CN117866104A - 一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米生物技术领域，涉及一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼及制备方法和应用。本发明提供了一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的各亚基交界面的loop区，插入有GALA肽；所述GALA肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述蛋白笼能够保护内部封装药物免受外界极端条件的侵害，且在机体内通过响应生理pH变化能够触发可逆性拆卸，进而在靶部位有效释放内部封装的药物。

Description

一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼及制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼及制备方法和应用。

背景技术

笼状蛋白是由有限数量的亚基精确自组装而成的球形大分子。这种组装是由大量的亚单元、亚单元之间的相邻亚单元相互作用介导的。在仿生纳米颗粒合成中，蛋白笼容器作为纳米级平台发挥了作用，并在生物医学方面提供了广泛的可能应用，包括医学成像和药物传递等。蛋白笼一旦组装完成，封装则表现出显著的稳定性。虽然这通常是一个理想的特性以保护封装的分子或药物免受外界条件的侵害，但也排除了蛋白笼在生理条件下的简单拆卸，特别是封装的固有稳定性阻止了笼内分子或药物的释放。因此，设计通过响应机体内部环境并触发组装或拆卸的蛋白笼对于分子或药物的有效递送和释放具有重要价值。

据报道，一些蛋白笼的组装可以被pH变化调节。例如，CCMV(豇豆绿斑病毒)和诺沃克衣壳在低pH值下组装，在高pH值下解体。铁蛋白在广泛的pH范围内保持完整，并在酸性盐酸胍或强酸性溶液下可逆分解。然而，还没有任何天然蛋白笼在生理pH值下可逆组装解离的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼及制备方法和应用。本发明所述蛋白笼能够保护内部封装药物免受外界极端条件的侵害，且在机体内通过响应生理pH变化能够触发可逆性拆卸，进而在靶部位有效释放内部封装的药物。

本发明提供了一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的各亚基交界面的loop区，插入有GALA肽；所述GALA肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，用于构建所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的基础蛋白笼包括但不限于来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn、来自Thermotoga maritima的60聚体封装蛋白Tm、来自Aquifex aeolicus的60聚体蛋白笼AaLS、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白Pf或来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白Qt。

优选的是，当用于构建所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的基础蛋白笼为来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn时，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种用于制备pH响应可逆性组装拆卸毒蛋白笼的表达载体，所述表达载体含有编码上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列。

优选的是，用于构建所述表达载体的基础载体包括pET-3a、pET-3d、pET-9a、pET-11a、pET-11b、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-20d、pET-21A、pET-21b、pET-21d、pET-22b、pET-23a、pET-24a、pET-24b、pET-24c、pET-24d、pET-26b、pET-27b、pET-28a、pET-28b、pET-29a、pET-29b、pET-30a、pET-30b、pET-31b、pET-32a或pET-32b。

本发明还提供了一种用于制备pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的重组菌株，所述重组菌株含有上述技术方案所述的表达载体。

优选的是，用于构建所述重组菌株的宿主菌包括芽孢杆菌、链霉菌、大肠杆菌或蓝细菌。

本发明还提供了上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的制备方法，包括以下步骤：

将编码上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列构建到表达载体上，转化宿主菌，培养，诱导，收获细胞，提取纯化蛋白，获得所述蛋白笼。

本发明还提供了上述技术方案所述蛋白笼或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述重组菌株或上述技术方案所述制备方法制备得到的蛋白笼在制备用于药物递送和释放的产品中的应用。

优选的是，所述药物包括RNA类药物和/或蛋白类药物。

本发明提供了一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼。本发明所述pH响应蛋白笼能够可逆性拆卸和组装，可用于有效释放笼内部封装药物。本发明通过GALA肽酸诱导分子开关对蛋白笼进行设计，使其能够响应生理pH变化触发可逆性拆卸，克服了蛋白笼递送系统在体内无法有效释放内部封装客体的缺陷；本发明构建的蛋白笼可逆性拆卸封装系统可在原核或真核表达系统中快速、简单生产，具有较高的经济性。本发明所述蛋白笼具有以下有益效果：一方面保护内部封装药物免受外界极端条件的侵害，另一方面在机体内通过响应生理pH变化触发可逆性拆卸，进而在靶部位有效释放内部封装的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的pH响应的可逆性拆卸蛋白笼设计示意图；

