JP4351430B2 - ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド - Google Patents
ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炭素材料物質であるカーボンナノホーンやカーボンナノチューブなどのナノ黒鉛構造体を認識するペプチド分子やファージ、前記ペプチド分子と機能性ペプチド若しくはタンパク質、又は標識化物質等との結合体からなる人工タンパク質又はキメラ分子、前記ペプチド分子、人工タンパク質又はキメラ分子とナノ黒鉛構造体との複合体等に関する。例えば、ナノメートルスケールの微細構造を有する黒鉛構造化合物とこれを特異的に認識するペプチド、人工タンパク質又はキメラ分子との複合体はナノバイオテクノロジー、材料工学、半導体、医薬品、化粧品などに有利に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
炭素の結晶構造としてはダイヤモンドとグラファイトが古くから知られているが、１９８５年にはスモーリー（Ｒ．Ｅ．Ｓｍａｌｌｅｙ）、カール（Ｒ．Ｆ．Ｃｕｒｌ）、クロトー（Ｈ．Ｗ．Ｋｒｏｔｏ）らにより（Ｃ６０）が発見された（例えば、非特許文献１参照。）。Ｃ６０は１２個の５角形と２０個の６角形からなるサッカーボール状の構造をしており、Ｃ６０のほかにもＣ７０、Ｃ７６などの大きな籠状分子が存在し、これら一連の分子は「フラーレン」と呼ばれている。また、１９９１年には本発明者の一人飯島澄男により「カーボンナノチューブ」（例えば、非特許文献２、及び特許文献１参照。）、１９９９年には同じく飯島澄男により「カーボンナノホーン」（例えば、非特許文献３、及び特許文献１参照。）といった、それまで存在が知られていなかった新しい構造を持った炭素系化合物が相次いで発見された。これら、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンはいずれも炭素原子の６員環と５員環から構成されており、ナノメートルスケールの微細構造体を形成することから、「ナノ黒鉛構造体」として近年大きな注目を集めている。
【０００３】
ナノ黒鉛構造体が注目を集める理由をいくつか上げてみると、「カーボンナノチューブが、そのカイラリティーの違いにより金属と半導体の両方の性質をもつことができる（例えば、非特許文献４参照。）。」、「金属導入フラーレンが超電導を示す（例えば、非特許文献５参照。）」、「カーボンナノホーンの示す選択的な気体貯蔵能力（例えば、非特許文献６参照。）」などがある。これらの特徴的な性質を利用して、新しい電子材料や触媒、光材料、その他の分野で、より具体的には、半導体配線、蛍光表示管、燃料電池、ガス貯蔵、遺伝子治療ベクター、化粧品、薬品送達システム、バイオセンサーなどへのナノ黒鉛構造体の応用利用が期待されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−６４００４号公報
【非特許文献１】
Nature,318:162-163, 1985
【非特許文献２】
Nature,354:56-58, 1991
【非特許文献３】
Chem.Phys.Lett.,309,165-170, 1999
【非特許文献４】
Nature,391:59-62, 1998
【非特許文献５】
Nature,350:600-601, 1991
【非特許文献６】
日経サイエンス８月号，４２，２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ナノ黒鉛構造体の様々な分野での応用利用を考える場合、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、あるいはその修飾体を効率良く、認識、結合、分離、整列させる技術が必要となる。しかしながら、カーボンナノホーンやカーボンナノチューブといったナノ黒鉛構造体は、これを特異的に認識、結合する手法が一般的には存在しないため、利用しにくいといった問題点がある。本発明の課題は、カーボンナノホーンやカーボンナノチューブなどのナノ黒鉛構造体を効率良く、認識、結合、分離、整列させることを可能とする、ナノ黒鉛構造体を認識するペプチドやファージ、前記ペプチドと機能性ペプチド若しくはタンパク質又は標識化物質等との結合体からなる人工タンパク質やキメラ分子、前記ペプチド分子、人工タンパク質又はキメラ分子とナノ黒鉛構造体との複合体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を大腸菌中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に再度接触させるパニング操作を繰り返すことによりナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮し、カーボンナノホーンやカーボンナノチューブ等のナノ黒鉛構造体を特異的に認識する、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮することを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドのスクリーニング方法（請求項１）に関する。
【０００８】
また本発明は、配列番号１〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項２）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項３）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項４）や、化学修飾されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項５）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項６）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項６記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項７）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項６又は７記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項８）に関する。
【０００９】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドをその粒子表面上に提示することを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項９）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１０）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１１）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１２）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項１２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１３）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項１２又は１３記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１４）に関する。
【００１０】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、機能性ペプチド又はタンパク質との結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１５）や、機能性ペプチド又はタンパク質が、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１６）や、機能性ペプチド又はタンパク質が、細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１７）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１８）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１９）や、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２０）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項１５〜２０のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２１）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項２１記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２２）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項２１又は２２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２３）に関する。
【００１１】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、単独又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識化物質又はペプチドタグとの結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２４）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、非ペプチド系化合物との結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２５）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項２４又は２５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２６）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項２４又は２５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２７）や、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２８）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項２４〜２８のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２９）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項２９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項３０）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項２９又は３０記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項３１）に関する。
【００１２】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、請求項１５〜２３いずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質、又は、請求項２４〜３１いずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子が、ナノ黒鉛構造体に結合したことを特徴とするナノ黒鉛構造体複合体（請求項３２）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項３２記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３３）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項３２記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３４）や、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項３２〜３４のいずれか記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３５）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項３２〜３５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３６）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項３６記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３７）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項３６又は３７記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３８）に関する。
【００１３】
さらに本発明は、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ（請求項３９）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドとしては、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の全部又はその一部を含むナノ黒鉛構造体に結合しうるペプチド（以下、これらペプチドを「本件ペプチド」という）を挙げることができ、かかる本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドは、ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮する、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドのスクリーニング方法により得ることができる。また、このスクリーニング方法により得ることができる、配列番号１〜２０のいずれかに示される以外のアミノ酸配列からなるナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドも本発明に含まれる。上記本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドは、そのアミノ酸配列情報から合成により作製することもでき、精製されたものが好ましい。なお、ファージ粒子上に提示されているものは本発明の上記ペプチドからは除かれる。さらに、本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、本件ペプチドをコードするものであれば特に制限されるものではない。
