KR20210039376A

KR20210039376A - 개인 맞춤형 암 백신

Info

Publication number: KR20210039376A
Application number: KR1020217002150A
Authority: KR
Inventors: 우구르 사힌; 마티아스 보르메르; 토마스 부커
Original assignee: 비온테크 알엔에이 파마슈티컬스 게엠베하; 트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-04-09
Also published as: CA3106883A1; WO2020020894A1; MX2021000853A; JP2021532122A; CN112533630A; BR112021001288A2; BR112021001288A8; EP3826668A1; US20210290746A1; WO2020020444A1; AU2019312509A1

Abstract

본 발명은 종양 면역요법 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 환자의 종양 시료에서 환자의 하나 이상의 암 세포에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 대한 트랜스크립톰 분석을 기반으로 환자의 종양에 특이적인 개인 맞춤형 암 백신을 제공한다. 이러한 개인 맞춤형 암 백신은, 환자에게 투여시, 환자의 하나 이상의 암 세포에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 환자의 종양에서 발현된 종양-관련 항원에 대해, 면역 반응을 유도한다. 개인 맞춤형 암 백신은, RNA 전사체의 과도한 상향 조절로 인해, 개체에게 백신을 접종하고 개체에서 자기-단백질인 종양-관련 항원에 대한 자기-관용을 파괴하는데 효과적이다.

Description

개인 맞춤형 암 백신

본 발명은 종양 면역요법 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 환자의 종양 시료에서 환자의 하나 이상의 암 세포에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 대한 트랜스크립톰 분석에 기반한, 환자의 종양에 특이적인 개인 맞춤형 암 백신을 제공한다. 이러한 개인 맞춤형 암 백신은, 환자에게 투여시, 환자의 하나 이상의 암 세포에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 환자의 종양에서 발현된 종양-관련 항원에 대해 면역 반응을 유도한다. 개인 맞춤형 암 백신은, RNA 전사체의 과도한 상향 조절로 인해, 개체에 백신 접종하고, 개체에서 자기-단백질인 종양-관련 항원에 대한 자기-관용을 파괴하는데 효과적이다.

암은 전체 사망 사례의 1/4을 차지하는 주요 사망 요인이다. 암 치료는 전통적으로 어떤 방법이 가장 많은 수의 환자들에게 최상으로 작동하는지 - 평균의 법칙에 기반하고 있다. 그러나, 암의 분자 이질성으로 인해, 대개 치료받은 개체의 25% 미만만 승인된 요법이 효과적이다. 환자 맞춤 치료에 기반한 개인 맞춤형 의학은 약물 개발을 혁신하기 위한 저효율 및 고비용에 대한 잠재적인 해법으로 간주된다.

항원-특이적인 면역요법은 악성 질환을 제어하기 위해 환자에서 특이적인 면역 반응을 강화 또는 유도하는 것을 목표로 한다. 점점 더 많은 수의 병원체-관련 및 종양-관련 항원들이 식별됨에 따라 면역요법에 적합한 광범위한 표적 콜렉션을 확보하게 되었다. 이들 항원으로부터 유래되는 면역원성 펩타이드 (에피토프)가 존재하는 세포는 능동적인 또는 수동적인 면역화 전략에 의해 특이적으로 표적화할 수 있다. 능동 면역화는 환자에서 병에 걸린 세포를 특이적으로 인지하여 살상할 수 있는 항원-특이적인 T 세포를 유도하고 증폭시키는 경향을 나타낸다. 그에 반해, 수동적인 면역화는, 시험관내에서 증폭시킨 선택적으로 유전자 조작된 T 세포를 입양 전달 (입양 T 세포 요법; ACT)하는 것에 의존한다.

종양 백신은 능동 면역화를 통해 내인성 종양에 특이적인 면역 반응을 유도하는 것을 목표로 한다. 병에 걸린 세포 전체, 단백질, 펩타이드 또는 환자에게 전달한 후 DC 펄싱에 의해 생체내 또는 시험관내에서 직접 적용될 수 있는 면역화 벡터, 예를 들어 RNA, DNA 또는 바이러스 벡터를 비롯한, 여러가지 항원 형태들이 종양 백신 접종에 이용될 수 있다.

복수의 병원체-관련 항원 및 종양-관련 항원의 발굴은 항원-특이적인 면역요법의 개념의 토대를 제공하였다. 종양-관련 항원 (TAA)은 이의 유전자 불안정성으로 인해 종양 세포 상에 발현되는 드문 단백질로서, 정상 세포에서는 발현되지 않거나 또는 발현이 제한적이다. 이들 TAA는 면역 시스템에 의한 악성 세포의 특이적인 인지를 유발할 수 있다. 아울러, 암은 게놈 돌연변이와 후성적 변화의 누적으로부터 생길 수 있으며, 그 일부가 원인으로 작용할 수 있다. 종양-관련 항원 외에도, 인간 암은 평균적으로 100-120개의 비-동의적 돌연변이를 가지고 있으며, 이들 다수는 백신에 의한 표적화가 가능하다. 종양에서 95% 이상의 돌연변이는 독특하고, 환자 특이적이다. 종양 특이적인 T 세포 에피토프를 생성할 수 있는, 단백질 변형 유발성 체세포 돌연변이의 수는 30 내지 400개 범위이다. 돌연변이는 암 면역요법의 이상적인 표적으로 간주된다. 신생-에피토프는 임의의 건강한 조직에서 발현이 엄격하게 결여되어 있어, 안전할 것으로 예상되며, 중추적인 관용 기전을 우회할 수 있다. 본 발명자들은 최근 개별 돌연변이 범주를 표적화하는 개인 맞춤형 면역요법 방식을 제안한 바 있다 (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)).

면역치료 방식에 매력적인 표적 구조체들이 점점 증가하고 있음에도 불구하고, 면역요법에 적합한 에피토프를 정의하는 것은 도전 과제로 남아있다. 자기-단백질에 대해 면역 반응을 유도하기 위해서는 면역학적 자기-관용을 깨뜨려야 한다. 자기-단백질 또는 이의 펩타이드는 면역학적 관용으로 인해 면역원성이 매우 약하다.

이에, 암 환자에게 백신 접종하기 위한 표적 구조체가 요구되고 있다. 이러한 표적 구조체는 백신 접근 방식으로 이용될 경우 특히 자기-관용 기전을 극복하여야 한다.

본 발명자들은 다수의 종양들이 특징적인 RNA 전사체 패턴으로 정의된다는 것을 알게 되었다. 구체적으로, 특이적인 RNA 전사체가 특정 종양 및 개별 환자에서 고도로 상향 조절되는 것으로 확인되었다. 본 발명은, 개별 환자의 종양이, 타입이 동일한 및 상이한 건강한 정상 세포 및 조직에서는 발현되지 않거나 또는 현저하게 낮은 양으로 발현되는 RNA 전사체가 과도하게 상향 조절된, 특징적인 트랜스크립톰 패턴을 가진다는, 사실을 토대로 한다. 종양의 트랜스크립톰 패턴은 RNA 수준에서 종양 고유성을 구축하고, 대응되는 비-암성 조직 및 기타 비-암성 조직을 포함한 비-암성 조직과 구분할 수 있게 해준다. 이러한 고유한 트랜스크립톰 패턴으로, 종양 세포 및 종양 조직을 특이적으로 표적화하는 백신의 제조가 가능하게 되었다. 본 발명은, 이러한 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 종양-관련 항원에 기반한, 개인 맞춤형, 즉 환자-특이적인 암 백신을 제공하는 것에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서 제공되는 개인 맞춤형 암 백신은 이러한 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 아미노산 서열(들)로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 포함하거나 또는 이를 암호화한다. 본 발명은 환자의 종양 세포에서 과도하게 상향 조절되지만 그 환자의 비-종양 세포에서는 발현되지 않거나 또는 현저하게 적은 양으로 발현되는 RNA 전사체의 발현 산물을 면역치료학적으로 표적화하는 것을 목표로 한다. 예를 들어, 차세대 서열분석 (NGS)은 암성 세포에서 환자 특이적인 트랜스크립톰 프로파일을 신속하고 비용-효율적으로 식별할 수 있다.

암성 세포에서 과도하게 상향 조절된 전사체 종들을 식별하고, 환자의 암 세포에 대해 인가되는 적절한 T 세포를 자극, 감작 및/또는 증폭시키기 위해 폴리펩타이드를 적절하게 가공 처리하여 환자의 면역 시스템에 에피토프를 나열하기 위한 MHC 분자를 통해 에피토프를 제시한 다음 에피토프에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 목적으로, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA와 같은 핵산을 투여함으로써 과도하게 상향 조절된 전사체 종 하나 이상에 의해 암호화되는 아미노산 서열로부터 유래된 하나 이상의 에피토프를 환자에게 제공하는 것은, 환자의 암에 특이적인 새로운 전략을 제시해준다. 순환성 종양 세포 (CTC)에서 발견되는 트랜스크립톰 프로파일을 이용하여, 원발성 종양뿐 아니라 종양 전이를 잠재적으로 표적화하는 면역 반응을 유도하는 백신을 제공할 수 있다. 본 발명은, 다수의 환자들에 존재하는 표적이 될 수 있는 공통 분자의 분모를 찾는 대신, 개별 환자의 암 세포에 존재하는 특징적인 트랜스크립톰 프로파일을 이용한다.

일 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 개인 맞춤형 암 백신의 제조 방법에 관한 것이다:

(a) 암 환자의 종양 시료에 존재하는 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계로서, 하나 이상의 RNA 전사체는 각각 아미노산 서열을 암호화하고, 하나 이상의 RNA 전사체는 각각 사전 결정된 발현 역치를 초과하는 카피수로 종양 시료에 존재하는, 단계; 및

(b) 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열(들)로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 특징으로 하는 백신을 제공하는 단계.

일 구현예에서, 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계는 암 환자의 종양 시료에 존재하는 RNA 전사체의 카피수를 확인하고, 각 RNA 전사체의 카피수를 각각의 사전 결정된 발현 역치와 비교하는 것을 포함한다.

일 구현예에서, 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수는 비-종양 세포에 비해 10배 이상, 바람직하게는 1000배 이상 많다.

일 구현예에서, 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수는 적어도 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000 TPM (transcripts per million)이고, 비-종양 조직에서 RNA 전사체의 카피수는 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만이다.

일 구현예에서, 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계는 하나 이상의 암 세포에 대한 단일 세포 서열분석을 포함한다.

일 구현예에서, 암 세포는 순환성 종양 세포이다.

일 구현예에서, 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계는 차세대 서열분석 (NGS)의 사용을 수반한다.

일 구현예에서, 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계는 종양 시료의 RNA 서열분석 및/또는 종양 시료의 RNA로부터 수득된 DNA 라이브러리에 대한 서열분석을 포함한다.

일 구현예에서, 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계는 적어도 2세트로 반복된다.

일 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되는 에피토프의 암 백신 접종에 대한 유용성을 확인하는 단계를 더 포함한다.

일 구현예에서, 백신은 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.

일 구현예에서, 폴리펩타이드는 에피토프를 최대 30종 포함한다.

일 구현예에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되진 않지만 암 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 에피토프를 더 포함한다.

일 구현예에서, 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되지 않은 하나 이상의 에피토프는 암 특이적인 신생-에피토프이다.

일 구현예에서, 에피토프는 백신 서열을 구성하기 위해 이의 본래의 서열 상태로 존재한다.

일 구현예에서, 백신 서열은 아미노산 약 30개 길이이다.

일 구현예에서, 에피토프 및/또는 백신 서열은 머리에서 꼬리로 정렬된다.

일 구현예에서, 에피토프 및/또는 백신 서열은 링커에 의해 이격된다.

일 구현예에서, 에피토프 및/또는 백신 서열은 비-종양 조직에서와 동일한 아미노산 서열을 종양 시료에서 가진다.

일 구현예에서, 백신은 RNA 백신이다.

일 구현예에서, 백신은 예방학적 백신 및/또는 치료학적 백신이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 수득되는 개인 맞춤형 암 백신에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은, 암 환자의 종양 시료에서 RNA 전사체의 발현으로 생기는 에피토프를 포함하는 재조합 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하며, RNA 전사체가 미리 결정된 발현 역치를 초과하는 카피수로 종양 시료에 존재하는, 개인 맞춤형 암 백신에 관한 것이다.

일 구현예에서, 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수는, 비-종양 조직, 예를 들어 종양 시료와 동일한 및 상이한 조직 타입의 비-종양 조직보다 10배 이상, 바람직하게는 1000배 이상 높다.

일 구현예에서, 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수는 적어도 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000 TPM (transcripts per million)이고, 비-종양 조직에서 RNA 전사체의 카피수는 상기한 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만이다.

일 구현예에서, 폴리펩타이드는 RNA 전사체에 의해 암호화되진 않지만 암 세포에 의해 발현되는 에피토프를 더 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다:

(a) 본원에 기술된 방법에 의해 개인 맞춤형 암 백신을 제공하는 단계; 및

(b) 상기한 백신을 환자에게 투여하는 단계.

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 백신은 정맥내, 피부로, 근육으로 또는 피하로 투여된다.

일 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 이러한 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 등의 핵산을 포함하는 백신에 관한 것으로, 이러한 폴리펩타이드는 각각 암 환자의 종양 시료에서 과도하게 상향 조절된 하나 이상의 RNA 전사체로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 이러한 백신에 대한 바람직한 구현예는 본 발명의 방법과 관련해 상기에 기술된 바와 같다.

본 발명에 따라 제공되는 백신은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 보강제, 안정화제 등을 선택적으로 포함할 수 있다. 백신은 치료학적 백신 형태 또는 예방학적 백신 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따라 제공되는 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기 위한, 구체적으로 암 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 기술된 백신을 제공한다.

본원에 기술된 암 치료는 외과적 절제 및/또는 방사선 치료 및/또는 전통적인 화학요법과 병용될 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기에 상세히 기술된 설명 및 청구항으로부터 명확해질 것이다.

도 1: B16-F10 흑색종 세포주에서 차별적으로 발현되는 유전자들에 대한 예
흑색종 세포주 B16-F10 및 뮤라인 조직에서 선택 유전자들의 발현 수치 TPM (transcripts per million)을 3가지 유형으로 세분하였다: 정상 조직 (n=46), 생식 조직 (n=5) 및 배아 조직 (n=14). 조직 발현은 조직 당 전체 샘플의 중간값으로 나타낸다. 원 기호는 단일 조직의 중간값을 나타낸다. 중앙 선이 표시된 박스 기호는 모든 조직의 중간값을 나타내고, 박스 기호는 제일 사분위수 및 제3 사분위수를 나타내고, 위스커는 중간값으로부터 2.5배 사분위수 거리이다.
도 2: Tyrp1 RNA 백신에 대한 면역원성 검사
C57BL/6 마우스 (n=5 /그룹)에 리포플렉스로서 제형화된 Tyrp1 항원 암호화 RNA 40 ㎍ 또는 40 ㎍ 비-관련 RNA를 0일, 7일 및 14일 (시간대 참조)에 접종하여, 면역화하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장세포를 분리하고, 각각 MHC I 에피토프 (TAPDNLGYA) 및 MHC II 에피토프 (CRPGWRGAACNQKI)를 암호화하는 Tyrp1 펩타이드 2종에 대한 인지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. 개별 마우스 3세트에 대한 평균 스팟 개수 (점) 및 전체 마우스의 평균 (막대)을 좌측에 나타낸다. ELISpot 플레이트의 사진은 우측에 나타낸다. 각각의 열은 마우스 한 마리를 나타낸다.
도 3: Dct RNA 백신에 대한 면역원성 검사
C57BL/6 마우스 (n=5 /그룹)에 20 ㎍ Dct 암호화 RNA 리포플렉스 또는 NaCl (백신 접종 시점은 점선으로 표시)를 반복적으로 백신 접종하였다. 1차 백신 접종 후 5일, 12일, 19일, 26일 및 33일째에, Dct (SVYDFFVWL)에 대한 CD8⁺ T-세포 반응을 혈액에서 유세포 측정에 의해 MHC 테트라머 (MBL international) 염색을 통해 측정하였다. 전체 CD8+ 림프구들 중 테트라머⁺ CD8⁺ T 세포의 빈도를 나타낸다 (평균 ± 평균의 표준 오차).
도 4: Pmel RNA 백신에 대한 면역원성 검사
C57BL/6 마우스 (n=8 /그룹)에 20 ㎍ Pmel 암호화 RNA 리포플렉스를 시간선으로 나타낸 바와 같이 반복적으로 백신 접종하였다. 1차 백신 접종 후 27일째에, 마우스의 비장세포를 IFNγ ELISpot에 의해 Pmel 펩타이드 (EGSRNQDWL) 또는 비-관련 펩타이드 (VSV-NP, RGYVYQGL)로 탐침 분석하였다. 개별 마우스에 대한 3세트의 평균 스팟 개수 (점) 및 전체 마우스의 평균 (막대)을 나타낸다.
도 5: Fkbp6 RNA 백신에 대한 면역원성 검사
C57BL/6 마우스 (n=3 /그룹)에 20 ㎍ Fkbp6 암호화 RNA 리포플렉스를 시간선으로 나타낸 바와 같이 반복적으로 백신 접종하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장세포에서 Fkbp6 RNA 또는 비-관련 RNA (대조군)의 인지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. 마우스 풀 비장세포에 대한 2세트 (대조군) 또는 3세트 (Fkbp9)의 평균 스팟 수 + 표준 편차를 나타낸다.
도 6: 치료학적 Tyrp1 백신을 접종한 후 종양 제어
C57BL/6 마우스 (n=11-12 /그룹)에 B16-F10 종양 세포 3x10⁵개를 i.v.로 접종하였다. 시간선으로 나타낸 바와 같이 Tyrp1 또는 비-관련 대조군 RNA를 이용한 RNA 리포플렉스 백신 접종을 개시하였다. 마우스 당 폐 종양 결절의 개수 (좌), 예시적인 폐 무게 (중앙) 및 생존성 (우)을 도시한다.
도 7: 치료학적 Tyrp1 또는 Dct 백신을 접종한 후 종양 제어
루시퍼라제 형질전환 B16-F10 종양 세포 (B16-F10-LUC)를 3x10⁵개를 나이브 C57BL/6 마우스 (n=12 /그룹)에 i.v.로 주사하고, 시간선으로 나타낸 바와 같이 처리하였다. 루시퍼라제 발광에 의해 측정된 종양 증식 중간값 (좌), 마우스 당 폐 종양 결절 개수 (중앙, 평균 ± 평균의 표준 오차) 및 마우스 당 폐 무게 (우측, 평균 ± 평균의 표준 오차)를 도시한다.
도 8: CT26, MC38, TRAMP-C2 및 4T1 종양 모델에서 차별적으로 발현되는 유전자들의 예
마우스 종양 세포주 CT26 (A), MC38 (B), TRAMP-C2 (C) 및 4T1 (D)뿐 아니라 뮤라인 조직에서 선택 유전자의 TPM (transcripts per million)으로 나타낸 발현 수치를 3가지 유형으로 세분하였다: 정상 조직 (n=46), 생식 조직 (n=5) 및 배아 조직 (n=14). 조직 발현은 조직 당 전체 샘플의 중간값으로 나타낸다. 원 기호는 단일 조직 중간값을 나타낸다. 중앙 선이 표시된 박스 기호는 모든 조직의 중간값을 나타내고, 박스 기호는 제일 사분위수 및 제3 사분위수를 나타내고, 위스커는 중간값으로부터 2.5배 사분위수 거리이다.
도 9: CT26 종양 세포주에서 식별된 표적에 대한 면역원성 검사
BALB/c 마우스 (n=3 /그룹)에 20 ㎍ 항원 암호화 RNA 리포플렉스를 시간선으로 나타낸 바와 같이 반복적으로 백신 접종하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장세포를 대상으로 IFNγ ELISpot에 의해 항원 암호화 RNA 또는 비-관련 RNA (대조군)가 전기천공에 의해 도입된 BMDC를 인지하는 지를 검사하였다. 마우스 풀 비장세포 3세트에 대한 평균 스팟 개수 + 표준 편차를 도시한다.
도 10: MC38 종양 세포주에서 식별된 표적들에 대한 면역원성 검사
C57BL/6 마우스 (n=3 /그룹)에 시간선으로 나타낸 바와 같이 20 ㎍ 항원 암호화 RNA 리포플렉스를 반복적으로 백신 접종하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장세포를 대상으로, 항원 암호화 RNA 또는 비-관련 RNA (대조군)가 전기천공에 의해 도입된 BMDC를 인지하는 지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. 상단 그래프에는 마우스 풀 비장세포에서 3세트 (Gm14819, Rhox2h, Gm15091, Ash2l, Gm15097, Dppa4) 또는 2세트 (대조군)에 대한 평균 스팟 개수 + 표준 편차를 도시한다. 하단 그래프에는 개별 마우스 비장세포 3세트에서, 표적 Mageb2, Gm773, Prl2c2, Fmr1nb 및 Luzp4에 따른 평균 스팟 개수 + 표준 오차를 도시한다.
도 11: TRAMP-C2 종양 세포주에서 식별된 표적들에 대한 면역원성 검사
C57BL/6 마우스 (n=3 /그룹)에 시간선으로 나타낸 바와 같이 20 ㎍ 항원 암호화 RNA 리포플렉스를 반복적으로 백신 접종하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장세포를 대상으로, 항원 암호화 RNA 또는 비-관련 RNA (대조군)가 전기천공에 의해 도입된 BMDC를 인지하는 지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. 마우스 풀 비장세포에서 3세트 (항원) 또는 2세트(대조군)의 평균 스팟 개수 + 표준 편차를 도시한다.

