JP2019106994A - 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】標的への特異性と選択性を改善したタンパク質ベースの治療薬の提供。【解決手段】標的結合部分（ＴＢＭ）と、マスキング部分（ＭＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）とを含有する活性化可能な抗体等の結合ポリペプチド（ＡＢＰ）の提供。第１のＴＢＭと、第２のＴＢＭと、ＣＭとを含有する二重特異性ＡＢＰも提供する。ＡＢＰは、ＣＭを切断できる切断剤の存在下で、少なくとも１つのＴＢＭがＣＭの切断後よりも未切断のときに標的に到達しにくいような「活性化可能な」コンホメーションを呈する。候補ＡＢＰのライブラリとＡＢＰを同定するためのスクリーニング方法及び使用方法も提供する。ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ−４又はＶＣＡＭと結合するＴＢＭを有するＡＢＰであって、ＶＥＧＦと結合する第１のＴＢＭとＦＧＦと結合する第２のＴＢＭとを有するＡＢＰならびに、組成物及び使用方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９５７，４４９号明細書、２００７年８月２２日に出願された同第６０／９５７，４５３号明細書、２００８年５月１３日に出願された同第６１／０５２，９８６号明細書（各出願全体を、あらゆる目的で本明細書に援用する）の優先権の利益を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより認められた助成番号１ Ｕ５４ ＣＡ１１９３３５−０１にて連邦政府からの助成金を受けてなされたものである。よって、政府は本発明に対して一定の権利を留保する。
タンパク質医薬品が癌や貧血、好中球減少症などの多種多様な疾患に応用されることで、近代医療の状況が変化しつつある。しかしながら、他の医薬品と同様、特に結合される標的が明らかな第２世代のタンパク質医薬品の開発にあたって、標的への特異性と選択性を改善した医薬品に対する需要や要望に、大きな関心が持たれている。
小分子医薬品の領域では、活性な化学物質の「プロドラッグ」を提供する戦略が開発されている。このようなプロドラッグは、比較的不活性な（または有意に活性が低い）形態で投与される。投与後、プロドラッグはｉｎ ｖｉｖｏにて代謝されて活性な化合物になる。このようなプロドラッグ戦略は、意図した標的に向けた医薬品の選択性を高めることができるものである。その一例が、有害作用の低減が常に最も重要とされる、多くの抗癌療法に認められる。酸化還元活性化を利用した低酸素癌細胞の標的に用いられる医薬品では、医薬品を細胞毒性のある形態に変換して基本的にこれを活性化させるのに、低酸素細胞に存在するレダクターゼ酵素を大量に利用している。プロドラッグは活性化前の細胞毒性が低いため、非癌性細胞を損傷する危険性が大幅に減り、それによって当該医薬品に関連する副作用が低減される。
タンパク質ベースの治療法にプロドラッグの特徴を持たせるための戦略に向けた分野で需要がある。
本開示は、標的結合部分（ＴＢＭ）と、マスキング部分（ＭＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）と、を含む、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供するものである。ＡＢＰは、ＣＭを切断できる切断剤の存在下で、ＴＢＭがＣＭの切断後よりも未切断のときに標的に到達しにくいような「活性化可能な」コンホメーションを呈する。本開示はさらに、候補ＡＢＰのライブラリ、このようなＡＢＰを同定するためのスクリーニング方法、使用方法も提供するものである。本開示はさらに、ＶＥＧＦと結合するＴＢＭを有するＡＢＰならびに、組成物および使用方法を提供するものである。
このため、本開示は、標的結合部分（ＴＢＭ）と、標的に対するＴＢＭの結合を阻害でき、前記ＴＢＭの天然に生じる結合相手のアミノ酸配列を有さない、マスキング部分（ＭＭ）と、切断状態で標的が存在すればＴＢＭが標的と結合し、未切断状態で標的が存在すると標的に対するＴＢＭの結合がＭＭによって阻害されるような位置で、活性化可能な結合ポリペプチドにある切断可能部分（ＣＭ）と、を含む、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供するものである。
関連の実施形態では、ＭＭが、未切断状態で標的に対するＴＢＭの結合を阻害し、切断状態では標的に対するＴＢＭの結合を可能にする機能に基づいて、複数の候補ポリペプチドから選択される。他の関連の実施形態では、ＭＭが、ＡＢＰが未切断状態にあるときに、立体障害により標的に対するＴＢＭの結合を阻害する。他の関連の実施形態では、ＭＭがシステイン残基を含み、立体障害が、前記システイン残基とＴＢＭに隣接するかその内部の別のシステイン残基との間のジスルフィド結合リンケージによって達成される。別の実施形態では、ＴＢＭが細胞外ポリペプチドである。
他の関連の実施形態では、ＣＭが、ＡＢＰのＴＢＭとＭＭとの間に位置し、他の実施形態では、ＭＭ内に位置する。特定の実施形態では、ＣＭが、たとえばプラスミン基質、カスパーゼ基質またはマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９またはＭＭＰ−１４の基質など）といったプロテアーゼ基質を含む。他の実施形態では、ＣＭが、細胞内プロテアーゼの基質であるプロテアーゼ基質を含む。別の実施形態では、ＣＭが、システイン−システインジスルフィド結合を含む。
もうひとつの態様では、本開示は、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）のスクリーニング方法であって、候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチド（候補ＡＢＰ）と、候補ＡＢＰの標的結合部分と結合できる標的およびＡＢＰの切断可能部分（ＣＭ）を切断できる切断剤とを接触させ、前記標的と結合する前記複数のメンバの第１の個体群を切断剤の存在下でスクリーニングし、前記切断剤の非存在下で第１の個体群と標的とを接触させ、切断剤の非存在下で標的と結合するメンバの前記第１の個体群を除外することで、メンバの第２の個体群を前記第１の個体群からスクリーニングすることを含み、切断剤の存在下での標的結合と比較して、切断剤の非存在下で標的に対する結合が低下する候補ＡＢＰを選択できる、前記方法を提供するものである。
関連の実施形態では、切断剤がプロテアーゼまたは還元剤である。他の関連の実施形態では、標的が検出可能な標識を含む。他の実施形態では、第１の個体群が、検出可能な標識の検出によって選択される。他の実施形態では、第２の個体群が、第１の個体群から、検出可能に標識されたメンバを分離することで生成される。
他の関連の実施形態では、前記候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチドが各々、提示足場における複製可能な生命体の表面に存在する。
本開示はさらに、候補となる活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）のライブラリであって、複製可能な生命体の表面で提示される候補となる複数のＡＢＰを含む、ライブラリを提供するものである。関連の実施形態では、複製可能な生命体が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞である。
また、本開示は、ＡＢＰをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含む組成物も提供するものである。関連の実施形態では、核酸コンストラクトが、提示足場をコードする核酸をさらに含み、ＡＢＰをコードする核酸が、コンストラクトに作動的に挿入され、宿主細胞の表面の提示足場におけるＡＢＰ提示用の融合タンパク質を発現する。例示としての提示足場が円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）である。関連の実施形態では、ＡＢＰが、候補ＭＭを有する候補ＡＢＰである。
本開示はさらに、複製可能な生命体のゲノムに、候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）をコードする組換えＤＮＡコンストラクトの集合体を導入することを含む候補となる活性化可能な結合ポリペプチドのライブラリの作製方法であって、前記複数の各メンバが、標的結合部分（ＴＢＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）と、候補マスキング部分（ＭＭ）とを含み、前記導入することで、組換え複製可能な生命体が生成され、前記方法がさらに、候補ＡＢＰの発現および提示に適した条件下で前記組換え複製可能な生命体を培養することを含む、方法を提供するものである。
また、本開示は、治療有効量の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物も提供するものである。関連の実施形態では、ＡＢＰのＴＢＭが、ＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦを阻害できるものである。
また、本開示は、投与を必要とする被検体に、治療有効量のＡＢＰを投与することを含む、血管形成の阻害が必要な被検体における血管形成の阻害方法を提供するものであり、例示としてのＡＢＰには、（腫瘍部位などで）ＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦ活性を阻害するＴＢＭを有するものがある。
一実施形態では、ＡＢＰの標的が、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ４０Ｌのうちのいずれか１つであるＡＢＰが開示される。
また、本開示は、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、第２のＴＢＭと、切断可能部分（ＣＭ）とを含有する、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供するものである。ＡＢＰは、ＣＭを切断できる切断剤の存在下で、少なくとも１つのＴＢＭがＣＭの切断後よりも未切断のときに標的に到達しにくいように、「活性化可能な」コンホメーションを呈する。本開示はさらに、このようなコンフィギュレーションを有する候補ＡＢＰのライブラリ、当該ＡＢＰを同定するためのスクリーニング方法および使用方法を提供するものである。本開示はさらに、ＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦ活性を阻害するＴＢＭと、ＦＧＦと結合してＦＧＦ活性を阻害するＴＢＭとを有するＡＢＰならびに、組成物および使用方法を提供するものである。
このため、本開示は、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、第２のＴＢＭと、切断可能部分（ＣＭ）とを含む活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）であって、前記ＣＭが、切断状態で標的の存在下、第１および第２のＴＢＭが標的と結合し、未切断状態で、ＡＢＰが、第１のＴＢＭが第２のＴＢＭによって結合される標的に干渉するコンホメーションにあるように、活性化可能な結合ポリペプチドに存在する、活性化可能な結合ポリペプチドを提供するものである。
関連の実施形態では、未切断状態のＡＢＰが、第１および第２のＴＢＭが、第１および第２のＴＢＭに対する標的の結合に干渉するようなコンホメーションにある。他の関連の実施形態では、第１および第２のＴＢＭが、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦなどの異なる標的と結合できる。他の関連の実施形態では、第１のＴＢＭが、ＡＢＰが未切断状態にあるときに前記第１のＴＢＭが標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を阻害し、ＡＢＰが切断状態にあるときに標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を可能にする機能に基づいて、複数の候補ポリペプチドから選択される。もうひとつの実施形態では、第１のＴＢＭが、ＡＢＰが未切断状態にあるときに立体障害による前記第２のＴＢＭによって標的結合に干渉する。他の関連の実施形態では、ＡＢＰが、前記第１のＴＢＭ内またはその付近に第１のシステイン残基を、前記第２のＴＢＭ内またはその付近に第２のシステイン残基を含み、立体障害が、前記第１および第２のシステイン残基間のジスルフィド結合リンケージによって達成される。関連の実施形態では、前記第１のＴＢＭおよび前記第２のＴＢＭの標的が細胞外ポリペプチドである。他の実施形態では、ＣＭが、ＡＢＰの前記第１のＴＢＭと前記第２のＴＢＭとの間に局在するか、あるいは、ＣＭがシステイン−システイン対を含む場合、前記第１のＴＢＭ内または前記第２のＴＢＭ内のいずれかにＣＭを局在させることが可能である。他の関連の実施形態では、ＣＭが、たとえばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９またはＭＭＰ−１４の基質といったマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質などのプロテアーゼ基質を含む。他の関連の実施形態では、プロテアーゼ基質が、細胞内プロテアーゼの基質である。もうひとつの実施形態では、ＣＭがシステイン−システインジスルフィド結合を含む。
本開示はさらに、候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）であって、前記複数の各メンバが、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、第２のＴＢＭと、切断可能部分（ＣＭ）とを含む結合ポリペプチドと、前記第１のＴＢＭと結合できる標的およびＣＭを切断できる切断剤とを接触させ、前記標的と結合する前記複数のメンバの第１の個体群を切断剤の存在下で選択し、前記第１の個体群を切断剤の非存在下で前記標的と接触させ、切断剤の非存在下で前記標的に結合するメンバの前記第１の個体群を除外することで、前記第１の個体群からメンバの第２の個体群を選択することを含み、切断剤の存在下での前記標的に対する結合と比較して、切断剤の非存在下で前記標的に対する結合が低下する候補ＡＢＰを選択する、二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を選択するための方法を提供するものである。
関連の実施形態では、切断剤が、プロテアーゼまたはジスルフィド結合還元剤である。他の関連の実施形態では、第１の標的および第２の標的が各々、検出可能な標識を含む。他の関連の実施形態では、第１の個体群が、検出可能な標識の検出によって選択される。他の関連の実施形態では、第２の個体群が、第１の個体群から、検出可能に標識されたメンバを分離することで生成される。さらに他の実施形態では、候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチドが、提示足場において複製可能な生命体の表面に提示される。他の実施形態では、提示足場にて第２のＴＢＭのアミノ酸配列を提供し、第２のＴＢＭに対する標的の結合を検出することで、標的に対する第２のＴＢＭの結合を評価する。
本開示は、候補となる二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）のライブラリであって、複製可能な生命体の表面で提示される候補となる複数の二重標的結合ＡＢＰを含む、前記ライブラリも提供するものである。関連の実施形態では、複製可能な生命体が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞である。
また、本開示は、二重標的結合ＡＢＰをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含む組成物も提供するものである。関連の実施形態では、核酸コンストラクトが提示足場をコードする核酸をさらに含み、ＡＢＰをコードする核酸が、コンストラクトに作動的に挿入され、宿主細胞の表面の提示足場におけるＡＢＰ提示用の融合タンパク質を発現する。他の関連の実施形態では、提示足場が円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）である。
また、本開示は、候補となる二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含む組成物であって、前記候補となる活性化可能な結合ポリペプチドが、（ａ）第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）と、（ｃ）第２のＴＢＭとを含み、第１のＴＢＭ、ＣＭおよび第２のＴＢＭが、前記第１のＴＢＭが未切断状態で標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を阻害し、切断状態では標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を可能にする機能を判断することができるように配置される。
関連の実施形態では、核酸コンストラクトが、円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）をコードする核酸をさらに含む。
本開示は、候補となる二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチドのライブラリの作製方法であって、複製可能な生命体のゲノムに、候補となる複数の二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）をコードする組換えＤＮＡコンストラクトの集合体を導入することを含み、前記複数の各メンバが、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）と、第２のＴＢＭとを含み、前記導入することで、組換え複製可能な生命体が生成され、前記組換え複製可能な生命体を、候補となる二重標的結合ＡＢＰの発現および提示に適した条件下で培養することを含む、前記方法を提供するものである。
また、本開示は、治療有効量の二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）と薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物も提供するものである。関連の実施形態では、第１のＡＢＰのＴＢＭがＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦを阻害し、第２のＴＢＭが線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ２）と結合してＦＧＦ２を阻害する。
また、本開示は、投与を必要とする被検体に、二重標的結合ＡＢＰを含む医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、哺乳類の被検体で血管形成を阻害する方法も提供するものである。
一態様では、本開示は、標的を結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物であって、前記ＡＢＤが少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）とカップリングされ、前記ＭＭが標的に対するＡＢＤの特異的結合に干渉する組成物を提供するものである。一実施形態では、この組成物が切断可能部分（ＣＭ）をさらに含み、前記組成物が、ＣＭが未切断状態にあってＭＭが標的に対するＡＢＤの特異的結合に干渉する第１のコンフィギュレーションと、ＣＭが切断状態にあってＭＭが標的に対するＡＢＤの特異的結合に干渉しない第２のコンフィギュレーションの２つのコンフィギュレーションを含む。
もうひとつの態様では、本開示は、標的を結合できる少なくとも１つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、標的に対するＡＢＤの特異的結合に干渉できる前記ＡＢＤとカップリングされた少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）と、前記ＡＢＤにカップリングされた少なくとも１つの切断可能部分（ＣＭ）と、を含む、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）であって、未切断状態でＭＭが標的に対するＡＢＤの特異的結合に干渉し、切断状態ではＭＭが標的に対するＡＢＤの特異的結合に干渉しないように前記ＣＭがＡＢＰに配置される。特定の実施形態では、ＣＭがＡＢＤのＣ末端にカップリングされる。他の実施形態では、ＣＭがＡＢＤのＮ末端またはＡＢＤのＶＬまたはＶＨ鎖のＮ末端にカップリングされる。関連の実施形態では、ＭＭがＡＢＤのＣ末端にカップリングされる。他の関連の実施形態では、ＭＭがＡＢＤのＮ末端またはＡＢＤのＶＬまたはＶＨ鎖のＮ末端にカップリングされる。別の実施形態では、ＡＢＰがＭＭとＣＭとの間に配置されたリンカーペプチドも含む。関連の実施形態では、リンカーペプチドがＡＢＤとＣＭとの間に配置される。特定の実施形態では、ＡＢＤと、ＣＭと、ＭＭとを含むＡＢＰが、検出可能な部分をさらに含む。特定の実施形態では、検出可能な部分が診断作用剤である。
一実施形態では、ＡＢＤと、ＣＭと、ＭＭとを含むＡＢＰが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖまたはＳＣＡＢ由来のＡＢＤを含有する。特定の実施形態では、ＡＢＤの標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、α４β７インテグリンからなる群から選択される。別の実施形態では、ＡＢＤを含むＡＢＰが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、ＴＡＣＥからなる群から選択される酵素の基質であるＣＭをさらに含む。特定の実施形態では、ＣＭがＭＭＰ９の基質である。
もうひとつの態様では、本開示は、未切断状態でＭＭが標的と特異的に結合するためのＡＢＤに干渉し、切断状態ではＭＭが標的と特異的に結合するためのＡＢＤに干渉しないように、マスキング部分（ＭＭ）および切断可能部分（ＣＭ）を前記ＡＢＤにカップリングすることを含む、標的と結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有する組成物を修飾する方法を提供するものである。一実施形態では、ＭＭおよび／またはＣＭがＡＢＤのＣ末端にカップリングされる。もうひとつの実施形態では、ＭＭおよび／またはＣＭがＡＢＤのＮ末端にカップリングされる。いくつかの実施形態では、ＣＭが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、ＴＡＣＥからなる群から選択される酵素の基質である。
特定の実施形態では、ＡＢＤの標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、α４β７インテグリンからなる群から選択される。関連の実施形態では、ＡＢＤが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖまたはＳＣＡＢ由来であり、ＡＢＤが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、インテグリンα４、ＩＬ２Ｒ、相補体Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶのＦタンパク質からなる群から選択される標的に対する抗体または抗体フラグメント由来である。他の関連の実施形態では、ＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、エクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、パリビズマブからなる群から選択される抗体由来である。特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＶＥＧＦに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがベバシズマブまたはラニビズマブ由来である。もうひとつの特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＴＮＦαに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがインフリキシマブまたはアダリムマブ由来である。もうひとつの特定の実施形態では、ＡＢＤがＣＤ２０に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤが、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタンまたはリツキシマブ由来である。さらに別の特定の実施形態では、ＡＢＤがＥＧＦＲに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがセツキシマブまたはパニツムマブ由来である。さらに別の特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＣＴＬＡ−４に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがイピリムマブまたはトレメリムマブ由来である。
また、本開示は、候補ペプチドをスクリーニングして、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む抗体またはそのフラグメントに対する特異的結合親和性を有するマスキング部分（ＭＭ）ペプチドを同定する方法も提供するものである。この方法は、ペプチド足場のライブラリを提供することを含み、各ペプチド足場が、膜貫通タンパク質（ＴＭ）と候補ペプチドを含み、ＡＢＤを含む抗体またはそのフラグメントをライブラリと接触させ、抗体またはそのフラグメントに含まれるＡＢＤに対する特異的結合親和性を有するＭＭペプチドを同定することを伴う。いくつかの実施形態では、ライブラリが、ウイルス、細胞または胞子を含む。特定の実施形態では、ライブラリが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。特定の実施形態では、ペプチド足場が検出可能な部分をさらに含む。
特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントが、ＭＭが標的と結合できることを同定するためにスクリーニング対象となるＡＢＤを含み、標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、α４β７インテグリンからなる群から選択される。関連の実施形態では、ＭＭを同定するのにスクリーニング対象となるＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、エクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、パリビズマブからなる群から選択される抗体由来である。特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、インテグリンα４、ＩＬ２Ｒ、相補体Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶのＦタンパク質からなる群から選択される標的に対する抗体または抗体フラグメント由来である。特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＶＥＧＦに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがベバシズマブまたはラニビズマブ由来である。もうひとつの特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＴＮＦαに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがインフリキシマブまたはアダリムマブ由来である。もうひとつの特定の実施形態では、ＡＢＤがＣＤ２０に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤが、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタンまたはリツキシマブ由来である。さらに別の特定の実施形態では、ＡＢＤがＥＧＦＲに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがセツキシマブまたはパニツムマブ由来である。さらに別の特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＣＴＬＡ−４に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがイピリムマブまたはトレメリムマブ由来である。
他の態様では、本開示は、未切断状態でＭＭが標的と特異的に結合するためのＡＢＤに干渉し、切断状態ではＭＭが標的と特異的に結合するためのＡＢＤに干渉しないように、切断可能部分（ＣＭ）およびマスキング部分（ＭＭ）にカップリングされた標的と結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有する抗体またはそのフラグメントを含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体における症状を治療および／または診断する方法を提供するものである。特定の実施形態では、ＡＢＤが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖまたはＳＣＡＢ由来である。特定の実施形態では、ＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、エクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、パリビズマブからなる群から選択される抗体由来である。関連の実施形態では、標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、α４β７インテグリンからなる群から選択される。他の関連の実施形態では、ＡＢＤが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、インテグリンα４、ＩＬ２Ｒ、相補体Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶのＦタンパク質からなる群から選択される標的に対する抗体または抗体フラグメント由来である。特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＶＥＧＦに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがベバシズマブまたはラニビズマブ由来である。もうひとつの特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＴＮＦαに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがインフリキシマブまたはアダリムマブ由来である。もうひとつの特定の実施形態では、ＡＢＤがＣＤ２０に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤが、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタンまたはリツキシマブ由来である。さらに別の特定の実施形態では、ＡＢＤがＥＧＦＲに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤが、セツキシマブまたはパニツムマブ由来である。さらに別の特定の実施形態では、ＡＢＤが、ＣＴＬＡ−４に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である。関連の一実施形態では、ＡＢＤがイピリムマブまたはトレメリムマブ由来である。
特定の具体的な態様では、本開示は、酵素活性化可能な抗体またはそのフラグメントを提供するものである。特定の実施形態では、酵素が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、ＴＡＣＥからなる群から選択される。関連の実施形態では、抗体フラグメントが全長抗体由来であるか、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＳＣＡＢである。具体的な一態様では、本開示は、酵素活性化可能な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体またはそのフラグメントを提供するものである。特定の一実施形態では、抗体がラニビズマブである。もうひとつの実施形態では、抗体がＭＭＰ９によって活性化される。もうひとつの態様では、本開示は、酵素活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントを提供するものである。特定の一実施形態では、抗体がイピリムマブまたはトレメリムマブである。もうひとつの実施形態では、抗体がＭＭＰ９によって活性化される。さらに別の関連の態様では、本開示は、酵素活性化可能なＶＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメントを提供するものである。特定の一実施形態では、抗体がＭＭＰ９によって活性化される。
一態様では、本開示は、ＡＢＰと、前記ＡＢＰを切断できるプロテアーゼと、前記ＡＢＰの標的とを含む反応混合物を提供するものである。
他の態様および実施形態については、本開示を読めば容易に分かるであろう。
不活性（未切断状態）および活性（切断状態）なＡＢＰを示す、ＡＢＰの図である。 ＡＢＰの同定および単離に使用できるライブラリスクリーニング手順の概略である。 Ｔ７対照コンストラクトのアミノ酸配列を示し、酵素の存在下および非存在下の両方でＶＥＧＦが対照コンストラクトと結合することを示す。また、図３は、ＭＭＰ−２によるＭＭＰ−２基質（ＣＭ）の切断も示す。 システイン制約ループＡＢＰおよびＧＳ対照コンストラクトのアミノ酸配列を示す。また、図４は、不活性（未切断状態）および活性（切断状態）なＡＢＰの図も示す。 ＡＢＰでのシステイン制約ループの形成によってＶＥＧＦ結合が干渉されることが分かる、結合実験の結果を示す。切断状態と未切断状態の両方で、ＧＳ対照およびＡＢＰの図も示してある。 ４つの例示としてのコンストラクトライブラリのアミノ酸配列を示し、このライブラリの提示されたコンストラクトを表す図を示す。 図６に示すコンストラクトライブラリを構成するのに適用されるスクリーニング手順の概略である。 図７に示すスクリーニング手順でコンストラクトを選別した後に、スイッチのような挙動を呈する例示としてのライブラリのメンバを同定可能であることを示す。 システイン制約対照よりも選択後のライブラリクローンで切り替え活性が改善されることを示す。 最も顕著な「切り替え」表現型を示したライブラリから単離されたクローンのアミノ酸配列を示す。 ＭＭにシステイン残基を有するクローンならびにＭＭにシステイン残基を欠いたクローンの切り替え活性を示す結合実験の結果を示す。 システイン制約親とＭＭにシステインを有するライブラリクローンの両方でジスルフィド結合の還元によってコンストラクトのＴＢＭに対するＶＥＧＦの結合が増加することを示す、実験結果を示す。 ＭＭＰ−２処理の非存在下でのＫｄとの比較で、システイン制約親コンストラクトをＶＥＧＦと接触させ、ＭＭＰ−２で処理した際に生じたＫｄ改善のグラフ図を示す。 ＭＭＰ−２処理の非存在下でのＫｄとの比較で、ライブラリクローン２．２Ａ．５をＶＥＧＦと接触させ、ＭＭＰ−２で処理した際に生じたＫｄ改善のグラフ図を示す。 標識された標的の濃度を調節することで拡大されたダイナミックレンジについてマスキング部分ライブラリ１を選別した結果を示す。 標識された標的を調節することで拡大されたダイナミックレンジについてマスキング部分ライブラリ１を選別した結果を示し、ライブラリ１のＡＢＰプールに平均４倍のダイナミックレンジを同定する。図１６では、ＥＡＢＰという用語が本明細書に記載のＡＢＰを示す点に注意されたい。 プロテアーゼ活性化可能なＶＥＧＦ阻害剤の例示としての実施形態の図を示す。 候補ＡＢＰライブラリのスクリーニングで同定された例示としてのＡＢＰのアミノ酸配列を示す。 プロテアーゼ−活性化可能なＶＥＧＦ阻害剤の同定に適した候補マスキング部分を有する候補ＡＢＰライブラリの図を示す。 本開示の例示としてのＡＢＰを示す概略図である。 図２に示すライブラリスクリーニング手順の実施形態を示す。 システイン含有ＭＭおよび非システイン含有ＭＭを有するさまざまな例示としてのＡＢＰの配列を示す。 ＭＭＰ−２の存在下および非存在下でのライブラリクローン４．２Ａ．１１（別名４−２Ａ−１１）および２．３Ｂ．５（別名２−３Ｂ−５）の蛍光値との比較で、ＭＭＰ−２の存在下および非存在下でのシステイン制約ループ構造の蛍光値を示す。 さまざまなＡＢＰライブラリクローンでの酵素処理後の蛍光の増加倍数を示す。 選択されたＡＢＰライブラリクローンの切り替え活性を示す。 可溶性タンパク質結合アッセイで利用するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ＡＢＰ融合体の図を示す。 可溶性ＡＢＰ融合物が酵素による結合特性を保つことを実証するＢｉａｃｏｒｅ（商標）でのアッセイ結果を示すグラフである。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶに対する選択された候補ＭＭペプチドの結合を示すＦＡＣＳ解析の結果である。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを含む予測的ＡＢＰのアミノ酸配列である。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを含む予測的ＡＢＰのアミノ酸配列である。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを含む予測的ＡＢＰのアミノ酸配列である。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを含む予測的ＡＢＰのアミノ酸配列であり、この場合のＡＢＰは封入体としての細胞質発現用に設計されている。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを含む予測的ＡＢＰのアミノ酸配列であり、この場合のＡＢＰは封入体としての細胞質発現用に設計されている。 抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを含む予測的ＡＢＰのアミノ酸配列であり、この場合のＡＢＰは封入体としての細胞質発現用に設計されている。 ＴＢＭが抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶ ＡＢＤを含み、ＣＭがＭＭＰ−１基質を含むＡＢＰの活性化と標的結合を示す概略である。 抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有するプロテアーゼ活性化ＡＢＰを示す。 ＭＭのスクリーニング；ＣＭのスクリーニング；ＭＭ、ＣＭ、ＡＢＤを含有するＴＢＭのアセンブル；アセンブルしたコンストラクトの発現および精製；アセンブルしたコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの活性と毒性のアッセイを含む、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有するプロテアーゼ活性化ＡＢＰを生成するためのプロセスを示す。 例示としてのＭＭＰ−９切断可能なマスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖアミノ酸配列である。 ＭＭ ３０６および３１４を用いる場合のＭＢＰ：抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ ＡＢＰのＭＭＰ−９活性化を示すＥＬＩＳＡデータである。試料をＴＥＶで処理してＭＢＰの融合相手を除去した後、ＭＭＰ−９での消化によって活性化した。 ３０６ ＭＭを用いる抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ ＨｉｓコンストラクトのＭＭＰ−９依存性ＶＥＧＦ結合を示すＥＬＩＳＡデータである。 ＨＥＫ細胞上清由来のＭＭ ３０６および３１４を用いる抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ−Ｆｃ ＡＢＰのＭＭＰ−９依存性ＶＥＧＦ結合を示すＥＬＩＳＡデータである。 タンパク質Ａカラムを用いて精製したＭＭ ３０６および３１４を用いる抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＡＢＰコンストラクトのＭＭＰ−９依存性ＶＥＧＦ結合を示すＥＬＩＳＡデータである。 ｓｃＦｖコンストラクトをＶＨＶＬとＶＬＶＨの両方の向きで生成するようＳＯＥ−ＰＣＲによって接合された抗ＣＴＬＡ４の軽鎖および重鎖を示す。 抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ ＶＨＶＬおよびＶＬＶＨコンストラクトのＮ末端に、ＭＭクローニングのための部位、ＣＭ切断配列、ＧＧＳ２リンカーを加えるのにＰＣＲを用いることを示す。 抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖを含むＡＢＰの調製時に用いられるＭＭリンカー−ＣＭ−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖリンカーのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
本発明についてさらに説明する前に、本発明はここに記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、それ自体がもちろん可変であることは理解できよう。また、本明細書で用いる専門用語は特定の実施形態を説明するだけのためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、限定することを意図したものではない旨も理解できよう。
値の範囲が与えられている場合、それぞれの間にある値、文脈から他の内容が明確に示される場合を除いて下限の１０分の１単位、その範囲の上限と下限との間、他の表記の範囲またはその表記の範囲での中間値も本発明に包含されることが理解される。これらのさらに小さな範囲の上限と下限は独立に、さらに小さな範囲に含まれることもあり、表記の範囲で具体的に排除された限界まで本発明内に包含される。表記の範囲が限界のうちの一方または両方を含む場合、この含まれる範囲の一方または両方を排除する範囲も本発明に包含される。
特に定義しないかぎり、本明細書で使用する技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者らに一般に理解されている意味と同一の意味を持つ。本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に用いることが可能であるが、ここでは好ましい方法および材料について説明する。本明細書で言及する刊行物はいずれも、その刊行物を引用することに関して方法および／または材料を説明および開示するために本明細書に援用する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、その指示対象の複数形を含む（文脈から、そうでないことが明白な場合を除く）ことに注意されたい。よって、たとえば、「活性化可能な結合ポリペプチド」とは、複数のこのような活性化可能な結合ポリペプチドを含み、「活性化可能な結合ポリペプチド」とは、１つ以上の活性化可能な結合ポリペプチドならびに当業者間で周知のその等価物を含むといった具合である。また、特許請求の範囲は、任意の要素を排除するようにも記載できる。その際、この記述は、権利請求する要素の記述に関連してこのような排除的な用語を「唯一」「単に」などと使用するか、「負の」限定として使用する先行技術として機能することを意図している点に注意されたい。
本明細書に言及する刊行物は、本出願の出願日前の開示物として提供したものにすぎない。本明細書のいずれの部分も、本発明が先行する発明のおかげでこのような刊行物に先行する資格がないと認めたとは解釈されない。さらに、ここにあげた発行日が実際の発行日とは異なる場合もあり、独立に確認する必要がある場合もある。
例示としての実施形態の詳細な説明
本開示は、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供するものであり、これは、標的結合部分（ＴＢＭ）と、マスキング部分（ＭＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）とを含有する。ＡＢＰは、たとえば切断作用剤（ＣＭの切断部位を認識するプロテアーゼなど）の存在下でＣＭが未切断のときに切断後よりもＴＢＭが標的に到達しにくいように「活性化可能な」コンホメーションを呈する。本開示はさらに、候補ＡＢＰのライブラリ、このようなＡＢＰを同定するためのスクリーニング方法および使用方法も提供するものである。本開示はさらに、ＶＥＧＦと結合するＴＢＭを有するＡＢＰならびに、組成物および使用方法も提供するものである。
