JP2790348B2 - 固定化方法 - Google Patents

固定化方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ポリペプチド、特に酵素もしくは他の生物
活性ポリペプチドの固定化もしくはポリマーのマトリッ
クスへの取り込み、該ポリマーによって得られる膜、お
よびバイオセンサーもしくは電気化学的センサーにおけ
るこのような膜の利用に関する。
発明の背景 従来、酵素は特に発酵分野等において、触媒として工
業的に用いられてきている。一般に、酵素は種々の水性
媒質に溶解もしくは分散して化学反応を促進する。反応
終了後、酵素は回収されず、廃棄されている。しかし、
近年酵素の固定化技術は発展しており、このため酵素を
安定かつ活性な状態でくり返しもしくは連続的に使用す
ることが可能となり、これにより酵素の使用範囲が例え
ばプロセス産業において、更にEIA（エンザイムイムノ
アッセイ）およELISA（エンザイムリンクト イムノ
ソルベント アッセイ）の如きに分析までも急速に広が
っている。
血液もしくは他の体液中の種々の成分の濃度の測定
は、臨床診断にとって極めて重要であり、従って種々の
種類の定量測定において多くの改善がなされ、開発が進
められてきている。
これらの開発の中で、酵素センサーの開発は注目され
ており、更に酵素が膜の中に固定化されているそのよう
な膜を用いることにより、急速かつ連続的測定を可能に
するような多くの提案がなされてきている。
バイオセンサーの開発に関する情報、それらの利点お
よび欠点は以下の文献に見出される：「Biosensors,Fun
damentals and Applications編集者、ターネル、カルベ
およびウイルソン、オックスフォード大学出版（1987
年）、特に409〜424頁；デイビス、Biosensors,２（198
6）101〜124およびチルチョウセ等、Biosensors,２（19
86）325〜342（これらは参考のため本明細書中で引用さ
れている）。
バイオセンサーは、化学物質の測定に対する膜内で固
定化された酵素を用いる典型的例のセンサーである。こ
のようなセンサーは、膜内に固定化された酵素並びに膜
内で消費されもしくは発生した物質を検知するように適
合した変換器を含んでなり、これは該物質を検知すると
電気信号を発生する。この場合に、膜内で固定された酵
素は、測定されるべき特定の化学物質を識別するのに役
立ち、更に物質の量的変化をもたらし、これは化学物質
内での変化に対応しかつ変換器により検知可能である。
このようなバイオセンサーの内で、グルコースの測定
のためにグルコースオキシダーゼを用いるセンサーが知
られている。
グルコースオキシダーゼは、次式に従ってグルコース
を分解するように作用する： グルコース＋O2→グルコノラクトン＋H2O2→グルコン
酸 ＋H2O2 従って、消費された酸素の量、生じた過酸化水素の
量、又は膜内での上記反応において生じたpHの減少を検
出することによりグルコースの量（活性）を測定するこ
とが可能となる。
この開発の初期において構築された酵素センサーにお
いては、膜内で固定された酵素は、酵素センサーの検知
部に物理的もしくは化学的に適用されており、該センサ
ーは物理的もしくは化学的量、例えば、温度イオン活
量、ガス活量等を電気信号に変換するように適合されて
いる。しかし、今や酵素センサーの小型化に伴い、セン
サーの検知部の限定された領域の表面上に固定化酵素を
含有する膜を選択的に形成することが必要となってきて
いる。
これらの膜が問題のバイオセンサーにおいて機能的な
ものとなりうるためには、これらの膜は該バイオセンサ
ーのタイプおよび性質に応じて多くの要求項目を充足す
る必要がある。
そのような要求項目の内で、特に生物学的液体の安定
性、臨床的に有用な範囲にわたっての応答性、高選択
