CN110662841B - 靶向性新表位载体及其方法 - Google Patents

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Abstract

提出了允许选择肿瘤新表位的系统和方法，然后将这些系统和方法用于生成编码一个或多个多表位的重组核酸，将这些多表位针对适当的运输和加工进行了优化。在优选的方法中，这些多表位在质粒和/或病毒表达系统中被编码，以用作治疗剂。

Description

靶向性新表位载体及其方法
本申请要求2017年4月24日提交的序列号为62/489,102的我们共同未决的美国临时专利申请的优先权。
技术领域
本发明的领域是改进的基于新表位的免疫治疗剂的组合物和方法，特别地本发明涉及癌症治疗中的重组核酸治疗剂。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请均通过援引并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过援引并入一样。如果并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
靶向特定癌症所共用的某些抗原的癌症免疫疗法已经在一些患者中引起了明显的应答。令人遗憾的是，尽管相同抗原有显性表达，但许多患者未能对这种免疫疗法产生应答。这种应答失败的一个可能的原因是免疫系统的多种效应细胞可能没有以足够的数量存在，或可能已经耗尽。而且，患者中细胞内抗原加工和HLA变异性可能已经导致抗原和/或抗原展示的加工不足，从而导致治疗无效或缺乏应答。
为了增加对用于免疫疗法的靶标的选择，最近已经考虑了随机突变，因为肿瘤细胞中的一些随机突变可能产生独特的肿瘤特异性抗原(新表位)。这样，并且至少在概念上，新表位可提供用于免疫疗法的独特的精确靶标。另外地，已经显示溶细胞性T细胞应答可以被非常少量的肽触发(例如，Sykulev等人，Immunity[免疫力]，第4卷，第6期，第565-571页，1996年6月1日)。而且，由于在许多癌症中突变的数量相对较多，可能的靶标数量相对较高。鉴于这些发现，将癌症新表位鉴定为治疗靶标已经引起了广泛关注。令人遗憾的是，目前的数据似乎表明所有或几乎所有的癌症新表位对于患者和特定的肿瘤均是独特的，并且未能提供关于哪种新表位可用于治疗有效的免疫治疗剂的任何具体指示。
为了克服与针对免疫疗法的大量可能的靶标相关联的至少一些问题，可以过滤新表位的突变类型(例如，以确定错义或无义突变)、转录水平(以确认突变基因的转录，并确认蛋白质表达)。而且，如WO 2016/172722中所述，可以进一步分析经如此过滤的新表位与患者HLA系统的特异性结合。尽管这种系统有利地减少了相对大量的潜在新表位，但这些新表位相对于治疗结果的重要性仍然不确定。仍进一步地，并且尤其是多个肽在抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)中有待表达的情况下，尚未充分理解生成新表位的前体蛋白加工，并因此导致缺乏治疗成功的可预测性。
可以使用至少两种概念上不同的方法进行免疫疗法，其中第一种方法基于DNA疫苗接种，并且第二种方法基于重组病毒的使用，该重组病毒编码在感染该病毒的细胞中表达的一种或多种抗原。例如，临床试验已经表明，当进行肌内施用时，质粒DNA疫苗按300mcg编码HIV病毒颗粒蛋白表达调节(rev)蛋白和包膜(env)蛋白的质粒DNA的剂量对人类而言是安全且免疫学上有效的。这种DNA疫苗接种在HIV-血清反应阴性的患者中引起抗原特异性的、分泌IFNγ的T细胞应答(J.Infect.Dis.[传染病杂志](2000)181：476-83)。另外，已经报道了使用皮内注射质粒DNA和腺病毒，在患有前列腺癌的患者中靶向PSMA(前列腺特异性膜抗原)的临床试验的结果(参见Eur.Urol.[欧洲泌尿学](2000)，38：208217)。在此，对26名患者以初免/加强免疫(prime/boost)策略，用表达PSMA的腺病毒载体，随后用编码PSMA的质粒DNA，或用单独的质粒DNA进行免疫，并且没有观察到显著的毒性。然而，使用这种方法尚未证明此类疫苗接种(特别是在治疗癌症中)的治疗功效。在仍其他实例中，如US2017/0312351中所述，已经报道了癌症新表位的腺病毒表达。尽管此类方法对患者和患者的肿瘤是高度特异的，但是生成足够数量的、编码一个或多个新表位的病毒颗粒是耗费时间的。例如，生成单剂量为1011个病毒颗粒的病毒产量将通常需要6-8周，并且在一些情况下甚至更久，并且通常需要多次施用才能引起治疗效果。根据癌症的类型和生长速度，这样的生产时间期限可能会令人望而却步。另外，仅用病毒表达的蛋白质进行的免疫刺激通常效果较差，并且通常需要另外的治疗模式(如细胞因子)来引起所希望的治疗效果。
因此，尽管本领域已知鉴定新表位和将新表位递送至多个细胞的多种方法，但这些方法中的全部或几乎全部都具有多种缺点，特别是在功效和时间要求方面的缺点。因此，希望具有用于选择和产生新表位的改进的系统和方法，从而以方便的方式增加免疫疗法中治疗应答的可能性。
发明内容
本发明的主题涉及多种免疫治疗组合物和方法，并且尤其是重组表达系统，其中将多个新表位组合以形成具有运输信号的合理设计的多肽，以增加抗原加工和呈递并以此增强治疗功效。另外地，本文预期的系统和方法利用了多种且不同的疫苗接种模式，这些模式将提供显著缩短的首次疫苗接种时间和不同且互补的免疫刺激方式。
例如，在第一疫苗接种模式包含编码多表位(典型地包含多个新表位和/或TAA)的DNA疫苗接种时，可以在几天内制备疫苗，并将提供TLR刺激(例如，TLR9刺激)，而第二疫苗接种模式可以包含编码多表位(典型地是与第一疫苗接种模式中相同的多表位)的重组细菌或酵母疫苗，并将因此提供不同的TRL刺激(例如，TRL1、TLR2、TLR5等)。在又另一个实例中，该第一疫苗接种模式可以包含编码多表位(polytope)的细菌或酵母疫苗，并且该第二疫苗接种模式可以包含编码多表位的重组病毒，这两种疫苗接种模式将再次提供不同的(并且典型地互补或甚至协同的)先天性免疫刺激。
显而易见地，这种多模式策略将大幅减少生成第一疫苗接种的时间，因为可以在几天内制备DNA疫苗、细菌疫苗和酵母疫苗，而不是像大多数病毒疫苗那样在几周内制备。而且，由于不同的递送形式，预期的疫苗组合物和方法也将利用由不同模式提供的不同免疫刺激作用，并在初免/加强免疫方案中将如此特别有用。另外地，应当认识到，预期的系统和方法在不同疫苗模式中利用了基本上相同的多表位。换言之，一旦确定了对患者具有潜在治疗作用的抗原，就可以将编码这些抗原的重组核酸组装成多表位盒，然后将该多表位盒跨多个疫苗平台使用。
在本发明主题的一个方面，诸位发明人预期了生成用于在哺乳动物的免疫疗法中使用的重组表达构建体的方法。此类方法将典型地包括生成第一重组核酸的步骤，该第一重组核酸具有编码多表位的序列，其中该多表位包含多个经过滤的新表位序列，其中该多表位进一步包含将多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体，并且其中该第一重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第一启动子，以驱动该多表位在哺乳动物中表达。在另一个步骤中，生成具有编码多表位的相同序列的第二重组核酸，其中该第二重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第二启动子，以驱动该多表位在非哺乳动物细胞中表达。
例如，在示例性实施例中，第一启动子可以是组成型启动子，或可被低氧、IFN-γ或IL-8诱导的启动子。另外地，运输元件可以是CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾或LAMP1-跨膜序列。最典型地，通过将同一患者的肿瘤与匹配的常态对照进行比较来过滤经过滤的新表位序列，和/或过滤以对MHC复合体具有等于或小于200nM的结合亲和力。尽管在一些方面，计算经过滤的新表位序列以与MHC-I结合，并且运输元件将多表位引导至循环内吞体、分选内吞体或溶酶体，在其他方面，计算经过滤的新表位序列以与MHC-II结合，并且该运输元件将多表位引导至循环内吞体、分选内吞体或溶酶体。
在需要时，第一重组核酸可以进一步包含编码第二多表位的另外的序列，其中该第二多表位包含将第二多表位引导至不同亚细胞位置的第二运输元件，并且其中该第二多表位包含多个第二经过滤的新表位序列。在一些实施例中，经过滤的新表位序列中的至少一个和第二经过滤的新表位序列中的至少一个可以是相同的。
仍进一步预期，该第一重组核酸进一步包含编码共刺激分子、免疫刺激细胞因子、和干扰或下调检查点抑制的蛋白质中至少一种的序列。例如，适合的共刺激分子包括CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL、GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1和/或LFA3，而适合的免疫刺激细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-15超激动剂(ALT803)、IL-21、IPS1和/或LMP1，和/或适合的进行干扰的蛋白质包括针对CTLA-4、PD-1、TIM1受体、2B4和/或CD160的抗体或拮抗剂。
尽管不限于本发明的主题，该第一重组核酸可以在细菌细胞或酵母细胞中复制，和/或该第一重组核酸可以是用于生成重组病毒(例如，任选地缺失E1和E2b基因中的至少一个的腺病毒)的表达载体或穿梭载体。还预期此类方法还可以包括将该第一重组核酸配制成注射用药物配制品的步骤。
最典型地，第二启动子是组成型细菌或酵母启动子。因此，适合的非哺乳动物细胞包括大肠杆菌细胞和酿酒酵母。在此类情况下，方法可以包括将该第二重组核酸转染到细菌细胞或酵母细胞中的另外的步骤；在细菌细胞或酵母细胞中表达多表位；并将细菌细胞或酵母细胞配制成注射用药物配制品。
因此，诸位发明人还预期用于哺乳动物的免疫疗法的重组细菌或酵母表达载体。最优选地，这种载体将包括重组核酸，该重组核酸具有编码多表位的序列，该序列与细菌或酵母启动子可操作地连接，以驱动多表位的表达，其中该多表位包含将多表位引导至哺乳动物免疫感受态细胞的亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体；并且其中该多表位包含多个经过滤的新表位序列。
优选但非必需地，启动子是组成型启动子，而运输元件选自下组，该组由以下组成：CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾和LAMP1-跨膜序列。如前所述，可通过将同一患者的肿瘤与匹配的常态对照进行比较来过滤经过滤的新表位序列，并且将经过滤的新表位序列与MHC-I和/或MHC-II结合，并且运输元件将多表位引导至循环内吞体、分选内吞体或溶酶体。仍进一步预期，该重组核酸还可以包含编码第二多表位的另外的序列，其中该第二多表位包含将该第二多表位引导至不同亚细胞位置的第二运输元件，并且其中该第二多表位包含多个第二经过滤的新表位序列。如前所述，经过滤的新表位序列中的至少一个和第二经过滤的新表位序列中的至少一个可以是相同的。
在仍进一步预期的方面，表达载体是细菌表达载体或酵母表达载体。因此，特别预期了用上文考虑的载体转染重组酵母细胞和细菌细胞。然后可以将这些细胞配制成包含重组酵母细胞或细菌细胞的药物组合物。
在关于本发明主题的另外的方面，诸位发明人还预期了制备用于患有肿瘤的个体的第一和第二处理组合物的方法。此类方法将典型地包括从肿瘤的组学数据鉴定多个表达的新表位序列的步骤，其中每个表达的新表位序列对个体的MHC-I和MHC-II中的至少一个具有等于或小于500nM的经计算的结合亲和力；以及生成具有编码多表位的序列的第一重组核酸的另外的步骤，其中该多表位包含多个表达的新表位序列。优选地，该多表位进一步包含将多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体，并且第一重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第一启动子，以驱动多表位在个体的细胞中表达。在另一个步骤中，将第一重组核酸配制成DNA疫苗配制品，以此获得第一处理组合物。在又另一个步骤中，生成包含编码多表位的序列的第二重组核酸，其中该第二重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第二启动子，以驱动细菌细胞或酵母细胞中多表位的表达，并且在另外的步骤中，用该第二重组核酸转染细菌细胞或酵母细胞，并在细菌细胞或酵母细胞中表达多表位。在仍另外的步骤中，将经转染的细菌细胞或酵母细胞配制成基于细胞的疫苗配制品，以此获得第二处理组合物。
最典型地，使用来自肿瘤的组学数据和来自同一个体的非肿瘤样品的组学数据的增量同步比对来鉴定表达的新表位序列。通常进一步优选的是，第一重组核酸是表达载体，和/或运输元件是CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾或LAMP1-跨膜序列。第二启动子优选地是组成型细菌或酵母启动子，并且细菌细胞或酵母细胞优选地是大肠杆菌细胞或酿酒酵母。最典型地，将基于细胞的疫苗配制品配制用于注射。此外，在需要时，这种方法可以进一步包括生成第三重组核酸的步骤，该第三重组核酸是包括编码多表位的序列的病毒表达载体，其中该第三重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第三启动子，以驱动多表位在个体的细胞中表达。
