CN111019959B

CN111019959B - 一种体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用

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Publication number: CN111019959B
Application number: CN201911403544.1A
Authority: CN
Inventors: 陈立; 贾明明; 黎小珠; 俞洋洋
Original assignee: Beijing Likang Life Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Likang Life Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111019959A

Abstract

本发明提供一种体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的所述核苷酸分子至少具有SEQ ID NO.3所示的核酸序列；至少转录具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或/和具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的mRNA；所述呈递细胞是负载有体外转录mRNA的核苷酸分子的树突状细胞，所述体外转录mRNA的核苷酸分子可以用于制备mRNA筛选或/和评估模型，或直接用于筛选或/和评估抗原表位或mRNA，本发明提供的体外转录mRNA的核苷酸分子表达的mRNA稳定度更高，持续表达时间增长，成本低，普适性广，解决了目前的肿瘤抗原疫苗只能对单一的抗原进行呈递的技术问题。

Description

一种体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白异常表达疾病抗原及应用。

背景技术

随着生物医学研究的进步，越来越多的与蛋白异常表达相关的疾病被发现。其中肿瘤蛋白质异常产生的抗原主要有肿瘤相关抗原(Tumor associated Antigen，TAA)和肿瘤新抗原(Neo-antigen)。目前抗体均通过结合位于细胞表面或细胞外的靶蛋白来实现其治疗作用。然而细胞外靶蛋白的数量非常有限，受此限制，市场已有抗体药物识别的目标蛋白高度集中，这一方面大大限制了抗体药物的适应症范围，很多疾病缺乏合适的抗体类药物；另一方面，有限的标靶也导致制药公司的研发工作高度同质化，造成行业内的过度竞争和社会资源的浪费；此外，受限于常规研究方案的通量，往往只能单次测试一种目标蛋白，增加了研发成本和研发时间。因此，一种能够方便、高效、安全、特异性、并双方向(包括活化和抑制)地调控机体免疫系统识别细胞内蛋白的方法，将开启生物制药产业发展的新阶段。

以用质粒为代表的DNA或者病毒为媒介，在细胞内表达功能蛋白是基因治疗的常用手段，该方法虽然具有较高的转染和表达效率，但却无法避免DNA与靶细胞的基因组发生重组，而导致其他疾病的风险。举例而言，外源DNA可能被插入某个正常的基因内部，从而导致突变甚至完全破坏该基因的表达，如果这个被插入的基因是比较重要的功能基因，这种改变将对细胞功能造成重大破坏，甚至导致细胞转化产生癌症。基于DNA的质粒或病毒为工具，在理论上无法避免相关的致癌风险，这也是基因治疗方法未能充分推广的重要原因。相比而言，RNA进入细胞后，无法反转录成DNA,因此在理论上不会对细胞基因组的稳定性造成破坏，可以说，RNA疗法从根本上规避了基因疗法的致癌风险，更适合临床用药的安全需求。此外，DNA需要进入细胞核才能被转录和表达，转染难度较大，且在一定程度上需要细胞处于活跃的分裂周期才能进入细胞核；而RNA只要进入细胞质内就可以表达，不需进细胞核转录，也不依赖细胞周期，同样的转染条件下RNA比DNA在胞内表达的效率更高，在临床应用的难度更小。

尤其是mRNA由于其低免疫原性、易于生产的优势，在基因治疗中具有巨大的治疗潜力，而目前通常用于肿瘤治疗领域，且均根据肿瘤相关抗原(Tumor associatedantigen,TAA)和肿瘤新抗原(Neo-antigen)进行设计，鉴于肿瘤异质性的存在，现有技术单次可设计的抗原数量较少，结构较为简单，mRNA稳定性和抗原呈递能力较差，且受限于蛋白选择，需要使用特定的肿瘤患者进行试验，大大增加了研发的成本及风险周期。