性、妨害物質中での変化からの独立性、高応答性、丈夫
さ、小型化、撹拌からの独立性および生適合性が挙げら
れる。
このような要求に応えるためには、実質的に複雑な多
層の膜を含んでなるセンサーが提案された。この提案さ
れたセンサーにおいては、酵素をポリマーマトリックス
に化学的に結合されることによって固定化を達成してい
た。このようなセンサーは、製造の際に相当の技術的困
難性と経費を必要とし、かつ廃棄されねばならないセン
サーの数は極めて多い。
特定の例のバイオセンサーは、次の特許および特許出
願に開示されている。Goughに付与された米国特許4,48
4,987および同4,650,547には、センサー装置において有
用な膜、センサー装置、および例えば液中でグルコース
および酸素のような成分に対して反応性を有するガスの
存在下で溶解成分を測定するための膜の使用が開示され
ている。
西ドイツ特許公開3335691（日立社）は、固定化酵素
を含んでなる膜を有する尿素電極を開示しており、この
膜は架橋アルブミンを基材とし、エチレンジアミンで処
理され、多数のアミノ基を導入しかつ増加し、これによ
りアンモニウムイオンに対する透過性の増大が得られて
いる。
西ドイツ特許公開2625544には、生物学的材料を固定
化するプロセスが開示されており、このプロセスによれ
ば、生物学的材料は、その材料内の反応性アミノ基を介
してポリウレタンポリマー中の遊離イソシアネート基と
共有結合している。
発明の簡単な説明 本発明の目的は、ポリマーのマトリックスにポリペプ
チドを共有的に結合させることなく物理的取り込みによ
りポリマーマトリックス中にポリペプチド、特に酵素も
しくは他の生物活性ポリペプチドを固定化するための簡
易かつ信頼性の高い方法を提供することにあり、これに
よってポリマーの活性は減少しうる。
本発明の別の目的は、該ポリマーマトリックスによっ
て製造された膜を提供することにある。
更に本発明の別の目的は、バイオセンサーにおいてそ
のような膜の利用に関する。
また、本発明の別の目的は、本発明方法に従って製造
された膜を設けた、強固でかつ信頼性のある高品質のバ
イオセンサーを提供することにある。
本発明を、添付の図面および実施例を参照しながら更
に詳しく説明する。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明に係る単一層の膜の針状電極の長手
方向の断面図であり、 第２図は、測定の際使用されるように組立てられた、
本発明に係る電極を示し、 第３図は、第１図における単一層の膜の針状電極の長
手方向の断面図に対応する本発明の多層構造の膜の電極
の断面図である。
発明の詳細な説明 上述のように、一つの面における本発明はポリマーの
マトリックス中に酵素のようなポリペプチドを固定化す
る方法であって、次のａ）〜ｃ）の工程： ａ）該ポリペプチドおよび透過性変性剤を、ポリマー
水性分散体に添加して該ポリペプチドが溶解した水性分
散体を調製する工程； ｂ）該分散体を１種又はそれ以上の所望形状の物体に
造形する工程； ｃ）該造形品を、乾燥の目的のため、室温で約５分な
いし約200分の時間放置する工程； を含んでなる。
本発明によれば、酵素のようなポリペプチドを固定化
するための簡易かつ信頼性の高い方法が提供され、この
方法によれば、わずか１回の混合工程が、反応成分とポ
リマーの不活性水性分散体との間で必要とされ、何らの
化学的もしくは物理的後処理を必要としない。
従って、活性成分はその最大活性が保持される。とい
うのは、ポリマーマトリックスとの共有結合を必要とし
ないからである。
好ましい態様によれば、次の内容が見出された。すな
わち、ポリマーの水性分散体として、水性ポリウレタン
分散体を用いることにより最良の結果が得られた。
上記の態様は、該ポリペプチドがグルコースオキシダ