また、本開示は、第１のＴＢＭと、第２のＴＢＭと、ＣＭとを含有するＡＢＰも提供するものである。これらのＡＢＰは、ＣＭを切断できる切断剤の存在下で、ＣＭが未切断のときに切断後よりも少なくとも１つのＴＢＭが標的に到達しにくいように「活性化可能な」コンホメーションを呈する。本開示はさらに、このようなコンフィギュレーションを有する候補ＡＢＰのライブラリ、当該ＡＢＰを同定するためのスクリーニング方法および使用方法も提供するものである。本開示はさらに、ＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦ活性を阻害するＴＢＭと、ＦＧＦと結合してＦＧＦ活性を阻害するＴＢＭとを有するＡＢＰならびに、組成物および使用方法も提供するものである。
また、本開示は、標的と結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有する抗体または抗体フラグメントである標的結合部分（ＴＢＭ）と、マスキング部分（ＭＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）とを含む活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供するものである。ＡＢＰは、たとえば切断作用剤（ＣＭの切断部位を認識するプロテアーゼなど）の存在下でＣＭが未切断のときに切断後よりもＡＢＤが標的に到達しにくいように「活性化可能な」コンホメーションを呈する。本開示はさらに、候補ＡＢＰのライブラリ、ＡＢＤの候補ＭＭ、このようなＡＢＰおよびＭＭを同定するためのスクリーニング方法および使用方法も提供するものである。本開示はさらに、本明細書に開示の複数の標的のうちの１つ以上と結合するＡＢＤを有するＡＢＰならびに、組成物および使用方法も提供するものである。
定義
「活性化可能な結合ポリペプチド」または「ＡＢＰ」という用語は、広義には、標的結合部分（ＴＢＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）と、マスキング部分（ＭＭ）とを含有するポリペプチドを示す。ＴＢＭは通常、標的タンパク質（ＶＥＧＦなど）への結合用のアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＴＢＭが、抗体またはその抗体フラグメントの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。
ＣＭは通常、酵素および／または還元可能なジスルフィド結合を形成可能なシステイン−システイン対の基質として機能するアミノ酸配列を含む。それ自体、ＣＭとの関連で「切断」、「切断可能な」、「切断された」などの表現を用いる場合、これらの表現は、プロテアーゼなどによる酵素切断ならびに、還元剤への曝露後のジスルフィド結合の還元によるシステイン−システイン対間のジスルフィド結合の破壊を包含する。
ＭＭは、ＡＢＰのＣＭが無傷（すなわち、対応する酵素によって切断されていないおよび／または非還元システイン−システインジスルフィド結合を含有する）である場合に、自らの標的に対するＴＢＭの結合にＭＭが干渉するアミノ酸配列である。ＣＭのアミノ酸配列は、ＭＭと重なることもあれば、ＭＭに含まれることもある。便宜上、本明細書で用いる「ＡＢＰ」は、その未切断の（または「ネイティブな」）状態にあるＡＢＰと、その切断状態にあるＡＢＰの両方を示す点に注意されたい。いくつかの実施形態では、少なくともＭＭを切り離すプロテアーゼなどによるＣＭの切断（ＭＭが共有結合によってＡＢＰと結合していない場合など（システイン残基間のジスルフィド結合など）が原因で、切断後のＡＢＰにＭＭが欠けている場合がある旨は、当業者であれば自明であろう。例示としてのＡＢＰについては、下記において詳細に説明する。
特に関心の対象となる一実施形態では、ＡＢＰが２つのＴＢＭを含み、少なくとも１つのＴＢＭが他のＴＢＭに対するマスキング部分（ＭＭ）として作用する、および／または未切断のコンホメーションで、少なくとも１つのＴＢＭの標的に対するＡＢＰの結合が、ＡＢＰが切断されたコンホメーションにある場合に比して少なくなるように、２つのＴＢＭが互いにマスキング部分として機能する。よって、本実施形態における「活性化可能な結合ポリペプチド」または「ＡＢＰ」は、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、第２のＴＢＭと、切断可能部分（ＣＭ）とを含有するポリペプチドを包含し、第１および第２のＴＢＭが相互作用して、標的に対する少なくとも１つのＴＢＭの結合を「マスク」する（すなわち、第１および／または第２のＴＢＭが標的結合のマスキング部分（ＭＭ）として作用する）。ＴＢＭは通常、標的タンパク質（ＶＥＧＦなど）への結合用のアミノ酸配列を含有する。
後者の実施形態では、ＡＢＰのＣＭが無傷（すなわち、対応する酵素によって切断されていない、および／または非還元システイン−システインジスルフィド結合を含有する）である場合に、第１および第２のＴＢＭの相互作用が、自らの対応する標的に対する一方または両方のＴＢＭの結合に干渉する。便宜上、本明細書で使用する「ＡＢＰ」は、その未切断の（または「ネイティブな」）状態にあるＡＢＰと、その切断状態にあるＡＢＰの両方を示す点に注意されたい。いくつかの実施形態では、プロテアーゼなどによるＣＭの切断が原因で、切断後のＡＢＰに上述したような２つのＴＢＭが含まれなくなる場合がある旨は、当業者であれば自明であろう。ＡＢＰが、プロテアーゼ切断可能なＣＭと、ジスルフィド結合を含むＣＭの両方を含む場合、プロテアーゼ切断可能なＣＭを切断してもジスルフィド結合が無傷のまま残り、切断後の形態のＡＢＰには標的結合が可能な「マスクされない」コンフィギュレーションで２つのＴＢＭが保持される場合もある。例示としてのＡＢＰについては、下記において詳細に説明する。
本明細書で使用する場合、「切断剤」という用語は、酵素切断などによってＣＭの配列を切断できる作用剤あるいは、システイン−システイン対間のジスルフィド結合を還元できる還元剤を示す。「還元剤」は一般に、ジスルフィド結合との還元酸化反応で電子供与化合物として機能する化合物または元素を示す。特に注目される還元剤として、タンパク質などの細胞還元剤あるいは、グルタチオン、チオレドキシン、ＮＡＤＰＨ、フラビン、アスコルビン酸塩などの生理学的条件下でジスルフィド結合を還元できる他の作用剤があげられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、本明細書では同義に用いられ、長さを問わずアミノ酸のポリマー形態を示し、これには、コードされたアミノ酸およびコードされないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を含むまたは含まない異種および同種リーダー配列との融合物；免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを含むがこれに限定されるものではない、融合タンパク質を含む。
「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」および「ポリペプチドを切断できる酵素」は、本明細書では同義に用いられ、ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼなどの酵素、通常はエンドペプチダーゼを示す。
「複製可能な生命体」という表現は、細菌、酵母、原虫、哺乳類細胞ならびに、このような細胞に感染し、複製できるさまざまなウイルスおよびバクテリオファージなどをはじめとする自己複製生物細胞を示す。
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、同義に用いられ、長さを問わずヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはその類似体を示す。ポリヌクレオチドは、どのような三次元構造であってもよく、周知のまたは周知ではないどのような機能を果たすものであってもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、プライマーがあげられる。
「でコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を示し、ポリペプチド配列またはその一部は、核酸配列でコードされるポリペプチドから少なくとも３から５アミノ酸、一層好ましくは少なくとも８から１０アミノ酸、なお一層好ましくは少なくとも１５から２０アミノ酸からなるアミノ酸配列を含有する。また、配列によってコードされるポリペプチドで免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も包含される。
「コンストラクト」は、本明細書では、共有結合的におよび作動的に結合された要素として特徴付けられるポリペプチドまたは核酸を示すものとして用いられる。たとえば、ＡＢＰコンストラクトは、少なくともＴＢＭ、ＭＭ、ＣＭを含むＡＢＰポリペプチド（これが作動的に結合されて本明細書に記載の切り替え可能な表現型が得られる）ならびにこのようなＡＢＰポリペプチドをコードする核酸を示し得るものである。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に伝達できる。一般に、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、宿主細胞で目的の遺伝子の発現を指令できる核酸コンストラクトを意味する。よって、この用語は、クローニングベクターおよび発現媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）ベクターならびに組み込み用（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ベクターも含む。
本明細書で使用する場合、「組換え」は当該技術分野での通常の意味であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成またはそうでなければ操作されたポリヌクレオチド（「組換えポリヌクレオチド」など）、細胞または他の生物学的系で組換えポリヌクレオチドを用いて遺伝子産物を産生する方法、組換えポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を示す。
「組換え」という表現を細胞に関して用いる場合、細胞が異種核酸を含有するか、このような異種核酸でコードされるペプチドまたはタンパク質を発現し、通常はこのような異種核酸を複製することを示す。組換え細胞は、その細胞のネイティブな（非組換え）形態には見られない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、その細胞のネイティブな形態に見られる遺伝子も含み得るものであり、これらの遺伝子が修飾されて人工的な手段で細胞に再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく修飾されている細胞に対して内在性の核酸を含有する細胞も包含する。このような修飾は、遺伝子の代置、部位特異的変異、関連の技法によって得られるものを含む。
「異種配列」、「異種核酸」、「異種ポリペプチド」または「異種アミノ酸配列」とは、本明細書で使用する場合、特定の宿主細胞にとって外来である起源に由来するものであり、あるいは、同一起源である場合には、その元の形態から修飾されている。よって、宿主細胞の異種核酸は、特定の宿主細胞に内在するが、修飾されている（宿主細胞に通常は見られない配列を提供するための核酸に対して、天然に生じる核酸または親核酸とは異なるアミノ酸配列をコードするなど）核酸を含む。異種配列の修飾は、ＤＮＡを制限酵素で処理して、プロモーターに作動的に結合され得るＤＮＡフラグメントを生成する、あるいはＤＮＡを異種プロモーターに作動的に結合させて宿主細胞にとって内在性ではない発現カセットを提供するなど、多岐にわたる方法で達成可能である。部位特異的突然変異誘発などの技法も異種核酸の修飾には有用である。
「作動的に結合された」という表現は、所望の機能を得るための分子間の機能的リンケージを示す。たとえば、核酸に関して「作動的に結合された」とは、転写、翻訳などの所望の機能を得るための核酸間の機能的リンケージ、たとえば核酸発現対照配列（プロモーター、シグナル配列または転写因子結合部位のアレイなど）と第２のポリヌクレオチドとの間の機能的リンケージを示し、発現対照配列は第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響する。ポリペプチドに関して「作動的に結合された」とは、ポリペプチドのここに記載の活性（ＡＢＰが未切断にあるときのＴＢＭの「マスキング」、切断を容易にするためのプロテアーゼに対する到達しやすさ、ＡＢＰのＴＢＭの「未マスキング」など）を得るためのアミノ酸配列（異なるドメインなど）間の機能的リンケージを示す。
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」とは、このような配列と矛盾しない宿主の対照要素と作動的に結合された構造的遺伝子の発現に影響できる対照要素を有する組換え的および／または合成的に生成された核酸コンストラクトである。発現カセットは、少なくともプロモーターを含み、任意に、転写終結シグナルも含む。一般に、組換え発現カセットは、少なくとも転写対象となる核酸とプロモーターとを含む。発現させるのに必要または役立つ別の因子も本明細書に記載したようにして使用可能である。たとえば、転写終結シグナル、エンハンサー、遺伝子発現に影響する他の核酸配列も発現カセットに含み得るものである。
「ゲノムに導入する」とは、組換え複製可能な生命体（宿主細胞、バクテリオファージなど）を作製することに関して本明細書で使用する場合、複製をするための組換え複製可能な生命体の生成を示し、必要があれば、複製可能な生命体の複製による外来性ポリペプチドの発現を示す。複製可能な生命体が宿主細胞（細菌、酵母または哺乳類細胞など）である場合、「ゲノムに導入する」とは、ゲノムの組み込み（安定した組み込みなど）によるゲノム的導入ならびに、宿主細胞で外来性核酸の安定したまたは一過性の維持を提供するためのエピソーム要素（プラスミドなど）の導入の両方を包含する。「トランスフォーメーション」という用語も同様に、目的のポリペプチドをコードする外来性核酸の導入による組換え細胞の生成を示して用いられ、この場合の外来性核酸は、エピソーム要素（細菌または酵母宿主細胞との関連ではプラスミドなど）と同様に安定してまたは一過的に維持可能であるか、安定してまたは一過性にゲノム組み込み可能である。
「単離された」という表現は、実体（ポリペプチド、核酸など）を、これが本来関連しているまたは合成（組換え、化学合成など）時に関連することがある他の実体から分離したことを示す。「単離された」という用語は、実体が天然に見いだせる状態にないことを意味し、実体が組換えまたは他の合成手段で産生される場合であれば、存在し得る他の成分に対して分離または富化されていることを意味する。よって、たとえば、「単離されたタンパク質」は、天然に見られるようなものではないが実質的に１００％未満の純粋なタンパク質のこともある。
「実質的に純粋」とは、実体（ポリペプチドなど）がなす部分が組成物全体（組成物の全タンパク質など）の約５０％を超え、一般に、タンパク質全体の約６０％を超えることを示す。より一般に、「実質的に純粋」とは、組成物全体の少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれより多くが目的の実体（全タンパク質のなどである組成物を示す。好ましくは、タンパク質がなす部分が約９０％を超え、一層好ましくは組成物のタンパク質全体の約９５％を超える。
「富化された」とは、開始組成物に比して、組成物で目的の実体の割合が増したことを示す。たとえば、メンバの１０％が所望の属性（酵素的に「切り替え可能」など）を呈する開始個体群すなわち第１の個体群を富化して、全体の１０％を超える（１５％またはそれより多くなど）メンバが所望の活性を呈する第２の個体群を得ることが可能である。富化に選択を伴うなど、富化によって個体群の異なるメンバ全体が減少する場合がある点に注意されたい。
「スクリーン」または「スクリーニング」ならびに、「選択」または「選択する」という表現は、本明細書では、所望の属性（酵素的に「切り替え可能」など）を有する個体群のメンバを、属性がそれほど望ましくない（検出可能な酵素的に切り替え可能な表現型がない、あるいは所望のダイナミックレンジにない酵素的に切り替え可能な表現型など）メンバから分離しやすくなるように個体群を処理することを示して用いられる。スクリーニングは、１つ以上の基準を用いてメンバの個体群について実施可能である。スクリーニングは、（たとえばＦＡＣＳを用いる細胞選別によるなど）分離後の個体群の回復性および／または生存度を維持する手段によって達成可能であるか、あるいは個体群の望ましくないメンバの生存度または回復性を抑えることで達成可能である。
スクリーニング（または選択）には、「ポジティブスクリーニング」または「ネガティブスクリーニング」（本明細書ではそれぞれ、「ポジティブ選択」または「ネガティブ選択」とも呼ぶ）が可能である。「ポジティブスクリーニング」では、所望の属性を呈するメンバを、ポジティブシグナル（検出可能なシグナルの存在、所望の属性を欠いたメンバの成長を阻害する作用剤の存在下での成長など）の存在に応じて選択する。「ネガティブスクリーニング」では、所望の属性を呈するメンバを、減少したシグナルまたは検出できないシグナル（比較的減少または検出できないシグナル；所望の属性を呈するメンバの成長を阻害する作用剤の存在下での成長の低下など）に応じて選択する。
本明細書で使用する場合、「接触」とは通常の意味であり、２つ以上の実体（標的タンパク質、候補ＡＢＰ、酵素など）を組み合わせることを示す。接触は、たとえば、試験管または他の容器内で（２つ以上の作用剤［切断剤（酵素など）とペプチド提示足場を発現している細胞など］を組み合わせるなど）、細胞ベースの系で（標的タンパク質および／または切断剤（酵素など）と細胞表面に提示されたでＡＢＰの接触など）または無細胞系で（無傷細胞を必要とせずにペプチド提示足場を提示するための切断剤（酵素など）と細胞膜、合成膜または他の膜とを組み合わせるなどなど）起こり得る。
本明細書で使用する場合、「リガンド」とは、酵素に対する基質、阻害剤またはアロステリックレギュレーターの結合などの結合相手の分子に結合する分子を示し、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、炭水化物、糖、脂質、リポタンパク質、小分子、天然および合成の有機物質および無機物質、合成ポリマーなどの天然および合成の生体分子を含む。
「結合」とは、本明細書で使用する場合、主に２つの分子間（本明細書では基質および酵素などの「結合相手」と呼ぶ）での共有結合または非共有結合の相互作用を示し、この結合は通常、特異的である。
本明細書で使用する場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、結合相手が互いに結合するが、その環境（生物学的試料中、組織中など）に存在し得る他の分子とは、特定の条件の組（生理学的条件など）のもとで有意なレベルまたは相当なレベルでは結合しないような結合相手間の相互作用を示す。
本明細書で使用する場合、「蛍光基」は、選択した波長の光で励起されると、異なる波長の光を放出する分子を示す。蛍光基を「フルオロフォア」と呼ぶこともある。
本明細書で使用する場合、「提示足場」という用語は、宿主細胞で発現されると、宿主細胞の細胞外到達可能な表面に提示され、作動的に結合された異種ポリペプチドを提示するポリペプチドを示す。たとえば、提示足場には、本明細書に開示した方法で候補ＡＢＰのスクリーニングを容易にする用途がある。提示足場は、提示足場からの融合タンパク質の切断と候補ＡＢＰの放出を容易にするプロテアーゼの作用によって、目的の異種ポリペプチドを提示足場から容易に放出できるように提供可能である。
「検出する」または「評価する」とは、あらゆる形態の定性的測定または定量的測定を含み、要素の有無を判断することを含む。「判断する」、「測定する」、「見極める」、「評価する」、「アッセイする」という表現は同義に用いられ、定量的および定性的判断を含む。評価は相対的なものであっても絶対的なものであってもよい。「存在を評価する」とは、存在する何かの量を判断することおよび／または有無を判断することを含む。本明細書で使用する場合、「検出する」、「判断する」、「測定する」、「評価する」、「アッセイする」という用語は同義に用いられ、定量的判断と定性的判断の両方を含む。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、治療対象となる疾患状態を治療するあるいは、そうでなければ所望の効果（腫瘍サイズの減少、血管形成の低減など）を得るのに十分な薬用量を意味する。厳密な薬用量は、被検体依存の変数（年齢、免疫系の健康など）、疾患（癌または腫瘍のタイプなど）、実施する治療などの多岐にわたる要因に応じて変わってくる。
「治療部位」という用語は、ＡＢＰの一方または両方のＴＢＭの標的とＡＢＰのＣＭを切断できる切断剤とが共存する部位など、本明細書に記載したようにＡＢＰが切り替え可能に設計される部位を示すことを意図している。治療部位としては、局所投与（注射、点滴など（カテーテルによるなど））または全身投与（治療部位から離れた部位への投与など）で到達できる組織がある。治療部位は、生物学的に比較的限局された部位（臓器、嚢、腫瘍部位など）も含む。
活性化可能な結合ポリペプチド
本開示は、標的タンパク質に対して、「切り替え可能な」結合とも呼ばれる「活性化可能な」結合を呈する活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供するものである。ＡＢＰは主に、標的結合部分（「ＴＢＭ」）と、マスキング部分（「ＭＭ」）と、切断可能部分（「ＣＭ」）とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭが、対象となるプロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、ＣＭが、還元によって切断可能なシステイン−システインジスルフィド結合を提供する。
ＡＢＰの概略を、図１、図３５および図３６に示す。後者の２つは、ＡＢＰのＴＢＭが抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有する実施形態を概略的に表したものである。図１、図３５、図３６に示すように、切断状態（または比較的「活性な」状態）で標的が存在すればＴＢＭが標的と結合するのに対し、未切断状態（または比較的「不活性な」状態）で標的が存在すると、ＭＭによるＴＢＭの「マスキング」を伴い得るＡＢＰのコンホメーションがゆえに、標的に対するＴＢＭの結合が阻害されるような位置にＣＭがあるような形で、ＡＢＰの各要素が配置されている。本明細書で使用する場合、「切断状態」という表現は、プロテアーゼおよび／またはＣＭのシステイン−システインジスルフィド結合の還元によるＣＭ切断後のＡＢＰの様子を示す。「未切断状態」という表現は、本明細書で使用する場合、プロテアーゼによるＣＭの切断がないおよび／またはＣＭのシステイン−システインジスルフィド結合の還元がない、ＡＢＰの様子を示す。上述したように、「ＡＢＰ」は、本明細書では便宜上、その未切断の（または「ネイティブな」）状態にあるＡＢＰと、その切断状態にあるＡＢＰの両方を示すのに用いられる。いくつかの実施形態では、少なくともＭＭを切り離すプロテアーゼによるＣＭの切断（ＭＭが共有結合（システイン残基間のジスルフィド結合など）によってＡＢＰと結合していない場合などが原因で、切断後のＡＢＰにＭＭが欠けている場合がある旨は、当業者であれば自明であろう。
「活性化可能な」または「切り替え可能な」とは、ＡＢＰがネイティブな状態または未切断状態（すなわち、第１のコンホメーション）で標的に対して第１のレベルの結合を呈し、切断状態（すなわち、第２のコンホメーション）で標的に対して第２のレベルの結合を呈し、第２のレベルの標的結合が第１のレベルの結合よりも強いことを意味する。通常、ＣＭを切断できる切断剤の存在下でのほうが、このような切断剤の非存在下よりもＡＢＰのＴＢＭへの標的の到達が大きくなる。よって、ネイティブな状態または未切断状態で、ＴＢＭは標的結合から「マスクされ」（すなわち、第１のコンホメーションは、これがＴＢＭに対する標的の到達に干渉するようなものである）、切断状態では、ＴＢＭが標的結合に対して「マスクされない」。
ＡＢＰのＣＭおよびＴＢＭについては、ＴＢＭが目的の標的用の結合部分を表し、ＣＭが被検体の治療部位で標的と共存するプロテアーゼの基質を表すように選択してもよい。上記の代わりまたは上記に加えて、ＣＭは、このジスルフィド結合の還元の結果として切断可能なシステイン−システインジスルフィド結合である。ＡＢＰは、少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能なＣＭまたはシステイン−システインジスルフィド結合を含有し、いくつかの実施形態では、両方の種類のＣＭを含む。本明細書に開示のＡＢＰには、たとえば、ＣＭの部位を切断できるプロテアーゼが、非治療部位の組織よりも治療部位の標的含有組織で比較的高めのレベルで存在する場合に、特定の利用法がある。
別の言い方をすると、ＡＢＰのＣＭ−ＴＢＭ対は、標的と共存するプロテアーゼのレベルが高くなることを有効利用するよう設計されている。このため、被検体の非治療部位よりも治療部位で優先的に酵素活性化される（よって、高い標的結合レベルを呈する）ようにＡＢＰを設計することが可能である。このように、ＡＢＰを用いると、非治療部位でＴＢＭの結合に起因し得る毒性および／または有害な副作用を減らすことが可能である。ＡＢＰが、ジスルフィド結合を還元しやすくする還元剤によって切断可能なＣＭを含有する場合、たとえば非治療部位の環境よりも環境での還元の可能性が高くなるような形で、還元剤のレベルの高さを特徴とする所望の治療部位に目的の標的が存在するＴＢＭの活性化を有効利用するよう、このようなＡＢＰのＴＢＭを選択してもよい。
通常、ＡＢＰを設計するには、目的のＴＢＭを選択し、コンホメーション的に制限がある場合はＭＭがＴＢＭをマスクするようＡＢＰの残りを構築すればよい。この機能的な特徴を提供するために構造的な設計基準が考慮対象となる。たとえば、ＡＢＰが、ＭＭと、少なくとも１つのＣＭと、リンカーとを含む場合、このリンカーは、ＴＢＭの標的結合部位からコンストラクトの残りが結合することになるＴＢＭの末端までの距離を代表する長さに対して、一般に少なくとも１．５から２倍、通常は少なくとも２倍になるように選択される。
二重標的結合ＡＢＰは、本開示において特に関心の対象となる。このような二重標的結合ＡＢＰは２つのＴＢＭを含有し、これらは同一の標的と結合することもあれば異なる標的と結合することもある。この場合、少なくとも１つのＴＢＭが、標的結合と「マスキング」の二重の機能を果たす。上述したように、このような二重標的結合ＡＢＰは通常、２つのＴＢＭを含有し、少なくとも１つのＴＢＭが他のＴＢＭに対するマスキング部分（ＭＭ）として作用および／またはＡＢＰが切断されたコンホメーションにある場合に比して、未切断のコンホメーションで、少なくとも１つのＴＢＭの標的に対するＡＢＰの結合が少なくなるように、２つのＴＢＭが互いにマスキング部分として作用する。よって、本実施形態における「ＡＢＰ」は、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、第２のＴＢＭと、切断可能部分（ＣＭ）とを含有するポリペプチドを包含し、第１および第２のＴＢＭが相互作用して、標的に対する少なくとも１つのＴＢＭの結合を「マスク」する（すなわち、第１および／または第２のＴＢＭが標的結合のマスキング部分（ＭＭ）として作用する）。ＴＢＭは、異なる標的（ＶＥＧＦならびに、ＦＧＦ２などの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）など）に結合するＴＢＭを含み得る。各ＴＢＭは、各々が標的に対する結合用の１つ以上の活性部位を含むように、独立して選択可能である。
図２０は、ＡＢＰが切断されたときにそれぞれの標的を結合し、ＡＢＰが未切断のときにＴＢＭの一方または両方の標的に対する結合からＡＢＰをマスクする、二重機能を果たし得る２つのＴＢＭを有する本開示の例示としてのＡＢＰを示す概略図である。図２０の上側には「ＭＭ」が示されているが、この場合のＭＭは単一の結合部位を有する第１のＴＢＭである。図２０の中程に、第１のＴＢＭおよび第２のＴＢＭ（任意にＴＢＭ１およびＴＢＭ２と表示）を有し、２つのＴＢＭ間に切断可能部分（ＣＭ）が位置するＡＢＰを示す。切り替え可能な未切断のコンホメーション（すなわちＣＭが対応する酵素によって切断されていないおよび／または非還元システイン−システインジスルフィド結合を含有する無傷のとき）では、図２０の下側に示すように、ＴＢＭ１がＴＢＭ２と相互作用することで、少なくともＴＢＭ１の標的に対する結合を「マスク」し、特定の実施形態では、ＴＢＭ１およびＴＢＭ２の両方の標的結合をマスクする。切断されると、各ＴＢＭは「マスクされていない」ため、それぞれの標的に自由に結合できる。
二重標的結合ＴＢＭについては、ＡＢＰのＴＢＭに結合できる標的の一方または両方と標的組織で共存する、切断剤によって切断可能なＣＭを有するように設計可能である。本開示はさらに、単一のＡＢＰを切断剤で切断することで、複数の標的結合フラグメントが放出されるように、ＴＢＭ１−ＴＢＭ２ドメインの複数の「単位」を企図するものである。
図２０に例示するように、「マスクされた」ＴＢＭと、標的または（血清ＩｇＧ結合タンパク質で例証されるような）血清半減期の延長などの別の所望の機能を提供し得る目的の部分との間に、第２のＣＭを配置することが可能である。この第２のＣＭは、同一または異なる切断剤による切断の影響を受けやすい。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼなどによるＣＭの切断が原因で、切断後のＡＢＰに上述したような２つのＴＢＭが含まれなくなる場合がある旨は、当業者であれば自明であろう。ＡＢＰが、プロテアーゼ切断可能なＣＭと、ジスルフィド結合を含むＣＭの両方を含む場合、プロテアーゼ切断可能なＣＭを切断してもジスルフィド結合が無傷のまま残り、切断後の形態のＡＢＰには標的結合が可能な「マスクされない」コンフィギュレーションで２つのＴＢＭが保持される場合もある。例示としてのＡＢＰについては、下記において詳細に説明する。
切断されたコンホメーション対未切断のコンホメーションで標的結合に対する所望のダイナミックレンジを切り替え可能な表現型を呈するＡＢＰが、特に関心の対象となる。「ダイナミックレンジ」という用語は、本明細書で使用する場合、主に（ａ）第１の組の条件下でのパラメータの最大検出レベルと、（ｂ）第２の組の条件下でのそのパラメータの最小検出値との比を示す。たとえば、ＡＢＰとの関連では、ダイナミックレンジは、（ａ）ＡＢＰのＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下でＡＢＰに結合する標的タンパク質の最大検出レベルと、（ｂ）プロテアーゼの非存在下でＡＢＰに結合する標的タンパク質の最小検出レベルとの比を示す。ＡＢＰのダイナミックレンジについては、ＡＢＰ切断剤（酵素など）治療の平衡解離定数と、ＡＢＰ切断剤治療の平衡解離定数との比として算出可能である。ＡＢＰのダイナミックレンジが大きくなればなるほど、ＡＢＰの「切り替え可能な」表現型が一層よくなる。ダイナミックレンジの値が比較的大きい（１を超えるなど）ＡＢＰは、ＡＢＰによる標的タンパク質結合が、ＡＢＰのＣＭを切断できる切断剤（酵素など）の存在下で、切断剤の非存在下よりも大きな度合いで生じる（優先的に生じるなど）ような一層望ましい切り替え表現型を呈する。
ＡＢＰは、切り替え可能な表現型が得られるように、ＴＢＭ、ＭＭ、ＣＭがＡＢＰに作動的に配置されるかぎり、多岐にわたる構造的コンフィギュレーションで提供可能なものである。ＡＢＰの例示としての式を以下にあげておく。ＴＢＭ、ＭＭおよびＣＭのＮ末端からＣ末端の順序をＡＢＰ内で反転してもよいことが、特に企図される。また、たとえばＣＭがＭＭ内に含まれるように、ＣＭとＭＭのアミノ酸配列が重なってもよいことも特に企図される。
たとえば、ＡＢＰについては、以下の式で表すことが可能である（アミノ（「Ｎ」）末端領域からカルボキシル（「Ｃ」）末端領域への順で以下のとおりであり、
（ＭＭ）−（ＣＭ）−（ＴＢＭ）
（ＴＢＭ）−（ＣＭ）−（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＣＭは切断可能部分であり、ＴＢＭは標的結合部分である。上記の式ではＭＭとＣＭが別々の成分として示されているが、本明細書に開示の例示としてのすべての実施形態（式を含む）では、ＣＭが完全にまたは部分的にＭＭの中に含まれるなど、ＭＭとＣＭのアミノ酸配列が重なってもよい旨に注意されたい。また、上記の式では、ＡＢＰ要素のＮ末端側またはＣ末端側に配置できる別のアミノ酸配列も得られる。いくつかの実施形態では、二重標的結合ＡＢＰは、ＭＭが第２のＴＢＭであるようなものである。本開示全体をとおして、ここに記載の式はこのような二重標的結合ＡＢＰを包含し、式中の「ＭＭ」がＴＢＭ１であり、「ＴＢＭ」がＴＢＭ２であり、この場合のＴＢＭ１およびＴＢＭ２は第１および第２のＴＢＭを任意に示しただけのものであり、ＴＢＭと結合できる標的が同一の標的であっても異なる標的であってもよく、同じ標的の同一の結合部位であっても異なる結合部位であってもよい旨は、理解できよう。
通常、ＡＢＰは、標的のＴＢＭへの到達が少なくともＭＭによって阻害されるようなＡＢＰの畳み込みの結果として、切り替え可能な表現型を呈することが可能である旨は理解できよう。よって、多くの実施形態では、ＭＭ−ＣＭ結合部分、ＣＭ−ＴＢＭ結合部分の１つ以上または両方で柔軟性を持たせるために、フレキシブルリンカーなどの１つ以上のリンカーをＡＢＰコンストラクトに挿入すると望ましいことがある。たとえば、ＴＢＭ、ＭＭおよび／またはＣＭには、所望の柔軟性が得られるほどの十分な数の残基（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙおよびＳｅｒ、ことさらＧｌｙなど）が含まれていないことがある。それ自体、このようなＡＢＰコンストラクトの切り替え可能な表現型が、フレキシブルリンカーを得るための１つ以上のアミノ酸の導入から恩恵を受けることがある。また、後述するように、ＡＢＰがコンホメーション的に制約されたコンストラクトとして提供される場合、フレキシブルリンカーを作動的に挿入して、未切断ＡＢＰの環状構造の形成と維持を容易にすることができる。
たとえば、特定の実施形態では、ＡＢＰが、以下の式（この場合、後述の式はＮからＣ末端方向またはＣからＮ末端方向のいずれかのアミノ酸配列を示す）のうちの１つを含み、
（ＭＭ）−Ｌ１−（ＣＭ）−（ＴＢＭ）
（ＭＭ）−（ＣＭ）−Ｌ１−（ＴＢＭ）
（ＭＭ）−Ｌ１−（ＣＭ）−Ｌ２−（ＴＢＭ）
シクロ［Ｌ１−（ＭＭ）−Ｌ２−（ＣＭ）−Ｌ３−（ＴＢＭ）］
式中、ＭＭ、ＣＭ、ＴＢＭは先に定義したとおりであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は各々独立かつ任意に存在するか存在せず、少なくとも１つのフレキシブルアミノ酸（Ｇｌｙなど）を含む同一または異なるフレキシブルリンカーであり、「シクロ」が含まれる場合は、ＡＢＰにおけるシステインの対間のジスルフィド結合がゆえにＡＢＰが環状構造である。また、上記の式では、ＡＢＰ要素のＮ末端側またはＣ末端側に存在してもよい別のアミノ酸配列も得られる。式シクロ［Ｌ１−（ＭＭ）−Ｌ２−（ＣＭ）−Ｌ３−（ＴＢＭ）］では、ＡＢＰがジスルフィド結合構造にある（よって、コンホメーション的に制約された状態である）場合に、ジスルフィド結合を担うシステインをＡＢＰに配置して１つまたは２つの「尾」を許容し、これによって「ラッシ」または「オメガ」構造を生成してもよい旨を理解されたい。尾のアミノ酸配列によって、ＡＢＰの局在化を容易にするための標的受容体に対する結合、ＡＢＰの血清半減期増大などのＡＢＰの別の特徴を得ることも可能である。標的部分（標的組織中に存在する細胞の受容体のリガンドなど）と血清半減期延長部分（免疫グロブリン（ＩｇＧなど）または血清アルブミン（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などなどの血清タンパク質と結合するポリペプチドなど。
上述したように、上記の式は、式の「ＭＭ」がＴＢＭ１であり、「ＴＢＭ」がＴＢＭ２であるような二重標的結合ＡＢＰを包含し、この場合のＴＢＭ１およびＴＢＭ２は第１および第２のＴＢＭを任意に示しただけのものであり、ＴＢＭと結合できる標的が同一の標的であっても異なる標的であってもよく、同じ標的の同一の結合部位であっても異なる結合部位であってもよい。本開示はさらに、第２のＣＭが異なるかまたは同じであるようなＡＢＰが第２のＣＭを含み得ることをさらに提供するものであり、目的の部分（標的部分、血清半減期延長部分、ＡＢＰを支持体に固定化するための部分など）の切断可能な放出を提供するものである。
ＡＢＰで使用するのに適したリンカーは通常、「マスクされた」コンホメーションを容易にするための柔軟性をＡＢＰに与えるものである。このようなリンカーは通常、「フレキシブルリンカー」と呼ばれる。好適なリンカーは容易に選択可能であり、１アミノ酸（Ｇｌｙなど）から２０アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸あるいは、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸または７アミノ酸から８アミノ酸をはじめとして３アミノ酸から１２アミノ酸など、異なる長さの好適なもののうちどのようなものであってもよく、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸であればよい。
例示としてのフレキシブルリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（たとえば、（ＧＳ）ｎ（ＧＳＧＧＳ：配列番号１）ｎおよび（ＧＧＧＳ：配列番号２）ｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、従来技術において周知の他のフレキシブルリンカーがある。このうちグリシンおよびグリシン−セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。グリシンはアラニンよりもかなり多くｐｈｉ−ｐｓｉスペースに到達し、側鎖が長めの残基よりも制限がかなり少ないことから、グリシンポリマーが特に注目されている（Ｓｃｈｅｒａｇａ， Ｒｅｖ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ． １１１７３〜１４２ （１９９２）を参照のこと）。例示としてのフレキシブルリンカーには、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ：配列番号３、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：配列番号４、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ：配列番号５、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：配列番号６、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ：配列番号７、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ：配列番号８、などがあるが、これに限定されるものではない。所望のＡＢＰ構造を得るために、フレキシブルリンカーと、これよりも柔軟性の低い構造となる１つ以上の部分とをリンカーに含み得るように、ＡＢＰの設計に全体または一部が柔軟なリンカーを含み得ることは、当業者であれば分かるであろう。
上述した要素に加えて、ＡＢＰは、たとえば、ＡＢＰのアミノ酸配列Ｎ末端またはＣ末端などの別の要素を含むものであってもよい。たとえば、ＡＢＰは、目的の細胞または組織への送達を容易にするための標的部分を含むことができる。さらに、後述するＡＢＰライブラリとの関連では、細胞表面でのＡＢＰの提示を容易にするための足場タンパク質との関連でＡＢＰを提供可能である。
ＡＢＰの例示としての基本要素については、下記において詳細に説明する。
標的結合部分（ＴＢＭ）
ＡＢＰの標的結合部分（ＴＢＭ）は、通常はタンパク質標的である目的の標的と結合でき、通常は特異的に結合できる、多岐にわたる周知のアミノ酸配列のどれを含むものであってもよい。たとえば、目的の標的タンパク質の結合相手のアミノ酸配列を含むようにＴＢＭを選択可能であり、この場合、結合相手と標的の結合によって、標的タンパク質の活性の阻害および／または標的タンパク質の検出などの所望の生物学的作用が得られる。
結合相手のアミノ酸配列（阻害剤など）が周知である例示としてのクラスの標的タンパク質として、細胞表面レセプターおよび分泌結合タンパク質（成長因子など）、可溶性酵素、構造的タンパク質（コラーゲン、フィブロネクチンなど）などがあげられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。具体的な例示としての実施形態では、何ら限定することなく、ＴＢＭが以下の表１に示すような任意の標的の結合相手である。
Figure 2019106994
いくつかの実施形態では、ＴＢＭが、通常は目的のタンパク質標的である目的の標的に結合、特に特異的に結合できる抗原結合ドメイン、抗原結合ドメインフラグメントまたは抗体の抗原結合フラグメント（単鎖の抗原結合ドメインなど）を含有する全長抗体または抗体フラグメントを含む。この実施形態では、ＴＢＭが、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有する。ＡＢＤを含有するＴＢＭを含むＡＢＰの概略を図３６に示す。このような実施形態では、ＡＢＤは、抗体の軽鎖および／または重鎖の可変領域または高頻度可変領域（ＶＬ、ＶＨ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）あるいは、標的タンパク質または標的タンパク質上のエピトープと結合できるＡＢＤを含有する従来技術において周知の他のポリペプチドなどの結合ポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではない。他の実施形態では、各ＡＢＤが同一または異なる標的と結合できるように、ＡＢＤを含有する第１のＴＢＭと、ＡＢＤを含有する第２のＴＢＭとをＴＢＭに含む、キメラまたはハイブリッドコンビネーションであるＴＢＭであってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＢＭが、２つの異なる抗原と結合するよう設計された二重特異性抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、活性化可能な形態で第１のＴＢＭにカップリングされた第１のＭＭと、第２のＴＢＭにカップリングされた第２のＭＭとがある。ＡＢＤの起源としては、天然に生じる抗体またはそのフラグメント、非天然の抗体またはそのフラグメント、合成抗体またはそのフラグメント、ハイブリッド抗体またはそのフラグメントあるいは、改変抗体またはそのフラグメントが可能である。
特定の標的に対する抗体を作製するための方法は、従来技術において周知である。抗体およびそのフラグメント、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造は、十分に理解されている。標的抗原の所望の抗原−結合ドメインを有するポリペプチドを生成するための方法は、従来技術において周知である。別のポリペプチドをカップリングするよう抗体を修飾するための方法も、従来技術において周知である。たとえば、ＭＭ、ＣＭまたはリンカーなどのペプチドをカップリングして抗体を修飾し、本開示のＡＢＰおよび他の組成物を生成してもよい。図３７に概略的に示すような標準的な方法を用いて、プロテアーゼ活性化ＡＢＤを含有するＡＢＰを開発し、生成することが可能である。
ＴＢＭがＡＢＤを含有する標的タンパク質の例示としてのクラスとしては、細胞表面レセプターおよび分泌結合タンパク質（成長因子など）、可溶性酵素、構造的タンパク質（コラーゲン、フィブロネクチンなど）などがあげられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。標的は、本明細書に記載し、表１に例示するがこれに限定されるものではない、ＴＢＭ標的から選択可能である。具体的な例示としての実施形態では、何ら限定することなく、例示としてのＡＢＤソースを以下の表２にあげておく。
Figure 2019106994
