JP2023549342A - 個別化されたがんワクチンのためのネオアンチゲンの選択 - Google Patents

Abstract

対象の腫瘍から、個別化された免疫原性組成物のための、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法が、本明細書に開示される。本明細書に開示される方法を用いて選択される腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を投与することによって、がんを治療することを必要とする対象においてそれを行う方法もまた、本明細書に開示される。

Description

本出願は、２０２０年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６３／１１０，７１１号の利益を主張するものであり、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照
本出願には、コンピューター可読形態の配列表が含まれる。そのコンピューター可読形態のものは、参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１０月２８日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、１４６４０１＿０９１５２４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、７５，５９８バイトのサイズである。

がんは、世界の死亡原因の１位であり、全死亡者の４分の１を占めている。Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ：Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，６８：７－３０（２０１８）。２０１８年には、１８１０万人の新たながん症例と９６０万人のがん関連死亡があった。Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ：Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，６８（６）：３９４－４２４。アブレーション技術（例えば、外科的処置及び放射線）及び化学的技術（例えば、化学療法剤）を含む、いくつかの既存のスタンダード・オブ・ケアがん療法が存在する。残念ながら、そのような治療法は、しばしば深刻なリスク、毒性副作用、及び非常に高いコスト、ならびに不確実な有効性が付きまとうものである。

がん免疫療法（例えば、がんワクチン）は、有望ながん治療法として浮上している。がん免疫療法の目的は、正常組織を無傷のままにしながら、がんの選択的破壊のために免疫系を利用することである。従来のがんワクチンは、典型的には、腫瘍関連抗原を標的とする。腫瘍関連抗原は、典型的には正常組織に存在するが、がんにおいて過剰発現される。しかし、これらの抗原はしばしば正常組織に存在するため、免疫寛容は免疫活性化を妨げる可能性がある。腫瘍関連抗原を標的とするいくつかの臨床試験では、標準治療と比較して持続的な有益な効果が示されていない。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．，２８（Ｓｕｐｐｌ １２）：ｘｉｉ１１－ｘｉｉ１７（２０１７）。

ネオアンチゲンは、がん免疫療法のための魅力的な標的を表す。ネオアンチゲンは、個々の特異性を有する非自己タンパク質である。ネオアンチゲンは、腫瘍細胞ゲノムにおけるランダム体細胞変異に由来し、正常細胞の表面上で発現されない。同文献。ネオアンチゲンは腫瘍細胞上でのみ発現され、したがって中枢免疫寛容を誘導しないため、がんネオアンチゲンを標的とするがんワクチンは、中枢免疫寛容の低下及び安全性プロファイルの改善を含む潜在的な利点を有する。同文献。

がんの変異ランドスケープは複雑であり、腫瘍変異は一般に個々の対象に固有である。配列決定によって検出されたほとんどの体細胞変異は、効果的なネオアンチゲンをもたらさない。腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍細胞における変異のわずかな割合のみが、有効である可能性が高いワクチンを設計するのに十分な精度で、腫瘍特異的ネオアンチゲンに転写、翻訳、及びプロセシングされる。さらに、全てのネオアンチゲンが免疫原性であるとは限らない。実際、内因性ネオアンチゲンを自発的に認識するＴ細胞の割合は約１％～２％である。Ｋａｒｐａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：１７１８（２０１７）を参照されたい。さらに、ネオアンチゲンワクチンの製造に関連するコスト及び時間は重要である。

したがって、免疫原性組成物の新抗原候補を効率的かつ正確に予測、優先順位付け、及び選択することは依然として課題である。したがって、ネオアンチゲンを同定し、どのネオアンチゲンが免疫系によって標的化されているかを同定し、どのネオアンチゲンが有効な免疫原性組成物に適している可能性が高いかを選択するために、腫瘍ゲノム材料を特徴付けるための、統合された方法に対する重要な満たされていないニーズが存在する。

発明の概要
本開示は、対象の腫瘍から、対象特異的免疫原性組成物のための、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法に関する。本開示はまた、腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択するための新規アプローチを使用して選択された腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を投与し、選択された腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を処方することによって、それを必要とする対象においてがんを治療する方法に関する。アプローチは、腫瘍から配列データを得ることを伴う。配列データを使用して、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列を表すデータを得る。配列データは、ヌクレオチド配列データ、ポリペプチド配列データ、エクソーム配列データ、トランスクリプトーム配列データ、または全ゲノムヌクレオチド配列データであり得る。配列データは、全エクソーム配列データ、ＲＮＡ配列データ、全ゲノム配列データ、またはそれらの組み合わせであり得る。配列データは、全エクソーム配列データ、ＲＮＡ配列データ、及び全ゲノム配列データの組み合わせであり得る。

次に、対象のポリペプチド配列（複数可）及びＭＨＣ分子（複数可）は、機械学習プラットフォームに入力される。機械学習プラットフォームは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性であるかどうか（例えば、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが対象において免疫応答を誘発するかどうか）を識別するために使用される。これらの予測に基づいて、機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが対象において免疫応答を誘発する確率数値スコアを生成する。

対象のＭＣＨ分子（複数可）は、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子であり得る。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードするポリペプチド配列は、短いポリペプチドに由来し得る。短いポリペプチドは、典型的には、ＭＣＨクラスＩ分子上に提示される。あるいは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードするポリペプチド配列は、長いポリペプチドに由来し得る。

対象における免疫応答としては、腫瘍細胞表面への１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの提示、腫瘍細胞上の１つまたは複数のＭＨＣ分子による１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの提示、または１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが抗原提示細胞によってＴ細胞に提示されることが可能であること、を挙げることができる。

対象における免疫応答は、ＣＤ４＋媒介応答またはＣＤ８＋媒介応答であり得る。典型的には、免疫応答は、ＣＤ４＋媒介応答またはＣＤ８＋媒介応答のいずれかである。

より低い確率数値スコアと比較してより高い確率数値スコアを有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが対象においてより大きな免疫応答を誘発することを示す。

腫瘍における１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現、好ましくはｍＲＮＡ発現もまた、対象において免疫応答を誘発するために十分に発現される１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをさらに特定するために定量される。次いで、腫瘍クローンは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが、腫瘍全体にわたる十分な割合を表す（例えば、遺伝的多様性を有する）ことを確認するために、任意選択的に特徴付けることができる。実施形態では、好適な腫瘍特異的ネオアンチゲンは、腫瘍の約１％に相当し得る。他の場合では、好適な腫瘍特異的ネオアンチゲンは、腫瘍の約５％に相当し得る。

これらのパラメータを使用して、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアについて、腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを計算する。腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを使用して、対象特異的免疫原性組成物の処方に好適な腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する。より低い腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアと比較してより高い腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアは、ネオアンチゲンがより強い免疫原性を有し、したがって、強い免疫応答を誘導し、安定した治療効果を誘発する可能性が高い（すなわち、免疫原性組成物に好適である可能性が高い）ことを示す。実施形態では、少なくとも約１０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、対象特異的免疫原性組成物を処方するために選択される。実施形態では、少なくとも約２０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、対象特異的免疫原性組成物を処方するために選択される。

本明細書に開示される方法は、正常組織に対する自己免疫応答を誘導する１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの能力を測定することをさらに含むことができる。正常組織において自己免疫応答を誘導する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、自己免疫応答を誘導しない腫瘍特異的ネオアンチゲンと比較してより低い腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを有する。自己免疫応答を誘導する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、免疫原性組成物のために選択されない。

処方された免疫原性組成物は、少なくとも約１０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンまたは少なくとも約２０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含み得る。腫瘍特異的ネオアンチゲンは、短いポリペプチドまたは長いポリペプチドによってコードされ得る。免疫原性組成物は、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、ベクター、樹状細胞、または合成された長いペプチドを含み得る。免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含むことができる。

本開示はまた、本明細書に記載の方法を使用して選択された１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む個別化された免疫原性組成物を投与することを含む、それを必要とする対象においてがんを治療する方法に関する。本明細書に開示される方法は、任意の数のがんの治療に好適であり得る。腫瘍は、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、膀胱癌、または肺癌に由来するものであり得る。好ましくは、がんは、黒色腫、乳癌、肺癌、及び膀胱癌である。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択するためのアプローチを示す概略図である。 次世代配列決定データ（入出力）のバイオインフォマティクス解析を示す概略フロー図である。 クローン性のデコンボリューションのためのモジュールのフロー図である。

本開示は、強力な個別化がん免疫原性組成物（例えば、対象特異的免疫原性組成物）に対して高精度の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択するための新規アプローチに関する。本開示はまた、腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択するための新規アプローチを使用して選択された腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を投与し、選択された腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を処方することによって、それを必要とする対象においてがんを治療する方法に関する。本発明者らは、以下のアプローチを開発した：１）１つまたは複数のネオアンチゲンのポリペプチド配列をコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡを配列決定することと、２）腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性であるかどうか（例えば、対象においてネオアンチゲンが免疫応答を誘発することができるかどうか）を決定することと、３）腫瘍が免疫応答を誘発するのに十分な量のネオアンチゲンを発現するかどうかを決定することと、４）任意選択的に、ネオアンチゲンが腫瘍の十分な割合を表すかどうかを決定することと、を含む。現在利用可能な方法は、ネオアンチゲンまたはネオアンチゲンがＭＨＣ分子によって提示される確率についてランク付け及び選択するための、ＭＨＣ結合親和性予測に依存する。これらの方法は、免疫原性を予測するものではない。さらに、現在の方法では、これらの要因の全てを高精度に評価する能力はない。

このアプローチは、腫瘍生検から得られた腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列の配列決定から始まる。次いで、予測機械学習プラットフォームを使用して、どのネオアンチゲンが対象のＭＨＣ分子によって認識されるかを特定する。プラットフォームは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性であるかどうか（例えば、腫瘍特異的ネオアンチゲンが対象において免疫応答を誘発すること）を決定することができる。これらの予測に基づいて、機械学習プラットフォームは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫応答を誘発する確率数値スコアを生成する。腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現、好ましくはｍＲＮＡ発現もまた、免疫応答を引き起こす可能性が高いよう豊富に発現される腫瘍特異的ネオアンチゲンに焦点を当てるべく定量化される。次いで、腫瘍クローンを任意に特徴付けて、腫瘍特異的ネオアンチゲンが腫瘍全体にわたって十分な遺伝的多様性を表すことを確認する。これらのパラメータを用いて、腫瘍特異的ネオアンチゲンに対する腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを作成する。腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアは、個別化ワクチンの処方に好適な腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択するために使用される。より低い腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアと比較して、より高い腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアは、該ネオアンチゲンがより強い免疫原性を有し、したがって、より強い免疫応答を誘導し、安定した治療効果を誘発する可能性が高いことを示す。

