KR20210084465A - 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법 - Google Patents

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이페이 이노우에
유이치 나카하라
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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 유기 화합물 봉입 페리틴의 대체적인 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법으로서,
(1) 완충액 중에서 유기 화합물을 페리틴과 혼합하여 유기 화합물 및 페리틴의 혼합물을 얻는 것; 및
(2) 완충액 중에서 상기 혼합물을 인큐베이트하는 것을 포함하고,
완충액은 pH3 이상 13 미만이며, 또한
완충액은, 유기 화합물의 pKa가 7 미만인 경우에는 3 이상 7 미만의 pH를 갖고, 유기 화합물의 pKa가 7 이상인 경우에는 6 이상 13 미만의 pH를 갖는, 방법을 제공한다.

Description

유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법
본 발명은, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법 등에 관한 것이다.
페리틴은 동식물에서 미생물까지 보편적으로 존재하는, 복수의 단량체로 구성된 내강(內腔)을 갖는 구상(球狀) 단백질이다. 인간 등의 동물에서는, 페리틴으로서 H쇄 및 L쇄의 2종 단량체가 존재하는 것, 및 페리틴은 24개의 단량체로 구성된 다량체(대부분의 경우, H쇄 및 L쇄의 혼합물)로서, 외경 12nm의 바구니상의 형태 및 내경 7nm의 내강을 갖는 것으로 알려져 있다. 페리틴은, 생체 또는 세포 중의 철 원소의 항상성(homeostasis)에 깊이 관여하고 있고, 그 내강 중에 철을 유지할 수 있기 때문에, 철의 수송·저장 등의 생리학적 기능의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
페리틴은 또한, 그 내강 중에 약제를 봉입하는 DDD 담체로서의 응용이 검토되고 있고, 또한, 전자 디바이스의 제작에도 이용되고 있다. 페리틴의 이러한 용도에 관련하여, 페리틴에 유기 화합물을 봉입하는 방법이 몇 가지 보고되어 있다. 구체적으로는, 이러한 방법으로서, (1) 용액의 pH를 변경함으로써 페리틴의 탈회합 및 재회합을 조절하는 방법, (2) 변성제에 의한 페리틴의 변성, 및 재폴딩을 행하는 방법, 및 (3) 압력에 의한 방법이 보고되어 있다.
예를 들면, 비특허문헌 1에서는, 페리틴을 pH2의 산성 조건 하에서 탈회합시키고, 이어서 용액의 pH를 7 내지 9로 변경하여 페리틴을 재회합시킴으로써, 약 28개의 독소루비신을 페리틴에 봉입할 수 있었다는 것이 보고되어 있다.
비특허문헌 2에서는, 페리틴을 개변함으로써 페리틴의 안정성을 향상시키면서, 용액의 pH를 HCl 첨가로 pH2로 변경하여 페리틴의 탈회합 및 재회합을 조절함으로써, 약 30 내지 90개의 독소루비신을 페리틴에 봉입할 수 있었다는 것이 보고되어 있다.
비특허문헌 3에서는, 우선, 요소 등의 변성제에 의해 페리틴을 변성시키고, 이어서, 변성 페리틴을 약제와 혼합한 후, 용액 중의 변성제를 빼냄으로써, 페리틴이 천연의 폴딩 구조로 회복될 때에 약 33개의 독소루비신을 페리틴에 봉입할 수 있었다는 것이 보고되어 있다.
특허문헌 1에서는, 페리틴 및 독소루비신의 혼합액을 고압(200 내지 800MPa) 하에서 6 내지 20시간 방치함으로써, 약 10 내지 20개의 독소루비신을 페리틴에 봉입할 수 있었다는 것이 보고되어 있다.
특허문헌 1: 중국특허출원공개 제106110333호 명세서
비특허문헌 1: Journal of Controlled Release 196(2014) 184-196 비특허문헌 2: Biomacromolecules 2016, 17, 514-522 비특허문헌 3: Proc Natl Acad Sci USA. 2014 111(41): 14900-5
상기의 종래 방법은, 페리틴의 회수율이나 페리틴에의 유기 화합물에 대한 봉입 효율이 낮고, 또한 조작이 복잡한 점이나, 소정의 장치를 필요로 하는 점, 봉입률을 높이기 위해 페리틴 표면을 특별히 개변할 필요가 있는 점에서 부담이 된다는 문제가 있다.
보다 구체적으로는, 상기 (1) 및 (2)의 방법에서는, 산성 완충액 또는 변성제에 의한 페리틴 구조의 파괴(탈회합/변성)가 필요한 바, 일단 페리틴 구조를 파괴해 버리면, 그 후에 구조의 회복 프로세스(재회합/재폴딩)를 설치해도, 페리틴의 일부가 파괴된 채의 상태가 되어 원래로 돌아가지 않기 때문에, 페리틴의 회수율이 저하된다는 문제가 있다. 더하여, 페리틴 구조를 파괴하고, 그 후에 구조를 회복시킨다는 상기 (1) 및 (2)의 방법은, 용액(반응장) 중에 분포하는 유기 화합물을 도입 페리틴에 봉입하는 데 불과한 것이기 때문에, 용액의 농도 이상의 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 없고, 페리틴에 봉입할 수 있는 유기 화합물의 양이 적다는 봉입 효율상의 과제가 있다.
또한, 상기 (1)의 방법에 대해서는, pH 조건의 변경을 요하기 때문에 완충액의 치환이 필요하다. 상기 (2)의 방법에 대해서는, 재폴딩을 위해 변성제의 제거가 필요할 뿐만 아니라, 봉입률을 높이기 위해 페리틴 표면을 특별히 개변할 필요가 있다. 따라서, 상기 (1), (2)의 방법은 복잡하다.
또한, 상기 (3)의 방법에 대해서는, 매우 높은 압력 조건을 달성할 수 있는 특수한 장치를 필요로 하는 점에서 부담이 된다.
따라서, 본 발명의 목적은, 상기와 같은 1 이상의 과제를 해결할 수 있는, 유기 화합물 봉입 페리틴의 대체적인 제조 방법을 제공하는 것이다.
종래, 금속 원자 및 금속 화합물(예, 금속 산화물)에 대해서는, 사이즈가 작기 때문에, 페리틴 구조의 파괴(탈회합/변성)를 일으키지 않는 조건 하에서, 금속 원자 및 금속 화합물을 페리틴에 봉입할 수 있는 것으로 알려져 있었다.
그러나, 유기 화합물에 대해서는, 사이즈가 상대적으로 크고, 페리틴 구조에서의 페리틴 투과능을 갖지 않는다고 생각되었기 때문에, 페리틴 구조의 파괴를 일으키지 않는 조건 하에서는, 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 없다고 생각했다. 실제로, 비특허문헌 1은, 독소루비신의 페리틴에의 봉입시에, 페리틴의 탈회합를 일으킬 수 있는 강산성 조건 하(pH 약 2.5 이하)를 굳이 채용하여, 페리틴을 탈회합시키고 있다.
이번에, 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 페리틴 구조를 파괴하지 않는 pH 범위 내에 있는, 유기 화합물의 산 해리 상수(pKa)에 따른 적절한 pH를 갖는 완충액을 사용한다는 간편한 방법에 의해, 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 있는 것 등을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
〔1〕 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법으로서,
(1) 완충액 중에서 유기 화합물을 페리틴과 혼합하여 유기 화합물 및 페리틴의 혼합물을 얻는 것; 및
(2) 완충액 중에서 상기 혼합물을 인큐베이트하는 것을 포함하고,
완충액은 pH3 이상 13 미만이며, 또한
완충액은, 유기 화합물의 pKa가 7 미만인 경우에는 3 이상 7 미만의 pH를 갖고, 유기 화합물의 pKa가 7 이상인 경우에는 6 이상 13 미만의 pH를 갖는 방법.
〔2〕 완충액의 pH와 유기 화합물의 pKa가 식: pH=2.6+0.6pKa±0.4pKa의 관계를 충족시키는, 〔1〕의 방법.
[3] 인큐베이트의 온도가 10℃ 이상 60℃ 이하인, 〔1〕 또는 〔2〕의 방법.
[4] 유기 화합물의 분자량이 100 이상 1000 미만인, 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나의 방법.
[5] 유기 화합물의 pKa가 2 이상 13 이하인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법.
[6] 10분자 이상 200분자 이하의 유기 화합물이 페리틴 분자에 봉입되어 있는, 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나의 방법.
[7] 혼합 및 인큐베이트의 합계 시간이 30분 이상인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 방법.
[8] 상기 혼합에서의 페리틴에 대한 유기 화합물의 중량비(유기 화합물/페리틴)가 0.20 이상 0.36 이하인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 방법.
[9] 유기 화합물이 양의 가전(架電) 부분, 또는 양으로 가전할 수 있는 부분을 갖는, [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 방법.
[10] 양의 가전 부분이, (a) 암모늄기(예, 제1급, 제2급, 제3급 또는 제4급), 구아니듐기, 이미다졸륨기, 옥사졸륨기, 티아졸륨기, 옥사디아졸륨기, 트리아졸륨기, 피롤리디늄기, 피리디늄기, 피페리디늄기, 피라졸륨기, 피리미디늄기, 피라디늄기, 및 트리아디늄기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양이온성 질소 함유기, 또는 (b) 포스포늄기인, 〔9〕의 방법.
[11] 양으로 가전할 수 있는 부분이, (a') 아미노기, 구아니디노기, 니트로기, 아미드기, 히드라지드기, 이미드기, 아지드기, 및 디아조기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질소 함유기, (b') 포스피노기인, 〔9〕 또는 〔10〕의 방법.
[12] 페리틴이 (1) 천연 페리틴, 또는 (2) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 개변을 갖는 유전자 재조합 페리틴 단량체로 구성된 페리틴인, [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 방법:
(a) 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역에 기능성 펩티드가 삽입되어 있는 페리틴 단량체;
(b) N 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체; 또는
(c) C 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체.
[13] 유기 화합물 봉입 페리틴을 포함하는 완충액으로서,
완충액은, 유기 화합물의 pKa가 7 미만인 경우에는 3 이상 7 미만의 pH를 갖고, 유기 화합물의 pKa가 7 이상인 경우는 6 이상 12 미만의 pH를 갖는, 완충액.
[14] 완충액이 6 이상 9 이하의 pH를 갖는, 〔13〕의 완충액.
[15] 유기 화합물이 6 이상 9 이하의 pKa를 갖는, 〔13〕 또는 〔14〕의 완충액.
[16] 유기 화합물 봉입 페리틴으로서,
유기 화합물이 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 및 표지 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
페리틴 1분자에의 유기 화합물의 봉입 분자수가 이하인, 유기 화합물 봉입 페리틴:
(1) 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴인 경우, 40분자 이상 200분자 이하;
(2) 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 유전자 재조합 페리틴인 경우, 100분자 이상 200분자 이하; 또는
(3) 유기 화합물이 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 또는 표지 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴 또는 유전자 재조합 페리틴인 경우, 10분자 이상 200분자 이하.
[17] 안트라사이클린계 물질이 독소루비신이고,
히스타민 H2 수용체 길항약이 파모티딘이고,
비구아나이드계 물질이 메트포르민이고,
ATP 감수성 칼륨채널 개구약이 미녹시딜이고,
β2 아드레날린 수용체 작동약이 테르부탈린이고,
이미다졸린계 물질이 크레아티닌이고,
비타민이 티아민, 리보플라빈, 또는 니코틴아미드이고,
표지 물질이 로다민 B, 우라닌, 또는 콩고 레드인, [16]의 유기 화합물 봉입 페리틴.
[18] 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, 및 β2 아드레날린 수용체 작동약으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 〔16〕 또는 〔17〕의 유기 화합물 봉입 페리틴.
[19] 페리틴이 (1) 천연 페리틴, 또는 (2) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 개변을 갖는 유전자 재조합 페리틴 단량체로 구성된 페리틴인, [16] 내지 [18] 중 어느 하나의 유기 화합물 봉입 페리틴:
(a) 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역에 기능성 펩티드가 삽입되어 있는 페리틴 단량체;
(b) N 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체; 또는
(c) C 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체.
본 발명의 방법에 의하면, 유기 화합물의 pKa에 따른 적절한 pH를 갖는 완충액을 사용한다는 간편한 방법에 의해, 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제작 효율이 우수하다. 우선, 본 발명의 방법은, 페리틴 구조의 파괴(탈회합/변성)를 필요로 하지 않기 때문에, 페리틴 구조의 파괴(탈회합/변성) 및 회복 프로세스를 필요로 하는 종래의 방법(회복 프로세스를 설치해도, 페리틴의 일부가 파괴된 채의 상태가 되어 원래로 돌아가지 않음)에 비해, 페리틴의 회수율이 우수하다. 다음으로, 본 발명의 방법은, 페리틴의 초분자 구조가 유지 가능한 환경 하에서 페리틴의 내강과 외각의 전기 화학 전위차를 이용함으로써, 용액 중의 농도 이상으로 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 있기 때문에, 용액 중의 농도 이상으로 유기 화합물을 페리틴에 봉입하는 것이 곤란한 종래의 방법(페리틴 구조의 회복에 따라, 용액을 페리틴 내강 중에 도입하는 방법)에 비해, 보다 많은 유기 화합물을 페리틴에 효율적으로 봉입할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 종래의 방법과는 달리, 완충액의 치환, 변성제의 제거, 또는 특수한 장치가 필요하지 않은 점에서 간편하다.
[도 1] 도 1은, 각 반응 pH에서의 페리틴에의 약제 도입률(중량%)을 나타낸 도면이다.
[도 2] 도 2는, 각 온도에서의 페리틴에의 약제 도입률(중량%)을 나타낸 도면이다.
[도 3] 도 3은, 페리틴에의 약제 도입률(중량%)의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
[도 4] 도 4는, 반응 용액 중의 약제·페리틴(단백질) 농도비와 약제 도입률(중량%)의 관계를 나타낸 도면이다.
[도 5] 도 5는, 페리틴에의 약제의 봉입 반응 후에서의 페리틴 및 약제의 컬럼 용출 피크의 일치(즉, 페리틴에의 약제의 봉입)를 나타낸 도면이다.
[도 6] 도 6은, 제타사이저 나노 ZS(말번사)에 의한 약제 봉입 페리틴 복합체(수용액 분산성 나노 입자)의 확인을 나타낸 도면이다.
[도 7] 도 7은, 독소루비신 봉입 처리되어 있지 않은 페리틴과 약제 봉입 페리틴의 표면 전하가 동등한 것(따라서, 페리틴 표면에 독소루비신이 흡착됨으로써 복합화되어 있는 것이 아닌 것)을 나타낸 도면이다.
[도 8] 도 8은, 약제 봉입 페리틴의 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
[도 9] 도 9는, 종래의 탈회합·재회합 프로세스에서의 페리틴의 탈회합 후의 방치 시간과 약제 도입률의 관계를 나타낸 도면이다.
[도 10] 도 10은, 본 발명의 원스텝 프로세스와 종래의 탈회합·재회합 프로세스에 의한 페리틴의 회수율의 비교를 나타낸 도면이다.
[도 11] 도 11은, 각 저분자 약제의 pKa와 가장 페리틴 내에 도입량이 많았던 반응에 사용한 완충액 pH(최적 pH)와의 상관 관계를 나타낸 도면이다. 근사 직선은, 도 11의 중앙에 있는 직선(pH=2.6+0.6pKa)이다. 각 저분자 약제의 pKa와 최적 pH는, 식: pH=2.6+0.6pKa±0.4pKa(절편: 2.6; 경사: 0.6; 변동 계수: 0.4)의 범위 내에 있다.
[도 12] 도 12는, 본 발명의 원스텝 프로세스에서의 약제 도입량과 종래의 탈회합·재회합 프로세트에서의 약제 도입량의 비를 나타낸 도면이다.
[도 13] 도 13은, 제타사이저 나노 ZS를 사용한 동적 광산란(DLS)법에 의한 각 pH에서의 페리틴의 사이즈 측정 결과를 나타낸 도면이다.
[도 14] 도 14는, 혈장 중에서의 우라닌 내포 페리틴의 안정성 평가 결과를 나타낸 도면이다.
[도 15] 도 15는, 형광 활성화 셀 소팅(FACS)에 의한, 트랜스페린 수용체 TfR 제시 세포(SKBR-3 세포) 내로의 우라닌 내포 페리틴의 도입 측정 결과를 나타낸 도면이다.