본 발명은 아래에서 상세하게 설명되지만, 본원에 기술된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약은 변경될 수 있으므로, 본 발명의 내용은 이들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어는 구체적인 구현예를 기술할 목적일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 규정된다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.

바람직하게는, 사용되는 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 기술된 바와 같이 정의된다.

본 발명의 실시는, 달리 언급되지 않은 한, 본 기술 분야의 문헌에 기술된 통상적인 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기법의 방법들을 채택할 것이다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

이하, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이들 요소는 구체적인 구현예를 들어 기술되지만, 임의의 방식 및 임의의 수로 조합하여 추가적인 구현예를 구성할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 구현예들은 본 발명을 명시적으로 기술한 구현예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명시적으로 기술된 구현예들을 임의의 다수의 기술된 요소들과 조합하는 구현예들을 기술하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 언급된 모든 요소들의 임의 치환 및 조합은 문맥상 달리 언급되지 않은 한 이러한 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.

용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본 발명에 기술된 수치 값 또는 범위의 맥락에서, 일 구현예에서, 언급되거나 또는 청구된 수치 값 또는 범위의 ±20%, ±10%, ±5% 또는 ±3%임을 의미한다.

내용을 설명하는 문맥에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 정관사 및 부정관사 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 비슷한 표현들은, 본 발명에서 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않은 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명에서 수치 값들에 대한 범위 언급은 주로 범위에 속하는 각각의 개별 값들을 각각 기술하는 약칭 방식을 채택하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 언급되지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에 각각 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 발명에 기술된 모든 방법들은, 본원에서 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않은 한, 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예, "와 같은")의 사용은 주로 내용을 잘 예시하기 위한 것일 뿐, 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 명세서에서 어떤 표현도 본원을 실시하는데 필수적인 임의의 청구하지 않은 요소들을 기술하는 것으로 해석되어서는 안된다.

명확하게 달리 명시되지 않은 한, 용어 "포함하는"은 본 발명의 맥락에서 "포함하는"에 의해 열거되는 목록의 구성원들과 더불어 추가적인 구성원들이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 본 발명의 구체적인 구현예로서 용어 "포함하는"은 추가적인 구성원들이 존재하지 않을 가능성도 포함하는 것으로 고려되며, 즉 이러한 구현예의 목적에서는 "포함하는"은 "로 이루어진"의 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다.

몇가지 문헌들이 본 명세서의 전체 내용에서 인용된다. 본원에 인용된 전술한 또는 후술한 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등)은, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본원이 이러한 내용을 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안된다.

정의

이하, 본 발명의 모든 측면들에 적용되는 정의들을 제시한다. 후술한 용어들은 달리 언급되지 않은 한 하기한 의미를 가진다. 정의되지 않은 임의의 용어들은 당해 기술 분야에서 인지되는 의미를 가진다.

본 발명의 내용에서, 용어 "펩타이드"는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하며, 펩타이드 결합으로 서로 연결된 연속적인 아미노산을 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상에서 약 50개 이하, 약 100개 이하 또는 약 150개 이하로 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 큰 펩타이드, 특히 아미노산을 약 151개 이상으로 가진 특정 펩타이드를 지칭하지만, 본 발명에서 용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 통상적으로 동의어로 사용된다.

"핵산"은 본 발명에 따라 바람직하게는 데옥시리보뉴클레익산 (DNA) 또는 리포뉴클레익산 (RNA)이다.

본 발명에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, RNA는 대부분 또는 전부 리보뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 본원에서, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 하이드록시 기를 가진 뉴클레오티드를 의미한다. RNA는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어 부분 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합에 의해 제조된 RNA뿐 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결손, 치환 및/또는 변형에 의해 자연 생성 RNA과 상이한 변형된 RNA를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 변형은 내부 RNA 뉴클레오티드에 또는 RNA 말단(들)에 비-뉴클레오티드성 물질의 부가를 의미할 수 있다. 또한, 본원에서, RNA에서 뉴클레오티드는 화학적으로 합성한 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에서, 이러한 변형된 RNA는 자연 생성 RNA의 유사체로 간주된다.

본원의 특정 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 RNA 전사체를 의미하는 메신저 RNA (mRNA)이다. 당해 기술 분야에서 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 펩타이드 암호화 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 제조된다. 일 구현예에서, mRNA는, DNA가 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한 핵산인, DNA 주형을 이용한 시험관내 전사에 의해 제조된다.

본원에서, 용어 "RNA가 암호화한다"는, RNA가, 표적 조직의 세포 내와 같이 적절한 환경에 존재할 경우, 번역 과정 중에 아미노산을 조립해, 이것이 암호화하는 펩타이드 또는 단백질을 제조하게 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질의 번역을 가능하게 하는 세포 번역 기구와 상호작용할 수 있다. 세포는 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 세포 내에서 (예, 세포질 및/또는 핵 내에서) 생산할 수 있거나, 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 분비할 수 있거나, 또는 표면 상으로 생산할 수 있다.

미리 결정된 발현 역치와 같은 "기준"을 이용해, 종양 시료로부터 본 발명의 방법으로 수득한 결과들의 연관성을 확인하고 비교할 수 있다. 전형적으로, "기준"은 하나 이상의 정상 조직, 특히 종양 시료가 유래된 환자와는 다른 하나 이상의 개체, 바람직하게는 건강한 개체, 특히 동일 종의 개체에서 정상적으로 수득되는, 종양 또는 암 질환에 영향을 받지 않는 조직 (즉, 비-종양성 조직)에 기반하여, 입수할 수 있다. 비-종양성 조직은 전형적으로 종양 시료가 유래된 조직과는 다른 조직을 포함하며, 종양 시료가 유래된 조직과 동일한 조직을 포함할 수 있다.

본원에서 "감소한다" 또는 "저해한다"는, 수준 측면에서, 전반적인 감소, 예를 들어 약 5% 이상의 감소, 약 10% 이상의 감소, 약 20% 이상의 감소, 약 50% 이상의 감소 또는 약 75% 이상의 감소를 유발할 수 있음을 의미한다. 용어 "저해한다" 또는 비슷한 표현은 완전한 또는 본질적으로 완전한 저해, 즉 0 또는 본질적으로 0까지의 감소를 포함한다.

일 구현예에서, "증가한다" 또는 "강화한다"와 같은 용어는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 100%까지의 증가 또는 강화를 의미한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 제조되는" 것을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 "재조합 물체"는 자연적으로 생기지 않는다.

본원에서, 용어 "자연 생성"은 대상을 자연에서 발견할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, (바이러스를 비롯한) 유기체에 존재하며; 자연계에서 공급원으로부터 단리할 수 있으며; 실험실에서 사람에 의한 의도적인 변형을 거치지 않은, 펩타이드 또는 핵산은, 자연적으로 생성된 것이다. 용어 "자연에서 발견된다"는 것은 "자연에 존재한다"는 것을 의미하며, 공지된 물질뿐 아니라 자연으로부터 아직 발견되거나 및/또는 단리되지 않았지만, 천연 공급원으로부터 향후 발견 및/또는 단리될 수 있는 물질을 포함한다.

용어 "백만 당 전사체 수" 또는 "TPM"은 표준화된 RNA-seq 방법으로, "샘플에서 RNA 분자 1,000,000개 당, 이 유전자/전사체로부터 생기는 x"로 해석되어야 한다.

과도하게 상향 조절된 RNA 전사체

본 발명은 하기 단계들을 포함하는 개인 맞춤형 암 백신의 제조 방법에 관한 것이다:

(a) 암 환자의 종양 시료에 존재하는 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계로서, 하나 이상의 RNA 전사체는 각각 아미노산 서열을 암호화하고, 하나 이상의 RNA 전사체는 각각 사전 결정된 발현 역치를 초과하는 카피수로 종양 시료에 존재하는 단계; 및

본원에서, 용어 "발현 역치"는 RNA 전사체의 발현 수준과 관련있는 정량적인 한계/값, 즉 카피수를 지칭하며, 본원에 기술된 방법을 수행하기 위해 고려되어야 한다. RNA 전사체에 대한 발현 역치는 전형적으로 이러한 RNA 전사체의 특징이다. 전형적으로 (예를 들어, 종양 또는 암 조직에서) 발현 역치보다 낮은 발현 수준은 RNA 전사체의 과도한 상향 조절을 반영하는 것으로 간주되지 않으며, 구체적으로 건강한 조직에서 RNA 전사체의 (잠재적인) 발현을 반영하는 것으로 간주된다. 전형적으로, (예, 종양 또는 암 조직에서) 발현 역치보다 높은 발현 수준은 RNA 전사체의 과도한 상향 조절을 반영하는 것으로 간주되며, 특히 건강한 조직에서 RNA 전사체의 (잠재적인) 발현을 반영하는 것으로는 간주되지 않는다. 따라서, 용어 "발현 역치"는, 이보다 높은 수준에서는 RNA 전사체가 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 특징으로 하는 백신을 제공하는데 적합한 것으로 간주되는, RNA 전사체의 발현 수준을 의미한다. 발현 역치는 전형적으로 건강한 조직에서 RNA 전사체의 발현이 이러한 역치를 초과하는 수준에서 예상되지 않도록 선택된다. 오히려, 발현 역치는 전형적으로 건강한 개체에서 RNA 전사체의 발현이 이러한 역치보다 훨씬 낮도록 선택된다. 암 조직 (예, 종양 시료)과 같은 병에 걸린 조직에서 발현 역치를 초과하는 RNA 전사체의 발현 수준이, 전형적으로, RNA 전사체가 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 특징으로 하는 백신을 제공하는데 적합하다는 것을 의미한다. 발현 역치는, 전형적으로, (건강한) 조직 코호트, 바람직하게는 여러가지 조직 타입들의 조직들, 선택적으로 서로 다른 개체들의 조직, 바람직하게는 동일 종의 개체로부터 RNA 전사체의 발현 수준과 관련한 정보를 입수하고, RNA 전사체의 발현 수준과 관련하여 입수한 정보를 고려하여 역치를 규정함으로써, 결정된다. 이러한 조직 코호트는 10종 이상, 예를 들어 100종 이상의 여러가지 조직 타입들을 포함할 수 있다. RNA 전사체의 발현 수준과 관련한 정보는, 예를 들어 서열 판독 아카이브 (SRA) 등의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 발현 역치는, 전형적으로, RNA 전사체가 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 유래되는 하나 이상의 에티토프를 특징으로 하는 백신을 제공하는데 적합하다는 효능 및/또는 안전성 측면에서, 유용한 예측을 달성하도록 계산된다. 전형적으로, 발현 역치는 건강한 조직에서 RNA 전사체에 대해 결정된 최고 발현 수준보다 충분히 높으며, 안전성 한계, 예를 들어 건강한 조직에서 RNA 전사체에 대해 결정된 (예, 최고 또는 중간값) 발현 수준의 특정 증배 계수를 포함한다. 이러한 안전 계수는, 예를 들어, 건강한 조직에서의 발현 수준보다 10배, 100배 또는 1000배 높을 수 있다. 발현 역치는, 바람직하게는, 다수의 RNA 전사체, 특히 암호화 전사체, 예를 들어 RNA 전사체 100개 이상, 1000개 이상 또는 10000개 이상에 대해 본원에 기술된 방법에서 이용가능하다. 전형적으로, 이러한 발현 역치는 미리 결정된 값이며, 여기서 용어 "미리 결정된" 또는 "사전 정의된"은 종양 시료에서 RNA 전사체의 발현 수준의 결정과 독립적인 고정된 값이며, 즉 종양 시료에서 RNA 전사체의 발현 수준을 결정할 때 결정하지 않으며, 종양 시료에서 결정된 RNA 전사체의 발현 수준과 비교할 값으로서 선택된다. 이에, 발현 역치는 개체에서 RNA 전사체의 발현 수준과 관련 있으며 이에 대한 정보를 제공해주는 정량적인 값이다. 본원에 기술된 방법에서, 개체의 비-종양 시료에서 RNA 전사체의 발현 수준은 결정하지 않아도 되며, 개체의 종양 시료에서 결정된 RNA 전사체의 발현 수준을 동일 개체의 비-종양 시료에서의 동일한 RNA 전사체의 발현 수준과 비교할 필요가 없다. 오히려, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 다수의 RNA 전사체 (예, RNA 전사체 10종 이상, 100종 이상, 1000종 이상 또는 10000종 이상)의 발현 수준을 개체의 종양 시료에서 결정하고, 이를 다수의 RNA 전사체 (예, RNA 전사체 100종 이상, 1000종 이상 또는 10000종 이상) 각각에 대해 미리 결정된 발현 수준과 비교한다. 즉, 본 발명의 방법은 다수의 RNA 전사체, 특히 암호화 전사체, 예를 들어 100종 이상, 1000종 이상 또는 10000종 이상의 RNA 전사체에 대한 발현 역치 정보를 포함하는 데이터베이스와 같은 데이터 콜렉션의 사용을 수반할 수 있다. 본 발명의 방법은, 발현의 비교 수준이 데이터 콜렉션에 포함된 각각의 발현 역치를 초과하는지의 여부를 확인하기 위해, 개체의 종양 시료에서 다수의 RNA 전사체 각각의 발현 수준을, 다수의 RNA 전사체에 대한 발현 역치 정보를 포함하는 데이터 콜렉션과 비교하는 것을, 수반할 수 있다. 발현 수준이 데이터 콜렉션에 포함된 각각의 발현 역치를 초과하는 RNA 전사체는, 백신을 제공하는데 적합한 것으로 또는 잠재적으로 적합한 것으로 간주할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은, 백신을 제공하기에 적합하거나 또는 잠재적으로 적합한 것으로 간주되는 RNA 전사체가 충분한 개수로 확보될 때까지, 시간에 걸쳐 수행할 수 있다. 그 지점에 도달하면, 방법을 중단할 수 있다.

용어 "과도하게 상향 조절된 RNA 전사체", "미리 결정된 발현 역치를 초과하는 카피수로 종양 시료에 존재하는 RNA 전사체" 또는 비슷한 표현은, 비-종양 조직과 비교해 종양 시료에서 발현 또는 존재가 강하게 증가된 RNA에 대한 것이다. 다양한 구현예들에서, RNA의 존재 또는 발현은 비-종양 조직에서의 존재 또는 발현과 비교해 10배 이상, 100배 이상, 10³배 이상, 10⁴배 이상, 10⁵배 이상 또는 심지어 이보다 더 높다. 본 발명에 따라 RNA 전사체는 심장, 뇌 등과 같은 주요 장기 및/또는 흉선에서 발현되지 않거나 또는 소량으로만 발현되는 것이 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계들을 포함한다:

i) 암 환자로부터 종양 시료를 제공하는 단계;

ii) 종양 시료에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 단계;

iii) 단계 (ii)에서 결정된 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체 하나 이상에 의해 암호화되는 아미노산 서열(들)로 된 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 설계하는 단계;

iv) 단계 (iii)에서 설계된 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 바람직하게는 RNA를 제공하는 단계; 및

v) 단계 (iv)에서 제공된 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함하는 백신을 제공하는 단계.