本開示で引用される全ての出版物及び特許文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる材料が本明細書と矛盾するか、または矛盾する範囲では、本明細書はそのような材料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本開示の先行技術であることを認めるものではない。値の範囲が表現されるとき、それは、その範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲に記載された値への参照は、その範囲内のそれぞれ及び全ての値を含む。全ての範囲にはエンドポイントが含まれており、組み合わせることができる。先行する「約」の使用によって、値が概算として表現されるとき、特定の値が、別の実施形態を形成することが理解されることになる。特定の数値への言及は、文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。「または」の使用は、その使用の特定の文脈が別途指示しない限り、「及び／または」を意味する。

本明細書及び請求項にわたって、本開示の態様に関連する様々な用語が用いられている。別段に示されていない限り、このような用語には、当該技術分野における通常の意味を付与するものとする。具体的に定義されているその他の用語は、本明細書に示されている定義と一致する形で解釈されるものとする。本明細書に記載または参照される技法及び手順は、概して、当業者によって十分に理解され、従来的な手法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される広く応用される分子クローニングの方法論などが共通に用いられる。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、特に明記しない限り、製造業者が定義したプロトコル及び条件に従って一般に実行される。

本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数形の形態を含む。「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「等の（ｓｕｃｈ ａｓ）」等の用語は、特に明記しない限り、限定することなく包含することを意図する。

別段の指示がない限り、一連の要素または範囲に先行する用語「少なくとも」、「よりも小さい」、及び「約」、または同様の用語は、シリーズまたは範囲内の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

「がん」という用語は、細胞集団が制御されていない増殖、不死性、転移性可能性、急速な成長及び増殖速度、及び／または特定の形態学的特徴を特徴とする対象における生理学的状態を指す。多くの場合、がんは腫瘍または腫瘤の形態であり得るが、対象内に単独で存在し得るか、または白血病細胞またはリンパ腫細胞などの独立した細胞として血流中を循環し得る。がんという用語は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、及び他の固形及び非固形腫瘍を含む、全てのタイプのがん及び転移を含む。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、それらに限定されない。かかるがんのさらに特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌、ホルモン受容体陽性乳癌）、骨肉腫、黒色腫、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜（例えば、しょう液性）、または、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な形の頭頸部癌が挙げられる。トリプルネガティブ乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びＨｅｒ２／ｎｅｕの遺伝子の発現がネガティブである乳癌を指す。ホルモン受容体陽性乳癌は、ＥＲまたはＰＲのうちの少なくとも１つが陽性であり、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２）が陰性である乳癌を指す。

本明細書で使用される「ネオアンチゲン」という用語は、例えば、腫瘍細胞における変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、対応する親抗原とは異なる少なくとも１つの改変を有する抗原を指す。変異としては、フレームシフト、インデル、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位改変、ゲノム転位もしくは遺伝子融合、またはネオアンチゲンを生じさせる任意のゲノム発現改変を挙げることができる。変異は、スプライス変異を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常なリン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、プロテアソーム生成スプライシング抗原も含むことができる。Ｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５４（６３１０）：３５４：３５８（２０１６）を参照されたい。一般に、点変異が腫瘍及びインデルにおける約９５％の変異を占め、フレームシフト変異が残りの変異を占める。Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３７１：２１８９－２１９９（２０１４）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「腫瘍特異的ネオアンチゲン」という用語は、対象の腫瘍細胞または組織に存在するが、対象の正常な細胞または組織には存在しないネオアンチゲンである。

「次世代配列決定」または「ＮＧＳ」という用語は、本明細書で使用される場合、一度に数十万の配列リードを生成する能力を有する、従来のアプローチ（例えば、サンガー配列決定）と比較してスループットを増加させた配列決定技術を指す。

本明細書で使用される「ニューラルネットワーク」という用語は、確率的勾配降下（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｄｅｓｃｅｎｔ）及び逆伝播（ｂａｃｋ－ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を介して典型的に訓練される要素ごとの非線形性に続く線形変換の複数の層からなる分類または回帰のための機械学習モデルを指す。

「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むが、これらに限定されない任意の哺乳類などの任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。

本明細書に使用されるような、用語「腫瘍細胞」は、がん細胞であるか、またはがん細胞に由来する細胞を指す。「腫瘍細胞」という用語はまた、がん様特性、例えば、制御不能な生殖、抗増殖シグナルへの耐性、転移する能力、及びプログラムされた細胞死を受ける能力の喪失を示す細胞を指すことができる。

本方法及び本方法の実施のためのガイダンスの説明を、以下に示す。

Ｉ．腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法
対象の腫瘍から、対象特異的免疫原性組成物に好適な腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法が、本明細書に開示される。好適な腫瘍特異的ネオアンチゲンは、腫瘍の細胞表面上に提示される可能性が高く、免疫原性である可能性が高く、対象において免疫応答を誘発するのに十分な量で発現されると予測され、任意に腫瘍全体にわたって十分な多様性を表す腫瘍特異的ネオアンチゲンである。

対象の腫瘍から１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する最初のステップは、腫瘍から配列データを得ることを含む。配列データを使用して、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列を表すデータを得る。一般に、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列を表す配列データは、腫瘍試料を配列分析に供することによって決定される。

配列データは、エクソーム配列データ、トランスクリプトーム配列データ、全ゲノムヌクレオチド配列データ、ヌクレオチド配列データ、またはポリペプチド配列データとすることができる。配列データは、全エクソーム配列データ、ＲＮＡ配列データ、全ゲノム配列データ、またはそれらの組み合わせであり得る。配列データは、全エクソーム配列データ、ＲＮＡ配列データ、及び全ゲノム配列データの組み合わせであり得る。

配列データを得る様々な方法が、本明細書に記載の方法において使用され得る。配列決定方法は、当該技術分野において周知であり、リアルタイムＰＣ、全エクソーム配列決定、深部配列決定、ハイスループット配列決定、またはこれらの組み合わせを含む、ＰＣＲに基づく方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前述の技術及び手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される方法に従い実施される。また、Ａｕｓｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）（定期的に更新される）を参照されたい。

配列決定方法はまた、限定されないが、ハイスループット配列決定、単一細胞ＲＮＡ配列決定、ＲＮＡ配列決定、パイロ配列決定、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｗ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、マックスハイベリーまたはＳａｎｇｅｒ配列決定、全ゲノム配列決定、全エクソーム配列決定、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉｄ、Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔまたはＮａｎｏｐｏｒｅを用いた配列決定、または任意の既知の配列決定方法を挙げることができる。配列データを得るために本明細書で用いられる配列決定方法は、好ましくは、ハイスループット配列決定である。ハイスループット配列決定技術は、複数の核酸分子を並列に配列決定することが可能であり、数百万の核酸分子を一度に配列決定することを可能にする。Ｃｈｕｒｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１１２（１２）：１６１３－１６２３（２０１３）を参照されたい。

いくつかの場合では、全エクソーム配列、ＲＮＡ配列決定、全ゲノム配列決定、またはそれらの組み合わせを行うことができる。いくつかの場合では、全エクソーム配列、ＲＮＡ配列決定、全ゲノム配列決定の組み合わせを行うことができる。

いくつかの場合では、ハイスループット配列決定は、次世代配列決定であり得る。異なる配列決定技術を使用するいくつかの異なる次世代プラットフォームが存在する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ機器を使用する）。これらのプラットフォームのうちのいずれも、本明細書に開示される遺伝物質を配列決定するために利用され得る。次世代配列決定は、多数の独立したリードの配列決定に基づいており、各リードは、核酸の１０～１０００塩基の間の任意の場所を表す。合成による配列決定は、次世代配列決定で使用される一般的な技術である。一般に、配列決定は、プライマーを鋳型にハイブリダイゼーションして鋳型／プライマー二本鎖を形成し、ポリメラーゼが鋳型依存性の様式でプライマーにヌクレオチドを付加することを可能にする条件下で、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で二本鎖をポリメラーゼと接触させることを伴う。次に、検出可能な標識からのシグナルを使用して組み込まれた塩基を同定し、テンプレート内のヌクレオチドの直線的順序を決定するために、ステップを順次繰り返す。例示的な検出可能な標識としては、放射性標識、蛍光標識、酵素標識等が挙げられる。サイクル末端配列決定によるＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム等の配列を検出するための多数の技術が知られている。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列を表す配列データが得られると、配列データは、対象のＭＨＣ分子とともに、機械学習プラットフォームに入力される。機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性であるかどうかを予測する確率数値スコアを生成する（例えば、対象において免疫応答を誘発する）。

ＭＨＣ分子は、細胞表面上でペプチドを輸送及び提示する。ＭＨＣ分子はクラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子としてクラス分類される。ＭＨＣクラスＩは、ほとんどの腫瘍細胞を含む体のほぼ全ての細胞の表面に存在する。ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、通常、内因性タンパク質または細胞内に存在する病原体由来の抗原を含み、細胞傷害性Ｔリンパ球（すなわち、ＣＤ８＋）に提示される。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃを含むことができる。クラスＩＩのＭＨＣ分子は、樹状細胞、Ｂリンパ球、マクロファージ、及び他の抗原提示細胞にのみ存在する。これらは、主に、外部抗原源、すなわち細胞の外側から、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞（すなわち、ＣＤ４＋）に処理されるペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１を含むことができる。場合によっては、ＭＨＣクラスＩＩ分子もがん細胞上で発現することができる。

ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子を機械学習プラットフォームに入力することができる。典型的には、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかが機械学習プラットフォームに入力される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、機械学習プラットフォームに入力される。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、機械学習プラットフォームに入力される。