[도 16] 도 16은, 이광자 여기 형광 현미경에 의한, 트랜스페린 수용체 TfR 제시 세포(SKBR-3 세포) 내로의 우라닌 내포 페리틴의 도입 측정 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은, 이하를 포함하는 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법을 제공한다:
(1) 완충액 중에서 유기 화합물을 페리틴과 혼합하여 유기 화합물 및 페리틴의 혼합물을 얻는 것; 및
(2) 완충액 중에서 상기 혼합물을 인큐베이트하는 것을 포함하고,
완충액은 pH3 이상 13 미만이며, 또한
완충액은, 유기 화합물의 pKa가 7 미만인 경우에는 3 이상 7 미만의 pH를 갖고, 유기 화합물의 pKa가 7 이상인 경우에는 6 이상 13 미만의 pH를 갖는, 방법.
페리틴(24 다량체 단백질)은, 포유 동물 등의 다양한 고등 생물에 보편적으로 존재한다. 페리틴을 구성하는 페리틴 단량체는, 다양한 고등 생물간에 고도로 보존된 6개의 α-헬릭스를 갖는 것, 및 고등 생물의 페리틴 단량체로서 H쇄 및 L쇄의 2종의 단량체가 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는, 페리틴을 구성하는 페리틴 단량체로서, 포유 동물의 페리틴 단량체를 사용할 수 있다. 포유 동물로서는, 예를 들면, 영장류(예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니피그, 토끼), 가축 및 사역용의 포유 동물(예, 소, 돼지, 양, 염소, 말)을 들 수 있다. 페리틴 단량체로서는, H쇄 또는 L쇄, 또는 이들의 혼합물을 모두 사용할 수 있다. 페리틴 단량체로서는, 천연 페리틴 단량체, 또는 24 다량체의 형성능을 갖는 그 유전자 재조합 페리틴 단량체를 모두 사용할 수 있다.
일 실시형태에서는, 유전자 재조합 페리틴 단량체는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 사이의 플렉시블 링커 영역에서 개변되어 있어도 좋다. 이러한 유전자 재조합 페리틴 단량체로서는, 예를 들면, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 1번째와 2번째 사이, 2번째와 3번째 사이, 3번째와 4번째 사이, 4번째와 5번째 사이, 또는 5번째와 6번째 사이(바람직하게는 2번째와 3번째 사이)의 플렉시블 링커 영역에 기능성 펩티드가 삽입된 페리틴 단량체를 들 수 있다(본원 실시예 및 미국특허출원공개 제2016/0060307호; Jae Og Jeon et al., ACS Nano(2013), 7(9), 7462-7471; Sooji Kim et al., Biomacromolecules(2016), 17(3), 1150-1159; Young Ji Kang et al., Biomacromolecules(2012), 13(12) 4057-4064). 예를 들면, 인간 페리틴 H쇄(서열번호 1), 및 인간 페리틴 L쇄(서열번호 2)에서는, 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 1 내지 6번째의 α-헬릭스는, 표 A에 나타낸 바와 같다. 따라서, 인간 페리틴 H쇄(서열번호 1)의 플렉시블 링커 영역은, 1번째와 2번째 사이의 플렉시블 링커 영역(43 내지 49 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역(78 내지 96 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 3번째와 4번째 사이의 플렉시블 링커 영역(125 내지 127 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 4번째와 5번째 사이의 플렉시블 링커 영역(138 위치의 아미노산 잔기의 위치), 또는 5번째와 6번째 사이의 플렉시블 링커 영역(160 내지 164 위치의 아미노산 잔기의 영역)이다. 또한, 인간 페리틴 L쇄(서열번호 2)의 플렉시블 링커 영역은, 1번째와 2번째 사이의 플렉시블 링커 영역(38 내지 45 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역(74 내지 92 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 3번째와 4번째 사이의 플렉시블 링커 영역(121 내지 123 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 4번째와 5번째 사이의 플렉시블 링커 영역(134 위치의 아미노산 잔기의 위치), 또는 5번째와 6번째 사이의 플렉시블 링커 영역(155 내지 159 위치의 아미노산 잔기의 영역)이다.
[표 A]
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다른 실시형태에서는, 유전자 재조합 페리틴 단량체는, 그 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역에서 개변되어 있어도 좋다. 페리틴 단량체의 N 말단 다량체의 표면 위에 노출되고, 그 C 말단은 표면 위에 노출될 수 없다. 따라서, 페리틴 단량체의 N 말단에 부가되는 펩티드 부분은 다량체의 표면에 노출되어, 다량체의 외부에 존재하는 표적 재료와 상호 작용할 수 있다(예, 국제공개 제2006/126595호). 한편, 페리틴 단량체의 C 말단은, 그 아미노산 잔기를 개변함으로써, 페리틴 내강 중의 유기 화합물과 상호 작용할 수 있다(예, Y. J. Kang, Biomacromolecules. 2012, vol. 13(12), 4057). 이러한 유전자 재조합 페리틴 단량체로서는, 예를 들면, N 말단 또는 C 말단에 기능성 펩티드가 부가된 페리틴 단량체를 들 수 있다.
바람직하게는, 페리틴은 인간에 대한 임상 응용의 관점에서, 인간 페리틴이다. 인간 페리틴을 구성하는 페리틴 단량체로서는, 인간 페리틴 H쇄, 또는 인간 페리틴 L쇄, 또는 이들의 혼합물을 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 페리틴 1분자(또는 1 단위)란, 24개의 페리틴 단량체로 구성되는 복합체(24량체)를 말하며, 페리틴 단량체는 페리틴 1분자(또는 1 단위)에 해당하지 않는 것으로 한다.
특정한 실시형태에서는, 페리틴 H쇄은 이하라도 좋다:
(A1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(B1) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 1 또는 여러개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질; 또는
(C1) 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질.
바람직하게는, 페리틴 L쇄은 이하라도 좋다:
(A2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(B2) 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 1 또는 여러개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질; 또는
(C2) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질.
단백질 (B1) 및 (B2)에서는 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 및 삽입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4종의 수식에 의해, 1개 또는 여러개의 아미노산 잔기를 개변할 수 있다. 아미노산 잔기의 수식은, 아미노산 서열 중 하나의 영역에 도입되어도 좋지만, 복수의 다른 영역에 도입되어도 좋다. 용어 「1 또는 여러개」은, 단백질의 활성을 크게 손상시키지 않는 개수를 나타낸다. 용어 「1 또는 여러개」가 나타내는 수는, 예를 들면 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱더 바람직하게는 1 내지 20개, 특히 바람직하게는 1 내지 10개 또는 1 내지 5개(예, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)이다.
단백질 (C1) 또는 (C2)에서는, 대상의 아미노산 서열에 대한 동일성의 정도는, 바람직하게는 92% 이상이고, 보다 바람직하게는 95% 이상이고, 더욱더 바람직하게는 97% 이상이고, 가장 바람직하게는 98% 이상 또는 99% 이상이다. 단백질의 동일성 %의 산출은, 알고리즘 blastp에 의해 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 단백질의 동일성 산정 %는, 알고리즘 blastp에 있어서, 디폴트 설정의 Scoring Parameters(Matrix: BLOSUM62; Gap Costs: Existence=11 Extension=1; Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment)을 사용하여 행할 수 있다.
아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 아미노산 잔기의 위치는, 당업자에게 명백하지만, 서열 얼라인먼트를 추가로 참고하여 특정되어도 좋다. 구체적으로는, 당업자는, 1) 복수의 아미노산 서열을 비교하고, 2) 상대적으로 보존되어 있는 영역, 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역을 명백히 하고, 이어서, 3) 상대적으로 보존되어 있는 영역 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역으로부터, 각각, 기능에 중요한 역할을 할 수 있는 영역 및 기능에 중요한 역할을 할 수 없는 영역을 예측할 수 있으므로, 구조·기능의 상관성을 인식할 수 있다. 따라서, 당업자는, 서열 얼라인먼트를 이용함으로써 아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 위치를 특정할 수 있고, 또한, 알려진 2차 및 3차 구조 정보를 병용하여, 아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 아미노산 잔기의 위치를 특정할 수 있다.
아미노산 잔기가 치환에 의해 변이되는 경우, 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환이라도 좋다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「보존적 치환」이란, 소정의 아미노산 잔기를, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 해당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 이러한 패밀리로서는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전성 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 위치 분기(分岐) 측쇄를 갖는 아미노산(예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘), 하이드록실기(예, 알코올성, 페놀성) 함유 측쇄를 갖는 아미노산(예, 세린, 트레오닌, 티로신), 및 유황 함유 측쇄를 갖는 아미노산(예, 시스테인, 메티오닌)을 들 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 보존적 치환은, 아스파라긴산과 글루타민산 사이에서의 치환, 아르기닌과 리신과 히스티딘 사이에서의 치환, 트립토판과 페닐알라닌 사이에서의 치환, 페닐알라닌과 발린 사이에서의 치환, 류신과 이소류신과 알라닌 사이에서의 치환, 및 글리신과 알라닌 사이에서의 치환이라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 본 발명에서 사용되는 페리틴은, (1) 천연 페리틴, 또는 (2) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 개변을 갖는 유전자 재조합 페리틴 단량체로 구성되는 페리틴이라도 좋다:
(a) 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역에 기능성 펩티드가 삽입되어 있는 페리틴 단량체;
(b) N 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체; 또는
(c) C 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체.
기능성 펩티드로서는, 목적 단백질과 융합된 경우에 임의의 기능을 목적 단백질에 부가할 수 있는 펩티드를 사용할 수 있다. 이러한 펩티드로서는, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드, 프로테아제 분해성 펩티드, 세포 투과성 펩티드, 안정화 펩티드들 수 있다.
기능성 펩티드는, 원하는 기능을 갖는 1개의 펩티드만이라도 좋고, 또는 원하는 기능을 갖는 동종 또는 이종의 복수(예, 2개, 3개 또는 4개 등 여러개)의 펩티드라도 좋다. 기능성 펩티드가 상기와 같은 복수의 펩티드인 경우, 복수의 기능성 펩티드는 임의의 순서로 삽입되어, 페리틴 단량체와 융합할 수 있다. 페리틴 단량체 및 기능성 펩티드의 융합은, 아미드 결합을 통해 달성할 수 있다. 이러한 융합은, 아미드 결합에 의해, 페리틴 단량체 및 기능성 펩티드를 직접적으로 연결함으로써 달성되어도 좋고, 또는 1개의 아미노산 잔기(예, 메티오닌) 또는 여러개(예를 들면: 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2, 3, 4 또는 5개)의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드(펩티드 링커)가 개재된 아미드 결합에 의해 간접적으로 달성되어도 좋다. 다양한 펩티드 링커가 알려져 있기 때문에, 본 발명에서도 이러한 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기능성 펩티드는, 20개 이하(바람직하게는 18개 이하, 보다 바람직하게는 15개 이하, 더욱 바람직하게는 12개 이하, 특히 바람직하게는 10개 이하)의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이다.
기능성 펩티드로서, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드를 사용하는 경우, 표적 재료로서는, 예를 들면, 유기물 및 무기물(예, 도체, 반도체 및 자성체)을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 이러한 표적 재료로서는, 생체 유기 분자, 금속 재료, 실리콘 재료, 탄소 재료, 단백질 정제용 태그(예, 히스티딘 태그, 말토오스 결합 단백질 태그, 글루타티온-S-트랜스페라아제)와 상호 작용할 수 있는 재료(예, 니켈, 말토오스, 글루타티온), 표지 물질(예, 방사성 물질, 형광 물질, 색소), 폴리머(예, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌옥사이드 또는 폴리(L-락트산) 등의 소수성 유기 폴리머 또는 전도성 폴리머)를 들 수 있다.
생체 유기 분자로서는, 예를 들면, 단백질(예, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드), 핵산(예, DNA 또는 RNA, 또는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드), 당질(예, 모노사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드), 지질을 들 수 있다. 생체 유기 분자는 또한, 세포 표면 항원(예, 암 항원, 심 질환 마커, 당뇨병 마커, 신경 질환 마커, 면역 질환 마커, 염증 마커, 호르몬, 감염증 마커)이라도 좋다. 생체 유기 분자는 또한, 질환 항원(예, 암 항원, 심 질환 마커, 당뇨병 마커, 신경 질환 마커, 면역 질환 마커, 염증 마커, 호르몬, 감염증 마커)이라도 좋다. 이러한 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는 다양한 펩티드가 보고되어 있다. 예를 들면, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, F. Danhier et al., Mol. Pharmaceutics, 2012, vol. 9, No. 11, p. 2961., C-H. Wu et al., Sci. Transl. Med., 2015, vol. 7, No. 290, 290ra91. L. Vannucci et. al. Int. J. Nanomedicine. 2012, vol. 7, p. 1489, J. Cutrera et al., Mol. Ther. 2011, vol. 19(8), p. 1468, R. Liu et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2017, vol. 110-111, p. 13을 참조), 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, R. Tan et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, p. 5282, R. Tan et. al. Cell, 1993, vol. 73, p. 1031, R. Talanian et. al. Biochemistry. 1992, vol. 31, p. 6871을 참조), 당질에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, K. Oldenburg et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, No. 12, p. 5393-5397., K. Yamamoto et. al., J. Biochem., 1992, vol. 111, p. 436, A. Baimiev et. al., Mol. Biol(Moscow), 2005, vol. 39, No. 1, p. 90을 참조), 지질에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, O. Kruse et. al., B Z. Naturforsch., 1995, vol. 50c, p. 380, O. Silva et. al., Sci. Rep., 2016, vol. 6, 27128., A. Filoteo et. al., J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, No. 17, p. 11800을 참조) 등의 다양한 펩티드가 보고되어 있다.
바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, Danhier et al., Mol. Pharmaceutics, 2012, vol. 9, No. 11, p. 2961에 개시된 RGD 함유 펩티드나 그 개변 서열(예, RGD(서열번호 19), ACDCRGDCFCG(서열번호 20), CDCRGDCFC(서열번호 21), GRGDS(서열번호 22), 및 ASDRGDFSG(서열번호 23)), 및 그 외의 인테그린 인식 서열(예, EILDV(서열번호 24), 및 REDV(서열번호 25)), L. Vannucci et. al. Int. J. Nanomedicine. 2012, vol. 7, p. 1489에 개시된 펩티드(예, SYSMEHFRWGKP(서열번호 26)), J. Cutrera et al., Mol. Ther. 2011, vol. 19, No. 8, p. 1468에 개시된 펩티드(예, VNTANST(서열번호 27)), R. Liu et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2017, vol. 110-111, p. 13에 개시된 펩티드(예, DHLASLWWGTEL(서열번호 28), 및 NYSKPTDRQYHF(서열번호 29), IPLPPPSRPFFK(서열번호 30), LMNPNNHPRTPR(서열번호 31), CHHNLTHAC(서열번호 32), CLHHYHGSC(서열번호 33) CHHALTHAC(서열번호 34), SPRPRHTLRLSL(서열번호 35), TMGFTAPRFPHY(서열번호 36), NGYEIEWYSWVTHGMY(서열번호 37), FRSFESCLAKSH(서열번호 38), YHWYGYTPQNVI(서열번호 39), QHYNIVNTQSRV(서열번호 40), QRHKPRE(서열번호 41), HSQAAVP(서열번호 42), AGNWTPI(서열번호 43), PLLQATL(서열번호 44), LSLITRL(서열번호 45), CRGDCL(서열번호 46), CRRETAWAC(서열번호 47), RTDLDSLRTYTL(서열번호 48), CTTHWGFTLC(서열번호 49), APSPMIW(서열번호 50), LQNAPRS(서열번호 51), SWTLYTPSGQSK(서열번호 52), SWELYYPLRANL(서열번호 53), WQPDTAHHWATL(서열번호 54), CSDSWHYWC(서열번호 55), WHWLPNLRHYAS(서열번호 56), WHTEILKSYPHE(서열번호 57), LPAFFVTNQTQD(서열번호 58), YNTNHVPLSPKY(서열번호 59), YSAYPDSVPMMS(서열번호 60), TNYLFSPNGPIA(서열번호 61), CLSYYPSYC(서열번호 62), CVGVLPSQDAIGIC(서열번호 63), CEWKFDPGLGQARC(서열번호 64), CDYMTDGRAASKIC(서열번호 65), KCCYSL(서열번호 66), MARSGL(서열번호 14), MARAKE(서열번호 67), MSRTMS(서열번호 68), WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(서열번호 69), MCGVCLSAQRWT(서열번호 70), SGLWWLGVDILG(서열번호 71), NPGTCKDKWIECLLNG(서열번호 72), ANTPCGPYTHDCPVKR(서열번호 73), IVWHRWYAWSPASRI(서열번호 74), CGLIIQKNEC(서열번호 75), MQLPLAT(서열번호 76), CRALLRGAPFHLAEC(서열번호 77), IELLQAR(서열번호 78), TLTYTWS(서열번호 79), CVAYCIEHHCWTC(서열번호 80), THENWPA(서열번호 81), WHPWSYLWTQQA(서열번호 82), VLWLKNR(서열번호 83), CTVRTSADC(서열번호 84), AAAPLAQPHMWA(서열번호 85), SHSLLSS(서열번호 86), ALWPPNLHAWVP(서열번호 87), LTVSPWY(서열번호 88), SSMDIVLRAPLM(서열번호 89), FPMFNHWEQWPP(서열번호 90), SYPIPDT(서열번호 91), HTSDQTN(서열번호 92), CLFMRLAWC(서열번호 93), DMPGTVLP(서열번호 94), DWRGDSMDS(서열번호 95), VPTDTDYS(서열번호 96), VEEGGYIAA(서열번호 97), VTWTPQAWFQWV(서열번호 98), AQYLNPS(서열번호 99), CSSRTMHHC(서열번호 100), CPLDIDFYC(서열번호 101), CPIEDRPMC(서열번호 102), RGDLATLRQLAQEDGVVG(서열번호 103), SPRGDLAVLGHK(서열번호 104), SPRGDLAVLGHKY(서열번호 105), CQQSNRGDRKRC(서열번호 106), CMGNKCRSAKRP(서열번호 107), CGEMGWVRC(서열번호 108), GFRFGALHEYNS(서열번호 109), CTLPHLKMC(서열번호 110), ASGALSPSRLDT(서열번호 111), SWDIAWPPLKVP(서열번호 112), CTVALPGGYVRVC(서열번호 113), ETAPLSTMLSPY(서열번호 114), GIRLRG(서열번호 115), CPGPEGAGC(서열번호 116), CGRRAGGSC(서열번호 117), CRGRRST(서열번호 118), CNGRCVSGCAGRC(서열번호 119), CGNKRTRGC(서열번호 120), HVGGSSV(서열번호 121), RGDGSSV(서열번호 122), SWKLPPS(서열번호 123), CRGDKRGPDC(서열번호 124), GGKRPAR(서열번호 125), RIGRPLR(서열번호 126), CGFYWLRSC(서열번호 127), RPARPAR(서열번호 128), TLTYTWS(서열번호 129), SSQPFWS(서열번호 130), YRCTLNSPFFWEDMTHEC(서열번호 131), KTLLPTP(서열번호 132), KELCELDSLLRI(서열번호 133), IRELYSYDDDFG(서열번호 134), NVVRQ(서열번호 135), VECYLIRDNLCIY(서열번호 136), CGGRRLGGC(서열번호 137), WFCSWYGGDTCVQ(서열번호 138), NQQLIEEIIQILHKIFEIL(서열번호 139), KMVIYWKAG(서열번호 140), LNIVSVNGRH(서열번호 141), QMARIPKRLARH(서열번호 142), 및 QDGRMGF(서열번호 143)) 또는 이들의 변이 펩타이드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩타이드를 들 수 있다.
