGAAGAATGA(SEQ ID NO：1)；
SYNZIP1氨基酸序列：
NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE
(SEQ ID NO：2)；
SYNZIP2核酸序列：
GCGCGTAACGCGTATCTGCGTAAGAAAATCGCACGTCTGAAAAAAGACAACCTGCAGCTGGAACGTGATGAACAGAACCTGGAAAAAATCATCGCGAACCTGCGTGACGAAATCGCGCGTCTCGAAAACGAAGTTGCGTCTCACGAACAGTGA(SEQ ID NO：3)；
SYNZIP2氨基酸序列：
ARNAYLRKKIARLKKDNLQLERDEQNLEKIIANLRDEIARLENEVAS HEQ(SEQ ID NO：4)；
2、PLGA纳米微球制备
(a)20mg SYNZIP2(sulfo-SMCC)交联活化反应：委托金斯瑞合成SYNZIP2多肽序列，SYNZIP2活化，用10ml PBS溶解SYNZIP2，加入TCEP，打开二硫键；透析去除TCEP，得到活化的SYNZIP2。再加入sulfo-SMCC，交联后透析去除多余的sulfo-SMCC，冷冻干燥后得到20mg SYNZIP2-sulfo-SMCC固体粉末。
(b)核酸分子CpG(CpG ODN1018)10mg与sulfo-SMCC交联反应：首先是CpG活化，用超纯水溶解CpG，加入TCEP，打开二硫键；然后脱盐去除TCEP，得到活化的CpG。再加入sulfo-SMCC，交联后醇沉离心，得到固体CpG-sulfo-SMCC。
CpG ODN 1018的序列为(5′-dT-dG-dA-dC-dT-dG-dT-dG-dA-dA-dC-dG-dT-dT-dC-dG-dA-dG-dA-dT-dG-dA-3′)(SEQ ID NO：5)。
(c)将15mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于15mL二氯甲烷中得溶液1，加入20mg SYNZIP2-sulfo-SMCC和10mg CpG-sulfo-SMCC，完成SYNZIP2-CpG与PLGA的偶联，作为油相；取15mL溶液1作为水相；在超声功率220W条件下，将油相逐滴加入水相中形成初乳；将所得初乳在400rpm搅拌下逐滴加入20mL超纯水中，继续搅拌4h使二氯甲烷彻底挥发，将所得溶液，首先1000rpm离心5分钟保留上清，去除大颗粒；然后再12000rpm离心10分钟保留沉淀，所得沉淀用超纯水洗涤三次，冷冻干燥，得到地SYNZIP2-CpG-PLGA纳米微球，保存备用。采用激光粒度仪检测纳米粒粒径为200.3±1.5nm，冻干后粒径223.2±1.9nm。将获得的纳米颗粒溶解在PBS中。即获得了包含了CpG核酸分子和SYNZIP2接头的PLGA纳米微球。
3、纳米微球负载的蛋白的制备
(a)负载蛋白的选择
Fc蛋白是抗体的恒定区，Fc蛋白通过结合FcγR发挥通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)或结合补体C1q来介导的补体依赖的细胞毒性(Complement-dependent cytotoxicity，CDC)等生物学活性，利用Fc/FcγR的结合可以定向靶向DC细胞，从而起到向抗原提呈细胞靶向递送的作用。IL21属于常见的细胞因子受体γ链家族，是一种四α螺旋束I型细胞因子。IL-21主要由活化的CD4+T细胞、NK细胞、TFH细胞、Th17细胞分泌。利用IL21刺激免疫细胞的激活比目前常用的IL-2效果要好。
(b)SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1的表达
SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1分别采用基因合成的方式获得全基因序列。具体的序列如下：
SYNZIP1-Fc核酸序列(EcoRI+KOZAK+信号肽+SYNZIP1+linker+Fc+NotI)：
gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTAACCTGGTTGCGCAGCTCGAAAACGAAGTTGCGTCTCTGGAAAATGAGAACGAAACCCTGAAGAAAAAGAACCTGCACAAAAAAGACCTGATCGCGTACCTGGAGAAAGAAATCGCGAATCTGCGTAAGAAAATCGAAGAAGAGATCAAAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACGCCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGCCGCAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAgcggccgc(SEQ ID NO：6)；
SYNZIP1-linker-Fc氨基酸序列(30KD)：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCNLVAQLENEVASLENENETLKKK NLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(GGGGS)3PELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：7)；
IL-21-SYNZIP1(EcoRI+KOZAK+信号肽+IL-21+linker+SYNZIP1+Not I)：
gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGAGATCAAAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAAACCTGGTTGCGCAGCTCGAAAACGAAGTTGCGTCTCTGGAAAATGAGAACGAAACCCTGAAGAAAAAGAACCTGCACAAAAAAGACCTGATCGCGTACCTGGAGAAAGAAATCGCGAATCTGCGTAAGAAAATCGAAGAACATCATCATCATCATCATCATTGAgcggccgc(SEQ ID NO：8)；
IL-21-linker-SYNZIP1对应的氨基酸序列28KD：
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(GGGGS)3NLVAQLENEV ASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEEHHHHHH(SEQ ID NO：9)。
(c)SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1基因克隆
在SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1两端设计酶切位点EcoR I和Not I采用全基因通合成的方式委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，获得PCDNA3.1-IL-21-SYNZIP1和PCDNA3.1-SYNZIP1-Fc克隆质粒，筛选出阳性克隆PCDNA3.1-IL-21-SYNZIP1和PCDNA3.1-SYNZIP1-Fc阳性菌，扩增阳性菌落，测序确认克隆序列的正确，使用质粒无内毒素大抽试剂盒提取PCDNA3.1-IL-21-SYNZIP1和PCDNA3.1-SYNZIP1-Fc质粒备用。
(d)IL-21-SYNZIP1和SYNZIP1-Fc的转染和蛋白表达
细胞瞬时转染和纯化：293细胞转染按LipofectamineTM 2000操作说明书进行，以6孔板中的1孔为例，步骤如下：向该孔接种4×105细胞，37℃、5％CO2培养12h后换液1次，12h后开始转染,贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95％。将4μg质粒DNA和10μlLipofectamineTM 2000分别用无抗生素、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置15min形成脂质体复合物。连续培养三天后收取上清，采用间接ELISA方法检测目的蛋白的表达情况。获得的细胞上清液使用亲和层析镍柱进行纯化，获得PCDNA3.1-IL-21-SYNZIP1和PCDNA3.1-SYNZIP1-Fc蛋白，BCA检测蛋白浓度80mg/ml和100mg/ml。
4、SYNZIP1-neoantigen特异性多肽的合成
将实施例一中验证后的新抗原多肽连接上SYNZIP1作为接头，委托南京金斯瑞生物公司进行全长多肽合成。连接顺序如下：(SYNZIP1-linker-neoantigen),从而获得如下序列。
将合成获得的SYNZIP1-linker-neo1-21多肽冻干粉采用磷酸盐缓冲液溶解后进行混合，换算成摩尔浓度进行使用。
5、ACTI新型纳米疫苗的制备
将SYNZIP1-Fc、IL-21-SYNZIP1和SYNZIP1-linker-neo1-21新抗原多肽(SEQ IDNO：10-30)按照等摩尔浓度混合成溶液使用，标记为Mix-neo，将Mix-neo缓慢加入到包含了CpG核酸分子和SYNZIP2接头的PLGA纳米微球溶液中，利用磁力搅拌混匀，按照摩尔浓度1：1进行混合，通过SYNZIP1和SYNZIP2的配对结合，即可得到ACTI新型纳米疫苗，将得到的纳米微球采用BCA法定量确定其浓度。
6、ACTI新型纳米疫苗的活性验证
(a)U937荧光素报告基因法检测ACTI的激活活性
首先利用已经构建好好的含有报告基因(荧光素酶)并且过表达FcR分子和TLR9(CpG分子受体)的U937细胞来鉴定ACTI的活性，将5*105的U937细胞在V底的6孔板中培养，12小时后分别把1μg/mL-100μg/mL的ACTI，37℃,5％CO2继续培养24小时，接着加入底物荧光素在振荡器(200rpm)上振荡3分钟，然后孵育10分钟，最后使用多功能酶标仪检测荧光值。试验结果表明不同浓度的ACTI随着浓度的升高，可以刺激U937细胞产生不同强度的荧光，结果如图7所示。
(b)ACTI与PBMC细胞共培养后细胞因子的变化
使用Miltenyi的MicroBead试剂盒，按照说明书步骤操作，从人的外周血中分别分离PBMC和pDC细胞，将分离的PBMC细胞在X-VIVO 15,2％人血清蛋白,10ng/ml IL2培养基中进行培养12小时后，将1x105的PBMC细胞铺板到6孔板中，分别加入1ug/ml-10ug/ml的ACTI分子，刺激48小时后收集培养液上清，利用细胞因子ELISA检测试剂盒检测,IFN-γ和TNF-alpha细胞因子的变化。如图8所示，结果表明不同浓度的ACTI可以刺激PBMC细胞产生不同浓度的细胞因子。
(c)ACTI新型纳米疫苗的小鼠肿瘤模型的免疫治疗实验
将2×106个MFC细胞皮下注射到小鼠体内，建立小鼠的胃癌模型。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将肿瘤切除。然后将小鼠随机分为6组，皮下PBS组、PLGA组、游离疫苗、ACTI纳米疫苗进行给药，每组给药150μg，在第0天，14天给小鼠各注射一次。每2天用卡尺以非盲方式测量肿瘤的大小，并使用等式(a2×b)/2(a，宽度；b，长度)计算它们的体积。如图9所示，试验结果表明ACTI组与其他对照组相比具有更好的肿瘤抑制的效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：胃癌患者肿瘤组织样本的收集、全外显子组测序(WES)、RNA测序、序列的表位预测、新抗原预测、新抗原免疫原性的体外评估、流式细胞技术检测细胞因子的情况和IFN-γELISPOT测定。