例如中国专利文献CN107793484A公开了一种重组肿瘤抗原及其制备方法和编码核酸及其应用，其重组抗原包含了经过密码子优化后的人GP96基因的信号肽，人AKR1B10基因的编码序列，人LAMP1基因信号序列，以及A64的ployA结构区域。该发明将经过优化后的AKR1B10重组抗原mRNA转染到未成熟的DC细胞中，经细胞因子诱导成熟后，得到成熟的树突细胞肿瘤疫苗DC-AKR1B10。以该肿瘤疫苗刺激机体，能够产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可引起有效的抗肿瘤免疫反应。但是该方法获得单一的肿瘤抗原，需要AKR1B10蛋白高表达患者作为试验样本，试验对象的选择范围窄；由于使用全长蛋白，因此获得的疫苗无法判断是由哪一部分表位呈递激活，且mRNA的稳定性较差。

综上所述，现有技术利用TAA进行肿瘤抗原mRNA设计不能满足目前蛋白表达异常导致的疾病的治疗需求，而且现有mRNA制备样品无法产生稳定、持续的抗原呈递能力。因此，亟需开发一种能够提高肿瘤抗原通量、提升mRNA的稳定、持续表达抗原的设计方案，实现对于肿瘤患者，乃至其他感染性疾病、蛋白表达异常的患者的抗原疫苗的设计及应用，促进肿瘤疫苗及其他蛋白表达异常疫苗新型治疗手段的研发及临床试验。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种能够获得更高通量、更高稳定性的mRNA的体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用，为促进肿瘤疫苗及其他蛋白表达异常疫苗的筛选及药效评估提供一个快速、经济渠道，促进新型治疗手段的研发及临床试验。

为实现本发明的技术目的，本发明一方面提供一种体外转录mRNA的核苷酸分子，所述核苷酸分子至少具有SEQ ID NO.3所示的核酸序列；和

至少转录：

具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或/和

具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

特别是，所述体外转录mRNA的核苷酸分子至少具有：

信号肽元件、转运信号元件和串联表位的表达元件；和

至少2个3’-非翻译区元件(3’UTR元件)。

特别是，所述信号肽元件包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自人MHC I的N端信号肽或人MHC I的N端信号肽的变体。

特别是，所述I类MHC转运信号元件包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自人I类MHC转运信号序列或人I类MHC转运信号序列的变体。

其中，所述串联表位的表达元件表位单元包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列为已知或未知的至少一个抗原表位。

其中，所述抗原表位可以为任何来源的抗原表位，例如来源于自身免疫疾病的抗原表位、来源于肿瘤的抗原表位、来源于感染性疾病的抗原表位等。

特别是，所述抗原表位是串联T细胞表位。

特别是，所述抗原表位中每个表位的长度为8～30氨基酸，数量可以是1～50个。

特别是，所述3’-非翻译区元件包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自人β-globin基因或人β-globin基因的变体。

本发明所使用的人MHC I即MHC Class I(major histocompatibility complexClass I，I型主要组织相容性复合体)，是抗原呈递过程中的关键分子，异常蛋白在细胞内降解为多肽后通过与MHC-I的结合呈递至抗原呈递细胞的细胞表面上，进而与CD8+T细胞表面TCR结合并使之激活，使CD8+T细胞释放穿孔素、颗粒酶等裂解含有相对应抗原的靶细胞，并产生记忆T细胞(Central Memory T cell,T_cm Cell)，产生具有长期记忆性的T细胞，维持机体稳定。本发明在mRNA上增加信号肽和I类MHC转运信号序列可增加mRNA所表达蛋白在经树突状细胞(Dendritic Cell,以下简称DC)呈递时增加其呈递效果。

本发明所用的3‘UTR对于mRNA的转运、翻译效率、亚细胞定位、mRNA稳定性息息相关，因此本发明使用了组织中稳定高表达的基因作为3’UTR选择范围。人β-globin的3’UTR为人β-globin的Untranslated Regions，及人β-globin的非翻译区，是信使RNA(mRNA)分子两端的非编码片段，3’UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的末端，本发明利用β-globin的3’UTR增强mRNA的稳定。

尤其是，所述串联表位的表达元件中的每个表位通过Arg-Glu-Lys-Arg位点实现拼接。

其中，所述信号肽元件、I类MHC转运信号元件、串联表位的表达元件以及至少2个3’-非翻译区元件的核苷酸序列是野生型人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列和CEF串联表位的核酸序列经过密码子优化处理获得。