바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, R. Tan et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, p. 5282에 개시된 펩티드 및 그 부분 펩티드(예, TRQARR(서열번호 17), TRQARRN(서열번호 144), TRQARRNRRRRWRERQR(서열번호 145), TRRQRTRRARRNR(서열번호 146), NAKTRRHERRRKLAIER(서열번호 147), MDAQTRRRERRAEKQAQWKAA(서열번호 148), 및 RKKRRQRRR(서열번호 149)), R. Tan et. al. Cell, 1993, vol. 73, p. 1031에 개시된 펩티드(예, TRQARRNRRRRWRERQR(서열번호 150)), Talanian et. al. Biochemistry. 1992, vol. 31, p. 6871에 개시된 펩티드(예, KRARNTEAARRSRARK(서열번호 151)), 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.
바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 당질에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 당질에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, K. Oldenburg et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, No12, p. 5393-5397에 개시된 펩티드(예, DVFYPYPYASGS(서열번호 152), 및 RVWYPYGSYLTASGS(서열번호 153)), K. Yamamoto et. al., J. Biochem., 1992, vol. 111, p. 436에 개시된 펩티드(예, DTWPNTEWS(서열번호 154), DSYHNIW(서열번호 155), DTYFGKAYNPW(서열번호 156), 및 DTIGSPVNFW(서열번호 157)), A. Baimiev et. al., Mol. Biol.(Moscow), 2005, vol. 39, No. 1, p. 90에 개시된 펩티드(TYCNPGWDPRDR(서열번호 158), 및 TFYNEEWDLVIKDEH(서열번호 159)) 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.
바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 지질에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 지질에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, O. Kruse et. al., Z. Naturforsch., 1995, vol. 50c, p. 380에 개시된 펩티드(예, MTLILELVVI(서열번호 160), MTSILEREQR(서열번호 161), 및 MTTILQQRES(서열번호 162)), O. Silva et. al., Sci. Rep., 2016, vol. 6, 27128에 개시된 펩티드(예, VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF(서열번호 163)), A. Filoteo et. al., J. Biol. Chem., 1992, vol. 267(17), p. 11800에 개시된 펩티드(예, KKAVKVPKKEKSVLQGKLTRLAVQI(서열번호 164)) 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.
금속 재료로서는, 예를 들면, 금속 및 금속 화합물을 들 수 있다. 금속으로서는, 예를 들면, 티타늄, 금, 크롬, 아연, 납, 망간, 칼슘, 구리, 칼슘, 게르마늄, 알루미늄, 갈륨, 카드뮴, 철, 코발트, 은, 백금, 팔라듐, 하프늄, 텔루르를 들 수 있다. 금속 화합물로서는, 예를 들면, 이러한 금속의 산화물, 황화물, 탄산화물, 비화물, 염화물, 불화물 및 요오드화물, 및 금속간 화합물을 들 수 있다. 이러한 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는 다양한 펩티드가 보고되어 있다(예, 국제공개 제2005/010031호; 국제공개 제2012/086647호; K. Sano et al., Langmuir, 2004, vol. 21, p. 3090; S. Brown, Nat. Biotechnol., 1997, vol. 15. p. 269; K. Kjaergaard et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol. 66. p. 10; Umetsu et al., Adv. Mater., 17, 2571-2575(2005); M. B. Dickerson et al., Chem. Commun., 2004, vol. 15. p. 1776.; C. E. Flynn et al., J. Mater. Chem., 2003, vol. 13. p. 2414.). 따라서, 본 발명에서는 이러한 다양한 펩티드를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 티타늄 또는 티타늄 화합물(예, 산화티타늄) 등의 티타늄 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드, 및 금 또는 금 화합물 등의 금 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 티타늄 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 후술하는 실시예 및 국제공개 제2006/126595호에 개시된 펩티드(예, RKLPDA(서열번호 165)), M. J. Pender et al., Nano Lett., 2006, vol. 6, No. 1, p. 40-44에 개시된 펩티드(예, SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(서열번호 166)), I. Inoue et al., J. Biosci. Bioeng., 2006, vol. 122, No. 5, p. 528에 개시된 펩티드(예, AYPQKFNNNFMS(서열번호 167)), 및 국제공개 제2006/126595호에 개시된 펩티드(예, RKLPDAPGMHTW(서열번호 168), 및 RALPDA(서열번호 169)), 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다. 금 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 후술하는 실시예와 S. Brown, Nat. Biotechnol. 1997, vol. 15, p. 269에 개시된 펩티드(예, MHGKTQATSGTIQS(서열번호 170)), J. Kim et. al., Acta Biomater., 2010, Vol. 6, No. 7, p. 2681에 개시된 펩티드(예, TGTSVLIATPYV(서열번호 171), 및 TGTSVLIATPGV(서열번호 172)), 및 K. Nam et. al., Science, 2006, vol. 312 No. 5775, p. 885개시된 펩티드(예, LKAHLPPSRLPS(서열번호 173)), 또는 이들의 변이 펩타이드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩타이드를 들 수 있다.
실리콘 재료로서는, 예를 들면, 실리콘 또는 실리콘 화합물을 들 수 있다. 실리콘 화합물로서는, 예를 들면, 실리콘의 산화물(예, 일산화규소(SiO), 이산화규소(SiO2)), 탄화규소(SiC), 실란(SiH4), 실리콘 고무를 들 수 있다. 이러한 실리콘 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는 다양한 펩티드가 보고되어 있다(예, 국제공개 제2006/126595호; 국제공개 제2006/126595호; M. J. Pender et al., Nano Lett., 2006, vol. 6, No. 1, p. 40-44). 따라서, 본 발명에서는 이러한 다양한 펩티드를 사용할 수 있다.　
바람직하게는, 실리콘 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 실리콘 또는 실리콘 화합물(예, 실리콘의 산화물)에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면, 국제공개 제2006/126595호에 개시된 펩티드(예, RKLPDA(서열번호 165)), M. J. Pender et al., Nano Lett., 2006, vol. 6, No. 1, p. 40-44에 개시된 펩티드(예, SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(서열번호 174)), 및 국제공개 제2006/126595호에 개시된 펩티드(MSPHPHPRHHHT(서열번호 175), TGRRRRLSCRLL(서열번호 176), 및 KPSHHHHHTGAN(서열번호 177)), 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.　
탄소 재료로서는, 예를 들면, 카본 나노 재료(예, 카본 나노튜브(CNT), 카본 나노혼(CNH)), 풀러렌(C60), 그래핀 시트, 그래파이트를 들 수 있다. 이러한 탄소 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는 다양한 펩티드가 보고되어 있다(예, 일본 공개특허공보 특개2004-121154호; 일본 공개특허공보 특개2004-121154호; M. J. Pender et al., Nano Lett., 2006, vol.6, No.1, p.40-44). 따라서, 본 발명에서는 이러한 다양한 펩티드를 사용할 수 있다.　
바람직하게는, 탄소 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 카본 나노튜브(CNT) 또는 카본 나노혼(CNH) 등의 카본 나노 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면, 후술하는 실시예 및 일본 공개특허공보 특개2004-121154호에 개시된 펩티드(예, DYFSSPYYEQLF(서열번호 178)), M. J. Pender et al., Nano Lett., 2006, vol. 6, No. 1, p. 40-44에 개시된 펩티드(HSSYWYAFNNKT(서열번호 179)), 및 일본 공개특허공보 특개2004-121154호에 개시된 펩티드(예, YDPFHII(서열번호 180)), 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.
기능성 펩티드로서 프로테아제 분해 펩티드가 사용되는 경우, 프로테아제로서는, 예를 들면, 카스파아제나 카텝신 등의 시스테인 프로테아제(D. McIlwain1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol. 5, a008656, V. Stoka et al., IUBMB Life. 2005, vol. 57, No. 4-5p. 347), 콜라게나아제(G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol. 67, No. 3, p. 646), 트롬빈이나 Xa 인자(R. Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol. 31, p. 1, H. Xu et al., J. Virol., 2010, vol. 84, No. 2, p. 1076), 바이러스 유래 프로테아제(C. Byrd et al., Drug Dev. Res., 2006, vol. 67, p. 501)를 들 수 있다.　
프로테아제 분해성 펩티드로서는, 예를 들면, E. Lee et al., Adv. Funct. Mater., 2015, vol. 25, p. 1279에 개시된 펩티드(예, GRRGKGG(서열번호 181)), G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol. 67, No. 3, p. 646에 개시된 펩티드(예, GPLGV(서열번호 182), 및 GPLGVRG(서열번호 183)), Y. Kang et al., Biomacromolecules, 2012, vol. 13, No. 12, p. 4057에 개시된 펩티드(예, GGLVPRGSGAS(서열번호 184)), R. Talanian et al., J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, p. 9677에 개시된 펩티드(예, YEVDGW(서열번호 185), LEVDGW(서열번호 186), VDQMDGW(서열번호 187), VDVADGW(서열번호 188), VQVDGW(서열번호 189), 및 VDQVDGW(서열번호 190)), Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol. 31, p. 1에 개시된 펩티드(예, ELSLSRLRDSA(서열번호 191), ELSLSRLR(서열번호 192), DNYTRLRK(서열번호 193), YTRLRKQM(서열번호 194), APSGRVSM(서열번호 195), VSMIKNLQ(서열번호 196), RIRPKLKW(서열번호 197), NFFWKTFT(서열번호 198), KMYPRGNH(서열번호 199), QTYPRTNT(서열번호 200), GVYARVTA(서열번호 201), SGLSRIVN(서열번호 202), NSRVA(서열번호 203), QVRLG(서열번호 204), MKSRNL(서열번호 205), RCKPVN(서열번호 206), 및 SSKYPN(서열번호 207)), H. Xu et al., J. Virol., 2010, vol. 84, No. 2, p. 1076에 개시된 펩티드(예, LVPRGS(서열번호 208)) 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.　
기능성 펩티드로서 안정화 펩티드가 사용되는 경우, 안정화 펩티드로서는, 예를 들면, X. Meng et al., Nanoscale, 2011, vol. 3, No. 3, p. 977에 개시된 펩티드(예, CCALNN(서열번호 209)), 및 E. Falvo et al., Biomacromolecules, 2016, vol. 17, No. 2, p. 514에 개시된 펩티드(예, PAS(서열번호 210)) 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.　
기능성 펩티드로서 세포 투과성 펩티드가 사용되는 경우, 세포 투과성 펩티드로서는, 예를 들면, Z. Guo et al. Biomed. Rep., 2016, vol. 4, No. 5, p. 528에 개시된 펩티드(예, GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 211), RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 212), CGYGPKKKRKVGG(서열번호 213), RRRRRRRR(서열번호 214), KKKKKKKK(서열번호 215), GLAFLGFLGAAGSTM(서열번호 216), GAWSQPKKKRKV(서열번호 217), LLIILRRRIRKQAHAHSK(서열번호 218), MVRRFLVTL(서열번호 219), RIRRACGPPRVRV(서열번호 220), MVKSKIGSWILVLFV(서열번호 221), SDVGLCKKRP(서열번호 222), NAATATRGRSAASRPTQR(서열번호 223), PRAPARSASRPRRPVQ(서열번호 224), DPKGDPKGVTVT(서열번호 225), VTVTVTGKGDPKPD(서열번호 226), KLALKLALK(서열번호 227), ALKAALKLA(서열번호 228), GWTLNSAGYLLG(서열번호 229), KINLKALAALAKKIL(서열번호 230), RLSGMNEVLSFRW(서열번호 231), SDLWEMMMVSLACQY(서열번호 232), 및 PIEVCMYREP(서열번호 233)) 또는 이들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.
기능성 펩티드로서는, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하다. 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드의 바람직한 예는, 유기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드이다. 유기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하고, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 보다 바람직하다.
페리틴은, 페리틴을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 사용하여, 페리틴을 숙주 세포로 생산시킴으로써 입수할 수 있다. 이러한 숙주 세포로서는, 예를 들면, 동물, 곤충, 어류, 또는 식물에 유래하는 세포, 및 미생물을 들 수 있다. 동물로서는, 포유 동물 또는 조류(예, 닭)가 바람직하고, 포유 동물이 보다 바람직하다. 포유 동물로서는, 예를 들면, 영장류(예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니피그, 토끼), 가축 및 사역용의 포유 동물(예, 소, 돼지, 양, 염소, 말)을 들 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 숙주 세포는 임상 응용의 관점에서, 인간 세포, 또는 인간 단백질의 생산에 범용되고 있는 세포(예, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 태아 신장 유래 HEK293 세포)라도 좋다.
다른 바람직한 실시형태에서는, 숙주 세포는 페리틴의 대량 생산 등의 관점에서, 미생물이라도 좋다. 미생물로서는, 예를 들면, 세균 및 진균을 들 수 있다. 세균으로서는, 숙주 세포로서 사용되고 있는 임의의 세균을 사용할 수 있고, 예를 들면, 바실러스(Bacillus)속 세균〔예, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)], 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균[(예, 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)], 에쉬리키아(Escherichia)속 세균〔예, 에쉬리키아·콜라이 (Escherichia coli)], 판토에아(Pantoea)속 세균(예, 판토에아·아나나티스(Pantoea ananatis))을 들 있다. 진균으로서는, 숙주 세포로서 사용되고 있는 임의의 진균을 사용할 수 있고, 예를 들면, 사카로미세스(Saccharomyces)속 진균[예, 사카로미세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)], 및 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속 진균[예, 스키조사카로미세스·폼베(Schizosaccharomyces pombe)]을 들 수 있다. 또는, 미생물로서 사상균을 사용해도 좋다. 사상균으로서는, 예를 들면, 아크레모늄속(Acremonium)/탈라로미세스속(Talaromyces), 트리코데르마속(Trichoderma), 아스페르길루스속(Aspergillus), 뉴로스포라속(Neurospora), 푸사리움속(Fusarium), 크리소스포륨속(Chrysosporium), 휴미콜라속(Humicola), 에메리셀라속(Emericella), 및 하이포크레아속(Hypocrea)에 속하는 세균을 들 수 있다.