图2为本发明提供的Fn蛋白笼可逆性拆卸封装系统构建示意图；

图3为本发明提供的SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色纯度鉴定结果图；

图4为本发明提供的Fn和GALA-Fn的TEM图；

图5为本发明提供的Fn和GALA-Fn在不同pH条件下的SEC图；

图6为本发明提供的Fn和GALA-Fn在pH变化下的SEC图；

图7为本发明提供的不同处理后细胞内的相对荧光强度结果图；

图8为本发明提供的不同EGFP组处理后细胞内的相对荧光强度结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的各亚基交界面的loop区，插入有GALA肽；所述GALA肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：EALAEALAEALAEALA。

本发明采用仿生学和合成生物学相关理论与技术，将GALA肽插入到蛋白笼结构的合适部位(各亚基结合面的loop区)，该肽作为酸诱导分子开关会启动蛋白笼的pH响应可逆性拆卸，进而促使蛋白笼释放内部封装的药物，可建立一种pH响应蛋白笼可逆性拆卸用于有效释放笼内部封装药物的方法。当携带外源性药物的蛋白笼通过内吞途径进入机体细胞，经过脱包被作用与第一胞内体融合。此时胞内体上有ATP驱动的质子泵，将氢离子泵入胞内体腔内，使腔内pH由约6.2降低至约5.5。而GALA在pH高于6时下呈无规则线圈状，当pH降低至6以下时形成α-螺旋，一方面扰乱结构完整性诱导蛋白质笼的分解进而释放药物，另一方面此构象与胞内体膜融合，导致囊泡内容物—即笼中释放的药物扩散到细胞质中。

在本发明中，用于构建所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的基础蛋白笼(即可用于蛋白笼可逆性拆卸封装系统设计的纳米蛋白颗粒)优选包括来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn、来自Thermotoga maritima的60聚体封装蛋白Tm、来自Aquifexaeolicus的60聚体蛋白笼AaLS、来自Pyrococcus furiosus的180聚体封装蛋白Pf或来自Quasibacillus thermotolerans的420聚体封装蛋白Qt。在本发明中，所述基础蛋白笼更优选为来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn。在本发明中，上述基础蛋白笼均可在原核或真核系统中过表达和纯化为空载或负载状态。本发明针对上述蛋白笼的空间结构进行分析，以寻找对蛋白质笼组装重要的可工程化改造特征，这些特征既不影响蛋白笼的自组装，也不会干扰货物装载。与此同时，为了给蛋白笼配备酸诱导分子开关GALA肽，将该肽段移植于蛋白笼的可工程化改造结构区域，进而将蛋白笼设计为可响应pH进行可逆性拆卸的封装与递送系统。具体的，如图1(pH响应的可逆性拆卸蛋白笼设计示意图)所示，本发明将GALA肽插入到蛋白笼各亚基交界面，交界面对于蛋白笼的结构形成至关重要。在高于6的pH下，GALA肽不会发生构象变化，蛋白笼稳定。在低于pH6时，GALA肽发生构象变化，导致交界面发生构象变化例如扭曲，蛋白笼空间结构不稳定，发生拆卸。

在本发明中，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的N端优选融合纯化标签。本发明对所述纯化标签的类型没有特殊限定，能够纯化出所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼即可。在本发明中，所述GALA肽插入时，两端优选融合柔性linker。在本发明中，所述纯化标签两端优选也融合柔性linker。本发明所述柔性linker优选包括GGGG。

