CN112533630A - 用于癌症的个体化疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤免疫治疗领域。特别地，本发明基于在患者的肿瘤标本中对在所述患者的一个或更多个癌细胞中过度上调的RNA转录物进行转录物组分析，提供了对患者的肿瘤具有特异性的个体化癌症疫苗。这些个体化癌症疫苗在施用于患者时，通过在所述患者的一个或更多个癌细胞中过度上调的RNA转录物来诱导针对在患者肿瘤中表达的肿瘤相关抗原的免疫应答。由于RNA转录物的过度上调，所述个体化癌症疫苗对于对象的疫苗接种和打破针对在所述对象中作为自身蛋白质的肿瘤相关抗原的自身耐受是有效的。

Description

用于癌症的个体化疫苗
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域。特别地，本发明基于在患者的肿瘤标本中对在所述患者的一个或更多个癌细胞中过度上调的RNA转录物进行转录物组(transcriptome)分析，提供了对患者的肿瘤具有特异性的个体化癌症疫苗。这些个体化癌症疫苗在施用于患者时，通过在所述患者的一个或更多个癌细胞中过度上调的RNA转录物来诱导针对在患者肿瘤中表达的肿瘤相关抗原的免疫应答。由于RNA转录物的过度上调，个体化癌症疫苗对于对象的疫苗接种和打破针对在所述对象中作为自身蛋白质的肿瘤相关抗原的自身耐受是有效的。
背景技术
癌症是导致死亡的主要原因，占所有死亡的四分之一。传统上，癌症的治疗基于平均法则(the law ofaverage)-即对最大数量的患者最有效。然而，由于癌症中的分子异质性，通常少于25％的被治疗个体从经批准的治疗中获益。基于患者的定制治疗的个体化医疗被认为是药物开发中创新的效率低且成本高的潜在解决方案。
抗原特异性免疫治疗旨在增强或诱导患者中的特异性免疫应答以控制恶性疾病。越来越多的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原的鉴定导致用于免疫治疗的合适靶标的广泛集合。可通过主动或被动免疫接种策略特异性地靶向呈递来源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。主动免疫接种倾向于诱导和扩增患者中的抗原特异性T细胞，其能够特异性地识别并杀伤病变细胞(diseased cell)。相比之下，被动免疫接种依赖于在体外扩增并任选地遗传改造的T细胞的过继转移(过继性T细胞治疗(adoptive T cell therapy)；ACT)。
肿瘤疫苗旨在通过主动免疫接种诱导内源性肿瘤特异性免疫应答。不同的抗原形式可用于肿瘤疫苗接种，包括完整的病变细胞、蛋白质、肽或免疫载体(例如RNA、DNA或病毒载体)，其可直接体内应用或通过进行DC的脉冲随后转移到患者中来体外应用。
多种病原体相关抗原和肿瘤相关抗原的发现为抗原特异性免疫治疗概念提供了基础。肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)是由于肿瘤细胞遗传不稳定性而在其上表达的不常见的蛋白质，其在正常细胞中没有或有限的表达。这些TAA可导致免疫系统对恶性细胞的特异性识别。此外，癌症可由基因组突变和表观遗传学变化的累积引起，其中一部分可具有病因的作用。除肿瘤相关抗原之外，人癌症还平均携带100至120个非同义突变，其中许多可被疫苗靶向。肿瘤中多于95％的突变是独特的和患者特异性的。可产生肿瘤特异性T细胞表位的蛋白质改变体细胞突变的数量为30至400。突变被认为是用于癌症免疫治疗的理想靶标。作为在任何健康组织中均严格缺乏表达的新表位，预期其是安全的并且可避开中心耐受机制(central tolerance mechanism)。我们最近已提出了靶向个体突变谱的个性化免疫治疗方法(Castle，J.C.，et al.，Cancer Res 72，1081(2012))。
尽管用于免疫治疗方法的有吸引力的靶结构的数量不断增加，但用于免疫治疗的合适表位的限定仍然是一个挑战。针对自身蛋白质的免疫应答的诱导需要打破免疫自身耐受。由于免疫耐受性，自身蛋白质或其肽仅具有弱的免疫原性。
因此，需要提供用于癌症患者的疫苗接种的靶结构。这些靶结构在用于疫苗方法时特别地应克服自身耐受机制。
发明概述
本发明人已发现许多肿瘤是由RNA转录物的特征性模式限定的。特别地，发现特定的RNA转录物在特定的肿瘤和个体患者中高度上调。本发明基于以下发现：个体患者的肿瘤具有特征性转录物组模式以及过度上调的RNA转录物，所述RNA转录物在正常健康细胞和相同或不同组织类型的组织中不表达或以显著较低的量表达。肿瘤的转录物组模式使肿瘤在RNA水平上是独特的，并且可与非癌组织(包括对应的非癌组织和其他非癌组织)区分开。这样的独特转录物组模式使得能够产生特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤组织的疫苗。本公开内容涉及基于由这样的过度上调的RNA转录物编码的肿瘤相关抗原来提供个体化的(即，患者特异性的)癌症疫苗。特别地，本文中提供的个体化癌症疫苗包含或编码来源于由这样的过度上调的RNA转录物编码的氨基酸序列的至少一个表位。本发明旨在免疫治疗性地靶向RNA转录物的表达产物，所述RNA转录物在患者的肿瘤细胞中过度上调但在所述患者的非致瘤细胞中不表达或以显著较低的量表达。例如，下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)使得能够在癌细胞中快速并经济有效地鉴定患者特异性转录物组谱。
鉴定癌细胞中过度上调的转录物种类，并且通过施用包含来源于由一种或更多种过度上调的转录物种类编码的氨基酸序列的一个或更多个表位的多肽或者编码所述多肽的核酸(例如RNA)来向患者提供所述一个或更多个表位，目的是在对多肽进行适当加工并通过MHC分子呈递表位以向患者的免疫系统展示表位以刺激、致敏(priming)和/或扩展针对患者癌细胞的适当的T细胞之后诱导针对所述表位的免疫应答，这提供了对患者的癌症具有特异性的新策略。利用在循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)中存在的转录物组谱使得能够提供诱导潜在地靶向原发性肿瘤以及肿瘤转移的免疫应答的疫苗。本发明利用了存在于个体患者的癌细胞中的特征性转录物组谱(transcriptome profile)，而不是检索存在于许多患者中的用于靶向的共同分子特性(denominator)。
在一个方面中，本发明涉及用于产生个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：
(a)鉴定存在于癌症患者的肿瘤标本中的一种或更多种RNA转录物，其中所述一种或更多种RNA转录物中的每一种编码氨基酸序列，并且其中所述一种或更多种RNA转录物中的每一种以超过预先确定的表达阈值的拷贝数存在于肿瘤标本中；以及
(b)提供疫苗，其特征在于至少一个表位来源于由所述一种或更多种RNA转录物编码的氨基酸序列。
在一个实施方案中，鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括确定存在于癌症患者的肿瘤标本中的RNA转录物的拷贝数，以及将RNA转录物中每一种的拷贝数与各自的预先确定的表达阈值进行比较。
在一个实施方案中，在肿瘤标本中RNA转录物的拷贝数是非肿瘤组织中的至少10倍，优选至少1000倍。
在一个实施方案中，肿瘤标本中RNA转录物的拷贝数为至少50、100、500、1000、2000、3000、4000或5000个转录物/百万(transcripts per million，TPM)，并且非肿瘤组织中RNA转录物的拷贝数小于肿瘤标本中所述RNA转录物的拷贝数的10％、5％、1％、0.1％或0.01％。
在一个实施方案中，鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括对一个或更多个癌细胞进行单细胞测序。
在一个实施方案中，癌细胞是循环肿瘤细胞。
在一个实施方案中，鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括使用下一代测序(NGS)。
在一个实施方案中，鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括对肿瘤标本的RNA和/或从肿瘤标本的RNA获得的DNA文库进行测序。
在一个实施方案中，鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤至少一式两份重复进行。
在一个实施方案中，该方法包括确定由一种或更多种RNA转录物编码的表位用于癌症疫苗接种的可用性的进一步的步骤。
在一个实施方案中，疫苗包含含有由一种或更多种RNA转录物编码的一个或更多个表位的多肽，或者编码所述多肽的核酸。
在一个实施方案中，多肽包含至多30个表位。
在一个实施方案中，多肽还包含不是由一种或更多种RNA转录物编码但是由癌细胞表达的一个或更多个表位。
在一个实施方案中，不是由一种或更多种RNA转录物编码的一个或更多个表位是癌症特异性新表位。
在一个实施方案中，表位处于其天然序列环境中以便于形成疫苗序列。
在一个实施方案中，疫苗序列为约30个氨基酸长。
在一个实施方案中，表位和/或疫苗序列头对尾排列(lined up head-to-tail)。
在一个实施方案中，表位和/或疫苗序列通过接头隔开。
在一个实施方案中，表位和/或疫苗序列在肿瘤标本中具有与在非肿瘤组织中相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗是RNA疫苗。
在一个实施方案中，疫苗是预防性和/或治疗性疫苗。
在另一个方面中，本发明涉及个体化癌症疫苗，其通过本文中所述的方法获得。
在另一个方面中，本发明涉及个体化癌症疫苗，其包含重组多肽或编码所述多肽的核酸，所述重组多肽包含由RNA转录物在癌症患者的肿瘤标本中的表达而产生的表位，其中RNA转录物以超过预先确定的表达阈值的拷贝数存在于肿瘤标本中。
在一个实施方案中，在肿瘤标本中RNA转录物的拷贝数是非肿瘤组织(例如，与肿瘤标本具有相同和不同组织类型的非肿瘤组织)中的至少10倍，优选至少1000倍。
在一个实施方案中，在肿瘤标本中RNA转录物的拷贝数为至少50、100、500、1000、2000、3000、4000或5000个转录物/百万(TPM)，并且非肿瘤组织中RNA转录物的拷贝数小于肿瘤标本中所述RNA转录物的拷贝数的10％、5％、1％、0.1％或0.01％。
在一个实施方案中，多肽还包含不是由RNA转录物编码但是由癌细胞表达的表位。
在另一个方面中，本发明涉及治疗癌症患者的方法，其包括以下步骤：
(a)通过本文中所述的方法提供个体化癌症疫苗；以及
(b)向患者施用所述疫苗。
在另一个方面中，本发明涉及治疗癌症患者的方法，其包括向患者施用本文中所述的疫苗。
在一个实施方案中，所述疫苗静脉内、经皮肤(dermally)、经肌肉(muscularly)或皮下施用。
在一个方面中，本发明涉及疫苗，其包含一种或更多种多肽或者编码所述一种或更多种多肽的核酸(例如RNA)，每种多肽包含来源于在癌症患者的肿瘤标本中过度上调的一种或更多种RNA转录物的一个或更多个表位。这样的疫苗的一些优选实施方案如以上在本发明的方法的情况下描述的。
根据本发明提供的疫苗可包含可药用载体并且可任选地包含一种或更多种佐剂、稳定剂等。疫苗可以是治疗性或预防性疫苗的形式。
另一个方面涉及用于在患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用根据本发明提供的疫苗。
在另一些方面中，本发明提供了本文中所述的疫苗，其用于本文中所述的治疗方法，特别地用于治疗或预防癌症。
本文中所述的癌症的治疗可与手术切除和/或放射和/或传统化学治疗组合。
从以下发明详述和所附权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图简述
图1：B16-F10黑素瘤细胞系中差异表达基因的一些实例
黑素瘤细胞系B16-F10和鼠组织(细分为三类：正常组织(n＝46)、生殖组织(n＝5)和胚胎组织(n＝14))中选定基因的以每百万的转录物(TPM)计的表达值。组织表达以每个组织所有样品的中位值给出。圆圈指示单组织中位值。箱图中心线指示所有组织的中位值，框示出了第一个和第三个四分位数，须(whisker)为距离中位值的2.5倍四分位数。
图2：Tyrp1 RNA疫苗的免疫原性测试
在第0、7和14天(参见时间线)，用40μg配制成脂质复合物(lipoplex)的Tyrp1抗原编码RNA或40μg不相关RNA对C57BL/6小鼠(每组n＝5)进行免疫接种。在最后一次疫苗接种之后五天，将小鼠的脾细胞分离并通过IFNγELISpot分别测试对编码MHC I表位(TAPDNLGYA)和MHC II表位(CRPGWRGAACNQKI)的两种Tyrp1肽的识别。左侧示出了单个小鼠一式三份的平均斑点数(点)以及所有小鼠的平均值(条)。右侧示出了ELISpot板的图片。每行代表一只小鼠。
图3：Dct RNA疫苗的免疫原性测试
用20μg Dct编码RNA脂质复合物或NaCl对C57BL/6小鼠(每组n＝5)重复进行疫苗接种(疫苗接种时间用虚线指示)。在第一次疫苗接种之后第5、12、19、26和33天，通过流式细胞术经MHC四聚体(MBL international)染色在血液中测量针对Dct(SVYDFFVWL)的CD8+T细胞应答。示出了所有CD8+淋巴细胞中四聚体+CD8+T细胞的频率(平均值±平均值的标准误差)。
图4：Pmel RNA疫苗的免疫原性测试
如时间线所示，用20μg Pmel编码RNA脂质复合物对C57BL/6小鼠(每组n＝8)重复进行疫苗接种。在第一次疫苗接种之后27天，通过IFNγELISpot针对Pmel肽(EGSRNQDWL)或不相关肽(VSV-NP，RGYVYQGL)对小鼠的脾细胞进行探测。示出了单个小鼠一式三份的平均斑点数(点)以及所有小鼠的平均值(条)。
图5：Fkbp6 RNA疫苗的免疫原性测试
如时间线所示，用20μg Fkbp6编码RNA脂质复合物对C57BL/6小鼠(每组n＝3)重复进行疫苗接种。在最后一次疫苗接种之后5天，通过IFNγELISpot测试小鼠的脾细胞对经Fkbp6 RNA或不相关RNA(对照)电穿孔的BMDC的识别。示出了合并小鼠脾细胞的一式两份(对照)或一式三份(Fkbp9)的平均斑点数加标准偏差。
图6：治疗性Tyrp1疫苗接种之后的肿瘤控制
用3×105个B16-F10肿瘤细胞对C57BL/6小鼠(每组n＝11至12)进行i.v.接种。如时间线所示，开始用Tyrp1或不相关对照RNA进行RNA脂质复合物疫苗接种。示出了每只小鼠的肺肿瘤结节计数(左)、示例性肺(中间)以及存活(右)。
图7：治疗性Tyrp1或Dct疫苗接种之后的肿瘤控制
如时间线所示，将3×105个萤光素酶转基因B16-F10肿瘤细胞(B16-F10-LUC)i.v.注射到初始C57BL/6小鼠(每组n＝12)中并进行处理。示出了由萤光素酶生物发光确定的中位肿瘤生长(左)、每只小鼠的肺肿瘤结节计数(中间，平均值±平均值的标准误差)以及每只小鼠的肺重量(右，平均值±平均值的标准误差)。
图8：肿瘤模型CT26、MC38、TRAMP-C2和4T1中差异表达基因的一些实例
