CN112912385A - 包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包封有有机化合物的铁蛋白的替代的制造方法。更具体而言，本发明提供一种包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法，该方法包括：(1)在缓冲液中将有机化合物与铁蛋白混合而获得有机化合物和铁蛋白的混合物的工序，以及(2)在缓冲液中孵育所述混合物的工序；其中，缓冲液的pH为3以上且低于13，并且，在有机化合物的pKa低于7的情况下，缓冲液具有3以上且低于7的pH，在有机化合物的pKa为7以上的情况下，缓冲液具有6以上且低于13的pH。
Description
技术领域
本发明涉及包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法等。
背景技术
铁蛋白是从动植物到微生物中普遍存在的具有由多个单体构成的内腔的球状蛋白质。已知在人等动物中，作为铁蛋白存在H链和L链这两种单体，以及铁蛋白是由24个单体构成的多聚体(大多数情况为H链和L链的混合物)，并且具有外径12nm的笼状形态及具有内径7nm的内腔。已知铁蛋白与生物体或细胞中的铁元素的稳态(homeostasis)密切相关，由于可在其内腔中保持铁，因此承担铁的运送、贮存等生理学功能的作用。
铁蛋白还被探讨作为在其内腔中包封药物(药剂)的DDS载体的应用，也被用于电子器件的制作。关于铁蛋白的这样的用途，报道有数种在铁蛋白中包封有机化合物的方法。具体来说，作为这样的方法，报道有：(1)通过改变溶液的pH来调节铁蛋白的解缔合(脱会合)和重缔合(复性)的方法、(2)进行采用变性剂的铁蛋白的变性和重折叠的方法、以及(3)基于压力的方法。例如，非专利文献1中报道了，通过使铁蛋白在pH为2的酸性条件下解缔合，接着将溶液的pH变为7～9而使铁蛋白重缔合，从而可将约28个阿霉素包封在铁蛋白中。非专利文献2中报道了，通过改变铁蛋白而使铁蛋白的稳定性提高，同时通过添加HCl而使溶液的pH变为pH 2，对铁蛋白的解缔合和重缔合进行调节，从而可在铁蛋白中包封约30～90个阿霉素。非专利文献3中报道了，首先，利用尿素等变性剂使铁蛋白变性，接着将变性铁蛋白与药物混合后，去除溶液中的变性剂，从而可在铁蛋白恢复成天然的折叠结构时将约33个阿霉素包封在铁蛋白中。专利文献1中报道了，通过将铁蛋白和阿霉素的混合液在高压(200～800MPa)下放置6～20小时，从而可将约10～20个阿霉素包封在铁蛋白中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：中国专利申请公开第106110333号说明书。
非专利文献
非专利文献1：JournalofControlledRelease 196(2014)184-196
非专利文献2：Biomacromolecules2016,17,514-522
非专利文献3：ProcNatlAcadSciUSA.2014111(41)：14900-5。
发明内容
发明所要解决的技术问题
上述的现有方法存在以下课题(问题)：铁蛋白的回收率和有机化合物在铁蛋白中的包封效率低，而且在操作复杂方面、需要规定的装置方面、为了提高包封率而需要对铁蛋白表面进行特别的修饰方面造成负担。更具体来说，上述(1)和(2)的方法中，需要通过酸性缓冲液或变性剂来破坏铁蛋白结构(解缔合/变性)，而一旦破坏铁蛋白结构，其后即使设置结构的恢复工艺(重缔合/重折叠)，也保持了铁蛋白的一部分被破坏的状态，无法复原，因此存在铁蛋白的回收率下降的课题。除此之外，破坏铁蛋白的结构并在其后使结构恢复的上述(1)和(2)的方法，只不过是摄入分布于溶液(反应环境)中的有机化合物而包封在铁蛋白中，所以无法将溶液的浓度以上的有机化合物包封入铁蛋白，存在可包封入铁蛋白的有机化合物的量较少这样的包封效率方面的课题。此外，关于上述(1)的方法，由于要改变pH条件，故需要缓冲液的置换。关于上述(2)的方法，不仅为了重折叠而需要除去变性剂，而且为了提高包封率而需要对铁蛋白表面进行特别的修饰。因此，上述(1)、(2)的方法复杂。进而，关于上述(3)的方法，在需要能实现非常高的压力条件的特殊装置这方面造成负担。
因此，本发明的目的是提供：可解决如上所述的1个以上的课题的包封有有机化合物的铁蛋白的替代的制造方法。
解决技术问题所采用的技术方案
以往，关于金属原子和金属化合物(例如金属氧化物)，已知由于尺寸小，因此在不引起铁蛋白结构的破坏(解缔合/变性)的条件下，可将金属原子和金属化合物包封入铁蛋白中。但是，关于有机化合物，认为尺寸相对较大，不具有铁蛋白结构中的铁蛋白透过能力，因此认为在不引起铁蛋白结构的破坏的条件下，无法将有机化合物包封入铁蛋白中。实际上，非专利文献1中，在将阿霉素包封入铁蛋白中时，反而采用可引起铁蛋白解缔合的强酸性条件(pH约2.5以下)，使铁蛋白解缔合。此次，本发明人等进行了认真研究后结果发现，通过使用具有处于不破坏铁蛋白结构的pH范围内的与有机化合物的酸离解常数(pKa)相应的适当的pH的缓冲液这样的简便的方法，可将有机化合物包封入铁蛋白中等，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述：
[1]一种包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法，该方法包括：
(1)在缓冲液中将有机化合物与铁蛋白混合而获得有机化合物和铁蛋白的混合物，以及
(2)在缓冲液中孵育所述混合物；
缓冲液的pH为3以上且低于13，
并且，在有机化合物的pKa低于7的情况下，缓冲液具有3以上且低于7的pH，在有机化合物的pKa为7以上的情况下，缓冲液具有6以上且低于13的pH；
[2]根据[1]的方法，其中，缓冲液的pH与有机化合物的pKa满足式：pH＝2.6+0.6pKa±0.4pKa的关系；
[3]根据[1]或[2]的方法，其中，孵育的温度为10℃以上且60℃以下；
[4]根据[1]～[3]中任一项的方法，其中，有机化合物的分子量为100以上且低于1000；
[5]根据[1]～[4]中任一项的方法，其中，有机化合物的pKa为2以上且13以下；
[6]根据[1]～[5]中任一项的方法，其中，在1分子铁蛋白中包封有10分子以上且200分子以下的有机化合物；
[7]根据[1]～[6]中任一项的方法，其中，混合和孵育的合计时间为30分钟以上；
[8]根据[1]～[7]中任一项的方法，其中，所述混合中的有机化合物与铁蛋白的重量比(有机化合物/铁蛋白)为0.20以上且0.36以下；
[9]根据[1]～[8]中任一项的方法，其中，有机化合物具有带正电荷的部分、或能够带正电荷的部分；
[10]根据[9]的方法，其中，带正电荷的部分为：
(a)选自铵基(例如伯、仲、叔或季)、胍鎓基、咪唑鎓基、噁唑鎓基、噻唑鎓基、噁二唑鎓基、三唑鎓基、吡咯烷鎓基、吡啶鎓基、哌啶鎓基、吡唑鎓基、嘧啶鎓基、吡嗪鎓基、及三嗪鎓基中的阳离子性含氮基团，或者
(b)鏻基；
[11]根据[9]或[10]的方法，其中，能够带正电荷的部分为：
(a')选自氨基、胍基(guanidino group)、硝基、酰胺基、酰肼基、酰亚胺基、叠氮基、及重氮基中的含氮基团，或者
(b')膦基；
[12]根据[1]～[11]中任一项的方法，其中，铁蛋白为：
(1)天然铁蛋白、或者
(2)由下述(a)～(c)中的任一种的具有修饰的基因重组铁蛋白单体构成的铁蛋白：
(a)在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区(flexible linker region)中插入有功能性肽的铁蛋白单体；
(b)在N末端添加有功能性肽的铁蛋白单体；或者
(c)在C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体；
[13]一种缓冲液，其是包含包封有有机化合物的铁蛋白的缓冲液，其中，
在有机化合物的pKa低于7的情况下，缓冲液具有3以上且低于7的pH，
在有机化合物的pKa为7以上的情况下，缓冲液具有6以上且低于12的pH；
[14]根据[13]的缓冲液，其中，缓冲液具有6以上且9以下的pH；
[15]根据[13]或[14]的缓冲液，其中，有机化合物具有6以上且9以下的pKa；
[16]一种包封有有机化合物的铁蛋白，其中，
有机化合物选自蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素及标记物质，
包封在1分子铁蛋白中的有机化合物的分子数如下：
(1)在有机化合物为蒽环类物质且铁蛋白为天然铁蛋白的情况下，为40分子以上且200分子以下；
(2)在有机化合物为蒽环类物质且铁蛋白为基因重组铁蛋白的情况下，为100分子以上且200分子以下；或者
(3)在有机化合物为组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素或标记物质且铁蛋白为天然铁蛋白或基因重组铁蛋白的情况下，为10分子以上且200分子以下；
[17]根据[16]的包封有有机化合物的铁蛋白，其中，
蒽环类物质为阿霉素(doxorubicin)，
组胺H2受体拮抗剂为法莫替丁(fomotidine)，
双胍类物质为二甲双胍(metformin)，
ATP敏感性钾通道开放剂为米诺地尔(minoxidil)，
β2肾上腺素能受体激动剂为特布他林(terbutaline)，
咪唑啉类物质为肌酐(creatinine)，
维生素为硫胺素(thiamine)、核黄素(riboflavin)或烟酰胺(nicotinamide)，
标记物质为罗丹明B(Rhodamine B)、荧光素钠(uranine)或刚果红(congo red)；
[18]根据[16]或[17]的包封有有机化合物的铁蛋白，其中，有机化合物选自蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、及β2肾上腺素能受体激动剂；
[19]根据[16]～[18]中任一项的包封有有机化合物的铁蛋白，其中，铁蛋白为：
(1)天然铁蛋白、或者
(2)由下述(a)～(c)中的任一种的具有修饰的基因重组铁蛋白单体构成的铁蛋白：
(a)在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区中插入有功能性肽的铁蛋白单体；
(b)在N末端添加有功能性肽的铁蛋白单体；或者
(c)在C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体。
发明的效果
如果采用本发明的方法，通过使用具有与有机化合物的pKa相应的适当的pH的缓冲液这样的简便的方法，可将有机化合物包封入铁蛋白中。此外，本发明的方法中，包封有有机化合物的铁蛋白的制作效率优异。首先，对于本发明的方法而言，不需要破坏铁蛋白结构(解缔合/变性)，因此，与需要破坏铁蛋白结构(解缔合/变性)和恢复工艺的以往的方法(即使设置恢复工艺，也成为铁蛋白的一部分被破坏的状态，无法复原)相比，铁蛋白的回收率优异。其次，对于本发明的方法而言，通过在可维持铁蛋白的超分子结构的环境下利用铁蛋白的内腔与外壳的电化学势差，可将溶液中的浓度以上的有机化合物包封入铁蛋白中，所以与难以将溶液中的浓度以上的有机化合物包封入铁蛋白中的以往的方法(伴随铁蛋白结构的恢复，将溶液纳入铁蛋白内腔中的方法)相比，可将更多的有机化合物有效地包封入铁蛋白中。进而，对于本发明的方法而言，与以往的方法不同，在缓冲液的置换、变性剂的除去、或不需要特殊装置等方面是简便的。
附图的简单说明
图1是表示各反应pH下的向铁蛋白中导入药物(药剂)的药物导入率(重量％)的图；
图2是表示各温度下的向铁蛋白中导入药物的药物导入率(重量％)的图；
图3是表示向铁蛋白中导入药物的药物导入率(重量％)的经时变化的图；
图4是表示反应溶液中的药物/铁蛋白(蛋白质)浓度比与药物导入率(重量％)的关系的图；
图5是表示向铁蛋白中包封药物的包封反应后的铁蛋白和药物的柱洗脱(columnelution)峰的一致性(即，药物在铁蛋白中的包封)的图；
图6是表示采用Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern))确认包封有药物的铁蛋白复合物(水溶液分散性纳米粒子)的图；
图7是表示未进行阿霉素包封处理的铁蛋白与包封有药物的铁蛋白的表面电荷为同等(因此，并未由于铁蛋白表面吸附阿霉素而复合化)的图；
图8是表示包封有药物的铁蛋白的pH稳定性的图；
图9是表示以往的解缔合/重缔合工艺中的铁蛋白的解缔合后的放置时间与药物导入率的关系的图；
图10是表示基于本发明的一步工艺(one step process，一步法)与以往的解缔合/重缔合工艺的铁蛋白的回收率的比较的图；
图11是表示各低分子药物的pKa与在向铁蛋白内的导入量最多的反应中使用的缓冲液pH(最优pH)的相关性的图。近似直线是位于图11的中央的直线(pH＝2.6+0.6pKa)。各低分子药物的pKa与最优pH在式：pH＝2.6+0.6pKa±0.4pKa(截距：2.6，斜率：0.6，变异系数：0.4)的范围内；
图12是表示采用本发明的一步工艺的药物导入量与采用以往的解缔合/重缔合工艺的药物导入量之比的图；
图13是表示基于使用Zetasizer Nano ZS的动态光散射(DLS)法的各pH下的铁蛋白的尺寸的测定结果的图；
图14是表示血浆中的内包(包封)有荧光素钠的铁蛋白的稳定性评价结果的图；
图15是表示基于荧光激活细胞分选(FACS)的向转铁蛋白受体TfR递呈细胞(SKBR-3细胞)内纳入内包有荧光素钠的铁蛋白的测定结果的图；
图16是表示基于双光子激发荧光显微镜的向转铁蛋白受体TfR递呈细胞(SKBR-3细胞)内纳入内包有荧光素钠的铁蛋白的测定结果的图。
具体实施方式
本发明提供一种包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法，其中，包括以下内容：
(1)在缓冲液中将有机化合物与铁蛋白混合而获得有机化合物和铁蛋白的混合物的工序，以及
(2)在缓冲液中孵育所述混合物的工序；
缓冲液的pH为3以上且低于13，
并且，在有机化合物的pKa低于7的情况下，缓冲液具有3以上且低于7的pH，在有机化合物的pKa为7以上的情况下，缓冲液具有6以上且低于13的pH。
铁蛋白(24聚体蛋白质)普遍存在于哺乳动物等各种高等生物。已知：构成铁蛋白的铁蛋白单体具有在各种高等生物间高度保守的6个α-螺旋，且作为高等生物的铁蛋白单体，存在H链和L链这两种单体。
本发明中，作为构成铁蛋白的铁蛋白单体，可使用哺乳动物的铁蛋白单体。作为哺乳动物，可举出例如：灵长类(例如人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔)、家畜和使役用的哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、山羊、马)。作为铁蛋白单体，可使用H链或L链、或者它们的混合物中的任一种。作为铁蛋白单体，可使用天然铁蛋白单体、或者具有24聚体形成能力的其基因重组铁蛋白单体中的任一种。
一个实施方式中，基因重组铁蛋白单体可在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋间的柔性连接区中进行了修饰。作为这样的基因重组铁蛋白单体，可举出例如：在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第1个与第2个之间、第2个与第3个之间、第3个与第4个之间、第4个与第5个之间、或者第5个与第6个之间(较好是第2个与第3个之间)的柔性连接区中插入有功能性肽的铁蛋白单体(本申请实施例、以及美国专利申请公开第2016/0060307号；Jae Og Jeon等,ACS Nano(2013),7(9),7462-7471；Sooji Kim等,Biomacromolecules(2016),17(3),1150-1159；Young Ji Kang等,Biomacromolecules(2012),13(12),4057-4064)。例如，人铁蛋白H链(SEQ ID NO:1)和人铁蛋白L链(SEQ ID NO:2)中，6个α-螺旋中的从N末端起数第1～6个的α-螺旋如表A所示。因此，人铁蛋白H链(SEQ ID NO:1)的柔性连接区为：第1个与第2个α-螺旋之间的柔性连接区(由第43～49位的氨基酸残基形成的区域)、第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区(由第78～96位的氨基酸残基形成的区域)、第3个与第4个α-螺旋之间的柔性连接区(由第125～127位的氨基酸残基形成的区域)、第4个与第5个α-螺旋之间的柔性连接区(第138位的氨基酸残基的位置)、或第5个与第6个α-螺旋之间的柔性连接区(第160～164位的氨基酸残基的区域)。此外，人铁蛋白L链(SEQ ID NO:2)的柔性连接区为：第1个与第2个α-螺旋之间的柔性连接区(由第38～45位的氨基酸残基形成的区域)、第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区(由第74～92位的氨基酸残基形成的区域)、第3个与第4个α-螺旋之间的柔性连接区(由第121～123位的氨基酸残基形成的区域)、第4个与第5个α-螺旋之间的柔性连接区(第134位的氨基酸残基的位置)、或第5个与第6个α-螺旋之间的柔性连接区(第155～159位的氨基酸残基的区域)。
[表A]
表A.铁蛋白的α-螺旋的位置
α-螺旋的分类基于Int J Mol Sci.2011；12(8)：5406-5421。
其他的实施方式中，关于基因重组铁蛋白单体，可在其N末端区域和/或C末端区域中进行了修饰。铁蛋白单体的N末端露出于多聚体的表面上，其C末端不会露出于表面上。因此，添加于铁蛋白单体的N末端的肽部分会露出于多聚体的表面，可与存在于多聚体外部的靶材(目标材料)相互作用(例如，国际公开第2006/126595号)。另一方面，关于铁蛋白单体的C末端，可通过修饰其氨基酸残基而与铁蛋白内腔中的有机化合物相互作用(例如，Y.J.Kang,Biomacromolecules.2012,vol.13(12),4057)。作为这样的基因重组铁蛋白单体，可举出例如在N末端或C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体。
从对人的临床应用的观点来看，铁蛋白较好是人铁蛋白。作为构成人铁蛋白的铁蛋白单体，可使用人铁蛋白H链、或人铁蛋白L链、或者它们的混合物中的任一种。
本发明中，1分子(或1单位)铁蛋白是指由24个铁蛋白单体构成的复合物(24聚体)，铁蛋白单体不对应于1分子(或1单位)铁蛋白。
特定的实施方式中，铁蛋白H链可以是以下蛋白质：
(A1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质；
(B1)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括选自氨基酸残基的取代、缺失、插入及添加中的一个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列，且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质；或者
(C1)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质。
优选地，铁蛋白L链可以是以下的蛋白质：
(A2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质；
(B2)包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包括选自氨基酸残基的取代、缺失、插入及添加中的一个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列，且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质；或者
