KR102341899B1 - 개인맞춤화 신생물 백신을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신생물에서 복수의 돌연변이를 확인하는 단계; 복수의 돌연변이를 분석하여, 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋을 확인하는 단계로서, 신생-항원 돌연변이가 미스센스 돌연변이, neoORF 돌연변이 및 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; 및 확인된 서브셋에 기초하여, 개인맞춤화 신생물 백신을 생성하는 단계를 포함하는, 신생물을 갖는 것으로 진단된 대상체를 위한 개인맞춤화 신생물 백신의 제조 방법을 제공한다.

Description

개인맞춤화 신생물 백신을 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR PERSONALIZED NEOPLASIA VACCINES}
정부 지원 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리 진술
본 연구는 미국 국립보건원 보조금 번호 NIH/NCI-1R01CA155010-02 및 NHLBI-5R01HL103532-03으로부터의 보조금을 지원받았다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
관련 출원
본 출원은 2013년 4월 7일에 출원된 미국 가출원 제61/809,406호 및 2013년 8월 25일에 출원된 미국 가출원 제61/869,721호의 이익 및 그에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 신생물의 치료를 위한 개인맞춤화 전략에 관한 것이다. 더욱 특별히, 본 발명은 대상체의 치료를 위한 개인맞춤화 종양 백신에서의 종양 특이적 신생-항원의 환자 특이적 풀(pool)의 확인 및 용도에 관한 것이다.
대략 160만 명의 미국인들이 매년 신생물이 있는 것으로 진단되고, 2013년에 미국에서 대략 580,000명의 사람들이 상기 질병으로 인해 사망한 것으로 예상된다. 과거 수십 년에 걸쳐, 신생물의 검출, 진단 및 치료에 상당한 개선이 있었으며, 이는 많은 유형의 신생물에 대한 생존율을 상당히 증가시켰다. 그러나 신생물이 있는 것으로 진단된 사람들 중 오직 약 60%만이 치료의 개수 5년 후에 여전히 살아 있으며, 이는 미국에서 신생물이 사망의 두 번째의 주된 원인이게 만든다.
현재, 제거 기술(예를 들어, 수술적 절차, 냉동/열 처리, 초음파, 고주파 및 방사선) 및 화학적 기술(예를 들어, 약제학적 제제, 세포독성/화학치료제, 모노클로널 항체 및 그들의 다양한 조합)을 포함하는 수많은 상이한 기존의 암 치료법이 존재한다. 불행히도, 그러한 치료법은 빈번하게 심각한 위험, 독성 부작용 및 매우 높은 비용 및 불확실한 효능과 관련이 있다.
환자 자신의 면역계를 사용하여 암 세포를 표적으로 하려는 암 치료법(예를 들어, 암 백신)에 관심이 증가하고 있는데, 그 이유는, 그러한 치료법이 상기 기술된 단점의 일부를 완화/제거할 수 있기 때문이다. 암 백신은 전형적으로 종양 항원 및 면역자극 분자(예를 들어, 사이토카인 또는 TLR 리간드)로 이루어져 있으며, 그들은 함께 작용하여, 종양 세포를 표적으로 하고 그를 파괴하는 항원-특이적 세포독성 T 세포를 유도한다. 현재의 암 백신은 전형적으로 공유된 종양 항원을 함유하며, 이는 많은 개체에서 관찰되는 종양에서 선택적으로 발현되거나 과-발현되는 고유 단백질(즉, - 개체 내의 모든 정상 세포의 DNA에 의해 인코딩되는 단백질)이다. 그러한 공유된 종양 항원이 특정 유형의 종양을 확인하는데 유용하지만, 그들은 특정 종양 유형에 대해 T-세포 반응을 표적화하기 위한 면역원으로서 이상적이지 않은데, 그 이유는 그들이 자기-관용의 면역 약화 효과를 겪기 때문이다. 따라서, 신생물 백신에 사용될 수 있는 더욱 효율적인 종양 항원의 확인 방법이 필요하다.
요약
본 발명은 신생물의 개인맞춤화 치료를 위한 전략, 더욱 특별히, 대상체에서의 종양의 치료를 위한, 본질적으로 종양-특이적 및 환자-특이적 신생-항원의 풀로 이루어진 개인맞춤화 암 백신의 확인 및 용도에 관한 것이다. 하기 기재된 바와 같이, 본 발명은 적어도 부분적으로, 전체 게놈/엑솜(exome) 시퀀싱을 사용하여, 개별 환자의 신생물/종양에 특유하게 존재하는 모든 또는 거의 모든 돌연변이된 신생-항원을 확인할 수 있으며, 이러한 돌연변이된 신생-항원의 집합을 분석하여, 환자의 신생물/종양의 치료를 위한 개인맞춤화 신생물 백신으로 사용하기 위한 특이적인 신생-항원의 최적화된 서브셋을 확인할 수 있다는 발견을 기반으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 신생물을 갖는 것으로 진단된 대상체를 위한 개인맞춤화 신생물 백신의 제조 방법을 제공하며, 이는 신생물에서 복수의 돌연변이를 확인하는 단계, 복수의 돌연변이를 분석하여, 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋을 확인하는 단계로서, 상기 신생-항원 돌연변이가 미스센스 돌연변이, neoORF 돌연변이 및 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계, 및 확인된 서브셋에 기초하여, 개인맞춤화 신생물 백신을 생성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 확인 단계가 신생물의 게놈, 전사체(transcriptome) 또는 프로테옴(proteome)을 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는 것으로 제공된다.
다른 실시형태에 있어서, 분석 단계는 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋과 관련된 하나 이상의 특징을 결정하는 단계로서, 상기 특징이 분자량, 시스테인 함량, 친수성, 소수성, 전하 및 결합 친화성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; 및 결정된 특징에 기초하여, 확인된 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋 내의 신생-항원 돌연변이의 각각의 순위를 정하는 단계를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 최상위 5 내지 30개의 신생-항원 돌연변이는 개인맞춤화 신생물 백신에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 신생-항원 돌연변이는 도 8에 나타낸 순서에 따라 순위가 정해진다.
일 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 신생-항원 돌연변이에 상응하는 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 신생-항원 돌연변이에 상응하는 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 DNA 분자를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 신생-항원 돌연변이에 상응하는 적어도 20개의 신생-항원 펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 RNA 분자를 포함한다.
실시형태들에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 500 nM 이하의 Kd를 갖는 neoORF 폴리펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 neoORF 돌연변이를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 150 nM 이하의 Kd를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 미스센스 돌연변이를 포함하며, 여기서, 고유 동족 단백질은 1000 nM 이상 또는 150 nM 이하의 Kd를 갖는다.
다른 실시형태에 있어서, 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 5 내지 약 50개 아미노산 범위이다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 15 내지 약 35개 아미노산 범위이다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 18 내지 약 30개 아미노산 범위이다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 6 내지 약 15개 아미노산 범위이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 적어도 약 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산이다.
일 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 애쥬번트(adjuvant)를 더 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 애쥬번트는 폴리-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod), ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM, 벡터 시스템, PLGA 마이크로입자, 레시퀴모드(resiquimod), SRL172, 비로좀(Virosome) 및 기타 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 아퀼라스(Aquila's) QS21 스티물론(stimulon), 바디메잔(vadimezan) 및/또는 AsA404(DMXAA)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 애쥬번트는 폴리-ICLC이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 개인맞춤화 신생물 백신을 사용한, 신생물을 갖는 것으로 진단된 대상체의 치료 방법을 포함하며, 이는 신생물에서 복수의 돌연변이를 확인하는 단계; 복수의 돌연변이를 분석하여, 발현된 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋을 확인하는 단계로서, 상기 신생-항원 돌연변이가 미스센스 돌연변이, neoORF 돌연변이 및 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; 확인된 서브셋에 기초하여, 개인맞춤화 신생물 백신을 생성하는 단계; 및 개인맞춤화 신생물 백신을 대상체에게 투여하여, 신생물을 치료하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 확인 단계는 신생물의 게놈, 전사체 또는 프로테옴을 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 분석 단계는 발현된 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋과 관련된 하나 이상의 특징을 결정하는 단계로서, 상기 특징이 분자량, 시스테인 함량, 친수성, 소수성, 전하 및 결합 친화성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; 및 결정된 특성에 기초하여, 확인된 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋 내의 신생-항원 돌연변이의 각각의 순위를 정하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 최상위 5 내지 30개의 신생-항원 돌연변이는 개인맞춤화 신생물 백신에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 신생-항원 돌연변이는 도 8에 나타낸 순서에 따라 순위가 정해진다.
일 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 신생-항원 돌연변이에 상응하는 적어도 20개의 신생-항원 펩티드를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 신생-항원 돌연변이에 상응하는 적어도 20개의 신생-항원 펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 DNA 분자를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 신생-항원 돌연변이에 상응하는 적어도 20개의 신생-항원 펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 RNA 분자를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 500 nM 이하의 Kd를 갖는 neoORF 폴리펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 neoORF 돌연변이를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 150 nM 이하의 Kd를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 것으로 예측되는 미스센스 돌연변이를 포함하며, 여기서, 고유 동족 단백질은 1000 nM 이상 또는 150 nM 이하의 Kd를 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 5 내지 약 50개 아미노산 범위이다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 15 내지 약 35개 아미노산 범위이다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 18 내지 약 30개 아미노산 범위이다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 약 6 내지 약 15개 아미노산 범위이다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 20개의 신생-항원 펩티드는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산이다.
일 실시형태에 있어서, 투여 단계는 생성된 백신을 2개 이상의 서브-풀로 나누는 단계; 및 각각의 서브-풀을 환자의 상이한 위치에 주입하는 단계를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 상이한 위치에 주입되는 각각의 서브-풀은 임의의 단일의 환자 HLA를 표적으로 하는 서브-풀 내의 개별 펩티드의 개수가 1개이거나, 1개 초과의 가능한 한 적은 개수이도록 하는 신생-항원 펩티드를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 투여 단계는 생성된 백신을 2개 이상의 서브-풀로 나누는 단계를 더 포함하며, 각각의 서브-풀은 풀 내의 상호작용을 최적화하도록 선택된 적어도 5개의 신생-항원 펩티드를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 최적화는 동일한 풀 내의 신생-항원 펩티드 간의 부정적인 상호작용을 감소시키는 것을 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 따라 제조된 개인맞춤화 신생물 백신을 포함한다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다:
문맥에서 특별히 언급하거나 명백하지 않은 한, 본원에 사용되는 "약"이라는 용어는 당업계에서 정상적인 허용 범위 내로서, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로서 이해된다. 약은 언급된 값의 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내로 이해될 수 있다. 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공되는 모든 수치는 약이라는 용어로 수식된다.
"작용제"는 임의의 소 분자 화합물, 항체, 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 또는 그들의 단편을 의미한다.
"개선한다"는 질병(예를 들어, 신생물, 종양 등)의 발생 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 줄이거나, 저지하거나 안정화시키는 것을 의미한다.
"변경"은 당업계에 알려져 있는 표준 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 것들에 의해 검출시의 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용되는 변경은 발현 수준의 10% 변화, 바람직하게는 발현 수준의 25% 변화, 더욱 바람직하게는 40% 변화, 가장 바람직하게는 50% 이상의 변화를 포함한다.
"유사체"는 동일하지 않지만, 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 종양 특이적 신생-항원 폴리펩티드 유사체는 천연-발생 폴리펩티드에 비하여 유사체의 기능을 향상시키는 소정의 생화학적 변형을 갖지만, 상응하는 천연-발생 종양 특이적 신생-항원 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지한다. 그러한 생화학적 변형은 예를 들어, 리간드 결합을 변경시키지 않고, 유사체의 프로테아제 내성, 막 투과성 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
"병용 요법"이라는 어구는 신생물/종양 특이적 신생-항원의 풀링된 시료 및 치료제의 동시-작용으로부터 유리한(상가적 또는 상승적) 효과를 제공하는 것으로 의도되는 특정 치료 섭생의 부분으로서 하나 이상의 추가의 치료제의 투여를 포괄한다. 병용의 유리한 효과는 치료제의 병용으로부터 야기되는 약동학적 또는 약력학적 동시-작용을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 전형적으로 병용되는 이들 치료제의 투여는 한정된 기간(선택되는 병용에 따라, 보통 수분, 수시간, 수일 또는 수주)에 걸쳐 수행된다. "병용 요법"은 각각의 치료제가 상이한 시간에 투여되는 순차적 방식으로의 이들 치료제의 투여, 및 실질적으로 동시의 방식으로의 이들 치료제 또는 치료제 중 적어도 2개의 투여를 포괄하는 것으로 의도된다. 실질적으로 동시의 투여는 예를 들어, 고정된 비의 각 치료제를 갖는 단일의 캡슐 또는 각각의 치료제에 대한 다중의, 단일의 캡슐을 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 병용은 동시의 또는 상이한 시간의 종양 특이적 신생-항원의 풀링된 시료 및 적어도 하나의 추가의 치료제(예를 들어, 화학치료제, 항-혈관신생제, 면역억제제, 항-염증제 등)를 포함할 수 있거나, 그들은 2개의 화합물을 포함하는 단일의 동시-제형화된 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 병용(예를 들어, 종양 특이적 신생-항원의 풀링된 시료 및 적어도 하나의 추가의 치료제)은 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있는 개별 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 각 치료제의 순차적인 또는 실질적으로 동시의 투여는 경구 경로, 정맥내 경로, 피하 경로, 근육내 경로, 점막 조직(예를 들어, 코, 입, 질 및 직장)을 통한 직접 흡수 및 안구 경로(예를 들어, 유리체내, 안구내 등)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 시행될 수 있다. 치료제는 동일한 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 병용의 하나의 성분은 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 한편, 병용의 다른 성분(들)은 경구 투여될 수 있다. 성분은 임의의 치료적으로 유효한 순서로 투여될 수 있다.
"병용"이라는 어구는 병용 요법의 부분으로서 유용한 화합물 또는 비-약물 치료법의 군을 포괄한다.
이러한 개시내용에서, "포함한다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에 제공되는 의미를 가질 수 있고, "포괄하다", "포괄하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 ~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진" 등은 미국 특허법에서 제공되는 의미를 갖고, 상기 용어는 제약을 두지 않는 것으로, 언급된 것의 기본적인 또는 신규한 특징들이 언급되는 것이 추가로 존재함으로 인해 변화하지 않는 한 추가로 언급되는 것이 더 존재할 수 있나, 종래 기술의 실시형태는 제외한다.
"대조군"은 표준 또는 참조 조건을 의미한다.
"질병"은 세포, 조직 또는 기관의 정상의 기능을 손상시키거나 그를 간섭하는 임의의 질환 또는 장애를 의미한다.
"유효량"은 미처리 환자에 비한 질병(예를 들어, 신생물/종양)의 증상을 개선시키는데 필요한 양을 의미한다. 질병의 치료적 처치를 위해 본 발명을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 일반 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 그러한 양은 "유효한" 양으로 지칭된다.
"단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 이러한 부분은 바람직하게는 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 함유한다. 단편은 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
"혼성화"는 상보성 핵염기 간의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역전된 후그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보성 핵염기이다.
"억제성 핵산"은 포유류 세포에게 투여되는 경우, 표적 핵산의 발현의 감소(예를 들어, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 심지어 90 내지 100%)를 야기하는 이중-가닥 RNA, siRNA, shRNA 또는 안티센스 RNA 또는 그들의 부분, 또는 그들의 모방체를 의미한다. 전형적으로, 핵산 억제제는 표적 핵산 분자의 적어도 일부분 또는 그의 오솔로그(ortholog)를 포함하거나, 표적 핵산 분자의 상보성 가닥의 적어도 일부분을 포함한다. 예를 들어, 억제성 핵산 분자는 본원에 기술된 임의의 또는 모든 핵산의 적어도 일부분을 포함한다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"는 유기체의 천연-발생 게놈에서 - 또는 유기체로부터 유래된 신생물/종양의 게놈 DNA에서 - 본 발명의 핵산 분자가 유래되는 유전자가 없는 핵산(예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 벡터로; 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 혼입되거나; 다른 서열과 독립적으로 개별 분자(예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA(예를 들어, 환자의 종양에서 확인된 neoORF, 리드-쓰루(read-through) 또는 InDel 유래 폴리펩티드를 코딩하는 DNA)를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자 및 추가의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 하이브리드 유전자의 부분인 재조합 DNA를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"는 천연적으로 그것과 동반되는 성분으로부터 분리된 본 발명의 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 그것이 천연적으로 회합되어 있는 단백질 및 천연-발생 유기 분자가 중량 기준으로 적어도 60% 없는 경우, 단리된 것이다. 바람직하게는, 제제는 중량 기준으로 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 본 발명의 폴리펩티드이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해, 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질의 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
"리간드"는 수용체의 구조와 상보적인 구조를 가지며, 수용체와 복합체를 형성할 수 있는 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따르면, 리간드는 펩티드 또는 펩티드 단편이 MHC 클래스(class) I 또는 MHC 클래스 II의 단백질과 복합체를 형성할 수 있도록 적합한 길이 및 그의 아미노산 서열에 적합한 결합 모티프를 갖는 펩티드 또는 펩티드 단편을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이러한 문헌의 목적을 위한 "돌연변이"는 동일한 환자의 상응하는 정상 DNA 시료에서 관찰되지 않는 환자의 종양 DNA 시료에서 관찰되는 DNA 서열을 의미한다. 또한, "돌연변이"는 개별 유전자에 대하여 알려져 있는 정보에 기초하여 예상되는 변이에 기인하지 않으며, 예를 들어, 환자의 종양 세포에서 특이적으로 변경된 하나 이상의 유전자의 스플라이싱 패턴의 신규한 변이인 것으로 합리적으로 고려되는 환자 유래의 RNA의 서열의 패턴을 말할 수 있다.
"신생-항원" 또는 "신생 항원성"은 게놈 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키는 종양-특이적 돌연변이(들)로부터 야기되는 종양 항원의 부류를 의미한다.
"신생물"이란, 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 아폽토시스(apoptosis) 또는 둘 모두에 의해 야기되거나 그로 이어지는 임의의 질병을 의미한다. 예를 들어, 암은 신생물의 일 예이다. 암의 예에는 제한 없이, 백혈병(예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종(호지킨병, 비-호지킨병), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병 및 고형 종양, 예를 들어 육종 및 암종(예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 정소암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 슈반세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종)이 포함된다. 림프구증식 장애도 또한 증식성 질병인 것으로 여겨진다.
문맥에서 특별히 언급하거나 명백하지 않은 한, 본원에 사용되는 "또는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 문맥에서 특별히 언급하거나 명백하지 않은 한, 본원에 사용되는 "하나의(a, an)" 및 "상기(the)"이라는 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 목적인 동물을 말한다. 오직 예시로서, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류, 예를 들어, 비-인간 영장류, 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하나 이들에 한정되지 않는 포유류를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
"약제학적으로 허용가능한"은 미국 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인가능하거나, 인간을 포함하는 동물에서의 사용에 대해 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 기타 약전에 열거됨을 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제"는 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고, 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며, 치료량의 작용제를 전달하기에 충분한 용량으로 투여되는 경우에 비독성인 부형제, 담체 또는 희석제를 말한다.
본원에 열거된 바와 같은 풀링된 종양 특이적 신생-항원의 "약제학적으로 허용가능한 염"은 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과의 접촉에 적합한 것으로 당업계에 일반적으로 고려되는 산 또는 염기 염일 수 있다. 그러한 염은 염기성 잔기, 예를 들어, 아민의 무기 및 유기산 염, 및 산성 잔기, 예를 들어, 카복실산의 알칼리 또는 유기 염을 포함한다. 구체적인 약제학적 염에는 산, 예를 들어, 염산, 인산, 브롬화수소산, 말산, 글리콜산, 푸마르산, 황산, 설팜산, 설파닐산, 포름산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 벤젠 설폰산, 에탄 디설폰산, 2-하이드록시에틸설폰산, 질산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 스테아르산, 살리실산, 글루탐산, 아스코르브산, 파모산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 프로피온산, 하이드록시말레산, 하이드로요오드산, 페닐아세트산, 알칸산, 예를 들어, 아세트산, HOOC-(CH2)n-COOH(여기서, n은 0 내지 4임) 등의 염이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 유사하게, 약제학적으로 허용가능한 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985)]에 열거된 것들을 포함하는 본원에 제공된 풀링된 종양 특이적 신생-항원을 위한 추가의 약제학적으로 허용가능한 염을 인식할 것이다. 일반적으로, 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 염은 임의의 통상의 화학 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모체 화합물로부터 합성될 수 있다. 약술하면, 그러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 적절한 용매 중에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 처치" 등은 질병 또는 질환을 갖지 않으나, 질병 또는 질환이 발생할 위험이 있거나, 질병 또는 질환이 발생하기 쉬운 대상체에서 질병 또는 질환의 발생 가능성을 감소시키는 것을 말한다.
"프라이머 세트"는 예를 들어, PCR을 위해 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 세트를 의미한다. 프라이머 세트는 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600개 이상의 프라이머로 이루어질 것이다.
"주 조직적합성 복합체(MHC)의 단백질 또는 분자", "MHC 분자", "MHC 단백질" 또는 "HLA 단백질"은 특히, 단백질 항원의 단백질 가수분해적 절단으로부터 야기되며, 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타내는 펩티드에 결합하여, 그들을 세포 표면으로 수송하고, 그들을 거기서 특정 세포, 특히, 나이브(naive) T-세포, 세포독성 T-림프구 또는 T-헬퍼(helper) 세포에 제시할 수 있는 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 게놈 내의 주 조직적합성 복합체는 유전자 산물이 세포 표면 상에서 발현되며, 내인성 및/또는 외래 항원과의 결합 및 이의 제시와, 이에 따른, 면역 과정의 조절에 중요한 유전 영역을 포함한다. 주 조직적합성 복합체는 상이한 단백질을 코딩하는 2개의 유전자 군으로 분류된다: MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II의 분자. 2개의 MHC 클래스의 분자는 상이한 항원 공급원에 대해 특수화된다. MHC 클래스 I의 분자가 통상 내인적으로 합성된 항원, 예를 들어, 바이러스 단백질 및 종양 항원을 제시하나, 이들에 제한되지 않는다. MHC 클래스 II의 분자는 외인성 공급원, 예를 들어, 박테리아 산물로부터 유래되는 단백질 항원을 제시한다. 2개의 MHC 클래스의 세포 생물학 및 발현 패턴은 이들 상이한 역할에 적응된다.
클래스 I의 MHC 분자는 중쇄 및 경쇄로 이루어지며, 이러한 펩티드가 적합한 결합 모티프를 갖는다면, 약 8 내지 11개 아미노산이나, 보통 9 또는 10개인 아미노산의 펩티드에 결합하고, 그것을 나이브 및 세포독성 T-림프구에 제시할 수 있다. 클래스 I의 MHC 분자에 의해 결합된 펩티드는 전형적으로 그러나 비배타적으로 내인성 단백질 항원에서 기원한다. 클래스 I의 MHC 분자의 중쇄는 바람직하게는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 단량체이며, 경쇄는 β-2-마이크로글로불린이다.
클래스 II의 MHC 분자는 α-쇄 및 β-쇄로 이루어지며, 펩티드가 적합한 결합 모티프를 갖는다면, 약 15 내지 24개 아미노산의 펩티드에 결합하고, 그것을 T-헬퍼 세포에 제시할 수 있다. 클래스 II의 MHC 분자에 의해 결합된 펩티드는 보통 세포외 또는 외인성 단백질 항원으로부터 기원한다. α-쇄 및 β-쇄는 특히, HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 단량체이다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위-범위, 및 상기 언급된 정수 사이에 개재되는 모든 소수의 값, 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 및 1.9를 포함하는 것으로 이해된다. 하위-범위에 관하여, 범위의 어느 하나의 종점으로부터 연장되는 "내재(nested) 하위-범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 예시적인 범위 1 내지 50의 내재 하위-범위는 하나의 방향으로 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30 및 1 내지 40, 또는 다른 방향으로 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.
"수용체"는 리간드에 결합할 수 있는 생물학적 분자 또는 분자 그루핑(grouping)을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 수용체는 세포, 세포 형성 또는 유기체에서 정보를 전달하는데 기여할 수 있다. 수용체는 적어도 하나의 수용체 유닛을 포함하고, 빈번하게 2개 이상의 수용체 유닛을 포함하고, 각각의 수용체 유닛은 단백질 분자, 특히 당단백질 분자로 이루어질 수 있다. 수용체는 리간드의 구조에 상보적인 구조를 갖고 결합 파트너로서 리간드와 함께 복합체를 형성할 수 있다. 신호전달 정보는 세포 표면 상의 리간드와의 결합 후에 수용체의 입체형태 변화에 의해 전달된다. 본 발명에 따르면, 수용체는 리간드, 특히 적합한 길이의 펩티드 또는 펩티드 단편과 함께 수용체/리간드 복합체를 형성할 수 있는 MHC 클래스 I 및 II의 특정 단백질을 말할 수 있다.
또한, "수용체/리간드 복합체"는 "수용체/펩티드 복합체" 또는 "수용체/펩티드 단편 복합체", 특히 클래스 I 또는 클래스 II의 펩티드- 또는 펩티드 단편-제시 MHC 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"감소한다"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 음의 변경을 의미한다.
"참조"는 표준 또는 대조군 조건을 의미한다.
"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 특정 서열의 서브셋 또는 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 게놈 서열의 세그먼트 또는 완전한 cDNA 또는 게놈 서열일 수 있다. 폴리펩티드에 있어서, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로, 적어도 약 10 내지 2,000개 아미노산, 10 내지 1,500, 10 내지 1,000, 10 내지 500 또는 10 내지 100개일 것이다. 바람직하게는 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 적어도 약 10 내지 50개 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10 내지 40개 아미노산, 더더욱 바람직하게는 약 10 내지 30개 아미노산, 약 10 내지 20개 아미노산, 약 15 내지 25개 아미노산 또는 약 20개 아미노산일 수 있다. 핵산에 있어서, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 60개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 더더욱 바람직하게는 약 100개 뉴클레오티드 또는 약 300개 뉴클레오티드, 또는 그 근처 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다.
"특이적으로 결합한다"는 본 발명의 폴리펩티드를 인식하고 이에 결합하지만, 실질적으로 시료, 예를 들어, 생물학적 시료 중 기타 분자를 인식하고 이에 결합하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다.
본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 인코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 그러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요가 없지만, 전형적으로 상당한 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대한 "상당한 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화한다"는 다양한 엄격성 조건하에 상보적 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 유전자), 또는 그의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하기 위해 쌍을 이루는 것을 의미한다(예를 들어, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399]; [Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조).
예를 들어, 엄격성 염 농도는 대개 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 더욱 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 저 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 부재하에 수득될 수 있는 한편, 고 엄격성 혼성화는 적어도 약 35%의 포름아미드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50%의 포름아미드 존재하에 수득될 수 있다. 엄격성 온도 조건은 대개 적어도 약 30℃, 더욱 바람직하게는 적어도 약 37℃, 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 추가의 파라미터, 예를 들어, 혼성화 시간, 세제, 예를 들어 황산도데실나트륨(SDS)의 농도, 및 캐리어 DNA의 포함 또는 배제를 변화시키는 것은 당업자에게 널리 알려져 있다. 다양한 수준의 엄격성이 이들 다양한 조건을 필요에 따라 조합함으로써 달성된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 혼성화는 30℃에서, 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨, 및 1% SDS 중에서 발생할 것이다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 혼성화는 37℃에서, 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 ㎍/㎖의 변성 연어 정자 DNA(ssDNA) 중에서 발생할 것이다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 혼성화는 42℃에서, 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 ㎍/㎖의 ssDNA 중에서 발생할 것이다. 이들 조건의 유용한 변화는 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.
대부분의 응용에 있어서, 혼성화 후의 세척 단계 또한 엄격성이 달라질 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시킴으로써 또는 온도를 상승시킴으로써 증가할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격성 염 농도는, 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만, 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격성 온도 조건은 대개, 적어도 약 25℃, 더욱 바람직하게는 적어도 약 42℃, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 세척 단계는 25℃에서, 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중에서 일어날 것이다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 세척 단계는 42℃에서, 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중에서 일어날 것이다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 세척 단계는 68℃에서, 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중에서 일어날 것이다. 이들 조건의 추가의 변이도 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Benton and Davis (Science 196:180, 1977)]; 문헌[Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)]; 문헌[Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)]; 문헌[Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)]; 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.
"상당히 동일한"은 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 것) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 임의의 것)에 대하여 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 그러한 서열은 아미노산 또는 핵산 수준에서, 비교를 위해 사용되는 서열과 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 80% 또는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 위스콘신 생명공학 센터 대학, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 그러한 소프트웨어는 상동성의 정도를 다양한 치환, 결실 및/또는 기타 변형으로 지정함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기의 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 방법에서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있으며, e-3 내지 e-100의 확률 점수는 밀접하게 관련된 서열을 나타낸다.
"T-세포 에피토프"는 펩티드-제시 MHC 분자의 클래스 I 또는 II의 MHC 분자 또는 MHC 복합체의 형태에 의해 결합된 다음, 이러한 형태에서 나이브 T-세포, 세포독성 T-림프구 또는 T-헬퍼 세포에 의해 인식되고 결합될 수 있는 펩티드 서열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용되는 "치료한다", "치료된", "치료하는", "치료" 등이라는 용어는 그(예를 들어, 신생물 또는 종양)와 관련된 장애 및/또는 증상을 감소시키거나 개선하는 것을 말한다. 배제하는 것은 아니지만, 장애 또는 질환의 치료는 장애, 질환, 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거될 것을 요하지 않는 것이 인식될 것이다.
"치료 효과"라는 용어는 장애(예를 들어, 신생물 또는 종양)의 증상 또는 그의 관련 병증 중 하나 이상의 어느 정도의 경감을 말한다. 본원에 사용되는 "치료적 유효량"은 세포 또는 대상체로의 단일 또는 다중 용량 투여시에, 그러한 치료의 부재하에 예상되는 것을 능가하는, 그러한 장애를 갖는 환자의 생존력의 연장, 장애의 하나 이상의 증후 또는 증상의 감소, 예방 또는 지연 등에 있어서 효과적인 작용제의 양을 말한다. "치료적 유효량"은 치료 효과를 달성하는데 필요한 양을 정량화하는 것으로 의도된다. 당업계의 통상의 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 "치료적 유효량"(예를 들어, ED50)을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 더 낮은 수준으로 약제학적 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여를 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 1일 체중 킬로그램당 약 0.0001 ㎎ 내지 약 200 ㎎의 화합물의 투여량을 제공해야 한다. 예를 들어, 인간 환자로의 전신 투여를 위한 투여량은 0.01 내지 10 ㎍/㎏, 20 내지 80 ㎍/㎏, 5 내지 50 ㎍/㎏, 75 내지 150 ㎍/㎏, 100 내지 500 ㎍/㎏, 250 내지 750 ㎍/㎏, 500 내지 1000 ㎍/㎏, 1 내지 10 ㎎/㎏, 5 내지 50 ㎎/㎏, 25 내지 75 ㎎/㎏, 50 내지 100 ㎎/㎏, 100 내지 250 ㎎/㎏, 50 내지 100 ㎎/㎏, 250 내지 500 ㎎/㎏, 500 내지 750 ㎎/㎏, 750 내지 1000 ㎎/㎏, 1000 내지 1500 ㎎/㎏, 1500 내지 2000 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 또는 200 ㎎/㎏ 범위일 수 있다. 약제학적 단위 투여 형태는 단위 투여형마다 약 0.001 ㎎ 내지 약 5000 ㎎, 예를 들어, 약 100 내지 약 2500 ㎎의 화합물 또는 필수 성분의 조합을 제공하도록 제조된다.
"백신"은 질병(예를 들어, 신생물/종양)의 예방 및/또는 치료를 위해 면역성을 생성하는 조성물을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 백신은 항원을 포함하는 약제이고 백신접종에 의해 특이적 방어 및 보호 물질을 생성하기 위해 인간 또는 동물에서 사용되는 것으로 의도된다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학기의 목록의 언급은 임의의 단일기 또는 열거된 기의 조합으로서의 변수의 정의를 포함한다. 본원의 변수 또는 양태에 대한 실시형태의 언급은 임의의 단일의 실시형태 또는 임의의 다른 실시형태 또는 그의 부분과의 조합으로서의 실시형태를 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 병용될 수 있다.
본 개시내용의 상기 언급된 특징 및 이점, 및 기타 특징 및 이점은 하기의 도면과 함께 하기의 상세한 설명을 확인하는 경우 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 개인맞춤화 암 백신을 제조하기 위한 흐름도를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 흑색종 환자를 위한 암 백신을 생성하기 위한 사전-처리 단계에 대한 흐름도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 초기 환자 집단 연구를 다루기 위한 방법을 도시한 흐름도이다. 5명의 환자를 제1 코호트(cohort)에서 예상되는 안전한 용량 수준으로 처치할 수 있다. 1차 안전성 종점(primary safety endpoint)에서 또는 그 이전에 이들 5명의 환자 중 2명 미만에서 용량 제한 독성이 발생하면, 10명의 환자를 그 용량 수준으로 더 동원하여, 환자 집단의 분석을 확대할 수 있다(예를 들어, 효능, 안전성 등의 평가를 위해). 2명 이상의 용량 제한 독성(DLT)이 관찰되면, 폴리-ICLC의 용량을 50%로 감소시키고, 5명의 추가의 환자를 처치할 수 있다. 이들 5명의 환자 중 2명 미만에서 용량 제한 독성이 발생하면, 10명의 환자를 그 용량 수준으로 더 동원할 수 있다. 그러나, 감소된 폴리-ICLC 수준에서 2명 이상의 환자에서 DLT가 발생하면, 연구는 중단될 것이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 상이한 유형의 별개의 돌연변이 및 neoORF의 예를 보여준다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 프라임 부스트(prime boost) 전략에 기초한 면역화 스케쥴을 예시한다. 다중의 면역화는 처음 약 3주에 걸쳐 일어나서, 면역 반응의 프라이밍 단계 동안 초기의 고도의 항원 노출을 유지할 수 있다. 그 다음, 환자를 8주 동안 휴지시켜, 기억 T 세포가 발생하게 할 수 있으며, 그 다음, 이들 T 세포를 부스팅시켜, 강력한 진행 반응을 유지할 것이다.
도 6은 본 발명의 예시적인 양태에 따른 1차 면역학적 종점을 나타내는 시각표를 보여준다.
도 7은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 신규 면역의 자극과 결합된 국소 면역 억제의 경감의 조합을 평가하기 위한 체크포인트 차단 항체를 사용한 동시-치료법을 시행하기 위한 시각표를 예시한 것이다. 도식에 나타낸 바와 같이, 체크포인트 차단 치료법, 예를 들어, 본원에 나타낸 바와 같은 항-PDL1에 적절한 후보로서 참가하는 환자를 참가시키고 즉시 항체로 처치하면서, 백신을 제조할 수 있다. 그 다음, 환자에 백신접종할 수 있다. 프라이밍 단계의 백신접종이 일어나는 동안 체크포인트 차단 항체 투여를 계속하거나 아마도 연기할 수 있다.
도 8은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 상이한 신생-항원 돌연변이에 대한 순위 지정을 보여주는 표이다.
도 9는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 4개의 하위군의 풀로의 개별 신생-항원 펩티드의 약물 산물 처리를 도시한 개략도를 보여준다.
도 10은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 종양 신생항원을 체계적으로 발견하기 위한 전략의 개략도를 보여준다. 암 시료에서의 종양 특이적 돌연변이는 전체-엑솜(WES) 또는 전체-게놈 시퀀싱(WGS)을 사용하여 검출되고, 돌연변이 호출 알고리즘(예를 들어, Mutect)의 적용을 통해 확인될 수 있다. 이후에, 후보 신생에피토프는 충분히 입증되어 있는 알고리즘(예를 들어, NetMHCpan)을 사용하여 예측될 수 있으며, 그들의 확인은 펩티드-HLA 결합에 대한 실험적 입증에 의해, 그리고 RNA 수준에서의 유전자 발현의 확인에 의해 개선될 수 있다. 이후에, 이들 후보 신생항원을 종양-특이적 T 세포 반응을 자극하는 그들의 능력에 대하여 시험할 수 있다.
도 11a 내지 도 11c는 만성 림프구성 백혈병(CLL)에서 신생항원을 생성하는 잠재력을 갖는 점 돌연변이의 부류의 빈도를 보여준다. 91건의 CLL 사례로부터 생성된 WES 및 WGS 데이터의 분석에 의해, (a) 미스센스 돌연변이가 신생-에피토프를 생성하는 잠재력을 갖는 가장 빈번한 체세포 변경의 부류인 한편, (b) 프레임쉬프트 사입 및 결실, 및 (c) 스플라이스-부위 돌연변이가 덜 흔한 사례를 이루는 것이 드러났다.
도 12a 내지 도 12d는 기능적으로-정의된 신생에피토프 및 CLL 사례에 대한 NetMHCpan 예측 알고리즘의 응용을 도시한 것이다. 도 12a는 예측된 결합 친화성을 기반으로 분류된, NetMHCpan에 의해 시험된, 문헌에 보고된 33개의 기능적으로 확인된 암 신생에피토프의 그들의 알려져 있는 제한 HLA 대립형질로의 예측된 결합(IC50)을 보여준다. 도 12b는 HLA 타이핑 정보가 이용가능한 31명의 CLL 환자에 걸쳐 150 nM 미만(흑색) 및 150 내지 500 nM(회색)의 HLA 결합 친화성을 갖는 예측된 펩티드의 수의 분포를 보여준다. 도 12c는 합성된 펩티드를 사용한 경쟁적 MHC I 대립형질-결합 분석법을 사용하여, HLA-A 및 -B 대립형질 결합에 대한, 4명의 환자 유래의 펩티드의 예측된 결합(NetMHCpan에 의해 500 nM 미만의 IC50)을 실험적으로 결정된 결합 친화성과 비교하는 그래프를 보여준다. 실험적 결합(IC50 < 500 nM)의 증거가 있는 예측된 펩티드의 백분율이 나타나 있다. 도 12d는 HLA 타이핑 및 아피메트릭스(Affymetrix) U133 2.0+ 유전자 발현 데이터가 이용가능한 26명의 CLL 환자로부터, 모든 체세포 돌연변이된 유전자에 대하여(n=347), 그리고 500 nM 미만의 IC50의 예측된 HLA 결합 점수를 갖는 신생에피토프를 인코딩하는 유전자 돌연변이의 서브셋에 대하여(n=180), 유전자 발현의 분포를 시험하였다. 부재-저: 가장 낮은 사분위수 발현 내의 유전자; 중간: 2개의 중간 사분위수 발현 내의 유전자; 및 고: 가장 높은 사분위수의 발현 내의 유전자.
도 13A 및 도 13B는 도 12d에서와 같으나, 개별적으로 9-mer(도 13A) 및 10-mer 펩티드(도 13B)에 대한 동일한 데이터를 보여준다. 각 경우에, 실험적 결합의 증거가 있는, 150 nM 미만 및 150 내지 500 nM의 예측된 IC50을 갖는 펩티드의 백분율이 나타나 있다.
도 14A 내지 도 14c는 환자 1에서 ALMS1 및 C6ORF89의 돌연변이가 면역원성 펩티드를 생성하는 것을 도시한 것이다. 도 14A는 25개의 미스센스 돌연변이가 환자 1 CLL 세포에서 확인되었으며, 이로부터 13개의 돌연변이 유래의 30개의 펩티드가 환자 1의 MHC 클래스 I 대립형질에 결합하는 것으로 예측됨을 보여준다. 9개의 돌연변이 유래의 총 14개의 펩티드가 HLA에 결합하는 것으로 실험적으로 확인하였다. 환자 1 유래의 이식후 T 세포(7년)를 풀마다 유사한 예측된 HLA 결합을 갖는 6개의 돌연변이된 펩티드로 된 5개의 풀을 사용하여, 4주 동안 생체외에서 주마다 자극한 후에, IFN-γ ELISPOT 분석법으로 시험하였다. 도 14B는 T 세포에 의한 증가된 IFN-γ 분비가 풀 2 펩티드에 대하여 검출되었음을 보여준다. 음성 대조군 - 관련없는 Tax 펩티드; 양성 대조군 - PHA. 도 14c는 풀 2 펩티드 중에서, 환자 1 T 세포가 돌연변이된 ALMS1 및 C6ORF89 펩티드에 반응성이었음을 보여준다(우측 패널; 2벌의 웰로부터의 평균 결과가 나타나 있음). 좌측 패널-돌연변이된 및 야생형 ALMS1 및 C6ORF89 펩티드의 예측 및 실험 IC50 점수(nM).
도 15는 FNDC3B, C6orf89 및 ALMS1 내의 돌연변이 부위 근처의 서열 환경에 진화적 보존이 결여되어 있음을 예시한다. 각각의 유전자로부터 생성된 신생에피토프는 네모 안에 있다. 적색-4개 모두의 종에서 보존된 아미노산(aa); 청색-4개의 종 중 적어도 2개의 종에서 보존된 aa; 흑색-종들 간의 보존 부재.
도 16은 FNDC3B, C6orf89 및 ALMS1 유전자에서 보고된 체세포 돌연변이의 국소화를 보여준다. CLL 환자 1 및 2의 FNDC3B, C6orf89 및 ALMS1에서 확인된 미스센스 돌연변이가 암에 대해 이전에 보고된 이들 유전자의 체세포 돌연변이(COSMIC 데이터베이스)와 비교되어 있다.