小鼠肿瘤细胞系CT26(A)、MC38(B)、TRAMP-C2(C)和4T1(D)以及鼠组织(细分为三类：正常组织(n＝46)，生殖组织(n＝5)和胚胎组织(n＝14))中选定基因的以每百万的转录物(TPM)计的表达值。组织表达以每个组织所有样品的中位值给出。圆圈指示单组织中位值。箱图中心线指示所有组织的中位值，框示出了第一个和第三个四分位数，须为距离中位值的2.5倍四分位数。
图9：在CT26肿瘤细胞系中鉴定的靶标的免疫原性测试
如时间线所示，用20μg抗原编码RNA脂质复合物对BALB/c小鼠(每组n＝3)重复进行疫苗接种。在最后一次疫苗接种之后5天，通过IFNγELISpot测试小鼠脾细胞对经抗原编码RNA或不相关RNA(对照)电穿孔的BMDC的识别。示出了合并小鼠脾细胞的一式三份的平均斑点数加标准偏差。
图10：在MC38肿瘤细胞系中鉴定的靶标的免疫原性测试
如时间线所示，用20μg抗原编码RNA脂质复合物对C57BL/6小鼠(每组n＝3)重复进行疫苗接种。在最后一次疫苗接种之后5天，通过IFNγELISpot测试小鼠脾细胞对经抗原编码RNA或不相关RNA(对照)电穿孔的BMDC的识别。上图示出了合并小鼠脾细胞的一式两份(对照)或一式三份(Gm14819、Rhox2h、Gm15091、Ash21、Gm15097、Dppa4)的平均斑点数加标准偏差。下图示出了针对靶标Mageb2、Gm773、Prl2c2、Fmrlnb和Luzp4的来自单个小鼠一式三份的脾细胞的平均斑点数加平均值的标准误差。
图11：在TRAMP-C2肿瘤细胞系中鉴定的靶标的免疫原性测试
如时间线所示，用20μg抗原编码RNA脂质复合物对C57BL/6小鼠(每组n＝3)重复进行疫苗接种。在最后一次疫苗接种之后5天，通过IFNγELISpot测试小鼠脾细胞对经抗原编码RNA或不相关RNA(对照)电穿孔的BMDC的识别。示出了合并小鼠脾细胞的一式两份(对照)或一式三份(抗原)的平均斑点数加标准偏差。
发明详述
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些特定实施方案的目的，并且不旨在限制本公开内容的范围，本公开内容的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel and H.
Figure BDA0002909720290000081
Eds.，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland，(1995)中所述进行定义。
除非另外指出，否则本公开内容的实施将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，J.Sambrook et al.eds.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素随一些具体实施方案列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的一些实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述要素的任何排列和组合应被认为被本说明书所公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所列举或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％、或±3％。
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定义
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且至多约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
根据本发明，“核酸”优选为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)。
在本公开内容中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA末端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的RNA被认为是天然存在RNA的类似物。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是与编码肽或蛋白质的RNA转录物相关的信使RNA(mRNA)。如本领域中认可的，mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mRNA通过使用DNA模板的体外转录产生，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
根据本公开内容，术语“RNA编码”意指，如果存在于合适环境中，例如靶组织的细胞内，则RNA可在翻译过程期间指导氨基酸的组装以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，RNA能够与细胞翻译机器相互作用，从而允许肽或蛋白质的翻译。细胞可在细胞内(例如在胞质中和/或在细胞核中)产生编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可使其在表面上产生。
例如作为预先确定的表达阈值的“参照”可用于关联和比较在本发明的方法中从肿瘤标本中获得的结果。通常来说，“参照”可基于一种或更多种正常组织，特别是不受肿瘤或癌症疾病影响的组织(即非肿瘤组织)获得，所述组织通常获自与肿瘤标本所来源的患者不同的一个或更多个个体，优选健康个体，特别是相同物种的个体。非肿瘤组织通常包括与肿瘤标本所来源的组织不同的组织，并且可包括与肿瘤标本所来源的组织相对应的组织。
本文中使用的术语例如“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低例如约5％或更大、约10％或更大、约20％或更大、约50％或更大、或约75％或更大的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上降低至零。
在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％、或至少约100％。
在本公开内容的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传工程制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物质”不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从天然来源分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。
术语“每百万的转录物”或“TPM”是RNA-seq的归一化方法，并且应理解为“对于样品中每1,000,000个RNA分子，x来自该基因/转录物”。
过度上调的RNA转录物
本发明涉及用于产生个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：
(a)鉴定存在于癌症患者的肿瘤标本中的一种或更多种RNA转录物，其中所述一种或更多种RNA转录物中的每一种编码氨基酸序列，并且其中所述一种或更多种RNA转录物中的每一种以超过预先确定的表达阈值的拷贝数存在于肿瘤标本中；以及
(b)提供疫苗，其特征在于至少一个表位来源于由所述一种或更多种RNA转录物编码的氨基酸序列。
本文中使用的术语“表达阈值”涉及与RNA转录物的表达水平(即，拷贝数)相关的定量界限/值，并且将被考虑用于实施本文中所述的方法。RNA转录物的表达阈值通常是所述RNA转录物的特征。通常来说，低于表达阈值的表达水平不被认为反映了(例如，肿瘤或癌组织中)RNA转录物的过度上调，并且特别地被认为反映了健康组织中RNA转录物的(潜在)表达。通常来说，高于表达阈值的表达水平被认为反映了(例如，肿瘤或癌组织中)RNA转录物的过度上调，并且特别地不被认为反映了健康组织中RNA转录物的(潜在)表达。因此，术语“表达阈值”是指这样的RNA转录物表达水平，高于该表达水平RNA转录物被认为适合用于提供疫苗，所述疫苗的特征在于至少一个表位来源于由RNA转录物编码的氨基酸序列。通常选择表达阈值以使得不期望在健康组织中RNA转录物的表达水平超过所述阈值。相反，通常选择表达阈值以使得在健康组织中RNA转录物的表达远低于所述阈值。在病变组织例如癌症组织中(例如，在肿瘤标本中)所述RNA转录物的表达水平高于所述表达阈值通常指示该RNA转录物适合于提供特征在于至少一个表位来源于由该RNA转录物编码的氨基酸序列的疫苗。通常通过获得有关在(健康)组织、优选地不同组织类型的组织组群、任选地不同对象(优选地相同物种的对象)的组织中RNA转录物表达水平的信息来确定表达阈值，并且考虑所获得的有关RNA转录物表达水平的信息来对阈值进行限定。这样的组织组群可包括10个或更多个，例如100个或更多个不同的组织类型。有关RNA转录物表达水平的信息可例如从可公开获得的数据库例如序列读取存档(Sequence Read Archive，SRA)中获得。通常计算表达阈值以实现关于适合于提供疫苗的RNA转录物的有效性和/或安全性的有用预测，所述疫苗的特征在于至少一个表位来源于由该RNA转录物编码的氨基酸序列。通常来说，表达阈值远高于针对健康组织中RNA转录物确定的最高表达水平，并且包括安全范围(margin)；例如，针对健康组织中RNA转录物确定的(例如，最高或中位)表达水平的某个倍增因数。这样的安全因数可以是例如健康组织中表达水平的10倍、100倍或1000倍高。优选地，在本文中所述的方法中表达阈值可用于许多RNA转录物，特别是编码转录物，例如至少100、至少1000或至少10000个RNA转录物。通常来说，这样的表达阈值是预先确定的值，其中术语“预先确定的”或“预先限定的”表示独立于肿瘤标本中RNA转录物表达水平的确定的恒定值，即，尚未确定何时确定肿瘤标本中RNA转录物的表达水平，并且选择该值作为必须与肿瘤标本中确定的RNA转录物的表达水平进行比较的值。因此，表达阈值是与对象中，特别是对象的不同组织中RNA转录物的表达水平相关并提供有关其的信息的定量值。在本文中所述的方法中，不需要确定对象的非肿瘤标本中RNA转录物的表达水平，并且不需要将在对象的肿瘤标本中确定的RNA转录物的表达水平与在相同对象的非肿瘤标本中相同RNA转录物的表达水平进行比较。相反，在对象的肿瘤标本中确定许多RNA转录物(例如，至少10个、至少100个、至少1000个或至少10000个RNA转录物)的表达水平，并将其与为(例如，如上所述的)许多RNA转录物(例如，至少100个、至少1000个或至少10000个RNA转录物)中的每一个预先确定的表达阈值进行比较。因此，本发明的方法可涉及使用数据集合，例如包含有关许多RNA转录物，特别是编码转录物，例如至少100个、至少1000个或至少10000个RNA转录物的表达阈值的信息的数据库。本发明的方法可涉及将对象的肿瘤标本中许多RNA转录物中的每一个的表达水平与包含有关许多RNA转录物的表达阈值的信息的数据集合进行比较，以确定比较的表达水平是否超过了包含在数据集合内的各自表达阈值。表达水平超过包含在数据集合内的各自的表达阈值的那些RNA转录物可被认为适合或潜在地适合于提供疫苗。在一个实施方案中，本发明的方法可随时间进行直至获得足够数量的被认为适合或潜在地适合于提供疫苗的RNA转录物。一旦达到这个点，就可停止该方法。
术语“过度上调的RNA转录物”，“以超过预先确定的表达阈值的拷贝数存在于肿瘤标本中的RNA转录物”或类似的术语涉及与非肿瘤组织相比其在肿瘤标本中的存在或表达强烈提高的RNA。在多个实施方案中，与在非肿瘤组织中的存在或表达相比，RNA的存在或表达为至少10倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍或甚至更高。根据本发明优选的是在胸腺和/或在关键器官(例如心脏、脑等)中不表达或仅以少量表达的那些RNA转录物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
i)提供来自癌症患者的肿瘤标本；
ii)鉴定在肿瘤标本中过度上调的RNA转录物；
iii)设计多肽，所述多肽包含由步骤(ii)中确定的过度上调的RNA转录物中的一种或更多种编码的氨基酸序列的表位；
iv)提供步骤(iii)中设计的多肽或编码所述多肽的核酸，优选RNA；以及
v)提供包含步骤(iv)中提供的多肽或核酸的疫苗。
根据本发明，“肿瘤标本”是这样的样品，例如来源于包含或怀疑包含肿瘤或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC))的患者的身体样品，特别是包含体液例如血液的组织样品，和/或细胞样品，并且可来源于肿瘤组织。在一个实施方案中，肿瘤标本涉及一个或更多个分离的肿瘤或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))或者包含一个或更多个分离的肿瘤或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))的样品。
根据本发明，“非肿瘤组织”是不受肿瘤或癌症影响并且不包含肿瘤或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))的组织。
身体样品可以以常规方式获得，例如通过组织活检，包括钻取活检，以及通过采集血液、支气管抽吸物、痰、尿、粪便或其他体液。根据本发明，术语“样品”还包括加工的样品，例如生物样品的级分或分离物，例如核酸或细胞分离物。
本发明可涉及鉴定存在于患者的一个或更多个癌细胞中的所有过度上调的RNA转录物，或者其可涉及鉴定存在于患者的一个或更多个癌细胞中的仅一部分过度上调的RNA转录物。通常来说，本发明的方法提供了鉴定许多过度上调的RNA转录物，其提供了足够数目的表位以包含在疫苗中。
在本发明的上下文中，转录物组意指给定个体的一个细胞、细胞群(优选癌细胞群)或所有细胞在特定时间点产生的所有RNA分子(包括mRNA、rRNA、tRNA和其他非编码RNA)的集合。因此，本发明的方法可包括鉴定一个或更多个癌细胞的转录物组，优选整个转录物组的过度上调的RNA转录物。在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤标本中过度上调的RNA转录物的步骤包括鉴定全转录物组过度上调的RNA转录物谱。
转录物组与外显子组的不同之处在于，其仅包含在特定细胞或细胞群中发现的那些RNA分子，并且除其分子身份之外，还可包含每个RNA分子的量或浓度。与大致固定于给定细胞系(排除突变)的基因组不同，转录物组可随外部环境条件而变化。
在一个实施方案中，鉴定过度上调的RNA转录物的步骤包括对一个或更多个，优选地2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或者甚至更多个癌细胞进行单细胞测序。因此，本发明的方法可包括鉴定所述一个或更多个癌细胞的转录物组特征。在一个实施方案中，癌细胞是循环肿瘤细胞。癌细胞(例如循环肿瘤细胞)可在单细胞测序之前分离。