ＭＨＣクラスＩ分子は、短いペプチドに結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、一般に、約８アミノ酸～約１０アミノ酸長のペプチドを収容することができる。実施形態では、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする配列データは、約８アミノ酸～約１０アミノ酸長の短いペプチドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、長さが長いペプチドに結合する。ＭＨＣクラスＩＩは、一般に約１３アミノ酸長～約２５アミノ酸長のペプチドを収容することができる。実施形態では、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする配列データは、約１３～２５アミノ酸長の長いペプチドである。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする配列データは、約５アミノ酸長、約６アミノ酸長、約７アミノ酸長、約８アミノ酸長、約９アミノ酸長、約１０アミノ酸長、約１１アミノ酸長、約１２アミノ酸長、約１３アミノ酸長、約１４アミノ酸長、約１５アミノ酸長、約１６アミノ酸長、約１７アミノ酸長、約１８アミノ酸長、約１９アミノ酸長、約２０アミノ酸長、約２１アミノ酸長、約２２アミノ酸長、約２３アミノ酸長、約２４アミノ酸長、約２５アミノ酸長、約２６アミノ酸長、約２７アミノ酸長、約２８アミノ酸長、約２９アミノ酸長、または約３０アミノ酸長であり得る。

機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性である（例えば、免疫応答を誘発する）可能性を予測する。

免疫原性腫瘍特異的ネオアンチゲンは、正常組織で発現されない。これらは、抗原提示細胞によってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に提示して、免疫応答を生成することができる。実施形態では、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンによって誘発される対象における免疫応答は、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの腫瘍細胞表面への提示を含む。より具体的には、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンによって誘発される対象における免疫応答は、腫瘍細胞上の１つまたは複数のＭＨＣ分子による１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの提示を含む。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンによって誘発される免疫応答は、Ｔ細胞媒介応答であると予想される。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンによって誘発される対象における免疫応答は、樹状細胞等の抗原提示細胞によってＴ細胞に提示することができる１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含み得る。好ましくは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することができる。

実施形態では、機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンがＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する可能性を予測することができる。実施形態では、機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンがＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する可能性を予測することができる。いくつかの場合では、機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが誘発し得る抗体力価を予測することができる。他の場合では、機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンによるＣＤ８＋活性化の頻度を予測することができる。

機械学習プラットフォームは、訓練データで訓練されたモデルを含むことができる。トレーニングデータは、一連の異なる対象から得ることができる。訓練データは、健康な対象、ならびにがんを有する対象から得られたデータを含むことができる。訓練データは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが対象において免疫応答を誘発するかどうかを示す確率スコアを生成するために使用することができる種々のデータを含み得る。例示的な訓練データは、正常組織及び／または細胞に由来するヌクレオチドまたはポリペプチド配列を表すデータ、腫瘍組織に由来するヌクレオチドまたはポリペプチド配列を表すデータ、正常組織及び腫瘍組織に由来するＭＨＣペプチドーム配列を表すデータ、ペプチド－ＭＨＣ結合親和性測定、またはこれらの組み合わせを含むことができる。参照データは、質量分析データ、ＤＮＡ配列決定データ、ＲＮＡ配列決定データ、健康な対象及びがんを有する対象からの臨床データ、サイトカインプロファイリングデータ、Ｔ細胞細胞毒性アッセイデータ、ペプチド－ＭＨＣモノまたはマルチマーデータ、ならびに合成タンパク質、正常及び腫瘍ヒト細胞株、新鮮及び凍結した一次試料、及びＴ細胞アッセイにその後曝露される所定のＭＨＣ対立遺伝子を発現するように操作された単一対立遺伝子細胞株のプロテオミクスデータをさらに含むことができる。

機械学習プラットフォームは、監督された学習プラットフォーム、監督されていない学習プラットフォーム、または半監督された学習プラットフォームとすることができる。機械学習プラットフォームは、配列に基づくアプローチを使用して、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫応答を誘発することができる（例えば、高いまたは低い抗体応答またはＣＤ８＋応答を誘発する）確率数値を生成することができる。シーケンスベースの予測は、人工ニューラルネットワーク（例えば、深いまたはそうでない場合）、サポートベクトルマシン、Ｋ近傍、ロジスティック多重ネットワーク制約回帰（ＬｏｇＭｉＮｅＲ）、回帰樹、ランダムフォレスト、アダブースト、ＸＧＢｏｏｓｔ、または隠れマルコフモデルを含む監督された機械学習モジュールを含むことができる。これらのプラットフォームは、既知のＭＨＣ結合ペプチドを含むトレーニングデータセットを必要とする。

多数の予測プログラムが、腫瘍特異的ネオアンチゲンがＭＨＣ分子上に提示され、免疫応答を誘発することができるかどうかを予測するために使用される。例示的な予測プログラムとしては、例えば、ＨＬＡｍｉｎｅｒ（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．，４：９５（２０１２）、ショットガンシーケンスデータの組み立てを方向付け、参照対立遺伝子配列データベースと比較することによって予測されるＨＬＡタイプ）、ＶａｒｉａｎｔＥｆｆｅｃｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ Ｔｏｏｌ（ＭｃＬａｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，１７：１２２（２０１６））、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（Ａｎｄｒｅａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，３２：５１１－５１７（２０１６）：人工ニューラルネットワークに基づく配列比較方法、及びペプチド－ＭＨＣ－Ｉ型分子の親和性の予測）、ＵＣＳＣブラウザ（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１２：９９６－１００６（２００２））、ＣｌｏｕｄＮｅｏ ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ｂａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３３：３１１０－２（２０１７））、ＯｐｔｉＴｙｐｅ（Ｓｚｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３０：３３１０－３１６（２０１４））、ＡＴＨＬＡＴＥＳ（Ｌｉｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：ｅ１４２（２０１３））、ｐＶＡＣ－Ｓｅｑ（Ｈｕｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．８：１１（２０１６）、ＭｕＰｅＸＩ（Ｂｊｅｒｒｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，６６：１１２３－３０（２０１７））、Ｓｔｒｅｌｋａ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２８：１８１１－７（２０１２））、Ｓｔｒｅｌｋａ２（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８；１５：５９１－４．）、ＶａｒＳｃａｎ２（Ｋｏｂｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２２：５６８－７６（２０１２））、Ｓｏｍａｔｉｃｓｅｑ（Ｆａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，１６：１９７（２０１５））、ＳＭＭＰＭＢＥＣ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，１０：３９４（２００９））、ＮｅｏＰｒｅｄＰｉｐｅ（Ｓｃｈｅｎｃｋ ＲＯ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，２０：２６４（２０１９））、Ｗｅｋａ（Ｗｉｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ：ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｍａｃｈｉｎｅ－ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．４^ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＩＳＢＮ：９７８０１２８０４３５５７８（ｅＢｏｏｋ）（２０１７）、またはＯｒａｎｇｅ（Ｄｅｍｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｎｇｅ：Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｉｎ Ｐｙｔｈｏｎ．，Ｊ．Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ Ｒｅｓ．，１４：２３４９－２３５３（２０１３）が挙げられる。任意の既知の予測プログラムを機械学習プラットフォームとして用いて、ネオアンチゲンが免疫応答を誘発するかどうかを示す確率数値スコアを生成し得る。

使用される機械学習プラットフォームに応じて、追加のフィルターを適用して、腫瘍特異的ネオアンチゲン候補を優先させることができ、これには、仮想（理研）タンパク質の除去、構成的または免疫プロテアソームによってタンパク質分解的に産生されない可能性が高いエピトープを除去するための抗原処理アルゴリズムの使用、及びネオアンチゲンが対応する野生型配列よりも高い予測される結合親和性を有するネオアンチゲンの優先順位付けが含まれる。

確率数値スコアは、０～１の間の数値とすることができる。実施形態では、確率数値スコアは、０、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０、または１の数とすることができる。より低い確率数値スコアと比較してより高い確率数値スコアを有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが対象においてより大きな免疫応答を誘発することを示し、したがって、免疫原性組成物の好適な候補である可能性が高い。例えば、確率数値スコアが１の腫瘍特異的ネオアンチゲンは、確率数値スコアが０．０５の腫瘍特異的ネオアンチゲンよりも、対象においてより大きな免疫応答を誘発する可能性が高い。同様に、確率数値スコアが０．５の腫瘍特異的ネオアンチゲンは、確率数値スコアが０．１の腫瘍特異的ネオアンチゲンよりも対象においてより大きな免疫応答を誘発する可能性が高い。

より低い確率数値スコアよりも高い確率数値スコアが好ましい。好ましくは、少なくとも０．８、０．８１、０．８２の確率数値スコアを有する腫瘍特異的ネオアンチゲンである。０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、または１は、対象において免疫応答が誘発される可能性が高いことを示す。

より高い確率数値スコアが好ましいが、より低い確率数値スコアは依然として、腫瘍特異的ネオアンチゲンが十分な免疫応答を誘発することができることを示し得、その結果、腫瘍特異的ネオアンチゲンが好適な候補である可能性が高い。

場合によっては、本明細書に記載の機械学習プラットフォームはまた、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが腫瘍細胞上のＭＨＣ分子によって提示される可能性を予測することができる。機械学習プラットフォームは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンがＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される可能性を予測することができる。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法は、対象のＭＨＣ分子に結合する１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの親和性をインシリコで測定するステップをさらに含み得る。約１０００ｎＭ未満のＭＨＣ分子との結合親和性を有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性組成物に好適であり得ることを示す。約５００ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満のＭＨＣ分子との結合親和性を有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫原性組成物に好適であり得ることを示すことができる。対象におけるＭＨＣ分子に結合する１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの親和性は、腫瘍特異的ネオアンチゲン免疫原性を予測することができる。あるいは、メジアン親和性は、腫瘍特異的ネオアンチゲン免疫原性を予測する有効な方法であり得る。メジアン親和性は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭ、及びＳＭＭＰＭＢＥＣなどのエピトープ予測アルゴリズムを使用して計算することができる。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現も定量化される。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現を定量化して、対象において免疫応答を誘発する１つまたは複数のネオアンチゲンを同定する。ＲＮＡ発現を測定するための様々な方法が存在する。ＲＮＡ発現を測定し得る既知の技術としては、ＲＮＡ－ｓｅｑ、及びインサイツハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、ノーザンブロット、ＤＮＡマイクロアレイ、タイリングアレイ、ならびに定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が挙げられる。当該技術分野における他の既知の技術を使用して、ＲＮＡの発現を定量化することができる。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、小核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｃＲＮＡ）、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、組み込みまたは非組み込みウイルスからのＲＮＡ、または任意の他のＲＮＡであり得る。好ましくは、ｍＲＮＡ発現を測定する。