表２に記載した例示としてのＡＢＤソースについては、１つ以上の参考ＡＢＤソースの説明について本明細書に援用する、以下の参考文献に一層詳細に論じられている。Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）（インフリキシマブ）：米国特許第６，０１５，５５７号明細書、Ｎａｇａｈｉｒａ Ｋ，Ｆｕｋｕｄａ Ｙ，Ｏｙａｍａ Ｙ，Ｋｕｒｉｈａｒａ Ｔ，Ｎａｓｕ Ｔ，Ｋａｗａｓｈｉｍａ Ｈ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｃ，Ｏｉｋａｗａ Ｓ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｔ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９ Ｊａｎ １；２２２（１−２）：８３〜９２）。Ｋｎｉｇｈｔ ＤＭ，Ｔｒｉｎｈ Ｈ，Ｌｅ Ｊ，Ｓｉｅｇｅｌ Ｓ，Ｓｈｅａｌｙ Ｄ，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ Ｍ，Ｓｃａｌｌｏｎ Ｂ，Ｍｏｏｒｅ ＭＡ，Ｖｉｌｃｅｋ Ｊ，Ｄａｄｄｏｎａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＴＮＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３ Ｎｏｖ；３０（１６）：１４４３〜５３。Ｈｕｍｉｒａ（商標）（アダリムマブ）：米国特許第６ ２５８ ５６２号明細書の配列。Ｒａｐｔｉｖａ（商標）（エファリズマブ）：Ｗｅｒｔｈｅｒ ＷＡ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＴＮ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＳＪ，ＭｃＣａｂｅ Ｓ，Ｃｈａｎ Ｂ，Ｈｏｔａｌｉｎｇ Ｔ，Ｃｈａｍｐｅ Ｍ，Ｆｏｘ ＪＡ，Ｊａｒｄｉｅｕ ＰＭ， Ｂｅｒｍａｎ ＰＷ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（ＬＦＡ）−１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｒｈｅｓｕｓ ＬＦＡ−１。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ Ｄｅｃ １；１５７（１１）：４９８６〜９５に列挙された配列。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）（ゲムツズマブ・オゾガマイシン）：（ＣＯ ＭＳ，Ａｖｄａｌｏｖｉｃ ＮＭ，Ｃａｒｏｎ ＰＣ，Ａｖｄａｌｏｖｉｃ ＭＶ，Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ ＤＡ，Ｑｕｅｅｎ Ｃ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＣＤ３３ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１４９，１９９１に列挙された配列）（Ｃａｒｏｎ ＰＣ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＭＡ，Ｃｏ ＭＳ，Ｑｕｅｅｎ Ｃ，Ｆｉｎｎ ＲＤ，Ｇｒａｈａｍ ＭＣ，Ｄｉｖｇｉ ＣＲ，Ｌａｒｓｏｎ ＳＭ，Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ ＤＡ．Ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍ１９５（ａｎｔｉ−ＣＤ３３） ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４ Ｆｅｂ １；７３（３ Ｓｕｐｐｌ）：１０４９〜５６）。Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）：Ｈｉｌｌｍｅｎ Ｐ，Ｙｏｕｎｇ Ｎ，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ Ｊ，Ｂｒｏｄｓｋｙ Ｒ，Ｓｏｃｉｅ Ｇ，Ｍｕｕｓ Ｐ，Ｒｏｔｈ Ａ，Ｓｚｅｒ Ｊ，Ｅｌｅｂｕｔｅ Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｒ，Ｂｒｏｗｎｅ Ｐ，Ｒｉｓｉｔａｎｏ Ａ，Ｈｉｌｌ Ａ，Ｓｃｈｒｅｚｅｎｍｅｉｅｒ Ｈ， Ｆｕ Ｃ，Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ Ｊ，Ｒｏｌｌｉｎｓ Ｓ，Ｍｏｊｃｉｋ Ｃ，Ｒｏｔｈｅｒ Ｒ，Ｌｕｚｚａｔｔｏ Ｌ（２００６）。“Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ ｉｎ ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ ｎｏｃｔｕｒｎａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ”．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５（１２）：１２３３〜４３。Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）（ナタリズマブ）：Ｌｅｇｅｒ ＯＪ，Ｙｅｄｎｏｃｋ ＴＡ，Ｔａｎｎｅｒ Ｌ，Ｈｏｒｎｅｒ ＨＣ，Ｈｉｎｅｓ ＤＫ，Ｋｅｅｎ Ｓ，Ｓａｌｄａｎｈａ Ｊ，Ｊｏｎｅｓ ＳＴ，Ｆｒｉｔｚ ＬＣ，Ｂｅｎｄｉｇ ＭＭ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−４ ｉｎｔｅｇｒｉｎ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．１９９７；８（１）：３〜１６に列挙された配列。
Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）（パリビズマブ）：Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｓ，Ｏｌｉｖｅｒ Ｃ， Ｐｒｉｎｃｅ ＧＡ，Ｈｅｍｍｉｎｇ ＶＧ，Ｐｆａｒｒ ＤＳ，Ｗａｎｇ ＳＣ，Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ Ｍ，Ｏ’Ｇｒａｄｙ Ｊ，Ｋｏｅｎｉｇ Ｓ， Ｔａｍｕｒａ ＪＫ，Ｗｏｏｄｓ Ｒ，Ｂａｎｓａｌ Ｇ，Ｃｏｕｃｈｅｎｏｕｒ Ｄ，Ｔｓａｏ Ｅ，Ｈａｌｌ ＷＣ，Ｙｏｕｎｇ ＪＦ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＥＤＩ−４９３）ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１９９７ Ｎｏｖ；１７６（５）：１２１５〜２４に列挙された配列。イピリムマブ：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ：２００７；３０（８）：８２５〜８３０ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（Ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）Ｃａｕｓｅｓ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｈｙｐｏｐｈｙｓｉｔｉｓ；Ｊａｍｅｓ Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｍａｒｙｂｅｔｈ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｕｄａｉ Ｋａｍｍｕｌａ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒｏｙａｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｂ．Ｓｕｒｉ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｌｅｖｙ，Ｔａｍｉｋａ Ａｌｌｅｎ，Ｓｈａｒｏｎ Ｍａｖｒｏｕｋａｋｉｓ，Ｉｓｒａｅｌ Ｌｏｗｙ，Ｄｏｎａｌｄ Ｅ．Ｗｈｉｔｅ，ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ。
トレメリムマブ：Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００７；１２；８７３〜８８３；Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃａｎｃｅｒ；Ａｎｔｏｎｉ Ｒｉｂａｓ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｃ．Ｈａｎｓｏｎ，Ｄｅｎｎｉｓ Ａ．Ｎｏｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｉｌｌｈａｍ，Ｄｅｂｏｒａｈ Ｊ．Ｇｕｙｏｔ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｈ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｐａｕｌ Ｃ．Ｃａｎｎｉｆｆ，Ａｍａｒｎａｔｈ Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ｊｅｓｕｓ Ｇｏｍｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰ（二重標的結合ＡＢＰを含む）のＴＢＭが、標的の結合用に複数の活性部位（１、２、３またはそれより多いなど）を含む。これらの活性部位は、同一または異なるアミノ酸配列を有するものであってもよく、通常は、ＴＢＭの第１の活性部位の結合が、標的に対するＴＢＭの第２の活性部位の結合に実質的に干渉しないように、目的の標的上の異なる結合部位に結合するよう設計される。特定の実施形態では、活性部位はアミノ酸リンカー配列によって分離されている。複数の活性部位を含むＴＢＭを図１７〜図１９に概略的に示す。ＡＢＰはさらに、複数のＴＢＭ−ＭＭ「単位」を含むことが可能であり、これらの単位は、切断剤への曝露時に１つ以上のＴＢＭのマスクが外れるように任意に別のＣＭで分離されていてもよい。二重標的結合ＡＢＰは、複数のＴＢＭ１−ＴＢＭ２単位を含むことが可能であり、これらの単位は、二重標的結合ＡＢＰの「アーム」のいずれかに位置する１つ以上のＣＭで分離可能であって、同一または異なる切断剤で切断可能なものであってもよい。
特定の実施形態では、ＡＢＰのＴＢＭが２つ以上のＡＢＤを含有することが可能である。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは二重特異性抗体またはそのフラグメント由来のものであってもよい。他の実施形態では、ＡＢＰは、２つの異なる抗体またはそのフラグメント由来のＡＢＤを取り込むために合成的に改変されたものであってもよい。このような実施形態では、２つの異なる標的、同じ標的上の２つの異なる抗原または２つの異なるエピトープと結合するようＡＢＤを設計可能である。２つ以上の標的部位を結合できる複数のＡＢＤを含有するＴＢＭは通常、ＴＢＭの第１のＡＢＤの結合が、標的に対するＴＢＭの第２のＡＢＤの結合に実質的に干渉しないように、目的の標的上の異なる結合部位に結合するよう設計される。複数のＡＢＤを含有するＡＢＰはさらに、複数のＡＢＤ−ＭＭ「単位」を含むことが可能であり、これらの単位は、切断剤への曝露時に、ＡＢＤのマスクが外れるように任意に別のＣＭで分離されていてもよい。二重標的結合ＡＢＰは、複数のＡＢＤ１−ＡＢＤ２単位を含むことが可能であり、これらの単位は、二重標的結合ＡＢＰの「アーム」のいずれかに位置する１つ以上のＣＭで分離可能であって、同一または異なる切断剤で切断可能なものであってもよい。
総じて、本開示に企図されるＡＢＰは、通常は細胞外タンパク質標的である細胞外標的を結合できるＴＢＭを有するものである。しかしながら、細胞取り込みができ、細胞内で切り替え可能なよう設計されるように、ＡＢＰを設計することも可能である。
マスキング部分（ＭＭ）
ＡＢＰのマスキング部分（ＭＭ）は通常、未切断状態では、ＴＢＭの標的が存在する場合ですらＭＭが標的に対するＴＢＭの結合に干渉する、ＡＢＰに配置されたアミノ酸配列を示す。しかしながら、ＡＢＰが切断状態にあると、ＴＢＭの標的結合に対するＭＭの干渉が低減されることで、ＴＢＭが標的に到達しやすくなるとともに、標的が結合される。よって、ＭＭは、ＡＢＰが未切断であるときに、ＴＢＭを標的結合から「マスキング」するが、ＡＢＰが切断されたコンホメーションにあるときにはＴＢＭに対する標的の結合に実質的にまたは有意に干渉または拮抗しないものである。このように、ＭＭとＣＭの組み合わせによって「切り替え可能な」表現型が容易になり、ＡＢＰが未切断のときにはＭＭが標的の結合を抑え、プロテアーゼによるＣＭの切断によって標的の結合が増す。
ＭＭの構造的な特性は、標的に対するＴＢＭ結合への干渉に必要な最小アミノ酸配列、目的の標的タンパク質−ＴＢＭ結合対、ＴＢＭの長さ、ＣＭの長さ、ＣＭがＭＭ内にあるか否か、未切断のＡＢＰでＴＢＭを「マスク」する機能を果たすか否か、リンカーの有無、システイン−システインジスルフィド結合のＣＭを得るのに適したＴＢＭ内にあるまたはこれをフランキングするシステインの有無などの多岐にわたる要因に応じて変化する。
いくつかの実施形態では、ＭＭが共有結合によってＡＢＰにカップリングされる。このような一実施形態では、カップリングがＡＢＰのＣ末端へのものである。もうひとつの実施形態では、カップリングがＡＢＰの内部アミノ酸への架橋によるものである。もうひとつの実施形態では、ＡＢＰ組成物がＭＭをＡＢＰのＮ末端に結合することでマスクされる。さらにもうひとつの実施形態では、ＭＭとＡＢＰとの間のシステイン−システインジスルフィドブリッジによってＡＢＰがＭＭにカップリングされる。
ＭＭは、多岐にわたる異なる形態で提供可能なものである。たとえば、標的ＴＢＭ結合におけるＭＭの干渉を抑えるためにＣＭの切断後にＴＢＭが結合するよう設計された標的タンパク質よりも低親和性および／またはアビディティでＭＭがＴＢＭと結合するかぎり、ＭＭをＴＢＭの周知の結合相手になるよう選択可能である。言い方を変えると、上述したように、ＭＭは、ＡＢＰが未切断であるときに、ＴＢＭを標的結合から「マスクする」が、ＡＢＰが切断されたコンホメーションにあるときには標的の結合に実質的にまたは有意に干渉または拮抗しないものである。特定の一実施形態では、ＴＢＭおよびＭＭが、ＴＢＭおよびＭＭのうちの少なくとも１つが天然に生じる結合相手のメンバのアミノ酸配列を有さないような形で、天然に生じる一対の結合相手のアミノ酸配列を含有しない。特定の一実施形態では、ＴＢＭおよびＭＭが、ＴＮＦ−αの一対の結合相手、ＴＮＦ−αの結合相手として作用するＴＮＦ受容体の完全または部分細胞外ドメインあるいはその誘導体以外である。もうひとつの特定の実施形態では、ＴＢＭおよびＭＭが、ＴＮＦ−αの一対の結合相手、ＴＮＦ−αの結合相手として作用するウイルスＴ２タンパク質またはその誘導体以外である。もうひとつの特定の実施形態では、ＴＢＭおよびＭＭが、ＦａｓＬの一対の結合相手ならびに、ＦａｓＬの結合相手として作用するＦａｓ受容体またはその誘導体の完全または部分細胞外ドメイン以外である。もうひとつの特定の実施形態では、ＴＢＭおよびＭＭが、ＦａｓＬの一対の結合相手ならびに、ＦａｓＬの結合相手として作用するウイルスタンパク質またはその誘導体以外である。もうひとつの特定の実施形態では、ＴＢＭおよびＭＭが、ＦａｓＬの一対の結合相手ならびに、ＦａｓＬに対する結合親和性のある抗体またはそのフラグメント以外である。
たとえば、天然の結合相手ではないようにＴＢＭおよびＭＭを選択することも可能であり、この場合のＭＭは、たとえば、切断後にＭＭがＴＢＭ標的結合に実質的にまたは有意に干渉しないように、親和性および／またはＴＢＭへの結合のアビディティを少なくとも若干低下させるアミノ酸の変化を含むＴＢＭの修飾された結合相手であってもよい。ＡＢＰは、結合を容易にするアミノ酸配列が分かっている既知の結合相手に基づくものであってもよいため、このようなＭＭ−ＴＢＭ対の生成は当業者の技量の範囲内である。たとえば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ阻害剤の相互作用を容易にするアミノ酸配列が周知であり、本明細書に例示されている。
ＭＭは、さまざまなＭＭを有する候補ＡＢＰのライブラリからのスクリーニング手法で同定可能である。たとえば、ＴＢＭおよびＣＭを選択し、所望の酵素／標的の組み合わせを得ることができ、後述するスクリーニング手法によってＭＭのアミノ酸配列を同定し、切り替え可能な表現型を提供するＭＭを同定することが可能である。たとえば、本明細書に開示のスクリーニング方法でランダムペプチドライブラリ（約４から約４０アミノ酸またはそれより多いなど）を使用して、好適なＭＭを同定してもよい。ランダムペプチドライブラリはまた、ジスルフィド結合の形成を助け、コンホメーション的に制約された「環状」ＡＢＰ構造の形成を容易にするためのシステイン残基の標的導入との関連でも利用できる。
他の実施形態では、候補ＭＭからなるペプチド足場のライブラリを提供することを含むスクリーニング手法であって、各足場が膜貫通タンパク質および候補ＭＭで構成されるスクリーニング手法で、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）に特異的結合親和性のあるＭＭを同定することが可能である。次に、抗原結合ドメイン（目的の標的の結合もできる）を含有する全長抗体、天然に生じる抗体フラグメントまたは非天然型のフラグメントなどのＴＢＭの全体または一部とライブラリとを接触させ、検出可能な結合ＡＢＤを有する１つ以上の候補ＭＭを同定する。スクリーニングは、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）または蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を１回以上実施することを含み得る。
このようにして、未切断状態で標的に対するＴＢＭの結合を阻害し、切断状態では標的に対するＴＢＭの結合を可能にするＭＭを有するＡＢＰを同定可能であり、さらに切り替え可能な表現型の最適なダイナミックレンジを有するＡＢＰを選択できる。望ましい切り替え表現型を有するＡＢＰを同定するための方法については、下記において詳細に説明する。
あるいは、ＭＭがＴＢＭと特異的に結合せず、立体障害などの非特異的相互作用によってＴＢＭ−標的結合に干渉する形であってもよい。たとえば、折り畳まれたＡＢＰがゆえにＭＭが電荷に基づく相互作用によってＴＢＭを「マスク」でき、これによってＭＭをＴＢＭへの標的の到達に干渉する適所に保持するように、未切断のＡＢＰにＭＭを配置してもよい。
また、環状構造などのコンホメーション的に制約された構造でＡＢＰを提供し、切り替え可能な表現型を容易にすることも可能である。これは、システイン対間のジスルフィド結合の形成によってＡＢＰがループまたは環状構造になるよう一対のシステインをＡＢＰコンストラクトに含むことで達成可能である。こうすると、ＴＢＭへの標的結合を阻害しつつ、ＡＢＰは所望のプロテアーゼによって切断可能なままである。ＣＭの切断時、環状構造が「開き」、標的がＴＢＭに到達できるようになる。図６に、ＡＢＰの端（この場合、「端」はジスルフィド結合形成前の線形形態のＡＢＰを示す）またはその付近の領域にあるシステイン残基間のジスルフィド結合（点線で表示）によってコンホメーション的に制約された未切断のＡＢＰの概略をあげておく。このような環状ＡＢＰは、未切断のＡＢＰではＣＭから対応するプロテアーゼへの到達性が標的タンパク質結合に対するＴＢＭの到達性よりも大きいように、（後述するスクリーニング方法を用いるなどして）設計または最適化が可能である。ＴＢＭへの標的の到達は、ジスルフィド結合の還元後にも生じる場合がある点に注意されたい。
システイン対は、コンホメーション的に制約されたＡＢＰが得られるが、ＣＭ切断後、ＴＢＭへの標的結合に実質的にまたは有意に干渉しないのであれば、ＡＢＰのどの位置にあっても構わない。たとえば、システイン対のシステイン残基をＭＭと、ＭＭおよびＴＢＭあるいは他の好適なコンフィギュレーションによってフランクされたリンカーに配置する。たとえば、ＭＭまたはＭＭをフランキングするリンカーに１つ以上のシステイン残基を含むことが可能であり、ＡＢＰが折り畳まれた状態のときに、このシステイン残基がＭＭと対向して配置され、システイン残基がジスルフィドブリッジを形成する。通常、ＡＢＰの切断後に標的結合との干渉を回避するには、システイン対のシステイン残基がＴＢＭの外側にあると望ましい。ジスルフィド結合対象となるシステイン対のシステインがＴＢＭ内にある場合、還元剤への曝露後などの切断剤への曝露後にＴＢＭ−標的結合との干渉を回避するよう配置されると望ましい。
システイン間にジスルフィド結合による環状構造を形成できる例示としてのＡＢＰには、以下の一般式のものが可能である（ＮからＣ末端方向またはＣからＮ末端方向のいずれであってもよい）。
Ｘｎ１−（Ｃｙｓ１）−Ｘｍ−ＣＭ−ＴＢＭ−（Ｃｙｓ２）−Ｘｎ２
Ｘｎ１−シクロ［（Ｃｙｓ１）−Ｘｍ−ＣＭ−ＴＢＭ−（Ｃｙｓ２）］−Ｘｎ２
式中、
Ｘｎ１およびＸｎ２は独立に、任意に存在してもしなくてもよく、存在する場合は、独立にアミノ酸を示し、任意に、フレキシブルリンカーのアミノ酸配列（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐのうちの少なくとも１つ、通常はＧｌｙまたはＳｅｒのうちの少なくとも１つ、通常は少なくとも１つのＧｌｙなど）を含むものであってもよく、ｎ１およびｎ２は独立に、ｓゼロまたは任意の整数から選択され、通常は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下であり、
Ｃｙｓ１およびＣｙｓ２は、ジスルフィド結合を形成できる対の第１および第２のシステインを表し、
Ｘｍは、マスキングモチーフ（ＭＭ）のアミノ酸を表し、Ｘは任意のアミノ酸であり、式中、Ｘｍは任意に、フレキシブルリンカー（少なくとも１つのＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、通常は少なくとも１つのＧｌｙまたはＳｅｒ、通常は少なくとも１つのＧｌｙなど）を含むことが可能であり、この場合のｍは１よりも大きく、通常は２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも大きい整数（上述のとおり）であり、
ＣＭは切断可能部分（本明細書に記載のとおり）を表し、
ＴＢＭは標的結合部分（本明細書に記載のとおり）を表す。
上記の式で使用する場合、「シクロ」は、ＡＢＰの環状構造を提供するＡＢＰのジスルフィド結合を示す。さらに、上記の式は、「ＭＭ」がＴＢＭ１、「ＴＢＭ」がＴＢＭ２を示す二重標的結合ＡＢＰを企図し、この場合のＴＢＭ１およびＴＢＭ２は第１および第２のＴＢＭを任意に示しただけのものであり、この場合、ＴＢＭと結合できる標的が同一の標的であっても異なる標的であってもよく、同じ標的の同一の結合部位であっても異なる結合部位であってもよい。このような実施形態では、ＴＢＭ１および／またはＴＢＭ２が、未切断の二重標的結合ＡＢＰに対する標的結合に干渉するためのマスキング部分として作用する。
先に示したように、システインはこうしてＡＢＰに配置可能であり、ＡＢＰがジスルフィド結合構造にある（よって、コンホメーション的に制約された状態である）場合に、１つまたは２つの「尾」を許容（上記のＸｎ１およびＸｎ２で表される）し、これによって「ラッシ」または「オメガ」構造を生成する。尾のアミノ酸配列によって、ＡＢＰの局在化を容易にするための標的受容体に対する結合などのＡＢＰの別の特徴を得ることも可能である。
たとえば、ＴＢＭとして例示としてのＶＥＧＦバインダーを含有するＡＢＰでは、ＴＢＭがアミノ酸配列ＮＦＧＹＧＫＷＥＷＤＹＧＫＷＬＥＫＶＧＧＣ：配列番号１０を含むことが可能であり、対応するＭＭがアミノ酸配列ＰＥＷＧＣＧ：配列番号１１を含む。その他の具体例については、下記の実施例のセクションにあげておく。
特定の具体的な実施形態では、ＭＭがＡＢＰの細胞侵入を阻害しない。
切断可能部分（ＣＭ）
ＡＢＰの切断可能部分（ＣＭ）は、通常は細胞外プロテアーゼ（すなわち細胞内プロテアーゼ以外）であるプロテアーゼの基質として機能し得るアミノ酸配列を含むものであってもよい。任意に、ＣＭは、ジスルフィド結合を形成できるシステイン−システイン対を含むが、これは還元剤の作用で切断可能である。ＣＭは、標的の存在下でＣＭが切断剤で切断されて（ＣＭのプロテアーゼ基質がプロテアーゼで切断されるおよび／またはシステイン−システインジスルフィド結合が還元剤への曝露による還元で破壊されるなど）切断状態になると、ＴＢＭが標的と結合し、未切断状態では標的が存在しても標的に対するＴＢＭの結合がＭＭによって阻害されるように、ＡＢＰに配置される。ＣＭのアミノ酸配列は、ＡＢＰが未切断のコンホメーションにあるときに、ＣＭの全体または一部がＴＢＭの「マスキング」を容易にするように、ＭＭと重なるものであってもよいし、ＭＭ内に含まれるものであってもよい旨に注意されたい。
上述したように、ＣＭは、所望のＡＢＰの標的のＴＢＭとともに組織内に共存するプロテアーゼに基づいて選択できるものである。目的の標的がプロテアーゼと共存する多岐にわたる異なる条件が周知であり、この場合のプロテアーゼの基質は従来技術において周知である。たとえば、標的組織が癌性組織、特に固体腫瘍の癌性組織の可能性がある。文献には固体腫瘍などの多数の癌で周知の基質を有するプロテアーゼのレベル増大についての多くの報告がなされている。たとえば、Ｌａ Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９０（７）：１４１４〜１４２１を参照のこと。さらに、ＶＥＧＦなどの抗血管新生標的も周知である。それ自体、ＶＥＧＦなどの抗血管新生標的と結合できるようにＡＢＰのＴＢＭが選択される場合、好適なＣＭは、癌性治療部位に存在し、特に非癌性組織と比較して高いレベルで癌性治療部位に存在するプロテアーゼで切断可能なペプチド基質を含むものであろう。たとえば、ＡＢＰのＴＢＭには、ＶＥＧＦと結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）が可能であり、ＣＭには、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質が可能であり、よってＭＭＰで切断可能である。
例示としての基質には、以下の酵素すなわち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、ＰＬＡＳＭＩＮ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、ＴＡＣＥ１つ以上で切断可能な基質があげられるが、これに限定されるものではない。
上記に代えてまたは上記に加えて、ＡＢＰのＴＢＭはＶＥＧＦと結合するものであればよく、ＣＭはシステイン対のジスルフィド結合を伴い得るものであり、よって、たとえば、固体腫瘍の組織またはその周辺の組織に大量に存在し得る、グルタチオン（ＧＳＨ）、チオレドキシン、ＮＡＤＰＨ、フラビン、アスコルビン酸塩などの細胞還元剤などの還元剤で切断可能である。
例示としてのＡＢＰ
特定の実施形態では、ＡＢＰは、ＴＢＭ、ＣＭ、ＭＭを含む活性化可能な抗体または活性化可能な抗体フラグメントである。このような実施形態では、ＴＢＭは、ＡＢＤまたはＡＢＤフラグメントを含む。非限定的な例示としての活性化可能な抗体組成物として、ＭＭＰ−９活性化可能な、マスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ、ＭＭＰ−９活性化可能な、マスクされた抗ＶＣＡＭ ｓｃＦｖ、ＭＭＰ−９活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４があげられる。これらは単に一例としてあげたものにすぎず、このような酵素活性化可能なマスクされた抗体ＡＢＰは、表２に列挙したようなものであるがこれに限定されるものではない、任意の抗体を用いて、表１に列挙したようなものであるがこれに限定されるものではない、任意の標的に対して設計可能である。
ＡＢＰを同定および／または最適化するための方法および組成物
ＡＢＰを同定および／または最適化するための方法ならびに、このような方法で有用な組成物については、後述する。
複製可能な生命体で提示されるＡＢＰまたは候補ＡＢＰのライブラリ
総じて、切り替え可能な表現型についてＡＢＰを同定するおよび／またはＡＢＰを最適化するためのスクリーニング方法には、表面に複数の異なる候補ＡＢＰを提示する（細胞で例示されるような）複製可能な生命体のライブラリの生成を伴う。ライブラリを生成したら、これらのライブラリにスクリーニング方法を適用し、ＡＢＰの１つ以上の所望の特徴を有する候補ＡＢＰを同定することが可能である。
候補ＡＢＰライブラリは、ＭＭ、リンカー（ＭＭの一部であってもよい）、ＣＭ（ＭＭの一部であってもよい）、ＴＢＭのうちの１つ以上が異なる候補ＡＢＰを含み得る。上述したように、ＡＢＰは、目的の症状についての周知のプロテアーゼ−標的対を標的するよう設計される。よって、一般に、ライブラリの候補ＡＢＰは、ＴＢＭおよびＣＭを事前に選択してＭＭおよび／またはリンカーごとに可変である。ＡＢＰでジスルフィド結合を提供するためのシステイン残基の対をＡＢＰに含むのであれば、ＡＢＰでのシステインの相対位置も可変である。
スクリーニング用のライブラリは通常、表面に異なる候補ＡＢＰを提示する複製可能な生命体のライブラリとして提供される。たとえば、候補ＡＢＰのライブラリは、複製可能な生命体の個体群の表面に提示される候補となる複数のＡＢＰを含み得るものであり、候補となる活性化可能な結合ポリペプチドの前記複数の各メンバが、（ａ）標的結合部分（ＴＢＭ）と、（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）と、（ｃ）候補マスキング部分（候補ＭＭ）とを含み、未切断状態で候補ＭＭが標的に対するＴＢＭの結合を阻害し、切断状態で標的に対するＴＢＭの結合を可能にする機能を判断できるように、ＴＢＭ、ＣＭおよび候補ＭＭが配置されている。
好適な複製可能な生命体としては、細胞（細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅなど）、哺乳類細胞など）、バクテリオファージ、ウイルスがあげられる。細菌宿主細胞およびバクテリオファージ、特に細菌宿主細胞が注目される。
複製可能な生命体の表面での候補ＡＢＰの提示
複製可能な生命体を用いるさまざまな提示技術が従来技術において周知である。これらの方法および実体として、ｍＲＮＡおよびリボソーム提示、真核生物ウイルス提示ならびに、細菌、酵母、哺乳類細胞表面提示などの提示方法論があげられるが、これに限定されるものではない。Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２００１ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８（７）：３７５０〜３７５５；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｏ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３１２；Ｂｕｐｐ，Ｋ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｒｏｔｈ（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（３）：３２９ ３５１３；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：２９ ３４１４；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ａｎｄ Ｋ．Ｄ．Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（６）：５５３ ５５７を参照のこと。表面提示方法は、ライブラリ解析およびスクリーニングに蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を適用できるため魅力的である。Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３（１ ２）：２１１ ２７１６；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．（２０００）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．５５：２９３ ３１５；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７（５）：２０２９ ３４１８；Ｏｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０：３２９ ３４２；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７（２０）：１０７０１ １０７０５；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１（１９）：９０２２ ９０２６；Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０（２）：１１７ １２２を参照のこと。目的の生物標的に結合可能なペプチドを同定するのに使用できる別の提示方法論が、米国特許第７，２５６，０３８号明細書に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
ファージ提示には、バクテリオファージ粒子のｐＩＩＩ、ｐＩＩＶなどのコートタンパク質への末端融合物としてのペプチドの局在化を伴う。Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（４９６７）：３８６ ３９０；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（４５）：１０８３２ １０８３８を参照のこと。一般に、特定の結合機能を有するポリペプチドは、標的とともにインキュベートし、非結合ファージを洗い流し、結合したファージを溶出した後、細菌の新鮮な培養に感染させてファージ個体群を再増幅することで単離される。
例示としてのファージ提示および細胞提示組成物ならびに方法が、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第７，１１８，８７９号明細書、同第６，９７９，５３８号明細書、同第７，２０８，２９３号明細書、同第５５７１６９８号明細書、同第５，８３７，５００号明細書に記載されている。
別の例示としての提示足場および方法として、２００７年３月２２日公開の米国特許出願公開第２００７／００６５８７８号明細書に記載されているものがあげられる。
任意に、提示足場にプロテアーゼ切断部位（ＣＭのプロテアーゼ切断部位とは異なる）を含み、ＡＢＰまたは候補ＡＢＰを宿主細胞の表面から切断できるようにすることも可能である。
ひとつにおいて、複製可能な生命体が細菌細胞である場合、好適な提示足場は、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（２００６）１５：８２５〜８３６に記載された円順列変異大腸菌（Ｅｓｃｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）外膜タンパク質ＯｍｐＸ（ＣＰＸ）を含む。２００７年８月１４日に発行された米国特許第７，２５６，０３８号明細書も参照のこと。
ＡＢＰおよび候補ＡＢＰをコードするコンストラクト
本開示はさらに、ＡＢＰおよび／または候補ＡＢＰをコードする配列を含む核酸コンストラクトを提供するものである。好適な核酸コンストラクトは、原核生物または真核生物の細胞を発現できるコンストラクトを含むが、これに限定されるものではない。発現コンストラクトは通常、これを使用することになる宿主細胞と適合するように選択される。
たとえば、ＡＢＰコードＤＮＡまたは候補ＡＢＰコードＤＮＡを複製および／または宿主細胞での発現を実現するためのプラスミドをはじめとして、非ウイルスおよび／またはウイルスコンストラクトベクターを調製および使用してもよい。どのベクターを選択するかは、増殖が望ましい細胞のタイプや増殖の目的に左右されることになる。所望のＤＮＡ配列を大量に増幅および作製するには、特定のコンストラクトが有用である。培養内での細胞の発現には、他のベクターも適している。適切なベクターの選択肢は当業者の技量の範囲内である。このようなベクターの多くが市販されている。コンストラクトを生成するための方法は、従来技術において周知の方法を用いて実現可能である。
宿主細胞での発現を達成するために、ＡＢＰまたは候補ＡＢＰをコードするポリヌクレオチドを制御配列に適宜作動的に結合し、所望の発現特性を得やすくする。これらの制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、誘導物質があげられる。発現コンストラクトも一般に、必要あるいは要望があれば、誘導的または構成的であってもよい転写開始領域および翻訳開始領域となり、この場合のコード領域は、転写開始領域ならびに、転写終結領域および翻訳終結領域の転写制御下で作動的に結合される。これらの制御領域は、核酸を入手した種にとってネイティブであってもよいし、外来起源由来のものであってもよい。
プロモーターは、構成的であっても制御可能であってもよい。状況によっては、誘導型プロモーターなどの条件的活性プロモーター（温度感受性プロモーターなど）を用いると望ましいことがある。誘導的要素は、プロモーターと連動して作用するＤＮＡ配列要素であり、リプレッサー（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃＯ／ＬＡＣ Ｉｑリプレッサー系など）または誘導物質（酵母のｇａｌ１／ＧＡＬ４誘導物質系など）と結合できる。このような場合、プロモーターが抑制解除または誘導されるまで転写は事実上「遮断」され、抑制解除または誘導の時点で転写が「開始」される。
発現コンストラクトをはじめとするコンストラクトは、たとえば目的のコンストラクトを含有する宿主細胞を成長させやすくするために宿主で作動的な選択可能なマーカーも含むことが可能である。このような選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの形質転換宿主細胞選択用の表現型形質または真核生物細胞培養のネオマイシン耐性を提供できるものである。
発現コンストラクトには、ＡＢＰおよび／または候補ＡＢＰをコードする核酸配列を挿入および除去するための便利な制限部位を含み得る。上記に代えてまたは上記に加えて、発現コンストラクトには、目的のＡＢＰ−コード配列の核酸増幅（ＰＣＲベースの増幅など）を容易にするためのプライマーの基礎として機能できるフランキング配列を含み得る。
発現の目的に応じて、上述した発現系を従来の方法で原核生物または真核生物に使用してもよい。いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの単細胞生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞あるいは、脊椎動物などの高等生物の細胞、たとえばＣＯＳ ７細胞、ＨＥＫ ２９３、ＣＨＯ、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞などを発現宿主細胞として用いてもよい。これらのクラスおよびタイプの宿主細胞それぞれについての発現系が従来技術において周知である。
複製可能な生命体に提示されるＡＢＰまたは候補ＡＢＰのライブラリの作製方法
本開示は、本明細書に記載のＡＢＰおよび／または候補ＡＢＰのライブラリの作製方法を企図する。
一実施形態では、ＡＢＰライブラリおよび／または候補ＡＢＰライブラリの作製方法が、（ａ）複数のＡＢＰおよび／または候補ＡＢＰをコードする、本明細書に記載するような一組の組換えＤＮＡベクターを構成し、（ｂ）ステップ（ａ）のベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｃ）ステップ（ｂ）で形質転換した宿主細胞を融合ポリペプチドに発現および提示に適した条件下で培養することを含む。
候補ＡＢＰをコードする核酸配列の生成
スクリーニング方法で用いる候補ＡＢＰの生成は、従来技術において周知の方法を用いて実現可能である。ポリペプチド提示、単鎖抗体提示、抗体提示、抗体フラグメント提示は、従来技術において周知の方法である。総じて、候補ＡＢＰライブラリで変更の対象となるＭＭなどのＡＢＰの要素をランダム化用に選択する。ライブラリの候補ＡＢＰを完全にランダム化してもよいし、ヌクレオチド／残基頻度などのランダム化に、全体的または要素内のアミノ酸の位置で偏らせてもよい。「ランダム化」とは、ランダム化したアミノ酸配列のどの位置でも遺伝的にコード可能なアミノ酸を提供可能であることを意味する。最適化対象となるＡＢＰの要素のアミノ酸配列も部分的にランダム化可能である。たとえば、選択した位置でアミノ酸のサブセットだけを提供する（アミノ酸配列の選択した位置でフレキシブルリンカーを提供する、所望の特徴のアミノ酸残基を提供する（たとえば疎水性、極性、正に荷電、負に荷電など）ように、ＡＢＰ要素（候補ＭＭなど）を部分的にランダム化することが可能である。もうひとつの例では、別の方法でランダム化されたアミノ酸配列内の１つ以上の残基が、ＡＢＰライブラリメンバの個体群または部分母集団から選択され、不変のものとして保持されるように（候補ＭＭ内の所望の位置でシステインが得られるようになど）、ＡＢＰ要素（候補ＭＭなど）を部分的にランダム化することが可能である。
ＡＢＰが二重標的結合ＡＢＰである場合、第１のＴＢＭを「固定」してもよく、周知の標的結合活性を有する第２のＴＢＭについては、未修飾の形態（周知の標的結合活性を有するネイティブなアミノ酸配列など）で提供してもよいし、「切り替え可能な」表現型を提供するにあたって修飾（定方向またはランダム突然変異誘発によるなど）して活性をスクリーニングしてもよい。スクリーニング方法で同定したＴＢＭを同定後に目的の標的を結合する活性を見極め、たとえば「マスキング」ＴＢＭが所望のレベルの標的結合を保つか否かを判断することが可能である。
このような方法を使用して、変更対象となる要素のアミノ酸配列の長さ方向全体に考えられるさまざまな異なるアミノ酸配列の組み合わせを有する候補ＡＢＰを生成し、こうしてランダム化候補ＡＢＰのライブラリを提供できる。それ自体、いくつかの実施形態では、要素の任意の位置における配列の優先度または定数を最適化することなく、候補ＡＢＰのライブラリを完全にランダム化することが可能である。他の実施形態では、候補ペプチドのライブラリに偏らせる。すなわち、配列内の何らかの位置を一定に保つか、限られた数の可能性から選択する。たとえば、一実施形態では、疎水性アミノ酸、親水性残基、架橋用にシステインが生成されるよう立体的に偏らせた（小さいまたは大きい）残基、ＳＨ−３ドメイン用のプロリン、セリン、トレオニン、チロシンまたはリン酸化部位用のヒスチジンあるいは、プリンに対してなどの定義されたクラス内で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基をランダム化する。
活性化可能な結合ポリペプチドのスクリーニング方法
本開示は、酵素的に活性化されたＡＢＰ、還元剤感受性のＡＢＰあるいは、酵素的活性化または還元ベースの活性化のいずれかまたは両方で活性化可能なＡＢＰが可能なＡＢＰを同定する方法を提供するものである。大まかに、この方法は、候補となる複数のＡＢＰと、ＡＢＰのＴＢＭと結合できる標的およびＡＢＰのＣＭを切断できるプロテアーゼとを接触させ、プロテアーゼへの曝露時に標的に結合する前記複数のメンバの第１の個体群を選択し、プロテアーゼの非存在下で前記第１の個体群を標的と接触させ、プロテアーゼの非存在下で標的と結合するメンバを前記第１の個体群から除外することで、前記第１の個体群からメンバの第２の個体群を選択することを含み、前記方法は、プロテアーゼの存在下での標的結合と比較して、プロテアーゼの非存在下で標的に対する結合が低下する候補ＡＢＰを選択できるものである。
総じて、所望の切り替え可能な表現型を有する候補ＡＢＰをスクリーニングするための方法は、（プロテアーゼへの曝露後に標的と結合するメンバを同定するための）ポジティブスクリーニングステップと、（プロテアーゼに曝露されないときに標的と結合しないメンバを同定するための）ネガティブスクリーニングステップで達成される。ネガティブスクリーニングステップは、たとえば、プロテアーゼの非存在下で標的と結合するメンバを個体群から除外することで達成可能である。本明細書に記載のライブラリのスクリーニング方法は、まずはネガティブスクリーニングを実施して、酵素処理の非存在下で標識された標的と結合しない（すなわち未切断時に標識された標的と結合しない）候補を選択し、続いてポジティブスクリーニング（すなわち、酵素で処理して、切断状態で標識された標的と結合するメンバを選択）を実施することで開始できるものである点に注意されたい。しかしながら、便宜上、以下では第１のステップとしてのポジティブ選択についてスクリーニング方法を説明する。
フローサイトメトリーを用いてポジティブスクリーニングステップとネガティブスクリーニングステップを適宜実施し、検出可能に標識された標的の結合に基づいて候補ＡＢＰを選別することが可能である。たとえば、図１８の概略に示すように、プロテアーゼによる切断に感受性のあるＣＭを有する候補ＡＢＰ（図１８に例示するものなど）を、提示足場（ＣＰＸで例示）にて宿主細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）で発現させることが可能である。候補ＡＢＰを提示している宿主細胞を、ＣＭを切断できるプロテアーゼに曝露し、ＴＢＭと結合できる、検出可能に標識された標的に曝露する。図１８右側の下側パネルに示すように、ＦＡＣＳを使用して検出可能に標識された標的の検出可能なシグナルの強度（赤色蛍光で例示）に応じて細胞を選別する。検出可能に標識された細胞は、細胞表面に存在し、プロテアーゼで切断可能なＣＭを含み、かつ、検出可能に標識された標的に結合された候補ＡＢＰを提示している細胞を含む。未標識の部分母集団（または相対的に検出可能なシグナルが低めの個体群）は、望ましいレベルで標的と結合できなかった宿主細胞を表す。次に、「標識された」部分母集団を回収し、プロテアーゼの非存在下で候補ＡＢＰを検出可能に標識された標的に曝露するネガティブスクリーニングを実施ことが可能である。図１８右側の上側パネルで例示したように、未標識の細胞は、個体群の他のメンバに比して検出可能に標識された標的の検出可能な結合が比較的少なめであるかまったくない、自らの表面で候補ＡＢＰを示す細胞を含む。検出可能に標識された細胞は、切断の非存在下で標的と結合する候補ＡＢＰを提示している細胞を含む。こうして、「未標識の」部分母集団を回収し、必要があれば、さらに回数を重ねてスクリーニングを実施することが可能である。
１「回」または「サイクル」のスクリーニング手順には、ポジティブ選択ステップとネガティブ選択ステップの両方を含む。複数のサイクル（完全サイクルと、１．５サイクル、２．５サイクルなどの部分サイクルを含む）を実施するライブラリでは、この方法を繰り返せばよい。このようにして、得られる個体群で、ＡＢＰの切り替えの特徴を呈する候補となる複数のＡＢＰのメンバを富化させることができる。