【００１５】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージとしては、本件ペプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージは、前記のスクリーニングの過程で、黒鉛構造体分子に強く結合したペプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンとして得られる他、本件ペプチドをコードするＤＮＡを常法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、ヘルパーファージを感染させることで得ることもできる。一般的にＭ１３やｆｄなどの繊維状ファージは、高濃度の状態では液晶状態となり、規則的な整列構造をとることから、ナノ黒鉛構造体を認識するペプチドファージを液晶状態にすることにより、ナノ黒鉛構造体を認識するペプチドが規則的にナノスケールで配列した状態をつくることができる。ここにナノ黒鉛構造体を接触させると、ペプチドのナノ黒鉛構造体認識能力により、ナノ黒鉛体を整列させることができる。
【００１６】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質としては、本件ペプチドと、機能性ペプチド又はタンパク質との結合体からなるものであれば特に制限されるものではなく、上記機能性ペプチド又はタンパク質の機能としては、αヘリックス形成等の二次構造を形成しやすい機能、ウイルス等の中和抗体を誘導する抗原機能、免疫賦活化する機能（Nature Medicine,3:1266-1270,1997）、細胞増殖を促進又は抑制する機能、癌細胞を特異的に認識する機能、プロテイン・トランスダクション機能、細胞死誘導機能、抗原決定残基呈示機能、金属結合機能、補酵素結合機能、触媒活性機能、蛍光発色活性機能、特定の受容体に結合してその受容体を活性化する機能、信号伝達に関わる特定の因子に結合してその働きをモジュレートする機能、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖などの生体高分子を特異的に認識する機能、細胞接着機能、細胞外へタンパク質を局在化させる機能、特定の細胞内小器官（ミトコンドリア、葉緑体、ＥＲなど）にターゲットする機能、細胞膜に埋め込まれる機能、アミロイド繊維形成機能、繊維性タンパク質の形成機能、タンパク質性ゲル形成機能、タンパク質性フィルム形成機能、単分子膜形成機能、二次元結晶を自己集合で形成しうる等の自己集合機能、粒子形成機能、他のタンパク質の高次構造形成を補助する機能などを挙げることができる。これらの人工タンパク質は、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドに機能性ペプチド又はタンパク質を、アミノ酸レベルで、あるいはＤＮＡレベルで直接的又は間接的に連結することにより、作製することができる。
【００１７】
上記機能性ペプチド又はタンパク質の中でも、例えば、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質を用いると、その二次元結晶に沿ってナノ黒鉛化合物をナノスケールできれいに整列化することができる人工タンパク質を構築することができる。かかるナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質として、ウイルス（例えば、アデノウィルス、ロタウィルス、ポリオウィルス、ＨＫ９７、ＣＣＭＶ等）、フェリチンやアポフェリチンのようなフェリチンファミリー、ＤｐｓＡタンパク質やＭｒｇＡタンパク質を挙げることができる。その他の、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質としては、人工的に設計された繰り返し性に富む人工タンパク質などを挙げることができる。また、タンパク質の二次元結晶を作製する方法としては、タンパク質溶液を水面上に単分子膜で展開させた後、固体基板に吸着させる方法などを例示することができる。
【００１８】
また、上記機能性ペプチド又はタンパク質の中でも、例えば、細胞接着活性等の細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質を用いると、ナノ黒鉛化合と細胞を同時に認識する複合活性をもつ人工タンパク質を得ることができる。かかる細胞接着活性等の細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質としては、各種リガンド、モノクローナル抗体やその可変領域、１本鎖抗体等を例示することができる他、上記のような天然タンパク質に限らず、細胞接着活性を有するペプチドを含む人工タンパク質を挙げることができる。
【００１９】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子としては、本件ペプチドと、単独又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識化物質又はペプチドタグとの結合体からなるキメラ分子を挙げることができる。上記標識化物質としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位体、抗体のＦｃ領域、等を挙げることができ、具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ等の放射性同位体、化学発光物質を挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン（Ｈｉｓ）等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。例えば、ＨｉｓタグとＮｉ−ＮＴＡの親和性を利用すると、ナノ黒鉛構造体複合体を容易に精製することができる。
【００２０】
また、本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子としては、本件ペプチドと、非ペプチド系化合物との結合体からなるキメラ分子を挙げることができる。上記非ペプチド系化合物のうち、非ペプチド系低分子化合物としては、フルオレセイン、ローダミン等の蛍光色素、クロラムフェニコール、アンピシリン等の抗生物質を、非ペプチド系高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスビーズ、シリカゲル、多糖類（誘導体を含む）、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコールを具体的に例示することができる。
【００２１】
本発明のナノ黒鉛構造体複合体としては、本件ペプチドや、上記本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質や、上記本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子が、ナノ黒鉛構造体に疎水結合、パイ電子結合、ファンデルワールス結合、イオン結合などの弱い結合のいずれか、あるいは組み合わせにより結合した複合体を挙げることができる。
【００２２】
また、本件ペプチドにおける、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の中でも、アミノ酸配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）やＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）からなるペプチドが、ナノ黒鉛構造体への優れた結合能を有する点で好ましい。そして、これら本件ペプチドやナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドとして、化学修飾がなされたペプチドを有利に用いることができる。かかる化学修飾としては、官能基を有するアミノ酸への置換からなる化学修飾や、リンカーとの結合を容易に形成させるための化学修飾を挙げることができるが、化学修飾によりナノ黒鉛構造体への結合能が低下しない修飾が好ましい。上記リンカーとの結合を容易に形成させるための化学修飾としては、ビオチンのＮ−ハイドロキシサクシイミドエステル体を用いて、ペプチドのアミノ基へのビオチンの共有結合を具体的に例示することができる。かかるペプチドのビオチン化により、前記キメラ分子を容易に作製することができる。
【００２３】
前記ナノ黒鉛構造体としては、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、カーボンナノカプセル、フラーレン等の炭素原子の６員環と５員環から構成されているナノメートルスケールの微細構造体を例示でき、上記カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブとしては、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有するものや、構成する炭素構造にカルボニル基、カルボキシル基、水酸基、エーテル基、イミノ基、ニトロ基、スルホン基等の官能基が付加されている親水性を呈するもの（特願２００１−２９４４９９号）を好適に挙げることができる。例えば、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有する親水性のカーボンナノホーンは、本来疎水性であるカーボンナノホーンを親水性にするために、酸化性のある硝酸、硫酸、過酸化水素酸等の酸を用いて酸化処理をすることによって製造することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（実施例１）
Ａｒガスの６ｘ１０4Ｐａ雰囲気圧内の焼結丸棒状炭素表面に高出力のＣＯ2ガスレーザ光（出力１００Ｗ、パルス幅２０ｍｓ、連続発振）を照射し、生じたすす状物質をエタノールに懸濁し、超音波撹拌（周波数４０ｋＨｚ、時間６０分）とデカンテーションとを４回繰り返して単層カーボンナノホーンを得た。この単層カーボンナノホーン約２００ｍｇを、濃度約７０％の硝酸４０ｍｌ中に入れ、１３０℃で１時間還流をおこなった。終了後、イオン交換水でうすめて遠心分離を行い上澄みを捨てることを繰り返して中和洗浄し、官能基（カルボキシル基を含む）をもつ水溶性の単層カーボンナノホーンを調製した。
【００２５】
１．２ｍｇの硝酸処理済みカーボンナノホーンを２ｍｌの０．１Ｍ 2-Morpholinoethanesulfonic acid.monohydrate（以下ＭＥＳ、同仁化学、熊本）（ｐＨ５．５）に懸濁した。これを、超音波装置用スピッツチューブ（ＡＳ−１０００、東湘電気）に入れ、超音波細胞粉砕装置（Biorupter、コスモバイオ、東京）を用いて、出力２００Ｗで１時間超音波撹拌して懸濁を完全なものとした。次にこの懸濁液を、５００μｌずつ１．８ｍｌプラスチックチューブに分注し、それぞれに２５μｌの５０ｍＭ 5-（Biotinamido）pentylamine（ＥＺ−Ｌｉｎｋ、ピアス社、Rockford）を加えて撹拌した。続いて直ちに０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で調製した６．２５μｌの１００ｍｇ／ｍｌの1-Ethyl-3-［3-Dimethylaminopropyl］carbodiimide Hydrochloride（以下ＥＤＣ、ピアス社）溶液をそれぞれに加えて、室温でマイクロインキュベーター（Ｍ−３６、タイテック社、東京）を用いて良く撹拌しながら２時間インキュベートした。これにより硝酸処理カーボンナノホーンのカルボキシル基とビオチンのアミノ基の間でカルボジイミドの作用により、アミド結合が形成され、ビオチン化カーボンナノホーンが得られる。
【００２６】
１０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンコート磁気ビーズ懸濁液（ダイナビーズＭ−２８０、ダイナル社、Oslo）を０．１％ Polyoxyethylenesorbitan monolaurate［以下Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ社、Ｓｔ．Louis）］、５０ｍＭ Tris-buffered Saline［以下ＴＢＳ、（ｐＨ７．５）］で２回洗浄し、最後にビーズが０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。ストレプトアビジンコート磁気ビーズの洗浄は、磁性体集積装置（ＭＰＣ−Ｅ、ダイナル社、Oslo）を用いて磁気ビーズをチューブ外側から磁石で吸着させることによって進めた。
【００２７】
１２０μｌのビオチン化カーボンナノホーンの０．１Ｍ ＭＥＳ懸濁液（０．６ｍｇ／ｍｌ。カーボンナノホーン約７０μｇ相当）と、５ｍｇ／ｍｌ前処理済みストレプトアビジンコート磁気ビーズ懸濁液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ）１００μｌを混合し、３０分おきに指で軽くチューブをたたくことで撹拌しながら、４時間、室温で吸着反応を進めた。次に、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン（岩井化学薬品、東京）、５０ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄し、同バッファー２００μｌに再懸濁して室温で２０分間インキュベートした。更に、１０μｌの１ｍＭ d-biotin（シグマ社）、２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＴＢＳを加え、室温で５分インキュベートした。この操作により、ストレプトアビジンのビオチン結合サイトをビオチンで飽和した。
【００２８】
ペプチド提示ファージライブラリーは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示するＤ１２ライブラリー（ＮＥＢ社、Beverly）と７残基の環状ランダムペプチドを提示するＣ７Ｃライブラリー（ＮＥＢ社）を用いた。それぞれ、２．７ｘ１０9、１．２ｘ１０9種の異なるペプチド配列をもつライブラリーである。
【００２９】
ビオチン化カーボンナノホーンが固相化された磁気ビーズ懸濁液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと、ビオチンが固相化されていない対照の磁気ビーズ懸濁液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌをそれぞれ１．８ｍｌプラスチックチューブに移し、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄する。続いて、同バッファーに懸濁して室温で２０分間インキュベートし、非特異的なファージの結合を抑えるための、ウシ血清アルブミンによるブロッキング操作を完了した。
【００３０】
ファージライブラリー原液を希釈し、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ中に、ファージ力価がＤ１２ライブラリーでは２．７ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ、Ｃ７Ｃライブラリーでは１．２ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌとなるようなファージ液を調製した。ファージ力価は常法（Phage Display-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）に従いもとめた。