ーゼ、カタラーゼ、もしくはラクターゼのような酵素の
場合に、特に有用であることが判明した。
前記の透過性変性剤は、ポリマーマトリックス中に導
入され、小さな親水性分子に対する目的生成物の透過性
を制御する。更に種々の荷電した高分子物質を使用する
と好都合であることが判明した。
特に、酵素センサーに対して本発明の膜を用いる場
合、ヘパリン、アルギン酸又はアルブミンのような化合
物を添加することにより、種々の妨害物質の透過性を制
御することが可能となる。
負に荷電した物質、例えばヘパリンおよびアルギン酸
は、妨害アニオンの透過性を減少するのに特に有用であ
り、一方、アルブミンのような中性物質は、被測定物質
の透過性を制御するのに有用である。
必要ではないけれども、合理的柔軟性を有しかつクラ
ック形成のない膜を得るためには、工程ａ）において可
塑剤を添加することは実際的である。
使用する可塑剤は、ポリマー産業において通常用いら
れるいかなる可塑剤であってよいが、本発明の目的に対
しては、ジブチルフタレートが好ましく使用された。
また、以下の内容が見出された。すなわち、工程ａ）
において融合助剤を該該水性分散体へ添加することは、
分散体中の個々の粒子が融着（融合）するために極めて
有用である。
当業者に周知の任意の適当な高沸点溶剤が、使用で
き、そのような溶剤内、エチルカルビトール、ブチルカ
ルビトール又はＮ−メチル−２−ピロリドンを挙げるこ
とができる。
驚くべきことに、以下の内容が見出された。すなわ
ち、乾燥形状物体を約40℃〜約80℃の温度で約30分〜約
30時間の間温和な熱処理に委ねる場合においてさえ、固
定化酵素の活性を保持することが可能である。
特定の理論に拘束されることなく、次のように考える
ことができる。すなわち、該熱処理は有機体、例えば融
合助剤を蒸発させることによりプロセスが改善され、更
に最終製品中にクラックや孔のない平滑な表面が得られ
る。
また、次のように考えられる。この熱処理は、一方で
は他の研究者に対しバイオセンサーに使用するための機
能的膜を極めて高い収率で与えることを可能にしてい
る。
また、多層膜の製造の場合には、該加熱処理により各
々の分離層が隣接層に部分的もしくは完全に融着すると
考えられる。
本発明の好ましい態様において、本発明の膜は浸漬法
により好都合に適用され、すなわち、膜が適用されねば
ならないバイオセンサーの検知表面を、乾燥、および所
望の加熱工程前に上記分散体中に注意深く浸漬する。
膜は勿論、スプレー法又はコーチーングを付与する他
の通常の方法（ブラッシング、ローリング等）により表
面に適用することもできる。
本発明により、また、ポリウレタンの如きポリマーマ
トリックス中に固定された酵素の如きポリペプチドを含
んでなる造形品が提供される。
該造形品は、任意の好都合な形状を有することができ
るが、小さなビーズおよび膜が好ましく、特に膜が好ま
しい。
このようなセンサーの好ましい態様において、該層に
は、該層と同様の組成の１種以上の「外側」膜が設けら
れるが但し、固定化ポリペプチドもしくは酵素はない。
更に本発明の特徴として、次の内容が見出された。す
なわち、本発明に係るセンサーは、センサーのコンディ
ショニング期間中試験緩衝剤を含有するチオメルザール
（thiomersal）を用いることにより容易に殺菌されう
る。
実施例１ 単一層針状電極 ａ）電極の物理的構造 第１図において電極の長手方向の断面図を示すが、該
電極は参照符号１で示される。この電極は、絶緑用ラッ
カー３でコートされたコアの白金アノード２を含んでな
りこのアノード２は、ステンレス鋼の参照カソード４の
内側に位置しており、このカソードはアノード２からラ
ッカー３およびエポキシ樹脂層５によって絶緑されてい
る。一方の端部、先端に、電極１は検知面６を有し、こ
の面は電極の方向に対し急な角度で存在する。他方の端