本明細書に開示される方法は、任意選択的に、腫瘍クローンの配列決定を含むことができる。腫瘍クローンを配列決定して、腫瘍の十分な部分を表す１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを同定する。腫瘍クローンは、例えば、本明細書に開示される配列技術を使用し、当業者に既知の他の既知の配列決定技術を使用して配列決定され得る。

実施形態では、腫瘍全体で少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％の腫瘍クローン割合を有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、腫瘍特異的ネオアンチゲンが腫瘍の十分な割合に相当することを示す。腫瘍の十分な割合は、腫瘍特異的ネオアンチゲンが腫瘍全体にわたって十分な遺伝的多様性を提供することを示す。

本方法は、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが正常組織において自己免疫応答を誘導する能力を測定することをさらに含むことができる。正常な抗原と同様の配列を有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、正常組織において自己免疫応答を誘導し得ることが予想される。例えば、正常な抗原と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同様である腫瘍特異的ネオアンチゲンは、自己免疫応答を誘導し得る。自己免疫応答誘導すると予測される腫瘍特異的ネオアンチゲンは、免疫原性組成物として優先されない。自己免疫応答を誘導すると予測される腫瘍特異的ネオアンチゲンは、典型的には、免疫原性組成物に対して選択されない。本方法は、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが免疫寛容を誘発する能力を測定することをさらに含むことができる。免疫寛容を引き起こすと予測される腫瘍特異的ネオアンチゲンは、免疫原性組成物として優先されない。免疫寛容を引き起こすと予測される腫瘍特異的ネオアンチゲンは、免疫原性組成物として優先されない。

腫瘍特異的スコアは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、対象及び１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現レベルにおいて、免疫応答を誘発する確率数値スコアを得ることによって生成されるデータに基づいて計算される。腫瘍を横断する腫瘍クローン割合は、腫瘍特異的スコアを計算するために使用される上記の計算に加えて、任意選択的に含めることができる。高い確率数値スコア（例えば、腫瘍特異的ネオアンチゲンは免疫原性である）を有し、かつ高いレベルのＲＮＡ発現を有する腫瘍特異的ネオアンチゲンが優先される。比較すると、自己免疫応答を誘導すると予測される腫瘍特異的抗原は、免疫応答を誘導しない腫瘍特異的新抗原と比較して低い腫瘍特異的新抗原スコアを有し、免疫原性組成物に含めるために選択されない。高い確率数値スコア（例えば、腫瘍特異的ネオアンチゲンは免疫原性である）を有し、高レベルのＲＮＡ発現を有し、腫瘍全体にわたって十分な腫瘍クローン割合を提供する腫瘍特異的ネオアンチゲンが優先される。

高い確率数値スコア（例えば、腫瘍特異的ネオアンチゲンは免疫原性である）を有し、任意選択的に腫瘍全体にわたって十分な腫瘍クローン割合を提供するが、ＲＮＡ発現レベルが低い腫瘍特異的ネオアンチゲンは、高い確率数値スコア、高いＲＮＡ発現レベルを有し、任意選択的に腫瘍全体にわたって十分な腫瘍クローン割合を提供する腫瘍特異的ネオアンチゲンと比較して、より低い腫瘍特異的スコアを有する。この実施例では、より低い腫瘍特異的スコアを有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、より高い腫瘍特異的スコアを有する腫瘍特異的ネオアンチゲンよりも優先されない。高い確率数値スコア（例えば、腫瘍特異的ネオアンチゲンは免疫原性である）を有し、免疫応答を誘発するのに十分なレベルのＲＮＡ発現を有するが、腫瘍全体に十分な腫瘍クローン割合を提供しない腫瘍特異的ネオアンチゲンは、高い確率数値スコア、高いＲＮＡ発現レベルを有し、腫瘍全体に十分な腫瘍クローン割合を提供する腫瘍特異的ネオアンチゲンと比較して、より低い腫瘍特異的スコアを有する。免疫応答を誘発するのに十分なレベルのＲＮＡ発現を有し、腫瘍全体に十分な腫瘍分画を提供するが、確率数値スコアが低い腫瘍特異的ネオアンチゲンは、高い確率数値スコア、高いＲＮＡ発現レベルを有し、腫瘍全体に十分な腫瘍分画を提供する腫瘍特異的ネオアンチゲンと比較して、低い腫瘍特異的スコアを有する。

最後に、対象特異的免疫原性組成物の処方のために、腫瘍特異的スコアに基づく１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが選択される。実施形態では、免疫原性組成物に対して、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約５０以上の腫瘍特異的ネオアンチゲンが選択される。典型的には、少なくとも約１０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンが選択される。他の場合では、少なくとも約２０の腫瘍特異的ネオアンチゲンが選択される。

ＩＩ．治療方法
本開示はまた、本明細書に記載の方法を使用して選択された１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む個別化された免疫原性組成物を投与することを含む、それを必要とする対象においてがんを治療する方法に関する。

がんは、任意の固形腫瘍または任意の血液腫瘍であり得る。本明細書に開示される方法は、固形腫瘍に好ましい。腫瘍は、原発腫瘍（例えば、腫瘍が最初に発生した元の部位にある腫瘍）であり得る。固形腫瘍には、乳癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、前立腺癌腫瘍、肺癌腫瘍、腎癌腫瘍、胃癌腫瘍、精巣癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、脳癌腫瘍、及び黒色腫瘍が含まれ得るが、これらに限定されない。血液腫瘍には、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）及び白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、及びＴ細胞リンパ性白血病）由来の腫瘍が含まれ得るが、これらに限定されない。

本明細書に開示される方法は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、及び他の固形及び非固形腫瘍を含む任意の好適ながん性腫瘍に対して使用することができる。例示的に適切ながんとしては、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、未知の一次起点癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、大腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、腺管癌、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、知覚神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、目癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、膠腫、頭頸部癌、肝細胞性癌、組織球症、ホジキン・リンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、唇及び口空洞癌、肝癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性鱗片状の頸部癌、ＮＵＴ遺伝子を有する正中路癌、口癌、多発性内分泌腺腹、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、脊髄形成異常の／骨髄増殖性の新生物、鼻腔及び胸膜肺の平均の鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞性肺癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、乳頭腫症、パラガングリオーマ、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、芽細胞腫、一次性中枢神経原発悪性リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎う及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、類奇形腫瘍、精巣癌、喉頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌及びウィルムス腫瘍が挙げられる。好ましくは、がんは、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、膀胱癌、または肺癌である。黒色腫が特に興味深い。乳癌、肺癌、及び膀胱癌も特に興味深い。

免疫原性組成物は、対象の免疫系、特に特定のＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を刺激する。ＣＤ８＋及びＴヘルパーＣＤ４＋細胞によって産生されるインターフェロンガンマは、ＰＤ－Ｌ１の発現を調節する。腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現は、Ｔ細胞によって攻撃されると上方制御される。したがって、腫瘍ワクチンは、特定のＴ細胞の産生を誘導し、同時にＰＤ－Ｌ１の発現を上方制御し得、これは、免疫原性組成物の有効性を制限し得る。さらに、免疫系が活性化される間、Ｔ細胞表面レポーターＣＴＬＡ－４の発現がそれに対応して増加し、これは、抗原提示細胞上のリガンドＢ７－１／Ｂ７－２と結合し、免疫抑制効果を果たす。したがって、いくつかの場合では、対象は、チェックポイント阻害剤等の抗免疫抑制剤または免疫刺激剤をさらに投与され得る。チェックポイント阻害剤には、抗ＣＴＬ４－Ａ抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれ得るが、これらに限定されない。これらのチェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞の免疫チェックポイントタンパク質に結合して、腫瘍細胞によるＴ細胞機能の阻害を除去する。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者のがん細胞に対する免疫応答を高めることができる。ＣＴＬＡ－４は、ワクチン接種プロトコルに従うときに効果的であることが示されている。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物は、がんと診断されている対象、すでにがんに罹患している対象、再発がん（すなわち、再発）を有する対象、またはがんを発症するリスクがある対象に投与することができる。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物は、他の形態のがん治療（例えば、化学療法、免疫療法、または放射線）に耐性のある対象に投与することができる。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物は、他の標準的なケアがん療法（例えば、化学療法、免疫療法、または放射線療法）の前に対象に投与することができる。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物は、他の標準的なケアがん療法（例えば、化学療法、免疫療法、または放射線）と同時に、後に、または組み合わせて、対象に投与することができる。

対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または腫瘍特異的応答が所望される任意の動物とすることができる。

免疫原性組成物は、腫瘍特異的ネオアンチゲンへの免疫応答を誘発し、症状及び／または合併症を破壊する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で対象に投与される。実施形態では、免疫原性組成物は、長期間持続する免疫応答を提供することができる。長期間持続する免疫応答は、免疫原性組成物の増強用量を対象に投与することによって確立することができる。免疫原性組成物に対する免疫応答は、対象に増強用量を投与することによって延長することができる。実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ以上の促進用量を投与して、がんを軽減することができる。第１の増強用量は、免疫応答を少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加させ得る。第２の増強用量は、免疫応答を少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加させ得る。第３の増強用量は、免疫応答を少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加させ得る。

免疫応答を誘発するのに十分な量は、「治療有効量」として定義される。この使用に効果的な量は、例えば、投与されるワクチン投与計画の特定な組成、投与様式、疾患の段階及び重症度、患者の一般的健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。免疫原性組成物は、一般に、重篤な疾患状態、すなわち、特にがんが転移した場合に、生命を脅かすまたは潜在的に生命を脅かす状況において用いることができることに留意されたい。そのような場合、外部物質の最小化及び新抗原の相対的な無毒性を考慮すると、これらの免疫原性組成物の実質的な過剰を投与することが可能であり、治療医によって望ましいと感じることができる。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物は、対象に単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与することができる。治療薬は、例えば、化学療法薬、放射線療法、または免疫療法であり得る。特定のがんに対する任意の好適な治療処置を施すことができる。代表的な化学療法剤としては、限定されないが、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミフォスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、タモキシフェン、タキソール、トポテカン塩酸塩、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン酒石酸塩が挙げられる。対象は、小分子、または標的療法（例えば、キナーゼ阻害剤）を投与され得る。対象は、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体をさらに投与され得る。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者のがん細胞に対する免疫応答を高めることができる。

