CN114672505A - 一种功能性表达细胞色素p450酶的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种功能性表达细胞色素P450酶的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明所公开的功能性表达细胞色素P450酶的方法是(1)一种模块化的表达系统，易于调节；(2)具有更高的生物合成效率；(3)适用于植物、动物来源的细胞色素P450酶，进行天然产物、异源物质及其代谢物的生物转化与生物合成。因此，本发明具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种功能性表达细胞色素P450酶的方法及其应用。
背景技术
细胞色素P450酶(Cytochrome P450 enzymes,CYP450s)是存在于所有生物体中的一类单加氧酶，参与大量天然产物的生物合成。CYP450s属于亚铁血红素依赖的单加氧酶超大家族，催化多种类型的氧化还原反应，包括羟基化、环氧化、脱氢、异构化、C-C键的裂解及脱卤、脱氨与杂原子氧化等反应。CYP450s催化的反应具有结构选择性、区域选择性和立体选择性，是活性天然产物生物合成的关键酶之一。CYP450s还参与生物体中异源物质的代谢。在人体中，CYP450s参与大量药物的代谢，如前体药物的活化和药物的清除等。在植物和微生物中，CYP450s参与大量农药、杀虫剂、有机物等环境污染物的降解与分解。CYP450s在活性天然产物和药物及其代谢物的生物制造，以及环境污染物的降解等方面具有非常重要的应用。
CYP450s的催化功能依赖于其氧化还原分子伴侣—细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 reductase,CPR)。CPR属于双黄素蛋白质家族，具有辅因子NADPH、FAD和FMN的结合结构域，负责将电子供体(还原力)NADPH中的电子经过FAD和FMN辅因子传递到CYP450s的亚铁红素基团，协助CYP450s进行一系列的结构专一性、区域专一性和立体专一性地生物反应。
CYP450s的异源功能性表达是利用合成生物学进行CYP450s基生物制造的前提。CYP450s可以在温和的条件下催化空气中氧气的氧原子特异性添加到复杂的分子骨架中，而对于传统的化学合成方法来说，这是一项极具挑战性的工作。在真核生物中，CYP450s和CPR属于膜蛋白，通常依靠其N-端疏水性的序列定位于细胞器膜。在CYP450s的异源表达过程中，CYP450s和CPR蛋白与表达宿主之间存在膜识别信号相容性差的问题。这使得CYP450s(尤其是真核细胞来源的CYP450s)的功能性表达普遍存在蛋白可溶性差、功能性低及周转速率低等现象，成为合成生物学、代谢工程以及生物技术领域的一个重要挑战。
现今，CYP450s的异源功能性表达策略主要有2种：(1)CYP450s和CPR蛋白串联融合表达；(2)CYP450s和CPR蛋白游离共表达。当一个生物合成途径包含多个CYP450s时(例如紫杉醇的生物合成至少包括8个CYP450s参与)，这需要每一个CYP450都要与CPR进行蛋白融合；多重CPR编码基因的表达会造成细胞资源(核苷酸、氨基酸)的过度浪费，也会使得可用的酶切位点越来越有限。这些策略存在着表达载体的构建与重构建繁琐及蛋白的表达量调控复杂等问题。因此，本领域有必要开发一种新颖的功能性表达细胞色素P450酶的方法。该方法可通过生物技术的方式进行天然产物、异源物质及其代谢物以及环境有机物的生物转化与生物合成。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种功能性表达细胞色素P450酶的方法，旨在提高CYP450s的生产效率。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述功能性表达细胞色素P450酶方法在天然产物和药物及其代谢物以及环境污染物的生物转化和生物合成中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案来实现的。
本发明的目的在于提供一种功能性表达细胞色素P450酶的方法，所述的功能性表达细胞色素P450酶方法包括：
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽元器件a和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽元器件b，融合到CYP450s和CPR的N-端或C-端，进行CYP450s的功能性表达；
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽元器件c和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽元器件d，融合到CYP450s和CPR的N-端或C-端，进行CYP450s的功能性表达；
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽元器件e和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽元器件f，融合到CYP450s和CPR的N-端或C-端，进行CYP450s的功能性表达；
或/和
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:1-6所示的多肽元器件a-f的组合，融合到CYP450s和CPR的N-端或C-端，进行CYP450s的功能性表达。
在一个优选例中，所述的CYP450和CPR分别为拟南芥来源的CYP73A5和ATR2。
在另一个优选例中，所述的CYP450和CPR分别为人源的CYP1A2和CPR。
在另一个优选例中，所述的CYP450和CPR分别为拟南芥来源的CYP73A5的N-端截短突变体CYP73A5(ΔN)和ATR2的N-端截短突变体ATR2(ΔN)。
在另一个优选例中，所述的CYP450和CPR分别为人源的CYP1A2的N-端截短突变体CYP1A2(ΔN)和CPR的N-端截短突变体CPR(ΔN)。
在另一个优选例中，所述的多肽元器件a-f与CYP450s和CPR之间还包括柔性肽序列。
在另一个优选例中，所述的多肽元器件a-f的N-端或C-端还包括标签序列、信号序列或分泌信号序列。
本发明的另一目的在于提供编码所述多肽元器件a-f的多核苷酸。
在一个优选例中，编码所述多肽元器件a的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码所述多肽元器件b的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一个优选例中，编码所述多肽元器件c的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码所述多肽元器件d的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一个优选例中，编码所述多肽元器件e的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码所述多肽元器件f的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种的密码子及其组合进行多肽和蛋白质的表达。因而，本发明所述的编码多肽元器件a-f的多核苷酸还应包括由SEQ ID NO:7-12所示核苷酸序列经取代和/或缺失和/或增加一个或几个核苷酸而得到的编码多肽元器件a-f的核苷酸。
本发明的又一目的是提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸。所述的载体是将本发明的编码所述多肽元器件a-f的多核苷酸与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明所述多肽元器件的重组表达载体。
在一个优选例中，所述的载体是含有编码所述多肽元器件a和b的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的重组表达载体pET-a-b。
在另一个优选例中，所述的载体是含有编码所述多肽元器件c和d的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的重组表达载体pET-c-d。
在另一个优选例中，所述的载体是含有编码所述多肽元器件e和f的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列的重组表达载体pET-e-f。
本发明的又一目的是提供一种表达构建物，所述表达构建物包括以下多核苷酸：
(1)序列如SEQ ID NO:7-12所示的编码所述多肽元器件a-f的多核苷酸之其一或多个；和
(2)编码细胞色素P450酶的多核苷酸；和/或
(3)编码细胞色素P450还原酶的多核苷酸；和/或
(4)基因表达所需的生物学元件；和/或
(5)基因表达盒。
在所述的表达构建物中，所述的多肽元器件与细胞色素P450酶和/或细胞色素P450还原酶是融合表达的。所述的多肽元器件或融合在细胞色素P450酶和/或细胞色素P450还原酶的N-端，或融合在二者的C-端。
所述的基因表达所需的生物学元件，是多核苷酸在宿主细胞中表达与调控所需要的，包括具有启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)、衰减子(Attenuator)、阻遏蛋白结合位点(repressor protein binding site,Operon site)、核糖体结合位点(ribosomebinding site,RBS)、Kozak序列(Kozak sequence)、内含子(Intron)和/或转录终止子(Terminator)等功能的多核苷酸的一种或多种；此外，还包括编码蛋白质标签(Tag)和/或信号肽(Signal peptide)的多核苷酸等。
所述的基因表达盒包含表达RNA聚合酶(RNA Polymerase)的多核苷酸、表达阻遏蛋白(repressor protein)的多核苷酸、表达激活蛋白(activator protein)的多核苷酸、复制子(replicon)多核苷酸、表达抗生素抗性蛋白(antibiotic resistant protein)的多核苷酸、质粒运动(plasmid mobilization,mob)所需的多核苷酸和/或基因组整合(genomeinsertion)所需的多核苷酸中的一种或多种。
在一个优选例中，所述的表达构建物是含有核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的编码所述多肽元器件a和b的核苷酸和拟南芥CYP73A5与ATR2编码基因的表达构建物pET-aCYP73A5-bATR2。
在另一个优选例中，所述的表达构建物是含有核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示的编码所述多肽元器件c和d的核苷酸和人CYP1A2与CPR编码基因的表达构建物pET-cCYP1A2-dCPR。
在另一个优选例中，所述的表达构建物是含有核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示的编码所述多肽元器件e和f的核苷酸、表达大肠杆菌乳糖操纵子阻遏蛋白的基因表达盒和拟南芥CYP73A5与ATR2编码基因的表达构建物pET-LacI-eCYP73A5-fATR2。