在关于本发明主题的仍另一个方面，诸位发明人还预期了制备用于患有肿瘤的个体的第一和第二处理组合物的方法，该方法包括从肿瘤的组学数据鉴定多个表达的新表位序列的步骤，其中这些表达的新表位序列对个体的MHC-I和MHC-II中的至少一个具有等于或小于500nM的经计算的结合亲和力；以及生成第一重组核酸的步骤，该第一重组核酸具有编码多表位的序列，其中该多表位包含多个表达的新表位序列，其中该第一重组核酸是病毒表达载体。优选地，该多表位进一步包含将多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体，并且第一重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第一启动子，以驱动多表位在个体的细胞中表达。在另外的步骤中，从病毒表达载体中生成病毒颗粒，并将这些病毒颗粒配制成病毒疫苗配制品，以此获得第一处理组合物。此类方法还将包括生成第二重组核酸的步骤，该第二重组核酸具有编码多表位的序列，其中该第二重组核酸包含与编码多表位的序列可操作地连接的第二启动子，以驱动非哺乳动物细胞中多表位的表达；以及用第二重组核酸转染细菌细胞或酵母细胞并在细菌细胞或酵母细胞中表达多表位的另外的步骤。然后将经如此转染的细菌细胞或酵母细胞配制成基于细胞的疫苗配制品，以此获得第二处理组合物。
最典型地，使用来自肿瘤的组学数据和来自同一个体的非肿瘤样品的组学数据的增量同步比对来鉴定表达的新表位序列，和/或运输元件是CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾或LAMP1-跨膜序列。同样，优选的是，该第一启动子是组成型启动子，或该第一启动子可被低氧、IFN-γ、或IL-8诱导，和/或第二启动子是组成型细菌或酵母启动子。在进一步预期的实施例中，病毒表达载体是任选地缺失E1和E2b基因的腺病毒表达载体。尽管不限于本发明的主题，但是通常优选的是，非哺乳动物细胞或酵母细胞是大肠杆菌细胞或酿酒酵母细胞，和/或病毒疫苗配制品和基于细胞的疫苗配制品均被配制用于注射。
从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。
附图说明
图1是多种新表位排列的示意性图示。
图2是用于选择新表位的优选排列的示例性和部分示意图。
现有技术图3是细胞质中抗原加工和MHC-I呈递的示意图。
现有技术图4是溶酶体和内吞体区室中抗原加工和MHC-II呈递的示意图。
图5A-5C是细胞质中I类抗原加工和MHC-I呈递的示例性序列排列。
图6A-6C是细胞质中I类抗原加工和MHC-II呈递的示例性序列排列。
图7A-7C是细胞质中II类抗原加工和MHC-II呈递的示例性序列排列。
图8是B16-F10黑色素瘤的示例性预防性疫苗接种方案。
图9A-9C是描述使用皮下注射疫苗的抗肿瘤疫苗接种的示例性结果的图。
图10A-10C是描绘使用静脉内注射疫苗的抗肿瘤疫苗接种的示例性结果的图。
图11A-11E是描绘所选DNA和病毒疫苗组合物和所选施用途径的示例性结果的图。
图12是描绘使用DNA和病毒疫苗经多种组合物和途径的抗肿瘤作用的示例性结果的图。
具体实施方式
诸位发明人现已发现，不仅可以通过将抗原或新表位靶向特定的加工和细胞表面呈递途径，还可以通过使用优选触发不同免疫刺激途径的不同疫苗模式来进一步改进基于肿瘤抗原和/或基于新表位的免疫疗法中的多个方面。
因此，除了基于重组病毒的病毒癌症疫苗，该疫苗在宿主细胞中触发肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的表达，相同的(和/或另外的)抗原可以从DNA疫苗表达，和/或在经基因工程化以表达这些抗原的酵母和/或细菌细胞中被提供。例如，在DNA疫苗中使用质粒的情况下，可以触发针对游离DNA(例如，基于TLR9或STING)的先天性免疫应答机制，连同基于游离DNA的体内表达的适应性免疫应答。在另一个实例中，在病毒表达载体被用作其中病毒感染患者细胞的病毒疫苗的一部分时，这种感染将典型地触发不同先天性免疫应答机制(典型地TLR2、TLR4、TLR 7、TLR 8、TLR 9)。在仍另一个实例中，在使用细菌或酵母疫苗时，其中该细菌或酵母已经表达一种或多种抗原，这种疫苗接种将再次触发不同的先天性免疫应答机制(典型地对于细菌是TLR1-3，并且对于酵母是TLR1-4)。如将容易理解的，各种不同的先天性免疫应答机制的触发可提供疫苗组合物的互补增强或甚至协同增强。
因此，应当理解，本文提出的组合物和方法将优选地包括使用至少两种不同的疫苗模式。例如，第一模式可以是选自下组的模式，该组由以下组成：DNA疫苗、蛋白质疫苗、细菌疫苗、酵母疫苗和病毒疫苗，而第二/后续模式可以是选自相同组的另一种不同的模式。最优选地，以任何模式存在的抗原将重叠或是相同的，以在重复的抗原激发时发挥初免/加强免疫作用。
另外，应当认识到，除了触发多种不同先天免疫途径的益处之外，如果及时鉴定出患者的肿瘤相关抗原，预期的组合物和方法还允许治疗的快速开始。实际上，应当认识到，可以在几天内(典型地在不到一周内，并且甚至少于4天或甚至少于48小时内)基于相关抗原制备DNA疫苗。而且，还可以使用(相同的)抗原，在几天内、典型地少于2周内，并且更典型地少于1周内来制备细菌或酵母疫苗。同时，当患者已经接受第一疫苗(例如，DNA疫苗、细菌疫苗和/或酵母疫苗)时，可以制备病毒疫苗。
从不同的角度来看，应当理解，本文提出的组合物和方法将包括对患者和患者中的肿瘤具有特异性的肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原和/或新表位中的一种或多种，以允许靶向治疗。而且，可以有利地定制这种治疗，以实现一种或多种特异性免疫反应(包括先天性免疫应答、CD4+偏向的免疫应答、CD8+偏向的免疫应答、抗体偏向的免疫应答、和/或经刺激的免疫应答(例如，减少检查点抑制和/或通过使用细胞因子激活免疫感受态细胞))。最典型地，在源自重组核酸的新表位的背景中实现了此类作用，该重组核酸可以经由一种或多种途径，以一种或多种不同型式(例如，作为重组质粒和作为重组病毒)被施用。
抗原
关于适合的治疗性抗原，预期多种抗原被认为用于在本文中使用是适合的。然而，特别优选的抗原包括肿瘤相关抗原(例如，CEA、MUC1、短尾类突变型(brachyury))、肿瘤特异性抗原(例如，HER2、PSA、PSMA等)，并且尤其是肿瘤和患者特异性抗原(即，新表位)。可以将新表位表征为在肿瘤细胞中表达的随机突变，这些随机突变产生独特的抗原和肿瘤特异性抗原。因此，从不同的角度来看，可以通过考虑突变的类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位)和突变的影响(例如，无义、错义、移码等)来鉴定新表位，因此这些新表位可以被用作内容过滤器，通过该过滤器可以消除沉默突变和其他不相关的(例如，未表达的)突变。还应当理解，新表位序列可以被定义为具有相对较短长度(例如，8-12mer或14-20mer)的序列延伸，其中此类延伸将包括氨基酸序列中的一个或多个变化。最典型地，但非必需地，发生改变的氨基酸将在中心氨基酸位置处或附近。例如，典型的新表位可以具有A4-N-A4、或A3-N-A5、或A2-N-A7、或A5-N-A3、或A7-N-A2的结构，其中A是蛋白原野生型或常态的(即，来自同一患者的相应健康组织)氨基酸，并且N是发生改变的氨基酸(相对于野生型或相对于匹配的常态)。因此，本文预期的新表位序列包括具有相对较短长度(例如，5-30mer、更典型地8-12mer，或14-20mer)的序列延伸，其中此类延伸包括氨基酸序列中的一个或多个改变。当需要时，可以将另外的氨基酸置于发生改变的氨基酸的上游或下游，例如，以允许在细胞的多种区室(例如，用于胞质溶胶中的蛋白酶体加工，或内吞体和/或溶酶体区室中的特定蛋白酶加工)中另外的抗原加工。
因此，应当理解，取决于发生改变的氨基酸的位置，单个氨基酸改变可以在包括这些改变的氨基酸的许多新表位序列中呈现。有利地，这种序列变异性允许新表位的多种选择，并因此增加了然后可以基于一种或多种所希望的特征(例如，对患者HLA型的最高亲和力，最高结构稳定性等)而选择的潜在有用的靶标的数量。最典型地，新表位将被计算为具有长度为在2-50个之间的氨基酸，更典型地为5-30个之间的氨基酸，并且最典型地为8-12个之间的氨基酸或14-20个之间的氨基酸，其中发生改变的氨基酸优选以改善其与MHC结合的方式位于中心或以其他方式定位。例如，在由MHC-I复合体呈递表位的情况下，典型的新表位长度将为约8-12个氨基酸，而经由MHC-II复合体呈递的典型新表位的长度将具有约14-20个氨基酸。如将容易理解的，由于新表位中发生改变的氨基酸的位置可以是非中心的，因此实际的肽序列以及新表位的实际拓扑结构可以发生明显的变化，并且具有对MHC-I或MHC-II呈递的所希望的结合亲和力和/或所希望的蛋白酶加工的新表位序列将通常决定特定的序列。
当然，应当理解，对新表位的鉴定或发现可以从多种生物材料(包括新鲜的活检物、冷冻的或以其他方式保存的组织或细胞样品、循环的肿瘤细胞、外来体、多种体液(并且尤其是血液)等)开始。因此，适合的组学分析方法包括核酸测序，并且特别是在DNA上操作的NGS方法(例如，Illumina测序、ion torrent测序、454焦磷酸测序、纳米孔测序等)；RNA测序(例如，RNAseq、基于逆转录的测序等)；并且在一些情况下是基于蛋白质测序或质谱的测序(例如，SRM、MRM、CRM等)。
照此，并且特别是对于基于核酸的测序，应该特别认识到，对肿瘤组织的高通量基因组测序将允许快速鉴定新表位。然而，必须意识到，在将如此获得的序列信息与标准参考序列比较时，正常发生的患者间变异(例如，由于SNP、短的插入缺失(indel)、重复的不同数目等)以及杂合性将导致相对大量的潜在假阳性新表位。值得注意地，在将患者的肿瘤样品与同一患者的匹配的常态(即，非肿瘤)样品进行比较的情况下，可以消除这种不准确性。
在本发明主题的一个尤其优选的方面，通过肿瘤和匹配的常态样品的全基因组测序和/或外显子组测序(通常按覆盖深度为至少10x，更典型地至少20x)来进行DNA分析。可替代地，还可以从来自同一患者的先前序列确定的已建立的序列记录(例如，SAM、BAM、FASTA、FASTQ或VCF文件)提供DNA数据。因此，适用于本文的数据集包括未处理的或已处理的数据集，并且示例性优选的数据集包括具有BAM格式、SAM格式、GAR格式、FASTQ格式、或FASTA格式以及BAMBAM、SAMBAM的那些，和VCF数据集。然而，尤其优选的，如US 2012/0059670 A1和US 2012/0066001 A1中所述，以BAM格式或BAMBAM不同对象提供数据集。而且，应注意，数据集反映了同一患者的肿瘤和匹配的常态样品。因此，可以排除不引起肿瘤(例如，沉默突变、SNP等)的遗传种系改变。当然，应当认识到，肿瘤样品可能来自初始肿瘤、来自治疗开始时的肿瘤、来自复发的肿瘤和/或转移部位等。在大多数情况下，患者的匹配的常态样品是血液或来自与肿瘤相同组织类型的未患病组织。
同样，可以按多种方式进行序列数据的计算分析。然而，在最优选的方法中，例如，在US 2012/0059670和US 2012/0066001中披露的，使用BAM文件和BAM服务器，通过对肿瘤和常态样品进行增量定位引导的同步比对，在计算机中进行分析。这种分析有利地减少了假阳性新表位，并且显著减少了对存储和计算资源的需求。
应当注意，应该读取针对计算机的任何语言，以包括任何合适的计算装置的组合，这些计算装置包括服务器、接口、系统、数据库、代理、端、引擎、控制器或单独或共同操作的其他类型的计算装置。应当理解，计算装置包括处理器，该处理器被配置为执行存储在有形的非暂时性计算机可读存储介质(例如，硬盘驱动器、固态驱动器、RAM、闪存、ROM等)上的软件指令。软件指令优选地配置计算装置，以提供如下文关于所披露的设备所讨论的角色、职责或其他功能。此外，所披露的技术可以体现为计算机程序产品，其包括存储软件指令的非暂时性计算机可读介质，这些软件指令使处理器执行与基于计算机的算法、过程、方法或其他指令相关联的所披露的步骤。在特别优选的实施例中，各种服务器、系统、数据库或接口交换数据使用标准化协议或算法，可能地基于HTTP、HTTPS、AES、公钥-私钥交换、web服务API、已知的金融交易协议、或其他电子信息交换方法。设备之间的数据交换可以通过分组交换网络、因特网、LAN、WAN、VPN或其他类型的分组交换网络；电路交换网络；信元交换网络；或其他类型的网络进行。
从不同的角度来看，可以建立患者和癌症特异性计算机模拟序列集合，这些序列集合编码具有预定长度为例如5和25个之间的氨基酸的新表位，并且包括至少一个发生改变的氨基酸。对于每个发生改变的氨基酸，这种集合将典型地包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个成员，其中发生改变的氨基酸的位置是不同的。这种集合有利地增加了适用于免疫疗法的潜在候选分子，并然后可以用于进一步过滤(例如，通过亚细胞定位、转录/表达水平、MHC-I和/或II亲和力等)，如下文详细的描述。当然，应当理解，这些新表位序列可以容易地反翻译成相应的核酸序列，以此生成编码新表位的核酸序列。最典型地，但非必需地，这种反翻译将考虑在其中表达核酸的生物的正确密码子使用。
例如，并使用同步定位指导对肿瘤和匹配的常态序列数据的分析，诸位发明人先前鉴定了来自多种癌症和患者的多种癌症新表位，这些癌症包括以下癌症类型BLCA、BRCA、CESC、COAD、DLBC、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PRAD、READ、SARC、SKCM、STAD、THCA和UCEC。针对这些癌症的示例性新表位数据可以在国际申请WO2016/172722中发现，该申请通过引用并入本文。