본 발명에서, "종양 시료"는, 혈액과 같은 체액 등의, 순환성 종양 세포 (CTC), 특히 조직 샘플 및/또는 세포 샘플과 같은 종양 또는 암 세포를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 환자로부터 유래되는 신체 샘플과 같은 샘플이며, 이는 종양 조직으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 종양 시료는 순환성 종양 세포 (CTC)와 같은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암 세포, 또는 순환성 종양 세포 (CTC)와 같은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암 세포를 함유한 샘플을 의미한다.

본 발명에서, "비-종양 조직"은 종양 또는 암에 의해 영향을 받지 않으며 순환성 종양 세포 (CTC)와 같은 종양 또는 암 세포를 함유하지 않는 조직이다.

신체 샘플은 펀치 생검 (punch biopsy)과 같은 조직 생검에 의해, 그리고 혈액, 기관지 흡입물, 객담, 뇨, 변 또는 기타 신체 체액을 수집함으로써와 같이, 통상적인 방식으로 수득할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "샘플"은 또한 생물학적 샘플의 분획 또는 분리물, 예를 들어 핵산 또는 세포 분리물과 같은 가공 처리된 샘플을 포함한다.

본 발명은 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체들을 모두 식별하는 것을 수반할 수 있거나, 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체의 일부만 식별하는 것을 수반할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 다수의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하여, 백신에 포함시킬 충분한 수의 에피토프를 제공해준다.

본 발명의 맥락에서, 트랜스크립톰은, 세포, 세포 집단, 바람직하게는 암 세포 집단, 또는 소정의 개체의 모든 세포들에서 특정 시점에 만들어지는, mRNA, rRNA, tRNA 및 기타 비-암호화 RNA를 포함한, 모든 RNA 분자 세트를 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 암 세포의 트랜스크립톰, 바람직하게는 전체 트랜스크립톰의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 암 환자의 종양 시료에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 단계는 트랜스크립톰-와이드 과도하게 상향 조절된 RNA 트랜스크립톰 프로파일을 식별하는 것을 포함한다.

트랜스크립톰은 지정된 세포 또는 세포 집단에서 발견되는 RNA 분자만 포함한다는 점에서 엑소좀과 상이하며, 또한 이의 분자 정체와 더불어 각 RNA 분자의 양 또는 농도를 포함할 수도 있다. 주어진 세포주에서 대체적으로 고정된 게놈과는 다르게 (돌연변이 제외), 트랜스크립톰은 외부 환경적인 조건에 따라 달라질 수 있다.

일 구현예에서, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 단계는 암 세포 하나 이상, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그보다 많은 수에 대한 단일 세포 서열분석을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 암 세포의 트랜스크립톰 시그니처를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 암 세포는 순환성 종양 세포이다. 순환성 종양 세포와 같은 암 세포는 단일 세포 서열분석을 수행하기 전에 단리할 수 있다.

일 구현예에서, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 단계는 차세대 서열분석 (NGS)의 사용을 수반한다.

일 구현예에서, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 단계는 종양 시료에 대한 RNA 서열분석을 포함한다.

과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 발굴하기 위해, 종양 시료부터 수득한 RNA 전사체의 특성 및 수준에 관한 정보를 미리 결정된 발현 역치와 비교한다. 이러한 발현 역치는 전형적으로 정상적인 비-암성 세포 또는 조직에서의 이의 발현 수준을 기반으로 RNA 전사체에 대해 정해진다. 일 구현예에서, 해당 정보는 데이터베이스로부터 수득한다. 일 구현예에서, 해당 정보는 조직 타입 2종 이상, 예를 들어 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 50 또는 적어도 100종의 비-종양 조직 (및 이들 각각의 RNA 발현 수준)을 포함한다. 일 구현예에서, 해당 정보는 이용가능한 모든 조직 타입들의 비-종양 조직 (및 이의 각각의 RNA 발현 수준), 예를 들어 데이터베이스에서 RNA 발현 수준을 이용가능한 모든 조직 타입들의 비-종양 조직을 포함한다. 일 구현예에서, 해당 정보는 비-종양 조직 (및 이의 각각의 RNA 발현 수준)을 포함하며, 즉 하나 이상의 주요 장기, 예를 들어 하나 이상의, 바람직하게는 모든 폐, 심장, 뇌, CNS, 신장 및 간의 비-종양 조직을 포함한다. 일 구현예에서, 상기한 하나 이상의, 바람직하게는 모든 주요 장기들의 비-종양 조직에서와 비교해, 종양 시료에서 RNA 전사체의 과도한 상향 조절은 필수적이며, 바람직하게는 이러한 주요 장기들의 비-종양 시료에서 RNA 전사체는 발현되지 않거나 또는 현저하게 발현되지 않는다. 일 구현예에서, 해당 정보는 하나 이상의 생식 장기, 예를 들어, 고환, 난소 및 태반의 비-종양 조직 (및 이의 각각의 RNA 발현 수준) 중 하나 이상, 바람직하게는 이들 전체는 제외한다. 일 구현예에서, 이러한 생식 장기들 중 하나 이상에 대한, 바람직하게는 이들 모두에 대한 비-종양 조직과 비교해, 종양 시료에서 RNA 전사체가 과도하게 상향 조절되어야 하는 것은 아니다.

임의의 적합한 방법을 사용해, 암 환자의 종양 시료에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 결정할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 부분 또는 완전한 트랜스크립톰 프로파일, 즉 암 환자의 종양 세포 또는 종양 조직의 하나 이상의 전사체의 상대적인 양 또는 절대적인 양을 확인하는 것을 포함한다. 이후, 이러한 트랜스크립톰에서 조절 이상 (dysregulated) 또는 과도하게 상향 조절된 RNA 종을 평가한다.

(발현 프로파일 규명, 스플라이스 변이체 분석 등을 포함한) 전사체학 연구는 소정의 세포 집단에서 전사체의 발현 수준, 흔히 mRNA를 집중적으로 조사하지만, 때때로 tRNA, sRNA와 같은 기타 물질을 포함한다.

전사체학 기술은 유기체의 트랜스크립톰, 즉 이의 모든 RNA 전사체들을 연구하는데 사용되는 기법이다. 유기체에 대한 정보 내용은 게놈의 DNA에 기록되며, 전사를 통해 발현된다. 여기서, mRNA는 정보 네트워크에서 일시적인 중간 분자로서 제공되며, 비-암호화 RNA는 부가적인 다양한 기능들을 수행한다. 트랜스크립톰은 세포에 존재하는 전체 전사체를 시간에 맞춰 스냅 사진으로 촬영한다. 전체 트랜스크립톰을 연구하고자 하는 1차 시도는 1990년대 초반에 시작되었으며, 1990년대 후반 이후로 기술적으로 발전하여 전사체학이 널리 보급되었다. 이러한 분야에서 주요한 현대적인 기술은 2가지이다: 미리 결정된 서열 세트를 정량하는 마이크로어레이, 및 서열들을 모두 포획하기 위한 고-처리율 서열분석을 이용하는 RNA-Seq. 또한, 전사는 단일-세포 전사체학에 의해 개별 세포 수준에서 검사할 수 있다.

마이크로어레이

상보적인 프로브 어레이에 혼성화를 통해 지정된 전사체 세트의 존재율 (abundance)을 측정하는 마이크로어레이는 1995년에 최초로 발표되었다. 마이크로어레이 기술은 유전자 당 비용을 크게 절감하고 노동력을 절약하면서 수천개의 전사체를 동시에 분석할 수 있게 하였다. 올리고뉴클레오티드가 스팟팅된 어레이 및 Affymetrix 고-밀도 어레이는 둘다 2000년대 후반까지 전사 프로파일을 획수하기 위한 선택 방법이었다. 그동안, 모델 또는 경제적으로 중요한 유기체에서 공지된 유전자들을 포괄하기 위한 다양한 마이크로어레이들이 제작되었다. 어레이 설계 및 제조 측면에서 진전을 이루어 프로브 특이성이 개선되었으며, 더 많은 유전자를 단일 어레이에서 검사할 수 있게 되었다. 형광 검출의 발달로, 존재율이 낮은 전사체에 대한 측정 정확도 및 민감도가 강화되었다.

RNA- Seq

RNA-Seq는 전사체 cDNA의 서열분석을 의미하며, 이때 존재율은 각 전사체 개수 값으로부터 나온다. 고-처리율 서열분석 기법의 개발이 이 기법에 상당한 영향을 미쳤다. 대규모 병렬 시그니처 서열분석 (MPSS, Massively Parallel Signature Sequencing)은 복잡한 일련의 혼성화를 통해 16-20 bp 서열을 제조하는 것에 기반하는 초기 예로서, 2004년에 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)에서 유전자 십만개의 발현을 검증하는데 사용되었다. 가장 초기 RNA-Seq 작업은 2006년에 발표되었으며, 454 기술을 이용해 전사체 십만개를 서열분석하였다. 이는, 전사체의 상대적인 존재율을 정량하기에 충분한 범위를 포괄한다. RNA-Seq는 새로운 Solexa/Illumina 기술이 전사체 서열 십억개를 분석할 수 있게 된 2008년 이후로 인기가 증가하기 시작하였다. 이러한 수율로, 이제 인간 트랜스크립톰을 정량 및 비교 가능해졌다.

공공 이용가능한 트랜스크립톰 데이터베이스

대부분의 유전자의 기능은 아직까지 밝혀지지 않았다. 트랜스크립톰 데이터베이스는 연구자들에서 유전자가 발현되는 모든 조직들의 목록을 제공할 수 있어, 이의 가능성 있는 기능에 대한 단서를 제공해준다. 예를 들어, 트랜스크립톰 데이터베이스에서 미공지 유전자의 발현 수준이 건강한 세포와 비교해 암 세포에서 현저하게 더 높은 것으로 확인된다면, 이 미공지 유전자는 세포 증식에 역할을 하는 것일 수 있다. 트랜스크립톰 데이터는 암성 세포에서 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하기 위한 관련 정보를 당해 기술 분야의 당업자에게 제공해준다.

국립 보건원 (NIH) 산하의 국립 인간 유전체 연구원 (NHGRI)은 전세계 연구자들을 대상으로 트랜스크립톰 자원을 구축하는 2가지 프로젝트, 포유류 유전자 수집 계획 및 마우스 트랜스크립톰 프로젝트에 참여하여 왔다. 포유류 유전자 수집 계획은 인간, 마우스 및 랫 mRNA 서열들에 대한 무료 공공 라이브러리를 구축하는 것으로, 본 발명의 맥락에서 적합한 데이터베이스로서 이용할 수 있다. 이 프로젝트는 NHGRI, 그리고 NIH의 또 다른 산하 기관인 국립 암 연구소 (NCI)가 주도하였다. 마우스 및 랫은 인간 생물학을 연구하기 위한 중요한 모델이다. 마우스 트랜스크립톰 프로젝트는 다수의 마우스 조직들에서 유전자 트랜스크립톰에 대한 무료 공공 데이터베이스를 구축하는 NIH로부터 지원을 받는 계획이며, 본 발명의 맥락에서 적합한 데이터베이스로서 이용할 수 있다. 이러한 조직-특이적인 유전자 발현 데이터는 마우스 게놈 지도로 작성되며, 국립 참조 트랜스크립톰 데이터베이스에서 검색가능한 형식으로 이용가능하다. 유전자형-조직 발현 프로젝트 (GTEx) 및 DNA 요소 백과사전 (ENCODE)과 같이 NIH 프로그램에서의 자원을 비롯해, 수종의 다른 트랜스크립톰 자원들도 있으며, 이들 모두 본 발명의 맥락에서 적합한 데이터베이스로서 이용할 수 있다. 이에, GTEx는 다양한 여러가지 조직들에서 인간 유전자 발현 목록을 생성하고 있다. ENCODE 연구자들은 트랜스크립톰 등의 게놈의 작동 영역을 파악하고 이해하는 것을 목표로 한다. 노바티스와 유럽 분자 생물학 연구소 둘다 충분히-확립된 유전자 데이터베이스를 가지고 있는데, 이들 모두 본 발명의 맥락에서 적합한 데이터베이스로서 이용할 수 있다.

다수의 유기체-특이적인 트랜스크립톰 데이터베이스들이 구축되어 있으며, 구분되는 세포 집단에서 차별적으로 발현되는 유전자를 식별하는데 도움이 될 수 있는 주석이 달려 있어, 이들 모두 본 발명의 맥락에서 적합한 데이터베이스로서 이용할 수 있다.

DNA 마이크로어레이 구 기법이 여전히 사용되고 있지만, 유기체에서 트랜스크립톰을 확인하기 위한 선택 방법으로 RNA-Seq가 부상하고 있다. 본 발명에서는, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하기 위해 바람직하게는 RNA-Seq를 이용한다.

본 발명에서는 임의의 적절한 서열분석 방법을 이용할 수 있으며, 차세대 서열분석 (NGS) 기술이 바람직하다. 3세대 서열분석 방법은 향후 NGS 기술을 대체해, 방법에서 서열분석 단계의 속도를 높일 수 있다. 명확하게 하기 위해, 용어 "차세대 서열분석" 또는 "NGS"는 본 발명의 맥락에서, 생거 화학법으로 알려진 "종래의" 서열분석 방법과는 대비되는, 전체 게놈을 작은 조각으로 분해하여 전체 게놈을 따라 동시에 무작위 방식으로 핵산 주형들을 판독하는, 모든 새로운 고-처리율 서열분석 기술을 지칭한다. 이러한 NGS 기술 (대규모 병렬 서열분석 기술이라고도 함)은 매우 짧은 시간 안에, 예를 들어 1-2주 안에, 바람직하게는 1-7일 안에, 가장 바람직하게는 24시간 미만에 전체 게놈, 엑솜, 트랜스크립톰 (게놈에서 전사된 서열 전체) 또는 메틸롬 (게놈에서 메틸화된 서열 전체)의 핵산 서열 정보를 전달할 수 있으며, 원칙적으로 단일 세포 서열분석 방식이 가능하다. 상업적으로 이용가능하거나 또는 문헌에 언급된 다중 NGS 플랫폼, 예를 들어 Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics . J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; 또는 Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658에 상세히 기술된 플랫폼을 본 발명의 맥락에서 이용할 수 있다. 이러한 NGS 기술/플랫폼에 대한 비-제한적인 예는 다음과 같다:

1) 예를 들어, Roche-associated company 454 Life Sciences (Branford, Connecticut)의 GS-FLX 454 Genome Sequencer™에서 구현되며, Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365에서 최초로 언급된, 파이로시퀀싱으로 알려진, 합성에 의한 서열분석 기술. 이 기술은, 에멀젼 PCR 증폭을 위해 PCR 반응물을 오일로 둘러싼 수성 마이셀로 왕성하게 볼텍싱함으로써 단일 가닥 DNA 결합성 비드를 캡슐화하는, 에멀젼 PCR을 사용한다. 파이로시퀀싱 공정에서, 뉴클레오티드가 병합되면서 포스페이트 분자로부터 방출되는 빛을, 중합효소가 DNA 가닥을 합성함에 따라 기록한다.

2) 가역적인 염료-종결인자에 기반하며, 예를 들어 Illumina/Solexa Genome Analyzer^TM 및 Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer^TM에서 구현되는, Solexa (now part of Illumina Inc., San Diego, California) 사에서 개발한 합성에 의한 서열분석 방식. 이 기술에서는, 뉴클레오티드 4종 모두 플로우-셀 채널내 올리고-프라이밍된 클러스터 단편들에 DNA 중합효소와 더불어 동시에 첨가한다. 브릿지 증폭은 형광 표지된 서열분석용 뉴클레오티드 4종 모두를 사용해 클러스터 가닥을 연장한다.

3) 예를 들어, Applied Biosystems (now Life Technologies Corporation, Carlsbad, California) 사의 SOLid^TM 플랫폼에서 구현되는, 라이게이션에 의한 서열분석 방식. 이 기술에서는, 길이가 고정된 모든 가능한 올리고뉴클레오티드들로 된 풀 (pool)은 서열분석된 위치를 따라 표지한다. 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 라이게이션한다; 서열을 매칭시키기 위해 DNA 리가제에 의해 선호적인 연결을 수행하여, 그 위치에서 뉴클레오티드의 신호 정보를 생성시킨다. 서열분석하기 전에 DNA를 에멀젼 PCR로 증폭한다. 동일한 DNA 분자 카피만 함유한 제조한 비드를 유리 슬라이드 상에 증착시킨다. 2번째 예로, Dover Systems (Salem, New Hampshire)의 Polonator^TM G.007 플랫폼은 무작위로 배열된 비드-기반의 에멀젼 PCR을 이용해 병렬 서열분석을 위해 DNA 단편들을 증폭하는, 라이게이션에 의한 서열분석 방식을 이용한다.

4) 예를 들어, Pacific Biosciences (Menlo Park, California)의 PacBio RS 시스템 또는 Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts)의 HeliScope^TM 플랫폼에서 구현되는, 단일-분자 서열분석 기술. 이 기술의 구별되는 특징은 단일 DNA 또는 RNA 분자를 증폭하지 않고 서열분석할 수 있다는 점으로, 단일-분자 실시간 (SMRT) DNA 서열분석으로 정의된다. 예를 들어, HeliScope는 각각의 뉴클레오티드 합성에 따라 직접 검출하기 위해 고 민감성 형광 검출 시스템을 이용한다. 형광 공명 에너지 전이 (FRET)에 기반한 비슷한 방식이 Visigen Biotechnology (Houston, Texas)에서 개발되었다. U.S. Genomics (GeneEngine^TM) 및 Genovoxx (AnyGene^TM) 사의 다른 형광-기반의 단일-분자 기법도 있다.