【００３１】
ビーズ部分を認識してしまうような好ましくないペプチドファージのバックグラウンド結合をあらかじめ除外するために、以下のプレパニング操作をおこなった。すなわち、ウシ血清アルブミンによるブロッキングをおこなったカーボンナノホーンの固相化されていないビーズ０．５ｍｇにファージ液２００μｌ（ファージ力価がＤ１２ライブラリーでは２．７ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ、Ｃ７Ｃライブラリーでは１．２ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ）を加え、室温で４時間インキュベートした。次に、ファージ液中の磁気ビーズを磁石に吸着させ、上清のファージ液を別のチューブに移した。さらに、ビーズ液を５０μｌの２％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ ＴＢＳで１回洗浄し、この洗浄液もあわせ、合計２５０μｌのプレパニング済みのファージ液を得た。
【００３２】
プレパニング処理をほどこした２５０μｌファージライブラリー液をウシ血清アルブミンによるブロッキングを行ったビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズ（カーボンナノホーン約７０μｇ相当）に加え、回転式撹拌器（ＲＴ−５０、タイテック社、東京）により室温、１８時間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。磁気ビーズを１ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ ＴＢＳで１０回洗浄した。最後の洗浄の後に、１ｍｌの溶出バッファー［２Ｍ Glycine-HCl（ｐＨ２．２）、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン］をカーボンナノホーン固相化磁気ビーズに加え１０分インキュベートし、カーボンナノホーンに結合したファージを溶出させた。磁石でビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズを吸着し、上清に回収される溶出したファージ液１ｍｌを別のチューブに移した。回収したファージ液に１５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて、溶出液を中和し、溶出したファージの力価を測定した。
【００３３】
上の操作で得られたファージ溶出液をＬＢ２０ｍｌ中で対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ‘ｌａｃｌq△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ+Ｂ+ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）△（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒk-ｍk-ＭｃｒＢＣ-）］に感染させ、振とう培養機（ＢＲ−４０ＬＦ、タイテック社）を用い３７℃で激しく撹拌しながら４時間３０分インキュベートした。ファージ感染菌培養液を遠心チューブ（５０ｍｌ、ベックマン、カルフォルニア）に移して、ベックマン遠心機（ベックマン、ＪＡ−１２ローター）を用い４℃、１０分、１００００ｒｐｍで遠心してＥＲ２７３８菌を取り除く操作を２度行い、上清のファージ液を別のチューブに移した。ファージ液に３．５ｍｌ（１／６量）の２０％Polyethylene glycol 6000（以下ＰＥＧ６０００、Ｆｌｕｋａ社、Ｂｕｃｈｓ）、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加え、ミキサー（Ｓ−１００、タイテック社）により良く撹拌して４℃、１２時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。
【００３４】
沈殿したファージをベックマン遠心機で４℃、１０分、１００００ｒｐｍで遠心して回収した。ファージ沈殿を、更に４０００ｒｐｍ、１分で遠心し少量残っている上清を完全に取り除いた。得られたファージ沈殿に、１ｍｌのＴＢＳを加え、氷上で冷却した後に、穏やかにファージを懸濁した。このファージ懸濁液を、１．８ｍｌプラスチックチューブに移し、微量高速遠心機（ＴＭＡ−ＩＩローター、トミー社、東京）を用い５分、１５０００ｒｐｍで遠心して上清を別のチューブに移し、懸濁されない残渣を取り除いた。ファージ液に再度、２００μｌの２０％ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌを加えてミキサーで良く撹拌し、氷上で１時間インキュベートしてファージを沈殿させた。次に、微量高速遠心機により１０分、１５０００ｒｐｍで遠心してファージ沈殿を回収した。得られたファージ沈殿に２００μｌの０．０２％ＮａＮ3（和光純薬、大阪）、５０ｍＭ ＴＢＳを加えて完全に懸濁させた。懸濁できない残渣を微量高速遠心機により５分、１５０００ｒｐｍで遠心し取り除いた。得られた濃縮ファージ液の力価を求めた。
【００３５】
上に示すような標的分子（この場合カーボンナノホーン）へのファージの結合、洗浄、回収、大腸菌による増幅といった一連の作業はパニング操作と呼ばれている。パニング操作を繰り返すことにより、標的分子へ特異的に強く結合するファージクローンを濃縮していくことが可能である。この場合も、１回目のパニング操作後、一度大腸菌で増やしたファージを用いて、再度、ビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズに対する結合、洗浄、回収、増殖の２回目以降のパニング操作を繰り返していった。２回目以降のパニング操作実験条件で、１回目の操作と異なるのは以下の通りであった。すなわち、２回目以降のパニング操作で加えるファージの力価を、Ｄ−１２ライブラリーでは２．７ｘ１０10、Ｃ７Ｃライブラリーでは１．２ｘ１０10となるように調製した。また、濃縮ファージを懸濁する溶液とビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズの反応バッファー及び、その洗浄バッファー中のＴｗｅｅｎ−２０濃度を２回目のパニング操作時で０．３％、３回目のパニング操作時とそれ以降で０．５％とした。
【００３６】
Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング実験のインプット力価（標的分子に加えたファージ力価）とアウトプット力価（洗浄後の標的分子から溶出されたファージ力価）の比の値の変化を図１に、またＣ７Ｃライブラリーでのパニング実験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図２に示す。
【００３７】
Ｄ１２ライブラリーでは５ラウンド、６ラウンドで得られたファージを、Ｃ７Ｃライブラリーでは６ラウンド、７ラウンドで得られたファージを、それぞれ常法（Phage Display A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）に従いクローン化し、その提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には提示ペプチド領域から９６塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー［−９６ｇIII シーケンシングプライマー（５’−HOＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）（配列番号３２）、ＮＥＢ社、Beverly］を用いて、ダイデオキシターミネイト法により決定した（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社、カルフォルニア）。反応産物の泳動とデータ解析にはキャピラリーシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマン）を用いた。
【００３８】
決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列のいくつかを、Ｄ１２ライブラリーについては図３（配列番号１、配列番号３〜７）に、Ｃ７Ｃライブラリーについては図４（配列番号２、配列番号８〜１０、配列番号２５）に示す。この中で、Ｄ１２ライブラリーの５回目のパニング操作から得られたＮＨＤ１２−５−２ファージの提示するペプチド配列、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）は、５回目のパニングから調べた３３個のクローンの中には同じ配列をもつものが１５個（４５％）あったのに対して、６回目のパニングから調べた１５個のクローン中の１３個（８７％）までがこの配列をもつクローンであった。同様に、Ｃ７Ｃライブラリーの６回目のパニング操作から得られたＮＨＣ−６−２ファージの提示するペプチド配列、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）は、６回目のパニングから調べた１４個のクローン中には同じ配列をもつものが７個（５０％）あったのに対して、７回目のパニングから調べた１４個のクローンの中の１０個（７１％）までがこの配列をもつクローンであった。このようにパニングの回数が進むにつれて、特定のファージクローンが集団中の大多数を占めるようになることの理由の１つに、そのファージクローンが標的分子に対して強い結合能力をもつことがあげられる。
【００３９】
図３（配列番号１、配列番号３〜７）、図４（配列番号２、配列番号８〜１０、配列番号２５）で示したペプチドを提示するファージをクローン化し、クローン化状態でのカーボンナノホーンとカーボンナノチューブに対する結合能力を実施例４に示すように評価した。
【００４０】
（実施例２）
化学的気相成長法で合成された単層カーボンナノチューブであるＨｉｐｃｏ（カーボンナノテクノロジーズ社、テキサス）を１７５０℃、１ｘ１０-5Ｔｏｒｒで５時間処理した後、濃度約７０％の硝酸中、約１３０℃で３０分還流をおこなった。終了後、水酸化ナトリウムで中和し、蒸留水で洗浄し、官能基（カルボキシル基を含む）をもつ単層カーボンナノチューブを調製した。
【００４１】
得られた硝酸処理単層カーボンナノチューブを、実施例１で示すと同じ方法でビオチン化し、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ上に固相化した。この固相化カーボンナノチューブを用い、実施例１で示すと同じ方法で、Ｄ１２ライブラリー、Ｃ７Ｃライブラリーを用いたパニング実験をおこなった。ただし、Ｃ７Ｃライブラリーでは１ラウンド目のファージのインプット力価を２．４ｘ１０11とし、以降は実施例１と同様に１．２ｘ１０10とした。
【００４２】
Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング実験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図５に、またＣ７Ｃライブラリーでのパニング実験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図６に示す。決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列のいくつかを、Ｄ１２ライブラリーについては図７（配列番号１１〜１５、配列番号２６〜２８）に、Ｃ７Ｃライブラリーについては図８（配列番号２９〜３０）に示す。クローン化状態でのカーボンナノホーン、カーボンナノチューブに対する結合能力を実施例４に示すように評価した。
【００４３】
（実施例３）
カーボンナノホーンの懸濁液と異なり、単層カーボンナノチューブの懸濁液は、遠心操作によりカーボンナノチューブだけを分離することが可能である。実施例１で示すと同じ方法で、Ｄ１２ライブラリーを用いた未処理単層カーボンナノチューブに対するパニング操作を進めた。ただし、プレパニング操作を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（イムロン４ＨＢＸ、ＤＹＮＥＸ、ＶＡ）で行い、ファージの結合反応を２時間とし、反応後の単層カーボンナノチューブの分離は、反応液を１．８ｍｌプラスチックチューブに移し、微量高速遠心機（上記）を用い８分、１５０００ｒｐｍでの遠心操作により行った。また、１−２ラウンド目のファージのインプット力価を２．７ｘ１０11にし、以降のラウンドでは２．７ｘ１０10とした。インプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図９に示す。決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列のいくつかを図１０（配列番号１６〜２０、配列番号３１）に示す。配列を決定した１９のファージクローンのうち、７個がファージクローンＨｉＰ２ファージが提示するペプチド配列（配列番号１７）と同じ配列をもっていた。同様に、２個がファージクローンＨｉＰ１ファージが提示するペプチド配列（配列番号１６）と同じ配列を、２個がファージクローンＨｉＰ６ファージが提示するペプチド配列（配列番号１８）と同じ配列をもっていた。クローン化状態でのカーボンナノホーン、カーボンナノチューブに対する結合能力を実施例４に示すように評価した。
【００４４】
（実施例４）
実施例１、２、３で得られたファージクローンを用い、固相化カーボンナノホーン、固相化単層カーボンナノチューブに対する結合能力を次のような実験から評価した。硝酸処理カーボンナノホーン、硝酸処理単層カーボンナノチューブを実施例１、２で示すと同じ方法でストレプトアビジンコート磁気ビーズ上に固相化した。これまでの１／２０量（カーボンナノホーン約３．５μｇ相当）の固相化試料を９６穴プレート（ファルコンＵ型アッセイプレート、ベクトンディッキンソン、ニュージャージー）に加え、磁性体集積装置（ＭＰＣ−９６、ダイナル社、Ｏｓｌｏ）を用いて、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、ＴＢＳ液にバッファー交換し、１時間インキュベートした。次に、２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで３回洗浄し、ファージ力価が５ｘ１０8ｐｆｕ／ｍｌとなるように２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ液中に調製したファージクローンを加えてマイルドミキサー（ＰＲ−１２、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、室温で撹拌しながら２時間インキュベートした。
【００４５】