在一个实施方案中，鉴定过度上调的RNA转录物的步骤包括使用下一代测序(NGS)。
在一个实施方案中，鉴定过度上调的RNA转录物的步骤包括对肿瘤标本的RNA进行测序。
为了揭示过度上调的RNA转录物，将有关从肿瘤标本获得的RNA转录物的性质和水平的信息与预先确定的表达阈值进行比较。这样的表达阈值通常针对RNA转录物基于其在正常非癌细胞或组织中的表达水平来确定。在一个实施方案中，从数据库中获得相应的信息。在一个实施方案中，相应的信息包括多于一种组织类型，例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少50种或至少100种组织类型的非肿瘤组织(及其各自的RNA表达水平)。在一个实施方案中，相应的信息包括例如在数据库中可获得其RNA表达水平的所有可获得组织类型的非肿瘤组织(及其各自的RNA表达水平)。在一个实施方案中，相应的信息包括一个或更多个关键器官(例如，肺、心、脑、CNS、肾和肝中的一个或更多个，优选全部)的非肿瘤组织(及其各自的RNA表达水平)。在一个实施方案中，相对于一个或更多个，优选所有这样的关键器官的非肿瘤组织，肿瘤标本中RNA转录物的过度上调是所需的，并且优选地RNA转录物在这样的关键器官的非肿瘤标本中不表达或不显著表达。在一个实施方案中，相应的信息排除一个或更多个生殖器官(例如睾丸、卵巢和胎盘中的一个或更多个，优选全部)的非肿瘤组织(及其各自的RNA表达水平)。在一个实施方案中，相对于一个或更多个，优选所有这样的生殖器官的非肿瘤组织，肿瘤标本中RNA转录物的过度上调不是所需的。
可使用任何合适的方法来确定癌症患者的肿瘤标本中过度上调的RNA转录物。通常来说，这样的方法包括确定部分或完整的转录物组谱，即，癌症患者的肿瘤组织或肿瘤细胞的一种或更多种转录物的相对量或绝对量。然后相对于失调或过度上调的RNA种类评估这样的转录物组谱。
转录物组学的研究(其包括表达谱绘制、剪接变体分析等)检查了给定细胞群中转录物的表达水平，其通常侧重于mRNA，但有时包括其他例如tRNA、sRNA。
转录物组学技术是用于研究生物体转录物组(所有其RNA转录物的总和)的技术。生物体的信息内容记录在其基因组的DNA中，并通过转录表达。在此，mRNA在信息网络中用作瞬时中介分子，而非编码RNA则执行另外的多种功能。转录物组捕获细胞中存在的全部转录物的时间快照。研究整个转录物组的首次尝试始于20世纪90年代初，并且自20世纪90年代后期以来的技术进步已使转录物组学成为一门广泛的学科。该领域中有两种重要的当代技术：微阵列，其可对一组预先确定序列进行定量；和RNA-Seq，其使用高通量测序来捕获所有序列。转录也可通过单细胞转录物组学在单个细胞水平上研究。
微阵列
通过其与互补探针阵列杂交来测量限定转录物集合的丰度的微阵列于1995年首次发表。微阵列技术允许同时测定数千种转录物，大大降低了成本/基因并且节省了劳动。直至2000年代后期，斑点寡核苷酸阵列和Affymetrix高密度阵列二者均是用于转录谱绘制的首选方法。在这段时间期间，产生了一系列微阵列来覆盖模型或经济上重要的生物体中的已知基因。阵列设计和制造的进步提高了探针的特异性，并允许在单阵列上测试更多的基因。荧光检测的进步提高了低丰度转录物的灵敏度和测量准确度。
RNA-Seq
RNA-Seq是指对转录物cDNA进行的测序，其中丰度来源于每个转录物的计数数目。因此，该技术受到高通量测序技术发展的严重影响。大规模平行签名测序(MassivelyParallel Signature Sequencing，MPSS)是基于通过复杂的杂交系列产生16至20bp序列的早期实例，并于2004年用于验证拟南芥(Arabidopsis thaliana)中一万个基因的表达。最早的RNA-Seq工作于2006年发表，其使用454技术对十万个转录物进行测序。这是对相对转录物丰度进行定量的充分覆盖。当新的Solexa/Illumina技术允许记录10亿个转录物序列时，RNA-Seq在2008年之后开始越来越受欢迎。该产量现在允许对人转录物组进行定量和比较。
可公开获得的转录物组数据库
大多数基因的功能尚不清楚。检索转录物组数据库可给予研究人员其中表达基因的所有组织的列表，从而提供有关其可能发挥功能的线索。例如，如果转录物组数据库显示未知基因在癌细胞中的表达水平显著高于健康细胞中的，则该未知基因可能在细胞生长中发挥作用。转录物组数据向技术人员提供了相关信息，以鉴定癌细胞中过度上调的RNA转录物。
作为国立卫生研究院(National Institutes ofHealth，NIH)一部分的国家人基因组研究所(National Human Genome Research Institute，NHGRI)参与了为全世界研究人员创建转录物组资源的两个项目：哺乳动物基因收集倡议(Mammalian Gene Collectioninitiative)和小鼠转录物组项目(Mouse Transcriptome Project)。哺乳动物基因收集倡改建立了人、小鼠和大鼠mRNA序列的免费公开文库，并且在本发明的上下文中可用作合适的数据库。该项目由NHGRI和国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)(也为NIH的一部分)领导。小鼠和大鼠是研究人生物学的重要模型。小鼠转录物组项目是NIH支持的倡议，其产生了许多小鼠组织的基因转录物的免费公开数据库，并且在本发明的上下文中可用作合适的数据库。这些映射到小鼠基因组的组织特异性基因表达数据可在小鼠参考转录物组数据库中以可检索的格式获得。存在数种其他转录物组资源，包括NIH项目中的那些例如基因型组织表达项目(GTEx)和DNA元素百科全书(ENCODE)，所有这些在本发明的上下文中均可用作合适的数据库。因此，GTEx正在创建人基因在多种不同组织中表达的目录。ENCODE研究人员旨在表征和了解基因组包括转录物组的工作部分。Novartis和欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)二者均具有良好建立的基因表达数据库，所有这些在本发明的上下文中均可用作合适的数据库。
已构建并注释了许多生物体特异性转录物组数据库以帮助鉴定在不同细胞群中差异表达的基因，所有这些在本发明的上下文中均可用作合适的数据库。
尽管仍使用较旧的DNA微阵列技术，但是RNA-Seq正在成为用于测量生物体的转录物组的首选方法。根据本发明，RNA-Seq优选用于鉴定过度上调的RNA转录物。
根据本发明可使用任何合适的测序方法，优选下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法在未来可替代NGS技术以加速方法的测序步骤。出于说明目的，术语“下一代测序”或“NGS”在本发明的上下文中意指全部的新高通量测序技术，其与称为Sanger化学的“常规”测序方法形成对比，通过将整个基因组断裂成小碎片来沿着整个基因组平行地随机读取核酸模板。这样的NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如在1至2周内，优选地在1至7天内或者最优选地在少于24小时内递送整个基因组、外显子组、转录物组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息并且在原理上允许单细胞测序方法。在本发明的上下文中可使用可商购获得或文献中提及的多个NGS平台，例如Zhang et al.2011：The impact of next-generation sequencing ongenomics.J.Genet Genomics 38(3)，95-109；或者Voelkerding et al.2009：Nextgeneration sequencing：From basic research to diagnostics.Clinical chemistry55，641-658中详细描述的那些。这样的NGS技术/平台的非限制性实例为：
1)例如在Roche联合公司454 Life Sciences(Branford，Connecticut)的GS-FLX454 Genome SequencerTM中实施的称为焦磷酸测序的边合成边测序技术，其首先在Ronaghiet al.1998：A sequencing method based on real-time pyrophosphate″.Science 281(5375)，363-365中进行了描述。这项技术使用乳液PCR，其中通过剧烈涡旋将单链DNA结合珠包封在由油包围的包含PCR反应物的水性胶束中，以用于进行乳液PCR扩增。在焦磷酸测序过程期间，随着聚合酶合成DNA链，记录在核苷酸并入期间从磷酸分子发射的光；
2)由Solexa(现在为Illumina Inc.，San Diego，California的一部分)开发的边合成边测序方法，其基于可逆染料-终止剂并且例如在Illumina/Solexa GenomeAnalyzerTM中和在Illumina HiSeq 2000 Genome AnalyzerTM中实施。在这项技术中，将全部四种核苷酸与DNA聚合酶一起同时添加至流式细胞通道中的寡聚物致敏的簇片段中。桥接扩增用所有四种荧光标记的核苷酸延伸簇链用于测序；
3)例如在Applied Biosystems(现在为Life Technologies Corporation，Carlsbad，California)的SOLidTM平台中实施的边连接边测序方法。在这项技术中，根据测序位置标记固定长度的所有可能寡核苷酸的库。使寡核苷酸退火并连接；DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生在该位置处的核苷酸的信息的信号。在测序之前，通过乳液PCR扩增DNA。将各自均仅包含相同DNA分子的拷贝的所得珠沉积在载玻片上。作为第二个实例，Dover Systems(Salem，New Hampshire)的PolonatorTMG.007平台还采用通过使用随机排列的基于珠的乳液PCR来扩增DNA片段用于平行测序的边连接边测序方法；
4)例如在Pacific Biosciences(Menlo Park，California)的PacBio RS系统或在Helicos Biosciences(Cambridge，Massachusetts)的HeliScopeTM平台中实施的单分子测序技术。这项技术的独特特征是其不经扩增对单DNA或RNA分子进行测序的能力，其被定义为单分子实时(Single-Molecule Real Time，SMRT)DNA测序。例如，HeliScope使用高灵敏荧光检测系统来直接随着每个核苷酸合成对其进行检测。Visigen Biotechnology(Houston，Texas)已开发了基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)的类似方法。其他基于荧光的单分子技术来自U.S.Genomics(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)；
5)用于单分子测序的纳米技术，其中使用例如布置在芯片上以监测在复制期间聚合酶分子在单链上的移动的多种纳米结构。基于纳米技术的方法的一些非限制性实例是Oxford Nanopore Technologies(Oxford，UK)的GridONTM平台、由Nabsys(Providence，Rhode Island)开发的杂交辅助纳米孔测序(HANSTM)平台、以及称为组合探针-锚连接(cPALTM)的具有DNA纳米球(DNA nanoball，DNB)技术的基于专有连接酶的DNA测序平台；
6)用于单分子测序的基于电子显微术的技术，例如由LightSpeed Genomics(Sunnyvale，California)和Halcyon Molecular(Redwood City，California)开发的那些；
7)基于检测在DNA聚合期间释放的氢离子的离子半导体测序。例如，离子激流系统(Ion Torrent System)(San Francisco，California)使用微加工孔的高密度阵列以大规模并行方式进行这一生物化学过程。每个孔容纳不同的DNA模板。在孔之下是离子灵敏层并且在其之下是专有离子传感器。
RNA制剂可用作NGS的起始物质。这样的核酸可容易地从例如生物材料的样品，例如从新鲜的、迅速冷冻的或经福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织(FFPE)或者从新鲜分离的细胞或者从患者外周血中存在的CTC获得。
根据本发明，可应用高通量全基因组单细胞基因分型方法。这样的方法可包括以下步骤：
1.从给定患者中获得肿瘤标本。
2.从肿瘤细胞中提取转录物组(RNA)，将其转化为cDNA并进行测序以确定由肿瘤细胞表达的转录物的量。
3.鉴定过度上调的RNA转录物。
疫苗
本文中描述的用于癌症治疗的疫苗的特征在于至少一个表位来源于由一种或更多种过度上调的RNA转录物编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，疫苗包含含有由一种或更多种过度上调的RNA转录物编码的一个或更多个表位的多肽。在一个实施方案中，疫苗包含核酸(特别是RNA)，其编码包含由一种或更多种过度上调的RNA转录物编码的一个或更多个表位的多肽。
因此，对于疫苗接种，将过度上调的RNA转录物的一个或更多个表位以包含所述一个或更多个表位的多肽或者编码所述多肽的核酸(特别是RNA)的形式提供给患者。这样的多肽可以是单表位的或多表位的。此外，这样的多肽可对应于由过度上调的RNA转录物表达的肿瘤相关抗原，或者可以是重组多肽，例如包含来源于由过度上调的RNA转录物表达的一种或更多种肿瘤相关抗原的表位的多肽。核酸可在患者的细胞，特别是抗原呈递细胞中翻译，以产生多肽。在细胞对多肽进行适当加工之后，表位由MHC呈递并展示给患者的免疫系统以用于刺激合适的T细胞。
根据本发明的方法提供的疫苗涉及这样的疫苗，当将其施用于患者时优选地提供MHC呈递表位，例如2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个，并且优选至多60个、至多55个、至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个MHC呈递表位的集合，所述MHC呈递表位来源于由过度上调的RNA转录物编码的氨基酸序列。通过患者的细胞(特别是抗原呈递细胞呈递这些表位)优选地导致T细胞在与MHC结合时靶向所述表位，并且因此靶向表达所述MHC呈递表位所源自的抗原和在肿瘤细胞表面上呈递相同表位的患者肿瘤，优选原发性肿瘤以及肿瘤转移。