取决于癌症的类型和阶段，以及患者的免疫状况，应当认识到并非所有经鉴定的新表位都必定会在患者中导致治疗上等效的反应。实际上，在本领域中熟知，仅一小部分新表位将产生免疫应答。为了增加治疗上希望的应答的可能性，可以进一步过滤最初鉴定的新表位。当然，应当理解，出于本文提出的方法的目的，下游分析不需要考虑沉默突变。然而，优选的突变分析将除了提供突变的特定类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位)，还提供突变影响的信息(例如，无义、错义等)，并且可以这样充当第一内容过滤器，通过该过滤器消除沉默突变。例如，可以选择新表位用于进一步考虑，其中突变是移码、无义、和/或错义突变。
在进一步的过滤方法中，新表位还可以针对亚细胞定位参数进行详细的分析。例如，如果新表位被鉴定为具有膜相关位置(例如，位于细胞的细胞膜的外部)和/或如果计算机模拟结构计算确认了新表位可能暴露于溶剂，或呈现出结构稳定的表位(例如，J ExpMed[实验医学杂志]2014)等，则可以选择新表位序列用于进一步考虑。
关于过滤新表位，通常预期新表位尤其适合于在组学(或其他)分析揭示出新表位实际表达的情况下使用。可以按本领域已知的所有方式对新表位的表达和表达水平进行鉴定，并且优选的方法包括定量RNA(hnRNA或mRNA)分析和/或定量蛋白质组学分析。最典型地，包含新表位的阈值水平将是以下表达水平，该表达水平是相应匹配的常态序列的表达水平的至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％，因此确保(新)表位对于免疫系统是至少潜在‘可见的’。因此，通常优选的是，组学分析还包括对基因表达的分析(转录组学分析)，以此帮助鉴定具有突变的基因的表达水平。
本领域存在已知的许多转录组分析方法，并且所有已知方法均被认为适用于本文。例如，优选的物质包括mRNA和初级转录物(hnRNA)，并且RNA序列信息可以从逆转录的多聚腺苷酸+-RNA(polyA+-RNA)获得，该逆转录的多聚腺苷酸+-RNA进而从同一患者的肿瘤样品和匹配的常态(健康的)样品中获得。同样，应注意，虽然通常优选多聚腺苷酸+-RNA作为转录组的代表，RNA的其他形式(hn-RNA、非多聚腺苷酸化的RNA、siRNA、miRNA等)也被认为适用于本文。优选的方法包括定量RNA(hnRNA或mRNA)分析和/或定量蛋白质组学分析，尤其是包括RNAseq。在其他方面，使用基于RNAseq、qPCR和/或rtPCR的方法进行RNA定量和测序，尽管多种可替代的方法(例如，基于固相杂交的方法)也被认为是适合的。从另一个角度看，转录组学分析(单独地或与基因组分析组合)可以是适合于鉴定和定量具有癌症特异性突变和患者特异性突变的基因。
类似地，可以按多种方式进行蛋白质组学分析以确定新表位的RNA的实际翻译，并且本文预期了蛋白质组学分析的所有已知方式。然而，特别优选的蛋白质组学方法包括基于抗体的方法和质谱方法。而且，应注意，蛋白质组学分析不仅可以提供有关蛋白质本身的定性或定量信息，还可以包括其中蛋白质具有催化活性或其他功能活性的蛋白质活性数据。将用于进行蛋白质组学测定的一种示例性技术描述于US 7473532中，将其通过引用并入本文。鉴定并甚至定量蛋白质表达的另外适合的方法包括多种质谱分析(例如，选择性反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)和连续性反应监测(CRM))。因此，应当理解，上述方法将提供患者和肿瘤特异性新表位，这些新表位可以通过包含新表位(例如，膜位置)的蛋白质的亚细胞位置，表达强度(例如，如与同一患者的匹配的常态对照相比，是过表达的)等被进一步过滤。
在过滤的又另一个方面，可以将新表位与包含已知人序列(例如，患者或患者集合的序列)的数据库进行比较，以此避免使用与人相同的序列。而且，过滤还可以包括去除由于患者中的SNP而导致的新表位序列，其中这些SNP同时存在于肿瘤和匹配的常态序列中。例如，dbSNP(单核苷酸多态性数据库)是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)与美国国家人类基因组研究所(NHGRI)合作开发和托管的关于不同物种内部和不同物种之间遗传变异的免费公共档案。尽管数据库的名称仅暗示了一类多态性(单核苷酸多态性(SNP))的集合，但实际上它包含相对广泛的分子变异：(1)SNP；(2)短缺失和插入多态性(插入缺失/DIP)；(3)微卫星标记或短串联重复序列(STR)；(4)多核苷酸多态性(MNP)；(5)杂合的序列；和(6)命名的变体。dbSNP接受明显的中性多态性，对应于已知表型的多态性和无变异的区域。使用如上所述的这样的数据库和其他过滤选项，可以过滤患者和肿瘤特异性新表位以去除那些已知序列，产生具有多个新表位序列的序列集，该多个新表位序列具有显著减少的假阳性。
一旦完成对新表位的所希望的过滤水平(例如，通过肿瘤相对于常态对照、和/或表达水平、和/或亚细胞位置、和/或患者特异性HLA匹配、和/或已知的变体过滤新表位)，考虑到受新表位影响的基因类型，预期了进一步的过滤步骤。例如，适合的基因类型包括癌症驱动基因、与细胞分裂的调控相关联的基因、与细胞凋亡相关联的基因，以及与信号转导相关的基因。然而，在尤其优选的方面，癌症驱动基因是特别优选的(其可以通过功能化多种基因类型而持续，这些基因类型包括受体基因、信号转导基因、转录调节基因等)。在另外预期的方面，适合的基因类型还可以是已知的乘客基因(passenger gene)和参与代谢的基因。
关于对作为癌症驱动基因的鉴定或其他确定(例如，预测)，多种方法和预测算法在本领域中是已知的，并且被认为适用于本文。例如，适合的算法包括MutsigCV(Nature[自然]2014，505(7484)：495-501)、ActiveDriver(Mol Syst Biol[分子系统生物学]2013，9：637)、MuSiC(Genome Res[基因组研究]2012，22(8)：1589-1598)、OncodriveClust(Bioinformatics[生物信息学]2013，29(18)：2238-2244)、OncodriveFM(Nucleic AcidsRes[核酸研究]2012，40(21)：e169)、OncodriveFML(Genome Biol[基因组生物学]2016，17(1)：128)、肿瘤抑制基因和致癌基因(TUSON)(Cell[细胞]2013，155(4)：948-962)、20/20+(https：//github.com/KarchinLab/2020plus)，和oncodriveROLE(Bioinformatics[生物信息学](2014)30(17)：i549-i555)。可替代地或另外地，癌症驱动基因的鉴定也可以采用多种来源来获得已知的癌症驱动基因及其与具体癌症的关联性。例如，驱动突变的Intogen目录(2016.5；URL：www.intogen.org)包含由癌症基因组解释程序(Cancer GenomeInterpreter)对28种肿瘤类型的泛癌群组中的6,792个外显子进行的驱动分析的结果。
然而，尽管进行了过滤，应当认识到，并不是所有新表位都对免疫系统可见，因为这些新表位还需要在更大的背景中(例如，多表位内)存在时被加工，并在患者的MHC复合体上呈递。在该上下文中，必须意识到，所有新表位中仅一部分将具有用于呈递的足够亲和力。因此，并且尤其在免疫疗法的背景下，应当显而易见的是，在新表位被适当加工、结合并由MHC复合体呈递的情况下，这些新表位将更可能有效。从另一个角度看，随着可以经由MHC复合体呈递的新表位数目的增加，治疗成功将增加，其中此类新表位对患者的HLA型具有最小的亲和力。因此，应当理解，有效的结合和呈递是新表位的序列与患者的特定HLA型的组合功能。因此，通常需要确定患者组织的HLA型。最典型地，HLA型的确定包括至少三种MHC-I亚型(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C)和至少三种MHC-II亚型(例如，HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)，优选地其中每种亚型被确定为至少2位或至少4位深度。然而，还预期更大的深度(例如，6位、8位)。
一旦确定了患者的HLA类型(使用已知的化学或计算机模拟测定)，就可以根据数据库计算和/或获取HLA类型的结构解决方案，然后将其用于计算机模拟的对接模型中以确定(典型地是过滤的)新表位与HLA结构解决方案的结合亲和力。如将在下文进一步讨论的那样，用于确定结合亲和力的适合的系统包括NetMHC平台(参见，例如，Nucleic AcidsRes.[核酸研究]2008年7月1日；36(Web服务器卷)：W509-W512.)。然后选择对先前确定的HLA型具有高亲和力(例如，小于100nM、小于75nM、小于50nM)的新表位，连同患者的MHC-I/II亚型的知识用于进行治疗。
可以使用本领域熟知的湿化学中的多种方法来进行HLA测定，并且所有这些方法均被认为适合用于本文。然而，在尤其优选的方法中，还可以使用包含大多数或所有已知和/或常见的HLA型的参考序列，从计算机模拟的组学数据中预测HLA型。例如，在根据本发明主题的一个优选的方法中，由数据库或测序仪提供映射至6号染色体短臂2区1带3亚带(或在发现HLA等位基因的任何其他位置附近/在该位置处)的相对大量的患者序列读取。最典型地，序列读取将具有约100-300个碱基的长度，并且包含元数据，该元数据包括读取质量、比对信息、方向、位置等。例如，适合的格式包括SAM、BAM、FASTA、GAR等。尽管不限于本发明主题，但是通常优选的是，患者序列读取提供至少5x、更典型地至少10x、甚至更典型地至少20x，并且最典型地至少30x的覆盖深度。
除了患者序列读取之外，预期的方法进一步采用一个或多个参考序列，这些参考序列包括多个已知不同的HLA等位基因的序列。例如，典型的参考序列可以是合成的(没有相应的人或其他哺乳动物对应物)序列，该序列包括至少一种HLA型的序列区段，该HLA型具有该HLA型的多个HLA等位基因。例如，适合的参考序列包括HLA-A的至少50个不同等位基因的已知基因组序列的集合。可替代地或另外地，参考序列还可以包括HLA-A的至少50个不同等位基因的已知RNA序列的集合。当然，并且如下文进一步详细讨论的，参考序列不限于HLA-A的50个等位基因，但是关于HLA型和等位基因的数目/组成可以具有可替代的组成。最典型地，参考序列将是计算机可读格式，并且将从数据库或其他数据存储设备提供。例如，适合的参考序列格式包括FASTA、FASTQ、EMBL、GCG或GenBank格式，并且可以直接从公共数据存储库(例如，IMGT，国际免疫遗传学(International ImMunoGeneTics)信息系统，或等位基因频率网数据库(The Allele Frequency Net Database)，EUROSTAM，URL：www.allelefrequencies.net)的数据中获得或构建。可替代地，参考序列还可以基于一个或多个预定标准(例如等位基因频率、种族等位基因分布、常见或稀有等位基因类型等)从各个已知的HLA等位基因构建。
使用参考序列，现可以将患者序列读取穿过迪布鲁英(de Bruijn)图，以鉴定具有最佳匹配的等位基因。在该上下文中，应注意，每个个体携带针对每种HLA型的两个等位基因，并且这些等位基因可能非常类似，或在一些情况下甚至是相同的。如此高的相似度给传统的比对方案带来了重大问题。发明人现已发现，可以使用以下方法来解析HLA等位基因，并且甚至是非常密切相关的等位基因，在该方法中通过将序列读取分解成相对小的k-mer(典型地具有10-20个之间的碱基长度)，并且通过实施加权投票过程(其中每个患者序列读取基于与等位基因的序列匹配的序列读取的k-mer，针对每个等位基因提供投票(“定量读取支持”))来构建迪布鲁英图。然后，等位基因的累积最高投票指示最可能预测的HLA等位基因。另外，通常优选与等位基因匹配的每个片段也用于计算该等位基因的总覆盖率和覆盖深度。
得分可以根据需要被进一步改进或完善，尤其是在许多最高命中(top hit)相似的情况下(例如，其得分的很大一部分来自高度共享的k-mer集)。例如，得分细化可以包括加权方案，其中从未来考虑中去除与当前最高命中基本上相似(例如，＞99％，或其他预定值)的等位基因。然后，将当前最高命中所使用的k-mer的计数重新加权一个因子(例如，0.5)，并通过将这些加权计数相加来重新计算每个HLA等位基因的得分。重复此选择过程以找到新的最高命中。使用RNA序列数据可甚至进一步改进该方法的准确性，该RNA序列数据允许鉴定由肿瘤表达的等位基因，这些等位基因有时可能只是DNA中存在的2个等位基因中的1个。在预期的系统和方法的进一步有利的方面，可以处理DNA或RNA、或DNA和RNA两者的组合以做出高度准确的HLA预测，并且可以源自肿瘤或血液DNA或RNA。在另外的方面中，用于高准确性计算机模拟的HLA分型的适合方法和考虑描述于WO 2017/035392(通过引用并入本文)中。
一旦鉴定了患者和肿瘤特异性新表位和HLA型，例如使用NetMHC，可以通过将新表位与HLA计算机模拟对接并确定最佳结合物(例如，最低KD，例如，小于500nM、或小于250nM、或小于150nM、或小于50nM)，来进行进一步的计算机分析。应当理解，这种方法不仅将鉴定对患者和肿瘤真实的特异性新表位，而且还将鉴定最可能在细胞上呈递并因此最有可能引发具有治疗效果的免疫应答的那些新表位。当然，还应当理解，如下文进一步讨论的，如此鉴定的HLA匹配的新表位可以在体外进行生物化学验证，然后将编码表位的核酸作为有效负载包含到病毒中。