도 17은 돌연변이된 FNDC3B가 환자 2에서 천연 면역원성 신생에피토프를 생성하는 것을 보여준다. 도 17A는 26개의 미스센스 돌연변이가 환자 2 CLL 세포에서 확인되었으며, 이로부터 16개의 돌연변이 유래의 37개 펩티드가 환자 2의 MHC 클래스 I 대립형질에 결합하는 것으로 예측되었음을 보여준다. 12개의 돌연변이 유래의 총 18개의 펩티드가 결합하는 것으로 실험적으로 확인하였다. 환자 2 유래의 이식후 T 세포(3년)를 생체외에서 2주 동안 3개의 풀의 실험적으로 입증된 결합성 돌연변이된 펩티드(총 18개 펩티드)로 펄싱된 자가 DC 또는 B 세포로 자극하였다(표 S6 참조). 도 17B는 증가된 IFN-γ 분비가 풀 1 펩티드로 자극된 T 세포에서 ELISPOT 분석법에 의해 검출되었음을 보여준다. 도 17c는 풀 1 펩티드 중에서, 증가된 IFN-γ 분비가 mut-FNDC3B 펩티드에 대하여 검출되었음을 보여준다(하부 패널; 2벌의 웰로부터의 평균 결과가 나타나 있음). 상측 패널 - 돌연변이- 및 야생형-FNDC3B 펩티드의 예측된 및 실험적 IC50 점수. 도 17d는 mut-FNDC3B에 반응성인 T 세포가 돌연변이된 에피토프에 대하여 특이성을 나타내나, 상응하는 야생형 펩티드(농도: 0.1 내지 10 ㎍/㎖)에 대하여 나타내지 않으며, 다기능성이어서, IFN-γ, GM-CSF 및 IL-2를 분비함을 예시한 것이다(돌연변이 대 야생형 펩티드에 대한 T 세포 반응성 간의 비교를 위한 이원분산분석 모델링으로부터의 터키(Tukey) 사후 검정). 도 17e는 mut-FNDC3B-특이적 T 세포가 클래스 I-제한 방식(좌측)으로 반응성이며, 그들이 FNDC3B 돌연변이를 포함하는 300bp의 미니유전자(minigene)를 인코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션된 HLA-A2 APC를 인식하기 때문에, 돌연변이된 FNDC3B의 내인적으로 처리되고 제시된 형태를 인식하는 것을 보여준다(우측)(양측 t 검정). 상부 우측 - 돌연변이- 및 야생형- FNDC3B를 인코딩하는 미니유전자의 발현을 확인시켜주는 웨스턴 블롯 분석. 도 17f는 HLA-A2+/mut FNDC3B 사량체에 의해 검출시, mut-FNDC3B 에피토프를 인식하는 T 세포가 정상의 공여자 유래의 T 세포에 비하여 환자 2에서의 T 세포에서 더욱 빈번하게 검출되는 것을 보여준다. 도 17g는 환자 2(삼각형), CLL-B 세포(n=182) 및 건강한 성인 공여자 유래의 정상의 CD19+ B 세포(n=24)에서의 FNDC3B (아피메트릭스 U133Plus2 어레이 데이터에 기초)의 발현을 보여준다.
도 18은 이식 과정과 관계한 mut-FNDC3B 특이적 T 세포 반응의 역학을 예시한 것이다. 도 18은 HSCT 전과 후의 일련의 시점에 클로노타입 IgH 서열에 기초한 환자 종양-특이적 Taqman PCR 분석법을 사용하여 분자적 종양 부하량(burden)을 환자 2에서 측정하였음을 보여준다(상측 패널). 중간의 패널 - wt-FNDC3B 또는 펩티드-펄싱된 자가 B 세포로의 자극 후에, IFN-γ ELISPOT에 의한 동종-HSCT 이전 및 이후의 말초 혈액 유래의 관련없는 펩티드와 비교한 mut-FNDC3B 반응성 T 세포의 검출. 각 시점에 세포마다 IFN-γ-분비 스폿(spot)의 개수를 3벌로 측정하였다(웰치(Welch) t 검정; 돌연변이 대 야생형). 삽도 - 0.1 내지 10 ㎍/㎖(로그 스케일) mut-FNDC3B 펩티드로 펄싱된 APC에 대한 노출 이후에 HSCT 이후 32개월(적색)에 비한 HSCT 이후 6개월(자주색)로부터의 T 세포의 IFN-γ 분비. 하부 패널 - 환자 2의 말초 혈액에서의 HSCT 이전 및 이후의 네스티드 클론-특이적 CDR3 PCR에 의한 mut-FNDC3B-특이적 TCR Vβ11 세포의 검출(보충 방법 참조). 삼각형 - 시료가 시험된 시점; NA- 증폭 없음; 흑색: 증폭 검출됨, '+'는 최대 2배의 검출가능한 증폭을 나타내며, '++'는 클론-특이적 Vβ11 서열의 검출가능한 발현이 있는 모든 시료의 중간값 수준보다 2배 넘게 더 큰 증폭을 나타낸다.
도 19a 내지 도 19d는 환자 2에서의 mut-FNDC3B 특이적 TCR Vβ 특이적 프라이머의 설계를 보여준다. 도 19a는 IFN-γ 포착 분석법을 사용하여 HSCT 이후 6개월에 환자 2 PBMC로부터 검출되고 단리된 mut-FNDC3B 특이적 T 세포를 보여준다. 도 19b는 FNDC3B-반응성 T 세포 유래의 RNA가 TCR Vβ11을 발현하여 350bp 길이의 앰플리콘(amplicon)을 생성함으로 보여준다. 도 19c는 Vβ11-특이적 리얼 타임(real time) 프라이머를 mut-FNDC3B 클론-특이적 CDR3 재배열 서열에 기초하여 정량적 PCR 프로브가 접합부 다양성(주황색)의 영역 내에 배치되게 설계하였음을 보여준다. 도 19d는 스펙트라타이핑(spectratyping)에 의해 검출시 FNDC3B-반응성 T 세포가 Vβ11에 대하여 모노클로널이었음을 보여준다.
도 20a 내지 도 20g는 암에 대한 신생항원 발견 파이프라인의 응용을 예시한 것이다. 도 20a는 대규모 병행 시퀀싱에 의한 암에 걸쳐 검출되는 전체 체세포 돌연변이율의 비교를 보여준다. 적색 - CLL; 청색 - 투명 세포 신장 암종(RCC) 및 녹색 - 흑색종. LSCC: 폐 편평 세포 암종, 폐 AdCa: 폐 선암종, ESO AdCa: 식도 선암종, DLBCL: 광범위 대형 B-세포 림프종, GBM: 교모세포종, 유두상 RCC: 유두상 신장 세포 암종, 투명 세포 RCC: 투명 세포 신장 암종, CLL: 만성 림프구성 백혈병, AML: 급성 골수성 백혈병. 도 20b의 분포는 흑색종, 투명 세포 RCC 및 CLL에서 사례마다의 미스센스, 프레임쉬프트 및 스플라이스-부위 돌연변이의 수를 보여주며, 도 20c는 시료마다 생성된 평균 neoORF 길이를 보여주고, 도 20d는 미스센스 및 프레임쉬프트 돌연변이로부터 생성된 150 nM 미만(파선) 및 500 nM 미만(실선)의 IC50을 갖는 예측된 신생펩티드를 보여준다. 도 20e는 13개의 암에 걸쳐 사례마다 미스센스, 프레임쉬프트 및 스플라이스-부위 돌연변이 수의 분포(박스 플롯(box plot)으로 나타냄)를 도시한 것이다. 도 20f는 시료마다 생성된 합계된 neoORF 길이를 보여준다. 도 20g는 미스센스 및 프레임쉬프트 돌연변이로부터 생성된 150 nM 미만 및 500 nM 미만의 IC50을 갖는 예측된 신생펩티드를 보여준다. 모든 박스 플롯에 대하여, 박스의 좌측 및 우측 말단은 각각 제25 및 제75 백분위수 값을 나타내는 한편, 중간의 세그먼트는 중간값이다. 막대의 좌측 및 우측 맨끝은 최소 및 최대 값으로 연장된다.
상세한 설명
본 발명은 복수의 신생물/종양 특이적 신생-항원을 포함하는, 치료적 유효량의 약제학적 조성물(예를 들어, 암 백신)을 대상체(예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간)에게 투여함에 의한 신생물, 더욱 특별히는 종양의 치료를 위한 개인맞춤화 전략에 관한 것이다. 하기 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 적어도 부분적으로, 전체 게놈/엑솜 시퀀싱을 사용하여 개별 환자의 신생물/종양에 독특하게 존재하는 모든 또는 거의 모든 돌연변이된 신생-항원을 확인할 수 있으며, 이러한 돌연변이된 신생-항원의 집합을 분석하여, 환자의 신생물/종양의 치료를 위한 개인맞춤화 암 백신으로 사용하기 위한 신생-항원의 특정 최적화된 서브셋을 확인할 수 있다는 발견에 기초한다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이, 신생물/종양 특이적 신생-항원의 집단은 각 환자의 신생물/종양 및 정상 DNA를 시퀀싱하여, 종양-특이적 돌연변이를 확인하고, 환자의 HLA 알로타입(allotype)을 결정함으로써 확인될 수 있다. 그 다음, 신생물/종양 특이적 신생-항원 및 그들의 동족 고유 항원의 집단은 종양-특이적 돌연변이가 환자의 HLA 알로타입에 결합할 수 있는 에피토프를 생성하는지, 특히 종양-특이적 돌연변이가 동족 고유 항원보다 더욱 효율적으로 환자의 HLA 알로타입에 결합할 수 있는 에피토프를 생성하는지를 예측하기 위한 입증된 알고리즘을 사용한 생물정보 분석으로 처리될 수 있다. 이러한 분석에 기초하여, 이들 돌연변이의 서브셋에 상응하는 복수의 펩티드를 각 환자에 대하여 설계하고 합성할 수 있으며, 환자의 면역화에서 암 백신으로 사용하기 위해 함께 풀링할 수 있다. 신생-항원 펩티드는 애쥬번트(예를 들어, 폴리-ICLC) 또는 다른 항-신생물제와 병용될 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 이들 신생-항원은 중심 흉선 관용을 우회하는 한편(이에 따라 보다 강력한 항-종양 T 세포 반응을 가능하게 함), 자가면역성에 대한 가능성을 감소시키는 것으로 예상된다(예를 들어, 정상의 자가-항원의 표적화를 회피함으로써).
면역계는 2가지 기능적 하위계로 분류될 수 있다: 선천성 및 후천성 면역계. 선천성 면역계는 감염에 대한 제1 선의 방어이며, 대부분의 잠재적인 병원체는 그들이 예를 들어, 뚜렷한 감염을 유발할 수 있기 전에 이러한 계에 의해 신속히 중화된다. 후천성 면역계는 항원으로 지칭되는, 침입하는 유기체의 분자 구조에 반응한다. 2가지 유형의 후천성 면역 반응이 존재하는데, 이는 체액성 면역 반응 및 세포-매개의 면역 반응을 포함한다. 체액성 면역 반응에서, B 세포에 의해 체액으로 분비되는 항체는 병원체-유래의 항원에 결합하여, 다양한 메카니즘, 예를 들어, 보체-매개의 용해를 통한 병원체의 제거를 야기한다. 세포-매개의 면역 반응에서, 다른 세포를 파괴할 수 있는 T-세포가 활성화된다. 예를 들어, 질병과 관련된 단백질이 세포에 존재한다면, 그들은 단백질 가수분해에 의해 세포 내에서 펩티드로 단편화된다. 그 다음, 특정 세포 단백질은 그들 자체가 이러한 방식으로 형성된 항원 또는 펩티드에 부착하고, 그들을 세포의 표면으로 수송하며, 여기서, 그들은 신체의 분자적 방어 메카니즘, 특히, T-세포에 제시된다. 세포독성 T 세포는 이들 항원을 인식하고, 항원이 부착된 세포를 사멸시킨다.
세포 표면 상에 펩티드를 수송하고, 제시하는 분자는 주 조직적합성 복합체(MHC)의 단백질로 지칭된다. MHC 단백질은 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II로 지칭되는 2가지 유형으로 분류된다. 2가지 MHC 클래스의 단백질의 구조는 매우 유사하나; 그들은 매우 상이한 기능을 갖는다. MHC 클래스 I의 단백질은 대부분의 종양 세포를 비롯하여 신체의 거의 모든 세포의 표면 상에 존재한다. MHC 클래스 I 단백질에, 보통 내인성 단백질로부터 또는 세포 내측에 존재하는 병원체로부터 기원하는 항원이 로딩된 다음, 나이브 또는 세포독성 T-림프구(CTL)에 제시된다. MHC 클래스 II 단백질은 수지상 세포, B-림프구, 대식구 및 기타 항원-제시 세포 상에 존재한다. 그들은 주로 외부의 항원 공급원, 즉, 세포의 외측으로부터 처리된 펩티드를 T-헬퍼(Th) 세포에 제시한다. MHC 클래스 I 단백질에 의해 결합되는 펩티드의 대부분은 유기체 그 자신의 건강한 숙주 세포에서 생성된 세포질 단백질로부터 기원하며, 보통 면역 반응을 자극하지 않는다. 따라서, 그러한 클래스 I의 자가-펩티드-제시 MHC 분자를 인식하는 세포독성 T-림프구는 흉선(중심 관용)에서 제거되거나, 그들이 흉선으로부터 방출된 후에 제거되거나 불활성화, 즉, 관용화된다(말초 관용). MHC 분자는 그들이 펩티드를 비-관용화 T-림프구에 제시하는 경우 면역 반응을 자극할 수 있다. 세포독성 T-림프구는 그들의 표면 상에 T-세포 수용체(TCR) 및 CD8 분자 둘 모두를 갖는다. T-세포 수용체는 MHC 클래스 I의 분자와 복합체화된 펩티드를 인식하고 이와 결합할 수 있다. 각각의 세포독성 T-림프구는 특유한 T- 세포 수용체를 발현하는데, 이는 특정 MHC/펩티드 복합체에 결합할 수 있다.
펩티드 항원은 그들이 세포 표면 상에 제시되기 이전에, 소포체 내에서의 경쟁적 친화성 결합에 의해 그들 자체가 MHC 클래스 I에 부착한다. 여기서, 개별 펩티드 항원의 친화성은 그의 아미노산 서열 및 아미노산 서열 내의 정의된 위치에서의 특이적 결합 모티프의 존재와 직접적으로 관련되어 있다. 그러한 펩티드의 서열이 알려져 있다면, 예를 들어, 펩티드 백신을 사용하여 질병 세포에 대하여 면역계를 조작할 수 있다.
치유적 및 종양-특이적 면역요법을 개발하는데 결정적인 장애물 중 하나는 자가면역을 회피하기 위한 고도로 특이적이며 제한된 종양 항원을 확인하고 선택하는 것이다. 악성종양 세포 내의 유전자 변화(예를 들어, 역위, 전좌, 결실, 미스센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이 등)의 결과로 생기는 종양 신생-항원은 가장 종양-특이적인 항원의 부류를 나타낸다. 신생-항원은 그들을 확인하고, 최적화된 신생-항원을 선택하고, 백신에 사용하기 위하여 신생-항원을 생성함에 있어서의 기술적 어려움 때문에, 암 백신에서 드물게 사용되어 왔다. 본 발명에 따르면, 이들 문제는 다음에 의해 다루어질 수 있다:
● 각 환자 유래의 종양 시료 대 일치되는 생식계열 시료의 전체 게놈, 전체 엑솜(오직 포착된 엑손만) 또는 RNA 시퀀싱을 사용하여 DNA 수준에서 신생물/종양에서 모든 또는 거의 모든 돌연변이를 확인하고;
● 확인된 돌연변이를 하나 이상의 펩티드-MHC 결합 예측 알고리즘을 사용하여 분석하여, 신생물/종양 내에서 발현되고, 환자 HLA 대립형질에 결합할 수 있는 복수의 후보 신생-항원 T 세포 에피토프를 생성하고;
● 암 백신에 사용하기 위하여, 모든 neoORF 펩티드 및 예측된 결합 펩티드의 세트로부터 선택되는 복수의 후보 신생-항원 펩티드를 합성한다.
예를 들어, 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 전달하는 것은 다음을 포함할 수 있다:
(1) 개체의 HLA 분자에 결합할 수 있는 개인의 돌연변이된 펩티드의 예측. 면역원으로 사용하기 위한 특정 돌연변이를 효율적으로 선택하는 것은 환자 HLA 유형의 확인, 및 돌연변이된 펩티드가 환자의 HLA 대립형질에 효율적으로 결합하는 지를 예측하는 능력을 필요로 한다. 최근에, 입증된 결합 및 비-결합 펩티드를 사용한 신경망 기반의 학습 접근법에 의해, 주요 HLA-A 및 -B 대립형질에 대한 예측 알고리즘의 정확성이 진전되었다.
(2) 긴 펩티드의 다중- 에피토프 백신으로서 약물의 제형화. 실제적으로 가능한 많은 돌연변이된 에피토프를 표적화하는 것은 면역계의 막대한 능력을 이용하며, 특정 면역 표적화된 유전자 산물의 하향-조절에 의해 면역학적 회피 가능성을 방지하고, 알려져 있는 에피토프 예측 방법의 부정확성을 보완한다. 합성 펩티드는 다중의 면역원을 효율적으로 제조하고, 돌연변이 에피토프의 확인을 효율적인 백신으로 신속하게 전달하기에 특히 유용한 수단을 제공한다. 펩티드는 오염 박테리아 또는 동물 물질이 없는 시약을 사용하여 화학적으로 손쉽게 합성되고 용이하게 정제될 수 있다. 작은 크기는 단백질의 돌연변이된 영역에 대한 분명한 집중을 가능하게 하고, 또한 다른 성분(비돌연변이된 단백질 또는 바이러스 벡터 항원)과의 관련없는 항원 경쟁을 감소시킨다.
(3) 강력한 백신 애쥬번트와의 병용. 효율적인 백신은 면역 반응을 개시하기 위하여 강력한 애쥬번트를 필요로 한다. 하기 기재된 바와 같이, 폴리-ICLC, TLR3의 효능제 및 RNA 헬리카제(helicas) - MDA5 및 RIG3의 도메인은 백신 애쥬번트에 바람직한 몇몇 특성을 나타내었다. 이들 특성은 생체내에서의 면역 세포의 전신 및 전신 활성화의 유도, 자극성 케모카인 및 사이토카인의 생성 및 DC에 의한 항원-제시의 자극을 포함한다. 추가로, 폴리-ICLC는 인간에서 지속적인 CD4+ 및 CD8+ 반응을 유도할 수 있다. 중요한 것은 폴리-ICLC로 백신접종된 대상체에서, 그리고 매우 효율적인 복제-가능(replication-competent) 황열 백신을 제공받은 자원자에서의 전사 및 신호 전달 경로의 상향조절에서 두드러진 유사성이 관찰되었다는 점이다. 추가로, 최근 단계 1 연구에서, NY-ESO-1 펩티드 백신(몬타나이드에 더하여)과 병용하여 폴리-ICLC로 면역화된 난소 암종 환자의 90% 초과에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유도 및 펩티드에 대한 항체 반응이 나타났다. 동시에, 폴리-ICLC를 현재까지 25회 초과의 임상 시험에서 광범위하게 시험하였으며, 비교적 양성의 독성 프로파일을 나타내었다.
본 발명의 상기 기재된 이점은 하기에 추가로 상세히 기재된다.
종양 특이적 신생-항원 돌연변이의 확인
본 발명은 적어도 부분적으로, 신생물/종양 내의 모든 또는 거의 모든 돌연변이(예를 들어, 전좌, 역위, 대규모 및 소규모 결실 및 삽입, 미스센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이 등)를 확인하는 능력에 기초한다. 특히, 이들 돌연변이는 대상체의 신생물/종양 세포의 게놈에 존재하지만, 대상체의 정상 조직에는 존재하지 않는다. 그러한 돌연변이는 그들이 환자의 신생물/종양에 특유한 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질(예를 들어, 신생-항원)을 초래하는 변화를 야기한다면 특히 흥미로운 것이다. 예를 들어, 유용한 돌연변이는 하기를 포함할 수 있다: (1) 단백질에서 상이한 아미노산을 야기하는 비-동의(non-synonymous) 돌연변이; (2) 정지 코돈이 변형되거나 결실되어 C-말단에서 신규 종양-특이적 서열을 갖는 보다 긴 단백질의 번역을 야기하는 리드-쓰루 돌연변이; (3) 인트론을 성숙 mRNA 내에 포함시켜 독특한 종양-특이적 단백질 서열을 야기하는 스플라이스 부위 돌연변이; (4) 2개의 단백질의 접합부에서 종양 특이적 서열을 갖는 키메라 단백질을 발생시키는 염색체 재배열(즉, 유전자 융합); (5) 신규 종양 특이적 단백질 서열을 갖는 신규 개방해독틀을 야기하는 프레임쉬프트 돌연변이 또는 결실 등. 종양 세포 내의 예를 들면, 스플라이스-부위, 프레임쉬프트, 리드-쓰루 또는 유전자 융합 돌연변이로부터 발생된, 돌연변이를 갖는 펩티드 또는 돌연변이된 폴리펩티드는 종양 세포 대 정상 세포 내의 DNA, RNA 또는 단백질을 시퀀싱함으로써 확인될 수 있다.
통상의 종양 드라이버 유전자(driver gene)로부터 유래된 개인 신생-항원 펩티드가 본 발명의 범주 내에 있으며, 이전에 확인된 종양 특이적 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 알려져 있는 통상의 종양 드라이버 유전자 및 통상의 종양 드라이버 유전자 내의 종양 돌연변이는 월드 와이드 웹((www)sanger.ac.uk/cosmic)에서 찾을 수 있다.
수백만 개의 개별 DNA 또는 RNA 분자로부터 직접적으로 서열 정보를 동시에 수득하기 위해 다수의 시도가 현재 진행되고 있다. 실시간 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(Real-time single molecule sequencing-bysynthesis) 기술은 형광 뉴클레오티드가 시퀀싱될 주형에 상보적인 DNA의 신생 가닥으로 혼입될 때 형광 뉴클레오티드를 검출하는 것에 의존한다. 한 방법에서, 30 내지 50개 염기의 길이의 올리고뉴클레오티드가 5' 말단에서 유리 커버 슬립에 공유적으로 부착된다. 이들 부착된 가닥은 2가지 기능을 수행한다. 첫째, 그들은 주형이 표면-결합 올리고뉴클레오티드에 상보적인 포획 테일(tail)을 갖도록 구성된다면, 표적 주형 가닥에 대한 포획 부위로서 작용한다. 또한, 그들은 서열 판독의 기초를 형성하는 주형 지향된 프라이머 연장을 위한 프라이머로서 작용한다. 포획 프라이머는 합성, 검출, 및 염료의 제거를 위한 염료-링커의 화학적 절단으로 구성된 다수의 사이클을 이용한 서열 결정을 위한 고정된 위치 부위로서 작용한다. 각각의 사이클은 중합효소/표지된 뉴클레오티드 혼합물의 첨가, 세정, 영상화 및 염료의 절단으로 구성된다. 대안적 방법에서, 중합효소는 형광 공여자 분자에 의해 변형되고 유리 슬라이드 상에 고정화되는 한편, 각각의 뉴클레오티드는 감마 포스페이트에 부착된 수용자 형광 모이어티(moiety)에 의해 색상-코딩된다. 이 시스템은 뉴클레오티드가 드 노보(de nove) 쇄 내로 혼입됨에 따라 형광-태깅된(tagged) 중합효소 및 형광 변형된 뉴클레오티드 사이의 상호작용을 검출한다. 다른 합성에 의한 시퀀싱 기술도 존재한다.
바람직하게는, 임의의 적합한 합성에 의한 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 돌연변이를 확인할 수 있다. 4가지의 주요 합성에 의한 시퀀싱 플랫폼이 현재 이용가능하다: 로슈/454 라이프 사이언시스(Roche/454 Life Sciences)로부터의 게놈 시퀀서(Genome Sequencer), 일루미나/솔렉사(Illumina/Solexa)로부터의 HiSeQ 어날라이저(Analyzer), 어플라이드 바이오시스템즈(Applied BioSystems)로부터의 SOLiD 시스템 및 헬리코스 바이오사이언스즈(Helicos Biosciences)로부터의 헬리스코프(Heliscope) 시스템. 합성에 의한 시퀀싱 플랫폼은 퍼시픽 바이오사이언스즈(Pacific BioSciences) 및 비지젠 바이오테크놀로지즈(visiGen Biotechnologies)에 의해서도 기재되었다. 이들 플랫폼 각각이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시퀀싱될 복수의 핵산 분자를 지지체(예를 들면, 고체 지지체)에 결합시킨다. 핵산을 지지체 상에 고정화시키기 위해, 포획 서열/보편적인 프라이밍 부위가 주형의 3' 및/또는 5' 말단에 부가될 수 있다. 핵산은 포획 서열을 지지체에 공유적으로 부착된 상보적인 서열에 혼성화시킴으로써 지지체에 결합될 수 있다. 포획 서열(보편적인 포획 서열로도 지칭됨)은 보편적인 프라이머로서 이중으로 작용할 수 있는 지지체에 부착된 서열에 상보적인 핵산 서열이다.
포획 서열에 대한 대체물로서, 커플링 쌍(예를 들면, 미국 특허 출원 제2006/0252077호에 기재된 바와 같은 항체/항원, 수용체/리간드 또는 아비딘-비오틴 쌍)의 한 구성원이 상기 커플링 쌍의 각각의 제2 구성원으로 코팅된 표면 상에 포획될 각각의 단편에 연결될 수 있다. 포획 후, 서열을 예를 들면, 실시예 및 미국 특허 제7,283,337호에 기재된 바와 같이 합성에 의한 주형 의존적 시퀀싱을 포함하는 단일 분자 검출/시퀀싱에 의해 분석할 수 있다. 합성에 의한 시퀀싱에서, 표면-결합된 분자는 중합효소의 존재하에 복수의 표지된 뉴클레오티드 트리포스페이트에 노출된다. 주형의 서열은 성장하는 쇄의 3' 말단에 혼입된 표지된 뉴클레오티드의 순서에 의해 결정된다. 이것은 실시간으로 수행될 수 있거나 단계-및-반복 방식으로 수행될 수 있다. 실시간 분석을 위해, 각각의 뉴클레오티드에 대한 상이한 광학 표지를 혼입할 수 있고, 다중 레이저를 이용하여 혼입된 뉴클레오티드를 자극할 수 있다.
임의의 세포 또는 조직을 사용하여 본원에 기재된 시퀀싱 방법에서 사용될 핵산 시료를 수득할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, DNA 또는 RNA 시료를 신생물/종양 또는 체액, 예를 들면, 공지된 기법(예를 들면, 정맥채혈)에 의해 수득된 혈액 또는 타액으로부터 수득한다. 대안적으로, 무수 시료(예를 들면, 모발 또는 피부)에 대하여 핵산 시험을 수행할 수 있다.
개체의 DNA 또는 RNA에서 특정 돌연변이 또는 대립형질의 존재를 검출하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 이 분야에서의 진보는 정확하고 용이하고 저렴한 대규모 SNP 유전형분석(genotyping)을 제공하였다. 가장 최근에, 예를 들면, 동적 대립형질 특이적 혼성화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동(MADGE), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 올리고뉴클레오티드 특이적 라이게이션(ligation), 택맨(TaqMan) 시스템 및 다양한 DNA "칩" 기술, 예컨대, 아피메트릭스 SNP 칩을 포함하는 여러 신규 기술이 기재되어 있다. 이들 방법은 전형적으로 PCR에 의한 표적 유전적 영역의 증폭을 필요로 한다. 침윤성 절단에 의한 신호 소분자의 발생 후 질량 분광법 또는 고정된 패드록(padloc) 프로브 및 회전 환(rolling-circle) 증폭에 기초한 다른 새로 개발된 방법이 궁극적으로 PCR에 대한 필요성을 없앨 것이다. 특정 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는, 당업계에서 공지된 몇몇 방법이 하기에 요약되어 있다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
PCR 기반의 검출 수단은 복수의 마커의 동시적인 다중 증폭을 포함할 수 있다. 예를 들면, 크기가 중첩되지 않고 동시에 분석될 수 있는 PCR 산물을 생성하기 위해 PCR 프라이머를 선택하는 것은 당업계에서 널리 알려져 있다.
대안적으로, 차등적으로 표지되어 있어 각각이 차등적으로 검출될 수 있는 프라이머를 사용하여 상이한 마커들을 증폭시킬 수 있다. 물론, 혼성화에 기초한 검출 수단은 한 시료에서 다중의 PCR 산물의 차등적 검출을 가능하게 한다. 복수의 마커의 다중 분석을 가능하게 하는 다른 기술이 당업계에 알려져 있다.
게놈 DNA 또는 세포 RNA 내의 단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 용이하게 하는 몇몇 방법이 개발되었다. 일 실시형태에 있어서, 단일 염기 다형성을 예를 들면, 미국 특허 제4,656,127호에 개시된 바와 같이 특수 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드를 사용하여 검출할 수 있다. 상기 방법에 따르면, 다형성 부위의 인접 3' 대립형질 서열에 상보적인 프라이머가 특정 동물 또는 인간으로부터 수득된 표적 분자에 혼성화되게 한다. 표적 분자 상의 상기 다형성 부위가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 유도체는 혼성화된 프라이머의 말단에 혼입될 것이다. 그러한 혼입은 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대한 내성을 나타내게 함으로써 그의 검출을 가능하게 한다. 시료의 엑소뉴클레아제 내성 유도체의 아이덴티티가 알려져 있기 때문에, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대한 내성을 나타내게 된다는 발견에 의해, 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드가 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체에 상보적이었다는 것이 드러난다. 이 방법은 다량의 외래 서열 데이터의 결정을 필요로 하지 않는다는 이점을 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 용액 기반의 방법을 이용하여 다형성 부위의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정한다(Cohen et al.(프랑스 특허 제2,650,840호; 및 PCT 출원 제WO1991/02087호)). 미국 특허 제4,656,127호의 방법에서와 같이, 다형성 부위의 인접 3'의 대립형질 서열에 상보적인 프라이머를 사용할 수 있다. 상기 방법은 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 프라이머의 말단에 혼입되게 될 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 상기 부위의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정한다.
제네틱 비트(Genetic Bit) 분석 또는 GBA®로서 알려져 있는 대안적 방법이 PCT 출원 제WO1992/15712호에 기재되어 있다. GBA®는 표지된 종결자(terminator)와, 다형성 부위의 3' 서열에 상보적인 프라이머의 혼합물을 사용한다. 따라서, 혼입되는 표지된 종결자는 평가될 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 의해 결정되고 이 뉴클레오티드에 상보적이다. Cohen 등(프랑스 특허 제2,650,840호; PCT 출원 제WO1991/02087호)의 방법과 대조적으로, GBA® 방법은 바람직하게는 프라이머 또는 표적 분자가 고체상에 고정되어 있는 이종상 분석법이다.
최근에, DNA 내의 다형성 부위를 분석하기 위해 몇몇 프라이머에 의해 안내된(guided) 뉴클레오티드 혼입 절차가 기재되었다(문헌[Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)]; 문헌[Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)]; 문헌[Syvanen, A.-C, et al., Genomics 8:684-692 (1990)]; 문헌[Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1143-1147 (1991)]; 문헌[Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992)]; 문헌[Ugozzoli, L. et al., GATA 9: 107-112 (1992)]; 문헌[Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208: 171-175 (1993)]). 이들 방법은 그들 모두 다형성 부위에서 염기를 구별하기 위해 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존한다는 점에서 GBA®와 상이하다. 그러한 형식에서, 신호는 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오티드의 전개부(run)에 존재하는 다형성은 상기 전개부의 길이에 비례하는 신호를 야기할 수 있다(문헌[Syvanen, A.-C, et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)]).
종양 특이적 신생-항원을 확인하기 위한 대안적인 방법은 직접적인 단백질 시퀀싱이다. 이중질량분석법(MS/MS)을 포함하는 다차원 MS 기술(MSn)을 이용한 효소 분해의 단백질 시퀀싱을 사용하여 본 발명의 신생-항원을 확인할 수도 있다. 그러한 프로테옴 접근법은 신속한 고도로 자동화된 분석을 가능하게 한다(예를 들어, 문헌[K. Gevaert and J. Vandekerckhove, Electrophoresis 21:1145-1154 (2000)] 참조). 추가로, 알려져 있지 않은 단백질의 고효율 드 노보 시퀀싱 방법을 이용하여, 환자의 종양의 프로테옴을 분석하여 발현된 신생-항원을 확인할 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다. 예를 들어, 메타 샷건(meta shotgun) 단백질 시퀀싱을 사용하여 발현된 신생-항원을 확인할 수 있다(예를 들어, 문헌[Guthals et al. (2012) Shotgun Protein Sequencing with Meta-contig Assembly, Molecular and Cellular Proteomics 11(10):1084-96] 참조).
또한, 종양 특이적 신생-항원은 신생-항원-특이적 T-세포 반응을 확인하기 위해 MHC 다량체를 이용하여 확인될 수도 있다. 예를 들어, 환자 시료에서의 신생-항원-특이적 T-세포 반응의 고효율 분석은 MHC 사량체-기반의 스크리닝 기술을 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hombrink et al. (2011) High-Throughput Identification of Potential Minor Histocompatibility Antigens by MHC Tetramer-Based Screening: Feasibility and Limitations 6(8):1-11]; 문헌[Hadrup et al. (2009) Parallel detection of antigen-specific T-cell responses by multidimensional encoding of MHC multimers, Nature Methods, 6(7):520-26]; 문헌[van Rooij et al. (2013) Tumor exome analysis reveals neoantigen-specific T-cell reactivity in an Ipilimumab-responsive melanoma, Journal of Clinical Oncology, 31:1-4]; 및 문헌[Heemskerk et al. (2013) The cancer antigenome, EMBO Journal, 32(2):194-203] 참조). 그러한 사량체 기반의 스크리닝 기술이 종양 특이적 신생-항원의 초기 확인을 위해 또는 대안적으로 이차 스크리닝 프로토콜로서 사용되어, 환자가 이미 노출된 신생-항원을 평가하여, 본 발명의 백신을 위한 후보 신생-항원의 선택을 용이하게 할 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
종양 특이적 신생-항원의 설계
본 발명은 추가로 단리된 펩티드(예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 확인된 종양 특이적 돌연변이를 함유하는 신생-항원 펩티드, 알려진 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 펩티드 및 본 발명의 방법에 의해 확인된 돌연변이 폴리펩티드 또는 그들의 단편)를 포함한다. 이들 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 "신생-항원 펩티드" 또는 "신생-항원 폴리펩티드"로 지칭된다. "펩티드"라는 용어는 전형적으로 인접 아미노산의 알파-아미노 및 알파-카복실기 간의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 전형적으로 L-아미노산을 표기하기 위하여, 본 명세서에서 "돌연변이 펩티드" 및 "신생-항원 펩티드" 및 "야생형 펩티드"와 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드 또는 펩티드는 다양한 길이의 것일 수 있으며, 최소한 환자의 HLA 분자에 결합하는 것으로 예측되는 작은 영역("에피토프") 및 N- 및 C-말단 방향 둘 모두로 연장되는 추가의 인접 아미노산을 포함할 것이다. 폴리펩티드 또는 펩티드는 그들의 중성(비대전) 형태 또는 염인 형태로 존재할 수 있고, 변형, 예를 들어, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화가 없거나 또는 이들 변형을 함유하여, 변형이 본원에 기재된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 조건을 겪게 할 수 있다.
특정 실시형태에서, 적어도 하나의 신생-항원 펩티드 분자의 크기는 비제한적으로 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120개 이상의 아미노 분자 잔기, 및 그 안에서 유래가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 신생-항원 펩티드 분자는 50개 이하의 아미노산이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 신생-항원 펩티드 분자는 약 20 내지 약 30개 아미노산이다.
보다 긴 펩티드가 몇몇 방식으로 설계될 수 있다. 예를 들어, HLA-결합 영역(예를 들어, "에피토프")이 예측되거나 알려져 있는 경우, 보다 긴 펩티드는 다음 중 어느 하나로 이루어질 수 있다: 각각의 상응하는 유전자 산물의 N- 및 C-말단을 향한 0 내지 10개 아미노산의 연장이 있는 개별 결합 펩티드. 또한, 보다 긴 펩티드는 각각에 대하여 연장된 서열을 갖는 결합 펩티드의 일부 또는 전부의 연결로 이루어질 수 있다. 다른 경우에, 시퀀싱에 의해, 종양에 존재하는 긴(10개 초과의 잔기) 신생-에피토프 서열(예를 들어, 신규한 펩티드 서열을 야기하는 프레임쉬프트, 리드-쓰루 또는 인트론 포함에 기인함)이 드러나는 경우, 보다 긴 펩티드는 신규한 종양-특이적 아미노산의 전체 스트레치로 이루어질 수 있다. 둘 모두의 경우에, 보다 긴 펩티드의 사용은 전문 항원 제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포에 의한 내인적 처리를 필요로 하며, 더욱 효율적인 항원 제시 및 T 세포 반응의 유도를 야기할 수 있다. 일부 경우에, 연장된 서열을 변경하여, 폴리펩티드의 생화학적 특성(용해도 또는 안정성과 같은 특성)을 개선시키거나, 펩티드의 효율적인 프로테아좀 처리 우도를 향상시키는 것이 요망되거나 바람직하다(문헌[Zhang et al (2012) Aminopeptidase substrate preference affects HIV epitope presentation and predicts immune escape patterns in HIV-infected individuals. J. Immunol 188:5924-34]; 문헌[Hearn et al (2010) Characterizing the specificity and co-operation of aminopeptidases in the cytosol and ER during MHC Class I antigen presentation. J. Immunol 184(9):4725-32]; 문헌[Wiemerhaus et al (2012) Peptidases trimming MHC Class I ligands. Curr Opin Immunol 25:1-7]).
신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 HLA 단백질에 결합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 상응하는 고유/야생형 펩티드보다 더 큰 친화성으로 HLA 단백질에 결합할 수 있다. 신생-항원 펩티드 또는 폴리펩티드는 약 1000 nM 미만, 약 500 nM 미만, 약 250 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만의 IC50을 가질 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 대상체에게 투여되는 경우, 자가면역 반응을 유도하고/거나 면역 관용을 일으키지 않는다.
또한, 본 발명은 복수의 신생-항원 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 조성물은 적어도 5개 또는 그 이상의 신생-항원 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 조성물은 적어도 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18 또는 약 20개의 별개의 펩티드를 함유한다. 일부 실시형태에 있어서, 조성물은 적어도 20개의 별개의 펩티드를 함유한다. 본 발명에 따르면, 별개의 펩티드 중 2개 이상이 동일한 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 신생-항원 돌연변이가 neoORF 폴리펩티드를 인코딩한다면, 신생-항원 펩티드 중 2개 이상이 neoORF 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, neoORF 폴리펩티드로부터 유래된 2개 이상의 신생-항원 펩티드는 폴리펩티드에 걸쳐 있는 타일링된(tiled) 어레이를 포함할 수 있다(예를 들어, 신생-항원 펩티드는 neoORF 폴리펩티드의 일부 또는 전부에 걸쳐 있는 일련의 중첩 신생-항원 펩티드를 포함할 수 있다). 이론에 결부되지 않고, 각 펩티드는 그 자체의 에피토프를 갖는 것으로 여겨지며; 이에 따라, 하나의 neoORF 폴리펩티드에 걸쳐 있는 타일링 어레이는 상이한 HLA 분자에 표적화된 폴리펩티드를 야기할 수 있다. 신생-항원 펩티드는 임의의 단백질 코딩 유전자로부터 유래될 수 있다. 신생-항원 펩티드가 유래될 수 있는 예시적인 폴리펩티드는 예를 들어, COSMIC 데이터베이스(월드 와이드 웹((www)sanger.ac.uk/cosmic))에서 찾을 수 있다. COSMIC는 인간 암에서의 체세포 돌연변이에 대한 포괄적인 정보를 관리한다. 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 종양 특이적 돌연변이는 흔한 드라이버 유전자 내에 존재하거나, 특정 암 유형에 대한 흔한 드라이버 돌연변이이다. 예를 들어, 흔한 드라이버 돌연변이 펩티드는 하기의 것을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다: SF3B1 폴리펩티드, MYD88 폴리펩티드, TP53 폴리펩티드, ATM 폴리펩티드, Abl 폴리펩티드, FBXW7 폴리펩티드, DDX3X 폴리펩티드, MAPK1 폴리펩티드 또는 GNB1 폴리펩티드.
신생-항원 펩티드, 폴리펩티드 및 유사체는 보통 단백질의 부분이 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 그들 유도체화된 모이어티는 용해도, 생물학적 반감기, 단백질의 흡수 또는 결합 친화성을 개선할 수 있다. 또한, 모이어티는 단백질의 임의의 바람직한 부작용 등을 감소시키거나 제거할 수 있다. 그들 모이어티에 대한 개요는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 찾을 수 있다.
예를 들어, 요망되는 활성을 갖는 신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 필요에 따라 특정 요망되는 속성, 예를 들어, 개선된 약리학적 특징을 제공하도록 변형될 수 있는 한편, 요망되는 MHC 분자에 결합하고, 적절한 T 세포를 활성화시키는 비변형된 펩티드의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 증가시키거나 적어도 유지한다. 예를 들어, 신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 다양한 변화, 예를 들어, 보존적 또는 비-보존적인 치환으로 처리될 수 있으며, 여기서, 그러한 변화는 그들의 이용에서 소정의 이점, 예를 들어, 개선된 MHC 결합을 제공할 수 있다. 그러한 보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 다른 아미노산 잔기로, 예를 들어, 하나의 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 극성 잔기로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 단일의 아미노산 치환의 영향은 D-아미노산을 사용하여 조사될 수 있다. 그러한 변형은 예를 들어, 문헌[Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield], 문헌[The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979)]; 및 문헌[Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984)]에 기재된 바와 같이 널리 알려져 있는 펩티드 합성 절차를 사용하여 이루어질 수 있다.
또한, 신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 예를 들면, 아미노산의 부가 또는 결실에 의해 화합물의 아미노산 서열을 연장시키거나 감소시킴으로써 변형될 수도 있다. 신생-항원 펩티드, 폴리펩티드 또는 유사체는 특정 잔기의 순서 또는 조성을 변경시킴으로써 변형될 수도 있다. 생물학적 활성에 필수적인 특정 아미노산 잔기, 예를 들면, 중요 접촉 부위에서의 것들 또는 보존된 잔기는 일반적으로 생물학적 활성에 대한 불리한 영향 없이 변경될 수 없다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 중요하지 않은 아미노산은 단백질에서 천연적으로 발생하는 아미노산, 예컨대, L-α-아미노산 또는 그들의 D-이성질체에 한정될 필요가 없고, 비천연 아미노산, 예컨대, β-γ-δ-아미노산 및 L-α-아미노산의 많은 유도체도 포함할 수 있다.