続いて磁性体集積装置を用いて、２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで１０回洗浄した。次に、Ｍ１３ファージ検出ＥＬＩＳＡキット（Detection Module Recombinant Phage Antibody System、amersham pharmacia biotech、Little Chalfont Buckinghamshire）を用い、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体を結合させ、これに発色基質の2'，2'-Azino-Bis（3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulphonic Acid）diammonium salt（ＡＢＴＳ）を過酸化水素と共に加えて、その吸光度（Ａ415nm）を求めることで、固相化ビーズに結合しているファージの定量化を行った。なお、コントロールのファージクローンにはランダムペプチドをもたないＮ１と、パニング操作を行っていない原液のＤ１２ライブラリーから得られたＮ２（配列番号２２）、Ｎ３（配列番号２３）、Ｎ４（配列番号２４）ペプチドを提示するクローンを用いた。
【００４６】
結果を図１１にまとめてある。２７クローンのうち２０のクローンでは、硝酸処理カーボンナノホーン、硝酸処理単層カーボンナノチューブ、いずれかの試料に対して強い結合が認められた。それぞれのクローンが示す、カーボンナノホーンとカーボンナノチューブに対するＥＬＩＳＡで評価される結合能力の程度は、クローンごとに特徴が見られた。すなわち、配列番号１で示されるペプチドを提示する、硝酸処理カーボンナノホーンに対する選択で得られたＮＨＤ１２−５−２ファージの場合、カーボンナノホーンとカーボンナノチューブの両方に強く結合するが、配列番号１１で示されるペプチドを提示する、硝酸処理単層カーボンナノチューブに対する選択で得られたＢＨｉＰ９ファージの場合、カーボンナノホーンよりはカーボンナノチューブの方により強く結合することがわかる。後者の性質をもつファージの提示するペプチド配列を利用することから、ナノ黒鉛構造体の中の、微妙な構造変化を区別するペプチドや人工タンパク質のナノバイオテクノロジー分野での利用が考えられる。
【００４７】
２７クローンのうち７つのクローンではいずれの試料に対してもコントロールと同程度の結合しか示さなかったので、これら７つのクローンの提示するペプチド（配列番号２５〜３１）はナノ黒鉛構造体に親和性をもつものではないと考えられる。
【００４８】
磁気ビーズに固相化した状態のナノ黒鉛構造体に対して、得られたファージペプチドの多くが結合することが示された。次に、磁気ビーズに固相化していない状態のカーボンナノホーンに対するファージ結合能力の評価を、ファージ凝集実験を用いて評価してみた。まず、単層カーボンナノホーンを、７６０Ｔｏｒｒの酸素雰囲気下で、１０分、４２０度で可熱処理し、官能基（カルボニル基を含む）をもつ単層カーボンナノホーンを調製した。この酸素処理カーボンナノホーンを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳ液に懸濁し、９６穴プレート（cell-culture-treated 96 microplate／Round bottom、ＩＷＡＫＩ）に２００μｌずつ加え、更に、ここにクローン化ファージを力価５×１０8で加えた。室温で２時間３０分インキュベートした後の沈澱の様子を実体光学顕微鏡（ＷＩＬＤ Ｍ１０、ライカ社、スイス）により撮影した。結果を図１２に示す。２０のクローンではプレート中心付近にはっきりとしたカーボンナノホーンの凝集した沈澱が確認できた。これは赤血球の抗体による凝集反応に似た現象がおこっているためと考えられ、ファージのカーボンナノホーンに対する結合能力を示していると考えられる。この２０のクローンは、上のＥＬＩＳＡの実験から、少なくとも硝酸処理カーボンナノホーン、硝酸処理単層カーボンナノチューブ、いずれかの試料に対して強い結合が認められた２０のクローンに完全に一致した。このことは、ＥＬＩＳＡの実験で、ペプチド提示ファージが、ナノ黒鉛構造体ではなく、ビオチン、ストレプトアビジン、磁気ビーズなどの本来の標的ではない分子を認識している可能性を強く排除する。
【００４９】
さらに次に、観察されるファージクローンのカーボンナノホーンへの結合には、提示されたペプチド部分が重要な役割をもつこと、さらに、ペプチド配列に特異的な結合であることを示すために、次のようなペプチド競合実験を、配列番号１で示されるペプチドを提示するＮＨＤ１２−５−２ファージを用いておこなった。
【００５０】
１μｇ／３５μｌのストレプトアビジン溶液（ＮＥＢ社）をＴＢＳで調製し、これを９６穴ＥＬＩＳＡプレート（イムロン４ＨＢＸ、ＤＹＮＥＸ、ＶＡ）に３５μｌずつ加え、密閉容器の中で３７℃、１時間インキュベートし、ストレプトアビジンをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。次に、非吸着のストレプトアビジン溶液を捨て、４℃に冷やした２００μｌのＴＢＳでプレートを洗浄した。次に、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、ＴＢＳ液を加えて１時間インキュベートした。２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで３回洗浄し、１００μｌのビオチン化カーボンナノホーンのＭＥＳ懸濁液を加えてマイルドミキサー（ＰＲ−１２、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、室温で撹拌しながら１時間インキュベートした。次に、１０μｌの１ｍＭ d-biotin、２％ウシ血清アルブミン、ＴＢＳを加えて５分インキュベートし、未反応のストレプトアビジンサイトをビオチンで飽和した。２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで３回洗浄した。
【００５１】
２００μｌの０．８％ Dimethyl sulphoxide（以下ＤＭＳＯ）、２％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳに、いろいろな量のＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）ペプチドもしくは、ＦＱＹＬＹＳＹＰＦＤＳＥ（配列番号２１）ペプチド（純度ＨＰＬＣグレードで９５％以上、Anygen、Kwang-ju）を加え、更に、ＮＨＤ１２−５−２クローンを力価１．８ｘ１０8で加えた。これを上記ビオチン化カーボンナノホーン固相化９６穴プレートに加え、マイルドミキサー（ＰＲ−１２、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、室温で撹拌しながら１８時間インキュベートした。続いて２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで１０回洗浄し、最後の洗浄の後に、ＥＬＩＳＡ法による結合ファージの定量化をおこない、各ペプチド濃度存在下におけるファージの結合能力を調べた。ペプチドを加えない場合のＮＨＤ１２−５−２クローンによるＥＬＩＳＡの値を１００％とし、ペプチドの添加による結合能の阻害効果を求めると図１３のようになった。加えるＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）合成ペプチドの濃度が上昇するに従い、ＮＨＤ１２−５−２クローンの固相化カーボンナノホーンに対する結合が抑制されるが、同じアミノ酸組成をもちながら、その並びの異なる、ＦＱＹＬＹＳＹＰＦＤＳＥ（配列番号２１）合成ペプチドの添加による阻害効果はあまり観察されなかった。この結果は、ＮＨＤ１２−５−２クローンの固相化カーボンナノホーンに対する結合に、ファージに提示されたペプチド部分が重要な役割をもつこと、さらに、この結合がペプチド配列に特異的な結合であることを示している。
【００５２】
以上のような結合評価実験のまとめを図１４に示す。強い結合能を示したクローンにはいずれもトリプトファン、チロシン、フェニルアラニンといった芳香族アミノ酸の並び配列が多く出現していることがわかる。また、強い結合能を示したクローンにはヒスチジンが多数出現するのも特徴である。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のナノ黒鉛構造体を特異的に認識するペプチド配列を用いると、ナノ黒鉛構造体とペプチドとの複合体、ナノ黒鉛構造体とペプチドを介した他の分子との複合体、ナノ黒鉛構造体とペプチド配列をもとに創製した人工タンパク質との複合体などを簡単に作製することができる。これらの複合体は、ナノ黒鉛構造体の性質改変、ナノメートルスケールでの整列といったナノバイオテクノロジー分野で応用することができる。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果を示す図である。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示している。
【図２】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示しているを示す図である。
【図３】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図４】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図５】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果を示す図である。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示している。
【図６】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果を示す図である。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示している。
【図７】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図８】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図９】本発明の実施例３でのカーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示す図である。
【図１０】本発明の実施例３でのカーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図１１】本発明の実施例４での固相化カーボンナノホーン、固相化単層カーボンナノチューブに対する結合能を求めた実験結果。各試料に対してファージクローンによる結合能をＥＬＩＳＡにより２回ずつ評価し、そのバラツキを求めた図である。グラフの上方には固相化したカーボンナノホーン（ＮＨ）に対しての結合能、下方には固相化したカーボンナノチューブ（ＮＴ）に対しての結合能を、ＥＬＩＳＡの吸光度で示した。また、ファージクローンの結合能の違いにより２つのグループ（左の集団と右の集団）に分類した。
【図１２】本発明の実施例４でのファージクローンによる酸素処理カーボンナノホーンの凝集実験の結果を示す図である。酸素処理カーボンナノホーン懸濁液にクローン化ファージを力価５×１０8で加え、室温で２時間３０分インキュベートした後の沈澱の様子を実体光学顕微鏡で観察している。
【図１３】本発明の実施例４でのＮＨＤ１２−５−２クローンと合成ペプチドによる結合競合実験の結果を示している。示された濃度の合成ペプチドが存在する状態での、配列番号１で示されるペプチドを提示するＮＨＤ１２−５−２ファージの固相化カーボンナノホーンに対する結合をＥＬＩＳＡで評価し、ペプチド非存在下での結合を１００％として示す図である。共存させるペプチドとしては、配列番号１をもつ合成ペプチドと、配列番号１と同じアミノ酸組成をもちながら、その並びの異なる、コントロールペプチド（配列番号２１）を用いている。
【図１４】本発明の実施例４で求めた各ファージクローンによる固相化カーボンナノホーン、固相化単層カーボンナノチューブに対する結合能、及び酸素処理カーボンナノホーンの凝集実験の結果をまとめ、ペプチド配列の傾向と共に示している図である。「＋」の数は図１１の実験で求めた結合能力の強さを表しており、数が多いほど強い。「＋／−」はコントロールと比べて有意な差が観察されなかったことを表す。ＮＨはカーボンナノホーンに、ＮＴはカーボンナノチューブに対する結合の結果を示す。「○」「×」はそれぞれ、図１２の実験で酸素処理カーボンナノホーンの凝集が観察されたものと観察されなかったものを表す。トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）には下線を引いている。ヒスチジン（Ｈ）は太文字にしている。
【発明の属する技術分野】
本発明は、炭素材料物質であるカーボンナノホーンやカーボンナノチューブなどのナノ黒鉛構造体を認識するペプチド分子やファージ、前記ペプチド分子と機能性ペプチド若しくはタンパク質、又は標識化物質等との結合体からなる人工タンパク質又はキメラ分子、前記ペプチド分子、人工タンパク質又はキメラ分子とナノ黒鉛構造体との複合体等に関する。例えば、ナノメートルスケールの微細構造を有する黒鉛構造化合物とこれを特異的に認識するペプチド、人工タンパク質又はキメラ分子との複合体はナノバイオテクノロジー、材料工学、半導体、医薬品、化粧品などに有利に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
炭素の結晶構造としてはダイヤモンドとグラファイトが古くから知られているが、１９８５年にはスモーリー（Ｒ．Ｅ．Ｓｍａｌｌｅｙ）、カール（Ｒ．Ｆ．Ｃｕｒｌ）、クロトー（Ｈ．Ｗ．Ｋｒｏｔｏ）らにより（Ｃ６０）が発見された（例えば、非特許文献１参照。）。Ｃ６０は１２個の５角形と２０個の６角形からなるサッカーボール状の構造をしており、Ｃ６０のほかにもＣ７０、Ｃ７６などの大きな籠状分子が存在し、これら一連の分子は「フラーレン」と呼ばれている。また、１９９１年には本発明者の一人飯島澄男により「カーボンナノチューブ」（例えば、非特許文献２、及び特許文献１参照。）、１９９９年には同じく飯島澄男により「カーボンナノホーン」（例えば、非特許文献３、及び特許文献１参照。）といった、それまで存在が知られていなかった新しい構造を持った炭素系化合物が相次いで発見された。これら、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンはいずれも炭素原子の６員環と５員環から構成されており、ナノメートルスケールの微細構造体を形成することから、「ナノ黒鉛構造体」として近年大きな注目を集めている。
【０００３】
ナノ黒鉛構造体が注目を集める理由をいくつか上げてみると、「カーボンナノチューブが、そのカイラリティーの違いにより金属と半導体の両方の性質をもつことができる（例えば、非特許文献４参照。）。」、「金属導入フラーレンが超電導を示す（例えば、非特許文献５参照。）」、「カーボンナノホーンの示す選択的な気体貯蔵能力（例えば、非特許文献６参照。）」などがある。これらの特徴的な性質を利用して、新しい電子材料や触媒、光材料、その他の分野で、より具体的には、半導体配線、蛍光表示管、燃料電池、ガス貯蔵、遺伝子治療ベクター、化粧品、薬品送達システム、バイオセンサーなどへのナノ黒鉛構造体の応用利用が期待されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−６４００４号公報
【非特許文献１】
Nature,318:162-163, 1985
【非特許文献２】
Nature,354:56-58, 1991
【非特許文献３】
Chem.Phys.Lett.,309,165-170, 1999
【非特許文献４】
Nature,391:59-62, 1998
【非特許文献５】
Nature,350:600-601, 1991