在本发明中，当用于构建所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的基础蛋白笼为来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn时，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn的亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEERNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKLDKLKFAKDSAEEEKDYSTRIGHALRFYNYIYDAFLEWFIFISKSIYELAALNEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPG，其中，加粗部分为E-LOOP区。本发明优选使用含柔性linker的GALA替换E-LOOP区。在本发明中，所述含柔性linker的GALA的氨基酸序列如GGGGEALAEALAEALAEALAGGGG所示(SEQ ID NO.4)。在本发明中，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的N端优选融合组氨酸标签，便于下游蛋白纯化。在本发明中，所述所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的氨基酸序列优选如下所示：MGGGGHHHHHHGGGGLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEERNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKLDKLKFAKDSAEEEKDYSTRIGHALRFYNYIYDAFLEWFIFISKSIYELAALNEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSGGGGEALAEALAEALAEALAGGGGRAPKLPG(SEQ ID NO.2)；加粗的GGGG为柔性linker，柔性linker之间分别为组氨酸标签和GALA肽。本发明所述GALA肽插入到了亚基的E-loop区。

本发明还提供了一种用于制备pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的表达载体，所述表达载体含有编码上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列。在本发明中，用于构建所述表达载体的基础载体优选包括pET-3a、pET-3d、pET-9a、pET-11a、pET-11b、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-20d、pET-21A、pET-21b、pET-21d、pET-22b、pET-23a、pET-24a、pET-24b、pET-24c、pET-24d、pET-26b、pET-27b、pET-28a、pET-28b、pET-29a、pET-29b、pET-30a、pET-30b、pET-31b、pET-32a或pET-32b。在本发明中，用于构建所述表达载体的基础载体更优选包括pET28a。

本发明还提供了一种用于制备pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的重组菌株，所述重组菌株含有上述技术方案所述的表达载体。在本发明中，用于构建所述重组菌株的宿主菌优选包括大肠杆菌。在本发明中，用于构建所述重组菌株的宿主菌优选包括芽孢杆菌、链霉菌、大肠杆菌或蓝细菌(蓝藻)等。在本发明中，所述大肠杆菌更优选为BL21(DE3)。

本发明还提供了上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的制备方法，包括以下步骤：

将编码上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列构建到表达载体上，转化宿主菌，培养，诱导，收获细胞，提取纯化蛋白，获得所述蛋白笼。

将编码上述技术方案所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列构建到表达载体上。本发明对表达载体的构建方法没有特殊限定，采用常规表达载体构建方法进行构建即可。在本发明中，用于构建所述表达载体的基础载体优选包括pET28a。得到表达载体后，本发明将表达载体转化到宿主菌中。在本发明中，用于构建所述重组菌株的宿主菌优选包括大肠杆菌。在本发明中，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)。得到重组菌株后，本发明优选用500μM异丙基β-d-1-硫代糖基糖苷(IPTG)在22℃过夜诱导蛋白表达。诱导后，本发明优选离心收获细胞。本发明优选通过超声、亲和层析和尺寸排阻色谱法提取和纯化目的蛋白。本发明对超声、亲和层析(Ni-NTA)和尺寸排阻色谱法(SEC)提取和纯化的具体操作条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规操作即可。

本发明还提供了上述技术方案所述蛋白笼或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述重组菌株或上述技术方案所述制备方法制备得到的蛋白笼在制备用于药物递送和释放的产品中的应用。在本发明中，所述药物优选包括RNA类药物和/或蛋白类药物。在本发明中，所述RNA类药物优选包括siRNA药物，更优选包括带有荧光适配体标签的siRNA。在本发明中，所述siRNA核苷酸序列优选为uaaggcuaugaagagauac(SEQ ID NO.5)。在本发明中，所述蛋白类药物优选以EGFP代表。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼及制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明以常用药物RNA和蛋白类为例，验证一种pH响应蛋白笼可逆性拆卸用于有效释放笼内部封装药物的方法。

实施例1

蛋白笼可逆性拆卸封装系统表达纯化与结构表征

选择可形成12面体的来自Pyrococcus furiosus的24聚体Fn用于构建蛋白笼可逆性拆卸封装系统。为了给Fn配备GALA肽，针对Fn的空间结构进行分析。Fn的笼型结构有24个亚基，每个亚基都由四螺旋束(包括A-螺旋、B-螺旋、C-螺旋、D-螺旋)和E-螺旋(连接在C末端)组成。有研究表明，后22个C端残基(E-螺旋的位置)的缺失不能阻止Fn自组装。因此，通过基因修饰将GALA肽连接到D-螺旋和E-螺旋之间的Loop区末端以替代E-螺旋。Fn的亚基N端暴露在笼外表面，通过融合组氨酸标签便于下游蛋白纯化。