전형적으로, 단일 아미노산 치환을 갖는 일련의 펩티드를 사용하여 MHC 결합에 대한 정전하, 소수성 등의 효과를 측정함으로써, 신생-항원 폴리펩티드 또는 펩티드가 최적화될 수 있다. 예를 들면, 다양한 MHC 분자 및 T 세포 수용체에 대해 상이한 민감성 패턴을 나타내는 일련의 양으로 대전된 아미노산(예를 들면, Lys 또는 Arg) 또는 음으로 대전된 아미노산(예를 들면, Glu) 치환이 펩티드의 길이를 따라 이루어질 수 있다. 또한, 상대적으로 중성을 띤 작은 모이어티, 예컨대, Ala, Gly, Pro 또는 유사한 잔기를 사용한 다중 치환을 이용할 수 있다. 상기 치환은 동종올리고머 또는 이종올리고머일 수 있다. 치환되거나 부가되는 잔기의 수 및 유형은 필수 접촉점 사이에 필요한 공간 및 추구되는 특정 기능적 속성(예를 들면, 소수성 대 친수성)에 좌우된다. 모체 펩티드의 친화성에 비해 증가한 MHC 분자 또는 T 세포 수용체에 대한 결합 친화성도 그러한 치환에 의해 달성될 수 있다. 임의의 경우, 그러한 치환은 예를 들면, 결합을 파괴할 입체적 간섭 및 전하 간섭을 피하도록 선택된 아미노산 잔기 또는 다른 분자 단편을 사용해야 한다.
아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이다. 치환, 결실, 삽입 또는 그들의 임의의 조합을 조합하여 최종 펩티드에 도달할 수 있다. 치환 변이체는 펩티드의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 위치에 삽입되어 있는 변이체이다.
신생-항원 펩티드 및 폴리펩티드는 요망되는 속성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, CTL 활성을 유도하는 펩티드의 능력은 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열과의 연결에 의해 증강될 수 있다. 특히 바람직한 면역원성 펩티드/T 헬퍼 컨쥬게이트는 스페이서 분자에 의해 연결된다. 스페이서는 전형적으로 생리학적 조건하에서 실질적으로 대전되지 않는 상대적으로 작은 중성 분자, 예컨대, 아미노산 또는 아미노산 모방체로 이루어진다. 스페이서는 전형적으로, 예를 들면, Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택된다. 임의로 당해 스페이서는 동일한 잔기로 이루어질 필요가 없으므로 이종올리고머 또는 동종올리고머일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 스페이서는 존재하는 경우, 통상적으로 적어도 1개 또는 2개의 잔기, 보다 통상적으로 3개 내지 6개의 잔기일 것이다. 대안적으로, 펩티드는 스페이서 없이 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다.
신생-항원 펩티드는 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단에서 직접적으로 또는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다. 신생-항원 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. 예시적 T 헬퍼 펩티드는 파상풍 톡소이드(toxoid) 830-843, 인플루엔자 307-319, 및 말라리아 환상포자소체 382-398 및 378-389를 포함한다.
종양 특이적 신생-항원의 생성
본 발명은 적어도 부분적으로 환자의 면역계에 종양 특이적 신생-항원의 풀을 제시하는 능력에 기초한다. 당업자는 그러한 종양 특이적 신생-항원을 생성하기 위한 다양한 방식이 존재함을 인식할 것이다. 일반적으로, 그러한 종양 특이적 신생-항원은 시험관내 또는 생체내에서 생성될 수 있다. 종양 특이적 신생-항원은 펩티드 또는 폴리펩티드로서 시험관내에서 생성될 수 있으며, 이는 이어서 개인맞춤화 신생물 백신으로 제형화되고, 대상체에게 투여될 수 있다. 하기에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 그러한 시험관내 생성은 당업자에게 알려져 있는 다양한 방법, 예를 들어, 펩티드 합성, 또는 다양한 박테리아, 진핵 또는 바이러스 재조합 발현 시스템 중 임의의 것에서의 DNA 또는 RNA 분자로부터의 펩티드/폴리펩티드의 발현에 이어서 발현된 펩티드/폴리펩티드의 정제에 의해 발생할 수 있다. 대안적으로, 종양 특이적 신생-항원은 종양 특이적 신생-항원을 인코딩하는 분자(예를 들어, DNA, RNA, 바이러스 발현 시스템 등)를 대상체 내로 도입하여, 인코딩된 종양 특이적 신생-항원이 발현됨으로써 생체내에서 생성될 수 있다.
시험관내 펩티드/폴리펩티드 합성
단백질 또는 펩티드는 표준 분자생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 펩티드의 단리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열은 이미 개시되어 있고 당업자에게 공지되어 있는 전산화된 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 그러한 데이터베이스 중 하나는 미국 국립보건원의 웹사이트에 위치하는 미국 국립생물공학정보센터 유전자은행(National Center for Biotechnology Information's Genbank) 및 진펩트(GenPept) 데이터베이스이다. 알려져 있는 유전자에 대한 코딩 영역은 본원에 개시된 기술을 이용함으로써 증폭 및/또는 발현될 수 있거나, 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 다양한 상업적 제제가 당업자에게 공지되어 있다.
펩티드는 오염 박테리아 또는 동물 물질이 없는 시약을 사용하여 화학적으로 용이하게 합성될 수 있다(문헌[Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963]).
본 발명의 추가 양태는 시험관내에서 신생-항원 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있는 본 발명의 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들면, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥의 DNA, cDNA, PNA, CNA 또는 RNA, 또는 고유 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 포스포로티오에이트 골격을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 조합일 수 있고, 폴리뉴클레오티드는, 그것이 펩티드를 코딩하는 한, 인트론을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 상이한 세포 유형에 대한 발현 벡터가 당업계에 널리 알려져 있고 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로, DNA는 발현을 위해 적절한 배향 및 정확한 리딩 프레임으로 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드 내로 삽입된다. 필요한 경우, DNA는 요망되는 숙주(예를 들어, 박테리아)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있지만, 그러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용가능하다. 그 다음, 벡터는 표준 기술을 사용하여 클로닝을 위한 숙주 박테리아 내로 도입된다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
추가로, 본 발명은 본원에 기재된, 확인된 종양 특이적 신생-항원과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 포괄한다. 이들은 예를 들어, 보존적 치환 돌연변이, 즉, 하나 이상의 아미노산의 유사한 아미노산에 의한 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하나의 아미노산을 동일한 일반적 부류 내의 다른 아미노산으로, 예를 들어, 하나의 산성 아미노산을 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 다른 염기성 아미노산으로 또는 하나의 중성 아미노산을 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 보존적 아미노산 치환으로 의도되는 것은 당업계에 널리 알려져 있다.
또한, 본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 또한, 신생-항원 펩티드가 요망되는 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 RNA 또는 cDNA 분자의 형태로 제공될 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 신생-항원 펩티드가 단일의 발현 벡터에 의해 인코딩될 수 있는 것을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 신생-항원 펩티드가 바이러스 기반의 시스템(예를 들어, 아데노바이러스 시스템)을 사용하여 생체내에서 인코딩되고, 발현될 수 있는 것을 제공한다.
"폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 오직 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하며; 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥이면, 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티-센스) 가닥일 수 있다.
실시형태들에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에, 예를 들어 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및/또는 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 세포로부터의 폴리펩티드의 수송을 제어하는 분비 서열로서 기능하는 리더 서열)에 융합된 종양 특이적 신생-항원 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프레단백질(preprotein)이며, 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가져, 성숙 형태의 폴리펩티드를 형성할 수 있다.
실시형태들에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에, 예를 들어, 이어서 개인맞춤화 신생물 백신으로 혼입될 수 있는 인코딩된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 융합된 종양 특이적 신생-항원 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주(예를 들어, COS-7 세포)를 사용하는 경우에 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. 추가의 태그는 칼모듈린(Calmodulin) 태그, FLAG 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, 소프태그(Softag) 1, 소프태그 3, V5 태그, 엑스프레스(Xpress) 태그, 아이소펩태그(Isopeptag), 스파이태그(SpyTag), 비오틴 카복실 운반 단백질(BCCP) 태그, GST 태그, 형광 단백질 태그(예를 들어, 녹색 형광 단백질 태그), 말토스 결합 단백질 태그, 누스(Nus) 태그, 스트렙(Strep)-태그, 티오레독신 태그, TC 태그, Ty 태그 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
실시형태들에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에 융합된 종양 특이적 신생-항원 펩티드 중 하나 이상에 대한 코딩 서열을 포함하여, 다중의 신생-항원 펩티드를 생성할 수 있는 단일의 연쇄체화된(concatamerized) 신생-항원 펩티드 작제물을 생성할 수 있다.
실시형태들에 있어서, 본 발명은 본 발명의 종양 특이적 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드와 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 예를 들어, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드마다 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위하여, 참조 서열의 뉴클레오티드의 최대 5%가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 참조 뉴클레오티드 내의 총 뉴클레오티드의 최대 5%의 뉴클레오티드 개수가 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 이들 참조 서열의 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치, 또는 그들 말단 위치 사이의 임의의 곳에, 참조 서열 내의 뉴클레오티드 중에 개별적으로 또는 참조 서열 내 하나 이상의 연속 그룹에 산재되어 일어날 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 참조 서열에 대하여 적어도 80% 동일한지, 적어도 85% 동일한지, 적어도 90% 동일한지, 일부 실시형태에 있어서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 알려져 있는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, 베스트핏(Bestfit) 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스(Unix)용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711))을 사용하여 관례적으로 결정할 수 있다. 베스트핏은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여 두 서열 간의 최적의 상동성 세그먼트를 찾는다. 특정 서열이 예를 들어 본 발명에 따른 참조 서열과 95％ 동일한지 여부를 결정하기 위해서 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는, 동일성 백분율이 참조 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 참조 서열 내 뉴클레오티드의 총 개수의 최대 5％의 상동성의 갭이 허용되도록 설정된다.
본원에 기재된 단리된 종양 특이적 신생-항원 펩티드는 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 방법에 의해 시험관내(예를 들어, 실험실 내)에서 생성될 수 있다. 그러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 단리된 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 작제하고 그들 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 것까지 다양하다. 일부 실시형태에 있어서, 재조합 기술을 이용하여 관심 야생형 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성하여 DNA 서열을 작제한다. 임의로, 서열은 위치-특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이유발되어, 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들어 문헌[Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)] 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조한다.
실시형태들에 있어서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 화학적 합성에 의해 작제될 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 요망되는 폴리펩티드의 아미노산 서열과, 관심 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 선호되는 코돈의 선택에 기초하여 설계될 수 있다. 단리된 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해서 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 작제할 수 있다. 추가로, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 요망되는 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 몇몇의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 라이게이션시킬 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 함유한다.
일단 (합성, 위치-지정 돌연변이유발 또는 다른 방법에 의해) 조립되면, 관심있는 특정 단리된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 삽입되고, 임의로 요망되는 숙주에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 적절한 조립은, 뉴클레오티드 시퀀싱, 제한 맵핑 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 트랜스펙션된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위하여, 유전자를 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결할 수 있다.
재조합 발현 벡터를 사용하여 종양 특이적 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시킬 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 종양 특이적 신생-항원 펩티드 또는 생물학적 등가 유사체를 인코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 작제물이다. 전사 단위는 일반적으로 하기 상세히 기재되는 바와 같이, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립을 포함한다. 그러한 조절 요소에는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열이 포함될 수 있다. 보통 복제 원점에 의해 수여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선택 유전자가 추가로 혼입될 수 있다. DNA 영역은 그들이 서로에 대해 기능적으로 관련되는 경우, 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드에 대한 DNA(분비 리더)가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로 발현되는 경우 그것은 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터가 서열의 전사를 제어하는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역이 이루어지도록 위치된 경우, 리보솜 결합 부위가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능한 연결은 인접한 것을 의미하며, 분비 리더의 경우, 이는 리딩 프레임 내에서 인접한 것을 의미한다. 효모 발현 시스템에서 사용하도록 의도된 구조적 요소에는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열이 포함된다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 그것은 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로 이후에 발현되는 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 산물을 제공할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 좌우될 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스 유래의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 포함된다. 박테리아 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는, 알려져 있는 박테리아 플라스미드, 예컨대, pCR1, pBR322, pMB9 및 그들의 유도체를 비롯한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 플라스미드, 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 섬유상 단일-가닥 DNA 파지가 포함된다.
폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포로는 적절한 프로모터의 조절하의 원핵생물, 효모, 곤충 또는 보다 고등한 진핵 세포가 포함된다. 원핵생물로는, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실러스(bacilli)가 포함된다. 보다 고등한 진핵 세포로는 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 또한, 무세포 번역 시스템이 이용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주에서 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 널리 알려져 있다(문헌[Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985] 참조).
또한, 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질의 발현에 유리하게 이용된다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 수행될 수 있는데, 그 이유는, 그러한 단백질이 일반적으로 올바르게 접혀지고, 적절히 변형되고, 완전히 기능적이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는, 문헌[Gluzman (Cell 23:175, 1981)]에 기재된 COS-7 계통의 원숭이 신장 세포 및, 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 비롯한, 적절한 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 발현시킬 유전자에 연결된 비-전사 요소, 예컨대 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생성하기 위한 배큘로바이러스 시스템은 문헌[Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에 개관되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질을 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 그러한 표준 방법에는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피 등), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제에 대한 임의의 다른 표준 기술이 포함된다. 친화성 태그, 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트(coat) 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 등을 단백질에 부착하여, 적절한 친화성 컬럼을 통과시킴으로써 정제를 용이하게 할 수도 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특성화될 수도 있다.
예를 들어, 배양 배지 내로 재조합 단백질을 분비하는 시스템 유래의 상층액을 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore) 펠리콘(Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여, 농축할 수 있다. 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기판을 이용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 통상 이용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체로는 술포프로필 또는 카복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 이용하여 암 줄기 세포 단백질-Fc 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 또한, 균질한 재조합 단백질을 제공하기 위해 상기한 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양한 조합으로 이용할 수도 있다.
박테리아 배양물에서 생성된 재조합 단백질은 예를 들어, 세포 펠렛으로부터의 최초 추출에 이어서 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 최종 정제 단계에 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 이용되는 미생물 세포는, 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제 이용을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파괴할 수 있다.
생체내 펩티드/폴리펩티드 합성
또한, 본 발명은 예를 들어, DNA/RNA 백신의 형태로 신생-항원 펩티드/폴리펩티드를 생체내에서 대상체에게 전달하기 위한 비히클로서의 핵산 분자의 이용을 고려한다(예를 들어, 본원에 전문이 참조로 포함되는 WO2012/159643호 및 WO2012/159754호 참조).
일 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 예를 들어, 본 발명에 따라 확인된 바와 같은 하나 이상의 신생-항원 펩티드/폴리펩티드를 인코딩하는 개별 DNA 플라스미드를 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 발현 벡터의 정확한 선택은 발현될 펩티드/폴리펩티드에 따라 달라질 것이며, 당업자의 기술 내에 있다. DNA 작제물(예를 들어, 에피솜, 근육 세포 내의 비-복제, 비-통합 형태)의 예상되는 지속성은 증가된 보호 기간을 제공하는 것으로 예상된다.
다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 본 발명의 신생-항원 펩티드/폴리펩티드를 인코딩하는 개별 RNA 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 개인맞춤화 신생물 백신은 인간 환자에 사용하기 위한 바이러스 기반의 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스 시스템(예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Baden et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis. 2013 Jan 15;207(2):240-7] 참조)을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물/전달 방법
또한, 본 발명은 임의로, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제와 병용한 본 발명에 따른, 유효량의 하나 이상의 화합물(그의 약제학적으로 허용가능한 염 포함)을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용가능한 유도체 또는 전구약물"은 수여자로의 투여시에, (직접적으로 또는 간접적으로) 본 발명의 화합물을 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 에스테르의 염 또는 다른 유도체를 의미한다. 특히 유리한 유도체 및 전구약물은 그러한 화합물이 포유동물에게 투여되는 경우, 본 발명의 화합물의 생체이용가능성을 증가시키거나(예를 들어, 경구로 또는 안구로 투여된 화합물이 보다 용이하게 혈액 내로 흡수되게 함으로써), 모체 종에 비하여 생물학적 구획(예를 들어, 망막)으로의 모체 화합물의 전달을 증가시키는 것들이다.
본 발명의 종양 특이적 신생-항원 펩티드가 단독의 활성 약제로서 투여될 수 있지만, 그들은 하나 이상의 다른 작용제 및/또는 애쥬번트와 병용하여 사용될 수도 있다. 병용으로 투여되는 경우, 치료제는 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 제공되는 개별 조성물로서 제형화될 수 있거나, 치료제는 단일의 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 종양 특이적 신생-항원 펩티드는 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체, 애쥬번트 및 비히클을 함유하는 단위 용량 제형으로, 주사에 의해, 경구, 비경구, 흡입 스프레이에 의해, 직장, 질 또는 국소로 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 비경구라는 용어는 림프절(들)내, 피하, 정맥내, 근육내, 흉골내, 주입 기술, 복강내, 눈 또는 안구내, 유리체내, 협측, 경피, 비강내, 두개내 및 경막내를 포함하여 뇌 내, 발목, 무릎, 엉덩이, 어깨, 팔꿈치, 손목을 포함하여 관절 내, 종양 내로 직접 등 및 좌제 형태를 포함한다.
본 발명의 약제학적 활성 화합물을 통상적인 약제 방법에 따라 처리하여, 인간 및 다른 포유동물을 포함하는 환자로의 투여를 위한 약제를 생성할 수 있다.
활성 화합물의 변형은 활성 종의 용해도, 생체이용가능성 및 대사율에 영향을 미쳐, 활성 종의 전달에 대한 제어를 제공할 수 있다. 이것은 유도체를 제조하고, 당업계의 통상의 기술 내에 알려져 있는 방법에 따라 그의 활성을 시험함으로써 용이하게 평가될 수 있다.
이들 화합물에 기초한 약제학적 조성물은 임의로 약제학적으로 허용가능한 첨가제, 담체 및/또는 부형제와 병용되는 본원에 기재된 질병 및 질환(예를 들어, 신생물/종양)을 치료하기 위한 치료적 유효량의 상기 기재된 종양 특이적 신생-항원 펩티드를 포함한다. 당업자는 치료적 유효량의 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물이 치료할 감염 또는 질환, 그의 중증도, 사용할 치료 섭생법, 사용되는 작용제의 약동학 및 치료되는 환자(동물 또는 인간)에 따라 달라질 것을 인식할 것이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물은 바람직하게는 용량을 생성하기 위한 통상의 약제 배합 기술에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체와 친밀히 배합된다. 담체는 수많은 다른 것들 중, 겔, 크림, 연고, 로션 및 시간 지연된 이식가능한 제제를 포함하여, 투여, 예를 들어, 안구, 경구, 국소 또는 비경구를 위해 요망되는 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여형의 약제학적 조성물의 제조에 있어서, 통상의 약제학적 매질 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 이에 따라, 액체 경구 제제, 예를 들어, 현탁액, 엘릭시르(elixir) 및 용액을 위하여, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향미제, 보존제, 착색제 등을 포함하는 적합한 담체 및 첨가제가 사용될 수 있다. 고체 경구 제제, 예를 들어, 분말, 정제, 캡슐을 위해, 그리고 고체 제제, 예를 들어, 좌제를 위해, 전분, 당 담체, 예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 락토스 및 관련 담체, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 포함하는 적합한 담체 및 첨가제가 사용될 수 있다. 요망되는 경우, 정제 또는 캡슐은 장용-코팅되거나 표준 기술에 의한 지속 방출형일 수 있다.
활성 화합물은 치료되는 환자에서 심각한 독성 효과를 야기하지 않고, 요망되는 적응증을 위해, 치료적 유효량을 환자에게 전달하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에 포함된다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용가능한 담체를 포함할 것이다. 그들은 젤라틴 캡슐에 둘러싸이거나, 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물 또는 그의 전구약물 유도체에는 부형제가 혼입될 수 있으며, 정제, 트로키제(troch) 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약제학적 혼화성 결합제 및/또는 애쥬번트 물질은 조성물의 부분으로 포함될 수 있다.
정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 임의의 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정 셀룰로스, 검 트래거캔트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산 또는 옥수수 전분과 같은 분산제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 콜로이드 이산화규소와 같은 활택제(glidant); 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제와 같은 향미제. 단위 투여형이 캡슐제인 경우, 그것은 상기 유형의 물질에 더하여, 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 단위 투여형은 물리적 투여 단위형을 변형시키는 다양한 다른 물질, 예를 들면, 당 피복제, 쉘락(shellac) 또는 장용제를 함유할 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 각각 소정량의 활성 성분을 함유하는 분리된 단위, 예를 들어, 캡슐제, 카셰제(cachet) 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 에멀전으로서 및 볼루스로서 등으로 제시될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분을 사용한 압축 또는 몰딩에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 임의로 결합제, 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 표면-활성 또는 분산제와 혼합된 자유 유동 형태, 예를 들어, 분말 또는 과립의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축시킴으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 비활성 액체 희석제로 적셔진 분말형 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 몰딩시킴으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의로, 코팅되거나 스코어링(scored)될 수 있으며, 그 안의 활성 성분의 서방 또는 조절 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
약제학적 활성 성분의 그러한 서방형 또는 조절 방출형 조성물의 제형화 방법은 당업계에 알려져 있으며, 일부가 개시내용의 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제3,870,790호; 제4,226,859호; 제4,369,172호; 제4,842,866호 및 제5,705,190호를 포함하나 이들에 한정되지 않는 몇몇 교부된 미국 특허에 기재되어 있다. 코팅은 장으로의 화합물의 전달을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,638,534호, 제5,541,171호, 제5,217,720호 및 제6,569,457호 및 거기에 인용된 참고문헌 참조).
또한, 활성 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉 검(chewing gum) 등의 성분으로서 투여될 수 있다. 시럽은 활성 화합물에 더하여, 감미제로서 수크로스 또는 프룩토스, 및 특정 보존제, 염료 및 착색제 및 향미제를 함유할 수 있다.
안구, 비경구, 피내, 피하 또는 국소 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용 물, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 비설피트; 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조절제, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스.
일 실시형태에 있어서, 활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출형 제형과 같이, 신체로부터의 신속한 제거에 대하여 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성 생체적합성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA)이 사용될 수 있다. 그러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
당업자는 정제에 더하여, 다른 투여형이 서방형 또는 조절 방출형의 활성 성분을 제공하도록 제형화될 수 있음을 인식할 것이다. 그러한 투여형은 캡슐제, 과립 및 겔-캡(gel-cap)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
또한, 리포좀 현탁액은 약제학적으로 허용가능한 담체일 수 있다. 이들은 당업자에게 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 적절한 지질(들)을 무기 용매 중에 용해시키고, 기화되면, 용기 표면에 건조된 지질의 박막이 남게 되어 제조될 수 있다. 그 다음, 활성 화합물의 수용액을 용기 내로 도입한다. 그 다음 용기를 용기 벽에 지질 물질이 없도록 그리고 지질 응집체를 분산시키기 위하여 수동으로 와류시켜, 리포좀 현탁액을 형성한다. 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 제조 방법도 본 발명의 이러한 양태에서 사용될 수 있다.
제형은 편리하게 단위 투여형으로 제시되고 통상의 약제 기술에 의해 제조될 수 있다. 그러한 기술은 활성 성분 및 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)가 회합되게 하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분이 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하게 그리고 친밀하게 회합되게 한 다음, 필요에 따라, 산물을 성형하여 제조된다.
입으로의 국소 투여에 적합한 제형 및 조성물은 향미 베이스, 통상적으로, 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔트 중에 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 비활성 베이스, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적합한 액체 담체 중에 투여될 성분을 포함하는 구강세척제를 포함한다.
피부로의 국소 투여에 적합한 제형은 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 투여될 성분을 포함하는 연고, 크림, 겔 및 페이스트로서 제시될 수 있다. 바람직한 국소 전달 시스템은 투여될 성분을 함유하는 경피 패치이다.
직장 투여용 제형은 예를 들어, 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 베이스를 사용하여 좌제로 제시될 수 있다.
담체가 고체인 비강 투여에 적합한 제형은 코담배(snuff)가 투여되는 방식, 즉, 코에 근접하게 유지된 분말의 용기로부터 비강 경로를 통한 빠른 흡입으로 투여되는 예컨대, 20 내지 500 미크론 범위의 입자 크기를 갖는 조분(coarse powder)을 포함한다. 비강 스프레이 또는 비강 점적액으로의 투여를 위한, 담체가 액체인 적합한 제형은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다.
질 투여에 적합한 제형은 활성 성분에 더하여 당업계에 적절한 것으로 알려져 있는 그러한 담체를 함유하는 페서리(pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼(foam) 또는 스프레이 제형으로 제시될 수 있다.
비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀(ampoule), 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이얼에 봉입될 수 있다. 정맥내 투여된다면, 바람직한 담체는 예를 들어, 생리 식염수 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다.
비경구 투여를 위하여, 담체는 분산을 보조하는 것들을 포함하는 다른 성분이 포함될 수 있지만, 통상 멸균수 또는 염화나트륨 수용액을 포함할 것이다. 물론, 멸균수가 사용되고 멸균으로 유지되는 경우, 조성물 및 담체는 또한 멸균될 것이다. 또한, 주사가능한 현탁액이 제조될 수 있으며, 이 경우 적절한 액체 담체, 현탁화제 등이 사용될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제(bacteriostat) 및 제형이 의도되는 수여자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 및 바이얼에 제시될 수 있으며, 냉동-건조(동결건조) 조건에 보관될 수 있으며, 이는 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용 물의 첨가만을 필요로 한다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
활성 화합물의 투여는 연속적으로(정맥내 점적)부터 1일 수회의 경구 투여(예를 들어, Q.I.D.)까지의 범위일 수 있으며, 눈 또는 안구 경로를 통한 것을 포함하여, 다른 투여 경로 중에, 경구, 국소, 눈 또는 안구, 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 경피(투과 증진제를 포함할 수 있음), 협측 및 좌제 투여를 포함할 수 있다.
대상 치료제의 적용은 관심 부위에 투여되도록 국소일 수 있다. 주사, 카테터, 투관침, 프로젝틸, 플루론 겔, 스텐트, 지연 약물 방출 폴리머 또는 내부 접근을 제공하는 다른 장치와 같은 다양한 기술이 관심 부위에 조성물을 대상체에게 제공하는데 사용될 수 있다. 환자로부터 제거됨으로 인해 기관 또는 조직이 접근가능한 경우, 그러한 기관 또는 조직을 대상 조성물을 함유하는 매질 중에 담그거나, 대상 조성물을 기관에 칠하거나 또는 임의의 편리한 방법으로 적용할 수 있다.
종양 특이적 신생-항원 펩티드는 요망되는 국소 또는 전신 생리학적 또는 약리학적 효과를 얻는데 효과적인 조성물의 조절 및 지속 방출에 적합한 장치를 통해 투여할 수 있다. 상기 방법은 지속 방출형 약물 전달 시스템을 작용제의 방출이 요망되는 영역에 배치하고, 작용제가 장치를 통과하여 요망되는 치료 영역으로 이동하게 하는 것을 포함한다.
종양 특이적 신생-항원 펩티드는 적어도 하나의 알려져 있는 다른 치료제 또는 상기 작용제의 약제학적으로 허용가능한 염과 병용하여 사용될 수 있다. 병용 요법에 사용될 수 있는 알려져 있는 치료제의 예는 코르티코스테로이드(예를 들어, 코르티손, 프레드니손, 덱사메타손), 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)(예를 들어, 이부프로펜, 셀레콕십, 아스피린, 인도메티신, 나프록센), 알킬화제, 예를 들어, 부설판, 시스-플라틴, 미토마이신 C, 및 카보플라틴; 항유사분열제(antimitotic agent), 예를 들어, 콜히친, 빈블라스틴, 파클리탁셀 및 도세탁셀; 토포 I 억제제, 예를 들어, 캄토테신 및 토포테칸; 토포 II 억제제, 예를 들어, 독소루비신 및 에토포시드; 및/또는 RNA/DNA 항대사물질, 예를 들어, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실 및 메토트렉세이트; DNA 항대사물질, 예를 들어, 5-플루오로-2'-데옥시-우리딘, ara-C, 하이드록시우레아 및 티오구아닌; 항체, 예를 들어, 헤르셉틴(Herceptin)® 및 리툭산(Rituxan)®을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
상기에 특별히 언급된 성분에 더하여, 본 발명의 제형이 당해 제형 유형을 고려하여 당업계에서 통상적인 다른 작용제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 경구 투여에 적합한 것들이 향미제를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
특정 약제학적 투여형에서, 화합물의 전구약물 형태가 바람직할 수 있다. 당업자는 본 발명의 화합물을 전구약물 형태로 용이하게 변형시켜, 숙주 유기체 또는 환자 내의 표적화된 부위로의 활성 화합물의 전달을 용이하게 하는 방법을 인식할 것이다. 또한, 통상의 전문가는 적용가능한 경우, 숙주 유기체 또는 환자 내의 표적화된 부위로의 본 발명의 화합물의 전달에서, 전구약물 형태의 바람직한 약동학적 파라미터를 이용하여, 화합물의 의도된 효과를 최대화시킬 것이다.
바람직한 전구약물은 수 용해도 또는 장막을 통한 능동 수송을 증진시키는 기가 본원에 기재된 화학식의 구조에 부착되는 유도체를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Alexander, J. et al. Journal of Medicinal Chemistry 1988, 31, 318-322]; 문헌[Bundgaard, H. Design of Prodrugs; Elsevier: Amsterdam, 1985; pp 1-92]; 문헌[Bundgaard, H.; Nielsen, N. M. Journal of Medicinal Chemistry 1987, 30, 451-454]; 문헌[Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and Development; Harwood Academic Publ.: Switzerland, 1991; pp 113-191]; 문헌[Digenis, G. A. et al. Handbook of Experimental Pharmacology 1975, 28, 86-112]; 문헌[Friis, G. J.; Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and Development; 2 ed.; Overseas Publ.: Amsterdam, 1996; pp 351-385]; 문헌[Pitman, I. H. Medicinal Research Reviews 1981, 1, 189-214]을 참조한다. 전구약물 형태는 그들 자체가 활성이거나, 또는 투여 후에 대사되는 경우 생체내에서 활성 치료제를 제공하도록 하는 것들일 수 있다.
약제학적 활성 염 형태는 본 발명에 따른 약제학적 조성물 중의 포함을 위한 바람직한 본 발명에 따른 화합물의 화학적 형태일 수 있다.
이들 작용제의 전구약물 형태를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 그들의 유도체는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 제공될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 염 또는 복합체라는 용어는 모체 화합물의 요망되는 생물학적 활성을 유지하고, 정상 세포에 대하여 제한된 독성 효과를 나타내는 본 발명에 따른 활성 화합물의 적절한 염 또는 복합체를 말한다. 그러한 염의 비제한적인 예에는 (a) 무기산(예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등)으로 형성된 산 부가염 및 유기산, 예를 들어, 다른 것들 중 특히, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산, 알긴산 및 폴리글루탐산으로 형성된 염; (b) 금속 양이온, 예를 들어, 다른 수많은 것들 중 특히 아연, 칼슘, 나트륨, 칼륨 등으로 형성된 염기 부가염이 있다.
본원에서 화합물은 상업적으로 이용가능하거나 합성될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 본원의 화학식의 화합물의 추가의 합성 방법이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 다양한 합성 단계는 교대 순서 또는 순으로 수행되어, 요망되는 화합물을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 화합물의 합성에 유용한 합성 화학 변환 및 보호기 방법(보호 및 탈보호)이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2nd. Ed., Wiley-VCH Publishers (1999)]; 문헌[T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd. Ed., John Wiley and Sons (1999)]; 문헌[L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1999)]; 및 문헌[L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)] 및 그의 이후의 판에 기재된 것과 같은 것들을 포함한다.
본 발명의 종양 특이적 신생-항원 펩티드와 함께 포함될 수 있는 추가의 작용제는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있으므로 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성체, 개별 부분입체이성체 및 부분입체이성체 혼합물로서 존재할 수 있다. 이들 화합물의 모든 그러한 이성체 형태는 본 발명에 명시적으로 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한, 다수의 호변체 형태로 제시될 수 있으며, 그러한 예에서, 본 발명이 본원에 기재된 화합물의 모든 호변체 형태를 명시적으로 포함한다(예를 들면, 고리 시스템의 알킬화는 다중의 위치에서 알킬화를 야기할 수 있고, 본 발명은 모든 그러한 반응 산물을 명시적으로 포함한다). 그러한 화합물의 모든 그러한 이성체 형태가 본 발명에 명시적으로 포함된다. 본원에 기재된 화합물의 모든 결정 형태는 본 발명에 명시적으로 포함된다.
바람직한 단위 용량 제형은 본원에 상기 언급된 바와 같이 1일 용량 또는 단위, 1일 하위-용량 또는 그의 적절한 분율의 투여되는 성분을 함유하는 것들이다.
본 발명의 종양 특이적 신생-항원 펩티드 및/또는 본 발명의 조성물을 사용한 장애 또는 질병의 치료를 위한 투여 섭생법은 질병의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 조건, 질환의 중증도, 투여 경로 및 사용되는 특정 화합물을 포함하는 다수의 요인에 기초한다. 이에 따라, 투여 섭생법은 광범위하게 달라질 수 있으나, 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다.
대상체에게 투여되는 양 및 투여 요법은 다수의 요인, 예를 들어, 투여 방식, 치료되는 질환의 성질, 치료되는 대상체의 체중 및 처방하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따른 치료적 활성 제형에 포함되는 화합물의 양은 질병 또는 질환을 치료하기 위한 유효량이다. 일반적으로, 투여형 중의 본 발명의 바람직한 화합물의 치료적 유효량은 사용되는 화합물, 치료되는 질환 또는 감염 및 투여 경로에 따라, 약 0.025 ㎎/㎏/일 보다 약간 적은 양 내지 약 2.5 g/㎏/일, 바람직하게는 약 0.1 ㎎/㎏/일 내지 약 100 ㎎/㎏/일의 환자 또는 그보다 상당히 더 많은 양의 범위이지만, 이러한 용량 범위에 대한 예외가 본 발명에 의해 고려될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 그의 가장 바람직한 형태에서, 약 1 ㎎/㎏/일 내지 약 100 ㎎/㎏/일의 범위의 양으로 투여된다. 화합물의 용량은 치료되는 질환, 특정 화합물 및 기타 임상적 요인, 예를 들어, 환자의 체중 및 질환 및 화합물의 투여 경로에 좌우될 것이다. 본 발명이 인간 및 수의학적 용도 둘 모두를 위한 응용을 갖는 것이 이해되어야 한다.
인간으로의 경구 투여를 위하여, 대략 0.1 내지 100 ㎎/㎏/일, 바람직하게는 대략 1 내지 100 ㎎/㎏/일의 용량이 일반적으로 충분하다.
약물 전달이 국소라기보다는 전신인 경우, 이러한 용량 범위는 일반적으로 약 0.04 미만 내지 약 400 ㎍/㏄(환자의 혈액) 이상 범위의 활성 화합물의 효율적인 혈중 수준 농도를 생성한다.
화합물은 단위 투여형당 0.001 내지 3000 ㎎, 바람직하게는 0.05 내지 500 ㎎의 활성 성분을 함유하는 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 적합한 단위 투여형으로 편리하게 투여된다. 10 내지 250 ㎎의 경구 용량이 보통 편리하다.
약물 조성물 중 활성 화합물의 농도는 약물의 흡수, 분포, 불활성화 및 배출 속도 및 당업자에게 알려져 있는 기타 요인에 좌우될 것이다. 또한, 용량 값이 완화될 질환의 중증도에 따라 달라질 것임을 주목해야 한다. 임의의 특정 대상체에 있어서, 특정 용량 섭생법을 개체 요구 및 조성물을 투여하고 조성물의 투여를 감독하는 개인의 전문적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정해야 하며, 본원에 기재된 농도 범위가 단지 예시적인 것이고, 청구된 조성물의 범주 또는 실시를 제한하려는 의도가 아님이 또한 이해되어야 한다. 활성 성분을 한꺼번에 투여하거나, 수많은 보다 작은 용량으로 분할하여, 다양한 시간 간격으로 투여할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 화합물을 1일 1회 투여하거나; 다른 실시형태에 있어서, 화합물을 1일 2회 투여하거나; 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물을 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 7일마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 2개월마다 1회, 6개월마다 1회 또는 1년에 1회 투여한다. 투여 간격을 개별 환자의 요구에 따라 조정할 수 있다. 보다 긴 투여 간격을 위하여, 연장 방출형 또는 데포(depot) 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물을 급성인 질병 및 질병 증상을 치료하기 위해 사용할 수 있으며, 또한 만성 질환의 치료를 위해 사용할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물을 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년, 10년 또는 15년을 초과하는 기간; 또는 예를 들어, 범위의 하한이 14일 내지 15년의 임의의 기간이며, 범위의 상한이 15일 내지 20년(예를 들어, 4주 내지 15년, 6개월 내지 20년)인 임의의 기간인 수일, 수개월 또는 수년의 임의의 기간 범위 동안 투여한다. 일부 경우에, 본 발명의 화합물을 환자의 나머지 생 동안 투여하는 것이 유리할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 환자를 질병 또는 장애의 진행을 점검하기 위해 모니터링하며, 이에 따라 용량을 조정한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 치료는 적어도 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년, 10년, 15년, 20년 동안 또는 대상체의 나머지 생 동안 효율적이다.
본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 종양 특이적 신생-항원을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 실시형태들에 있어서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 함유하며, 이는 그 자체가 조성물을 제공받은 대상체에게 유해한 면역 반응의 생성을 유도하지 않는 임의의 약제를 포함하고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되고, 척추동물 및 더욱 구체적으로 포유동물, 더욱 특별히는 인간에 사용하기 위한 것으로 미국 약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열된 것을 의미한다. 이런 조성물은 바이러스 감염 및/또는 자가면역 질병을 치료 및/또는 예방하는데 유용할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 기타 부형제의 전체적인 논의는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed., Mack Publishing Company)] 및 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Lippincott Williams & Wilkins)]에 제시되어 있다. 약제학적 조성물의 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 실시형태들에 있어서, 약제학적 조성물은 인간으로의 투여에 적합하며, 멸균, 비-미립자 및/또는 비-발열성일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장 수성 완충제 및 그들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 및 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 산화방지제도 또한 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 산화방지제의 예는 다음을 포함하나 이들에 한정되지 않는다: (1) 수용성 산화방지제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설피트, 소듐 설피트 등; (2) 유용성 산화방지제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
실시형태들에 있어서, 약제학적 조성물은 고체 형태, 예를 들어, 재구성에 적합한 동결건조 분말, 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 지속 방출형 제형 또는 분말로 제공된다.
실시형태들에 있어서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 양과 농도를 표기하는 밀봉 용기에 액체 형태로 공급된다. 관련 실시형태에서, 액체 형태의 약제학적 조성물은 기밀 밀봉 용기에 공급된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제형화 방법은 통상적이며, 당업계에 널리 알려져 있다(문헌[Remington and Remington's] 참조). 당업자는 요망되는 특징(예를 들어, 투여 경로, 생체안전성 및 방출 프로파일)을 갖는 약제학적 조성물을 용이하게 제형화할 수 있다.
약제학적 조성물의 제조 방법은 활성 성분이 약제학적으로 허용가능한 담체 및 임의로 하나 이상의 보조 성분과 회합되게 하는 단계를 포함한다. 약제학적 조성물은 활성 성분이 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 회합되게 한 다음, 필요에 따라, 산물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 다층 투여형의 제조를 포함하는 약제학적 조성물의 추가의 제조 방법은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9th ed., Lippincott Williams & Wilkins)]에 기재되어 있다.
경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 캡슐제, 카셰제, 환제, 정제, 로젠지(향미 베이스, 통상적으로는 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔트 사용), 분말, 과립 형태로, 또는 수성 또는 비수성 액체의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 향정(비활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 사용)으로서, 및/또는 구강 세척제 등으로서 존재할 수 있으며, 이들 각각은 활성 성분(들)으로서 소정량의 본원에 기재된 화합물(들), 그의 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물을 함유한다. 활성 성분은 또한 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여형(예를 들어, 캡슐제, 정제, 환제, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 다음 중 임의의 것과 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; (3) 보습제(humectant), 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 그의 혼합물; (10) 착색제. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우에, 약제학적 조성물은 완충제도 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한, 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐제에서 충전제, 및 락토스 또는 유당과 같은 부형제, 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 제조될 수도 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 몰딩에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 전분글리콜산나트륨 또는 교차-결합된 소듐 카복시메틸 셀룰로스), 표면-활성 및/또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 비활성 액체 희석제로 적셔진 분말 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계에서 몰딩시킴으로써 제조될 수 있다.
정제 및 기타 고체 투여형, 예를 들어, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립은 임의로, 스코어링되거나 코팅 및 쉘, 예를 들어, 장용 코팅 및 당업계에 잘 알려져 있는 기타 코팅과 함께 제조될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 활성 성분의 효과를 연장시키기 위하여, 피하 또는 근육내 주사로부터 화합물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 불량한 수 용해도를 갖는 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 활성 성분의 흡수율은 그의 용해율에 따라 달라지며, 용해율은 차례로 결정 크기 및 결정질 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구-투여된 활성 성분의 지연된 흡수는 화합물을 오일 비히클 중에 용해시키거나 현탁화시킴으로써 달성된다. 또한, 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 야기될 수 있다.
조절 방출형 비경구 조성물은 수성 현탁액, 미소구체, 마이크로캡슐, 자성 미소구체, 오일 용액, 오일 현탁액, 에멀젼의 형태일 수 있거나, 활성 성분은 생체적합성 담체(들), 리포좀, 나노입자, 이식물 또는 주입 장치에 혼입될 수 있다.
미소구체 및/또는 마이크로캡슐의 제조에 사용하기 위한 물질은 생분해성/생침식성 폴리머, 예를 들어, 폴리글락틴, 폴리-(아이소부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(2-하이드록시에틸-L-글루타민) 및 폴리(락트산)을 포함한다.
조절 방출형 비경구 제형을 제형화하는 경우 사용될 수 있는 생체적합성 담체는 탄수화물, 예를 들어, 덱스트란, 단백질, 예를 들어, 알부민, 리포단백질 또는 항체를 포함한다.
이식물에 사용하기 위한 물질은 비-생분해성, 예를 들어, 폴리디메틸실록산 또는 생분해성, 예를 들어, 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 폴리(오르토 에스테르)일 수 있다.
실시형태들에 있어서, 활성 성분(들)은 에어로졸에 의해 투여된다. 이는 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포좀 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성된다. 비수성(예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 초음파 네뷸라이저를 사용하여 투여될 수 있으며, 이는 화합물의 분해를 야기할 수 있는 전단으로의 작용제의 노출을 최소화시킬 것이다.
대개는, 수성 에어로졸은 통상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및 안정화제와 함께 활성 성분(들)의 수용액 또는 현탁액을 제형화시킴으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정 화합물의 요건에 따라 달라지나, 전형적으로, 비이온성 계면활성제(Tween, Pluronics 또는 폴리에틸렌 글리콜), 혈청 알부민과 같은 무해한 단백질, 소르비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 아미노산, 예를 들어, 글리신, 완충제, 염, 당 또는 당 알콜을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로부터 제조된다.