5) 예를 들어, 복제 중에 단일 가닥에서 중합효소 분자의 이동을 모니터링하기 위해 칩 상에 정렬된 다양한 나노구조체들을 이용하는, 단일-분자 서열분석의 나노-기술. 나노기술에 기반한 방식에 대한 비-제한적인 예로는 Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK) 사의 GridON^TM 플랫폼, Nabsys (Providence, Rhode Island) 사에서 개발된 혼성화-보조 나노-포어 서열분석 (HANS^TM) 및 조합 프로브-앵커 라이게이션 (cPAL^TM)으로 지칭되는 DNA 나노볼 (DNB) 기술을 이용한 전용 리가제-기반의 DNA 서열분석 플랫폼이 있다.

6) 예를 들어, LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) 및 Halcyon Molecular (Redwood City, California) 사에서 개발한, 전자 현미경에 기반한 단일-분자 서열분석 기술.

7) DNA 중합 중에 방출되는 수소 이온의 검출에 기반한 이온 반도체 서열분석. 예를 들어, 이온 토렌트 시스템 (San Francisco, California)은 미세 가공된 웰들로 이루어진 고-밀도 어레이를 사용해 대규모 병렬 방식으로 이러한 생화학적 공정을 수행한다. 각각의 웰에는 서로 다른 DNA 주형이 수용된다. 웰 아래는 이온-민감성 층이, 그 아래는 전용 이온 센서가 배치된다.

RNA 조제물을 NGS 출발 물질로 사용할 수 있다. 이러한 핵산은 생물학적 재료와 같은 샘플로부터, 예를 들어, 신선한, 급속-냉동된 또는 포르말린-고정된 파라핀 포매된 종양 조직 (FFPE)으로부터 또는 신선하게 단리된 세포로부터, 또는 환자의 말초혈에 존재하는 CTC로부터 쉽게 입수할 수 있다.

본 발명에서, 고-처리율 게놈-와이드 단일 세포 유전자형 분석법을 활용할 수 있다. 이러한 방식은 하기 단계들을 포함할 수 있다:

1. 소정의 환자로부터 종양 시료를 수득하는 단계.

2. 종양 세포에서 트랜스크립톰 (RNA)을 추출하고, 이를 cDNA로 변환한 다음 서열분석하여, 종양 세포에 의해 발현된 전사체의 양을 확인하는 단계.

3. 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체를 식별하는 단계.

백신

본원에 기술된 암 치료용 백신은 하나 이상의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열(들)로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 백신은 하나 이상의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 백신은 하나 이상의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 핵산, 특히 RNA를 포함한다.

이에, 백신 접종의 경우, 하나 이상의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체의 하나 이상의 에피토프는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 형태로, 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 특히 RNA 형태로 환자에게 제공된다. 이러한 폴리펩타이드는 단일 에피토프성 (monoepitopic)이거나 또는 다가 에피토프성 (polyepitopic)일 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩타이드는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 발현된 종양-관련 항원에 해당하거나, 또는 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체(들)에 의해 발현된 하나 이상의 종양-관련 항원(들)으로부터 유래된 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 핵산은 환자의 세포에서, 특히 항원 제시 세포에서 번역되어, 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 폴리펩타이드는 세포에 의해 적절하게 가공 처리된 후, MHC를 통해 에피토프를 제시하고, 적절한 T 세포를 자극하기 위해 환자의 면역 시스템에 제시된다.

본 발명에 따라 제공되는 백신은 환자에게 투여시, 바람직하게는 MHC 제시되는 에피토프 콜렉션, 예를 들어 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 그리고 바람직하게는 60개 이하, 55개 이하, 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하의 MHC 제시되는 에피토프를 제공하는 백신에 관한 것이며, MHC 제시되는 에피토프는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 유래된다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의해 이러한 에피토프가 제시되면, 바람직하게는 MHC에 결합되었을 때 T 세포가 에피토프를 표적으로 하게 되며, 따라서 MHC에 의해 제시된 에피토프가 유래된 항원을 발현하고 종양 세포의 표면에 동일한 에피토프를 제시하는 환자의 종양, 바람직하게는 원발성 종양뿐 아니라 종양 전이를 T 세포가 표적화하게 된다.

백신을 제공하기 위해, 본 발명의 방법은 하나 이상의 암 특이적으로 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 에피토프를 (바람직하게는 암호화하는 핵산 형태로) 충분한 개수로 백신에 임의로 포함시키는 것을 포함할 수 있거나, 또는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체 및/또는 에피토프에서 암 백신 접종에 대한 유용성을 확인하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 즉, 추가적인 단계들은 다음 중 하나 이상을 수반할 수 있다: (i) 예를 들어, 과도하게 상향 조절된 수준에 따라, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체의 우선 순위 또는 순위를 매기는 단계; 일반적으로, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체가 많을수록 백신을 제공하기에 더 적합함, (ii) 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열이 MHC에 의해 제시되는 것으로 공지된 또는 예상되는 에피토프를 포함하는 지를 확인하는 단계, (iii) 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열이 MHC를 통해 제시되는 에피토프를 포함하는 지를 시험관내 및/또는 인 실리코로 검사하는 단계, 예를 들어, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열이 MHC를 통해 제시되는 에피토프로 가공 처리되거나 및/또는 이와 같이 제시되는 서열을 포함하는 지를 검사하는 단계, 및 (iv) 예상되는 에피토프가, 특히 천연 서열 상황으로 존재하는 경우, 예를 들어 자연 생성 단백질에서 이들 에피토프 측면에 또한 존재하는 아미노산 서열이 측면에 존재하는 경우, 그리고 항원 제시 세포에서 발현되는 경우, 원하는 특이성을 가진 환자의 T 세포를 자극할 수 있는 지를 시험관내에서 검사하는 단계. 이러한 측면 서열은 각각 아미노산을 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 그리고 바람직하게는 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하로 포함할 수 있으며, 에피토프 서열에서 N-말단 및/또는 C-말단에 측면으로 위치할 수 있다.

잠재적으로 면역원성인 에피토프를 식별하는 단계는 이의 MHC-결합 능력, 바람직하게는 MHC 클래스-I 결합 능력의 예측 결과에 따라 에피토프를 결정하거나 및/또는 순위를 매기는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 식별되고 본 발명의 백신에 의해 제공되는 에피토프 콜렉션은, 바람직하게는, 이러한 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 형태로 (다가 에피토프성 폴리펩타이드 또는 다중 에피토프성 폴리펩타이드 (multiepitopic polypeptide)) 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 특히 RNA 형태로 제공된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 동일한 또는 상이한 종양-관련 항원들로부터 유래되는 에피토프를 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상으로 포함한다. 에피토프는 백신 서열의 형태로 폴리펩타이드에 존재할 수 있으며, 즉, 예를 들어 자연 생성 단백질에서 에피토프 측면에 위치한 아미노산 서열이 또한 측면에 존재하는 본래의 서열 상태로 존재할 수 있다. 이러한 측면 서열은 각각 아미노산을 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 그리고 바람직하게는 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하로 포함할 수 있으며, 에피토프 서열에서 N-말단으로 및/또는 C-말단으로 측면에 위치할 수 있다. 즉, 백신 서열은 아미노산을 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 그리고 바람직하게는 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프 및/또는 백신 서열은 폴리펩타이드 머리에서 꼬리로 정렬된다.

특히 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 다가 에피토프성 또는 다중 에피토프성 폴리펩타이드는 환자에게 핵산 형태로, 바람직하게는 시험관내 전사되거나 합성된 RNA와 같은 RNA 형태로 투여되며, 이는 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에서 발현되어 폴리펩타이드를 생산할 수 있다.

일 구현예에서, 에피토프 및/또는 백신 서열은 링커, 특히 중성 링커에 의해 이격된다. 본 발명에서, 용어 "링커"는 에피토프 또는 백신 서열과 같은 펩타이드 도메인 2종 사이에 삽입되어, 이들 펩타이드 도메인들을 연결하는 펩타이드를 지칭한다. 링커 서열은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 링커 서열은 이들 2종의 펩타이드 도메인 간에 입체 간섭을 낮추고, 원활하게 번역되게 하고, 에피토프의 가공 처리를 뒷받침하거나 또는 허용하는 것이 바람직하다. 아울러, 링커는 면역원성 서열 요소가 없거나 또는 거의 없어야 한다. 링커는, 바람직하게는, 원치않은 면역 반응을 야기할 수 있는, 인접한 에피토프들 간의 연결 접합 (junction suture)으로 생기는 것과 같은 비-내인성 에피토프를 만들지 않아야 한다. 따라서, 다가 에피토프성 백신은 바람직하게는 MHC에 결합하는 원치않은 접합 에피토프를 수적으로 줄일 수 있는 링커 서열을 포함하여야 한다. Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) 및 Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004)은, 글리신-풍부 서열이 프로테아좀 가공 처리를 손상시키며, 따라서 글리신 풍부 링커 서열의 사용이 프로테아좀에 의해 가공 처리될 수 있는 링커-함유 펩타이드를 수적으로 최소화하도록 작용함을, 입증하였다. 아울러, 글리신은 MHC 결합성 그루브 위치들에서 강력한 결합을 저해하는 것으로 관찰되었다 (Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993). Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005)은, 아미노산 서열에 포함된 아미노산 글리신과 세린이, 번역 및 프로테아좀에 의해 가공 처리에 더 효율적인 더 유연한 단백질을 형성시켜, 암호화된 에피토프에 더 잘 접근할 수 있게 만든다는 것을, 밝혔다. 링커 각각은 아미노산을 3개 이상, 6개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 그리고 바람직하게는 50개 이하, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하 또는 30개 이하로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커에는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 풍부하게 존재한다. 바람직하게는, 링커 아미노산들 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 글리신 및/또는 세린이다. 바람직한 일 구현예에서, 링커는 실질적으로 아미노산 글리신과 세린으로 구성된다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)_a(GSS)_b(GGG)_c(SSG)_d(GSG)_e을 포함하며, 여기서 a, b, c, d 및 e는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20으로부터 선택되는 숫자이고, 여기서 a + b + c + d + e는 0이 아니며, 바람직하게는 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상이다. 일 구현예에서, 링커는 서열 GGSGGGGSG를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명에서 식별되고 본 발명의 백신에 의해 제공되는 에피토프 콜렉션은, 바람직하게는, 여러가지 폴리펩타이드 상의 에피토프들을 포함하며, 이들 폴리펩타이드는 각각 또한 중첩성일 수 있는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 콜렉션 형태로 존재하거나, 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 특히 RNA 콜렉션 형태로 존재한다. 2 이상의 다가 에피토프성 폴리펩타이드 및/또는 다중 에피토프성 폴리펩타이드를 투여하는 경우, 여러가지 폴리펩타이드에 의해 제공되는 에피토프들은 서로 상이하거나 또는 일부 중첩성을 가질 수 있다.

본원에서, 폴리펩타이드는, 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에 존재하면, 가공 처리되어, 본 발명에서 식별된 에피토프를 형성한다. 본 발명에서 제공되는 백신의 투여는 MHC에 의해 제시된 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응을 유발할 수 있는 MHC 클래스 II-제시되는 에피토프를 제공할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명에서 제공되는 백신의 투여는 MHC에 의해 제시되는 에피토프가 유래되는 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8+ T 세포 반응을 유발할 수 있는 MHC 클래스 I-제시된 에피토프를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 제공되는 백신은 세포독성 T 세포 반응 및/또는 헬퍼 T 세포 반응을 다가 에피토프에 의해 자극하는데 유용하다.

백신 접종에 사용되는 본원에 기술된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 특히 RNA는, 바람직하게는, 폴리펩타이드 또는 핵산이 투여되는 개체에서 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭을 유발한다. 이러한 자극, 감작 및/또는 증폭된 T 세포는, 바람직하게는, 표적 항원, 특히 암 세포, 조직 및/또는 장기에 의해 발현된 표적 항원, 즉 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 발현된 종양-관련 항원을 겨냥하는 것이다. 따라서, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드는 종양-관련 항원 또는 이의 단편 (예, 에피토프 또는 백신 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 종양-관련 항원 또는 이의 단편의 변이체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 변이체는 종양-관련 항원 또는 단편과 면역학적으로 등가이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "종양-관련 항원 또는 그 단편의 변이체"는, 자극, 감작 및/도는 증폭된 T 세포가 종양-관련 항원, 특히 존재하는 경우 병에 걸린 세포, 조직 및/또는 장기를 표적으로 하는, T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭을 유발하는 서열을 의미한다. 따라서, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드는 종양-관련 항원에 해당하거나 또는 이를 포함할 수 있거나, 또는 종양-관련 항원의 단편에 해당하거나 또는 이를 포함할 수 있거나, 또는 종양-관련 항원 또는 이의 단편과 상동적인 아미노산 서열에 해당하거나 또는 이를 포함할 수 있다. 만일 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드가 종양-관련 항원의 단편 또는 종양-관련 항원의 단편에 상동적인 아미노산 서열을 포함한다면, 상기한 단편 또는 아미노산 서열은 종양-관련 항원의 T 세포 에피토프와 같은 에피토프 또는 종양-관련 항원의 T 세포 에피토프와 같은 에피토프에 상동적인 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 따라, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 종양-관련 항원의 면역원성 단편, 또는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 종양-관련 항원의 면역원성 단편에 상보적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에서, "항원의 면역원성 단편"은, 바람직하게는, MHC 분자와 관련되어 존재하는 경우에 T 세포를 자극, 감작 및/또는 증폭시킬 수 있는 항원의 단편을 의미한다. 바람직하게는, (종양-관련 항원과 비슷한) 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드는 T 세포에 의해 결합하기 위한 적절한 에피토프를 제공하도록 항원-제시 세포와 같은 세포에 의해 제시될 수 있다.

용어 "면역학적으로 등가"는, 면역학적으로 등가인 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 등가인 분자가, 동일한 또는 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내거나, 및/또는 동일한 또는 실질적으로 동일한 면역학적 효과를, 예를 들어 면역학적 효과의 유형 측면에서 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "면역학적 등가"는 바람직하게는 면역화를 위해 사용되는 항원 또는 항원 변이체의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열이, 참조 아미노산 서열에 결합하는 T 세포 또는 참조 아미노산 서열을 발현하는 세포와 같은 개체의 면역 시스템에 노출되었을 때, 참조 아미노산 서열과 반응하는 특이성을 가진 면역 반응을 유도한다면, 이 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 면역학적으로 등가인 것이다. 따라서, 항원과 면역학적으로 등가인 분자는, T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭과 관련하여 T 세포가 표적으로 하는 항원과 동일한 또는 본질적으로 동일한 특성을 나타내거나, 및/또는 동일한 또는 본질적으로 동일한 효과를 발휘한다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 백신은, (a) 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체(들)에 의해 암호화되는 하나 이상의 종양-관련 항원, 또는 (a) 종양-관련 항원(들)을 암호화하는, 하나 이상의 핵산, 특히 하나 이상의 RNA을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 백신은 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 2 이상의 종양-관련 항원, 또는 이러한 종양-관련 항원을 암호화하는 2 이상의 핵산, 특히 2 이상의 RNA를 포함한다. 다른 구현예에서, 2 이상은 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상을 포함한다. 2 이상의 종양-관련 항원 또는 핵산은 혼합물로 존재하거나, 또는 사로 각각 분리되어 백신 형태로 존재하여, 서로 분리하여, 예를 들어 서로 다른 시점에 및/또는 서로 다른 경로에 의해 환자에게 투여할 수 있다.

용어 "감작"은 T 세포가 특이적인 항원과 먼저 접촉해 작동자 T 세포로 분화 유발되는 과정을 의미한다.

용어 "클론 증폭" 또는 "증폭"은 특정 물질이 복제되는 과정을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 이 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되어 증식되고, 상기한 항원을 인지하는 특정 림프구가 증폭되는, 면역학적 반응 맥락으로 사용된다. 바람직하게는, 클론 증폭은 림프구의 분화로 이어진다.

과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 또한 "종양-관련 항원" 또는 "종양 항원"으로도 본원에서 언급된다. 일 구현예에서, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 암 조직과 건강한 조직 간에 아미노산 서열에 차이가 없는 "표준 항원"일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는, 개체의 종양에 특이적이고 면역 시스템에 의해 기존에 인지된 적 없는 "신생-항원"일 수 있다. 신생-항원 또는 신생-에피토프는 아미노산 변화를 야기하는 암 세포 게놈 내 하나 이상의 암-특이적인 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적에서, 표준 항원을 암호화하는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체 및 신생-항원을 암호화하는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체는 동일한 전사체로 간주되며, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체의 양 또는 카피수 둘다에 기여한다.

암 돌연변이는 각 개체에 따라 다양한다. 따라서, 새로운 에피토프 (신생-에피토프)를 암호화하는 암 돌연변이는 백신 조성물 및 면역요법을 개발하는데 매력적인 표적이 된다. 종양 면역요법의 효과는 숙주에서 강력한 면역 반응을 유도할 수 있는 암-특이적인 항원 및 에피토프의 선택에 따라 결정된다.

용어 "돌연변이"는 기준 서열과 비교해 핵산 서열의 변화 또는 차이 (뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결손)가 존재하는 것을 의미한다. "체세포 돌연변이"는 생식 세포 (정자 및 난자)를 제외한 신체의 임의 세포에서 발생할 수 있으며, 따라서 아이에게로 전달되지 않는다. 이러한 변형은 (항상 그런 것은 아니지만) 암 또는 기타 질환을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 비-동의 돌연변이 (non-synonymous mutation)이다. 용어 "비-동의 돌연변이"는 전사 산물에 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화를 야기하는 돌연변이, 바람직하게는 뉴클레오티드 치환을 의미한다.

본 발명에서, 용어 "돌연변이"는 점 돌연변이, Indel, 융합, 염색체 파괴 (chromothripsis) 및 RNA 편집을 포함한다.

본 발명에서, 용어 "Indel"은 삽입과 결손 및 뉴클레오티드의 순 획득 또는 순 상실이 동시에 발생하여 생기는 돌연변이로서 정의되는 특수 돌연변이를 지칭한다. 게놈의 암호화 영역에서, Indel의 길이가 3의 배수이지 않은 한, 프래임쉬프트 돌연변이가 발생한다. Indel은 점 돌연변이와 대비될 수 있는데, Indel은 서열에서 뉴클레오티드를 삽입 및 결손시키는 것이고, 점 돌연변이는 뉴클레오티드 하나를 대체하는 치환 형태이다.