2.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在新抗原免疫原性的体外评估步骤中，包括将冷冻的人PBMC解冻并在添加有10％FCS的AIM-V培养基中培养，在培养基中加入25ng mL-1IL-7(PeproTech)在第2天加入20U ml-1IL-2(PeproTech)，每3天更换一半含有细胞因子的培养基，将2×105个PBMC接种在含有单个肽(25μg mL-1)的96孔细胞培养板中并孵育过夜，使用无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作阴性和阳性对照，对于抗原特异性T细胞的体外刺激，刺激1天后，收集细胞用于进一步的免疫分析，检测细胞因子的变化。
3.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在流式细胞技术检测细胞因子的步骤中，包括根据流式多因子检测技术(CBA)产品说明书(BDBiosciences)在体外利用合成的突变多肽刺激后细胞上清液中的IFN-γ浓度，无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作空白(阴性)和阳性对照，将样品使用CytoFLEXLX流式细胞仪(Beckman Coulter)检测并分析数据，将合成的突变肽混合在一起刺激PBMC，对PBMC样品中的CD8+和IFN-γ的变化进行检测和分析。
4.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在IFN-γELISPOT测定步骤中，对于体外预刺激的PBMC，在用载有相应多肽的经辐照的自体PBMC过夜刺激后，使用IFN-γELISPOT试剂盒(达科为)评估T细胞释放的IFN-γ的分泌，包括预刺激PBMC(每孔105个细胞)和装载有相应肽(1-20μg mL-1)的经辐照自体PBMC以一式三份添加到孔中，在AIM-V培养基中孵育18-20小时，洗涤后，加入稀释的检测抗体，37℃孵育1小时，然后将链霉亲和素-HRP(1:100稀释)和3-氨基-9-乙基咔唑溶液混合物依次加入每个孔中，在室温下将板在黑暗中保持约20分钟后，加入去离子水以终止反应，在ELISPOT读取器(Cellular Technology Inc)下扫板，并使用ELISPOT软件(AID)分析数据。
5.一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：连接肽的选择、PLGA纳米微球制备、纳米微球负载的蛋白的制备、SYNZIP1与如权利要求1所述的新抗原连接合成特异性多肽、ACTI新型纳米疫苗的制备、ACTI新型纳米疫苗的活性验证。
6.根据权利要求5所述的一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述连接肽为SYNZIP1/SYNZIP2组合，所述SYNZIP1核酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述SYNZIP2核酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述SYNZIP2氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
7.根据权利要求5所述的一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，在PLGA纳米微球制备步骤中，包括以下步骤20mg SYNZIP2(sulfo-SMCC)交联活化反应、核酸分子CpG(CpG ODN1018)10mg与sulfo-SMCC交联反应、将CpG核酸分子和SYNZIP2接头偶联于PLGA纳米微球。
8.根据权利要求5所述的一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，在纳米微球负载的蛋白的制备步骤中，包括负载蛋白的选择、SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1的表达、SYNZIP1-Fc和IL-21-SYNZIP1基因克隆、IL-21-SYNZIP1和SYNZIP1-Fc的转染和蛋白表达。
9.根据权利要求5所述的一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，在ACTI新型纳米疫苗的活性验证步骤中，包括验证U937荧光素报告基因法检测ACTI的激活活性、ACTI与PBMC细胞共培养后细胞因子的变化、ACTI新型纳米疫苗的小鼠胃癌肿瘤模型中的免疫治疗试验。
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| CN117883558A (zh) * | 2024-03-15 | 2024-04-16 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 靶向肝肿瘤个性化mRNA疫苗的制备方法 |
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- 2023-01-28 CN CN202310072867.7A patent/CN116359509A/zh active Pending
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