对于提供疫苗，本发明的方法可包括将由一种或更多种癌症特异性过度上调的RNA转录物(优选为编码核酸的形式)编码的足够数目的表位任意地包含在疫苗中，或者其可包括确定过度上调的RNA转录物和/或表位用于癌症疫苗接种的可用性的进一步的步骤。因此，进一步的步骤可包括以下的一个或更多：(i)例如根据过度上调的水平对过度上调的RNA转录物进行排序或排名；通常来说，过度上调的RNA转录物越多，越适合于提供疫苗；(ii)评估由过度上调的RNA转录物编码的氨基酸序列是否包含已知或预测的MHC呈递表位，(iii)在体外和/或通过计算机测试由过度上调的RNA转录物编码的氨基酸序列是否包含MHC呈递表位，例如测试由过度上调的RNA转录物编码的氨基酸序列是否包含被加工成MHC呈递表位和/或呈现为MHC呈递表位的序列，以及(iv)在体外测试所设想的表位是否能够刺激具有期望特异性的患者的T细胞，特别是当存在于其天然序列环境中时，例如当侧翼为在天然存在蛋白质中也侧接所述表位的氨基酸序列时，以及当在抗原呈递细胞中表达时。这样的侧翼序列各自可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个并且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。
鉴定具有潜在免疫原性的表位的步骤可包括根据对其MHC结合能力，优选地I类MHC结合能力的预测来确定和/或对表位进行排名。
根据本发明鉴定并由本发明的疫苗提供的表位集合优选以包含所述表位的多肽(多表位或多重表位多肽)或编码所述多肽的核酸(特别是RNA)的形式存在。在本公开内容的某些实施方案中，多肽包含来源于由过度上调的RNA转录物编码的相同或不同肿瘤相关抗原的至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。这些表位可以以疫苗序列的形式存在于多肽中，即存在于其天然序列环境中，例如侧翼为在天然存在蛋白质中也侧接所述表位的氨基酸序列。这样的侧翼序列各自可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个并且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。因此，疫苗序列可包含20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个并且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸。在一个实施方案中，表位和/或疫苗序列在多肽中头对尾排列。
在一个特别优选的实施方案中，将根据本发明的多表位或多重表位多肽以核酸(优选RNA例如体外转录或合成RNA)的形式施用于患者，所述核酸可在患者的细胞例如抗原呈递细胞中表达以产生多肽。
在一个实施方案中，表位和/或疫苗序列通过接头(特别是中性接头)隔开。根据本发明的术语“接头”涉及添加在两个肽结构域(例如表位或疫苗序列)之间以连接所述肽结构域的肽。关于接头序列没有特别限制。然而，优选地，接头序列降低了两个肽结构域之间的空间位阻，被很好地翻译并且支持或允许表位加工。此外，接头应当不具有或仅具有很少的免疫原性序列元件。接头优选地不应当产生非内源性表位，例如由相邻表位之间的接合缝(junction suture)产生的那些，这可能产生不想要的免疫反应。因此，多表位疫苗应优选地包含能够降低不想要的MHC结合接合表位的数目的接头序列。Hoyt et a1.(EMBO J.25(8)，1720-9，2006)和Zhang et al.(J.Biol.Chem.，279(10)，8635-41，2004)已示出，富含甘氨酸的序列会损害蛋白酶体加工，并且因此使用富含甘氨酸的接头序列最大限度地降低可由蛋白酶体加工的包含接头的肽的数目。此外，观察到甘氨酸抑制MHC结合沟位置中的强结合(Abastado et al.，J.Immunol.151(7)，3569-75，1993)。Schlessinger et al.(Proteins，61(1)，115-26，2005)已发现氨基酸序列中包含的氨基酸甘氨酸和丝氨酸导致更高效地翻译和被蛋白酶体加工的更具柔性的蛋白质，从而使得能够更好地接近编码的表位。接头各自可包含3个或更多个、6个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个并且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸。优选地，接头富含甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。优选地，接头的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。在一个优选实施方案中，接头基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e，其中a、b、c、d和e独立地为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数，并且其中a+b+e+d+e与0不同且优选为2或更大、3或更大、4或更大或者5或更大。在一个实施方案中，接头包含序列GGSGGGGSG。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明鉴定并由本发明的疫苗提供的表位的集合优选地以包含不同多肽上所述表位的多肽的集合的形式存在，其中所述多肽各自包含一个或更多个表位，其也可以是重叠的或者是编码所述多肽的核酸(特别是RNA)的集合。在施用多于一种多表位和/或多重表位多肽的情况下，由不同多肽提供的表位可以是不同的或部分重叠的。
一旦存在于患者的细胞例如抗原呈递细胞中，根据本发明的多肽就被加工以产生根据本发明鉴定的表位。施用根据本发明提供的疫苗可提供II类MHC呈递表位，其能够引发针对表达MHC呈递表位所源自的抗原之细胞的CD4+辅助T细胞应答。作为替代或补充，施用根据本发明提供的疫苗可提供I类MHC呈递表位，其能够引发针对表达MHC呈递表位所源自的抗原之细胞的CD8+T细胞应答。优选地，根据本发明提供的疫苗可用于细胞毒性和/或辅助T细胞应答的多表位刺激。
本文中所述的用于疫苗接种的包含一个或更多个表位的多肽或者编码所述多肽的核酸(特别是RNA)优选地在施用所述多肽或核酸的对象中导致T细胞的刺激、致敏和/或扩增。所述刺激、致敏和/或扩增的T细胞优选地针对靶抗原，特别是由癌细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即由过度上调的RNA转录物表达的肿瘤相关抗原。因此，包含一个或更多个表位的多肽可包含肿瘤相关抗原或其片段(例如，表位或疫苗序列)，或者可包含肿瘤相关抗原或其片段的变体。在一个实施方案中，这样的变体与肿瘤相关抗原或片段免疫学上等同。在本公开内容的上下文中，术语“肿瘤相关抗原或其片段的变体”意指导致T细胞的刺激、致敏和/或扩增的序列，所述刺激、致敏和/或扩增的T细胞靶向肿瘤相关抗原，特别是当由病变细胞、组织和/或器官呈递时。因此，包含一个或更多个表位的多肽可对应于或可包含肿瘤相关抗原，可对应于或可包含肿瘤相关抗原的片段，或者可对应于或可包含与肿瘤相关抗原或其片段同源的氨基酸序列。如果包含一个或更多个表位的多肽包含肿瘤相关抗原的片段或与肿瘤相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包含表位(例如肿瘤相关抗原的T细胞表位)或与表位(例如肿瘤相关抗原的T细胞表位)同源的序列。因此，根据本公开内容，包含一个或更多个表位的多肽可包含由过度上调的RNA转录物编码的肿瘤相关抗原的免疫原性片段或与由过度上调的RNA转录物编码的肿瘤相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及当在MHC分子的情况下存在时能够刺激、致敏和/或扩增T细胞的抗原的片段。优选的是，包含一个或更多个表位的多肽(类似于肿瘤相关抗原)可由细胞例如抗原呈递细胞呈递，从而提供相关的表位用于被T细胞结合。
术语“免疫学上等同的”意指例如关于免疫效应类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体用于免疫接种的免疫学效应或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统(例如与参照氨基酸序列结合的T细胞或表达参照氨基酸序列的细胞)时诱导具有与参照氨基酸序列反应的特异性的免疫应答，则所述氨基酸序列与该参照氨基酸序列免疫学上等同。因此，免疫学上等同于抗原的分子在T细胞的刺激、致敏和/或扩增方面表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或发挥相同或基本上相同的作用。
在一个实施方案中，本文中所述的疫苗包含由一种或多种过度上调的RNA转录物编码的一种或更多种肿瘤相关抗原或者编码一种或多种肿瘤相关的抗原的一种或更多种核酸，特别是一种或更多种RNA。在一个实施方案中，本文中所述的疫苗包含由过度上调的RNA转录物编码的两种或更多种肿瘤相关抗原或者编码肿瘤相关抗原的两种或更多种核酸，特别是两种或更多种RNA。在不同的实施方案中，两种或更多种包括3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种或者10种或更多种。两种或更多种肿瘤相关抗原或核酸可存在于混合物中，或者可彼此分开存在于疫苗中，并且因此可彼此分开施用，例如在不同的时间点和/或通过不同的途径施用于患者。
术语“致敏”是指其中T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化为效应T细胞的过程。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体扩增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且扩增识别所述抗原的特异性淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。
由过度上调的RNA转录物编码的肽或多肽在本文中也称为“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”。在一个实施方案中，由过度上调的RNA转录物编码的肽或多肽可以是“标准”抗原，其在癌症组织和健康组织的氨基酸序列之间没有差异。作为替代地或补充，由过度上调的RNA转录物编码的肽或多肽可以是“新抗原”，其对个体的肿瘤具有特异性，并且先前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以是由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一种或更多种癌症特异性突变导致的。然而，出于本公开内容的目的，编码标准抗原的过度上调的RNA转录物和编码新抗原的对应的过度上调的RNA转录物被认为是相同的转录物，并且对过度上调的RNA转录物的量或拷贝数二者具有贡献。
癌症突变因个体而异。因此，编码新的表位(新表位)的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。
术语“突变”是指与参照相比的核酸序列的变化或差异(核苷酸替换、添加或缺失)。除生殖细胞(精子和卵子)之外，身体的任何细胞都可发生“体细胞突变”，并且因此不传递给儿童。这些改变可(但不总是)引起癌症或其他疾病。优选地，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中氨基酸改变(例如氨基酸替换)的突变，优选核苷酸替换。
根据本发明，术语“突变”包括点突变、插失(Indel)、融合、染色体碎裂(chromothripsis)和RNA编辑。
根据本发明，术语“插失”描述一种特殊的突变种类，其定义为导致共定位的插入和缺失以及核苷酸净增多或损失的突变。在基因组的编码区中，除非插失的长度为3的倍数，否则其产生移码突变。插失可与点突变形成对比，其中插失从序列中插入和缺失核苷酸，点突变是替代一个核苷酸的替换形式。
融合可产生由两个先前分离的基因形成的杂合基因。其可由于易位、中间缺失或染色体倒位而发生。通常来说，融合基因是癌基因。致癌性融合基因可导致具有新功能或与两个融合配偶体具有不同功能的基因产物。或者，原癌基因与强启动子融合，并且由此致癌功能被设定为通过由上游融合配偶体的强启动子引起的上调而发挥作用。致癌性融合转录物还可通过反式剪接或通读事件产生。
根据本发明，术语“染色体碎裂”是指通过单个灾难性事件(devastating event)，基因组的特定区域被破碎并然后拼接在一起的遗传现象。
根据本发明，术语“RNA编辑”是指其中通过碱基组成的化学改变来改变RNA分子中的信息内容的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰，例如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基，以及非模板的核苷酸添加和插入。mRNA中的RNA编辑有效地改变所编码蛋白质的氨基酸序列，以使得其与由基因组DNA序列预测的不同。
术语“抗原”涉及包含这样的表位的物质：针对该表位可产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包含蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞(例如抗原呈递细胞如树突细胞或巨噬细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如T细胞表位，通过T或B细胞受体或通过免疫球蛋白分子例如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。
术语“肿瘤相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与肿瘤或癌症相关的任何抗原。肿瘤相关抗原优选地由过度上调的RNA转录物编码，并且可以是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对肿瘤或癌症的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。因此，肿瘤相关抗原或其表位可用于治疗性目的。
术语“表位”是指分子(例如抗原)被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包含T细胞表位。
本文中使用的术语“新表位”是指不存在于参照例如正常非癌细胞或种系细胞中但存在于癌细胞中的表位。这尤其包括这样的情况，其中在正常的非癌细胞或种系细胞中发现相应的表位，然而，由于癌细胞中的一个或更多个突变，表位的序列被改变以便于产生新表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的情况下存在时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。