(C2)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质。
蛋白质(B1)和(B2)中，通过选自氨基酸残基的缺失、取代、添加及插入中的1、2、3或4种修饰，可改变一个或数个氨基酸残基。氨基酸残基的修饰，可被引入至氨基酸序列中的1个区域，也可被引入至多个不同的区域。术语“一个或数个”表示不会大幅损害蛋白质活性的个数。术语“一个或数个”所示的数量例如为1～50个，较好是1～40个，更好是1～30个，进一步更好是1～20个，特别好是1～10个或1～5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)。
蛋白质(C1)或(C2)中，与作为对象的氨基酸序列的同一性的程度较好是92％以上，更好是95％以上，进一步更好是97％以上，最好是98％以上或99％以上。蛋白质的同一性％的计算可通过算法blastp进行。更具体来说，蛋白质的同一性％的计算可使用算法blastp中默认设定的评分参数(Matrix(矩阵):BLOSUM62；Gap Costs(空位罚分):Existence(存在)＝11Extension(延伸)＝1；Compositional Adjustments(组成调整):Conditional compositional score matrix adjustment(条件组成打分矩阵调整))进行。
氨基酸序列中应引入突变的氨基酸残基的位置，对于本领域技术人员不言自明，可进一步参考序列比对来确定(特别规定)。具体来说，本领域技术人员可以1)比较多个氨基酸序列，2)明确相对保守的区域和相对不保守的区域，接着3)由相对保守的区域和相对不保守的区域可分别预测能对功能发挥重要作用的区域和不能对功能发挥重要作用的区域，所以能够识别结构和功能的相关性。因此，本领域技术人员可通过利用序列比对来确定在氨基酸序列中应引入突变的位置，还可并用已知的二级结构或三级结构信息来确定在氨基酸序列中应引入突变的氨基酸残基的位置。
在通过取代使氨基酸残基突变的情况下，氨基酸残基的取代可以是保守性取代。在本说明书中使用的情况下，术语“保守性取代”是指将规定的氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基进行取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在该领域中周知。例如，作为这样的家族，可举出：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有非电荷性(不带电荷)极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)、具有含羟基(例如醇性、酚性)侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、及具有含硫侧链的氨基酸(例如半胱氨酸、蛋氨酸)。较好的是，氨基酸的保守性取代可以是：天冬氨酸与谷氨酸之间的取代；精氨酸、赖氨酸与组氨酸之间的取代；色氨酸与苯丙氨酸之间的取代；苯丙氨酸与缬氨酸之间的取代；亮氨酸、异亮氨酸与丙氨酸之间的取代；以及，甘氨酸与丙氨酸之间的取代。
特定的实施方式中，本发明中所用的铁蛋白可以是：(1)天然铁蛋白、或者(2)由下述(a)～(c)中的任何的具有修饰的基因重组铁蛋白单体构成的铁蛋白：
(a)在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第2个与第3个之间的柔性连接区中插入有功能性肽的铁蛋白单体；
(b)在N末端添加有功能性肽的铁蛋白单体；或者
(c)在C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体。
作为功能性肽，可使用在与目标蛋白融合时能够对目标蛋白附加任意的功能的肽。作为这样的肽，可举出：具有对靶材的结合能力的肽(具有与靶材结合的能力的肽)、蛋白酶降解性肽、细胞透过性肽、稳定化肽。
功能性肽可以是具有所期望的功能的仅1个肽，或者也可以是具有所期望的功能的相同类型或不同类型的多个(例如2个、3个或4个等的数个)肽。功能性肽为如上所述的多个肽的情况下，多个功能性肽可按照任意顺序插入并与铁蛋白单体融合。铁蛋白单体和功能性肽的融合可经由酰胺键来实现。关于此种融合，可通过以酰胺键将铁蛋白单体和功能性肽直接连接来实现，或者也可通过在其间存在1个氨基酸残基(例如蛋氨酸)或由数个(例如2～20个，较好是2～10个，更好是2、3、4或5个)氨基酸残基形成的肽(肽接头)的酰胺键而间接实现。已知各种肽接头，所以本发明中也可使用这样的肽接头。优选地，上述功能性肽为：由20个以下(较好是18个以下，更好是15个以下，进一步更好是12个以下，特别好是10个以下)的氨基酸残基形成的肽。
作为功能性肽，在使用具有对靶材的结合能力的肽的情况下，作为靶材，可举出例如有机物和无机物(例如导体、半导体和磁性体)。更具体来说，作为这样的靶材，可举出生物有机分子、金属材料、硅材料、碳材料、可与蛋白质纯化用标签(例如组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白质标签、谷胱甘肽S-转移酶)相互作用的材料(例如镍、麦芽糖、谷胱甘肽)、标记物质(例如放射性物质、荧光物质、色素)、聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚环氧乙烷或聚(L-乳酸)等疏水性有机聚合物或导电性聚合物)。
作为生物有机分子，可举出例如：蛋白质(例如寡肽或多肽)、核酸(例如DNA或RNA、或者核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸)、糖类(例如单糖、寡糖或多糖)、脂质。生物有机分子还可以是细胞表面抗原(例如癌抗原、心脏病标志物、糖尿病标志物、神经系统疾病标志物、免疫性疾病标志物、炎症标志物、激素、传染病标志物)。生物有机分子还可以是疾病抗原(例如癌抗原、心脏病标志物、糖尿病标志物、神经系统疾病标志物、免疫性疾病标志物、炎症标志物、激素、传染病标志物)。作为具有对这样的生物有机分子的结合能力的肽，报道有各种肽。例如，报道有：具有对蛋白质的结合能力的肽(参照例如F.Danhier等，Mol.Pharmaceutics，2012，第9卷，第11期，第2961页；C-H.Wu等，Sci.Transl.Med.，2015，第7卷，第290期，290ra91；L.Vannucci等，Int.J.Nanomedicine，2012，第7卷，第1489页；J.Cutrera等，Mol.Ther.，2011，第19(8)卷，第1468页；R.Liu等，Adv.Drug Deliv.Rev.，2017，第110-111卷，第13页)、具有对核酸的结合能力的肽(参照例如R.Tan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1995，第92卷，第5282页；R.Tan等，Cell，1993，第73卷，第1031页；R.Talanian等，Biochemistry，1992，第31卷，第6871页)、具有对糖类的结合能力的肽(参照例如K.Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1992，第89卷，第12期，第5393-5397页；K.Yamamoto等，J.Biochem.,1992，第111卷，第436页；A.Baimiev等，Mol.Biol.(莫斯科)，2005，第39卷，第1期，第90页)、具有对脂质的结合能力的肽(参照例如O.Kruse等，BZ.Naturforsch.，1995，第50c卷，第380页；O.Silva等，Sci.Rep.，2016，第6卷，27128；A.Filoteo等，J.Biol.Chem.，1992，第267卷，第17期，第11800页)等的各种肽。
优选地，具有对生物有机分子的结合能力的肽，可以是具有对蛋白质的结合能力的肽。作为具有对蛋白质的结合能力的肽，可举出例如：Danhier等,Mol.Pharmaceutics，2012，第9卷，第11期，第2961页中所揭示的含RGD的肽或其修饰序列(例如，RGD(SEQ ID NO:19)、ACDCRGDCFCG(SEQ ID NO:20)、CDCRGDCFC(SEQ ID NO:21)、GRGDS(SEQ ID NO:22)、及ASDRGDFSG(SEQ ID NO:23))、以及其他的整联蛋白识别序列(例如，EILDV(SEQ ID NO:24)、及REDV(SEQ ID NO:25))、L.Vannucci等，Int.J.Nanomedicine.2012，第7卷，第1489页中所揭示的肽(例如，SYSMEHFRWGKP(SEQ ID NO:26))、J.Cutrera等，Mol.Ther.，2011，第19卷，第8期，第1468页中所揭示的肽(例如，VNTANST(SEQ ID NO:27))、R.Liu等，Adv.DrugDeliv.Rev.，2017，第110-111卷，第13页中所揭示的肽(例如，DHLASLWWGTEL(SEQ ID NO:28)、及NYSKPTDRQYHF(SEQ ID NO:29)、IPLPPPSRPFFK(SEQ ID NO:30)、LMNPNNHPRTPR(SEQID NO:31)、CHHNLTHAC(SEQ ID NO:32)、CLHHYHGSC(SEQ ID NO:33)、CHHALTHAC(SEQ IDNO:34)、SPRPRHTLRLSL(SEQ ID NO:35)、TMGFTAPRFPHY(SEQ ID NO:36)、NGYEIEWYSWVTHGMY(SEQ ID NO:37)、FRSFESCLAKSH(SEQ ID NO:38)、YHWYGYTPQNVI(SEQ ID NO:39)、QHYNIVNTQSRV(SEQ ID NO:40)、QRHKPRE(SEQ ID NO:41)、HSQAAVP(SEQ ID NO:42)、AGNWTPI(SEQ ID NO:43)、PLLQATL(SEQ ID NO:44)、LSLITRL(SEQ ID NO:45)、CRGDCL(SEQID NO:46)、CRRETAWAC(SEQ ID NO:47)、RTDLDSLRTYTL(SEQ ID NO:48)、CTTHWGFTLC(SEQID NO:49)、APSPMIW(SEQ ID NO:50)、LQNAPRS(SEQ ID NO:51)、SWTLYTPSGQSK(SEQ ID NO:52)、SWELYYPLRANL(SEQ ID NO:53)、WQPDTAHHWATL(SEQ ID NO:54)、CSDSWHYWC(SEQ IDNO:55)、WHWLPNLRHYAS(SEQ ID NO:56)、WHTEILKSYPHE(SEQ ID NO:57)、LPAFFVTNQTQD(SEQID NO:58)、YNTNHVPLSPKY(SEQ ID NO:59)、YSAYPDSVPMMS(SEQ ID NO:60)、TNYLFSPNGPIA(SEQ ID NO:61)、CLSYYPSYC(SEQ ID NO:62)、CVGVLPSQDAIGIC(SEQ ID NO:63)、CEWKFDPGLGQARC(SEQ ID NO:64)、CDYMTDGRAASKIC(SEQ ID NO:65)、KCCYSL(SEQ ID NO:66)、MARSGL(SEQ ID NO:14)、MARAKE(SEQ ID NO:67)、MSRTMS(SEQ ID NO:68)、WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(SEQ ID NO:69)、MCGVCLSAQRWT(SEQ ID NO:70)、SGLWWLGVDILG(SEQ ID NO:71)、NPGTCKDKWIECLLNG(SEQ ID NO:72)、ANTPCGPYTHDCPVKR(SEQ ID NO:73)、IVWHRWYAWSPASRI(SEQ ID NO:74)、CGLIIQKNEC(SEQ ID NO:75)、MQLPLAT(SEQ ID NO:76)、CRALLRGAPFHLAEC(SEQ ID NO:77)、IELLQAR(SEQ ID NO:78)、TLTYTWS(SEQ ID NO:79)、CVAYCIEHHCWTC(SEQ ID NO:80)、THENWPA(SEQ ID NO:81)、WHPWSYLWTQQA(SEQ ID NO:82)、VLWLKNR(SEQ ID NO:83)、CTVRTSADC(SEQ ID NO:84)、AAAPLAQPHMWA(SEQ ID NO:85)、SHSLLSS(SEQ ID NO:86)、ALWPPNLHAWVP(SEQ ID NO:87)、LTVSPWY(SEQ ID NO:88)、SSMDIVLRAPLM(SEQ ID NO:89)、FPMFNHWEQWPP(SEQ ID NO:90)、SYPIPDT(SEQ ID NO:91)、HTSDQTN(SEQ ID NO:92)、CLFMRLAWC(SEQ ID NO:93)、DMPGTVLP(SEQ ID NO:94)、DWRGDSMDS(SEQ ID NO:95)、VPTDTDYS(SEQ ID NO:96)、VEEGGYIAA(SEQ ID NO:97)、VTWTPQAWFQWV(SEQ ID NO:98)、AQYLNPS(SEQ ID NO:99)、CSSRTMHHC(SEQ ID NO:100)、CPLDIDFYC(SEQ ID NO:101)、CPIEDRPMC(SEQ ID NO:102)、RGDLATLRQLAQEDGVVG(SEQ IDNO:103)、SPRGDLAVLGHK(SEQ ID NO:104)、SPRGDLAVLGHKY(SEQ ID NO:105)、CQQSNRGDRKRC(SEQ ID NO:106)、CMGNKCRSAKRP(SEQ ID NO:107)、CGEMGWVRC(SEQ ID NO:108)、GFRFGALHEYNS(SEQ ID NO:109)、CTLPHLKMC(SEQ ID NO:110)、ASGALSPSRLDT(SEQ ID NO:111)、SWDIAWPPLKVP(SEQ ID NO:112)、CTVALPGGYVRVC(SEQ ID NO:113)、ETAPLSTMLSPY(SEQ ID NO:114)、GIRLRG(SEQ ID NO:115)、CPGPEGAGC(SEQ ID NO:116)、CGRRAGGSC(SEQID NO:117)、CRGRRST(SEQ ID NO:118)、CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO:119)、CGNKRTRGC(SEQID NO:120)、HVGGSSV(SEQ ID NO:121)、RGDGSSV(SEQ ID NO:122)、SWKLPPS(SEQ ID NO:123)、CRGDKRGPDC(SEQ ID NO:124)、GGKRPAR(SEQ ID NO:125)、RIGRPLR(SEQ ID NO:126)、CGFYWLRSC(SEQ ID NO:127)、RPARPAR(SEQ ID NO:128)、TLTYTWS(SEQ ID NO:129)、SSQPFWS(SEQ ID NO:130)、YRCTLNSPFFWEDMTHEC(SEQ ID NO:131)、KTLLPTP(SEQ ID NO:132)、KELCELDSLLRI(SEQ ID NO:133)、IRELYSYDDDFG(SEQ ID NO:134)、NVVRQ(SEQ ID NO:135)、VECYLIRDNLCIY(SEQ ID NO:136)、CGGRRLGGC(SEQ ID NO:137)、WFCSWYGGDTCVQ(SEQID NO:138)、NQQLIEEIIQILHKIFEIL(SEQ ID NO:139)、KMVIYWKAG(SEQ ID NO:140)、LNIVSVNGRH(SEQ ID NO:141)、QMARIPKRLARH(SEQ ID NO:142)、及QDGRMGF(SEQ ID NO:143))或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
优选地，具有对生物有机分子的结合能力的肽，可以是具有对核酸的结合能力的肽。作为具有对核酸的结合能力的肽，可举出例如：R.Tan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，第92卷，第5282页中所揭示的肽及其部分肽(例如，TRQARR(SEQ ID NO:17)、TRQARRN(SEQ ID NO:144)、TRQARRNRRRRWRERQR(SEQ ID NO:145)、TRRQRTRRARRNR(SEQ ID NO:146)、NAKTRRHERRRKLAIER(SEQ ID NO:147)、MDAQTRRRERRAEKQAQWKAA(SEQ ID NO:148)、及RKKRRQRRR(SEQ ID NO:149))、R.Tan等，Cell，1993，第73卷，第1031页中所揭示的肽(例如，TRQARRNRRRRWRERQR(SEQ ID NO:150))、Talanian等，Biochemistry，1992，第31卷，第6871页中所揭示的肽(例如，KRARNTEAARRSRARK(SEQ ID NO:151))、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
优选地，具有对生物有机分子的结合能力的肽，可以是具有对糖类的结合能力的肽。作为具有对糖类的结合能力的肽，可举出例如：K.Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，第89卷，第12期，第5393-5397页中所揭示的肽(例、DVFYPYPYASGS(SEQ ID NO:152)、及RVWYPYGSYLTASGS(SEQ ID NO:153))、K.Yamamoto等，J.Biochem.，1992，第111卷，第436页所揭示的肽(例如，DTWPNTEWS(SEQ ID NO:154)、DSYHNIW(SEQ ID NO:155)、DTYFGKAYNPW(SEQ ID NO:156)、及DTIGSPVNFW(SEQ ID NO:157))、A.Baimiev等，Mol.Biol.(莫斯科)，2005，第39卷，第1期，第90页中所揭示的肽(TYCNPGWDPRDR(SEQ ID NO:158)、及TFYNEEWDLVIKDEH(SEQ ID NO:159))或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
优选地，具有对生物有机分子的结合能力的肽，可以是具有对脂质的结合能力的肽。作为具有对脂质的结合能力的肽，可举出例如：O.Kruse等，Z.Naturforsch.，1995，第50c卷，第380页中所揭示的肽(例如，MTLILELVVI(SEQ ID NO:160)、MTSILEREQR(SEQ IDNO:161)、及MTTILQQRES(SEQ ID NO:162))、O.Silva等，Sci.Rep.，2016，第6卷，27128中所揭示的肽(例如，VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF(SEQ ID NO:163))、A.Filoteo等，J.Biol.Chem.，1992，第267(17)卷，第11800页中所揭示的肽(例如，KKAVKVPKKEKSVLQGKLTRLAVQI(SEQ ID NO:164))或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为金属材料，可举出例如金属和金属化合物。作为金属，可举出例如钛、金、铬、锌、铅、锰、钙、铜、钙、锗、铝、镓、镉、铁、钴、银、铂、钯、铪、碲。作为金属化合物，可举出例如这样的金属的氧化物、硫化物、碳酸盐、砷化物、氯化物、氟化物和碘化物、以及金属间化合物。作为具有对这样的金属材料的结合能力的肽，报道有各种肽(例如，国际公开第2005/010031号；国际公开第2012/086647号；K.Sano等，Langmuir，2004，第21卷，第3090页；S.Brown,Nat.Biotechnol.，1997，第15卷，第269页；K.Kjaergaard等，Appl.Environ.Microbiol.，2000，第66卷，第10页；Umetsu等，Adv.Mater.,17，2571-2575(2005)；M.B.Dickerson等，Chem.Commun.，2004，第15卷，第1776页；C.E.Flynn等，J.Mater.Chem.，2003，第13卷，第2414页)。因此，本发明中可使用这样的各种肽。