활성 성분(들)의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분(들)은 멸균 조건하에 약제학적으로 허용가능한 담체, 및 적절한 경우 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 경피 패치는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives (Marcel Dekker Inc., 1989)] 및 미국 특허 제4,743,249호, 제4,906,169호, 제5,198,223호, 제4,816,540호, 제5,422,119호, 제5,023,084호에 개시되어 있다. 또한, 경피 패치는 경음낭 패치를 포함하는 당업계에 널리 알려져 있는 임의의 경피 패치일 수 있다. 그러한 경피 패치 내의 약제학적 조성물은 당업계에 잘 알려져 있는 하나 이상의 흡수 증진제 또는 피부 투과 증진제를 함유할 수 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,379,454호 및 제4,973,468호 참조). 본 발명에 사용하기 위한 경피 치료 시스템은 이온도입법(iontophoresis), 확산 또는 이들 2개 효과의 병용에 기초할 수 있다.
경피 패치는 신체로의 활성 성분(들)의 조절된 전달을 제공하는 이점이 부가된다. 그러한 투여형은 활성 성분(들)을 적절한 매질에 용해시키거나 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 흡수 증진제를 사용하여, 피부를 가로지르는 활성 성분의 유동을 증가시킬 수 있다. 그러한 유동 속도는 속도 조절 막을 제공하거나 활성 성분(들)을 폴리머 매트릭스 또는 겔에 분산시킴으로써 조절될 수 있다.
그러한 약제학적 조성물은 크림, 연고, 로션, 도포제, 겔, 하이드로겔, 용액, 현탁액, 스틱(stick), 스프레이, 페이스트, 플라스터(plaster) 및 기타 종류의 경피 약물 전달 시스템의 형태일 수 있다. 또한, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제, 예를 들어, 유화제, 산화방지제, 완충제, 보존제, 보습제, 투과 증진제, 킬레이트화제, 겔-형성제, 연고 베이스, 향료 및 피부 보호제를 포함할 수 있다.
유화제의 예는 천연 발생 검(gum), 예를 들어, 아카시아 검 또는 트래거캔트 검, 천연 발생 포스파티드, 예를 들어, 대두 레시틴 및 소르비탄 모노올레에이트 유도체를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
산화방지제의 예는 부틸화 하이드록시 아니솔(BHA), 아스코르브산 및 그의 유도체, 토코페롤 및 그의 유도체 및 시스테인을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
보존제의 예는 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
보습제의 예는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및 우레아를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
투과 증진제의 예는 프로필렌 글리콜, DMSO, 트리에탄올아민, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드, 2-피롤리돈 및 그들의 유도체, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트 또는 메틸 라우레이트를 갖는 디에틸렌 글리콜 모노에틸 또는 모노메틸 에테르, 유칼립톨, 레시틴, 트란스쿠톨(Transcutol)® 및 아존(Azone)®을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
킬레이트화제의 예는 나트륨 EDTA, 시트르산 및 인산을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
겔 형성제의 예는 카보폴(Carbopol), 셀룰로스 유도체, 벤토나이트, 알기네이트, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
활성 성분(들)에 더하여, 본 발명의 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 부형제, 예를 들어, 동물 및 식물 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화아연 또는 그들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 부형제, 예를 들어, 락토스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가로 관례적 추진제, 예를 들어, 클로로플루오로하이드로카본 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예를 들어, 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.
주사가능한 데포 형태는 생분해성 폴리머, 예를 들어, 폴리락티드-폴리글리콜리드 중 본 발명의 화합물(들)의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 화합물 대 폴리머의 비, 및 사용되는 특정 폴리머의 성질에 따라, 화합물 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 또한, 주사가능한 데포 제형은 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획함으로써 제조된다.
피하 이식물은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명에 사용하기에 적합하다. 피하 이식 방법은 바람직하게는 비-자극성이며 기계적으로 탄성이다. 이식물은 매트릭스 유형, 저장소 유형 또는 그의 혼성물일 수 있다. 매트릭스 유형 장치에서, 담체 물질은 다공성 또는 비다공성, 고체 또는 반고체일 수 있으며, 활성 화합물 또는 화합물들에 대하여 투과가능하거나 투과불가능하다. 담체 물질은 생분해성일 수 있거나, 투여 후에 천천히 침식할 수 있다. 일부 예에서, 매트릭스는 비-분해성이나, 대신에, 담체 물질이 분해되기 위하여, 매트릭스를 통한 활성 화합물의 확산에 의존한다. 대안적인 피하 이식 방법은 저장소 장치를 사용하며, 여기서, 활성 화합물 또는 화합물들은 속도 조절 막, 예를 들어, 성분 농도와 독립적인(0차 동역학을 갖는) 막으로 둘러싸인다. 또한, 속도 조절 막으로 둘러싸인 매트릭스로 이루어진 장치도 사용하기에 적합하다.
저장소 및 매트릭스 유형 장치 둘 모두는 폴리디메틸실록산, 예를 들어, 실라스틱(Silastic)™ 또는 기타 실리콘 고무와 같은 물질을 함유할 수 있다. 매트릭스 물질은 불용성 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 에틸비닐 아세테이트, 폴리스티렌 및 폴리메타크릴레이트, 및 글리세롤 팔미토스테아레이트, 글리세롤 스테아레이트 및 글리세롤 베헤네이트 유형의 글리세롤 에스테르일 수 있다. 물질은 소수성 또는 친수성 폴리머일 수 있으며, 임의로, 가용화제를 함유한다.
피하 이식 장치는 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,035,891호 및 제4,210,644호에 기재된 바와 같이 임의의 적합한 폴리머로 제조된 서방형 캡슐일 수 있다.
일반적으로, 약물 화합물의 방출 및 경피 투과에 대한 속도 조절을 제공하기 위하여 적어도 4개의 상이한 접근법이 적용가능하다. 이들 접근법은 막-조절 시스템(membrane-moderated system), 점착 분산-조절 시스템(adhesive diffusion-controlled system), 매트릭스 분산형 시스템 및 마이크로저장소 시스템이다. 조절 방출형 경피 및/또는 국소 조성물이 이들 접근법의 적합한 혼합을 사용하여 수득될 수 있는 것이 인식된다.
막-조절 시스템에서, 활성 성분은 금속 플라스틱 라미네이트와 같은 약물 비투과성 라미네이트 및 마이크로다공성 또는 비다공성 폴리머 막, 예를 들면, 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머와 같은 속도-조절 폴리머 막으로부터 몰딩된 얕은 구획 내에서 전체가 캡슐화되어 있는 저장소 안에 존재한다. 활성 성분은 속도-조절 폴리머 막을 통과하여 방출된다. 약물 저장소에서, 활성 성분은 고체 폴리머 매트릭스에 분산되거나 또는 실리콘 유체와 같은 여과불가능한 점성 액체 매질 내에 현탁화될 수도 있다. 폴리머 막의 외부 표면에서, 경피 시스템과 피부 표면의 친밀한 접촉을 달성하기 위해 점착성 폴리머의 박막이 적용된다. 점착성 폴리머는 바람직하게는 활성 약물 물질과 혼화성인 저알러지성 폴리머이다.
점착성 분산-조절 시스템에서, 활성 성분의 저장소는 활성 성분을 점착성 폴리머 내에 직접 분산시킨 후, 예를 들어, 용매 캐스팅에 의해, 활성 성분을 포함하는 점착제를 실질적으로 약물-비투과성인 금속 플라스틱 백킹(backing)의 평평한 시트에 도포하여 얇은 약물 저장소 층을 형성함으로써 형성된다.
매트릭스 분산형 시스템은 활성 성분의 저장소가 친수성 또는 친유성 폴리머 매트릭스 내에 활성 성분을 실질적으로 균질하게 분산시킴으로써 형성되는 것을 특징으로 한다. 그 다음, 약물-함유 폴리머를 실질적으로 잘 정의된 표면적 및 조절된 두께를 갖는 디스크에 몰딩한다. 점착성 폴리머를 주변을 따라 도포하여, 디스크 주위의 점착제 스트립(strip)을 형성한다.
마이크로저장소 시스템은 저장소 및 매트릭스 분산형 시스템의 조합으로 여겨질 수 있다. 이러한 경우에, 활성 물질의 저장소는 먼저 약물 고체를 수용성 폴리머의 수용액에 현탁화시킨 다음, 약물 현탁액을 친유성 폴리머에 분산시켜 약물 저장소의 다수의 여과불가능한 미세한 미소구체를 형성함으로써 형성된다.
상기 기재된 조절 방출형, 연장 방출형 및 지속 방출형 조성물 중 임의의 것을 제형화하여, 약 30분 내지 약 1주 내에, 약 30분 내지 약 72시간 내에, 약 30분 내지 24시간 내에, 약 30분 내지 12시간 내에, 약 30분 내지 6시간 내에, 약 30분 내지 4시간 내에 그리고 약 3시간 내지 10시간 내에 활성 성분을 방출시킬 수 있다. 실시형태들에 있어서, 유효 농도의 활성 성분(들)은 대상체로의 약제학적 조성물의 투여 후에 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간 이상 동안 대상체에서 유지된다.
투여량
본원에 기재된 작용제가 약제로서 인간 또는 동물에게 투여되는 경우, 그들은 그 자체로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 병용되는 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준 및 투여의 시간 경과는 환자에게 독성 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위하여 달라질 수 있다. 일반적으로 본 발명의 작용제 또는 약제학적 조성물은 바이러스 감염 및/또는 자가면역 질병과 관련된 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분한 양으로 투여된다.
예시적인 용량 범위는 0.01 ㎎ 내지 250 ㎎/일, 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎/일, 1 ㎎ 내지 100 ㎎/일, 10 ㎎ 내지 100 ㎎/일, 1 ㎎ 내지 10 ㎎/일 및 0.01 ㎎ 내지 10 ㎎/일을 포함한다. 작용제의 바람직한 용량은 환자가 용인할 수 있고, 심각한 또는 허용불가능한 부작용을 발생하지 않는 최대치이다. 실시형태들에 있어서, 작용제는 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎎/㎏(체중)/일, 약 0.1 내지 약 10 ㎎/㎏/일 또는 약 1.0 ㎎ 내지 약 10 ㎎/㎏(체중)/일의 농도로 투여된다.
실시형태들에 있어서, 약제학적 조성물은 1 내지 10 ㎎, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ㎎ 범위의 양의 작용제를 포함한다.
실시형태들에 있어서, 치료적 유효 용량은 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 50 내지 100 ㎍/㎖의 작용제의 혈청 농도를 생성한다. 약제학적 조성물은 전형적으로 약 0.001 ㎎ 내지 약 2000 ㎎의 화합물/㎏(체중)/일의 투여량을 제공해야 한다. 예를 들어, 인간 환자로의 전신 투여를 위한 투여량은 1 내지 10 ㎍/㎏, 20 내지 80 ㎍/㎏, 5 내지 50 ㎍/㎏, 75 내지 150 ㎍/㎏, 100 내지 500 ㎍/㎏, 250 내지 750 ㎍/㎏, 500 내지 1000 ㎍/㎏, 1 내지 10 ㎎/㎏, 5 내지 50 ㎎/㎏, 25 내지 75 ㎎/㎏, 50 내지 100 ㎎/㎏, 100 내지 250 ㎎/㎏, 50 내지 100 ㎎/㎏, 250 내지 500 ㎎/㎏, 500 내지 750 ㎎/㎏, 750 내지 1000 ㎎/㎏, 1000 내지 1500 ㎎/㎏, 1500 내지 2000 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 1000 ㎎/㎏, 1500 ㎎/㎏ 또는 2000 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 약제학적 단위 투여형은 단위 투여형당 약 1 ㎎ 내지 약 5000 ㎎, 예를 들어, 약 100 내지 약 2500 ㎎의 화합물 또는 또는 필수 성분의 조합을 제공하도록 제조된다.
실시형태들에 있어서, 약 50 nM 내지 약 1 μM의 작용제가 대상체에게 투여된다. 관련 실시형태들에 있어서, 약 50 내지 100 nM, 50 내지 250 nM, 100 내지 500 nM, 250 내지 500 nM, 250 내지 750 nM, 500 내지 750 nM, 500 nM 내지 1 μM 또는 750 nM 내지 1 μM의 작용제가 대상체에게 투여된다.
유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용의 견지에서 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 일반적으로, 작용제의 효과적인 또는 유효한 양은 먼저 낮은 용량의 작용제(들)를 투여한 다음, 요망되는 효과(예를 들어, 바이러스 감염 또는 자가면역 질병과 관련된 증상의 감소 또는 제거)가 최소의 또는 허용가능한 독성 부작용과 함께, 치료되는 대상체에서 관찰될 때까지 투여된 용량 또는 투여량을 증분식으로 증가시킴으로써 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여에 적절한 용량 및 투여 스케쥴을 결정하기 위해 적용가능한 방법은 예를 들어, 각각이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005] 및 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005)]에 기재되어 있다.
병용 요법
본원에 기재된 종양 특이적 신생-항원 펩티드 및 약제학적 조성물은 다른 치료 분자와 병용하여 투여될 수도 있다. 치료 분자는 신생물 또는 그의 증상을 완화시키는데 사용되는 임의의 화합물일 수 있다. 그러한 화합물은 예는 화학치료제, 항-혈관신생제, 체크포인트 차단 항체 또는 면역-억제를 감소시키는 기타 분자 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
종양 특이적 신생-항원 펩티드는 추가의 치료제의 투여 이전, 그 동안 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 실시형태들에 있어서, 종양 특이적 신생-항원 펩티드는 추가의 치료제의 처음의 투여 이전에 투여된다. 실시형태들에 있어서, 종양 특이적 신생-항원 펩티드는 추가의 치료제의 처음의 투여 이후(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상)에 투여된다. 실시형태들에 있어서, 종양 특이적 신생-항원 펩티드는 추가의 치료제의 처음의 투여와 동시에 투여된다.
백신
예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 특정 T-세포 반응을 야기할 수 있는 면역원성 조성물, 예를 들어, 백신 조성물에 관한 것이다. 백신 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 종양 특이적 신생-항원에 상응하는 돌연변이 신생-항원 펩티드 및 돌연변이 신생-항원 폴리펩티드를 포함한다.
적합한 백신은 바람직하게는 복수의 종양 특이적 신생-항원 펩티드를 함유할 것이다. 일 실시형태에 있어서, 백신은 1 내지 100개 세트의 펩티드, 더욱 바람직하게는 10 내지 50개의 그러한 펩티드, 더더욱 바람직하게는 10 내지 30개 세트의 펩티드, 더더욱 바람직하게는 15 내지 25개의 펩티드를 포함할 것이다. 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 백신은 대략 20개 펩티드, 더욱 바람직하게는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 상이한 펩티드, 더욱 바람직하게는 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 상이한 펩티드, 가장 바람직하게는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 상이한 펩티드를 포함할 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상이한 종양 특이적 신생-항원 펩티드 및/또는 폴리펩티드는 신생물 백신에 사용하여, 환자의 신생물/종양에 대한 면역 공격을 생성할 우도를 최대화시키도록 선택된다. 이론에 의해 결부되지 않고, 종양 특이적 신생-항원 펩티드의 다양성의 포함은 신생물/종양에 대한 넓은 범위의 면역 공격을 생성할 것으로 여겨진다. 일 실시형태에 있어서, 선택된 종양 특이적 신생-항원 펩티드/폴리펩티드는 미스센스 돌연변이에 의해 인코딩된다. 제2 실시형태에 있어서, 선택된 종양 특이적 신생-항원 펩티드/폴리펩티드는 미스센스 돌연변이 및 neoORF 돌연변이의 조합에 의해 인코딩된다. 제3 실시형태에 있어서, 선택된 종양 특이적 신생-항원 펩티드/폴리펩티드는 neoORF 돌연변이에 의해 인코딩된다.
선택된 종양 특이적 신생-항원 펩티드/폴리펩티드가 미스센스 돌연변이에 의해 인코딩되는 일 실시형태에 있어서, 펩티드 및/또는 폴리펩티드는 환자의 특정 MHC 분자와 회합하는 그들의 능력에 기초하여 선택된다. 또한, neoORF 돌연변이로부터 유래된 펩티드/폴리펩티드는 환자의 특정 MHC 분자와 회합하는 그들의 능력에 기초하여 선택될 수 있을 뿐 아니라, 환자의 특정 MHC 분자와 회합하는 것으로 예측되지 않더라도 선택될 수도 있다.
백신 조성물은 특이적인 세포독성 T 세포 반응 및/또는 특이적인 헬퍼 T 세포 반응을 야기할 수 있다.
백신 조성물은 애쥬번트 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 유용한 애쥬번트 및 담체의 예는 본원에서 하기에 제공되어 있다. 조성물 중의 펩티드 및/또는 폴리펩티드는 담체, 예컨대, 단백질 또는 항원 제시 세포, 예컨대, 펩티드를 T-세포에 제시할 수 있는 수지상 세포(DC)와 회합될 수 있다.
애쥬번트는 백신 조성물 내로 혼합되어 돌연변이 펩티드에 대한 면역 반응을 증가시키거나 달리 변형시키는 임의의 물질이다. 담체는 신생항원 펩티드와 회합될 수 있는 스카폴드 구조체, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 다당류이다. 임의로, 애쥬번트는 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드에 공유적으로 또는 비공유적으로 컨쥬게이트된다.
항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 애쥬번트의 능력은 전형적으로 면역 매개 반응의 유의한 증가 또는 질병 증상의 감소에 의해 표시된다. 예를 들면, 체액성 면역의 증가는 전형적으로 항원에 대해 유도된 항체의 역가의 유의한 증가에 의해 표시되고, T-세포 활성의 증가는 전형적으로 증가된 세포 증식, 세포 독성 또는 사이토카인 분비에 의해 표시된다. 애쥬번트는 예를 들면, 일차 체액성 또는 Th2 반응을 일차 세포성 또는 Th1 반응으로 변화시킴으로써 면역 반응을 변경시킬 수도 있다.
적합한 애쥬번트는 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM. 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 기타 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 사포닌, 마이코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체로부터 유래된 아퀼라스 QS21 스티물론(아퀼라 바이오텍(Aquila Biotech)(Worcester, Mass., USA)) 및 다른 전매특허 애쥬번트, 예컨대, 리비스 데톡스(Ribi's Detox), 퀼(Quil) 또는 수퍼포스(Superfos)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 수지상 세포 및 그들의 제제에 특이적인 몇몇의 면역학적 애쥬번트(예를 들면, MF59)가 종래에 기재되어 있다(문헌[Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1): 18-27]; 문헌[Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11]). 사이토카인도 사용될 수 있다. 몇몇의 사이토카인이 림프 조직으로의 수지상 세포 이동에 대한 영향(예를 들면, TNF-α), T 림프구를 위한 효율적인 항원 제시 세포로의 수지상 세포의 성숙의 가속화(예를 들면, GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(전문이 본원에 참고로 구체적으로 포함되는 미국 특허 제5,849,589호) 및 면역애쥬번트로서의 작용(예를 들면, IL-12)(문헌[Gabrilovich DI, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418])과 직접적으로 연관되어 있다.
톨 유사 수용체(TLR)도 애쥬번트로 사용될 수 있으며, "병원체-관련 분자 패턴"(PAMPS)으로 지칭되는 많은 미세유기체에 의해 공유되는 보존된 모티프를 인식하는 패턴 인식 수용체(PRR)의 과의 중요한 구성원이다. 이들 "위험 신호"의 인식은 선천성 및 후천성 면역계의 다중의 요소를 활성화시킨다. TLR은 선천성 및 후천성 면역계의 세포, 예를 들어, 수지상 세포(DC), 대식구, T 및 B 세포, 비만 세포 및 과립구에 의해 발현되며, 상이한 세포 구획, 예를 들어, 원형질막, 리소좀, 엔도좀 및 엔도리소좀에 국소화된다. 상이한 TLR은 별개의 PAMPS를 인식한다. 예를 들어, TLR4는 박테리아 세포벽에 함유된 LPS에 의해 활성화되며, TLR9는 비메틸화 박테리아 또는 바이러스 CpG DNA에 의해 활성화되고, TLR3은 이중 가닥 RNA에 의해 활성화된다. TLR 리간드 결합은 하나 이상의 세포내 신호전달 경로의 활성화를 야기하여, 궁극적으로 염증 및 면역성과 관련된 많은 주요 분자(특히, 전사 인자 NF-κB 및 I형 인터페론)의 생성을 야기한다. TLR 매개의 DC 활성화는 증진된 DC 활성화, 식세포작용, 활성화 및 동시-자극 마커, 예를 들어, CD80, CD83 및 CD86의 상향조절, DC가 배출 림프절로 이동하게 하고, T 세포로의 항원 제시를 용이하게 하는 CCR7의 발현 및 사이토카인, 예를 들어, I형 인터페론, IL-12 및 IL-6의 증가된 분비를 야기한다. 이들 다운스트림 사건의 전부는 후천성 면역 반응의 유도에 결정적이다.
현재 임상 개발 중인 가장 유망한 암 백신 애쥬번트 중 하나는 TLR9 효능제 CpG 및 합성 이중 가닥 RNA(dsRNA) TLR3 리간드 폴리-ICLC이다. 예비임상 연구에서, 폴리-ICLC는 그의 염증유발성 사이토카인의 유도 및 IL-10의 자극의 결여 및, DC에서의 높은 수준의 동시-자극 분자의 유지로 인하여, LPS 및 CpG와 비교하여 가장 강력한 TLR 애쥬번트인 것으로 보인다. 추가로, 폴리-ICLC는 최근에, 인간 파필로마바이러스(HPV)16 캡소머로 이루어진 단백질 백신을 위한 애쥬번트로서 비-인간 영장류(레서스 원숭이)에서 CpG와 직접 비교되었다(문헌[Stahl-Hennig C, Eisenblatter M, Jasny E, et al. Synthetic double-stranded RNAs are adjuvants for the induction of T helper 1 and humoral immune responses to human papillomavirus in rhesus macaques. PLoS pathogens. Apr 2009;5(4)]).
CpG 면역 자극 올리고뉴클레오티드도 또한 백신 환경에서 애쥬번트의 효과를 증진시키는 것으로 나타났다. 이론에 결부되지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 주로 TLR9를 통해 선천성(비-적응) 면역계를 활성화시킴으로써 작용한다. CpG 촉발된 TLR9 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 생 또는 사멸 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신 둘 모두의 다당류 컨쥬게이트를 포함한 매우 다양한 항원에 대한 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포 성숙 및 분화를 향상시켜, Th1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T-림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움의 부재하에서도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 유도된 Th1 편향은 보통 Th2 편향을 촉진시키는 알룸(alum) 또는 불완전 프레운트 애쥬번트(IFA)와 같은 백신 애쥬번트의 존재하에서도 유지된다. CpG 올리고뉴클리오티드는 다른 애쥬번트와 제형화되거나 동시-투여되는 경우 또는 특히 항원이 상대적으로 약한 경우 강한 반응을 유도하는데 필요한 제형, 예를 들어, 마이크로입자, 나노입자, 지질 에멀젼 또는 유사한 제형에서 훨씬 더 큰 애쥬번트 활성을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 연구에서 항원 용량이 대략 수십 배 감소되게 하여, CpG가 없는 전체-용량 백신에 대한 유사한 항체 반응을 갖게 할 수 있다(문헌[Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, Jun. 2006, 471-484]). 미국 특허 제6,406,705 B1호는 항원-특이적 면역 반응을 유도하기 위한, CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 애쥬번트 및 항원의 병용을 기재한다. 상업적으로 입수가능한 CpG TLR9 길항제는 몰로젠(Mologen)(Berlin, GERMANY)에 의한 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며 이는 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9와 같은 다른 TLR 결합 분자도 또한 이용될 수 있다.
잔테논 유도체, 예를 들어, 바디메잔(Vadimezan) 또는 AsA404(5,6-디메틸아잔테논-4-아세트산(DMXAA)으로도 알려져 있음)는 또한 본 발명의 실시형태에 따른 애쥬번트로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 그러한 유도체는 또한 예를 들어, 전신 또는 종양내 전달을 통해 본 발명의 백신과 동시에 투여되어, 종양 부위에서 면역성을 자극할 수 있다. 이론에 결부되지 않고, 그러한 잔테논 유도체는 IFN(유전자 ISTING) 수용체의 자극제를 통해 인터페론(IFN) 생성을 자극함으로써 작용하는 것으로 여겨진다(예를 들어, 문헌[Conlon et al. (2013) Mouse, but not Human STING, Binds and Signals in Response to the Vascular Disrupting Agent 5,6-Dimethylxanthenone-4-Acetic Acid, Journal of Immunology, 190:5216-25] 및 문헌[Kim et al. (2013) Anticancer Flavonoids are Mouse-Selective STING Agonists, 8:1396-1401] 참조).
유용한 애쥬번트의 다른 예는 화학적으로 변형된 CpG(예를 들어, CpR, Idera), 폴리(I:C)(예를 들어, 폴리:CI2U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA, 및 면역활성 소분자 및 항체, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 수니티닙(sunitinib), 베바시주맙(bevacizumab), 셀레브렉스(celebrex), NCX-4016, 실데나필(sildenafil), 타달라필(tadalafil), 바르데나필(vardenafil), 소라피닙(sorafinib), XL-999, CP-547632, 파조파닙(pazopanib), ZD2171, AZD2171, 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab) 및 SC58175를 포함하나 이들에 한정되지 않으며, 이는 치료적으로 및/또는 애쥬번트로서 작용할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 유용한 애쥬번트 및 첨가제의 양 및 농도는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 추가의 애쥬번트는 콜로니-자극 인자, 예를 들어, 과립구 대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 사그라모스팀(sargramostim))를 포함한다.
폴리-ICLC는 약 5000개 뉴클레오티드의 평균 길이의 폴리I 및 폴리C 가닥으로 이루어진 합성에 의해 제조된 이중-가닥 RNA이며, 이는 폴리라이신 및 카복시메틸셀룰로스의 첨가에 의해 열 변성 및 혈청 뉴클레아제에 의한 가수분해에 안정화된다. 화합물은 TLR3 및 MDA5의 RNA 헬리카제-도메인(둘 모두 PAMP 과의 구성원임)을 활성화시켜, DC 및 자연 살해(NK) 세포 활성화 및 I형 인터페론, 사이토카인 및 케모카인의 "천연 믹스(mix)"의 생성을 야기한다. 추가로, 폴리-ICLC는 2개의 IFN-유도성 핵 효소 시스템, 2'5'-OAS 및 PKR(4-6)로도 알려져 있는 P1/eIF2a 키나제, 및 RIG-I 헬리카제 및 MDA5에 의해 매개되는 더욱 직접적이고 광범위한 숙주-표적화된 항-감염성 및 아마도 항종양 효과를 가한다.
설치류 및 비-인간 영장류에서, 폴리-ICLC는 바이러스 항원에 대한 T 세포 반응, 교차-프라이밍, 및 종양-, 바이러스- 및 자가항원-특이적 CD8+ T-세포의 유도를 증진시키는 것으로 보였다. 비-인간 영장류에서의 최근의 연구에서, 폴리-ICLC는 DC 표적화된 또는 비-표적화된 HIV Gag p24 단백질에 대한 항원 반응 및 T-세포 면역성의 생성에 필수적인 것으로 관찰되어, 백신 애쥬번트로서의 그의 유효성을 강조한다.
인간 대상체에서, 연속 전혈 시료의 전사 분석에 의해, 1회의 단일의 폴리-ICLC의 피하 투여를 제공받은 8명의 건강한 인간 공여자 간에 유사한 유전자 발현 프로파일, 및 이들 8명의 대상체 대 위약을 제공받은 4명의 대상체 간에 최대 212개의 유전자의 차별적인 발현이 드러났다. 현저하게, 매우 효율적인 황열 백신 YF17D로 면역화된 자원자로부터의 이전의 데이터에 대한 폴리-ICLC 유전자 발현 데이터의 비교에 의해, 선천성 면역계의 경로를 포함하는 다수의 전사 및 신호 전달 정규 경로가 피크 시점에서 유사하게 상향조절되었음이 나타났다.
더욱 최근에, 단독의 고환암 항원 NY-ESO-1 유래의 긴 합성 중첩 펩티드(OLP), 또는 몬타나이드-ISA-51, 또는 1.4 ㎎의 폴리-ICLC 및 몬타나이드를 사용한 피하 백신접종의 단계 1 연구로 처치된, 제2 또는 제3 완전 임상 관해의 난소, 나팔관 및 원발성 복막암이 있는 환자에 대하여 면역학적 분석이 보고되었다. NY-ESO-1-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포 및 항체 반응의 생성은 단독의 OLP 또는 OLP 및 몬타나이드에 비하여, 폴리-ICLC 및 몬타나이드의 첨가로 현저하게 향상되었다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 1가지 초과의 상이한 애쥬번트를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명은 상기의 것 중 임의의 것 또는 그의 조합을 포함하는 임의의 애쥬번트 물질을 포함하는 치료적 조성물을 포함한다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 애쥬번트가 임의의 적절한 순서로 따로 투여될 수 있는 것이 고려된다.
담체는 애쥬번트와 독립적으로 존재할 수 있다. 담체의 기능은 예를 들어, 안정성을 부여하거나, 생물학적 활성을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키는 것일 수 있다. 추가로, 담체는 T-세포로의 펩티드의 제시를 보조할 수 있다. 담체는 당업자에게 알려져 있는 임의의 적합한 담체, 예를 들어, 단백질 또는 항원 제시 세포일 수 있다. 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 단백질, 예를 들어, 트랜스페린, 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 티로글로불린 또는 오브알부민, 면역글로불린 또는 호르몬, 예를 들어, 인슐린 또는 팔미트산일 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 인간의 면역화를 위하여, 담체는 인간에게 허용가능하고 안전한, 생리학적으로 허용가능한 담체일 수 있다. 그러나, 파상풍 톡소이드 및/또는 디프테리아 톡소이드는 본 발명의 일 실시형태에서 적합한 담체이다. 대안적으로, 담체는 덱스트란, 예를 들어, 세파로스일 수 있다.
세포독성 T-세포(CTL)는 무손상 외래 항원 그 자체보다는 MHC 분자에 결합된 펩티드의 형태의 항원을 인식한다. MHC 분자 그 자체는 항원 제시 세포의 세포 표면에 위치한다. 따라서, CTL의 활성화는 오직 펩티드 항원, MHC 분자 및 APC의 삼량체 복합체가 존재하는 경우에만 가능하다. 상응하여, 그것은 펩티드가 CTL의 활성화를 위해 사용되는 경우뿐 아니라, 추가적으로 각각의 MHC 분자를 갖는 APC가 첨가되는 경우에 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 추가로 적어도 하나의 항원 제시 세포를 함유한다.
항원-제시 세포(또는 자극인자 세포)는 전형적으로 그의 표면 상에 MHC 클래스 I 또는 II 분자를 가지며, 일 실시형태에 있어서, 실질적으로 그 자체가 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 선택된 항원을 로딩할 수 없다. 하기에 더욱 상세히 기재되어 있는 바와 같이, MHC 클래스 I 또는 II 분자에는 시험관내에서 선택된 항원이 용이하게 로딩될 수 있다.
바람직하게는, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 적합하게는, 수지상 세포는 신생-항원 펩티드가 펄싱된 자가 수지상 세포이다. 펩티드는 적절한 T-세포 반응을 야기하는 임의의 적합한 펩티드일 수 있다. 종양 관련 항원 유래의 펩티드로 펄싱된 자가 수지상 세포를 사용한 T-세포 치료법은 문헌[Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380] 및 문헌[Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278]에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 항원 제시 세포를 함유하는 백신 조성물에는 본 발명의 하나 이상의 펩티드가 펄싱되거나 로딩된다. 대안적으로, 환자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에는 생체외에서 펩티드가 로딩되고, 환자로 다시 주사될 수 있다. 대안적으로, 항원 제시 세포는 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 발현 작제물을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 그것이 수지상 세포를 형질도입시켜, 펩티드의 제시 및 면역성의 유도를 야기할 수 있는 것이 바람직하다.
치료 방법
본 발명은 추가로 본 발명의 신생-항원 펩티드 또는 백신 조성물을 대상체에게 투여함에 의한 대상체에서의 신생물/종양 특이적 면역 반응의 유도, 신생물/종양에 대한 백신접종, 대상체에서의 암의 증상의 치료 및/또는 완화 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 기재된 암 백신은 암을 갖는 것으로 진단되거나 암이 발생할 위험이 있는 환자를 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 환자는 고형 종양, 예를 들어, 유방, 난소, 전립선, 폐, 신장, 위, 결장, 정소, 두경부, 췌장, 뇌, 흑색종 및 다른 조직 기관의 종양 및 조혈 종양, 예를 들어, 림프종 및 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, T 세포 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병 및 B 세포 림프종을 가질 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 조성물은 CTL 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명의 신생-항원 펩티드, 폴리펩티드 또는 백신 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 치료제는 예를 들어, 화학치료 또는 생물치료제, 방사선 또는 면역요법이다. 특정 암에 대한 임의의 적합한 치료적 처치가 시행될 수 있다. 화학치료 및 생물치료제의 예는 알데스류킨(aldesleukin), 알트레타민(altretamine), 아미포스틴(amifostine), 아스파라기나제(asparaginase), 블레오마이신(bleomycin), 카페시타빈(capecitabine), 카보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 클라드리빈(cladribine), 시사프리드(cisapride), 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine)(DTIC), 다크티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 드로나비놀(dronabinol), 에포에틴(epoetin) 알파, 에토포시드(etoposide), 필그라스팀(filgrastim), 플루다라빈(fludarabine), 플루오로우라실, 젬시타빈(gemcitabine), 그라니세트론(granisetron), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 인터페론 알파, 이리노테칸(irinotecan), 란소프라졸(lansoprazole), 레바미솔(levamisole), 류코보린(leucovorin), 메게스트롤(megestrol), 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토클로프라미드(metoclopramide), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 오메프라졸(omeprazole), 온단세트론(ondansetron), 파클리탁셀(탁솔(Taxol)®), 필로카르핀(pilocarpine), 프로클로로페라진(prochloroperazine), 리툭시맙(rituximab), 타목시펜(tamoxifen), 탁솔(taxol), 토포테칸 하이드로클로라이드(topotecan hydrochloride), 트라스투주맙(trastuzumab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 비노렐빈 타르트레이트(vinorelbine tartrate)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 전립선암 치료를 위하여, 항-CTLA-4가 병용될 수 있는 바람직한 화학치료제는 파클리탁셀(탁솔®)이다.
또한, 대상체에는 추가로 항-면역억제 또는 면역자극제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체에는 항-CTLA 항체 또는 항-PD-1 또는 항-PD-Ll이 추가로 투여된다. 항체에 의한 CTLA-4 또는 PD-1/PD-L1의 차단이 환자에서 암 세포에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 특히, CTLA-4 차단은 백신접종 프로토콜을 따르는 경우, 효과적인 것으로 나타났다(문헌[Hodi et al 2005]).
백신 조성물 및 최적의 투여 섭생에 포함될 각 펩티드의 최적의 양은 과도한 실험 없이, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 그의 변이체는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사용으로 제조될 수 있다. 바람직한 펩티드 주사 방법은 피하, 피내, 복강내, 근육내 및 정맥내를 포함한다. 바람직한 DNA 주사 방법은 피내, 근육내, 피하, 복강내 및 정맥내를 포함한다. 예를 들어, 1 내지 500 ㎎, 50 ㎍ 내지 1.5 ㎎, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 500 ㎍의 용량의 펩티드 또는 DNA가 제공될 수 있으며, 각각의 펩티드 또는 DNA에 좌우될 것이다. 이러한 범위의 용량은 이전의 시험에서 성공적으로 사용되었다(문헌[Brunsvig P F, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12): 1553-1564]; 문헌[M. Staehler, et al., ASCO meeting 2007; Abstract No 3017]). 백신 조성물의 다른 투여 방법이 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 조성물에 존재하는 펩티드의 선택, 수 및/또는 양이 조직, 암 및/또는 환자-특이적이도록 컴파일링(compiled)된다. 예를 들어, 펩티드의 정확한 선택은 주어진 조직에서의 모체 단백질의 발현 패턴에 의해 안내되어, 부작용을 피할 수 있다. 선택은 특정 유형의 암, 질병의 상태, 보다 조기의 치료 섭생, 환자의 면역 상태 및 물론 환자의 HLA-단상형에 좌우될 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 백신은 특정 환자의 개인적 요구에 따라, 개별화된 성분을 함유할 수 있다. 예는 특정 환자에서의 관련 신생항원의 발현에 따른 펩티드의 양의 변화, 개인적 알러지 또는 다른 처치로 인한 원치않는 부작용, 및 치료 계획 또는 제1차 치료 후의 제2 치료에 대한 조정을 포함한다.
본 발명의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 이미 암을 앓고 있는 개체에게 투여될 수 있다. 치료적 응용에서, 조성물은 종양 항원에 대하여 유효한 CTL 반응을 유도하고, 증상 및/또는 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이를 달성하기에 적당한 양은 "치료적 유효 용량"으로 정의된다. 이러한 이용에 유효한 양은 펩티드 조성, 투여 방식, 치료 중인 질병의 병기 및 중증도, 환자의 체중 및 일반적 건강 상태 및 처방하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이나, 일반적으로, 초기 면역화(치료적 또는 예방적 투여를 위함)를 위해서 70 ㎏ 환자에 대하여 약 1.0 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍의 펩티드 범위이며, 부스팅 용량, 또는 아마도 환자의 혈액 중 특이적 CTL 활성을 측정함으로써 그리고 환자의 반응 및 질환에 따라 수주 내지 수개월에 걸친 부스팅 섭생에 따른 약 1.0 ㎍ 내지 약 10,000 ㎍의 펩티드 범위이다. 본 발명의 펩티드 및 조성물은 일반적으로 특히 암이 전이되는 경우에, 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황인 중증의 질병 상태에 사용될 수 있음을 유념해야 한다. 치료적 이용을 위하여, 투여는 종양의 검출 또는 수술적 제거 후 가능한 빨리 시작해야 한다. 이는 적어도 증상이 실질적으로 약화될 때까지 그리고 그 후 소정의 기간 동안 부스팅 용량으로 이어진다.
치료적 처치를 위한 약제학적 조성물(예를 들어, 백신 조성물)은 비경구, 국소, 비강, 경구 또는 국소 투여용으로 의도된다. 바람직하게는 약제학적 조성물은 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내 투여된다. 조성물은 수술 절제 부위에 투여되어, 종양에 대한 국소 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명은 펩티드의 용액을 포함하는 비경구 투여를 위한 조성물을 제공하며, 백신 조성물은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해되거나 현탁화된다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.9% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 시용될 수 있다. 이들 조성물은 통상의 잘 알려져 있는 멸균 기술에 의해 멸균되거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액을 그대로의 사용을 위해 포장하거나, 동결건조시킬 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 배합된다. 조성물은 생리학적 조건에 근접되기 위해 필요한 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어, pH 조절제 및 완충제, 장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다.
약제학적 제형 중 본 발명의 펩티드의 농도는 광범위하게, 즉, 통상 중량 기준으로 약 0.1% 미만 내지 적어도 약 2%에서 20% 내지 50% 이상까지 달라질 수 있으며, 선택되는 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다.
펩티드를 함유하는 리포좀 현탁액은 특히, 투여 방식, 전달되는 펩티드 및 치료되는 질병의 병기에 따라 달라지는 용량으로, 정맥내, 국소, 국부 등으로 투여될 수 있다. 면역 세포로의 표적화를 위하여, 리간드, 예를 들어, 요망되는 면역계 세포의 세포 표면 결정기에 특이적인 항체 또는 그의 단편이 리포좀에 혼입될 수 있다.
고체 조성물에 있어서, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함하는 종래의 또는 나노입자 비독성 고체 담체가 사용될 수 있다. 경구 투여를 위하여, 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제 중 임의의 것, 예를 들어, 이전에 열거된 담체 및 일반적으로, 본 발명의 하나 이상의 펩티드인, 10 내지 95%, 더욱 바람직하게는 25% 내지 75%의 농도의 활성 성분을 혼입시킴으로써 형성된다.
에어로졸 투여를 위하여, 면역원성 펩티드는 바람직하게는 계면활성제 및 추진제와 함께 미분된 형태로 공급된다. 펩티드의 전형적인 백분율은 중량 기준으로, 0.01% 내지 20%, 바람직하게는 1% 내지 10%이다. 계면활성제는 물론 비독성이며, 바람직하게는 추진제 중에 용해성일 것이다. 그러한 작용제를 대표하는 것은 6 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산의 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대 지방족 다가 알콜 또는 그의 환형 무수물을 갖는 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산이다. 혼합된 에스테르, 예컨대 혼합 또는 천연 글리세리드가 사용될 수 있다. 계면활성제는 조성물의 0.1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.25 중량% 내지 5 중량%를 구성할 수 있다. 조성의 평형은 일반적인 추진제이다. 담체, 예를 들어, 비강내 전달용 레시틴도 또한 필요에 따라 포함될 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 오염 박테리아 또는 동물 물질이 없는 시약을 사용하여 화학적으로 용이하게 합성될 수 있다(문헌[Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963]).
치료 목적 또는 면역화 목적을 위하여, 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산 및 본원에 기재된 펩티드 중 하나 이상도 또한 환자에게 투여될 수 있다. 수많은 방법이 핵산을 환자에 전달하기 위해 알맞게 사용된다. 예를 들어, 핵산은 "네이키드 DNA"로서 직접 전달될 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어, 문헌[Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990)], 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호에 기재되어 있다. 또한, 핵산은 예를 들어, 미국 특허 제5,204,253호에 기재된 바와 같이 볼리스틱(ballistic) 전달을 사용하여 투여될 수 있다. 단지 DNA만으로 이루어진 입자가 투여될 수 있다. 대안적으로, DNA는 입자, 예를 들어, 금 입자에 부착될 수 있다.
또한, 핵산은 양이온 화합물, 예를 들어, 양이온 지질로 복합체화되어 전달될 수 있다. 지질-매개의 유전자 전달 방법은 예를 들어, WO1996/18372호; WO 1993/24640호; 문헌[Mannino & Gould-Fogerite , BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)]; 미국 특허 제5,279,833호; WO 1991/06309호; 및 문헌[Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)]에 기재되어 있다.
관심 펩티드를 인코딩하는 RNA도 또한 전달을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kiken et al, 2011; Su et al, 2011] 참조).