图2为Fn蛋白笼可逆性拆卸封装系统构建示意图，其中，a：Fn单体由四螺旋束A/B/C/D和第五个E-螺旋组成；以不同的颜色展示；b：Fn 24聚体笼状颗粒的单个亚基分别以不同的颜色在3和4重对称轴周围表示(左和右)；沿水平轴旋转90°后，以虚线圆放大4倍对称轴周围的孔隙结构(下)。为了清晰起见，在四重对称关系中的一个单体被简化，三个E-螺旋被染成绿色；c：GALA肽与蛋白笼结合；pH 7.4时GALA肽的随机卷曲结构(黄色)不阻碍蛋白笼的组装，但pH 6.0时转变为螺旋结构时，在狭窄的人工孔中GALA肽之间产生分子排斥(洋红色)；d：Fn单体中GALA肽和RNA结合肽的合理插入；N端引入His标签用于后续纯化(红色)；E螺旋(绿色)被替换为GALA肽(黄色)。Fn的氨基酸序列为：MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEERNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKLDKLKFAKDSAEEEKDYSTRIGHALRFYNYIYDAFLEWFIFISKSIYELAALNEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPG(SEQ ID NO.3)，本发明将加粗部分E-LOOP区PQILFMLDKELSA(SEQ ID NO.6)替换为GGGGEALAEALAEALAEALAGGGG(SEQ ID NO.4)，GGGG为柔性linker，EALAEALAEALAEALA(SEQID NO.1)为GALA肽；并且融合组氨酸标签。最终得到本发明pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的氨基酸序列：MGGGGHHHHHHGGGGLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEERNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKLDKLKFAKDSAEEEKDYSTRIGHALRFYNYIYDAFLEWFIFISKSIYELAALNEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSGGGGEALAEALAEALAEALAGGGGRAPKLPG(SEQ IDNO.2)。斜体部分为融合的组氨酸标签和替换的GALA肽。

蛋白笼可逆性拆卸封装系统表达与纯化

将Fn蛋白笼亚基编码用核苷酸序列和图2构建的Fn可逆性拆卸封装系统中的pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼亚基的编码用核苷酸序列分别委托公司进行基因合成，cDNA序列分别亚克隆到原核表达质粒pET28a中。质粒分别转化到BL21(DE3)大肠杆菌中进行扩大培养。用500μM异丙基β-d-1-硫代糖基糖苷在22℃过夜诱导蛋白表达。离心收获细胞，通过超声细胞、亲和层析(Ni-NTA)和尺寸排阻色谱法纯化目的蛋白(分别命名为Fn和GALA-Fn)，浓缩后采用SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色和负染色透射电镜进行蛋白纯度和颗粒形态鉴定。

Fn可逆性拆卸蛋白笼的一般表征

(1)SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定

结果如图3所示，图3为SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色纯度鉴定结果图。

(2)负染色透射电镜(TEM)观察Fn和GALA-Fn的空间结构

结果如图4所示，图4为Fn和GALA-Fn的TEM图。

SDS-PAGE结果显示，Fn和GALA-Fn以高纯度纯化。负染色TEM结果显示，Fn和GALA-Fn镜下显示均匀一致的纳米颗粒球状形态。上述均表明GALA肽替换E-螺旋对于Fn的蛋白表达和结构自组装未产生明显影响。

实施例2

蛋白笼可逆性拆卸封装系统拆卸与重组

pH响应的Fn-GALA蛋白笼拆卸

为了验证GALA肽的配备使Fn蛋白笼具备酸敏感性分解的特征，GALA-Fn样品在不同的酸性条件下(pH<6.0(3，4，5)、pH＝6.0、pH＝6.5、pH＝6.8、pH＝7.0、pH＝8.0)透析，然后在SEC色谱柱上进行分析。