当然，为了获得具有更佳的表达效果的体外转录mRNA的核苷酸分子，本领域技术人员还可以采用其他处理方式对野生型人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列、CEF串联表位进行处理，本发明不作限制。

其中，所述密码子优化处理可以采用本技术领域的常规方法，在本发明的一个实施例中，所述密码子优化处理包括：

将人MHC class I的N端信号肽或其变体、人I类MHC转运信号序列或其变体，CEF表位或其变体编码序列中的GC含量优化到50％～65％之间；

将在人源细胞中表达频率较低的密码子更改为人源细胞中使用频率较高的密码子；

去除人MHC class I的N端信号肽或其变体、人I类MHC转运信号序列或其变体，CEF表位或其变体中可能进行二级结构的核酸序列；

避免人MHC class I的N端信号肽和I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区序列中容易产生后续需要酶切的相同序列。

需要说明的是，上述密码子优化步骤可以根据本领域常规方法进行先后顺序的调整，本发明不作限制。

其中，采用本发明的密码子优化后，所述人MHC I的N端信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

其中，采用本发明的密码子优化后，所述人I类MHC转运信号序列具有如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。

其中，采用本发明的密码子优化后，所述CEF表位具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

需要说明的是，在本技术领域中，密码子优化的规则和方式有多种，本领域技术人员可以采用任意一种方式对本发明提供的编码区和非编码区序列进行优化，优化后的序列可以与本发明相同，也可以和本发明不同，本发明不做限制，只要优化后的序列能够转录翻译如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或/和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的mRNA，均属于本发明的保护范围之内。

作为示例性的，在本发明的一个实施例中，使用了CEF串联表位作为本发明的串联表位表达元件，因此，本发明获得的一个体外转录mRNA的核苷酸分子能还能够表达如SEQID NO.4所示的氨基酸序列的mRNA。

需要说明的是，本发明通过将上述人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列，CEF表位、人β-globin的3’UTR重复2次的编码序列形成能够在体外转录mRNA的核苷酸分子，打破了本技术领域只能获得单一且需全长蛋白的肿瘤抗原构建的疫苗，对医疗技术领域具有重大贡献。

其中，所述人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列，CEF表位、人β-globin的3’UTR重复2次的编码序列可以通过分子克隆的方式形成本发明的体外转录mRNA的核苷酸分子。

其中，通过分子克隆使所述人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列，CEF表位、人β-globin的3’UTR重复2次的编码序列形成本发明的体外转录mRNA的核苷酸分子的步骤包括：

将MHC I的N端信号肽和I类MHC转运信号序列、CEF表位、人β-globin的3’UTR同源重组后，克隆至pSP73载体上，形成重组载体pSP73-CEF；

线性化重组载体pSP73-CEF后，以线性化重组载体pSP73-CEF为模板进行体外转录，获得抗原mRNA。

其中，所述线性化重组载体pSP73-CEF包括：

使用Phi29酶对重组载体进行pSP73-CEF滚环扩增，得到扩增产物；

利用SpeI-HF限制性内切酶对扩增得到的产物进行酶切处理，得到酶切产物；

回收纯化酶切产物，得到线性化后的重组质粒。

其中，所述回收酶切产物包括：

将酶切产物使用2倍体积的乙醇，混匀后置于-20℃沉淀30分钟，然后在12000rpm，4℃条件下离心处理15min，沉淀DNA，弃去上清后使用1mL 70％乙醇洗涤一次，回收得到含有酶切产物的混合物。

其中，所述纯化酶切产物包括：

向回收得到含有酶切产物的混合物中加入20μL无DNA酶、RNA酶的纯净水进行重悬，使用紫外分光光度计进行核酸浓度测定，将DNA重悬至1μg/μL，获得线性化后的重组质粒。

为实现本发明的技术目的，本发明再提供一种抗原表位的mRNA筛选或/和评估模型，其具有上述体外转录mRNA的核苷酸分子，所述核苷酸分子的串联表位的表达元件为待筛选或/和评估的抗原表位。