総じて、まずは提示足場にて候補となる複数のＡＢＰをコードする核酸ライブラリを生成し、これを複製可能な生命体の表面での発現用に提示足場に導入することで、スクリーニング方法を実施する。本明細書で使用する場合、「複数の候補となる活性化可能な結合ポリペプチド」または「複数の候補ＡＢＰ」とは、候補ＡＢＰをコードするアミノ酸配列を有する複数のポリペプチドを示し、この場合、複数が、ＭＭ、ＣＭまたはＴＢＭ、通常はＭＭのアミノ酸配列に関して可変であるなど、複数のメンバがＡＢＰの少なくとも１つの成分のアミノ酸配列に関して可変である。
たとえば、候補ＡＢＰのＴＢＭおよびＣＭを「固定」に保ち、ライブラリの候補ＡＢＰがＭＭのアミノ酸配列に関して可変である。以下、ＭＭの可変のアミノ酸配列を候補マスキング部分（候補ＭＭ）と呼ぶ。図１９に示すように、異なるＭＭを有するライブラリを生成することが可能であり、これは、たとえばシステイン残基を配置して、候補ＡＢＰに存在する別のシステイン（他の方法で完全にまたは少なくとも部分的にランダム化されたアミノ酸配列を有するＭＭを提供するよう選択される他の残基）とのジスルフィド結合の形成を「強制」するよう設計されるＭＭを有する候補ＡＢＰを含み得るものである。もうひとつの例では、候補ＡＢＰでの別のシステイン（他の方法で完全にまたは少なくとも部分的にランダム化されたアミノ酸配列を有するＭＭを提供するよう選択される他の残基）とのジスルフィド結合形成が望ましいようにシステイン残基を配置するよう設計されるＭＭを有する候補ＡＢＰを含む形でライブラリを生成することが可能である。もうひとつの例では、ＭＭが完全にランダム化されたアミノ酸配列を含む候補ＡＢＰを含む形でライブラリを生成することが可能である。このようなライブラリは、これらの基準のうち１つ以上によって設計された候補ＡＢＰを含み得る。本明細書に記載の方法による前記複数のメンバをスクリーニングすることによって、所望の切り替え可能な表現型を提供する候補ＭＭを有するメンバを同定することが可能である。
「候補」という用語は、たとえば「候補ＡＢＰ」または「候補ＭＭ」（あるいはスクリーニング対象となるＡＢＰの他の要素）などの文脈で使用する場合、所望の構造的および／または機能的特徴を呈するか否かを判断するためのスクリーニング対象となるポリペプチドを示す。たとえば、「候補ＡＢＰ」は、ＭＭ、ＣＭ、ＴＢＭ、リンカーのうちの少なくとも１つがそのアミノ酸配列に関して可変である場合を除いて、本明細書に記載したようなＡＢＰの構造に似るよう設計されるポリペプチドを示し、ここで、候補ＡＢＰは、所望の切り替え可能な表現型についてスクリーニングされる。「候補ＭＭ」は、たとえば、ＡＢＰとの関連でマスキング部分としての機能についてのスクリーニング対象となるＡＢＰのアミノ酸配列を示す。
方法の一実施形態では、候補となる複数のＡＢＰの各メンバが、複製可能な生命体（ここでは細菌細胞で例示）の表面に提示される。複数のメンバが候補ＡＢＰのＣＭを切断できるプロテアーゼに曝露され、候補ＡＢＰのＴＢＭの結合相手である標的と接触される。プロテアーゼへの曝露後に標的と結合するＴＢＭを含むメンバを提示している細菌細胞を、標的結合の検出（標的−ＴＢＭ複合体の検出など）によって同定および／または分離する。次に、（ＣＭの切断につながり得る）プロテアーゼ曝露後に標的と結合するＴＢＭを含むメンバを、プロテアーゼの非存在下で標的と接触させる。切断の非存在下で標的に対する結合が低下または検出不能であるＴＢＭを含むメンバを提示している細菌細胞を、結合標的のない細胞の検出によって同定および／または分離する。このようにして、切断状態で標的と結合し、未切断状態では標的結合が低下または検出不能である候補となる複数のＡＢＰのメンバを同定および／または選択する。
上述したように、候補ＡＢＰライブラリは、ＭＭ、ＣＭ、ＴＢＭのうちの１つ以上について切り替え可能な表現型を最適化するなど、ＡＢＰコンストラクトの１つ以上の態様をスクリーニングするよう構築可能である。ＡＢＰの１つ以上の他の要素を変化させて、最適化しやすくすることが可能である。たとえば、切断剤（酵素など）の非存在下にてＡＢＰの異なるコンホメーションの特徴を提供できるシステインまたは他の残基の数または位置を変えることをはじめとして、ＭＭを変化させる：１つ以上の所望の特徴（酵素切断の特異性など）について最適化される基質を同定するようＣＭを変化させる；および／または「切り替え可能な」標的結合が最適化されるようＴＢＭを変化させる。
総じて、候補ＡＢＰライブラリの要素は、目的の標的タンパク質に応じて選択される。この場合、ＡＢＰはＣＭを切断する切断剤（酵素など）の存在下で標的の結合を増すよう活性化される。たとえば、ライブラリメンバの中でＣＭおよびＴＢＭを「固定」に保つ場合、目的の標的と共存する切断剤（酵素など）によって切断可能なようにＣＭを選択する。この場合、目的の標的はＴＢＭの結合相手である。このようにして、適切な生物学的条件下、ひいては生物学的に適切な場所で、ＡＢＰを選択的に活性化されるよう選択可能である。たとえば、抗血管新生化合物として使用され、ＶＥＧＦ結合に対して切り替え可能な表現型を呈するＡＢＰを開発すると望ましい場合、候補ＡＢＰのＣＭをＶＥＧＦと共存する酵素の基質および／または還元剤になるよう選択する（ＣＭがマトリクス−メタロプロテアーゼによって切断可能であるなど）。
上述したように、ＴＢＭは通常、目的の標的に応じて選択される。多くの標的が従来技術において周知である。目的の生物学的標的は、疾患において何らかの役割を果たすものとして同定されたタンパク質標的を含む。このような標的としては、細胞表面レセプターおよび分泌結合タンパク質（成長因子など）、可溶性酵素、構造的タンパク質（コラーゲン、フィブロネクチンなど）などがあげられるが、これに限定されるものではない。例示としての非限定的な標的を表１にあげておくが、他の好適な標的も当業者であれば容易に同定可能である。また、目的の標的と共存する多くのプロテアーゼが従来技術において周知である。それ自体、当業者であれば、上記の方法で用いるのに適切な酵素および酵素基質を容易に同定できよう。
ＡＢＰスクリーニング前の細胞表面提示の任意の富化
スクリーニング方法の前に、細胞表面で適切なペプチド提示足場を発現する細胞を富化すると望ましいことがある。任意の富化によって、（１）細胞外膜でペプチド提示足場を発現しない、あるいは（２）細胞外膜で非機能的ペプチド提示足場を発現する細胞ライブラリから細胞を除去できる。「非機能的」とは、停止コドンまたは欠失変異の結果などでペプチド提示足場が候補ＡＢＰを適切に提示しないことを意味する。
細胞の富化は、細胞個体群を増殖し、ペプチド提示足場の発現を誘導することで達成できる。次に、たとえば、足場に取り込んだ検出可能なシグナルまたは部分の検出に基づいて、あるいは提示足場またはＡＢＰの共通の部分に結合する検出可能に標識した抗体を用いて、細胞を選別する。これらの方法は、２００７年３月２２日公開の米国特許出願公開第２００７／００６５８７８号明細書に詳細に記載されている。
切断されたＡＢＰによる標的結合のスクリーニング
スクリーニング前に、（好適な条件下での好適な培地での成長によるなど）候補ＡＢＰライブラリを拡大することができる。任意の拡大後、あるいは初期ステップとして、ライブラリに第１のスクリーニングをほどこしてプロテアーゼへの曝露後に標的と結合する候補ＡＢＰを同定する。したがって、本明細書ではこのステップを「ポジティブ」選択ステップと呼ぶことが多い。
プロテアーゼ切断後に標的と結合するメンバを同定するために、候補ＡＢＰライブラリを、十分な長さの時間、ＣＭのプロテアーゼ基質の切断に適した条件下で、提示された候補ＡＢＰのＣＭを切断できるプロテアーゼと接触させる。多岐にわたるプロテアーゼ−ＣＭの組み合わせが、当業者により容易に確認できるであろうが、この場合のプロテアーゼは、ＣＭを切断でき、ｉｎ ｖｉｖｏにて目的の標的（ＴＢＭの結合相手）と共存するものである。たとえば、目的の標的が固体腫瘍関連の標的（ＶＥＧＦなど）である場合、好適な酵素としては、たとえば、マトリクス−メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−２など）、Ａディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）／トロンボスポンジン様モチーフを有するＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、カテプシン、カリクレインがあげられる。本明細書に記載のＡＢＰにおけるＣＭとして有用な基質のアミノ酸配列が従来技術において周知であり、望ましい場合、これをスクリーニングして、本明細書に記載の方法に手を入れてＣＭとして使用するのに適した最適な配列を同定することが可能である。例示としての基質には、以下の酵素すなわち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、ＰＬＡＳＭＩＮ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、ＴＡＣＥのうちの１つ以上で切断可能な基質を含み得るが、これに限定されるものではない。
候補ＡＢＰライブラリも、十分な長さの時間、標的結合に適した条件下で、標的に曝露される。この条件については、ＴＢＭに対する標的結合が想定されるよう条件に応じて選択可能である。プロテアーゼと標的の両方が同一の環境に存在する、想定されるｉｎ ｖｉｖｏの状況を最適にモデル化するために、（切断されたＡＢＰを含む候補ＡＢＰの個体群を提供するなど）標的への曝露前あるいは、標的への曝露との組み合わせ（通常は後者である）で、候補ＡＢＰライブラリをプロテアーゼに曝露することができる。プロテアーゼと標的の両方に曝露後、ライブラリをスクリーニングして、結合標的を有するメンバを選択するが、これは候補ＡＢＰを標的ＴＢＭ複合体の形で含むものである。
標的結合候補ＡＢＰの検出を多岐にわたる方法で達成可能である。たとえば、標的を検出可能に標識でき、検出可能な標識を検出することで標的結合候補ＡＢＰの第１の個体群を選択して、結合標的を有する第２の個体群を生成できる（標的結合候補ＡＢＰのポジティブ選択など）。
プロテアーゼ切断の非存在下では標的と結合しない候補ＡＢＰのスクリーニング
（好適な条件下での好適な培地での成長によるなど）プロテアーゼへの曝露後の標的結合用に選択される候補ＡＢＰの個体群を拡大することが可能であり、拡大後のライブラリに第２のスクリーニングをほどこして、プロテアーゼ曝露の非存在下で標的に対する検出可能な結合が低下または認められないメンバを同定する。この第２のスクリーニングで得られた個体群には、未切断では標的を有意にまたは検出可能なレベルで結合しない候補ＡＢＰが含まれることになる。したがって、本明細書ではこのステップを「ネガティブ」選択ステップと呼ぶことが多い。
第１のスクリーニングで得られた個体群をプロテアーゼの非存在下で十分な長さの時間、標的結合に適した条件下で標的と接触させるが、この条件はＴＢＭへの標的結合が想定される条件下で選択可能なものである。次に、ネガティブ選択を実施して、検出可能な標的結合を呈さないものなどの標的結合が比較的少ない候補ＡＢＰを同定することが可能である。この選択については、たとえば、検出可能に標識された標的を使用して標的曝露個体群をフローサイトメトリー分析し、検出可能な標的結合を呈さないおよび／または比較的低めの検出可能なシグナルを呈する候補ＡＢＰを提示する細胞の別々の部分母集団に選別することで達成可能である。このように、上記の部分母集団は、切断の非存在下で標的への結合が少ないまたは検出不能である候補ＡＢＰを有する細胞が富化されたものである。
検出可能な標識
本明細書で使用する場合、「標識」、「検出可能な標識」、「検出可能な部分」という表現は同義に用いられ、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、発色団、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテンなど）などを含むがこれに限定されるものではない、検出できる分子を示す。「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を呈することのできる物質またはその一部を示す。標的標識として用いるのに適した例示としての検出可能な部分には、親和性タグおよび蛍光タンパク質がある。
「親和性タグ」という用語は、本明細書で使用する場合、親和性タグと結合して検出可能なシグナル（蛍光化合物またはタンパク質など）を提供する分子を用いて検出可能な標的と結合可能なペプチドセグメントを示す。原理上、抗体または他の特異的結合剤を利用できるものであれば、どのようなペプチドまたはタンパク質でも親和性タグとして使用可能である。使用するのに適した例示としての親和性タグとしては、単球アダプタータンパク質（ＭＯＮＡ）結合ペプチド、Ｔ７結合ペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチド、ポリヒスチジントラクト、タンパク質Ａ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５（１９８５）；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３（１９９１））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性タグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７９５２（１９８５））、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧペプチド（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８））または他の抗原エピトープまたは結合ドメインがあげられるが、これに限定されるものではない。概要については、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５（１９９１）を参照のこと。親和性タグをコードするＤＮＡ分子を供給業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．など）から入手可能である。
従来技術において周知のどのような蛍光ポリペプチド（本明細書では蛍光標識とも呼ぶ）であっても、検出可能な部分としてあるいは、本明細書に記載のペプチド提示足場の親和性タグとともに用いるのに適している。好適な蛍光ポリペプチドは、細菌細胞または哺乳類細胞などの所望の宿主細胞で発現可能であって、定性的（ポジティブ／ネガティブ）および定量的（蛍光の比較度）に評価できる検出可能なシグナルを容易に得られるものである。例示としての蛍光ポリペプチドには、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＧＦＰ、ｍＲＦＰ、ＲＦＰ（ｔ二量体２）、ＨＣＲＥＤなど、あるいは任意の変異体（蛍光を増大または放出スペクトルをシフトさせるための蛍光タンパク質など）、類似体またはその誘導体があるが、これに限定されるものではない。他の好適な蛍光ポリペプチドならびに、本明細書に列挙したものの具体例は、従来技術において提供されており、周知である。
ビオチンベースの標識にも、本明細書に開示の方法での用途がある。標的分子および基質のビオチン化は周知であり、たとえば、タンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン化用のアミン反応剤およびチオール反応剤をはじめとして多数のビオチン化剤が周知である；本明細書に援用するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ，Ｈａｕｇｌａｎｄ，６ｔｈ Ｅｄ．１９９６の第４章などを参照のこと。ビオチン化基質については、アビジンまたはストレプトアビジンなどの検出可能に標識されたビオチン結合相手の結合によって検出可能である。同様に、多数のハプテニル化試薬も周知である。
スクリーニング方法
目的のＡＢＰを分離および回収できる好適な方法を利用すればよい。たとえば、目的のＡＢＰを提示する細胞を、ＦＡＣＳで、イムノクロマトグラフィあるいは、検出可能な標識が磁性である場合は磁気分離によって、分離すればよい。分離の結果、切断後に標的に対する結合を呈するあるいは、切断の非存在下で標的に対する検出可能な結合が低減または認められないなど、所望の特徴を呈する細胞の個体群が富化される。
たとえば、検出可能に標識された結合標的を有する候補ＡＢＰの選択を、従来技術において周知の多岐にわたる技法を用いて達成可能である。たとえば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ（登録商標）など）法を用いて、検出可能に標識された候補ＡＢＰを未標識の候補ＡＢＰから選別することが可能である。フローサイトメトリー法を実施し、さらにスクリーニングするために第２の個体群に分けられるよう、「一層薄暗い」細胞個体群を許容または「一層明るい」細胞個体群を必要とするゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）の修飾などによって、候補ＡＢＰの個体群分離についての多かれ少なかれストリンジェントな要件を得ることができる。
もうひとつの例では、イムノアフィニティクロマトグラフィを使用して、標的と結合しないものから標的結合候補ＡＢＰを分離することが可能である。たとえば、結合した抗標的抗体を有する支持体（カラム、磁気ビーズなど）を、プロテアーゼおよび標的に曝露しておいた候補ＡＢＰと接触させることができる。結合標的を有する候補ＡＢＰは、抗標的抗体に結合するため、結合標的のない候補ＡＢＰからの分離が容易になる。スクリーニングステップが、（他の候補ＡＢＰとの比較などで）標的結合が比較的減少したか検出可能な標的結合がない未切断の候補ＡＢＰが富化された個体群を提供するためのものである場合、目的の部分母集団は、結合標的に対する検出可能なシグナルが欠けているか、比較的少ないメンバである。たとえば、このような結合標的のネガティブ選択にイムノアフィニティの技術を使用する場合、目的の部分母集団は、抗標的支持体に結合されないものである。
二重標的結合ＡＢＰのスクリーニング
本明細書に開示のスクリーニング方法に対して容易に手を入れて、２つのＴＢＭ間の相互作用がゆえに所望の切り替え可能な表現型を有する二重標的結合ＡＢＰを同定することが可能である。総じて、上記の例における候補ＭＭよりも、周知の結合活性を有するＴＢＭがＭＭの代わりに候補ＡＢＰに提示される。総じて、この方法では候補となる複数のＡＢＰを含有するライブラリを必要とし、前記複数の各メンバが、第１のＴＢＭと、第２のＴＢＭと、ＣＭとを含む。ライブラリを少なくとも第１のＴＢＭと結合できる標的およびＣＭを切断できる切断剤と接触させる。切断剤（ＣＭのプロテアーゼなど）の存在下で標的を結合するために、ライブラリのメンバの第１の個体群を選択する。この選択された個体群に対して上記のネガティブスクリーニングを実施し、切断剤の非存在下でのライブラリメンバへの標的の結合を評価する。次に、切断剤の非存在下で前記標的に結合するメンバの部分母集団を除外することで、メンバの第２の個体群を生成する。これは、たとえば、標的に結合されないメンバを標的に結合されるメンバから選り分ける（検出可能に標識された標的の検出で判断）ことで達成可能である。このように、この方法では切断剤の存在下での標的に対する結合に比して、切断剤の非存在下で前記標的に対する結合が少ない候補ＡＢＰが選択される。
この方法は、両方の標的に対して反復可能なものであるが、溶液中にてＴＢＭ含有ＡＢＰフラグメントとの間で複合体を形成した標的の有無（および／または相対レベル）を見極め、切断後の提示足場と関係のないＴＢＭへの標的結合を評価しなければならない。
一例では、候補となる複数のＡＢＰを含むライブラリが生成され、各メンバが、第１のＴＢＭと、第２のＴＢＭと、ＣＭとを含み、ＣＭが第１のＴＢＭと第２のＴＢＭとの間に配置され、第１のＴＢＭが提示足場によって複製可能な生命体の表面に固定化される。次に、このライブラリに、第２のＴＢＭを結合できる標的で上記のポジティブおよびネガティブスクリーニングステップをほどこす。たとえば、ライブラリを第１のＴＢＭと結合できる標的およびＣＭを切断できる切断剤と接触させた後、前記標的と結合する前記複数のメンバの第１の個体群を切断剤の存在下で選択する。選択された第１の個体群を切断剤の非存在下で第１のＴＢＭと結合できる標的と接触させ、切断剤の非存在下で前記標的に結合するメンバの第２の個体群を選択する。
上記同様、ライブラリ内で二重標的結合ＡＢＰの任意の要素を変更できる。たとえば、第１のＴＢＭを「固定」にし、周知の標的結合活性を有する第２のＴＢＭを未修飾の形態（周知の標的結合活性を有するネイティブなアミノ酸配列など）で提供してもよいし、修飾（定方向突然変異誘発またはランダム突然変異誘発など）して「切り替え可能な」表現型での活性をスクリーニングしてもよい。このようにすれば、スクリーニング方法で「マスキング」活性を呈するものとして同定されるＴＢＭを、たとえば「マスキング」ＴＢＭが所望のレベルの標的結合を保っていることを判断するために、目的の標的を結合する活性について見極めることが可能である。たとえば、複製可能な生命体の表面での発現および提示のために、提示足場および二重標的結合ＡＢＰのＴＢＭ−ＭＭ二重機能要素をコードするコンストラクトを挿入可能である。こうして、従来技術の方法でＴＢＭ−ＭＭの結合を見極めることができる。
候補ＡＢＰを選択するためのスクリーニング方法の例示としての変形例
上記の方法を改変し、切り替えについて所望の特徴を示す個体群およびライブラリメンバを選択するようにしてもよい。
ＡＢＰ要素を同定および／または最適化するための反復スクリーニング
本明細書に記載の方法および候補ＡＢＰライブラリに対して容易に手を入れて、ＡＢＰの１つ以上の要素を同定および／または最適化することが可能である。たとえば、ＴＢＭ、ＣＭ、リンカーなどの１つ以上について変化する候補ＡＢＰを生成し、本明細書に記載のスクリーニング方法を用いることが可能である。
還元剤活性化可能なＡＢＰ
上記の方法はＡＢＰを同定するためのスクリーニング方法を説明するものであるが、ＡＢＰでのシステイン−システインジスルフィド結合の形成を容易にできるＣＭを有するＡＢＰまたは候補ＡＢＰにも本明細書に開示のスクリーニング方法を用いることが可能である旨を理解されたい。このようなＡＢＰは、プロテアーゼ基質を含んでもよいし含まなくてもよいＣＭ（同一であっても異なるＣＭであってもよい）をさらに含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。これらの実施形態では、ＡＢＰまたは候補ＡＢＰをＡＢＰのシステイン−システイン対のジスルフィド結合を切断できる還元剤（還元条件など）に曝露して上述したポジティブスクリーニングを実施してもよい。その後、還元条件の非存在下でネガティブスクリーニングを実施すればよい。その際、生成されるライブラリは、ジスルフィド結合還元条件への曝露によって活性化可能なＡＢＰが富化されたものであってもよい。
サイクル数と足場なしのＡＢＰスクリーニング
上記の方法のサイクル数を増やすことで、図８に例示するように切り替えの特徴が改善された個体群とライブラリメンバを同定することが可能である。スクリーニングのサイクルについては何回でも実施可能である。
また、候補ＡＢＰのダイナミックレンジを判断する目的で、候補ＡＢＰの個々のクローンを単離し、スクリーニングすることが可能である。また、足場とは別に所望の切り替え可能な表現型について候補ＡＢＰを試験することも可能である。すなわち、提示足場とは別に候補ＡＢＰを発現させるか、そうでなければ生成し、必要があれば、無細胞系（可溶化ＡＢＰを用いるなど）にて足場の非存在下で候補ＡＢＰの切り替え可能な表現型を評価することが可能である。
分泌シグナルを含むＡＢＰ発現コンストラクトを提供してＡＢＰを細胞外分泌させ、これによって目的のＡＢＰの生成と回収を容易にすると望ましいことがある。細菌系および哺乳類系で用いるのに適した分泌シグナルは、従来技術において周知である。
ＡＢＰ成分および切り替え活性の最適化
上記の方法を改変して、本明細書に記載のスクリーニング方法で同定されるＡＢＰなどのＡＢＰの性能を最適化してもよい。たとえば、未切断状態でのＴＢＭの標的結合の阻害を改善するなど、マスキング部分の性能を最適化すると望ましい場合、候補ＡＢＰライブラリでＴＢＭおよびＣＭのアミノ酸配列を「固定」し、ライブラリのメンバのＭＭが互いに異なるようにＭＭを変更してもよい。ＭＭについては、ＭＭを構成するアミノ酸の数およびまたはタイプを変えるなどの多岐にわたる方法で最適化すればよい。たとえば、候補となる複数のＡＢＰの各メンバが候補ＭＭを含んでもよく、この場合の候補ＭＭは、少なくとも１つのシステインアミノ酸残基を含み、残りのアミノ酸残基は複数のメンバ間で可変である。他の例では、候補となる複数のＡＢＰの各メンバが候補ＭＭを含んでもよく、この場合の候補ＭＭは、システインアミノ酸残基と、５アミノ酸のランダム配列などのアミノ酸残基のランダム配列とを含む。
拡大したダイナミックレンジの選択
上述したように、切断状態と未切断状態での標的結合に関して所望のダイナミックレンジを有するＡＢＰが、特に注目されている。このようなＡＢＰは、たとえば、被検体の治療部位および非治療部位に見られる生理学的レベルでの標的の存在下で検出可能な結合がないが、ひとたびプロテアーゼで切断されると、標的に対する高い親和性および／または高アビディティの結合を呈するものである。ＡＢＰのダイナミックレンジが大きくなればなるほど、ＡＢＰの「切り替え可能な」表現型が一層よくなる。このため、切断剤の存在下および非存在下で標的結合のダイナミックレンジが「拡大した」ものを選択するように、ＡＢＰを最適化することが可能である。
本明細書に記載のスクリーニング方法については、所望のおよび／または最適化されたダイナミックレンジを有するＡＢＰを選択しやすいように改変可能である。総じて、これは未切断のＡＢＰの標的結合のスクリーニングよりも標的濃度が比較的低いプロテアーゼに曝露されたＡＢＰの標的結合のスクリーニング（すなわち、切断されたＡＢＰを含む個体群のスクリーニング）を実施するような形で、方法のポジティブ選択ステップとネガティブ選択ステップで用いられる標的の濃度を変えて達成できる。したがって、切り替え可能な表現型に対する「選択圧」が得られるようにステップ間で標的濃度を変更する。必要があれば、サイクル数を増やしてポジティブ選択ステップとネガティブ選択ステップで用いる標的濃度の差を大きくすることも可能である。
ポジティブ選択ステップで比較的低濃度の標的を用いることで、切断状態にあるときの標的結合が改善されたこれらのＡＢＰメンバの選択をドライブする機能を果たすことが可能である。たとえば、ＴＢＭ−標的相互作用のＫｄに対して約２から約１００分の１、約２から５０分の１、約２から２０分の１、約２から１０分の１または約２から５分の１の標的濃度で、プロテアーゼに曝露したＡＢＰを用いるスクリーニングを実施できる。結果として、標的と結合されたＡＢＰの個体群の選択後、選択された個体群は、その個体群の他のＡＢＰに比して親和性および／またはアビディティ結合が高いＡＢＰの富化されたものとなる。
ネガティブ選択ステップで比較的高濃度の標的を用いることで、未切断状態で検出可能な標的結合が減少したかまったくない、これらのＡＢＰメンバの選択をドライブする機能を果たすことが可能である。たとえば、ＴＢＭ−標的相互作用のＫｄに対して約２から約１００倍、約２から５０倍、約２から２０倍、約２から１０倍または約２から５倍の標的濃度で、（ネガティブ選択ステップで）プロテアーゼに曝露していないＡＢＰを用いるスクリーニングを実施できる。結果として、検出可能な状態では標的と結合しないＡＢＰ個体群の選択後、選択された個体群は、その個体群の他の未切断ＡＢＰに比して、未切断状態での標的に対する結合度が低いＡＢＰの富化されたものとなる。言い方を変えると、検出可能な状態では標的と結合しないＡＢＰの個体群の選択後、選択された個体群は、標的結合からのＴＢＭの「マスキング」などによってＴＢＭに対する標的結合が阻害されるＡＢＰの富化されたものとなる。
ＡＢＰが二重標的結合ＡＢＰである場合、上述したスクリーニング方法に手を入れて、第１のＴＢＭと結合できる第１の標的と、第２のＴＢＭと結合できる第２の標的とに対する所望のダイナミックレンジを有するＡＢＰを得ることも可能である。切断されたフラグメントを捕捉するための抗ＡＢＰフラグメント抗体を有するイムノクロマトグラフィなど、溶液中（培養液中など）での標的−ＴＢＭ複合体の形成を評価した後、カラムに捕捉された結合後の検出可能に標識された標的を検出することで、提示足場に存在するＡＢＰから「切断除去」されたＡＢＰの一部に局在するＴＢＭへの標的結合を見極めることが可能である。
可溶性ＡＢＰの試験
候補ＡＢＰが可溶性形態で「切り替え可能な」表現型を維持する機能を試験することが可能である。このような方法のひとつに、支持体（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５センサチップ表面などのアレイなど）に対する標的の固定化を利用するものがある。目的の標的の固定化は、好適な任意の技法（標準的なアミンカップリングなど）を用いて実現可能である。支持体の表面をブロックして、非特異的結合を還元する。任意に、この方法は、対照（固定化された標的を含まない支持体など（支持体へのバックグラウンド結合を評価するためなど）および／またはネガティブ対照として機能する化合物を含む（標的対非標的に対する候補ＡＢＰの結合の特異性を評価するためなど）の使用を必要とするものであってもよい。
標的を共有結合的に固定化した後、この固定化された標的への特異的結合を可能にするのに適した条件下で、候補ＡＢＰを支持体と接触させる。候補ＡＢＰについては、「切り替え可能な」表現型を評価する目的で、好適な切断作用剤の存在下および非存在下で支持体に固定化された標的に接触させることが可能である。切断作用剤の非存在下と比較して、かつ、任意にネガティブ対照での結合と比較して、切断作用剤の存在下での候補ＡＢＰの結合の評価では結合応答が得られ、これが「切り替え可能な」表現型を示す指標となる。
候補ＡＢＰで使用される個々の部分のスクリーニング
候補ＡＢＰの「切り替え可能な」表現型を試験する前に、ＴＢＭ、ＭＭまたはＣＭなどの候補ＡＢＰの１つ以上の部分を別々にスクリーニングすると望ましいことがある。たとえば、特異的プロテアーゼで切断可能なペプチド基質を同定する周知の方法を利用して、このようなプロテアーゼによる活性化用に設計されるＡＢＰで用い切断可能な部分を同定することが可能である。また、目的の標的に結合するペプチド配列の同定には多岐にわたる方法を利用できる。これらの方法は、たとえば、特定の標的に結合するＴＢＭを同定あるいは、特定のＴＢＭに結合するＭＭを同定するのに使用可能である。
上記の方法は、たとえば、ＴＢＭ、ＭＭまたはＣＭなどの候補ＡＢＰの一部が複製可能な生命体を用いて提示される方法を含む。
本明細書にて上述したように、複製可能な生命体を用いるさまざまな提示技術が従来技術において周知である。これらの方法および実体として、ｍＲＮＡおよびリボソーム提示、真核生物ウイルス提示ならびに、細菌、酵母、哺乳類細胞表面提示などの提示方法論があげられるが、これに限定されるものではない。Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２００１ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８（７）：３７５０〜３７５５；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｏ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３１２；Ｂｕｐｐ，Ｋ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｒｏｔｈ（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（３）：３２９ ３５１３；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：２９ ３４１４；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ａｎｄ Ｋ．Ｄ．Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（６）：５５３ ５５７を参照のこと。表面提示方法は、ライブラリ解析およびスクリーニングに蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を適用できるため魅力的である。Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３（１ ２）：２１１ ２７１６；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．（２０００）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．５５：２９３ ３１５；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７（５）：２０２９ ３４１８；Ｏｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０：３２９ ３４２；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７（２０）：１０７０１ １０７０５；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１（１９）：９０２２ ９０２６；Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０（２）：１１７ １２２を参照のこと。目的の生物標的に結合可能なペプチドを同定するのに使用できる別の提示方法論が、米国特許第７，２５６，０３８号明細書に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
ファージ提示には、バクテリオファージ粒子のｐＩＩＩ、ｐＩＩＶなどのコートタンパク質への末端融合物としてのペプチドの局在化を伴う。Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（４９６７）：３８６ ３９０；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（４５）：１０８３２ １０８３８を参照のこと。一般に、特定の結合機能を有するポリペプチドは、標的とともにインキュベートし、非結合ファージを洗い流し、結合したファージを溶出した後、細菌の新鮮な培養に感染させてファージ個体群を再増幅することで単離される。
例示としてのファージ提示および細胞提示組成物ならびに方法が、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第７，１１８，８７９号明細書、同第６，９７９，５３８号明細書、同第７，２０８，２９３号明細書、同第５５７１６９８号明細書、同第５，８３７，５００号明細書に記載されている。
別の例示としての提示足場および方法として、２００７年３月２２日公開の米国特許出願公開第２００７／００６５８７８号明細書に記載されているものがあげられる。
任意に、提示足場にプロテアーゼ切断部位（ＣＭのプロテアーゼ切断部位とは異なる）を含み、ＡＢＰまたは候補ＡＢＰを宿主細胞の表面から切断できるようにすることも可能である。
ひとつにおいて、複製可能な生命体が細菌細胞である場合、好適な提示足場は、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（２００６）１５：８２５〜８３６に記載された円順列変異大腸菌（Ｅｓｃｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）外膜タンパク質ＯｍｐＸ（ＣＰＸ）を含む。２００７年８月１４日に発行された米国特許第７，２５６，０３８号明細書も参照のこと。
自動スクリーニング方法
本明細書に記載のスクリーニング方法を自動化し、所望の切り替え可能な活性についてＡＢＰのライブラリをリアルタイムに大量スクリーニングする便利な方法を提供してもよい。自動方法は、所望のサイクル数にわたって選択した個体群を分離し、自動的に次のスクリーニングに送る、ポジティブ選択とネガティブ選択を何度も反復する形で設計可能である。
個体群の候補ＡＢＰを評価するための解析点は、ポジティブ選択ステップ、ネガティブ選択ステップまたはその両方の終了後の経時的なものであってもよい。また、異なる標的濃度の選択圧による影響を評価するために、ポジティブ選択ステップとネガティブ選択ステップにおける選択された標的濃度での候補ＡＢＰの個体群の平均ダイナミックレンジに関する情報を監視して、後の解析用に保存することが可能である。
コンピュータプログラム製品は、検出および／または測定手段の動作を制御可能であり、上述したステップに関する算術演算を実施し、所望の出力（フローサイトメトリー解析など）を生成することが可能である。コンピュータプログラム製品は、媒体に統合されたコンピュータ読み取り可能なプログラムコード手段を有するコンピュータ読取り可能な記憶媒体を備える。このような自動装置に適したハードウェアは、当業者間で周知であり、コンピュータコントローラ、自動サンプルハンドラ、蛍光測定ツール、プリンタ、光ディスプレイを含み得る。測定ツールは、蛍光検出可能な分子が用いられている試料からの蛍光シグナルを測定するための１つ以上の光検出器を含むものであってもよい。また、測定ツールは、各制御および／または被検試料を、試料のアレイとして配置し、蛍光強度を測定するステップの間に光検出器と対向して自動的かつ繰り返し位置決めできるように、コンピュータ制御されたステップモータを含むものであってもよい。
測定ツール（蛍光標示式細胞分取器など）を、汎用コンピュータまたは特定用途向けコンピュータのコントローラと作動的に接続することが可能である。このコントローラは、測定ツールの動作を制御し、上述したステップに関する算術演算を実施するためのコンピュータプログラム製品を含み得る。コントローラは、ファイル、ディスク入力またはデータバスを介してセットアップデータまたは他の関連のデータを受け取るようになっていてもよい。ディスプレイとプリンタを設けて、コントローラの動作を表示してもよい。コントローラが実施する機能の全体または一部を汎用コンピュータシステム上で動作するソフトウェアモジュールとして実現してもよいことは、当業者であれば理解できよう。あるいは、上述した機能と動作を実現するための特定用途向け集積回路を備える専用のスタンドアロン型システムを設けてもよい。
セラピーでのＡＢＰの使用方法
たとえば目的のＡＢＰおよびキャリア薬学的に許容される賦形剤（薬学的に許容されるキャリアとも呼ぶ）を治療有効量で含有する医薬組成物に、ＡＢＰを取り入れることが可能である。多くの薬学的に許容される賦形剤が従来技術において周知であり、一般に、投与経路、治療対象となる症状、従来技術において十分に理解されている他の可変要素などに応じて選択される。薬学的に許容される賦形剤は、たとえば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ． Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃをはじめとする多岐にわたる刊行物に多く記載されている。医薬組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化調整剤、安定剤、湿潤剤などの他の成分を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子またはリポソームがＡＢＰ含有医薬組成物を担持する。
ＡＢＰの医薬組成物に適した成分を、ＡＢＰのＴＢＭに利用できる医薬組成物によってガイドすることが可能である。たとえば、ＡＢＰがＶＥＧＦバインダー（すなわちＶＥＧＦ阻害剤）を含む場合、このようなＡＢＰを、ＶＥＧＦバインダーとの併用に適した方法および組成物による製剤処方薬の形で処方することが可能である。ＡＢＰが全長抗体またはその抗原結合フラグメントを含む実施形態では、組成物を、抗体および抗原結合フラグメントとの併用に適した方法および組成物による製剤処方薬の形で処方することが可能である。
総じて、１つ以上のＡＢＰの製剤処方薬は、所望の純度のＡＢＰと、生理学的に許容される任意のキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））とを、凍結乾燥製剤または水溶液の形で混合することで、保存できるように調製される。許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用する薬用量および濃度でレシピエントにとって無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレソールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖および他のグルコース、マンノースまたはデキストリンをはじめとする炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（Ｚｎ−タンパク質錯体など）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン系界面活性剤を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に使用される製剤は滅菌されたものでなければならない。これは、滅菌濾過膜での濾過によって容易に達成される。また、製剤処方薬は、治療対象となる特定の徴候に合わせて、必要に応じて２種類以上の活性化合物を含むものであってもよく、この場合の別の活性化合物は通常、ＡＢＰに対して相補的な活性を有するものである。このような化合物は、意図した目的に効果的な量で適宜組み合わせて用いられる。
製剤処方薬は、全身調製物または局所注射可能な調製物などの多岐にわたる剤形で提供可能なものである。これらの成分は、コロイド状のドラッグデリバリー系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル）で、あるいはマクロエマルションで、たとえばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルを、それぞれたとえばコアセルベーション法によって、あるいは界面重合によって調製されるものなどのマイクロカプセルなどのキャリアで提供可能である。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
徐放調製物もＡＢＰ含有製剤の範囲内である。例示としての徐放調製物は、抗体を含有する疎水性の固体ポリマーの半透性マトリクスを含み得るものであり、このマトリクスはフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸があげられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日を超えて分子の放出を可能にするのに対し、特定のヒドロゲルは、これよりも短い期間タンパク質を放出する。
ＡＢＰがカプセル化されたまま体内に長期間とどまると、３７℃で水分に曝露されることで変性したり凝集したりして、生物活性の低下や免疫原性の変化につながる場合がある。これに関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することが可能である。たとえば、凝集機序がチオ−ジスルフィド相互交換による望ましくない分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かったのであれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、特定のポリマーマトリクス組成物の開発といった方法で、安定化できることがある。
治療の目的を果たす活性作用剤の標的送達用に、ＡＢＰを送達ビヒクルにコンジュゲートすることが可能である。たとえば、医薬品がカプセル封入された、あるいは医薬品と関連付けられたナノ粒子またはリポソームに、ＡＢＰをコンジュゲートすることができる。このようにして、医薬品を特異的に標的送達することが可能である。ポリペプチドをリポソームにリンクする方法は従来技術において周知であり、このような方法を適用して、リポソーム内容物の標的およびまたは選択的送達用にＡＢＰをリポソームにリンクさせることができる。一例として、チオエーテル結合を介してポリペプチドをリポソームに共有結合的にリンクさせることが可能である。ＰＥＧ化ゼラチンナノ粒子およびＰＥＧ化リポソームも、単鎖抗体などのポリペプチド結合用の支持体として使用されている。たとえば、抗体フラグメントなどのポリペプチドをリポソームにコンジュゲートするための方法についての開示を本明細書に援用する、Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１（３）：２９７〜３１５を参照のこと。
治療方法
本明細書に記載のＡＢＰは、ＡＢＰで提供されるＣＭ−ＴＢＭの組み合わせによる好適な被検体の治療方法で使用するよう選択可能である。ＶＥＧＦ−阻害ＡＢＰに基づく例を以下にあげておく。
ＡＢＰは、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、さらには必要であれば局所注射（固体腫瘍部位での注射など）をはじめとする好適な手段で投与可能である。非経口投与経路としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与があげられる。
ＡＢＰの適切な薬用量は、治療対象となる疾患のタイプ、疾患の重篤度と経過、患者の臨床履歴とＡＢＰに対する応答、主治医の裁量に左右される。ＡＢＰは、患者に対して一度にまたは一連の治療をとおして適宜投与可能である。
疾患のタイプと重篤度に応じて、たとえば１回以上の個別投与であるか連続注入であるかを問わず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（０．１〜２０ｍｇ／ｋｇなど）のＡＢＰが患者に投与する初期の候補薬用量となり得る。一般的な１日薬用量は、上述したものなどの要因次第で約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはこれより多くの範囲であろう。数日間またはそれよりも長期にわたる反復投与では、症状に応じて、疾患症候に対する所望の抑制が生じるまで治療を続ける。しかしながら、他の投与計画が有用なこともある。