ＩＩＩ．免疫原性組成物
本発明はさらに、本明細書に記載の方法を使用して選択される１つまたは複数の腫瘍特異的抗原を含む、個別化された（すなわち、対象特異的な）免疫原性組成物（例えば、がんワクチン）に関する。そのような免疫原性組成物は、当該技術分野の標準的な手順に従って処方することができる。免疫原性組成物は、特異的免疫応答を上昇させることができる。

免疫原性組成物は、腫瘍特異的ネオアンチゲンの選択及び数が対象の特定のがんに合わせて調整されるように処方することができる。例えば、腫瘍特異的ネオアンチゲンの選択は、特定の種類のがん、がんの状態、対象の免疫状態、及び対象のＭＨＣタイプに依存することができる。

免疫原性組成物は、少なくとも１個、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含むことができる。免疫原性組成物は、約１０～２０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～３０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～４０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～５０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～６０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～７０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～８０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、約１０～９０個の腫瘍特異的ネオアンチゲン、または約１０～１００個の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含有することができる。好ましくは、免疫原性組成物は、少なくとも約１０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む。また、好ましくは、少なくとも約２０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物である。

免疫原性組成物は、天然または合成抗原をさらに含むことができる。天然または合成抗原は、免疫応答を増加させることができる。例示的な天然または合成抗原には、汎ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）及び破傷風毒素抗原が含まれるが、これらに限定されない。

免疫原性組成物は、任意の形態、例えば、合成された長いペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、樹状細胞、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、プラスミド、またはベクターとすることができる。

腫瘍特異的ネオアンチゲンはまた、ワクシニア、鳥痘、自己複製アルファビム、マラバウイルス、アデノウイルスなどのウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含まれ得る（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：６１６－６２９（２００４）を参照されたい）、またはレンチウイルス、限定されないが、特定の細胞型または受容体を標的にするように設計された任意の世代の第２、第３またはハイブリッド第２／第３世代レンチウイルス及び組換えレンチウイルスを含む（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２３９（１）：４５－６１（２０１１）、Ｓａｋｍａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，４４３（３）：６０３－１８（２０１２）を参照されたい）。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンペプチドをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列に隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または細胞下区画を標的とする１つまたは複数の配列に先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，２２（４）：４３３－８（２０１６）、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，３５２（６２９１）：１３３７－１３４１（２０１６）、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０（１３）：３４０１－３４１０（２０１４）を参照されたい）。宿主に導入されると、感染細胞は、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを発現し、それによって、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンに対する宿主免疫（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）応答を誘発する。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。本明細書の説明から当業者に自明な、ネオアンチゲンの治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のワクチンベクターもまた、用いられ得る。

免疫原性組成物は、特定の対象の個々のニーズに応じて、個別化された成分を含有することができる。

本明細書に記載される免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは、免疫原性組成物への混合物が増加するか、またはそうでなければ、腫瘍特異的ネオアンチゲンへの免疫応答を増強及び／またはブーストするが、その物質が単独で投与されるときに、腫瘍特異的ネオアンチゲンへの免疫応答を生成しない任意の物質である。アジュバントは、好ましくは、ネオアンチゲンに対する免疫応答を生成し、アレルギーまたは他の有害反応を生成しない。本明細書では、免疫原性組成物は、免疫原性組成物の投与の前に、一緒に、併用して、または免疫原性組成物の投与の後に投与することができることが企図される。

アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂ及び／またはＴ細胞の刺激、及びマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増強することができる。本発明の免疫原性組成物がアジュバントを含むか、または１つまたは複数のアジュバントと一緒に投与される場合、使用可能なアジュバントとしては、限定されないが、ミネラル塩アジュバントまたはミネラル塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、及び免疫刺激アジュバントが挙げられる。アジュバントの例としては、アルミニウム塩（ミョウバン）（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウムなど）、３Ｄｅ－Ｏ－アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（ＧＢ２２２０２１１を参照）、ＭＦ５９（ノバルティス）、ＡＳ０３（グラクソスミスクライン）、ＡＳ０４（グラクソスミスクライン）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０；ＩＣＬ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．）、イミダゾピリジン化合物（国際公開第ＷＯ２００７／１０９８１２号として公開されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４８５７号を参照）、イミダゾキノキサリン化合物（国際公開第ＷＯ２００７／１０９８１３号として公開されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４８５８号を参照）、ならびにサポニン、例えばＱＳ２１（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）、米国特許第５，０５７，５４０号）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、アジュバントはフロイントアジュバント（完全または不完全）である。他のアジュバントは、任意選択的に、モノホスホリル脂質Ａ等の免疫刺激剤と組み合わせた、水エマルション中の油（スクアレンまたはピーナッツ油等）である（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６－９１（１９９７）を参照）。

ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、ワクチンの設定におけるアジュバントの効果を増強することが報告されている。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／またはＴＬＲ９等の他のＴＬＲ結合分子も使用し得る。

有用なアジュバントの他の例としては、限定されないが、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ポリポリ：ＣＩ２Ｕ）、ポリＩＣＬＣ、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびにシクロホスファミド、スニトミブ、ベバシズマブ、セレブレックス（セレコキシブ）、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパンブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリマブ、及びＳＣ５８１７５等の免疫活性小分子及び抗体が挙げられ、これらは治療用として、及び／またはアジュバントとして作用し得る。実施形態では、ポリＩＣＬＣは好ましいアジュバントである。

免疫原性組成物は、本明細書に単独で、または薬学的に許容される担体と一緒に記載される１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含むことができる。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲン、特に等張水性懸濁液、分散液、またはアンピギル溶媒の懸濁液または分散液を使用することができる。免疫原性組成物は、滅菌されてもよく、及び／または賦形剤、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤及び／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧及び／または緩衝液を調節するための塩を含んでもよく、例えば、従来の分散及び懸濁プロセスによって、それ自体知られている方法で調製される。ある特定の実施形態では、かかる分散液または懸濁液は、粘度調節剤を含んでもよい。懸濁液または分散液は、約２℃～８℃の温度で維持されるか、またはより長い保管のために優先的に凍結され、次に使用直前に解凍され得る。注射のために、ワクチンまたは免疫原性調製物は、水溶液中、好ましくは、ハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。この溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような処方剤を含有していてもよい。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、防腐剤、例えば、水銀誘導体チメロサールをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は０．００１％～０．０１％のチメロサールを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は防腐剤を含まない。

賦形剤は、アジュバントとは独立して存在することができる。賦形剤の機能は、例えば、免疫原性組成物の分子量を増加させること、活性または免疫原性を増加させること、安定性を付与すること、生物学的活性を増加させること、または血清半減期を増加させることであり得る。賦形剤は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）への１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの提示を助けるためにも使用することができる。賦形剤は、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリン等の血清タンパク質、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオバルブミン、免疫グロブリン、またはインスリンもしくはパルミチン酸等のホルモン等の担体タンパク質であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫化のために、担体は、一般に、ヒトに許容され、安全な生理学的に許容される担体である。あるいは、担体はデキストラン、例えばセファロースであり得る。

細胞傷害性Ｔ細胞は、無傷の外来抗原自体ではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態の抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の三量体複合体が存在する場合、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が可能である。１つまたは複数の腫瘍特異的抗原が細胞傷害性Ｔ細胞の活性化のために使用されるだけでなく、それぞれのＭＨＣ分子を有する追加のＡＰＣが添加される場合、それは免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１つのＡＰＣをさらに含有する。

免疫原性組成物は、許容可能な担体（例えば、水性担体）を含むことができる。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の高知の殺菌技法によって殺菌され得るか、または無菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのままで使用するために包装され、または凍結乾燥させられ得、凍結乾燥調製品は、投与の前に無菌の溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤などの生理学的条件に近似するために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレイン酸塩などを含み得る。

ネオアンチゲンはまた、リンパ組織等の特定の細胞組織を標的にするリポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増加させるのに有用である。リポソームは、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層等を含む。これらの調製物において、送達されるネオアンチゲンは、リポソームの一部として、単独で、または例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体等のリンパ系細胞間で流行する受容体に結合する分子とともに、または他の治療用もしくは免疫原性組成物とともに組み込まれる。したがって、所望のネオアンチゲンで満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位に向けられ得、そこでリポソームは、次いで、選択された免疫原性組成物を送達する。リポソームは、通常、中性及び負に荷電したリン脂質、ならびにコレステロール等のステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成することができる。脂質の選択は、一般的に、例えば、血流中のリポソームのリポソームサイズ、酸性度、及び安定性を考慮することによって誘導される。リポソームの様々な調製方法が利用可能であり、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、第５，０１９，３６９号が挙げられる。

免疫細胞を標的とするために、リポソームに組み込まれるリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与方法、送達されるペプチド、及び治療される疾患の段階に応じて変化する用量で、静脈内、局所的、局所的等に投与することができる。

免疫細胞、免疫原性組成物の成分、例えば、抗原（すなわち、腫瘍特異的ネオアンチゲン）、リガンド、またはアジュバント（例えば、ＴＬＲ）を標的にするための代替方法は、ポリ（乳酸－共グリコール）微粒子に組み込むことができる。ポリ（乳酸－共グリコール）微粒子は、エンドソーム送達デバイスとして免疫原性組成物の成分を捕捉することができる。

治療または免疫化の目的で、本明細書に記載の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする核酸を患者に投与することもできる。核酸を患者に送達するために、いくつかの方法が好適に使用される。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達され得る。このアプローチについては、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８（１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号を参照されたい。核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように、弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与することもできる。ＤＮＡのみからなる粒子を投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子等の粒子に付着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションの有無にかかわらず、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターを含み得る。核酸は、カチオン性脂質等のカチオン性化合物に複合体化して送達することもできる。

本明細書に提供される免疫原性組成物は、限定されないが、経口、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、静脈内、局所、皮下、経皮、鼻腔内及び吸入経路を含むが、対象に投与することができ、傷跡形成（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分岐針を使用して、皮膚の最上層を掻く）を介して投与することができる。免疫原性組成物は、腫瘍部位に投与して、腫瘍に対する局所的免疫応答を誘導することができる。

１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの投与量は、組成物の種類、及び対象の年齢、体重、体表面積、個々の状態、個々の薬物動態データ、及び投与様式に依存し得る。