【非特許文献６】
日経サイエンス８月号，４２，２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ナノ黒鉛構造体の様々な分野での応用利用を考える場合、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、あるいはその修飾体を効率良く、認識、結合、分離、整列させる技術が必要となる。しかしながら、カーボンナノホーンやカーボンナノチューブといったナノ黒鉛構造体は、これを特異的に認識、結合する手法が一般的には存在しないため、利用しにくいといった問題点がある。本発明の課題は、カーボンナノホーンやカーボンナノチューブなどのナノ黒鉛構造体を効率良く、認識、結合、分離、整列させることを可能とする、ナノ黒鉛構造体を認識するペプチドやファージ、前記ペプチドと機能性ペプチド若しくはタンパク質又は標識化物質等との結合体からなる人工タンパク質やキメラ分子、前記ペプチド分子、人工タンパク質又はキメラ分子とナノ黒鉛構造体との複合体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を大腸菌中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に再度接触させるパニング操作を繰り返すことによりナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮し、カーボンナノホーンやカーボンナノチューブ等のナノ黒鉛構造体を特異的に認識する、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮することを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドのスクリーニング方法（請求項１）に関する。
【０００８】
また本発明は、配列番号１〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項２）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項３）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項４）や、化学修飾されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項５）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項６）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項６記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項７）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項６又は７記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド（請求項８）に関する。
【０００９】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドをその粒子表面上に提示することを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項９）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１０）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１１）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１２）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項１２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１３）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項１２又は１３記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ（請求項１４）に関する。
【００１０】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、機能性ペプチド又はタンパク質との結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１５）や、機能性ペプチド又はタンパク質が、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１６）や、機能性ペプチド又はタンパク質が、細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１７）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１８）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項１９）や、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２０）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項１５〜２０のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２１）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項２１記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２２）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項２１又は２２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質（請求項２３）に関する。
【００１１】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、単独又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識化物質又はペプチドタグとの結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２４）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、非ペプチド系化合物との結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２５）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項２４又は２５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２６）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項２４又は２５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２７）や、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２８）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項２４〜２８のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項２９）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項２９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項３０）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項２９又は３０記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子（請求項３１）に関する。
【００１２】
また本発明は、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、請求項１５〜２３いずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質、又は、請求項２４〜３１いずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子が、ナノ黒鉛構造体に結合したことを特徴とするナノ黒鉛構造体複合体（請求項３２）や、アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項３２記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３３）や、アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項３２記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３４）や、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項３２〜３４のいずれか記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３５）や、ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項３２〜３５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３６）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項３６記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３７）や、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項３６又は３７記載のナノ黒鉛構造体複合体（請求項３８）に関する。
【００１３】
さらに本発明は、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ（請求項３９）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドとしては、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の全部又はその一部を含むナノ黒鉛構造体に結合しうるペプチド（以下、これらペプチドを「本件ペプチド」という）を挙げることができ、かかる本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドは、ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮する、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドのスクリーニング方法により得ることができる。また、このスクリーニング方法により得ることができる、配列番号１〜２０のいずれかに示される以外のアミノ酸配列からなるナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドも本発明に含まれる。上記本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドは、そのアミノ酸配列情報から合成により作製することもでき、精製されたものが好ましい。なお、ファージ粒子上に提示されているものは本発明の上記ペプチドからは除かれる。さらに、本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、本件ペプチドをコードするものであれば特に制限されるものではない。
【００１５】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージとしては、本件ペプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージは、前記のスクリーニングの過程で、黒鉛構造体分子に強く結合したペプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンとして得られる他、本件ペプチドをコードするＤＮＡを常法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、ヘルパーファージを感染させることで得ることもできる。一般的にＭ１３やｆｄなどの繊維状ファージは、高濃度の状態では液晶状態となり、規則的な整列構造をとることから、ナノ黒鉛構造体を認識するペプチドファージを液晶状態にすることにより、ナノ黒鉛構造体を認識するペプチドが規則的にナノスケールで配列した状態をつくることができる。ここにナノ黒鉛構造体を接触させると、ペプチドのナノ黒鉛構造体認識能力により、ナノ黒鉛体を整列させることができる。
【００１６】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質としては、本件ペプチドと、機能性ペプチド又はタンパク質との結合体からなるものであれば特に制限されるものではなく、上記機能性ペプチド又はタンパク質の機能としては、αヘリックス形成等の二次構造を形成しやすい機能、ウイルス等の中和抗体を誘導する抗原機能、免疫賦活化する機能（Nature Medicine,3:1266-1270,1997）、細胞増殖を促進又は抑制する機能、癌細胞を特異的に認識する機能、プロテイン・トランスダクション機能、細胞死誘導機能、抗原決定残基呈示機能、金属結合機能、補酵素結合機能、触媒活性機能、蛍光発色活性機能、特定の受容体に結合してその受容体を活性化する機能、信号伝達に関わる特定の因子に結合してその働きをモジュレートする機能、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖などの生体高分子を特異的に認識する機能、細胞接着機能、細胞外へタンパク質を局在化させる機能、特定の細胞内小器官（ミトコンドリア、葉緑体、ＥＲなど）にターゲットする機能、細胞膜に埋め込まれる機能、アミロイド繊維形成機能、繊維性タンパク質の形成機能、タンパク質性ゲル形成機能、タンパク質性フィルム形成機能、単分子膜形成機能、二次元結晶を自己集合で形成しうる等の自己集合機能、粒子形成機能、他のタンパク質の高次構造形成を補助する機能などを挙げることができる。これらの人工タンパク質は、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドに機能性ペプチド又はタンパク質を、アミノ酸レベルで、あるいはＤＮＡレベルで直接的又は間接的に連結することにより、作製することができる。
【００１７】