优选地，具有对金属材料的结合能力的肽，可以是具有对钛或钛化合物(例如氧化钛)等钛材料的结合能力的肽、以及具有对金或金化合物等金材料的结合能力的肽。作为具有对钛材料的结合能力的肽，可举出例如：后述的实施例和国际公开第2006/126595号中所揭示的肽(例如，RKLPDA(SEQ ID NO:165))、M.J.Pender等，Nano Lett.，2006，第6卷，第1期，第40-44页中所揭示的肽(例如，SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(SEQ ID NO:166))、I.Inoue等，J.Biosci.Bioeng.，2006，第122卷，第5期，第528页中所揭示的肽(例如，AYPQKFNNNFMS(SEQID NO:167))、以及国际公开第2006/126595号中所揭示的肽(例如，RKLPDAPGMHTW(SEQ IDNO:168)、及RALPDA(SEQ ID NO:169))、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。作为具有对金材料的结合能力的肽，可举出例如后述的实施例和S.Brown,Nat.Biotechnol.1997，第15卷，第269页中所揭示的肽(例如，MHGKTQATSGTIQS(SEQ ID NO:170))、J.Kim等，Acta Biomater.，2010，第6卷，第7期，第2681页中所揭示的肽(例如，TGTSVLIATPYV(SEQ ID NO:171)、及TGTSVLIATPGV(SEQ ID NO:172))、以及K.Nam等，Science，2006，第312卷，第5775期，第885页中所揭示的肽(例如，LKAHLPPSRLPS(SEQ ID NO:173))、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为硅材料，可举出例如硅或硅化合物。作为硅化合物，可举出例如硅的氧化物(例如一氧化硅(SiO)、二氧化硅(SiO2))、碳化硅(SiC)、硅烷(SiH4)、硅酮橡胶。作为具有对这样的硅材料的结合能力的肽，报道有各种肽(例如，国际公开第2006/126595号、国际公开第2006/126595号、M.J.Pender等，Nano Lett.，2006，第6卷，第1期，第40-44页)。因此，本发明中可使用这样的各种肽。
优选地，具有对硅材料的结合能力的肽，可以是具有对硅或硅化合物(例如硅的氧化物)的结合能力的肽。作为这样的肽，可举出例如：国际公开第2006/126595号中所揭示的肽(例如，RKLPDA(SEQ ID NO:165))、M.J.Pender等，Nano Lett.，2006，第6卷，第1期，第40-44页中所揭示的肽(例如，SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(SEQ ID NO:174))、以及国际公开第2006/126595号中所揭示的肽(MSPHPHPRHHHT(SEQ ID NO:175)、TGRRRRLSCRLL(SEQ ID NO:176)、及KPSHHHHHTGAN(SEQ ID NO:177))、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为碳材料，可举出例如碳纳米材料(例如碳纳米管(CNT)、碳纳米角(CNH))、富勒烯(C60)、石墨烯片、石墨。作为具有对这样的碳材料的结合能力的肽，报道有各种肽(例如，日本特开2004-121154号公报；日本特开2004-121154号公报；M.J.Pender等，Nano Lett.，2006，第6卷，第1期，第40-44页)。因此，本发明中可使用这样的各种肽。
优选地，具有对碳材料的结合能力的肽，可以是具有对碳纳米管(CNT)或碳纳米角(CNH)等碳纳米材料的结合能力的肽。作为这样的肽，可举出例如：后述的实施例和日本特开2004-121154号公报中所揭示的肽(例如，DYFSSPYYEQLF(SEQ ID NO:178))、M.J.Pender等，Nano Lett.，2006，第6卷，第1期，第40-44页中所揭示的肽(HSSYWYAFNNKT(SEQ ID NO:179))、以及日本特开2004-121154号公报中所揭示的肽(例如，YDPFHII(SEQ ID NO:180))、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为功能性肽，使用蛋白酶降解性肽的情况下，作为蛋白酶，可举出例如胱天蛋白酶(caspase)和组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶(D.McIlwain1等，Cold Spring HarbPerspect Biol.，2013，第5卷，a008656、V.Stoka等，IUBMB Life，2005，第57卷，第4-5期，第347页)、胶原酶(G.Lee等，Eur J Pharm Biopharm.，2007，第67卷，第3期，第646页)、凝血酶和Xa因子(R.Jenny等，Protein Expr.Purif.,2003，第31卷，第1页；H.Xu等，J.Virol.,2010，第84卷，第2期，第1076页)、来源于病毒的蛋白酶(C.Byrd等，Drug Dev.Res.，2006，第67卷，第501页)。
作为蛋白酶降解性肽，可举出例如：E.Lee等，Adv.Funct.Mater.，2015，第25卷，第1279页中所揭示的肽(例如，GRRGKGG(SEQ ID NO:181))、G.Lee等，Eur J PharmBiopharm.，2007，第67卷，第3期，第646页中所揭示的肽(例如，GPLGV(SEQ ID NO:182)、及GPLGVRG(SEQ ID NO:183))、Y.Kang等，Biomacromolecules,2012，第13卷，第12期，第4057页中所揭示的肽(例如，GGLVPRGSGAS(SEQ ID NO:184))、R.Talanian等，J.Biol.Chem.,1997，第272期，第9677页中所揭示的肽(例如，YEVDGW(SEQ ID NO:185)、LEVDGW(SEQ IDNO:186)、VDQMDGW(SEQ ID NO:187)、VDVADGW(SEQ ID NO:188)、VQVDGW(SEQ ID NO:189)、及VDQVDGW(SEQ ID NO:190))、Jenny等，Protein Expr.Purif.，2003，第31卷，第1页中所揭示的肽(例如，ELSLSRLRDSA(SEQ ID NO:191)、ELSLSRLR(SEQ ID NO:192)、DNYTRLRK(SEQID NO:193)、YTRLRKQM(SEQ ID NO:194)、APSGRVSM(SEQ ID NO:195)、VSMIKNLQ(SEQ IDNO:196)、RIRPKLKW(SEQ ID NO:197)、NFFWKTFT(SEQ ID NO:198)、KMYPRGNH(SEQ ID NO:199)、QTYPRTNT(SEQ ID NO:200)、GVYARVTA(SEQ ID NO:201)、SGLSRIVN(SEQ ID NO:202)、NSRVA(SEQ ID NO:203)、QVRLG(SEQ ID NO:204)、MKSRNL(SEQ ID NO:205)、RCKPVN(SEQ IDNO:206)、及SSKYPN(SEQ ID NO:207))、H.Xu等，J.Virol.,2010，第84卷，第2期，第1076页中所揭示的肽(例如，LVPRGS(SEQ ID NO:208))、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为功能性肽，使用稳定化肽的情况下，作为稳定化肽，可举出例如：X.Meng等，Nanoscale,2011，第3卷，第3期，第977页中所揭示的肽(例如，CCALNN(SEQ ID NO:209))、以及E.Falvo等，Biomacromolecules，2016，第17卷，第2期，第514页中所揭示的肽(例如，PAS(SEQ ID NO:210))或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为功能性肽，使用细胞透过性肽的情况下，作为细胞透过性肽，可举出例如：Z.Guo等，Biomed.Rep.,2016，第4卷，第5期，第528页中所揭示的肽(例如，GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:211)、RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:212)、CGYGPKKKRKVGG(SEQ ID NO:213)、RRRRRRRR(SEQ ID NO:214)、KKKKKKKK(SEQ ID NO:215)、GLAFLGFLGAAGSTM(SEQ ID NO:216)、GAWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:217)、LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQ ID NO:218)、MVRRFLVTL(SEQ ID NO:219)、RIRRACGPPRVRV(SEQ ID NO:220)、MVKSKIGSWILVLFV(SEQ ID NO:221)、SDVGLCKKRP(SEQ ID NO:222)、NAATATRGRSAASRPTQR(SEQ ID NO:223)、PRAPARSASRPRRPVQ(SEQ ID NO:224)、DPKGDPKGVTVT(SEQ ID NO:225)、VTVTVTGKGDPKPD(SEQ ID NO:226)、KLALKLALK(SEQ ID NO:227)、ALKAALKLA(SEQ ID NO:228)、GWTLNSAGYLLG(SEQ ID NO:229)、KINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:230)、RLSGMNEVLSFRW(SEQ ID NO:231)、SDLWEMMMVSLACQY(SEQ ID NO:232)、及PIEVCMYREP(SEQ ID NO:233))或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等的突变)、或者具有1个或多个这样的氨基酸序列的肽。
作为功能性肽，较好是具有对靶材的结合能力的肽。具有对靶材的结合能力的肽的优选例子为具有对有机物的结合能力的肽。作为具有对有机物的结合能力的肽，较好是具有对生物有机分子的结合能力的肽，更好是具有对蛋白质的结合能力的肽。
关于铁蛋白，可使用含编码铁蛋白的多核苷酸的宿主细胞，通过使宿主细胞产生铁蛋白来获得。作为这样的宿主细胞，可举出例如来源于动物、昆虫、鱼类或植物的细胞、以及微生物。作为动物，较好是哺乳动物或鸟类(例如鸡)，更好是哺乳动物。作为哺乳动物，可举出例如：灵长类(例如人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔)、家畜和使役用的哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、山羊、马)。
在优选的实施方式中，从临床应用的观点来看，宿主细胞可以是人细胞、或者广泛用于产生人蛋白质的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、来源于人胎肾的HEK293细胞)。
其他优选的实施方式中，从大量生产铁蛋白等观点来看，宿主细胞可以是微生物。作为微生物，可举出例如细菌和真菌。作为细菌，可使用被用作宿主细胞的任意的细菌，可举出例如：芽孢杆菌(Bacillus)属细菌[例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)]、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌[例如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)]、埃希氏菌(Escherichia)属细菌[例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)]、泛菌(Pantoea)属细菌[例如菠萝泛菌(Pantoea ananatis)]。作为真菌，可使用被用作宿主细胞的任意的真菌，可举出例如酵母(Saccharomyces)属真菌[例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)]、和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属真菌[例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)]。或者，作为微生物，可使用丝状菌。作为丝状菌，可举出例如属于枝顶孢霉属(Acremonium)/篮状菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、金孢属(Chrysosporium)、腐质霉属(Humicola)、裸胞壳属(Emericella)、和肉座菌属(Hypocrea)的细菌。
作为有机化合物，可使用任意的有机化合物。作为这样的有机化合物，可举出例如低分子化合物、糖化合物、肽化合物、核酸化合物(例如DNA、RNA、人工核酸)，较好是低分子化合物。
本发明中，术语“低分子化合物”是指分子量100～1000的有机化合物。作为低分子化合物的有机化合物的分子量可以是150以上、200以上、250以上或300以上。此外，分子量可以是950以下、900以下、850以下或800以下。更具体来说，分子量可以是150～950、200～900、250～850或300～800。
作为低分子化合物，可举出例如药物、维生素、标记物质、氨基酸、寡肽、核苷、核苷酸、寡核苷酸、单糖、脂质、脂肪酸及它们的代谢产物。
在特定的实施方式中，本发明中所用的药物可以是蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素、或标记物质；
作为蒽环类物质，可举出例如阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(Valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)。其中，较好是阿霉素；
作为组胺H2受体拮抗剂，可举出例如法莫替丁、西咪替丁(cimetidine)、雷尼替丁(ranitidine)、尼扎替丁(nizatidine)、罗沙替丁乙酸酯(roxatidine acetate)、拉呋替丁(Lafutidine)。其中，较好是法莫替丁；
作为双胍类物质，可举出例如二甲双胍、丁双胍(buformin)、苯乙双胍(phenformin)、氯胍(Proguanil)、氯丙胍(Chlorproguanil)、氯己定(Chlorhexidine)、阿来西定(Alexidine)。其中，较好是二甲双胍；
作为ATP敏感性钾通道开放剂，可举出例如米诺地尔、尼可地尔(Nicorandil)、吡那地尔(Pinacidil)、二氮嗪(diazoxide)、克罗卡林(Cromakalim)、左克罗卡林(levcromakalim)、来马卡林(lemakalim)。其中，较好是米诺地尔；
作为β2肾上腺素能受体激动剂，可举出例如：特布他林、沙丁胺醇(Salbutamol)、左沙丁胺醇(Levosalbutamol)、吡布特罗(pirbuterol)、丙卡特罗(Procaterol)、奥西那林(Metaproterenol)、非诺特罗(fenoterol)、比托特罗(Bitolterol)、沙美特罗(Salmeterol)、福莫特罗(Formoterol)、维兰特罗(Vilanterol)、班布特罗(Bambuterol)、克伦特罗(Clenbuterol)、茚达特罗(Indacaterol)。其中，较好是特布他林；
作为咪唑啉类物质，可举出例如肌酐、羟甲唑啉(Oxymetazoline)、可乐定(Clonidine)、西苯唑啉(Cibenzoline)、替扎尼定(Tizanidine)、四氢唑啉(Tetrahydrozoline)、萘甲唑啉(Naphazoline)、酚妥拉明(Phentolamine)、溴莫尼定(Brimonidine)、莫索尼定(Moxonidine)。其中，较好是肌酐。
作为维生素，可举出例如：维生素B1(例如硫胺素)、维生素B2(例如核黄素)、维生素B3(例如烟酸(Niacin)、烟酰胺)、维生素B5(例如泛酸)、维生素B6(例如吡哆醛、吡哆胺、吡哆醇)、维生素B7(例如生物素)、维生素B9(例如叶酸)、维生素B12(例如氰钴胺、羟钴胺)、维生素C(例如抗坏血酸)、维生素A(例如视黄醇、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质(cryptoxanthin))、维生素D(例如麦角钙化醇(Ergocalciferol)、胆钙化醇(Cholecalciferol))、维生素E(例如生育酚、生育三烯酚(tocotrienol))、维生素K(例如叶绿醌(Phylloquinone)、甲基萘醌(Menaquinone))等。其中，较好是维生素B1、维生素B2、维生素B3。
作为标记物质，可举出例如罗丹明(例如罗丹明B、6G、6GP、3GO、123)、荧光素钠等荧光物质、刚果红等色素和染料、以及发光物质。其中，较好是罗丹明B、荧光素钠、或刚果红。
作为氨基酸，可举出例如：α-氨基酸(例如丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸)、β-氨基酸(例如β-丙氨酸、泛酸)、γ-氨基酸(例如γ-氨基丁酸)。氨基酸可以是L型，也可以是D型。
有机化合物的pKa可以为2以上且13以下。在有机化合物的pKa为2以上且13以下的情况下，通过使用具有与该pKa相应的适当的pH的缓冲液，可将有机化合物更有效地包封入铁蛋白中。更具体来说，在有机化合物的pKa为2以上且低于7(较好是3以上且低于6)的情况下，缓冲液较好是具有3以上且低于7(较好是3以上且低于6)的pH。此外，在有机化合物的pKa为7以上且13以下的情况下，缓冲液较好是具有6以上且低于13(较好是6以上且低于12，更好是6以上且低于11，进一步更好是6以上且低于10)的pH。
有机化合物的pKa可通过中和滴定法求得(化学便览基础篇I、II(修订第4版)，日本化学会编，丸善，1993)。中和滴定法中，可通过制备各分子的0.1摩尔/L溶液，在25℃对于该溶液用0.1摩尔/L的氢氧化钠水溶液或盐酸水溶液进行滴定，并测定pH，由此进行计算。在有机化合物具有单一的pKa值的情况下，采用该值作为有机化合物的pKa。另一方面，在有机化合物具有多个(例如2～6个、较好是2～5个、更好是2～4个、进一步更好是2或3个)pKa值的情况下，采用它们的平均值作为有机化合物的pKa。