术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)”和缩写“MHC”包括I类MHC和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)二者展示给T细胞。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及识别T细胞靶向的抗原的T细胞，特别是当在MHC分子的情况下呈现在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时，并且优选发挥T细胞的效应功能。如果T细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为T细胞对抗原具有特异性。可使用多种标准技术中的任一种来评价T细胞特异性，例如，在铬释放分析或增殖测定中。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素-γ)的合成。
对于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽或蛋白质)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体和物种同源物，特别是由细胞天然表达的那些。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合体。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的N端和/或C端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于除去序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另一个残基。优先考虑的是在同源蛋白质或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置中的修饰和/或考虑的是用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参照氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参照氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度针对参照氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用Align、使用标准设置，优选EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5来完成。
“序列相似性”表明相同的或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。
术语“百分比同一性”旨在表示在最佳比对之后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长内随机分布。两个氨基酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除人工之外，可借助于Smith and Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法、借助于Neddlemanand Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法、借助于Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性检索方法，或者借助于使用这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来产生。
百分比同一性通过确定待比较的两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100来计算，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选地至少95％、至少98％或至少99％同一性。
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作在例如Sambrooket al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。
“来源于”指定氨基酸序列(肽或蛋白质)的氨基酸序列(肽或蛋白质)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的表位可被改变以使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然序列不同，同时保留天然序列的期望活性。
编码本文中所述的包含一个或更多个表位的多肽的RNA可用于将来源于由过度上调的RNA转录物编码的肿瘤相关抗原的表位递送至患者。存在于脾中的树突细胞(dendritic cell，DC)代表对表位的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。
在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。
在一个实施方案中，RNA可具有经修饰的核糖核苷酸。经修饰的核糖核苷酸的一些实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-帽。在一个实施方案中，本公开内容的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可被5’-帽类似物修饰。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可通过体外转录来实现，其中5’-帽共同转录表达到RNA链中，或者可使用加帽酶转录后与RNA连接。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或”UTR”涉及DNA分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(untranslated region，UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3’-UTR(如果存在的话)位于3’端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”优选不包含poly(A)尾。因此，3’-UTR位于poly(A)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含3’-poly(A)序列。术语“poly(A)序列”涉及通常位于RNA分子的3’端的腺苷酸(A)残基的序列。根据本公开内容，在一个实施方案中，poly(A)序列包含至少约20、至少约40、至少约80、或至少约100，并且至多约500、至多约400、至多约300、至多约200、或至多约150个A核苷酸，并且特别是约120个A核苷酸。
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可被翻译成肽或蛋白质。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mRNA的链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白质的在细胞的核糖体中的过程。
含RNA的颗粒
待施用的RNA可存在于包含RNA和与RNA缔合以形成RNA颗粒的一种或更多种组分的颗粒内。RNA颗粒可包含复合和/或包封形式的RNA。本文中所述的颗粒优选地不是病毒颗粒(特别是传染性病毒颗粒)，即它们不能病毒性地感染细胞。含RNA的颗粒可以是例如蛋白质颗粒的形式或含脂质的颗粒的形式。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成物质”包含合适的蛋白质或脂质。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成物质”涉及与RNA缔合以形成RNA颗粒的任何组分。
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的紧密结构。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA颗粒”涉及包含RNA的颗粒。带正电荷的分子(例如聚合物和脂质)与带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA颗粒的络合和自发形成。在一个实施方案中，RNA颗粒是纳米粒。
如本公开内容中使用的，在一个实施方案中，“纳米粒”是指具有适合于静脉内施用的平均直径的颗粒。
脂质、聚合物或两亲物是典型的RNA颗粒制剂成分。
先前已描述了适合于以颗粒形式递送RNA的蛋白质颗粒和含脂质的颗粒(例如Kaczmarek，J.C.et al.，2017，Genome Medicine 9，60)。对于非病毒RNA递送载剂，RNA的纳米粒包封物理保护RNA免受降解，并且取决于特定的化学性质，可有助于细胞摄取和内含体逃逸。鉴于其高度的化学柔性，聚合物是用于基于纳米粒递送的常用材料。通常来说，阳离子聚合物用于将带负电荷的RNA静电凝聚成纳米粒。这些带正电荷的基团通常由在生理pH(pKa～7.4)下质子化的胺组成，所述生理pH被认为导致离子失衡从而导致内含体破裂。聚合物例如聚-L-赖氨酸、聚酰胺胺、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺，以及天然存在的聚合物例如壳聚糖已被应用于RNA递送。另外，一些研究人员已合成了专门用于核酸递送的聚合物。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和可生物降解性而在核酸递送中获得了广泛应用。
本文中使用的“聚合物”以其通常含义给出，即包含通过共价键连接的一个或更多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可全部相同，或者在一些情况下，聚合物中可存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物是生物来源的，即生物聚合物，例如蛋白质。在一些情况下，聚合物中也可存在另外的部分，例如靶向部分例如本文中所述的那些。
如果聚合物中存在多于一种类型的重复单元，则该聚合物被称为“共聚物”。应理解，在使用聚合物的任何实施方案中，所使用的聚合物在一些情况下可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、以交替顺序或作为“嵌段”共聚物排列，即，其包含各自包含第一重复单元的一个或更多个区域(例如，第一嵌段)，以及各自包含第二重复单元的一个或更多个区域(例如，第二嵌段)等。嵌段共聚物可具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数目的不同嵌段。
在某些实施方案中，聚合物是生物相容性的。生物相容性聚合物是通常在中等浓度下不导致显著细胞死亡的聚合物。在某些实施方案中，生物相容性聚合物是可生物降解的，即，该聚合物能够在生理环境内(例如人体内)化学地和/或生物地降解。在某些实施方案中，聚合物可以是鱼精蛋白或聚乙烯亚胺。
RNA可通过所谓的脂质复合物制剂递送至脾，其中RNA与包含阳离子脂质和任选地另外的或辅助脂质(helper lipid)的脂质体结合以形成可注射的纳米粒制剂。脂质体可通过将乙醇中的脂质溶液注入到水或合适的水相中而获得。RNA脂质复合物颗粒可通过将脂质体与RNA混合来制备。靶向RNA脂质复合物颗粒的脾在WO 2013/143683中描述，其通过引用并入本文。已发现具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有RNA积聚和/或RNA表达发生。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中在抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA脂质复合物颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合物颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如DOTMA)和另外的脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒是纳米粒。
本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用与脂质基质与带负电荷的RNA结合。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于：1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双二十八烷基铵(DDAB)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(2，3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1，2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在一些具体实施方案中，所述阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。
可并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和RNA脂质复合物颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。本文中使用的“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。
在某些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、或约3∶1至约1∶1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以是约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1、或约1∶1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。
在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。
术语“平均直径”是指如通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS)以及使用所谓的累积量算法(cumulant algorithm)进行数据分析而测量的颗粒的平均流体动力学直径，所述累积量算法的结果是提供具有长度维度的所谓的Z平均值和无量纲的多分散性指数(polydispersity index，PI)(Koppel，D.，J.Chem.Phys.57，1972，pp 4814-4820，ISO 13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该Z平均值的值同义使用。