本发明的又一目的是提供一种重组细胞，所述的重组细胞是在细胞质和/或细胞器和/或基因组中含有所述的载体或所述的表达构建物的宿主细胞。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。所述的原核细胞包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、运动假单胞杆菌和乳酸菌等；所述的真核细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。较佳地，所述的宿主细胞是内源存在细胞色素P450酶的底物或其生物合成前体的细胞。将所述的载体或所述的表达构建物导入所述的宿主细胞中，获得含有本发明所述功能性表达细胞色素P450酶的重组菌株、转基因细胞系、转基因愈伤、转基因组织、转基因植株或者基因工程植株。
本发明的又一目的是提供所述的载体的用途，用于功能性表达细胞色素P450酶。
本发明的又一目的是提供所述的表达构建物的用途，用于功能性表达细胞色素P450酶。
本发明的又一目的是提供所述的重组细胞的用途，用于功能性表达细胞色素P450酶。
本发明的又一目的是提供所述的功能性表达细胞色素P450酶方法的用途，用于天然产物和药物及其代谢物以及环境有机物的生物转化与生物合成。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的功能性表达细胞色素P450酶的方法是(1)一种模块化的表达系统，易于调节；(2)具有更高的生物合成效率；(3)适用于植物、动物来源的细胞色素P450酶，进行天然产物和药物及其代谢物以及环境有机物的生物转化与生物合成。因此，本发明具有极高的工业生产应用价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、编码多肽元器件a–f的多核苷酸的合成
合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的编码多肽元器件a、b的核苷酸。
合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示的编码多肽元器件c、d的核苷酸。
合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的编码多肽元器件e、f的核苷酸。
实施例2、多肽元器件a–f重组表达载体的构建
(1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的两条引物。合成的引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的5’-端分别设置了与pET29a载体(Novagen)的Nde I和Xho I两个酶切位点两侧25bp同源的序列。以编码多肽元器件a、b的核苷酸为模板进行PCR扩增。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的
Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序为：95℃5min；94℃45s,56℃45s，72℃2min，共30个循环；72℃10min，降至10℃。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET29a载体Nde I和Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I和Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET29a载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将编码多肽元器件a、b的核苷酸导入pET29a载体的Nde I和Xho I酶切位点之间。组装产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得阳性转化子。通过测序进一步验证重组载体pET-a-b构建成功，并在NdeI和Xho I酶切位点之间含有SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列。所获得的重组质粒命名为pET-a-b。
(2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的两条引物。合成的引物SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的5’-端分别设置了与pET29a载体(Novagen)的Nde I和Xho I两个酶切位点两侧25bp同源的序列。以编码多肽元器件c、d的核苷酸为模板进行PCR扩增。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的
Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序同上(1)。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET29a载体Nde I和Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I和Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET29a载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将编码多肽元器件c、d的核苷酸导入pET29a载体的Nde I和Xho I酶切位点之间。组装产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得阳性转化子。通过测序进一步验证重组载体pET-c-d构建成功，并在Nde I和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO:18所示的多核苷酸序列。所获得的重组质粒命名为pET-c-d。
(3)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的两条引物。合成的引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的5’-端分别设置了与pET29a载体(Novagen)的Nde I和Xho I两个酶切位点两侧25bp同源的序列。以编码多肽元器件e、f的核苷酸为模板进行PCR扩增。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的
Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序同上(1)。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET29a载体Nde I和Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I和Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET29a载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将编码多肽元器件e、f的核苷酸导入pET29a载体的Nde I和Xho I酶切位点之间。组装产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得阳性转化子。通过测序进一步验证重组载体pET-e-f构建成功，并在Nde I和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO:21所示的多核苷酸序列。所获得的重组质粒命名为pET-e-f。
实施例3、拟南芥CYP73A5的功能性表达构建物的构建
(1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-a-b载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-a-b载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-a-b载体的SalI酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP73A5-b的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP73A5-b构建成功，其中多肽元器件a与CYP73A5融合表达。
(2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-aCYP73A5-b载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-aCYP73A5-b载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-aCYP73A5-b载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP73A5-bATR2的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP73A5-bATR2构建成功，其中多肽元器件b与ATR2融合表达。
(3)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-a-b载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-a-b载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-a-b载体的SalI酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP73A5(ΔN)-b的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP73A5(ΔN)-b构建成功，其中多肽元器件a与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(4)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-aCYP73A5(ΔN)-b载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-aCYP73A5(ΔN)-b载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-aCYP73A5(ΔN)-b载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP73A5(ΔN)-bATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP73A5(ΔN)-bATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件b与ATR2(ΔN)融合表达。