其中，所述抗原表位的数量可以是1-50个。

其中，所述每个抗原表位的长度为8～30氨基酸。

特别是，本发明提供的抗原表位的筛选或/和评估模型还可以用于mRNA疫苗的筛选。本领域技术人员可以截取蛋白抗原的某一个或两个以上的抗原表位作为本发明提供的核苷酸分子的串联表位的表达元件，然后采用生物学方法对mRNA进行表达检测，根据是否能够表达的结果，判断截取的抗原表位是否为目的表位。

为实现本发明的技术目的，本发明还提供一种呈递细胞，其是负载上述体外转录mRNA的核苷酸分子的树突状细胞。

特别是，所述呈递细胞能够从其内部稳定的表达mRNA，进而表达、加工、修饰和呈递mRNA转录翻译形成的多肽或蛋白，最终形成细胞表面抗原。

其中，所述负载方法采用常规的分子克隆的方法。

为实现本发明的技术目的，本发明还提供一种蛋白异常表达相关疾病的mRNA筛选或/和评估的方法，该方法通过应用上述体外转录mRNA的核苷酸分子或上述模型或上述呈递细胞实现。

具体的，所述方法包括：

构建串联表位的表达元件为待筛选或/和评估的抗原表位的；

通过酶切和T7体外转录，获得待筛选/评估的mRNA样本；

将待筛选/评估的mRNA样本经抗原呈递细胞负载呈递后，与CD8+T细胞在体外接触，从而激活所述CD8+T；

应用ELISPOT方法检测CD8+T细胞分泌IFN-γ功能能否引起免疫反应作为筛选/评价mRNA样本的结果。

其中，如果CD8+T细胞分泌IFN-γ功能能引起免疫反应，则评价抗原表位肽段获得的mRNA可以作为疫苗，反正则不能。

其中，所述蛋白异常表达疾病自身免疫缺陷、肿瘤、癌或其相关疾病。

其中，所述肿瘤是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、新生物或恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤、癌(carcinoma)和肉瘤。本发明可用于筛选和评估的肿瘤如包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性，ER阳性，ER阴性，化疗抗性，赫赛汀抗性，HER2阳性，多柔比星抗性，他莫昔芬抗性，导管癌，小叶癌，原发癌，转移癌)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(如肝细胞癌)、肺癌(如非小细胞肺癌，鳞状细胞肺癌，腺癌，大细胞肺癌，小细胞肺癌，类癌，肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部，颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。其它实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或成神经管细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、胰腺内分泌或外分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓样癌瘤、黑色素瘤、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、佩吉特乳头病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星形细胞癌、肝星形细胞癌或前列腺癌。

有益效果

1、本发明利用mRNA上的CEF表位实现了多种类抗原的同时呈递，解决了现有技术只能对一种抗原进行呈递的技术问题。

2、本发明通过增加人β-globin的3’UTR序列，mRNA上的抗原稳定度更高，持续表达时间增长；

3、本发明相对于现有技术如TAA肿瘤抗原疫苗而言，单次设计可引起更多种类的抗原免疫应答，更加经济，普适性广。

附图说明

图1为本发明流式细胞仪检测DC细胞转染的效率图；

图2为本发明荧光定量PCR检测含有重组CEF表位的抗原经转染DC后细胞负载情况图；

图3为本发明含有重组CEF表位的抗原经转染DC后，抗原提呈后对于特异性T细胞分泌INF-γ的影响。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1体外转录mRNA的核苷酸分子的获得

1、密码子优化

利用密码子优化软件和网站对野生型人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列的编码区，CEF表位的编码区编码区进行密码子优化，获得MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列的核苷酸序列、CEF表位。

需要说明的是，在本发明的一个实施例中，CEF表位仅为示例性的表位，本领域技术人员可以采用其他具有串联淋巴细胞的表位作为核苷酸分析的串联表位元件替代本实施例中的CEF表位。

