JP2018521640A5 - - Google Patents
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Claims (23)
- 融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
a)第1のタンパク質と第2のタンパク質とを、これらのタンパク質間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第1のタンパク質および該第2のタンパク質は、いずれもペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第1のタンパク質を該第2のタンパク質に結合して結合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、第1のタンパク質と第2のタンパク質とを接触させることと、
b)前記(a)の結合タンパク質と第3のタンパク質とを、該第3のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第3のタンパク質は、(a)の結合タンパク質のさらなるペプチドリンカーと反応するペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第3のタンパク質を該結合タンパク質に結合して融合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、前記(a)の結合タンパク質と第3のタンパク質とを接触させることと、を含む、方法であって、
(a)において用いられる該ペプチドリンカー対は、(b)において用いられる前記ペプチドリンカー対に対して直交している、方法。 - 融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
a)第1のペプチドリンカーを含む第1のタンパク質を提供することと、
b)該第1のタンパク質と、第2のペプチドリンカーおよび第3のペプチドリンカーを含む第2のタンパク質とを、該第1のペプチドリンカーと該第2のペプチドリンカーとの間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第1のタンパク質と該第2のタンパク質とを結合することと、
c)該結合された第1のタンパク質および第2のタンパク質と、第4のペプチドリンカーを含む第3のタンパク質とを、該第3のペプチドリンカーと該第4のペプチドリンカーがイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第2のタンパク質と該第3のタンパク質とを結合して融合タンパク質を形成することと、を含む、方法であって、
該第1のペプチドリンカーと該第2のペプチドリンカーとが、該第3のペプチドリンカーと該第4のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対である方法であり、
場合によっては、前記方法は、前記融合タンパク質を伸長させるステップをさらに含み、前記融合タンパク質に結合される新規タンパク質は、前記融合タンパク質中で先にイソペプチド結合を形成するのに用いられた前記ペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対の一部を成すペプチドリンカーを含み、前記新規タンパク質のペプチドリンカーは、前記融合タンパク質中のタンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる、方法であり、該方法は、該新規タンパク質と該融合タンパク質とを、該新規タンパク質が前記融合タンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記融合タンパク質は、分岐構造、直鎖構造、または環状構造を有しており、
場合によっては、前記融合タンパク質は、環状化可能である、請求項1または2に記載の方法。 - 前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成は、自発的である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成は、前記反応に添加された成分によって誘導されており、
好ましくは、前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成を誘導する前記成分は、ペプチドリガーゼであり、
好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成を誘導するグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含み、さらに好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、イソペプチドタンパク質由来であり、さらにより好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、イソペプチド結合の形成を誘導する前記ペプチドリンカー対と同じイソペプチドタンパク質由来であり、
場合によっては、前記ペプチドリガーゼは、アミノ酸を50〜300個含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ペプチドリンカー対は、それぞれイソペプチドタンパク質由来であり、好ましくは、前記ペプチドリンカー対は、それぞれ異なるイソペプチドタンパク質由来であり、
場合によっては、前記イソペプチドタンパク質は、配列番号21、23、25、27、29、または31のいずれか1つに示すアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号21、23、25、27、29、または31のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - ペプチドリンカー対の各ペプチドリンカーは、アミノ酸を少なくとも6個含んでおり、
場合によっては、各対の一方のペプチドリンカーは、アミノ酸を6〜50個含み、該対のもう一方のペプチドリンカーは、アミノ酸を50〜300個含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 各対の一方のペプチドリンカーは、リジン残基を含み、該対のもう一方のペプチドリンカーは、アスパラギン残基またはアスパラギン酸残基を含み、これらの残基は、イソペプチド結合の形成に関わる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記直交したペプチドリンカー対は、
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列、または配列番号1に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、9位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号2に示すアミノ酸配列、または配列番号2に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、55位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、94位にスレオニン残基を含み、100位にグリシン残基を含み、106位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
(2)配列番号5に示すアミノ酸配列、または配列番号5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、8位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号6に示すアミノ酸配列、または配列番号6に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、8位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
(3)配列番号9に示すアミノ酸配列、または配列番号9に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、17位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号10に示すアミノ酸配列、または配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、9位にリジン残基を含み、70位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
(4)配列番号109に示すアミノ酸配列、または配列番号109に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、17位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、11位にグリシン残基を含み、場合によっては20位にイソロイシン残基を含み、21位および22位にプロリン残基を含み、23位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号10に示すアミノ酸配列、または配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、9位にリジン残基を含み、70位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