上記機能性ペプチド又はタンパク質の中でも、例えば、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質を用いると、その二次元結晶に沿ってナノ黒鉛化合物をナノスケールできれいに整列化することができる人工タンパク質を構築することができる。かかるナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質として、ウイルス（例えば、アデノウィルス、ロタウィルス、ポリオウィルス、ＨＫ９７、ＣＣＭＶ等）、フェリチンやアポフェリチンのようなフェリチンファミリー、ＤｐｓＡタンパク質やＭｒｇＡタンパク質を挙げることができる。その他の、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質としては、人工的に設計された繰り返し性に富む人工タンパク質などを挙げることができる。また、タンパク質の二次元結晶を作製する方法としては、タンパク質溶液を水面上に単分子膜で展開させた後、固体基板に吸着させる方法などを例示することができる。
【００１８】
また、上記機能性ペプチド又はタンパク質の中でも、例えば、細胞接着活性等の細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質を用いると、ナノ黒鉛化合と細胞を同時に認識する複合活性をもつ人工タンパク質を得ることができる。かかる細胞接着活性等の細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質としては、各種リガンド、モノクローナル抗体やその可変領域、１本鎖抗体等を例示することができる他、上記のような天然タンパク質に限らず、細胞接着活性を有するペプチドを含む人工タンパク質を挙げることができる。
【００１９】
本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子としては、本件ペプチドと、単独又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識化物質又はペプチドタグとの結合体からなるキメラ分子を挙げることができる。上記標識化物質としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位体、抗体のＦｃ領域、等を挙げることができ、具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ等の放射性同位体、化学発光物質を挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン（Ｈｉｓ）等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。例えば、ＨｉｓタグとＮｉ−ＮＴＡの親和性を利用すると、ナノ黒鉛構造体複合体を容易に精製することができる。
【００２０】
また、本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子としては、本件ペプチドと、非ペプチド系化合物との結合体からなるキメラ分子を挙げることができる。上記非ペプチド系化合物のうち、非ペプチド系低分子化合物としては、フルオレセイン、ローダミン等の蛍光色素、クロラムフェニコール、アンピシリン等の抗生物質を、非ペプチド系高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスビーズ、シリカゲル、多糖類（誘導体を含む）、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコールを具体的に例示することができる。
【００２１】
本発明のナノ黒鉛構造体複合体としては、本件ペプチドや、上記本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質や、上記本発明のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子が、ナノ黒鉛構造体に疎水結合、パイ電子結合、ファンデルワールス結合、イオン結合などの弱い結合のいずれか、あるいは組み合わせにより結合した複合体を挙げることができる。
【００２２】
また、本件ペプチドにおける、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の中でも、アミノ酸配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）やＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）からなるペプチドが、ナノ黒鉛構造体への優れた結合能を有する点で好ましい。そして、これら本件ペプチドやナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドとして、化学修飾がなされたペプチドを有利に用いることができる。かかる化学修飾としては、官能基を有するアミノ酸への置換からなる化学修飾や、リンカーとの結合を容易に形成させるための化学修飾を挙げることができるが、化学修飾によりナノ黒鉛構造体への結合能が低下しない修飾が好ましい。上記リンカーとの結合を容易に形成させるための化学修飾としては、ビオチンのＮ−ハイドロキシサクシイミドエステル体を用いて、ペプチドのアミノ基へのビオチンの共有結合を具体的に例示することができる。かかるペプチドのビオチン化により、前記キメラ分子を容易に作製することができる。
【００２３】
前記ナノ黒鉛構造体としては、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、カーボンナノカプセル、フラーレン等の炭素原子の６員環と５員環から構成されているナノメートルスケールの微細構造体を例示でき、上記カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブとしては、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有するものや、構成する炭素構造にカルボニル基、カルボキシル基、水酸基、エーテル基、イミノ基、ニトロ基、スルホン基等の官能基が付加されている親水性を呈するもの（特願２００１−２９４４９９号）を好適に挙げることができる。例えば、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有する親水性のカーボンナノホーンは、本来疎水性であるカーボンナノホーンを親水性にするために、酸化性のある硝酸、硫酸、過酸化水素酸等の酸を用いて酸化処理をすることによって製造することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（実施例１）
Ａｒガスの６ｘ１０4Ｐａ雰囲気圧内の焼結丸棒状炭素表面に高出力のＣＯ2ガスレーザ光（出力１００Ｗ、パルス幅２０ｍｓ、連続発振）を照射し、生じたすす状物質をエタノールに懸濁し、超音波撹拌（周波数４０ｋＨｚ、時間６０分）とデカンテーションとを４回繰り返して単層カーボンナノホーンを得た。この単層カーボンナノホーン約２００ｍｇを、濃度約７０％の硝酸４０ｍｌ中に入れ、１３０℃で１時間還流をおこなった。終了後、イオン交換水でうすめて遠心分離を行い上澄みを捨てることを繰り返して中和洗浄し、官能基（カルボキシル基を含む）をもつ水溶性の単層カーボンナノホーンを調製した。
【００２５】
１．２ｍｇの硝酸処理済みカーボンナノホーンを２ｍｌの０．１Ｍ 2-Morpholinoethanesulfonic acid.monohydrate（以下ＭＥＳ、同仁化学、熊本）（ｐＨ５．５）に懸濁した。これを、超音波装置用スピッツチューブ（ＡＳ−１０００、東湘電気）に入れ、超音波細胞粉砕装置（Biorupter、コスモバイオ、東京）を用いて、出力２００Ｗで１時間超音波撹拌して懸濁を完全なものとした。次にこの懸濁液を、５００μｌずつ１．８ｍｌプラスチックチューブに分注し、それぞれに２５μｌの５０ｍＭ 5-（Biotinamido）pentylamine（ＥＺ−Ｌｉｎｋ、ピアス社、Rockford）を加えて撹拌した。続いて直ちに０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で調製した６．２５μｌの１００ｍｇ／ｍｌの1-Ethyl-3-［3-Dimethylaminopropyl］carbodiimide Hydrochloride（以下ＥＤＣ、ピアス社）溶液をそれぞれに加えて、室温でマイクロインキュベーター（Ｍ−３６、タイテック社、東京）を用いて良く撹拌しながら２時間インキュベートした。これにより硝酸処理カーボンナノホーンのカルボキシル基とビオチンのアミノ基の間でカルボジイミドの作用により、アミド結合が形成され、ビオチン化カーボンナノホーンが得られる。
【００２６】
１０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンコート磁気ビーズ懸濁液（ダイナビーズＭ−２８０、ダイナル社、Oslo）を０．１％ Polyoxyethylenesorbitan monolaurate［以下Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ社、Ｓｔ．Louis）］、５０ｍＭ Tris-buffered Saline［以下ＴＢＳ、（ｐＨ７．５）］で２回洗浄し、最後にビーズが０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。ストレプトアビジンコート磁気ビーズの洗浄は、磁性体集積装置（ＭＰＣ−Ｅ、ダイナル社、Oslo）を用いて磁気ビーズをチューブ外側から磁石で吸着させることによって進めた。
【００２７】
１２０μｌのビオチン化カーボンナノホーンの０．１Ｍ ＭＥＳ懸濁液（０．６ｍｇ／ｍｌ。カーボンナノホーン約７０μｇ相当）と、５ｍｇ／ｍｌ前処理済みストレプトアビジンコート磁気ビーズ懸濁液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ）１００μｌを混合し、３０分おきに指で軽くチューブをたたくことで撹拌しながら、４時間、室温で吸着反応を進めた。次に、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン（岩井化学薬品、東京）、５０ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄し、同バッファー２００μｌに再懸濁して室温で２０分間インキュベートした。更に、１０μｌの１ｍＭ d-biotin（シグマ社）、２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＴＢＳを加え、室温で５分インキュベートした。この操作により、ストレプトアビジンのビオチン結合サイトをビオチンで飽和した。
【００２８】
ペプチド提示ファージライブラリーは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示するＤ１２ライブラリー（ＮＥＢ社、Beverly）と７残基の環状ランダムペプチドを提示するＣ７Ｃライブラリー（ＮＥＢ社）を用いた。それぞれ、２．７ｘ１０9、１．２ｘ１０9種の異なるペプチド配列をもつライブラリーである。
【００２９】
ビオチン化カーボンナノホーンが固相化された磁気ビーズ懸濁液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと、ビオチンが固相化されていない対照の磁気ビーズ懸濁液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌをそれぞれ１．８ｍｌプラスチックチューブに移し、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄する。続いて、同バッファーに懸濁して室温で２０分間インキュベートし、非特異的なファージの結合を抑えるための、ウシ血清アルブミンによるブロッキング操作を完了した。
【００３０】
ファージライブラリー原液を希釈し、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ中に、ファージ力価がＤ１２ライブラリーでは２．７ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ、Ｃ７Ｃライブラリーでは１．２ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌとなるようなファージ液を調製した。ファージ力価は常法（Phage Display-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）に従いもとめた。
【００３１】
ビーズ部分を認識してしまうような好ましくないペプチドファージのバックグラウンド結合をあらかじめ除外するために、以下のプレパニング操作をおこなった。すなわち、ウシ血清アルブミンによるブロッキングをおこなったカーボンナノホーンの固相化されていないビーズ０．５ｍｇにファージ液２００μｌ（ファージ力価がＤ１２ライブラリーでは２．７ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ、Ｃ７Ｃライブラリーでは１．２ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ）を加え、室温で４時間インキュベートした。次に、ファージ液中の磁気ビーズを磁石に吸着させ、上清のファージ液を別のチューブに移した。さらに、ビーズ液を５０μｌの２％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ ＴＢＳで１回洗浄し、この洗浄液もあわせ、合計２５０μｌのプレパニング済みのファージ液を得た。
【００３２】
プレパニング処理をほどこした２５０μｌファージライブラリー液をウシ血清アルブミンによるブロッキングを行ったビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズ（カーボンナノホーン約７０μｇ相当）に加え、回転式撹拌器（ＲＴ−５０、タイテック社、東京）により室温、１８時間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。磁気ビーズを１ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ ＴＢＳで１０回洗浄した。最後の洗浄の後に、１ｍｌの溶出バッファー［２Ｍ Glycine-HCl（ｐＨ２．２）、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン］をカーボンナノホーン固相化磁気ビーズに加え１０分インキュベートし、カーボンナノホーンに結合したファージを溶出させた。磁石でビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズを吸着し、上清に回収される溶出したファージ液１ｍｌを別のチューブに移した。回収したファージ液に１５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて、溶出液を中和し、溶出したファージの力価を測定した。
【００３３】
