JP6020913B2

JP6020913B2 - カーボンに結合できるペプチド

Info

Publication number: JP6020913B2
Application number: JP2013048252A
Authority: JP
Inventors: 和晃西尾
Original assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Current assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2016-11-02
Anticipated expiration: 2033-03-11
Also published as: US20130267679A1; JP2013231024A; US8674065B2

Description

本発明は、カーボンに結合できるペプチドに関する。

特許文献１は、カーボンに結合できるペプチドを開示している。

特開２００４−１２１１５４号公報

本発明の目的は、カーボンに結合できる新規なペプチドを提供することである。

本発明は、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなる、カーボンに結合できるペプチドである。
本発明は、ペプチドをカーボンに結合させる方法であって、以下の工程を具備する：
カーボンを、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む溶液に混合し、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドをカーボンに結合させる工程、である。

本発明は、カーボンに結合できる新規なペプチドを提供する。

図１は、実験例１に含まれる比較例１−１および比較例１−２によるアビジン１０１およびビオチン−ＰＥＧ１２（参照符号：１０２）の２成分複合体１０３の概略図を示す。図２は、実験例１に含まれる実施例１−１および実施例１−２によるアビジン１０４およびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド１０５の複合体１０６の概略図を示す。図３は、実験例１に含まれる実施例１−１および実施例１−２によるカーボン粒子１０７、アビジン１０４、およびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド１０５の３成分複合体１０８の概略図を示す。図４は、実験例１の結果を示す電気泳動写真である。

以下、本発明の実施形態が説明される。

本発明者は、ＳＱＭＭＧＨＭＧＨＧＮＭＮＨＭＮＨＧＧＫＦＤＦＨＨ（配列番号：０１）によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、カーボンを認識することを見出した。本発明は、その知見に基づいて提供される。

配列番号：０１により表されるアミノ酸からなるペプチドは、ＣｕｅＯの３８２番目のアミノ酸から４０６番目のアミノ酸のアミノ酸配列に由来する。用語「ＣｕｅＯ」は、大腸菌Ｋ−１２株のマルチ銅酸化酵素を意味する。

（実験例）
以下の実験例は、本発明をより詳細に説明する。

（実験例１）
実験例１は、実施例１−１、実施例１−２、比較例１−１、および比較例１−２から構成される。

実験例１では、プルダウン法が実施された。実験例１によるプルダウン法が、以下、簡単に説明される。

実験例１によるプルダウン法では、アビジン、ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド、およびカーボン粒子の３成分複合体が水溶液中で形成される。３成分複合体を含有する水溶液が遠心分離に供された後、３成分複合体は上清として回収されない。言い換えれば、３成分複合体は沈殿物（すなわち、残渣）として水溶液中に残る。その後、３成分複合体が熱処理により分解され、そして溶液が電気泳動に供される。電気泳動の後、アビジンのサブユニットモノマーのバンドが観察される。

一方、アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の２成分複合体は、カーボン粒子と結合しない。２成分複合体を含有する水溶液が遠心分離に供された後、２成分複合体は上清として除去される。水溶液が加熱された後、水溶液が電気泳動に供される。しかし、アビジンは上清に含まれる１つの化学成分として既に除去されているので、アビジンのサブユニットモノマーのバンドは観察されない。

実験例１では、以下の溶液が調製された。
ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド溶液
ビオチン−ＰＥＧ１２溶液
トリス塩酸緩衝液
酢酸緩衝液
アビジン水溶液
アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の２成分複合体水溶液（図１参照）
アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの複合体水溶液（図２参照）
ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレート水溶液
ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有する緩衝液
ドデシル硫酸ナトリウム溶液
グリセロール水溶液
変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動用の水溶液
カーボン粒子分散液
これらの試薬を調製する詳細な方法が以下、記述される。

（ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド溶液の調製）
本発明者は、下記の式（Ｉ）によって表される化合物（以下、「ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド」という）の合成を、シグマアルドリッチジャパン（株）に依頼した。固相合成法がビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの合成のために用いられた。
（化０１）
ビオチン−ＰＥＧ１２−ＳＱＭＭＧＨＭＧＨＧＮＭＮＨＭＮＨＧＧＫＦＤＦＨＨ（配列番号：０１）（Ｉ）

シグマアルドリッチジャパン（株）によって調製されたビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドは、９６．２％の純度を有していた。

式（Ｉ）から明らかなように、ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドでは、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端が、ビオチン−ポリエチレングリコールによって化学的に修飾されている。

ビオチン−ポリエチレングリコールでペプチドのＮ末端側を修飾させる方法は公知である。一例として、ＥＺ−ＬｉｎｋＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手可能）が用いられ得る。