ＡＢＰ組成物は、適正な医療規範と矛盾しないような方法で、処方、投薬、投与される。この観点で考慮すべき要因としては、どの機能障害が治療対象となっているのか、どの哺乳動物が治療対象となっているのか、個々の患者の臨床症状、機能障害の原因、ＡＢＰの送達部位、投与方法、投与スケジュールならびに、医療関係者にとって周知の他の要因があげられる。投与される「治療有効量」のＡＢＰは、これらの考慮事項に影響され、疾患または機能障害の予防、寛解または治療に必要な最低限の量である。
通常、疾患または機能障害の軽減または治療には、疾患または機能障害に関連する１つ以上の症候または医学的な問題の低減が関与する。たとえば、癌の場合、治療有効量の医薬品によって、癌細胞数の低減；腫瘍サイズの縮小；周辺臓器に対する癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減少および／または停止）；腫瘍転移の阻害；腫瘍成長のある程度の阻害；および／または癌に関連する１つ以上の症候のある程度の軽減のうちの１つまたはその組み合わせが実現可能である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を使用して、被検体すなわち哺乳動物での疾患または機能障害の発症または再発を予防することが可能である。
ＡＢＰは、（同一の製剤または別の製剤で）１つ以上の別の治療薬または治療方法（「併用剤」）と併用可能である。ＡＢＰを、別の治療薬との混合物で投与してもよいし、別々の製剤で投与してもよい。ＡＢＰとの併用で投与可能であり、なおかつ治療対象となる症状に応じて選択される治療薬および／または治療方法としては、外科手術（癌性組織の外科的除去など）、放射線療法、移植、化学治療、上記の特定の組み合わせなどがあげられる。
抗血管新生療法においてＶＥＧＦを阻害するＡＢＰの使用
ＡＢＰがＶＥＧＦ阻害剤であるＴＢＭを含有する場合、このＡＢＰには、血管形成の阻害が望ましい症状、特にＶＥＧＦの症状が注目される症状の治療用途がある。ＶＥＧＦ阻害ＡＢＰは、ＶＥＧＦに結合するＴＢＭならびに、線維芽細胞成長因子（たとえばＦＧＦ−２）などの第２の成長因子に結合して、ＦＧＦ活性を阻害するＴＢＭを有する二重標的結合ＡＢＰを含み得る。よって、２つの血管形成促進因子を阻害する目的でこのような二重標的結合ＡＢＰを設計することが可能であり、これは、異所性の血管形成部位に共存する切断剤（たとえば、本明細書に記載のＭＭＰまたは他の酵素などの酵素）によって活性化可能である。
血管形成阻害ＡＢＰには、被検体（ヒトなど）での固体腫瘍、特に、血管形成の阻害によって阻害または腫瘍成長が得られる腫瘍に栄養分を与える、関連の血管床を有する固体腫瘍の治療に用途がある。また、抗ＶＥＧＦベースの抗血管形成ＡＢＰには、異常な血管形成の阻害によるセラピーに適している１つ以上の症候を有する他の症状でも用途がある。
総じて、異常な血管形成は、疾患のある状態あるいは、疾患のある状態を引き起こすような形で新たな血管が過剰に、不十分にまたは不適切に成長する（血管形成の場所、タイミングまたは開始が医療的な観点から望ましくないなど）際に生じる。過剰な、不適切なまたは未制御の血管形成は、癌、特に血管新生化した固体腫瘍および転移性腫瘍（大腸癌、肺癌（特に小細胞肺癌）または前立腺癌を含む）、眼血管新生によって生じる疾患、特に糖尿病性失明、網膜症、一次糖尿病性網膜症または加齢による黄斑変性症および虹彩血管新生；乾癬、乾癬性関節炎、血管腫などの血管芽細胞腫；糸球体腎炎などの炎症性腎疾患、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症または高血圧性腎硬化症；関節炎、特に関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症などのさまざまな炎症性疾患ならびに、移植後に発生する疾患、子宮内膜症または慢性喘息、当業者において容易に認識可能な他の症状などで、疾患のある状態の悪化の一因となるか、あるいは疾患のある状態を引き起こす新たな血管成長があるときに生じる。新たな血管は、疾患のある組織に栄養を与え、正常な組織を破壊する可能性があり、癌の場合は、新たな血管がゆえに腫瘍細胞が血液の循環に混じって他の臓器にとどまる（腫瘍の転移）可能性がある。
ＡＢＰベースの抗血管形成療法には、移植片拒絶、肺炎、ネフローゼ症候群、妊娠高血圧腎症、心膜炎に関連するものや胸水貯留などの心膜液貯留、脳腫瘍関連の浮腫などの望ましくない血管透過性を特徴とする疾患および機能障害、悪性腫瘍に関連する腹水症、メージュ症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、心筋梗塞および脳卒中後の症状などの心血管疾患に関連する透過性などの治療に用途がある可能性もある。
本明細書に記載したような抗血管新生ＡＢＰを用いて治療できる他の血管形成依存性疾患としては、血管線維腫（出血しやすい血管の異常な血液）、血管新生緑内障（眼における血管の成長）、動静脈奇形（動脈と静脈との連絡異常）、癒着不能骨折（治癒しない骨折）、動脈硬化性プラーク（動脈の硬化）、化膿性肉芽腫（血管で構成される一般的な皮膚病変）、強皮症（結合組織疾患の一形態）、血管種（血管で構成される腫瘍）、トラコーマ（第三世界での失明の主因）、血友病性関節炎、血管接着および肥厚性瘢痕（異常な痕形成）があげられる。
所望の治療効果を得るためのＡＢＰの投与量は、上述したものなどの多数の要因に応じて変わってくる。総じて、癌に対するセラピーとの関連では、ＡＢＰの治療有効量とは、血管形成を阻害し、これによってたとえば、好適な対照と比較した場合に、被検体における腫瘍量、アテローム性動脈硬化症を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、最大で腫瘍の完全根絶まで低減しやすくするのに有効な量である。実験動物系では、好適な対照は、作用剤で処置していない遺伝的に等しい動物であってもよい。非実験系では、好適な対照は作用剤投与前の腫瘍量であってもよい。他の好適な対照としてプラセボ対照があげられる。
腫瘍量が減少しているか否かについては、固体腫瘍体積の測定；細胞学的アッセイを用いる腫瘍細胞数の計数；特定の腫瘍抗原を持つ細胞数を求めるための蛍光標識細胞分取（腫瘍関連抗原に特異な抗体を用いるなど）；腫瘍サイズを見極めるおよび／または監視するための腫瘍のコンピュータ断層撮影走査、磁気の磁気共鳴画像法および／またはＸ線撮像；血液または血清などの生物学的試料における腫瘍関連抗原量の測定などであるがこれに限定されるものではない、周知の方法で判断すればよい。
いくつかの実施形態では、これらの方法は、好適な対照と比較した場合に、腫瘍の成長率を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、最大で腫瘍の成長を完全に阻害するまで抑えるのに有効である。よって、これらの実施形態では、ＡＢＰの「有効量」は、好適な対照と比較した場合に、腫瘍の成長率を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、最大で腫瘍の成長を完全に阻害するまでの量である。実験動物系では、好適な対照は、作用剤で処置していない遺伝的に等しい動物における腫瘍成長率であってもよい。非実験系では、好適な対照は、作用剤投与前の腫瘍量または腫瘍成長率であってもよい。他の好適な対照としてプラセボ対照があげられる。
腫瘍の成長が阻害されたか否かについては、腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ；ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ；３Ｈ−チミジン取り込みアッセイなどであるがこれに限定されるものではない、周知の方法で判断すればよい。
ＡＢＰを用いる非治療方法
また、診断および／または画像形成方法にＡＢＰを使用することも可能である。たとえば、酵素的に切断可能なＣＭを有するＡＢＰを使用して、ＣＭを切断できる酵素の有無を検出することができる。このようなＡＢＰを診断に使用してもよく、それには、特定の宿主生物の特定組織における活性化ＡＢＰの蓄積測定値による目的の標的の存在が附随する酵素活性のｉｎ ｖｉｖｏ検出（定性的または定量的など）（あるいは、いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合を低減できる提供できるものなどの還元可能性のある環境の増加）を含み得る。
たとえば、生物学的に限局された部位（膿瘍内、臓器内など）といった腫瘍の部位、ウイルス感染または細菌感染の部位に見られるプロテアーゼのプロテアーゼ基質にＣＭを選択することが可能である。ＴＢＭは、標的抗原と結合するものであればよい。当業者に馴染みのある方法を使用して、検出可能な標識（蛍光標識など）をＡＢＰのＴＢＭまたは他の領域にコンジュゲートすることが可能である。適した検出可能な標識については上記のスクリーニング方法との関連で論じてあるが、さらに別の具体例を以下にあげておく。目的の疾患組織で活性が高まるプロテアーゼと一緒に疾患状態のタンパク質またはペプチドに特異的なＴＢＭを使用すると、ＡＢＰはＣＭ特異的酵素が検出可能なレベルで存在しないか、疾患組織よりも低めのレベルで存在する組織よりも疾患組織への結合率が高くなることになる。小タンパク質およびペプチドは、腎臓の濾過システムによって短時間で血中から排除され、ＣＭに特異的な酵素が検出可能なレベルで存在しない（あるいは非疾患組織に低めのレベルで存在する）がゆえに、疾患のある組織での活性化されたＡＢＰの蓄積が非疾患組織よりも増大する。
もうひとつの例では、試料中の切断剤の有無の検出にＡＢＰを使用できる。たとえば、ＡＢＰが酵素によって切断されやすいＣＭを含有する場合、ＡＢＰを使用して試料中の酵素の存在を検出（定性的または定量的のいずれか）することが可能である。もうひとつの例では、ＡＢＰが還元剤によって切断されやすいＣＭを含有する場合、ＡＢＰを使用して試料における還元条件の存在を検出（定性的または定量的のいずれか）することが可能である。これらの方法での解析を容易にするために、ＡＢＰを検出可能に標識してもよく、支持体（スライドまたはビーズなどの固相支持体など）に結合してもよい。検出可能な標識をＡＢＰの切断後に放出される部分に配置することも可能である。アッセイについては、たとえば、検出可能に標識した固定化ＡＢＰを、酵素および／または還元剤を含有する可能性のある試料と、切断を生じさせるのに十分な長さの時間接触させた後、洗浄して余分な試料や汚染物質を洗い流すことで実施可能である。その後、試料と接触させる前にＡＢＰの検出可能なシグナル（試料中の切断剤によるＡＢＰの切断ならびに、このような切断の結果として検出可能な標識が結合したＡＢＰフラグメントの除去による検出可能なシグナルの減少などの変化を頼りに試料中の切断剤（酵素または還元剤など）の有無を評価する。
このような検出方法を、ＡＢＰのＴＢＭと結合できる標的の有無を検出するようにしてもよい。よって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、切断剤の有無と目的の標的の有無を評価するようにしてもよい。切断剤の有無については、上述したようなＡＢＰの検出可能な標識が減少することに基づいて検出可能であり、検出可能に標識された抗標的抗体を用いるなどして標的−ＴＢＭ複合体を検出することで、標的の有無を検出可能である。
上述したように、本明細書に開示のＡＢＰは、検出可能な標識を含み得るものである。一実施形態では、ＡＢＰは、診断作用剤として使用できる検出可能な標識を含み得る。診断作用剤として使用できる検出可能な標識の非限定的な例には、インジウムまたはテクネチウムなどの放射性同位元素を含有する画像形成剤；ヨウ素、ガドリニウムまたは酸化鉄を含有するＭＲＩおよび他の用途での造影剤；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなどの酵素；ＧＦＰ、ユーロピウム誘導体などの蛍光物質およびフルオロフォア；Ｎ−メチルアクリジニウム誘導体などのルミネッセント物質などがある。
不安定プラークの破綻と、以後の血塊形成は、心臓発作の大部分を引き起こすと考えられている。不安定プラークを効果的に標的することで、安定化用の治療薬を送達することによる破綻の尤度を抑えられる可能性がある。
ＶＣＡＭ−１は、アテローム性動脈硬化症になりやすい領域ならびに、確立された病変境界の両方で上方制御される。Ｉｉｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．８５：１９９〜２０７。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３などのコラゲナーゼは、アテローム性プラークの破綻の一助となり得るヒトアテローマで過発現される。Ｆｒｉｃｋｅｒ，Ｊ．（２００２）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ７（２）：８６〜８８。
一例では、本明細書に開示のＡＢＰには、動脈硬化性不安定プラークなどの動脈硬化性プラークを検出および／または標識するよう設計された診断および／または画像形成方法に用途がある。動脈硬化性プラークに関連したタンパク質を標的することで、ＡＢＰを用いてこのようなプラークを検出および／または標識することが可能である。たとえば、抗ＶＣＡＭ−１ ＡＢＤと検出可能な標識とを含むＡＢＰには、動脈硬化性プラークを検出および／または標識するよう設計された方法に用途がある。これらのＡＢＰについては、ＡｐｏＥマウスなどの動物モデルで試験可能である。
以下の実施例は、本発明をどのように製造および使用するのかについて当業者に完全に開示および説明すべくまとめたものであり、本発明者らが自らの発明とみなす範囲を限定することを意図したものではなければ、以下の実験が実施した実験のすべてまたは唯一のものであると表すことを意図したものでもない。使用した数（量、温度など）については正確を期するよう最善を尽くしているが、若干の実験誤差や偏差とを念頭におく必要がある。特に明記しないかぎり、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏であり、圧力は大気圧前後である。また、塩基対にｂｐ；キロベースにｋｂ；ピコリットルにｐｌ；秒にｓまたはｓｅｃ；分にｍｉｎ；時間にｈまたはｈｒ；アミノ酸にａａ；キロベースにｋｂ；塩基対にｂｐ；ヌクレオチドにｎｔ；筋肉内の（に）にｉ．ｍ．；腹腔内の（に）にｉ．ｐ．；皮下（に）にｓ．ｃ．などの標準的な略記を使用することもある。
方法および材料
下記の実施例１〜５では、以下の方法および材料を用いた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１を用いてクローニングと発現実験を実施した。ＬＢ培地およびクロラムフェニコールにて細胞を３７℃で一晩成長させた。次に、培養をクロラムフェニコール含有ＬＢ培地で１：５０に希釈し、３７℃で２時間成長させ、０．２％Ｌ−（＋）−アラビノースを用いて３７℃で２時間、基質発現を誘導した。およそ２×１０８個の細胞を５０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、２０ｍＭのＮａＣｌ／２ｍＭのＣａＣｌ２／１００μＭのＺｎＣｌ２を加えた５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で１回洗浄し、１０ｕＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液で再懸濁させた。
酵素の添加を伴う実験では、３０ｎＭのＭＭＰ−２をＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液に含め（対照反応には酵素を添加しなかった）、反応混合物を室温にて２時間インキュベートした。次に、細胞を取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：１００に希釈して反応を停止させ、遠心処理によってペレット化し、２５ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦを含有する３０マイクロリットルの冷蔵ＰＢＳに再懸濁させた。回転式振盪培養器の冷蔵庫で４５分間のインキュベーション後、細胞を４℃でペレット化し、５０ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリン蛍光コンジュゲートを含有する冷蔵ＰＢＳに再懸濁させた。回転式振盪培養器の冷蔵庫で４５分間のインキュベーション後、細胞を４℃でペレット化し、ＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機にて解析または選別用に赤色蛍光を測定した。酵素で処理した細胞の蛍光を対照試料と比較し、ＶＥＧＦ結合の増加を判断した。
円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）のＮ末端を使用して、スイッチコンストラクトおよびライブラリをすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の表面に提示した。
下記の実験で同定したクローンについて説明するにあたり、以下の命名規則すなわち＃−＃Ｘ−＃および＃．＃Ｘ．＃（この場合、＃は数字の識別子であり、Ｘはアルファベットの識別子である）を同義に使用する点に注意されたい。
実施例１：ＶＥＧＦ結合部分と酵素で切断可能な部分とを有するポリペプチドの構成
上述したように、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）は、標的結合部分（ＴＢＭ）と切断可能部分（ＣＭ）とを含み、ＣＭがプロテアーゼの基質を含有する。ＡＢＰ生成の第１のステップとして、ＶＥＧＦ結合配列（ＴＢＭとして作用）とマトリクスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）で切断可能なアミノ酸配列とを含有する、細菌細胞表面での提示用のコンストラクトを生成した。Ｔ７抗原のアミノ酸配列は、未切断の生成物を検出しやすくするための免疫検出可能なタグとしてＮ末端に含まれる。具体的には、検出可能に標識された抗Ｔ７抗体の結合が、未切断ＡＢＰを示す目安となった。この細胞表面アンカー配列を持たないコンストラクトのアミノ酸配列を、以下に配列番号１２としてあげておく。図３に酵素の存在下および非存在下におけるコンストラクトの概略を示す（詳細については右上のパネルを参照のこと）。
Figure 2019106994
ＭＭＰ−２の存在下または非存在下でコンストラクトが標識されたＶＥＧＦと結合する能力を試験した。自己の表面でコンストラクトを提示している細菌を、標識されたＶＥＧＦの存在下で、ＭＭＰ−２の存在下または非存在下のいずれかにてインキュベートした（図３、左側のパネル）。検出可能に標識された抗Ｔ７抗原抗体の存在下または非存在下のいずれにて細胞をインキュベートして、プロテアーゼによるコンストラクトの切断を確認した（図３、右側のパネル）。標識されたＶＥＧＦまたは標識された抗Ｔ７抗体のいずれかの結合をＦＡＣＳで評価した。図３に示すように、ＭＭＰ−２の存在下または非存在下のいずれかでコンストラクトが標識されたＶＥＧＦと接触すると、標識されたＶＥＧＦがＶＥＧＦバインダー配列と結合できることから、酵素基質が存在してもコンストラクトのＴＢＭに対するＶＥＧＦ結合が実質的に干渉されないことが分かる。また、図３は、酵素の存在下でコンストラクトの平均蛍光がおよそ１６．５分の１に低下したことから分かるように、ＭＭＰ−２がコンストラクトのＰＬＧＬＡＧ基質を切断したことも示している。
これらのデータは、ＭＭＰ−２基質が存在してもＶＥＧＦ結合が実質的に損なわれず、Ｔ７対照ポリペプチドに用いられるＭＭＰ−２基質がＡＢＰでＣＭとして用いられる候補酵素基質であることを示す。
実施例２：システイン制約ループを有するＡＢＰ
ＡＢＰの標的結合部分（ＴＢＭ）を「マスクする」ためのひとつの戦略に、標的がＴＢＭに到達するのを立体的に邪魔する「ループ」状のＡＢＰを提供することがある。この戦略では、システイン間でのジスルフィド結合の形成時にＴＢＭがマスクされるような形で、ＡＢＰのＮ末端およびＣ末端またはその付近にシステインを配置する。
例示としてのＡＢＰを図４に示す。このＡＢＰは、ＭＭＰ−２基質（切断可能部分（ＣＭ）、以下では「基質」と表記）のＮ末端に位置するシステイン含有フレキシブルリンカー配列を含み、これがＴＢＭとしてのＶＥＧＦバインダーのＮ末端であった。フレキシブルリンカーは、ＣＭとＴＢＭとの間に配置された。この配列を以下に配列番号１３としてあげておく。
Figure 2019106994
システイン−システインジスルフィド結合のない対照（「ＧＳ対照」）も構成した。ＧＳ対照の配列を以下に配列１４としてあげておく。
Figure 2019106994
次に、これらのコンストラクトが上述したようなＭＭＰ−２の存在下または非存在下で標識されたＶＥＧＦと結合する能力を試験した。
図４のＡＢＰは細菌細胞の表面に提示され、ＭＭＰ−２酵素の存在下または非存在下で標識されたＶＥＧＦと接触された。ＶＥＧＦ標識細胞を検出するためのＦＡＣＳ解析を実施して、システイン−システインジスルフィド結合のない対照ポリペプチドと比較してＡＢＰが切り替え挙動を示したか否かを判断した。図５に示すように、酵素の非存在下の場合と比較すると、酵素の存在下で、ＭＭＰ−２処理後に蛍光がおよそ２．６倍になった（図５、右側のパネル）ことから分かるように、標識されたＶＥＧＦの結合が増大した。ＶＥＧＦ結合における同様の増加はＧＳ対照ポリペプチドには認められなかった。
これらのデータは、ＭＭＰ−２で基質が切断されることで、ＭＭＰ−２の非存在下でのＡＢＰに対するＶＥＧＦの結合と比較した場合にＡＢＰに対するＶＥＧＦの結合が増大したことを示す。また、システインループ含有ＡＢＰのほうがＧＳ対照に比して「切り替え可能な」ＶＥＧＦ結合表現型が増大した。未切断のシステインループ含有ＡＢＰと比較した切断後のシステインループ含有ＡＢＰへのＶＥＧＦ結合のレベルは、未切断のＧＳ対照と比較した切断後のＧＳ対照に対するＶＥＧＦ結合レベルよりも高かった。
実施例３：ＡＢＰライブラリのスクリーニング
所望の「切り替え」特徴を有する（すなわち、切断されたコンホメーションにあるときの標的結合と比較して、未切断のコンホメーションでは標的結合が低下する）別のＡＢＰを同定するために、マスキング部分（ＭＭ）に異なる可変アミノ酸配列を有し、ＭＭのシステインの位置が変わる候補ＡＢＰのライブラリを生成した。例示としてのライブラリのアミノ酸配列を表６の配列番号１５〜１８として以下にあげておく。「Ｘ」はランダム化アミノ酸配列を示す。ＭＭに柔軟性を持たせるために、グリシンを含めた。
Figure 2019106994
図６はライブラリコンストラクトの概略であり、ジスルフィドブリッジを形成可能なコンストラクトのシステイン（下線を付した残基）を提供することで、未切断状態でのコンストラクトのコンホメーションを抑制するためのコンストラクト設計を示す。
図７は、切り替え可能な表現型を提示する候補を同定するのに用いられるスクリーニング／選別方法を示す概略である。細菌細胞表面でのＡＢＰポリペプチドの提示につながる発現ベクターを介してライブラリを導入した。得られた提示ライブラリには、３×１０８個を超える形質転換体が含まれていた。培養によるライブラリの拡大（「成長させたライブラリ」）後、ＡＢＰポリペプチドを提示する細胞をＭＭＰ−２酵素で処理し、切断可能な基質部分を切断した。次に、ＭＭＰ−２処理細胞を蛍光標識されたＶＥＧＦと接触させ、ＦＡＣＳで細胞を選別して、ＭＭＰ−２の切断後にＶＥＧＦと結合したＡＢＰを提示する細胞を単離する。次に、ＶＥＧＦ結合コンストラクトを提示した細胞を培養中で成長させて拡大（「成長させたライブラリ」）した。さらに、これらの細胞を標識されたＶＥＧＦと接触させ、ＦＡＣＳで選別して、ＭＭＰ−２の非存在下で標識されたＶＥＧＦと結合しなかったＡＢＰを提示する細胞を単離した。これらのステップをスクリーニング手順の１「サイクル」とする。その後、別のサイクルで細胞を培養中にて成長させて拡大（「成長させたライブラリ」）し、この培養物に対して再度スクリーニングステップの全体または一部を実施することが可能である。
ライブラリのスクリーニングと選別は、まずは酵素処理の非存在下で標識されたＶＥＧＦと結合しない（すなわち、切断されていないときにＶＥＧＦと結合しない）候補を選択して開始することも可能である旨に注意されたい。
ライブラリのうちの１つの例示としてのデータを図８にあげておく。１．５サイクルの選択（すなわち、完全な１サイクルの酵素処理、選別、ＶＥＧＦ結合、選別に続いて、半サイクルの酵素処理と選別）後、ライブラリでは「切り替え可能な」表現型に顕著な改善が認められ、酵素の非存在下での標識されたＶＥＧＦの結合（図８、右上パネル）が酵素の存在下（図８、右下パネル）よりも有意に低かった。また、図８の左側のパネルに示すように、未選別のライブラリはそれほど有意でもない切り替え可能な表現型を呈することから、この選択／選別方法が、ライブラリでの所望の切り替え可能な表現型を有するＡＢＰを提示する細胞の富化に有効であることが確認された。
また、選択されたクローンでは、システイン制約対照に比して「切り替え」活性の改善が認められた。図９は、各ライブラリ１〜４から同定された選択後のライブラリクローンについてのＭＭＰ−２での切断後の蛍光の増加倍数を示す。図６で同定されたライブラリのスクリーニング後に同定された図９の選択後のクローンは、ランダムライブラリのスクリーニング由来のクローンと比較すると、適度な改善を示した。たとえば、図９で同定された４０のクローンのうち、６つで蛍光が３倍に増加した。４０のクローンの平均蛍光増加はおよそ２倍であった。ランダムライブラリ由来のクローンでは、２３のクローンのうち２つで蛍光が３倍になった。クローンのランダムライブラリの平均蛍光増加はおよそ１．５倍であった。
最も顕著な「切り替え」表現型（酵素的に「活性化可能な」表現型とも呼ぶ）を呈するクローンのアミノ酸配列を図１０にあげておく。
さらにスクリーニングして、顕著な「切り替え」表現型を呈する別のクローンをいくつか同定した。これらのクローンでの酵素処理後の蛍光の増加倍数を図２４に示す。
図２５は、酵素切断後の蛍光の増加倍数に基づく、選択されたクローンの切り替え活性を示す。クローン４−２Ａ−１１（ＧＥＤＥＥＧ：固定のＧ残基を含む配列番号１９）、２−２Ａ−５（ＰＥＷＧＣＧ：固定のＧ残基を含む配列番号１１）、２−３Ｂ−５（ＣＥＹＡＦＧ：固定のＧ残基を含む配列番号２０）、１−３Ａ−４（ＣＳＭＹＷＭＲＧ：固定のＣ残基およびＧ残基を含む配列番号２１）、および２−３Ｂ−６（ＥＹＥＧＥＧ：固定のＧ残基を含む配列番号２２）の各々で、対照に比して切り替え活性の改善が示され、ＧＳ対照では蛍光の増加がおよそ２倍未満であったのに対してクローン２−３Ｂ−５では蛍光がほぼ１０倍増加した。
実施例４：切り替え可能な表現型は切断可能部分の切断に起因する
総じて、切り替え可能な表現型は、多かれ少なかれ標的結合部分（ＴＢＭ）に標的が到達できるようにするＡＢＰのコンホメーションの変化によるものである。ＡＢＰがジスルフィドブリッジを形成できるシステインを含有する場合、切り替え可能な表現型は少なくとも２つの異なる機序すなわち、１）酵素切断部位でのＡＢＰの切断または２）ＡＢＰのＮ末端およびＣ末端付近のシステイン間のジスルフィド結合の還元の結果であろう。
たとえば、システインを欠いたＭＭを含有するＡＢＰで切り替え挙動が観察された。各々異なる５アミノ酸ＭＭライブラリ配列を有する３つのクローンを、ＭＭＰ−２の存在下および非存在下で標識されたＶＥＧＦと結合する機能について試験した。図１１に示すように、ＧＥＤＥＥ：配列番号２３（ＧＥＤＥＥＧ：固定のＧ残基を含む配列番号１９）およびＤＤＭＥＥ：配列番号２４（ＤＤＭＥＥＧ：固定のＧ残基を含む配列番号２５）のＭＭライブラリアミノ酸配列を有するクローンでは、ＭＭでシステイン残基が欠けているにもかかわらず、ＭＭＰ−２の存在下で結合の改善が認められた。この結果から、ＡＢＰが所望の切り替え活性を呈するのにジスルフィド結合リンケージが必ずしも必要ではないことが分かる。
本明細書に記載のスクリーニング方法による同定された別のシステインおよび非システイン含有ＭＭ配列を、図２２に示す。
上述したように、切り替え可能な表現型は、ＭＭのシステイン残基とＴＢＭに隣接するシステイン残基との間のジスルフィド結合リンケージの破壊によって生じる可能性がある。この可能性を、ジスルフィド結合の還元条件の存在下および非存在下でクローンを試験して確認した。図１２に示すように、クローン２．２Ａ．５（上記のスクリーニング手順の生成物であるクローン）と、スクリーニング手順の生成物ではないシステイン制約親（すなわち、２倍の切り替え活性を示す設計または「トライアル」配列であり、配列を図４にあげてある）の各々を、ＤＴＴ還元条件の存在下および非存在下で標識されたＶＥＧＦと結合する機能について試験した。システイン制約親とクローン２．２Ａ．５の両方で、ＤＴＴによるジスルフィド結合の還元後に標識されたＶＥＧＦの結合の増加が認められた。
しかしながら、上記実施例のスクリーニング手順では、ジスルフィド結合の還元の結果として、コンホメーションの変化と関連するものよりも切り替え表現型が増大する。これは、システイン制約親コンストラクトおよびクローン２．２Ａ．５の切り替え表現型の解析結果によって実証される。ＭＭＰ−２の存在下および非存在下で、システイン制約親によるＶＥＧＦ結合のＫｄ，ａｐｐ値を求め、ＭＭＰ−２の存在下および非存在下で、ライブラリクローン２．２Ａ．５によるＶＥＧＦ結合のＫｄ，ａｐｐ値と比較した。酵素の存在下でのシステイン制約親のＫｄがおよそ３．４倍改善された（図１３）のに対し、クローン２．２Ａ．５では酵素の存在下でＫｄがおよそ４．８倍改善された（図１４）。
別の実験では、ＭＭＰ−２の存在下および非存在下でシステイン制約ループ構造の蛍光値を求め、ＭＭＰ−２の存在下および非存在下でライブラリクローン４．２Ａ．１１（別名４−２Ａ−１１）および２．３Ｂ．５（別名２−３Ｂ−５）の蛍光値と比較した。システイン制約ループ構造では酵素の存在下で蛍光がおよそ３倍に増加した（図２３）のに比して、クローン４．２Ａ．１１では酵素の存在下で蛍光がほぼ５．７倍に増加（図２３）し、クローン２．３Ｂ．５では酵素の存在下で蛍光がほぼ１１．８倍に増加した。
これらの結果から、切り替え可能な表現型を増すためのシステイン制約ＡＢＰの最適化は、可変アミノ酸配列を有するＭＭを含有するＡＢＰライブラリをスクリーニングすることで達成可能であることが分かる。
実施例５：所望のダイナミックレンジのスクリーニング
１）ＭＭを改善して標的とＴＢＭとの間の結合を防止することで、スイッチオフ状態を改善可能である、２）協働標的結合要素として作用するＭＭモチーフにつながる基質切断後にＴＢＭの親和性を改善可能であるという少なくとも２つの機序で、ダイナミックレンジを増すことが可能である（図４および図５）。拡大されたダイナミックレンジのスクリーニングは、特定の実施形態では、図２に表される「Ａ」ステップと「Ｂ」ステップに異なる濃度の標的タンパク質を用いる交互分離（ＦＡＣＳを用いるなど）を使用することで、効果的に実現可能である。単独で（すなわちスイッチの状況外で）使用する場合にＴＢＭに比して親和性が改善されている場合がある分離「Ａ」バインダーで同定するには、ＴＢＭの想定解離定数（１００ｎＭ）のおよそ１０分の１である標的ｃｅｏｎｔｒａｔｉｏｎ１０ｎＭを使用した。次に、ＦＡＣＳを用いて蛍光レベルが最大の細胞を回収し、一晩成長させて増幅した。続いて、オフ状態（すなわちプロテアーゼの非存在下で標的と結合する機能）を改善する目的で、１μＭのＶＥＧＦ（ＴＢＭのＫＤよりも有意に高い濃度）とともに細胞個体群をインキュベートし、蛍光レベルの低い細胞を回収した。このプロセスによって、Ａ選別とＢ選別の両方で同一濃度の標的を用いるプロセスよりもダイナミックレンジが大きいＡＢＰのプールが得られた。ステップ「Ａ」および「Ｂ」に異なる標的濃度を用いるスクリーニング方法の別の実施形態を図２１に示す。ここでは、ＶＥＧＦ濃度２５ｎＭを「Ａ」選別に使用し、ＶＥＧＦ濃度２５０ｎＭを「Ｂ」選別に使用する。ＦＡＣＳを用いた選択による富化された細胞個体群を、選別１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａについて図１５および図１６に示す。この場合、ＡおよびＢは、それぞれポジティブ選択とネガティブ選択である。ライブラリのＡＢＰ富化については、プロテアーゼ処理による未選別のライブラリ個体群での蛍光分布の変化と、プロテアーゼ処理前後のラウンド３Ａの個体群の蛍光分布の変化とを比較することで、判断可能である。後者の富化されたプールでは、酵素処理後の細胞蛍光の４倍増（図１６、右側のパネル「選別３Ａ ２５ｎＭ ＶＥＧＦ」）から分かるように、平均ダイナミックレンジがおよそ４倍になる。
実施例６：可溶性タンパク質融合物が酵素による結合を実証
可溶性形態でのＡＢＰの活性を実証するために、ＶＥＧＦ結合クローンおよびＶＥＧＦ結合ＡＢＰのＣ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合物を構成し、試験した。
方法および材料
標準的なアミンカップリングキットを用いて、ＶＥＧＦをＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５センサチップ表面に固定化した。まず、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ソフトウェアの表面調製ウィザードを用いてＮＨＳ／ＥＤＣ混合物を注入して、表面を活性化した。次に、所望の固定化量に達する（一般に約５０００応答単位）まで濃度２５ｕｇ／ｍＬのＶＥＧＦを注入した。さらに、表面をエタノールアミンでブロックする。別の表面で、ＮＨＳ／ＥＤＣを使用し、続いてエタノールアミンを用いて対照反応を実施した。
ＶＥＧＦを共有結合的に固定化した後、ＶＥＧＦ結合またはＶＥＧＦ結合ＡＢＰクローンのマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合物を、ＶＥＧＦ表面と対照表面の両方に注入した。注入は一般に１分間なされ、注入ごとに数分の解離時間を取った。３０ｎＭのＭＭＰ−２酵素を用いる場合と用いない場合の両方で、クローンを注入した。解析用に、ＶＥＧＦ表面でのシグナルから対照表面でのシグナルを差し引いた値を結合応答（ＲＵ）とする。酵素を用いる場合と用いない場合とで、クローン濃度を最大で１５マイクロモルとして、クローンを３重に比較した。
結果
図２７に示すように、例示としてのＭＢＰ−ＡＢＰ融合物は、その酵素によるＶＥＧＦ結合特性を保ち、２．３Ｂ．５（２−３Ｂ−５）融合物ではＭＭＰ−２酵素の存在下で結合応答がほぼ４倍に増加した。酵素の存在下で、ＶＥＧＦ結合ペプチド対照には同様の結合応答の増加は認められなかった。これらの結果から、可溶性ＡＢＰの「切り替え活性」が保たれたことが実証される。
実施例７：抗ＶＣＡＭ−１ ＡＢＰでＭＭとして用いるペプチド配列の同定
ＡＢＰのマスキング部分（ＭＭ）として用いるペプチド配列の同定には、以下の材料および方法を利用した。ここで、標的結合部分（ＴＢＭ）は、抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦｖの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。
方法および材料
磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）（１回）と蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）（３回）を利用して、抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦｖと強く結合しているクローンを富化した。
１ｎＭの抗ビオチンフィコエリトリン（ＰＥ）または５０ｎＭのビオチン化抗ＶＣＡＭ ｓｃＦｖ、続いて１ｎＭの抗ビオチンＰＥと接触させた後、選択されたペプチド配列を提示する細菌細胞をＦＡＣＳで選別した。
結果
参照ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ解析の結果として、以下のペプチド配列を同定した。
Figure 2019106994
図２８のＦＡＣＳ解析で示されるように、各クローンＢＢＢ−０８、ＢＢＢ−０９、ＢＢＢ−１６は、抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶに対して有意な結合を示した。３種類のクローンのうち、ＢＢＢ−０８が抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶに対して最高レベルの結合を示し、抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶの非存在下での平均蛍光値が１４２であったのに比して、抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦＶを伴うインキュベーション後の平均蛍光値は２，６２５であった。それ自体、これらのペプチドは、ＴＢＭとして抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦｖの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むＡＢＰにおける機能的ＭＭの候補となる可能性が高い。
実施例８：抗ＶＣＡＭ−１抗原結合ドメインを含む予測的ＡＢＰ
抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦｖ（ＭＫ２７１）を含むＡＢＰの予測的な例を本明細書に記載する。これらのＡＢＰは、結合されたＭＭがゆえに正常な状態で不活性になる。しかしながら、ｓｃＦｖがプラークの部位に到達すると、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１がペプチド阻害剤とｓｃＦｖとをつないでいる基質リンカーを切断し、これがＶＣＡＭ−１と結合できるようにする。このプロセスの表示を図３５に示す。細菌細胞の表面提示を実施例７に記載されているようにして使用し、抗体の好適なＭＭを見いだした。予測的ＡＢＰでは、プロテアーゼ活性化後に標的された結合とコンピテントになるｓｃＦｖコンストラクトを作製するトリガーとして用いられる酵素基質と、選択されたＭＭとを組み合わせる。
実施例７で同定され、抗ＶＣＡＭ−１ ｓｃＦｖの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むペプチド配列を利用する予測的ＡＢＰを、図２９、図３０、図３１に示す。これらの予測的ＡＢＰ配列は、抗ＶＣＡＭ ｓｃＦＶ、ＭＭＰ−１基質、抗ＶＣＡＭ ｓｃＦＶ配列と結合するＯｍｐＡ周辺質シグナル配列、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ペプチド配列を含む。小文字の太字ではない文字はリンカー配列を示す。抗ＶＣＡＭ ｓｃＦＶの配列については、下線と大文字で示してある。ＭＭ配列は太字の大文字で示してある。
プロテアーゼ活性化抗体の構成
単鎖形態のＶＣＡＭ−１抗体を含むＡＢＰをコードする遺伝子を、フランキング用のＳｆｉＩ制限酵素部位を用いる全遺伝子合成またはオーバーラップ伸長ＰＣＲで生成し、ＳｆｉＩで消化し、同様に消化した発現プラスミドｐＢＡＤ３３あるいは、当業者に馴染みのある他の好適な細菌、酵母または哺乳類の発現ベクターにライゲートする。あるいは、半減期延長部分（ＩｇＧのＦｃ領域、血清アルブミンまたはトランスフェリンなど）を取り入れた市販の発現ベクターと当業者に馴染みのある方法とを用いて、全長抗体を生成してもよい。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢＬ２１またはＨＥＫ２９３ｔ細胞などの適切な発現宿主に、発現プラスミドを形質転換またはトランスフェクトする。周辺質画分抽出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、一晩培養から単鎖抗体を収穫し、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィで精製する。
場合によっては、細胞質に不溶性凝集体として抗体を含むＡＢＰを生成すると望ましいことがある。このような場合、シグナル配列を除去することができ、適切な親和性タグ（６×Ｈｉｓ）をＣ末端に導入して精製を助けることが可能である。（封入体としての）細胞質発現用の予測的ＡＢＰ配列を、図３２、図３３、図３４にあげておく。小文字の太字ではない文字はリンカー配列を示す。抗ＶＣＡＭ ｓｃＦＶの配列については、下線と大文字で示してある。ＭＭ配列は太字の大文字で示してある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗体切り替え活性のアッセイ
濃度１ｐＭ〜１μＭ）のプロテアーゼ活性化抗体のアリコートを、０ｎＭと５０ｎＭのＭＭＰ−１を用いて別々に３時間、緩衝水溶液でインキュベートする。次に、固定化抗原ＶＣＡＭ−１を用いるＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって、反応混合物の結合をアッセイする。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標） ＳＰＲ機器を用いると、共鳴単位が増加することで、プロテアーゼ処理後のＡＢＰの結合活性の増大が示される。その後、機器製造業者の指示（ＢＩＡｃｏｒｅ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って、ＭＭＰ切断の結果としての見かけの解離定数（Ｋｄｉｓｓ）の変化を計算することができる。
実施例９：抗ＶＥＧＦ ｓｃＦＶ ＴＢＭのクローニング
特定の実施形態では、ＡＢＰは、ＡＢＤと、ＭＭと、ＣＭとを含有するＴＢＭを含む。この例ならびに以下の例では、マスクされたＭＭＰ−９切断可能な抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ（標的＝ＶＥＧＦ；ＴＢＭ＝抗ＶＥＧＦ単鎖Ｆｖ）を含有するＡＢＰを構成した。このようなＡＢＰの生成における第１のステップとして、抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖを含有するコンストラクトを生成した（ＴＢＭ）。ラニビズマブの公開されている配列（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｃ．，Ｆｕｈ，Ｇ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．，ＭｃＫａｙ，Ｐ．，ｄｅ Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．，Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９９）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ Ｆａｂ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３，８６５〜８８１）から、抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭ（ＶＬ−リンカーＬ−ＶＨ）を設計し、Ｃｏｄｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で合成した。
ラニビズマブは、ベバシズマブと同一の親マウス抗体に由来するモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントである（Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＳＪ，ｅｔ ａｌ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７：４５９３〜９，１９９７）。親分子よりもかなり小さく、ＶＥＧＦ−Ａに対して一層強い結合が得られるよう親和性成熟されている。ラニビズマブは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）のあらゆるサブタイプと結合し、これを阻害する。Ｎ末端のＨｉｓ６タグとＴＥＶプロテアーゼ切断部位とを設計に含めた。ＴＥＶプロテアーゼは、タバコエッチウイルスから単離されたプロテアーゼであり、極めて特異的であり、精製後に融合タンパク質を分離するのに用いられる。抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、以下の配列番号２９および３０に示す。
Figure 2019106994
Figure 2019106994
実施例１０：抗ＶＥＧＦ ｓｃｆｖに対するＭＭのスクリーニングと同定
ラニビズマブを使用して、Ｘ１５（８．３×１０９）、Ｘ４ＣＸ７ＣＸ４（３．６×１０９）またはＸ１２ＣＸ３（１．１×１０９）であるペプチドからなるプールされたランダムペプチドライブラリをスクリーニングした。この場合のＸは任意のアミノ酸であり、数字はライブラリの全多様性を表している。プールされたライブラリの全多様性は１．３×１０１０であった。スクリーニングについては、ＭＡＣＳを１回とＦＡＣＳ選別を２回で構成した。１回目のＭＡＣＳスクリーニングでは、１×１０１１個の細胞を１５０ｎＭのビオチン化−ラニビズマブでプローブし、５．５×１０７個の結合細胞を単離した。１回目のＦＡＣＳスクリーニングでは、ＭＡＣＳスクリーニングで単離されたポジティブ細胞を５００ｎＭのビオチン化−ラニビズマブでプローブし、ニュートラアビジン−ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で可視化した。２回目と３回目のＦＡＣＳ選択は、５００ｎＭと１００ｎＭのＡｌｅｘａ−標識ラニビズマブを用いて、２０ｕＭのＩｇＧの存在下で実施した。個々のクローンを配列決定し、続いてＦＡＣＳ解析により抗ＶＥＧＦ ｓｃｆｖと結合する機能を検証した。抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖに対するＭＭのアミノ酸配列を以下の表１０にあげておく。（以下、これらの配列を２８３ＭＭ、２９２ＭＭ、３０６ＭＭなどと呼ぶ。）
