CN111474226B - 一种电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种电化学生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电化学生物传感器的制备方法，针对现有的电化学生物传感器上蛋白质的固定过程操作繁琐，不够稳定的问题，本发明在导电碳浆加入羧基官能化的石墨直接得到带有官能基团的电极，再依次进行链霉亲和素键合处理和牛血清白蛋白封闭制备得到电化学生物传感器，该方法操作简单，无需芯片的预处理，直接得到带有官能基团的电极，蛋白质的固定不仅稳定而且容易操作。

Description

一种电化学生物传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器的制备方法，可用于在各种丝网印刷电极、圆盘电极、针式电极上抗体、酶、核酸等生物大分子的固定。
背景技术
生物传感器属于新兴学科生物电子学的研究范畴,是一个涉及生物、化学、材料、物理、医学,以及纳米技术、微电子技术、信息技术等多学科技术在内的交叉领域。无论是对生物电子体系的机理研究,还是实际应用开发,生物传感器都激发了各国研究者广泛而持久的兴趣。生物传感器的应用领域主要包括医疗检测、环境监测、食品安全和国防应用。
生物传感器是有生物识别界面及与之衔接的信号转换器组成的分析装置，涉及一种待分析物或一组待分析物的浓度及可检测的响应。因此，对于基于蛋白质直接电子转移的电化学生物传感器而言，如何固定生物识别元件(例如氧化还原酶或蛋白质)到信号转换器上(例如电极)是一个很重要的过程。
目前应用较多的蛋白质的固定方法包括物理吸附法，溶胶-凝胶法，表面活性剂包埋法，和共价键合法。其中，共价键合法因其牢固稳定，成为目前应用较多的方法之一。该过程需要低温(0℃)、低离子强度及生理pH值条件。
Mondy报道通过双功能化的戊二醛—酶固定试剂，将葡萄糖氧化酶共价连接到一个硅烷化和阳极氧化的铂丝表面从而制备得到酶电极传感器。在三电极安培模式下通过测试阳极分解的氢气可得到响应特性。该电极持续浸泡在10mmol/L的葡萄糖中可以维持9h的寿命。Lanniello分别将葡萄糖氧化酶和L-氨基酸氧化酶通过氰脲酰氯共价键合到石墨电极上，制成葡萄糖和L-氨基酸传感器。此电极在适当条件下保存，电极的高活性可保持20-30天。
然而，目前的电极表面蛋白质共价键合方法中，都需要将已有电极表面做进一步的活化处理，使电极表面带有各种官能基团，进而利用各种官能团与蛋白之间的化学反应进行键合。例如，在前述的Mondy等人的工作中，利用戊二醛修饰电极表面，使其带有多个醛基，进一步利用醛基与酶上的氨基反应实现修饰。Lanniello课题组的工作中，石墨电极需要首先进行等离子体处理，并经氢氧化铝锂还原得到表面羟基化的电极，进一步相继引入氰脲酰氯和目标蛋白。传统方法中，也有利用消化剂(如混合酸)处理，得到硝基后再经还原为氨基。这些方法操作繁琐，步骤较多，容易引入较多的加工误差，使得批次间或批次内的变异系数较大，并且对于诸如丝网印刷电极等产品而言，后续表面处理过程需要考虑到电极其他部分的耐受性和稳定性问题，限制较多，较多反应不能应用。
发明内容
本发明目的是解决电化学生物传感器上蛋白质的固定过程操作繁琐，不够稳定的问题。本发明采用的技术方案具体如下：
一种电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
一、印刷电极
1)在PVC或PET基底上印刷导电银浆形成电极条，然后将电极在100℃烘箱内热固化40min；
2)接续印刷导电碳浆形成工作电极端，将电极在100℃烘箱内热固化40min；
所述的导电碳浆的组分中含有羧基官能化的石墨；具体的所述导电碳浆由以下质量百分数的原料制成：酚醛树脂17％、环氧树脂13％、热固性丙烯酸树脂9％、钛白粉1.0％、粒径在5～100nm纳米氧化锌1.0％、气相二氧化硅8％、消泡剂1％、羧基官能化石墨15％、石墨烯15％和高沸点溶剂20％；所述的高沸点溶剂，包括但不限于甲基环己烷，甲苯，吡啶，正丁醇，1,4-二氧六环，N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
3)再印刷Ag/AgCl混合油墨形成参比电极端，并再次将电极在100℃烘箱内热固化40min；
4)最后印刷绝缘油墨覆盖中间导电部分，在80℃下热固化5min，得到生物芯片。
二、蛋白质键合
将1mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与10mL水混合得到混合溶液；
将步骤一制得的生物芯片在室温(25℃)浸泡在上述混合溶液中20分钟后，用生物芯片点样仪加入1.3微升链霉亲和素的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，室温下摇匀放置10h；
用蒸馏水缓慢洗去没有标记键合上的链霉亲和素；所述链霉亲和素的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液中链霉亲和素的浓度是5μg/mL；
三、牛血清白蛋白(BSA)封闭
将1mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与10mL水混合得到混合溶液；
将步骤二制得的生物芯片在室温(25℃)浸泡在上述混合溶液中20分钟后，用生物芯片点样仪加入1.3微升浓度1wt％的BSA的水溶液，室温(25℃)摇匀放置10h；用蒸馏水缓慢洗去没有标记键合上的BSA，得到亲和素包被的生物传感器。
本发明的有益效果：
1.步骤简单，无需芯片的预处理，直接得到带有官能基团的电极；
2.丝网印刷电极表面的官能化基团多。
具体实施方式
下面以具体实施例的形式对本发明技术方案做进一步解释和说明。
1)在PVC或PET基底上印刷导电银浆形成电极条，然后将电极在100℃烘箱内热固化40min；
2)接续印刷导电碳浆形成工作电极端，将电极在100℃烘箱内热固化40min；
所述的导电碳浆的组分中含有羧基官能化的石墨，羧基官能化的石墨使用市售试剂即可；具体的所述导电碳浆由以下质量百分数的原料制成：酚醛树脂17％、环氧树脂13％、热固性丙烯酸树脂9％、钛白粉1.0％、粒径在5～100nm纳米氧化锌1.0％、气相二氧化硅8％、消泡剂1％、羧基官能化石墨15％、石墨烯15％和高沸点溶剂20％；所述的高沸点溶剂，包括但不限于甲基环己烷，甲苯，吡啶，正丁醇，1,4-二氧六环，N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。所述的消泡剂，是指炔二醇类，聚醚类，酯类，矿物油类和有机硅类试剂。
3)再印刷Ag/AgCl混合油墨形成参比电极端，并再次将电极在100℃烘箱内热固化40min；
4)最后印刷绝缘油墨覆盖中间导电部分，在80℃下热固化5min，得到生物芯片。
二、蛋白质键合
将1mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与10mL水混合得到混合溶液；
将步骤一制得的生物芯片在室温(25℃)浸泡在上述混合溶液中20分钟后，用生物芯片点样仪加入1.3微升链霉亲和素的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，室温下摇匀放置10h；
用蒸馏水缓慢洗去没有标记键合上的链霉亲和素；所述链霉亲和素的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液中链霉亲和素的浓度是5μg/mL；
三、牛血清白蛋白(BSA)封闭
将1mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与10mL水混合得到混合溶液；
将步骤二制得的生物芯片在室温(25℃)浸泡在上述混合溶液中20分钟后，用生物芯片点样仪加入1.3微升浓度1wt％的BSA的水溶液，室温(25℃)摇匀放置10h；用蒸馏水缓慢洗去没有标记键合上的BSA，最终得到Avidin(亲和素)包被的生物传感器。