当然，应当理解，可以使用除NetMHC之外的系统，并且适合的系统包括NetMHC II、NetMHCpan、IEDB分析资源(URL immuneepitope.org)、RankPep、PREDEP、SVMHC、Epipredict、HLABinding等(参见，例如，J Immunol Methods[免疫学方法杂志]2011；374：1-4)，将患者的HLA型与患者和癌症特异性新表位匹配。在计算最高亲和力时，应注意，可以使用新表位序列的集合，其中发生改变的氨基酸的位置被移动(同上)。可替代地或另外地，通过添加N末端和/或C末端修饰可以实施对新表位的修饰，以进一步增加表达的新表位与患者的HLA型的结合。因此，新表位可以是天然的，或可以被进一步修饰以更好地匹配特定的HLA型。而且，在需要时，可以计算相应的野生型序列(即，没有氨基酸变化的新表位序列)的结合以确保高的差别亲和力。例如，新表位及其相应的野生型序列之间的MHC结合中尤其优选的高差别亲和力是至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍等。
使用多种系统和方法，还可以在体外确定结合亲和力和特定的差别结合亲和力。例如，可以使用如下文详细描述的构建体，用核酸(例如，病毒、质粒、线状DNA、RNA等)转染患者的抗原呈递细胞或具有匹配的HLA型的细胞，以表达一个或多个新表位。在表达和抗原加工后，然后可以使用新表位的特异性结合物或使用基于细胞的系统(例如，患者的PBMC)(其中可以在体外观察到T细胞激活或毒性NK的细胞活性)，在细胞外的MHC复合体中鉴定新表位。然后将选择具有差别活性的新表位(如与相应的野生型表位相比，引发更强的信号或免疫应答)用于进行治疗。
重组核酸/多表位
在适当的选择经过滤的新表位(或肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)后，可以构建形成所有下游疫苗组合物的重组核酸。最典型地，所希望的核酸序列(用于从病毒感染的细胞表达)在本领域熟知的合适调节元件的控制下。还将容易理解，调节元件的选择将由其中待表达重组核酸的系统决定。因此，适合的调节元件包括组成型活性或诱导型细菌和酵母启动子(和在需要时的相关诱导子序列和/或阻遏子序列)，以及真核生物(以及优选哺乳动物/人)启动子序列。例如，在DNA疫苗中使用重组核酸的情况下，适合的启动子元件包括组成型强启动子(例如，SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK、CAGG启动子)。在其他方面，在重组核酸是病毒表达载体的一部分的情况下，预期的启动子也包括诱导型启动子(特别是在对肿瘤微环境典型的诱导条件的情况下)。例如，诱导型启动子包括对缺氧敏感的启动子和对TGF-β或IL-8敏感的启动子(例如，经由TRAF、JNK、Erk，或其他应答元件启动子)。在其他实例中，适合的诱导型启动子包括四环素-诱导型启动子，粘病毒抗性1(Mx1)启动子等。
类似地，当重组核酸用于生成细菌疫苗和/或酵母疫苗时，其中细菌或酵母表达新表位或其他治疗性抗原，适合的启动子包括强组成型或诱导型细菌和酵母启动子。例如，用于表达抗原/多表位的适合细菌启动子包括T7启动子、Tac启动子、BAD启动子、Trc启动子等。同样，酵母预期的酵母启动子包括AOX1启动子、GAL启动子、GDS启动子、ADH启动子等。
在该上下文中，应当理解，诸位发明人已经发现，新表位排列的方式和新表位的合理设计的运输可对多种免疫治疗组合物的功效产生实质性的影响，这将在下文更详细地进行进一步描述。例如，单个新表位可以从作为单个质粒、病毒表达构建体等递送的相应重组构建体中单独表达。可替代地，多个新表位可以从单独的启动子分别表达以形成单独的mRNA，然后单独翻译成各自的新表位；或从包含针对每个新表位序列的单独翻译起始点的单个mRNA表达(例如，使用2A或IRES信号)。值得注意地，尽管通常认为这样的排列允许适当的新表位肽的受控递送，但是此类表达系统的功效已经低于期望的(数据未显示)。
相反，从单个转录物表达多个新表位以此形成单个转录物，然后将该单个转录物翻译成单个多表位(即，具有一系列串联连接的新表位的多肽，任选地具有插入的接头序列)的表达、加工和抗原呈递被认为是有效的。值得注意地，多表位的表达需要在细胞内通过合适的蛋白酶(例如，蛋白酶体、内吞体蛋白酶、溶酶体蛋白酶)进行加工以产出新表位序列，并且如与单个新表位，特别是其中具有相对较短长度(例如，小于25个氨基酸；结果未显示)的个体新表位的表达相比，多表位导致大多数新表位的抗原加工和呈递得到改进。而且，这种方法还允许合理设计在新表位肽序列之间的蛋白酶敏感序列基序，以此确保或避免被特异性蛋白酶加工(因为蛋白酶体、内吞体蛋白酶和溶酶体蛋白酶具有不同的切割偏好)。因此，可以设计多表位，这些多表位不仅包括在空间上分开的新表位的接头序列，而且还包括将优先被特异性蛋白酶切割的序列部分(例如，3-15个之间的氨基酸)。
因此，诸位发明人预期了包含核酸区段的重组核酸和表达载体(例如，病毒表达载体)，该核酸区段编码多表位，其中该多表位与所希望的启动子元件可操作地偶联，并且其中个体新表位任选地被接头和/或蛋白酶切割或识别序列分开。例如，图1示例性地说明了新表位的多种预期的排列，用于从腺病毒表达系统(在此：AdV5，具有E1和E2b基因缺失)中表达。在此，构建体1示例性地说明了新表位排列，该新表位排列包含8个新表位(‘小基因’)，在串联体序列中具有的总长度为15个氨基酸，而没有插入的接头序列，而构建体2显示了构建体1的排列，但包含了在每个新表位序列之间的9个氨基酸接头。当然，并且如上所述，应当认识到，新表位序列的确切长度不限于15个氨基酸，并且确切长度可以变化很大。然而，在大多数情况下，当在8-12个之间的氨基酸的新表位序列侧接另外的氨基酸时，总长度将典型地不超过25个氨基酸、或30个氨基酸或50个氨基酸。同样，应注意，尽管图1指示G-S接头，多种其他接头序列也适合用于本文。当旨在经由MHC-I复合体呈递新表位时，这种相对短的新表位是特别有利的。
在该上下文中，应当理解，适合的接头序列将提供空间柔性并分离两个相邻的新表位。然而，必须注意不要为接头选择可能具有免疫原性/形成患者体内已经存在的表位的氨基酸。因此，针对可以在患者中发现的表位的存在(例如，作为常态序列的一部分或由于SNP或其他序列变异)，通常优选再次过滤多表位构建体。这样的过滤将应用如上文已经讨论的相同的技术和标准。
类似地，构建体3示例性地说明了新表位排列，该新表位排列包含在串联体序列中没有插入的接头序列的8个新表位，并且构建体4显示了构建体3的排列，其中包含了在每个新表位序列之间的9个氨基酸接头。如上所述，应当认识到，此类新表位序列的确切长度不限于25个氨基酸，并且确切长度可以变化很大。然而，在大多数情况下，当在14-20个之间的氨基酸的新表位序列侧接另外的氨基酸时，总长度将典型地不超过30个氨基酸、或45个氨基酸或60个氨基酸。同样，应注意，尽管图1指示这些构建体的G-S接头，多种其他接头序列也适合用于本文。当旨在经由MHC-II复合体呈递新表位时，这种相对长的新表位是特别有利的。
在该实例中，应当理解，15个氨基酸的(15-aa)小基因是在任一侧用天然序列的7个氨基酸选择的MHC I类靶向的肿瘤突变，而25个氨基酸的小基因是在任一侧用天然序列的12个氨基酸选择的MHC II类靶向的肿瘤突变。示例性的9个氨基酸接头被认为具有足够的长度，使得在相邻的小基因之间不会形成“非天然的”MHC I类表位。多表位序列倾向于比单个新表位更有效地加工和呈递(数据未显示)，并且对于MHC-I呈递添加超过12个氨基酸的氨基酸，并且对于MHC-I呈递添加超过20个氨基酸的氨基酸似乎允许在某种程度上改进了蛋白酶的加工。
为了使定制的蛋白质序列保留在细胞内以供HLA复合体加工和呈递的可能性最大化，可以将新表位序列以使疏水序列最小化的方式安排，这些疏水序列可以指导向细胞膜或细胞外空间的运输。最优选地，疏水序列或信号肽的检测是通过将序列与权重矩阵进行比较来完成的(参见，例如，Nucleic Acids Res.[核酸研究]1986年6月11日；14(11)：4683-4690)或通过使用在包含信号序列的肽上训练的神经网络(参见，例如，Journal ofMolecular Biology[分子生物学杂志]2004，第338卷，第5期，1027-1036)。图2描述了排列选择的示例性方案，其中分析了多个多表位序列。在此，计算所有新表位的所有位置置换以产生排列的集合。然后，通过权重矩阵和/或神经网络预测对该集合进行加工，以生成代表疏水序列或信号肽存在和/或强度的可能性的得分。然后将所有的位置置换按得分排序，将分数低于预定阈值或最低分数(针对疏水序列或信号肽的存在和/或强度的可能性)的一个或多个置换用于构建定制的新表位表达盒。
关于多表位中新表位序列的总数，通常优选多表位包含至少两个、或至少三个、或至少五个、或至少八个、或至少十个新表位序列。实际上，重组DNA的宿主生物的有效负载能力通常被预期为限制因素，以及过滤后的和合适的新表位的可用性。例如，腺病毒表达载体，并且特别地Adv5是尤其优选的，因为此类载体在重组有效负载中可以容纳高达14kb。同样，细菌和酵母系统可以容纳甚至更大的有效负载，通常超过50kb。在其他方面，当将重组DNA用于DNA疫苗时，适合的大小将典型地在5kb和20kb之间的范围中。
在仍进一步考虑的本发明主题的方面，应注意，新表位/多表位可以被导向特定的亚细胞区室(例如，胞质溶胶、内吞体、溶酶体)，并因此被导向特定的MHC呈递类型。这样的定向表达、加工和呈递是特别有利的，因为可以制备将免疫应答引导至CD8+型应答(其中多表位被引导至细胞质空间)或引导至CD4+型应答(其中多表位被引导至内吞体/溶酶体区室)的预期的组合物。而且，应当认识到将通常经由MHC-I途径呈递的多表位可以经由MHC-II途径呈递(并因此模拟新表位的交叉呈递)。因此，应当理解，可以使用合适的序列元件设计新表位和多表位序列并将其引导至一个或两个MHC呈递途径。关于将这样表达的新表位送到所希望的MHC系统，应注意，MHC-I呈递的肽将通常通过蛋白酶体加工从细胞质中产生并通过内质网递送。因此，如在下文中更详细讨论的，旨在用于MHC-I呈递的表位的表达将通常被引导至细胞质。在其他方面，MHC-II呈递的肽将通常在递送至细胞膜之前经由通过酸性蛋白酶(例如，豆荚蛋白、组织蛋白酶L和组织蛋白酶S)的降解和加工自内吞体和溶酶体区室而产生。
而且，预期使用多种方法还可以增强多表位的蛋白质降解，并且尤其预期的方法包括将可切割的或不可切割的泛素部分添加至N末端，和/或将一个或多个去稳定的氨基酸(例如，N、K、C、F、E、R、Q)置于多表位的N末端，其中呈递被导向MHC-I。在其他方面，在呈递被导向MHC-II的情况下，可以将特定内吞体或溶酶体蛋白酶的切割位点工程化为多表位，以此有助于促进抗原加工。
因此，在本发明主题的预期方面，信号和/或前导肽可用于将新表位和/或多表位运输至内吞体和溶酶体区室，或用于保留在细胞质空间中。例如，在将多表位输出至内吞体和溶酶体区室的情况下，可以使用前导肽(例如CD1b前导肽)，以从细胞质中隔离(新生的)蛋白质。另外地或可替代地，可以采用靶向前序列和/或靶向肽。可以将靶向肽的前序列添加至N末端和/或C末端，并且典型地包含在6-136个之间的碱性氨基酸和疏水性氨基酸。在过氧化物酶体靶向的情况下，靶向序列可以在C末端处。可以使用其他信号(例如，信号斑)，并且包括在肽序列中分离并在适当的肽折叠后起作用的序列元件。另外，诸如糖基化的蛋白质修饰可以诱导靶向。在其他适合的靶向信号中，诸位发明人预期过氧化物酶体靶向信号1(PTS1)(C末端三肽)，和过氧化物酶体靶向信号2(PTS2)(是位于N末端附近的九肽)。
另外，还可以通过蛋白质的胞质溶胶结构域内的信号来介导蛋白质向内吞体和溶酶体的分拣，这些信号通常包含短的线性序列。一些信号被称为基于酪氨酸的分拣信号，并且符合NPXY或
Figure BPA0000278822310000231
共有基序。称为基于双亮氨酸的信号的其他信号也适合[DE]XXXL[LI]或DXXLL共有基序。所有这些信号都被与膜的胞质溶胶表面外围相关的蛋白质外壳的成分所识别。/>
Figure BPA0000278822310000232
和[DE]XXXL[LI]信号被衔接蛋白(AP)复合体AP-1、AP-2、AP-3和AP-4识别为具有特征性精细特异性，然而DXXLL信号则被另一个称为GGA的衔接蛋白家族识别。还可以添加FYVE结构域，该结构域与液泡蛋白分选和内吞体功能相关联。在仍进一步的方面，使用人CD1尾序列还可以靶向内吞体区室(参见，例如，Immunology[免疫学]，122，522-531)。例如，如更详细地在下文中显示，使用LAMP1-TM(跨膜)序列可以实现溶酶体靶向；而循环内吞体可以经由CD1a尾靶向序列来靶向；并且分选内吞体可以经由CD1c尾靶向序列来靶向。
运输至或保留在胞质溶胶区室中不一定需要一种或多种特定的序列元件。然而，在至少一些方面，可以添加N或C末端细胞质保留信号，包括膜锚定蛋白或膜锚定蛋白的膜锚定结构域，使得该蛋白质被保留在面向胞质溶胶的细胞中。例如，膜锚定蛋白包括SNAP-25、突触融合蛋白、小突触泡蛋白(synaptoprevin)、突触结合蛋白、囊泡相关膜蛋白(VAMP)、突触囊泡糖蛋白(SV2)、高亲和力胆碱转运蛋白、神经毒素、电压门控钙通道、乙酰胆碱酯酶和NOTCH。
在仍进一步考虑的本发明主题的方面，多表位还可包含一个或多个跨膜片段，该跨膜片段将在加工后将新表位引导至细胞膜的外部，以此使其对免疫感受态细胞可见。存在本领域已知的许多跨膜结构域，并且所有这些均被认为适合用于本文，包括具有单个α螺旋、多个α螺旋、α/β桶形结构等的那些跨膜结构域。例如，预期的跨膜结构域可以包含T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR或PAG/Cbp的α、β或ζ链的一个或多个跨膜区域。当需要融合蛋白时，预期重组嵌合基因具有编码一个或多个跨膜区的第一部分，其中将第一部分与编码抑制蛋白的第二部分框内克隆。应注意，这种呈递将不会导致MHC复合体的呈递，并因此提供了不依赖于MHC/T细胞受体相互作用的新表位呈递，这可能进一步为免疫识别和触发针对新表位的抗体产生开辟了另外的途径。