优选地，有机化合物可具有带正电荷的部分和/或能够带正电荷的部分。
一个实施方式中，有机化合物具有带正电荷的部分。带正电荷的部分是指在固体的状态下带正电荷的基团。作为带正电荷的部分，可举出例如阳离子性含氮基团和阳离子性含磷基团。
阳离子性含氮基团是指带正电荷的具有氮原子的基团。作为阳离子性含氮基团，可举出例如：铵基(例如伯、仲、叔或季)、胍鎓基、咪唑鎓基、噁唑鎓基、噻唑鎓基、噁二唑鎓基、三唑鎓基、吡咯烷鎓基、吡啶鎓基、哌啶鎓基、吡唑鎓基、嘧啶鎓基、吡嗪鎓基、及三嗪鎓基。
阳离子性含磷基团是指带正电荷的具有磷原子的基团。作为阳离子性含磷基团，可举出例如鏻基(例如伯、仲、叔或季)。
其他实施方式中，有机化合物具有能够带正电荷的部分。能够带正电荷的部分是指，虽然在固体的状态下不带正电荷，但在溶解于水溶液中的状态下作为氢原子受体起作用，可根据水溶液的pH而带正电荷的基团。作为能够带正电荷的部分，可举出例如：能够带正电荷的含氮基团、和能够带正电荷的含磷基团。作为能够带正电荷的含氮基团，可举出例如氨基(例如伯、仲或叔)、胍基、硝基、酰胺基、酰肼基、酰亚胺基、叠氮基、重氮基。作为能够带正电荷的含磷基团，可举出例如膦基(例如伯、仲或叔)。
除了带正电荷的部分或能够带正电荷的部分之外，有机化合物可还具有带负电荷部分(例如氧化胺中的氧基(oxide group))或能够带负电荷的部分(例如硫酸基)。在有机化合物除了具有带正电荷的部分或能够带正电荷的部分之外、还具有带负电荷部分或能够带负电荷的部分的情况下，较好是“带正电荷的部分和/或能够带正电荷的部分的总数”比“带负电荷部分和/或能够带负电荷的部分的总数”多(即，作为整体带正电荷，或者根据溶液所期望的pH条件作为整体容易带正电荷)。
特定的实施方式中，有机化合物的pKa与pH，可在关系式：pH＝2.6+0.6pKa±0.4pKa的范围内(图11)。变异系数较好是0.3。
其他特定的实施方式中，有机化合物可具有6以上且9以下的pKa。该情况下，通过将包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法中使用的缓冲液(例如pH为6以上且9以下)直接用于保存，从而可在制造包封有有机化合物的铁蛋白后稳定地保存包封有有机化合物的铁蛋白。因此，本发明中，可优选使用具有6以上且9以下的pKa的有机化合物。
本发明的方法中，首先，通过在缓冲液中将有机化合物与铁蛋白混合，从而获得有机化合物和铁蛋白的混合物。混合可通过任意的方式进行。例如，可将有机化合物溶解于含铁蛋白的缓冲液中，或者可将有机化合物溶解于含有机化合物的缓冲液中，亦或可通过将含有机化合物的缓冲液与含铁蛋白的缓冲液合并来进行。关于混合中的有机化合物与铁蛋白的重量比(有机化合物/铁蛋白)，只要可将有机化合物包封入铁蛋白中，则无特别限定，例如可为0.05～0.45。从将有机化合物有效地包封入铁蛋白中的观点来看，上述重量比例如可为0.20以上且0.36以下。
本发明中所用的缓冲液具有3以上且低于13的pH。如果是这样的范围的pH，则可防止铁蛋白结构的破坏(解缔合或变性)。关于缓冲液的pH，根据有机化合物的pKa等因素，可以为4以上、5以上、6以上或7以上。此外，关于缓冲液的pH，根据有机化合物的pKa等因素，可以为低于13、低于12、低于11、低于10、低于9、低于8或低于7。缓冲液的pH可使用通过玻璃电极法在25℃测得的值。
作为缓冲液，可根据目标的pH而选择适当的缓冲液。在目标的pH为3以上且低于7的情况下，作为可优选使用的缓冲液，可举出例如：磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、甘氨酸盐酸盐缓冲液、MES-NaOH缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES-NaOH缓冲液、PIPES-NaOH缓冲液、Bis-Tris盐酸盐缓冲液。在目标的pH为6以上且低于13的情况下，作为可优选使用的缓冲液，可举出例如：Tris盐酸盐缓冲液、碳酸钠缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES-NaOH缓冲液、PIPES-NaOH缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、CAPS-NaOH缓冲液、氯化钾-氢氧化钠缓冲液。
特定的实施方式中，缓冲液的pH可以为6以上且9以下。该情况下，通过将包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法中使用的缓冲液直接用于保存，从而可在制造包封有有机化合物的铁蛋白后稳定地保存包封有有机化合物的铁蛋白。因此，本发明中，可优选使用具有6以上且9以下的pH的缓冲液。
本发明的方法中，接着，在缓冲液中孵育上述混合物。孵育可通过任意的方式进行。例如，孵育通过在缓冲液中静置或搅拌上述混合物来进行。关于孵育的温度，只要可将有机化合物包封入铁蛋白中，则无特别限定，例如可以为10℃以上且60℃以下。孵育的温度可以为15℃以上、或20℃以上。此外，孵育的温度可以为55℃以下、或50℃以下。
关于混合和孵育的合计时间，只要可将有机化合物包封入铁蛋白中，则无特别限定，例如可以为5分钟以上、10分钟以上、15分钟以上、或20分钟以上。优选地，从将有机化合物充分地包封入铁蛋白中的观点来看，混合和孵育的合计时间可以为30分钟以上。
本发明中，包封在1分子铁蛋白中的有机化合物的数量无特别限定，例如可将10分子以上且200分子以下的有机化合物包封在1分子铁蛋白中。包封在1分子铁蛋白中的有机化合物的数量可以较好是20分子以上，更好是30分子以上，进一步更好是40分子以上，再进一步更好是50分子以上，特别好是60分子以上、70分子以上、80分子以上、90分子以上、100分子以上、110分子以上、120分子以上、130分子以上、140分子以上、或150分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的有机化合物的数量可以较好是190分子以下，更好是180分子以下，进一步更好是170分子以下，再进一步更好是160分子以下，特别好是150分子以下、140分子以下、130分子以下、120分子以下、110分子以下、100分子以下、90分子以下、80分子以下、70分子以下、60分子以下、50分子以下、40分子以下、30分子以下、20分子以下或15分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为蒽环类物质的情况下，包封在1分子铁蛋白中的蒽环类物质的数量，根据铁蛋白为(a)由天然铁蛋白单体构成的天然铁蛋白、或者(b)由基因重组铁蛋白单体构成的基因重组铁蛋白的情况而改变。
例如，在有机化合物为蒽环类物质、且铁蛋白为天然铁蛋白的情况下，包封在1分子天然铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以为40分子以上且200分子以下。包封在1分子天然铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以较好是50分子以上，更好是60分子以上，进一步更好是70分子以上，再进一步更好是80分子以上，特别好是90分子以上。此外，包封在1分子天然铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以较好是170分子以下，更好是140分子以下。
另一方面，在有机化合物为蒽环类物质、且铁蛋白为基因重组铁蛋白的情况下，包封在1分子基因重组铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以为100分子以上且200分子以下。包封在1分子基因重组铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以较好是110分子以上，更好是120分子以上，进一步更好是130分子以上，再进一步更好是140分子以上，特别好是150分子以上。此外，包封在1分子基因重组铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以较好是190分子以下，更好是180分子以下。
或者，在有机化合物为蒽环类物质的情况下，包封在1分子铁蛋白中的蒽环类物质的数量也可不区分(a)天然铁蛋白、或者(b)基因重组铁蛋白来进行规定。这样的情况下，包封在1分子铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以为100分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以较好是110分子以上，更好是120分子以上，进一步更好是130分子以上，再进一步更好是140分子以上，特别好是150分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的蒽环类物质的数量可以较好是190分子以下，更好是180分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为组胺H2受体拮抗剂的情况下，包封在1分子铁蛋白中的组胺H2受体拮抗剂的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的组胺H2受体拮抗剂的数量可以较好是20分子以上，更好是30分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的组胺H2受体拮抗剂的数量可以较好是150分子以下，更好是100分子以下，进一步更好是50分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为双胍类物质的情况下，包封在1分子铁蛋白中的双胍类物质的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的双胍类物质的数量可以较好是20分子以上，更好是30分子以上，进一步更好是40分子以上，再进一步更好是50分子以上，特别好是60分子以上、或70分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的双胍类物质的数量可以较好是150分子以下，更好是100分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为ATP敏感性钾通道开放剂的情况下，包封在1分子铁蛋白中的ATP敏感性钾通道开放剂的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的ATP敏感性钾通道开放剂的数量可以较好是20分子以上，更好是30分子以上，进一步更好是40分子以上，再进一步更好是50分子以上，特别好是60分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的ATP敏感性钾通道开放剂的数量可以较好是150分子以下，更好是100分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为β2肾上腺素能受体激动剂的情况下，包封在1分子铁蛋白中的β2肾上腺素能受体激动剂的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的β2肾上腺素能受体激动剂的数量可以较好是20分子以上，更好是30分子以上，进一步更好是40分子以上，再进一步更好是50分子以上，特别好是60分子以上、70分子以上、80分子以上、90分子以上、100分子以上、110分子以上、或120分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的β2肾上腺素能受体激动剂的数量可以较好是150分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为咪唑啉类物质的情况下，包封在1分子铁蛋白中的咪唑啉类物质的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的咪唑啉类物质的数量可以较好是15分子以上，更好是20分子以上。此外，包封在1分子铁蛋白中的咪唑啉类物质的数量可以较好是150分子以下，更好是100分子以下，进一步更好是50分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为维生素的情况下，包封在1分子铁蛋白中的维生素的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的维生素的数量可以较好是150分子以下，更好是100分子以下，进一步更好是50分子以下，再进一步更好是30分子以下，特别好是20分子以下。
特定的实施方式中，在有机化合物为标记物质的情况下，包封在1分子铁蛋白中的标记物质的数量可以为10分子以上且200分子以下。包封在1分子铁蛋白中的标记物质的数量可以较好是150分子以下，更好是100分子以下，进一步更好是50分子以下，再进一步更好是30分子以下，特别好是20分子以下。
有机化合物在铁蛋白中的包封的确认，可通过测定铁蛋白和有机化合物的吸收峰来进行。
对铁蛋白和有机化合物的吸收峰的测定进行说明。首先，将孵育后的缓冲液中的铁蛋白通过凝胶过滤柱进行纯化。接着，对于纯化后的洗脱液，同时测量铁蛋白的吸收峰(280nm的吸光度)和有机化合物的吸收峰(例如，阿霉素的情形为480nm的吸光度)。此时，如果双方的吸收峰的洗脱位置一致，则可判定为有机化合物已被包封入铁蛋白中。根据本发明的方法，确认了有机化合物没有吸附于铁蛋白的表面，而是再现性良好地包封在铁蛋白的内腔中，故基于吸收峰的洗脱位置的一致而可以认为有机化合物已被包封入铁蛋白中。
有机化合物在铁蛋白中的包封的确认中，可并用其他方法。作为这样的其他方法，可举出例如测定铁蛋白的表面电荷和/或尺寸。
对铁蛋白的表面电荷的测定进行说明。如果孵育后的缓冲液中的铁蛋白的表面电荷(ζ-电位)与未经有机化合物的包封处理的铁蛋白的表面电荷为同等，则可判定为有机化合物并未通过吸附于铁蛋白表面而复合化(即，有机化合物包封在铁蛋白中)。表面电荷的测定可通过电泳光散射法进行。优选地，采用电泳光散射法的测定，可使用Zetasizer NanoZS(马尔文公司)进行。优选采用铁蛋白的表面电荷的测定的有机化合物的pKa例如为1～4(较好是1～3)和6～14(较好是7～14)。本发明中，也优选使用具有这样的pKa值的有机化合物。
对铁蛋白的尺寸的测定进行说明。该情况下，可进一步确认孵育后的缓冲液中的铁蛋白的尺寸与未经有机化合物的包封处理的铁蛋白的尺寸(外径约12nm)为同等。尺寸的同等性可通过动态光散射法进行。优选地，采用动态光散射法的测定可使用ZetasizerNano ZS(马尔文公司)进行。
包封在铁蛋白中的有机化合物的分子数可如下确定。(1)将孵育后的缓冲液中的铁蛋白和有机化合物分离(例如，使用脱盐柱)。(2)使铁蛋白解缔合(例如，调整至pH 2.3)，使铁蛋白中的有机化合物释放至溶液中。(3)基于吸光度通过校正曲线确定溶液中的有机化合物的浓度(重量/体积)。(4)通过标准蛋白质定量法(例如，使用以牛白蛋白为标准的蛋白质测定用CBB溶液)来确定溶液中的铁蛋白的浓度(重量/体积)。(5)求出有机化合物向铁蛋白中的导入率(有机化合物在有机化合物与铁蛋白的总重量中所占的重量)。(6)使用有机化合物的分子量，根据溶液中的有机化合物的浓度(重量/体积)确定溶液中的有机化合物的浓度(摩尔/体积)。(7)使用铁蛋白的分子量，根据溶液中的铁蛋白的浓度(重量/体积)确定溶液中的铁蛋白的浓度(摩尔/体积)。(8)求出有机化合物向铁蛋白中的导入数(有机化合物在1摩尔铁蛋白中所占的摩尔数)。
此外，本发明还提供包封有特定的有机化合物的铁蛋白。本发明的包封有有机化合物的铁蛋白中，有机化合物选自蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素、及标记物质；
包封在1分子铁蛋白中的有机化合物的分子数(包封分子数)如下：
(1)在有机化合物为蒽环类物质、且铁蛋白为天然铁蛋白的情况下，为40分子以上且200分子以下；
(2)在有机化合物为蒽环类物质、且铁蛋白为基因重组铁蛋白的情况下，为100分子以上且200分子以下；或者
(3)在有机化合物为组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素、或标记物质、且铁蛋白为天然铁蛋白或基因重组铁蛋白的情况下，为10分子以上且200分子以下。
优选地，本发明的包封有有机化合物的铁蛋白中，有机化合物可选自蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、和β2肾上腺素能受体激动剂。
本发明的包封有有机化合物的铁蛋白中的特定的有机化合物、铁蛋白、和包封分子数等构成要素具体如上所述。
进而，本发明还提供包含包封有有机化合物的铁蛋白的缓冲液。本发明的缓冲液中的有机化合物、铁蛋白、缓冲液、和包封分子数等构成要素具体如上所述。
实施例
以下，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。应予说明，以下所用的药物(低分子)均为有机化合物。此外，缓冲液的pH采用通过玻璃电极法在25℃测得的值。
＜实施例1：铁蛋白的制备＞
对编码人源铁蛋白H链(FTH(SEQ ID NO:1))单体的DNA进行了全合成。以全合成的DNA为模板，并以5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(SEQ ID NO:3)及5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(SEQ ID NO:4)为引物进行了PCR。此外，以pET20(默克公司)为模板，并以5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(SEQ ID NO:5)及5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(SEQ ID NO:6)为引物进行了PCR。将分别得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(Clean-Up System)(普洛麦格(Promega)公司)纯化后，以In-Fusion HD克隆试剂盒(Cloning Kit)(Takara Bio株式会社)在50℃下进行15分钟的In-Fusion酶处理，从而构建了携带有编码FTH单体的基因的表达质粒(pET20-FTH)。
接着，将导入了构建的pET20-FTH的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)在100ml的LB培养基(包含10g/l的细菌用胰蛋白胨(Bacto-typtone)、5g/l的细菌用酵母提取物(Bacto-yeast extract)、5g/l的NaCl、100mg/l的氨苄西林)中于37℃进行了24小时的烧瓶培养。将所得的菌体进行超声波破碎后，将上清液于60℃加热20分钟。将加热后得到的上清液注入用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp Q HP柱(GE医疗(GEHealthcare)公司)，用含0mM至500mM的NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)施以盐浓度梯度，从而分离纯化由FTH单体构成的铁蛋白(以下简称FTH铁蛋白)。将含该蛋白质的溶液的溶剂通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤而置换为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。将该溶液注入用10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，利用尺寸来分离纯化FTH铁蛋白。将含该FTH铁蛋白的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)，以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。结果是，可以得到1ml含有5mg/ml的FTH铁蛋白的溶液。