上の操作で得られたファージ溶出液をＬＢ２０ｍｌ中で対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ‘ｌａｃｌq△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ+Ｂ+ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）△（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒk-ｍk-ＭｃｒＢＣ-）］に感染させ、振とう培養機（ＢＲ−４０ＬＦ、タイテック社）を用い３７℃で激しく撹拌しながら４時間３０分インキュベートした。ファージ感染菌培養液を遠心チューブ（５０ｍｌ、ベックマン、カルフォルニア）に移して、ベックマン遠心機（ベックマン、ＪＡ−１２ローター）を用い４℃、１０分、１００００ｒｐｍで遠心してＥＲ２７３８菌を取り除く操作を２度行い、上清のファージ液を別のチューブに移した。ファージ液に３．５ｍｌ（１／６量）の２０％Polyethylene glycol 6000（以下ＰＥＧ６０００、Ｆｌｕｋａ社、Ｂｕｃｈｓ）、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加え、ミキサー（Ｓ−１００、タイテック社）により良く撹拌して４℃、１２時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。
【００３４】
沈殿したファージをベックマン遠心機で４℃、１０分、１００００ｒｐｍで遠心して回収した。ファージ沈殿を、更に４０００ｒｐｍ、１分で遠心し少量残っている上清を完全に取り除いた。得られたファージ沈殿に、１ｍｌのＴＢＳを加え、氷上で冷却した後に、穏やかにファージを懸濁した。このファージ懸濁液を、１．８ｍｌプラスチックチューブに移し、微量高速遠心機（ＴＭＡ−ＩＩローター、トミー社、東京）を用い５分、１５０００ｒｐｍで遠心して上清を別のチューブに移し、懸濁されない残渣を取り除いた。ファージ液に再度、２００μｌの２０％ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌを加えてミキサーで良く撹拌し、氷上で１時間インキュベートしてファージを沈殿させた。次に、微量高速遠心機により１０分、１５０００ｒｐｍで遠心してファージ沈殿を回収した。得られたファージ沈殿に２００μｌの０．０２％ＮａＮ3（和光純薬、大阪）、５０ｍＭ ＴＢＳを加えて完全に懸濁させた。懸濁できない残渣を微量高速遠心機により５分、１５０００ｒｐｍで遠心し取り除いた。得られた濃縮ファージ液の力価を求めた。
【００３５】
上に示すような標的分子（この場合カーボンナノホーン）へのファージの結合、洗浄、回収、大腸菌による増幅といった一連の作業はパニング操作と呼ばれている。パニング操作を繰り返すことにより、標的分子へ特異的に強く結合するファージクローンを濃縮していくことが可能である。この場合も、１回目のパニング操作後、一度大腸菌で増やしたファージを用いて、再度、ビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズに対する結合、洗浄、回収、増殖の２回目以降のパニング操作を繰り返していった。２回目以降のパニング操作実験条件で、１回目の操作と異なるのは以下の通りであった。すなわち、２回目以降のパニング操作で加えるファージの力価を、Ｄ−１２ライブラリーでは２．７ｘ１０10、Ｃ７Ｃライブラリーでは１．２ｘ１０10となるように調製した。また、濃縮ファージを懸濁する溶液とビオチン化カーボンナノホーン固相化ビーズの反応バッファー及び、その洗浄バッファー中のＴｗｅｅｎ−２０濃度を２回目のパニング操作時で０．３％、３回目のパニング操作時とそれ以降で０．５％とした。
【００３６】
Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング実験のインプット力価（標的分子に加えたファージ力価）とアウトプット力価（洗浄後の標的分子から溶出されたファージ力価）の比の値の変化を図１に、またＣ７Ｃライブラリーでのパニング実験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図２に示す。
【００３７】
Ｄ１２ライブラリーでは５ラウンド、６ラウンドで得られたファージを、Ｃ７Ｃライブラリーでは６ラウンド、７ラウンドで得られたファージを、それぞれ常法（Phage Display A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）に従いクローン化し、その提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には提示ペプチド領域から９６塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー［−９６ｇIII シーケンシングプライマー（５’−HOＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）（配列番号３２）、ＮＥＢ社、Beverly］を用いて、ダイデオキシターミネイト法により決定した（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社、カルフォルニア）。反応産物の泳動とデータ解析にはキャピラリーシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマン）を用いた。
【００３８】
決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列のいくつかを、Ｄ１２ライブラリーについては図３（配列番号１、配列番号３〜７）に、Ｃ７Ｃライブラリーについては図４（配列番号２、配列番号８〜１０、配列番号２５）に示す。この中で、Ｄ１２ライブラリーの５回目のパニング操作から得られたＮＨＤ１２−５−２ファージの提示するペプチド配列、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）は、５回目のパニングから調べた３３個のクローンの中には同じ配列をもつものが１５個（４５％）あったのに対して、６回目のパニングから調べた１５個のクローン中の１３個（８７％）までがこの配列をもつクローンであった。同様に、Ｃ７Ｃライブラリーの６回目のパニング操作から得られたＮＨＣ−６−２ファージの提示するペプチド配列、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）は、６回目のパニングから調べた１４個のクローン中には同じ配列をもつものが７個（５０％）あったのに対して、７回目のパニングから調べた１４個のクローンの中の１０個（７１％）までがこの配列をもつクローンであった。このようにパニングの回数が進むにつれて、特定のファージクローンが集団中の大多数を占めるようになることの理由の１つに、そのファージクローンが標的分子に対して強い結合能力をもつことがあげられる。
【００３９】
図３（配列番号１、配列番号３〜７）、図４（配列番号２、配列番号８〜１０、配列番号２５）で示したペプチドを提示するファージをクローン化し、クローン化状態でのカーボンナノホーンとカーボンナノチューブに対する結合能力を実施例４に示すように評価した。
【００４０】
（実施例２）
化学的気相成長法で合成された単層カーボンナノチューブであるＨｉｐｃｏ（カーボンナノテクノロジーズ社、テキサス）を１７５０℃、１ｘ１０-5Ｔｏｒｒで５時間処理した後、濃度約７０％の硝酸中、約１３０℃で３０分還流をおこなった。終了後、水酸化ナトリウムで中和し、蒸留水で洗浄し、官能基（カルボキシル基を含む）をもつ単層カーボンナノチューブを調製した。
【００４１】
得られた硝酸処理単層カーボンナノチューブを、実施例１で示すと同じ方法でビオチン化し、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ上に固相化した。この固相化カーボンナノチューブを用い、実施例１で示すと同じ方法で、Ｄ１２ライブラリー、Ｃ７Ｃライブラリーを用いたパニング実験をおこなった。ただし、Ｃ７Ｃライブラリーでは１ラウンド目のファージのインプット力価を２．４ｘ１０11とし、以降は実施例１と同様に１．２ｘ１０10とした。
【００４２】
Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング実験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図５に、またＣ７Ｃライブラリーでのパニング実験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図６に示す。決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列のいくつかを、Ｄ１２ライブラリーについては図７（配列番号１１〜１５、配列番号２６〜２８）に、Ｃ７Ｃライブラリーについては図８（配列番号２９〜３０）に示す。クローン化状態でのカーボンナノホーン、カーボンナノチューブに対する結合能力を実施例４に示すように評価した。
【００４３】
（実施例３）
カーボンナノホーンの懸濁液と異なり、単層カーボンナノチューブの懸濁液は、遠心操作によりカーボンナノチューブだけを分離することが可能である。実施例１で示すと同じ方法で、Ｄ１２ライブラリーを用いた未処理単層カーボンナノチューブに対するパニング操作を進めた。ただし、プレパニング操作を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（イムロン４ＨＢＸ、ＤＹＮＥＸ、ＶＡ）で行い、ファージの結合反応を２時間とし、反応後の単層カーボンナノチューブの分離は、反応液を１．８ｍｌプラスチックチューブに移し、微量高速遠心機（上記）を用い８分、１５０００ｒｐｍでの遠心操作により行った。また、１−２ラウンド目のファージのインプット力価を２．７ｘ１０11にし、以降のラウンドでは２．７ｘ１０10とした。インプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図９に示す。決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列のいくつかを図１０（配列番号１６〜２０、配列番号３１）に示す。配列を決定した１９のファージクローンのうち、７個がファージクローンＨｉＰ２ファージが提示するペプチド配列（配列番号１７）と同じ配列をもっていた。同様に、２個がファージクローンＨｉＰ１ファージが提示するペプチド配列（配列番号１６）と同じ配列を、２個がファージクローンＨｉＰ６ファージが提示するペプチド配列（配列番号１８）と同じ配列をもっていた。クローン化状態でのカーボンナノホーン、カーボンナノチューブに対する結合能力を実施例４に示すように評価した。
【００４４】
（実施例４）
実施例１、２、３で得られたファージクローンを用い、固相化カーボンナノホーン、固相化単層カーボンナノチューブに対する結合能力を次のような実験から評価した。硝酸処理カーボンナノホーン、硝酸処理単層カーボンナノチューブを実施例１、２で示すと同じ方法でストレプトアビジンコート磁気ビーズ上に固相化した。これまでの１／２０量（カーボンナノホーン約３．５μｇ相当）の固相化試料を９６穴プレート（ファルコンＵ型アッセイプレート、ベクトンディッキンソン、ニュージャージー）に加え、磁性体集積装置（ＭＰＣ−９６、ダイナル社、Ｏｓｌｏ）を用いて、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、ＴＢＳ液にバッファー交換し、１時間インキュベートした。次に、２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで３回洗浄し、ファージ力価が５ｘ１０8ｐｆｕ／ｍｌとなるように２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＴＢＳ液中に調製したファージクローンを加えてマイルドミキサー（ＰＲ−１２、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、室温で撹拌しながら２時間インキュベートした。
【００４５】
続いて磁性体集積装置を用いて、２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで１０回洗浄した。次に、Ｍ１３ファージ検出ＥＬＩＳＡキット（Detection Module Recombinant Phage Antibody System、amersham pharmacia biotech、Little Chalfont Buckinghamshire）を用い、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体を結合させ、これに発色基質の2'，2'-Azino-Bis（3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulphonic Acid）diammonium salt（ＡＢＴＳ）を過酸化水素と共に加えて、その吸光度（Ａ415nm）を求めることで、固相化ビーズに結合しているファージの定量化を行った。なお、コントロールのファージクローンにはランダムペプチドをもたないＮ１と、パニング操作を行っていない原液のＤ１２ライブラリーから得られたＮ２（配列番号２２）、Ｎ３（配列番号２３）、Ｎ４（配列番号２４）ペプチドを提示するクローンを用いた。
【００４６】
結果を図１１にまとめてある。２７クローンのうち２０のクローンでは、硝酸処理カーボンナノホーン、硝酸処理単層カーボンナノチューブ、いずれかの試料に対して強い結合が認められた。それぞれのクローンが示す、カーボンナノホーンとカーボンナノチューブに対するＥＬＩＳＡで評価される結合能力の程度は、クローンごとに特徴が見られた。すなわち、配列番号１で示されるペプチドを提示する、硝酸処理カーボンナノホーンに対する選択で得られたＮＨＤ１２−５−２ファージの場合、カーボンナノホーンとカーボンナノチューブの両方に強く結合するが、配列番号１１で示されるペプチドを提示する、硝酸処理単層カーボンナノチューブに対する選択で得られたＢＨｉＰ９ファージの場合、カーボンナノホーンよりはカーボンナノチューブの方により強く結合することがわかる。後者の性質をもつファージの提示するペプチド配列を利用することから、ナノ黒鉛構造体の中の、微妙な構造変化を区別するペプチドや人工タンパク質のナノバイオテクノロジー分野での利用が考えられる。
【００４７】
２７クローンのうち７つのクローンではいずれの試料に対してもコントロールと同程度の結合しか示さなかったので、これら７つのクローンの提示するペプチド（配列番号２５〜３１）はナノ黒鉛構造体に親和性をもつものではないと考えられる。
【００４８】
磁気ビーズに固相化した状態のナノ黒鉛構造体に対して、得られたファージペプチドの多くが結合することが示された。次に、磁気ビーズに固相化していない状態のカーボンナノホーンに対するファージ結合能力の評価を、ファージ凝集実験を用いて評価してみた。まず、単層カーボンナノホーンを、７６０Ｔｏｒｒの酸素雰囲気下で、１０分、４２０度で可熱処理し、官能基（カルボニル基を含む）をもつ単層カーボンナノホーンを調製した。この酸素処理カーボンナノホーンを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳ液に懸濁し、９６穴プレート（cell-culture-treated 96 microplate／Round bottom、ＩＷＡＫＩ）に２００μｌずつ加え、更に、ここにクローン化ファージを力価５×１０8で加えた。室温で２時間３０分インキュベートした後の沈澱の様子を実体光学顕微鏡（ＷＩＬＤ Ｍ１０、ライカ社、スイス）により撮影した。結果を図１２に示す。２０のクローンではプレート中心付近にはっきりとしたカーボンナノホーンの凝集した沈澱が確認できた。これは赤血球の抗体による凝集反応に似た現象がおこっているためと考えられ、ファージのカーボンナノホーンに対する結合能力を示していると考えられる。この２０のクローンは、上のＥＬＩＳＡの実験から、少なくとも硝酸処理カーボンナノホーン、硝酸処理単層カーボンナノチューブ、いずれかの試料に対して強い結合が認められた２０のクローンに完全に一致した。このことは、ＥＬＩＳＡの実験で、ペプチド提示ファージが、ナノ黒鉛構造体ではなく、ビオチン、ストレプトアビジン、磁気ビーズなどの本来の標的ではない分子を認識している可能性を強く排除する。