また、本明細書に開示される方法のステップを実施することによって選択される１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を製造する方法も本明細書に開示される。本明細書に記載の免疫原性組成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して製造することができる。例えば、本明細書に開示される腫瘍特異的ネオアンチゲンまたはベクター（例えば、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を産生する方法は、ネオアンチゲンまたはベクターを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することであって、宿主細胞は、ネオアンチゲンまたはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、培養することと、ネオアンチゲンまたはベクターを精製することと、を含むことができる。標準精製方法としては、クロマトグラフィー法、電気泳動法、免疫学的法、沈殿法、透析法、濾過法、濃縮法、及びクロマトフォーカシング法が挙げられる。

宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母細胞、またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられ得る。宿主細胞は、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンまたは本明細書に開示されるベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む１つまたは複数のポリヌクレオチドで形質転換することができる。ある特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであり得る。

ＩＶ．試料
本明細書に開示される方法は、腫瘍に由来する１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択することを含む。１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法は、腫瘍に由来する配列データを得ることを含む。このような配列データは、対象の腫瘍試料に由来し得る。腫瘍試料は、腫瘍生検から得ることができる。

腫瘍試料は、ヒトまたは非ヒト対象から得ることができる。好ましくは、腫瘍試料はヒトから得られる。腫瘍試料は、がん性腫瘍を含む様々な生物源から得ることができる。腫瘍は、腫瘍部位に由来し得るか、または血液由来の循環腫瘍細胞に由来し得る。例示的な試料としては、体液、組織生検、血液試料、血清血漿、便、皮膚試料等が挙げられ得るが、これらに限定されない。試料の供給源は、腫瘍組織生検などの固体組織試料であり得る。組織生検試料は、例えば、肺、前立腺、結腸、皮膚、乳房組織、またはリンパ節からの生検であり得る。試料はまた、例えば、骨髄穿刺及び骨髄生検を含む骨髄の試料であり得る。試料はまた、液体生検、例えば、循環腫瘍細胞、無細胞循環腫瘍ＤＮＡ、またはエクソソームであり得る。血液試料は、全血、部分的に精製された血液、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）等の全血もしくは部分的に精製された血液の一部であり得る。

本明細書に記載の腫瘍試料は、対象から直接入手するか、対象に由来するか、または対象から入手した試料、例えば、生体液または組織試料に由来する培養細胞に由来することができる。腫瘍生検は、新鮮な試料であり得る。新鮮な試料は、任意の既知の固定剤（例えば、ホルマリン、ゼンカーの固定剤、またはＢ－５固定剤）を用いて対象から除去した後に固定することができる。腫瘍生検は、対象から直接得られた細胞、または対象から得られた細胞に由来する細胞の凍結試料、凍結保存試料等のアーカイブされた試料とすることもできる。好ましくは、対象から得られた腫瘍試料は、新鮮な腫瘍生検である。

腫瘍試料は、腫瘍生検、針吸引、擦過、外科的切除、外科的切開、静脈穿刺、または当該技術分野で既知の他の手段を含むがこれらに限定されない任意の手段によって、対象から得ることができる。腫瘍生検は、腫瘍を得るための好ましい方法である。腫瘍生検は、任意のがん性部位、例えば、原発腫瘍または二次腫瘍から得ることができる。原発腫瘍からの腫瘍生検が一般に好ましい。当業者は、腫瘍試料を得るための他の好適な技法を認識するであろう。

腫瘍試料は、単一の手順で対象から得ることができる。腫瘍試料は、一定の期間にわたって繰り返し対象から得ることができる。例えば、腫瘍試料は、１日に１回、週に１回、月に１回、半年に１回、または年に１回入手することができる。一定の期間にわたって多数の試料を得ることは、新しい腫瘍特異的ネオアンチゲンを同定及び選択するのに有用であり得る。腫瘍試料は、同じ腫瘍または異なる腫瘍から得ることができる。

腫瘍試料は、原発腫瘍、１つまたは複数の転移、及び／または腫瘍成長の個々の部位（例えば、股関節、骨、または椎骨などの異なる骨格部分からの骨髄）から得ることができる。腫瘍試料は、同じ部位または異なる部位から得ることができる。

均等物
本明細書に記載される本発明の方法の他の好適な修正及び適合は明白であり、本開示または実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な等価物を用いてなされ得ることは、当業者には容易に明白であろう。特定の組成物及び方法を詳細に説明した後、限定することを意図するものではなく、例示のみのために導入される以下の実施例を参照することによって、同じことがより明確に理解されるであろう。

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書に提供される概要を読むことにより、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解されよう。

実施例１．ネオアンチゲンペプチドの選択
本実施例は、患者の腫瘍及び正常組織から生成される次世代配列決定データから識別される新抗原性免疫原性ペプチドを選択する個々の手順ステップを説明する。

１．１．試料調製及びＷＥＳ、ＷＧＳ、及びＲＮＡ－Ｓｅｑデータの生成
腫瘍生検または外科的インプラントを、インフォームドコンセントを伴って試験参加者から収集し、氷上の組織培養培地でＣｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ＣＬＩＡ研究室に輸送した。そこで、試料が受入され、特定のユニークな試料識別子が割り当てられた。次に、組織を計量し、分割し、その体積の５（５）倍量のＲＮＡｌａｔｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＣａｔＮｏ ＡＭ７０２０）中に入れた。次いで、試料を４℃で一晩放置し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液から除去し、１ｍＬのＳＴＥＭＣＥＬＬ ＣｒｏｙＳｔｏｒ１０（ＣａｔＮｏ０７９５２）を含む凍結卵管中に入れ、－８０℃でＣｏｏｌＣｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣａｔＮｏ４３２０００）中に移した。

付随する治験実施計画書の参加者からＡＣＤチューブに採取された末梢血を検体処理及び研究細胞バンクに輸送し、Ｆｉｃｏｌｌを使用してＳＯＰに従ってＰＢＭＣ処理を行った。ＰＢＭＣ処理を、腫瘍生検前に行うことで、ＰＢＭＣ及び腫瘍生検組織を配列決定プロバイダーに同時に出荷することが可能となり得る。

全ての検体（腫瘍生検及びＰＢＭＣ）を、ＣＬＩＡ研究室によって一晩、ドライアイス上で提供する配列決定に送った。

ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡユニバーサルキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、同じ組織または細胞標本から同時に単離した。

適切な方法（例えば、Ｑｕｂｉｔ、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）を使用してＤＮＡ／ＲＮＡ試料の質及び量を評価し、以下の測定基準を記録した。

ＤＮＡ：濃度（ｎｇ／μＬ）、総量（ｎｇ）、体積（μＬ）

ＲＮＡ：濃度（ｎｇ／μＬ）、総量（ｎｇ）、体積（μＬ）、純度（ＲＩＮ）

２００ｎｇを超えるゲノムＤＮＡを含有するＤＮＡ試料アリコートを調製し、２００ｎｇをＷＥＳに使用し、残りのＤＮＡをＷＧＳの別の配列決定プロバイダーのために出荷した。

ＮＧＳを実施した。ライブラリー調製及び配列決定ストラテジーの概要を以下の表３に示す。

ペアになった腫瘍／正常試料からのＷＥＳデータを使用して、患者及びその腫瘍の生殖細胞系及び体細胞変異体を同定した。

ＷＥＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ ｖ６ ｂａｉｔキットを使用して市販の配列決定ベンダーで実施し、ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ６０００機器上で生成し、配列決定した。ＰＢＭＣ試料からのＤＮＡは、１００ｂｐのＰＥストラテジー、７５倍の平均カバレッジ、及び３８００万リードのターゲットを使用してＷＥＳに供した。組織試料からのＤＮＡは、１００ｂｐのＰＥストラテジー、１２５倍の平均カバレッジ、及び６３００万リードのターゲットを使用してＷＥＳに供する。

ＲＮＡ配列決定データを使用して、十分に高い発現を有するＲＮＡ転写物をコードするネオアンチゲンを同定し、ならびにＷＥＳ由来の体細胞変異体を独立して確認した。

５０ｂｐのＰＥストラテジー及び１億リードのターゲットを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ配列決定法を使用してＲＮＡを配列決定した。

ポリアデニル化テールを利用してメッセンジャーＲＮＡを優先的に選択する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ法を使用して配列決定ライブラリーを作製した。

ＷＧＳデータを使用して、ＣＮＶ呼び出しを実行し、腫瘍試料のサブクローンを同定した。

上記に詳述されるように調製された腫瘍及び正常なゲノムＤＮＡからの商業的なＣＬＩＡ検証された実験室で、ＷＧＳを実施した。同じ個体からの２つのプールされたライブラリーを、読み取り長さが２×１０１のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｓ４フローセル（ＦＣ）上で配列決定した。デマルチプレクシング（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）のために、Ｑ３０＞８０％かつエラー率＜３％のＦＣで生成されたデータを通過させた。

ＦＡＳＴＱ形式のＮＧＳデータを、さらなるバイオインフォマティクス解析のために配列決定ベンダーから転送した。

ＨＬＡタイピングは、認定された臨床免疫遺伝学研究所で分子アッセイを用いて実施した。

１．２．ＮＧＳデータのバイオインフォマティクス分析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＲＡＧＥＮ Ｂｉｏ－ＩＴプラットフォーム（ｖ３．８．５）を使用して、ｈｇ１９参照ゲノムへのＮＧＳリードのマッピング及びアライメントを行った。入出力ファイルの詳細について、マッピング及びアライメントに使用される処理ステップの自動実行を、図２に示す。

全てのＮＧＳ分析は、ｈｇ１９ヒト参照ゲノムアセンブリ（初期ＧＲＣｈ３７放出に基づく初期ＵＣＳＣ参照アセンブリ、ｍｄ５チェックサムａ２４４ｄ８ａ３２４７３６５０ｂ２５ｃ６ｅ８ｅ１６５４３８７ｄ６、Ｓｅｎｔｉｅｏｎ参照バンドルからダウンロード）を用いて実施した。既知のＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子とｈｇ１９染色体座標（ＧＴＦファイル）との間のマッピングをＵＣＳＣからダウンロードした。このファイルは、ＲＮＡ遺伝子発現の定量化に使用される。ＤＲＡＧＥＮ Ｂｉｏ－ＩＴプラットフォームは、マッピング、アライメント、及び変異体呼び出しに必要な一連のハッシュテーブルファイルを生成するために使用した。生成されたハッシュテーブルファイル及びｈｇ１９アンサンブルＧＴＦファイルを、Ｓ３データストレージバケットにアップロードした。