(5)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-c-d载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-c-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-c-d载体的SalI酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cCYP73A5(ΔN)-d的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cCYP73A5(ΔN)-d构建成功，其中多肽元器件c与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(6)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-cCYP73A5(ΔN)-d载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-cCYP73A5(ΔN)-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-cCYP73A5(ΔN)-d载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cCYP73A5(ΔN)-dATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cCYP73A5(ΔN)-dATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件d与ATR2(ΔN)融合表达。
(7)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-e-f载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-e-f载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-e-f载体的SalI酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-eCYP73A5(ΔN)-f的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-eCYP73A5(ΔN)-f构建成功，其中多肽元器件e与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(8)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-eCYP73A5(ΔN)-f载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-eCYP73A5(ΔN)-f载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-eCYP73A5(ΔN)-f载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-eCYP73A5(ΔN)-fATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-eCYP73A5(ΔN)-fATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件f与ATR2(ΔN)融合表达。
(9)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-c-d载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-c-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-c-d载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-c-dCYP73A5(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-c-dCYP73A5(ΔN)构建成功，其中多肽元器件d与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(10)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-c-dCYP73A5(ΔN)载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ IDNO:17所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-c-dCYP73A5(ΔN)载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-c-dCYP73A5(ΔN)载体的Sal I酶切位点中，利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cATR2(ΔN)-dCYP73A5(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cATR2(ΔN)-dCYP73A5(ΔN)构建成功，其中多肽元器件c与ATR2(ΔN)融合表达。
(11)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-c-d载体Nde I酶切位点两侧同源的序列。利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-c-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-c-d载体的Nde I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)c-d的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)c-d构建成功，其中多肽元器件c与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(12)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-CYP73A5(ΔN)c-d载体Nco I酶切位点(通过序列表中SEQ IDNO:17所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Nco I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-CYP73A5(ΔN)c-d载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-CYP73A5(ΔN)c-d载体的Nco I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)c-ATR2(ΔN)d的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)c-ATR2(ΔN)d构建成功，其中多肽元器件d与ATR2(ΔN)融合表达。
(13)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-cCYP73A5(ΔN)-d载体Nco I酶切位点(通过序列表中SEQ IDNO:17所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Nco I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-cCYP73A5(ΔN)-d载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-cCYP73A5(ΔN)-d载体的Nco I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cCYP73A5(ΔN)-ATR2(ΔN)d的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cCYP73A5(ΔN)-ATR2(ΔN)d构建成功，其中多肽元器件d与ATR2(ΔN)融合表达。
(14)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-CYP73A5(ΔN)c-d载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-CYP73A5(ΔN)c-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-CYP73A5(ΔN)c-d载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)c-dATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)c-dATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件d与ATR2(ΔN)融合表达。
(15)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-c-d载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ IDNO:17所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-c-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET-c-d载体的Sal I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-d的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-d构建成功，其中多肽元器件c通过柔性肽Linker与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(16)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-d载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-d载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件d通过柔性肽Linker与ATR2(ΔN)融合表达。