Claims (4)

1.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：
一、印刷电极
1）在PVC或PET基底上印刷导电银浆形成电极条，然后将电极在100 oC烘箱内热固化40min；
2）接续印刷导电碳浆形成工作电极端，将电极在100 oC烘箱内热固化40 min；
所述的导电碳浆的组分中含有羧基官能化的石墨；具体的所述导电碳浆由以下质量百分数的原料制成：酚醛树脂17％、环氧树脂13％、热固性丙烯酸树脂9％、钛白粉1.0％、粒径在5~100nm纳米氧化锌1.0％、气相二氧化硅8％、消泡剂1％、羧基官能化石墨15％、石墨烯15％和高沸点溶剂20％；所述的高沸点溶剂，选自甲基环己烷，甲苯，吡啶，正丁醇，1,4-二氧六环，N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜；
3）再印刷Ag/AgCl混合油墨形成参比电极端，并再次将电极在100 oC烘箱内热固化40min；
4）最后印刷绝缘油墨覆盖中间导电部分，在80 oC下热固化5 min，得到生物芯片；
二、蛋白质键合，将步骤一获得的生物芯片使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液处理后，将链霉亲和素点样到生物芯片上；
三、牛血清白蛋白封闭，将步骤二获得的生物芯片使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液处理后，将牛血清白蛋白点样到生物芯片上得到所述的电化学生物传感器。
2. 根据权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液由1 mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.5 mmol N-羟基琥珀酰亚胺与10mL水混合得到。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤二的具体步骤如下：
将步骤一制得的生物芯片在室温浸泡在上述混合溶液中20分钟后，用生物芯片点样仪加入1.3微升链霉亲和素的0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液，室温下摇匀放置10h;
用蒸馏水缓慢洗去没有标记键合上的链霉亲和素；所述链霉亲和素的0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液中链霉亲和素的浓度是5 μg/mL。
4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤三的具体步骤如下：
将步骤二制得的生物芯片在室温浸泡在上述混合溶液中20分钟后，用生物芯片点样仪加入1.3微升浓度1wt%的BSA的水溶液，室温摇匀放置10h；用蒸馏水缓慢洗去没有标记键合上的BSA，得到所述的电化学生物传感器。
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