术语“多分散性指数”在本文中用作颗粒(例如，纳米粒)系综(ensemble)的尺寸分布的量度。基于动态光散射测量通过所谓的累积量分析来计算多分散性指数。
术语“挤出”是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的小型化，由此迫使颗粒通过具有限定孔的滤器。
本公开内容的RNA脂质颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下方程来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷总数)]。
本文中所述的靶向脾的RNA脂质复合物颗粒在生理pH下优选具有净负电荷，例如正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2至约1∶2。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2.0、约1.8∶2.0、约1.7∶2.0、约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4：2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。
本文中使用的“生理pH”是指约7.5的pH。
药物组合物
本文中所述的试剂可用作或者用于制备药物组合物或药物，特别是用于治疗性或预防性治疗的疫苗。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中，药物组合物可包含本文中所述的RNA、RNA颗粒和/或另一些试剂。
根据本发明，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答，特别是细胞免疫应答的药物制剂(药物组合物)或产品，所述免疫应答识别和攻击病原体或病变细胞例如癌细胞。疫苗可用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”涉及特定癌症患者并且意味着癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
本公开内容的药物组合物优选包含一种或更多种佐剂或可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括化合物例如油乳剂(例如弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些实例包括但不限于：LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如
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ISA51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和“可药用制剂”施加。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
术语“药学有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防其发生。本文中所述的组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、身材大小和体重，治疗持续时间，伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径以及类似的因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者的反应不足的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效地更高的剂量)。
本公开内容的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中。
可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
药物组合物的施用途径
在一个实施方案中，可静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用本文中所述的药物组合物。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式的施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用通过静脉内施用。
在一个实施方案中，在施用本文中所述的药物组合物之后，至少一部分活性剂(例如包含一个或更多个表位的多肽或者编码所述多肽的核酸，特别是RNA)任选地以RNA颗粒的形式被递送至靶细胞。在一个实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生多肽。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。因此，本文中所述的RNA颗粒可用于将RNA递送至这样的靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于在对象中将RNA递送至靶细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的RNA颗粒。在一个实施方案中，RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA是编码包含一个或更多个表位的多肽的RNA，并且RNA被靶细胞翻译以产生多肽。
在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。
“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的重要部分，包含运送淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。原发性或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成原发性淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
药物组合物的用途
本文中所述的疫苗可用于治疗性或预防性治疗癌症疾病。
在一个实施方案中，本公开内容涉及用于在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向对象施用如本文中所述的疫苗。在一个示例性实施方案中，免疫应答是针对癌症的。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些类似的问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生命的看法和个体性格。
在本发明背景下，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发生、在个体中抑制或减缓疾病的发生，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在目前患有或以前曾患有疾病的个体中降低复发。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达抗原的病变细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答，并且治疗涉及表达抗原例如肿瘤抗原的细胞的疾病例如癌症疾病。
可将本文中所述的包含含有由一种或更多种过度上调的RNA转录物编码的一个或更多个表位的多肽或者编码所述多肽的核酸的疫苗施用于对象，以在对象中引发针对所述一个或更多个表位的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
本文中使用的“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原并且以用I类或II类MHC分子呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与T淋巴细胞相关，T淋巴细胞可归类为辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)，其通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞，CD8+T细胞或CTL)发挥主要作用，在感染的细胞或癌细胞中诱导凋亡。在一个实施方案中，施用本公开内容的药物组合物涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CD8+T细胞应答。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原与I类MHC分子一起呈递。
本公开内容考虑了可以是保护性、防止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。本文中使用的“诱导免疫应答”可指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者可指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
在一个实施方案中，本公开内容设想了这样的实施方案，其中施用靶向脾组织的本文中所述的RNA颗粒。RNA编码包含由例如本文中所述的一种或更多种过度上调的RNA转录物编码的一个或更多个表位的多肽。RNA被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)摄取，以表达多肽。在抗原呈递细胞进行任选的加工和呈递之后，可产生针对一个或更多个表位的免疫应答，从而导致对癌症的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文中所述的RNA颗粒诱导的免疫应答包括通过抗原呈递细胞(例如树突细胞和/或巨噬细胞)对一个或更多个表位的呈递，以及由于该呈递而引起的细胞毒性T细胞的活化。例如，由RNA或其加工产物编码的多肽可由在抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白来呈递。然后，MHC肽复合物可被免疫细胞(例如T细胞或B细胞)识别，从而导致其活化。
因此，在一个实施方案中，在施用之后，本文中所述的RNA颗粒中的RNA被递送至脾和/或在脾中表达。在一个实施方案中，RNA颗粒被递送至脾以活化脾抗原呈递细胞。因此，在一个实施方案中，在施用RNA颗粒之后，在抗原呈递细胞中发生RNA递送和/或RNA表达。抗原呈递细胞可以是专职抗原呈递细胞或非专职抗原呈递细胞。专职抗原呈递细胞可以是树突细胞和/或巨噬细胞，甚至更优选地是脾树突细胞和/或脾巨噬细胞。
因此，本公开内容涉及本文中所述的RNA颗粒或包含RNA颗粒的药物组合物，其用于诱导或增强针对癌症的免疫应答。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及本文中所述的RNA颗粒或包含RNA颗粒的药物组合物，其用于癌症疾病的预防性和/或治疗性治疗。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及用于将一个或更多个表位递送至脾中的抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)，或者在脾中的抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)中表达一个或更多个表位的方法，其包括向对象施用本文中所述的RNA颗粒或包含RNA颗粒的药物组合物。所述一个或更多个表位优选地由RNA颗粒中的RNA编码。
在一个实施方案中，全身性施用本文中所述的RNA颗粒或包含RNA颗粒的药物组合物导致RNA颗粒或RNA在脾中而不在肺和/或肝中的靶向和/或积聚。在一个实施方案中，RNA颗粒在脾中释放RNA和/或进入脾中的细胞中。在一个实施方案中，全身性施用本文中所述的RNA颗粒或包含RNA颗粒的药物组合物将RNA递送至脾中的抗原呈递细胞。在一个具体实施方案中，脾中的抗原呈递细胞是树突细胞或巨噬细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及用于在对象中诱导或增强针对癌症的免疫应答的方法，其包括向对象施用本文中所述的RNA颗粒或包含RNA颗粒的药物组合物。
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞在巨噬细胞内通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀伤外来病原体，从而导致病原体的降解。来自降解的蛋白质的肽显示在巨噬细胞表面上，在这里其可被T细胞识别，并且其可直接与B细胞表面上的抗体相互作用，从而导致T细胞和B细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦其与可呈递的抗原接触，其就被活化成为成熟的树突细胞，并且开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小块(piece)，并且在成熟之后，这些片段使用MHC分子呈现在其细胞表面处。同时，其上调了在T细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，例如CD80、CD86和CD40，极大地增强了其活化T细胞的能力。其还上调了CCR7，所述CCR7是诱导树突细胞穿过血流到达脾，或穿过淋巴系统到达淋巴结的趋化性受体。在此其充当抗原呈递细胞，并通过与非抗原特异性共刺激信号一起呈递其抗原来活化辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(antigen presenting cell，APC)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原性片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可区分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成性表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(II类MHC)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的JI类MHC分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导T细胞活化的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职抗原呈递细胞”是指不组成性表达II类MHC分子，但是在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激后组成性表达II类MHC分子的抗原呈递细胞。一些示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个与MHC分子的缔合(例如，通过结合)用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递到特定的T细胞。