ＤＮＡ配列マッピング及びアライメントのステップは、ＮＧＳ ＦＡＳＴＱファイルを入力として取得し、正常及び腫瘍（提供される場合）試料について独立して、提供された参照ゲノムハッシュテーブルに読み取りをアライメントする。正常なマッピング／アライメントには、体細胞ＣＮＶ呼び出し（Ｂ対立遺伝子ファイルと称される）のためにモジュールＡ３で使用される生殖細胞系変異体呼び出しの生成を含めた。

マッピング／アライメントアルゴリズムに加えて、このモジュールは、品質管理に使用されたＤＲＡＧＥＮのレポート機能（マッピング統計及びトリミングレポートを含む）を利用した。

腫瘍試料のマッピング／アライメントのために、コマンドラインを表５に概説した。

定量化及び遺伝子融合検出が可能なＤＲＡＧＥＮ Ｂｉｏ－ＩＴプラットフォーム（ｖ３．８．５）ＲＮＡモジュールを使用して、ＲＮＡ Ｓｅｑ ＦＡＳＴＱファイルをＵＣＳＣ ｈｇ１９ヒト参照ゲノムに整列させた。ＧＥＮＣＯＤＥ ｈｇ１９／ＧＲＣｇ３７．ｐ１３ ＧＴＦファイルを使用して、遺伝子及び遺伝子転写産物（Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子及び転写産物ＩＤ）をゲノム領域にマッピングした。

ＵＣＳＣ ｈｇ１９ヒト参照ゲノムに整列した正常（ＰＢＭＣ）ＷＥＳ及びＷＧＳ．ＢＡＭファイルを個別に使用して、生殖細胞系変異体呼び出しのリスト（．ＶＣＦファイル）を生成し、試験参加者のゲノム対参照ゲノムの差異を示した。検出された変異体は、単一または複数の塩基変異、挿入、及び欠失であった。構造的な変異体はプロセシングされなかった。ＤＲＡＧＥＮ Ｂｉｏ－ＩＴプラットフォーム（ｖ３．８．５）を使用して、生殖細胞系変異体呼び出しを導出し、フィルタリングされていない、及びフィルタリングされた生殖細胞系．ＶＣＦファイルを生成するための詳細なコマンドライン引数を以下に説明する。

得られた生殖細胞系．ＶＣＦファイルを使用して、候補ワクチンペプチドが研究参加者の生殖細胞系配列（自己ペプチド）を表さないことを確認にし、さらにＣＮＶ呼び出しを入力Ｂ－対立遺伝子頻度ファイルとして提供した。

ＤＲＡＧＥＮ Ｂｉｏ－ＩＴプラットフォームを使用して、ＷＥＳ及びＷＧＳに位置合わせされた．ＢＡＭファイルから、腫瘍と正常な試験参加者サンプルとの間の差として生じる体細胞変異体を同定した。最初のステップでは、腫瘍ファイルと正常な．ＢＡＭファイルを比較して、腫瘍特異的（体細胞）ＤＮＡ変異を同定し、．ＶＣＦファイルとして出力され、１つはフィルタリングされず、１つは信頼性の高い変異体でフィルタリングされた。２番目のステップでは、ＷＧＳの場合のみ、ＣＮＶ呼び出しが生成され、．ＶＣＦファイルとして出力した。このステップの入力は、腫瘍及び正常な．ＢＡＭファイル、ならびにＢ－対立遺伝子頻度の入力として使用されるフィルタリング困難な生殖細胞系変異体呼び出しファイルであった。

体細胞変異体及びＣＮＶ呼び出しを実行するための追加の詳細及びコマンドラインインターフェースオプションを表８に記載する。

体細胞．ＶＣＦファイル（フィルタリング困難）を、下流のワクチンペプチド選択モジュールに使用した。

ＤＲＡＧＥＮでのＣＮＶ呼び出しには、Ｂ－Ａｌｌｅｌｅ．ＶＣＦファイルが必要である。ＣＮＶ呼び出しには、生殖細胞系呼び出し及びモジュールＡ１からの正常／腫瘍．ＢＡＭファイルが先行していた。

コンティグ全体のマッピング／アライメントの有効性を分析するために、モジュールＡ－ＱＣ１は．ＢＡＭファイルを入力としてｍｏｓｄｅｐｔｈ分析プログラムを採用した。さらに、ＷＥＳについては、定義されたゲノム領域に分析を制限するための．ＢＥＤファイルが提供された。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ ｖ６キャプチャベイトセットのｈｇ１９ベッドファイルは、Ａｇｉｌｅｎｔウェブサイトからダウンロードし、処理パイプラインによって自動ダウンロードするためにＳ３に保存した。

ｍｏｓｄｅｐｔｈサマリーファイルは、タブ区切りのテキストファイルで、．ＢＡＭファイル（カラムクロム）に存在する全ての連続体の平均カバレッジ（カラム平均）を示す。．ＢＥＤファイルが提供された場合、接尾辞「＿ｒｅｇｉｏｎ」は．ＢＥＤ制限付きコンティグのメトリックを示す。ｍｏｓｄｅｐｔｈサマリーファイルの省略されたリストを示す（例えば表１０）。

分析及び品質管理のために、腫瘍及び正常なｍｏｓｄｅｐｔｈ要約ファイルを使用して仕様レポートを生成した。

マッピングアライメントの結果例を以下の表１１～１５に示す。

変異体呼び出しプロセスの結果を表１６～１９に示す。

ワークフローの後続のモジュールは、腫瘍正常なＷＧＳ試料からモジュールＡによって呼び出される腫瘍体細胞変異体及びコピー数変異体を処理し、各体細胞変異体の会員確率をＮ個の腫瘍特異的サブクローンのセットに出力し、Ｎは、モジュールによって出力されるパラメータである。また、各変異の細胞有病率の推定値を出力する。このモジュールはまた、サブクローンへの変異体のバルクデコンボリューションを行った。ＷＧＳファイルは、モジュールＡのＤＲＡＧＥＮから生成され、このモジュールで処理されて、体細胞変異体の細胞有病率からサブクローナリティを推定した。図３は、クローン性デコンボリューションのためのモジュールのワークフロー図を示す。

１．３．ＮＧＳデータからのペプチドの選択
製造されるワクチンペプチドを、個別化ペプチド予測パイプライン（ｐ４ｖａｘ）内のペプチド予測及び機械学習アルゴリズムによって選択した。本ソフトウェアソリューションの全てのコンポーネントを本明細書に簡潔に記載する。

マッピング／アライメント、ＲＮＡ遺伝子発現、生殖細胞系変異形、体細胞変異形、及びＣＮＶ発呼者出力ファイル、ならびにＨＬＡハプロタイピングの結果を、ペプチド予測ワークフローによって摂取して、以下を行う：
１．発現ＲＮＡに対するコーディング効果を有する変異体を同定する
２．非同義変異体にわたる推定されるＭＨＣクラスＩ及びＩＩ結合ペプチドを選択する
３．ＲＮＡシークエンシングリードにおける変異体の存在を確認する
４．ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの処理、提示、及び免疫原性の推定
５．生殖細胞系変異体呼び出しでｈｇ１９参照を補正することにより、腫瘍ＤＮＡのみに変異が存在するが、生殖細胞系（正常）ＤＮＡには存在しないことを確認する
６．潜在的に有毒なペプチド、またはエンドペプチダーゼもしくはエクソペプチダーゼ代謝の産物をフィルターすること
７．ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ処理、提示、及び免疫原性に関するペプチドをランク付けすること
８．ペプチドによって標的とされる腫瘍細胞の予想されるパーセントを最大化すること。

具体的には、ペプチド選択のために、体細胞変異体呼び出しに基づくＷＥＳ及びＷＥＳからの結果を使用した。

腫瘍サブクローン・デコンボリューションアルゴリズムを使用して、ワークフローは、腫瘍正常ＷＧＳ試料からモジュールＡによって呼び出される腫瘍体細胞変異体及びコピー数変異体を処理し、さらに、各体細胞変異体のメンバーシップ確率を、変異／細胞有病率のＮ個の腫瘍特異的クラスターのセットに出力する。このステップの結果をステップ８で使用した。

ペプチド予測パイプラインの出力は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ結合／提示スコア、免疫原性、及び腫瘍細胞有病率クラスターの組み合わせによってランク付けされる潜在的なワクチンペプチドの徹底的なリストである。

潜在的なペプチド合成候補のこのランク付けされたリストから、リスト内で最もランク付けされた最大８０個のペプチドのセットを選択した。体細胞変異体の存在を手動で検証した後、検証された体細胞変異体から生じるペプチド配列を、合成のためにペプチド製造業者に伝えた。

実施例試料のＤＤＤＤＤ、ＦＦＦＦＦ、及びＧＧＧＧＧ（表２０～表２２）についてペプチド選択を行い、さらに２０個のペプチドをプール処方の候補として選択した。

１．４．ペプチド製造
ワクチンペプチドの製造及びプール処方は、ペプチド合成、品質管理、ペプチド及びペプチドプールの溶解及び混合を行うペプチドメーカーで行った。

ペプチドを固相ペプチド合成によって調製し、ＲＰ－ＨＰＬＣカラムを使用して精製し、品質（同一性、純度、ペプチド含有量、酢酸塩／ＴＦＡ含有量、残留有機溶媒）について分析した。

ペプチド合成の結果を表２３～２５に示す。

次いで、品質管理基準（外観、同一性、ペプチド含有量、ペプチド純度、酢酸含有量、ＴＦＡ含有量、残留有機溶媒）に合格することによって決定された通りに製造されたペプチドをプール最適化アルゴリズムに供した。

簡潔に述べると、このアルゴリズムでは、選択されたペプチドを４つのプールに分配し、各プールが高いＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの両方のスコアを有するペプチドを含むように分布を最適化した。プール処方中の多量体化を回避するために２つ以上のシステインを含有する配列を最初に除外した後、最適化アルゴリズムでは、個々のワクチンペプチドプールに組み合わされるべき約１４個の長いワクチンペプチド及び６個の短いペプチドの最良の組み合わせを同定した。最初のペプチドの予測または生成が１４未満の長いワクチンペプチドを産生した場合、それぞれ５つのペプチドを有する４つのプールの標的に対応するように、長いペプチド対短いペプチド比を変更してもよい。同様に、ワクチンペプチドプールがＣＤ４エンゲージメントの低い可能性に外挿する３（３）未満の長いペプチドで構成される場合、プールペプチドの１つがＰＡＤＲＥであるように選択された。