本发明所用的CEF表位为Cytomegalovirus,Epstein-Barr Virus and InfluenzaVirus Control Peptide阳性表位，每个表位长度为8-12个氨基酸，来源于巨细胞病毒、EB病毒或流感病毒。由于其在人群中的感染频率较高，因此正常志愿者亦有较高概率针对于CEF产生特异性应答。本发明利用CEF中12个已被验证的表位，可以应用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌IFN-γ功能来作为检测和评价能否引起免疫反应的方法，进而实现高通量的蛋白异常表达相关疾病的疫苗筛选和评估。

其中，由于本发明所用的CEF表位具有十二个，为了使多个表位能够作为一个整体的串联表位表达元件，本发明在不同表位直接使用了弗林蛋白酶(furin)识别位点Arg-Glu-Lys-Arg，不仅实现了多个表位的串联，而且还能增加各个表位的切割效率，提升各个抗原被各自呈递的效果。

需要说明的是，所述码子优化软件和网站可以是本领域技术人员常用的，例如DNAWorks(Hoover and Lubkowski 2002)、Codon Optimizer(Fuglsang 2003)、.UpGene(Gao,Rzewski et al.2004)、Synthetic Gene Designer等。

具体的，在本发明的一个实施例中，密码子优化标准为：将野生型人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区的GC含量优化到50％～65％之间；将在人源细胞中表达频率较低的密码子更改为人源细胞中使用频率较高的密码子；去除人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区中可能进行二级结构的核酸序列进行优化；避免人MHC class I的N端信号肽和I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区序列中容易产生后续需要酶切的相同序列。

具体的，优化后的人MHC class I的N端信号肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；优化后的人I类MHC转运信号序列编码区具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；优化后的CEF表位编码区具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

需要指出的是，上述优化后的核苷酸序列仅为本发明示例性的，本领域技术人员还可以根据本领域的其他密码子优化方法或生物学方法对野生型的上述元件进行处理，只要最终获得的体外转录mRNA的核苷酸分子具有上述元件结构和/或上述元件源于人MHCclass I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列的编码区，CEF表位的编码区均属于本发明的保护范围。

2分子克隆

2.1构建重组质粒，形成重组载体

将经过密码子优化后的人MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列，CEF表位、人β-globin的3’UTR，经同源重组后，克隆至pSP73载体上，形成重组载体pSP73-CEF。

具体的，所述同源重组的步骤和克隆方法均按照本领域常规步骤进行，所用试剂均从市售获得。

2.2、线性化重组载体pSP73-CEF

为了使后续获得目的长度的mRNA，将形成的重组载体pSP73-CEF进行线性化处理，具体为：

a)扩增重组载体pSP73-CEF

使用Phi29酶对重组载体进行pSP73-CEF进行常规的滚环扩增，得到扩增产物。

b)酶切处理

利用SpeI-HF限制性内切酶对扩增得到的产物进行酶切处理，酶切步骤按照按SpeI-HF限制性内切酶说明书进行，即将产物与SpeI-HF混匀后置于37℃酶切2h，得到酶切产物。

c)酶切产物的回收和纯化

将酶切产物使用2倍体积的乙醇，混匀后置于-20℃沉淀30分钟，然后在12000rpm，4℃条件下离心处理15min，沉淀DNA，弃去上清后使用1mL 70％乙醇洗涤一次。

洗涤后加入20μL无DNA酶、RNA酶的纯净水进行重悬，使用紫外分光光度计进行核酸浓度测定，将DNA重悬至1μg/μL，获得线性化后的重组质粒。

d)核苷酸分子的获得

将得到的线性化重组质粒为模板进行体外转录(以20μL反应体系为例)：2xNTP(含ARCA)，10μL；质粒模板(1μg/μL)，1μL；无DNA酶、RNA酶的纯净水，5μL；T7体外转录酶，2μL；10x Buffer，2μL。混匀后置于37℃反应2小时。

然后加入30μLLiCl，混匀后置于-20℃沉淀核酸，然后在12000rpm，4℃条件下离心15min，沉淀核酸，弃去上清后使用1mL 70％乙醇洗涤一次。

最后向洗涤后的核酸中加入20μL无DNA酶、RNA酶的纯净水进行重悬，使用紫外分光光度计进行核酸浓度测定，并重悬至1μg/μL，得到体外转录mRNA的核苷酸分子，其具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