융합은 기존에 분리된 유전자 2종으로부터 형성되는 하이브리드 유전자를 제조할 수 있다. 이는 전좌, 사이 결손 (interstitial deletion) 또는 염색체 역위의 결과로 발생할 수 있다. 종종, 융합 유전자는 발암 유전자이다. 발암성 융합 유전자들은 2개의 융합 파트너들로부터 새로운 또는 다른 기능을 가진 유전자 산물을 유발할 수 있다. 대안적으로, 원발암 유전자를 강력한 프로모터에 융합시켜, 따라서 발암 기능이 상류 융합 파트너의 강력한 프로모터에 의해 유발되는 상향 조절에 의해 작동되도록 설정한다. 발암성 융합 전사체는 또한 트랜스-스플라이싱 또는 번역초과 (read-through) 현상에 의해 유발될 수도 있다.

본 발명에서, 용어 "크로모트립시스"는 게놈의 특정 영역들이 한번의 강력한 사건을 통해 조각난 다음 다시 연결되는 유전자 현상을 지칭한다.

본 발명에서, 용어 "RNA 편집" 또는 "RNA 편집법"은 RNA 분자의 정보 내용이 염기 조립시 화학적 변화를 통해 변이되는 분자 공정을 지칭한다. RNA 편집법은 시티딘 (C)에서 우리딘 (U)으로, 아데노신 (A)에서 이노신 (I)으로의 탈아민화뿐 아니라 비-주형 뉴클레오티드 부가 및 삽입과 같은 뉴클레오티드 변형을 포함한다. mRNA에서 RNA 편집법은 게놈 DNA 서열에 의해 예측되는 것과는 상이하도록, 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 효과적으로 변형시킨다.

용어 "항원"은 면역 반응을 구축할 수 있는 에피토프를 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "항원"은 특히 단백질 및 펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 항원은 수지상 세포 또는 대식 세포와 같은 항원 제시 세포 등의 면역 시스템의 세포에 의해 제시된다. 항원 또는 T 세포 에피토프와 같이 이의 가공 산물에는, 일 구현예에서, T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체가 결합하거나, 또는 항원과 같은 면역글로불린 분자가 결합한다. 이에, 항원 또는 이의 가공 산물은 항체 또는 T-림프구 (T 세포)와 특이적으로 반응할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질환-관련 항원, 및 이러한 항원으로부터 유래되는 에피토프이다.

용어 "종양-관련 항원"은 광의적인 의미에서 종양 또는 암과 관련있는 임의의 항원을 지칭하기 위해 사용된다. 종양-관련 항원은 바람직하게는 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되며, 숙주의 면역 시스템을 자극해 종양 또는 암에 대한 항원-특이적인 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 발생시킬 에피토프를 함유한 분자일 수 있다. 따라서, 종양-관련 항원 또는 이의 에피토프는 치료학적 목적으로 사용할 수 있다.

용어 "에피토프"는 면역 시스템에 의해 인지되는 항원과 같은 분자의 일부분 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 T 세포, B 세포 또는 항체에 의해 인지될 수 있다. 항원의 에피토프는 항원의 연속적인 부분 또는 비-연속적인 부분을 포함할 수 있으며, 아미노산 약 5개 내지 약 100개, 예를 들어 약 5개 내지 약 50개, 더 바람직하게 약 8개 내지 약 30개, 가장 바람직하게는 약 10개 내지 약 25개 길이일 수 있으며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 아미노산 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이다. 용어 "에피토프"는 T 세포 에피토프를 포함한다.

본원에서, 용어 "신생-에피토프"는 정상적인 비-암성 세포 또는 생식 세포와 같은 참조 물질에는 존재하지 않지만 암 세포에서 발견되는 에피토프를 지칭한다. 이는, 특히, 정상적인 비-암성 세포 또는 생식 세포에서는 대응되는 에피토프가 발견되지만, 암 세포에서는 하나 이상의 돌연변이로 인해 에피토프의 서열이 변경되어 신생-에피토프가 만들어지는 경우를 포함한다.

용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 분자를 통해 제시되었을 때 T 세포에 의해 인지되는 단백질의 일부분 또는 단편을 지칭한다.

용어 "주 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 이는 모든 척추동물에 존재하는 유전자들의 복합체를 지칭한다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병에 걸린 세포 간의 신호전달에 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드 에피토프와 결합하여 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 인지되도록 이를 제시한다. MHC에 의해 암호화되는 단백질은 세포 표면 상에 발현되며, T 세포에 자기-항원 (세포 자체로부터 유래된 펩타이드 단편) 및 비-자기-항원 (예, 침입 미생물의 단편) 둘다를 제시한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우에, 결합성 펩타이드는 전형적으로 아미노산 약 8개 내지 약 10개 길이이지만, 더 길거나 또는 짧은 펩타이드도 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합성 펩타이드는 전형적으로 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이며, 구체적으로 아미노산 약 13개 내지 약 18개 길이이나, 더 긴 펩타이드 및 더 짧은 펩타이드도 효과적일 수 있다.

용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본 발명에서 상호 호환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포 (CTL, CD8+ T 세포)를 포괄한다. 용어 "항원-특이적인 T 세포" 또는 유사 용어는 T 세포가 표적으로 하는 항원을, 구체적으로 MHC 분자와 관련하여 암 세포와 같은 질병에 걸린 세포 또는 항원 제시 세포의 표면 상에 존재할 경우에, 인지하며, 바람직하게는 T 세포의 작동자 기능을 발휘하는, T 세포를 지칭한다. T 세포는, 세포가 항원을 발현하는 표적 세포를 살상한다면, 그 항원에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 다양한 임의의 표준 기법을 사용해, 예를 들어 크로뮴 방출 분석 또는 증식 분석으로 평가할 수 있다. 대안적으로, 림포카인 (예, 인터페론-γ)의 합성을 측정할 수 있다.

아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부를 의미하며, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 짧아진 아미노산 서열을 의미한다. C-말단에서 짧아진 단편 (N-말단 단편)은, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 3'-말단이 결핍된 절단형 (truncated) 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. N-말단 짧아진 단편 (C-말단 단편)은, 절단형 오픈 리딩 프래임이 번역 개시에 이용되는 개시 코돈을 포함하는 한, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 5'-말단이 결핍된 절단형 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. 아미노산 서열의 단편은, 예를 들어, 아미노산 서열의 아미노산 잔기들 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은, 바람직하게는, 아미노산 서열로부터 유래되는 연속적인 아미노산을 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개 포함한다.

본 발명의 목적에서, 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 스플라이스 변이체, 번역후 변형된 변이체, 입체구조 (conformation), 이소형 및 종 상동체 (species homolog), 특히 세포에 의해 천연적으로 발현되는 것을 모두 포함한다.

아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산이 삽입된 것을 포함한다. 삽입이 존재하는 아미노산 서열 변이체의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열에서 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입된다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수로 된 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다. 아미노산 결손 변이체는 서열에서 하나 이상의 아미노산의 제거, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 제거를 특징으로 한다. 결손은 단백질의 임의 위치에 존재할 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결손을 포함하는 아미노산 결손 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단형 변이체 (truncation variant)로도 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 하나 이상의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 특징으로 한다. 상동적인 단백질들 또는 펩타이드들 간에 비-보존된 아미노산 서열 위치에 변형이 존재하거나, 및/또는 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 펩타이드 및 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적인 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전 또는 비-하전된 아미노산의 치환이다. 보존적인 아미노산 변화는 측쇄가 비슷한 하나의 아미노산 계열 내에서의 치환을 수반한다. 자연 생성 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 나뉜다: 산성 아미노산 (아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성 아미노산 (알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비-하전된 극성 아미노산 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.

바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과, 주어진 아미노산 서열의 변이체의 아미노산 서열 간의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%의 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 아미노산 200개로 구성된다면, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개에 대해 제공된다. 바람직한 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 제공된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 공지된 도구를 사용해, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어, Align을 사용해, 표준 설정 조건으로, 바람직하게는 EMBOSS::needle, 매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 (Gap Open) 10.0, 갭 연장 (Gap Extend) 0.5 하에 수행할 수 있다.

"서열 유사성"은 보존적인 아미노산 치환이거나 또는 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 아미노산 서열 2종 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 %를 나타낸다.

용어 "동일성 %"는 최상으로 정렬하여 수득되는, 비교 서열 2종 간에 동일한 아미노산 잔기의 %를 나타내는 것으로 의도되며, 이 %는 순수하게 통계이며, 서열 2종 간의 차이는 전장에 걸쳐 무작위로 분포된다. 아미노산 서열 2종 간의 서열 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 이러한 비교는 국소 서열 유사성 영역을 식별 및 비교하기 위해 세그먼트 또는 "비교 창"에 의해 수행된다. 서열을 비교하기 위한 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색 방법을 이용하거나, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 사용해, 생성할 수 있다.

동일성 %는 서열 2종 간의 동일성 %를 구하기 위해 비교 중인 서열 2종 간에 동일한 위치의 수를 측정한 다음 이를 비교한 위치의 수로 나눈 후 그 결과에 100을 곱하여 계산한다.

상동적인 아미노산 서열은 본원에 따르면 아미노산 잔기들에 대해 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 가진다.

본 발명에 기술된 아미노산 서열 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결손을 가진 펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작 방법은 예를 들어 Sambrook et al. (1989)에 상세히 기술되어 있다. 또한, 본 발명에 기술된 펩타이드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어 고상 합성 및 유사 방법과 같이, 공지된 펩타이드 합성 기법을 보조적으로 사용해 쉽게 제조할 수 있다.

일 구현예에서, 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"라는 용어는 이것이 유래되는 아미노산 서열과 동일한 또는 비슷한 한가지 이상의 기능적 특성을 발휘하는 임의의 단편 또는 변이체라는 것을 의미하며, 즉 기능적 등가이다.

지정된 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)"로부터 유래되는" 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)은 제1 아미노산 서열의 기원을 참조한다. 바람직하게는, 특정 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편과 동일한, 본질적으로 동일한 또는 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 특정 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명에서 사용하기 적합한 에피토프는, 에피토프가 본래의 서열의 바람직한 활성을 유지하면서도 이것이 유래되는 자연 생성 또는 본래의 서열과 서열 차이를 가지도록 변형될 수 있음을, 이해할 것이다.

본원에 기술된 하나 이상의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA는, 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화된 종양-관련 항원으로부터 유래된 에피토프를 환자에게 전달하는데 이용할 수 있다. 비장에 상주하는 수지상 세포 (DC)는 에피토프를 RNA로 발현시키기 위한 특히 흥미로운 항원-제시 세포이다.

일 구현예에서, RNA는 시험관내에서 전사된 RNA (IVT-RNA)이며, 적절한 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 수득할 수 있다. 전사 조절 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사용 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고, 이를 시험관내 전사를 위해 적절한 벡터에 도입하여 수득할 수 있다. cDNA는 DNA를 역전사하여 수득할 수 있다.

일 구현예에서, RNA는 변형된 리보뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 예로는, 비-제한적으로, 5-메틸시티딘, 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m¹ψ) 또는 5-메틸-우리딘 (m⁵U) 등이 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 5'-캡을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 RNA는 캡이 없는 5'-트리포스페이트를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA의 5'-말단에서 발견되는 구조를 지칭하며, 이는 일반적으로 5' -> 5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 구현예에서, 구아노신은 7번 위치에서 메틸화된다. 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 가진 RNA는, 5'-캡을 RNA 가닥으로 공동 전사 발현하는 시험관내 전사에 의해 제공할 수 있거나, 또는 캡핑 효소를 이용하여 번역 후에 RNA에 부착하여 제공할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비-번역 영역" 또는 "UTR"은 DNA 분자에서 전사되지만 아미노산 서열로 번역되진 않는 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자에서 대응되는 영역을 지칭한다. 비-번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프래임의 5' (상류)에 존재할 수 있거나 (5'-UTR), 및/또는 오픈 리딩 프래임의 3' (하류)에 존재할 수 있다 (3'-UTR). 5'-UTR은, 존재할 경우, 5' 말단, 즉 단백질-암호화 영역의 개시 코돈의 상류에 위치한다. 5'-UTR은 (존재할 경우) 5'-캡의 하류이며, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접하게 존재한다. 3'-UTR은, 존재할 경우, 3' 말단, 즉 단백질-암호화 영역의 종결 코돈의 하류에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리 (A) 꼬리를 포함하진 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재할 경우) 폴리 (A) 서열의 상류이며, 예를 들어 폴리 (A) 서열에 바로 인접하게 존재한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다. 용어 "폴리(A) 서열"은 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치한 아데닐 (A) 잔기들로 구성된 서열을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 일 구현예에서, 폴리(A) 서열은 A 뉴클레오티드를 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 80개 또는 적어도 약 100개, 그리고 약 500개 이하, 약 400개 이하, 약 300개 이하, 약 200개 이하 또는 약 150개 이하로 포함하며, 특히 A 뉴클레오티드 약 120개를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 유전자 코드가 DNA 서열에서 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다. 이후 RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.

RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 mRNA 가닥이 아미노산 서열을 조립하여 펩타이드 또는 단백질을 만드는, 세포의 리보솜에서 이루어지는 과정을 지칭한다.

RNA-함유 입자

투여될 RNA는 RNA, 및 RNA와 조합하여 RNA 입자를 형성하는 하나 이상의 구성성분을 포함하는, 입자 안에 존재할 수 있다. RNA 입자는 RNA를 복합체 형태로 및/또는 캡슐화된 형태로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 입자는 바람직하게는 바이러스 입자, 특히 감염성 바이러스 입자가 아니며, 즉 이는 세포에 바이러스 감염시킬 수 없다. RNA-함유 입자는, 예를 들어, 단백질성 입자 (proteinaceous particle) 형태 또는 지질-함유 입자 형태일 수 있다. 적절한 단백질 또는 지질은 용어 "입자 형성 구성성분" 또는 "입자 형성제"에 포함된다. 용어 "입자 형성 구성성분" 또는 "입자 형성제"는 RNA와 조합하여 RNA 입자를 형성하는 임의 구성성분을 지칭한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체에 의해 형성된 구조화된 물질을 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "입자"는 미세 크기 또는 나노 크기의 구조, 예를 들어 미세 크기 또는 나노 크기의 조밀한 구조를 지칭한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 입자"는 RNA 입자를 함유한 입자를 지칭한다. 폴리머 및 지질과 같은 양으로 하전된 분자와 음으로 하전된 RNA 간의 정전기적 상호작용으로 복합체화가 이루어지고, RNA 입자가 자발적으로 만들어진다. 일 구현예에서, RNA 입자는 나노입자이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 일 구현예에서 "나노입자"는 정맥내 투여하기에 적합한 평균 직경을 가진 입자를 지칭한다.

지질, 폴리머 또는 양친성 물질이 RNA 입자 제형의 전형적인 구성인자이다.

단백질성 입자 및 지질-함유 입자는 RNA를 미립자 형태로 전달하는데 적합한 것으로 기존에 개시되었다 (예, Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60). 비-바이러스성 RNA 전달 비히클의 경우, RNA의 나노입자 캡슐화로 RNA를 분해로부터 물리적으로 보호하고, 구체적인 화학 특성에 따라 세포 흡수 및 엔도좀 탈출을 도울 수 있다. 더 높은 수준의 화학적 유연성을 감안해, 나노입자-기반의 전달에 통상적으로 사용되는 물질은 폴리머이다. 전형적으로, 양이온성 폴리머를 사용해, 음으로 하전된 RNA를 나노입자로 정전기적으로 압축한다. 이러한 양으로 하전된 기들은 엔도좀을 파괴하는 이온 불균형을 일으키는 것으로 간주되는, 대개 생리학적 pH에서 양성자화되는 아민 (pKa ~7.4)으로 구성된다. 폴리-L-라이신, 폴리아미도아민, 프로타민 및 폴리에틸렌이민과 같은 폴리머뿐 아니라 키토산과 같은 자연 생성 폴리머 모두 RNA 전달에 이용된 바 있다. 또한, 일부 연구자들은 핵산 전달용으로 폴리머를 특수 합성하였다. 특히, 폴리(β-아미노 에스테르)는 이의 용이한 합성 및 생분해성으로 인해 핵산 전달에 널리 사용되고 있다.

본원에서, "폴리머"는 일반적인 의미로 제공되며, 즉 공유 결합에 의해 연결된 하나 이상의 반복 단위 (모노머)를 포함하는 분자 구조를 의미한다. 이러한 반복 단위들은 모두 동일할 수 있거나, 또는 일부 경우에는 폴리머에 2가지 타입 이상의 반복 단위가 존재할 수 있다. 일부 경우에, 폴리머는 생물학적으로 유래된 것이며, 즉 단백질과 같은 바이오폴리머이다. 일부 경우에, 폴리머에 부가적인 모이어티가 존재할 수 있으며, 예를 들어 본원에 언급된 것과 같은 표적화 모이어티가 존재할 수 있다.

폴리머에 2가지 타입 이상의 반복 단위가 존재한다면, 이러한 폴리머는 "코폴리머"로 지칭된다. 폴리머가 사용되는 임의 구현예에서, 이용되는 폴리머는 일부 경우에 코폴리머일 수 있다. 코폴리머를 형성하는 반복 단위는 임의 방식으로 정렬될 수 있다. 예를 들어, 반복 단위는 무작위 순서로, 교대로 배치되는 순서로 또는 "블록" 코폴리머로서, 즉 각각 제1 반복 단위 (예, 제1 블록)를 포함하는 하나 이상의 영역과 각각 제2 반복 단위 (예, 제2 블록)을 포함하는 하나 이상의 영역 등을 포함하는 블록 코폴리머로서 정렬될 수 있다. 블록 코폴리머는 별개의 블록을 2개 (다이블록 코폴리머), 3개 (트리블록 코폴리머) 또는 그 이상의 개수로 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 폴리머는 생체적합하다. 생체적합한 폴리머는 전형적으로 보통 수준의 농도에서는 유의한 세포 사멸을 유발하지 않는 폴리머이다. 특정 구현예에서, 생체적합한 폴리머는 생분해성이며, 즉, 폴리머는 체내와 같은 생리학적 환경에서 화학적으로 및/또는 생물학적으로 분해될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리머는 프로타민 또는 폴리에틸렌이민일 수 있다.