유기 화합물로서는, 임의의 유기 화합물을 사용할 수 있다. 이러한 유기 화합물로서는, 예를 들면, 저분자 화합물, 당 화합물, 펩티드 화합물, 핵산 화합물(예, DNA, RNA, 인공 핵산)을 들 수 있지만, 저분자 화합물이 바람직하다.
본 발명에서는, 용어 「저분자 화합물」이란, 분자량 100 내지 1000의 유기 화합물을 말한다. 저분자 화합물인 유기 화합물의 분자량은 150 이상, 200 이상, 250 이상, 또는 300 이상이라도 좋다. 분자량은 또한, 950 이하, 900 이하, 850 이하, 또는 800 이하라도 좋다. 보다 구체적으로는, 분자량은 150 내지 950, 200 내지 900, 250 내지 850, 또는 300 내지 800이라도 좋다.
저분자 화합물로서는, 예를 들면, 의약, 비타민, 표지 물질, 아미노산, 올리고펩티드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 단당류, 지질, 지방산, 및 이들의 대사물을 들 수 있다.
특정한 실시형태에서는, 본 발명에서 사용되는 의약은 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 또는 표지 물질이라도 좋다.
안트라사이클린계 물질로서는, 예를 들면, 독소루비신, 다우노루비신, 에피 루비신, 이다루비신, 발루비신, 미톡산트론을 들 수 있다. 이 중에서도, 독소루비신이 바람직하다.
히스타민 H2 수용체 길항약으로서는, 예를 들면, 파모티딘, 시메티딘, 라니티딘, 니자티딘, 록사티딘 아세테이트, 라푸티딘을 들 수 있다. 이 중에서도, 파모티딘이 바람직하다.
비구아나이드계 물질로서는, 예를 들면, 메트포르민, 부포르민, 펜포르민, 프로구아닐, 클로로프로구아닐, 클로르헥시딘, 아렉시딘들 수 있다. 이 중에서도, 메트포르민이 바람직하다.
ATP 감수성 칼륨채널 개구약으로서는, 예를 들면, 미녹시딜, 니콜란딜, 피나시딜, 디아족시드, 크로마칼림, 레브크로마칼림, 레마칼림을 들 수 있다. 이 중에서도, 미녹시딜이 바람직하다.
β2 아드레날린 수용체 작동약으로서는, 예를 들면, 테르부탈린, 살부타몰, 레보살부타몰, 피르부테롤, 프로카테롤, 메타프로테레놀, 페노테롤, 바이톨테롤, 살메테롤, 포르모테롤, 빌란테롤, 밤부테롤, 클렌부테롤, 인다카테롤을 들 수 있다. 이 중에서도, 테르부탈린이 바람직하다.
이미다졸린계 물질로서는, 예를 들면, 크레아티닌, 옥시메타졸린, 클로니딘, 시벤졸린, 티자니딘, 테트라하이드로졸린, 나파졸린, 펠톨라민, 브리모니딘, 목소니딘을 들 수 있다. 이 중에서도, 크레아티닌이 바람직하다.
비타민으로서는, 예를 들면, 비타민 B1(예, 티아민), 비타민 B2(예, 리보플라빈), 비타민 B3(예, 니아신, 니코틴아미드), 비타민 B5(예, 판토텐산), 비타민 B6(예, 피리독살, 피리독사민, 피리독신), 비타민 B7(예, 비오틴), 비타민 B9(예, 엽산), 비타민 B12(예, 시아노코발라민, 히드록소코발라민), 비타민 C(예, 아스코르브산), 비타민 A(예, 레티놀, β-카로틴, α-카로틴, β-크립톡산틴), 비타민 D(예, 에르고칼시페롤, 콜레칼시페롤), 비타민 E(예, 토코페롤, 토코트리에놀), 비타민 K(예, 필로퀴논, 메나퀴논)를 들 수 있다. 이 중에서도, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3이 바람직하다.
표지 물질로서는, 예를 들면, 로다민(예, 로다민 B, 6G, 6GP, 3GO 123), 우라닌 등의 형광 물질, 콩고 레드 등의 색소 및 염료, 및 발광 물질을 들 수 있다. 이 중에서도, 로다민 B, 우라닌, 또는 콩고 레드가 바람직하다.
아미노산으로서는, 예를 들면, α-아미노산(예, 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 아스파라긴산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글리신), β-아미노산(예, β-알라닌, 판토텐산), γ-아미노산(예, γ-아미노산)을 들 수 있다. 아미노산은 L체라도 좋고, D체라도 좋다.
유기 화합물의 pKa는, 2 이상 13 이하라도 좋다. 유기 화합물의 pKa가 2 이상 13 이하인 경우, 당해 pKa에 따른 적절한 pH를 갖는 완충액을 사용함으로써, 페리틴에 유기 화합물을 보다 효율적으로 봉입할 수 있다. 보다 구체적으로는, 유기 화합물의 pKa가 2 이상 7 미만(바람직하게는 3 이상 6 미만)인 경우, 완충액은, 3 이상 7 미만(바람직하게는 3 이상 6 미만)의 pH를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 유기 화합물의 pKa가 7 이상 13 이하인 경우, 완충액은, 6 이상 13 미만(바람직하게는 6 이상 12 이하, 보다 바람직하게는 6 이상 11 미만, 더욱 바람직하게는 6 이상 10 미만)의 pH를 갖는 것이 바람직하다.
유기 화합물의 pKa는, 중화 적정법에 의해 구할 수 있다(화학 편람 기초편 I, II(개정 4판), 일본 화학회편, 마루젠, 1993). 중화 적정법에서는, 각 분자의 0.1몰/L 용액을 조제하고, 25℃에서 이 용액에 0.1몰/L의 수산화나트륨 수용액 또는 염산 수용액을 적정하고, pH를 측정함으로써 계산할 수 있다. 유기 화합물이 단일의 pKa값을 갖는 경우, 이 값을 유기 화합물의 pKa로서 채용된다. 한편, 유기 화합물이 복수(예를 들면, 2 내지 6, 바람직하게는 2 내지 5, 더욱 바람직하게는 2 내지 4, 더욱더 바람직하게는 2 또는 3)의 pKa값을 갖는 경우, 이들의 평균값이 유기 화합물의 pKa로서 채용된다.
바람직하게는, 유기 화합물은 양의 하전(荷電) 부분 및/또는 양으로 하전할 수 있는 부분을 갖고 있어도 좋다.
일 실시형태에서는, 유기 화합물은 양의 하전 부분을 갖는다. 양의 하전 부분이란, 고체의 상태에서 양으로 전하하고 있는 기를 의미한다. 양의 하전 부분으로서는, 예를 들면, 양이온성 질소 함유기, 및 양이온성 인 함유기를 들 수 있다.
양이온성 질소 함유기란, 양으로 하전한 질소 원자를 갖는 기를 의미한다. 양이온성 질소 함유기로서는, 예를 들면, 암모늄기(예, 제1급, 제2급, 제3급 또는 제4급), 구아니듐기, 이미다졸륨기, 옥사졸륨기, 티아졸륨기, 옥사디아졸륨기, 트리아졸륨기, 피롤리디늄기, 피리디늄기, 피페리디늄기, 피라졸륨기, 피리미디늄기, 피라디늄기, 및 트리아디늄기를 들 수 있다.
양이온성 인 함유기란, 양으로 하전한 인 원자를 갖는 기를 의미한다. 양이온성 인 함유기로서는, 예를 들면 포스포늄기(예, 제1급, 제2급, 제3급 또는 제4급)를 들 수 있다.
다른 실시형태에서는, 유기 화합물은 양으로 하전할 수 있는 부분을 갖는다. 양으로 하전할 수 있는 부분이란, 고체의 상태에서는 양으로 하전하고 있지 않지만, 수용액 중에 용해된 상태에서는 수소 원자 억셉터로서 작용하여, 수용액의 pH에 의존하여 양으로 하전할 수 있는 기를 의미한다. 양으로 하전할 수 있는 부분으로서는, 예를 들면, 양으로 하전할 수 있는 질소 함유기, 및 양으로 하전할 수 있는 인 함유기를 들 수 있다. 양으로 하전할 수 있는 질소 함유기로서는, 예를 들면, 아미노기(예, 제1급, 제2급 또는 제3급), 구아니디노기, 니트로기, 아미드기, 히드라지드기, 이미드기, 아지드기, 디아조기를 들 수 있다. 양으로 하전할 수 있는 인 함유기로서는, 예를 들면, 포스피노기(예, 제1급, 제2급 또는 제3급)를 들 수 있다.
유기 화합물은, 양의 하전 부분 또는 양으로 하전할 수 있는 부분에 더하여, 음의 하전 부분(예, 아민옥사이드의 옥사이드기) 또는 음으로 하전할 수 있는 부분(예, 황산 기)을 갖고 있어도 좋다. 유기 화합물이, 양의 하전 부분 또는 양으로 하전할 수 있는 부분에 더하여, 음의 하전 부분 또는 음으로 하전할 수 있는 부분을 갖는 경우, 양의 하전 부분 및/또는 양으로 하전할 수 있는 부분의 총수가, 음의 하전 부분 및/또는 음으로 하전할 수 있는 부분의 총수에 비해 많은 것(즉, 전체로서 양의 전하를 띠고 있거나, 용액의 원하는 pH 조건에 따라 전체로서 양의 전하를 띠기 쉬워진 것)이 바람직하다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물의 pKa와 pH는, 상관식: pH=2.6+0.6pKa±0.4pKa의 범위 내라도 좋다(도 11). 변동 계수는, 바람직하게는 0.3이다.
다른 특정한 실시형태에서는, 유기 화합물은 6 이상 9 이하의 pKa를 갖고 있어도 좋다. 이 경우, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법에 사용한 완충액(예, pH6 이상 9 이하)을 그대로 보존에 사용함으로써, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 후에 유기 화합물 봉입 페리틴을 안정적으로 보존할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, 6 이상 9 이하의 pKa를 갖는 유기 화합물을 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 우선, 완충액 중에서 유기 화합물을 페리틴과 혼합함으로써, 유기 화합물 및 페리틴의 혼합물이 얻어진다. 혼합은, 임의의 양식에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 페리틴 함유 완충액 중에 유기 화합물을 용해해도 좋고, 또는 유기 화합물 함유 완충액 중에 유기 화합물을 용해해도 좋고, 또는, 유기 화합물 함유 완충액을 페리틴 함유 완충액와 혼합함으로써 행하여져도 좋다. 혼합에서의 페리틴에 대한 유기 화합물의 중량비(유기 화합물/페리틴)는, 페리틴에 유기 화합물을 봉입할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 0.05 내지 0.45라도 좋다. 페리틴에 유기 화합물을 효율적으로 봉입하는 관점에서, 이러한 중량비는, 예를 들면, 0.20 이상 0.36 이하라도 좋다.
본 발명에서 사용되는 완충액은, 3 이상 13 미만의 pH를 갖는다. 이러한 범위의 pH라면, 페리틴 구조의 파괴(탈회합 및 변성)를 방지할 수 있다. 완충액의 pH는, 유기 화합물의 pKa 등의 인자에 따라, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7 이상이라도 좋다. 완충액의 pH는 또한, 유기 화합물의 pKa 등의 인자에 따라, 13 미만, 12 미만, 11 미만, 10 미만, 9 미만, 8 미만, 또는 7 미만이라도 좋다. 완충액의 pH는, 유리 전극법에 의해 25℃에서 측정되는 값을 사용할 수 있다.
완충액으로서는, 목적의 pH에 따라 적절한 것을 선택할 수 있다. 목적의 pH가 3 이상 7 미만인 경우에 적합하게 사용할 수 있는 완충액으로서는, 예를 들면, 인산 완충액, 아세트산 완충액, 시트르산 완충액, 시트르산 인산 완충액, 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, 프탈산 완충액, 글리신염산염 완충액, MES-NaOH 완충액, MOPS 완충액, HEPES-NaOH 완충액, PIPES-NaOH 완충액, 비스트리스염산염 완충액을 들 수 있다. 목적의 pH가 6 이상 13 미만인 경우에 적합하게 사용할 수 있는 완충액으로서는, 예를 들면, 트리스염산염 완충액, 탄산나트륨 완충액, MOPS 완충액, HEPES-NaOH 완충액, PIPES-NaOH 완충액, 글리신-NaOH 완충액, CAPS-NaOH 완충액, 염화칼륨-수산화나트륨 완충액을 들 수 있다.
특정한 실시형태에서는, 완충액의 pH는 6 이상 9 이하라도 좋다. 이 경우, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법에 사용한 완충액을 그대로 보존에 사용함으로써, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 후에 유기 화합물 봉입 페리틴을 안정적으로 보전할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, 6 이상 9 이하의 pH를 갖는 완충액을 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 이어서 완충액 중에서 상기 혼합물을 인큐베이트된다. 인큐베이트는, 임의의 양식에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 인큐베이트는, 완충액 중에서 상기 혼합물을 정치 또는 교반함으로써 행하여진다. 인큐베이트의 온도는, 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 10℃ 이상 60℃ 이하이다. 인큐베이트의 온도는, 15℃ 이상, 또는 20℃ 이상이라도 좋다. 인큐베이트의 온도는 또한, 55℃ 이하, 또는 50℃ 이하라도 좋다.
혼합 및 인큐베이트의 합계 시간은, 유기 화합물을 페리틴에 봉입할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 5분 이상, 10분 이상, 15분 이상, 또는 20분 이상이라도 좋다. 바람직하게는, 유기 화합물을 페리틴 충분히 봉입하는 관점에서는, 혼합 및 인큐베이트의 합계 시간은 30분 이상이라도 좋다.
본 발명에 있어서, 페리틴 1분자에 봉입되는 유기 화합물의 수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 10분자 이상, 200분자 이하의 유기 화합물을 페리틴 1분자에 봉입할 수 있다. 페리틴 1분자에 봉입되는 유기 화합물의 수는, 바람직하게는 20분자 이상, 보다 바람직하게는 30분자 이상, 더욱 바람직하게는 40분자 이상, 더욱더 바람직하게는 50분자 이상, 특히 바람직하게는 60분자 이상, 70분자 이상, 80분자 이상, 90분자 이상, 100분자 이상, 110분자 이상, 120분자 이상, 130분자 이상, 140분자 이상, 또는 150분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 유기 화합물의 수는 또한, 바람직하게는 190분자 이하, 보다 바람직하게는 180분자 이하, 더욱 바람직하게는 170분자 이하, 더욱더 바람직하게는 160분자 이하, 특히 바람직하게는 150분자 이하, 140분자 이하, 130분자 이하, 120분자 이하, 110분자 이하, 100분자 이하, 90분자 이하, 80분자 이하, 70분자 이하, 60분자 이하, 50분자 이하, 40분자 이하, 30분자 이하, 20분자 이하 또는 15분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 페리틴이 (a) 천연 페리틴 단량체로 구성된 천연 페리틴, 또는 (b) 유전자 재조합 페리틴 단량체로 구성된 유전자 재조합 페리틴인 경우에 따라 변동되어도 좋다.
예를 들면, 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴인 경우, 천연 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 40분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 천연 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 바람직하게는 50분자 이상, 보다 바람직하게는 60분자 이상, 더욱 바람직하게는 70분자 이상, 더욱더 바람직하게는 80분자 이상, 특히 바람직하게는 90분자 이상이라도 좋다. 천연 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는 또한, 바람직하게는 170분자 이하, 보다 바람직하게는 140분자 이하라도 좋다.
한편, 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 유전자 재조합 페리틴인 경우, 유전자 재조합 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 100분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 유전자 재조합 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 바람직하게는 110분자 이상, 보다 바람직하게는 120분자 이상, 더욱 바람직하게는 130분자 이상, 더욱더 바람직하게는 140분자 이상, 특히 바람직하게는 150분자 이상이라도 좋다. 유전자 재조합 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는 또한, 바람직하게는 190분자 이하, 보다 바람직하게는 180분자 이하라도 좋다.