ＥＺ−ＬｉｎｋＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチンは、以下の（ＩＩ）に示される化学構造を有する。

用語「ＮＨＳ」とは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを意味する。ＮＨＳは活性エステル基に結合している。ペプチドが添加されると、ＮＨＳによって活性化されたエステル基は、ペプチドのＮ末端またはリジン残基の側鎖に位置するＮＨ_２基と速やかに反応して、アミド結合を形成する。

用語「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールを意味する。より詳細には、ＰＥＧは以下の化学式（ＩＩＩ）により表される。
−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ− （ＩＩＩ）
ここで、ｎは自然数である。

ｎの値は１以上２０以下であることが望ましい。用語「ＰＥＧ１２」とは、ｎ＝１２であるＰＥＧを意味する。

ポリエチレングリコールを介して結合された２つの分子間での非特異的な相互作用は、ポリエチレングリコールによって抑制されると考えられる。言い換えれば、このようなポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールの両端に化学的に結合された２つの生体分子間での非特異的な相互作用を抑制すると考えられる。なぜなら、化学式（ＩＩ）からも明らかなように、２つの分子間に挟まれるポリエチレングリコールにより、２つの分子は互いに遠くに位置するためである。詳細について必要ならば、非特許文献２を参照せよ。

（非特許文献２） George et. al., ”Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents”, Journal of the American Chemical Society, Vol. 120, pp 3464-3473 (1998)

従って、化学式（Ｉ）において、ビオチン分子および配列番号：０１により表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＰＥＧ１２により、相互作用しない。

（ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド溶液の調製）
シグマアルドリッチジャパン（株）から入手したビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドが、超純水を用いて溶解され、０．１ｍＭの濃度を有するビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド溶液を調製した。調製されたビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド溶液は、−３０℃の温度下で保管された。

（ビオチン−ＰＥＧ１２溶液の調製）
ＥＺ−ＬｉｎｋＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手可能）が、ジメチルスルホキシドを用いて溶解され、１０ｍＭの濃度を有するＥＺ−ＬｉｎｋＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチン溶液を調製した。

次に、表１に示される試薬が混合された。混合液は２５℃の温度下で１時間放置された。

このようにして、１ｍＭの濃度を有するビオチン−ＰＥＧ１２溶液が調製された。このビオチン−ＰＥＧ１２溶液は、水で希釈され、０．１ｍＭの濃度を有するビオチン−ＰＥＧ１２溶液を調製した。

（トリス塩酸緩衝液の調製）
塩酸がトリス緩衝液に添加され、表２に示される以下の４種類のトリス塩酸緩衝液を調製した。

（酢酸緩衝液の調製）
水酸化ナトリウムが酢酸水溶液に添加され、表３に示される２種類の酢酸緩衝液を調製した。

（アビジン水溶液の調製）
アビジン（商品名：ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手可能、１０ミリグラム）が、超純水で溶解されて、１０ミリグラム／ミリリットルのアビジン水溶液を調製した。図１において、アビジンは、参照符号１０１を有する。

（アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の２成分複合体水溶液の調製）
下記の表４に示す試薬が混合された。図１において、ビオチン−ＰＥＧ１２は、参照符号１０２を有する。混合物は、２３℃の温度下で２時間放置された。

その後、混合物（５００マイクロリットル）は、遠心分離型限外ろ過ユニット（商品名：ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５、ＭＷＣＯ：３０，０００；メルク株式会社より入手可能）を用いて濾過され、残渣を得た。遠心分離は、１０，０００ｘｇのｒｐｍで、４℃の温度下で、２０分間行われた。このようにして、混合物は濃縮され、約５０マイクロリットルの濃縮液を得た。

１０ｍＭの濃度を有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８、４５０マイクロリットル）が、濃縮液に混合された。濃縮液は、再度、上記と同じ条件下で遠心分離に供され、約５０マイクロリットルの濃縮液を再度、得た。これがもう一度繰り返された。

濃縮液は、１０ｍＭの濃度を有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）で希釈され、アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の２成分複合体を含有する水溶液を得た。この水溶液は、５００マイクロリットルの容量を有していた。図１において、アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の２成分複合体は、参照符号１０３を有する。

（アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの複合体の調製）
表４に示される試薬に代えて、下記の表５に示す試薬が混合されたこと以外は、アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の複合体の調製と同様の手順が実行され、アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの複合体を含有する水溶液を調製した。

図２において、アビジンは、参照符号１０４を有する。ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドは、参照番号１０５を有する。複合体は、参照番号１０６を有する。

（ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレート水溶液の調製）
１０重量％の濃度を有するポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレート（商品名：ＡＮＡＰＯＥ―２０；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社より入手可能）の水溶液が、超純水で希釈され、１重量％の濃度を有するポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレート水溶液が調製された。同様に、０．１重量％の濃度を有するポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレート水溶液も調製された。ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートは、界面活性剤として用いられ得る。

（ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有する緩衝液の調製）
表６に示される４種類の緩衝液が調製された。

（ドデシル硫酸ナトリウム水溶液の調製）
ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社より入手可能）が、超純水で溶解され、１０重量％の濃度を有するドデシル硫酸ナトリウム水溶液を調製した。

（グリセロール水溶液の調製）
グリセロール（ライフテクノロジーズ株式会社より入手可能）が、超純水で溶解され、５０重量％の濃度を有するグリセロール水溶液を調製した。

（変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動用の水溶液の調製）
下記の表７に示す試薬が混合され、水溶液を得た。さらにおよそ１ミリグラムのブロモフェノールブルー（粉末）が水溶液に添加された。その後、水溶液はよく攪拌された。このようにして、変性ポリアクリルアミドを用いた電気泳動用の水溶液が調製された。

（カーボン粒子分散液の調製）
０．４〜１２マイクロメートルの直径を有するカーボン粒子の粉末（Ｓ−１２グラッシーカーボンパウダー；ビー・エー・エス社より入手可能）にポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートの０．１％水溶液が混合され、５０ミリグラム／ミリリットルの濃度を有するカーボン粒子分散液を調整した。

（実施例１−１）
下記の表８に示される試薬が混合された。混合物は、２５℃の温度下で１０分間放置された。

図３において、カーボン粒子は参照符号１０７を有する。アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの複合体は、参照符号１０６を有する。カーボン粒子、アビジン、およびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの３成分複合体は、参照符号１０８を有する。アビジンを加熱することによって得られるアビジンのサブユニットモノマーは、参照符号１０９を有する。加熱後のビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドは、参照符号１１０を有する。

混合物は、２０，０００ｘｇのｒｐｍで、４℃の温度下で、５分間、遠心分離に供された。その後、上清が除去され、未反応のビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドを除去した。このようにして、混合物は濃縮され、１０マイクロリットルの容量を有する濃縮液（すなわち、残渣）を得た。

次いで、０．１重量％ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８、１０ｍＭ、２００マイクロリットル）が濃縮液に添加された。その後、濃縮液は、上記の条件下で、再度、遠心分離に供され、上清が除去された。このようにして、１０マイクロリットルの容量を有する濃縮液（すなわち、残渣）を得た。

もう一度、０．１重量％ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８、１０ｍＭ、２００マイクロリットル）が濃縮液に添加された。その後、濃縮液は、上記の条件下で、再度、遠心分離に供され、上清が除去された。このようにして、１０マイクロリットルの容量を有する濃縮液（すなわち、残渣）が再度、得られた。この濃縮液は、黒色を有していた。カーボン粒子分散液は黒色を有するので、得られた濃縮液（すなわち、残渣）は、カーボン粒子を含有していたことが肉眼で確認された。

変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動用の水溶液が、濃縮されたカーボン粒子分散液に添加された。添加後の水溶液の容量は２０マイクロリットルであった。

その後、超音波が、超音波洗浄機（ＵＳＫ−１Ａ，アズワン社より入手可能、設定：Ｈｉｇｈ）を用いて、水溶液に印加された。

濃縮されたカーボン粒子分散液は、９８℃の温度下で、１０分間、加熱され、アビジン分子をアビジンサブユニットモノマーに分解した。

加熱後、カーボン粒子分散液は１０，０００ｘｇのｒｐｍで１分間、遠心分離に供された。このようにして実施例１−１によるサンプル溶液が得られた。

（実施例１−２）
下記の表９に示される試薬が混合された。混合物は、２５℃の温度下で１０分間放置された。

混合物は、２０，０００ｘｇのｒｐｍで、４℃の温度下で、５分間、遠心分離に供された。その後、上清が除去され、未反応のビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの複合体を除去した。このようにして、混合物は濃縮され、１０マイクロリットルの容量を有する濃縮液（すなわち、残渣）を得た。

次いで、０．１重量％ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５、１０ｍＭ、２００マイクロリットル）が濃縮液に添加された。その後、濃縮液は、上記の条件下で、再度、遠心分離に供され、上清が除去された。このようにして、１０マイクロリットルの容量を有する濃縮液（すなわち、残渣）を得た。