(17)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示核苷酸序列的两条引物，以表达构建物pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)为模板进行PCR扩增6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6His。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体Nde I和Nco I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I和Nco I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6His多核苷酸片段导入pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体的Nde I和Nco I酶切位点之间，利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6HisdLinkerATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6HisdLinkerATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件c和d的N-端包括六组氨酸标签并通过柔性肽Linker分别与CYP73A5(ΔN)和ATR2(ΔN)融合表达。
(18)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所示核苷酸序列的两条引物，以表达构建物pET-a-b为模板进行PCR扩增编码多肽元器件a的多核苷酸。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体Nde I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将编码多肽元器件a的多核苷酸片段导入pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体的Nde I酶切位点中，利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件a和c通过柔性肽Linker与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(19)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示核苷酸序列的两条引物，以表达构建物pET-a-b为模板进行PCR扩增编码多肽元器件b的多核苷酸。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体Nco I酶切位点两侧同源的序列。利用Nco I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将编码多肽元器件b的多核苷酸片段导入pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)载体的Nco I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-bdLinkerATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-bdLinkerATR2(ΔN)构建成功，其中多肽元器件b和d通过柔性肽Linker与ATR2(ΔN)融合表达。
实施例4、人CYP1A2的功能性表达构建物的构建
(1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CYP1A2编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP1A2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-a-b载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-a-b载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP1A2编码基因导入pET-a-b载体的Sal I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP1A2-b的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP1A2-b构建成功，其中多肽元器件a与CYP1A2融合表达。
(2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CPR编码基因的载体为模板进行PCR扩增HsCPR编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-aCYP1A2-b载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-aCYP1A2-b载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将HsCPR编码基因导入pET-aCYP1A2-b载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP1A2-bHsCPR的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP1A2-bHsCPR构建成功，其中多肽元器件b与HsCPR融合表达。
(3)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:50所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CYP1A2编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP1A2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-a-b载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-a-b载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP1A2编码基因导入pET-a-b载体的Sal I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP1A2(ΔN)-b的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP1A2(ΔN)-b构建成功，其中多肽元器件a与CYP1A2(ΔN)融合表达。
(4)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:52所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CPR编码基因的载体为模板进行PCR扩增HsCPR编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-aCYP1A2(ΔN)-b载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-aCYP1A2(ΔN)-b载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将HsCPR编码基因导入pET-aCYP1A2(ΔN)-b载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-aCYP1A2(ΔN)-bHsCPR(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-aCYP1A2(ΔN)-bHsCPR(ΔN)构建成功，其中多肽元器件b与HsCPR(ΔN)融合表达。
(5)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:50所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CYP1A2编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP1A2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-c-d载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-c-d载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP1A2编码基因导入pET-c-d载体的Sal I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cCYP1A2(ΔN)-d的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cCYP1A2(ΔN)-d构建成功，其中多肽元器件c与CYP1A2(ΔN)融合表达。
(6)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:52所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CPR编码基因的载体为模板进行PCR扩增HsCPR编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-cCYP1A2(ΔN)-d载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-cCYP1A2(ΔN)-d载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将HsCPR编码基因导入pET-cCYP1A2(ΔN)-d载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-cCYP1A2(ΔN)-dHsCPR(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-cCYP1A2(ΔN)-dHsCPR(ΔN)构建成功，其中多肽元器件d与HsCPR(ΔN)融合表达。
(7)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:50所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CYP1A2编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP1A2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-e-f载体Sal I酶切位点(通过序列表中SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的引物引入的)两侧同源的序列。利用Sal I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-e-f载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP1A2编码基因导入pET-e-f载体的Sal I酶切位点中，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-eCYP1A2(ΔN)-f的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-eCYP1A2(ΔN)-f构建成功，其中多肽元器件e与CYP1A2(ΔN)融合表达。