图5为Fn和GALA-Fn在不同pH条件下的SEC图；其中，a为SEC色谱图，b为从a图SEC色谱中富集各流出组分，分析各组分的占比结果图。a中，横坐标代表流出体积，颗粒越大在体积越小处流出，相应的峰值则越高，可以看出在10ml处主要流出的为pH>6.0条件下的蛋白笼颗粒，表明蛋白笼粒径较大没有发生拆卸，而pH≤6.0条件下，主要在大于15ml处流出，表明此时的颗粒粒径较小，蛋白发生了拆卸。b中可以看出pH≤6时，GALA-Fn没有蛋白笼生成，即纵坐标为0；而高于pH6时，纵坐标增加，表明蛋白笼生成，其中Fn不受pH影响。

pH响应的Fn-GALA蛋白笼重组

药物或货物在重组过程中需要被分离的亚基封装，因此重组能力在药物输送系统的应用中非常重要。为了验证是否可以简单地通过缓冲液pH条件改变将被分解的亚基重新组装成固定的粒子，样品在pH<6.0的缓冲液体系下在SEC柱上进样后，对应的分离亚基峰被汇聚。为了中和样品，混合组分在含有50mM Tris-HCl(pH 7.0)和100mM NaCl的缓冲液中透析，然后浓缩到1mg/mL，最后在pH 7.0的SEC柱上再次注入样品，分析样品流出峰。

图6为Fn和GALA-Fn在pH变化下的SEC图。图5结果表明，与pH 7.0和8.0时相比，随着pH从7.0降至6.0，Fn-GALA在SEC柱上产生了移位的洗脱峰，这意味着从24-mer到小的构建块的构象转变，在pH 6.0及低于pH 6.0时，笼状颗粒完全解离，表明GALA作为酸诱导开关可促使Fn笼状蛋白的拆卸。图6结果表明，当pH响应的解离亚基恢复至原有pH条件时(pH7.0)，可以观察到与拆卸前相同的24-mer洗脱峰，表明pH响应的蛋白笼拆卸是可逆的，解离的亚基可以通过pH中和重新组装成笼状蛋白。

实施例3

蛋白笼可逆性拆卸封装系统药物递送与释放评估

为了验证GALA肽修饰的Fn蛋白笼能够在生理pH条件下触发可逆性拆卸，以常用的两种药物RNA和蛋白类药物为例，本发明不限于以上两种递送药物，分别采用GALA-Fn蛋白笼对两种药物进行封装(GALA-Fn蛋白笼经pH为4.0或5.0处理后发生拆卸，此时加入药物RNA(荧光适配体标记的siRNA)或蛋白类药物(增强型荧光蛋白EGFP)，恢复pH(7.0或8.0)，蛋白笼重新组装，此时形成内部封装有siRNA的蛋白笼颗粒)，探究其是否通过响应内体pH变化触发可逆性拆卸。

蛋白笼可逆性拆卸封装系统递送RNA类药物

为了进一步探讨构建的GALA-Fn可逆性拆卸蛋白笼是否可以真正响应细胞内的生理pH变化，以递送货物siRNA为例，将封装带有荧光适配体标签(携带Pepper，购自纳莹生物)的siRNA；siRNA核苷酸序列为uaaggcuaugaagagauac，构建方法为常规方法)的GALA-Fn用于感染Hela细胞，通过荧光追踪封装siRNA在细胞内的释放情况。Hela细胞分为阴性对照组、游离siRNA组(携带Pepper，购自纳莹生物)、Fn-siRNA组和GALA-Fn-siRNA组。游离siRNA组与Fn-siRNA、GALA-Fn-siRNA组中封装的siRNA等摩尔，阴性对照组为常规培养细胞。孵育12h后(加入HBC染料，与Pepper荧光适配体结合，用于激发荧光产生；DAPI用于显示细胞核，pepper用于显示细胞中的siRNA。)，荧光显微镜下观察细胞内siRNA的释放情况。