もう一度、０．１重量％ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５、１０ｍＭ、２００マイクロリットル）が濃縮液に添加された。その後、濃縮液は、上記の条件下で、再度、遠心分離に供され、上清が除去された。このようにして、１０マイクロリットルの容量を有する濃縮液（すなわち、残渣）が再度、得られた。この濃縮液は、黒色を有していた。カーボン粒子分散液は黒色を有するので、得られた濃縮液（すなわち、残渣）は、カーボン粒子を含有していたことが肉眼で確認された。

その後、超音波が、超音波洗浄機（ＵＳＫ−１Ａ，アズワン社より入手可能、設定：Ｈｉｇｈ）を用いて、濃縮されたカーボン粒子分散液に印加された。

加熱後、カーボン粒子分散液は１０，０００ｘｇのｒｐｍで１分間、遠心分離に供された。このようにして実施例１−２によるサンプル溶液が得られた。

（比較例１−１）
ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドに代えて、ビオチン−ＰＥＧ１２が用いられたこと以外を除き、実施例１−１と同様の手順が行われた。このようにして、比較例１−１によるサンプル溶液が得られた。

（比較例１−２）
ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドに代えて、ビオチン−ＰＥＧ１２が用いられたこと以外を除き、実施例１−２と同様の手順が行われた。このようにして、比較例１−２によるサンプル溶液が得られた。

（実験例１の電気泳動）
実施例１−１、実施例１−２、比較例１−１、および比較例１−２によるこれらの４種類のサンプル溶液が、電気泳動に供された。以下、電気泳動の詳細が説明される。

ポリアクリルアミドゲル（プレキャストゲル；バイオ・ラッドラボラトリーズ社より入手可能、商品名：１２％ミニプロティアンＴＧＸ）が電気泳動槽にセットされた。電気泳動バッファーとして、プレミックスバッファー（バイオ・ラッドラボラトリーズ社より入手可能、商品名：プレミックスバッファー１０ｘトリス／グリシン／ＳＤＳ）が超純水で１０倍に希釈された。この希釈液が電気泳動槽に注がれた。

実施例１−１、実施例１−２、比較例１−１、および比較例１−２による４つのサンプル溶液（各１５マイクロリットル）が、ポリアクリルアミドゲルの上部に設けられたウェルに添加された。

ベンチマークタンパク質ラダー（ライフテクノロジーズ社より入手可能、５マイクロリットル）が、分子量マーカーとして、ポリアクリルアミドゲルの上部に設けられたウェルに添加された。

１５０ボルトの一定電圧下で、電気泳動が行われた。

水溶液に含まれるブロモフェノールブルーがポリアクリルアミドゲルの下端付近まで泳動されたら泳動を停止した。その後、ＣＢＢ染色キット（商品名：ＣＢＢＲ−２５０ステイン＆デステインキット；バイオ・ラッドラボラトリーズ社より入手可能）を用いて、ＣＢＢ染色が行われた。

染色されたポリアクリルアミドゲルの画像が、フラットベッドスキャナ（商品名：ＣａｎｏＳｃａｎＤ２４００Ｕ；キャノン社より入手可能）で読み込まれた。読み込まれた画像に基づいて、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈより入手可能）を用いて、アビジンのサブユニットモノマーのバンドが定量された。

図４は、電気泳動の結果を示す。

図４に示されるように、実施例１−１および実施例１−２では、明瞭なバンドが観察された。一方、比較例１−１および比較例１−２では、そのような明瞭なバンドが観察されなかった。

画像処理ソフトウェアによれば、比較例１−１では、バンドは検出されなかった。実施例１−２によるバンドは、比較例１−２によるバンドよりも１３．３倍のアビジンのサブユニットモノマーを含有していた。

図４に示される電気泳動の結果、すなわち、プルダウン法の結果から、ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドがカーボン粒子に結合して、凝集物（すなわち、沈殿物）を形成することが分かった。ＰＥＧ１２によってビオチンおよびペプチドが相互作用しないので、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドはカーボンに結合できることが見出された。言い換えれば、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドはカーボンを認識することが見出された。

本発明は、カーボンに結合するペプチドを提供する。

１０１、１０４アビジン
１０２ビオチン−ＰＥＧ１２
１０３アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２の２成分複合体
１０５、１１０ビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチド
１０６アビジンおよびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの複合体
１０７カーボン粒子
１０８カーボン粒子、アビジン、およびビオチン−ＰＥＧ１２−ペプチドの３成分複合体
１０９アビジンのサブユニットモノマー

Claims

ペプチドをカーボンに結合させる方法であって、以下の工程：
カーボンを、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む溶液に混合し、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドをカーボンに結合させる工程、
を含む方法。
配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
カーボン
を具備する複合体であって、
前記ペプチドが前記カーボンに結合している、複合体。