＜实施例2：pH条件的探讨＞
为了确立不经解缔合/重缔合工艺而将低分子导入FTH铁蛋白内的方法(一步工艺)，进行了pH条件的探讨。
在0.1ml的50mM缓冲液(pH 3～9)中以FTH铁蛋白和盐酸阿霉素(Doxorubicinhydrochloride)(DOX，CAS No.25316-40-9，分子量579.98)的最终浓度分别成为1mg/ml和0.1mg/ml的方式进行混合，分别于25℃放置60分钟。该反应中，pH为3、4、5和6时采用乙酸盐缓冲液，pH为7、8和9时使用Tris盐酸盐缓冲液。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.1ml，通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司)测定了280nm和480nm的吸光。根据所得的吸光度，通过由各种浓度的DOX和FTH铁蛋白的280nm和480nm的吸光度制成的校正曲线确定了DOX和FTH铁蛋白的浓度。基于该浓度，求出药物导入率(DOX在DOX与FTH铁蛋白的总重量中所占的重量)。
其结果是，pH为6以下时，药物导入率为0.5％(wt)以下，这提示少许DOX被纳入(图1)。另一方面，pH为7以上时，伴随pH的上升，药物导入率上升，pH为9时药物导入率为1％(wt)以上。由以上结果提示，pH为7以上时可以在FTH铁蛋白内导入DOX。
＜实施例3：温度条件的探讨＞
为了确立不经解缔合/重缔合工艺而将低分子导入FTH铁蛋白内的方法(一步工艺)，进行了温度条件的探讨。
在0.1ml的50mM Tris盐酸盐缓冲液(pH 9)中以FTH铁蛋白和盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride)(DOX，CAS No.25316-40-9，分子量579.98)的最终浓度分别成为1mg/ml和0.1mg/ml的方式进行混合，分别于10℃至60℃放置60分钟。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.1ml，通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定了280nm和480nm的吸光。根据所得的吸光度，通过由各种浓度的DOX和FTH铁蛋白的280nm和480nm的吸光度制成的校正曲线确定了DOX和FTH铁蛋白的浓度。基于该浓度，求出药物导入率(DOX在DOX与FTH铁蛋白的总重量中所占的重量)。
其结果是，20℃以上时，在反应温度上升的同时，药物导入率上升，60℃时药物导入率为5％(wt)以上(图2)。由该结果提示，在室温以上时，DOX被有效地导入FTH铁蛋白内。
＜实施例4：反应时间的探讨＞
为了确立不经解缔合/重缔合工艺而将低分子导入FTH铁蛋白内的方法(一步工艺)，进行了反应时间条件的探讨。
在0.5ml的50mM Tris盐酸盐缓冲液(pH 9)中以FTH铁蛋白和盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride)(DOX，CAS No.25316-40-9，分子量579.98)的最终浓度分别成为1mg/ml和0.1mg/ml的方式进行混合，于60℃放置5分钟至60分钟。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩。向该溶液中添加甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)以使最终浓度成为100mM，调整至容量0.2ml。在此，通过调整至pH 2.3，从而FTH铁蛋白解缔合，纳入在FTH铁蛋白内的DOX被释放至溶液中。将该溶液通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定480nm的吸光，确定了DOX的浓度。此外，关于溶液中的蛋白质浓度，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)，以牛白蛋白为标准进行确定。基于该浓度，求出药物导入率(DOX在DOX与FTH铁蛋白的总重量中所占的重量)。
其结果确认了，到放置时间30分钟为止，DOX纳入量随着放置时间而上升，每1g铁蛋白以1.7mg-DOX/分钟的速度纳入DOX(图3)。此外，30分钟之后，药物导入率未确认到较大的变化。此时的最大药物导入率为5％(wt)，推测每1个FTH铁蛋白中所纳入的DOX的平均分子数为50个。
＜实施例5：反应液中的FTH铁蛋白与DOX的量比的探讨＞
为了确立不经解缔合/重缔合工艺而将低分子导入FTH铁蛋白内的方法(一步工艺)，进行了量比条件的探讨。
向0.5ml的含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH9)中，混合盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride)(DOX，CAS No.25316-40-9，分子量579.98)以使最终浓度为0.05mg/l至0.5mg/l，于60℃放置60分钟。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩。向该溶液中添加甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)以使最终浓度为100mM，调整至容量0.5ml。将该溶液通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定480nm的吸光，确定了DOX的浓度。此外，关于溶液中的蛋白质浓度，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)，以牛白蛋白为标准进行确定。基于该浓度，求出药物导入率(DOX在DOX与FTH铁蛋白的总重量中所占的重量)。
其结果确认了，FTH铁蛋白与DOX的浓度比至10:3为止，DOX纳入量随着浓度比而上升，最大的药物导入率为16％(wt)(图4)。推测此时的每1个FTH铁蛋白中所纳入的DOX的平均分子数为165个。另一方面，FTH铁蛋白与DOX的浓度比为10:4时纳入量下降，为10:5时未能回收蛋白质。认为其原因在于，在高浓度区域DOX析出，在该DOX沉淀的同时FTH铁蛋白也沉淀。
此时，由现有知识(Journal ofControlled Release 196(2014)184-196、ProcNatl Acad Sci USA.2014111(41):14900-5)中报道的数据所计算的采用以往方法的在铁蛋白内的药物导入率为3％(wt)至4％(wt)，本次的方法与以往方法相比可导入4倍至5倍以上的较多的药物。此外，已在销售的作为包封有阿霉素的脂质体的DOXIL(ドキシル)(批准编号：21900AMX00001000)的药物导入率为11％(wt)，本次的方法与DOXIL相比可导入1.4倍以上的较多的药物。
＜实施例6：包封有DOX的FTH铁蛋白的分散性＞
确认了通过一步工艺得到的包封有低分子的FTH铁蛋白实际上包封有低分子。
向1ml的含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH9)中，混合DOX以使最终浓度为0.1mg/l，于60℃放置60分钟。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩。混合同样制备的5ml份量的含包封有DOX的FTH铁蛋白的10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)，进而通过超滤使成为容量1ml，将该溶液注入用10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，一边利用尺寸来分离纯化，一边同时测量280nm的吸光和480nm的吸光。
其结果是，在与不含DOX的FTH铁蛋白相同的洗脱位置观察到被推测为来源于DOX的480nm的吸光峰，可知DOX与FTH铁蛋白以通过采用超滤的稀释清洗和凝胶过滤柱所无法分离的程度牢固地复合化(图5)。该DOX-FTH铁蛋白复合物的溶液分散性也通过ZetasizerNano ZS(马尔文公司)进行了测定，因而可确认该DOX-FTH铁蛋白复合物为与野生型FTH铁蛋白同等的直径12nm的水溶液分散性纳米粒子(图6)。该测定中，将50μl以FTH铁蛋白量计含1mg/ml的DOX-FTH铁蛋白复合物的10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)加入ZEN0040测定池中，按照材料设定(RI：1.450，吸收：0.001)、分散剂(Dispersant)设定(温度：25℃，粘度：0.8872cP，RI：1.330，介电常数：78.5)、马克·霍温克(Mark-Houwink)参数(A参数：0.428，K参数：7.67×10-5cm2/s)、测量角为173°背散射(Backscatter)的条件于25℃进行。
＜实施例7：包封有DOX的FTH铁蛋白的表面电荷＞
通过表面电荷的评价确认了采用一步工艺得到的包封有低分子药物的FTH铁蛋白中的低分子药物的包封。
向1ml的含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)中，混合DOX以使最终浓度为0.3mg/l，于40℃放置60分钟。放置和离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，获得了悬浮于1ml水中的DOX与FTH铁蛋白的复合物。
接着，将该DOX-FTH铁蛋白复合物按照最终浓度以FTH铁蛋白量计成为0.1g/l的条件分别悬浮于最终浓度50mM的磷酸盐缓冲液(pH3、6或7)、乙酸盐缓冲液(pH4或5)、Tris盐酸盐缓冲液(pH8或9)、或者碳酸钠缓冲液(pH10)，在该缓冲液中，通过Zetasizer Nano ZS(马尔文公司)测定了25℃时的表面电荷。测定中，将750μl样品加入DTS1070测定池中，按照材料设定(RI：1.450，吸收：0.001)、分散剂设定(温度：25℃，粘度：0.8872cP，RI：1.330，介电常数：78.5)、斯莫鲁霍夫斯基模型(Smoluchowski model)(Fκa值：1.50)的条件进行。其结果是，未进行DOX包封处理的FTH铁蛋白与DOX-FTH铁蛋白复合物的表面电荷为同等，可知并未通过在FTH铁蛋白表面吸附DOX而复合化(图7)。
即，将DOX与FTH铁蛋白在水溶液中放置而以一步工艺获得的该DOX-FTH铁蛋白复合物的表面电荷与FTH铁蛋白为同等，认为并非在FTH铁蛋白表面吸附碱性的DOX，而是形成在FTH铁蛋白的内部包封有DOX的结构。
＜实施例8：包封有DOX的FTH铁蛋白的稳定性评价＞
对通过一步工艺得到的包封有低分子药物的FTH铁蛋白的稳定性进行了评价。
向1ml的含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)中，混合DOX以使最终浓度为0.3mg/l，于40℃放置60分钟。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，获得了悬浮于1ml水中的DOX与FTH铁蛋白的复合物。另外，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了其含有蛋白质的浓度。
将该DOX-FTH铁蛋白复合物按照最终浓度以含有蛋白质的浓度计成为1.5g/l的条件分别悬浮于最终浓度50mM的乙酸盐缓冲液(pH4)、50mM的磷酸盐缓冲液(pH6)、50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH9)、或者D-PBS(-)(pH7.4，富士胶卷和光纯药株式会社制)，将各0.1ml保存于阴凉处(4℃)。然后，间隔数天分别回收3份各条件的样品，通过Vivaspin 500-100K(GE医疗公司)分离DOX-FTH铁蛋白复合物与缓冲液。分别通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定480nm的吸光度，对未流出至缓冲液中而维持在DOX-FTH铁蛋白复合物中的DOX的量进行了定量。
由其结果可知，即使放置了2周以上后，从在pH6至pH9的缓冲液中保存的DOX-FTH铁蛋白复合物几乎未流出DOX(图8，平均值±标准差)。另一方面，pH为4时，放置刚结束后虽然流出30％(wt)左右的DOX，但其后的流出变缓。即，可知DOX-FTH铁蛋白复合物在合适的pH条件下稳定地维持。
＜实施例9：FTH铁蛋白中的DOX状态的推定＞
铁蛋白呈直径12nm的笼状，其内部空腔的直径为7nm。理想的是，内腔的容积为0.18zl(zl：Zepto little，10-21升)。若1分子的DOX(分子量579.98)存在于铁蛋白的内腔的情况下，DOX在铁蛋白内腔中的浓度为5.4g/l。可确认DOX于室温下在水中的溶解性为60g/l以上。此次，每1个FTH铁蛋白中最多导入有165个DOX分子，此时的DOX在铁蛋白内腔中的浓度为890g/l。该浓度大幅高于在室温下的DOX的水中溶解度，在铁蛋白内腔中析出而形成纳米粒子的可能性高。因此，纳入铁蛋白中的DOX的定量中，需要将铁蛋白一度解缔合，使DOX释放后，进行分光评价。
＜实施例10：一步工艺与解缔合/重缔合工艺的比较(1)＞
对分别采用一步工艺和解缔合/重缔合工艺而得到的包封有DOX的FTH铁蛋白中的DOX包封量进行了比较。
解缔合/重缔合工艺的情况下，将0.5ml含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白和最终浓度0.2mg/l的DOX的50mM的甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)在室温下放置5分钟至120分钟。然后，加入10μl的1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)中和，在室温下放置5分钟至120分钟。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.1ml，通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定了280nm和480nm的吸光。根据所得的吸光度，通过由各种浓度的DOX和FTH铁蛋白的280nm和480nm的吸光度所制成的校正曲线确定了DOX和FTH铁蛋白的浓度。基于该浓度，求出药物导入率(DOX在DOX与FTH铁蛋白的总重量中所占的重量)。
其结果是，放置了15分钟的FTH铁蛋白的情形确认了最高的药物导入率，为2％(wt)左右(图9)。另一方面，使用最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白和最终浓度0.2mg/l的DOX的采用一步工艺得到的包封有DOX的FTH铁蛋白的药物导入率高至其5倍(图4)。因此，可知采用一步工艺能够得到具有更高的药物包封率的FTH铁蛋白。
＜实施例11：一步工艺与解缔合/重缔合工艺的比较(2)＞
对分别采用一步工艺和解缔合/重缔合工艺而得到的FTH铁蛋白的回收率进行了比较。
一步工艺的情况下，将0.1ml含10mg/ml的FTH铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH9)于60℃放置60分钟。然后，加入2.9ml的10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，注入用10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 16/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，一边利用尺寸进行分离纯化，一边测量280nm的吸光。
解缔合/重缔合工艺的情况下，将0.1ml含10mg/ml的FTH铁蛋白的50mM的甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)在室温下放置15分钟，从而使FTH铁蛋白解缔合成单体。然后，加入10μl的1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)中和，在室温下放置15分钟，从而使FTH铁蛋白重缔合(复性)。然后，加入2.9ml的10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)，注入用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp 16/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，一边利用尺寸进行分离纯化，一边测量280nm的吸光。
此外，作为对照，将未进行60℃放置和解缔合/重缔合处理的等量的FTH铁蛋白也注入用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 16/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，一边利用尺寸进行分离纯化，一边测量280nm的吸光。
其结果是，于60℃放置60分钟的采用一步工艺得到的FTH铁蛋白的回收率为未处理FTH铁蛋白的97％。另一方面，采用解缔合/重缔合工艺得到的FTH铁蛋白的回收率为未处理FTH铁蛋白的72％，在洗脱后半还可确认到未能重缔合的FTH铁蛋白单体。
由以上的内容可知，不会积极地破坏FTH铁蛋白的超分子结构的一步工艺，与一度破坏了FTH铁蛋白的超分子结构的解缔合/重缔合工艺相比，处理后回收的FTH铁蛋白量明显更多，是更有效的方法(图10)。
＜实施例12：采用一步工艺的低分子药物导入(1)＞
采用一步工艺在FTH铁蛋白内导入了各种低分子。
此次所导入的低分子药物示于表1。向含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白的最终浓度50mM的磷酸盐缓冲液(pH3、6或7)、乙酸盐缓冲液(pH4或5)、Tris盐酸盐缓冲液(pH8或9)、或者碳酸钠缓冲液(pH10)中，混合各种低分子药物以使最终浓度成为0.2mM～5mM，于20℃～60℃分别放置60分钟。所有的反应以容量0.1ml进行反应。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，从而将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.1ml。
此外，作为对照，也进行了表1所示的一部分低分子药物的采用解缔合/重缔合工艺的向铁蛋白内的导入。即，将0.5ml分别含最终浓度1mg/ml的FTH铁蛋白和最终浓度0.2mg/l的各种低分子药物的50mM的甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)在室温下放置15分钟。然后，加入10μl的1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)中和，在室温下放置15分钟。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.1ml。
[表1]
表1.