본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 약독화된 바이러스 숙주, 예를 들어, 우두 또는 계두에 의해 발현될 수 있다. 이러한 접근법은 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 벡터로서 우두 바이러스를 사용하는 것을 포함한다. 급성 또는 만성 감염된 숙주로의 또는 비감염된 숙주로의 도입시에, 재조합 우두 바이러스는 면역원성 펩티드를 발현하며, 이에 의해, 숙주 CTL 반응을 유도한다. 면역화 프로토콜에 유용한 우두 백터 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,722,848호에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 문헌[Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991))]에 기재되어 있다. 본 발명의 펩티드의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 매우 다양한 다른 벡터, 예를 들어, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 벡터 등이 본원의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산의 바람직한 투여 방식은 다수의 에피토프를 인코딩하는 미니유전자 작제물을 사용한다. 인간 세포에서의 발현을 위하여, 선택된 CTL 에피토프를 인코딩하는 DNA 서열(미니유전자)을 생성하기 위하여, 에피토프의 아미노산 서열은 역 번역된다. 인간 코돈 사용 표를 사용하여 각 아미노산에 대한 코돈 선택을 안내한다. 이들 에피토프-인코딩 DNA 서열은 직접 연결되어, 연속 폴리펩티드 서열을 생성한다. 발현 및/또는 면역원성을 최적화시키기 위하여, 추가의 요소가 미니유전자 설계에 혼입될 수 있다. 역 번역될 수 있으며, 미니유전자 서열에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예에는 헬퍼 T 림프구, 에피토프, 리더(신호) 서열 및 소포체 잔류 신호가 포함된다. 또한, CTL 에피토프의 MHC 제시는 합성(예를 들어, 폴리-알라닌) 또는 천연 발생 플랭킹 서열을 CTL 에피토프에 인접하게 포함함으로써 향상될 수 있다.
미니유전자 서열은 미니유전자의 플러스 및 마이너스 가닥을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 조립함으로써 DNA로 전환된다. 중첩 올리고뉴클레오티드(30 내지 100개 염기 길이)는 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 적절한 조건하에 합성, 인산화, 정제 및 어닐링된다. 올리고뉴클레오티드의 말단은 T4 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 연결된다. 그 다음, CTL 에피토프 폴리펩티드를 인코딩하는 이러한 합성 미니유전자는 요망되는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
당업자에게 널리 알려져 있는 표준 조절 서열을 벡터에 포함시켜, 표적 세포에서의 발현을 보장한다. 몇몇 벡터 요소가 필요하다: 미니유전자 삽입을 위한 다운스트림 클로닝 부위가 있는 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐화 신호; 에스케리키아 콜라이 복제 원점; 및 에스케리키아 콜라이 선택 마커(예를 들어, 앰피실린 또는 카나마이신 내성). 많은 프로모터, 예를 들어, 인간 거대세포바이러스(hCMV) 프로모터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 프로모터 서열에 대하여 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호를 참조한다.
미니유전자 발현 및 면역원성을 최적화하기 위하여, 추가의 벡터 변형이 요망될 수 있다. 일부 경우에, 효율적인 유전자 발현을 위해 인트론이 필요하며, 하나 이상의 합성 또는 천연-발생 인트론이 전사되는 미니유전자의 영역 내로 혼입될 수 있다. 또한, mRNA 안정화 서열의 포함은 미니유전자 발현을 증가시키는 것으로 여겨질 수 있다. 면역 자극 서열(ISS 또는 CpG)이 DNA 백신의 면역원성에서 역할을 수행하는 것이 최근에 제안되었다. 이들 서열은 면역원성을 증진시키는 것으로 관찰된다면, 미니유전자 코딩 서열 외측에 벡터 내에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 미니유전자-인코딩된 에피토프, 및 면역원성을 증가시키거나 감소시키기 위해 포함되는 제2 단백질의 생성을 가능하게 하기 위하여, 비시스트론(bicistronic) 발현 벡터가 사용될 수 있다. 동시-발현되는 경우 면역 반응을 유리하게 증가시킬 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 예는 사이토카인(예를 들어, IL2, IL12, GM-CSF), 사이토카인-유도 분자(예를 들어, LeIF) 또는 동시자극 분자를 포함한다. 헬퍼(HTL) 에피토프는 세포내 표적화 신호에 연결될 수 있으며, CTL 에피토프와 따로 발현될 수 있다. 이는 CTL 에피토프와 상이한 세포 구획으로의 HTL 에피토프의 지향을 가능하게 할 것이다. 필요에 따라, 이는 MHC 클래스 II 경로로의 HTL 에피토프의 더욱 효율적인 유입을 용이하게 하여, CTL 유도를 향상시킬 수 있다. CTL 유도와 대조적으로, 면역억제 분자(예를 들어, TGF-β)의 동시-발현에 의해 면역 반응을 특이적으로 감소시키는 것은 특정 질병에서 유리할 수 있다.
일단 발현 벡터를 선택하면, 미니유전자를 프로모터의 다운스트림 폴리링커 영역으로 클로닝한다. 이러한 플라스미드를 적절한 에스케리키아 콜라이 균주로 형질전환시키고, DNA를 표준 기술을 사용하여 제조한다. 벡터에 포함되는 미니유전자, 및 모든 다른 요소의 배향 및 DNA 서열을 제한 맵핑 및 DNA 서열 분석을 사용하여 확인한다. 올바른 플라스미드를 지니는 박테리아 세포를 마스터(master) 세포 은행 및 작업용 세포 은행으로 보관할 수 있다.
정제된 플라스미드 DNA를 다양한 제형을 사용한 주사용으로 제조할 수 있다. 이들 중 가장 간단한 것은 멸균 인산염-완충 염수(PBS) 중 동결건조된 DNA의 재구성이다. 다양한 방법이 설명되어 있으며, 신규 기술이 이용가능하게 될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 핵산을 양이온 지질과 편리하게 제형화시킨다. 또한, 보호성, 상호작용성, 비-축합성(PINC)으로서 총칭되는, 당지질, 융합유도성 리포좀, 펩티드 및 화합물이 또한 정제된 플라스미드 DNA로 복합체화되어, 안정성, 근육내 분산, 또는 특정 기관 또는 세포 유형으로의 트래픽킹(trafficking)과 같은 변수에 영향을 미칠 수 있다.
미니유전자-인코딩된 CTL 에피토프의 발현 및 MHC 클래스 I 제시에 대한 기능적 검정으로서 표적 세포 감작화를 사용할 수 있다. 플라스미드 DNA를, 표준 CTL 크로뮴 방출 분석법에 대한 표적으로서 적합한 포유류 세포주 내로 도입한다. 사용된 트랜스펙션 방법은 최종 제형에 좌우될 것이다. "네이키드" DNA에 대해서는 전기천공법이 사용될 수 있는 반면, 양이온 지질은 직접적인 시험관내 트랜스펙션을 가능하게 한다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 플라스미드를 동시-트랜스펙션시켜, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 트랜스펙션된 세포를 농축시킬 수 있다. 이어서, 이들 세포를 크로뮴-51 표지시키고, 이를 에피토프-특이적 CTL 주에 대한 표적 세포로서 사용한다. 51Cr 방출에 의해 검출된 세포용해는 미니유전자-인코딩된 CTL 에피토프의 MHC 제시의 생성을 나타낸다.
생체내 면역원성은 미니유전자 DNA 제형을 기능적으로 시험하기 위한 제2의 접근법이다. 적절한 인간 MHC 분자를 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 DNA 산물로 면역화시킨다. 용량 및 투여 경로는 제형 의존적이다(예를 들면, PBS 중의 DNA의 경우에는 근육내이고, 지질-복합체화된 DNA의 경우에는 복강내이다). 면역화 21일 후, 비장 세포를 수집하고, 시험되는 각각의 에피토프를 인코딩하는 펩티드의 존재하에 1주 동안 재자극시킨다. 이들 이펙터 세포(CTL)를 표준 기술을 사용하여, 펩티드-로딩되고 크로뮴-51 표지된 표적 세포의 세포용해에 대해 분석한다. 미니유전자-인코딩된 에피토프에 상응하는 펩티드의 MHC 로딩에 의해 감작화된 표적 세포의 용해는 생체내 CTL 유도를 위한 DNA 백신 기능을 입증해준다.
펩티드를 사용하여, 또한 생체외에서 CTL을 유도할 수 있다. 생성된 CTL을 사용하여, 기타 종래의 형태의 치료법에 반응하지 않거나 또는 펩티드 백신 치료 접근법에 반응하지 않을 환자에서 만성 종양을 치료할 수 있다. 특정 종양 항원에 대한 생체외 CTL 반응은, 환자의 CTL 전구체 세포(CTLp)를 항원-제시 세포(APC)의 공급원 및 적절한 펩티드와 함께 조직 배양에서 인큐베이션시킴으로써 유도된다. CTLp를 활성화시키고, 이를 성숙시키고, 이펙터 CTL로 증량시키는 적절한 인큐베이션 시간(전형적으로, 1 내지 4주) 후에, 세포를 환자에게 다시 주입하고, 여기서, 그들은 그들의 특이적 표적 세포(즉, 종양 세포)를 파괴시킬 것이다. 특이적 세포독성 T 세포의 생성을 위한 시험관내 조건을 최적화시키기 위하여, 자극인자 세포의 배양을 적절한 무혈청 배지에서 유지한다.
활성화될 세포, 예를 들어, 전구체 CD8+ 세포와 자극인자 세포의 인큐베이션 전에, 자극인자 세포의 표면상에서 발현될 인간 클래스 I 분자에 로딩되기에 충분한 양의 항원 펩티드의 양을 자극인자 세포 배양에 첨가한다. 본 발명에서, 펩티드의 충분한 양은 약 200개, 바람직하게는 200개 이상의, 펩티드가 로딩된 인간 클래스 I MHC 분자가 각각의 자극인자 세포의 표면상에 발현되게 할 양이다. 바람직하게는, 자극인자 세포를 2 ㎍/㎖ 초과의 펩티드와 함께 인큐베이션시킨다. 예를 들어, 자극인자 세포를 3, 4, 5, 10, 15 ㎍/㎖ 이상의 펩티드와 인큐베이션시킨다.
이어서, 휴지 또는 전구체 CD8+ 세포를, CD8+ 세포를 활성화시키기에 충분한 기간 동안 적절한 자극인자 세포와 함께 배양에서 인큐베이션시킨다. 바람직하게는, CD8+ 세포를 항원-특이적 방식으로 활성화시킨다. 휴지 또는 전구체 CD8+(이펙터) 세포 대 자극인자 세포의 비는 개체마다 달라질 수 있고, 이는 추가로, 배양 조건에 대한 개체의 림프구의 순응(amenability), 및 기존의 치료 양상이 이용되는 질병 증상 또는 기타 증상의 성질 및 중증도와 같은 변수에 좌우될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 림프구:자극인자 세포 비는 약 30:1 내지 300:1의 범위이다. 이펙터/자극인자 배양은, 치료학적으로 이용가능하거나 유효한 수의 CD8+ 세포를 자극하는데 필요한 만큼 장시간 동안 유지시킬 수 있다.
CTL을 시험관내에서 유도하기 위해서는, APC 상의 대립형질 특이적 MHC 클래스 I 분자와 결합되는 펩티드를 특이적으로 인식해야 한다. APC당 특이적 MHC/펩티드 복합체의 수는 CTL을 자극하는데, 특히 1차 면역 반응에 있어 결정적이다. 세포당 소량의 펩티드/MHC 복합체는, 세포가 CTL에 의한 용해에 감수성이게 하거나 2차 CTL 반응을 자극하는데 충분하지만, 1차 반응 동안에 CTL 전구체(pCTL)를 성공적으로 활성화시키기 위해서는, 상당히 더 많은 수의 MHC/펩티드 복합체가 필요하다. 세포 상에 빈(empty) 주 조직적합성 복합체 분자의 펩티드 로딩은 1차 세포독성 T 림프구 반응의 유도를 가능하게 한다.
돌연변이 세포주가 모든 인간 MHC 대립형질에 대하여 존재하지 않기 때문에, APC 표면으로부터 내인성 MHC-회합된 펩티드를 제거하는 기술을 사용한 다음, 생성된 빈 MHC 분자에 관심 면역원성 펩티드를 로딩하는 것이 유리하다. APC로서의, 환자의 비-형질전환되고(비-종양형성), 비-감염된 세포, 바람직하게는 자가 세포의 이용이, 생체외 CTL 치료법 개발에 지향된 CTL 유도 프로토콜의 설계에 바람직하다. 본 출원에는 APC의 표면으로부터 내인성 MHC-회합된 펩티드를 스트립핑(stripping)한 다음, 요망되는 펩티드를 로딩하는 방법이 개시되어 있다.
안정한 MHC 클래스 I 분자는 다음 요소로 형성된 삼량체 복합체이다: 1) 통상 8 내지 10개 잔기의 펩티드, 2) 그의 α1 및 α2 도메인 내에 펩티드-결합 부위를 보유하고 있는 막횡단 다형성 단백질 중쇄, 및 3) 비-공유적으로 회합된 비-다형성 경쇄, p2마이크로글로불린. 결합된 펩티드를 제거하고/하거나 복합체로부터 p2마이크로글로불린을 해리시켜, MHC 클래스 I 분자를 비기능성이고 불안정하게 만들어, 신속한 분해를 야기한다. PBMC로부터 단리된 모든 MHC 클래스 I 분자는 그들에 결합된 내인성 펩티드를 갖는다. 따라서, 제1 단계는 그들의 분해를 야기하지 않고, APC 상의 MHC 클래스 I 분자에 결합된 모든 내인성 펩티드를 제거한 후, 외인성 펩티드를 그들에 첨가하는 것이다.
MHC 클래스 I 분자에 결합된 펩티드가 없게 하기 위한 가능한 2가지 방법에는, 배양 온도를 밤새 37℃에서 26℃로 낮추어 p2마이크로글로불린을 불안정화시키는 방법, 및 온건한 산 처리를 이용하여 세포로부터 내인성 펩티드를 스트리핑하는 방법이 포함된다. 상기 방법은 이전에 결합된 펩티드를 세포외 환경으로 방출시켜, 신규한 외인성 펩티드가 빈 클래스 I 분자에 결합하도록 한다. 냉온 인큐베이션 방법은 외인성 펩티드가 MHC 복합체에 효율적으로 결합되게 할 수 있으나, 26℃에서의 밤샘 인큐베이션을 필요로 하는데, 이는 세포의 대사 속도를 늦출 수 있다. 또한, MHC 분자를 활발히 합성하지 않는 세포(예를 들어, 휴지 PBMC)는 아마도 냉온 과정에 의해 다량의 빈 표면 MHC 분자를 생성하지 않을 것이다.
가혹한 산 스트립핑은 트리플루오로아세트산, pH 2를 사용한 단백질의 추출 또는 면역친화성 정제된 클래스 I-펩티드 복합체의 산 변성을 포함한다. 이들 방법으로는 CTL을 유도할 수 없는데, 이는 항원 제시에 있어 결정적인 최적의 대사 상태와 APC 생존력을 보존하면서 내인성 펩티드를 제거하는 것이 중요하기 때문이다. pH 3의 온건한 산 용액, 예를 들면, 글리신 또는 시트르산염-인산염 완충액을 사용하여 내인성 펩티드를 확인하고 종양 관련 T 세포 에피토프를 확인하였다. 상기 처리는, MHC 클래스 II 분자를 포함한 다른 표면 항원은 무손상으로 유지되는 반면, MHC 클래스 I 분자만이 불안정화(및 회합 펩티드 방출)된다는 점에서 특히 유효하다. 가장 중요하게는, 세포를 온건한 산 용액으로 처리하는 것은 세포 생존력 또는 대사 상태에 영향을 미치지 않는다. 온건한 산 처리는 신속한데, 이는 내인성 펩티드의 스트립핑이 4℃에서 2분 내에 일어나고, 적당한 펩티드가 로딩된 후에 APC가 그의 기능을 수행할 준비가 되기 때문이다. 상기 기술을 본원에 활용하여, 1차 항원-특이적 CTL의 생성을 위해 펩티드-특이적 APC를 제조한다. 생성된 APC는 펩티드-특이적 CD8+ CTL을 유도하는데 효율적이다.
활성화된 CD8+ 세포는, 공지된 각종 방법 중의 한 방법을 사용하여 자극인자 세포로부터 효과적으로 분리될 수 있다. 예를 들면, 자극인자 세포, 자극인자 세포에 로딩된 펩티드 또는 CD8+ 세포(또는 그의 세그먼트)에 특이적인 모노클로널 항체를 이용하여, 그들의 적절한 상보적 리간드를 결합시킬 수 있다. 이어서, 항체-태그된 분자를, 적절한 수단, 예를 들면, 널리 알려져 있는 면역침전법 또는 면역분석법을 통하여 자극인자-이펙터 세포 혼합물로부터 추출할 수 있다.
활성화된 CD8+ 세포의 유효한 세포독성 양은 시험관내 용도 및 생체내 용도 간에 달라질 수 있을 뿐만 아니라 이들 킬러 세포의 궁극적인 표적인 세포의 유형과 양에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 또한, 환자의 상태에 따라서 달라질 것이며, 이는 전문의가 모든 적절한 요인들을 고려하여 결정해야 한다. 그러나, 마우스에서 약 5 × 106 내지 약 5 × 107개 세포를 사용하는 것에 비해, 성인 인간의 경우, 바람직하게는 약 1 × 106 내지 약 1 × 1012개, 보다 바람직하게는 약 1 × 108 내지 약 1 × 1011개, 더더욱 바람직하게는 약 1 × 109 내지 약 1 × 1010개의 활성화된 CD8+ 세포를 사용한다.
바람직하게는, 앞서 논의된 바와 같이, 활성화된 CD8+ 세포를 세포 배양으로부터 수집한 후에, CD8+ 세포를 치료될 개체에게 투여한다. 그러나 다른 존재하는 및 제안된 치료 양상과는 달리, 본 발명의 방법이 종양형성성이 아닌 세포 배양 시스템을 이용하는 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 자극인자 세포와 활성화된 CD8+ 세포의 완전한 분리가 달성되지 않는 경우, 소수의 자극인자 세포 투여와 연관되는 것으로 공지된 내재 위험이 없는 반면, 포유동물 종양-증진성 세포의 투여가 극도로 위험할 수 있다.
세포 성분을 재도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 미국 특허 제4,844,893호(Honsik et al.) 및 미국 특허 제4,690,915호(Rosenberg)에 예시된 바와 같은 과정이 포함된다. 예를 들면, 활성화된 CD8+ 세포를 정맥내 주입을 통하여 투여하는 것이 적절하다.
CD8+ 세포 활성은 CD4+ 세포의 사용을 통해 증강될 수 있다. 종양 항원에 대한 CD4 T+ 세포 에피토프의 확인은 관심이 고취되는데, 그 이유는 암에 대한 많은 면역 기반의 치료법이 CD8+ 및 CD4+ T 림프구 둘 모두가 환자의 종양을 표적화하기 위해 사용된다면 더욱 효율적일 수 있기 때문이다. CD4+ 세포는 CD8 T 세포 반응을 증진시킬 수 있다. 동물 모델에서의 많은 연구에 의해, CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두가 항-종양 반응에 참여하는 경우 보다 나은 결과가 명백하게 입증되었다(예를 들어, 문헌[Nishimura et al. (1999) Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (TH1) and Th2 cells in tumor eradication in vivo. J Ex Med 190:617-27] 참조). 상이한 유형의 암에 대한 치료법의 개발에 적용가능한 보편적 CD4+ T 세포 에피토프가 확인되었다(예를 들어, 문헌[Kobayashi et al. (2008) Current Opinion in Immunology 20:221-27] 참조). 예를 들어, 파상풍 톡소이드 유래의 HLA-DR 제한 헬퍼 펩티드를 흑색종 백신에 사용하여, CD4+ T 세포를 비특이적으로 활성화시켰다(예를 들어, 문헌[Slingluff et al. (2007) Immunologic and Clinical Outcomes of a Randomized Phase II Trial of Two Multipeptide Vaccines for Melanoma in the Adjuvant Setting, Clinical Cancer Research 13(21):6386-95] 참조). 그러한 CD4+ 세포가 그들의 종양 특이성을 달라지게 하는 3가지 수준으로 적용가능할 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다: 1) 보편적 CD4+ 에피토프(예를 들어, 파상풍 톡소이드)를 사용하여 CD8+ 세포를 보강할 수 있는 광범위한 수준; 2) 종양-관련 고유 CD4+ 에피토프를 사용하여 CD8+ 세포를 보강할 수 있는 중간 수준; 및 3) 신생항원 CD4+ 에피토프를 사용하여 환자 특이적 방식으로 CD8+ 세포를 보강할 수 있는 환자 특이적 수준.
또한, CD8+ 세포 면역성은 신생-항원 로딩된 수지상 세포(DC) 백신으로 생성될 수 있다. DC는 T 세포 면역성을 개시하는 강력한 항원-제시 세포이며, 예를 들어, 직접 펩티드 주사에 의해 하나 이상의 관심 펩티드가 로딩되는 경우, 암 백신으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이성 흑색종으로 새로이 진단된 환자는 IL-12p70-생성 환자 DC 백신을 통하여 자가 펩티드 펄싱된 CD40L/IFN-g-활성화 성숙 DC와 함께 3개의 HLA-A*0201-제한 gp100 흑색종 항원-유래 펩티드에 대하여 면역화된 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Carreno et al (2013) L-12p70-producing patient DC vaccine elicits Tc1-polarized immunity, Journal of Clinical Investigation, 123(8):3383-94] 및 문헌[Ali et al. (2009) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy, 1(8):1-10] 참조). 신생-항원 로딩된 DC가 합성 TLR 3 효능제 폴리이노신-폴리시티딜산-폴리-L-라이신 카복시메틸셀룰로스(폴리-ICLC)를 사용하여 DC를 자극하여 제조될 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다. 폴리-ICLC는 CD83 및 CD86의 상향조절, 인터류킨-12(IL-12), 종양 괴사 인자(TNF), 인터페론 감마-유도 단백질 10(IP-10), 인터류킨 1(IL-1) 및 I형 인터페론(IFN)의 유도 및 최소 인터류킨 10(IL-10) 생성에 의해 평가시, 인간 DC에 대한 강력한 개별 성숙 자극제이다. DC를 백혈구분리반출술에 의해 수득되는 동결된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분화시킬 수 있는 한편, PBMC를 피콜(Ficoll) 기울기 원심분리에 의해 단리하고, 분취물로 동결시킬 수 있다.
예시적으로, 하기의 7일 활성화 프로토콜을 사용할 수 있다. 1일 - PBMC를 해동시키고, 조직 배양 플라스크에 플레이팅하여, 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 1 내지 2시간 인큐베이션시킨 후에 플라스틱 표면에 부착된 단핵구를 선택한다. 인큐베이션 후에, 림프구를 세척해내고, 부착 단핵구를 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구 대식구-콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 존재하에 5일 동안 배양하여, 미성숙 DC로 분화시킨다. 6일에, 미성숙 DC를 백신의 품질에 대한 조절의 역할을 하는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 단백질로 펄싱시키고, 백신의 면역원성을 부스팅시킬 수 있다. DC를 자극하여 성숙시키고, 펩티드 항원을 로딩하고, 하룻밤 인큐베이션시킨다. 7일에, 세포를 세척하고, 속도 조절 동결기를 사용하여 4 내지 20 × 10(6)개 세포를 함유하는 1 ㎖ 분취액에서 동결시켰다. DC의 뱃치에 대한 출하 승인(Lot release) 시험을 수행하여, DC를 환자에게 주사하기 전에 최소 사양을 만족시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Sabado et al. (2013) Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy, J. Vis Exp. Aug 1;(78). doi: 10.3791/50085] 참조).
DC 백신은 환자로의 전달을 용이하게 하기 위해 스캐폴드 시스템으로 혼입될 수 있다. DC 백신을 사용한 신생물 환자의 치료적 처치는 숙주 수지상 세포를 동원하는 인자를 장치에 방출시키고, 항원을 방출하면서 애쥬번트(예를 들어, 위험 신호)를 국소 제시함으로써 잔류 미성숙 DC를 분화시키며, DC가 T 세포와 상호작용하여 암 신생-항원에 대한 강력한 세포독성 T 림프구 반응을 생성할 수 있는 림프절(또는 요망되는 작용 부위)로의 활성화된, 항원 로딩된 DC의 방출을 촉진시키는 생체물질 시스템을 사용할 수 있다. 이식가능한 생체물질을 사용하여 환자 특이적 방식으로 신생물에 대한 강력한 세포독성 T 림프구 반응을 생성할 수 있다. 그 다음, 생체물질로부터의 항원의 방출과 협력하여 감염을 모방하는 위험 신호에 그들을 노출시킴으로써 생체물질-잔류 수지상 세포를 활성화시킬 수 있다. 그 다음, 활성화된 수지상 세포를 생체물질로부터 림프절로 이동시켜, 세포독성 T 이펙터 반응을 유도한다. 이러한 접근법은 종양 생검으로부터 제조된 용해물을 사용한 예비임상 연구에서, 확립된 흑색종의 퇴행을 야기하는 것으로 이전에 입증되어 있으며(예를 들어, 문헌[Ali et al. (2209) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy 1(8):1-10]; 문헌[Ali et al. (2009) Infection-mimicking materials to program dendritic cells in situ. Nat Mater 8:151-8] 참조), 그러한 백신은 현재 대나-파버 암연구소(Dana-Farber Cancer Institute)에서 최근에 개시된 단계 I 임상 시험에서 시험 중이다. 또한, 이러한 접근법은 현 제안에서, C6 랫트 신경교종 모델을 사용하여 교모세포종의 퇴행, 및 강력한 기억 반응의 유도를 야기하여, 재발을 방지하는 것으로 나타났다.24 종양 특이적 수지상 세포 활성화를 증폭시키고 유지하기 위한 그러한 이식가능한 바이오매트릭스 백신 전달 스캐폴드의 능력은 종래의 피하 또는 림프절 내 백신 투여에 의해 달성될 수 있는 것보다 더욱 강력한 항-종양 면역감작을 야기할 수 있다.
본 발명의 실시는 다르게 나타내지 않는 한, 충분히 당업자의 이해 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 사용한다. 그러한 기술은 문헌, 예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)]; 문헌["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; 문헌["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Wei, 1996)]; 문헌["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; 문헌["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; 문헌["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에 완전히 설명되어 있다. 이들 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성에 적용가능하며, 그와 같이, 본 발명의 제조 및 실시에서 고려될 수 있다. 특정 실시형태에 특히 유용한 기술이 하기의 섹션에 논의될 것이다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 분석법, 스크리닝 및 치료 방법을 이루고 사용하는 방법의 완전한 개시내용 및 설명을 당업자에게 제공하기 위하여 기재되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하고자 하지 않는다.
실시예 1: 암 백신 시험 프로토콜
상기 기재된 조성물 및 방법을 도 2에 나타낸 일반적 흐름도에 따라 고위험 흑색종(완전 절제된 병기 IIIB, IIIC 및 IVM1a,b)이 있는 15명의 환자에서 시험할 수 있다. 환자는 4주 기간에 걸친 개인맞춤화 종양-특이적 펩티드 및 폴리-ICLC의 혼합물을 사용한 일련의 프라이밍 백신접종에 이어서, 유지 단계 동안 2회의 부스트를 제공받을 수 있다. 모든 백신접종은 피하 전달될 것이다. 백신은 환자에서 안전성, 용인성, 면역 반응 및 임상 효과에 대하여, 그리고 백신 생성의 실행가능성 및 적절한 시간 내의 성공적인 백신접종의 개시에 대하여 평가될 것이다. 제1 코호트는 5명의 환자로 이루어질 것이며, 안전성이 적당하게 입증된 후에, 추가의 10명의 환자의 코호트가 등록될 수 있다(예를 들어, 초기 집단 연구에 대한 접근법을 도시하는 도 3 참조). 말초 혈액을 펩티드-특이적 T-세포 반응에 대하여 광범위하게 모니터링할 것이며, 환자는 질병 재발을 평가하기 위하여 최대 2년 동안 추적될 것이다.
상기 기재된 바와 같이, 동물 및 인간 둘 모두에서, 돌연변이된 에피토프가 면역 반응의 유도에 효율적이며, 자발적 종양 퇴행 또는 장기간 생존의 경우가 돌연변이된 에피토프에 대한 CD8+ T-세포 반응과 상호관련이 있으며(문헌[Buckwalter and Srivastava PK. "It is the antigen(s), stupid" and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296-300 (2008)]; 문헌[Karanikas et al, High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 61:3718-3724 (2001)]; 문헌[Lennerz et al, The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neo-antigens. Proc Natl Acad Sci U S A.102:16013 (2005)]), "면역교정"이 마우스 및 인간에서 돌연변이된 우성 항원의 발현의 변경까지 추적될 수 있다는 대규모의 증거가 있다(문헌[Matsushita et al, Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting Nature 482:400 (2012)]; 문헌[DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012)]; 및 문헌[Sampson et al, Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)]).
차세대 시퀀싱에 의해, 이제 별개의 돌연변이, 예를 들어, 개별 종양 내의 코딩 돌연변이, 가장 흔하게 단일의 아미노산 변화(예를 들어, 미스센스 돌연변이; 도 4a) 및 덜 빈번하게 프레임-쉬프트 삽입/결실/유전자 융합, 정지 코돈 내의 리드-쓰루 돌연변이 및 부적절하게 스플라이싱된 인트론의 번역에 의해 생성되는 신규한 스트레치의 아미노산(예를 들어, neoORF; 도 4b)의 존재를 신속하게 나타낼 수 있다. NeoORF는 그들의 서열의 전체가 면역계에 대하여 완전히 신규하고, 바이러스 또는 박테리아 외래 항원과 유사하기 때문에, 특히 면역원으로서 가치가 있다. 따라서, neoORF는 (1) 종양에 매우 특이적이며(즉, 임의의 정상 세포에서 발현이 존재하지 않음); (2) 중심 관용을 우회하여, 그에 의해, 신생항원-특이적 CTL의 전구체 빈도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 치료적 항암 백신에서 유사한 외래 서열을 사용하는 능력은 인간 파필로마 바이러스(HPV)로부터 유래된 펩티드를 사용하여 최근에 입증되었다. 바이러스 암유전자 E6 및 E7로부터 유래된 HPV 펩티드의 믹스의 3 내지 4회의 백신접종을 제공받은 예비-신생물, 바이러스-유도 질병이 있는 19명의 환자의 약 50%는 24개월 이상 동안 완전한 반응을 유지하였다(문헌[Kenter et a, Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia NEJM 361:1838 (2009)]).
시퀀싱 기술에 의해, 각 종양이 유전자의 단백질 코딩 내용을 변경시키는 다중의 환자-특이적인 돌연변이를 함유하는 것으로 드러났다. 그러한 돌연변이는 변경된 단백질을 생성하며, 이는 단일의 아미노산 변화(미스센스 돌연변이에 의해 야기)에서, 프레임 쉬프트, 종결 코돈의 리드-쓰루 또는 인트론 영역의 번역(신규한 오픈 리딩 프레임 돌연변이; neoORF)으로 인한 긴 영역의 신규한 아미노산 서열의 부가까지의 범위이다. 이들 돌연변이된 단백질은 고유 단백질과 달리, 그들이 자기-관용의 면역-약화 영향을 겪지 않기 때문에, 종양에 대한 숙주의 면역 반응에 대한 가치있는 표적이다. 따라서, 돌연변이된 단백질은 면역원성일 확률이 더 크며, 또한, 환자의 정상 세포에 비하여 종양 세포에 대하여 더욱 특이적이다.
어떤 미스센스 돌연변이가 환자의 동족 MHC 분자에 대하여 강력한 결합 펩티드를 생성하는지 예측하기 위하여 최근에 개선된 알고리즘을 사용하여, 각 환자에 대한 최적으로 돌연변이된 에피토프(neoORF 및 미스센스 둘 모두)의 대표적인 펩티드의 세트를 확인하고 우선순위를 정할 것이며, 최대 20개 이상의 펩티드를 면역화를 위해 제조할 것이다(문헌[Zhang et al, Machine learning competition in immunology - Prediction of HLA class I binding peptides J Immunol Methods 374:1 (2011)]; 문헌[Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)]). 길이가 약 20 내지 35개 아미노산인 펩티드는 그러한 "긴" 펩티드가 효율적인 내재화, 처리 및 전문 항원-제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포에서 교차-제시를 겪고, 인간에서 CTL을 유도하는 것으로 보이기 때문에, 합성할 것이다(문헌[Melief and van der Burg, Immunotherapy of established (pre) malignant disease by synthetic long peptide vaccines Nature Rev Cancer 8:351 (2008)]).
강력하고 특이적인 면역원에 더하여, 효율적인 면역 반응은 면역계를 활성화시키기 위한 강력한 애쥬번트를 필요로 한다(문헌[Speiser and Romero, Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy, and protective T cell immunity Seminars in Immunol 22:144 (2010)]). 예를 들어, 톨-유사 수용체(TLR)는 선천성 면역계와 차례로 후천성 면역계를 효율적으로 유도하는 미생물 및 바이러스 병원체 "위험 신호"의 강력한 센서로 드러났다(문헌[Bhardwaj and Gnjatic, TLR AGONISTS: Are They Good Adjuvants? Cancer J. 16:382-391 (2010)]). TLR 효능제 중에, 폴리-ICLC(합성 이중-가닥 RNA 모방체)는 골수-유래 수지상 세포의 가장 강력한 활성화제 중 하나이다. 인간 자원자 연구에서, 폴리-ICLC는 안전하며, 가장 강력한 약독화된 생 바이러스 백신 중 하나, 황열 백신 YF-17D에 의해 유도되는 것과 유사한, 말초 혈액 세포 내의 유전자 발현 프로파일을 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Caskey et al, Synthetic double-stranded RNA induces innate immune responses similar to a live viral vaccine in humans J Exp Med 208:2357 (2011)]). 힐토놀(Hiltonol)®, 온코비르, 인코포레이티드(Oncovir, Inc)에 의해 제조되는 폴리-ICLC의 GMP 제제가 애쥬번트로 이용될 것이다.
실시예 2: 표적 환자 집단
병기 IIIB, IIIC 및 IVM1a,b, 흑색종이 있는 환자는 심지어 질병의 완전한 수술적 절제에도, 상당한 질병 재발 및 사망의 위험을 갖는다(문헌[Balch et al, Final Version of 2009 AJCC Melanoma Staging and Classification J Clin Oncol 27:6199 - 6206 (2009)]). 이러한 환자 집단에 대한 이용가능한 전신 애쥬번트 요법은 인터페론-α(IFNα)이며, 이는 측정가능하나 미미한 이익을 제공하며, 상당한, 빈번하게 용량을 제한하는 독성과 관련이 있다(문헌[Kirkwood et al, Interferon alfa-2b Adjuvant Therapy of High-Risk Resected Cutaneous Melanoma: The Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684 J Clin Oncol 14:7-17 (1996)]; 문헌[Kirkwood et al, High- and Low-dose Interferon Alpha-2b in High-Risk Melanoma: First Analysis of Intergroup Trial E1690/S9111/C9190 J Clin Oncol 18:2444 - 2458 (2000)]). 이들 환자는 이전의 암-지향 치료법에 의해 또는 활성 암에 의해 면역-약화되지 않으며, 이에 따라, 백신의 안전성 및 면역학적 영향을 평가하기 위한 뛰어난 환자 집단을 나타낸다. 마지막으로, 이들 환자에 대한 현재의 표준의 치유는 수술 후에 어떠한 치료도 지시하지 않아서, 백신 제제에 대한 8 내지 10주 창을 가능하게 한다.
표적 집단은 임상적으로 검출가능한, 조직학적으로 확인된 림프절(국소 또는 원위)이 있거나, 또는 완전히 절제되고 질병이 없는 전이 중인 피부 흑색종 환자일 것이다(병기 IIIB의 대부분(시퀀싱 및 세포주 발생에 적당한 종양 조직을 가져야 하기 때문에, 궤양형 원발성 종양과 미세전이 림프절(T1-4b, N1a 또는 N2a)이 있는 환자는 배제될 것임), 모든 병기 IIIC 및 병기 IVM1a, b). 이들은 처음의 진단시의 또는 보다 조기의 단계의 흑색종이 이전에 진단된 후의 질병 재발시의 환자일 수 있다.
종양 수집: 환자는 그들에 흑색종이 없게 하려는 의도로, 그들의 원발성 흑색종(이미 제거되지 않았다면) 및 모든 영역 전이 질병의 완전한 절제를 겪을 것이다. 병리학적 평가를 위해 적당한 종양을 수집한 후에, 잔류 종양 조직을 멸균 용기에서 멸균 매질에 두고, 분해를 위해 준비한다. 종양 조직의 부분을 전체-엑솜 및 전사체 시퀀싱 및 세포주 생성을 위해 사용할 것이며, 임의의 잔여 종양을 동결시킬 것이다.
정상 조직 수집: 정상 조직 시료(혈액 또는 객담 시료)를 전체 엑솜 시퀀싱을 위해 취할 것이다.
임상적으로 분명한 국소영역 전이 질병 또는 완전히 절제가능한 원위의 림프절, 피부 또는 폐 전이 질병이 있는 환자(절제가능하지 않은 원위 또는 내장 전이 질병의 부재)를 확인하고 연구에 참가시킬 것이다. 수술 전의 환자의 유입은 흑색종 세포주 개발을 위하여 신선한 종양 조직을 획득하는데 필요하다(면역 모니터링 계획의 부분으로서의 시험관내 세포독성 분석법을 위해 표적 세포를 생성하기 위함).
실시예 3: 용량 및 스케쥴
예비-치료 기준을 만족하는 환자에 있어서, 백신 투여를 가능한 연구 약물이 도착하고, 인커밍(incoming) 사양이 만족된 후에 가능한 빨리 시작할 것이다. 각 환자에 있어서, 4개의 개별 연구 약물이 존재할 것이며, 각각은 20개의 환자-특이적 펩티드 중 5개를 함유한다. 면역화는 일반적으로 도 5에 나타낸 스케쥴에 따라 처리될 수 있다.
환자는 외래 진료에서 처치될 것이다. 각 처치일의 면역화는 각각이 개별 사지로의 4회의 1 ㎖ 피하 주사로 이루어져, 상이한 영역의 림프계를 표적화하여, 항원 경쟁을 줄일 것이다. 환자가 완전한 액와 또는 서혜부 림프절 절제를 겪는다면, 백신은 대안으로서 우측 또는 좌측 횡격막으로 투여될 것이다. 각각의 주사는 그 환자에 대한 4개의 연구 약물 중 1개로 이루어질 것이며, 동일한 연구 약물이 각 사이클 동안 동일한 사지로 주사될 것이다. 각각 1 ㎖ 주사의 조성은
5개의 환자-특이적 펩티드 각각 300 ㎍를 함유하는 0.75 ㎖ 연구 약물
2 ㎎/㎖의 폴리-ICLC(힐토놀®) 0.25 ㎖(0.5 ㎎).
유도/프라이밍 단계 동안, 환자는 1, 4, 8, 15 및 22일에 면역화될 것이다. 유지 단계에서, 환자는 12 및 24주에 부스터 용량을 제공받을 것이다.
혈액 시료는 다수의 시점: 예비-(기준선; 상이한 날에 2개의 시료); 프라이밍 백신접종 동안 15일; 유도/프라이밍 백신접종 후 4주(8주); 예비-제1 부스트(12주) 및 제1 부스트 이후(16주); 예비-제2 부스트(24주) 및 제2 부스트 이후(28주)에 수득될 수 있으며, 50 내지 150 ㎖ 혈액을 각 시료에 대하여 수집할 것이다(16주 제외). 1차 면역학적 종점은 16주일 것이며, 이에 따라, 환자는 백혈구분리반출술을 겪을 것이다(다르게 나타내지 않는 한, 환자 및 의사 평가에 기초함).
실시예 4: 면역 모니터링
면역화 전략은 일련의 초기의 근접 배치된 면역화를 수반하여, 면역 반응을 유도하며, 휴지 기간으로 이어져, 기억 T-세포가 확립되게 하는 "프라임-부스트" 접근법이다. 이것은 부스터 면역화로 이어질 것이며, 이러한 부스트 4주 후의 T-세포 반응은 강력한 반응을 생성하는 것으로 예상되며, 1차 면역학적 종점일 것이다. 전반적 면역학적 반응을 먼저, 모든 면역화 에피토프를 포함하는 중첩 15mer 펩티드(11개 아미노산 중첩)의 풀로 자극하는 생체외 ELISPOT 분석법에서 18시간 내의 이러한 시점으로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 모니터링할 것이다. 예비-백신접종 시료를 평가하여, 이러한 펩티드 풀에 대한 기준선 반응을 확립할 것이다. 보장된 바와 같이, 추가의 PBMC 시료를 평가하여, 전체 펩티드 믹스에 대한 면역 반응의 동역학을 시험할 것이다. 기준선을 상당히 초과하는 반응을 나타내는 환자에 있어서, 모든 15mer의 풀을 디콘볼루션시켜 특정 면역화 펩티드(들)가 면역원성이었는지를 결정할 것이다. 또한, 다수의 추가의 분석법을 적절한 시료를 위해 개별적으로 행할 것이다:
● 전체 15mer 풀 또는 하위-풀을 세포내 사이토카인 염색 분석법을 위한 자극 펩티드로서 사용하여, 항원-특이적 CD4+, CD8+, 중심 기억 및 이펙터 기억 집단을 확인하고 정량화할 것이다.
● 유사하게, 이들 풀을 사용하여, 이들 세포에 의해 분비되는 사이토카인의 패턴을 평가하여, TH1 대 TH2 표현형을 결정할 것이다.
● 세포외 사이토카인 염색 및 비자극 세포의 유세포계수를 사용하여 Treg 및 골수-유래의 억제자 세포(MDSC)를 정량화시킬 것이다.
● 흑색종 세포주가 반응하는 환자로부터 성공적으로 확립되고, 활성화 에피토프가 확인될 수 있다면, 돌연변이 및 상응하는 야생형 펩티드를 사용하여 T-세포 독성 분석법을 행할 것이다.
● 1차 면역학적 종점으로부터의 PBMC를 도 6에 나타낸 바와 같이, 자극제로서 알려져 있는 흑색종 종양 관련 항원을 사용함으로써 그리고 면역원 중 하나인 것으로 선택되지 않았던 몇몇의 추가의 확인된 돌연변이 에피토프를 사용함으로써 "에피토프 스프레딩"에 대하여 평가할 것이다.
종양 시료의 면역-조직화학을 행하여, CD4+, CD8+, MDSC 및 Treg 침윤 집단을 정량화할 것이다.