术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指牵涉抗原或表位的任何疾病，例如以抗原或表位的存在为特征的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的一些实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinalaxis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。通常来说，术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”涉及从原发性肿瘤或肿瘤转移瘤脱离并且在血流中循环的细胞。CTC可构成随后在不同组织中生长另外的肿瘤(转移)的种子。循环肿瘤细胞以约1至10CTC/mL全血的频率存在于患有转移性疾病的患者中。已开发了研究方法来分离CTC。本领域中已描述了数种研究方法来分离CTC，例如使用上皮细胞通常表达细胞黏附蛋白EpCAM(其在正常血细胞中不存在)的这一事实的技术。基于免疫磁珠的捕获涉及用已与磁性颗粒缀合的针对EpCAM的抗体处理血液样本，随后在磁场中分离标记的细胞。然后，将分离的细胞用针对另一上皮标志物细胞角蛋白和常见的白细胞标志物CD45的抗体染色，以使得将罕见的CTC与污染白细胞区分开来。这种稳健且半自动化的方法以平均产量为约1CTC/mL且纯度为0.1％鉴定CTC(Allard et al.，2004：Clin Cancer Res 10，6897-6904)。用于分离CTC的第二种方法使用基于微流控的CTC捕获装置，其涉及使全血流过嵌入有80,000个微柱的室，所述微柱通过包被有针对EpCAM的抗体而变得具有功能性。CTC然后用针对细胞角蛋白或组织特异性标志物(例如前列腺癌中的PSA或乳腺癌中的HER2)的二抗进行染色，并且通过沿着三维坐标在多个平面中自动化扫描微柱来可视化。CTC芯片能够以50个细胞/ml的中位产率和1％至80％的纯度来鉴定患者中的细胞角蛋白化阳性循环肿瘤细胞(Nagrath et al.，2007：Nature 450，1235-1239)。用于分离CTC的另一种可能性是使用来自Veridex，LLC(Raritan，NJ)的CellSearchTM循环肿瘤细胞(CTC)测试，其对血管中的CTC进行捕获、鉴定和计数。CellSearchTM系统是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于全血中CTC计数的方法，其是基于免疫磁性标记和自动化数字显微术的组合。存在文献中描述的用于分离CTC的其他方法，所有这些方法均可与本发明联合使用。
由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是理想的，其可比单一治疗方法的影响要强得多。在一个实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起施用。本文中使用的“免疫治疗剂”涉及可参与激活特异性免疫应答和/或免疫效应功能的任何试剂。本公开内容考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受到理论的束缚，抗体能够通过多种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(complement dependentcytotoxicity，CDC)。可与本公开内容组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号里)的一些非限制性实例包括：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿达木单抗(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿昔莫单抗(CEA)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利木单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、布妥昔单抗(CD30TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、克劳西单抗(Claudiximab)(密蛋白)、替坦司可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、西他土珠单抗(TRAIL-R2)、达西珠单抗(CD40)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥珠单抗(PDL192)、恩司昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(整合素ανβ3)、法勒珠单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、夫苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、盖尼塔单抗(IGF-I)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)(IL-Iβ)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、格莱木单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、依库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(CA-125)、依坦希单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、鲁卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL-5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(C242抗原)、他那莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(Namatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-R a)、奥纳珠单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumabmonatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、欧西鲁单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumomab)(MUC1)、帕妥珠单抗(HER2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL-6)、他贝鲁单抗(Tabalumab)(BAFF)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(CD 19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(生腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、西木单抗(CTLA-4)、替加珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL-13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、替西木单抗(CTLA-4)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(EpCAM)、优利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(4-1BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎妥木单抗(EGFR)和扎木单抗(CD4)。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是PD-1轴结合拮抗剂。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于：PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体实施方案中，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体实施方案中，PD-L2结合配偶体是PD-1。PD-1结合拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。抗PD-1抗体的一些实例包括但不限于MDX-1106(纳武单抗，OPDIVO)、Merck 3475(MK-3475，派姆单抗，KEYTRUDA)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、BGB-108和BGB-A317。
在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素，其包含与恒定区融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224(也称为B7-DCIg，是PD-L2-Fc)，其是WO2010/027827和WO2011/066342中所述的融合可溶性受体。
在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体，包括但不限于YW243.55.S70、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MEDI4736(度伐单抗)、MDX-1105和MSB0010718C(阿维单抗)。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是PD-1结合拮抗剂。在另一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个示例性实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
实施例1：B16-F10黑素瘤细胞系中差异表达基因的选择
对黑素瘤细胞系B16-F10的mRNA来源的cDNA进行测序(Castle，J.C.et al.CancerRes.72，1081-1091(2012))。使用pseudoalignment软件kallisto(Bray，N.L.etal.Nat.Biotech.34，525-527(2016))估计基因表达丰度，并报道为每百万的转录物(TPM)。然后将基因表达值与以相同方式处理的选定的正常组织的参照基因表达数据库进行比较。参照数据库包含来自小鼠ENCODE项目(Mouse ENCODE project)的样品(n＝487)(Pervouchine，D.D.et al.Nat.Comm.6，5903(2015))、来自小鼠转录物组BodyMap(MouseTranscriptomic BodyMap)的样品(n＝72)(Li，B.et al.Sci.Rep.7(1)：4200(2017))、来自昼夜节律基因表达图谱(Circadian Gene Expression Atlas)的鼠样品(n＝96)(Zhang，R.et al.PNAS 111(45)：1 6219-24(2014))，以及来自内部测序的鼠组织的样品(n＝67)。相对于组织来源和组织类别对样品进行注释。组织类别包括胚胎组织(所有样品均标注为“胚胎”)、生殖组织(囊腺、子宫、卵巢、胎盘和睾丸)和正常组织(所有其他组织)。对于每个独特的组织，计算所有样品的中位表达。如果B16-F10靶标超过计算为以下的截止c，则对该B16-F10靶标进行预选择：
c＝10*M+1，
其中M等于所有正常组织中位值的第95百分位。最后，通过与正常组织中表达值的总和相比的B16-F10中表达基因的倍数变化对潜在靶标列表进行排序。允许在生殖器官以及胚胎组织中表达(这些所谓的癌症种系抗原仅存在于肿瘤、雄性生殖细胞、胎盘或胚胎发育的早期阶段)。
在小鼠B16-F10黑素瘤细胞系中最差异表达的基因中，我们发现了数种公知的黑素瘤分化抗原(图1)。例如，在通过我们的算法排名的前10种基因中，我们发现了已知的免疫原性抗原酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrp1，排名1，Wang，R.et al.J.Exp.Med.183，1131-40(1996))，溶质载体家族45，成员2(Slc45a2，排名2，Park，J.et al.Cancer Immunol.Res.5，618-629(2017).)，酪氨酸酶(Tyr，排名3，
Figure BDA0002909720290000471
T.etal.Eur.J.Immunol.24，759-64(1994).)，多巴色素互变异构酶(Dct，排名5，Wang，R.F.et al.J.Exp.Med.184，2207-16(1996).)，mlan-A(Mlana，排名6，Kawakami，Y.et al.J.Exp.Med.180，347-52(1994).)以及前黑素体蛋白质(Pmel，排名9，Kawakami，Y.et al.J.Immunol.154，3961-8(1995).)。这令人印象深刻地证明了我们的算法富集相关肿瘤抗原的效力。在上述靶标中，我们选择Tyrp1、Tyr、Dct、Pmel和Fkbp6用于首次概念验证研究。针对除Tyr之外的所有靶标的疫苗接种引起了强烈的T细胞免疫应答(实施例2至5)。
实施例2：Tyrp1 RNA疫苗的免疫原性测试
如Kranz，L.M.et al.Nature 534，396-401(2016)中所述，在第0、7和14天用40μg配制成脂质复合物的Tyrp1抗原编码RNA或40μg不相关RNA对C57BL/6小鼠(每组n＝5)进行免疫接种。在最后一次疫苗接种之后五天，分离小鼠脾细胞，并通过IFNγELISpot分别测试5×105个细胞对编码MHC I表位(TAPDNLGYA，2μg/m1)和MHC II(CRPGWRGAACNQKI，2μg/ml)表位的两种Tyrp1肽的识别。针对Tyrp1的疫苗接种导致强效的CD4+和CD8+T细胞应答(图2)。使用GraphPad Prism6通过单因素ANOVA和Dunett多重比较检验来确定统计学显著性。n.s.：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例3：Dct RNA疫苗的免疫原性测试