(8)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:52所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CPR编码基因的载体为模板进行PCR扩增HsCPR编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-eCYP1A2(ΔN)-f载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-eCYP1A2(ΔN)-f载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将HsCPR编码基因导入pET-eCYP1A2(ΔN)-f载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-eCYP1A2(ΔN)-fHsCPR(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-eCYP1A2(ΔN)-fHsCPR(ΔN)构建成功，其中多肽元器件f与HsCPR(ΔN)融合表达。
实施例5、CYP450与CPR融合表达构建物的构建
(1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥CYP73A5编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP73A5编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET29载体Nde I和Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用NdeI和Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET29a载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP73A5编码基因导入pET29a载体的Nde I和Xho I酶切位点之间，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)构建成功。
(2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-CYP73A5(ΔN)载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-CYP73A5(ΔN)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-CYP73A5(ΔN)载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQ ID NO:63所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN)构建成功，其中CYP73A5(ΔN)与ATR2(ΔN)融合表达。
(3)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥ATR2编码基因的载体为模板进行PCR扩增ATR2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-CYP73A5(ΔN)载体Nde I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-CYP73A5(ΔN)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将ATR2编码基因导入pET-CYP73A5(ΔN)载体的Nde I酶切位点中，利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO:66所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN)构建成功，其中ATR2(ΔN)与CYP73A5(ΔN)融合表达。
(4)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CYP1A2编码基因的载体为模板进行PCR扩增CYP1A2编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET29a载体Nde I和Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I和Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET29a载体线性化。利用One-stepcloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CYP1A2编码基因导入pET29a载体的Nde I和Xho I酶切位点之间，利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP1A2(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP1A2(ΔN)构建成功。
(5)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70所示核苷酸序列的两条引物，以含有人CPR编码基因的载体为模板进行PCR扩增HsCPR编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-CYP1A2(ΔN)载体Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-CYP1A2(ΔN)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将HsCPR编码基因导入pET-CYP1A2(ΔN)载体的Xho I酶切位点中，利用通用测序引物T7ter与合成的具有序列表中SEQID NO:71所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物pET-CYP1A2(ΔN)HsCPR(ΔN)的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物pET-CYP1A2(ΔN)HsCPR(ΔN)构建成功，其中CYP1A2(ΔN)与HsCPR(ΔN)融合表达。
实施例6、CYP73A5的底物生物合成酶的表达构建物的构建
合成分别具有序列表中SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73所示核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA或含有拟南芥苯丙氨酸脱氨酶PAL1编码基因的载体为模板进行PCR扩增AtPAL1编码基因。PCR扩增程序同实施例2(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与p15A-lacI-trcO-NdeI-XhoI-ter载体Nde I和Xho I酶切位点两侧同源的序列。利用Nde I和Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将p15A-lacI-trcO-NdeI-XhoI-ter载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将AtPAL1编码基因导入p15A-lacI-trcO-NdeI-XhoI-ter载体的Nde I和Xho I酶切位点中，利用合成的具有序列表中SEQID NO:74和SEQ ID NO:75所示核苷酸序列的引物进行菌落PCR验证，获得表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter的阳性转化子。进一步测序证实表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter构建成功。
实施例7、重组细胞的获得
(1)将表达载体pET-aCYP73A5-bATR2利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-aCYP73A5-bATR2。
(2)将表达载体pET-aCYP73A5(ΔN)-bATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-aCYP73A5(ΔN)-bATR2(ΔN)。
(3)将表达载体pET-cCYP73A5(ΔN)-dATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cCYP73A5(ΔN)-dATR2(ΔN)。
(4)将表达载体pET-eCYP73A5(ΔN)-fATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-eCYP73A5(ΔN)-fATR2(ΔN)。
(5)将表达载体pET-cATR2(ΔN)-dCYP73A5(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cATR2(ΔN)-dCYP73A5(ΔN)。
(6)将表达载体pET-CYP73A5(ΔN)c-ATR2(ΔN)d利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ATR2(ΔN)c-CYP73A5(ΔN)d。
(7)将表达载体pET-cCYP73A5(ΔN)-ATR2(ΔN)d利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cCYP73A5(ΔN)-ATR2(ΔN)d。
(8)将表达载体pET-CYP73A5(ΔN)c-dATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP73A5(ΔN)c-dATR2(ΔN)。
(9)将表达载体pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)。
(10)将表达载体pET-6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6HisdLinkerATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6HisdLinkerATR2(ΔN)。
(11)将表达载体pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-bdLinkerATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-bdLinkerATR2(ΔN)。
(12)将表达载体pET-aCYP1A2-bHsCPR利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-aCYP1A2-bHsCPR。
(13)将表达载体pET-aCYP1A2(ΔN)-bHsCPR(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-aCYP1A2(ΔN)-bHsCPR(ΔN)。
(14)将表达载体pET-cCYP1A2(ΔN)-dHsCPR(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cCYP1A2(ΔN)-dHsCPR(ΔN)。