利用分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定这些溶液的吸光度，同时使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。对于罗丹明B和刚果红，测定了280nm和480nm的吸光度；对于法莫替丁、二甲双胍、米诺地尔、特布他林、肌酐、烟酰胺、核黄素和硫胺素，测定了250nm和280nm的吸光度。然后，通过根据用蛋白质测定用CBB溶液定量的蛋白质含量所推定的来源于蛋白质的吸光度进行了校正后，基于由各分子的吸光度制成的校正曲线确定了低分子药物的浓度。
采用一步工艺的各低分子药物的导入条件(反应pH、反应温度和反应时间)和包封数(包封在每1笼的铁蛋白24聚体中的低分子的数量)、导入率(低分子在低分子与铁蛋白的总重量中所占的重量，重量％)示于表2、3。其结果是，分子量和pKa等物性不同的各种低分子药物均可采用一步工艺简便地导入铁蛋白内。
[表2]
表2.采用一步下艺的各低分子药物的导入中的条件及结果(其一)
| No. | 导入低分子 | pH | 温度(℃) | 时间(分钟) | 药物的包封数 | 导入率(重量％) |
| 1 | 罗丹明B | 4 | 60 | 60 | 4.3 | 0.4 |
| 2 | 罗丹明B | 5 | 60 | 60 | 16.7 | 1.5 |
| 3 | 罗丹明B | 6 | 60 | 60 | 3.5 | 0.3 |
| 4 | 罗丹明B | 7 | 60 | 60 | 2.3 | 0.2 |
| 5 | 罗丹明B | 8 | 60 | 60 | 1.8 | 0.2 |
| 6 | 罗丹明B | 9 | 60 | 60 | 2.5 | 0.2 |
| 7 | 罗丹明B | 10 | 60 | 60 | 6.6 | 0.6 |
| 8 | 罗丹明B | 8 | 20 | 60 | 11.1 | 1.0 |
| 9 | 罗丹明B | 9 | 30 | 60 | 7.6 | 0.7 |
| 10 | 罗丹明B | 9 | 40 | 60 | 3.9 | 0.4 |
| 11 | 罗丹明B | 9 | 50 | 60 | 2.6 | 0.2 |
| 12 | 罗丹明B | 10 | 40 | 60 | 3.2 | 0.3 |
| 13 | 罗丹明B | 10 | 50 | 60 | 2.6 | 0.2 |
| 14 | 刚果红 | 3 | 25 | 60 | 0.2 | 0.0 |
| 15 | 刚果红 | 4 | 25 | 60 | 3.7 | 0.5 |
| 16 | 刚果红 | 5 | 25 | 60 | 1.0 | 0.1 |
| 17 | 刚果红 | 6 | 25 | 60 | 0.9 | 0.1 |
| 18 | 刚果红 | 7 | 25 | 60 | 0.7 | 0.1 |
| 19 | 刚果红 | 8 | 25 | 60 | 0.8 | 0.1 |
| 20 | 刚果红 | 9 | 25 | 60 | 0.8 | 0.1 |
| 21 | 刚果红 | 6 | 10 | 60 | 1.4 | 0.2 |
| 22 | 刚果红 | 6 | 20 | 60 | 1.4 | 0.2 |
| 23 | 刚果红 | 6 | 30 | 60 | 1.6 | 0.2 |
| 24 | 刚果红 | 6 | 40 | 60 | 1.7 | 0.2 |
| 25 | 刚果红 | 6 | 50 | 60 | 1.8 | 0.2 |
| 26 | 刚果红 | 6 | 60 | 60 | 2.8 | 0.4 |
| 27 | 法莫替丁 | 4 | 40 | 60 | 0.0 | 0.0 |
| 28 | 法莫替丁 | 6 | 40 | 60 | 15.1 | 1.0 |
| 29 | 法莫替丁 | 8 | 40 | 60 | 8.4 | 0.6 |
| 30 | 法莫替丁 | 10 | 40 | 60 | 5.1 | 0.3 |
[表3]
表3.采用一步工艺的各低分子药物的导入中的条件及结果(其二)
| No. | 导入低分子 | pH | 温度(℃) | 时间(分钟) | 药物的包封数 | 导入率(重量％) |
| 31 | 法莫替丁 | 6 | 20 | 60 | 36.9 | 2.4 |
| 32 | 法莫替丁 | 6 | 60 | 60 | 23.4 | 1.6 |
| 33 | 二甲双胍 | 4 | 40 | 60 | 0.0 | 0.0 |
| 34 | 二甲双胍 | 6 | 40 | 60 | 0.2 | 0.0 |
| 35 | 二甲双胍 | 8 | 40 | 60 | 2.9 | 0.1 |
| 36 | 二甲双胍 | 10 | 40 | 60 | 1.8 | 0.0 |
| 37 | 二甲双胍 | 8 | 20 | 60 | 78.0 | 1.9 |
| 38 | 二甲双胍 | 8 | 60 | 60 | 53.5 | 1.3 |
| 39 | 米诺地尔 | 4 | 40 | 60 | 8.3 | 0.3 |
| 40 | 米诺地尔 | 6 | 40 | 60 | 20.0 | 0.8 |
| 41 | 米诺地尔 | 8 | 40 | 60 | 12.0 | 0.5 |
| 42 | 米诺地尔 | 10 | 40 | 60 | 4.3 | 0.2 |
| 43 | 米诺地尔 | 6 | 20 | 60 | 65.6 | 2.6 |
| 44 | 米诺地尔 | 6 | 60 | 60 | 12.0 | 0.5 |
| 45 | 特布他林 | 4 | 40 | 60 | 0.0 | 0.0 |
| 46 | 特布他林 | 6 | 40 | 60 | 19.5 | 0.9 |
| 47 | 特布他林 | 8 | 40 | 60 | 21.0 | 0.9 |
| 48 | 特布他林 | 10 | 40 | 60 | 27.1 | 1.2 |
| 49 | 特布他林 | 10 | 20 | 60 | 32.8 | 1.4 |
| 50 | 特布他林 | 10 | 60 | 60 | 126.8 | 5.3 |
| 51 | 肌酐 | 4 | 20 | 60 | 15.8 | 0.4 |
| 52 | 肌酐 | 4 | 60 | 60 | 24.8 | 0.5 |
| 53 | 烟酰胺 | 4 | 40 | 60 | 15.6 | 0.4 |
| 54 | 烟酰胺 | 6 | 40 | 60 | 6.8 | 0.2 |
| 55 | 烟酰胺 | 8 | 40 | 60 | 13.9 | 0.3 |
| 56 | 烟酰胺 | 10 | 40 | 60 | 7.6 | 0.2 |
| 57 | 核黄素 | 4 | 40 | 60 | 6.4 | 0.5 |
| 58 | 核黄素 | 6 | 40 | 60 | 6.5 | 0.5 |
| 59 | 核黄素 | 8 | 40 | 60 | 6.4 | 0.5 |
| 60 | 核黄素 | 10 | 40 | 60 | 7.7 | 0.6 |
| 61 | 硫胺素 | 4 | 40 | 60 | 11.6 | 0.8 |
| 62 | 硫胺素 | 6 | 40 | 60 | 13.9 | 0.9 |
| 63 | 硫胺素 | 8 | 40 | 60 | 13.7 | 0.9 |
| 64 | 硫胺素 | 10 | 40 | 60 | 13.6 | 0.9 |
此外，各低分子药物的pKa与在铁蛋白内的导入量最多的反应中使用的缓冲液pH的关系示于表4、5。它们的相关性示于图11。其相关系数为0.84，存在占优(显著)的正相关(t-检验，p＜1％)。并且提示了：pKa低于中性(pH7)的分子，在酸性条件(pH6以下)下被有效地导入铁蛋白内；pKa高于中性的分子，在弱酸性条件至碱性条件(pH6以上)下被有效地导入铁蛋白内。
[表4]
表4.有机化合物与其特征的关系(其一)
[表5]
表5.有机化合物与其特征的关系(其二)
进而，对采用一步工艺导入铁蛋白内的低分子药物的量与采用解缔合/重缔合工艺导入铁蛋白内的低分子药物的量进行了比较。图12表示采用一步工艺的药物导入量与采用解缔合/重缔合工艺的药物导入量之比。关于DOX的导入量比较，使用实施例5和实施例10进行计算。在任何低分子药物的情况下，一步工艺这种方式均可将较多的药物导入铁蛋白内，即使是导入量的差异最小的二甲双胍也可确认到2.5倍的差异，导入量的差异最大的DOX可确认到30倍的差异。对于解缔合/重缔合工艺而言，铁蛋白重缔合时，将反应液中的低分子卷入并使其包封，因此很难实现以反应液中的低分子以上的浓度进行的包封。此外，在酸性条件下使其解缔合成铁蛋白单体时，铁蛋白单体结构发生部分变性，重缔合后也存在内部的药物泄漏的风险；
另一方面，对于一步工艺而言，在可维持铁蛋白的超分子结构的环境下，能够将药物导入铁蛋白内部。因此认为，即使在反应结束后也对铁蛋白本身的损伤少，而且几乎没有泄漏。由于在维持铁蛋白的超分子结构的状态下导入了各种各样的药物，因此药物向铁蛋白中的导入被推测与金属离子同样通过三重对称通道进行(T Douglas和DR RipollProtein Sci,7,1083-1091.(1998)、MA Carrondo EMBO J.22,1959-1968.(2003))。作为理由认为是，通道以外的铁蛋白的结构紧密，甚至金属离子也无法通过，认为与其相比排阻体积更大的有机分子无法通过。并且，在中性的缓冲液中，三重对称通道带负电，与基于其静电势梯度的金属离子的流入同样，有机分子也被主动地纳入铁蛋白内部，蓄积于带负电的铁蛋白内部，因此认为可实现以反应液中的低分子以上的浓度进行的包封。此外推测，如果从带负电的铁蛋白表面的孔通过其静电势梯度导入至内部，则具有大量氨基而易带正电的有机分子更容易被纳入。
由此可知，一步工艺可导入比以往的解缔合/重缔合工艺更多的药物。
＜实施例13：包封有DOX的突变型FTH铁蛋白的构建(1)＞
使用一步工艺进行了药物向递呈肽适体的铁蛋白中的导入。
首先，对编码人源铁蛋白H链(FTH-BC-TBP)单体的DNA进行了全合成，在该人源铁蛋白H链单体中，在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区中插入融合有钛识别肽(minTBP1：RKLPDA(SEQ ID NO:7))。以全合成的DNA为模板，并以5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(SEQ ID NO:8)及5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(SEQ ID NO:9)为引物进行了PCR。此外，以pET20(默克公司)为模板，并以5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(SEQ ID NO:10)及5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(SEQ ID NO:11)为引物进行了PCR。将这些PCR产物用Wizard DNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化后，以In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio株式会社)在50℃下进行15分钟的In-Fusion酶处理，从而构建了携带有编码FTH-BC-TBP单体的基因的表达质粒(pET20-FTH-BC-TBP)。根据需要，将由FTH-BC-TBP单体构成的铁蛋白简称为FTH-BC-TBP铁蛋白。
此外，以携带有编码人源铁蛋白H链单体的DNA的pET20-FTH为模板，并以5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(SEQ ID NO:12)及5'-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG-3'(SEQ ID NO:13)为引物进行了PCR。将得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化后，用限制酶DpnI和BamHI(Takara Bio株式会社)处理，进行自身连接，从而构建了携带有编码在C末端附加有半胱氨酸的FTHc单体的基因的表达质粒(pET20-FTHc)。根据需要，将由FTHc单体构成的铁蛋白简称为FTHc铁蛋白。
接着，将分别导入了构建的携带有突变铁蛋白单体(FTH-BC-TBP单体、或FTHc单体)的载体pET20-FTH-BC-TBP或pET20-FTHc的大肠埃希氏菌BL21(DE3)分别在100ml的LB培养基(包含10g/l的细菌用胰蛋白胨(Bacto-typtone)、5g/l的细菌用酵母提取物(Bacto-yeast extract)、5g/l的NaCl、100mg/l的氨苄西林)中于37℃进行了24小时的烧瓶培养。将所得的各菌体进行超声波破碎后，将上清液于60℃加热20分钟。将加热后得到的上清液注入用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp Q HP柱(GE医疗公司)，用含0mM至500mM的NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)施以盐浓度梯度，从而分离纯化目标蛋白。将含该蛋白质的溶液的溶剂通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤置换为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。将该溶液注入用10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，利用尺寸来分离纯化各突变铁蛋白。将含该各突变铁蛋白的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤分别浓缩，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。结果是，可分别获得：1ml含有0.2mg/ml的FTH-BC-TBP铁蛋白的溶液和1ml含有5mg/ml的FTHc铁蛋白的溶液。
在1ml的含最终浓度1mg/ml的各突变铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)中，混合DOX以使最终浓度成为0.3mg/l，于50℃放置60分钟。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(SephadexG-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，获得了悬浮于1ml水中的DOX与各突变铁蛋白的复合物。并且，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了其含有蛋白质的浓度。此外，通过480nm的吸光分析确定了DOX浓度。
其结果是，两种突变铁蛋白中均可导入DOX。关于此时的药物导入率，FTH-BC-TBP铁蛋白中的药物导入率为6.5％(wt)，FTHc铁蛋白中的药物导入率为8.6％(wt)。即，可知即使是插入肽而功能化的铁蛋白中也可使用一步工艺导入药物。
＜实施例14：包封有DOX的突变型FTH的构建(2)＞
使用一步工艺进行了药物向递呈肽适体的铁蛋白中的导入。
首先，为了获得编码在铁蛋白单体的N末端插入融合有癌识别肽(HER2a：MARSGL(SEQ ID NO:14)；M Houimel等,Int.J.Cancer 92,748-755.(2001))的人源铁蛋白H链(HER2a-FTH)单体的DNA，以携带有编码人源铁蛋白H链单体的DNA的pET20-FTH为模板，并以5'-TTTCATATGGCACGTAGTGGTTTAACGACCGCGTCCACCTCG-3'(SEQ ID NO:15)及5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(SEQ ID NO:16)为引物进行了PCR。将得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化后，用限制酶DpnI和NdeI(Takara Bio株式会社)处理，进行自身连接，从而构建了携带有编码HER2a-FTH的基因的表达质粒(pET20-HER2a-FTH)。根据需要，将由HER2a-FTH单体构成的铁蛋白简称为HER2a-FTH铁蛋白。
为了获得编码在铁蛋白单体的C末端插入融合有RNA识别肽(U2AF：TRQARR(SEQ IDNO:17)R Tan和AD Frankel,Proc Natl Acad Sci USA 92,5282-5286.(1995))的人源铁蛋白H链(FTH-U2AF)的DNA，以携带有编码人源铁蛋白H链单体的DNA的pET20-FTH为模板，并以5'-TTTGGATCCTTATCTGCGTGCTTGACGTGTGCTTTCATTATCACTG-3'(SEQ ID NO:18)及5'-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG-3'(SEQ ID NO:13)为引物进行了PCR。将得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化后，用限制酶DpnI和NdeI(Takara Bio株式会社)处理，进行自身连接，从而构建了携带有编码FTH-U2AF单体的基因的表达质粒(pET20-FTH-U2AF)。根据需要，将由FTH-U2AF单体构成的铁蛋白简称为FTH-U2AF铁蛋白。
接着，将导入了构建的携带有突变铁蛋白单体(HER2a-FTH单体、或FTH-U2AF单体)的pET20的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100ml的LB培养基(包含10g/l的细菌用胰蛋白胨(Bacto-typtone)、5g/l的细菌用酵母提取物(Bacto-yeast extract)、5g/l的NaCl、100mg/l的氨苄西林)中于37℃进行了24小时的烧瓶培养。将所得的菌体进行超声波破碎后，将上清液于60℃加热20分钟。将加热后得到的上清液注入用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp Q HP柱(GE医疗公司)，用含0mM至500mM的NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)施以盐浓度梯度，从而分离纯化目标蛋白。将含该蛋白质的溶液的溶剂通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤置换为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。将该溶液注入用10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，利用尺寸来分离纯化各突变铁蛋白。将含该各突变铁蛋白的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。结果是，可分别获得：1ml含0.8mg/ml的HER2a-FTH铁蛋白的溶液和1ml含1.1mg/ml的FTH-U2AF铁蛋白的溶液。
向1ml的含最终浓度1mg/ml的各突变铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH9)中，混合DOX以使最终浓度成为0.3mg/l，于50℃放置60分钟。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(SephadexG-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，获得了悬浮于1ml水中的DOX与突变铁蛋白的复合物。并且，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了其含有蛋白质的浓度。此外，通过480nm的吸光分析确定了DOX浓度。
其结果是，任何突变铁蛋白中均可导入DOX。关于此时的药物导入率，HER2a-FTH铁蛋白中的药物导入率为14.6％(wt)，FTH-U2AF铁蛋白中的药物导入率为17.9％(wt)。即，可知即使是插入肽而功能化的铁蛋白中也可使用一步工艺导入药物。
＜实施例15：FTH铁蛋白结构的pH依赖性＞
为了考察铁蛋白的笼状结构的pH依赖性的变化，将FTH铁蛋白按照最终浓度成为1mg/ml的条件悬浮于各pH的溶液并于25℃放置30分钟后，通过使用Zetasizer Nano ZS的动态光散射(DLS)法对各pH下的铁蛋白的尺寸进行了测定。测定于25℃实施。关于所用的溶液，使用了0.1N HCl(pH1.7)、20mM磷酸(pH2.6、pH3.2、pH5.6、pH6.7、pH7.7)、20mM乙酸(pH4.2、pH4.9、pH5.3)、1mM NaOH(pH11.1)、10mM NaOH(pH12.3)和100mM NaOH(pH12.8)。此外，关于pH2.0～pH2.4的溶液，通过向10mM Tris-HCl中滴加HCl而调节pH。
该结果提示，在pH1.7～pH2.4的范围内，基于DLS的平均粒径为8nm以下，铁蛋白解缔合，笼状结构被破坏(图13)。另一方面，可知pH2.6～pH12.8时的平均粒径为11nm以上，笼状结构得到维持。即，可知在此次的一锅(one-pot)法中，可在维持笼状结构的条件下将药物导入铁蛋白内部。
＜实施例16：包封有DOX的FTL铁蛋白的构建＞
使用一步工艺进行了药物向L链铁蛋白中的导入。对编码人源铁蛋白L链(FTL(SEQID NO:2))单体的DNA进行了全合成。以全合成的DNA为模板，并以5'-GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG-3'(SEQ ID NO:234)及5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTGAGAGTGAG-3'(SEQ ID NO:235)为引物进行了PCR。此外，以pET20(默克公司)为模板，并以5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(SEQ ID NO:5)及5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(SEQ ID NO:6)为引物进行了PCR。将分别得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化后，以In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio株式会社)在50℃下进行15分钟的In-Fusion酶处理，从而构建了携带有编码FTL单体的基因的表达质粒(pET20-FTL)。
接着，将导入了构建的pET20-FTL的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100ml的LB培养基(包含10g/l的细菌用胰蛋白胨(Bacto-typtone)、5g/l的细菌用酵母提取物(Bacto-yeastextract)、5g/l的NaCl、100mg/l的氨苄西林)中于37℃进行了24小时的烧瓶培养。将所得的菌体进行超声波破碎后，将上清液于60℃加热20分钟。将加热后得到的上清液注入用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp Q HP柱(GE医疗公司)，用含0mM至500mM的NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)施以盐浓度梯度，从而分离纯化由FTL单体构成的铁蛋白(以下简称为FTL铁蛋白)。将含该FTL铁蛋白的溶液的溶剂通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤置换为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。将该溶液注入用10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，利用尺寸来分离纯化FTL铁蛋白。将含该FTL铁蛋白的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。结果是，可分别获得1ml含3mg/ml的FTL铁蛋白的溶液。
向1ml的含最终浓度1mg/ml的各突变FTL铁蛋白的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)中，混合DOX以使最终浓度成为0.3mg/l，于50℃放置60分钟。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(SephadexG-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，获得了悬浮于1ml水中的DOX与FTL铁蛋白的复合物。并且，使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了其含有蛋白质的浓度。此外，通过480nm的吸光分析确定了DOX浓度。
其结果是，在FTL铁蛋白中可导入DOX。此时的药物导入率为7.0％(wt)。即，可知即使是FTL铁蛋白中也可通过一步工艺导入药物。
＜实施例17：采用一步工艺的低分子药物导入(2)＞
通过一步工艺，将具有带负电的官能团的荧光素钠(Cas No.518-47-8，分子量376，pKa＝2.2、4.4、6.7)导入FTH内。
向含最终浓度3mg/ml的FTH铁蛋白的最终浓度50mM的磷酸盐缓冲液(pH3或7)、或乙酸盐缓冲液(pH5)中，混合荧光素钠以使最终浓度成为300mM，于30℃或60℃分别放置60分钟。所有的反应以容量1ml进行反应。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，从而将未包封的药物与蛋白质分离，获得3.5ml样品溶液。通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定这些溶液的430nm的吸光度而确定荧光素钠的浓度，同时使用蛋白质测定用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了其含有蛋白质的浓度。
其结果示于表6。此次，根据荧光素钠的pKa的平均值4.4所预测的反应pH的最优值为pH5左右，实际上于60℃在pH3和pH5下可效率良好地导入铁蛋白内。
[表6]
表6.采用一步工艺的荧光素钠的内包(包封)
| No. | 反应温度 | pH | 荧光素钠(μM) | FTH铁蛋白(μM) | 荧光素钠/FTH铁蛋白 |
| 1 | 30℃ | 3 | 71.0 | 0.7 | 99.2 |
| 2 | 30℃ | 5 | 135.6 | 0.7 | 183.6 |
| 3 | 30℃ | 7 | 68.5 | 0.8 | 90.0 |
| 4 | 60℃ | 3 | 198.9 | 0.7 | 267.5 |
| 5 | 60℃ | 5 | 201.4 | 0.8 | 265.3 |
| 6 | 60℃ | 7 | 93.4 | 0.7 | 137.7 |
此外，作为对照，采用解缔合/重缔合工艺向铁蛋白内导入了荧光素钠。即，将0.5ml的含有最终浓度5mg/ml的FTH铁蛋白、并且以最终浓度1mM至300mM分别含有荧光素钠的50mM的甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)在室温下放置15分钟。然后，加入10μl的1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)中和，在室温下放置15分钟。放置后，加入0.5ml水，离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，将未包封的药物与蛋白质分离。将该溶液的全部量(3.5ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.1ml。
其结果是，在反应液中的荧光素钠为100mM的情况下确认到最有效的内包(表7)。对分别采用一步工艺和解缔合/重缔合工艺得到的内包有荧光素钠的FTH铁蛋白的荧光素钠内包量进行了比较，结果是采用一步工艺构建的样品中内包有2.7倍的较多的荧光素钠，提示采用一步工艺实现了更有效的药物内包。
[表7]
表7.采用解缔合/重缔合工艺的荧光素钠的内包(包封)
| No. | 反应中荧光素钠浓度(mM) | 荧光素钠(μM) | FTH铁蛋白(μM) | 荧光素钠/FTH铁蛋白 |
| 1 | 1 | 864.5 | 23.6 | 36.7 |
| 2 | 5 | 1186.3 | 25.1 | 47.2 |
| 3 | 10 | 1382.1 | 26.3 | 52.6 |
| 4 | 50 | 1764.2 | 24.3 | 72.5 |
| 5 | 100 | 2106.1 | 21.0 | 100.2 |
| 6 | 300 | 2405.1 | 26.5 | 90.8 |
<实施例18：采用一步工艺构建的内包有色素的铁蛋白的稳定性>
对采用一步工艺构建的内包有荧光素钠的FTH铁蛋白在血浆中的稳定性进行了评价。首先，在40μl人血浆(血液凝固试验用标准人血浆，GCH-100A，SIEMENS，希森美康(Sysmex)株式会社销售，Lot503264B)中，以最终浓度1mg/ml的内包有荧光素钠的FTH铁蛋白于37℃遮光静置。在反应刚开始后、放置24小时或48小时后分别回收各3份，立即冷藏保存。将所得的各样品用水稀释5倍，一边通过凝胶过滤柱分析将FTH铁蛋白与血浆蛋白质分离，一边测定430nm的分光，对FTH铁蛋白内的荧光素钠进行了定量。作为凝胶过滤柱分析的条件，使用Superdex200 increase(GE医疗集团)和PBS(pH7.4)，采用流速0.8ml/分钟。
由其结果可知，内包的荧光素钠中的94％即使48小时后仍然内包于FTH铁蛋白内，内包有荧光素钠的FTH铁蛋白在血浆中稳定(图14)。
<实施例19：采用一步工艺构建的内包有色素的铁蛋白的细胞导入>
已知铁蛋白依赖于转铁蛋白受体(T限)被转运至细胞内。为了对采用一步工艺构建的内包有药物的铁蛋白的细胞内迁移性进行评价，以荧光素钠为模型化合物，对内包有荧光素钠的FTH铁蛋白的细胞内纳入活性进行了评价。
向2ml含最终浓度3mg/ml的FTH铁蛋白的最终浓度50mM的乙酸盐缓冲液(pH5)中，混合荧光素钠以使最终浓度成为100mM，于40℃放置60分钟。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)，将上清液供于用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(SephadexG-25填充品，GE医疗公司)，从而将未包封的药物与蛋白质分离。将3.5ml得到的样品溶液供于用PBS平衡化的HiPrep 16/60Sephacryl S-300HR，用PBS以流速0.5ml/分钟洗脱内包有荧光素钠的FTH铁蛋白并纯化。纯化后，通过分光光度计(DU-800，贝克曼库尔特公司)测定通过采用Vivaspin 20-100k(GE医疗公司)的离心超滤进行了浓缩的内包有荧光素钠的FTH铁蛋白的430nm的吸光度而确定荧光素钠的浓度，同时使用蛋白质测定用CBB溶液(NacalaiTesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。其结果是，获得了1ml含有569μM的溶液荧光素钠和6.7μM的FTH铁蛋白的内包有荧光素钠的FTH铁蛋白水溶液。
向评价用培养基(Opti-MEMTM(赛默飞世尔科技公司)+1％非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技公司)+1％青霉素-链霉素(Nacalai Tesque株式会社))中分别添加内包有荧光素钠的FTH铁蛋白以使最终浓度成为0nM(荧光素钠浓度0μM)至800nM(荧光素钠浓度67.9μM)，在由此得到的培养基100μl中，添加来源于人乳腺癌的SKBR-3细胞(20000细胞/孔，96孔板)，于37℃进行了培养。该SKBR-3细胞表达转铁蛋白受体TfR。分别培养24小时后，用100μl磷酸盐缓冲生理盐水清洗2次，在50μl胰蛋白酶-EDTA(西格玛奥德里奇公司)中于37℃放置10分钟。然后，加入100μl的Opti-MEMTM培养基，将细胞转移至荧光激活细胞分选(FACS)用板，以400×g离心分离5分钟。将各细胞悬浮于FACS用缓冲液(AttuneTM Focusing Fluid，赛默飞世尔科技公司)，通过FACS(Attune NxT，赛默飞世尔科技公司)进行了分析。