RNA는, RNA가 양이온성 지질, 및 선택적으로 부가적인 또는 보조 지질을 포함하는 리포좀에 결합되어 주사가능한 나노입자 제형을 형성하는, 소위 리포플렉스 제형에 의해 비장으로 전달할 수 있다. 리포좀은 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적절한 수상에 주입함으로써 수득할 수 있다. RNA 리포플렉스 입자는 리포좀을 RNA와 혼합하여 제조할 수 있다. 비장을 표적으로 하는 RNA 리포플렉스 입자는 WO 2013/143683에 언급되어 있으며, 본원에 원용에 의해 포함된다. 음의 순 전하를 가진 RNA 리포플렉스 입자를 이용하여, 항원-제시 세포와 같은 비장 조직 또는 비장 세포, 구체적으로 수지상 세포를 선호적으로 표적화할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이에, RNA 리포플렉스 입자가 투여된 후, 비장에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 이루어진다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 비장에서 RNA를 발현시키기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자가 투여된 후, 폐 및/또는 간에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현은 발생하지 않거나, 또는 본질적으로 발생하지 않는다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자가 투여된 후, 비장내 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 이러한 항원 제시 세포에서 RNA를 발현시키기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식 세포이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질과 RNA를 함유한 입자를 지칭한다. 양으로 하전된 리포좀과 음으로 하전된 RNA 간의 정전기적 상호작용으로 복합체화가 이루어지고, RNA 리포플렉스 입자가 자발적으로 만들어진다. 양으로 하전된 리포좀은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 부가적인 지질을 사용해 합성할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.

본 발명의 내용에서, "양이온성 지질"은 양의 순 전하를 가진 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 지질 매트릭스에의 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 RNA에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 또는 다이아실 쇄와 같은 친지성 모이어티를 가지고 있으며, 전형적으로 지질 헤드 기는 양 전하를 띤다. 양이온성 지질의 예로는, 비-제한적으로 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 다이메틸다이옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 1,2-다이알킬옥시-3- 다이메틸암모늄 프로판; 다이옥타데실다이메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 2,3-다이(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-다이메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), 1,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE) 및 2,3-다이올레오일옥시-N-[2(스페르민 카르복사미드)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 등이 있다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA 및/또는 DOTAP이다.

총 양 전하 : 음 전하의 비율과 RNA 리포플렉스 입자의 물리적 안정성을 조정하기 위해 부가적인 지질이 병합될 수 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 중성 지질이다. 본 발명의 내용에서, "중성 지질"은 순 전하가 0인 지질을 지칭한다. 중성 지질의 예로는, 비-제한적으로, 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 다이아실포스파티딜 콜린, 다이아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 세팔린, 콜레스테롤 및 세레브로사이드 등이 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 DOPE, 콜레스테롤 및/또는 DOPC이다.

특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질과 부가적인 지질을 둘다 포함한다. 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고, 부가적인 지질은 DOPE이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기한 몰 비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 2:1이다.

본 발명에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는, 일 구현예에서, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위의 평균 직경을 가진다. 특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm, 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm 또는 약 1000 nm이다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 250 nm 내지 약 700 nm의 범위이다. 다른 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 300 nm 내지 약 500 nm의 범위이다. 예시적인 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 400 nm이다.

용어 "평균 직경"은 동적 광 산란 (DLS)과 소위 누적 알고리즘을 이용한 데이터 분석에 의해 측정하였을 경우의 입자의 평균 유체역학적 직경을 의미하며, 이는 결과로서 길이 치수를 가진 Z_평균과 치수가 없는 다분산 지수 (PI)를 제공해준다 (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). 여기서, 입자의 "평균 직경", "직경" 또는 "크기"는 Z_평균 값과 동의어로 사용된다.

용어 "다분산 지수"는 본원에서 입자, 예를 들어 나노입자의 전체 크기 분포를 나타내는 척도로 사용된다. 다분산 지수는 소위 누적 분석을 통해 동적 광 산란 측정값을 기반으로 계산한다.

용어 "압출" 또는 "압착"은 고정된 횡단면 프로파일을 가진 입자를 제조하는 과정을 지칭한다. 특히, 이 용어는 입자를 규정된 구멍이 구비된 필터를 통해 강제로 통과시킴으로써 입자를 소형화하는 것을 의미한다.

본 발명의 RNA-지질 입자의 전하는 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 전하와 RNA에 존재하는 전하의 총합이다. 전하 비율은 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 비율이다. 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 전하 비율은 다음의 식으로 계산한다: 전하 비율 = [(양이온성 지질 농도 (mol)) * (양이온성 지질에 존재하는 양 전하의 총 수)] / [(RNA 농도 (mol)) * (RNA에 존재하는 음 전하의 총 수)].

생리학적 pH에서 비장을 표적화하는 본 발명에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 바람직하게는 양 전하 : 음 전하의 전하 비율 약 1.9:2 내지 약 1:2와 같이 음의 순 전하를 가진다. 특정 구현예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자의 양 전하 : 음 전하의 전하 비율은 약 1.9:2.0, 약 1.8:2.0, 약 1.7:2.0, 약 1.6:2.0, 약 1.5:2.0, 약 1.4:2.0, 약 1.3:2.0, 약 1.2:2.0, 약 1.1:2.0, 또는 약 1:2.0이다.

본 발명에서 "생리학적 pH"는 pH 약 7.5를 의미한다.

약학적 조성물

본원에 기술된 물질들은 약학적 조성물 또는 약제로, 특히 치료학적 치료 또는 예방학적 치료를 위한 백신으로서 유용하거나 또는 이의 제조에 사용가능하다.

용어 "약학적 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제형을 지칭한다. 이러한 약학적 조성물은, 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 낮추거나, 방지하거나 또는 치료하기 위해 사용가능하다. 약학적 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 약학적 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같이 RNA, RNA 입자 및/또는 추가적인 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "백신"은 투여시 면역 반응, 특히 암 세포와 같은 병에 걸린 세포 또는 병원체를 인지 및 공격하는 세포성 면역 반응을 유도하는, 약제학적 제제 (약학적 조성물) 또는 산물을 지칭한다. 백신은 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다. 용어 "개인 맞춤형 암 백신"은 특정 암 환자에 대한 것이며, 암 백신이 개별 암 환자의 필요 또는 특수 상황에 맞게 조정되는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 보강제를 포함하거나, 또는 하나 이상의 보강제와 함께 투여할 수 있다. 용어 "보강제"는 면역 반응을 연장, 강화 또는 가속화하는 화합물을 지칭한다. 보강제는 오일 에멀젼 (예, 프로인트 보강제), 미네랄 화합물 (예, 알럼), 박테리아 생산물 (예, 백일해균 독소) 또는 면역-자극 복합체와 같은 이종적인 화합물 군을 포함한다. 보강제의 예로는, 비-제한적으로, LPS, GP96, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 성장인자 및 사이토카인, 예를 들어 모노카인, 림포카인, 인터루킨, 케모카인 등이 있다. 케모카인은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a일 수 있다. 추가적으로 알려진 보강제는 알루미늄 하이드록사이드, 프로인트 보강제 또는 오일, 예를 들어 Montanide® ISA51이다. 본 발명에 사용하기 적합한 다른 보강제로는 Pam3Cys과 같은 리포펩타이드 등이 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 제제"로 적용된다.

용어 "약제학적으로 허용가능한"은 물질이 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 무독성임을 의미한다.

용어 "약제학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진행 속도를 늦추는 것을 포함하며, 구체적으로 질환의 진행을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 이러한 질환 또는 병태의 개시 지연 또는 개시 예방일 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중등도, 나이, 신체 상태, 키 및 체중 등의 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본 발명에 기술된 조성물의 투여 용량은 이러한 다양한 매개변수에 따라 결정될 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이보다 고 용량 (또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용하기 적합한 보존제로는, 비-제한적으로, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살 등이 있다.

본 발명의 내용에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 의미한다. 부형제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제 등이 있다.

용어 "희석제"는 희석하는 물질 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 어느 하나를 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물 등이 있다.

용어 "담체"는 약학적 조성물의 투여를 쉽게 만들거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기성일 수 있는 성분을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 담체는, 개체에게 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는, 비-제한적으로, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 소듐 클로라이드 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 특히, 생체적합한 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머 등이 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.

치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.

약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약제학 실무에 따라 선택할 수 있다.

약학적 조성물의 투여 경로

일 구현예에서, 본 발명에 기술된 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 또는 전신 투여용으로 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에서, "비경구 투여"는 정맥내 주사 등의 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다. 다른 바람직한 구현예에서, 전신 투여는 정맥내 투여에 의한 것이다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물의 투여 후, 활성 물질, 예를 들어 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 특히 선택적으로 RNA 인자 형태의 RNA는 적어도 일부가 표적 세포로 전달된다. 일 구현예에서, RNA의 적어도 일부가 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일 구현예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 폴리펩타이드를 생산한다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 항원 제시 세포, 예를 들어 비장의 전문적 항원 제시 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장의 수지상 세포이다. 따라서, 본원에 기술된 RNA 입자는 RNA를 이러한 표적 세포에 전달하기 위해 이용할 수 있다. 이에, 본 발명은 또한 본원에 기술된 RNA 입자를 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 표적 세포에 RNA를 전달하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, RNA는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일 구현예에서, RNA는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA이며, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 폴리펩타이드를 생산한다.

일 구현예에서, 본 발명은 림프 시스템, 특히 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화를 포함한다.

"림프 시스템"은 순환계의 일부이자, 림프액을 운반하는 림프관 네트워크를 포함하는 면역 시스템의 중요한 부분이다. 림프 시스템은 림프 장기, 림프관으로 된 이동 네트워크 및 순환성 림프액으로 구성된다. 일차 또는 중추 림프 장기는 미성숙 전구 세포로부터 림프구를 생산한다. 흉선 및 골수는 일차 림프 장기를 구성한다. 이차 또는 말초 림프 장기는 림프절과 비장을 포함하며, 성숙한 나이브 림프구를 유지시키고, 적응 면역 반응을 개시한다.

약학적 조성물의 용도

본원에 기술된 백신은 암 질환을 치료학적 치료하거나 또는 예방학적으로 치료하는데 이용할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 백신을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 구현예에서, 면역 반응은 암에 대한 것이다.

용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비-정상적인 병태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 신호와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 보다 넒은 의미에서 개체와 접촉시 질병이 병을 앓고 있는 개체에서 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망 또는 비슷한 문제를 유발하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 사용된다. 더 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 독립된 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포함하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구별할 수 있는 범주로 간주될 수 있다. 질환은, 여러가지 질환에 걸려 생활하면 개체의 삶에 대한 관점과 성격을 바꿀 수 있으므로, 일반적으로 개체에게 신체적으로뿐 아니라 감정적으로 영향을 미친다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 병태를 퇴치할 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연시키거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하거나, 및/또는 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 해결하거나, 아울러 병태를 예방하기 위해, 치료학적으로 효과적인 화합물의 투여 등의, 병에 걸린 개체로부터 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포괄하는 것으로 의도되며, 이때 예방은 질환, 병태 또는 장애와 싸우기 위한 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것으로서 이해되어야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.

용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하거나 및/또는 개체의 수명을 연장(증가)하는 임의의 치료를 의미한다. 이러한 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 이전에 걸린 적 있는 개체에서 재발 감소일 수 있다.

용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환 발생을 방지하기 위해 의도되는 모든 치료를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.

용어 "개인" 및 "개체"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있는 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭하지만, 질환 또는 장애에 걸렸을 수 있거나 또는 걸리지 않았을 수 있다. 다수 구현예들에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개인" 및 "개체"는 특정 연령을 지정하지 않으며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포괄한다. 본 발명의 구현예에서, "개체" 또는 "개인"은 "환자"이다.

용어 "환자"는 치료가 필요한 개인 또는 개체, 구체적으로 질환에 걸린 개인 또는 개체를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 목표는 종양 항원을 발현하는 암 세포 등의 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포에 대해 면역 반응을 제공하는 것이며, 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 수반하는 암 질환과 같은 질환을 치료하는 것이다.

하나 이상의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 기술된 백신은, 개체에서 하나 이상의 에피토프에 대해, 치료학적이거나 또는 일부 또는 완전히 예방적일 수 있는, 면역 반응을 야기하기 위해 개체에 투여할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 면역요법 및 백신 접종의 원리가, 치료할 질환과 면역학적으로 관련있는 항원 또는 에피토프로 개체를 면역화함으로써, 질환에 대한 면역보호 반응을 구축한다는 점에 기반함을, 알 것이다. 이에, 본 발명에 기술된 약학적 조성물은 면역 반응을 유도 또는 강화하기 위해 적용가능하다. 본 발명에 기술된 약학적 조성물은 따라서 항원 또는 에피토프를 수반하는 질환의 예방학적 및/또는 치료학적 치료에 이용가능하다.

본 발명의 내용에서, "면역 반응"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 일체화된 신체 반응을 지칭하며, 이는 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 지칭한다. 세포성 면역 반응은, 비-제한적으로, 항원을 발현하는 세포에 대한 세포성 반응을 포함하며, 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자를 사용해 항원을 제시하는 것을 특징으로 한다. 세포성 반응은 T 림프구에 관한 것이며, T 림프구는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 수행하는 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포로도 지칭됨) 또는 감염된 세포 또는 암 세포에 세포자살을 유도하는 살상 세포 (세포독성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로도 지칭됨)로서 분류할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암 세포에 대한 항-종양성 CD8+ T 세포 반응의 자극을 수반한다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 클래스 I MHC 분자를 통해 제시된다.

본 발명은 보호적, 예방적, 예방학적 및/또는 치료학적일 수 있는 면역 반응을 구상한다. 본 발명의 내용에서, "면역 반응을 유도한다 [또는 유도하는]"는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 없다는 것을 의미할 수 있거나, 또는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 기저 수준으로 존재하고 유도 후 강화되는 것을 의미할 수 있다. 따라서, "면역 반응을 유도한다 [또는 유도하는]"는 "면역 반응을 강화한다 [또는 강화하는]"를 포함한다.

용어 "면역요법"은 면역 반응의 유도 또는 강화에 의한 질환 또는 병태의 치료를 의미한다. 용어 "면역요법"은 항원 면역화 또는 항원 백신 접종을 포함한다.

용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은 예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 이유로, 면역 반응을 유도하기 위한 목적으로 항원을 개체에 투여하는 과정을 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명은 비장 조직을 표적으로 하는 본 발명에 기술된 RNA 입자를 투여하는 구현예를 구상한다. RNA는, 예를 들어 본 발명에 기술된 바와 같이 하나 이상의 과도하게 상향 조절된 RNA 전사체에 의해 암호화되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. RNA는 폴리펩타이드를 발현하기 위해 수지상 세포와 같은 비장내 항원-제시 세포에 의해 흡수된다. 항원-제시 세포에 의한 선택적인 처리 및 제시 후, 하나 이상의 에피토프에 대한 면역 반응이 구축되어, 암의 예방학적 및/또는 치료학적 치료가 달성된다. 일 구현예에서, 본 발명에 기술된 RNA 입자에 의해 유도되는 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식 세포와 같은 항원 제시 세포에 의한 하나 이상의 에피토프의 제시, 및 이러한 제시로 인한 세포독성 T 세포의 활성화를 포함한다. 예를 들어, RNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 또는 이의 처리 산물은 항원 제시 세포 상에 발현된 주 조직친화성 복합체 (MHC) 단백질을 통해 제시될 수 있다. 따라서, MHC 펩타이드 복합체는 T 세포 또는 B 세포와 같은 면역 세포에 의해 인지될 수 있으며, 이의 활성화로 이어질 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNA 입자에서 RNA는 투여 후 비장으로 전달되거나 및/또는 비장에서 발현된다. 일 구현예에서, RNA 입자는 비장의 항원 제시 세포를 활성화하기 위해 비장으로 전달된다. 즉, 일 구현예에서, RNA 입자의 투여 후, 항원 제시 세포에서 RNA 전달 및/또는 RNA 발현이 이루어진다. 항원 제시 세포는 전문적 항원 제시 세포 또는 비-전문적 항원 제시 세포일 수 있다. 전문적 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식세포일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는, 비장의 수지상 세포 및/또는 비장의 대식세포일 수 있다.

이에, 본 발명은 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화하기 위한 본원에 기술된 RNA 입자 또는 이러한 RNA 입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 암 질환의 예방학적 및/또는 치료학적 치료에 이용하기 위한 본원에 기술된 RNA 입자 또는 이러한 RNA 입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 RNA 입자 또는 이러한 RNA 입자를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 비장에서, 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 하나 이상의 에피토프를 전달하거나, 또는 비장에서 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 하나 이상의 에피토프를 발현하는 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 에피토프는 바람직하게는 RNA 입자에서 RNA에 의해 암호화된다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 전신 투여되는 RNA 입자 또는 이러한 RNA 입자를 포함하는 약학적 조성물은 폐 및/또는 간이 아닌 비장에서 RNA 입자 또는 RNA의 표적화 및/또는 축적을 달성한다. 일 구현예에서, RNA 입자는 비장에서 RNA를 방출하며, 및/또는 비장내 세포에 들어진다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 전신 투여되는 RNA 입자 또는 이러한 RNA 입자를 포함하는 약학적 조성물은 RNA를 비장의 항원 제시 세포로 전달한다. 특정 구현예에서, 비장의 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 대식세포이다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 RNA 입자 또는 이러한 RNA 입자를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화하는 방법에 관한 것이다.

용어 "대식 세포"는 단핵구의 분화에 의해 만들어진 식세포의 하위군을 지칭한다. 염증, 면역 사이토카인 또는 미생물 산물에 의해 활성화된 대식 세포는 비-특이적으로 탐식 작용을 수행하여, 가수분해성 및 산화성 공격에 의해 대식 세포 내 외인성 병원체를 사멸시켜 병원체를 분해한다. 분해된 단백질로부터 유래된 펩타이드는 대식 세포의 세포 표면 상에 제시되고, 이는 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, B 세포 표면 상에서 항체와 직접 상호작용하여, T 세포 및 B 세포를 활성화하고 면역 반응을 추가적으로 자극할 수 있다. 대식 세포는 항원-제시 세포 클래스에 속한다. 일 구현예에서, 대식 세포는 비장 대식 세포이다.