可替代地或另外地，多表位也可以被设计成包括用于一种或多种新表位的蛋白质输出的信号序列，从而迫使转染的细胞产生并分泌一种或多种新表位。例如，可以将SPARC前导序列添加至新表位或多表位序列，导致新表位或多表位序列在体内分泌到细胞外空间。有利地，此类分泌的新表位或多表位然后被免疫感受态细胞(并且尤其是抗原呈递细胞和树突状细胞)吸收，这些抗原呈递细胞和树突状细胞通常进而经由MHC-II途径加工和展示新表位。
在仍进一步预期的方面，还可以将多表位设计为嵌合多表位，该嵌合多表位包括至少一部分，并且更典型地整个肿瘤相关抗原(例如，CEA、PSMA、PSA、MUC1、AFP、MAGE、HER2、HCC1、p62、p90等)。最值得注意地，通常经由MHC-II途径加工和呈递肿瘤相关抗原。因此，代替使用区室特异性信号序列和/或前导序列，可以将用于肿瘤相关抗原的加工机制用于MHC-II靶向。
因此，应当理解，可以制备免疫治疗组合物，该免疫治疗组合物可以将一个或多个新表位递送至多种亚细胞位置，并产生不同免疫应答。例如，现有技术图3示意性地说明了多表位主要在细胞质的蛋白酶体中加工并经由MHC-I复合体呈递的情况，该复合体被CD8+T细胞的T细胞受体识别。因此，将多表位加工靶向胞质溶胶区室将使免疫应答向CD8+型应答偏斜。在其他方面，现有技术图4示意性地说明了多表位主要在内吞体区室中加工并经由MHC-II复合体呈递的情况，该复合体被CD4+T细胞的T细胞受体识别。因此，将多表位加工靶向内吞体或溶酶体区室将使免疫应答向CD4+型应答偏斜。另外，应当理解，此类靶向方法允许将多表位或新表位肽特异性递送至与该肽具有最高亲和力的MHC亚型，即使该肽将不会由该MHC亚型呈递。因此，如前所述，用于MHC-I呈递的肽将通常被设计为具有8-12个氨基酸(加上用于蛋白酶加工的灵活性的另外的氨基酸)，而用于MHC-II呈递的肽将被设计为具有14-20个氨基酸(加上用于蛋白酶加工的灵活性的另外的氨基酸)。在一些实例中，添加另外的氨基酸以允许细胞质、蛋白酶体或内吞体区室中的加工灵活性。
在本发明主题的仍进一步预期的方面，应注意，可以将新表位或多表位的运输模式组合以适应一个或多个特定的目的。例如，依次施用具有不同靶向的相同新表位或多表位在初免-加强免疫方案中特别有利，其中在首次施用时，用重组病毒对患者接种以感染患者细胞，导致抗原表达、加工和呈递(例如，主要为MHC-I呈递)，将导致源自细胞内的第一免疫应答。然后可将与白蛋白结合的相同新表位的第二次施用用作加强免疫，因为如此递送的蛋白质被抗原呈递细胞吸收，从而在大多数情况下导致不同的抗原呈递(例如，主要为MHC-II呈递)。当将相同的新表位或多表位运输到细胞表面用于细胞表明结合的MHC非依赖性呈递时，则可促进ADCC应答或NK介导的细胞杀伤。在仍进一步预期的方面，并且如以下实例所说明的，新表位的免疫原性可通过交叉呈递或MHC-II引导的呈递得到增强。值得注意地，由于癌症细胞新表位通常在内部产生和再循环，并且优先通过MHC-I系统呈递，因此考虑的系统和方法现在允许经由MHC-II呈递此类新表位，如下文更详细的显示，这些新表位可能更具免疫原性。另外，由于对细胞和体液免疫系统的各种不同成分的刺激，相同的新表位或多表位的多种不同的运输可以有利地增加或补充免疫应答。
当然，应当理解，可以按多种方式实现相同的新表位或多表位的多种不同运输。例如，使用相同的(例如，病毒表达载体)或不同的(例如，病毒表达载体和白蛋白结合)模式，可以分别施用不同运输的新表位或多表位。类似地，并且尤其是当治疗剂是表达系统(例如，病毒的或细菌的)时，重组核酸可以包含两个不同的部分，这两个不同的部分编码相同的，尽管不同运输的新表位或多表位(例如，第一部分运输至第一位置(例如，胞质溶胶或内吞体或溶酶体的)，第二部分运输至第二个不同的位置(例如，胞质溶胶或内吞体或溶酶体，分泌的、膜结合))。同样，第一次施用可以采用细胞质靶向的新表位或多表位的病毒递送，而第二次施用是典型地在第一次施用后至少一天、两天、四天、一周或两周，并且可以采用内吞体或溶酶体靶向的或分泌的新表位或多表位的病毒递送。
另外，应当理解，在重组核酸用于DNA疫苗、细菌疫苗或酵母疫苗的情况下，这些模式的摄取方式将至少部分地指示细胞内运输。最典型地，DNA疫苗、细菌疫苗或酵母疫苗是通过内吞或相关过程摄取的，并因此将优先被送到内吞体或溶酶体区室。使用已经如上所述的合适的运输信号或通过使用细胞质保留序列来抵消，可以进一步增强这种途径选择(至少在DNA疫苗的情况下)。然而，在其他实施例中，应当理解，经由DNA疫苗、细菌疫苗或酵母疫苗递送的多表位根本不需要具有运输信号。然后，将经由MHC-II系统优先处理/呈递此类多表位。
另外地，预期表达构建体(并且尤其是针对DNA疫苗的重组病毒表达载体或DNA质粒)，可以进一步编码至少一个、更典型地至少两个、甚至更典型地至少三个，并且最典型地至少四个共刺激分子，以增强感染的细胞(例如，抗原呈递细胞)和T细胞之间的相互作用。例如，适合的共刺激分子包括CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL，而具有较少定义的(或理解)作用机制的其他刺激分子包括GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1、LFA3和SLAM家族成员。然而，用于与癌症相关联的序列协同表达的尤其优选的分子包括CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD54(ICAM-1)和CD11(LFA-1)。除共刺激分子之外，诸位发明人还预期一种或多种细胞因子或细胞因子类似物可以从重组核酸表达，并且尤其优选的细胞因子和细胞因子类似物包括IL-2、IL-15和IL-a5超激动剂(ALT-803)。而且，应当理解，共刺激分子和/或细胞因子的表达将优选地是协同的，使得新表位或多表位与一种或多种共刺激分子和/或细胞因子同时表达。因此，典型地预期，例如，使用内部核糖体进入位点或2A序列，从单个转录物(可以包括或可以不包括编码多表位的序列部分)或从多个转录物产生共刺激分子和/或细胞因子。
同样，预期病毒载体还可包含编码与检查点受体结合的一种或多种肽配体的序列部分。最典型地，结合将抑制或至少减少经由受体的信号传导，并且特别预期的受体包括CTLA-4(尤其是针对CD8+细胞)、PD-1(尤其是针对CD4+细胞)、TIM1受体、2B4和CD160。例如，适合的肽结合剂可包括特异性结合受体的抗体片段以及尤其是scFv，还有小分子肽配体(例如，经由RNA展示或噬菌体淘选分离)。再次，应当理解，肽分子的表达将优选地是协同的，使得新表位或多表位与一种或多种肽配体同时表达。因此，典型地预期，例如，使用内部核糖体进入位点或2A序列，从单个转录物(可以包括或可以不包括编码多表位的序列部分)或从多个转录物产生肽配体。
应当理解，上述所有的共刺激基因和编码干扰/下调检查点抑制的抑制蛋白的基因是本领域熟知的，并且这些基因、同种型和变体的序列信息可以从各种公共资源(包括在NCBI、EMBL、GenBank、RefSeq等可访问的序列数据库)检索。而且，尽管上述示例性刺激分子优选以在人中表达的全长形式表达，但是经修饰的和非人形式也被认为是适合的，只要此类形式有助于刺激或活化T细胞。因此，本文明确预期了截短形式和嵌合形式的突变蛋白。
因此，预期的表达构建体将优选地包括编码一个或多个多表位的序列部分，其中至少一个，并且更典型地至少两个或所有的多表位将包括运输信号，该运输信号将导致多表位优先运输到至少一个，并且更典型地至少两个不同的亚细胞位置。例如，该第一多表位可以被导向细胞质(并且可以包括另外可切割的或不可切割的泛素)，而该第二多表位可以被导向内吞体或溶酶体区室。或者，该第一多表位可以被导向内吞体或溶酶体区室，而该第二多表位可以被导向细胞膜或被分泌。如前所述，经编码的多表位将包含至少两个(任选地由接头隔开的)新表位。而且，此类预期的表达构建体还将包括编码一种或多种共刺激分子和/或细胞因子的序列部分，并且还可以包括干扰/下调检查点抑制的一种或多种抑制蛋白。最典型地，表达构建体还将包括与上述序列部分可操作地偶联以驱动多表位和共刺激分子、细胞因子和/或抑制蛋白同时表达的调节序列。适合的启动子元件是本领域已知的，并且尤其优选的启动子包括以上讨论的组成型启动子和诱导型启动子。
疫苗组合物
在鉴定出所希望的新表位后，可以使用新表位的序列信息制备一种或多种免疫治疗剂，优选将其配置为如上所述的多表位。优选地，免疫治疗剂包括：至少两种DNA疫苗，该DNA疫苗包括编码存在于肿瘤中的至少一种抗原(以及更典型地至少两种、三种、四种或更多种抗原)的重组核酸；细菌疫苗，其中细菌表达存在于肿瘤中的至少一种抗原(以及更典型地至少两种、三种、四种或更多种抗原)；酵母疫苗，其中细菌表达存在于肿瘤中的至少一种抗原(以及更典型地至少两种、三种、四种或更多种抗原)；以及病毒疫苗，该病毒疫苗包含含有重组核酸的病毒表达载体，该重组核酸编码存在于肿瘤中的至少一种抗原(以及更典型地至少两种、三种、四种或更多种抗原)。
关于用于表达和DNA疫苗接种系统的重组核酸，预期重组核酸可以是RNA或DNA。关于导致肿瘤抗原和/或新表位表达的RNA、DNA或其他重组载体的使用，尤其预期的核酸包括可以是超螺旋、卷曲的、松弛的或甚至线性化的质粒载体。例如，并且在其他合适的选择中，预期的载体包括用于克隆在制备病毒表达载体中使用的一个或多个序列部分的载体。因此，尤其预期的载体包括转移载体或穿梭载体，以及各种通用的克隆载体(例如，具有细菌复制起点、选择标记(例如，抗生素抗性或荧光蛋白)和多克隆位点)。适合的载体是本领域熟知的，并且典型地基于在细菌中具有复制能力以便大量克隆和生产的质粒。适当的载体选择可以通过以下内容被进一步确定：通过其特定用途(例如，针对腺病毒、慢病毒、或杆状病毒等的穿梭载体)；诱导型启动子或组成型启动子(例如，CMV、UbC)的选择；永久性或瞬时表达的选择；转染方式(例如，脂质转染、电穿孔等)、重组有效负载的容量等。
仍应当进一步注意，质粒可以是甲基化的或未甲基化的，这可以通过直接的酶促体外反应或更简单地通过在甲基化感受态的或甲基化缺陷的宿主中体内复制质粒来控制。仍另外地，应该理解，质粒可以进一步具有一个或多个已知触发先天性免疫应答的核酸部分(例如，CpG岛或与Toll样受体(如TLR3、TLR 7、TLR 8、TLR 9)、RIG-I样受体、STING、和/或细胞内DNA传感器(如NLRP3/CIAS1)相互作用的其他序列基序)。
最典型地，并且如上所述，预期的质粒和其他核酸将包括一种或多种编码优选患者和肿瘤特异性新表位或多表位的序列元件，最优选地与调节元件可操作地偶联，这些调节元件允许或驱动真核细胞(并且尤其是哺乳动物(例如，人)细胞)中新表位或多表位的表达。而且，应注意，还如本文中所讨论的，新表位或多表位可包括用于将肽送到所希望的亚细胞位置的运输信号。因此，尤其优选的质粒包括在病毒表达载体的生产中使用的质粒，并因此将已经包括在哺乳动物细胞中用于表达和/或运输多表位所需的所有调节元件。因此，克隆载体和穿梭载体是尤其优选的。
如将理解的，可以按本领域已知的多种方式施用本文预期的质粒，并且适合的递送模式包括注射(肌内、静脉内、真皮内)，经由基因枪递送或其他弹道转移，或通过脂质体介导的转移。因此，预期的组合物将特别地包括可注射配制品，该配制品包含核酸脂质复合体和其他DNA-脂质或DNA脂蛋白复合体。有利地，递送的选择可用于极化针对Th1(经由使用盐水注射)或Th2(经由基因枪递送)应答的免疫应答，如其他地方所述(参见，例如，JImmunol[免疫学杂志]1997年3月1日，158(5)2278-2284)。在尤其优选的方面，如下文更详细讨论的，用DNA疫苗接种将优选地通过静脉内注射进行，然而，其他途径(包括肌内、真皮内、皮下、动脉内)也被认为适合用于本文，而施用病毒表达载体(典型地使用重组病毒)将优选地通过皮下注射进行。
不希望被任何特定理论或假设所束缚，据信使用质粒和其他“裸”核酸(例如线状DNA RNA)将提供产生免疫应答的第一个机会，该免疫应答对患者的新表位是非特异性的或特异性的。非特异性反应被认为是由针对外源核酸(例如，其中核酸是未甲基化的(例如，经由TLR-9))的先天性免疫应答的组分引起的。另外，在用质粒转染的细胞中新表位或多表位的表达也将促进适应性免疫应答。
除了使用DNA疫苗接种，预期的质粒还可以用于生产病毒或酵母表达载体，该病毒或酵母表达载体可用于产生以便随后施用于患者的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒)或酵母。当质粒用于产生酵母或病毒表达系统时，所有已知的表达系统均被认为适合用于本文。例如，可以在非营利性质粒储存库Addgene或在AdEasy腺病毒载体系统(可从安捷伦公司(Agilent)商购)中找到合适的材料和方案。类似地，存在本领域中已知的多种酵母表达系统，并且所有这些表达系统被认为适合用于本文。可以将这种第二次施用视为对DNA疫苗接种的加强免疫方案，因为哺乳动物已经被质粒载体引发。当然，应当认识到，在初免疫苗接种是用如上所述质粒的DNA疫苗接种的情况下，加强免疫可以使用多种可替代的形式(包括使用更常规的疫苗配制品，用新表位肽或多表位的疫苗接种)。另外适合的DNA疫苗描述于例如US 2014/0178438中。
关于细菌表达和疫苗接种系统，预期所有的细菌菌株均被认为是适合的，并且尤其包括来自沙门氏菌属(Salmonella)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等的物种，特别地在此类菌株是非致病的情况下，经基因工程化以具有降低的毒性，和/或在施用前进行辐照。从历史上讲，大多数细菌菌株已经被认为不适合引入血流或移植到器官或组织中，因为大多数细菌表达脂多糖，脂多糖触发免疫应答并引起内毒素应答，从而可能导致患者出现有可能致命的败血症(例如，CD-14介导的败血症)。因此，一种尤其优选的细菌菌株是基于经遗传修饰的细菌，该细菌按以下水平表达内毒素，当引入人体中时，该水平足够低不引起人细胞中的内毒素应答和/或不足以诱导CD-14介导的败血症。