또는, 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, (a) 천연 페리틴, 또는 (b) 유전자 재조합 페리틴에 관계없이 규정할 수도 있다. 이러한 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 100분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는, 바람직하게는 110분자 이상, 보다 바람직하게는 120분자 이상, 더욱 바람직하게는 130분자 이상, 더욱더 바람직하게는 140분자 이상, 특히 바람직하게는 150분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 안트라사이클린계 물질의 수는 또한, 바람직하게는 190분자 이하, 보다 바람직하게는 180분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 히스타민 H2 수용체 길항약인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 히스타민 H2 수용체 길항약의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 히스타민 H2 수용체 길항약의 수는, 바람직하게는 20분자 이상, 보다 바람직하게는 30분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 히스타민 H2 수용체 길항약의 수는 또한, 바람직하게는 150분자 이하, 보다 바람직하게는 100분자 이하, 더욱 바람직하게는 50분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 비구아나이드계 물질인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 비구아나이드계 물질의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 비구아나이드계 물질의 수는, 바람직하게는 20분자 이상, 보다 바람직하게는 30분자 이상, 더욱 바람직하게는 40분자 이상, 더욱더 바람직하게는 50분자 이상, 특히 바람직하게는 60분자 이상, 또는 70분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 비구아나이드계 물질의 수는 또한, 바람직하게는 150분자 이하, 보다 바람직하게는 100분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 ATP 감수성 칼륨채널 개방약인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 ATP 감수성 칼륨채널 개구약의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 ATP 감수성 칼륨채널 개구약의 수는, 바람직하게는 20분자 이상, 보다 바람직하게는 30분자 이상, 더욱 바람직하게는 40분자 이상, 더욱더 바람직하게는 50분자 이상, 특히 바람직하게는 60분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 ATP 감수성 칼륨채널 개구약의 수는 또한, 바람직하게는 150분자 이하, 보다 바람직하게는 100분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 β2 아드레날린 수용체 작동약인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 β2 아드레날린 수용체 작동약의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 β2 아드레날린 수용체 작동약의 수는, 바람직하게는 20분자 이상, 보다 바람직하게는 30분자 이상, 더욱 바람직하게는 40분자 이상, 더욱더 바람직하게는 50분자 이상, 특히 바람직하게는 60분자 이상, 70분자 이상, 80분자 이상, 90분자 이상, 100분자 이상, 110분자 이상, 또는 120분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 β2 아드레날린 수용체 작동약의 수는 또한, 바람직하게는 150분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 이미다졸린계 물질인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 이미다졸린계 물질의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 이미다졸린계 물질의 수는, 바람직하게는 15분자 이상, 보다 바람직하게는 20분자 이상이라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 이미다졸린계 물질의 수는 또한, 바람직하게는 150분자 이하, 보다 바람직하게는 100분자 이하, 더욱 바람직하게는 50분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 비타민인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 비타민의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 비타민의 수는, 바람직하게는 150분자 이하, 보다 바람직하게는 100분자 이하, 더욱 바람직하게는 50분자 이하, 더욱더 바람직하게는 30분자 이하, 특히 바람직하게는 20분자 이하라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 유기 화합물이 표지 물질인 경우, 페리틴 1분자에 봉입되는 표지 물질의 수는, 10분자 이상 200분자 이하라도 좋다. 페리틴 1분자에 봉입되는 표지 물질의 수는, 바람직하게는 150분자 이하, 보다 바람직하게는 100분자 이하, 더욱 바람직하게는 50분자 이하, 더욱더 바람직하게는 30분자 이하, 특히 바람직하게는 20분자 이하라도 좋다.
페리틴에의 유기 화합물의 봉입 확인은, 페리틴 및 유기 화합물의 흡광도 피크의 측정에 의해 행할 수 있다.
페리틴 및 유기 화합물의 흡광도 피크의 측정에 대하여 설명한다. 우선, 인큐베이트 후의 완충액 중의 페리틴을 겔 여과 컬럼에 의해 정제한다. 이어서, 정제 후의 용출액에 대하여 페리틴의 흡광도 피크(280nm의 흡광도) 및 유기 화합물의 흡광도 피크(예를 들면, 독소루비신이면 480nm의 흡광도)를 동시 계측한다. 이때, 쌍방의 흡광도 피크의 용출 위치가 일치한다면, 유기 화합물이 페리틴에 봉입되어 있다고 판별할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하면, 유기 화합물이 페리틴의 표면에 흡착되는 것이 아니라, 페리틴의 내강에 재현 좋게 봉입되는 것이 확인되고 있기 때문에, 흡광도 피크의 용출 위치의 일치에 의해 유기 화합물이 페리틴에 봉입되어 있다고 생각할 수 있다.
페리틴에의 유기 화합물의 봉입 확인에서는, 다른 방법이 병용되어도 좋다. 이러한 다른 방법으로서는, 예를 들면, 페리틴의 표면 전하 및/또는 사이즈의 측정을 들 수 있다.
페리틴의 표면 전하의 측정에 대하여 설명한다. 인큐베이트 후의 완충액 중의 페리틴의 표면 전하(제타 전위)가, 유기 화합물의 봉입 처리가 되어 있지 않은 페리틴의 표면 전하와 동등하면, 유기 화합물이 페리틴의 표면에 흡착함으로써 복합화되어 있는 것은 아니라(즉, 유기 화합물이 페리틴에 봉입되어 있다)고 판별할 수 있다. 표면 전하의 측정은, 전기 영동 광산란법에 의해 행할 수 있다. 바람직하게는, 전기 영동 광산란법에 의한 측정은, 제타사이저 나노 ZS(말번사)를 사용하여 행할 수 있다. 페리틴의 표면 전하의 측정이 적합하게 이용되는 유기 화합물의 pKa는, 예를 들면, 1 내지 4(바람직하게는 1 내지 3), 및 6 내지 14(바람직하게는 7 내지 14)이다. 본 발명에서는, 이러한 pKa값을 갖는 유기 화합물을 사용하는 것도 또한 바람직하다.
페리틴의 사이즈 측정에 대하여 설명한다. 이 경우, 인큐베이트 후의 완충액 중의 페리틴의 사이즈가, 유기 화합물의 봉입 처리가 되어 있지 않은 페리틴의 사이즈(외경 약 12nm)와 동등한 것이 또한 확인되어도 좋다. 사이즈의 동등성은, 동적 광산란법에 의해 행할 수 있다. 바람직하게는, 동적 광산란법에 의한 측정은, 제타사이저 나노 ZS(말번사)를 사용하여 행할 수 있다.
페리틴에의 유기 화합물에 대한 봉입 분자수는, 이하과 같이 결정할 수 있다. (1) 인큐베이트 후의 완충액 중의 페리틴 및 유기 화합물을 분리한다(예, 탈염 컬럼의 사용). (2) 페리틴을 탈회합시키고(예, pH2.3으로 조정), 페리틴 중의 유기 화합물을 용액 중에 방출시킨다. (3) 용액 중의 유기 화합물의 농도(중량/체적)를, 흡광도에 기초하여 검량선에 의해 결정한다. (4) 용액 중의 페리틴의 농도(중량/체적)를, 표준적인 단백질 정량법(예, 소 알부민을 표준으로 하는 단백질 검정 CBB 용액의 사용)에 의해 결정한다. (5) 페리틴에의 유기 화합물의 도입률(유기 화합물과 페리틴의 총 중량에서 차지하는 유기 화합물의 중량)을 구한다. (6) 유기 화합물의 분자량을 사용하여, 용액 중의 유기 화합물의 농도(중량/체적)로부터 용액 중의 유기 화합물의 농도(몰/체적)를 결정한다. (7) 페리틴의 분자량을 사용하여, 용액 중의 페리틴의 농도(중량/체적)로부터 용액 중의 페리틴의 농도(몰/체적)를 결정한다. (8) 페리틴에의 유기 화합물의 도입수(페리틴의 1몰에서 차지하는 유기 화합물의 몰수)를 구한다.
본 발명은 또한, 특정한 유기 화합물 봉입 페리틴을 제공한다. 본 발명의 유기 화합물 봉입 페리틴에서는, 유기 화합물은 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 및 표지 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
페리틴 1분자에의 유기 화합물의 봉입 분자수가 이하이다:
(1) 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴 인 경우, 40분자 이상 200분자 이하;
(2) 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 유전자 재조합 페리틴인 경우, 100분자 이상 200분자 이하; 또는
(3) 유기 화합물이 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 또는 표지 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴 또는 유전자 재조합 페리틴 인 경우, 10분자 이상 200분자 이하.
바람직하게는, 본 발명의 유기 화합물 봉입 페리틴에서는, 유기 화합물은 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, 및 β2 아드레날린 수용체 작동약으로 이루어진 그룹으로부터 선택되어도 좋다.
본 발명의 유기 화합물 봉입 페리틴에서의 특정한 유기 화합물, 페리틴, 및 봉입 분자수 등의 구성 요소의 상세는 상기와 같다.
본 발명은 또한, 유기 화합물 봉입 페리틴을 포함하는 완충액을 제공한다. 본 발명의 완충액에서의 유기 화합물, 페리틴, 완충액, 및 봉입 분자수 등의 구성 요소의 상세는 상기와 같다.
실시예
다음으로 실시예를 게시하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하에서 사용한 약제(저분자)는 모두 유기 화합물이다. 또한, 완충액의 pH는, 유리 전극법에 의해 25℃에서 측정되는 값을 사용하였다.
<실시예 1: 페리틴의 조제>
인간 유래 페리틴 H쇄(FTH(서열번호 1)) 단량체를 코드하는 DNA를 전체 합성하였다. 전체 합성된 DNA를 주형으로 하여, 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열번호 3) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(서열번호 4)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 하여, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열번호 5) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열번호 6)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(다카라바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, FTH 단량체를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH)를 구축하였다.
이어서, 구축한 pET20-FTH를 도입한 에쉐리키아 콜라이 BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤(Bacto-typtone), 5g/l 박토-효모 추출물(Bacto-yeast extract), 5g/l NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양하였다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열하였다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)에서 염 농도 구배를 적용함으로써, FTH 단량체로 구성된 페리틴(이하, FTH 페리틴이라고 약기함)을 분리 정제하였다. 이 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환하였다. 이 용액을 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 FTH 페리틴을 분리 정제하였다. 이 FTH 페리틴을 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 함유 단백질 농도를 단백질 검정(protein assay) CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 결과, 5mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 용액 1ml를 얻을 수 있었다.
<실시예 2: pH 조건의 검토>
탈회합·재회합 프로세스를 거치지 않고, FTH 페리틴 내에 저분자를 도입하는 방법(원스텝 프로세스)을 확립하기 위해, pH 조건의 검토를 실시하였다.
50mM 완충액(pH3 내지 9) 0.1ml 중에, FTH 페리틴 및 독소루비신 하이드로클로라이드(DOX, CAS No. 25316-40-9, 분자량 579.98)의 최종 농도가 각각 1mg/ml와 0.1mg/ml가 되도록 혼합하고, 각각 25℃에서 60분간 방치하였다. 이 반응에 있어서, pH3, 4, 5 및 6에서는 아세트산 완충액, pH7, 8 및 9에서는 트리스염산염 완충액을 사용하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 0.1ml로 농축하고, 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 280nm 및 480nm의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도로부터, 각종 농도의 DOX나 FTH 페리틴의 280nm 및 480nm의 흡광도로 작성된 검량선으로 DOX와 FTH 페리틴 농도를 결정하였다. 이 농도를 바탕으로, 약제 도입률(DOX와 FTH 페리틴의 총 중량에서 차지하는 DOX의 중량)을 구하였다.
그 결과, pH6 이하에서는 약제 도입률 0.5%(wt) 이하이고, DOX가 약간 도입되어 있는 것이 시사되었다(도 1). 한편, pH7 이상에서는 pH의 상승과 함께, 약제 도입률이 상승하고, pH9에서는 약제 도입률 1%(wt) 이상이었다. 이상의 사실로부터, pH7 이상에서 FTH 페리틴에 DOX가 도입되어 있을 가능성이 시사되었다.
<실시예 3: 온도 조건의 검토>
탈회합·재회합 프로세스를 거치지 않고, FTH 페리틴 내에 저분자를 도입하는 방법(원스텝 프로세스)을 확립하기 위해, 온도 조건의 검토를 실시하였다.
50mM 트리스염산염 완충액(pH9) 0.1ml 중에, FTH 페리틴 및 독소루비신 하이드로클로라이드(DOX, cas 번호 25316-40-9, 분자량 579.98)의 최종 농도가 각각 1mg/ml와 0.1mg/ml가 되도록 혼합하고, 10℃ 내지 60℃에서 각각 60분간 방치하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 0.1ml로 농축하고, 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 280nm 및 480nm의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도로부터, 각종 농도의 DOX나 FTH 페리틴의 280nm 및 480nm의 흡광도로 작성된 검량선으로 DOX와 FTH 페리틴 농도를 결정하였다. 이 농도를 바탕으로, 약제 도입률(DOX와 FTH 페리틴의 총 중량에서 차지하는 DOX의 중량)을 구하였다.
그 결과, 20℃ 이상에서는 반응 온도의 상승과 함께 약제 도입률이 상승하고, 60℃에서는 약제 도입률 5%(wt) 이상이었다(도 2). 이러한 사실로부터, 실온 이상에서 효율적으로 FTH 페리틴 내에 DOX가 도입되어 있는 것이 시사되었다.
<실시예 4: 반응 시간의 검토>
탈회합·재회합 프로세스를 거치지 않고, FTH 페리틴 내에 저분자를 도입하는 방법(원스텝 프로세스)을 확립하기 위해, 반응 시간 조건의 검토를 실시하였다.
50mM 트리스염산염 완충액(pH9) 0.5ml 중에, FTH 페리틴 및 독소루비신 하이드로클로라이드(DOX, cas 번호 25316-40-9, 분자량 579.98)의 최종 농도가 각각 1mg/ml와 0.1mg/ml가 되도록 혼합하고, 60℃에서 5분간 내지 60분간 방치하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하였다. 이 용액에 최종 농도 100mM이 되도록 글리신염산염 완충액(pH2.3)을 첨가하고, 용량 0.2ml로 조정하였다. 여기서, pH2.3으로 함으로써 FTH 페리틴은 탈회합하고, FTH 페리틴 내에 도입된 DOX는 용액 중에 방출된다. 이 용액을 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 480nm의 흡광도를 측정하고, DOX의 농도를 결정하였다. 또한, 용액 중의 단백질 농도는 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 이 농도를 바탕으로, 약제 도입률(DOX와 FTH 페리틴의 총 중량에서 차지하는 DOX의 중량)을 구하였다.
그 결과, 방치 시간 30분까지는, 방치 시간과 함께 DOX 도입량의 상승이 확인되고, 페리틴 1g당 1.7mg-DOX/분의 속도로 DOX가 도입되어 있었다(도 3). 또한 30분 이후에는 약제 도입률에 큰 변화는 확인되지 않았다. 이때의 최대 약제 도입률은 5%(wt)이고, FTH 페리틴 1개당에 도입된 DOX 분자수는 평균 50개로 추정되었다.
<실시예 5: 반응액 중의 FTH 페리틴과 DOX 양비(량비)의 검토>
탈회합·재회합 프로세스를 거치지 않고, FTH 페리틴 내에 저분자를 도입하는 방법(원스텝 프로세스)을 확립하기 위해, 양비 조건의 검토를 실시하였다.
최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH9) 0.5ml 중에, 최종 농도가 0.05mg/l 내지 0.5mg/l가 되도록 독소루비신 하이드로클로라이드(DOX, cas 번호 25316-40-9, 분자량 579.98)을 혼합하고, 60℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하였다. 이 용액에 최종 농도 100mM이 되도록 글리신염산염 완충액(pH2.3)을 첨가하고, 용량 0.5ml로 조정하였다. 이 용액을 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 480nm의 흡광도를 측정하고, DOX의 농도를 결정하였다. 또한, 용액 중의 단백질 농도는 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 이 농도를 바탕으로, 약제 도입률(DOX와 FTH 페리틴의 총 중량에서 차지하는 DOX의 중량)을 구하였다.
그 결과, FTH 페리틴과 DOX의 농도비가 10:3까지는, 농도비화 함께 DOX 도입량의 상승이 확인되고, 최대 약제 도입률 16%(wt)로 되어 있었다(도 4). 이때의 FTH 페리틴 1개당에 도입된 DOX의 평균 분자수는 165개로 추정되었다. 한편, FTH 페리틴과 DOX의 농도비가 10:4에서는 도입량이 저하되고, 10:5에서는 단백질을 회수할 수 없었다. 이것은, 고농도역에서 DOX이 석출되고, 이 DOX 침전과 함께 FTH 페리틴도 침전했기 때문이라고 생각되었다.
이때, 선행 지견(Journal of Controlled Release 196 (2014) 184-196, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 111(41): 14900-5)에 보고된 데이터로부터 계산된 종래법에서의 페리틴 내에의 약제 도입률은 3%(wt) 내지 4%(wt)이고, 이번의 수법은 종래법보다 4 내지 5배 이상 많은 약제를 도입할 수 있었다. 또한, 이미 판매되고있는 독소루비신 봉입 리포솜인 독실(승인번호: 21900AMX00001000)의 약제 도입률은 11%(wt)이고, 이번의 수법은 독실보다 1.4배 이상 많은 약제를 도입할 수 있었다.