(15)将表达载体pET-eCYP1A2(ΔN)-fHsCPR(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-eCYP1A2(ΔN)-fHsCPR(ΔN)。
(16)将表达载体pET-CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN)。
(17)将表达载体pET-ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN)。
(18)将表达载体pET-CYP1A2(ΔN)HsCPR(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP1A2(ΔN)HsCPR(ΔN)。
(19)将表达载体pET-aCYP73A5-bATR2和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-aCYP73A5-bATR2&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(20)将表达载体pET-aCYP73A5(ΔN)-bATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-aCYP73A5(ΔN)-bATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(21)将表达载体pET-cCYP73A5(ΔN)-dATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cCYP73A5(ΔN)-dATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(22)将表达载体pET-eCYP73A5(ΔN)-fATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-eCYP73A5(ΔN)-fATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(23)将表达载体pET-cATR2(ΔN)-dCYP73A5(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cATR2(ΔN)-dCYP73A5(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(24)将表达载体pET-CYP73A5(ΔN)c-ATR2(ΔN)d和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ATR2(ΔN)c-CYP73A5(ΔN)d&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(25)将表达载体pET-cCYP73A5(ΔN)-ATR2(ΔN)d和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cCYP73A5(ΔN)-ATR2(ΔN)d&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(26)将表达载体pET-CYP73A5(ΔN)c-dATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP73A5(ΔN)c-dATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(27)将表达载体pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cLinkerCYP73A5(ΔN)-dLinkerATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(28)将表达载体pET-6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6HisdLinkerATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)-6HisdLinkerATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(29)将表达载体pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-bdLinkerATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-acLinkerCYP73A5(ΔN)-bdLinkerATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(30)将表达载体pET-CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(31)将表达载体pET-ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN)和表达构建物p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN)&p15A-lacI-trcO-NdeI-AtPAL1-XhoI-ter。
(32)将表达载体pET-CYP1A2(ΔN)c-HsCPR(ΔN)d利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP1A2(ΔN)c-HsCPR(ΔN)d。
(33)将表达载体pET-cCYP1A2(ΔN)-HsCPR(ΔN)d利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-cCYP1A2(ΔN)HsCPR(ΔN)d。
(34)将表达载体pET-CYP1A2(ΔN)c-dHsCPR(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP1A2(ΔN)c-dHsCPR(ΔN)。
(35)将表达载体pET-CYP1A2(ΔN)-HsCPR(ΔN)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CYP1A2(ΔN)-HsCPR(ΔN)。
实施例8、功能性表达CYP73A5进行对香豆酸生物合成
(1)配制培养基。
种子LB培养基(1L)：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。
发酵培养基(1L)：100mM 3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS),28.71mM K2HPO4,25.72mMKH2PO4,26.50mM(NH4)2HPO4,10.00mM柠檬酸,5.00mM MgSO4,1g/L维生素B1,0.5g/L生物素,166.67mM葡萄糖,0.02mM酚红,and 10mL微量元素母液。
微量元素母液配方为(1L)：36.00mM FeSO4,7.82mM ZnSO4,4.00mM CuSO4,2.00mMMnSO4,0.60mM Na2B4O7,13.60mM CaCl2,0.08mM(NH4)6Mo7O24，100mM HCl。
(2)每个重组菌株各挑取单克隆接种添加合适抗生素(卡那霉素终浓度为25μg/ml和/或四环素终浓度为12.5μg/ml)的LB培养基于37℃、200rpm过夜培养。
(3)将过夜培养菌液按100倍稀释于含合适抗生素的50mL发酵培养基中培养。待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂——异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行发酵培养，温度为25℃-37℃，。
(4)取发酵液1ml于4℃冻融，加入等体积的甲醇，振荡混匀。室温下，12000rpm，离心5min。取上清用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。分析条件为：采用LC-20A高效液相色谱仪(岛津，日本)，InertSustain C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，30℃柱温，二极管阵列检测器，278nm和314nm波长，10μl进样量，0.9mL/min流速。流动相为：1.5％(v/v)乙酸水溶液为流动相A，100％乙腈为流动相B；洗脱程序为：0–20min,10–100％B，线性；20–20.5min,100％–10％，线性；20.5–30min,10％B等度。
分析结果如表1所示。
表1 实施例8检测结果
| CYP73A5的表达形式 | 产物产量(μM) |
| aCYP73A5、bATR2 | 17.22 |
| aCYP73A5(ΔN)、bATR2(ΔN) | 876.09 |
| cCYP73A5(ΔN)、dATR2(ΔN) | 1034.64 |
| eCYP73A5(ΔN)、fATR2(ΔN) | 1031.46 |
| cATR2(ΔN)、dCYP73A5(ΔN) | 509.54 |
| ATR2(ΔN)c、CYP73A5(ΔN)d | 171.43 |
| cCYP73A5(ΔN)、ATR2(ΔN)d | 120.39 |
| CYP73A5(ΔN)c、dATR2(ΔN) | 387.81 |
| cLinkerCYP73A5(ΔN)、dLinkerATR2(ΔN) | 1536.23 |
| 6HiscLinkerCYP73A5(ΔN)、6HisdLinkerATR2(ΔN) | 1556.78 |
| acLinkerCYP73A5(ΔN)、bdLinkerATR2(ΔN) | 1869.54 |
| CYP73A5(ΔN)ATR2(ΔN) | 201.31 |
| ATR2(ΔN)CYP73A5(ΔN) | 99.66 |
表1中的实验数据显示，使用本发明所提供的方法可以实现植物细胞色素P450的功能性表达，进行天然产物的生物合成。
实施例9、功能性表达CYP1A2进行对乙酰氨基苯酚生物合成
(1)培养基的配制。
种子培养基成分为：10g酵母蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，用去离子水定容到1L。
诱导培养基成分为：3.5g KH2PO4，5g K2HPO4，3.5g(NH4)2HPO4，1.92g柠檬酸，0.6gMgSO4，1g酵母提取物，30g葡萄糖，10mL微量元素溶液，用去离子水定容到1L；其中，微量元素溶液的成分为(1L)：5mM HCl，10g FeSO4·7H2O，2.25g ZnSO4·7H2O，1gCuSO4·5H2O，0.5gMnSO4·5H2O，0.23g Na2B4O7·10H2O，2g CaCl2·2H2O，0.1g(NH4)6Mo7O24。
(2)将重组菌株解冻并在含有相应抗生素的LB平板上进行划线。挑取单克隆至添加合适抗生素的3ml LB培养基中，在37℃、200rpm培养8h；然后，取2.5ml细胞培养液至装有50ml诱导培养基的250ml摇瓶中，于37℃、120rpm条件下生长。当细胞OD600达到约0.6时，添加0.1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞，在30℃、200rpm下进行蛋白的表达，诱导培养时间为15h。