【００４９】
さらに次に、観察されるファージクローンのカーボンナノホーンへの結合には、提示されたペプチド部分が重要な役割をもつこと、さらに、ペプチド配列に特異的な結合であることを示すために、次のようなペプチド競合実験を、配列番号１で示されるペプチドを提示するＮＨＤ１２−５−２ファージを用いておこなった。
【００５０】
１μｇ／３５μｌのストレプトアビジン溶液（ＮＥＢ社）をＴＢＳで調製し、これを９６穴ＥＬＩＳＡプレート（イムロン４ＨＢＸ、ＤＹＮＥＸ、ＶＡ）に３５μｌずつ加え、密閉容器の中で３７℃、１時間インキュベートし、ストレプトアビジンをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。次に、非吸着のストレプトアビジン溶液を捨て、４℃に冷やした２００μｌのＴＢＳでプレートを洗浄した。次に、２００μｌの２％ウシ血清アルブミン、ＴＢＳ液を加えて１時間インキュベートした。２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで３回洗浄し、１００μｌのビオチン化カーボンナノホーンのＭＥＳ懸濁液を加えてマイルドミキサー（ＰＲ−１２、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、室温で撹拌しながら１時間インキュベートした。次に、１０μｌの１ｍＭ d-biotin、２％ウシ血清アルブミン、ＴＢＳを加えて５分インキュベートし、未反応のストレプトアビジンサイトをビオチンで飽和した。２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで３回洗浄した。
【００５１】
２００μｌの０．８％ Dimethyl sulphoxide（以下ＤＭＳＯ）、２％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳに、いろいろな量のＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）ペプチドもしくは、ＦＱＹＬＹＳＹＰＦＤＳＥ（配列番号２１）ペプチド（純度ＨＰＬＣグレードで９５％以上、Anygen、Kwang-ju）を加え、更に、ＮＨＤ１２−５−２クローンを力価１．８ｘ１０8で加えた。これを上記ビオチン化カーボンナノホーン固相化９６穴プレートに加え、マイルドミキサー（ＰＲ−１２、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、室温で撹拌しながら１８時間インキュベートした。続いて２００μｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳで１０回洗浄し、最後の洗浄の後に、ＥＬＩＳＡ法による結合ファージの定量化をおこない、各ペプチド濃度存在下におけるファージの結合能力を調べた。ペプチドを加えない場合のＮＨＤ１２−５−２クローンによるＥＬＩＳＡの値を１００％とし、ペプチドの添加による結合能の阻害効果を求めると図１３のようになった。加えるＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）合成ペプチドの濃度が上昇するに従い、ＮＨＤ１２−５−２クローンの固相化カーボンナノホーンに対する結合が抑制されるが、同じアミノ酸組成をもちながら、その並びの異なる、ＦＱＹＬＹＳＹＰＦＤＳＥ（配列番号２１）合成ペプチドの添加による阻害効果はあまり観察されなかった。この結果は、ＮＨＤ１２−５−２クローンの固相化カーボンナノホーンに対する結合に、ファージに提示されたペプチド部分が重要な役割をもつこと、さらに、この結合がペプチド配列に特異的な結合であることを示している。
【００５２】
以上のような結合評価実験のまとめを図１４に示す。強い結合能を示したクローンにはいずれもトリプトファン、チロシン、フェニルアラニンといった芳香族アミノ酸の並び配列が多く出現していることがわかる。また、強い結合能を示したクローンにはヒスチジンが多数出現するのも特徴である。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のナノ黒鉛構造体を特異的に認識するペプチド配列を用いると、ナノ黒鉛構造体とペプチドとの複合体、ナノ黒鉛構造体とペプチドを介した他の分子との複合体、ナノ黒鉛構造体とペプチド配列をもとに創製した人工タンパク質との複合体などを簡単に作製することができる。これらの複合体は、ナノ黒鉛構造体の性質改変、ナノメートルスケールでの整列といったナノバイオテクノロジー分野で応用することができる。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果を示す図である。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示している。
【図２】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示しているを示す図である。
【図３】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図４】本発明の実施例１での固相化カーボンナノホーンに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図５】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果を示す図である。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示している。
【図６】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果を示す図である。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示している。
【図７】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図８】本発明の実施例２での固相化カーボンナノチューブに対するＣ７Ｃペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図９】本発明の実施例３でのカーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験の結果。各パニング操作でのラウンド毎のアウトプット力価とインプット力価の比を示す図である。
【図１０】本発明の実施例３でのカーボンナノチューブに対するＤ１２ペプチド提示ライブラリーのパニング実験により得られたファージクローンのクローン名とそのファージが提示しているペプチド配列を示す図である。
【図１１】本発明の実施例４での固相化カーボンナノホーン、固相化単層カーボンナノチューブに対する結合能を求めた実験結果。各試料に対してファージクローンによる結合能をＥＬＩＳＡにより２回ずつ評価し、そのバラツキを求めた図である。グラフの上方には固相化したカーボンナノホーン（ＮＨ）に対しての結合能、下方には固相化したカーボンナノチューブ（ＮＴ）に対しての結合能を、ＥＬＩＳＡの吸光度で示した。また、ファージクローンの結合能の違いにより２つのグループ（左の集団と右の集団）に分類した。
【図１２】本発明の実施例４でのファージクローンによる酸素処理カーボンナノホーンの凝集実験の結果を示す図である。酸素処理カーボンナノホーン懸濁液にクローン化ファージを力価５×１０8で加え、室温で２時間３０分インキュベートした後の沈澱の様子を実体光学顕微鏡で観察している。
【図１３】本発明の実施例４でのＮＨＤ１２−５−２クローンと合成ペプチドによる結合競合実験の結果を示している。示された濃度の合成ペプチドが存在する状態での、配列番号１で示されるペプチドを提示するＮＨＤ１２−５−２ファージの固相化カーボンナノホーンに対する結合をＥＬＩＳＡで評価し、ペプチド非存在下での結合を１００％として示す図である。共存させるペプチドとしては、配列番号１をもつ合成ペプチドと、配列番号１と同じアミノ酸組成をもちながら、その並びの異なる、コントロールペプチド（配列番号２１）を用いている。
【図１４】本発明の実施例４で求めた各ファージクローンによる固相化カーボンナノホーン、固相化単層カーボンナノチューブに対する結合能、及び酸素処理カーボンナノホーンの凝集実験の結果をまとめ、ペプチド配列の傾向と共に示している図である。「＋」の数は図１１の実験で求めた結合能力の強さを表しており、数が多いほど強い。「＋／−」はコントロールと比べて有意な差が観察されなかったことを表す。ＮＨはカーボンナノホーンに、ＮＴはカーボンナノチューブに対する結合の結果を示す。「○」「×」はそれぞれ、図１２の実験で酸素処理カーボンナノホーンの凝集が観察されたものと観察されなかったものを表す。トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）には下線を引いている。ヒスチジン（Ｈ）は太文字にしている。
Claims (39)
- ナノ黒鉛構造体を硝酸で処理し、ナノ黒鉛構造体上にまずカルボキシル基を生成させた後、このカルボキシル基をビオチン化し、さらにこのビオチン化されたナノ黒鉛構造体をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固相化し、この固相化ナノ黒鉛構造体に、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合した固相化ナノ黒鉛構造体を永久磁石により回収し、得られたナノ黒鉛構造体に結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を固相化ナノ黒鉛構造体に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ナノ黒鉛構造体に結合するファージクローンを濃縮することを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドのスクリーニング方法。
- 配列番号１〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- 化学修飾されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項６記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項６又は７記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドをその粒子表面上に提示することを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ。
- ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項１２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項１２又は１３記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するファージ。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、機能性ペプチド又はタンパク質との結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- 機能性ペプチド又はタンパク質が、ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- 機能性ペプチド又はタンパク質が、細胞認識活性をもつペプチド配列を有するペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項１５〜２０のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項２１記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項２１又は２２記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、単独又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識化物質又はペプチドタグとの結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、非ペプチド系化合物との結合体からなることを特徴とするナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項２４又は２５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項２４又は２５記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項２４〜２８のいずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項２９記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項２９又は３０記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子。
- 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、請求項１５〜２３いずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有する人工タンパク質、又は、請求項２４〜３１いずれか記載のナノ黒鉛構造体に結合能を有するキメラ分子が、ナノ黒鉛構造体に結合したことを特徴とするナノ黒鉛構造体複合体。
- アミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項３２記載のナノ黒鉛構造体複合体。
- アミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項３２記載のナノ黒鉛構造体複合体。
- ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドが、化学修飾されていることを特徴とする請求項３２〜３４のいずれか記載のナノ黒鉛構造体複合体。
- ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項３２〜３５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体複合体。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、炭素原子の大きさに相当する厚みの単層構造を有してなることを特徴とする請求項３６記載のナノ黒鉛構造体複合体。
- カーボンナノホーン又はカーボンナノチューブが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項３６又は３７記載のナノ黒鉛構造体複合体。
- 配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ。
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