실시예 5: 전이 질병이 있는 환자에서의 임상 효능
전이 질병이 있는 환자의 백신 처치는 활성 암에 효율적인 치료법에 대한 그들의 요구 및 이후의 백신 제제에 대한 처치외 시간창의 부재에 의해 복잡해진다. 추가로, 이들 암 처치는 환자의 면역계를 위태롭게 할 수 있으며, 아마도 면역 반응의 유도를 지연시킨다. 이들 고려사항을 명심하여, 백신 제제의 시기가 일시적으로 특정 환자 집단에 대한 다른 표준 치유 접근법과 일치하고/거나 그러한 표준 치유가 명백히 면역치료 접근법과 양립될 수 있는 환경이 선택될 수 있다. 추구될 수 있는 2가지 유형의 환경이 존재한다.
1. 체크포인트 차단과의 병용: 체크포인트 차단 항체는 전이 흑색종에 대한 효율적인 면역치료법으로 부상하였으며(문헌[Hodi et al, Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma NEJM 363:711 - 723 (2010)]), 비소세포 폐암(NSCLC) 및 신세포 암종을 포함하는 다른 질병 환경에서 활발히 추구되고 있다(문헌[Topalian et al, Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer NEJM 366:2443-2454 (2012)]; 문헌[Brahmer et al, Safety and Activity of Anti-PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer NEJM 366:2455-2465(2012)]). 작용 메카니즘이 입증되어 있지 않지만, 면역 반응의 증진 및 국소 면역억제로부터의 경감의 역전 둘 모두가 가능한 설명이다. 강력한 백신을 통합시켜, 체크포인트 차단 항체를 사용하여 면역 반응을 개시하는 것은 다수의 동물 연구에서 관찰되는 바와 같이 상승작용을 제공할 수 있다(문헌[van Elsas et al Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation J Exp Med 190:35-366 (1999)]; 문헌[Li et al, Anti-programmed death-1 synergizes with granulocyte macrophage colony-stimulating factor-secreting tumor cell immunotherapy providing therapeutic benefit to mice with established tumors Clin Cancer Res 15:1623 - 1634 (2009)]; 문헌[Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy Nature Reviews Cancer 12:252 - 264 (2012)]; 문헌[Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Mar 2;107(9):4275-80]; 문헌[Curran et al. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. Cancer Res. 2009 Oct 1;69(19):7747-55]). 환자는 도 7에 예시된 바와 같이, 체크포인트 차단 치료법에서 즉시 시작할 수 있는 한편, 백신을 제조하고, 일단 제조되면, 백신 투여를 항체 치료법과 통합할 수 있다; 그리고
2. 유리한 면역 특성을 나타내는 표준 치료 섭생과의 병용
a) 전이 질병이 존재하는 신세포 암종(RCC) 환자는 전형적으로 수술적 감축(de-bulking)에 이어서, 통상 승인된 티로신 키나제 억제제(TKI) 중 하나, 예를 들어, 수니티닙(sunitinib), 파조파닙(pazopanib) 및 소라페닙(sorafenib)을 사용한 전신 처치를 겪는다. 승인된 TKI 중에, 수니티닙은 TH1 반응성을 증가시키고, Treg 및 골수-유래 억제자 세포를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Finke et al, Sunitinib reverses Type-1 immune suppression and decreases T-regulatory cells in renal cell carcinoma patients Clin Can Res 14:6674 - 6682 (2008)]; 문헌[Terme et al, VEGFA-VEGFR pathway blockade inhibits tumor-induced regulatory T cell proliferation in colorectal cancer (Cancer Research Author Manuscript published Online (2102)]). 환자를 면역계를 약화시키지 않는 승인된 치료법으로 즉시 처치하는 능력은 백신을 제조하기 위한 필요한 창을 제공하며, 백신 치료법과 함께 상승작용을 제공할 수 있다. 또한, 사이클로포스파미드(CTX)는 다수의 동물 및 인간 연구에서, Treg 세포에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 암시되었며, 최근에, 백신 이전의 단일 용량의 CTX가 백신에 반응하는 RCC 환자에서 생존을 향상시키는 것으로 나타났다(문헌[Walter et al, Multipeptide immune response to a cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival Nature Medicine 18:1254-1260 (2012)]). 이들 면역-상승적 접근법 둘 모두는 RCC의 고유 펩티드 백신의 최근 완료된 단계 3 연구에서 사용된다(문헌[ClinicalTrials.gov, NCT01265901 IMA901 in Patients Receiving Sunitinib for Advanced/Metastatic Renal Cell Carcinoma]);
b) 대안적으로, 교모세포종(GBM)의 표준 처치는 수술, 회복 및 후속 방사선 및 저용량 테모졸로미드(TMZ) 이후에, 표준 용량 TMZ를 개시하기 전 4주의 휴지 기간으로 이어진다. 이러한 표준 처치는 백신 제조 이후에 표준 용량 TMZ를 시작하기 전 백신접종의 개시에 대한 창을 제공한다. 흥미롭게도, 전이 흑색종의 연구에서, 표준 용량 TMZ 처치 동안의 펩티드 백신접종은 단독의 백신접종에 비하여 측정된 면역 반응성을 증가시켰으며, 이는 추가의 상승적 이익을 시사한다(문헌[Kyte et al, Telomerase peptide vaccination combined with temozolomide: a clinical trial in stage IV melanoma patients Clin Cancer Res 17:4568 (2011)]).
실시예 6: 백신 제제
환자 종양 조직을 수술에 의해 절제할 것이며, 종양 조직을 분해할 것이며, 개별 부분을 DNA 및 RNA 추출을 위해, 그리고 환자-특이적 흑색종 세포주 발생을 위해 사용할 것이다. 종양 조직으로부터 추출된 DNA 및/또는 RNA를 전체-엑솜 시퀀싱(예를 들어, Illumina HiSeq 플랫폼의 사용에 의함)을 위해 그리고 HLA 타이핑 정보를 결정하기 위해 사용할 것이다. 미스센스 또는 neoORF 신생-항원 펩티드가 단백질-기반의 기술(예를 들어, 질량 분광법)에 의해 직접 확인될 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
생물정보학 분석을 다음과 같이 행할 것이다. 엑솜 및 RNA의 서열 분석 - SEQ 패스트(fast) Q 파일은 대규모 프로젝트, 예를 들어, 많은 환자 시료에 대한 TCGA에서 광범위하게 사용되고 입증된 기존의 생물정보학 파이프라인을 활용할 것이다(예를 들어, 문헌[Chapman et al, 2011, Stransky et al, 2011, Berger et al, 2012]). 2개의 순차적인 카테고리의 분석이 존재한다: 데이터 처리 및 암 게놈 분석.
데이터 처리 파이프라인: 피카드(Picard) 데이터 처리 파이프라인(picard.sourceforge.net/)을 시퀀싱 플랫폼에 의해 개발하였다. 각각의 종양 및 정상 시료에 대한 (예를 들어, 일루미나(Illumina)) 시퀀서(sequencer)로부터 추출된 미가공 데이터를 피카드 파이프라인에서 다양한 모듈을 사용하여 하기의 과정으로 처리한다:
(i) 품질 재보정: 일루미나 파이프라인에 의해 보고된 원래의 염기 품질 점수를 판독-사이클, 레인(lane), 유세포 타일(tile), 의문 염기 및 이전의 염기에 기초하여 재보정할 것이다.
(ii) 정렬: BWA(문헌[Li and Durbin, 2009])를 사용하여 판독물 쌍을 인간 게놈(hg19)에 대하여 정렬할 것이다.
(iii) 중복 표시: PCR 및 광학적 중복을 판독물 쌍 맵핑 위치에 기초하여 확인하고 최종 bam 파일에 표시할 것이다.
피카드의 출력물은 주어진 시료에 대한 염기 서열, 품질 점수 및 모든 판독물의 정렬 상세사항을 저장하는 bam 파일(문헌[(Li et al, 2009) (samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf)])이다.
암 돌연변이 검출 파이프라인: 피카드 파이프라인 유래의 종양 및 매치되는 정상 bam 파일을 하기에 기재된 바와 같이 분석할 것이다:
1. 품질 조절
(i) 수십 개의 부위에서 시료에 대해 행해진 초기 SNP 핑거프린팅을 그들 부위에서의 엑솜 시퀀싱 파일업(pileup)과 비교함으로써 시퀀싱 동안 시료 믹스-업(mix-up)을 행할 것이다.
(ii) 시료내 종양/정상 믹스업을 먼저, 둘 모두의 종양 및 정상 시료에 대한 동일한 라이브러리에 상응하는 레인의 삽입물 크기 분포를 비교하고, 상이한 분포를 갖는 레인을 폐기함으로써 점검할 것이다. 생물정보학 분석을 종양 및 일치되는 정상 엑솜 시료에 적용하여, DNA 카피수 프로파일을 얻을 것이다. 또한, 종양 시료는 상응하는 정상 카피수보다 더 큰 카피수 변이를 가져야 한다. 동일한 종양 시료로부터의 다른 레인과 일치하는 프로파일을 갖지 않는 종양 레인을 폐기할 것이기 때문에, 평평한 프로파일을 갖지 않는 정상 시료에 상응하는 레인을 폐기할 것이다.
(iii) 종양 순도 및 배수성을 생물정보학-생성 카피수 프로파일에 기초하여 추정할 것이다.
(iv) ContEst(문헌[Cibulskis et al, 2011])를 사용하여 시료 중 교차-시료 오염의 수준을 결정할 것이다.
2. 추정의 indel 주위의 국소 재정렬
참조 게놈에 비한 실제 체세포 및 생식계의 작은 indel은 종종 미스센스 돌연변이 및 indel의 오정렬 및 미스콜(miscall)을 야기한다. 이것은 GATK IndelRealigner 모듈(월드와이드 웹에서 (www)broadinstitute.org/gatk)(McKenna et al, 2010, Depristo et al, 2011)을 사용하여 추정의 indel의 부근에 맵핑되는 모든 판독물의 국소 재정렬을 행하고, 그들을 완전히 평가하여, indel 호출(call)의 일관성 및 정확성을 보장함으로써 교정될 것이다.
3. 체세포 단일 뉴클레오티드 변이(SSNV)의 확인
체세포 염기 쌍 치환은 뮤텍트(muTect)(문헌[Cibulskis et al, 2013])로 지칭되는 베이지안(Bayesian) 통계 프레임워크를 사용하여 환자로부터의 종양 및 일치되는 정상 시료를 분석함으로써 확인될 것이다. 예비처리 단계에서, 우세한 저 품질 염기 또는 게놈에 대한 미스매치가 있는 판독물을 필터링한다. 이어서, 뮤텍트는 2개의 로그-오즈(LOD) 점수를 산출하며, 이는 각각 종양 및 정상 시료에서의 변이체의 존재 및 부재하의 신뢰성을 표현한다. 처리후 단계에서, 후보 돌연변이를 포획 아티팩트(artifact), 시퀀싱 및 정렬을 고려하여 다양한 기준에 의해 실험적으로 필터링한다. 그러한 필터 중 하나는, 예를 들어, 돌연변이를 지니는 판독물의 배향의 분포와 유전자좌에 맵핑되는 판독물의 전체 배향 분포 간의 일관성에 대하여 시험하여, 가닥 편향이 존재하지 않음을 보장한다. 이어서, 최종 돌연변이 세트에 게놈 영역, 코돈, cDNA 및 단백질 변화를 포함하는 몇몇 필드에 의해 온코테이터(Oncotator) 툴을 사용하여 주석을 달 것이다.
4. 체세포 작은 삽입 및 결실의 확인
섹션 2.2로부터의 국소 재정렬 출력물을 사용하여, 종양에서 배타적으로 또는 각각 종양 및 정상 bam 둘 모두에서 변이체를 뒷받침하는 판독물의 평가에 기초하여 후보 체세포 및 생식계 indel을 예측할 것이다. 미스매치의 개수 및 분포, 및 염기 품질 점수에 기초한 추가의 필터링을 행할 것이다(문헌[McKenna et al, 2010], 문헌[DePristo et al, 2011]). 모든 indel을 인테그레이티드 게노믹스 뷰어(Integrated Genomics Viewer)(문헌[Robinson et al, 2011])(월드와이드 웹에서 (www)broadinstitute.org/igv)를 사용하여 수동으로 조사하여, 고충실도 호출을 보장할 것이다.
5. 유전자 융합 검출
유전자 융합 검출 파이프라인에서의 제1 단계는 종양 RNA-Seq 판독물을 유전자 서열이 알려져 있는 라이브러리에 대하여 정렬한 다음, 게놈 좌표에 대하여 이러한 정렬의 맵핑을 행하는 것이다. 게놈 맵핑은 공통의 게놈 위치에 엑손을 공유하는 상이한 전사물 변이체로 맵핑되는 다수의 판독물 쌍의 붕괴에 도움을 준다. DNA 정렬된 bam 파일을 2개의 짝이 상이한 염색체 상의 또는 동일한 염색체 상이라면 적어도 1 MB 떨어져 있는 2개의 상이한 코딩 영역에 대해 맵핑되는 판독물 쌍에 대하여 질의할 것이다. 또한, 그들 각각의 유전자에서 정렬된 쌍 말단이 (추정의) 융합 mRNA 전사물의 코딩-->코딩 5'-> 3' 방향과 일치하는 방향으로 존재하는 것이 필요할 것이다. 적어도 2개의 그러한 '키메라' 판독물 쌍이 존재하는 유전자 쌍의 목록은 추가의 정제로 처리되는 초기 추정 사건 목록으로 열거될 것이다. 다음으로, 모든 정렬되지 않은 판독물을 원래 bam 파일로부터 추출할 것인데, 그들의 짝이 원래 정렬되고, 상기 기재된 바와 같이 수득된 유전자 쌍 내의 유전자 중 하나로 맵핑되는 추가의 제한이 있다. 그 다음, 모든 그러한 원래 정렬되지 않은 판독물을 발견된 유전자 쌍 간의 모든 가능한 엑손-엑손 접합부(전장, 경계-대-경계, 코딩 5'-> 3' 방향)의 맞춤 "참조" 빌트에 정렬하기 위한 시도가 이루어질 것이다. 그러한 하나의 원래 정렬되지 않은 판독물이 유전자 X의 엑손 및 유전자 Y의 엑손 간의 접합부로 (독특하게) 맵핑되고, 그의 짝이 실제로 유전자 X 또는 Y 중 하나로 맵핑된다면, 그러한 판독물은 "융합" 판독물로 표시될 것이다. 유전자 융합 사건은 엑손:엑손 접합부 주위의 과도한 수의 미스매치 없이, 그리고 어느 하나의 유전자에서 적어도 10 bp의 커버리지(coverage)와 함께, 그의 짝에 대한 올바른 상대적 배향으로 적어도 하나의 융합 판독물이 존재하는 경우에, 호출될 것이다. 매우 상동성인 유전자(예를 들어, HLA 과) 간의 유전자 융합은 아마도 허위이며, 필터링될 것이다.
6. 클론성의 추정
생물정보 분석을 사용하여 돌연변이의 클론성을 추정할 수 있다. 예를 들어, ABSOLUTE 알고리즘(문헌[Carter et al, 2012], 문헌[Landau et al, 2013])을 사용하여 종양 순도, 배수성, 절대 카피수 및 돌연변이의 클론성을 추정할 수 있다. 각각의 돌연변이의 대립형질 분획의 밀도 분포 확률을 생성한 다음 돌연변이의 암 세포 분율(CCF)로의 전환이 행해질 것이다. 돌연변이는 그들의 CCF의 사후 확률이 각각 0.95 이상인지 0.5 미만인지에 기초하여, 클론 또는 서브클론으로 분류될 것이다.
7. 발현의 정량화
TopHat 모음(문헌[Langmead et al, 2009])을 사용하여 종양에 대한 RNA-Seq 판독물 및 일치되는 정상 bam을 hg19 게놈에 대해 정렬할 것이다. RNA-Seq 데이터의 품질을 RNA-SeQC(문헌[DeLuca et al, 2012]) 패키지에 의해 평가할 것이다. 그 다음, RSEM 툴(문헌[Li et al, 2011])을 사용하여 유전자 및 아이소폼 발현 수준을 추정할 것이다. 백만당 킬로베이스당 생성된 판독물 및 tau 추정을 사용하여 다른 곳에 기재된 바와 같이 각 환자에서 확인된 신생-항원을 개인맞춤화시킬 것이다.
8. RNA-Seq에서의 돌연변이의 확인
전체 엑솜 데이터(섹션 2.3)의 분석에 의해 확인될 돌연변이를 환자의 상응하는 RNA-Seq 종양 bam 파일에서의 존재에 대하여 평가할 것이다. 각 변이체 유전자좌에 있어서, 베타-이항 분포에 기초한 능력 계산을 수행하여, RNA-Seq 데이터에서 그것을 검출하기 위한 적어도 80% 능력이 존재하는 것을 보장할 것이다. 포획으로 확인된 돌연변이는, 적당한 능력의 부위에 대한 돌연변이를 지니는 적어도 2개의 판독물이 존재한다면 입증되는 것으로 여겨질 것이다.
종양-특이적 돌연변이-함유 에피토프의 선택: 모든 미스센스 돌연변이 및 neoORF를 네덜란드 소재의 덴마크 기술 대학, 생물 서열 분석 센터에 의해 제공되고 유지되는 신경망 기반의 알고리즘 netMHC를 사용하여 돌연변이-함유 에피토프의 존재에 대하여 분석할 것이다. 이러한 과의 알고리즘을 일련의 관련 접근법(ref) 중에 최근에 완료된 경쟁에 기초하여 상위 에피토프 예측 알고리즘의 순위를 정하였다. 알고리즘을 100,000개 초과의 측정된 결합 및 비-결합 상호작용을 사용하여 다수의 상이한 인간 HLA A 및 B 대립형질에서 인공의 신경망 기반의 접근법을 사용하여 트레이닝하였다.
HLA 알로타입이 알려져 있는 CLL 환자에서 관찰되는 돌연변이로부터 예측을 행함으로써 알고리즘의 정확성을 평가하였다. 포함된 알로타입은 A0101, A0201, A0310, A1101, A2402, A6801, B0702, B0801, B1501이었다. mid-2011에서 netMHCpan을 사용하여 각 돌연변이에 걸쳐 있는 모든 9mer 및 10 mer 펩티드에 대하여 예측이 이루어졌다. 이들 예측에 기초하여, 예측된 친화성의 대부분이 500 nM 미만인 칠십사(74)개의 9mer 펩티드 및 육십삼(63)개의 10mer 펩티드를 합성하고, 결합 친화성을 경쟁적 결합 분석법(Sette)을 사용하여 측정하였다.
이들 펩티드에 대한 예측을 가장 최신의 버전의 각각의 MHC 서버(netMHCpan, netMHC 및 netMHCcons)를 사용하여 2013년 3월에 반복하였다. 이들 3개의 알고리즘은 2012년(Zhang 등)에 경쟁에 사용되는 20개의 그룹 중 상위 평가된 알고리즘이었다. 그 다음, 신규한 예측의 각각에 대하여 관찰된 결합 친화성을 평가하였다. 예측된 및 관찰된 각 세트의 값에 대하여, 각 범위에 대한 올바른 예측의 % 및 시료의 개수가 제공되어 있다. 각 범위에 대한 정의는 하기와 같다:
0~150: 150 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 예측되고 150 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 측정.
0~150*: 150 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 예측되고 500 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 측정.
151~500 nM: 150 nM 초과이나 500 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 예측되고, 500 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 측정.
FN(>500 nM): 위음성 - 500 nM 초과의 친화성을 갖는 것으로 예측되나 500 nM 이하의 친화성을 갖는 것으로 측정.
9mer 펩티드(표 1)에 있어서, 알고리즘 간에 차이가 거의 없었으며, netMHC cons에 대한 151~500 nM 범위에 대한 약간 더 큰 값은 적은 개수의 시료로 인해 유의미한 것으로 판단되지 않는다.
[표 1]
Figure 112015108225424-pct00001
10mer 펩티드(표 2)에 대하여, 다시 netMHCpan 또는 netMMHCcons보다 상당히 더 위양성을 생성한 netMHC를 제외하고, 알고리즘 간에 차이가 거의 존재하지 않았다. 그러나, 10mer 예측의 정확성은 9mer에 비하여, 0~150 nM 및 0~150* nM 범위에서 약간 더 낮고, 151~500 nM 범위에서 상당히 더 낮다.
[표 2]
Figure 112015108225424-pct00002
10mer에 있어서, 151~500 nM 범위에서 결합제에 대한 50% 미만의 예측으로 인하여, 0~150 nM 범위에서의 예측만을 사용할 것이다.
임의의 개별 HLA 대립형질에 대한 시료의 개수는 상이한 대립형질에 대한 예측 알고리즘의 정확성에 관한 어떠한 결론을 도출하기에 너무 적었다. 가장 큰 이용가능한 서브셋(0~150* nM; 9mer) 유래의 데이터는 일 예로서 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure 112015108225424-pct00003
HLA C 대립형질에 대한 예측의 정확성을 판단하기 위하여 이용가능한 데이터가 거의 없기 때문에, HLA A 및 B 대립형질에 대한 예측만을 사용할 것이다(Zhang 등).
흑색종 서열 정보 및 펩티드 결합 예측의 평가를 TCGA 데이터베이스로부터의 정보를 사용하여 행하였다. 상이한 환자 유래의 220개 흑색종으로부터의 정보에 의해, 환자마다 평균하여 대략 450개의 미스센스 및 5개의 neoORF가 존재하였음이 드러났다. 20명의 환자를 무작위로 선택하고, netMHC를 사용하여 예측된 결합 친화성을 모든 미스센스 돌연변이에 대하여 계산하였다(문헌[Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)]). HLA 알로타입이 이들 환자에 대하여 알려져 있지 않지만, 알로타입마다 예측된 결합 펩티드의 개수를 알로타입의 빈도에 기초하여 조정하여(지리적 영역[흑색종에 대한 백인(Caucasian)]에서의 예측된 발병 우성 집단에 대한 골수 등록 데이터세트), 환자마다 예측된 개수의 실행가능한 돌연변이 에피토프를 생성하였다. 각각의 이들 돌연변이 에피토프(MUT)에 대하여, 또한 상응하는 고유(야생형) 에피토프 결합을 예측하였다. 각각의 neoORF의 전장에 걸쳐 있는 중첩 펩티드 및 500 nM 이하의 Kd 및 5배 초과의 야생형/돌연변이 Kd 비를 갖는 예측된 미스센스 결합제에 대한 단일 펩티드를 사용하여, 환자의 80%(20명 중 16명)가 백신접종에 적절한 적어도 20개의 펩티드를 갖는 것으로 예측되었다. 환자의 1/4에 있어서, neoORF 펩티드는 20개 펩티드 모두에 대해 거의 절반을 구성할 수 있었다. 따라서, 높은 비율의 환자가 적당한 개수의 면역원성 펩티드를 생성하는 것으로 예상하기에 적당한 돌연변이 로드가 흑색종에 존재한다.
실시예 7: 면역화 펩티드의 우선순위결정
면역화를 위한 펩티드는 다수의 기준에 기초하여 우선순위결정될 수 있다: neoORF 대 미스센스, 돌연변이된 펩티드에 대한 예측된 Kd, 돌연변이된 펩티드에 비한 고유 펩티드에 대한 예측된 친화성의 비교가능성, 돌연변이가 발암 드라이버 유전자 또는 관련 경로에 존재하는지 여부 및 RNA-Seq 판독물의 개수(예를 들어, 도 8 참조).
도 8에 나타낸 바와 같이, 결합하는 것으로 예측된(500 nM 미만의 Kd) neoORF 돌연변이의 세그먼트로부터 유래된 펩티드에는 이들 전체적으로 신규한 서열에 대한 관용의 부재 및 그들의 강력한 종양-특이성에 기초하여 가장 높은 우선순위가 제공될 수 있다.
고유 펩티드가 결합하는 것으로 예측되지 않고(1000 nM 초과의 Kd), 돌연변이된 펩티드가 강력한/중등의 친화성(150 nM 미만의 Kd)으로 결합하는 것으로 예측된 유사한 미스센스 돌연변이의 부류에는 다음으로 가장 높은 우선순위가 제공될 수 있다. 이러한 부류(상기 논의된 그룹 I)는 천연에서 관찰되는 T-세포 반응의 대략 20%를 나타낸다.
세 번째로 가장 높은 우선순위는 상기 논의된 그룹 II 부류의 더욱 단단히 결합하는(150 nM 미만) 서브셋에 제공될 수 있다. 이러한 부류는 천연에서 관찰되는 T-세포 반응의 대략 거의 2/3의 원인이 된다.
neoORF 돌연변이로부터 유래된 모든 잔여 펩티드에 네 번째 우선순위가 제공될 수 있다. 결합하는 것으로 예측되지 않음에도 불구하고, 이들은 알려져 있는 위 음성 비율, HLA-C로의 결합 가능성, 클래스 II 에피토프의 존재 가능성 및 가치가 높은 완전히 외래인 항원의 사용에 기초하여 포함된다.
다섯 번째 우선순위는 예측된 결합 친화성이 보다 낮은(150~500 nM) 그룹 II의 서브셋에 제공될 수 있다. 이러한 부류는 천연에서 관찰되는 T-세포 반응의 대략 10%의 원인이 된다.
예측된 친화성이 감소함에 따라, 보다 높은 엄격성이 발현 수준에 적용될 수 있다. 각각의 그루핑 내에서, 펩티드는 결합 친화성(예를 들어, 가장 낮은 Kd는 가장 높은 우선순위를 가질 수 있음)에 기초하여 순위가 정해질 수 있다. 주어진 미스센스 돌연변이 그루핑 내에서, 발암 드라이버 돌연변이에 보다 높은 우선순위가 제공될 수 있다. 모든 알려져 있는 인간 단백질 서열(HG19)로부터 조직되는(curated) 약 1260만 개의 독특한 9 및 10mer의 정상 인간 펩티돔 라이브러리를 생성하였다. 최종 선택 전에, 미스센스 돌연변이 및 모든 neoORF 영역으로부터 유래된 임의의 가능한 예측된 에피토프를 이러한 라이브러리에 대하여 스크리닝할 수 있으며, 완벽한 매치는 배제될 것이다. 하기 논의된 바와 같이, 유해한 생화학적 특성을 갖는 것으로 예측된 특정 펩티드를 제거하거나 변형시킬 수 있다.
본원의 기술에 따라, RNA 수준을 분석하여, 신생항원 발현을 평가할 수 있다. 예를 들어, RNA-Seq 판독물-계수는 신생항원 발현을 추정하기 위한 대용물로 사용될 수 있다. 그러나 세포용해를 개시하는데 필요한 종양 세포에 요구되는 최소 RNA 발현 수준을 평가하기 위하여 현재 이용가능한 정보가 없다. 심지어 넌센스 매개의 파괴가 될 메시지의 "파이오니어(pioneer)" 번역으로부터의 발현의 수준도 표적 생성에 충분할 수 있다. 따라서, 본원의 기술은 먼저 우선순위 군에 의해 역으로 달라질 수 있는 RNA 수준에 대한 광범위한 허용 한계를 설정한다. 예측된 친화성이 감소함에 따라, 보다 높은 엄격성이 발현 수준에 적용될 수 있다. 당업자는 추가의 정보가 이용가능하게 됨에 따라, 그러한 제한이 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
그들의 신규성 및 강력한 종양 특이성으로 인하여, 표적으로서 가치가 높은 neoORF 때문에, RNA-Seq에 의해 검출가능한 mRNA 분자가 존재하지 않음에도 불구하고, 예측된 결합 에피토프(500 nM 이하의 Kd)를 갖는 neoORF를 사용할 수 있다(순위 1). 몇몇 수준의 RNA 발현이 검출되는 경우에만, 예측된 결합 에피토프가 없는(500 nM 초과) neoORF의 영역이 일반적으로 사용될 수 있다(순위 4). RNA-Seq 판독물이 존재하지 않는 경우를 제외하고, 강력한 내지 중간의 예측된 MHC 결합 친화성(150 nM 이하)이 있는 모든 미스센스 돌연변이가 일반적으로 사용될 수 있다(순위 2 및 3). 보다 낮은 예측된 결합 친화성(150 내지 500 nM 이하)이 있는 미스센스 돌연변이에 대하여, 이들은 아마도 약간 더 높은 수준의 RNA 발현이 검출되는 경우에만 사용될 것이다(순위 5).
발암 드라이버는 높은 우선순위 그룹을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 주어진 미스센스 돌연변이의 그루핑에서, 발암 드라이버 돌연변이는 우선순위가 보다 높은 것일 수 있다. 이러한 접근법은 면역 압력(예를 들어, 면역교정)에 의해 표적화되는 유전자의 관찰된 하향-조절에 기초한다. 하향-조절이 암 세포 성장에 유해한 효과를 갖지 않을 수 있는 다른 면역 표적과 대조적으로, 발암 드라이버 유전자의 계속된 발현은 면역 회피의 경로를 차단하여 암 세포 생존에 결정적일 수 있다. 예시적인 발암 드라이버는 표 3-1에 열거되어 있다(예를 들어, 월드와이드 웹 (www)geneontology.org에서의 Vogelstein et al; GOTERM_BP Assignment of genes to Gene Ontology Term - Biological Function; 월드와이드 웹 (www)biocarta.com에서의 BIOCARTA Assignment of genes to signaling pathways; 월드와이드 웹 (www)genome.jp/krgg/pathway.html에서의 KEGG Assignment of genes to pathways according to KEGG pathway database; 월드와이드 웹 (www)reactome.org에서의 REACTOME Assignment of genes to pathways according to REACTOME pathways and gene interactions 참조).
[표 3-1]
Figure 112015108225424-pct00004
Figure 112015108225424-pct00005
Figure 112015108225424-pct00006
Figure 112015108225424-pct00007
실시예 8: 펩티드 생성 및 제형
면역화를 위한 GMP 신생-항원 펩티드를 FDA 규정에 따라 화학적 합성(문헌[Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963])에 의해 제조할 것이다. 각각 20개의 약 20 내지 30mer 펩티드로 3회의 개발 시행을 행하였다. 각 시행을 동일한 시설에서 행하고, 드래프트(draft) GMP 뱃치 기록을 사용하여 GMP 시행에 사용될 것과 동일한 장비를 사용하였다. 각 시행에 의해, 각각 50 ㎎ 초과의 펩티드가 성공적으로 생성되었으며, 이는 모든 현재 계획된 방출 시험(예를 들어, 외양, MS에 의한 아이덴티, RP-HPLC의한 순도, 질소 원소에 의한 함량 및 RP-HPLC에 의한 TFA 함량)에 의해 시험되고, 적절한 경우 표적화된 사양을 충족시킨다. 또한, 산물을 이러한 과정의 부분에 대하여 예상되는 기간(대략 4주) 내에 생성하였다. 동결건조된 벌크 펩티드를 장기간 안정성 연구에 두고, 최대 12개월의 다양한 시점에 평가할 것이다.
이들 시행으로부터의 물질을 사용하여 계획된 용해 및 혼합 접근법을 시험하였다. 약술하면, 각 펩티드를 100% DMSO 중에 고농도(50 ㎎/㎖)로 용해시키고, 수성 용매 중에 2 ㎎/㎖로 희석할 것이다. 먼저, PBS가 희석제로 사용될 것이지만, 소수의 펩티드의 염석이 가시적인 혼탁을 야기하는 것으로 예상되었다. D5W(수 중 5% 덱스트로스)가 훨씬 더 효율적인 것으로 나타났으며; 40개의 펩티드 중 37개를 투명한 용액으로 성공적으로 희석하였다. 문제가 있는 펩티드만이 매우 소수성인 펩티드이다. 계획된 면역화 펩티드의 예측된 생화학적 특성을 평가할 것이며, 이에 따라 합성 계획을 변경시킬 수 있다(보다 짧은 펩티드 사용, 예측된 에피토프 주위의 N- 또는 C-말단 방향의 합성될 영역의 이동 또는 잠재적으로 대안적 펩티드의 사용). DMSO/D5W 중 10개의 개별 펩티드를 2회의 동결/해동 사이클을 겪게 하였으며, 완전한 복구를 보였다. 2개의 개별 펩티드를 DMSO/D5W 중에 용해시키고, 2가지 온도(-20℃ 및 -80℃)에 안정하게 두었다. 이들 펩티드를 최대 6개월 동안 평가할 것이다(RP-HPLC, MS 및 pH). 현재까지, 둘 모두의 펩티드가 12주 시점에 안정하며, 24주의 추가의 시점을 평가할 것이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 투여형 과정의 설계는 각각 5개의 펩티드로 이루어진 환자-특이적 펩티드의 4개의 풀을 제조하는 것이다. RP-HPLC 분석법을 준비하고, 정량화하여, 이들 펩티드 믹스를 평가하였다. 이러한 분석법으로 단일의 믹스 내의 다수의 펩티드의 우수한 용해가 달성되며, 이를 사용하여 개별 펩티드를 정량화할 수 있다.
막 여과(0.2 ㎛ 포어 크기)를 사용하여 바이오버든(bioburden)을 감소시키고, 최종 여과 멸균을 행할 것이다. 4가지의 상이한 적절하게 사이징된(sized) 필터 유형을 먼저 평가하고, 폴(Pall), PES 필터(# 4612)를 선택하였다. 현재까지, 각각 5개의 상이한 펩티드로 된 4개의 상이한 혼합물을 제조하고, 개별적으로 2개의 PES 필터를 통해 순차적으로 여과하였다. RP-HPLC 분석법을 사용하여 각 개별 펩티드의 회수를 평가하였다. 20개의 펩티드 중 18개에 있어서, 2회의 여과 후의 회수는 90% 초과였다. 2개의 고도의 소수성 펩티드에 대하여, 회수는 소규모로 평가되는 경우 60% 미만이었으나, 소정의 규모에서 거의 완전히 회수되었다(87 및 97%). 상기 언급된 바와 같이, 선택된 서열의 소수성 성질을 제한하기 위한 접근법을 착수할 것이다.
면역화를 위한 GMP 신생-항원 펩티드를 FDA 규정에 따라 화학적 합성(문헌[Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963])에 의해 제조할 것이다.
실시예 9: 종점 평가
이러한 연구의 1차 면역학적 종점은 생체외 IFN-γ ELISPOT에 의해 측정되는 T 세포 반응의 평가일 것이다. IFN-γ 분비는 동족 펩티드의 인식 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포에 의한 미토겐 자극의 결과로서 발생한다. 백신접종에 사용되는 20 내지 30mer 펩티드가 항원 제시 세포에 의한 보다 작은 펩티드로의 처리를 겪어야 하기 때문에, 다수의 상이한 CD4+ 및 CD8+ 결정기는 아마도 생체내에서 T 세포에 제시될 것이다. 이론에 결부되지 않고, 면역계에 신규하며, 이에 따라 자기-관용의 면역-약화 효과를 겪지 않는 개인맞춤화 신생-항원 및 강력한 면역 애쥬번트 폴리-ICLC의 병용이 강력한 CD4+ 및/또는 CD8+ 반응을 유도할 것으로 여겨진다. 따라서, T 세포 반응이 생체외에서, 즉, 단기간 배양을 통한 에피토프 특이적 T 세포의 시험관내 증량의 필요 없이 검출가능한 것으로 예상된다. 환자를 먼저 ELISPOT 분석법에서 자극제로서 펩티드 면역원의 전체 풀을 사용하여 평가할 것이다. 강력한 양성 반응을 나타내는 환자에 있어서, 정밀한 면역원성 펩티드(들)가 후속 분석에서 결정될 것이다. IFN-γ ELISPOT는 일반적으로 생체외 T 세포 활성을 검출하고 특이성을 결정하기 위한 강력하고 재현가능한 분석법으로 받아들여진다. 말초 혈액 단핵구에서의 T 세포 반응의 세기 및 결정기 맵핑의 분석에 더하여, 백신에 의해 유도되는 면역 반응의 다른 양태가 결정적이며, 이것이 평가될 것이다. 이들 평가는 스크리닝 분석법에서 생체외 IFN-γ ELISPOT 반응을 나타내는 환자에서 수행될 것이다. 그들은 T 세포 서브셋(Th1 대 Th2, T 이펙터 대 기억 세포)의 평가, 조절 세포, 예를 들어, T 조절 세포 또는 골수 유래 억제 세포의 존재 및 존재비의 분석, 및 환자-특이적 흑색종 세포주가 성공적으로 확립된다면, 세포독성 분석법을 포함한다.
실시예 10: 펩티드 합성
GMP 펩티드를 표준 고체상 합성 펩티드 화학에 의해 합성하고, RP-HPLC에 의해 정제할 것이다. 각 개별 펩티드를 다양한 정량화된 분석법에 의해 분석하여 외양(시각적), 순도(RP-HPLC), 아이덴티티(질량 분광법에 의함), 양(질소 원소) 및 트리플루오로아세테이트 반대이온(RP-HPLC)을 평가하고, 방출시킬 것이다.
개인맞춤화 신생항원 펩티드는 각 환자에 특유한 최대 20개의 별개의 펩티드로 이루어질 수 있다. 각 펩티드는 표준 펩티드 결합에 의해 연결된 약 20 내지 약 30개의 L-아미노산의 선형 폴리머일 수 있다. 아미노 말단은 일차 아민(NH2-)일 수 있으며, 카복시 말단은 카보닐기(-COOH)이다. 포유류 세포에서 통상 관찰되는 표준 20개 아미노산이 사용된다(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린). 각 펩티드의 분자량은 그의 길이 및 서열에 기초하여 달라지며, 각 펩티드에 대하여 계산한다.
개인맞춤화 신생항원 펩티드는 색상-코딩 캡이 있는 2 ㎖ 넌크(Nunc) 크라이오(Cryo) 바이얼을 함유하는 박스로 공급될 수 있으며, 각 바이얼은 400 ㎍/㎖의 농도로 최대 5개의 펩티드를 함유하는 대략 1.5 ㎖의 동결된 DMSO/D5W 용액을 함유한다. 4개 그룹의 펩티드 각각에 대하여 10 내지 15개 바이얼이 존재할 수 있다. 바이얼은 사용 전에 -80℃에 보관해야 한다. 진행 중인 안정성 연구는 보관 온도 및 시간을 뒷받침한다.
저장 및 안정성: 개인맞춤화 신생항원 펩티드는 -80℃에서 동결 보관한다. 해동된, 멸균 여과된, 개인맞춤화 신생항원 펩티드 및 폴리-ICLC의 과정 중 중간체 및 최종 혼합물은 실온에서 유지하나 4시간 내에 사용해야 한다.
상용성: 개인맞춤화 신생항원 펩티드는 사용 직전에 1/3부피의 폴리-ICLC와 혼합할 것이다.
실시예 11: 투여
개인맞춤화 신생-항원 펩티드/폴리펩티드와의 혼합 후에, 백신(예를 들어, 펩티드 + 폴리-ICLC)은 피하 투여되어야 한다.
개인맞춤화 신생-항원 펩티드/폴리펩티드 풀의 제조: 펩티드를 각각 최대 5개의 펩티드로 된 4개의 풀에서 함께 혼합할 것이다. 각 풀에 대한 선택 기준은 펩티드가 결합하는 것으로 예측되는 특정 MHC 대립형질에 기초할 것이다.
풀 조성: 풀의 조성은 각 펩티드가 결합하는 것으로 예측되는 특정 HLA 대립형질에 기초하여 선택될 것이다. 4가지 풀을 개별 림프절 베이신(lymph node basin)으로 배액되는 해부학적 부위에 주사할 것이다. 이러한 접근법을 동일한 HLA 대립형질로의 펩티드 결합 간의 항원 경쟁을 가능한 많이 잠재적으로 감소시키고, 면역 반응의 발생에서 환자의 면역계의 넓은 서브셋을 관련시키기 위해 선택하였다. 각 환자에 있어서, 최대 4개의 상이한 HLA A 및 B 대립형질에 결합하는 것으로 예측되는 펩티드가 확인될 것이다. 일부 neoORF 유래의 펩티드는 임의의 특정 HLA 대립형질과 회합되지 않을 것이다. 펩티드를 상이한 풀에 분배하는 접근법은 특정 HLA 대립형질과 회합되는 각 세트의 펩티드를 가능한 4개의 풀만큼 많은 풀에 분산시키는 것일 것이다. 주어진 대립형질에 대하여 4개 초과의 예측된 펩티드가 존재할 상황이 존재할 가능성이 높으며, 이들 경우에, 특정 대립형질과 회합되는 1가지 초과의 펩티드를 동일한 풀에 할당하는 것이 필요할 것이다. 임의의 특정 대립형질과 회합되지 않는 그들 neoORF 펩티드를 잔여 슬롯(slot)에 무작위로 할당할 것이다. 예는 하기에 나타나 있다:
Figure 112015108225424-pct00008
동일한 MHC 대립형질에 결합하는 것으로 예측된 펩티드는 가능한 때마다 개별 풀로 배치될 것이다. neoORF 펩티드의 일부는 환자의 임의의 MHC 대립형질에 결합하는 것으로 예측되지 않을 수 있다. 그러나 이들 펩티드는 주로 그들이 완전히 신규하고 이에 따라 중심 관용의 면역-약화 효과를 겪지 않고, 이에 따라, 높은 확률의 면역원성을 갖기 때문에 여전히 사용될 것이다. 또한, NeoORF 펩티드는 임의의 정상 세포에서 등가의 분자가 존재하지 않기 때문에, 현저하게 감소된 자가면역 가능성을 지닌다. 또한, 예측 알고리즘으로부터 야기되는 위 음성이 존재할 수 있으며, 펩티드가 HLA 클래스 II 에피토프를 함유할 가능성이 있다(HLA 클래스 II 에피토프는 현재의 알고리즘에 기초하여 신뢰성있게 예측되지 않음). 특정 HLA 대립형질로 확인되지 않은 모든 펩티드는 개별 풀로 무작위로 할당될 것이다. 주사마다 300 ㎍의 각 펩티드의 최종 용량으로 각 펩티드의 양이 예측된다.
각 환자에 있어서, 각각 5개의 합성 펩티드로 된 4개의 별개의 풀("A", "B", "C" 및 "D"로 표지)은 제조처에 의해 제조되고 -80℃에 보관될 것이다. 면역화 날에, 펩티드 성분(들) 및 폴리-ICLC로 이루어진 완전한 백신을 연구 약국의 층류 생물안전 캐비넷에서 제조할 것이다. 각 하나의 바이얼(A, B, C 및 D)을 실온에서 해동시키고, 나머지 단계를 위해 생물안전 캐비넷으로 이동시킬 것이다. 0.75 ㎖의 각 펩티드 풀을 바이얼로부터 개별 주사기로 빼낼 것이다. 개별적으로, 4개의 0.25 ㎖(0.5 ㎎)의 폴리-ICLC의 분취물을 개별 주사기로 빼낼 것이다. 그 다음, 각 펩티드-풀 함유 주사기의 내용물을 주사기-대-주사기 전달에 의해 온건하게 0.25 ㎖의 폴리-ICLC의 분취물와 혼합할 것이다. 전체 1 ㎖의 혼합물을 주사를 위해 사용할 것이다. 이들 4개의 제제를 "연구 약물 A", "연구 약물 B", "연구 약물 C" 및 "연구 약물 D"로 표지할 것이다.