Figure 2019106994
実施例１０：ＡＢＰの構成：ＭＭＰ−９切断可能な、マスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖベクター
ＣＭ（ＭＭＰ−９の基質）をマスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖコンストラクトに融合し、切断可能な、マスクされたＡＢＰを得た。例示としてのコンストラクトを図３８に示す。異なるＣＭを含有するいくつかの例示としてのＡＢＰコンストラクトおよび配列について、詳細を以下で説明する。例示としてのコンストラクトの構成に利用されるプライマーを、以下の表１１にあげておく。
Figure 2019106994
ＡＢＰのクローニングと発現：ＭＢＰ融合物としてのＭＭＰ−９切断可能な、マスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ
クローニング：ＭＢＰ：抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭ融合物をクローニングした。ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）は、融合タンパク質としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で十分に発現し、融合タンパク質を生成するための従来技術において周知の方法であるマルトースカラムで精製可能である。この例では、ＭＢＰを用いて、マスクされたｓｃＦｖを分離した。複数のクローニング部位（ＭＣＳ）でＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いて、Ｈｉｓ６タグを付した抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭをＭＢＰとのＣ末端融合物としてのｐＭａｌ−ｃ４ｘベクター（ＮＥＢ）にクローニングした。プライマーＣＸ０２３３およびＣＸ０２４９（表１１）を用いて、抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭを増幅し、それぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。
ペプチドＭＭのクローニング部位、リンカー配列、ＭＭＰ−９ ＣＭプロテアーゼ部位を、ＴＥＶプロテアーゼ部位と抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭとの間に配置するオーバーラッププライマーＣＸ０２７１およびＣＸ０２７０を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＡＢＰ（ペプチドＭＭ、抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭ、ＭＭＰ−９ ＣＭ）の受容ベクターを合成した。プライマーＣＸ０２７１とＣＸ０２４９（表１１）を用いて、コンストラクトのＣ末端部分を増幅し、かたやプライマーＣＸ０２７０とＣＸ０２８８（表１１）を用いて、Ｎ末端部分を増幅した。両方の反応で得られる生成物を、外部プライマーであるＣＸ０２４９およびＣＸ０２８８（表１１）を用いる最終ＰＣＲ反応用に組み合わせ、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（配列番号５０）を用いてＭＢＰ融合物としてｐＭａｌ ベクターにクローニングした。
Figure 2019106994
プライマーＣＸ０２８９およびＣＸ０２９０（表１１）を用いて、ｅｃｐＸ提示ベクターから３０６ＭＭおよび３１４ＭＭ（表１０）を増幅し、ＳｆｉＩ制限部位を用いてＮ末端マスクされたベクターに方向クローニングした。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下の表１３にあげておく。
Figure 2019106994
Figure 2019106994
発現：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫ１２ ＴＢ１株でＭＢＰ：ＡＢＰ融合物を発現させた。所望のコンストラクトを含有するアンピシリン耐性コロニーを用いて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢ培地を含有する５ｍｌの一晩培養を播種した。この一晩培養全体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと０．２％のグルコースとを補充した５００ｍＬの新鮮なＬＢ培地の播種に使用し、３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪してＯ．Ｄ．０．５に達するまで成長させた。次に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを最終濃度０．３ｍＭまで加え、同一条件下で培養をさらに３時間成長させた後、３０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収穫した。標準的な方法を用いて封入体を精製した。簡単に説明すると、１０ｍｌのＢＰＥＲ ＩＩ細胞溶解試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）。１４，０００×ｇの遠心処理で不溶性材料を回収し、可溶性タンパク質を廃棄した。１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを補充した５ｍｌのＢＰＥＲ ＩＩに不溶性材料を再懸濁させ、氷上にて１０分間インキュベートした後、水で１：２０に希釈した５ｍｌのＢＰＥＲ ＩＩを加えて、試料を１４，０００×ｇでスピンした。上清を除去し、ペレットを１：２０のＢＰＥＲＩＩで２回洗浄した。精製後の封入体を、ＰＢＳ ８Ｍの尿素、１０ｍＭのＢＭＥ、ｐＨ７．４に可溶化した。
ＭＢＰ融合タンパク質をおよそ１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、８から０Ｍの尿素から、６、４、２、０．５、０Ｍの尿素で段階的に透析し、再び折り畳んだ。４、２、０．５Ｍの尿素のステップでは、０．２Ｍのアルギニン、２ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭのオキシグルタチオンを加えた。０Ｍの尿素での透析には０．２Ｍのアルギニンを含めた。尿素の除去後、０．０５Ｍのアルギニンに対してタンパク質を透析した後、ＰＢＳ ｐＨ７．４に対して大規模に透析した。透析はすべて４℃で一晩実施した。凝集体を除去するために、セファクリルＳ−２００カラムで各タンパク質にサイズ排除クロマトグラフィをほどこした。正しく折り畳まれたタンパク質を含有する画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過機で濃縮した。
ＡＢＰのクローニングと発現：ＭＭＰ−９切断可能な、マスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃｆｖ ＣＨｉｓタグ
クローニング：プライマーＣＸ０３０８およびＣＸ０３１０（表１１）を用いて、ＮｃｏＩ制限部位を増幅して（ＭＭ受容部位／ＭＭＰ−９ ＣＭ／ＶＥＧＦｓｃＦｖ ＴＢＭ）ベクターの５’末端に加え、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびＨｉｓ６タグを増幅して３’末端に加えた上で、これをｐｅｌＢシグナルペプチド含有ベクターにクローニングした。抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＭＭを上述したようにしてクローニングした。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下の表１４にあげておく。
Figure 2019106994
発現：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫ１２ ＴＢ１株で抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ Ｈｉｓ ＡＢＰを発現させた。所望のコンストラクトを含有するアンピシリン耐性コロニーを用いて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢ培地を含有する５ｍｌの一晩培養を播種した。この一晩培養２．５ｍｌを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと０．２％のグルコースとを補充した２５０ｍＬの新鮮なＬＢ培地の播種に使用し、３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪してＯ．Ｄ．１．０に達するまで成長させた。次に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを最終濃度０．３ｍＭまで加え、３０℃で培養をさらに５時間成長させた後、３０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収穫した。リゾチーム／浸透圧衝撃法を用いて、周辺質画分をすみやかに精製した。簡単に説明すると、細胞ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０％スクロース（ｐＨ７．４）３ｍＬに再懸濁させ、２ｕＬ／ｍＬのすぐに使える状態にあるリゾチーム溶液を加えた。氷上にて１５分間のインキュベーション後、１．５容量の水（４．５ｍＬ）を加え、細胞を氷上にてさらに１５分間インキュベートした。１４，０００×ｇでの遠心処理で可溶性周辺質画分を回収した。
Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて、抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ Ｈｉｓタンパク質を部分精製した。粗周辺質抽出物をＮｉ−ＮＴＡ樹脂０．５ｍｌに仕込み、５０ｍＭのホスフェート、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。Ｈｉｓタグを付したタンパク質を、５０ｍＭのホスフェート、３００ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＩｍｉｄｉｚａｌｅ、ｐＨ６．０で溶出した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濃縮器を用いてタンパク質をおよそ６００μＬまで濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
ＡＢＰのクローニングと発現：ヒトＦｃ融合物としてのＭＭＰ−９切断可能な、マスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ
クローニング：プライマーＣＸ０３１２およびＣＸＯ３１４（表１１）を用いて、ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖをコードする配列を増幅した。このプライマーは、５’ＥｃｏＲＩ制限部位および３’ＮｃｏＩ制限部位の配列ならびに、リンカー配列も含んでいた。ＰＣＲ増幅配列をＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで切断し、続いてｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクターにクローニングすることで、Ｆｃ融合タンパク質の発現用のベクターを生成した。これらのベクターに、上述したようにして抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭ ＭＭを挿入した。３０６ＭＭ、３１３ＭＭ、３１４ＭＭ、３１５ＭＭ、非結合ＭＭ（１００ＭＭ）を含有するコンストラクトならびに、ＭＭを持たないコンストラクトを構成し、配列を確認した。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下の表１５にあげておく。
Figure 2019106994
Figure 2019106994
発現：ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）どおりに用いるトランスフェクションによって、３０６ ＭＭ／ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ−Ｆｃ、３１４ ＭＭ／ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ−Ｆｃまたは抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ−Ｆｃの発現ベクター１０μｇを、１０７個のＨＥＫ−２９３ ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）に導入した。トランスフェクトした細胞を、さらに７２時間インキュベートした。インキュベーション後、条件培地を収穫し、遠心処理して細胞とデブリを取り除いた。条件培地の活性をＥＬＩＳＡでアッセイした。
実施例１１：ＡＢＰの試験
ＭＭＰ−９による、マスクされたＭＭＰ−９切断可能な抗ＶＥＧＦ ＡＢＰの活性化を測定するために、ＶＥＧＦの２μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液１００μｌをマイクロウェル（９６ Ｗｅｌｌ Ｅａｓｙ Ｗａｓｈ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、４℃で一晩インキュベートした。次に、ウェルを３×１５分間３００ｕＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックした。次に、ＭＭＰ−９で処理したまたは未処理のＡＢＰ（各コンストラクトに関する詳細については下記参照）１００マイクロリットルを、ＰＢＳＴ、１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋでウェルに加え、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。３００ｕｌのＰＢＳＴを用いて、すべての洗浄ステップを３回実施した。次に、１００マイクロリットルの二次検出試薬を加え、ＲＴで１時間インキュベートしておいた。１００ｕｌのＴＭＢ １（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液を用いてＨＲＰの検出を終了した。１００μＬの１Ｎ ＨＣＬを用いて反応を停止し、４５０ｎＭでの吸光度を測定した。
ＭＢＰ／ＭＭ／ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＴＢＭを含有するＡＢＰコンストラクトのＥＬＩＳＡアッセイ
２００マイクロリットルのビオチン化ＡＢＰを、ＭＭＰ−９消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ６．８）中、濃度２００ｎＭで、２０Ｕ ＴＥＶプロテアーゼを用いて４℃で一晩消化し、ＭＢＰの融合相手を除去した。次に、約３ＵのＭＭＰ−９を用いて３７℃で試料を３時間インキュベートし、ＰＢＳＴ、１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋにて１：１で最終濃度１００ｎＭまで希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに加えた。アビジン−ＨＲＰコンジュゲートを希釈率１：７５００で用いて、ＡＢＰを検出した。ＭＭＰ−９切断可能なマスクされたＭＢＰ：抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ ＡＢＰのＭＭＰ−９活性化を図３９に示す。
ＭＭ／ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ Ｈｉｓを含有するＡＢＰコンストラクトのＥＬＩＳＡアッセイ
ＭＭＰ−９消化緩衝液（１５０μＬ）で透析した粗周辺質抽出物を、約３ＵのＭＭＰ−９を用いる場合と用いない場合とで、３７℃で３時間インキュベートした。次に、ＰＢＳＴ、１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋを用いて試料を４００μＬまで希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに加えた。抗Ｈｉｓ６−ＨＲＰコンジュゲートを希釈率１：５０００で用いて、ＡＢＰを検出した。ＭＭＰ−９切断可能なマスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ Ｈｉｓ ＡＢＰのＭＭＰ−９活性化を図４０に示す。
ＭＭ／ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ−Ｆｃを含有するＡＢＰコンストラクトのＥＬＩＳＡアッセイ
５０マイクロリットルのＨＥＫ細胞上清を２００μＬのＭＭＰ−９消化緩衝液に加え、約１９ＵのＭＭＰ−９を用いる場合と用いない場合とで、３７℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳＴ、１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋにて試料を１：１に希釈し、１００μＬをＥＬＩＳＡウェルに加えた。抗ヒトＦｃ−ＨＲＰコンジュゲートを希釈率１：２５００で用いて、ＡＢＰを検出した。ＭＭＰ−９切断可能なマスクされた抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ−ＦｃのＭＭＰ−９活性化を図４１示す。
ＭＭ／ＭＭＰ−９ ＣＭ／抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ−Ｆｃを含有するＡＢＰコンストラクトの精製とアッセイ
タンパク質Ａカラムクロマトグラフィを用いて抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ Ｆｃ ＡＢＰを精製した。簡単に説明すると、ＨＥＫ細胞上清１０ｍＬをＰＢＳで１：１に希釈し、ＰＢＳで事前に平衡化した０．５ｍＬのタンパク質Ａ樹脂に加えた。結合されたタンパク質を、１７０ｍＭの酢酸塩、３００ｍＬのＮａＣｌ ｐＨ２．５で溶出する前に、１０カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄し、２００μＬの２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で１ｍＬの画分をすみやかに中和した。次に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濃縮器を用いてタンパク質を含有する画分を濃縮した。ＨＥＫ細胞上清でＥＬＩＳＡを実施した。タンパク質Ａカラムを用いて精製したＭＭ ３０６および３１４を有する抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ Ｆｃ ＡＢＰコンストラクトのＭＭＰ−９依存性ＶＥＧＦ結合を示すＥＬＩＳＡデータを図４２に示す。
実施例１２：抗ＣＴＬＡ４ ＭＭのライブラリスクリーニングと単離
Ｂｅｓｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ（Ｂｅｓｓｅｔｔｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｊ ａｎｄ Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．１７：１０，７３１〜７３９，２００４）の方法で、ＣＴＬＡ４抗体マスキング部分（ＭＭ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面に提示された１０１０のランダム１５ｍｅｒペプチドのコンビナトリアルライブラリから単離した。ビオチン化マウス抗ＣＴＬＡ４抗体（クローンＵＣ４ Ｆ１０−１１、２５ｎＭ）をライブラリとともにインキュベートし、推定上の結合ペプチドを発現している抗体結合細菌を、ストレプトアビジンコート磁気ナノビーズを用いて非バインダーから磁気的に選別した。ＦＡＣＳを用いて富化の後続回を実施した。ＦＡＣＳの初回では、ビオチン化標的（５ｎＭ）と、ストレプトアビジンフィコエリトリンを用いる二次標識ステップによって、細菌を選別した。ＦＡＣＳの後続回では、Ｄｙｌｉｇｈｔ標識抗体を用いて選別し、標的の濃度を低下させて（１ｎＭ、続いて０．１ｎＭ）、二次標識ステップのアビディティの影響を回避するとともに、親和性が最も高いバインダーを選択した。ＭＡＣＳを１回とＦＡＣＳを３回でバインダーのプールを得て、そこから個々のクローンを配列決定した。フィシン消化Ｄｙｌｉｇｈｔ標識Ｆａｂ抗体フラグメントを用いて個々のクローンの相対親和性およびオフレートスクリーニングを実施し、細菌表面での複数のペプチドの発現による二価抗体のアビディティの影響を抑えた。標的特異性についての別の試験として、競合相手としての２０ｕＭの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）欠失ＩｇＧの存在下で個々のクローンの結合をスクリーニングした。ＭＭ最適化用に選んだ４つのクローンのアミノ酸とヌクレオチド配列を表１６にあげておく。これらの配列は、１８７ＭＭ、１８４ＭＭ、１８２ＭＭ、１７５ＭＭと同義に示される。切断後にＭＭの解離に対してオフレートがおよぼす影響を判断するように、一定範囲のオフレートを有するＭＭ候補を選択した。抗ＣＴＬＡ４と結合しなかったＭＭをネガティブ対照として使用した。
Figure 2019106994
実施例１３：抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖのクローニング
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ Ｌ．Ｋ．，Ｎ．Ａ．Ｎｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｔ．Ｔ．Ｔｓｕ，Ｍ．Ｓ．Ｈａｙｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｙｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｍｉｔｔｌｅｒ，ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ．．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：１，１〜２０，１９９６）の方法に基づいて、ＵＣ４Ｆ１０−１１ハムスター抗マウスＣＴＬＡ４抗体を分泌するＨＢ３０４ハイブリドーマ細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から抗ＣＴＬＡ４ ＳｃＦｖをクローニングした。このプロトコールの詳細な内容については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ ｉｎ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ．ｉｂｍｓ．ｓｉｎｉｃａ．ｅｄｕ．ｔｗ／〜ｓｒｏｆｆ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｓｃＦｖ．ｈｔｍで指定可能なウェブサイトで参照可能である。簡単に言えば、ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ハイブリドーマから全ＲＮＡを単離した。プライマーＩｇＫ１（ｇｔｙｔｔｒｔｇｎｇｔｎａｃｙｔｃｒｃａ）およびＩｇＨ１（ａｃｄａｔｙｔｔｙｔｔｒｔｃｎａｃｙｔｔｎｇｔ）（上記にて引用したＧｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）を、それぞれ可変軽鎖および重鎖の最初の鎖合成に使用した。末端トランスフェラーゼとともにポリＧ尾を加えた後、軽鎖と重鎖（ポリＧ尾特異的）の両方に対するＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ部位を含有する５’ＡＮＣＴＡＩＬプライマー（上記にて引用したＧｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）（ｃｇｔｃｇａｔｇａｇｃｔｃｔａｇａａｔｔｃｇｃａｔｇｔｇｃａａｇｔｃｃｇａｔｇｇｔｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ：配列番号７３）と、マウス抗体定常領域配列由来であって、それぞれ軽鎖および重鎖の増幅用にＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ部位を含有する３’ＨＢＳ−ｈＩｇＫ（ｃｇｔｃａｔｇｔｃｇａｃｇｇａｔｃｃａａｇｃｔｔａｃｙｔｔｃｃａｙｔｔｎａｃｒｔｔｄａｔｒｔｃ：配列番号７４）およびＨＢＳ−ｈＩｇＨ（ｃｇｔｃａｔｇｔｃｇａｃｇｇａｔｃｃａａｇｃｔｔｒｃａｎｇｃｎｇｇｎｇｃｎａｒｎｇｇｒｔａｎａｃ：配列番号７５）（上記にて引用したＧｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）とを用いて、ＰＣＲを実施した。コンストラクトおよびベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、ライゲートして、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に形質転換した。個々のコロニーを配列決定し、既存のマウス抗体およびハムスター抗体と比較して、ＶＬおよびＶＨの正しい配列（それぞれ表１７および表１８）を確認した。提示された配列における抗ＣＴＬＡ４について説明したようなリーダー配列も一般にシグナル配列または分泌リーダー配列と呼ばれ、抗体の分泌を指令するアミノ酸配列である。この配列は、分泌時に細胞によって切り落とされ、成熟タンパク質には含まれない。また、Ｔｕｖｅ ｅｔ ａｌ（Ｔｕｖｅ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｔ−Ｌ．，Ｔｏｕｒｅ，Ｐ．，Ｓｏｗ，Ｐ．Ｓ．，Ｆｅｎｇ，Ｑ．，Ｋｉｖｉａｔ，Ｎ．，Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｒ．，Ｎｉ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｒｏｆｆｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｓｉｔｅ −Ｌｏｃａｔｅｄ ＣＴＬ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ−４ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：１２，５９２９〜５９３９，２００７）によってクローニングされた同一のｓｃＦｖが、本明細書に記載の配列と同一であった。
Figure 2019106994
Figure 2019106994
実施例１４：ＭＭおよびＣＭを用いる抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの構成
発現と機能に最適な抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの向きを判断するために、プライマーを設計し、ＶＨまたはＶＬのいずれかをＮ末端に用いて、後の「オーバーラップ伸長によるスプライシング」ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ用に（ＧＧＧＳ）３リンカーの半分をＮ末端またはＣ末端のいずれかに用いて可変軽鎖および重鎖を個々にＰＣＲ増幅した；Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅ ７７，６１〜６８）。ＮｄｅＩ制限部位をＮ末端で操作して、ヌクレオチド配列の最初で開始コドンをインフレームに生成し、Ｈｉｓタグおよび停止コドンをＣ末端に加えた。次に、アウタープライマーを用いてソーイングＰＣＲによって軽鎖と重鎖を接合し、ＶＨＶＬおよびＶＬＶＨの両方でＳｃＦｖを生成した（図４３）。プライマーを以下の表１９にあげておく。
Figure 2019106994
次に、一組のオーバーラッププライマーを設計してＭＭクローニング用のｓｆｉおよびｘｈｏ１部位を加えた後、ＳｃＦｖコンストラクトのＮ末端にＭＭＰ−９切断配列および（ＧＧＳ）２リンカーを加えた。これらのプライマーを表２０にあげ、図４４に概略的に示す。
Figure 2019106994
ＳｃＦｖを含有するリンカーをＰＣＲ増幅し、Ｎｄｅ１およびＥｃｏＲ１（ＶＨの内部制限部位）で消化し、ゲル精製した。ＰＣＲフラグメントをベクターにライゲートし、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に形質転換した。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表２１にあげ、図４５に示す。
Figure 2019106994
ＭＭ配列をＰＣＲ増幅し、ｓｆｉ１部位およびｘｈｏ１部位で消化し、リンカー抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖコンストラクトにライゲートし、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に形質転換して配列決定した。ＭＭ１８７−ＣＭ−ＴＢＭの完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、以下の表２２および表２３にそれぞれ配列番号９６および９７としてあげておく。
Figure 2019106994
Figure 2019106994
ＭＭ−ＣＭ−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦＶ−Ｆｃ融合体を生成するために、表２４に列挙する以下のプライマーを設計して、インフュージョンシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によってｐｆｕｓｅ Ｆｃベクターへのクローニング用にコンストラクトをＰＣＲ増幅した。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、個々のクローンの配列を確認した。
Figure 2019106994
実施例１５：ＨＥＫ−２９３細胞におけるマスクされた／ＭＭＰ−９／抗ＣＴＬＡ ｓｃＦｖ−Ｆｃの発現とアッセイ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）どおりに用いるトランスフェクションによって、ｐ１７５ＣＴＬＡ４ｐｆｕｓｅ、ｐ１８２ＣＴＬＡ４ｐｆｕｓｅ、ｐ１８４ＣＴＬＡ４ｐｆｕｓｅ、ｐ１８７ＣＴＬＡ４ｐｆｕｓｅまたはｐｎｅｇＣＴＬＡ４ｐｆｕｓｅの発現ベクター１０ｕｇを、１０７個のＨＥＫ−２９３ ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。トランスフェクトした細胞を、さらに７２時間インキュベートした。インキュベーション後、条件培地を収穫し、遠心処理して細胞とデブリを取り除いた。条件培地の活性を後述するようにＥＬＩＳＡでアッセイした。
ＭＭ１７５−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、ＭＭ１８２−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、ＭＭ１８４−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、ＭＭ１８７−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖまたはＭＭｎｅｇ−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖを発現しているＨＥＫ−２９３由来の条件培地５０マイクロリットルを、２００μＬのＭＭＰ−９消化緩衝液に加え、約１９ＵのＭＭＰ−９を用いる場合と用いない場合とで、３７℃で２時間インキュベートした。次に、試料をＰＢＳ、４％ノンファット脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で１：１に希釈し、競合ＥＬＩＳＡで結合活性をアッセイした。
マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳに入れた０．５ｍｇ／ｍｌの溶液１００ｕｌを９６ウェルのＥａｓｙ Ｗａｓｈ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。次に、２％ノンファット脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）をＰＢＳに入れたもの１００ｕｌでウェルを室温（ＲＴ）にて１時間ブロックした後、ＰＢＳ；０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。ＭＭＰ−９で事前に処理しておくか未処理のＭＭ１７５−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、ＭＭ１８２−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、ＭＭ１８４−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、ＭＭ１８７−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖまたはＭＭｎｅｇ−抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖを発現しているトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞由来の条件培地５０ｕｌを、ウェルに加え、ＲＴで１５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５ｕｇ／ｍｌのビオチン化マウスＢ７１−Ｆｃ（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する５０ｕｌのＰＢＳを各ウェルに加えた。ＲＴで３０分さらにインキュベーションした後、ウェルを１５０ｕｌのＰＢＳＴで５×洗浄した。アビジン−ＨＲＰの１：３０００希釈物を含有する１００ｕｌのＰＢＳを加え、プレートをＲＴで４５分間インキュベートした後、１５０ｕｌのＰＢＳＴで７×洗浄した。１００ｕｌのＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いるＥＬＩＳＡを展開し、１００μＬの１Ｎ ＨＣＬを用いて反応を停止し、４５０ｎＭでの吸光度を測定した。
以上、本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の真の主旨および範囲を逸脱することなくさまざまな変更をほどこしてもよく、これを等価物で置き換えてもよいことは、当業者であれば理解できよう。また、多くの改変をほどこして、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップまたはステップを、本発明の目的、主旨、範囲に合わせるようにしてもよい。このような改変はいずれも添付の特許請求の範囲に記載の範囲に包含されるものとする。
本発明は以下の態様を含む。
（Ａ１）
標的結合部分（ＴＢＭ）と、
標的に対するＴＢＭの結合を阻害でき、前記ＴＢＭの天然に生じる結合相手のアミノ酸配列を有さない、マスキング部分（ＭＭ）と、
切断状態で標的が存在すれば前記ＴＢＭが前記標的と結合し、未切断状態で前記標的の存在下、前記標的に対する前記ＴＢＭの結合が前記ＭＭによって阻害されるような位置で、活性化可能な結合ポリペプチドにある切断可能部分（ＣＭ）と
を含む、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）。
（Ａ２）
前記ＭＭが、未切断状態で前記標的に対する前記ＴＢＭの結合を阻害し、切断状態では前記標的に対する前記ＴＢＭの結合を可能にする機能に基づいて、複数の候補ポリペプチドから選択される、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ３）
前記ＭＭが、前記ＡＢＰが未切断状態にあるときに、立体障害により標的に対する前記ＴＢＭの結合を阻害する、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４）
前記ＭＭがシステイン残基を含み、立体障害が、前記システイン残基と前記ＴＢＭに隣接するかその内部の別のシステイン残基との間のジスルフィド結合リンケージによって達成される、（Ａ３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ５）
前記ＴＢＭの前記標的が細胞外ポリペプチドである、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ６）
前記ＣＭが前記ＡＢＰの前記ＴＢＭと前記ＭＭとの間に位置する、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ７）
前記ＣＭが前記ＭＭ内に位置する、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８）
前記ＣＭがプロテアーゼ基質を含む、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ９）
前記プロテアーゼ基質が、プラスミン基質、カスパーゼ基質またはマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む、（Ａ８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ１０）
前記プロテアーゼ基質がＭＭＰ基質を含む、（Ａ９に記載のＡＢＰ。
（Ａ１１）
前記マトリクスメタロプロテアーゼ基質が、マトリクスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）基質、マトリクスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）基質、マトリクスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）基質またはマトリクスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ−１４）基質である、（Ａ１０）に記載のＡＢＰ。
（Ａ１２）
前記プロテアーゼ基質が細胞内プロテアーゼの基質である、（Ａ８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ１３）
前記ＣＭがシステイン−システインジスルフィド結合を含む、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ１４）
活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を選択するための方法であって、
候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチド（候補ＡＢＰ）と、前記候補ＡＢＰの標的結合部分と結合できる標的および前記ＡＢＰの切断可能部分（ＣＭ）を切断できる切断剤とを接触させ、
前記標的と結合する前記複数のメンバの第１の個体群を前記切断剤の存在下でスクリーニングし、
前記切断剤の非存在下で前記第１の個体群と前記標的とを接触させ、
前記切断剤の非存在下で前記標的と結合するメンバの前記第１の個体群を除外することで、メンバの第２の個体群を前記第１の個体群からスクリーニングすることを含み、前記切断剤の存在下での標的結合と比較して、前記切断剤の非存在下で前記標的に対する結合が低下する候補ＡＢＰを選択できる、方法。
（Ａ１５）
前記切断剤がプロテアーゼである、（Ａ１４）に記載の方法。
（Ａ１６）
前記切断剤がジスルフィド結合還元剤である、（Ａ１４）に記載の方法。
（Ａ１７）
前記標的が検出可能な標識を含む、（Ａ１４）に記載の方法。
（Ａ１８）
前記第１の個体群が、前記検出可能な標識の検出によって選択される、（Ａ１４）に記載の方法。
（Ａ１９）
前記第２の個体群が、前記第１の個体群から、検出可能に標識されたメンバを分離することで生成される、（Ａ１４）に記載の方法。
（Ａ２０）
前記候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチドが各々、提示足場における複製可能な生命体の表面に存在する、（Ａ１４）に記載の方法。
（Ａ２１）
候補となる活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）のライブラリであって、前記複製可能な生命体の表面で提示される候補となる複数のＡＢＰを含む、ライブラリ。
（Ａ２２）
前記複製可能な生命体が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞である、（Ａ２１）に記載のライブラリ。
（Ａ２３）
（Ａ１）に記載のＡＢＰをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含む組成物。
（Ａ２４）
前記核酸コンストラクトが提示足場をコードする核酸をさらに含み、前記ＡＢＰをコードする核酸が、前記コンストラクトに作動的に挿入され、宿主細胞の表面の提示足場における前記ＡＢＰ提示用の融合タンパク質を発現する、（Ａ２３）に記載の組成物。
（Ａ２５）
前記提示足場が円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）である、（Ａ２４）に記載の組成物。
（Ａ２６）
候補となる活性化可能な結合ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含み、前記候補となる活性化可能な結合ポリペプチドが、
（ａ）標的結合部分（ＴＢＭ）と、
（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）と、
（ｃ）候補マスキング部分（ＭＭ）と
を含み、前記ＴＢＭ、前記ＣＭおよび前記候補ＭＭが、前記候補ＭＭが未切断状態で標的に対する前記ＴＢＭの結合を阻害し、切断状態では前記標的に対する前記ＴＢＭの結合を可能にするような機能を判断することができるように配置される、組成物。
（Ａ２７）
前記核酸コンストラクトが、円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）をコードする核酸をさらに含む、（Ａ２６）に記載の組成物。
（Ａ２８）
候補となる活性化可能な結合ポリペプチドのライブラリの作製方法であって、
複製可能な生命体のゲノムに、候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）をコードする組換えＤＮＡコンストラクトの集合体を導入することを含み、前記複数の各メンバが、標的結合部分（ＴＢＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）と、候補マスキング部分（ＭＭ）とを含み、前記導入することで、組換え複製可能な生命体が生成され、
前記組換え複製可能な生命体を、前記候補ＡＢＰの発現および提示に適した条件下で培養することを含む、方法。
（Ａ２９）
（Ａ１）に記載の治療有効量の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）と薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
（Ａ３０）
前記ＡＢＰの前記ＴＢＭがＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦ活性を阻害することができる、（Ａ２９）に記載の医薬組成物。
（Ａ３１）
哺乳類被検体で血管形成を阻害する方法であって、
投与を必要とする被検体に、（Ａ２９）に記載の医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、方法。
（Ａ３２）
前記標的が、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ４０Ｌのうちのいずれか１つである、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ３３）
検出可能な標識をさらに含む、（Ａ１）に記載のＡＢＰ。
（Ａ３４）
検出用に標的を標識する方法であって
活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を、
標的と、
切断剤と
の両方を含有する疑いのある試料と接触させることを含み、前記ＡＢＰが、
標的結合部分（ＴＢＭ）と、
検出可能な標識と、
標的に対するＴＢＭの結合を阻害でき、前記ＴＢＭの天然に生じる結合相手のアミノ酸配列を有さない、マスキング部分（ＭＭ）と、
切断状態で標的が存在すれば前記ＴＢＭが前記標的と結合し、未切断状態で前記標的が存在すると前記標的に対する前記ＴＢＭの結合が前記ＭＭによって阻害されるような位置で、活性化可能な結合ポリペプチドにある切断可能部分（ＣＭ）と、を含み、