与实施例2类似，如图3中所示(虚线)，用20μg Dct编码RNA脂质复合物或NaCl分别对C57BL/6小鼠(每组n＝5)重复进行疫苗接种。在第一次疫苗接种之后第5、12、19、26和33天，通过流式细胞术经MHC四聚体(MBL international)染色在血液中测量了针对Dct(SVYDFFVWL)的CD8+T细胞应答(如Kranz，L.M.et al.Nature 534，396-401(2016)中所述)。截止第33天，重复疫苗接种导致抗原特异性T细胞持续提高，超过所有外周CD8+T细胞的4％。使用GraphPad Prism 6通过双因素ANOVA和Sidak多重比较检验来确定统计学显著性。n.s：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例4：Pmel RNA疫苗的免疫原性测试
如在实施例2中，如图4中所示，用20μg Pmel编码RNA脂质复合物对C57BL/6小鼠(每组n＝8)重复进行疫苗接种。在第一次疫苗接种之后第27天，通过IFNγELISpot针对Pmel肽(EGSRNQDWL，2μg/ml)或不相关肽(VSV-NP，RGYVYQGL，2μg/ml)对小鼠脾细胞进行探测。如通过配对双尾student T检验确定的，检测到显著的Pmel特异性CD8+T细胞应答。n.s.：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例5：Fkbp6 RNA疫苗的免疫原性测试
如实施例2中所述，在第0、7和14天用20μg配制成脂质复合物的Fkbp6抗原编码RNA对C57BL/6小鼠(每组n＝3)进行免疫接种。在最后一次疫苗接种之后五天，分离小鼠的脾细胞，并通过IFNγELISpot测试5×105个细胞对用10μg Fkbp6 RNA或不相关RNA(对照)电穿孔的同基因骨髓来源的树突细胞(BMDC)的识别。BMDC是通过在存在GM-CSF的情况下培养骨髓来源细胞而产生的(Lutz，M.B.et al.J.Immunol.Methods 223，77-92(1999))。针对Fkbp6的疫苗接种导致强效的T细胞应答(图5)。
实施例6：治疗性Tyrp1疫苗接种之后的肿瘤控制
为了测试选定的疫苗靶标是否具有治疗意义，我们用3×105个B16-F10肿瘤细胞对C57BL/6小鼠(每组n＝11至12)进行静脉内(i.v.)接种。在肿瘤细胞注射之后四天，如图6中所示，开始用Tyrpl或不相关对照(没有抗原的骨干)RNA(40μg)进行RNA脂质复合物疫苗接种。在实验开始之后26天，切除小鼠的肺并对肿瘤结节进行计数。所有经对照RNA处理的小鼠均显示出不计其数的肿瘤结节(超过至少500个结节/小鼠)，并且大多数小鼠由于疾病不得不在第26天之前被处死。与之形成鲜明对比的是，Tyrp1疫苗接种的小鼠直至第26天还存活，且大多数小鼠未显示出肉眼可见的肿瘤迹象。使用未配对双尾Mann-Whitney检验(肿瘤结节比较)和对数秩检验(存活)来确定显著性。n.s：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例7：治疗性Tyrp1或Dct疫苗接种之后的肿瘤控制
使用允许限定肿瘤生长动力学的类似实验设置，我们证实了Tyrp1疫苗接种的治疗潜力，并另外测试了Dct RNA处理对肿瘤生长的作用。如图7中所示，将3×105个萤光素酶转基因B16-F10肿瘤细胞(B16-F10-LUC)i.v.注射到初始C57BL/6小鼠(每组n＝12)中并用40μg RNA脂质复合物进行疫苗接种。在第4、7、12、17、19和25天时，通过IVIS生物发光成像系统(如Kranz，L.M.et al.Nature 534，396-401(2016)中所述)测量通过萤光素酶生物发光测定的肿瘤生长。与未经处理组或经不相关RNA处理组相比的生物发光信号显著降低，表明通过Tyrp1和Dct疫苗接种实现了降低肿瘤负荷。这是通过独立读出比较肿瘤接种之后25天的肿瘤结节计数或肺重量得到证实的。使用双因素ANOVA和Dunnett多重比较检验(萤光素酶生物发光随时间的比较)或者进行克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)之后进行Dunn检验(肿瘤结节或肺重量的比较)来确定显著性。n.s.：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例8：肿瘤模型CT26、MC38、TRAMP-C2和4T1中多个迄今未描述的差异表达基因的鉴定
实施例1至7表明，可以通过将基于RNA测序的基因表达与健康组织的基因表达数据库进行比较来鉴定个体肿瘤中的差异表达基因。在最高排名的B16-F10基因中，发现了数种已知的肿瘤抗原。我们证明针对五分之四受试候选物的RNA脂质复合物疫苗接种产生了强烈的T细胞应答。对于这些候选物中的两个，我们证明了治疗性疫苗接种产生了强烈的抗肿瘤免疫应答，导致完全的肿瘤排斥。
随后，我们扩展了我们的肿瘤模型以测试在其他肿瘤类型中鉴定差异表达基因是否也可行。因此，我们对小鼠结肠肿瘤细胞系CT26和MC38，前列腺癌细胞系TRAMP-C2以及乳腺癌细胞系4T1进行了测序(测序在Kreiter，S.et al.Nature 520，692-696(2015).中进行了描述)，并将细胞系的RNA基因表达与我们的健康组织数据库进行比较。在每个细胞系中鉴定出多个差异表达基因，其中的一个选择示于图8中。对选定候选物的免疫原性研究描述于实施例9中。
实施例9：CT26、MC38和TRAMP-C2中选定靶标的免疫原性测试
如实施例2中所述，在第0、7和14天用20μg配制成脂质复合物的抗原编码RNA对BALB/c小鼠(n＝3，CT26)或C57BL/6小鼠(每组n＝3，MC38和TRAPM-C2)进行免疫接种。对于大多数组，每只小鼠注射两种抗原。在最后一次接种疫苗之后五天，分离小鼠的脾细胞，并通过IFNγELISpot测试5×105个细胞对用10μg抗原RNA或不相关RNA(对照)电穿孔的同基因骨髓来源的树突细胞(BMDC)的识别。BMDC是通过在存在GM-CSF的情况下培养骨髓来源细胞而产生的(Lutz，M.B.et al.J.Immunol.Methods 223，77-92(1999))。确定了针对CT26来源的靶标Rhox5和Ndst4(图9)，MC38来源的靶标GM14819、Rhox2h、Gm15091、Gm15097、Dppa4、GM773、Prl2c2、Fmr1nb和Luzp4(图10)以及针对TRAPM-C2靶标Amotl2(图11)的免疫应答。
实施例10：用于在人中进行个性化癌症免疫治疗的差异表达基因的选择
为了在个体患者中确定潜在靶标，将对mRNA来源的肿瘤cDNA进行测序，并估计基因表达丰度。然后将基因表达值与以相同方式处理的选定正常组织的参照基因表达数据库进行比较。参照数据库可能包括来自以下的RNA-Seq数据：来自基因型-组织表达(GTEx)数据库的正常样品、人蛋白质图谱(Human Protein Atlas，HPA)、来自癌症基因组图谱(TheCancer Genome Atlas，TCGA)的正常组织、蓝图表观基因组数据库(Blueprint Epigenomedatabase)以及其他组群。将根据实施例1进行高度表达抗原的选择。在选择之后，在最终选择疫苗接种治疗之前，将对潜在靶标进行验证。
序列表
<110> 生物技术RNA制药有限公司等
<120> 用于癌症的个体化疫苗
<130> 674-227 PCT2
<150> PCT/EP2018/070058
<151> 2018-07-24
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(3)
<223> 重复a次的序列部分，其中a独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> a + b + c + d + e 不同于0，并且优选地为2或
更大、3或更大、4或更大或者5或更大
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(6)
<223> 重复b次的序列部分，其中b独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> REPEAT
<222> (7)..(9)
<223> 重复c次的序列部分，其中c独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> REPEAT
<222> (10)..(12)
<223> 重复d次的序列部分，其中d独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<220>
<221> REPEAT
<222> (13)..(15)
<223> 重复e次的序列部分，其中e独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 3
Thr Ala Pro Asp Asn Leu Gly Tyr Ala
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 4
Cys Arg Pro Gly Trp Arg Gly Ala Ala Cys Asn Gln Lys Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 5
Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 6
Glu Gly Ser Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 7
Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu
1 5

Claims (26)

1.用于产生个体化癌症疫苗的方法，其包括以下步骤：
(a)鉴定存在于癌症患者的肿瘤标本中的一种或更多种RNA转录物，其中所述一种或更多种RNA转录物中的每一种编码氨基酸序列，并且其中所述一种或更多种RNA转录物中的每一种以超过预先确定的表达阈值的拷贝数存在于所述肿瘤标本中；以及
(b)提供疫苗，所述疫苗的特征在于至少一个表位来源于由所述一种或更多种RNA转录物编码的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括确定存在于癌症患者的肿瘤标本中的RNA转录物的拷贝数，以及将所述RNA转录物中每一种的拷贝数与各自的预先确定的表达阈值进行比较。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述肿瘤标本中所述RNA转录物的拷贝数是非肿瘤组织中的至少10倍，优选至少1000倍。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括对一个或更多个癌细胞进行单细胞测序。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述癌细胞是循环肿瘤细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括使用下一代测序(NGS)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中鉴定一种或更多种RNA转录物的步骤包括对所述肿瘤标本的RNA和/或从所述肿瘤标本的所述RNA获得的DNA文库进行测序。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括确定由所述一种或更多种RNA转录物编码的表位用于癌症疫苗接种的可用性的进一步的步骤。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述疫苗包含含有由所述一种或更多种RNA转录物编码的一个或更多个表位的多肽，或者编码所述多肽的核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽包含至多30个表位。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述多肽还包含不是由所述一种或更多种RNA转录物编码但是由癌细胞表达的一个或更多个表位。
12.根据权利要求11所述的方法，其中不是由所述一种或更多种RNA转录物编码的所述一个或更多个表位是癌症特异性新表位。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述表位处于其天然序列环境中以便于形成疫苗序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述疫苗序列为约30个氨基酸长。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中所述表位和/或疫苗序列头对尾排列。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述表位和/或疫苗序列通过接头隔开。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中所述表位和/或疫苗序列在所述肿瘤标本中具有与在非肿瘤组织中相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述疫苗是RNA疫苗。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述疫苗是预防性和/或治疗性疫苗。
20.个体化癌症疫苗，其通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法获得。
21.个体化癌症疫苗，其包含重组多肽或编码所述多肽的核酸，所述重组多肽包含由RNA转录物在癌症患者的肿瘤标本中的表达而产生的表位，其中所述RNA转录物以超过预先确定的表达阈值的拷贝数存在于所述肿瘤标本中。
22.根据权利要求21所述的疫苗，其中在所述肿瘤标本中所述RNA转录物的拷贝数是非肿瘤组织中的至少10倍，优选至少1000倍。
23.根据权利要求21或22所述的疫苗，其中所述多肽还包含不是由所述RNA转录物编码但是由癌细胞表达的表位。
24.治疗癌症患者的方法，其包括以下步骤：
(a)通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法提供个体化癌症疫苗；以及
(b)向所述患者施用所述疫苗。
25.治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求21至23中任一项所述的疫苗。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述疫苗静脉内、经皮肤、经肌肉或皮下施用。
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