주사: 각 면역화 시에, 4가지 연구 약물의 각각을 하나의 사지로 피하 주사할 것이다. 전체 치료 기간(즉, 연구 약물 A를 1, 4, 8일 등에 좌측 팔에 주사하고, 연구 약물 B를 1, 4, 8일 등에 우측 팔에 주사할 것임) 동안 각 면역화 시에 각 개별 연구 약물을 동일한 사지에 투여할 것이다. 완전한 액와 또는 서혜부 림프절 절제 후의 상태인 환자에 대한 대안적인 해부학적 위치는 각각 좌측 및 우측 횡격막이다.
백신은 프라임/부스트 스케쥴에 따라 투여될 것이다. 백신의 프라이밍 용량은 상기 나타낸 바와 같이 1, 4, 8, 15 및 22일에 투여될 것이다. 부스트 단계에서, 백신은 85일(13주) 및 169일(25주)에 투여될 것이다.
적어도 하나의 용량의 백신을 제공받은 모든 환자를 독성에 대하여 평가할 수 있을 것이다. 환자는 그들이 유도 단계 동안 모든 백신접종 및 유지 단계 동안 제1 백신접종(부스트)을 제공받는다면, 면역학적 활성에 대하여 평가할 수 있을 것이다.
실시예 12: 약역학적 연구
면역화 전략은 면역 반응을 유도하기 위한 일련의 초기의 밀접 배치된 면역화에 이어서 기억 T-세포가 확립되게 하는 휴지 기간을 수반하는 "프라임-부스트" 접근법이다. 이는 부스터 면역화로 이어질 것이며, 이러한 부스트 4주 후(처음의 백신접종 16주 후)의 T-세포 반응은 가장 강력한 반응을 생성하는 것으로 예상되며, 1차 면역학적 종점일 것이다. 면역 모니터링을 하기 약술된 바와 같이 단계식 방식으로 수행하여, 유도된 면역 반응의 세기 및 질을 특성화할 것이다. 말초 혈액을 수집할 것이며, PBMC를 처음의 백신접종 전의 2개의 개별 시점(기준선) 및 반응식 B에 예시되고, 연구 달력에 특정된 바와 같이 이후 상이한 시점에 동결시킬 것이다. 각각 유도 단계 및 유지 단계로부터 전체 세트의 시료를 수집한 후에, 주어진 환자에서 면역 모니터링을 수행할 것이다. 충분한 종양 조직이 이용가능하다면, 종양의 일부를 사용하여 세포독성 T-세포 분석법에 사용하기 위한 자가 흑색종 세포주를 발생시킬 것이다.
실시예 13: 생체외 IFN -γ ELISPOT 스크리닝
각 환자에 있어서, 한 세트의 스크리닝 펩티드를 합성할 것이다. 스크리닝 펩티드는 11개 아미노산이 중첩되고, 각 펩티드의 전체 길이 또는 neoORF-유래 펩티드에 대하여 neoORF의 전체 길이를 커버하는 15개 아미노산 길이일 것이다(가끔 16mer 또는 17mer가 사용될 것임). 전체 세트의 환자-특이적 스크리닝 펩티드를 대략적으로 동일한 농도로 함께 풀링할 것이며, 또한, 각 펩티드의 부분을 개별적으로 보관할 것이다. 생체외 IFN-γ ELISPOT에서 저 백그라운드가 확립된 5명의 건강한 공여자로부터 PBMC를 시험함으로써 펩티드 풀의 순도를 확인할 것이다. 먼저, 기준선 및 16주(1차 면역학적 종점)에 수득된 PBMC를 중첩 15-mer 펩티드(11개 아미노산 중첩)의 완전한 풀을 사용하여 18시간 동안 자극하여, 펩티드 백신에 대한 전반적 반응을 시험할 것이다. 이후의 분석법은 표기된 바와 다른 시점에 수집된 PBMC를 사용할 수 있다. 생체외 IFN-γ ELISPOT 분석법을 사용하여 반응이 1차 면역학적 종점에서 확인되지 않는다면, PBMC를 보다 긴 기간(최대 10일) 동안 펩티드 풀로 자극하고 재분석할 것이다.
실시예 14: 후속 생체외 IFN -γ ELISPOT 분석법에서의 에피토프의 디콘볼루션
일단, 중첩 펩티드 풀에 의해 유도되는 생체외 IFN-γ ELISPOT 반응이 관찰되면(적어도 55개의 스폿 형성 단위/106개 PBMC로 정의되거나 기준선에 비하여 적어도 3배 증가), 이러한 반응을 유도하는 특정 면역원성 펩티드가 면역화 펩티드에 기초한 펩티드 풀의 하위-풀로의 디콘볼루션 및 생체외 IFN-γ ELISPOT 분석법의 반복에 의해 확인될 것이다. 일부 반응에 있어서, IFN-γ ELISPOT 분석법에서 확인된 자극 펩티드로부터 유래된 중첩 8 내지 10mer 펩티드를 사용함으로써 자극 에피토프를 정밀하게 특성화하기 위한 시도가 이루어질 것이다. 추가의 분석법은 적절한 시료에 대하여 개별적으로 행해질 수 있다. 예를 들어,
● 전체 15mer 풀 또는 하위-풀을 세포내 사이토카인 염색 분석법을 위한 자극 펩티드로서 사용하여, 항원-특이적 CD4+, CD8+, 중심 기억 및 이펙터 기억 집단을 확인하고 정량화할 것이다.
● 유사하게, 이들 풀을 사용하여 이들 세포에 의해 분비되는 사이토카인의 패턴을 평가하여 TH1 대 TH2 표현형을 결정할 것이다.
● 자극되지 않은 세포의 세포외 사이토카인 염색 및 유세포계수를 사용하여 Treg 및 골수-유래 억제 세포(MDSC)를 정량화할 것이다.
● 흑색종 세포주가 반응하는 환자로부터 성공적으로 확립되고, 활성화 에피토프가 확인될 수 있으면, T-세포 독성 분석법을 돌연변이 및 상응하는 야생형 펩티드를 사용하여 행할 것이다.
● 1차 면역학적 종점으로부터의 PBMC를 자극제로서 알려져 있는 흑색종 종양 관련 항원을 사용하고, 면역원 중 하나이도록 선택되지 않은 몇몇의 추가의 확인된 돌연변이 에피토프를 사용함으로써 "에피토프 스프레딩"에 대하여 평가할 것이다.
종양 시료의 면역조직화학을 행하여, CD4+, CD8+, MDSC 및 Treg 침윤 집단을 정량화할 것이다.
실시예 15: 종양 신생항원의 체계적 확인을 위한 파이프라인
시퀀싱 기술 및 펩티드 에피토프 예측에서의 최근의 진전을 활용하여, 2-단계 파이프라인을 생성하여, 후보 종양-특이적 HLA-결합 신생항원을 체계적으로 발견하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 이러한 접근법은 일치되는 정상 DNA와 병행하여 종양의 DNA 시퀀싱(예를 들어, 전체-엑솜(WES) 또는 전체-게놈 시퀀싱(WGS)에 의함)으로 시작하여, 비-동의 체세포 돌연변이를 완전히 확인한다(예를 들어, 문헌[Lawrence et al. 2013]; 문헌[Cibulski et al. 2012] 참조). 다음으로, 개인 클래스 I HLA 단백질에 결합하는 가능성을 갖는 종양 돌연변이에 의해 생성되고, 이에 따라 CD8+ T 세포에 제시되는 후보 종양 특이적 돌연변이 펩티드는 예측 알고리즘, 예를 들어, NetMHCpan을 사용하여 예측될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lin 2008]; 문헌[Zhang 2011] 참조). 후보 펩티드 항원을 자가 백혈병 세포에서 발현 동족 mRNA 및 HLA로의 그들의 결합의 실험적 입증에 기초하여 추가로 평가하였다.
이러한 파이프라인을 시퀀싱된 CLL 시료의 큰 데이터세트에 적용하였다(예를 들어, 문헌[Wang et al. 2011] 참조). WES 또는 WGS 중 어느 하나에 의해 시퀀싱된 91건의 사례로부터, 총 1838개의 비-동의 돌연변이를 단백질-코딩 영역에서 발견하였으며, 이는 메가염기마다 0.72(±0.36 s.d.)의 평균 체세포 돌연변이율(범위, 0.08 내지 2.70) 및 환자마다 평균 20개의 비-동의 돌연변이(범위, 2 내지 76)에 상응한다(예를 들어, 문헌[Wang et al. 2011] 참조). 아미노산 변경 영역을 생성하는 것으로 예상되고, 이에 따라 잠재적으로 면역학적으로 인식될 3가지 일반적 부류의 돌연변이를 확인하였다. 가장 풍부한 부류는 CLL마다 90%의 체세포 돌연변이를 나타내는 단일의 아미노산(aa) 변경을 야기하는 미스센스 돌연변이를 포함하였다. 91개의 시료 중에, 99%는 미스센스 돌연변이를 지녔으며, 69%는 10 내지 25개 미스센스 돌연변이를 가졌다(예를 들어, 도 2a 참조). 다른 2가지 부류의 돌연변이, 프레임쉬프트 및 스플라이스 부위 돌연변이(엑손-인트론 접합부에서의 돌연변이)는 (미스센스 돌연변이에 비하여) 주어진 변경마다 더 많은 개수의 신생항원 펩티드를 갖는, 종양에 완전히 특이적인 보다 긴 스트레치의 신규한 아미노산 서열(신생-오픈 리딩 프레임 또는 neoORF)의 생성 가능성을 갖는다. 그러나, 다른 암 유형으로부터의 데이터와 일치하게, neoORF-생성 돌연변이는 CLL에서 미스센스 돌연변이보다 대략 10배 덜 풍부하였다(예를 들어, 도 2b 및 도 2c 참조). 미스센스 돌연변이의 출현율을 고려해볼 때, 이후의 실험 연구는 미스센스 돌연변이에 의해 생성된 신생에피토프의 분석에 집중되었다.
실시예 16: 체세포 미스센스 돌연변이는 개인 HLA 클래스 I 대립형질에 결합하는 것으로 예측되는 신생펩티드를 생성한다
T 세포 수용체(TCR)에 의한 펩티드 에피토프의 T 세포 인식은 항원-제시 세포의 표면상의 HLA 분자의 결합 홈(groove) 내에 결합된 펩티드의 디스플레이를 필요로 한다. 30개 초과의 이용가능한 클래스 I 예측 알고리즘에 걸친 최근의 비교 연구는 NetMHCpan이 HLA 대립형질에 대하여 높은 민감성 및 친화성으로 일관되게 수행되는 것을 보여준다(예를 들어, 문헌[Zhang et al. 2011] 참조).
NetMHCpan 알고리즘을 그들의 기능적 활성(즉, 항종양 세포용해 T 세포 반응을 자극하는 능력)에 기초하여 문헌에서 최초 확인되거나, 알고리즘이 33개의 알려져 있는 돌연변이된 에피토프에 대한 결합을 올바르게 예측하는지 여부를 결정하기 위한 면역원성 부 조직적합성 항원으로 특성화된 33개의 알려져 있는 돌연변이된 에피토프의 세트에 대하여 시험하였다(예를 들어, 표 4 및 표 5 참조). 표 4 및 표 5는 NetMHCpan을 사용하여 인간 암에 대한 알려져 있는 기능적으로 유래된 면역원성 돌연변이 에피토프의 HLA-펩티드 결합 친화성을 보여준다. 표 4는 미스센스 돌연변이로부터의 에피토프를 보여준다(NSCLC: 비-소세포 폐암; MEL: 흑색종; CLL: 만성 림프구성 백혈병; RCC: 투명 세포 신장 암종; BLD: 방광암; NR: 기록되지 않음;). 황색: IC50 < 150 nM, 녹색: IC50, 150 내지 500 nM 및 회색: IC50 > 500 nM.
[표 4]
Figure 112015108225424-pct00009
Figure 112015108225424-pct00010
표 5는 부 조직적합성 항원으로부터의 에피토프를 보여준다(MM: 다발성 골수종; HM: 혈액학적 악성종양; B-ALL: B 세포 급성 림프구성 백혈병).
[표 5]
Figure 112015108225424-pct00011
모든 가능한 타일링된 9-mer 및 10-mer 중에, NetMHCpan에 의해, 주어진 돌연변이에 대한 가능한 선택 중의 최적의 결합 펩티드로서 모두 33개의 기능적으로 입증된 돌연변이 에피토프를 확인하였다. 33개의 돌연변이 에피토프의 각각의 알려져 있는 보고된 HLA 제한 요소에 대한 예측된 결합 친화성 중간값(IC50)은 32 nM(범위, 3 내지 11, 192 nM)이었다. 예측된 IC50 컷-오프를 150 및 500 nM로 설정함으로써, 각각 기능적으로 입증된 펩티드의 82 및 91%를 포획하였다(예를 들어, 표 4 및 표 5, 및 도 12a 참조).
그 다음, NetMHCpan을 그의 고도의 민감성 및 특이성에 기초하여, HLA 타이핑 정보가 이용가능한 91건의 CLL 사례 중 31건에 적용하였다. 관례적으로, 각각 150 nM 미만의 IC50을 갖는 펩티드는 강력한 내지 중간의 결합제로 간주되며, 150 내지 500 nM의 IC50은 약한 결합제로, 500 nM 초과의 IC50은 비-결합제로 간주된다(예를 들어, 문헌[Cai et al. 2012] 참조). 모든 91건의 CLL 사례에서, 강력하게 결합하는 펩티드의 중간값 10개(범위, 2 내지 40) 및 중간 내지 약하게 결합하는 펩티드의 중간값 12개(범위, 2 내지 41)가 관찰되었다. 종합하여, 사례마다 500 nM 미만의 IC50을 갖는 펩티드의 중간값 22개(범위, 6 내지 81)가 예측되었다(예를 들어, 도 12b 및 표 6 참조). 특히, 표 6은 이용가능한 HLA 타이핑을 사용하여 31건의 CLL 사례로부터 예측된 펩티드의 수 및 친화성 분포를 보여준다. 백인 집단에서 8개의 가장 흔한 HLA-A, -B 대립형질을 발현하는 환자는 회색으로 표시되어 있다.
[표 6]
Figure 112015108225424-pct00012
실시예 17: 절반이 넘는 예측된 HLA -결합 신생펩티드는 시험관내에서 HLA 단백질로의 직접적인 결합을 보였다
표 7에 나타낸 바와 같이, HLA-펩티드 결합 예측에 의해 생성된 IC50 nM 점수를 경쟁적 MHC I 대립형질 결합 분석법을 사용하여 입증하고, 클래스 I-A 및 -B 대립형질에 집중하였다. 이를 위하여, 4건의 CLL 사례(환자 1 내지 4)로부터 확인된 500 nM 미만의 예측된 IC50 점수를 갖는 112개의 돌연변이된 펩티드(9 또는 10-mer 돌연변이 펩티드)를 합성하였다. 실험적 결과는 결합 예측과 상호관련이 있었다. 실험적 결합(500 NM 미만의 IC50으로 정의됨)을 각각 150 nM 미만 또는 150 내지 500 nM의 IC50을 갖는 예측된 펩티드의 76.5% 및 36%에서 확인하였다(예를 들어, 도 12c 참조). 종합하여, 예측된 펩티드의 약 54.5%(61/112)를 실험에 의해 개인 HLA 대립형질로의 결합제로 확인하였다. 종합적으로, 도 13에 나타낸 바와 같이, 각각 예측된 펩티드(500 nM 미만의 IC50)의 60% 대 44.5%가 실험적으로 입증될 수 있기 때문에, 9-mer 펩티드에 대한 예측은 10-mer 펩티드보다 더욱 민감하였다.
[표 7]
Figure 112015108225424-pct00013
Figure 112015108225424-pct00014
Figure 112015108225424-pct00015
Figure 112015108225424-pct00016
Figure 112015108225424-pct00017
실시예 18: 신생항원은 CLL 종양에서 발현된다
에피토프에 대한 CTL 반응은 에피토프를 인코딩하는 유전자가 표적 세포에서 발현되는 경우에만 유용할 것이다. 시퀀싱되고 HLA에 대하여 타이핑된 31명의 환자 시료 중에, 26명을 게놈-범위에 걸친 발현 프로파일링으로 처리하였다(예를 들어, 문헌[Brown et al. 2012] 참조). CLL 시료 내의 돌연변이가 있는 347개의 유전자의 발현 수준을 저/부재(가장 낮은 사분위수), 중간(중간의 2개의 사분위수) 또는 고(가장 높은 사분위수) 발현을 갖는 것으로 분류하였다. 도 12d에 나타낸 바와 같이, 347개의 돌연변이된 유전자 중 80%(또는 HLA-결합이 예측된 180개의 돌연변이 중 79%)가 중간 또는 고 발현 수준으로 발현되었다. 예측된 클래스 I 결합 에피토프가 있는 221개의 돌연변이된 유전자의 서브셋 중에 유사한 높은 빈도의 발현이 관찰되었다(88.6%).
RNA 수준은 유전자 산물마다의 판독의 수에 기초하여 결정되고 사분위수에 의해 순위가 정해질 수 있다. "H" - 상위 사분위수; "M" - 중간의 2개의 사분위수; "L" - 가장 낮은 사분위수(판독 부재의 유전자 배제); "-" - 검출가능한 판독 없음. 예측되는 친화성이 감소함에 따라, 보다 높은 엄격성이 발현 수준에 적용될 수 있다. RNA-Seq에 의해 검출가능한 mRNA 분자가 존재하지 않더라도, 예측된 결합제가 있는 NeoORF를 사용하였다. 활성화된 T-세포에 대한 표적으로 유용한 NeoORF에 대하여, 존재하는 경우, 종양 세포에 필요한 최소 발현 수준을 평가하기 위하여 현재 이용가능한 데이터가 존재하지 않다. 심지어 넌센스 매개의 파괴가 될 메시지의 "파이오니어" 번역의 발현의 수준도 표적 생성에 충분할 수 있다(문헌[Chang YF, Imam JS, Wilkinson MF: The nonsense-mediated decay RNA surveillance pathway. Annu Rev Biochem 76:51-74, 2007]). 따라서, neoORF의 신규성 및 강력한 종양 특이성으로 인한 neoORF의 표적으로서의 높은 가치 때문에, RNA 수준에서의 발현이 낮거나 검출가능하지 않는 경우에도 neoORF는 면역원으로 사용될 수 있다.
실시예 19: 후보 신생에피토프를 표적으로 하는 T 세포를 HSCT 이후 CLL 환자 1에서 검출하였다
CLL에서의 동종이계 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 이후 환경을 분석하여, 예측된 돌연변이 펩티드에 대한 면역 반응이 환자에서 발생할 수 있는지를 결정하였다. HSCT 후에 건강한 공여자로부터의 T 세포의 재구성에 의해, 숙주의 내인성 면역 결함을 극복할 수 있으며, 또한, 생체내에서 숙주 내의 백혈병 세포에 대한 프라이밍을 가능하게 한다. 분석은 진행된 CLL에 대한 비관련 강도 감소 컨디셔닝 동종-HSCT를 겪고, HSCT 후 4년 초과 동안 연속적 완화를 달성한 2명의 환자에 집중하였다(예를 들어, 표 8 참조). 이식후 T 세포를 이식 시간으로부터 7년(환자 1) 및 4년(환자 2)에 수집하였다.
표 8은 CLL 환자 1 및 2의 임상적 특징을 보여준다. 둘 모두의 환자는 HSCT 후 7년(환자 1) 및 4년(환자 2)을 초과하여 진행 중인 연속 완화를 달성하였다. M: 남성; HSCT: 조혈 줄기 세포 이식; RIC: 강도 감소 컨디셔닝; Flu/Bu: 플루다라빈/부설판; GvHD: 이식편대 숙주병; URD: 비관련 공여자; Mis: 미스센스; FS: 프레임쉬프트.
[표 8]
Figure 112015108225424-pct00018
환자(Pt 1)에 있어서, 25개의 미스센스 돌연변이를 WES에 의해 확인하였다. 통틀어, 13개의 돌연변이로부터 30개의 펩티드가 개인 HLA에 결합하는 것으로 예측되었다(13개 펩티드는 150 미만의 IC50을 가지며; 17개의 펩티드는 150 내지 500 nM의 IC50을 가짐). 도 14A에 나타낸 바와 같이, 펩티드 예측의 실험적 입증에 의해, 9개의 돌연변이로부터 유래된 14개의 펩티드에 대하여 HLA 결합을 확인하였다. 30개 모두의 예측된 HLA 결합 펩티드를 T 세포 프라이밍 연구를 위해 선택하였으며, 6개 펩티드/풀로된 5개의 풀로 체계화하였다(예를 들어, 표 9 참조). 유사한 예측된 결합 점수를 갖는 펩티드를 동일한 풀에 함께 두었다.
표 9는 T 세포 자극 연구를 위한 펩티드 풀에 포함되는 환자 1 미스센스 돌연변이로부터의 펩티드의 요약을 제공한다. 환자 1에서, HLA -A 및 -B 대립형질에 결합하는 500 nM 미만의 IC50을 갖는 모든 예측된 펩티드를 사용하였다. 6개 펩티드/풀을 갖는 돌연변이 펩티드의 5개 풀은 MHC 클래스 I 대립형질에 대한 예측된 결합 친화성의 감소 순서로 열거되어 있다. 상응하는 실험적 HLA-펩티드 결합 친화성, 야생형 펩티드 및 그들의 예측된 IC50 점수는 우측 맨끝 열에 포함되어 있다.
[표 9]
Figure 112015108225424-pct00019
Figure 112015108225424-pct00020
T 세포를 그들을 후보 신생항원 펩티드 풀로 펄싱된(주마다 1회 × 4주) 자가 항원 제시 세포(APC)를 사용하여 증량시킴으로써 신생항원 반응성에 대하여 시험하였다. 도 14B에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 분석법에서 반응성이 풀 2에 대하여 검출되었으나, 관련없는 펩티드(Tax 펩티드)에 대해서는 검출되지 않았다. 풀의 디콘볼루션에 의해, 풀 2 내의 돌연변이된(mut) ALMS1 및 C6orf89k 면역원성인 것으로 드러났다. ALMS1은 섬모 기능, 세포 휴지기 및 세포내 수송에서 역할을 수행하며, 이러한 유전자의 돌연변이는 II형 당뇨병에 연루된다. C6orf89는 세포 사이클 진행 및 기관지 상피 세포의 상처 회복에 연루되는 봄베신 수용체 하위유형-3과 상호작용하는 단백질을 인코딩한다. 둘 모두의 돌연변이 부위는 유전자의 보존된 영역 내에 존재하지 않고, 암에서 돌연변이되는 것으로 이전에 보고된 유전자 내에 존재하지 않는다. 표적 펩티드 둘 모두는 환자 1의 HLA 대립형질에 결합하는 것으로 실험적으로 확인될 수 있는 14개의 예측된 펩티드의 서브셋 중 하나였다. 돌연변이 및 야생형(wt) ALMS1의 실험적 결합 점수는 각각 91 및 666 nM이었으며; 돌연변이- 및 야생형-C6ORF89는 각각 131 및 1.7 nM이었다(예를 들어, 도 14c 및 표 9 참조). 돌연변이된 둘 모두의 유전자는 불량하게 보존된 영역에 국소화되며, 암에서 이전에 보고된 돌연변이 부위에 국소화되지 않는다(예를 들어, 도 15 내지 도 16 참조).
실시예 20: CLL 환자 2는 천연적으로 처리된 돌연변이 FNDC3B 펩티드에 대하여 면역성을 나타낸다
환자 2에서, 장기간 생존 완화의 환경에서 기억 T 반응에 기여하는 개인 신생항원의 능력을 시험하였다. 이러한 개체로부터, 26개의 비-동의 미스센스 돌연변이를 확인하였다. 통틀어, 16개의 돌연변이로부터 37개의 펩티드가 개인 HLA 대립형질에 결합하는 것으로 예측되었으며, 12개의 돌연변이로부터 18개의 펩티드가 실험적으로 입증될 수 있었다(15개는 150 미만의 IC50을 가지며; 3개는 150 내지 500 nM의 IC50을 가짐)(예를 들어, 도 17A 참조). 환자 2에서, 18개 모두의 실험적으로 입증된 HLA-결합 펩티드를 연구하였다. 6개 펩티드/풀로 된 3개의 풀을 사용하여 T 세포 자극을 수행하였다(예를 들어, 표 10 참조). 표 10은 T 세포 자극 연구를 위한 펩티드 풀에 포함되었던 환자 2 미스센스 돌연변이로부터의 펩티드의 요약을 보여준다. 환자 2에서, HLA -A 및 -B 대립형질에 결합하는 것으로 실험적으로 확인된 모든 펩티드를 사용하였다. 6개 펩티드/풀을 갖는 3개의 풀의 펩티드는 돌연변이 펩티드의 실험적 결합 친화성의 감소 순서로 열거되어 있다. 상응하는 야생형 펩티드 및 그들의 예측된 IC50 점수는 우측 맨끝 열에 포함되어 있다.
[표 10]
Figure 112015108225424-pct00021
Figure 112015108225424-pct00022
유사한 실험적 결합 점수를 갖는 펩티드를 동일한 풀 내에 조합하였다. 도 17B에 나타낸 바와 같이, 반응을 돌연변이 펩티드 풀-펄싱된 자가 APC에 대하여 T 세포를 주마다 2회 자극한 후에 평가하였으며, T 세포가 풀 1에 대하여 반응성인 것으로 관찰되었다. 풀의 디콘볼루션에 의해, mut-FNDC3B가 이러한 풀 내의 다른 것들 중에 우세한 면역원성 펩티드인 것으로 드러났다(mut- 및 wt-FNDC3B의 실험적 IC50은 각각 6.2 및 2.7 nM이었음; 예를 들어, 도 17c 참조). 혈액 악성종양에서의 FNDC3B의 기능이 분명하지 않지만, FNDC3B 발현의 하향-조절은 miR-143 발현을 상향조절되는 것으로 알려져 있으며, 이는 전립성 암 줄기 세포를 분화시키고, 전립선 암 전이를 촉진시키는 것으로 나타났다. ALMS1 및 C6orf89와 유사하게, FNDC3B 내의 돌연변이는 진화적으로 보존된 영역에 국소화되지 않거나 다른 암에서 이전에 보고되지 않았다(예를 들어, 도 15 및 도 16 참조).
mut-FNDC3B에 대한 T 세포 반응성은 다기능성이며(GM-CSF, IFN-γ 및 IL-2 분비), mut-FNDC3B 펩티드에 특이적이었으나, 그의 야생형 대응부에 특이적이지 않았다. 상이한 농도의 mut- 및 wt-FNDC3B 펩티드에 대한 T 세포 반응성의 시험에 의해, mut-FNDC3B 반응성 T 세포의 높은 결합활성 및 특이성이 드러났다. T 세포 반응성은 클래스 I 블로킹 항체(W6/32)의 존재에 의해 폐지되었으며, 이는 T 세포 반응성이 클래스 I 제한되는 것을 나타낸다(예를 들어, 도 17d 내지 도 17e 참조). 더욱이, 도 17e, 우측 패널에 나타낸 바와 같이, 유전자 돌연변이의 영역을 포함하는 300개 염기쌍 미니유전자로 트랜스펙션된 HLA-A2-발현 APC에 대하여 T 세포 반응성이 검출되었으나 야생형 미니유전자로는 검출되지 않았기 때문에, mut-FNDC3B 펩티드는 천연적으로 처리되고 펩티드를 제시하는 것으로 보인다.
도 17f에 나타낸 바와 같이, mut-FNDC3B/A2+-특이적 사량체를 사용하여, 별개의 집단의 mut-FNDC3B-반응성 CD8+ T 세포를 건강한 성인 HLA-A2+ 자원자로부터의 대조군 PBMC(0.38%)에 비하여 풀 1-자극된 T 세포(집단의 2.42%) 내에서 검출하였다. 도 17g에 나타낸 바와 같이, 182건의 CLL 사례(환자 2 포함)의 큰 데이터세트 및 정상의 자원자로부터 수집된 24개의 CD19+ B 세포에서의 FNDC3B의 유전자 발현 분석에 의해, 이러한 유전자가 다른 CLL 및 정상 B 세포에 비하여 환자 2에서 상대적으로 과발현되는 것이 드러났다. 따라서, 장기간 생존하는 신생항원-특이적 T 세포가 CLL 환자 2에서 추적될 수 있는 것이 명백하다.
HSCT 이후 과정과 관련하여 mut-FNDC3B 특이적 T 세포의 역학을 정의하기 위하여, HSCT 이전 및 이후의 상이한 시점으로부터 단리된 환자 2 T 세포를 2주 동안 자극한 다음, ELISPOT에서 IFN-γ 반응성에 대하여 시험하였다. mut-FNDC3B-특이적인 T 세포의 출현은 분자적 완화와 동시에 일어났으며, 시간이 지남에 따라 연속 완화로 유지되었다. 도 18(상측 및 중간 패널)에 나타낸 바와 같이, mut-FNDC3B T 세포 반응은 HSCT 이전 또는 이후 최대 3개월 동안 검출되지 않았다. 분자적 완화가 HSCT 이후 4개월에 처음 달성되었으며, 이후에 mut-FNDC3B-특이적 T 세포가 HSCT 이후 6개월에 처음 검출되었다. 이후에 항원-특이적 반응성이 약화되었으나(HSCT 후 12 내지 20개월), HSCT 32개월 후에 다시 강력하게 검출되었다. 도 19 및 표 11에 나타낸 바와 같이, mut-FNDC3B-특이적 T 세포의 TCR의 분자적 분석에 기초하여, Vβ11은 반응성 T 세포에 의해 사용되는 우세한 CDR3 Vβ 하위과로 확인되었다. 표 11은 TCR Vβ 하위과의 증폭에 사용된 프라이머를 보여준다.
[표 11]
Figure 112015108225424-pct00023
Figure 112015108225424-pct00024
Figure 112015108225424-pct00025
이러한 분자 정보를 사용하여 클론-특이적 네스티드 PCR 분석법을 개발하였다. 이러한 분석법을 적용하여, mut-FNDC3B에 대하여 동일한 특이성이 있는 T 세포가 정상의 건강한 자원자의 PBMC(n=3) 및 CD8+ T 세포에서 검출되지 않았으나(예를 들어, 표 12 참조), 도 18, 하부 패널에 나타낸 바와 같이 환자에서 HSCT 이후에 IFN-γ 분비의 검출과 유사한 동역학으로 검출될 수 있음이 관찰되었다. 클론-특이적 T 세포의 상대 개수가 시간이 지남에 따라 감소되지만, HSCT 이후 6개월에 비하여 32개월에, 보다 낮은 농도의 펩티드 항원이 T 세포 반응성을 자극할 수 있었으며, 이는 시간이 지남에 따라 잠재적으로 더 많은 항원-감수성 기억 T 세포가 출현함을 나타낸다(예를 들어, 도 18 삽도 참조).
표 12는 환자 2에서의 T 세포 수용체-특이적 프라이머를 사용한 mut-FNDC3B 특이적 TCR Vβ11의 검출을 보여준다. 실시간 PCR 분석법을 설계하여 mut-FNDC3B-특이적 TCR Vβ11 클론을 검출하였다. 이러한 클론은 건강한 공여자 PBMC 또는 CD8 T 세포에서 검출가능하지 않았으나, 환자 2로부터의 mut-FNDC3B 반응성 T 세포 유래의 cDNA에서 명백하게 검출가능하였다(HSCT 이후 6개월에). PCR 산물을 18S 리보솜 RNA에 대해 정규화시켰다. -, 음성: 증폭 부재; +, 양성: 증폭이 검출됨; ++, 이중 양성, 증폭이 검출되며, 증폭 수준은 모든 양성 시료의 중간값 수준을 초과함.
[표 12]
Figure 112015108225424-pct00026
실시예 21: 다수의 후보 신생항원을 다양한 암에 대하여 예측하였다
CLL의 전체 체세포 돌연변이율은 다른 혈액 악성종양과 유사하나, 고형 악성종양과 비교하여 낮다(예를 들어, 도 20a 참조). 종양 유형 및 돌연변이율이 후보 신생항원의 존재비 및 질에 영향을 미치는 방법을 시험하기 위하여, 파이프라인을 높은 수준, 흑색종(MEL), 폐 편평세포암종(LUSC) 및 선암종(LUAD), 두경부암(HNC), 방광암, 결장 및 직장 선암종, 중간 수준, 교모세포종(GBM), 난소, 투명 세포 신장 암종(투명 세포 RCC) 및 유방암 및 낮은 수준, CLL 및 급성 골수성 백혈병(AML) 암을 포함하는 13개의 악성 종양으로부터의 공개적으로 이용가능한 WES 데이터에 적용하였다. 이러한 분석을 수행하기 위하여, 또한, WES 데이터로부터의 HLA 타이핑의 추론을 가능하게 하는 최근에 기재된 알고리즘을 구현하였다(문헌[Liu et al. 2013]).
이들 고형 악성종양에서의 전체 돌연변이율은 CLL에서보다 수십 배 더 높았으며, 미스센스 돌연변이의 수 중간값의 증가와 관련이 있었다. 예를 들어, 각각 흑색종은 사례마다 300개(범위, 34 내지 4276)개의 중간값의 미스센스 돌연변이를 나타내는 한편, RCC는 41개(범위, 10 내지 101)를 가졌다. RCC 및 흑색종에서의 프레임쉬프트 및 스플라이스-부위 돌연변이는 CLL에 비하여 빈도가 오직 2 내지 3배 증가하였으며, 시료마다 합계된 neoORF 길이는 오직 중등으로 증가하였다(5 내지 13배). 종합적으로, 미스센스 및 프레임쉬프트 사건으로부터 생성된 500 nM 미만의 IC50을 갖는 예측된 신생펩티드의 시료마다의 수의 중간값은 돌연변이율에 비례하였으며; 이것은 CLL(24; 범위 2 내지 124)에 비하여 각각 흑색종(488; 범위, 18 내지 5811) 및 RCC(80; 범위, 6 내지 407)에 대하여 대략 20배 및 4배 더 높았다. 150 nM 미만의 IC50의 더욱 엄격한 역치에서, 예측된 신생펩티드의 상응하는 수는 도 20b 및 표 13에 나타낸 바와 같이, 흑색종, RCC 및 CLL 각각에 대하여 212, 35 및 10개였다.
표 13은 13개의 암에 걸친 돌연변이 부류의 분포, 합계된 neoORF 크기 및 예측된 결합 펩티드의 수를 보여준다. MEL:흑색종, LUSC: 폐 편평 세포 암종, LUAD: 폐 선암종, BLCA: 방광, HNSC: 두경부암, COAD: 결장 선암종, READ: 신장 선암종, GBM: 교모세포종, OV: 난소, RCC: 투명 세포 신장 암종, BRCA: 유방, CLL: 만성 림프구성 백혈병, AML: 급성 골수성 백혈병. *-미스센스 및 프레임쉬프트 돌연변이에 기초한 펩티드의 예측된 수.
[표 13]
Figure 112015108225424-pct00027
실시예 22: 클론 돌연변이를 다루기 위한 임상적 전략
"클론" 돌연변이는 종양 내의 모든 암 세포에서 관찰되는 것들인 한편, "서브클론" 돌연변이는 통계적으로 모든 암 세포에서 존재하지 않고, 이에 따라, 종양 내의 하위 집단으로부터 유래되는 것들이다.
본원의 기술에 따라, 생물정보 분석을 사용하여 돌연변이의 클론성을 추정할 수 있다. 예를 들어, ABSOLUTE 알고리즘(문헌[Carter et al, 2012], 문헌[Landau et al, 2013])을 사용하여 종양 순도, 배수성, 절대 카피수 및 돌연변이의 클론성을 추정할 수 있다. 각각의 돌연변이의 대립형질 분획의 밀도 분포 확률을 생성한 다음 돌연변이의 암 세포 분율(CCF)로의 전환이 행해질 수 있다. 돌연변이는 그들의 CCF의 사후 확률이 각각 0.95 초과인지 0.5 미만인지에 기초하여, 클론 또는 서브클론으로 분류될 수 있다.
신생항원 백신이 클론, 하위-클론 또는 둘 모두의 유형의 돌연변이 펩티드를 포함할 수 있는 것이 본 개시내용의 범주 내인 것으로 고려된다. 결정은 환자의 병기 및 시퀀싱되는 종양 시료(들)에 좌우될 수 있다. 애쥬번트 환경에서 초기 임상 연구에 있어서, 펩티드 선택 동안 2가지 돌연변이 유형을 구별하는 것이 필요하지 않을 수 있으나, 당업자는 그러한 정보가 다수의 이유로, 추가의 연구를 안내하는데 유용할 수 있음을 인식할 것이다.
먼저, 대상 종양 세포는 유전학적으로 이질성일 수 있다. 질병 진행의 상이한 단계를 나타내는 종양을 이질성에 대하여 평가한 다수의 연구가 공개되어 있다. 이들은 예비-악성종양 질병(골수형성이상 증후군)에서 백혈병(이차 급성 골수성 백혈병[AML])으로의 발달(문헌[Walter et al 2012]), AML의 치료법-유도 완화 이후의 재발(문헌[Ding et al 2012]), 원발성에서 전이성 유방암 및 수모세포종으로의 발달(문헌[Ding et al 2012]; 문헌[Wu et al Nature 2012]), 및 원발성에서 고도의 전이성 췌장 및 신장암으로의 발달(문헌[Yachida et al 2012]; 문헌[Gerlinger et al 2012])을 시험하는 것을 포함한다. 대부분의 연구는 게놈 또는 엑솜 시퀀싱을 사용하였으나, 하나의 연구는 또한 카피수 변이 및 CpG 메틸화 패턴 변이도 평가하였다. 이들 연구는 돌연변이의 프로파일을 변경시키는 유전적 사건이 암 세포 성장 동안 얻어지는 것을 나타낸다. 가장 조기에 검출가능한 돌연변이("파운더(founder) 돌연변이")의 다수 및 거의 대부분(40% 내지 90%)이 모든 발달된 변이체에서 존속되나, 발달된 클론에 특유한 새로운 돌연변이가 발생하며, 이들은 상이하게 발달된 클론 간에 상이할 수 있다. 이들 변화는 숙주/암 세포 "환경" 압력 및/또는 치료적 개입에 의해 추진될 수 있으며, 이에 따라, 고도의 전이성 질병 또는 이전의 치료적 개입은 일반적으로 더욱 유의미한 이질성을 야기한다.
두 번째로, 각 환자에 대한 단일의 종양을 먼저 시퀀싱할 수 있고, 이는 특정 시점 동안 유전적 변이의 프로파일의 스냅샷(snapshot)을 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 시퀀싱된 종양은 이동/위성 전이 상태의 임상적으로 명백한 림프절 또는 절제가능한 내장 전이로부터 유래될 수 있다. 처음에 시험된 환자 중 어느 환자도 임상적으로 다수의 부위로 진행된 질병을 갖지 않을 것이나; 본원에 기재된 기술이 다수의 부위로 진행된 암을 갖는 환자에게 광범위하게 적용가능할 것으로 고려된다. 이러한 종양 세포 집단에서, "클론 돌연변이"는 절제된 종양을 씨딩하는 세포에 존재하는 파운더 돌연변이 및 임의의 신규한 돌연변이 둘 모두로 이루어질 수 있으며, 서브클론 돌연변이는 절제된 종양의 성장 동안 발달되는 것들을 나타낸다.
세 번째로, 백신 유도된 T-세포가 표적으로 하기에 임상적으로 중요한 종양 세포는 흔히 절제되는 종양 세포가 아니라, 오히려 주어진 환자 내의 현재 검출가능하지 않은 다른 종양 세포이다. 이들 세포는 원발성 종양으로부터 또는 절제된 종양으로부터 직접 확산될 수 있으며, 씨딩 종양 내의 우세한 또는 하위-우세한 집단으로부터 유래될 수 있고, 수술에 의해 절제된 부위에서 추가로 유전학적으로 발달될 수 있다. 이들 사례는 현재 예측가능하지 않다.
따라서, 수술적으로 절제된 애쥬번트 환경에서, 클론 또는 서브클론인 절제된 종양에서 관찰되는 돌연변이가 다른 비-절제된 암 세포를 표적화하기 위한 최적의 선택을 나타내는지를 결정하기 위한 선험적 방법이 존재하지 않는다. 예를 들어, 절제된 종양 내의 서브클론인 돌연변이는 다른 부위가 절제된 종양 내의 서브-클론 돌연변이를 함유하는 세포의 하위집단으로부터 씨딩된다면, 그들 다른 부위에서 클론일 수 있다.
그러나, 다른 질병 환경, 예를 들어, 환자가 다수의 및 전이성 병변을 지니는 환경에서, 상이한 시점으로부터 1개 초과의 병변(또는 병변의 부분) 또는 병변들의 시퀀싱은 효율적인 펩티드 선택에 대한 더 많은 정보를 제공할 수 있다. 클론 돌연변이를 전형적으로 백신을 위한 신생-항원 에피토프의 설계에서 우선순위를 결정할 수 있다. 일부 예에서, 특히 종양이 발달하고, 전이성 병변으로부터의 시퀀싱 상세사항을 개별 환자에 대하여 평가함에 따라, 특정 서브클론 돌연변이를 펩티드 선택의 부분으로서의 고려를 위해 우선순위를 결정할 수 있다.