次いで、いくつかの提案されたプール組成物をペプチド製造業者に伝え、ワクチンペプチドプール処方を実施した。

ペプチドの群を選択し、プールする。各プール中に（ＮＭＴ）５（５）個以下のペプチドを有する最大４（４）個のプールを調製した。各ペプチドを５．５３８％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ中に溶解させ、続いて０．４１５８ｍｇ／ｍＬの各ペプチドの濃度で０．９％のＮａＣｌ溶液に溶解させた。その溶解を目視できるペプチドは、その群のプールに受け入れた。グループ内の全てのペプチドのプールに成功した後、プールを０．２μｍのナイロンフィルターを通して濾過した。ペプチドを滅菌チューブで出荷し、プール名、ロット番号、成分、製造データ、数量／濃度、及び保管条件でラベル付けした。

１．５．ペプチドワクチンの処方
個別化ワクチンを処方するために、ペプチドプールを、以下の手順を使用して、アジュバントとしてポリＩＣＬＣと混合した：

プールごとに１つのペプチドバイアルを冷凍庫から取り出す。各ペプチドプールについて、以下のステップを実施する。

ペプチドプールを室温で２０～３０分間解凍する。ペプチド溶液はＤＭＳＯを含有し、完全な解凍のためにわずかな温暖化（手で温める）及び／または撹拌を必要とする場合がある。この物質は、透明で無色の溶液であることが期待される。沈殿物が形成される場合、溶液をボルテックスして沈殿物を溶解させ得る。

解凍中に、ステップ４～９のシリンジを準備してラベルを貼付ける（表２６を参照）。（Ａ）「Ｍ１－２［Ａ－Ｄ］」とラベル付けされたプールごとの２（２）つの混合シリンジ（プールを示す）：（ｉ）シリンジ１：１０ｍＬ（または適切なサイズ）、及び（ｉｉ）シリンジ２：１ｍＬ（または適切なサイズ）；ならびに（Ｂ）「投与シリンジ［Ａ－Ｄ］」とラベル付けされた（プールを示す）プール当たり１個の（１）投与シリンジ。

必要な追加材料（ペプチドプール当たり）
１（１）つのメスからメスのルアーアダプターへのガードされたメス
１（１）つの混合のスポイトＭ１にペプチドプールを移す３”吸引の針
１（１）つの非発熱性滅菌低タンパク結合シリンジフィルター。孔径０．２２μｍ。（例えば、Ｐａｌｌ ＤＭＳＯ－安全エアロディスクシリンジフィルター、＃４４３３、またはＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ０．２２μｍ ＰＶＤＦ、３３ｍｍ、ガンマ滅菌。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＳＬＧＶＭ３３ＲＳ）
３（３）つの滅菌皮下注射針適切なゲージ
１（１）つのＩＭ注射用スピロスクローズドシステム薬物移送装置（ＣＳＴＤ）［ＩＣＵメディカル、＃ＳＨ２０００ＳＣ－１０］
各バイアルの内容物のフィルター滅菌：１０ｍＬシリンジとルアーロック（混合シリンジ１、Ｍ１）を使用して、０．２２μｍの滅菌フィルターに連結し、アセンブリの３インチ吸引針をスライドさせ、バイアルから２ｍＬのペプチドプールを取り出す。

ポリＩＣＬＣ溶液を調製する。１ｍＬシリンジ（混合シリンジ２、Ｍ２）と適切なサイズの針を使用して、無菌条件下で０．７６０ｍＬのポリＩＣＬＣを吸引する。ポリＩＣＬＣは、白色の半透明の溶液である。下流ステップは、半透明の生成物をもたらし得るが、これは許容される。

シリンジ１（Ｍ１）とシリンジ２（Ｍ２）の混合から針を取り外し、シリンジ１（Ｍ１）の混合から滅菌フィルターを取り出す。

ポリＩＣＬＣ混合シリンジ２（Ｍ２）をペプチドプール混合シリンジ１（Ｍ１）に、メスからメスへのルアーロックガードコネクタを介して連結する。

ポリＩＣＬＣ混合シリンジ２（Ｍ２）を混合シリンジ１（Ｍ１）に移し、両方のシリンジ間で十分に混合する。泡が生成物に形成される可能性がある。シリンジをタップすると、気泡を収集しやすくなり得る。得られる混合物が、個別化ワクチンである。

Claims (47)

1. 対象の腫瘍から、対象特異的免疫原性組成物のための、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択する方法であって、
   ａ）前記腫瘍から配列データを得ることであって、前記配列データを使用して、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列を表すデータを得る、前記得ることと、
   ｂ）前記対象の前記ポリペプチド配列（複数可）及びＭＨＣ分子（複数可）を機械学習プラットフォームに入力して、前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが前記対象において免疫応答を誘発する確率数値スコアを生成することと、
   ｃ）腫瘍における前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現を定量化して、前記対象において免疫応答を誘発するのに十分な量の前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを発現する１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを同定することと、
   ｄ）ステップｂ）及びｃ）に基づいて、前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを計算することと、
   ｅ）前記腫瘍特異的スコアに基づいて、対象特異的免疫原性組成物の処方のための、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択することと、を含む、前記方法。
2. がんの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
   ａ）腫瘍から配列データを得ることであって、前記配列データを使用して、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのポリペプチド配列を得る、前記得ることと、
   ｂ）前記対象の前記ポリペプチド配列（複数可）及びＭＨＣ分子（複数可）を機械学習プラットフォームに入力して、前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが前記対象において免疫応答を誘発する確率数値スコアを生成することと、
   ｃ）腫瘍における前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンのＲＮＡ発現を定量化して、前記対象において免疫応答を誘発するのに十分な量の前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを発現する１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを同定することと、
   ｄ）ステップｂ）及びｃ）に基づいて、前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを計算することと、
   ｅ）前記腫瘍特異的スコアに基づいて、１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを選択して、前記対象に対する対象特異的免疫原性組成物を処方することと、
   ｆ）１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、対象特異的免疫原性組成物を形成することと、
   ｇ）前記免疫原性組成物を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
3. ステップｄ）の前に、前記腫瘍の腫瘍クローンを配列決定して、前記腫瘍の十分な割合を表す１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを同定することをさらに含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアが、ステップｂ）、ｃ）、及び前記腫瘍クローンの配列決定に基づいて計算される、請求項３に記載の方法。
5. ステップｂの１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする前記ポリペプチド配列が、短いポリペプチド由来である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記短いポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される、請求項５に記載の方法。
7. ステップｂの１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンをコードする前記ポリペプチド配列が、長いポリペプチド由来である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記対象における前記免疫応答が、前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを腫瘍細胞表面に提示することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記対象における前記免疫応答が、前記腫瘍細胞上の１つまたは複数のＭＨＣ分子により前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを提示することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記対象における前記免疫応答が、ＣＤ４＋媒介応答である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記対象における前記免疫応答が、ＣＤ８＋媒介応答である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記対象における前記免疫応答が、ＣＤ４＋媒介応答またはＣＤ８＋媒介応答のいずれかである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記対象における前記免疫応答が、抗原提示細胞によってＴ細胞に提示することができる１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
14. より低い確率数値スコアと比較してより高い確率数値スコアを有する腫瘍特異的ネオアンチゲンは、前記腫瘍特異的ネオアンチゲンが前記対象においてより大きな免疫応答を誘発することを示す、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記ＲＮＡ発現が、ｍＲＮＡ発現である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、前記腫瘍の少なくとも約１％に相当する、請求項３～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、前記腫瘍の少なくとも約５％に相当する、請求項３～１６のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記配列データが、ヌクレオチド配列データである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記配列データが、ポリペプチド配列データである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記配列データが、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムヌクレオチド配列データである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
22. 少なくとも約１０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、前記対象特異的免疫原性組成物を処方するために選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
23. 少なくとも約２０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、前記対象特異的免疫原性組成物を処方するために選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記免疫原性組成物が、少なくとも約１０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、請求項２～２１のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記免疫原性組成物が、少なくとも約２０個の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、請求項２～２１のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記免疫原性組成物が、短いポリペプチドによってコードされる１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、請求項２～２１のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記免疫原性組成物が、長いポリペプチドによってコードされる１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、請求項２～２１のいずれか１項に記載の方法。
28. 腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のステップを実施することを含み、さらに、前記腫瘍特異的ネオアンチゲンのうちの選択された１つまたは複数を含む免疫原性組成物を処方することと、前記免疫原性組成物を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
29. 前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンの、正常組織に対する自己免疫応答を誘導する能力を測定することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
30. 正常組織に対する自己免疫応答を誘導する前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、前記免疫原性組成物のために選択されない、請求項２９に記載の方法。
31. 正常組織に対する自己免疫応答を誘導する前記１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンが、自己免疫応答を誘導しない腫瘍特異的ネオアンチゲンと比較して、より低い腫瘍特異的ネオアンチゲンスコアを有する、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 前記腫瘍が、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、膀胱癌、または肺癌に由来する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記腫瘍が、黒色腫、乳癌、肺癌、及び膀胱癌からなる群から選択されるがんに由来する、請求項３２に記載の方法。
34. 前記腫瘍が、黒色腫である、請求項３２または３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記腫瘍が、乳癌腫瘍である、請求項３２または３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記腫瘍が、肺癌腫瘍である、請求項３２または３３のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記がんが、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、膀胱癌、または肺癌である、請求項２～３１のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記がんが、黒色腫、乳癌、肺癌、及び膀胱癌からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記がんが、黒色腫である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記がんが、乳癌である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記がんが、肺癌である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
42. 免疫原性組成物を製造する方法であって、請求項１に記載のステップを実施することを含み、さらに、前記選択された１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物を処方することを含む、前記方法。
43. 請求項１、３～２７、及び２９～４１のいずれか１項に記載の方法を実施することによって選択される１つまたは複数の腫瘍特異的ネオアンチゲンを含む、免疫原性組成物。
44. 前記免疫原性組成物が、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、ベクター、樹状細胞、または合成された長いペプチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
45. アジュバントをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
46. 前記配列データが、全エクソーム配列データ、ＲＮＡ配列データ、全ゲノム配列データ、またはそれらの組み合わせである、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記配列データが、全エクソーム配列データと、ＲＮＡ配列データと、全ゲノム配列データとの組み合わせである、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

Images