一种优选的细菌物种是经遗传修饰的大肠杆菌(E.coli)菌株，因为其快速生长(例如，在20分钟内完成一个完整的细胞周期)，和许多针对诱导(例如，用IPTG的lac启动子诱导等)后蛋白质过表达而优化的菌株的有效性。最典型地，遗传修饰将减少或去除导致内毒素应答的大多数脂多糖组分的产生。例如，具有经修饰的脂多糖合成的一种示例性细菌菌株包括
Figure BPA0000278822310000301
BL21(DE3)电感受态细胞。该细菌菌株是BL21，具有基因型F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm lonλ(DE3[lacI lacUV5-T7基因1 ind1 sam7 nin5])msbA148 ΔgutQΔkdsD ΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA。在该上下文中，应理解，若干个特定的缺失突变(ΔgutQ ΔkdsD ΔlpxL ΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA)编码LPS对脂质IVA的修饰，而一个另外的补偿突变(msbA148)使得细胞能够在LPS前体脂质IVA的存在下维持生活力。这些突变导致寡糖链从LPS中缺失。更具体地，六个酰基链中的两个发生缺失。LPS的六个酰基链是触发物，通过Toll样受体4(TLR4)与髓样分化因子2(MD-2)复合被识别，从而引起
Figure BPA0000278822310000302
的激活和促炎细胞因子的产生。仅包含四个酰基链的脂质IVA未被TLR4识别，并因此不会触发内毒素应答。尽管提供电感受态BL21细菌作为实例，诸位发明人预期经遗传修饰的细菌也可以是化学感受态细菌。
可替代地，诸位发明人还预期患者自身的内共生细菌可以被用作媒介物，以在体内表达人疾病相关的抗原，从而至少局部地引起免疫应答。如本文所使用的，患者的内共生细菌是指存在于患者体内的细菌，而与患者的健康状况无关，没有引起任何实质性的免疫应答。因此，预期患者的内共生细菌是患者的正常菌群。例如，患者的内共生细菌可以包括通常在人的肠或胃中发现的大肠杆菌或链球菌属。在这些实施例中，患者自身的内共生细菌可以从来自一部分肠、胃、口腔粘膜或结膜的活检样品或粪便样品中获得。然后可以在体外培养患者的内共生细菌，并用编码一种或多种人疾病相关抗原的核苷酸转染。
因此，应理解，本文提出的方法中使用的细菌可以来自产生LPS的菌株，或经基因工程化以减少或消除一种或多种导致LPS形成的酶表达的菌株，该LPS由TLR(并且特别地TLR4)识别。最典型地，这种细菌将被遗传修饰以按诱导型方式表达用于免疫疗法的至少一种人疾病相关抗原。在其他选择中，可以用哺乳动物中不常见的合成化合物(例如，IPTG、取代的苯、环己酮相关化合物)或用哺乳动物中天然存在的化合物(例如，糖(包括1-阿拉伯糖、1-鼠李糖、木糖和蔗糖)、ε-己内酰胺、丙酸酯或肽)来诱导表达，或者诱导可能受一种或多种环境因子(例如，温度或氧敏感启动子)的控制。
可以将编码肿瘤抗原或多表位的预期的重组核酸插入具有特异性启动子(例如，诱导型启动子等)的表达载体中，以驱动抗原或多表位在细菌中表达。然后根据常规方法，将载体转染到细菌(例如，
Figure BPA0000278822310000311
BL21(DE3)电感受态细胞)或任何其他类型的感受态细菌(当被引入人体时该感受态细菌以不足以诱导CD-14介导的败血症的低内毒素水平表达)，或转染到如上所述任选地在转化前在体外培养的患者自身内共生细菌中。
关于酵母表达和疫苗接种系统，预期所有已知的酵母菌株均被认为适合用于本文。然而，优选的是，酵母是如上所讨论的用核酸构建体遗传修饰的重组酵母属菌株，导致至少一种肿瘤抗原的表达，从而引发针对肿瘤的免疫应答。然而，应注意，可以将任何酵母菌株用于产生本发明的酵母媒介物。酵母是属于以下三类中之一的单细胞微生物：子囊菌(Ascomycetes)、担子菌(Basidiomycetes)和不完全菌(Fungi Imperfecti)。对用作免疫调节剂的酵母类型进行选择的一个考虑因素是酵母的致病性。在优选的实施例中，酵母是非致病性菌株(例如酿酒酵母)，因为非致病性酵母菌株使对施用酵母媒介物的个体的任何不利影响最小化。然而，如果可以通过药物干预消除酵母的致病性，则可以使用致病酵母。
例如，适合的酵母菌株的属包括酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida、Cryptococcus)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和亚罗酵母属(Yarrowia)。在一方面，酵母属选自酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，并且在优选的方面，使用酵母属。可用于本发明的酵母菌株的种类包括酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、乳酸马克斯克鲁维酵母变体(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
应进一步理解，这些物种中的许多物种包括旨在包括在上述物种内的各种亚种、类型、亚型等。在一方面，在本发明中使用的酵母物种包括酿酒酵母(S.cerevisiae)、白色念珠菌(C.albicans)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、毕赤酵母(P.pastoris)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)。酿酒酵母是有用的，因为酿酒酵母相对容易操作并且用作食品添加剂而被“公认安全”或“GRAS”(GRAS，FDA建议的规则62FR18938，1997年4月17日)。因此，诸位发明人特别预期能够将质粒复制至特别高拷贝数的酵母菌株(例如，酿酒酵母环状(cir)菌株)。酿酒酵母菌株是一种这样的菌株，该菌株能够支持表达载体，这些表达载体允许一种或多种靶抗原和/或抗原融合蛋白和/或其他蛋白以高水平表达。另外，任何突变的酵母菌株都可以用于本发明，包括那些表现出降低的表达的靶抗原或其他蛋白质的翻译后修饰的菌株，例如延伸N-联糖基化的酶中的突变。
可以使用本领域技术人员已知的技术来完成酵母中预期的抗原/新表位的表达。最典型地，将编码至少新表位或其他蛋白质的核酸分子插入表达载体，使得该核酸分子与转录控制序列可操作地连接，当转化为宿主酵母细胞时，从而能够影响该核酸分子的组成型或调节性表达。如将容易理解的，编码一种或多种抗原和/或其他蛋白质的核酸分子可以在与一种或多种表达控制序列可操作地连接的一种或多种表达载体上。特别重要的表达控制序列是控制转录起始的那些序列(例如启动子和上游激活序列)。
任何适合的酵母启动子都可用于本发明，并且多种此类启动子对于本领域技术人员而言是已知的，并且已在上文进行了一般性讨论。在酿酒酵母中用于表达的启动子包括编码以下酵母蛋白的基因的启动子：醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、翻译延伸因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；还被称为TDH3，用于磷酸丙糖脱氢酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿嘧啶转移酶(GAL7)、UDP-半乳糖表异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括杂合启动子，如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子，并且包括ADH2/GAPDH启动子(当细胞中葡萄糖浓度低(例如，约0.1％至约0.2％)时被诱导)，以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样，已知许多上游激活序列(UAS)(也被称为增强子)。用于在酿酒酵母中表达的上游激活序列包括编码以下蛋白质的基因的UAS：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及由GAL4基因产物激活的其他UAS，其中在一方面使用ADH2UAS。由于ADH2UAS被ADR1基因产物激活，当异源基因与ADH2UAS可操作地连接时，可能更优选过表达ADR1基因。用于在酿酒酵母中表达的转录终止序列包括α-因子、GAPDH和CYC1基因的终止序列。在甲基营养型酵母中表达基因的转录控制序列包括编码醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录控制区。
同样，根据本发明，可以通过任何方法来完成将核酸分子转染到酵母细胞中，通过该方法将核酸分子施用到细胞中，并且包括扩散、主动转运、浴超声处理、电穿孔、微注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。可以使用本领域技术人员已知的技术将转染的核酸分子整合到酵母染色体中，或维持在染色体外载体上。如上所讨论的，还可以通过用所希望的核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球，在其中产生抗原，并然后使用对于本领域技术人员已知的技术进一步处理这些微生物或原生质球，以产生包含所希望的抗原或其他蛋白质的细胞质、菌壳或亚细胞酵母膜提取物或其级分，重组产生酵母细胞质、酵母菌壳和酵母膜颗粒或细胞壁制剂。适合在本文中使用的另外的示例性酵母表达系统、方法和条件描述于US 20100196411 A1、US 2017/0246276、或US 2017/0224794和US 2012/0107347中。
关于病毒表达和疫苗接种系统，预期所有的治疗性重组病毒表达系统均被认为适合用于本文，只要此类病毒能够导致重组有效负载在经感染的细胞中表达。例如，适合的病毒包括经遗传修饰的α病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，腺病毒是特别优选的。例如，优选经遗传修饰的腺病毒，该腺病毒不仅适合于多次疫苗接种，而且还适合于在对腺病毒具有预先存在的免疫力的个体中进行疫苗接种(参见，例如，WO 2009/006479和WO 2014/031178)，典型地通过使E2b基因和其他完全蛋白缺失来降低免疫原性。而且，由于这些特定的缺失，此类经遗传修饰的病毒是复制缺陷的，并允许用于相对较大的重组货物。例如，WO 2014/031178描述了使用此类经遗传修饰的病毒以表达CEA(结肠直肠胚胎抗原)，从而提供针对结肠癌的免疫反应。而且，如已报道的，使用经遗传修饰的人293细胞可以实现相对高滴度的重组病毒(例如，J Virol.[病毒学杂志]1998年2月；72(2)：926-933)。
无论重组病毒的类型如何，预期可以将该病毒用于在离体或体内感染患者(或非患者)细胞。例如，可以将该病毒皮下或静脉内注射，或可以经鼻内或经吸入施用以此感染患者细胞(并且尤其是抗原呈递细胞)。可替代地，可以在体内感染患者的(或来自同种异体来源)免疫感受态细胞(例如，NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)，并然后输送至患者。可替代地，免疫疗法不必依赖病毒，但可以受到使用RNA或DNA，或导致新表位(例如，作为单一肽，串联小基因等)在所希望的细胞(并且尤其是免疫感受态细胞)中表达的其他重组载体，用核酸转染或疫苗接种的影响。
如上所述，所希望的核酸序列(用于从病毒感染的细胞中表达)在本领域熟知的合适的调节元件的控制下。例如，适合的启动子元件包括组成型强启动子(例如，SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK、CAGG启动子)，但诱导型启动子也被认为适合用于本文，特别是在对于肿瘤微环境典型的诱导条件下。例如，诱导型启动子包括对缺氧敏感的启动子和对TGF-β或IL-8敏感的启动子(例如，经由TRAF、JNK、Erk，或其他应答元件启动子)。在其他实例中，适合的诱导型启动子包括四环素-诱导型启动子，粘病毒抗性1(Mx1)启动子等。
可替代地或另外地，应当认识到抗原/新表位或多表位还可以作为肽被施用，任选地与载体蛋白结合以此充当肽疫苗。在其他适合的载体蛋白中，人白蛋白或乳铁蛋白是特别优选的。此类载体蛋白可以处于天然的构象，或被预处理以形成具有暴露的疏水性结构域的纳米颗粒(参见，例如，Adv Protein Chem Struct Biol.[蛋白质化学和结构生物学的进展]2015；98：121-43)，新表位或多表位可以与此类载体蛋白偶联。最典型地，新表位或多表位与载体蛋白的偶联将是非共价的。类似于分泌的新表位或多表位，结合载体蛋白的新表位或多表位将被免疫感受态细胞(并且尤其是抗原呈递细胞和树突状细胞)吸收，这些抗原呈递细胞和树突状细胞通常进而经由MHC-II途径加工和展示新表位。
配制品
在疫苗是病毒疫苗(例如，腺病毒，并且尤其是具有E1和E2b缺失的AdV)的情况下，然后预期重组病毒在药物组合物中可以单独地或组合地用作治疗性疫苗，该药物组合物典型地被配制为无菌可注射组合物，其中病毒滴度为106-1013个病毒颗粒/剂量单位，并且更典型地在109-1012个病毒颗粒/剂量单位。可替代地，可以离体采用病毒感染患者(或其他HLA匹配的)细胞，并且然后将如此感染的细胞输送给患者。在进一步的实例中，用病毒治疗以下患者，具有可以伴有同种异体移植、或自体自然杀伤细胞、或处于裸露形式的T细胞或携带表达靶向新表位的抗体、新表位、肿瘤相关抗原或与该病毒相同的有效负载的嵌合抗原受体的T细胞。包括来自患者的NK-92细胞系的自然杀伤细胞还可以表达CD16，并且可以与抗体偶联。