前記標的および前記切断剤が前記試料に存在する場合、前記切断剤が前記ＣＭを切断して前記ＡＢＰの前記ＴＢＭが前記標的と結合する切断状態を生成し、これによって前記標的を検出可能な標識で標識する、方法。
（Ａ３５）
前記検出可能な標識の有無を検出することをさらに含む、（Ａ３４）に記載の方法。
（Ａ３６）
前記接触がｉｎ ｖｉｖｏで生じる、（Ａ３４）に記載の方法。
（Ａ３７）
前記接触がｉｎ ｖｉｔｒｏで生じる、（Ａ３４）に記載の方法。
（Ａ３８）
第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、
第２のＴＢＭと、
切断可能部分（ＣＭ）と、を含み、切断状態で標的の存在下、第１および第２のＴＢＭが前記標的と結合し、未切断状態では、前記ＡＢＰが、第１のＴＢＭが第２のＴＢＭによって結合される前記標的に干渉するコンホメーションにあるように、前記ＣＭが活性化可能な結合ポリペプチドに配置される、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）。
（Ａ３９）
未切断状態で、前記ＡＢＰが、第１および第２のＴＢＭが第１および第２のＴＢＭに対する標的の結合に干渉するようなコンホメーションにある、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４０）
第１および第２のＴＢＭが異なる標的を結合できる、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４１）
前記異なる標的がＦＧＦ２およびＶＥＧＦである、（Ａ４０）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４２）
前記第１のＴＢＭが、前記ＡＢＰが未切断状態にあるときに前記第１のＴＢＭが標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を阻害し、前記ＡＢＰが切断状態にあるときに標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を可能にする機能に基づいて、複数の候補ポリペプチドから選択される、請求項３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４３）
前記第１のＴＢＭが、前記ＡＢＰが未切断状態にあるときに立体障害によって前記第２のＴＢＭによる標的結合に干渉する、（Ａ３８に記載のＡＢＰ。
（Ａ４４）
前記ＡＢＰが、前記第１のＴＢＭ内またはその付近に第１のシステイン残基を、前記第２のＴＢＭ内またはその付近に第２のシステイン残基を含み、立体障害が、前記第１および第２のシステイン残基間のジスルフィド結合リンケージによって達成される、（Ａ４３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４５）
前記第１のＴＢＭおよび前記第２のＴＢＭの前記標的が細胞外ポリペプチドである、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４６）
前記ＣＭが、前記ＡＢＰの前記第１のＴＢＭと前記第２のＴＢＭとの間に局在する、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４７）
前記ＣＭが、前記第１のＴＢＭまたは前記第２のＴＢＭのいずれかの中に局在する、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４８）
前記ＣＭがプロテアーゼ基質を含む、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ４９）
前記プロテアーゼ基質が、プラスミン基質、カスパーゼ基質またはマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む、（Ａ４８に記載のＡＢＰ。
（Ａ５０）
前記プロテアーゼ基質がＭＭＰ基質を含む、（Ａ４８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ５１）
前記ＭＭＰ基質が、マトリクスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）基質、マトリクスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）基質、マトリクスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）基質またはマトリクスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ−１４）基質である、（Ａ５０）に記載のＡＢＰ。
（Ａ５２）
前記プロテアーゼ基質が細胞内プロテアーゼの基質である、（Ａ４８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ５３）
前記ＣＭがシステイン−システインジスルフィド結合を含む、（Ａ３８）に記載のＡＢＰ。
（Ａ５４）
二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を選択する方法であって、
候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）であって、前記複数の各メンバが、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、第２のＴＢＭと、切断可能部分（ＣＭ）とを含む結合ポリペプチドと、前記第１のＴＢＭと結合できる標的およびＣＭを切断できる切断剤とを接触させ、
前記標的と結合する前記複数のメンバの第１の個体群を切断剤の存在下で選択し、
前記第１の個体群を切断剤の非存在下で前記標的と接触させ、
前記切断剤の非存在下で前記標的と結合するメンバの前記第１の個体群を除外することで、前記第１の個体群からメンバの第２の個体群を選択することを含み、
前記切断剤の存在下での前記標的に対する結合と比較して、前記切断剤の非存在下で前記標的に対する結合が低下する候補ＡＢＰを選択する、方法。
（Ａ５５）
前記切断剤がプロテアーゼである、（Ａ５４）に記載の方法。
（Ａ５６）
前記切断剤がジスルフィド結合還元剤である、（Ａ５４）に記載の方法。
（Ａ５７）
前記標的が検出可能な標識を含む、（Ａ５４）に記載の方法。
（Ａ５８）
前記第１の個体群が、前記検出可能な標識の検出によって選択される、（Ａ５７）に記載の方法。
（Ａ５９）
前記第２の個体群が、前記第１の個体群から、検出可能に標識されたメンバを分離することで生成される、（Ａ５７）に記載の方法。
（Ａ６０）
前記候補となる複数の活性化可能な結合ポリペプチドが各々、提示足場における複製可能な生命体の表面に存在する、（Ａ５４）に記載の方法。
（Ａ６１）
提示足場にて前記第２のＴＢＭの前記アミノ酸配列を提供し、前記第２のＴＢＭに対する標的の結合を検出することで、標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を評価する、（Ａ５４）に記載の方法。
（Ａ６２）
前記複製可能な生命体の表面に提示される複数の候補となる二重標的結合ＡＢＰを含む、候補となる二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）のライブラリ。
（Ａ６３）
前記複製可能な生命体が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞である、（Ａ６２）に記載のライブラリ。
（Ａ６４）
（Ａ３８）に記載のＡＢＰをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含む組成物。
（Ａ６５）
前記核酸コンストラクトが、提示足場をコードする核酸をさらに含み、前記ＡＢＰをコードする前記核酸が、コンストラクトに作動的に挿入され、宿主細胞の表面の前記提示足場における前記ＡＢＰ提示用の融合タンパク質を発現する、（Ａ６４）に記載の組成物。
（Ａ６６）
前記提示足場が円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）である、（Ａ６５）に記載の組成物。
（Ａ６７）
候補となる活性化可能な結合ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸コンストラクトを含む組成物であって、前記候補となる活性化可能な結合ポリペプチドが、
（ａ）第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、
（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）と、
（ｃ）第２のＴＢＭと
を含み、第１のＴＢＭ、ＣＭおよび第２のＴＢＭが、前記第１のＴＢＭが未切断状態で標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を阻害し、切断状態では前記標的に対する前記第２のＴＢＭの結合を可能にする機能を判断することができるように配置される、組成物。
（Ａ６８）
前記核酸コンストラクトが、円順列変異外膜タンパク質Ｘ（ＣＰＸ）をコードする核酸をさらに含む、（Ａ６７）に記載の組成物。
（Ａ６９）
候補となる活性化可能な結合ポリペプチドのライブラリの作製方法であって、
複製可能な生命体のゲノムに、候補となる複数の二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）をコードする組換えＤＮＡコンストラクトの集合体を導入することを含み、前記複数の各メンバが、第１の標的結合部分（ＴＢＭ）と、切断可能部分（ＣＭ）と、第２のＴＢＭとを含み、前記導入することで、組換え複製可能な生命体が生成され、
前記組換え複製可能な生命体を、前記候補となる二重標的結合ＡＢＰの発現および提示に適した条件下で培養することを含む、方法。
（Ａ７０）
（Ａ３８）に記載の治療有効量の二重標的結合活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）と薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
（Ａ７１）
前記第１のＡＢＰのＴＢＭがＶＥＧＦと結合してＶＥＧＦを阻害し、前記第２のＴＢＭが線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ２）と結合してＦＧＦ２を阻害する、（Ａ７０）に記載の医薬組成物。
（Ａ７２）
投与を必要とする被検体に、（Ａ７０）に記載の医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、哺乳類の被検体で血管形成を阻害する方法。
（Ａ７３）
ａ．標的と結合できる少なくとも１つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、
ｂ．前記ＡＢＤとカップリングされ、前記標的に対する前記ＡＢＤの特異的結合に干渉できる少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）と、
ｃ．前記ＡＢＤとカップリングされた少なくとも１つの切断可能部分（ＣＭ）と
を含み、前記ＣＭが、未切断状態で前記ＭＭが前記標的に対する前記ＡＢＤの特異的結合に干渉し、切断状態では前記ＭＭが前記標的に対する前記ＡＢＤの特異的結合に干渉しないような形で、前記ＡＢＰに配置される、活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）。
（Ａ７４）
前記ＡＢＤが、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖまたはＳＣＡＢ由来である、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ７５）
前記ＣＭが前記ＡＢＤのＣ末端にカップリングされる、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ７６）
前記ＣＭが前記ＡＢＤのＮ末端にカップリングされる、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ７７）
前記ＣＭがＡＢＤのＶＬ鎖のＮ末端にカップリングされる、（Ａ７６）に記載のＡＢＰ。
（Ａ７８）
前記標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、およびα４β７インテグリンからなる群から選択される、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ７９）
前記ＣＭが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、およびＴＡＣＥからなる群から選択される酵素の基質である、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８０）
前記ＣＭがＭＭＰ−９の基質である、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８１）
前記ＭＭと前記ＣＭとの間に位置するリンカーペプチドをさらに含む、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８２）
リンカーペプチドをさらに含み、前記リンカーペプチドが前記ＡＢＤと前記ＣＭとの間に配置される、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８３）
検出可能な部分をさらに含む、（Ａ７３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８４）
前記検出可能な部分が診断作用剤である、（Ａ８３）に記載のＡＢＰ。
（Ａ８５）
少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）にカップリングされた標的と結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含み、前記ＭＭが前記標的に対する前記ＡＢＤの特異的結合に干渉する、組成物。
（Ａ８６）
切断可能部分（ＣＭ）をさらに含み、前記ＣＭが未切断状態にあって前記ＭＭが前記標的に対する前記ＡＢＤの特異的結合に干渉する第１のコンフィギュレーションと、前記ＣＭが切断状態にあって前記ＭＭが標的に対する前記ＡＢＤの特異的結合に干渉しない第２のコンフィギュレーションの２つのコンフィギュレーションを含む、（Ａ８５）に記載の組成物。
（Ａ８７）
標的と結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有する組成物を修飾する方法であって、マスキング部分（ＭＭ）および切断可能部分（ＣＭ）を前記ＡＢＤにカップリングして、未切断状態でＭＭが前記標的と特異的に結合するための前記ＡＢＤに干渉し、切断状態では前記ＭＭが前記標的と特異的に結合するための前記ＡＢＤに干渉しないようにすることを含む、方法。
（Ａ８８）
前記ＭＭが前記ＡＢＤのＣ末端にカップリングされる、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ８９）
前記ＭＭが前記ＡＢＤのＮ末端にカップリングされる、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９０）
前記ＡＢＤが、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖまたはＳＣＡＢ由来である、（Ａ８７）に記載の組成物。
（Ａ９１）
前記標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、およびα４β７インテグリンからなる群から選択される、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９２）
前記ＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、エクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、およびパリビズマブからなる群から選択される抗体由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９３）
前記ＡＢＤが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、インテグリンα４、ＩＬ２Ｒ、相補体Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶのＦタンパク質からなる群から選択される標的に対する抗体または抗体フラグメント由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９４）
前記ＡＢＤが、ＶＥＧＦに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９５）
前記ＡＢＤが、ベバシズマブまたはラニビズマブ由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９６）
前記ＡＢＤが、ＴＮＦαに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９７）
前記ＡＢＤがインフリキシマブまたはアダリムマブ由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９８）
前記ＡＢＤがＣＤ２０に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ９９）
前記ＡＢＤが、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタンまたはリツキシマブ由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ１００）
前記ＡＢＤがＥＧＦＲに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ１０１）
前記ＡＢＤが、セツキシマブまたはパニツムマブ由来である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ１０２）
前記ＣＭが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、およびＴＡＣＥからなる群から選択される酵素の基質である、（Ａ８７）に記載の方法。
（Ａ１０３）
候補ペプチドをスクリーニングして、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む抗体またはそのフラグメントに対する特異的結合親和性を有するマスキング部分（ＭＭ）ペプチドを同定する方法であって、
ａ．ペプチド足場のライブラリを提供することを含み、各ペプチド足場が、
ｉ．膜貫通タンパク質（ＴＭ）と、
ｉｉ．候補ペプチドと
を含み、
ｂ．ＡＢＤを含む抗体またはそのフラグメントを前記ライブラリと接触させ、
ｃ．ＡＢＤを含む抗体またはそのフラグメントに対する特異的結合親和性を有するＭＭペプチドを同定することを含む、方法。
（Ａ１０４）
前記抗体またはそのフラグメントが、標的と結合できるＡＢＤを含み、前記標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、およびα４β７インテグリンからなる群から選択される、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１０５）
前記ＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、エクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、およびパリビズマブからなる群から選択される抗体由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１０６）
前記ＡＢＤが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、インテグリンα４、ＩＬ２Ｒ、相補体Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶのＦタンパク質からなる群から選択される標的に対する抗体または抗体フラグメント由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１０７）
前記ＡＢＤが、ＶＥＧＦに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１０８）
前記ＡＢＤが、ベバシズマブまたはラニビズマブ由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１０９）
前記ＡＢＤが、ＴＮＦαに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１０）
前記ＡＢＤがインフリキシマブまたはアダリムマブ由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１１）
前記ＡＢＤがＣＤ２０に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１２）
前記ＡＢＤが、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタンまたはリツキシマブ由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１３）
前記ＡＢＤがＥＧＦＲに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１４）
前記ＡＢＤが、セツキシマブまたはパニツムマブ由来である、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１５）
前記ライブラリが、ウイルス、細胞または胞子を含む、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１６）
前記ライブラリが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１７）
前記ペプチド足場が検出可能な部分をさらに含む、（Ａ１０３）に記載の方法。
（Ａ１１８）
被検体における症状を治療する方法であって、未切断状態でマスキング部分（ＭＭ）が標的と特異的に結合するための抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）に干渉し、切断状態では前記ＭＭが前記標的と特異的に結合するための前記ＡＢＤに干渉しないように、前記ＭＭおよび切断可能部分（ＣＭ）にカップリングされた前記標的と結合できる前記ＡＢＤを含有する抗体またはそのフラグメントを含む組成物を被検体に投与することを含む、方法。
（Ａ１１９）
被検体における症状を診断する方法であって、切断状態でマスキング部分（ＭＭ）が標的と特異的に結合するための抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）に干渉し、未切断状態ではＭＭが標的と特異的に結合するためのＡＢＤに干渉しないように、前記ＭＭおよび切断可能部分（ＣＭ）にカップリングされた前記標的と結合できる前記ＡＢＤを含有する抗体またはそのフラグメントを含む組成物を被検体に投与することを含む、方法。
（Ａ１２０）
前記ＡＢＤが、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖまたはＳＣＡＢ由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２１）
前記ＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、エクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、およびパリビズマブからなる群から選択される抗体由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２２）
前記標的が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、ＲＳＶのＦタンパク質、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、α４β１インテグリン、およびα４β７インテグリンからなる群から選択される、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２３）
前記ＡＢＤが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、インテグリンα４、ＩＬ２Ｒ、相補体Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶのＦタンパク質からなる群から選択される標的に対する抗体または抗体フラグメント由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２４）
前記ＡＢＤが、ＶＥＧＦに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２５）
前記ＡＢＤがベバシズマブまたはラニビズマブ由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２６）
前記ＡＢＤが、ＴＮＦαに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２７）
前記ＡＢＤがインフリキシマブまたはアダリムマブ由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２８）
前記ＡＢＤが、ＣＤ２０に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１２９）
前記ＡＢＤが、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタンまたはリツキシマブ由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１３０）
前記ＡＢＤが、ＥＧＦＲに対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１３１）
前記ＡＢＤがセツキシマブまたはパニツムマブ由来である、（Ａ１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１３２）
酵素活性化可能な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体またはそのフラグメント。
（Ａ１３３）
前記抗体がラニビズマブである、（Ａ１３２）に記載の抗体。
（Ａ１３４）
前記抗体がＭＭＰ−９によって活性化される、（Ａ１３２）に記載の抗体。
（Ａ１３５）
酵素活性化可能なＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメント。
（Ａ１３６）
前記抗体がＭＭＰ−９によって活性化される、（Ａ１３５）に記載の抗体。
（Ａ１３７）
酵素活性化可能なＶＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメント。
（Ａ１３８）
前記抗体がＭＭＰ−９によって活性化される、（Ａ１３７）に記載の抗体。
（Ａ１３９）
前記酵素が、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、Ｃａｓｐａｓｅ−１、Ｃａｓｐａｓｅ−２、Ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｃａｓｐａｓｅ−４、Ｃａｓｐａｓｅ−５、Ｃａｓｐａｓｅ−６、Ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃａｓｐａｓｅ−１０、Ｃａｓｐａｓｅ−１１、Ｃａｓｐａｓｅ−１２、Ｃａｓｐａｓｅ−１３、Ｃａｓｐａｓｅ−１４、およびＴＡＣＥからなる群から選択される、（Ａ１３２、１３５および１３７のいずれか一項）に記載の酵素。
（Ａ１４０）
前記抗体フラグメントが、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＳＣＡＢである、（Ａ１３２、１３５および１３７のいずれか一項）に記載の抗体。
（Ａ１４１）
前記抗体がイピリムマブまたはトレメリムマブである、（Ａ１３５）に記載の抗体。
（Ａ１４２）
前記ＡＢＤが、ＣＴＬＡ−４に対する抗体またはその抗体フラグメント由来である、（Ａ８７、１０３、１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１４３）
前記ＡＢＤがイピリムマブまたはトレメリムマブ由来である、（Ａ８７、１０３、１１８または１１９）に記載の方法。
（Ａ１４４）
ＡＢＰと、前記ＡＢＰを切断できるプロテアーゼと、前記ＡＢＰの標的とを含む、反応混合物。
本発明は更に以下の態様を含む。
（Ｂ１）
活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）であって、そのＮ末端からＣ末端に向けて又はＣ末端からＮ末端に向けて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）及び標的結合部分（ＴＢＭ）を備え、
前記ＭＭは前記ＴＢＭの標的への結合を阻害することができるペプチドであり、前記ＴＢＭの天然に生じる結合相手のアミノ酸配列を有さず、
前記ＴＢＭは抗体あるいは標的に特異的に結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む抗体断片を含み、
前記ＡＢＰが切断された状態では、前記ＴＢＭが標的と結合可能であり、前記ＡＢＰが未切断状態では、前記ＡＢＤが前記ＭＭに結合していることにより前記ＴＢＭの標的への結合が阻害され、
前記ＭＭは、切断状態での前記ＴＢＭの標的への結合を妨害しない又は競合しない、活性化可能な結合ポリペプチド。
（Ｂ２）
前記抗体断片がＦａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＡｂである、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ３）
前記標的が細胞表面レセプターである、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ４）
前記標的が、
ａ）ＣＤ４４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ６、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＶＣＡＭ−１、ＴＮＦα、ＣＴＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−２、ＨＥＲ２／ｎｅｕからなる標的群、又は、
ｂ）ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＬ２Ｒ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＤＬＬ４、ＮＯＴＣＨＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２３、ＣＤ４１、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＲＢＢ３、ＶＣＡＭ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、Ｃ５相補体、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＲＳＶのＦタンパク質、及び糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体からなる標的群、
から選択される、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ５）
前記標的がＣＴＬＡ−４である、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ６）
前記標的が成長因子又は成長因子受容体である、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ７）
前記標的がＥＧＦＲである、（Ｂ６）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ８）
前記標的がＶＥＧＦである、（Ｂ６）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ９）
前記ＡＢＤが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、バシリキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、リツキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、アレムツズマブ、アブシキシマブ、オマリズマブ、トラスツズマブ、パリビズマブ、イピリムマブ、及びトレメリムマブからなる抗体の１つに由来する、（Ｂ１又は２）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１０）
前記ＡＢＤが、セツキシマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、及びエファリズマブからなる群から選択される抗体に由来する、（Ｂ１又は２）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１１）
前記ＣＭが、
ａ）プラスミン基質、カスパーゼ基質、ＰＳＡ基質、ＰＳＭＡ基質、カテプシン基質、又はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質；
ｂ）ＰＱＧＬＬＧ、ＰＬＧＬＡＧ、ＶＬＶＰＭＡＭＭＡＳ、及びＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰからなる群から選択されるアミノ酸配列；又は
ｃ）システイン−システインジスルフィド結合、
を含む、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１２）
前記ＭＭが、
ａ）以下の式：
Ｘ１５、Ｘ４ＣＸ７ＣＸ４、Ｘ１２ＣＸ３、ＣＸ６Ｇ、Ｘ５Ｇ、及びＸＣＸ３（ただし、Ｘは任意のアミノ酸である）
の１つで表される配列を有するアミノ酸配列；
ｂ）ＣＶＲＶＦＲＭＧ、ＣＦＦＭＰＬＱＧ、ＧＧＷＣＲＧ、ＶＶＳＥＥＧ、配列番号：１１、２０〜２４、３１〜３８、６３、６５、６７、６９及び７１からなる群から選択されるアミノ酸配列；又は、
ｃ）４〜４０のアミノ酸、
を含む、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１３）
前記ＣＭが、天然に生ずる酵素基質のアミノ酸配列を有さない、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１４）
前記ＣＭが、ＡＢＰにおいて、切断状態であれば標的の存在下でＴＢＭが標的と結合し、未切断状態であれば標的の存在下であってもＴＢＭが標的と結合しない位置にある、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１５）
前記ＡＢＰが、ＭＭとＣＭとの間及び／又はＣＭとＴＢＭとの間に位置するフレキシブルリンカーを含む、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１６）
前記フレキシブルリンカーが、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは少なくとも１の整数である）から選択されるアミノ酸配列を含む、（Ｂ１５）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１７）
前記フレキシブルリンカーが、ＧＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＳＧ、及びＧＳＳＳＧから選択されるアミノ酸配列を含む、（Ｂ１５）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１８）
前記ＭＭが、ＭＭ及び第２のＴＢＭの両方として機能するように配置される、（Ｂ１から１７のいずれか一項）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ１９）
ＴＢＭ及び第２のＴＢＭが異なる標的に結合するように配置される、（Ｂ１８）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ２０）
前記ＡＢＰが１を超えるダイナミックレンジを有する、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ２１）
ａ）酵素活性化可能な、ＣＤ４４抗体又はその断片、ＮＯＴＣＨＲ１抗体又はその断片、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその断片、ＩＬ６抗体又はその断片、ＤＬＬ４抗体又はその断片、ＥＧＦＲ抗体又はその断片、ＶＣＡＭ−１抗体又はその断片、ＴＮＦα抗体又はその断片、ＣＴＬＡ−４抗体又はその断片、ＶＥＧＦ抗体又はその断片、ＩＬ−２抗体又はその断片、又はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体又はその断片、あるいは、
ｂ）酵素が、プラスミン、カスパーゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシン、又はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）である、酵素活性化可能な抗体又はその断片、
である、（Ｂ１）に記載の活性化可能なポリペプチド。
（Ｂ２２）
（Ｂ１から２１）のいずれか一項に記載の活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を含む、患者の治療又は診断用の組成物。
（Ｂ２３）
癌治療用である、（Ｂ２２）に記載の組成物。
（Ｂ２４）
活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）の製造方法であって、当該方法は、
（Ｂ１から２１）のいずれか一項に記載のＡＢＰをコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、ＡＢＰの発現を誘導する条件下で培養し、
ＡＢＰを回収し、次いで、
前記ＡＢＰについて活性化可能な表現型を維持する能力を試験することを含む、方法。
（Ｂ２５）
活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）の製造方法であって、当該方法は、
（ａ）マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）及び標的結合部分（ＴＢＭ）を提供し、前記ＴＢＭは、抗体あるいは標的に特異的に結合できる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む抗体断片を含み、前記ＭＭは前記ＴＢＭの標的への結合を阻害することができるペプチドであり、前記ＴＢＭの天然に生じる結合相手のアミノ酸配列を有さず、
（ｂ）前記ＭＭを前記ＣＭに結合し、前記ＴＢＭを前記ＣＭに結合し、（Ｂ１から２１のいずれか一項）に記載のＡＢＰを生成させ、次いで、
前記ＡＢＰについて可溶化形態において活性化可能な表現型を維持する能力を試験することを含む、方法。
（Ｂ２６）
前記活性化可能な表現型が、酵素的に活性化可能な表現型である、（Ｂ２４又は２５）に記載の方法。
（Ｂ２７）
前記ＡＢＰが第２のＣＭを更に含む、（Ｂ１９）に記載の活性化可能なポリペプチド。

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  1. 明細書に記載された発明。
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Families Citing this family (196)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2368387T5 (es) 2000-10-09 2019-03-07 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos terapéuticos y que inducen tolerancia
US8293685B2 (en) 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
CA2696263C (en) 2007-08-15 2017-06-13 Bing Liu Monospecific and multispecific antibodies and method of use
EP3492488A1 (en) * 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
BRPI1006141B8 (pt) * 2009-01-12 2021-05-25 Cytomx Therapeutics Llc composições de anticorpo modificado, métodos para preparar e usar as mesmas
CA2753294A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Proproteins and methods of use thereof
KR20110134494A (ko) * 2009-03-27 2011-12-14 자이모제네틱스, 인코포레이티드 항체-수용체 조합물을 포함하는 다중특이적-결합 단백질을 사용하기 위한 조성물 및 방법
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
EP2646464B1 (en) * 2010-12-03 2015-06-03 Adamed sp. z o.o. Anticancer fusion protein
AU2012225766B9 (en) * 2011-03-04 2017-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
EP3138581B1 (en) 2011-03-17 2019-01-02 The University of Birmingham Re-directed immunotherapy
PL394618A1 (pl) * 2011-04-19 2012-10-22 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
US9120853B2 (en) * 2012-04-27 2015-09-01 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
US8822423B2 (en) 2012-05-17 2014-09-02 Janssen Biotech, Inc. Affinity peptides toward infliximab
US9127053B2 (en) * 2012-06-22 2015-09-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
US9856314B2 (en) 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
WO2014026136A2 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
WO2014052462A2 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
AU2014204015A1 (en) * 2013-01-04 2015-07-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity in biological systems
US20160009817A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-14 Bayer Healthcare Llc Pro-drug antibodies against tissue factor pathway inhibitor
WO2014193973A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
US9517276B2 (en) * 2013-06-04 2016-12-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions and methods for conjugating activatable antibodies
AU2014286872B2 (en) 2013-07-05 2020-01-23 Formation Biologics Inc. EGFR antibody conjugates
KR102216088B1 (ko) 2013-07-25 2021-02-15 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 그의 사용 방법
MX2016003957A (es) * 2013-09-25 2017-02-02 Cytomx Therapeutics Inc Substratos de metaloproteinasas de matriz y otras porciones escindibles y metodos para usar los mismos.