용어 "수지상 세포" (DC)는 항원 제시 세포 클래스에 속하는 식세포의 다른 하위종을 지칭한다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래된다. 이들 전구 세포는 먼저 미성숙 수지상 세포로 변환된다. 이들 미성숙 세포는 높은 탐식 활성과 낮은 T 세포 활성화 잠재성을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 바이러스 및 박테리아 등의 병원체에 대해 주변 환경을 계속적으로 샘플링한다. 미성숙 수지상 세포가 제시가능한 항원과 접촉하게 되면, 그 세포는 성숙한 수지상 세포로 활성화되어, 비장 또는 림프절로 이동하게 된다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하여, 이의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙화되면 이들 조각들을 MHC 분자를 이용해 세포 표면에 제시한다. 동시에, 이들 세포는 CH80, CH86 및 CH40과 같은 T 세포 활성화에서 공동-수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향 조절하여, 이의 T 세포 활성화 능력을 크게 강화한다. 이들 세포는 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 또는 림프 시스템을 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7을 상향 조절한다. 여기서, 이들 세포는 항원-제시 세포로 작용하며, 비-항원 특이적인 공동-자극 신호와 동시에, 헬퍼 T 세포 및 살상 T 세포뿐 아니라 항원 제시에 의해 B 세포를 활성화한다. 따라서, 수지상 세포는 T 세포-관련 면역 반응 또는 B 세포-관련 면역 반응을 활발하게 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 비장의 수지상 세포이다.

용어 "항원 제시 세포" (APC)는 세포의 표면 상에 (또는 표면에서) 하나 이상의 항원 또는 항원 단편을 나열, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다양한 세포들 중 한가지 세포이다. 항원-제시 세포는 전문적 항원 제시 세포 및 비-전문적 항원 제시 세포로 구분할 수 있다.

용어 "전문적 항원 제시 세포"는 나이브 (naive) T 세포와의 상호작용에 필요한 주 조직적합성 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II) 분자를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포이다. T 세포가 항원 제시 세포의 막 상에서 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호작용하면, 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동-자극성 분자를 생산하게 된다. 전문적 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식 세포를 포함한다.

용어 "비-전문적 항원 제시 세포"는 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하진 않지만, 인터페론-γ와 같은 특정 사이토카인에 의한 자극시 발현하는 항원 제시 세포를 지칭한다. 예를 들어, 비-전문적 항원 제시 세포는 섬유모세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 신경교 세포, 췌장 베타 세포 또는 혈관 내피 세포를 포함한다.

"항원 가공 처리"는 항원을 가공 처리 산물로 분해하는 것을 의미하며, 처리 산물은 항원의 단편 (예, 단백질의 펩타이드로의 분해)이며, 그리고 특정 T 세포에 항원 제시 세포와 같이 세포에 의해 제시하기 위한 MHC 분자와 이들 하나 이상의 단편의 (예, 결합을 통한) 조합물이다.

용어 "항원을 수반하는 질환" 또는 "에피토프를 수반하는 질환"은 항원 또는 에피토프가 연루된 임의 질환, 예를 들어 항원 또는 에피토프의 존재를 특징으로 하는 질환을 의미한다. 항원 또는 에피토프를 수반한 질환은 암 질환 또는 단순 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 종양-관련 항원과 같은 질환-관련 항원일 수 있다.

용어 "암 질환" 또는 "암"은 개체에서 전형적으로 통제를 벗어난 세포 증식을 특징으로 하는 병리학적 병태를 지칭하거나 또는 이를 의미한다. 암의 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 보다 상세하게는, 이러한 암의 예로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 신경외배엽 암, 척추 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 용어 "암"은 암 전이를 또한 포함한다. 일반적으로, 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.

용어 "순환성 종양 세포" 또는 "CTC"는 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 탈착되어, 혈류에서 순환하는 세포를 지칭한다. CTC는 여러가지 조직들에서 부가적인 종양을 후속적으로 증식 (전이)시키기 위한 시드 (seed)를 형성할 수 있다. 순환성 종양 세포는 전이성 질환을 가진 환자의 전혈 ml 당 1-10 CTC 정도의 빈도로 발견된다. CTC를 단리하기 위한 연구 방법들이 개발되어 있다. 당해 기술 분야에서 CTC를 단리하기 위한 몇가지 연구 방법들, 예를 들어, 상피 세포가 정상적인 혈액 세포에는 없는 세포 응착 단백질 EpCAM을 일반적으로 발현하다는 점을 이용하는 기법이 개시되어 있다. 면역자기 비드에 기반한 포획은 혈액 시료에, 자기 입자가 접합된 EpCAM에 대한 항체를 처리한 다음 자기장 하에 태그가 달린 세포를 분리하는 단계를 수반한다. 이후, 단리된 세포는 다른 상피 마커인 사이토케라틴에 대한 항체뿐 아니라, 드문 CTC를 백혈구 세포 오염물질로부터 구별하기 위해, 공통 백혈구 마커 CD45로 염색한다. 이러한 견고하고 반-자동화된 방식은 CTC를 식별하며, 이의 평균 수율은 대략 1 CTC/mL이고, 순도는 0.1%이다 ( Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). CTC를 단리하는 2번째 방법은, EpCAM에 대한 항체로 코팅된 관능기가 부여된 마이크로포스트 80,000개가 임베딩된 챔버로 전혈을 유동시키는 단계를 수반하는, 미세유체-기반의 CTC 포획 장치를 이용하는 것이다. 이후, CTC는 사이토케라틴 또는 조직 특이 마커, 예를 들어 전립선암의 경우 PSA, 또는 유방암의 경우 HER2를 염색하고, 다중 평면에서 3차원 좌표를 따라 마이크로포스트를 자동 스캐닝함으로써 가시화한다. CTC-칩은 환자에서 사이토케라틴-양성의 순환성 종양 세포를 식별할 수 있으며, 수율 중간값은 50 세포/ml이고, 순도는 1-80% 범위이다 (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). CTC를 단리하는 또 다른 가능한 방법은, 혈액 튜브에서 CTC를 포획, 식별 및 수를 측정하는 Veridex, LLC (Raritan, NJ) 사의 CellSearch^TM 순환성 종양 세포 (CTC)를 사용하는 것이다. CellSearch^TM 시스템은 미국 식의약청 (FDA)으로부터 승인된, 면역자기 표지 및 자동화된 디지털 현미경을 조합 사용하는 것에 기반한, 전혈에서 CTC 수를 측정하는 방법이다. 문헌에 기술된 그외 CTC 단리 방법들도 있으며, 이들 모두 본 발명과 연계하여 사용할 수 있다.

암 치료에서 병용 전략 (combination strategy)이, 단일요법 방식의 효과보다 더 높은 것으로 간주될 수 있는, 달성되는 상승 효과로 인해 적합할 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 면역치료제와 함께 투여된다. 본원에서 "면역치료제"는 특이적인 면역 반응 및/또는 면역 작동자 기능(들)을 활성화하는데 관여할 수 있는 임의 물질을 의미한다. 본 발명은 면역치료제로서 항체의 사용을 고려한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 항체는, 세포자살 유도, 신호 전달 경로의 구성요소의 차단 또는 종양 세포의 증식 저해 등의, 다양한 기전을 통해 암 세포에 대한 치료학적 효과를 달성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 항체-의존적인 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포 사멸을 유도할 수 있거나, 또는 보체 단백질에 결합하여, 보체 의존적인 세포독성 (CDC)으로 알려진 직접적인 세포 독성을 유도할 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 항암 항체 및 잠재적인 항체 표적(괄호 안)에 대한 비-제한적인 예로는, 아바고보맵 (Abagovomab) (CA-125), 압시시맵 (Abciximab) (CD41), 아데카투무맵 (Adecatumumab)(아투무맵, atumumab) (EpCAM), 아푸투주맵 (Afutuzumab) (CD20), 알라시주맵 페골 (Alacizumab pegol) (VEGFR2), 알투모맵 펜테테이트 (Altumomab pentetate) (CEA), 아마투시맵 (Amatuximab) (MORAb-009), 아나투모맵 마페나톡스 (Anatumomab mafenatox) (TAG-72), 아폴리주맵 (Apolizumab) (HLA-DR), 아르시투모맵 (Arcitumomab) (CEA), 아테졸리주맵 (Atezolizumab) (PD-L1), 바비투시맵 (Bavituximab) (포스파티딜세린), 벡투모맵 (Bectumomab) (CD22), 벨리무맵 (Belimumab) (BAFF), 베바시주맵 (Bevacizumab) (VEGF-A), 비바투주맵 메르탄신 (Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6), 빌리나투모맵 (Blinatumomab) (CD19), 브렌투시맵 베도틴 (Brentuximab vedotin) (CD30 TNFRSF8), 칸투주맵 메르탄신 (Cantuzumab mertansin) (mucin CanAg), 칸투주맵 라브탄신 (Cantuzumab ravtansine) (MUC1), 카프로맵 펜데티드 (Capromab pendetide) (전립선 암종 세포), 카를루맵 (Carlumab) (CNT0888), 카투맥소맵 (Catumaxomab) (EpCAM, CD3), 세투시맵 (Cetuximab) (EGFR), 시타투주맵 보가톡스 (Citatuzumab bogatox) (EpCAM), 시수투무맵 (Cixutumumab) (IGF-1 수용체), 클라우디시맵 (Claudiximab) (Claudin), 클리바투주맵 테트라세탄 (Clivatuzumab tetraxetan) (MUC1), 코나투무맵 (Conatumumab) (TRAIL-R2), 다세투주맵 (Dacetuzumab) (CD40), 달로투주맵 (Dalotuzumab) (인슐린-유사 성장인자 I 수용체), 데노수맵 (Denosumab) (RANKL), 데투모맵 (Detumomab) (B-림프종 세포), 드로지투맵 (Drozitumab) (DR5), 에크로멕시맵 (Ecromeximab) (GD3 강글리오시드), 에드레콜로맵 (Edrecolomab) (EpCAM), 엘로투주맵 (Elotuzumab) (SLAMF7), 에나바투주맵 (Enavatuzumab) (PDL192), 엔시투시맵 (Ensituximab) (NPC-1C), 에프라투주맵 (Epratuzumab) (CD22), 에르투막소맵 (Ertumaxomab) (HER2/neu, CD3), 에타라시주맵 (Etaracizumab) (인테그린 αγβ3), 파를레투주맵 (Farletuzumab)(폴레이트 수용체 1), FBTA05 (CD20), 피클라투주맵 (Ficlatuzumab) (SCH 900105), 피기투무맵 (Figitumumab) (IGF-1 수용체), 플란보투맵 (Flanvotumab) (당단백질 75), 프레솔리무맵 (Fresolimumab) (TGF-β), 갈리시맵 (Galiximab) (CD80), 가니투맵 (Ganitumab) (IGF-I), 겜투주맵 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin) (CD33), 게보키주맵 (Gevokizumab) (IL1β), 기렌투시맵 (Girentuximab) (카보닉 안하이드라제 9 (CA-IX)), 글렘바투무맵 베도틴 (Glembatumumab vedotin) (GPNMB), 이브리투모맵 티우세탄 (Ibritumomab tiuxetan) (CD20), 이크루쿠맵 (Icrucumab) (VEGFR-1), 이고보마 (Igovoma) (CA-125), 인다투시맵 라브탄신 (Indatuximab ravtansine) (SDC1), 인테투무맵 (Intetumumab) (CD51), 이노투주맵 오조가미신 (Inotuzumab ozogamicin) (CD22), 이필리무맵 (Ipilimumab) (CD 152), 이라투무맵 (Iratumumab) (CD30), 라베투주맵 (Labetuzumab) (CEA), 렉사투무맵 (Lexatumumab) (TRAIL-R2), 리비비루맵 (Libivirumab) (B형 간염 표면 항원), 린투주맵 (Lintuzumab) (CD33), 로르보투주맵 메르탄신 (Lorvotuzumab mertansine) (CD56), 루카투무맵 (Lucatumumab) (CD40), 루밀리시맵 (Lumiliximab) (CD23), 마파투무맵 (Mapatumumab) (TRAIL-R1), 마투주맵 (Matuzumab) (EGFR), 메폴리주맵 (Mepolizumab) (IL5), 밀라투주맵 (Milatuzumab) (CD74), 미투모맵 (Mitumomab) (GD3 강글리오시드), 모가물리주맵 (Mogamulizumab) (CCR4), 모세투모맵 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox) (CD22), 나콜로맵 타페나톡스 (Nacolomab tafenatox) (C242 항원), 나프투모맵 에스타페나톡스 (Naptumomab estafenatox) (5T4), 나마투맵 (Namatumab) (RON), 넥시투무맵 (Necitumumab) (EGFR), 니모투주맵 (Nimotuzumab) (EGFR), 니볼루맵 (Nivolumab) (IgG4), 오파투무맵 (Ofatumumab) (CD20), 올라라투맵 (Olaratumab) (PDGF-R a), 오나르투주맵 (Onartuzumab) (인간 스캐터 인자 수용체 키나제 (human scatter factor receptor kinase)), 오포르투주맵 모나톡스 (Oportuzumab monatox) (EpCAM), 오레고보맵 (Oregovomab) (CA-125), 옥셀루맵 (Oxelumab) (OX-40), 파니투무맵 (Panitumumab) (EGFR), 파트리투맵 (Patritumab) (HER3), 펨투모마 (Pemtumoma) (MUC1), 페르투주마 (Pertuzuma) (HER2/neu), 핀투모맵 (Pintumomab) (선암종 항원), 프리투무맵 (Pritumumab) (비멘틴 (vimentin)), 라코투모맵 (Racotumomab) (N-글리콜릴뉴라민산), 라드레투맵 (Radretumab) (파이브로넥틴 엑스트라 도메인-B), 라피비루맵 (Rafivirumab) (광견병 바이러스 당단백질), 라무시루맵 (Ramucirumab) (VEGFR2), 릴로투무맵 (Rilotumumab) (HGF), 리투시맵 (Rituximab) (CD20), 로바투무맵 (Robatumumab) (IGF-1 수용체), 살말리주맵 (Samalizumab) (CD200), 시브로투주맵 (Sibrotuzumab) (FAP), 실투시맵 (Siltuximab) (IL6), 타발루맵 (Tabalumab) (BAFF), 타카투주맵 테트라세탄 (Tacatuzumab tetraxetan)(α-페토프로테인), 타플리투모맵 파프톡스 (Taplitumomab paptox) (CD 19), 테나투모맵 (Tenatumomab) (테나신 C), 테프로투무맵 (Teprotumumab) (CD221), 티실리무맵 (Ticilimumab) (CTLA- 4), 티가투주맵 (Tigatuzumab) (TRAIL-R2), TNX-650 (IL13), 토시투모맵 (Tositumomab) (CD20), 트라스투주맵 (Trastuzumab)(HER2/neu), TRBS07 (GD2), 트레멜리무맵 (Tremelimumab) (CTLA-4), 투코투주맵 셀모루킨 (Tucotuzumab celmoleukin) (EpCAM), 우블리투시맵 (Ublituximab) (MS4A1), 우레루맵 (Urelumab) (4-1 BB), 볼로시시맵 (Volociximab) (인테그린 α5β1), 보투무맵 (Votumumab) (종양 항원 CTAA 16.88), 잘루투무맵 (Zalutumumab) (EGFR) 및 자놀리무맵 (Zanolimumab) (CD4) 등이 있다.

일 구현예에서, 면역치료제는 PD-1 축 결합성 길항제 (PD-1 axis binding antagonist)이다. PD-1 축 결합성 길항제는 PD-1 결합성 길항제, PD-L1 결합성 길항제 및 PD-L2 결합성 길항제를 포함하나, 이들로 제한되진 않는다. "PD-1"의 다른 명칭은 CD279 및 SLEB2이다. "PD-L1"의 다른 명칭은 B7-H1, B7-4, CD274 및 B7-H이다. "PD-L2"의 다른 명칭은 B7-DC, Btdc 및 CD273이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합성 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 파트너에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 다른 구현예에서, PD-L1 결합성 길항제는 PD-L1이 이의 결합 파트너에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 특정 구현예에서, PD-L1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 다른 구현예에서, PD-L2 결합성 길항제는 PD-L2가 이의 결합 파트너에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 특정 구현예에서, PD-L2 결합 파트너는 PD-1이다. PD-1 결합성 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 결합성 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체)이다. 항-PD-1 항체에 대한 예로는, 비-제한적으로, MDX-1106 (니볼루맵 (Nivolumab), OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, 펨브롤리주맵 (Pembrolizumab), KEYTRUDA), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, BGB-108 및 BGB-A317 등이 있다.

일 구현예에서, PD-1 결합성 길항제는 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 영역 또는 PD-1 결합 영역이 불변부와 융합된 것을 포함하는 이뮤노어드헤신이다. 일 구현예에서, PD-1 결합성 길항제는 WO2010/027827 및 WO201 1/066342에 기술된 용해성 융합 수용체인 AMP-224 (B7-DCIg로도 알려짐, PD-L2-Fc)이다.

일 구현예에서, PD-1 결합성 길항제는, 비-제한적으로 YW243.55.S70, MPDL3280A (Atezolizumab), MEDI4736 (Durvalumab), MDX-1105 및 MSB0010718C (Avelumab) 등의, 항-PD-L1 항체이다.

일 구현예에서, 면역치료제는 PD-1 결합성 길항제이다. 다른 구현예에서, PD-1 결합성 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 예시적인 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맵 (Atezolizumab)이다.

본원에 참조된 문헌 및 연구에 대한 언급은 임의의 전술한 내용이 선행 기술 분야와 관련 있다는 인정으로서 의도되진 않는다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원에 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관한 어떠한 인정으로도 간주되지 않는다.