类似地，在疫苗是细菌或酵母疫苗的情况下，优选在施用前辐照细菌或酵母细胞以防止进一步繁殖。最典型地，以药物组合物中的治疗性疫苗形式施用，典型地被配制为无菌可注射的组合物，其中细胞滴度为106-109个细胞/剂量单位，并且更典型地108-1011个细胞/剂量单位。最优选地，将疫苗配制品在肌内、皮下或瘤内施用。DNA疫苗将通常如本领域熟知的那样施用，优选地通过在缓冲溶液中作为药物组合物静脉内注射DNA来进行。尽管不限于本发明主题，DNA的总剂量/施用将典型地在0.1mcg至几十mg的范围内，或在10mcg至几千mcg的范围内。
在需要时，可以采用基于新表位的(例如，如WO 2016/172722中所述针对新表位的合成抗体)，单独地或与自体或同种异体NK细胞，并且尤其是haNK细胞或taNK细胞(例如，二者均可从NantKwest公司，9920杰弗逊大街卡尔弗城(Jefferson Blvd.Culver City)，加利福尼亚州90232商购)组合的另外的治疗模式。在采用haNK或taNK细胞的情况下，特别优选的是，haNK细胞在CD16变体上携带与所治疗的患者的新表位结合的重组抗体，并且在采用taNK细胞的情况下，优选的是taNK细胞的嵌合抗原受体与所治疗的患者的新表位结合。另外的治疗模式还可以不依赖新表位，并且尤其优选的模式包括基于细胞(例如激活的NK细胞(例如，aNK细胞，可从NantKwest公司，9920杰弗逊大街卡尔弗城，加利福尼亚州90232商购))的疗法；以及非基于细胞的疗法(例如，化学疗法和/或放射疗法)。在仍进一步预期的方面，可以单独地或与一种或多种检查点抑制剂(例如，伊匹木单抗、纳武单抗等)组合施用免疫刺激细胞因子(并且尤其是IL-2、IL15和IL-21)。类似地，仍进一步预期，另外的药物干预可以包括施用一种或多种抑制免疫抑制性细胞(并且尤其是MDSC、Treg和M2巨噬细胞)的药物。因此，适合的药物包括IL-8或干扰素-γ抑制剂或结合IL-8或干扰素-γ的抗体；以及使MDSC失活的药物(例如，NO抑制剂、精氨酸酶抑制剂、ROS抑制剂)；阻断细胞发育或分化为MDSC的药物(例如，IL-12、VEGF抑制剂、双膦酸盐)；或对MDSC有毒性的药剂(例如，吉西他滨、顺铂、5-FU)。同样，可以使用诸如环磷酰胺、达利珠单抗和抗GITR或抗OX40抗体的药物来抑制Treg。
方案
因此，诸位发明人考虑用本文预期的组合物用于治疗的多种示例性策略。最典型地，治疗将包括以顺序方式施用的至少两种或至少三种不同的疫苗模式。例如，在一些实施例中，初始施用将是DNA疫苗施用，随后是细菌疫苗施用。细菌疫苗可以任选地在酵母疫苗之后。在细菌或酵母疫苗施用之后，然后可以施用病毒疫苗。在另一个实例中，初始施用将是细菌疫苗施用，任选地随后是酵母疫苗施用。在细菌或酵母疫苗施用之后，然后可以施用病毒疫苗。在仍另一个实例中，初始施用将是DNA疫苗施用，随后是病毒疫苗施用。如将容易理解地，可以根据需要将每种模式施用一次或重复施用。例如，可以将DNA疫苗给予一次，而随后的细菌疫苗和/或酵母疫苗可以在开始施用病毒疫苗之前施用两次、三次或更多次。类似地，可以在病毒疫苗组合物之前施用多种细菌或酵母疫苗组合物。以相同的方式，可以将DNA疫苗、细菌疫苗和/或酵母疫苗给予一次，并且可以将病毒疫苗给予多次。因此，应注意，在初免/加强免疫方案中，初免疫苗接种可以使用与加强免疫疫苗接种不同的模式(例如，DNA疫苗、细菌疫苗或酵母疫苗接种作为初免，病毒疫苗接种作为加强免疫)。
还应该进一步认识到，将特定模式的施用间隔几天，以允许免疫应答得以发展。最典型地，第一次施用将与第二次施用间隔至少两天、更典型地至少四天、甚至更典型地至少一周，并且最典型地两周或甚至更长时间。而且，应注意，患者的免疫系统还可以使用免疫刺激细胞因子(例如，IL-2、IL-15、IL-21)或细胞因子类似物(例如，ALT-803)预处理；使用检查点抑制剂或Treg或M2巨噬细胞抑制剂以减少免疫抑制；或使用细胞因子来支持免疫应答，并产生免疫记忆(例如，IL-12)。
如本文所使用的，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)。最优选地，重组病毒经由皮下或真皮下注射施用。然而，在其他预期的方面，施用还可以是静脉内注射。可替代地或另外地，可以从患者的细胞中分离抗原呈递细胞或使其生长，在体外感染，并然后输送至患者。因此，应理解，可以将预期的系统和方法视为用于高度个性化癌症治疗的完整药物探索系统(例如，药物探索、治疗方案、验证等)。如还应理解，可以随时间重复预期的治疗，特别是在新颖的新表位已经出现的情况下(例如，作为克隆扩增的结果)。
而且，应注意，可以实施另外的治疗方案以辅助预期的方法和组合物。将优选地进行此类另外的治疗方案以增加肿瘤对免疫系统的‘可见性’。例如，为触发应激信号的过表达或转录，预期可以按低剂量方案、优选以节律方式采用化学疗法和/或放射疗法。例如，通常优选这样的治疗将使用有效影响蛋白质表达、细胞分裂和细胞周期中至少一种的剂量，优选诱导细胞凋亡或至少诱导或增加应激相关基因的表达(并且特别是NKG2D配体)。因此，在另外预期的方面，这种治疗将包括使用一种或多种化学治疗剂的低剂量治疗。最典型地，针对化学治疗剂，低剂量治疗的暴露量将是LD50或IC50的等于或小于70％、等于或小于50％、等于或小于40％、等于或小于30％、等于或小于20％、等于或小于10％、或等于或小于5％。另外地，在有利的情况下，这种低剂量方案可以按如例如在US 7758891、US 7771751、US 7780984、US 7981445和US 8034375中所述的节律方式进行。
关于在低剂量方案中使用的特定药物，预期所有的化学治疗剂均被认为是合适的。在其他适合的药物中，激酶抑制剂、受体激动剂和拮抗剂、抗代谢药物、细胞抑制剂和细胞毒性药物在本文中均被预期。然而，特别优选的药剂包括那些被鉴定为干扰或抑制驱动肿瘤生长或发育的途径组分的试剂。可以使用例如WO 2011/139345和WO 2013/062505中所述的对组学数据的途径分析来鉴定适合的药物。最值得注意地，如此获得的肿瘤细胞中应激相关基因的表达将导致NKG2D、NKP30、NKP44和/或NKP46配体的表面呈递，该表面呈递进而激活NK细胞以特异性破坏肿瘤细胞。因此，应理解可以将低剂量化学疗法用作肿瘤细胞中的触发物，以表达和展示压力相关的蛋白质，这进而将触发NK细胞激活和/或NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤。另外地，NK细胞介导的杀伤将与细胞内肿瘤特异性抗原的释放相关联，这被认为可以进一步增强免疫应答。
实例
示例性序列排列
如例如在US 2012/0059670和US 2012/0066001中披露的，使用BAM文件和BAM服务器，通过肿瘤和常态样品的位置引导的同步比对，由计算机模拟确定新表位序列。具体地，进行DNA分析的肿瘤来自B16-F10小鼠黑色素瘤系，并且匹配的常态对照是来自C57b1/6亲本小鼠DNA的血液。通过对该肿瘤细胞系进行RNA测序，将这些结果过滤用于表达。对发现表达的新表位进一步分析针对鼠MHC-I(此处为Kb)和MHC-II(此处为I-Ab)的结合亲和力。在dbSNP过滤的另外的步骤后，使用然后通过权重矩阵和神经网络预测处理的所有新表位的位置置换，对所选择的结合物(具有等于或小于200nM的亲和力)进行进一步分析，以产生代表存在疏水序列或信号肽的存在和/或强度可能性的得分。将针对多表位(未显示)的最佳得分排列(疏水序列或信号肽的最低可能性)用于进一步的实验。通过在RNAseq或其他定量系统中进行检测来将新表位优先化，该定量系统会针对具有新表位突变的特定基因产生表达强度。
表1显示了示例性新表位，其由RNAseq确定，连同基因名称和突变的氨基酸以及突变的氨基酸的位置一起表达。在dbSNP过滤后丢弃用*列出的新表位，因为该新表位在28％的人群中作为变体Rs71257443出现。
表1
基因 位置 新表位-a 新表位-b
VIPR2 V73M GETVTMPCP
LILRB3 T187N VGPVNPSHR*
FCRL1 R286C GLGAQCSEA
FAT4 S1613L RKLTTELTI PERRKLTTE
PIEZO2 T2356M MDWVWMDTT VWMDTTLSL
SIGLEC14 A292T GKTLNPSQT REGKTLNPS
SIGLEC1 D1143N VRNATSYRC NVTVRNATS
SLC4A11 Q678P FAMAQIPSL AQIPSLSLR
表2显示了新表位的另外的实例，其中突变的氨基酸的位置发生了改变，并且显示针对MHC-I呈递(9-mer)和MHC-II呈递(15-mer)的另外可替代的序列。用于MHC-II呈递的新表位序列被反翻译为相应的核酸序列，也显示在表2中。
表2
Figure BPA0000278822310000391
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Figure BPA0000278822310000401
序列运输
模式癌症：使用鼠B16-F10黑色素瘤(衍生自C57/B16小鼠)，在以相对于如上所述正常方式的肿瘤中筛选肿瘤，并在B16F10黑色素瘤细胞系中鉴定了表达的突变表位。使用测序数据分析和与鼠MHC I(H2-Kb，H2-Dd)和MHC II(I-Ab)的结合分析，如上所述进一步过滤候选新表位。然后制备九种不同的多表位构建体用于测试多种运输方案，并且在CMV启动子的控制下将每种构建体制备为相应的重组核酸。将每种构建体克隆到已经缺失E1和E2b基因的AdV5表达载体中，如下文进一步讨论的，然后将所得重组病毒用于转染小鼠。
更具体地，三种多表位构建体包括用于MHC-I呈递的MHC I结合新表位，并因此靶向细胞质区室。尽管一种构建体具有未经修饰的N末端，另一种构建体具有N末端不可切割的泛素，并且又另一种构建体具有N末端的可切割的泛素。将泛素化用于靶向胞质溶胶中的蛋白酶体。三种另外的多表位构建体包括用于MHC-II呈递的MHC I结合新表位，并因此靶向溶酶体区室/内吞体区室。尽管一种构建体具有溶酶体靶向序列，另一种构建体具有循环内吞体靶向序列，并且又另一种构建体具有分选内吞体靶向序列。三种另外的多表位构建体包括用于MHC-II呈递的MHC II结合新表位，并还靶向溶酶体区室/内吞体区室。再次，一种构建体具有溶酶体靶向序列，另一种构建体具有循环内吞体靶向序列，并且又另一种构建体具有分选内吞体靶向序列。这九种构建体具有如下的序列排列。
在以下示例性序列中，对于MHC-I呈递，将泛素(可切割的和不可切割的)用于蛋白酶体靶向，而将CD1b前导肽用作输出前导肽，用于将多肽从所有MHC-II引导的序列的胞质溶胶中运输出去。LAMP1-TM/细胞质尾被用作溶酶体靶向序列，而LAMP1-TM/CD1a尾被用作循环内吞体靶向序列，并且LAMP1-TM/CD1c尾被用作分选内吞体靶向结构域。
应另外注意，在上述多肽中也使用了多种内部对照来说明表达和呈递。更具体地，将SIINFEKL肽用作针对MHC I限制性(Kb)肽表位的内部对照，而将Esat6肽用作针对MHC II呈递的分泌蛋白的内部对照。将FLAG标签用作用于检测表达的内部对照表位，并且将cMYC用作用于简单蛋白质检测的内部对照标签。
针对引导至MHC-I呈递(穿过蛋白酶体，细胞质靶向)的MHC-I表位的示例性构建 体：
仅多表位：12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-cMYC。图5A示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中SIINFEKL基序加了下划线；Esat6基序以斜体显示；并且其中cMY基序以粗体字体显示。图5A的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，并且图5A的多肽序列为SEQ ID NO：4。
多表位和可切割的泛素GGR N末端：泛素-GGR-12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIIN FEKL-AAAA-Esat6-cMYC。图5B示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中可切割的泛素部分以斜体并加下划线显示；SIINFEKL基序加了下划线；Esat6基序以斜体显示；并且其中cMY基序以粗体字体显示。图5B的核苷酸序列为SEQ IDNO：2，并且图5B的多肽序列为SEQ ID NO：5。
多表位和不可切割的泛素G N末端：泛素-G-12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFE KL-AAAA-Esat6-cMYC。图5C示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中可切割的泛素部分以斜体并加下划线显示；SIINFEKL基序加了下划线；Esat6基序以斜体显示；并且其中cMY基序以粗体字体显示。图5C的核苷酸序列为SEQ IDNO：3，并且图5C的多肽序列为SEQ ID NO：6。
针对引导至MHC-II呈递(从细胞质输出，穿过内吞体/溶酶体)的MHC-I表位的示例 性构建体：
Kb表位肽的溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-Flag标签-LAMP1TM/细胞质尾。图6A示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分以粗体显示；Esat6基序加了下划线；Flag标签基序以斜体显示；并且其中LAMP1TM/细胞质尾以粗体/下划线字体显示。图6A的核苷酸序列为SEQ ID NO：7，并且图6A的多肽序列为SEQ ID NO：10。