(3)测定诱导培养15h菌液的生物量OD600，调节菌体浓度为OD600＝50，体积为20mL，于5000rpm，20℃，离心5min，弃上清；用20mL生物转化缓冲液洗涤菌体2次；在三角瓶中，用20mL生物转化缓冲液完全重悬菌体，并加入底物非那西汀DMSO母液至终浓度约为100μM，混匀后取样1mL保存于-20℃；转化液于30℃、200rpm震荡培养进行生物转化，转化过程中用KOH调节pH＝7.0；反应结束后，向转化液中加入0.5倍体积的甲醇以终止反应，然后用高效液相色谱法(HPLC)进行分析。
(4)所有样品均在12000rpm离心2分钟，上清液经0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)过滤后，上样岛津LC-20A高效液相色谱仪(HPLC)进行分析和定量。分析条件为：色谱柱为InertSustain C18(5μm，4.6mm×250mm)，柱温为30℃，检测器为岛津SPD-M20A二极管阵列检测器，波长为254nm，进样量为10μl，流速为1.0mL/min。流动相为：流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为100％乙腈；梯度洗脱程序为：0–10.0min，10％–50％B线性；10.1–15.0min，50％B等度；15.1–17.0min，50％–10％B线性；17.1–20.0min，10％B等度。
(5)分析结果如表2。
表2 实施例9检测结果
| CYP1A2的表达形式 | 产物产量(μM) |
| aCYP1A2、bHsCPR | 6.25 |
| aCYP1A2(ΔN)、bHsCPR(ΔN) | 118.51 |
| cCYP1A2(ΔN)、dHsCPR(ΔN) | 142.97 |
| eCYP1A2(ΔN)、fHsCPR(ΔN) | 53.08 |
| CYP1A2(ΔN)c、dHsCPR(ΔN) | 24.66 |
| cCYP1A2(ΔN)、HsCPR(ΔN)d | 10.05 |
| CYP1A2(ΔN)c、HsCPR(ΔN)d | 17.24 |
| CYP1A2(ΔN)HsCPR(ΔN) | 22.98 |
结果表明，使用本发明所提供的方法可以实现动物细胞色素P450的功能性表达，进行药物及其代谢物的生物合成。
此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修饰，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种功能性表达细胞色素P450酶的方法及其应用
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Met Ala Glu Tyr Val Arg Ala Leu Phe Asp Phe Asn Gly Asn Asp Glu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Pro Phe Lys Lys Gly Asp Ile Leu Arg Ile Arg Asp Lys
20 25 30
Pro Glu Glu Gln Trp Trp Asn Ala Glu Asp Ser Glu Gly Lys Arg Gly
35 40 45
Met Ile Pro Val Pro Tyr Val Glu Lys Tyr Arg
50 55
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Pro Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 3
Met Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly
1 5 10 15
Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys
20 25 30
Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met
35 40 45
Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp
50 55 60
Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val
65 70 75 80
Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe
85 90 95
Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys
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Gly Asp Ala His Ile
115
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 4
Met Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 5
Met Lys Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln
20 25 30
Asn Val Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys
50 55 60
Pro Val Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu
65 70 75 80
Val Arg Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln Asp Ile Pro Ala Thr Tyr
85 90 95
Glu Phe Thr Asn Gly Lys His Tyr Ile Thr Asn Glu Pro Ile Pro Pro
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
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tttaaaaaag gtgatattct gcgtattcgt gataaaccgg aagaacagtg gtggaatgca 120
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catatggctg aatatgttcg tgcactgttt gattttaatg gtaatgatga agaagatctg 60
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aacggtaaac actacattac taatgaaccg attccgccaa aaagctctgg ttctggcagc 360
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggttccgtat gttgaaaaat atcgtatgga cctcctcttg ctggagaagt c 51
<210> 23
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
catggtatat ctccttcttg tcgacttagc agttacgcgg tttcataaca atg 53
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgcgctgccg ccaaaacgcc gtcggatgtc ctcttcttct tcttcgtcaa cctcc 55
<210> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtggtggtg gtggtggtgc tcgagttacc aaacatcacg cagataacgg c 51
<210> 26
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gtcgacaaga aggagatata ccatg 25
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ggttccgtat gttgaaaaat atcgtaagaa actgaaactg ccgccgggtc 50
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tgcgctgccg ccaaaacgcc gtcggggtaa tagtaaacgt gttgaac 47
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<400> 29
agcgaccaaa ggtgatgcgc acatcagctc tggttctggc agcagcacta gtaagaaact 60
gaaactgccg ccgggtc 77
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcag cggtggtagt ggcactagtg gtaatagtaa 60
acgtgttgaa c 71
<210> 31
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tactaatgaa ccgattccgc caaaaagctc tggttctggc agcagcacta gtaagaaact 60
gaaactgccg ccgggtc 77
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<211> 71
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tattgaattt attaaagtga acaagggcag cggtggtagt ggcactagtg gtaatagtaa 60
acgtgttgaa c 71
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcag cggtggtagt ggcactagta agaaactgaa 60
actgccgccg 70
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagcggtttc tttaccagac tcgagttagc agttacgcgg tttcataaca atg 53
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agcgaccaaa ggtgatgcgc acatcagctc tggttctggc agcagcacta gtggtaatag 60
taaacgtgtt gaac 74
<210> 36
<211> 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
catggtatat ctccttcttg tcgacttacc aaacatcacg cagataacgg c 51
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