<실시예 6: DOX 봉입 FTH 페리틴의 분산성>
원스텝 프로세스로 얻어진 저분자 봉입 FTH 페리틴이 실제로 저분자를 봉입하고 있는 것을 확인하였다.
최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH9) 1ml 중에, 최종 농도가 0.1mg/l가 되도록 DOX를 혼합하고, 60℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하였다. 마찬가지로 조제된 5ml분의 DOX 봉입 FTH 페리틴을 포함하는 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)을 혼합하고, 추가로 한외 여과에 의해 용량 1ml로 하고, 이 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 분리 정제하면서 280nm의 흡광도과 480nm의 흡광도를 동시에 계측하였다.
그 결과, DOX을 함유하지 않는 FTH 페리틴과 같은 용출 위치에 DOX 유래로 추정되는 480nm의 흡광도 피크가 관찰되고, DOX와 FTH 페리틴은, 한외 여과에 의한 희석 세정이나 겔 여과 컬럼에서는 분리할 수 없을 정도로 강고하게 복합화되어 있는 것을 알 수 있었다(도 5).
이 DOX-FTH 페리틴 복합체의 용액 분산성는 제타사이저 나노 ZS(말번사)에서도 측정되었기 때문에, 이 DOX-FTH 페리틴 복합체는, 야생형 FTH 페리틴과 동등한 직경 12nm의 수용액 분산성 나노 입자임을 확인할 수 있었다(도 6). 이 측정은, DOX-FTH 페리틴 복합체를 FTH 페리틴량으로서 1mg/ml를 포함하는 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0) 50μl를 ZEN0040셀에 넣고, 물질(Material) 설정(RI: 1.450, 흡광도: 0. 001), 분산제 설정(온도: 25℃, 점도: 0.8872cP, RI: 1.330, 유전 상수(Dielectric constant): 78.5), Mark-Houwink 파라미터(A 파라미터: 0.428, K 파라미터: 7.67×10-5cm2/s), 측정 각도는 173°역산란기(Backscatter)로 25℃에서 행하였다.
<실시예 7: DOX 봉입 FTH 페리틴의 표면 전하>
원스텝 프로세스로 얻어진 저분자 약제 봉입 FTH 페리틴에 의한 저분자 약제의 봉입을, 표면 전하의 평가에 의해 확인하였다.
최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH8) 1ml 중에, 최종 농도가 0.3mg/l가 되도록 DOX를 혼합하고, 40℃에서 60분간 방치하였다. 방치 및 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 1ml의 물에 현탁한 DOX와 FTH 페리틴의 복합체를 얻었다.
이어서, 이 DOX-FTH 페리틴 복합체를 최종 농도 50mM의 인산 완충액(pH3, 6 또는 7), 아세트산 완충액((pH4 또는 5), 트리스염산염 완충액(pH8 또는 9), 또는 탄산나트륨 완충액(pH10))에 각각 FTH 페리틴량으로서 최종 농도 0.1g/l가 되도록 현탁하고, 이 완충액 중, 25℃에서의 표면 전하를 제타사이저 나노 ZS(말번사)로 측정하였다. 측정은, 샘플 750μl를 DTS1070셀에 넣고, 물질 설정(RI: 1.450, 흡광도: 0.001), 분산제 설정(Temperature: 25℃, 점도: 0.8872cP, RI: 1.330, 유전 상수: 78.5), 스모루코우스키 모델(Smoluchowski model)(Fκa value: 1.50)로 행하였다. 그 결과, DOX 봉입 처리되어 있지 않은 FTH 페리틴과 DOX-FTH 페리틴 복합체의 표면 전하는 동등하고, FTH 페리틴 표면에 DOX가 흡착함으로써 복합화되어 있는 것은 아니라는 것을 알 수 있었다(도 7).
즉, DOX와 FTH 페리틴을 수용액 중에 방치하여 원스텝에서 얻어진 이 DOX-FTH 페리틴 복합체의 표면 전하는 FTH 페리틴과 동등하고, FTH 페리틴 표면에 염기성 DOX가 흡착되어 있는 것이 아니라, FTH 페리틴의 내부에 DOX가 봉입되어 있는 구조를 취하고 있다고 생각되었다.
<실시예 8: DOX 봉입 FTH 페리틴의 안정성 평가>
원스텝 프로세스으로 얻어진 저분자 약제 봉입 FTH 페리틴의 안정성을 평가하였다.
최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH8) 1ml 중에, 최종 농도가 0.3mg/l가 되도록 DOX를 혼합하고, 40℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 1ml의 물에 현탁한 DOX와 FTH 페리틴의 복합체를 얻었다. 그리고, 이 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다.
이 DOX-FTH 페리틴 복합체를 함유 단백질 농도로서 최종 농도 1.5g/l가 되도록, 최종 농도 50mM 아세트산 완충액(pH4), 50mM 인산 완충액(pH6), 50mM 트리스염산염 완충액(pH9), 또는 D-PBS(-)(pH7.4 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제조)에 각각 현탁하고, 각 0.1ml를 냉암소(4 ℃)에서 보관하였다. 그 후, 며칠 간격으로 각 조건의 샘플을 3개씩 회수하고, Vivaspin 500-100K(GE healthcare사)로 DOX-FTH 페리틴 복합체와 완충액을 분리하였다. 각각 480nm의 흡광도를 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 측정하고, 완충액 중에 유출하지 않고, DOX-FTH 페리틴 복합체에 유지되어 있는 DOX의 양을 정량하였다.
그 결과, 2주간 이상 방치한 후에도, pH6 내지 pH9의 완충액 중에 보관된 DOX-FTH 페리틴 복합체으로부터는 거의 DOX가 유출되지 않는 것을 알 수 있었다(도 8, 평균값±표준 편차). 한편, pH4에서는 방치 직후, 30%(wt) 정도의 DOX가 유출되지만, 그 후의 유출은 작아졌다. 즉, DOX-FTH 페리틴 복합체는, 적절한 pH 조건 하에서는 안정적으로 유지되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 9: FTH 페리틴 중의 DOX 상태의 추정>
페리틴은 직경 12nm의 바구니상을 하고 있고, 그 내부 공강의 직경은 7nm이다. 이상적으로는, 내강의 용적은 0.18zl(zl: Zepto little, 10의 -21승 리터)이다. 만약 1분자의 DOX(분자량 579.98)가 페리틴의 내강에 존재한 경우, DOX의 페리틴 내강에서의 농도는 5.4g/l가 된다. DOX의 실온에서의 물에 대한 용해성은 60g/l 이상인 것을 확인할 수 있었다. 이번에, 최대 FTH 페리틴 1개당 165개의 DOX 분자가 도입되어 있고, 이때의 DOX의 페리틴 내강에서의 농도는 890g/l가 된다. 이 농도는 실온에서의 DOX의 물 용해도를 크게 상회하고, 페리틴 내강에서 석출, 나노 입자를 형성하고 있을 가능성이 높다. 이 때문에, 페리틴에 도입된 DOX의 정량에는 한번 페리틴을 탈회합하고, DOX를 방출시킨 후에, 분광 평가할 필요가 있다.
<실시예 10: 원스텝 프로세스와 탈회합·재회합 프로세스의 비교(1)>
원스텝 프로세스와 탈회합·재회합 프로세스에서 각각 얻어지는 DOX 봉입 FTH 페리틴의 DOX 봉입량을 비교하였다.
탈회합·재회합 프로세스에서는, 최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴과 최종 농도 0.2mg/l의 DOX를 포함하는 50mM 글리신염산염 완충액(pH2.3) 0.5ml를, 실온에서 5분간 내지 120분간 방치하였다. 그 후, 1M의 트리스염산염 완충액(pH9.0) 10μl를 첨가하여 중화하고, 5분간 내지 120분간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 0.1ml로 농축하고, 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 280nm 및 480nm의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도로부터, 각종 농도의 DOX나 FTH 페리틴의 280nm 및 480nm의 흡광도로 작성된 검량선으로 DOX와 FTH 페리틴 농도를 결정하였다. 이 농도를 바탕으로, 약제 도입률(DOX와 FTH 페리틴의 총 중량에서 차지하는 DOX의 중량)을 구하였다.
그 결과, 15분 방치된 FTH 페리틴에서 가장 높은 약제 도입률이 확인되었지만, 2%(wt) 정도였다(도 9). 한편, 최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴과 최종 농도 0.2mg/l의 DOX를 시용한 원스텝 프로세스에서 얻어지는 DOX 봉입 FTH 페리틴의 약제 도입률은 그 5배 높았다(도 4). 따라서, 원스텝 프로세스에 의해, 보다 높은 약제 봉입률을 가진 FTH 페리틴을 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 11: 원스텝 프로세스와 탈회합·재회합 프로세스의 비교(2)>
원스텝 프로세스와 탈회합·재회합 프로세스에서 각각 얻어지는 FTH 페리틴의 회수율을 비교하였다.
원스텝 프로세스에서는, 10mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH9) 0.1ml를, 60℃에서 60분간 방치하였다. 그 후, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0) 2.9ml를 첨가하고, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 크기에 따라 분리 정제하면서 280nm의 흡광도를 계측하였다.
탈회합·재회합 프로세스에서는, 10mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 50mM 글리신염산염 완충액(pH2.3) 0.1ml를, 실온에서 15분간 방치함으로써 FTH 페리틴을 단량체에 탈회합시켰다. 그 후, 1M의 트리스염산염 완충액(pH9.0) 10μl를 첨가하여 중화하고, 15분간 실온 방치함으로써 FTH 페리틴을 재회합시켰다. 그 후, 10mM의 트리스염산염 완충액(pH8.0) 2.9ml를 첨가하고, 10mM의 트리스염산염 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 분리 정제하면서 280nm의 흡광도를 계측하였다.
또한, 대조군으로서, 60℃ 방치나 탈회합·재회합 처리를 행하지 않은 등량의 FTH 페리틴도 10mM의 트리스염산염 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 분리 정제하면서 280nm의 흡광도를 계측하였다.
그 결과, 60℃에서 60분간 방치되는 원스텝 프로세스로 얻어진 FTH 페리틴의 회수율은 미처리 FTH 페리틴의 97%였다. 한편, 탈회합·재회합 프로세스로 얻어진 FTH 페리틴의 회수율은 미처리 FTH 페리틴의 72%이고, 재회합할 수 없었던 FTH 페리틴 단량체도 용출 후반에 확인할 수 있었다.
이상의 사실로부터, FTH 페리틴의 초분자 구조를 적극적으로 파괴하지 않는 원스텝 프로세스는, FTH 페리틴의 초분자 구조를 한번 파괴하는 탈회합·재회합 프로세스과 비교하여, 현저하게 처리 후 회수되는 FTH 페리틴량이 많아, 효율적인 수법인 것을 알 수 있었다(도 10).
<실시예 12: 원스텝 프로세스에 의한 저분자 약제 도입(1)>
원스텝 프로세스로 각종의 저분자를 FTH 페리틴 내에 도입하였다.
　이번에 도입된 저분자 약제를 표 1에 나타낸다. 최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 최종 농도 50mM 인산 완충액(pH3, 6 또는 7), 아세트산 완충액(pH4 또는 5), 트리스염산염 완충액(pH8 또는 9), 또는 탄산나트륨 완충액(pH10)에, 최종 농도가 0.2mM 내지 5mM이 되도록 각종 저분자 약제를 혼합하고, 20℃ 내지 60℃에서 60분간 각각 방치하였다. 모든 반응은 용량 0.1ml로 반응시켰다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)하고, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공함으로써, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 0.1ml로 농축하였다.
또한 대조군으로서, 표 1에 나타낸 일부의 저분자 약제의 탈회합·재회합 프로세스에서의 페리틴 내에의 도입도 행하였다. 즉, 최종 농도 1mg/ml의 FTH 페리틴과 최종 농도 0.2mg/l의 각종 저분자 약제를 각각 포함하는 50mM 글리신염산염 완충액(pH2.3) 0.5ml를, 실온에서 15분간 방치하였다. 그 후, 1M의 트리스염산염 완충액(pH9.0) 10μl를 첨가하여 중화하고, 15분간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 0.1ml로 농축하였다.
[표 1]
Figure pct00002
이들 용액의 흡광도를 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 측정하는 동시에, 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 로다민 B와 콩고 레드는 280nm와 480nm의 흡광도, 파모티딘, 메트포르민, 미녹시딜, 테르부탈린, 크레아티닌, 니?A틴아미드, 리보플라빈 및 티아민은 250nm와 280nm의 흡광도를 측정하였다. 그 후, 단백질 검정 CBB 용액으로 정량된 단백질 함유량으로부터 추정되는 단백질 유래의 흡광도로 보정한 후, 각 분자의 흡광도로 작성된 검량선으로 저분자 약제의 농도를 결정하였다.
원스텝 프로세스에서의 각 저분자 약제의 도입 조건(반응 pH, 반응 온도 및 반응 시간)과 봉입수(페리틴 24량체의 1 바구니당에 봉입된 저분자의 수), 도입률(저분자와 페리틴의 총 중량에서 차지하는 저분자의 중량, 중량%)을 표 2, 3에 나타낸다. 그 결과, 분자량이나 pKa 등의 물성이 다른 각종 저분자 약제도 원스텝 프로세스로 간편하게 페리틴 내에 도입할 수 있었다.
[표 2]
Figure pct00003
[표 3]
Figure pct00004
또한, 각 저분자 약제의 pKa와 가장 페리틴 내에 도입량이 많았던 반응에서 사용한 완충액 pH와의 관계를 표 4, 5에 나타낸다. 이들의 상관관계를 도 11에 나타낸다. 이 상관 계수는 0.84로 우위에 양의 상관이 있었다(t- 검정, p<1%). 그리고, pKa가 중성(pH7)보다 낮은 분자는 산성 조건(pH6 이하), pKa가 중성보다 높은 분자는 약산성 조건에서부터 알칼리성 조건(pH6 이상)에서, 효율적으로 페리틴 내에 도입되는 것이 시사되었다.
[표 4]
Figure pct00005
[0141]
[표 5]
Figure pct00006
또한, 원스텝 프로세스에서 페리틴 내에 도입된 저분자 약제의 양과 탈회합·재회합 프로세스에서 페리틴 내에 도입된 저분자 약제의 양을 비교하였다. 도 12는 원스텝 프로세스에서의 약제 도입량과 탈회합·재회합 프로세트에서의 약제 도입량의 비를 나타낸다. DOX의 도입량 비교는, 실시예 5와 실시예 10을 사용하여 계산하였다. 어느 저분자 약제의 경우에도, 원스텝 프로세스의 쪽이 많은 약제를 페리틴 내에 도입할 수 있고, 도입량의 차이가 가장 작았던 메트포르민에서도 2.5배, 도입량의 차이가 가장 컸던 DOX에서는 30배의 차이를 확인할 수 있었다. 탈회합·재회합 프로세스에서는, 페리틴이 재회합할 때에, 반응액 중의 저분자을 감아넣어 봉입시키기 때문에, 반응액 중의 저분자 이상의 농도에서의 봉입은 어렵다. 또한, 산성 조건 하에서 페리틴 단량체에 탈회합시킬 때에, 페리틴 단량체 구조가 일부 변성하고, 재회합 후에도 내부의 약제가 누출될 위험이 있다.
한편, 원스텝 프로세스에서는 페리틴의 초분자 구조가 유지 가능한 환경 하에서, 약제를 페리틴 내부에 도입할 수 있다. 따라서, 반응 종료 후에도 페리틴 자체에 대한 대미지는 적고, 누출도 거의 없다고 생각된다. 페리틴의 초분자 구조가 유지된 채 다양한 약제가 도입되었기 때문에, 페리틴에의 약제 도입은, 금속 이온과 마찬가지로, 3회 대칭 채널을 통과하여 행하여지고 있는 것으로 추정된다(T Douglas and DR Ripoll Protein Sci, 7, 1083-1091(1998), MA Carrondo EMBO J. 22, 1959-1968(2003)). 이유로서, 채널 이외의 페리틴의 구조는 타이트하고 금속 이온조차 통과할 수 없다고 생각하고 있고, 그보다도 배제 체적이 큰 유기 분자는 통과할 수 없다고 생각된다. 그리고, 중성의 완충액 하에서, 3회 대칭 채널은 음으로 대전하고 있고, 이 정전 구배에 의한 금속 이온의 유입과 마찬가지로, 유기 분자도 페리틴 내부에 능동적으로 도입되고, 음으로 대전한 페리틴 내부에 축적되기 때문에, 반응액 중의 저분자 이상의 농도에서의 봉입이 가능해졌다고 생각된다. 또한, 음으로 대전한 페리틴 표면의 구멍으로부터, 그 정전 구배에 의해 내부에 도입된다면, 아미노기를 많이 갖고 양으로 대전하기 쉬운 유기 분자의 쪽이 보다 도입하기 쉬운 것으로 추정된다.