其结果是，确认了内包有荧光素钠的FTH铁蛋白的依赖于浓度的荧光强度的变化，提示向细胞中的纳入量依赖于浓度而增加(图15)。
通过双光子激发荧光显微镜(CQ-1，横川电机株式会社)对以同样条件制备的细胞进行了观察，结果可以确认依赖于浓度的内包有荧光素钠的FTH铁蛋白向细胞中的纳入(图16)。
以上的结果提示，内包有药物的铁蛋白与天然型铁蛋白同样具有向细胞内的转运能力。
工业上利用的可能性
本发明的方法有望用于包封有有机化合物的铁蛋白的制造，其例如作为新型药物递送系统(DDS)受到期待或用于电子器件的制作。例如，构成本发明的多聚体的融合蛋白中的铁蛋白单体为人铁蛋白单体的情况下，本发明的多聚体作为DDS有用。此外，基于人铁蛋白单体不具有对人的抗原性和免疫原性，本发明的多聚体还具有在临床应用中安全性优异的优点。本发明的缓冲液例如在包封有有机化合物的铁蛋白的制造中有用。包封有有机化合物的铁蛋白例如作为新型药物递送系统(DDS)有用。
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法
<130> PAMA-20854
<150> JP2018-203246
<151> 2018-10-29
<160> 235
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 人源
<400> 1
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 2
<211> 175
<212> PRT
<213> 人源
<400> 2
Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala
85 90 95
Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu
100 105 110
Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys
130 135 140
Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala
145 150 155 160
Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gaaggagata tacatatgac gaccgcgtcc acctcg 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ctcgaattcg gatccttagc tttcattatc actgtc 36
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aac 33
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钛结合肽
<400> 7
Arg Lys Leu Pro Asp Ala
1 5
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gaaggagata tacatatgac gaccgcgtcc acctcg 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ctcgaattcg gatccttagc tttcattatc actgtc 36
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aac 33
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
tttggatcct taacagcttt cattatcact g 31
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 癌识别肽
<400> 14
Met Ala Arg Ser Gly Leu
1 5
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
tttcatatgg cacgtagtgg tttaacgacc gcgtccacct cg 42
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aac 33
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA识别肽
<400> 17
Thr Arg Gln Ala Arg Arg
1 5
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tttggatcct tatctgcgtg cttgacgtgt gctttcatta tcactg 46
<210> 19
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 19
Arg Gly Asp
1
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 20
Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 21
Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 22
Gly Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 23
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人铁蛋白H链和插入在人铁蛋白H链的从N末端起数第2个与第3个
α-螺旋之间的柔性连接区中的肿瘤结合肽的融合蛋白、且在
C末端具有半胱氨酸残基
<400> 23
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Ala Ser Asp Arg Gly Asp Phe Ser Gly
85 90 95
Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys
100 105 110
Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His
115 120 125
Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu
130 135 140
Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp
145 150 155 160
His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala
165 170 175
Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180 185 190
Cys
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 24
Glu Ile Leu Asp Val
1 5
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 25
Arg Glu Asp Val
1
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 26
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 27
Val Asn Thr Ala Asn Ser Thr
1 5
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 28
Asp His Leu Ala Ser Leu Trp Trp Gly Thr Glu Leu
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 29
Asn Tyr Ser Lys Pro Thr Asp Arg Gln Tyr His Phe
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 30
Ile Pro Leu Pro Pro Pro Ser Arg Pro Phe Phe Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 31
Leu Met Asn Pro Asn Asn His Pro Arg Thr Pro Arg
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 32
Cys His His Asn Leu Thr His Ala Cys
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 33
Cys Leu His His Tyr His Gly Ser Cys
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 34
Cys His His Ala Leu Thr His Ala Cys
1 5
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 35
Ser Pro Arg Pro Arg His Thr Leu Arg Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 36
Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 37
Asn Gly Tyr Glu Ile Glu Trp Tyr Ser Trp Val Thr His Gly Met Tyr
1 5 10 15
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 38
Phe Arg Ser Phe Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ser His
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 39
Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 40
Gln His Tyr Asn Ile Val Asn Thr Gln Ser Arg Val
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 41
Gln Arg His Lys Pro Arg Glu
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 42
His Ser Gln Ala Ala Val Pro
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 43
Ala Gly Asn Trp Thr Pro Ile
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 44
Pro Leu Leu Gln Ala Thr Leu
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 45
Leu Ser Leu Ile Thr Arg Leu
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 46
Cys Arg Gly Asp Cys Leu
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 47
Cys Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala Cys
1 5
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 48
Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Thr Leu
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 49
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 50
Ala Pro Ser Pro Met Ile Trp
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 51
Leu Gln Asn Ala Pro Arg Ser
1 5
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 52
Ser Trp Thr Leu Tyr Thr Pro Ser Gly Gln Ser Lys
1 5 10
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 53
Ser Trp Glu Leu Tyr Tyr Pro Leu Arg Ala Asn Leu
1 5 10
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 54
Trp Gln Pro Asp Thr Ala His His Trp Ala Thr Leu
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 55
Cys Ser Asp Ser Trp His Tyr Trp Cys
1 5
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 56
Trp His Trp Leu Pro Asn Leu Arg His Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 57
Trp His Thr Glu Ile Leu Lys Ser Tyr Pro His Glu
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 58
Leu Pro Ala Phe Phe Val Thr Asn Gln Thr Gln Asp
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 59
Tyr Asn Thr Asn His Val Pro Leu Ser Pro Lys Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 60
Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ser Val Pro Met Met Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 61
Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 62
Cys Leu Ser Tyr Tyr Pro Ser Tyr Cys
1 5
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 63
Cys Val Gly Val Leu Pro Ser Gln Asp Ala Ile Gly Ile Cys
1 5 10
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 64
Cys Glu Trp Lys Phe Asp Pro Gly Leu Gly Gln Ala Arg Cys
1 5 10
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 65
Cys Asp Tyr Met Thr Asp Gly Arg Ala Ala Ser Lys Ile Cys
1 5 10
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 66
Lys Cys Cys Tyr Ser Leu
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 67
Met Ala Arg Ala Lys Glu
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 68
Met Ser Arg Thr Met Ser
1 5
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 69
Trp Thr Gly Trp Cys Leu Asn Pro Glu Glu Ser Thr Trp Gly Phe Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Phe
20
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 70
Met Cys Gly Val Cys Leu Ser Ala Gln Arg Trp Thr
1 5 10
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 71
Ser Gly Leu Trp Trp Leu Gly Val Asp Ile Leu Gly
1 5 10
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 72
Asn Pro Gly Thr Cys Lys Asp Lys Trp Ile Glu Cys Leu Leu Asn Gly
1 5 10 15
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 73
Ala Asn Thr Pro Cys Gly Pro Tyr Thr His Asp Cys Pro Val Lys Arg
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 74
Ile Val Trp His Arg Trp Tyr Ala Trp Ser Pro Ala Ser Arg Ile
1 5 10 15
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 75
Cys Gly Leu Ile Ile Gln Lys Asn Glu Cys
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 76
Met Gln Leu Pro Leu Ala Thr
1 5
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 77
Cys Arg Ala Leu Leu Arg Gly Ala Pro Phe His Leu Ala Glu Cys
1 5 10 15
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 78
Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 79
Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser
1 5
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 80
Cys Val Ala Tyr Cys Ile Glu His His Cys Trp Thr Cys
1 5 10
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 81
Thr His Glu Asn Trp Pro Ala
1 5
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 82
Trp His Pro Trp Ser Tyr Leu Trp Thr Gln Gln Ala
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 83
Val Leu Trp Leu Lys Asn Arg
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 84
Cys Thr Val Arg Thr Ser Ala Asp Cys
1 5
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 85
Ala Ala Ala Pro Leu Ala Gln Pro His Met Trp Ala
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 86
Ser His Ser Leu Leu Ser Ser
1 5
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 87
Ala Leu Trp Pro Pro Asn Leu His Ala Trp Val Pro
1 5 10
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 88
Leu Thr Val Ser Pro Trp Tyr
1 5
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 89
Ser Ser Met Asp Ile Val Leu Arg Ala Pro Leu Met
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 90
Phe Pro Met Phe Asn His Trp Glu Gln Trp Pro Pro
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 91
Ser Tyr Pro Ile Pro Asp Thr
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 92
His Thr Ser Asp Gln Thr Asn
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 93
Cys Leu Phe Met Arg Leu Ala Trp Cys
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 94
Asp Met Pro Gly Thr Val Leu Pro
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 95
Asp Trp Arg Gly Asp Ser Met Asp Ser
1 5
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 96
Val Pro Thr Asp Thr Asp Tyr Ser
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 97
Val Glu Glu Gly Gly Tyr Ile Ala Ala
1 5
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 98
Val Thr Trp Thr Pro Gln Ala Trp Phe Gln Trp Val
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 99
Ala Gln Tyr Leu Asn Pro Ser
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 100
Cys Ser Ser Arg Thr Met His His Cys
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 101
Cys Pro Leu Asp Ile Asp Phe Tyr Cys
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 102
Cys Pro Ile Glu Asp Arg Pro Met Cys
1 5
<210> 103
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 103
Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu Ala Gln Glu Asp Gly Val
1 5 10 15
Val Gly
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 104
Ser Pro Arg Gly Asp Leu Ala Val Leu Gly His Lys
1 5 10
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 105
Ser Pro Arg Gly Asp Leu Ala Val Leu Gly His Lys Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 106
Cys Gln Gln Ser Asn Arg Gly Asp Arg Lys Arg Cys
1 5 10
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 107
Cys Met Gly Asn Lys Cys Arg Ser Ala Lys Arg Pro
1 5 10
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 108
Cys Gly Glu Met Gly Trp Val Arg Cys
1 5
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 109
Gly Phe Arg Phe Gly Ala Leu His Glu Tyr Asn Ser
1 5 10
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 110
Cys Thr Leu Pro His Leu Lys Met Cys
1 5
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 111
Ala Ser Gly Ala Leu Ser Pro Ser Arg Leu Asp Thr
1 5 10
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 112
Ser Trp Asp Ile Ala Trp Pro Pro Leu Lys Val Pro
1 5 10
<210> 113
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 113
Cys Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg Val Cys
1 5 10
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 114
Glu Thr Ala Pro Leu Ser Thr Met Leu Ser Pro Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 115
Gly Ile Arg Leu Arg Gly
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 116
Cys Pro Gly Pro Glu Gly Ala Gly Cys
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 117
Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 118
Cys Arg Gly Arg Arg Ser Thr
1 5
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 119
Cys Asn Gly Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys
1 5 10
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 120
Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Gly Cys
1 5
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 121
His Val Gly Gly Ser Ser Val
1 5
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 122
Arg Gly Asp Gly Ser Ser Val
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 123
Ser Trp Lys Leu Pro Pro Ser
1 5
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 124
Cys Arg Gly Asp Lys Arg Gly Pro Asp Cys
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 125
Gly Gly Lys Arg Pro Ala Arg
1 5
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 126
Arg Ile Gly Arg Pro Leu Arg
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 127
Cys Gly Phe Tyr Trp Leu Arg Ser Cys
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 128
Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 129
Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 130
Ser Ser Gln Pro Phe Trp Ser
1 5
<210> 131
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 131
Tyr Arg Cys Thr Leu Asn Ser Pro Phe Phe Trp Glu Asp Met Thr His
1 5 10 15
Glu Cys
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 132
Lys Thr Leu Leu Pro Thr Pro
1 5
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 133
Lys Glu Leu Cys Glu Leu Asp Ser Leu Leu Arg Ile
1 5 10
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 134
Ile Arg Glu Leu Tyr Ser Tyr Asp Asp Asp Phe Gly
1 5 10
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 135
Asn Val Val Arg Gln
1 5
<210> 136
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 136
Val Glu Cys Tyr Leu Ile Arg Asp Asn Leu Cys Ile Tyr