将检测，本实施例获得的具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的核苷酸分子能够转录表达如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列、以及如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

需要说明的是，本发明的一个实施例获得的具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列为体外转录mRNA的核苷酸分子的其中一种，仅为示例性的，本领域技术人员根据生物学方法还可以获得其他编码序列的核苷酸分子，只要该分子具有如SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列，和/或能够表达如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或/和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的mRNA，均属于本发明的保护范围之内。

实施例2抗原呈递细胞

1.DC的体外诱导培养

1.1高纯度单核细胞的分离

为了获得更高纯度的单核细胞，首先采用单核细胞采集机分离纯化健康志愿者外周血中的单核细胞，然后在超净台中使用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，最后通过阴选试剂盒纯化单核细胞，得到高纯度的单核细胞。

1.2DC的培养

将单核细胞加入ImmunoCult^TM分化培养基中(ImmunoCult^TM培养基中加入ImmunoCult^TMDC Differentiation Medium)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养6天，每3天进行半数换液。

在第6天进行DC的成熟培养，更换为ImmunoCult^TM成熟培养基中(ImmunoCult^TM培养基中加入ImmunoCult^TMDC Maturation Medium)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2天，得到体外诱导的成熟DC。

2、CEF抗原的负载

将成熟的DC收集至15mL离心管中，使用PBS将细胞密度调整到1*10^7iDC/mL，得到DC细胞悬液。吸取100μL细胞悬液和7.5μg体外转录的重组CEF mRNA混匀，将细胞-mRNA混合物置于Bio-rad 2mm电转杯中进行电击，电击后将细胞转移至6孔板中继续培养，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养16h，得到负载有抗原mRNA的DC。

对照例1

采用实施例2中同样的条件转染GFP mRNA至成熟DC(Mature Dendritic Cell,DC)中，作为转染效率对照组。

试验例1 DC的转染效率及表型测定

转染GFP mRNA 16h后，收集DC，使用流式细胞分析术分析DC的转染效率，分析结果如图1所示，图中FSC表示流式前向光，SSC表示流式侧向光，FITC-GFP GFP表示蛋白表达量，根据图1所示的结果可知，负载有抗原mRNA的DC细胞中能成功产生GFP蛋白，而且DC细胞转染后的GFP转染效率大于70％。转染CEF mRNA16h后，经qPCR检测，CEF mRNA表达量相比于对照组增加3个数量级以上，可见，将本发明提供的mRNA负载到DC后，可以检测到高浓度的CEFmRNA。

试验例3 DC的抗原呈递功能验证

将负载有抗原mRNA的DC进行收集，在96孔板中将负载有抗原mRNA的DC和对应志愿者的T细胞共培养，按1：10的比例进行铺板，经过24h共培养后检测板底IFN-γ的分泌量。如图3所示，图中，Mock DC组表示DC未经负载CEF表位，DC表面的抗原不能激活该志愿者的T细胞，只能产生较弱的IFN-γ；DC pulse CEF Epitope表示该志愿者的T细胞能够识别DC经电转负载本发明提供的抗原mRNA产生的表位，并且产生较强的IFN-γ；DC pulse CEF未使用优化结构组为加入CEF表位，但缺少本专利声明的优化结构，该组能产生较弱的IFN-γ，Tcell组表示该志愿者的T细胞本底反应，在未接触到DC呈递的表位时，T细胞不产生IFN-γ。根据图3所示的结果可知，本发明提供的负载抗原mRNA(即负载CEF表位)的DC细胞可以引起T细胞活化并分泌IFN-γ，可以作为抗原疫苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京立康生命科技有限公司

<120> 一种体外转录mRNA疫苗的核苷酸分子、呈递细胞及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人MHC Class N端信号肽(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Val Met Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala

20

<210> 2

<211> 55

<212> PRT

<213> 人转运序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile

1 5 10 15

Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly

20 25 30

Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp Ser Ala Gln Gly

35 40 45

Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala

50 55

<210> 3

<211> 272

<212> DNA

<213> beta-Globin 3‘UTR 2次重复序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta 60

ctaaactggg ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat 120

ttattttcat tgctgcagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt 180

tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct 240

gcctaataaa aaacatttat tttcattgct gc 272

<210> 4

<211> 269

<212> PRT

<213> CEF表位串联区(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Arg Glu Lys Arg Thr Pro

1 5 10 15

Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Arg Glu Lys Arg Glu Leu Arg Ser

20 25 30

Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Glu Lys Arg Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp

35 40 45

Ala Ile Arg Glu Lys Arg Asp Tyr Cys Asn Val Leu Asn Lys Glu Phe

50 55 60

Arg Glu Lys Arg Asp Tyr Cys Asn Val Leu Asn Lys Glu Phe Arg Glu

65 70 75 80

Lys Arg Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Arg Glu Lys Arg Val

85 90 95

Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Arg Glu Lys Arg Gly Ile Leu Gly

100 105 110

Phe Val Phe Thr Leu Arg Glu Lys Arg Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe

115 120 125

Thr Leu Arg Glu Lys Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Arg

130 135 140

Glu Lys Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Arg Glu Lys Arg

145 150 155 160

Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Arg Glu Lys Arg Arg Val Arg

165 170 175

Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Arg Glu Lys Arg Ile Leu Arg Gly Ser Val

180 185 190

Ala His Lys Arg Glu Lys Arg Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys

195 200 205

Arg Glu Lys Arg Phe Met Tyr Ser Asp Phe His Phe Ile Arg Glu Lys

210 215 220

Arg Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Arg Glu Lys Arg Ser Asp

225 230 235 240

Glu Glu Glu Ala Ile Val Ala Tyr Thr Leu Arg Glu Lys Arg Leu Ala

245 250 255

Thr Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Arg Glu Lys Arg Lys

260 265

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人MHC Class I N端信号肽(Artificial Sequence)

<400> 5

atgctggtca tggcgccccg aaccgtcctc ctgctgctct cggcggccct ggccctgacc 60

gagacctggg cc 72

<210> 6

<211> 165

<212> DNA

<213> 人I类MHC转运信号序列编码区(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgtgggca ttgttgctgg cctggctgtc ctagcagttg tggtcatcgg agctgtggtc 60

gctgctgtga tgtgtaggag gaagagttca ggtggaaaag gagggagcta ctctcaggct 120

gcgtgcagcg acagtgccca gggctctgat gtgtctctca cagct 165

<210> 7

<211> 807

<212> DNA

<213> CEF表位串联区(Artificial Sequence)

<400> 7

acccccaggg tgaccggggg gggcgccatg agagagaagc ggacccctag ggtgacaggc 60

ggcggcgcca tgagggaaaa gagggagctg aggagcagat actgggccat tcgggagaag 120

cgcgagctgc ggagcaggta ctgggctatt cgggagaagc gggactactg caacgtgctg 180

aacaaggagt tcagggagaa gcgggactac tgcaacgtgc tgaacaagga gttcagggag 240

aagcgcgtga gcgatggggg cccaaacctg taccgggaga aacgggtgtc cgacgggggc 300

cccaacctgt acagggaaaa gcgggggatc ctggggttcg tgtttacact gagagagaag 360

cgcggcattc tggggttcgt cttcacactg cgggagaagc ggagccggta ctgggccatc 420

cggacacgga gagagaagcg gtcccggtac tgggccatcc ggaccaggcg ggagaagcgc 480

cgggtgaggg cctacaccta cagcaagcgc gagaagcgga gggtgcgggc ctacacatac 540

tccaagcggg agaagcgcat cctgaggggc agcgtcgccc acaagaggga gaagcggatc 600

ctgcggggga gcgtggccca caagcgtgag aagcgcttca tgtacagcga tttccacttc 660

attagggaga agcgctccat cattcccagc ggccccctga agcgcgagaa gcgatccgat 720

gaggaggagg ccatcgtggc ctacacactc cgggagaagc gactggccac aatcttcttc 780

gcccagttcg tgcgcgagaa gcgaaag 807

<210> 8

<211> 1397

<212> DNA

<213> 体外转录mRNA的核苷酸分子(Artificial Sequence)