图7为不同siRNA组处理后细胞内的相对荧光强度结果图。结果表明，与游离siRNA组相比，GALA-Fn-siRNA组显示出更强的荧光强度，表明经GALA肽修饰的Fn可将siRNA递送至细胞内并有效释放；而Fn-siRNA组的细胞内几乎无荧光，表明野生型Fn在细胞内无法响应内体环境启动拆卸，导致内部的siRNA无法释放。

蛋白笼可逆性拆卸封装系统递送蛋白类药物

为了直观观察蛋白类药物经蛋白笼递送和释放的效果，采用增强型荧光蛋白EGFP代替常规蛋白类药物。将封装有EGFP的GALA-Fn蛋白笼用于感染HK293细胞，通过荧光蛋白跟踪蛋白的释放情况。HK293分为游离EGFP组、Fn-EGFP组和GALA-Fn-EGFP组。游离EGFP组与Fn-EGFP、GALA-Fn-EGFP组中封装的EGFP等量。孵育12h后，荧光显微镜下观察细胞内EGFP的释放情况。

图8为不同EGFP组处理后细胞内的相对荧光强度结果图。结果显示，与游离EGFP组相比，GALA-Fn-EGFP组显示出更强的荧光强度，表明经GALA肽修饰的Fn可将EGFP递送至细胞内并有效释放；而Fn-EGFP组的细胞内几乎无荧光，表明野生型Fn在细胞内无法响应内体环境启动拆卸，导致内部的EGFP无法释放。

综上，经酸诱导分子开关GALA修饰的Fn蛋白笼能够响应生理pH条件变化进而启动可逆性拆卸，可将其内部封装的药物(siRNA或EGFP等)递送至细胞内并有效释放，进而更好的发挥药物作用。与游离药物相比，药物经蛋白笼的递送效率更高；与未经修饰的蛋白笼相比，蛋白笼可有效响应内体pH环境变化进而触发可逆性拆卸和重新组装。GALA-Fn蛋白笼封装系统可在原核系统中快速、简单生成，具有产量高和经济性优势。上述均表明构建一种响应生理pH的可逆性拆卸蛋白笼用于有效释放笼内部封装药物的方法具有重要应用价值。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼，其特征在于，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的各亚基交界面的loop区，插入有GALA肽；所述GALA肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼，其特征在于，用于构建所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的基础蛋白笼包括来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn、来自Thermotogamaritima的60聚体封装蛋白Tm、来自Aquifexaeolicus的60聚体蛋白笼AaLS、来自Pyrococcusfuriosus的180聚体封装蛋白Pf或来自Quasibacillusthermotolerans的420聚体封装蛋白Qt。

3.根据权利要求2所述的pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼，其特征在于，当用于构建所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的基础蛋白笼为来自Pyrococcus furiosus的24聚体铁蛋白Fn时，所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种用于制备pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的表达载体，所述表达载体含有编码权利要求1～3任一项所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，用于构建所述表达载体的基础载体包括pET-3a、pET-3d、pET-9a、pET-11a、pET-11b、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-20d、pET-21A、pET-21b、pET-21d、pET-22b、pET-23a、pET-24a、pET-24b、pET-24c、pET-24d、pET-26b、pET-27b、pET-28a、pET-28b、pET-29a、pET-29b、pET-30a、pET-30b、pET-31b、pET-32a或pET-32b。

6.一种用于制备pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求4或5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，用于构建所述重组菌株的宿主菌包括芽孢杆菌、链霉菌、大肠杆菌或蓝细菌。

8.权利要求1～3任一项所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的制备方法，包括以下步骤：

将编码权利要求1～3任一项所述pH响应可逆性组装拆卸蛋白笼的亚基的核苷酸序列构建到表达载体上，转化宿主菌，培养，诱导，收获细胞，提取纯化蛋白，获得所述蛋白笼。

9.权利要求1～3任一项所述蛋白笼或权利要求4或5所述表达载体或权利要求6或7所述重组菌株或权利要求8所述制备方法制备得到的蛋白笼在制备用于药物递送和释放的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括RNA类药物和/或蛋白类药物。