US9540440B2 (en) 2013-10-30 2017-01-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) * 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
MX2016007958A (es) 2013-12-17 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso.
CA2936377A1 (en) 2014-01-10 2015-07-16 Shanghai Birdie Biotech, Inc. Compounds and compositions for treating egfr expressing tumors
RU2016135239A (ru) 2014-01-31 2018-03-12 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Субстраты матриптазы и u-активатора плазминогена и другие расщепляемые остатки и способы их применения
TWI727427B (zh) 2014-07-09 2021-05-11 英屬開曼群島商博笛生物科技有限公司 用於治療腫瘤的抗pd-1組合
CN105440135A (zh) 2014-09-01 2016-03-30 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-pd-l1结合物
CN105233291A (zh) 2014-07-09 2016-01-13 博笛生物科技有限公司 用于治疗癌症的联合治疗组合物和联合治疗方法
CN107108738A (zh) 2014-07-25 2017-08-29 西托姆克斯治疗公司 抗cd3抗体、可活化抗cd3抗体、多特异性抗cd3抗体、多特异性可活化抗cd3抗体及其使用方法
TWI758928B (zh) 2014-11-21 2022-03-21 美商必治妥美雅史谷比公司 抗cd73抗體及其用途
CA2971732A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to tigit
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
WO2016126611A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 The University Of Birmingham Targeting moiety peptide epitope complexes having a plurality of t-cell epitopes
IL292449B2 (en) * 2015-03-13 2024-02-01 Cytomx Therapeutics Inc Nucleic acids encoding antibodies against PDL1 and methods for their preparation
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
CA3176004A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd71 antibodies, activatable anti-cd71 antibodies, and methods of use thereof
CA2984892A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
AU2016257929B2 (en) 2015-05-04 2022-10-20 Cytomx Therapeutics, Inc Anti-CD166 antibodies, activatable anti-CD166 antibodies, and methods of use thereof
JP6841754B2 (ja) 2015-05-13 2021-03-10 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
WO2016187594A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
CN113603784A (zh) 2015-05-29 2021-11-05 艾吉纳斯公司 抗-ctla-4抗体及其使用方法
LT3303396T (lt) 2015-05-29 2023-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Antikūnai prieš ox40 ir jų panaudojimo būdai
CA2985818A1 (en) 2015-05-31 2016-12-08 Curegenix Corporation Combination compositions comprising an antagonist of porcupine and a pd-l/pd-1 axis antagonist for immunotherapy
JP2018526972A (ja) 2015-06-16 2018-09-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ３抗体及び使用方法
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
EA201890162A1 (ru) 2015-06-29 2018-07-31 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к cd40 с повышенной агонистической активностью
KR20180040138A (ko) 2015-07-13 2018-04-19 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항pd-1 항체, 활성화 가능한 항pd-1 항체, 및 이들의 사용 방법
EP3328427A4 (en) 2015-07-27 2018-12-12 The General Hospital Corporation Antibody derivatives with conditionally enabled effector function
IL256989B (en) 2015-08-07 2022-08-01 Alx Oncology Inc Constructs with a sirp-alpha site or a variant thereof
KR20180038560A (ko) 2015-08-28 2018-04-16 아뮤닉스 오퍼레이팅 인코포레이티드 키메라 폴리펩티드 조립체와 이의 제조 및 사용 방법
BR112018003186A2 (pt) 2015-09-01 2018-09-25 Agenus Inc. anticorpos anti-pd-1 e seus métodos de uso
US10066023B2 (en) 2015-10-30 2018-09-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for tumor transduction
US10508143B1 (en) 2015-10-30 2019-12-17 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
JP7073258B2 (ja) * 2015-11-19 2022-05-23 レビトープ リミテッド 望ましくない細胞の再指向性死滅に対する二成分系のための機能的抗体断片相互補完
EP3389720A1 (en) 2015-12-18 2018-10-24 The General Hospital Corporation Polyacetal polymers, conjugates, particles and uses thereof
US20190284293A1 (en) 2016-03-04 2019-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EA201892693A1 (ru) 2016-05-20 2019-04-30 Харпун Терапьютикс, Инк. Белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с cd3
CN109312367B (zh) 2016-06-06 2023-04-11 艾斯克立必恩股份有限公司 用于药物递送的抗体融合蛋白
CN109715196A (zh) 2016-06-13 2019-05-03 转矩医疗股份有限公司 用于促进免疫细胞功能的组合物和方法
WO2018004338A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Cleavable tetrazine used in bio-orthogonal drug activation
EA201990875A1 (ru) 2016-11-03 2019-09-30 Бристол-Маерс Сквибб Компани Активируемые антитела против ctla-4 и их применение
EP3541843A1 (en) 2016-11-15 2019-09-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
KR102275008B1 (ko) 2016-11-23 2021-07-13 하푼 테라퓨틱스, 인크. 전립선 특이 막 항원 결합 단백질
KR20190087539A (ko) 2016-11-23 2019-07-24 하푼 테라퓨틱스, 인크. Psma 표적화 삼중특이성 단백질 및 사용 방법
TW202235438A (zh) 2016-11-28 2022-09-16 日商中外製藥股份有限公司 能夠調節配體結合活性的配體結合分子
US11168139B2 (en) * 2016-11-28 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
WO2018106738A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Massachusetts Institute Of Technology Brush-arm star polymers, conjugates and particles, and uses thereof
BR112019011582A2 (pt) 2016-12-07 2019-10-22 Agenus Inc. anticorpos e métodos de utilização dos mesmos
MD3551660T2 (ro) 2016-12-07 2024-03-31 Agenus Inc Anticorpi anti-CTLA-4 și procedee de utilizare a acestora
EP3551667A4 (en) * 2016-12-09 2020-06-17 Seattle Genetics, Inc. BIVALENT ANTIBODIES MASKED BY COILS
MA47613A (fr) * 2017-02-22 2020-01-01 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et procédés de traitement du cancer
WO2018160671A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Targeted checkpoint inhibitors and methods of use
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
CA3055574A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd147 antibodies, activatable cd147 antibodies, and methods of making and use thereof
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CN110770255A (zh) 2017-04-11 2020-02-07 印希彼有限公司 具有受限cd3结合的多特异性多肽构建体及其使用方法
CN108728444A (zh) 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
WO2018209298A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
JP7209936B2 (ja) 2017-05-12 2023-01-23 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｍｓｌｎ標的三重特異性タンパク質及びその使用方法
US11643463B2 (en) 2017-05-19 2023-05-09 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Monoclonal antibodies to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4)
WO2018219301A1 (zh) * 2017-05-31 2018-12-06 四川大学华西医院 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
AU2018278327B2 (en) 2017-06-01 2023-03-16 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-pdl1 antibodies and methods of use thereof
WO2018236701A1 (en) * 2017-06-20 2018-12-27 The Board Of Regents Of The University Of Texas System INTERFERON PRODRUCE FOR THE TREATMENT OF CANCER
JP7187048B2 (ja) 2017-06-30 2022-12-12 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 分枝多官能性マクロモノマーおよび関連ポリマーならびにそれらの使用
WO2019014586A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Cytomx Therapeutics, Inc. ANTI-CD166 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019018828A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Cytomx Therapeutics, Inc. METHODS OF QUALITATIVE AND / OR QUANTITATIVE ANALYSIS OF ACTIVATABLE ANTIBODY PROPERTIES AND USES THEREOF
EP3668545A2 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Bristol-Myers Squibb Company Prodruggable antibodies, prodrugs thereof, and methods of use and making
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
BR112020004231A2 (pt) 2017-08-30 2020-09-08 Cytomx Therapeutics, Inc. anticorpos anti-cd166 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
CA3078799A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
US11136403B2 (en) 2017-10-13 2021-10-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
SG11202002384VA (en) 2017-10-14 2020-04-29 Cytomx Therapeutics Inc Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
ES2864013T3 (es) 2017-10-14 2021-10-13 Abbvie Inc Conjugados de fármaco y anticuerpo activable anti-CD71 y métodos de uso de los mismos
US20230158141A1 (en) * 2017-11-08 2023-05-25 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technolog Co., Ltd Conjugates of Biomolecule and Use Thereof
RU2020120556A (ru) 2017-11-28 2021-12-29 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Лигандсвязывающая молекула, обладающая регулируемой лигандсвязывающей активностью
EP3719035A4 (en) 2017-11-28 2021-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha POLYPEPTIDE INCLUDING AN ANTIGEN BINDING DOMAIN AND A TRANSPORT SECTION
EP3717515A2 (en) 2017-12-01 2020-10-07 Seattle Genetics, Inc. Cd47 (masked) antibodies and uses thereof for treating cancer
WO2019133747A1 (en) 2017-12-27 2019-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2019148445A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
JP7466442B2 (ja) 2018-02-14 2024-04-12 中外製薬株式会社 抗原結合分子および組合せ
EP3762420A1 (en) 2018-03-09 2021-01-13 CytomX Therapeutics, Inc. Activatable cd147 antibodies and methods of making and use thereof
CN112005304A (zh) 2018-03-20 2020-11-27 西托姆克斯治疗公司 用于哺乳动物受试者中的可活化抗体种类的定量药理学建模的系统和方法
CA3092589A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Five Prime Therapeutics, Inc. Antibodies binding to vista at acidic ph
WO2019213444A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
CA3099419A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Tetrazines for high click conjugation yield in vivo and high click release yield
BR112020023118A2 (pt) * 2018-05-14 2021-04-13 Werewolf Therapeutics, Inc. Polipeptídeos de interleucina 12 ativáveis e métodos de uso destes
US20210292421A1 (en) * 2018-05-14 2021-09-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
WO2019222278A1 (en) * 2018-05-14 2019-11-21 Harpoon Therapeutics, Inc. Dual binding moiety
KR20210021467A (ko) 2018-05-14 2021-02-26 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 활성화가능한 인터루킨-2 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
EP3816182A4 (en) 2018-05-30 2022-07-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha LIGAND BINDING MOLECULE WITH SINGLE DOMAIN ANTIBODY
CN112654633A (zh) 2018-06-22 2021-04-13 科优基因公司 基于细胞因子的可生物活化药物及其使用方法
MX2021000213A (es) 2018-07-11 2021-03-25 Five Prime Therapeutics Inc Anticuerpos de union al supresor de activacion de linfocitos t que contiene inmunoglobulina con dominio v (vista) a ph acidico.
JP2021531785A (ja) 2018-07-24 2021-11-25 インヒブルクス インコーポレイテッド 制約されたｃｄ３結合ドメインおよび受容体結合領域を含有する多重特異性ポリペプチド構築物ならびにそれを使用する方法
EA202190382A1 (ru) * 2018-07-31 2021-05-17 Эмджен Инк. Фармацевтические составы на основе маскированных антител
JPWO2020027330A1 (ja) 2018-08-03 2021-08-19 中外製薬株式会社 互いに連結された２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子
US10988491B2 (en) 2018-08-17 2021-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Degradable polymers of a cyclic silyl ether and uses thereof
WO2020055952A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Georgia Tech Research Corporation Compositions and methods for immunotherapy profiling
CN113286817A (zh) 2018-09-25 2021-08-20 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
WO2020076977A2 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202028246A (zh) 2018-10-11 2020-08-01 美商英伊布里克斯公司 B7h3單域抗體及其治療性組合物
EP3863721A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
AU2019356573A1 (en) 2018-10-11 2021-05-27 Inhibrx, Inc. PD-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202029980A (zh) 2018-10-26 2020-08-16 美商免疫遺傳股份有限公司 Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
KR20210098989A (ko) 2018-11-02 2021-08-11 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화 가능한 항-cd166 항체 및 이의 사용 방법
TW202033555A (zh) 2018-11-16 2020-09-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗nkg2a抗體及其用途
US20200377602A1 (en) * 2018-12-06 2020-12-03 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
CN113677372A (zh) 2019-02-26 2021-11-19 西托姆克斯治疗公司 可活化免疫检查点抑制剂和经缀合可活化抗体的组合疗法
CA3133802A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Immunogen, Inc. Methods of preparing cell-binding agent-drug conjugates
US11851487B2 (en) * 2019-04-01 2023-12-26 Rensselaer Polytechnic Institute Methods and systems for detecting peptide aggregates
EP3946470A4 (en) * 2019-04-05 2023-05-31 Earli Inc. IMPROVED METHODS AND COMPOSITIONS FOR SYNTHETIC BIOMARKERS
CN113924118A (zh) 2019-04-18 2022-01-11 百时美施贵宝公司 在低ph下具有增强的结合特异性的伊匹单抗变体
EP4316524A3 (en) 2019-04-26 2024-04-24 ImmunoGen, Inc. Camptothecin derivatives
CA3137512A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
EP3972982A1 (en) 2019-05-20 2022-03-30 Massachusetts Institute of Technology Boronic ester prodrugs and uses thereof
BR112021024003A2 (pt) 2019-05-31 2022-04-19 Alx Oncology Inc Métodos de tratamento de câncer com fusão sirp alfa-fc em combinação com um inibidor de checkpoint imunológico
BR112021023735A2 (pt) 2019-06-05 2022-01-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de ligação de sítio de clivagem de anti-corpo
US20220306727A1 (en) 2019-06-05 2022-09-29 Seagen Inc. Methods of Purifying Masked Antibodies
TW202112354A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 遮蔽抗體調配物
US20220251206A1 (en) 2019-06-11 2022-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
KR20220020879A (ko) 2019-06-12 2022-02-21 에스크진 파마, 아이엔씨. 새로운 il-15 프로드럭 및 이를 사용하는 방법
CN114173815A (zh) 2019-06-13 2022-03-11 西托姆克斯治疗公司 可活化抗pdl1抗体和抗ctla-4抗体在用于治疗癌症的联合疗法中的用途
US20220296692A1 (en) 2019-06-13 2022-09-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Use of an activatable anti-pdl1 antibody and an anti-ctla-4 antibody in a neoadjuvant combination therapy for the treatment of cancer
IL289094A (en) 2019-06-17 2022-02-01 Tagworks Pharmaceuticals B V Tetrazines for increasing the speed and yield of the "click release" reaction
JP2022537543A (ja) 2019-06-17 2022-08-26 タグワークス ファーマシューティカルス ビー．ブイ． 高速で且つ効率的なクリック放出の為の化合物
US20220289822A1 (en) * 2019-08-21 2022-09-15 AskGene Pharma, Inc. Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof
CN112480263A (zh) * 2019-09-12 2021-03-12 普米斯生物技术(苏州)有限公司 一种双特异t细胞激活器活化t细胞的设计及其应用
JP2022548292A (ja) 2019-09-19 2022-11-17 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 酸性ｐＨでＶＩＳＴＡと結合する抗体
EP4034171A1 (en) 2019-09-23 2022-08-03 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-cd47 antibodies, activatable anti-cd47 antibodies, and methods of use thereof
US20210220391A1 (en) 2020-01-10 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Proteolysis targeting chimeric molecules (protacs) with functional handles and uses thereof
BR112022014667A2 (pt) 2020-01-29 2022-09-20 Inhibrx Inc Anticorpos de domínio único de cd28 e construtos multivalentes e multiespecíficos dos mesmos
KR20220137923A (ko) 2020-02-05 2022-10-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 재조합 항원 결합 분자를 제조 및/또는 농축하기 위한 방법
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法
KR20220151189A (ko) 2020-03-09 2022-11-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
CN115397866A (zh) 2020-03-31 2022-11-25 中外制药株式会社 靶向dll3的多特异性抗原结合分子及其用途
BR112022019841A2 (pt) 2020-04-09 2022-12-06 Cytomx Therapeutics Inc Composições contendo anticorpos ativáveis
WO2021207669A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
KR20230052963A (ko) 2020-08-21 2023-04-20 젠자임 코포레이션 Fgfr3 항체 및 사용 방법
WO2022104186A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited A shielded and homing bispecific antibody that simultaneously inhibits angiogenic pathway targets and her2 family proteins and uses thereof
WO2022109611A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Simcere Innovation, Inc. Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
WO2022170619A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Adagene Pte. Ltd. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
EP4305063A1 (en) * 2021-03-09 2024-01-17 Molecular Partners AG Protease cleavable prodrugs
JP2024511387A (ja) 2021-03-16 2024-03-13 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド マスクした活性化可能サイトカイン構成体ならびに関連する組成物及び方法
WO2023288236A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Seagen Inc. Antibody masking domains
TW202321281A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 日商中外製藥股份有限公司 使用融合多肽之蛋白酶媒介之靶特異性細胞激素傳遞
WO2023049825A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
TW202334186A (zh) 2021-10-13 2023-09-01 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法
WO2023064937A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Programmable delivery platforms for rna structures
WO2023064929A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
TW202330611A (zh) 2021-10-15 2023-08-01 美商賽特艾克斯生物製藥公司 可活化之多肽複合物
WO2023064955A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd3, anti-egfr, heteromultimeric bispecific polypeptide complex
WO2023100829A1 (ja) * 2021-11-30 2023-06-08 第一三共株式会社 プロテアーゼ分解性マスク抗体
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023183923A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
WO2023192606A2 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
WO2023222580A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Byondis B.V. Novel masked antibodies
WO2024015830A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Epcam immunoconjugates and uses thereof
WO2024030850A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030843A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030858A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030845A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030847A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004027045A2 (en) * 2002-09-23 2004-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Polymer-linker-drug conjugates for targeted drug delivery
JP2006503545A (ja) * 2002-02-14 2006-02-02 ラター， ウィリアム ジェイ． 処置される宿主における切断についてのキメラ分子
JP2006506333A (ja) * 2002-07-23 2006-02-23 イシス イノベーション リミテッド 副作用が軽減された治療抗体

Family Cites Families (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS5686121A (en) 1979-12-14 1981-07-13 Teijin Ltd Antitumor proten complex and its preparation
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5306731A (en) * 1985-06-14 1994-04-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Method and products for treating the eye
US5849478A (en) 1986-08-14 1998-12-15 Cashman; Daniel P. Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4952394A (en) 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5322678A (en) 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US5144012A (en) 1988-08-08 1992-09-01 Eli Lilly And Company Cytotoxic drug conjugates
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
US5010176A (en) 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
KR900701847A (ko) 1988-11-18 1990-12-04 원본미기재 복합 폴리펩티드, 그들의 제조 방법 및 사용 방법
US5162218A (en) 1988-11-18 1992-11-10 The Regents Of The University Of California Conjugated polypeptides and methods for their preparation
KR0162259B1 (ko) 1989-12-05 1998-12-01 아미 펙터 감염성 병변 및 염증성 병변을 검출 및 치료하기 위한 키메라 항체
US5525491A (en) 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5272253A (en) 1991-07-01 1993-12-21 Eli Lilly And Company Cluster conjugates of drugs with antibodies
US6004554A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US6107059A (en) * 1992-04-29 2000-08-22 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5844094A (en) 1992-09-25 1998-12-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization Target binding polypeptide
US5834247A (en) 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US6955900B1 (en) 1993-02-02 2005-10-18 The Scripps Research Institute Methods for producing polypeptide binding sites, monoclonal antibodies and compositions thereof
US5679548A (en) 1993-02-02 1997-10-21 The Scripps Research Institute Methods for producing polypeptide metal binding sites and compositions thereof
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5777078A (en) 1993-04-28 1998-07-07 Worcester Foundation For Experimental Biology Triggered pore-forming agents
GB9322156D0 (en) 1993-10-27 1993-12-15 Univ Newcastel Upon Tyne Activation of molecules
US5733757A (en) 1995-12-15 1998-03-31 The Scripps Research Institute Aldolase catalytic antibody
US5468785A (en) 1994-04-15 1995-11-21 University Of Akron Cobaloxime photoinitiated free radical polymerizations
ES2297832T3 (es) 1994-08-19 2008-05-01 La Region Wallonne Conjugados que comprenden un agente antitumoral y su utilizacion.
US5877155A (en) 1995-03-17 1999-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Mimotopes and anti-mimotopes of human platelet glycoprotein Ib/IX
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
JP4212111B2 (ja) 1995-05-03 2009-01-21 バイオエンハンスメンツ リミテッド 結合能力が光開裂性分子により可逆的に阻害される二重特異性抗体
US7060808B1 (en) 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
HU221984B1 (hu) 1996-02-09 2003-03-28 Basf Ag Humán TNFalfa-t kötő antitestek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és alkalmazásuk
GB9603507D0 (en) 1996-02-20 1996-04-17 Isis Innovation Antibody variants
US5866341A (en) 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
AU724326B2 (en) 1996-09-09 2000-09-14 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptide prodrugs containing an alpha-hydroxyacid linker
US6368598B1 (en) 1996-09-16 2002-04-09 Jcrt Radiation Oncology Support Services, Inc. Drug complex for treatment of metastatic prostate cancer
US5994104A (en) * 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US5990286A (en) 1996-12-18 1999-11-23 Techniclone, Inc. Antibodies with reduced net positive charge
ES2236634T3 (es) 1997-04-07 2005-07-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-vegf.
US7365166B2 (en) 1997-04-07 2008-04-29 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
CA2288992C (en) 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6265540B1 (en) 1997-05-19 2001-07-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Tissue specific prodrug
US6451575B1 (en) 1997-07-25 2002-09-17 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Aggrecan degrading metallo proteases
US20030166108A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6391311B1 (en) 1998-03-17 2002-05-21 Genentech, Inc. Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
AU5003299A (en) 1998-07-17 2000-02-07 Emory University Methods for detecting and mapping genes, mutations and variant polynucleotide sequences
US7157418B1 (en) 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US6203989B1 (en) 1998-09-30 2001-03-20 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays
IL142350A0 (en) 1998-10-16 2002-03-10 Biogen Inc Interferon-beta fusion proteins and pharmaceutical compositions containing the same
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US6015557A (en) * 1999-02-24 2000-01-18 Tobinick; Edward L. Tumor necrosis factor antagonists for the treatment of neurological disorders
ES2421720T3 (es) 1999-04-12 2013-09-05 Genentech Inc Homólogos del factor de necrosis tumoral y ácidos nucleicos que los codifican
IL129427A0 (en) * 1999-04-13 2000-02-17 Yeda Res & Dev Preparation of biologically active molecules
US6524583B1 (en) 1999-04-28 2003-02-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody methods for selectively inhibiting VEGF
US6268488B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Barbas, Iii Carlos F. Prodrug activation using catalytic antibodies
US20040146516A1 (en) * 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
JP2003508028A (ja) 1999-07-28 2003-03-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍治療のための組成物と方法
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US20050208558A1 (en) * 1999-10-19 2005-09-22 Applera Corporation Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression or 10,000 or more Drosophila genes and uses thereof
DE19952956A1 (de) 1999-11-03 2001-05-17 Acgt Progenomics Ag Verfahren zur Verbindung von molekularen Substanzen
US7220552B1 (en) 1999-11-19 2007-05-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional molecules and their use in the disruption of protein-protein interactions
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
WO2001077335A2 (fr) * 2000-04-11 2001-10-18 Institut Pasteur Genome de listeria monocytogenes, polypeptides et utilisations
US7514067B2 (en) * 2000-04-25 2009-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for tumor diagnosis and therapy
US20040181830A1 (en) * 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US20040014652A1 (en) 2000-06-01 2004-01-22 Andre Trouet Tumor activated prodrug compounds and methods of making and using the same
JP2003534387A (ja) * 2000-06-01 2003-11-18 ユニべルシテ・カトリック・ドゥ・ルベン 腫瘍活性化プロドラッグ化合物、並びにこれらの製造方法及び使用方法
WO2001091798A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
US6625945B2 (en) * 2000-08-08 2003-09-30 Alfred D. Commins Balanced, multi-stud hold-down
US8314060B2 (en) 2000-09-05 2012-11-20 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
DE10045592A1 (de) * 2000-09-15 2002-03-28 Klaus Pfizenmaier Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie
US7465790B2 (en) * 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
ES2368387T5 (es) 2000-10-09 2019-03-07 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos terapéuticos y que inducen tolerancia
CA2432489A1 (en) 2001-01-04 2002-08-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Detection of protein conformation using a split ubiquitin reporter system
US7141392B2 (en) 2001-01-09 2006-11-28 Queen Mary And Westfield College Latent fusion protein
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
EP1355675A1 (en) 2001-01-30 2003-10-29 Universite Catholique De Louvain Anti-tumor compounds
KR20040074587A (ko) 2001-02-19 2004-08-25 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성을 갖는 인공 단백질
RU2297245C2 (ru) 2001-02-19 2007-04-20 Мерк Патент Гмбх Модифицированные анти-egfr антитела с уменьшенной иммуногенностью
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
GB0118155D0 (en) * 2001-07-25 2001-09-19 Lorantis Ltd Superantigen
WO2003012105A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 University Of Bristol Vegf isoform
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20030134824A1 (en) 2001-11-12 2003-07-17 Ronald Breslow Beta-cyclodextrin dimers and phthalocyanines and uses thereof
US20060246066A1 (en) * 2001-12-17 2006-11-02 Morgan Bryan P Cleavable reagents for specific delivery to disease sites
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7452535B2 (en) 2002-04-12 2008-11-18 Medarex, Inc. Methods of treatment using CTLA-4 antibodies
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
JP4351430B2 (ja) 2002-10-04 2009-10-28 財団法人癌研究会 ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド
EP1572242B1 (en) * 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
CN1548537B (zh) 2002-12-27 2010-05-05 深圳市源兴生物医药科技有限公司 疫苗制备方法和抗肿瘤疫苗
WO2004111192A2 (en) 2003-05-29 2004-12-23 The Scripps Research Institute Targeted delivery to legumain-expressing cells
US20050009110A1 (en) 2003-07-08 2005-01-13 Xiao-Jia Chang Methods of producing antibodies for diagnostics and therapeutics
WO2005012531A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Genentech, Inc. Antibody cdr polypeptide sequences with restricted diversity
ATE447611T1 (de) 2003-08-18 2009-11-15 Univ California Polypeptid-display-bibliotheken und verfahren zur herstellung und verwendung davon
US20050106100A1 (en) * 2003-09-03 2005-05-19 Harris Thomas D. Compounds containing matrix metalloproteinase substrates and methods of their use
US7985401B2 (en) * 2003-10-31 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
US7431915B2 (en) * 2003-10-31 2008-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
WO2005051315A2 (en) * 2003-11-24 2005-06-09 The Regents Of The University Of California On-demand cleavable linkers for radioconjugates for cancer imaging and therapy
WO2005067980A2 (en) 2004-01-12 2005-07-28 Pointilliste, Inc. Design of therapeutics and therapeutics
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
GB0404187D0 (en) 2004-02-25 2004-03-31 Biotransformations Ltd Binding agents
EP1579873A1 (en) 2004-03-23 2005-09-28 Complex Biosystems GmbH Polymeric prodrugs
US7541330B2 (en) 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
JP4246121B2 (ja) 2004-07-29 2009-04-02 株式会社リコー 静電潜像現像用カラーキャリア及び現像剤
US20090022782A1 (en) 2005-02-25 2009-01-22 National University Corp. Hokkaido University Blood Retainable Device Exhibiting Selective Degradability in Tumor Tissue
WO2006108052A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Genzyme Corporation Peg and polysialic lysosomal enzyme conjugates via acid labile linkers for therapeutic targeting
DE102005036542A1 (de) 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
US7666817B2 (en) * 2005-08-31 2010-02-23 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
US20090130776A1 (en) 2005-09-01 2009-05-21 Canon Kabushiki Kaisha Binding protein molecule
EP1770099A1 (en) 2005-09-28 2007-04-04 University of Geneva Method of producing a modified (poly)peptide
WO2007064759A2 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The Scripps Research Institute Inhibiting tumour cell invasion, metastasis and angiogenesis through targetting legumain
KR20080077261A (ko) 2005-12-06 2008-08-21 도만티스 리미티드 Ｅｇｆｒ 및/또는 ｖｅｇｆ에 대해 결합 특이성이 있는리간드 및 그의 사용 방법
GB0604187D0 (en) 2006-03-02 2006-04-12 Fusion Antibodies Ltd Peptide and uses thereof
WO2007106415A2 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Massachusetts Institute Of Technology Triggered self-assembly conjugates and nanosystems
CA2645347A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Diatos Anticancer drugs conjugated to antibody via an enzyme cleavable linker
CN103073639A (zh) 2006-03-17 2013-05-01 比奥根艾迪克Ma公司 稳定的多肽组合物
US20100215670A1 (en) 2006-10-30 2010-08-26 Jeannick Cizeau Immunotoxin Fusions Comprising An Antibody Fragment and a Plant Toxin Linked by Protease Cleavable Linkers
ATE542830T1 (de) 2006-12-04 2012-02-15 Pasteur Institut Als gerüst verwendeter ob-fold zur entwicklung neuer spezifischer bindemittel
US20080317677A1 (en) 2007-06-22 2008-12-25 Szymczak Christopher E Laser Marked Dosage Forms
WO2009018500A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 The Johns Hopkins University Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
EP3492488A1 (en) * 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CN108129573B (zh) 2007-09-21 2021-10-08 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
US20100189727A1 (en) 2008-12-08 2010-07-29 Tegopharm Corporation Masking Ligands For Reversible Inhibition Of Multivalent Compounds
BRPI1006141B8 (pt) * 2009-01-12 2021-05-25 Cytomx Therapeutics Llc composições de anticorpo modificado, métodos para preparar e usar as mesmas
CA2753294A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Proproteins and methods of use thereof
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006503545A (ja) * 2002-02-14 2006-02-02 ラター， ウィリアム ジェイ． 処置される宿主における切断についてのキメラ分子
JP2006506333A (ja) * 2002-07-23 2006-02-23 イシス イノベーション リミテッド 副作用が軽減された治療抗体
WO2004027045A2 (en) * 2002-09-23 2004-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Polymer-linker-drug conjugates for targeted drug delivery

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELL DEATH DIFFER., vol. 14, no. 4, JPN6015028664, April 2007 (2007-04-01), pages 765 - 774, ISSN: 0004518710 *
MOL. PHARM., vol. 1, no. 1, JPN6013043966, 2004, pages 9 - 22, ISSN: 0004518709 *

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