1 5 10
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 137
Cys Gly Gly Arg Arg Leu Gly Gly Cys
1 5
<210> 138
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 138
Trp Phe Cys Ser Trp Tyr Gly Gly Asp Thr Cys Val Gln
1 5 10
<210> 139
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 139
Asn Gln Gln Leu Ile Glu Glu Ile Ile Gln Ile Leu His Lys Ile Phe
1 5 10 15
Glu Ile Leu
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 140
Lys Met Val Ile Tyr Trp Lys Ala Gly
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 141
Leu Asn Ile Val Ser Val Asn Gly Arg His
1 5 10
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 142
Gln Met Ala Arg Ile Pro Lys Arg Leu Ala Arg His
1 5 10
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 143
Gln Asp Gly Arg Met Gly Phe
1 5
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 144
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn
1 5
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 145
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln
1 5 10 15
Arg
<210> 146
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 146
Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg
1 5 10
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 147
Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 148
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 148
Met Asp Ala Gln Thr Arg Arg Arg Glu Arg Arg Ala Glu Lys Gln Ala
1 5 10 15
Gln Trp Lys Ala Ala
20
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 149
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 150
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln
1 5 10 15
Arg
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 151
Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys
1 5 10 15
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 152
Asp Val Phe Tyr Pro Tyr Pro Tyr Ala Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 153
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 153
Arg Val Trp Tyr Pro Tyr Gly Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 154
Asp Thr Trp Pro Asn Thr Glu Trp Ser
1 5
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 155
Asp Ser Tyr His Asn Ile Trp
1 5
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 156
Asp Thr Tyr Phe Gly Lys Ala Tyr Asn Pro Trp
1 5 10
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 157
Asp Thr Ile Gly Ser Pro Val Asn Phe Trp
1 5 10
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 158
Thr Tyr Cys Asn Pro Gly Trp Asp Pro Arg Asp Arg
1 5 10
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 159
Thr Phe Tyr Asn Glu Glu Trp Asp Leu Val Ile Lys Asp Glu His
1 5 10 15
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 160
Met Thr Leu Ile Leu Glu Leu Val Val Ile
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 161
Met Thr Ser Ile Leu Glu Arg Glu Gln Arg
1 5 10
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 162
Met Thr Thr Ile Leu Gln Gln Arg Glu Ser
1 5 10
<210> 163
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 163
Val Phe Gln Phe Leu Gly Lys Ile Ile His His Val Gly Asn Phe Val
1 5 10 15
His Gly Phe Ser His Val Phe
20
<210> 164
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对生物有机分子的结合能力的肽
<400> 164
Lys Lys Ala Val Lys Val Pro Lys Lys Glu Lys Ser Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Lys Leu Thr Arg Leu Ala Val Gln Ile
20 25
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钛结合肽
<400> 165
Arg Lys Leu Pro Asp Ala
1 5
<210> 166
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 166
Ser Ser Lys Lys Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ser Lys Arg
1 5 10 15
Arg Ile Leu
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 167
Ala Tyr Pro Gln Lys Phe Asn Asn Asn Phe Met Ser
1 5 10
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 168
Arg Lys Leu Pro Asp Ala Pro Gly Met His Thr Trp
1 5 10
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 169
Arg Ala Leu Pro Asp Ala
1 5
<210> 170
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 金结合肽
<400> 170
Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser
1 5 10
<210> 171
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 171
Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val
1 5 10
<210> 172
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 172
Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Gly Val
1 5 10
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对金属材料的结合能力的肽
<400> 173
Leu Lys Ala His Leu Pro Pro Ser Arg Leu Pro Ser
1 5 10
<210> 174
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对硅材料的结合能力的肽
<400> 174
Ser Ser Lys Lys Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ser Lys Arg
1 5 10 15
Arg Ile Leu
<210> 175
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对硅材料的结合能力的肽
<400> 175
Met Ser Pro His Pro His Pro Arg His His His Thr
1 5 10
<210> 176
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对硅材料的结合能力的肽
<400> 176
Thr Gly Arg Arg Arg Arg Leu Ser Cys Arg Leu Leu
1 5 10
<210> 177
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对硅材料的结合能力的肽
<400> 177
Lys Pro Ser His His His His His Thr Gly Ala Asn
1 5 10
<210> 178
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对碳纳米材料的结合能力的肽
<400> 178
Asp Tyr Phe Ser Ser Pro Tyr Tyr Glu Gln Leu Phe
1 5 10
<210> 179
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对碳纳米材料的结合能力的肽
<400> 179
His Ser Ser Tyr Trp Tyr Ala Phe Asn Asn Lys Thr
1 5 10
<210> 180
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有对碳纳米材料的结合能力的肽
<400> 180
Tyr Asp Pro Phe His Ile Ile
1 5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 181
Gly Arg Arg Gly Lys Gly Gly
1 5
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 182
Gly Pro Leu Gly Val
1 5
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 183
Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly
1 5
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 184
Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ala Ser
1 5 10
<210> 185
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 185
Tyr Glu Val Asp Gly Trp
1 5
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 186
Leu Glu Val Asp Gly Trp
1 5
<210> 187
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 187
Val Asp Gln Met Asp Gly Trp
1 5
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 188
Val Asp Val Ala Asp Gly Trp
1 5
<210> 189
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 189
Val Gln Val Asp Gly Trp
1 5
<210> 190
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 190
Val Asp Gln Val Asp Gly Trp
1 5
<210> 191
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 191
Glu Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg Asp Ser Ala
1 5 10
<210> 192
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 192
Glu Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg
1 5
<210> 193
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 193
Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys
1 5
<210> 194
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 194
Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln Met
1 5
<210> 195
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 195
Ala Pro Ser Gly Arg Val Ser Met
1 5
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 196
Val Ser Met Ile Lys Asn Leu Gln
1 5
<210> 197
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 197
Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys Trp
1 5
<210> 198
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 198
Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr
1 5
<210> 199
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 199
Lys Met Tyr Pro Arg Gly Asn His
1 5
<210> 200
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 200
Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr
1 5
<210> 201
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 201
Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Ala
1 5
<210> 202
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 202
Ser Gly Leu Ser Arg Ile Val Asn
1 5
<210> 203
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 203
Asn Ser Arg Val Ala
1 5
<210> 204
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 204
Gln Val Arg Leu Gly
1 5
<210> 205
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 205
Met Lys Ser Arg Asn Leu
1 5
<210> 206
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 206
Arg Cys Lys Pro Val Asn
1 5
<210> 207
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 207
Ser Ser Lys Tyr Pro Asn
1 5
<210> 208
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶降解性肽
<400> 208
Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 209
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 稳定化肽
<400> 209
Cys Cys Ala Leu Asn Asn
1 5
<210> 210
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 稳定化肽
<400> 210
Pro Ala Ser
1
<210> 211
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 211
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 212
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 212
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 213
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 213
Cys Gly Tyr Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly
1 5 10
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 214
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 215
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 215
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 216
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 216
Gly Leu Ala Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met
1 5 10 15
<210> 217
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 217
Gly Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5 10
<210> 218
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 218
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 219
Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu
1 5
<210> 220
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 220
Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val
1 5 10
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 221
Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val
1 5 10 15
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 222
Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro
1 5 10
<210> 223
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 223
Asn Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Gln Arg
<210> 224
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 224
Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro Val Gln
1 5 10 15
<210> 225
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 225
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr
1 5 10
<210> 226
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 226
Val Thr Val Thr Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp
1 5 10
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 227
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys
1 5
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 228
Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Leu Ala
1 5
<210> 229
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 229
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 230
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 230
Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
1 5 10 15
<210> 231
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 231
Arg Leu Ser Gly Met Asn Glu Val Leu Ser Phe Arg Trp
1 5 10
<210> 232
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 232
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr
1 5 10 15
<210> 233
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞透过性肽
<400> 233
Pro Ile Glu Val Cys Met Tyr Arg Glu Pro
1 5 10
<210> 234
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 234
gaaggagata tacatatgag ctcccagatt cgtcag 36
<210> 235
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 235
ctcgaattcg gatccttagt cgtgcttgag agtgag 36
Claims (19)
1.一种包封有有机化合物的铁蛋白的制造方法，该方法包含：
(1)在缓冲液中将有机化合物与铁蛋白混合而获得有机化合物和铁蛋白的混合物的工序、以及
(2)在缓冲液中孵育所述混合物的工序；
其中，缓冲液的pH为3以上且低于13，
并且，在有机化合物的pKa低于7的情况下，缓冲液具有3以上且低于7的pH，
在有机化合物的pKa为7以上的情况下，缓冲液具有6以上且低于13的pH。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，缓冲液的pH与有机化合物的pKa满足式：pH＝2.6＋0.6pKa±0.4pKa的关系。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，孵育的温度为10℃以上且60℃以下。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，有机化合物的分子量为100以上且低于1000。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，有机化合物的pKa为2以上且13以下。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在1分子铁蛋白中包封有10分子以上且200分子以下的有机化合物。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，混合和孵育的合计时间为30分钟以上。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述混合中的有机化合物相对于铁蛋白的重量比(有机化合物/铁蛋白)为0.20以上且0.36以下。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，有机化合物具有带正电荷的部分、或者能够带正电荷的部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，带正电荷的部分为：
(a)选自铵基、胍鎓基、咪唑鎓基、噁唑鎓基、噻唑鎓基、噁二唑鎓基、三唑鎓基、吡咯烷鎓基、吡啶鎓基、哌啶鎓基、吡唑鎓基、嘧啶鎓基、吡嗪鎓基及三嗪鎓基中的阳离子性含氮基团；或者
(b)鏻基。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，能够带正电荷的部分为：
(a')选自氨基、胍基、硝基、酰胺基、酰肼基、酰亚胺基、叠氮基及重氮基中的含氮基团；或者
(b')膦基。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，铁蛋白为：
(1)天然铁蛋白、或者
(2)由下述(a)～(c)中的任一种的具有修饰的基因重组铁蛋白单体构成的铁蛋白，
(a)在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区中插入有功能性肽的铁蛋白单体、
(b)在N末端添加有功能性肽的铁蛋白单体、或者
(c)在C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体。
13.一种缓冲液，其是包含包封有有机化合物的铁蛋白的缓冲液，其中，
在有机化合物的pKa低于7的情况下，缓冲液具有3以上且低于7的pH，
在有机化合物的pKa为7以上的情况下，缓冲液具有6以上且低于12的pH。
14.根据权利要求13所述的缓冲液，其中，缓冲液具有6以上且9以下的pH。
15.根据权利要求13或14所述的缓冲液，其中，有机化合物具有6以上且9以下的pKa。
16.一种包封有有机化合物的铁蛋白，其中，
有机化合物选自蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素及标记物质，
包封在1分子铁蛋白中的有机化合物的分子数如下：
(1)在有机化合物为蒽环类物质且铁蛋白为天然铁蛋白的情况下，为40分子以上且200分子以下；
(2)在有机化合物为蒽环类物质且铁蛋白为基因重组铁蛋白的情况下，为100分子以上且200分子以下；或者
(3)在有机化合物为组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂、β2肾上腺素能受体激动剂、咪唑啉类物质、维生素或标记物质且铁蛋白为天然铁蛋白或基因重组铁蛋白的情况下，为10分子以上且200分子以下。
17.根据权利要求16所述的包封有有机化合物的铁蛋白，其中，
蒽环类物质为阿霉素，
组胺H2受体拮抗剂为法莫替丁，
双胍类物质为二甲双胍，
ATP敏感性钾通道开放剂为米诺地尔，
β2肾上腺素能受体激动剂为特布他林，
咪唑啉类物质为肌酐，
维生素为硫胺素、核黄素或烟酰胺，
标记物质为罗丹明B、荧光素钠或刚果红。
18.根据权利要求16或17所述的包封有有机化合物的铁蛋白，其中，有机化合物选自蒽环类物质、组胺H2受体拮抗剂、双胍类物质、ATP敏感性钾通道开放剂及β2肾上腺素能受体激动剂。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的包封有有机化合物的铁蛋白，其中，铁蛋白为：
(1)天然铁蛋白、或者
(2)由下述(a)～(c)中的任一种的具有修饰的基因重组铁蛋白单体构成的铁蛋白，
(a)在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第2个与第3个α-螺旋之间的柔性连接区中插入有功能性肽的铁蛋白单体、
(b)在N末端添加有功能性肽的铁蛋白单体、或者
(c)在C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体。
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