catggtatat ctccttcttg tcgac 25
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actttaagaa ggagatatac atatgaagaa actgaaactg ccgccg 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgctcagggt gtccaccatc gcgccttagc agttacgcgg tttcataaca atg 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtcgacaaga aggagatata ccatgggtaa tagtaaacgt gttgaac 47
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aggcgtccac catcacgatg tgggcccaaa catcacgcag ataacgg 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agcgaccaaa ggtgatgcgc acatcagctc tggttctggc agcagcacta gtaagaaact 60
gaaactgccg ccgggtc 77
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actttaagaa ggagatatac atatgcatca tcatcatcat cacggcgcga tggtggacac 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggcgtccac catcacgatg tgggcgtggt ggtggtggtg gtgcatggta tatctccttc 60
ttgtcgac 68
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
actttaagaa ggagatatac atatggctga atatgttcgt gcactgtttg 50
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cgctcagggt gtccaccatc gcgccacgat atttttcaac atacggaacc gga 53
<210> 47
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gtcgacaaga aggagatata ccatgccacc gcctgcgctg ccgccaaa 48
<210> 48
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<212> DNA
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<400> 48
aggcgtccac catcacgatg tgggcccgac ggcgttttgg cggcagcgca ggcggtggca 60
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggttccgtat gttgaaaaat atcgtatggc attgtcccag tctgttccct 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
catggtatat ctccttcttg tcgacttagt tgatgctgaa acgcagacgc 50
<210> 51
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tgcgctgccg ccaaaacgcc gtcggatggg agactcccac gtggacacca gctcc 55
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ctcagtggtg gtggtggtgg tgctcgagtt agctccaaac gtccagagag taac 54
<210> 53
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggttccgtat gttgaaaaat atcgtggcct gaaatctccg ccggaaccgt gg 52
<210> 54
<211> 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgcgctgccg ccaaaacgcc gtcgggaatt caccaaaatc cagaccctga cctc 54
<210> 55
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agcgaccaaa ggtgatgcgc acatcggcct gaaatctccg ccggaaccgt gg 52
<210> 56
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ggtggacgcc tacaagccga cgaaggaatt caccaaaatc cagaccctga cctc 54
<210> 57
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tactaatgaa ccgattccgc caaaaggcct gaaatctccg ccggaaccgt gg 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tattgaattt attaaagtga acaaggaatt caccaaaatc cagaccctga cctc 54
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actttaagaa ggagatatac atatgaagaa actgaaactg ccgccgggtc 50
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agtggtggtg gtggtggtgc tcgagttagc agttacgcgg tttcataaca atg 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtggtggtg gtggtggtgc tcgagttacc aaacatcacg cagataacgg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaagcaagg ttgataccag cgag 24
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actttaagaa ggagatatac atatgggtaa tagtaaacgt gttgaac 47
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gacccggcgg cagtttcagt ttcttccaaa catcacgcag ataacgg 47
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ggccgtcatc aatttcttct tcac 24
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tttcgtttta tttgatgcct ggttactcga gactttatgg taagaaaaaa acagaggact 60
atactc 66
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ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
actttatggt aagaaaaaaa cagaggacta tactc 35
Claims (8)
1.一种功能性表达细胞色素P450酶的方法，其特征在于，所述的功能性表达细胞色素P450酶方法包括：
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽元器件a和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽元器件b，融合到细胞色素P450酶和细胞色素P450酶分子伴侣的N-端或C-端，进行细胞色素P450酶的功能性表达；
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽元器件c和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽元器件d，融合到细胞色素P450酶和细胞色素P450酶分子伴侣的N-端或C-端，进行细胞色素P450酶的功能性表达；
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽元器件e和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽元器件f，融合到细胞色素P450酶和细胞色素P450酶分子伴侣的N-端或C-端，进行细胞色素P450酶的功能性表达；
或/和
利用氨基酸序列如SEQ ID NO:1-6所示的多肽元器件a-f的组合，融合到细胞色素P450酶和细胞色素P450酶分子伴侣的N-端或C-端，进行细胞色素P450酶的功能性表达。
2.编码权利要求1所述的多肽元器件的多核苷酸。
3.含有权利要求2所述的多核苷酸的载体。
4.含有权利要求2所述的多核苷酸的表达构建物，其特征在于，所述的表达构建物包含启动子、增强子、衰减子、阻遏蛋白结合位点、核糖体结合位点、Kozak序列、内含子、转录终止子、编码蛋白质标签和/或信号肽的多核苷酸、表达RNA聚合酶的多核苷酸、表达阻遏蛋白的多核苷酸、复制子多核苷酸、表达抗生素抗性蛋白的多核苷酸、质粒运动所需的多核苷酸、基因组整合所需的多核苷酸中的一种或多种，以及权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞是在细胞质和/或细胞器和/或基因组中含有权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的表达构建物的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞；所述的原核宿主细胞包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等，所述的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。较佳地，所述的宿主细胞是内源存在细胞色素P450酶的底物或其生物合成前体的细胞。
7.权利要求3～5任一所述的载体、表达构建物、重组细胞的用途，其特征在于，所述的载体、表达构建物、重组细胞用于功能性表达细胞色素P450酶。
8.功能性表达细胞色素P450酶方法的用途，其特征在于，所述的功能性表达细胞色素P450酶方法用于天然产物和药物及其代谢物的生物合成以及有机物的降解。
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