실시예 23: 개인맞춤화 암 백신은 종양 신생항원에 대한 면역성을 자극한다
종합적인 생물정보학과 CLL 및 기타 암에서의 기능적 데이터의 상기 기재된 상세화된 통합은 몇몇의 신규한 생물학적 이해를 제공한다. 먼저, CLL이 상대적으로 돌연변이율이 낮은 암이지만, 그럼에도 불구하고, 장기간 T 세포 반응을 유도하는 체세포 돌연변이에 의해 생성된 에피토프를 확인할 수 있다. 31개의 CLL 시료로부터의 전체-엑솜 시퀀싱 데이터에 의해, 16개(범위, 2 내지 75)의 중간값의 미스센스 돌연변이로부터 기원하여, 사례마다, 22개(범위, 6 내지 81)의 중간값의 펩티드가 500 nM 미만의 IC50으로 개인 HLA-A 및 -B 대립형질에 결합하는 것으로 예측되는 것으로 드러났다. 각각 150 nM 및 500 nM 미만의 IC50을 갖는 예측된 펩티드의 대략 75% 및 절반(54.5%)이 환자의 HLA 대립형질에 결합하는 것으로 실험적으로 입증되었다. RNA 발현 분석에 의해, 예측된 돌연변이 펩티드에 상응하는 동족 유전자의 거의 90%가 CLL 세포에서 발현되는 것으로 확인되었으며, 돌연변이된 대립형질로부터의 전사물의 발현이 시험된 3개(데이터 미도시)의 실시예 각각에서 검출된 것으로 나타났다. 모든 신생에피토프 중 오직 소정의 분율만이 자발적 T-세포 반응을 생성하였지만, 이러한 반응은 이식 수년 후에 여전히 검출가능하였으며; 모든 예측되고 시험된 돌연변이 펩티드의 약 6%(3/48) 또는 실험적으로 입증되고 시험된 돌연변이 펩티드의 9%(3/32)는 환자의 T 세포로부터의 IFN-γ 분비 반응을 자극하였다. CLL, 돌연변이율이 낮은 종양에서의 이러한 신생-에피토프 발견의 비는 흑색종(4.5% 또는 11/247개 펩티드; 문헌[Robbins PF, Lu YC, El-Gamil M, et al: Mining exomic sequencing data to identify mutated antigens recognized by adoptively transferred tumor-reactive T cells. Nat Med, 2013]), 돌연변이율이 높은 암에서 최근에 보고된 비와 매우 유사하다. 그러므로, 기능적 신생에피토프는 돌연변이율이 낮은 종양을 포함하는 넓은 범위의 암에 걸쳐 체계적으로 발견될 수 있다.
두 번째 주요 발견은 CLL 신생에피토프에 대한 T 세포 반응이 장기간 지속되고(대략 수년), 연속적 질병 완화와 관련이 있으며, 기억 T 세포 반응과 일치하는 기간에 시험관내 자극 동안 생성된 것이다. 증가하는 문헌에 부가되는 이들 연구에서, 종양 신생항원에 대한 반응은 효율적인 면역 반응에 기여한다. 따라서, 미스센스 돌연변이로부터 생성된 예측된 펩티드의 대략 5%가 검출가능한 T 세포 반응을 제공하지만, 반응의 동역학은 진행 중인 항-백혈병 감시 기능에서의 가능한 역할을 시사한다. 신생항원-지향된 T-세포 반응의 기능적 영향은 펩티드-HLA 대립형질 결합제의 예측 및 B16 쥣과 흑색종의 WES에 의해 후보 신생에피토프를 확인한 문헌[Castle et al. (Castle JC, Kreiter S, Diekmann J, et al: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72:1081-1091, 2012)]으로부터 최근의 연구에 의해 뒷받침된다. 이들 예측된 에피토프의 서브셋은 돌연변이 펩티드에 특이적이고 야생형 대응부에 특이적이지 않은 면역 반응을 유도할 뿐 아니라, 치료적 및 예방적으로 질병을 조절할 수 있다. GvL 반응에 대해 또는 다른 유형의 CLL 항원, 예를 들어, 과발현된 또는 공유된 고유 항원(흑색종과 대조적으로, CLL 종양 항원은 널리 특성화되지 않음)에 대해 종양 신생항원의 상대적 공헌을 직접 비교하는 것은 어렵지만, 생존이 연장된 흑색종 환자로부터의 항원-특이적 T 세포 반응의 이전의 특성화에 의해, 항-신생항원 면역성이 시간이 지남에 따라 공유된 과발현 종양 항원에 대해서보다 보다 더욱 연장되고 지속되는 것이 뒷받침되었다.
세 번째로, 이들 결과는 종양-특이적 "트렁크(trunk)" 돌연변이의 표적화가 면역학적 견지에서 강력할 수 있다는 개념을 강조한다. 2명의 환자에서 면역원성 신생항원의 3개 모두(돌연변이 FND3CB, ALMS1, C6orf89)는 패신저(passenger) 돌연변이이며, 직접적으로 발암 과정에 기여하지 않는 것으로 보이며, 클론성이어서, 암 덩어리의 부피에 영향을 미치는 것으로 보인다. 이들 면역원성 돌연변이의 몇몇 특징은 그들이 패신저 돌연변이임을 시사한다: 돌연변이 근처에 서열 보존이 결여됨, 및 관찰된 부위에서, 다른 암에서의 이전에 보고된 돌연변이가 결여됨. 클론 발달이 암의 근본적인 특징이기 때문에, 그들이 선택압에 직면하여 유지되는데 필요한 종양 기능에서 필수적임을 고려해볼 때, 암 드라이버의 면역학적 표적화가 최소 항원 연속변이(drift)의 이점을 가질 것으로 가정된다. 그러한 이점이 가능할 수 있지만, 명시적으로 요건은 아니다. 추가로, 드라이버 돌연변이는 본질적으로 면역원성 펩티드를 생성하지 않을 수 있다. 예를 들어, 환자 2에서의 TP53-S83R 돌연변이는 그의 클래스 I HLA-A 또는 -B 대립형질 중 임의의 것에 대하여 500 nM 미만의 예측된 에피토프를 생성하지 않았다.
마지막으로, 문헌으로부터의 신생항원 데이터(표 4) 및 CLL에서의 데이터로부터의 후보 신생에피토프의 결합 특징의 분석에 의해, 가장 효율적으로 T 세포 반응을 생성할 것 같은 점 돌연변이의 유형에 대한 개념적 통찰이 드러났다. 면역원성 신생에피토프의 일관된 특징은 500 nM 미만의 예측된 결합 친화성이었으며(3개 중 3개의 면역원성 CLL 펩티드 및 33개 중 30개[91%]의 종래의 기능적 신생에피토프), 이들 중 대다수(92%)는 150 nM 미만의 예측된 친화성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 그러나 예상외로, 대부분의 경우에(3개 중 3개의 면역원성 CLL 펩티드 및 33개 중 27개[82%]의 종래의 기능적 신생에피토프), 상응하는 야생형 에피토프도 비슷하게 강한/중간의(150 nM 미만, 표 4에서 그룹 1) 또는 약한(150 내지 500 nM, 표 4에서 그룹 2) 친화성으로 결합하는 것으로 예측되었다. 데이터에 의해 돌연변이 중 2개의 유형이 신생항원에 대한 천연 발생 T-세포 반응 간에 공통으로 관찰된다는 발상이 뒷받침된다: (1) 아마도 MHC와의 개선된 상호작용 때문에, MHC 대립형질에 실질적으로 더 잘 결합하게 하는 위치에서의 돌연변이(돌연변이 ALMS1 및 33개 중 6개(18%)의 종래의 기능적으로 확인된 신생에피토프['그룹 3', 표 4]), 또는 (2) MHC와 상당하게 상호작용하지 않지만 대신에 아마도 T 세포 수용체 결합을 변경시키는 위치에서의 돌연변이((3개 중 2개의 CLL 에피토프[FNDC3B 및 C6orf89] 및 33개 중 24개(73%)의 천연 면역원성 신생에피토프['그룹 1' 및 '그룹 2', 표 4]). 이들 2가지 유형의 돌연변이 간의 차이는 펩티드가 "열쇠(key)"로 여겨질 수 있으며, 세포용해를 자극하여, 돌연변이가 독립적으로 MHC 또는 TCR 결합을 달라지게 하기 위하여, MHC 및 TCR "자물쇠(lock)" 둘 모두와 들어맞아야 한다는 개념과 부합한다. 이식편대 숙주병에 대한 부 조직적합성 항원의 기여를 제외하고, 이들 환자에서, 심지어 반응이 돌연변이 펩티드에 대하여 발생하는 그들 환자에서도 신생항원과 관련된 자가-면역 후유증의 보고가 없으며, 동족 고유 펩티드는 단단한 결합제인 것으로 예측된다. 이러한 결과는 MHC-결합 고유 펩티드가 음성 선택 과정에 보통 수반되며, 여기서, 이들 고유 펩티드에 반응성인 TCR을 지니는 T 세포가 흉선에서 제거되거나 무력성이 되고, T 세포 레퍼토리가 T 세포 수용체로의 돌연변이 펩티드의 제시가 변경됨으로 인하여, 신생에피토프 펩티드에 대하여 특이적인 면역 반응의 발생을 제공할 수 있다는 발상과 일치한다. 환자에서 각 개별 종양이 환경에 반응하여 계속 발달할 수 있는 넓은 스펙트럼의 공유된 및 개인의 유전적 변경 둘 모두를 지닐 수 있으며, 이러한 진행이 종종 치료법에 대한 내성을 야기할 수 있는 것이 명백하다. 종양의 특유성 및 적응성(plasticity)을 고려해 볼 때, 최적의 치료법은 각 종양에 존재하는 정확한 돌연변이에 기초하여 맞춤화될 필요가 있을 수 있으며, 다수의 림프절을 표적화하여 내성을 회피할 필요가 있을 수 있다. 인간 CTL의 광대한 레퍼토리는 다수의 개인맞춤화된 종양 항원을 표적화하는 그러한 치료법을 만들어 내는 능력을 갖는다. 상기 논의된 바와 같이, 본 개시내용은 HLA-결합 펩티드를 효율적으로 예측하는 알고리즘과 병용하여 대규모의 병행 시퀀싱을 사용하여, 종양-특이적 돌연변이를 지니는 CTL 표적 항원을 체계적으로 확인할 수 있음을 보여준다. 유리하게, 본 개시내용은 다양한 저 및 고 돌연변이율 암에서 종양 신생항원이 예측되게 하고, CLL 환자에서 백혈병 신생항원을 표적으로 하는 장기간 생존하는 CTL을 실험적으로 확인한다. 본 개시내용은 종양 신생항원을 표적으로 하는 보호 면역의 존재를 뒷받침하며, 개인맞춤화 종양 백신을 위한 신생항원의 선택 방법을 제공한다.
상기 상세히 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 기술을 동종이계-HSCT 후에 항-종양 면역 반응과 관련된 임상적으로 명백한 지속적인 완화가 발생한 특유한 CLL 환자의 군에 적용하였다. 이들 이식편대 백혈병 반응은 전형적으로 조혈 세포를 표적으로 하는 동종-반응성 면역 반응에 기인한다. 그러나 상기 기재된 결과는 GvL 반응이 개인 백혈병 신생항원을 인식하는 CTL과도 관련이 있음을 나타낸다. 이들 결과는 동종-항원보다는 종양에 대한 특이성을 갖는 GvL-관련 CTL의 존재를 나타내는 데이터와 일치한다. 장기간 흑색종 생존자의 연구에 의해, 신생항원으로 표적으로 하는 CTL이 비-돌연변이 과발현된 종양 항원에 대한 것보다 상당히 더 풍부하며 지속적인 것이 관찰되었기 때문에, 신생항원-반응성 CTL이 암 관측에 중요한 것으로 가정된다(문헌[Lennerz V, Fatho M, Gentilini C, et al: The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci U S A 102:16013-8, 2005]). CLL 환자에서의 신생항원-특이적 T 세포 반응이 장기간 생존하는(대략 수년) 기억 T 세포이며(시험관내에서의 그들의 신속한 자극에 기초하여), 지속적 질병 완화와 관련이 있는 것으로 관찰되었기 때문에 상기 제시된 데이터는 이러한 흑색종 연구와 일치한다. 따라서, 신생항원-반응성 CTL은 아마도 이식된 CLL 환자에서 백혈병의 조절에 적극적인 역할을 수행할 것이다.
더욱 일반적으로, 많은 종양에 걸친 신생항원의 존재비를 추정하였으며, 점 돌연변이마다 약 1.5개의 HLA-결합 펩티드가 500 nM 미만의 IC50을 갖는 것이 관찰되었으며, 프레임쉬프트 돌연변이마다 약 4개의 결합 펩티드가 관찰되었다. 예상되는 바와 같이, 예측되는 HLA 결합 펩티드의 비는 종양 유형마다의 체세포 돌연변이율을 반영한다(예를 들어, 도 20 참조). 2가지 접근법을 사용하여, 예측된 결합 친화성과 CTL을 유도하는 면역원성 신생항원 간의 관계를 연구하였다. 상기 기재된 기술을 공개된 면역원성 종양 신생항원(즉, 여기서, 반응성 CTL이 환자에서 관찰됨)에 적용하여, 기능적 신생항원의 대다수(91%)가 500 nM 미만의 IC50으로 HLA에 결합하는 것으로 예측되는 것이 입증되었다(유사한 친화성으로 결합하는 것으로 예상되는 야생형 대응부 에피토프는 약 70%)(예를 들어, 표 4 참조). 이러한 시험은 황금 표준 세트의 신생항원을 사용하여, 본원에 기재된 기술이 진 양성(true positive)을 정확하게 분류하는 것을 확인하였다. 신생에피토프의 장래 예측에 이어서 기능적 입증에 의해, 예측된 에피토프의 6%(3/48)가 환자에서 신생항원-특이적 T 세포 반응과 관련이 있는 것이 나타났으며, 이는 흑색종에 대하여 최근에 관찰된 4.8%의 비에 필적한다. 낮은 비율은 본질적으로 알고리즘에 대한 낮은 예측 정확성을 암시하지 않는다. 오히려, 참의 신생항원의 개수는 크게 과소평가되는데, 그 이유는 (i) 동종-HSCT가 아마도 오직 소수의 신생항원-특이적 T 세포 기억 클론만을 유도하는 일반적 세포 치료법이고; (ii) 표준 T 세포 증량 방법이, 훨씬 더 큰 레퍼토리의 부분을 나타내나 훨씬 더 낮은 전구체 빈도를 갖는 나이브 T 세포를 검출하기에 충분히 민감하지 않기 때문이다. neoORF를 표적으로 하는 CTL의 빈도가 아직 측정되지 않았지만, 구체적으로 이러한 부류의 신생항원이 뛰어난 후보 신생항원일 수 있는 것이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려되는데, 그 이유는 그것이 아마도 더욱 특이적이며(야생형 대응부의 결여) 면역원성(흉선 관용의 우회의 결과로서)이기 때문이다.
매우 강력한 백신접종 시약의 개발이 진행 중임에 따라, 본 개시내용은 종양 신생항원에 대하여 면역성을 효율적으로 자극하는 개인맞춤화 암 백신의 생성을 실현가능하게 하는 기술을 제공한다.
재료 및 방법
환자 시료: 헤파린처리된 혈액을 다나-파버 암 연구소(Dana-Farber Cancer Institute; DFCI)의 임상 연구 프로토콜에 등록된 환자로부터 수득하였다. 모든 임상 프로토콜은 DFCI 인간 대상 보호 위원회에 의해 승인되었다. 환자 시료 유래의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜(Ficoll)/하이파크(Hypaque) 밀도-기울기 원심분리에 의해 단리하고, 10% DMSO를 사용하여 동결보존시키고, 분석시까지 증기상 액체 질소에서 보관하였다. 환자의 서브셋에 있어서, 분자 또는 혈청학적 타이핑에 의해 HLA 타이핑을 수행하였다(Tissue Typing Laboratory, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA).
CLL 및 다른 암에 대한 전체 엑솜 포획 시퀀싱 데이터: 흑색종에 대한 목록을 dbGaP 데이터베이스(phs000452.v1.p1)로부터 수득하고, 11개의 다른 암에 대한 목록을 TCGA(세이지 바이오네트워크 시냅스 리소스(Sage Bionetworks' Synapse resource)(월드와이드 웹 (www)synapse.org/#!Synapse:syn1729383에서)를 통해 이용가능)를 통해 수득하였다. 이들 13개의 종양 유형에 걸친 2488개의 시료에서의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 2단계 우도 기반의 접근법을 사용하여 시퀀싱하였으며, 이러한 데이터는 표 14에 요약되어 있다. 약술하면, IMGT 데이터베이스에 기초한, 모든 알려져 있는 HLA 대립형질(6597개의 특유한 엔트리)로 이루어진 전용 서열 라이브러리를 작제하였다. 이러한 공급원으로부터 38-mer의 2차 라이브러리를 생성하고, HLA 유전자좌로부터 나오는 추정의 판독물을 그에 대한 완벽한 일치에 기초하여, 전체 서열 판독물로부터 추출하였다. 그 다음, 추출된 판독물을 Novoalign 소프트웨어(월드와이드 웹, (www)novocraft.com)를 사용하여 IMGT-기반의 HLA 서열 라이브러리에 대하여 정렬하고, 2-단계 우도 계산을 통해 HLA 대립형질을 추론하였다. 제1 단계에서, 집단-기반의 빈도를 각 대립형질에 대한 사전 값으로 사용하고, 이후의 우도를 정렬된 판독물의 인서트 크기 분포 및 질에 기초하여 계산하였다. HLA-A, B 및 C 유전자 각각에 대하여 가장 높은 우도를 갖는 대립형질을 제1 세트의 대립형질로 확인하였다. 그 다음, 승자의 제1 세트와 함께 계산된 우도의 경험적 가중 전략을 사용하여 제2 세트의 대립형질을 확인하였다.
표 14는 암에 걸친 신생항원 로드 추정치에 대한 TCGA 환자 ID를 보여준다. LUSC(폐 편평세포 암종), LUAD(폐 선암종), BLCA(방광), HNSC(두경부), COAD(결장) 및 READ(직장), GBM(교모세포종), OV(난소), RCC(투명 세포 신장 암종), AML(급성 골수성 백혈병) 및 BRCA(유방),
[표 14]
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개인 HLA 대립형질로의 결합이 있는 유전자 돌연변이로부터 유래된 펩티드의 예측을 위한 파이프라인: MHC-결합 친화성을 NetMHCpan(버전 2.4)을 사용하여 각각의 체세포 돌연변이로부터 생성된 모든 가능한 9-mer 및 10-mer 펩티드 및 상응하는 야생형 펩티드에 걸쳐 예측하였다. 이들 타일링된 펩티드를 환자의 HLA 프로파일에서 각각의 클래스 I 대립형질에 대한 그들의 결합 친화성(IC50 nM)에 대하여 분석하였다. 150 nM 미만의 IC50 값은 예측되는 강력한 결합제 내지 중간의 결합제로 여겨지며, 150 내지 500 nM의 IC50은 예측되는 약한 결합제로 여겨지는 한편, 500 nM 초과의 IC50은 비-결합제로 여겨진다. HLA 분자에 결합하는 예측된 펩티드(500 nM 미만의 IC50)의 실험적 확인을 경쟁적 MHC 클래스 I 대립형질-결합 분석법을 사용하여 수행하였으며, 다른 곳에 상세하게 설명되어 있다(문헌[Cai et al. 28 and Sidney et al. 2001]).
항원의 공급원: 뉴 잉글랜드 펩티드(New England Peptide)(Gardner, MA); 또는 알에스 신티시스(RS Synthesis)(Louisville, KY)로부터 95% 초과의 순도(고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인)로 펩티드를 합성하였다. 펩티드를 DMSO(10 ㎎/㎖) 중에 재구성하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 돌연변이 또는 야생형 FNDC3B를 포함하는 300 bp의 서열로 이루어진 미니유전자를 하기의 프라이머를 사용하여 환자 2의 종양으로부터 발현 벡터 pcDNA3.1로 PCR-클로닝하였다: 5' 프라이머: GACGTCGGATCCCACCATGGGTCCCGGAATTAAGAAAACAGAG; 3' 프라이머: CCCGGGGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGGTGACATTCTAATTCTTCTCCACTGTAAA. 20 ㎍의 플라스미드를 아막사 뉴클레오펙션(Amaxa nucleofection)(Solution V, 프로그램 T16, 론자 인코포레이티드(Lonza Inc); Walkersville, MD)에 의해 HLA-A2로 안정적으로 트랜스펙션된 200만 개의 K562 세포(ATCC)에 도입함으로써 미니유전자를 항원-제시 표적 세포에서 발현하였다. 세포를 10% 우태아혈청(셀그로(Cellgro)), 1% HEPES 완충제(셀그로) 및 1% L-글루타민(셀그로)이 보충된 RPMI 배지(셀그로; Manassas, VA)에서 인큐베이션시켰다. 세포를 면역 분석법을 위해 뉴클레오펙션 2일 후에 수집하였다.
CLL 사례에서의 유전자 발현의 분석: 이전에 보고된 마이크로어레이 데이터(NCI 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus) 수탁 번호 GSE37168)를 재분석하였다. 아피메트릭스 CEL 파일을 R에서 아피(affy) 패키지를 사용하여 처리하였다. 지수적으로 분포된 신호 및 정규 분포된 신호의 혼합으로서 관찰된 세기를 모델링하는 로버스트 멀티칩 분석(Robust Multichip Analysis; RMA) 알고리즘을 백그라운드 보정을 위해 사용하였다. 이어서, 어레이에 대한 사분위수 정규화를 행하여, 상이한 조건하의 유전자 발현의 비교를 용이하게 하였다. 개별 프로브-수준을 중간값 폴리시(polish) 접근법을 사용하여 최종적으로 요약하여, 강력한 프로브셋-수준 값을 얻었다. 각 유전자에 대하여 최대 평균 발현을 갖는 프로브를 선택함으로써 유전자-수준 값을 수득하였다. 데이터에서의 뱃치 영향을 컴뱃(Combat) 프로그램에 의해 제거하였다.
환자 PBMC로부터의 항원 특이적 T 세포의 생성 및 검출: 자가 수지상 세포(DC)를 120 ng/㎖ GM-CSF 및 70 ng/㎖ IL-4(알앤디 시스템즈(R&D Systems), Minneapolis, MN)의 존재하에 3% 우태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신(셀그로), 1% L-글루타민 및 1% HEPES 완충제가 보충된 RPMI(셀그로) 중에 배양시킨 면역자성적으로(immunomagnetically) 단리된 CD14+ 세포(밀테니이(Miltenyi), Auburn CA)로부터 생성하였다. 제3일 및 제5일에, 추가의 GM-CSF 및 IL-4를 첨가하였다. 제6일에, 세포를 IL-4 및 GM-CSF를 첨가하는 것에 더하여, 30 ㎍/㎖ 폴리 I:C(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), St Louis, MO)에 노출시켜, 성숙을 겪게 하였다(48시간 동안). CD19+ B 세포를 면역자성적 선택(CD19+ 마이크로비드; 밀테니이, Auburn, CA)에 의해 환자 PBMC로부터 단리하고, 24-웰 플레이트에 1×106개 세포/웰로 씨딩하였다. B 세포를 10% 인간 AB 혈청(젬셀(GemCell), Sacramento, CA), 5 ㎍/㎖ 인슐린(시그마 케미컬, St Louis, MO), 15 ㎍/㎖ 젠타마이신, IL-4(2 ng/㎖, 알앤디 시스템즈, Minneapolis, MN) 및 CD40L-Tri(1 ㎍/㎖)가 보충된 B 세포 배지(이소코브스(Iscoves) 변형 둘베코(Dulbecco) 배지(IMDM; 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), Woburn, MA)에서 배양하였다. CD40L-Tri를 3 내지 4일마다 보충하였다. 일부 실험을 위하여, CD40L-Tri 활성화 및 증량된 CD19+ B 세포를 APC로 사용하였다.
환자 PBMC로부터의 항원-특이적 T 세포의 생성: CLL 환자로부터 펩티드-반응성 T 세포를 생성하기 위하여, 이식 전 및 이식 후 PBMC(CD8+ 마이크로비드, 밀테니이, Auburn, CA)로부터 면역자성적으로 선택된 CD8+ T 세포(5×106개/웰)를 10% FBS 및 5 내지 10 ng/㎖ IL-7, IL-12 및 IL-15가 보충된 완전 배지 중 각각 자가 펩티드 풀-펄싱된 DC(40:1 비) 또는 CD40L-Tri-활성화 조사된 B 세포(4:1 비)와 함께 배양하였다. APC를 펩티드 풀을 사용하여 3시간 동안 펄싱시켰다(10 μM/펩티드/풀). CD8+ T 세포를 APC를 사용하여 주마다 재자극시켰다(7일에 시작하여, 1 내지 3주 동안).
항원-특이적 T 세포의 검출: 펩티드 풀에 대한 T 세포 특이성을 2차 및 4차 자극 10일 후에, IFN-γ ELISPOT 분석법에 의해 시험하였다. IFN-γ 방출을 ELISPOT 플레이트에서 24시간 동안 50,000개 CD8+ T 세포/웰(밀리포어, Billerica, MA)과 동시-인큐베이션시킨 시험 및 대조군 펩티드-펄싱된 CD40L-활성화 B 세포(50,000개 세포/웰)를 사용하여 검출하였다. IFN-γ를 지시된 바와 같이 포획 및 검출 항체를 사용하여 검출하고(Mabtech AB, Mariemont, OH), 영상화시켰다(이뮤노스폿 시리즈 어널라이저(ImmunoSpot Series Analyzer); Cellular Technology, Cleveland, OH). MHC 클래스 I에 대한 T 세포 반응성 의존성을 시험하기 위하여, ELISPOT 플레이트를 먼저 37℃에서 2시간 동안 클래스 I 블로킹 항체(W6/32)와 동시-인큐베이션시킨 APC로 코팅한 후에, T 세포를 웰에 도입하였다. MHC 클래스 I 사량체를 사용하여 지시된 바와 같이 T 세포의 특이성을 시험하였다(에모리 유니버서티(Emory University), Atlanta GA). 사량체 염색을 위하여, 5×105개 세포를 4℃에서 60분 동안 1㎍/㎖ PE-표지된 사량체와 인큐베이션시킨 다음, 항-CD3-FITC 및 항-CD8-APC 항체(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences), San Diego CA)를 첨가하여 4℃에서 다시 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최소 100,000건의 사례를 시료마다 획득하였다. 배양된 CD8+ T 세포로부터의 GM-CSF 및 IL-2의 분비를 제조처의 권고에 따라(EMD 밀리포어, Billerica, MA) 루미넥스(Luminex) 다중 비드-기반의 기술을 사용하여 배양 상청액의 분석에 의해 검출하였다. 약술하면, 형광-표지된 미소구체를 특이적인 사이토카인 포획 항체로 코팅하였다. 배양 상청액 시료와 인큐베이션시킨 후에, 포획된 사이토카인을 비오티닐화된 검출 항체에 의해 검출한 후, 스트렙트아비딘-PE 컨쥬게이트 및 중간값 형광 세기(MFI)를 측정하였다(루미넥스 200 비드 어레이 기기; 루미넥스 코포레이션, Austin TX). 표준 곡선에 기초하여, 사이토카인 수준을 비드 뷰(Bead View) 소프트웨어 프로그램(업스테이트(Upstate), EMD 밀리포어, Billerica, MA)에서 계산하였다. TCR Vβ 클로노타입의 검출 및 정량화를 위하여, mut-FNDC3B 특이적 T 세포를 제조처의 지시에 따라 그리고 이전에 기재된 바와 같이, IFN-γ 분비 분석법(밀테니이, Auburn, CA)을 사용하여 환자 2의 T 세포주로부터 농축시켰다.
통계적 고려사항: IFN-감마, GM-CSF 및 IL-2 방출 형태의 돌연변이 대 야생형 펩티드에 대한 T 세포 반응성에 대하여 이원 분산분석 모델을 구축하였으며, 적절한 경우 상호작용 항과 함께 고정 요인으로서 농도 및 돌연변이 상태를 포함시켰다. 터키(Tukey) 방법을 사용한 다중의 사후 비교를 위해 이들 모델에 대한 P-값을 조정하였다. IFN-감마의 정규화된 비교를 위하여, t-검정을 수행하여, 정규화된 비가 1과 같다는 가설을 검정하였다. 그룹들 간의 연속 측정의 다른 비교를 위하여, 웰치(Welch) t-검정을 사용하였다. 보고된 모든 P-값은 양쪽이며, 다중의 비교를 위해 적절한 조정을 사용하여 0.05 수준에서 유의미한 것으로 고려한다. 분석을 SAS v9.2에서 수행하였다.
TCR Vβ 클로노타입의 검출 및 정량화: mut-FNDC3B 특이적 TCR Vβ를 검출하기 위하여, 펩티드-특이적 IFN-γ 농축 T 세포 집단으로부터 2-단계 네스티드 PCR을 수행하였다. 약술하면, 24개의 알려져 있는 Vβ 하위과 중에서 우세한 Vβ 하위과를 확인하였다. 먼저, 5개 풀의 Vβ 정방향 프라이머(풀 1: Vβ 1 내지 5.1; 풀 2: Vβ 5.2 내지 9; 풀 3: Vβ 10 내지 13.2; 풀 4: Vβ 14 내지 19; 및 풀 5: Vβ 20, 22 내지 25)를 생성하였다. T 세포 클론(QIAamp RNA 혈액 미니-키트; 퀴아젠(Qiagen), Valencia, CA)으로부터 추출된 RNA를 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA(슈퍼스크립트(Superscript), GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)로 역 전사시키고, 5개의 개별 20 ㎕ 부피 반응에서 PCR 증폭시켰다. 두 번째로, FAM-컨쥬게이트된 Cβ 역(내부) 프라이머와 함께 양성 풀에 포함된 5개의 개별 프라이머 각각을 사용하여 T 세포 클론-유래의 cDNA를 재증폭시켰다. 이후에, 4 ㎕의 이러한 PCR 산물을 20 ㎕의 총 부피 중 1 ㎕의 클론 CDR3 영역-특이적 프라이머 및 프로브, 및 10 ㎕의 택맨 패스트 유니버설(Fast Universal) PCR 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈, Foster City, CA)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 20분×1 사이클 및 95℃에서 3초에 이어서, 60℃에서 30초의 40 사이클(7500 패스트 리얼-타임 PCR 사이클러; 어플라이드 바이오시스템즈, Foster City, CA). 시험 전사물을 이전에 기재된 바와 같이 2^(S18 rRNA CT-표적 CT)를 계산함으로써 S18 리보솜 RNA 전사물에 비하여 정량화하였다.
분자 종양 부하량의 검출: 환자 2의 클로노타입 IgH 서열을 이전에 기재된 바와 같이 VH-특이적 PCR 프라이머를 사용하여 확인하였다. 이러한 서열에 기초하여, 서열-특이적 프로브가 접합 다양성 영역에 위치하도록 정량적 택맨 PCR 분석법을 설계하였다(어플라이드 바이오시스템즈; Foster City, CA). 이러한 택맨 분석법을 종양 유래의 cDNA에 적용하였다. 모든 PCR 반응은 다음으로 이루어진다: 50℃에서 1분×1 사이클, 95℃에서 10분×1 사이클 및 95℃에서 15초에 이어서, 60℃에서 1분의 40 사이클. 모든 반응을 7500 패스트 리얼-타임 PCR 사이클러(어플라이드 바이오시스템즈, Foster City, CA)를 사용하여 수행하였다. 시험 전사물을 GAPDH에 비하여 정량화하였다.
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SEQUENCE LISTING <110> THE BROAD INSTITUTE, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PERSONALIZED NEOPLASIA VACCINES <130> 92784WO(314024) <140> PCT/US2014/033185 <141> 2014-04-07 <150> 61/869,721 <151> 2013-08-15 <150> 61/809,406 <151> 2013-04-07 <160> 338 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 1 His His His His His His 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Leu Asp Glu Phe Met Glu Gly Val 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Thr Asp Asp Arg Leu Phe Thr Cys Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Leu Leu Asp Asp Leu Leu Val Ser Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Thr Leu Thr Ser Val Phe Gln Lys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ala Phe Ile Gln Pro Ile Thr Arg 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Pro His Val Pro Glu Ser Ala Phe 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Leu Ala Asp Glu Ala Glu Val Tyr Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lys Ile Phe Ser Glu Val Thr Leu Lys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Thr Val Ser Glu Gln Ser Asn Val 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Ile Val Glu Gly Leu Ile Thr Thr Val 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Leu Phe Glu Gly Ile Asp Ile Tyr Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Phe Ile Ala Ser Asn Gly Val Lys Leu Val 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Cys Ile Leu Gly Lys Leu Phe Thr Lys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Thr Ala Cys Glu Val Leu Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ile Leu Asn Ala Met Ile Ala Lys Ile 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Tyr Thr Asp Phe His Cys Gln Tyr Val 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Glu Leu Phe Arg Ser Gly Leu Asp Ser Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Glu Pro Ile Asp Ile Gln Thr Trp 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Thr Leu Asp Trp Leu Leu Gln Thr Pro Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Leu Phe Gly Asp Ile Tyr Leu Ala Ile 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ile Leu Asp Lys Val Leu Val His Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Lys Glu Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Lys Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys 1 5 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Phe Leu Glu Gly Asn Glu Val Gly Lys 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sapiens <400> 312 Glu Ser Val Ala Asn Gly Phe Thr Leu Ile Ser Asn Gln Arg 1 5 10 <210> 313 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Asn Gly His Ser Glu 1 5 <210> 314 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Asn Gly His Ser Glu Ser Leu Lys His Ile Val Ala Asn Ser Glu 1 5 10 15 <210> 315 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 315 cttgatcgga tcgtagctac g 21 <210> 316 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 316 cttgaacgga tcgtagctac g 21 <210> 317 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Leu Asp Arg Ile Val Ala Thr 1 5 <210> 318 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 Leu Glu Arg Ile Val Ala Thr 1 5 <210> 319 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Ala Arg Tyr Met Ser Trp Glu Leu 1 5 10 <210> 320 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Glu Ser Val Ala Asn Gly Phe Thr Leu Ser Asn Gln Arg 1 5 10 <210> 321 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Met Pro Ile Glu Pro Gly Asp Ile Gly Tyr 1 5 10 <210> 322 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Met Pro Ile Glu Pro Gly Asp Ile Gly Cys 1 5 10 <210> 323 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Thr Pro Thr Val Pro Ser Gly Ser Phe 1 5 <210> 324 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 324 Thr Pro Thr Val Pro Ser Ser Ser Phe 1 5 <210> 325 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 325 Val Val Leu Ser Trp Ala Pro Pro Val 1 5 <210> 326 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 326 Gly Pro Gly Ile Lys Lys Thr Glu Arg Arg Ala Arg Ser Ser Pro Lys 1 5 10 15 Ser Asn Asp Ser Asp Leu Gln Glu Tyr Glu Leu Glu Val Lys Arg Val 20 25 30 Gln Asp Ile Leu Ser Gly Ile Glu Lys Pro Gln Val Ser Asn Ile Gln 35 40 45 Ala Arg Ala Val Val Leu Ser Trp Ala Pro Pro Val Gly Leu Ser Cys 50 55 60 Gly Pro His Ser Gly Leu Ser Phe Pro Tyr Ser Tyr Glu Val 65 70 75 <210> 327 <211> 78 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 327 Gly Pro Gly Ile Lys Lys Thr Glu Arg Arg Ala Arg Ser Ser Pro Lys 1 5 10 15 Ser Ser Asp Ser Asp Leu Gln Glu Tyr Glu Leu Glu Val Lys Arg Val 20 25 30 Gln Asp Ile Leu Ser Gly Ile Glu Lys Pro Gln Val Ser Asn Ile Gln 35 40 45 Ala Arg Ala Val Val Leu Ser Trp Ala Pro Pro Val Gly Leu Ser Cys 50 55 60 Gly Pro His Gly Gly Leu Ser Phe Pro Tyr Ser Tyr Glu Val 65 70 75 <210> 328 <211> 80 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 328 Ala Pro Gly Val Lys Lys Pro Glu Arg Arg Ala Arg Ser Ser Pro Lys 1 5 10 15 Ser Thr Glu Gln Glu Pro His Glu Tyr Asp Ser Glu Thr Lys Arg Val 20 25 30 Gln Asp Ile Leu Ser Gly Met Glu Lys Pro Gln Val Thr Asn Ile Gln 35 40 45 Ala Arg Thr Val Leu Leu Ser Trp Ser Pro Pro Ala Gly Leu Leu Asn 50 55 60 Thr Asp Arg His Asn Asn Gly Leu Pro Tyr Ala Cys Thr Tyr Glu Val 65 70 75 80 <210> 329 <211> 76 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 329 Lys Lys Pro Thr Arg Gly Ala Arg Ser Ser Pro Arg Ser Ser Glu Pro 1 5 10 15 Glu Leu Gln Asp His Asp Ser Glu Ala Lys Arg Val Gln Asp Val Leu 20 25 30 Ser Gly Met Glu Lys Pro Gln Val Leu Asn Ile Gln Ser Arg Thr Ala 35 40 45 Arg Leu Thr Trp Ala Pro Pro Ala Gly Leu Gln Asn Arg Glu Arg His 50 55 60 Ser Asn Gly 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10 15 Lys Gly Thr Arg Ser Tyr Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Tyr Ser Cys 20 25 30 Asn Gln Glu Ala Asp Glu Glu His Ser Lys Ala Ser Ser Asp Lys Arg 35 40 45 Phe His Ser Asp Ser Gln Thr Gln Ala Phe Arg Thr Lys Glu Leu Leu 50 55 60 Glu Pro Ser Leu Gln His Val Val Pro Leu Tyr Arg 65 70 75 <210> 333 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Leu Pro Phe Pro Lys Asp Ala Ser Leu Asn Lys Cys Ser Phe Leu His 1 5 10 15 Pro Glu Pro Val Val Gly Ser Lys Met His Lys Met Pro Asp Leu Phe 20 25 30 Ile Ile Gly Ser Gly Glu Ala Met Leu Gln Leu Ile Pro Pro Phe Gln 35 40 45 Cys Arg Arg His Cys Gln Ser Val Ala Met Pro Ile Glu Pro Gly Asp 50 55 60 Ile Gly Tyr Val Asp Thr Thr His Trp Lys Val Tyr Val Ile 65 70 75 <210> 334 <211> 78 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 334 Leu Pro Phe Pro Lys Asp Ser Ser Leu Asn Lys Cys Phe Leu Ile Gln 1 5 10 15 Pro Glu Pro Val Val Gly Ser Lys Met His Lys Val His Asp Leu Phe 20 25 30 Thr Leu Gly Ser Gly Glu Ala Met Leu Gln Leu Ile Pro Pro Phe Gln 35 40 45 Cys Arg Thr His Cys Gln 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Claims (50)

  1. 하기를 포함하는, 신생물(neoplasia)을 갖는 것으로 진단된 대상체를 위한 대상체-특이적 신생물 백신의 제조 방법:
    (a) 신생물에서 미스센스 또는 neoORF 돌연변이를 포함하는 복수의 서열을 확인하는 단계로서, 각각의 서열은 하기 순위 기준 (ⅰ)-(ⅴ) 중 하나에 해당하는 것인 단계;
    (b) 우선 순위가 감소하는 순서로, 미스센스 또는 neoORF 돌연변이를 포함하는 복수의 서열에 의해 인코딩되는 신생-항원 돌연변이를 포함하는 신생-항원 폴리펩티드의 순위를 정하는 단계로서, 상기 순서는 하기를 포함하는 단계:
    (ⅰ) neoORF 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩되는, 대상체의 HLA 에 500 nM 이하의 Kd 로 결합하는 neoORF 폴리펩티드,
    (ⅱ) 미스센스 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩되는, 대상체의 HLA 에 150 nM 이하의 Kd 로 결합하는 폴리펩티드, 여기서 고유 동족 단백질은 1000 nM 이상의 Kd 를 가짐,
    (ⅲ) 미스센스 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩되는, 대상체의 HLA 에 150 nM 이하의 Kd 로 결합하는 폴리펩티드, 여기서 고유 동족 단백질은 150 nM 이하의 Kd 를 가짐,
    (ⅳ) neoORF 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩되는, 대상체의 HLA 에 500 nM 초과의 Kd 로 결합하는 neoORF 폴리펩티드,
    (ⅴ) 미스센스 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩되는, 대상체의 HLA 에 150 nM 초과 내지 500 nM 이하의 Kd 로 결합하는 폴리펩티드, 여기서 고유 동족 단백질은 150 nM 초과 내지 500 nM 이하의 Kd 를 가짐; 및
    (c) (A) 상기 순위에 근거한, 미스센스 또는 neoORF 돌연변이를 포함하는 복수의 서열에 의해 인코딩되는 5 개의 상위 순위 신생-항원 폴리펩티드 중 2 개 이상 또는 (B) (A) 의 5 개의 상위 순위 신생-항원 폴리펩티드 중 2 개 이상을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대상체-특이적 신생물 백신을 생성하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 신생물에서 미스센스 또는 neoORF 돌연변이를 포함하는 복수의 서열을 확인하는 단계가 하기를 포함하는, 방법:
    신생물의 게놈, 전사체(transcriptome) 또는 프로테옴(proteome)을 시퀀싱(sequencing)하는 단계.
  3. 제 1 항에 있어서, 대상체-특이적 신생물 백신이, 미스센스 또는 neoORF 돌연변이를 포함하는 복수의 서열에 의해 인코딩되는 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드 또는 상기 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 대상체-특이적 신생물 백신이, 미스센스 또는 neoORF 돌연변이를 포함하는 복수의 서열에 의해 인코딩되는 20 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드 또는 상기 20 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 대상체-특이적 신생물 백신이, (A) 의 5 개의 상위 순위 신생-항원 폴리펩티드 중 2 개 이상을 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 대상체-특이적 신생물 백신이, (A) 의 5 개의 상위 순위 신생-항원 폴리펩티드 중 2 개 이상을 인코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드는 길이가 5 내지 50 개 아미노산 범위인, 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드는 길이가 15 내지 35 개 아미노산 범위인, 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드는 길이가 18 내지 30 개 아미노산 범위인, 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드는 길이가 6 내지 15 개 아미노산 범위인, 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 10 개 이상의 신생-항원 폴리펩티드는 길이가 15 내지 25 개 아미노산 범위인, 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 대상체-특이적 신생물 백신이 애쥬번트(adjuvant)를 더 포함하는, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 애쥬번트가 폴리-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스®(Amplivax®), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM®, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod), ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX®, Juvlmmune, LipoVac, MF59®, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드® (Montanide®) IMS 1312, 몬타나이드® ISA 206, 몬타나이드® ISA 50V, 몬타나이드® ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK®, PepTel®, 벡터 시스템, PLGA 마이크로입자, 레시퀴모드(resiquimod), SRL172, 비로좀(Virosome) 및 기타 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 아퀼라스QS21 스티물론® (Aquila's QS21 stimulon®), 바디메잔(vadimezan) 및 AsA404(DMXAA)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 애쥬번트가 폴리-ICLC 인 방법.
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