이 사실로부터, 원스텝 프로세스는 종래의 탈회합·재회합 프로세스보다 많은 약제를 도입할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 13: DOX 봉입 변이형 FTH 페리틴의 구축(1)>
원스텝 프로세스를 사용하여, 펩티드 앱타머를 제시한 페리틴에의 약제 도입을 행하였다.
먼저, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역에 티타늄 인식 펩티드(minTBP1: RKLPDA(서열번호 7))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-BC-TBP) 단량체를 코드하는 DNA를 전체 합성하였다. 전체 합성된 DNA를 주형, 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열번호 8) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(서열번호 9)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 또한, pET20(머크사)을 주형, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열번호 10) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열번호 11)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 이들 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(다카라바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, FTH-BC-TBP 단량체를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-BC-TBP)를 구축하였다. FTH-BC-TBP 단량체로 구성된 페리틴을, 필요에 따라 FTH-BC-TBP 페리틴이라고 약기한다.
[0146]
또한, 인간 유래 페리틴 H쇄 단량체를 코딩하는 DNA가 탑재된 pET20-FTH를 주형으로 하여, 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열번호 12) 및 5'-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG-3'(서열번호 13)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, 제한 효소 DpnI과 BamHI(다카라바이오사)로 처리하고, 셀프 라이게이션함으로써, C 말단에 시스테인이 부여된 FTHc 단량체를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTHc)를 구축하였다. FTHc 단량체로 구성된 페리틴을, 필요에 따라 FTHc 페리틴이라고 약기한다.
이어서, 구축한 변이 페리틴 단량체(FTH-BC-TBP 단량체, 또는 FTHc 단량체)가 탑재된 벡터 pET20-FTH-BC-TBP 또는 pET20-FTHc를 각각 도입한 에쉐리키아 콜라이 BL21(DE3)을 각각 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양하였다. 얻어진 각 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열하였다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM 내지 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)에서 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제하였다. 이 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환하였다. 이 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 각 변이 페리틴을 분리 정제하였다. 이 각 변이 페리틴을 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 각각 농축하고, 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 결과, 0.2mg/ml의 FTH-BC-TBP 페리틴을 포함하는 용액 1ml와 5mg/ml의 FTHc 페리틴을 포함하는 용액 1ml를 각각 얻을 수 있었다.
최종 농도 1mg/ml의 각 변이 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH8) 1ml 중에, 최종 농도가 0.3mg/l가 되도록 DOX를 혼합하고, 50℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 1ml의 물에 현탁한 DOX와 각 변이 페리틴의 복합체를 얻었다. 그리고, 이 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 또한, DOX 농도를 480nm의 흡광 분석에 의해 결정하였다.
그 결과, 어느 변이 페리틴에나 DOX를 도입할 수 있었다. 이때의 약제 도입률은, FTH-DE-TBP 페리틴은 6.5%(wt), FTHc 페리틴은 8.6%(wt)였다. 즉, 펩티드가 삽입되어 기능화된 페리틴에서도 원스텝 프로세스를 사용하여 약제를 도입할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 14 : DOX 봉입 변이형 FTH의 구축(2)>
원스텝 프로세스를 사용하여, 펩티드 앱타머를 제시한 페리틴에의 약제 도입을 행하였다.
먼저, 페리틴 단량체의 N 말단에 암 인식 펩티드(HER2a: MARSGL(서열번호 14); M Houimel et.al., Int. J. Cancer 92, 748-755(2001))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(HER2a-FTH) 단량체를 코드하는 DNA를 얻기 위해, 인간 유래 페리틴 H쇄 단량체를 코딩하는 DNA가 탑재된 pET20-FTH를 주형으로 하여, 5'-TTTCATATGGCACGTAGTGGTTTAACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열번호 15) 및 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열번호 16)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, 제한 효소 DpnI과 NdeI(다카라바이오사)로 처리하고, 셀프 라이게이션함으로써, HER2a-FTH를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-HER2a-FTH)를 구축하였다. HER2a-FTH 단량체로 구성된 페리틴을, 필요에 따라 HER2a-FTH 페리틴이라고 약기한다.
페리틴 단량체의 C 말단에 RNA 인식 펩티드(U2AF: TRQARR(서열번호 17) R Tan and AD Frankel, Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5282-5286(1995)))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-U2AF)를 코드하는 DNA를 얻기 위해, 인간 유래 페리틴 H쇄 단량체가 코딩하는 DNA가 탑재된 pET20-FTH를 주형으로 하여, 5'-TTTGGATCCTTATCTGCGTGCTTGACGTGTGCTTTCATTATCACTG-3'(서열번호 18) 및 5'-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG-3'(서열번호 13)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, 제한 효소 DpnI과 NdeI(다카라바이오사)로 처리하고, 셀프 라이게이션함으로써, FTH-U2AF 단량체를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-U2AF)를 구축하였다. FTH-U2AF 단량체로 구성된 페리틴을, 필요에 따라 FTH-U2AF 페리틴이라고 약기한다.
이어서, 구축한 변이 페리틴 단량체(HER2a-FTH 단량체, 또는 FTH-U2AF 단량체)가 탑재된 pET20을 도입한 에쉐리키아 콜라이 BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양하였다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열하였다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM 내지 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)에서 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제하였다. 이 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환하였다. 이 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 각 변이 페리틴을 분리 정제하였다. 이 각 변이 페리틴을 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 결과, 0.8mg/ml의 HER2a-FTH 페리틴을 포함하는 용액 1ml와 1.1mg/ml의 FTH-U2AF 페리틴을 포함하는 용액 1ml를 각각 얻을 수 있었다.
최종 농도 1mg/ml의 각 변이 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH9) 1ml 중에, 최종 농도가 0.3mg/l가 되도록 DOX를 혼합하고, 50℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 1ml의 물에 현탁한 DOX 변이 페리틴의 복합체를 얻었다. 그리고, 이 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 또한, DOX 농도를 480nm의 흡광도 분석에 의해 결정하였다.
그 결과, 어느 페리틴에나 DOX를 도입할 수 있었다. 이때의 약제 도입률은, HER2a-FTH 페리틴은 14.6%(wt), FTH-U2AF 페리틴은 17.9%(wt)였다. 즉, 펩티드가 삽입되어 기능화된 페리틴에서도 원스텝 프로세스를 사용하여 약제를 도입할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 15: FTH 페리틴 구조의 pH 의존성>
페리틴의 바구니상 구조의 pH 의존적인 변화를 조사하기 위해, FTH 페리틴을 최종 농도 1mg/ml가 되도록 각 pH의 용액에 현탁하여 25℃에서 30분 방치한 후, 제타사이저 나노 ZS를 사용한 동적 광산란(DLS)법으로 각 pH에서의 페리틴의 사이즈를 측정하였다. 측정은 25℃에서 실시되었다. 사용된 용액은 0.1N HCl(pH1.7), 20mM 인산(pH2.6, pH3.2, pH5.6, pH6.7, pH7.7), 20mM 아세트산(pH4.2, pH4.9, pH5.3), 1mM NaOH(pH11.1), 10mM NaOH(pH12.3) 및 100mM NaOH(pH12.8)을 사용하였다. 또한, pH2.0 내지 pH2.4의 용액은 10mM TrisHCl에 HCl을 적하하여 pH를 조제하였다.
그 결과, pH1.7 내지 pH2.4의 범위에서는, DLS에서의 평균 입경은 8nm 이하로, 페리틴이 탈회합하고, 바구니상 구조가 파괴되어 있는 것이 시사되었다(도 13). 한편, pH2.6 내지 pH12.8에서의 평균 입경은 11nm 이상이고, 바구니상 구조가 유지되어 있는 것을 알 수 있었다. 즉, 이번의 원포트법에서는, 바구니상 구조가 유지된 조건에서 약제를 페리틴 내부에 도입할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 16: DOX 봉입 FTL 페리틴의 구축>
원스텝 프로세스를 사용하여 L쇄 페리틴에의 약제 도입을 행하였다. 인간 유래 페리틴 L쇄(FTL(서열번호 2)) 단량체를 코드하는 DNA를 전체 합성하였다. 전체 합성된 DNA를 주형으로 하여, 5'-GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG-3'(서열번호 234) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTGAGAGTGAG-3'(서열번호 235)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 하여, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열번호 5) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열번호 6)를 프라이머로서 PCR을 행하였다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(다카라바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, FTL 단량체를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTL)를 구축하였다.
이어서, 구축한 pET20-FTL을 도입한 에쉐리키아 콜라이 BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양하였다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열하였다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM 내지 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)에서 염 농도 구배를 적용함으로써, FTL 단량체로 구성된 페리틴(이하, FTL 페리틴이라고 약기함)을 분리 정제하였다. 이 FTL 페리틴을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환하였다. 이 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 FTL 페리틴을 분리 정제하였다. 이 FTL 페리틴을 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 결과, 3mg/ml의 FTL 페리틴을 포함하는 용액 1ml를 각각 얻을 수 있었다.
최종 농도 1mg/ml의 각 변이 FTL 페리틴을 포함하는 50mM 트리스염산염 완충액(pH8) 1ml 중에, 최종 농도가 0.3mg/l가 되도록 DOX를 혼합하고, 50℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 농축하고, 1ml의 물에 현탁한 DOX와 FTL 페리틴의 복합체를 얻었다. 그리고, 이 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 또한, DOX 농도를 480nm의 흡광도 분석에 의해 결정하였다.
그 결과, FTL 페리틴에 DOX를 도입할 수 있었다. 이때의 약제 도입률은 7.0%(wt)였다. 즉, FTL 페리틴에서도 원스텝 프로세스에 의해 약제를 도입할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 17: 원스텝 프로세스에 의한 저분자 약제 도입(2)>
원스텝 프로세스에 의해, 음으로 대전하는 관능기를 가진 우라닌(Cas no. 518-47-8, 분자량 376, pKa=2.2, 4.4, 6.7)을 FTH 내에 도입하였다.
최종 농도 3mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 최종 농도 50mM의 인산 완충액(pH3 또는 7), 또는 아세트산 완충액(pH5)에, 최종 농도가 300mM이 되도록 우라닌을 혼합하고, 30℃ 또는 60℃에서 60분간 각각 방치하였다. 모든 반응은 용량 1ml로 반응시켰다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)하고, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공함으로써, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하고, 샘플 용액 3.5ml를 얻었다. 이들 용액의 430nm의 흡광도를 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 측정하여 우라닌의 농도를 결정하는 동시에, 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다.
그 결과를 표 6에 나타낸다. 이번 우라닌의 pKa 평균값 4.4로 예측되는 반응 pH의 최적값은 pH5 전후이고, 실제로, 60℃, pH3과 pH5에서 효율적으로 페리틴 내에 도입할 수 있었다.
[표 6]
Figure pct00007
또한, 대조군으로서, 우라닌을 탈회합·재회합 프로세스에서 페리틴 내로 도입하였다. 즉, 최종 농도 5mg/ml의 FTH 페리틴과 최종 농도 1mM 내지 300mM에서 각각 포함하는 50mM 글리신염산염 완충액(pH2.3) 0.5ml를, 실온에서 15분간 방치하였다. 그 수, 1M의 트리스염산염 완충액(pH9.0) 10μl를 첨가하여 중화하고, 15분간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 물 0.5ml를 첨가하고, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 이 용액 전량(3.5ml)을 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과로 0.1ml에 농축하였다.
그 결과, 반응액 중의 우라닌이 100mM의 경우에 가장 효율적인 내포이 확인되었다(표 7). 원스텝과 탈회합·재회합 프로세스에서 각각 얻어진 우라닌 내포 FTH 페리틴의 우라닌 내포량을 비교한 결과, 원스텝으로 구축된 샘플 쪽이 2.7배 많은 우라닌을 내포하고 있고, 원스텝에서 보다 효율적인 약제 내포이 실현되고 있는 것이 시사되었다.
[표 7]
Figure pct00008
<실시예 18: 원스텝 프로세스에서 구축된 색소 내포 페리틴의 안정성>
원스텝 프로세스에서 구축된 우라닌 내포 FTH 페리틴의 혈장 중에서의 안정성을 평가하였다. 먼저, 인간 혈장(혈액 응고 시험용 표준 인간 혈장, GCH-100A, SIEMENS, 시스멕스 판매. Lot503264B) 40ul 중, 최종 농도 1mg/ml의 우라닌 내포 FTH 페리틴으로서, 37℃에서 차광 정치하였다. 반응 개시 직후, 24시간 또는 48시간 방치 후에 각각 3개씩 회수하고, 곧 바로 냉장 보존하였다. 얻어진 각 샘플을 물로 5배 희석하고, 겔 여과 컬럼 분석으로 FTH 페리틴과 혈장 단백질을 분리하면서, 430nm의 분광을 측정하고, FTH 페리틴 내의 우라닌을 정량하였다. 겔 여과 컬럼 분석의 조건으로서, Superdex200 increase(GE 헬스케어사)와 PBS(pH7.4)를 사용하고, 유속 0.8ml/분을 사용하였다.
그 결과, 내포된 우라닌 중 94%가 48시간 후에도 FTH 페리틴 내에 내포되어 있고, 우라닌 내포 FTH 페리틴이 혈장 중에서 안정적인 것을 알 수 있었다(도 14).
<실시예 19: 원스텝 프로세스로 구축된 색소 내포 페리틴의 세포 도입>
페리틴은 트랜스페린 수용체(TfR) 의존적으로 세포 내로 수송되는 것으로 알려져 있다. 원스텝 프로세스로 구축된 약물 내포 페리틴의 세포 내 이행성을 평가하기 위해, 우라닌을 모델 화합물로 하여, 우라닌 내포 FTH 페리틴의 세포 내 도입 활성을 평가하였다.
최종 농도 3mg/ml의 FTH 페리틴을 포함하는 최종 농도 50mM의 아세테이트 완충액(pH5) 2ml에, 최종 농도가 100mM이 되도록 우라닌을 혼합하고, 40℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 원심 분리(15,000rpm, 1분간)하고, 상청을 10mM 트리스염산염 완충액(pH8)으로 평형화된 탈염 컬럼 PD-10(Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공함으로써, 봉입되지 않은 약제와 단백질을 분리하였다. 얻어진 샘플 용액 3.5ml를, PBS로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR에 제공하고, PBS로, 유속 0.5ml/분에서 우라닌 내포 FTH 페리틴을 용출 정제하였다. 정제 후, Vivaspin20-100k(GE 헬스케어사)를 사용한 한외 여과에 의해 농축된 우라닌 내포 FTH 페리틴의 430nm의 흡광도를 분광 광도계(DU-800, 벡크만쿨터사)로 측정하여 우라닌의 농도를 결정하는 동시에, 함유 단백질 농도를 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로 하여 결정하였다. 그 결과, 용액 우라닌을 569μM, 및 FTH 페리틴을 6.7μM 함유하는 우라닌 내포 FTH 페리틴 수용액 1ml를 얻었다.
평가용 배지(Opti-MEMTM(Thermo Fisher Scientific사)+1% 비필수 아미노산 용액(Thermo Fisher Scientific사)+1% 페니실린-스트렙토마이신(나카라이 테스크사))에 우라닌 내포 FTH 페리틴의 최종 농도가 0nM(우라닌 농도 0μM) 내지 800nM(우라닌 농도 67.9μM)이 되도록 각각 첨가된 배지 100μl 중에서, 인간 유방암 유래인 SKBR-3 세포(20,000 세포/웰, 96-웰 플레이트)에 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 이 SKBR-3 세포는 트랜스페린 수용체 TfR이 발현되어 있다. 각각 24시간 배양 후, 인산 완충 생리 식염수 100μl로 2회 세정하고, 트립신-EDTA(Sigma-Aldrich사) 50μl 중에서 37℃, 10분간 방치하였다. 그 후, Opti-MEMTM 배지 100μl를 첨가하고, 형광 활성화 셀 소팅(FACS)용 플레이트에 세포를 옮겨 400xg, 5분간 원심 분리하였다. 각 세포를 FACS용 완충액(AttuneTM Focusing Fluid, Thermo Fisher Scientific사)에 현탁하고, FACS(Attune NxT, Thermo Fisher Scientific사)로 분석하였다.