Kb表位肽的再循环溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-Flag标签-LAMP1TM/CD1a尾。图6B示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分以粗体显示；Esat6基序加了下划线；Flag标签基序以斜体显示；并且其中LAMP1TM基序以粗体/下划线字体显示；并且CD1a靶向基序加了下划线/斜体显示。图6B的核苷酸序列为SEQ ID NO：8，并且图6B的多肽序列为SEQ IDNO：11。
Kb表位肽的分选内吞体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-Flag标签-LAMP1TM/CD1c尾。图6C示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分以粗体显示；Esat6基序加了下划线；Flag标签基序以斜体显示；并且其中LAMP1TM基序以粗体/下划线字体显示；并且CD1c靶向基序加了下划线/斜体显示。图6C的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，并且图6C的多肽序列为SEQ ID NO：12。
针对引导至MHC-II呈递(从细胞质输出，穿过内吞体/溶酶体)的MHC-II表位的示 例性构建体：
IAb表位肽的溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-Flag标签-LAMP1TM/细胞质尾。图7A示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分以粗体显示；SIINFEKL和Esat6基序加了下划线；Flag标签基序以斜体显示；并且其中LAMP1TM/细胞质尾以粗体/下划线字体显示。图7A的核苷酸序列我SEQ ID NO：13，并且图7A的多肽序列为SEQ ID NO：16。
IAb表位肽的再循环溶酶体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-Flag标签-LAMP1TM/CD1a尾。图7B示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分以粗体显示；SIINFEKL和Esat6基序加了下划线；Flag标签基序以斜体显示；其中LAMP1TM基序以粗体/下划线字体显示；并且其中CD1a尾以粗体/斜体显示。图7B的核苷酸序列为SEQ ID NO：14，并且图7B的多肽序列为SEQ IDNO：17。
IAb表位肽的分选内吞体靶向：(CD1b前导肽)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-Flag标签-LAMP1TM/CD1c尾。图7C示例性地描绘了这种排列的多肽结构，其中CD1b前导肽部分以粗体显示；SIINFEKL和Esat6基序加了下划线；Flag标签基序以斜体显示；其中LAMP1TM基序以粗体/下划线字体显示；并且其中CD1c尾以粗体/斜体显示。图7C的核苷酸序列为SEQ ID NO：15，并且图7C的多肽序列为SEQ IDNO：18。
体内疫苗接种
图8描绘了示例性的体内疫苗接种实验，其中用包含基本上如上所述的序列排列的九种不同的重组Ad5病毒对九组C57b1/6小鼠进行免疫。按照每两周一次的方案施用免疫，其中(如图8示意性显示)对不同的动物组采用不同的途径(皮下和静脉内)。在第42天，用B16-F10黑色素瘤细胞进行肿瘤激发，随后施用M2巨噬细胞抑制性药物(RP 182)和IL-15超激动剂(Alt-803)。图9A-9C描绘了皮下施用的示例性结果，而图10A-10C描绘了静脉内施用的示例性结果。
值得注意地，如从图9A可看出，无论是否存在泛素化，皮下注射引导至细胞质和MHC-I呈递的编码I类多表位的腺病毒均不能提供显著的免疫保护。在其他方面，如图9B明显看出，在经由MHC-II将I类多表位被引导至内吞体和溶酶体区室用于加工和呈递的情况下，观察到引导至循环内吞体区室和溶酶体区室的一些保护性免疫。当将II类多表位引导至内吞体和溶酶体区室经由MHC-II用于加工和呈递时，观察到甚至更强的免疫保护。在此，如图9C所示，对于溶酶体和分选内吞体区室观察到最强的保护。
当用相同的病毒构建体进行免疫接种时，尽管经由静脉内注射，但对于引导至细胞质(其中多表位包含可切割的泛素)的I类新表位，观察到新表位疫苗接种的保护作用，而从图10A可以看出，在多表位包含不可切割的泛素的情况下，观察到了一些保护作用。值得注意地，如图10B所示，当I类多表位被引导至内吞体和溶酶体区室时，在所有疫苗接种中观察到更强的保护作用。而且，当II类多表位被引导至内吞体和溶酶体区室用于经由MHC-II加工和呈递时，观察到强保护作用。在此，如图10C的图中所示，针对循环和分选内吞体区室观察到最强的保护。
对途径和载体的比较
在仍另外的实验中，诸位发明人进一步研究了实际的施用途径和表达载体的类型是否对治疗功效有影响。为此，采用如上所述基本上相同的小鼠模型，并且由来自B16F10黑色素瘤细胞的新表位构建多表位。图11A和11B显示其中表达载体是腺病毒的实验的示例性结果。如可以容易地看出，如从图11A可看出，皮下施用编码MHC II靶向的多表位的腺病毒表达系统对于所有亚细胞位置赋予了显著的免疫保护作用，而空载体未能提供免疫保护作用。值得注意地，当使用静脉内施用测试相同的载体构建体时，如从图11B可看出免疫保护作用不太明显。
相反，当表达载体是如上靶向MHC II呈递的质粒(此处：用于生成腺病毒表达载体的穿梭载体)时，如图11C所示，与空载体相比，皮下施用该质粒赋予明显的免疫保护作用。而且，并且出乎意料的是，如从图11D可看出，在通过静脉内注射施用相同质粒的情况下，甚至对于空载体也观察到了很大程度的免疫保护作用。尽管不希望受到任何特定理论或假设的束缚，但是诸位发明人因此预期免疫保护作用可能至少部分归因于先天性和适应性免疫应答。
图11E说明了使用空质粒(‘空’)与空病毒(‘空’)表达载体，在不同途径的使用之间的比较。如可以从结果容易地看出，皮下施用没有赋予免疫保护作用，而通过静脉内施用空质粒观察到最强的免疫保护作用。
图12描绘了下表3中所示的数据，其中将表达载体的类型显示为“类型”，并且将施用途径表示为“途径”。在“核酸”下显示了特定的MHC靶向和亚细胞位置的靶向，而在B16-F10黑色素瘤细胞植入后针对所测量的日期指示了肿瘤体积。
表3
Figure BPA0000278822310000451
如可以从此处提供的数据容易地看出，当以质粒形式静脉内施用和以腺病毒形式皮下施用时，经由CD1c、LAMP1和CD1a，靶向多表位的MHC-II匹配的新表位和将多表位靶向MHC-II的呈递是显著有效的。值得注意地，并且正如在数据中所反映的那样，靶向MHC-I在提供免疫保护方面的有效性显著较低。
本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。在本文描述的所有方法能够以任何适合顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的范围中之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他性的方式指代要素、部件或步骤，从而指示所提及的要素、部件或步骤可以与未明确提及的其他要素、部件或步骤一起存在、或使用、或组合。当说明书权利要求涉及选自由A、B、C......和N组成的组中的至少一种时，该文字应解释为只需要该组中的一个要素，而不是A加N、或B加N等。
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Figure IPA0000278822240000291
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Figure IPA0000278822240000311
Figure IPA0000278822240000321
Figure IPA0000278822240000331
Figure IPA0000278822240000341
Figure IPA0000278822240000351

Claims (16)

1.一种生成用于在哺乳动物的免疫疗法中使用的重组表达构建体的方法，该方法包括：
生成具有编码多表位的序列的第一重组核酸，其中该多表位包含多个经过滤的新表位序列，其中通过将同一患者的肿瘤与匹配的常态对照进行比较来在计算机中过滤核酸序列；其中在计算机中过滤所述核酸序列以对MHC-II的结合亲和力等于或小于200nM；
其中该多表位进一步包含将该多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体；
其中该第一重组核酸包含与编码该多表位的序列可操作地连接的第一启动子，以驱动该多表位在哺乳动物中表达；其中重组核酸是用于生成重组腺病毒的穿梭载体；以及
生成具有编码该多表位的序列的第二重组核酸，其中该第二重组核酸包含与编码该多表位的序列可操作地连接的第二启动子，以驱动该多表位在非哺乳动物细胞中表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中该第一启动子是组成型启动子，或者其中该第一启动子能够被低氧、IFN-γ或IL-8诱导。
3.如权利要求1所述的方法，其中该运输元件选自下组，该组由以下组成：CD1b前导序列、CD1a尾、CD1c尾和LAMP1-跨膜序列。
4.如权利要求1所述的方法，其中该第一重组核酸(a)进一步包含编码第二多表位的另外的序列，其中该第二多表位包含将该第二多表位引导至不同亚细胞位置的第二运输元件，并且其中该第二多表位包含多个第二经过滤的新表位序列，或
(b)进一步包含序列，该序列编码共刺激分子、免疫刺激细胞因子和干扰或下调检查点抑制的蛋白质中的至少一种。
5.如权利要求1所述的方法，其中该第一重组核酸在细菌细胞或酵母细胞中复制，或是用于生成重组病毒的穿梭载体。
6.如权利要求1所述的方法，其中该第二启动子是组成型细菌或酵母启动子。
7.如权利要求1所述的方法，其中该非哺乳动物细胞是大肠杆菌细胞或酿酒酵母细胞。
8.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：
将该第二重组核酸转染到细菌细胞或酵母细胞中；
在该细菌细胞或酵母细胞中表达该多表位；以及
将该细菌细胞或酵母细胞配制成注射用药物配制品。
9.如权利要求4所述的方法，其中该经过滤的新表位序列中的至少一个和该第二经过滤的新表位序列中的至少一个是相同的。
10.如权利要求4所述的方法，其中该共刺激分子选自下组，该组由以下组成：CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL、GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1和LFA3。
11.如权利要求4所述的方法，其中该免疫刺激细胞因子选自下组，该组由以下组成：IL-2、IL-12、IL-15、IL-15超激动剂、IL-21、IPS1和LMP1。
12.如权利要求4所述的方法，其中进行干扰的蛋白质是CTLA-4、PD-1、TIM1受体、2B4或CD160的抗体或拮抗剂。
13.如权利要求5所述的方法，其中该重组病毒是腺病毒。
14.如权利要求13所述的方法，其中该腺病毒包含E1和E2b基因缺失的至少一个。
15.一种制备用于患有肿瘤的个体的第一和第二处理组合物的方法，该方法包括：
从肿瘤的组学数据中鉴定多个表达的新表位序列，其中每个表达的新表位序列对该个体的MHC-I和MHC-II中的至少一个具有等于或小于500nM的经计算的结合亲和力；
生成具有编码多表位的序列的第一重组核酸，其中该多表位包含该多个表达的新表位序列；
其中该多表位进一步包含将该多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体；
其中该第一重组核酸是包含与编码该多表位的序列可操作地连接的第一启动子以驱动该多表位在该个体的细胞中表达的腺病毒载体；
将该第一重组核酸配制成DNA疫苗配制品，以此获得该第一处理组合物；
生成包含编码该多表位的序列的第二重组核酸，其中该第二重组核酸包含与编码该多表位的序列可操作地连接的第二启动子，以驱动该多表位在细菌细胞或酵母细胞中表达；
将该细菌细胞或酵母细胞用该第二重组核酸转染，并在该细菌细胞或酵母细胞中表达该多表位；以及
将经转染的细菌细胞或酵母细胞配制成基于细胞的疫苗配制品，以此获得该第二处理组合物。
16.一种制备用于患有肿瘤的个体的第一和第二处理组合物的方法，该方法包括：
从肿瘤的组学数据中鉴定多个表达的新表位序列，其中这些表达的新表位序列对该个体的MHC-I和MHC-II中的至少一个具有等于或小于500nM的经计算的结合亲和力；
生成具有编码多表位的序列的第一重组核酸，其中该多表位包含该多个表达的新表位序列，其中该第一重组核酸是腺病毒表达载体；
其中该多表位进一步包含将该多表位引导至亚细胞位置的运输元件，该亚细胞位置选自下组，该组由以下组成：循环内吞体、分选内吞体和溶酶体；
其中该第一重组核酸包含与编码该多表位的序列可操作地连接的第一启动子，以驱动该多表位在该个体的细胞中表达；
从该病毒表达载体形成病毒颗粒，并且将这些病毒颗粒配制成病毒疫苗配制品，以此获得该第一处理组合物；
生成具有编码该多表位的序列的第二重组核酸，其中该第二重组核酸包含与编码该多表位的序列可操作地连接的第二启动子，以驱动该多表位在非哺乳动物细胞中表达；
将该细菌细胞或酵母细胞用该第二重组核酸转染，并在该细菌细胞或酵母细胞中表达该多表位；以及
将经转染的细菌细胞或酵母细胞配制成基于细胞的疫苗配制品，以此获得该第二处理组合物。
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