<400> 8

atgctggtca tggcgccccg aaccgtcctc ctgctgctct cggcggccct ggccctgacc 60

gagacctggg ccacccccag ggtgaccggg gggggcgcca tgagagagaa gcggacccct 120

agggtgacag gcggcggcgc catgagggaa aagagggagc tgaggagcag atactgggcc 180

attcgggaga agcgcgagct gcggagcagg tactgggcta ttcgggagaa gcgggactac 240

tgcaacgtgc tgaacaagga gttcagggag aagcgggact actgcaacgt gctgaacaag 300

gagttcaggg agaagcgcgt gagcgatggg ggcccaaacc tgtaccggga gaaacgggtg 360

tccgacgggg gccccaacct gtacagggaa aagcggggga tcctggggtt cgtgtttaca 420

ctgagagaga agcgcggcat tctggggttc gtcttcacac tgcgggagaa gcggagccgg 480

tactgggcca tccggacacg gagagagaag cggtcccggt actgggccat ccggaccagg 540

cgggagaagc gccgggtgag ggcctacacc tacagcaagc gcgagaagcg gagggtgcgg 600

gcctacacat actccaagcg ggagaagcgc atcctgaggg gcagcgtcgc ccacaagagg 660

gagaagcgga tcctgcgggg gagcgtggcc cacaagcgtg agaagcgctt catgtacagc 720

gatttccact tcattaggga gaagcgctcc atcattccca gcggccccct gaagcgcgag 780

aagcgatccg atgaggagga ggccatcgtg gcctacacac tccgggagaa gcgactggcc 840

acaatcttct tcgcccagtt cgtgcgcgag aagcgaaagc ttatcgtggg cattgttgct 900

ggcctggctg tcctagcagt tgtggtcatc ggagctgtgg tcgctgctgt gatgtgtagg 960

aggaagagtt caggtggaaa aggagggagc tactctcagg ctgcgtgcag cgacagtgcc 1020

cagggctctg atgtgtctct cacagcttag tcgacagctc gctttcttgc tgtccaattt 1080

ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg 1140

ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgctg cagctcgctt 1200

tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct aagtccaact actaaactgg 1260

gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta ataaaaaaca tttattttca 1320

ttgctgctta attaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaa 1397

Claims

1.一种体外转录mRNA的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子为SEQ ID NO.3所示的核酸序列；和

至少转录并翻译：

SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或/和

SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的mRNA。

2.如权利要求1所述的体外转录mRNA的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子由：

信号肽元件、I类MHC转运信号元件和串联表位的表达元件；和

至少2个3’-非翻译区元件组成。

3.如权利要求2所述的体外转录mRNA的核苷酸分子，其特征在于：

所述信号肽元件由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自人MHC I的N端信号肽；

所述I类MHC转运信号元件转运编码区由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自人I类MHC转运信号序列；

所述3’-非翻译区元件由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自人β-globin基因；

所述串联表位的表达元件为已知或未知的至少一个抗原表位。

4.如权利要求2所述的体外转录mRNA的核苷酸分子，其特征在于，所述串联表位的表达元件中的每个表位通过Arg-Glu-Lys-Arg位点实现拼接。

5.一种呈递细胞，其特征在于，其是负载有权利要求1-4任一所述的体外转录mRNA的核苷酸分子的树突状细胞。

6.如权利要求5所述的呈递细胞，其特征在于，所述呈递细胞能够从其内部稳定的表达mRNA，进而表达、加工、修饰和呈递mRNA转录翻译形成的多肽或蛋白，最终形成细胞表面抗原。

7.一种抗原表位的筛选或/和评估模型，其特征在于，其具有权利要求1-4任一所述的体外转录mRNA的核苷酸分子，所述核苷酸分子的串联表位的表达元件为待筛选或/和评估的抗原表位，

其中，所述抗原表位的数量至少为1个，长度最小为8个氨基酸长度。