그 결과, 우라닌 내포 FTH 페리틴 농도 의존적인 형광 강도의 변화가 확인되고, 농도 의존적으로 세포에의 도입량이 증가하고 있는 것이 시사되었다(도 15).
같은 조건으로 조정된 세포를 이광자 여기 형광 현미경(CQ-1, 요코가와덴키 가부시키가이샤)으로 관찰한 결과, 농도 의존적인 우라닌 내포 FTH 페리틴 세포에의 도입을 확인할 수 있었다(도 16).
이상의 결과로, 약물을 내포한 페리틴은 천연형 페리틴과 마찬가지로, 세포 내로의 수송 능력을 가진 것이 시사되었다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 방법은, 예를 들면, 신규 약물 송달계(DDS)로서 기대되는, 또는 전자 디바이스의 제작에 이용되는 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조에 유망하다. 예를 들면, 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질에서의 페리틴 단량체가 인간 페리틴 단량체인 경우, 본 발명의 다량체는 DDS로서 유용하다. 또한, 인간 페리틴 단량체가 인간에 대한 항원성 및 면역원성을 갖지 않는 것에 비추어 보면, 본 발명의 다량체는 임상 응용에 있어서 안전성이 우수하다는 이점도 있다.
본 발명의 완충액은, 예를 들면, 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조에 유용하다.
유기 화합물 봉입 페리틴은, 예를 들면, 신규 약물 송달계(DDS)로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method of producing an organic compound-encapsulating ferritin <130> PAMA-20854 <150> JP2018-203246 <151> 2018-10-29 <160> 235 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 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Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tttggatcct taacagcttt cattatcact g 31 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cancer-recognizing peptide <400> 14 Met Ala Arg Ser Gly Leu 1 5 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tttcatatgg cacgtagtgg tttaacgacc gcgtccacct cg 42 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aac 33 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-recognizing peptide <400> 17 Thr Arg Gln Ala Arg Arg 1 5 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tttggatcct tatctgcgtg cttgacgtgt gctttcatta tcactg 46 <210> 19 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 19 Arg Gly Asp 1 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 20 Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 21 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 22 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 23 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein of human ferritin H chain and tumor-binding peptide inserted into a flexible linker portion between 2nd and 3rd alpha-helices of human ferritin H chain from N-terminus, and a cysteine residue at its C-terminus <400> 23 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 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organic molecule <400> 30 Ile Pro Leu Pro Pro Pro Ser Arg Pro Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 31 Leu Met Asn Pro Asn Asn His Pro Arg Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 32 Cys His His Asn Leu Thr His Ala Cys 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 33 Cys Leu His His Tyr His Gly Ser Cys 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 34 Cys His His Ala Leu Thr His Ala Cys 1 5 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 35 Ser Pro Arg Pro Arg His Thr Leu Arg Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 12 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Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 41 Gln Arg His Lys Pro Arg Glu 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 42 His Ser Gln Ala Ala Val Pro 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 43 Ala Gly Asn Trp Thr Pro Ile 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 44 Pro Leu Leu Gln Ala Thr Leu 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 45 Leu Ser Leu Ile Thr Arg Leu 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 46 Cys Arg Gly Asp Cys Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 47 Cys Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala Cys 1 5 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 48 Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Thr Leu 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 49 Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 50 Ala Pro Ser Pro Met Ile Trp 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 51 Leu Gln Asn Ala Pro Arg Ser 1 5 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 52 Ser Trp Thr Leu Tyr Thr Pro Ser Gly Gln 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Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 58 Leu Pro Ala Phe Phe Val Thr Asn Gln Thr Gln Asp 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 59 Tyr Asn Thr Asn His Val Pro Leu Ser Pro Lys Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 60 Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ser Val Pro Met Met Ser 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 61 Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 62 Cys Leu Ser Tyr Tyr Pro Ser Tyr Cys 1 5 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 63 Cys Val Gly Val Leu Pro Ser Gln Asp Ala Ile Gly Ile Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 64 Cys Glu Trp Lys Phe Asp Pro Gly Leu Gly Gln Ala Arg Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 65 Cys Asp Tyr Met Thr Asp Gly Arg Ala Ala Ser Lys Ile Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 66 Lys Cys Cys Tyr Ser Leu 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 67 Met Ala Arg Ala Lys Glu 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 68 Met Ser Arg Thr Met Ser 1 5 <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 69 Trp Thr Gly Trp Cys Leu Asn Pro Glu Glu Ser Thr Trp Gly Phe Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Phe 20 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 70 Met Cys Gly Val Cys Leu Ser Ala Gln Arg Trp Thr 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 71 Ser Gly Leu Trp Trp Leu Gly Val Asp Ile Leu Gly 1 5 10 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 72 Asn Pro Gly Thr Cys Lys Asp Lys Trp Ile Glu Cys Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 73 Ala Asn Thr Pro Cys Gly Pro Tyr Thr His Asp Cys Pro Val Lys Arg 1 5 10 15 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molecule <400> 90 Phe Pro Met Phe Asn His Trp Glu Gln Trp Pro Pro 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 91 Ser Tyr Pro Ile Pro Asp Thr 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 92 His Thr Ser Asp Gln Thr Asn 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 93 Cys Leu Phe Met Arg Leu Ala Trp Cys 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 94 Asp Met Pro Gly Thr Val Leu Pro 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 95 Asp Trp Arg Gly Asp Ser Met Asp Ser 1 5 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 96 Val Pro Thr Asp Thr Asp Tyr Ser 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 97 Val Glu Glu Gly Gly Tyr Ile Ala Ala 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 98 Val Thr Trp Thr Pro Gln Ala Trp Phe Gln Trp Val 1 5 10 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 99 Ala Gln Tyr Leu Asn Pro Ser 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 100 Cys Ser Ser Arg Thr Met His His Cys 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 101 Cys Pro Leu Asp Ile Asp Phe Tyr Cys 1 5 <210> 102 <211> 9 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biological organic molecule <400> 112 Ser Trp Asp Ile Ala Trp Pro Pro Leu Lys Val Pro 1 5 10 <210> 113 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 113 Cys Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg Val Cys 1 5 10 <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 114 Glu Thr Ala Pro Leu Ser Thr Met Leu Ser Pro Tyr 1 5 10 <210> 115 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 115 Gly Ile Arg Leu Arg Gly 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 116 Cys Pro Gly Pro Glu Gly Ala Gly Cys 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 117 Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys 1 5 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molecule <400> 123 Ser Trp Lys Leu Pro Pro Ser 1 5 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 124 Cys Arg Gly Asp Lys Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 125 Gly Gly Lys Arg Pro Ala Arg 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 126 Arg Ile Gly Arg Pro Leu Arg 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 127 Cys Gly Phe Tyr Trp Leu Arg Ser Cys 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 128 Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 129 Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 130 Ser Ser Gln Pro Phe Trp Ser 1 5 <210> 131 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 131 Tyr Arg Cys Thr Leu Asn Ser Pro Phe Phe Trp Glu Asp Met Thr His 1 5 10 15 Glu Cys <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 132 Lys Thr Leu Leu Pro Thr Pro 1 5 <210> 133 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 133 Lys Glu Leu Cys Glu Leu Asp Ser Leu Leu Arg Ile 1 5 10 <210> 134 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 134 Ile Arg Glu Leu Tyr Ser Tyr Asp 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biological organic molecule <400> 150 Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg <210> 151 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 151 Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys 1 5 10 15 <210> 152 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 152 Asp Val Phe Tyr Pro Tyr Pro Tyr Ala Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 153 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 153 Arg Val Trp Tyr Pro Tyr Gly Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Gly Ser 1 5 10 15 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 154 Asp Thr Trp Pro Asn Thr Glu Trp Ser 1 5 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 155 Asp Ser Tyr His Asn Ile Trp 1 5 <210> 156 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 156 Asp Thr Tyr Phe Gly Lys Ala Tyr Asn Pro Trp 1 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 157 Asp Thr Ile Gly Ser Pro Val Asn Phe Trp 1 5 10 <210> 158 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 158 Thr Tyr Cys Asn Pro Gly Trp Asp Pro Arg Asp Arg 1 5 10 <210> 159 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 159 Thr Phe Tyr Asn Glu Glu Trp Asp Leu Val Ile Lys Asp Glu His 1 5 10 15 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a biological organic molecule <400> 160 Met Thr Leu Ile Leu 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metal material <400> 171 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 172 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a metal material <400> 172 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Gly Val 1 5 10 <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a metal material <400> 173 Leu Lys Ala His Leu Pro Pro Ser Arg Leu Pro Ser 1 5 10 <210> 174 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a silicon material <400> 174 Ser Ser Lys Lys Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ser Lys Arg 1 5 10 15 Arg Ile Leu <210> 175 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a silicon material <400> 175 Met Ser Pro His Pro His Pro Arg His His His Thr 1 5 10 <210> 176 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of binding to a silicon material <400> 176 Thr Gly Arg Arg Arg Arg Leu Ser Cys Arg Leu 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which can be degraded by protease <400> 189 Val Gln Val Asp Gly Trp 1 5 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 190 Val Asp Gln Val Asp Gly Trp 1 5 <210> 191 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 191 Glu Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg Asp Ser Ala 1 5 10 <210> 192 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 192 Glu Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg 1 5 <210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 193 Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys 1 5 <210> 194 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 194 Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln Met 1 5 <210> 195 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 195 Ala Pro Ser Gly Arg Val Ser Met 1 5 <210> 196 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 196 Val Ser Met Ile Lys Asn Leu Gln 1 5 <210> 197 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 197 Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys Trp 1 5 <210> 198 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 198 Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 5 <210> 199 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 199 Lys Met Tyr Pro Arg Gly Asn His 1 5 <210> 200 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 200 Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr 1 5 <210> 201 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 201 Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Ala 1 5 <210> 202 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 202 Ser Gly Leu Ser Arg Ile Val Asn 1 5 <210> 203 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 203 Asn Ser Arg Val Ala 1 5 <210> 204 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 204 Gln Val Arg Leu Gly 1 5 <210> 205 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 205 Met Lys Ser Arg Asn Leu 1 5 <210> 206 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 206 Arg Cys Lys Pro Val Asn 1 5 <210> 207 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 207 Ser Ser Lys Tyr Pro Asn 1 5 <210> 208 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide which can be degraded by protease <400> 208 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 209 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stabilization peptide <400> 209 Cys Cys Ala Leu Asn Asn 1 5 <210> 210 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stabilization peptide <400> 210 Pro Ala Ser 1 <210> 211 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 211 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 212 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 212 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 213 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 213 Cys Gly Tyr Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly 1 5 10 <210> 214 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 214 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 215 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 215 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 216 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 216 Gly Leu Ala Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met 1 5 10 15 <210> 217 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 217 Gly Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 10 <210> 218 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 218 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 219 Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu 1 5 <210> 220 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 220 Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val 1 5 10 <210> 221 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 221 Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val 1 5 10 15 <210> 222 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 222 Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro 1 5 10 <210> 223 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 223 Asn Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Gln Arg <210> 224 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 224 Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro Val Gln 1 5 10 15 <210> 225 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 225 Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr 1 5 10 <210> 226 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 226 Val Thr Val Thr Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp 1 5 10 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 227 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys 1 5 <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 228 Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Leu Ala 1 5 <210> 229 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 229 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 230 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 230 Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 <210> 231 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 231 Arg Leu Ser Gly Met Asn Glu Val Leu Ser Phe Arg Trp 1 5 10 <210> 232 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 232 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 233 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 233 Pro Ile Glu Val Cys Met Tyr Arg Glu Pro 1 5 10 <210> 234 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 234 gaaggagata tacatatgag ctcccagatt cgtcag 36 <210> 235 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 235 ctcgaattcg gatccttagt cgtgcttgag agtgag 36

Claims (19)

  1. 유기 화합물 봉입 페리틴의 제조 방법으로서,
    (1) 완충액 중에서 유기 화합물을 페리틴과 혼합하여 유기 화합물 및 페리틴의 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (2) 완충액 중에서 상기 혼합물을 인큐베이트하는 단계를 포함하고,
    완충액은 pH3 이상 13 미만이며, 또한
    완충액은, 유기 화합물의 pKa가 7 미만인 경우에는 3 이상 7 미만의 pH를 갖고, 유기 화합물의 pKa가 7 이상인 경우에는 6 이상 13 미만의 pH를 갖는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 완충액의 pH와 유기 화합물의 pKa가 식: pH=2.6+0.6pKa±0.4pKa의 관계를 충족시키는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인큐베이트의 온도가 10℃ 이상 60℃ 이하인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 화합물의 분자량이 100 이상 1000 미만인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 화합물의 pKa가 2 이상 13 이하인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 10분자 이상 200분자 이하의 유기 화합물이 페리틴 1분자에 봉입되어 있는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 및 인큐베이트의 합계 시간이 30분 이상인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합에서의 페리틴에 대한 유기 화합물의 중량비(유기 화합물/페리틴)가 0.20 이상 0.36 이하인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 화합물이 양의 가전 부분, 또는 양으로 가전할 수 있는 부분을 갖는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 양의 가전 부분이, (a) 암모늄기, 구아니듐기, 이미다졸륨기, 옥사졸륨기, 티아졸륨기, 옥사디아졸륨기, 트리아졸륨기, 피롤리디늄기, 피리디늄기, 피페리디늄기, 피라졸륨기, 피리미디늄기, 피라디늄기, 및 트리아디늄기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양이온성 질소 함유기, 또는 (b) 포스포늄기인. 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,　양으로 가전할 수 있는 부분이, (a') 아미노기, 구아니디노기, 니트로기, 아미드기, 히드라지드기, 이미드기, 아지드기, 및 디아조기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질소 함유기, 또는 (b') 포스피노기인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 페리틴이 (1) 천연 페리틴, 또는 (2) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 개변을 갖는 유전자 재조합 페리틴 단량체로 구성된 페리틴인, 방법:
    (a) 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역에 기능성 펩티드가 삽입되어 있는 페리틴 단량체;
    (b) N 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체; 또는
    (c) C 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체.
  13. 유기 화합물 봉입 페리틴을 포함하는 완충액으로서,
    완충액은, 유기 화합물의 pKa가 7 미만인 경우에는 3 이상 7 미만의 pH를 갖고, 유기 화합물의 pKa가 7 이상인 경우에는 6 이상 12 미만의 pH를 갖는, 완충액.
  14. 제13항에 있어서, 완충액이 6 이상 9 이하의 pH를 갖는, 완충액.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 유기 화합물이 6 이상 9 이하의 pKa를 갖는, 완충액.
  16. 유기 화합물 봉입 페리틴으로서,
    유기 화합물이 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 및 표지 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    페리틴 1분자로의 유기 화합물의 봉입 분자수가 하기와 같은, 유기 화합물 봉입 페리틴:
    (1) 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴 인 경우, 40분자 이상 200분자 이하;
    (2) 유기 화합물이 안트라사이클린계 물질이며, 또한 페리틴이 유전자 재조합 페리틴인 경우, 100분자 이상 200분자 이하; 또는
    (3) 유기 화합물이 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, β2 아드레날린 수용체 작동약, 이미다졸린계 물질, 비타민, 또는 표지 물질이며, 또한 페리틴이 천연 페리틴 또는 유전자 재조합 페리틴 인 경우, 10분자 이상 200분자 이하.
  17. 제16항에 있어서, 안트라사이클린계 물질이 독소루비신이고,
    히스타민 H2 수용체 길항약이 파모티딘이고,
    비구아나이드계 물질이 메트포르민이고,
    ATP 감수성 칼륨채널 개구약이 미녹시딜이고,
    β2 아드레날린 수용체 작동약이 테르부탈린이고,
    이미다졸린계 물질이 크레아티닌이고,
    비타민이 티아민, 리보플라빈, 또는 니코틴아미드이고,
    표지 물질이 로다민 B, 우라닌, 또는 콩고 레드인, 유기 화합물 봉입 페리틴.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 유기 화합물이, 안트라사이클린계 물질, 히스타민 H2 수용체 길항약, 비구아나이드계 물질, ATP 감수성 칼륨채널 개구약, 및 β2 아드레날린 수용체 작동약으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 유기 화합물 봉입 페리틴.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 페리틴이 (1) 천연 페리틴, 또는 (2) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 개변을 갖는 유전자 재조합 페리틴 단량체로 구성된 페리틴인, 유기 화합물 봉입 페리틴 :
    (a) 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 계수하여 2번째와 3번째 사이의 플렉시블 링커 영역에 기능성 펩티드가 삽입되어 있는 페리틴 단량체;
    (b) N 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체; 또는
    (c) C 말단에 기능성 펩티드가 부가되어 있는 페리틴 단량체.


















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