후술한 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 구현예들을 구성 및 이용할 수 있게 하기 위해 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본 발명에 기술된 예에 대한 다양한 변형들도 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 구현예들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다른 예 및 활용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예들은 본 발명에 기술된 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위로 부합되는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1: B16-F10 흑색종 세포주에서 차별적으로 발현되는 유전자의 선별

흑색종 세포주 B16-F10의 mRNA-유래 cDNA를 서열분석하였다 (Castle, J. C. et al. Cancer Res. 72, 1081-1091 (2012)). 유전자 발현 존재율을 슈도얼라인먼트 소프트웨어 칼리스토 (Bray, N. L. et al. Nat. Biotech. 34, 525-527 (2016))를 이용해 추정하고, TPM (transcripts per million)으로 기록하였다. 유전자 발현 수치는 이후 동일한 방식으로 처리한 정상 선택 조직의 참조 유전자 발현 데이터베이스와 비교하였다. 참조 데이터베이스는 마우스 ENCODE 프로젝트의 샘플 (n=487) (Pervouchine, D. D. et al. Nat. Comm. 6, 5903 (2015)), 마우스 트랜스크립토믹 BodyMap (n=72) (Li, B. et al. Sci. Rep. 7(1):4200 (2017)), 일주기 유전자 발현 아틀라스의 뮤라인 샘플 (n=96) (Zhang, R. et al. PNAS 111(45):16219-24 (2014)), 및 국내 서열분석된 뮤라인 조직 (n=67)을 포함하였다. 샘플에는 조직 기원과 조직 유형에 대한 주석이 달려 있다. 조직 유형은 배아 조직 (시료 모두 '배아'로 표시함), 생식 조직 (정낭, 자궁, 난소, 태반 및 고환) 및 정상 조직 (그외 기타)을 포함한다. 각각의 고유한 조직에 대해, 전체 샘플의 발현 중간값을 계산하였다. 그런 후, 다음과 같이 계산된 컷오프 c를 초과하면 B16-F10 표적들을 예비-선별하였다:

여기서, M은 전체 정상 조직 중간값의 95번째 백분위수이다. 마지막으로, 잠재적인 표적 목록을, 정상 조직에서의 발현 수치 총합과 비교하여, B16-F10에서 발현된 유전자의 배수 변화에 의해 분류하였다. 생식 장기 및 배아 조직에서의 발현은 허용하였다 (소위 암 생식 세포 항원으로 지칭되는 이것은 종양, 남성 생식세포, 태반 또는 배아 발생의 초기 단계에만 존재함).

마우스 B16-F10 흑색종 세포주에서 차별적으로 발현된 유전자 상위 군들 중에서, 몇가지 잘-알려진 흑색종 분화 항원들이 확인되었다 (도 1). 예를 들어, 알고리즘에 따라 순위가 매겨진 상위 유전자 10종들에서, 공지된 면역원성 항원 티로시나제-관련 단백질 1 (Tyrp1, 1 순위, Wang, R. et al. J. Exp . Med . 183, 1131-40 (1996)), 용질 담체 패밀리 45, 멤버 2 (Slc45a2, 2 순위, Park, J. et al. Cancer Immunol. Res. 5, 618-629 (2017).), 티로시나제 (Tyr, 3 순위, Wolfel, T. et al. Eur. J. Immunol . 24, 759-64 (1994).), 도파크롬 호변이소머라제 (Dct, 5 순위, Wang, R. F. et al. J. Exp . Med . 184, 2207-16 (1996)), mlan-A (Mlana, 6 순위 , Kawakami, Y. et al. J. Exp . Med . 180, 347-52 (1994)) 및 프리멜라노솜 단백질 (Pmel, 9 순위, Kawakami, Y. et al. J. Immunol . 154, 3961-8 (1995))이 확인되었다. 이는, 본 발명의 알고리즘이 관련 종양 항원을 선별하는 능력을 명확하게 입증해준다. 전술한 표적들 중에서, 본 발명에서는 첫번째 개념 증명 실험용으로 Tyrp1, Tyr, Dct, Pmel 및 Fkbp6을 선택하였다. 강력한 T 세포 면역 반응을 유발하는 Tyr을 제외하고는, 이들 표적들 모두에 대해 백신 접종 실험을 수행하였다 (실시예 2-5).

실시예 2: Tyrp1 RNA 백신에 대한 면역원성 검사

C57BL/6 마우스 (n=5 /그룹)에 리포플렉스로 제형화한 Tyrp1 항원 암호화 RNA 40 ㎍ 또는 비-관련 RNA 40 ㎍을 Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016)에 기술된 바와 같이 0일, 7일 및 14일에 면역 접종하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장 세포를 분리하고, 세포 5x10⁵개를 사용해 각각 MHC I 에피토프 (TAPDNLGYA, 2㎍/ml) 및 MHC II (CRPGWRGAACNQKI, 2㎍/ml) 에피토프를 암호화하는 Tyrp1 펩타이드 2종에 대한 인지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. Tyrp1에 대한 백신 접종으로 강력한 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 반응이 구축되었다 (도 2). 통계학적 유의성은 일원식 ANOVA 및 GraphPad Prism 6를 이용한 듀넷의 다중 비교 검정에 의해 구하였다. n.s.: P>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

실시예 3: Dct RNA 백신에 대한 면역원성 검사

실시예 2와 마찬가지로, C57BL/6 마우스 (n=5 /그룹)에 20 ㎍ Dct 암호화 RNA 리포플렉스 또는 NaCl을 도 3 (점선)에 나타낸 바와 같이 반복하여 백신 접종하였다. 1차 백신 접종 후 5일, 12일, 19일, 26일 및 33일째에, Dct (SVYDFFVWL)에 대한 CD8⁺ T-세포 반응을 혈액에서 MHC 테트라머 (MBL international) 염색을 통한 유세포 측정에 의해 측정하였다 (Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016)). 반복적인 백신 접종으로, 33일까지 전체 말초 CD8⁺ T 세포의 4%를 초과하는 수준으로, 항원 특이적인 T 세포가 지속적으로 증가하였다. 통계학적 유의성은 이원식 ANOVA 및 GraphPad Prism 6를 이용한 시다크의 다중 비교 검정에 의해 구하였다. n.s.: P>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

실시예 4: Pmel RNA 백신에 대한 면역원성 검사

실시예 2에서와 마찬가지로, C57BL/6 마우스 (n=8 /그룹)에 20 ㎍ Pmel 암호화 RNA 리포플렉스를 도 4에 나타낸 바와 같이 반복하여 백신 접종하였다. 1차 백신 접종 후 27일째에, 마우스의 비장 세포에서 Pmel 펩타이드 (EGSRNQDWL, 2㎍/ml) 또는 비-관련 펩타이드 (VSV-NP, RGYVYQGL, 2㎍/ml)에 대한 프로브를 사용해 IFNγ ELISpot에 의해 탐침 분석하였다. 대응 양측 검정 스튜던트 T 검정에 의해 확인된 바와 같이 현저한 Pmel 특이적인 CD8⁺ T-세포 반응이 검출되었다. n.s.: P>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

실시예 5: Fkbp6 RNA 백신에 대한 면역원성 검사

실시예 2에 기술된 바와 같이, C57BL/6 마우스 (n=3 /그룹)에 리포플렉스로 제형화한 Fkbp6 항원 암호화 RNA 20 ㎍을 0일, 7일 및 14일에 면역 접종하였다. 마지막 백신 접종 후 5일째에, 마우스의 비장세포를 분리하고, 세포 5x10⁵개에서 10 ㎍ Fkbp6 RNA 또는 비-관련 RNA (대조군)이 전기천공에 의해 도입된 동계 골수-유래 수지상 세포 (BMDC)의 인지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. BMDC는 골수 유래 세포를 GM-CSF의 존재하에 배양하여 준비하였다 (Lutz, M. B. et al. J. Immunol. Methods 223, 77-92 (1999)). Fkbp6에 대한 백신 접종으로 강력한 T 세포 반응이 발생되었다 (도 5).

실시예 6: 치료학적 Tyrp1 백신 접종 후 종양 제어

선택한 백신 표적이 치료학적으로 유용한 지를 검사하기 위해, C57BL/6 마우스 (n=11-12/그룹)에 B16-F10 종양 세포 3x10⁵개를 정맥내 (i.v.)로 접종하였다. 종양 세포 주사 후 4일째에, 도 6에 나타낸 바와 같이, Tyrp1 또는 비-관련 대조군 (항원이 없는 백본) RNA (40 ㎍)를 이용한 RNA 리포플렉스의 백신 접종을 개시하였다. 실험 개시 후 26일째에, 마우스 폐를 해부하고, 종양 결절의 수를 측정하였다. 모든 대조군 RNA 처리 마우스에서는 많은 종양 결절들이 관찰되었고 (마우스 당 최소 결절 수 500를 초과함), 대부분의 마우스는 병으로 인해 26일째 전에 사망하였다. 이와는 완전히 대조적으로, Tyrp1 백신 접종된 마우스는 26일까지 생존하였으며, 마우스 대부분에서 종양의 거시적인 신호는 관찰되지 않았다. 유의성은 비-대응, 양측 검정 만-휘트니 검정 (종양 결절의 수 비교) 및 로그 순위 검정 (생존율)으로 구하였다.. n.s.: P>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

실시예 7: 치료학적 Tyrp1 또는 Dct 백신 접종 후 종양 제어

종양 증식 카이네틱을 규정할 수 있도록 확립된 유사 실험들을 이용해, 본 발명자들은 Tyrp1 백신의 치료학적 잠재성을 검증하였으며, 부가적으로 종양 증식에 대한 Dct RNA 처리 효과를 검사하였다. 3x10⁵개의 루시퍼라제 형질전환 B16-F10 종양 세포 (B16-F10-LUC)를 나이브 C57BL/6 마우스 (n=12 /그룹)에 i.v.로 주사하고, 도 7에 나타낸 바와 같이 40　㎍ RNA 리포플렉스를 백신 접종하였다. 4일, 7일, 12일, 17일, 19일 및 25일에, IVIS 생발광 이미징 시스템 (Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016))을 사용해 루시퍼라제 발광을 검출함으로써 종양 증식을 측정하였다. 종양 부담 감소를 의미하는 무처리 또는 비-관련 RNA 처리군 대비 현저하게 낮은 생발광 신호가 Tyrp1 및 Dct 백신 접종에 의해 달성되었다. 이는, 종양 접종 후 25일째에 종양 결절의 수 또는 폐 무게를 비교한, 독립적인 판독에 의해 검증하였다. 유의성은 이원식 ANOVA 및 듀넷의 다중 비교 검정 (경시적인 루시퍼라제 생발광 비교) 또는 크루스카-발리스 검정 및 이후 듄의 검정 (종양 결절 또는 폐 무게 비교)으로 구하였다. n.s.: P>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

실시예 8: 종양 모델 CT26, MC38, TRAMP-C2 및 4T1에서 지금까지 개시된 바 없는 차별적으로 발현된 유전자 식별

실시예 1-7에서, RNA 서열분석에 기반한 유전자 발현을 건강한 조직의 유전자 발현 데이터베이스와 비교하여 개체 종양에서 차별적으로 발현된 유전자를 식별하는 것이 가능하다는 것이 입증되었다. 상위 순위의 B16-F10 유전자들에서 몇가지 공지된 종양 항원들이 확인되었다. 본 발명자들은, 검사한 후보 물질 5개 중 4개에서 RNA 리포플렉스 백신 접종시 강력한 T 세포 반응이 형성된다는 것을, 입증하였다. 이들 후보 물질들 중 2종에 대해, 본 발명자들은 치료학적 백신 접종시 강력한 항-종양 면역 반응이 형성되어 완전한 종양 거부가 달성됨을 확인하였다.

이에, 후속적으로, 본 발명자들은 다른 종양 타입들에서 차별적으로 발현되는 유전자를 식별하는 것도 물론 가능한 지를 검사하기 위해 본 종양 모델 실험을 확대하였다. 이에, 마우스 결장 종양 세포주 CT26 및 MC38, 전립선암 세포주 TRAMP-C2 및 유방암 세포주 4T1을 서열분석하고 (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)에 기술된 바와 같이 서열분석함), 세포주의 RNA 유전자 발현을 건강한 조직 데이터베이스와 비교하였다. 차별적으로 발현되는 다수 유전자들이 각각의 세포주에서 식별되었으며, 이중 선택 유전자를 도 8에 나타낸다. 선택 후보 유전자들에 대한 면역원성 실험을 실시예 9에 기술한다.

실시예 9: CT26, MC38 및 TRAMP-C2에서 선택 표적에 대한 면역원성 검사

BALB/c (n=3, CT26) 또는 C57BL/6 마우스 (n=3 /그룹, MC38 및 TRAPM-C2)에 리포플렉스로서 제형화한 항원 암호화 RNA 20 ㎍을 0일, 7일 및 14일에 실시예 2에 기술된 바와 같이 접종하여 면역화하였다. 대부분의 그룹들에는 마우스 당 항원 2종을 주사하였다. 마지막 백신 접종하고 5일 후, 마우스의 비장세포를 분리하고, 세포 5x10⁵개에서 10 ㎍ 항원 RNA 또는 비-관련 RNA (대조군)이 전기천공에 의해 도입된 동계 골수-유래 수지상 세포 (BMDC)의 인지를 IFNγ ELISpot에 의해 검사하였다. BMDC는 골수 유래 세포를 GM-CSF의 존재하에 배양하여 준비하였다 (Lutz, M. B. et al. J. Immunol. Methods 223, 77-92 (1999)). CT26 유래된 표적 Rhox5 및 Ndst4 (도 9), MC38 유래된 표적 GM14819, Rhox2h, Gm15091, Gm15097, Dppa4, GM773, Prl2c2, Fmr1nb 및 Luzp4 (도 10) 뿐 아니라 TRAPM-C2 표적 Amotl2 (도 11)에 대한 면역 반응들이 확인되었다.

실시예 10: 인간에서 개인 맞춤형 암 면역요법을 위한 차별적으로 발현된 유전자의 선별

개별 환자에서 잠재적인 표적을 결정하기 위해, 종양의 mRNA-유래 cDNA를 서열분석하고, 유전자 발현 존재율을 추정한다. 유전자 발현 수치를 동일한 방식으로 처리한 정상 선택 조직의 참조 유전자 발현 데이터베이스와 비교한다. 참조 데이터베이스는 유전자형-조직 발현 (GTEx) 데이터베이스, 인간 프로젝트 아틀라스 (HPA), 암 게놈 아클라스의 정상 조직 (TCGA), 블루프린트 에피게놈 데이터베이스 및 기타 코호트의 정상 샘플에 대한 RNA-Seq 데이터를 포함할 수 있다. 실시예 1에 따라 고도로 발현된 항원을 선별한다. 선별 후, 백신 요법용으로 최종 선정하기 전에 잠재적인 표적을 검증한다.

<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al. <120> INDIVIDUALIZED VACCINES FOR CANCER <130> 674-227 PCT2 <150> PCT/EP2018/070058 <151> 2018-07-24 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more <220> <221> REPEAT <222> (4)..(6) <223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (7)..(9) <223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (10)..(12) <223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (13)..(15) <223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 3 Thr Ala Pro Asp Asn Leu Gly Tyr Ala 1 5 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 4 Cys Arg Pro Gly Trp Arg Gly Ala Ala Cys Asn Gln Lys Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 5 Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 6 Glu Gly Ser Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 7 Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu 1 5

Claims

(a) 암 환자의 종양 시료에 존재하는 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계로서, 상기 하나 이상의 RNA 전사체는 각각 아미노산 서열을 암호화하고, 상기 하나 이상의 RNA 전사체는 각각 사전 결정된 발현 역치를 초과하는 카피수로 종양 시료에 존재하고;
(b) 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화된 아미노산 서열(들)로부터 유래된 하나 이상의 에피토프를 특징으로 하는 백신을 제공하는 단계를 포함하는 개인 맞춤형 암 백신의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계가 암 환자의 종양 시료에 존재하는 RNA 전사체의 카피수를 확인하는 단계 및 각 RNA 전사체의 카피수를 각각의 사전 결정된 발현 역치와 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
종양 시료에서의 RNA 전사체의 카피수가 비-종양 조직에서와 비교해 10배 이상, 바람직하게는 1000배 이상 높은, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계가 하나 이상의 암 세포에 대한 단일 세포 서열분석을 포함하는, 방법.
제4항에 있어서,
상기 암 세포가 순환성 종양 세포인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계가 차세대 서열분석 (NGS)의 사용을 수반하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 RNA 전사체를 식별하는 단계가 종양 시료의 RNA를 서열분석하는 단계 및/또는 종양 시료의 RNA로부터 수득된 DNA 라이브러리를 서열분석하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되는 에피토프에서 암 백신 접종에 대한 유용성을 확인하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백신이 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 폴리펩타이드가 에피토프를 최대 30개 포함하는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 폴리펩타이드가 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되진 않지만 암 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 에피토프를 더 포함하는, 방법.
제11항에 있어서,
상기 하나 이상의 RNA 전사체에 의해 암호화되지 않는 하나 이상의 에피토프가 암 특이적인 신생에피토프인, 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에피토프가 백신 서열을 형성하기 위해 이의 본래의 서열 상태로 존재하는, 방법.
제13항에 있어서,
상기 백신 서열이 아미노산 약 30개 길이인, 방법.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에피토프 및/또는 백신 서열이 머리에서 꼬리로 정렬된, 방법.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에피토프 및/또는 백신 서열이 링커에 의해 이격된, 방법.
제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에피토프 및/또는 백신 서열이 종양 시료에서 비-종양 조직에서와 동일한 아미노산 서열을 가지는, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백신이 RNA 백신인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백신이 예방학적 백신 및/또는 치료학적 백신인, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 의해 수득되는 개인 맞춤형 암 백신.
암 환자의 종양 시료에서 RNA 전사체의 발현으로부터 생기는 에피토프를 포함하는 재조합 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하며,
RNA 전사체가 사전 결정된 발현 역치를 초과하는 카피수로 종양 시료에 존재하는, 개인 맞춤형 암 백신.
제21항에 있어서,
상기 종양 시료에서 RNA 전사체의 카피수가 비-종양 조직에 비해 10배 이상, 바람직하게는 1000배 이상 높은, 개인 맞춤형 암 백신.
제21항 또는 제22항에 있어서,
상기 폴리펩타이드가 RNA 전사체에 의해 암호화되진 않지만 암 세포에 의해 발현되는 에피토프를 더 포함하는, 개인 맞춤형 암 백신.
(a) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 개인 맞춤형 암 백신을 제공하는 단계; 및
(b) 백신을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 백신을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 백신이 정맥내, 피부에, 근육으로 또는 피하로 투여되는, 방법.