(5)配列番号13に示すアミノ酸配列、または配列番号13に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、7位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号14に示すアミノ酸配列、または配列番号14に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、56位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、10位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
(6)配列番号13に示すアミノ酸配列、または配列番号13に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、7位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号33に示すアミノ酸配列、または配列番号33に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、8位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および、
(7)配列番号17に示すアミノ酸配列、または配列番号17に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、11位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号18に示すアミノ酸配列、または配列番号18に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、241位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、162位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
のいずれか1つから選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記直交したペプチドリンカー対は、(1)と(4)、(1)と(5)、(1)と(6)、(1)と(3)、(1)と(2)、(2)と(5)、(2)と(6)、(3)と(5)、(3)と(6)、(4)と(5)、または(4)と(6)を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記方法は、固相上で行われる方法であり、
場合によっては、前記方法は、前記融合タンパク質を、前記固相から溶出させるステップをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - (i)配列番号1に示すアミノ酸配列、または配列番号1に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、9位にリジン残基を含む、配列、
(ii)配列番号2に示すアミノ酸配列、または配列番号2に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、55位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、94位にスレオニン残基を含み、100位にグリシン残基を含み、106位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
(iii)配列番号5に示すアミノ酸配列、または配列番号5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、8位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列、
(iv)配列番号6に示すアミノ酸配列、または配列番号6に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、8位にリジン残基を含む、配列、
(v)配列番号9に示すアミノ酸配列、または配列番号9に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、17位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列であって、好ましくは、配列番号109に示すアミノ酸配列、または配列番号109に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、17位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、11位にグリシン残基を含み、場合によっては20位にイソロイシン残基を含み、21位および22位にプロリン残基を含み、23位にリジン残基を含む、配列、あるいは、
(vi)配列番号10に示すアミノ酸配列、または配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、9位にリジン残基を含み、70位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカー。 - (a)前記(i)のペプチドリンカーは、前記(ii)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり;
(b)前記(ii)のペプチドリンカーは、前記(i)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり;
(c)前記(iii)のペプチドリンカーは、前記(iv)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号6に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり;
(d)前記(iv)のペプチドリンカーは、前記(iii)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号5に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり;
(e)前記(v)のペプチドリンカーは、前記(vi)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号10に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり;および/または
(f)前記(vi)のペプチドリンカーは、前記(v)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号9または配列番号109に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーである請求項12に記載のペプチドリンカー。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法で用いるペプチドリンカー対であって、該ペプチドリンカー対は、
(1)請求項12の(i)に記載のペプチドリンカーと請求項12の(ii)に記載のペプチドリンカー、
(2)請求項12の(iii)に記載のペプチドリンカーと請求項12の(iv)に記載のペプチドリンカー、または
(3)請求項12の(v)に記載のペプチドリンカーと請求項12の(vi)に記載のペプチドリンカー、
を含む、ペプチドリンカー対。 - ポリペプチドおよび請求項12または13に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド。
- 請求項12または13に記載のペプチドリンカーまたは請求項15に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項16に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項16に記載の核酸分子および/または請求項17に記載のベクターを含有する、組み換え宿主細胞。
- (a)請求項12の(i)、(iii)、もしくは(v)、または請求項13(a)、(c)もしくは(e)に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および
(b)請求項12の(ii)、(iv)、もしくは(vi)、または請求項13(b)、(d)もしくは(f)に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および/または、
(c)請求項12の(i)、(iii)、もしくは(v)、または請求項13(a)、(c)もしくは(e)に記載のペプチドリンカーをコードする核酸分子、および/または、
(d)請求項12の(ii)、(iv)、もしくは(vi)、または請求項13(b)、(d)もしくは(f)に記載のペプチドリンカーもしくはポリペプチドリンカーをコードする核酸分子、
を含むキットであって、
場合によっては、前記(a)および/または(b)の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、前記(a)および(b)のポリペプチドのペプチドリンカーに対して直交しているペプチドリンカー対の一部である、さらなるペプチドリンカーを含む、キット。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質を少なくとも1つ含む、固体基質であり、
場合によっては、前記基質は、アレイである、固体基質。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質を少なくとも2つ含む、融合タンパク質のライブラリ。
- 融合タンパク質を作製するための、少なくとも2つの直交したペプチドリンカー対の使用であって、各ペプチドリンカー対は、反応してイソペプチド結合を形成する、使用であり、
場合によっては、前記融合タンパク質、イソペプチド結合、ペプチドリンカー、およびペプチドリガーゼは、請求項1〜14のいずれか1項に記載されたものである、使用。
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