部、基部において、電極２にはアノード２およびカソー
ド４に対する端子７および８がそれぞれ設けられてい
る。端子７および８はそれぞれリード９および10にハン
ダ付けされ、これらのリードは測定を行う場合に用いら
れる装置に接続される。
電極アッセンブリーは、ラッカーコーチングを含む直
径0.16mmの商業的に入手可能なラッカーで絶緑された白
金線2,3を、外径0.46mmのステンレス鋼のチューブ４内
に挿入することにより製造され、最終的にはアノード２
は、チューブ４の内側のエポキシ樹脂内に該アノードを
埋め込むことによりカソード４に対し不伝導の位置に固
定される。引き続き、作動および参照電極２および４
は、７および８において、低損失もしくは超小型の同軸
ケーブルのリード９および10にハンダ付けされている。
次いで全てのハンダ付けされた接続体をエポキシ樹脂内
に埋め込まれる。
最終的には、電極チップは約15度の角度に研摩され次
いで砥石の上でチップを砥石でとぐことによってみがか
れ、これにより電極チップと互角の平滑な検知表面６並
びに生体内側定に対する電極の挿入の容易さが達成され
る。
ｂ）膜内で固定化された酵素の調製および適用 単一層の膜を、次の手順に従って調製した。
上記ａ）によって製造された如き電極アッセンブリー
を、エチルセロソルブ（Etyl Cellosolve（商標））中
で浸漬された、多数回折り重ねたレンズ用紙を４〜６回
該電極アッセンリーに通して脱脂し次いで清浄にし、し
かる後650mVの電圧を白金電極２に印加し、次いで検知
表面６を本発明の水性ポリマー分散体に浸漬することに
より浸漬コートし、コーチングＡを得る。コーチングＡ
を室温で乾燥し、この間検知表面６は、水平位置で電流
が少なくとも0.1nAに減少するに十分な時間保持され
た。この乾燥に引き続き、コーチングＡは45℃で24時間
加熱処理に委ねられる。
使用もしくは試験前に、乾燥センサー１は、例えば次
の組成の緩衝溶液に該センサーを浸漬することによりコ
ンディショニングされねばならない。
試験緩衝液 Na2HPO42H2O 5.77g NaH2PO4H2O 1.05g ヒトアルブミン 1.00g チオメルザール 0.24g NaCl 6.00g 脱イオン水を加えて全体を1000mlとする pH 7.3〜7.5 この間650mVの電圧がアノード２にかけられる。
安定な信号が発生する場合、センサーは使用可能とみ
なされる。典型的には、これは５〜24時間の時間内で得
られる。もしも、一定時間内に安定な信号を得ることが
できない場合、センサーは廃棄される。
上述のように、このコンディショニングはまた緩衝液
中のチオメルザールの活性によりセンサーを殺菌するの
に役立っている。実験の結果、チオメルザールはバイオ
センサーの電気化学的特性に関しては何ら影響を与えな
かった。
ｃ）センサーの試験 上述のように製造されかつ以下に示す如き膜組成を有
する単一層電極を、第２図に概説するような実験組立に
おいて試験した。
第２図において、グルコース含有試験緩衝液11をビー
カ12に入れる。センサー１を試験緩衝液内に浸漬し、次
いでアノード２からのリード９を、650mVの電圧を与え
る安定化電力供給設備14の正の端子に接続する。カソー
ドを電流監視装置15、例えば電流計、記録計もしくは同
様の設備にケーブル10を介して接続する。一方、監視装
置15および電力供給設備14は、ケーブル16を介して接続
されている。
本発明のセンサーのテストに対しての実験の組立にお
いて、使用した監視装置15は、カイザレーピコアンペア
メーターモデル485であり、電力供給設備14は分圧器に
接続された1.5Vのドライセルであった。
材 料 −ポリウレタン分散体。84重量％の商業品のポリウレ
タン分散体（NeoRez商標Ｒ−974,Polyvinyl Chemie Hol
land（ワールウイック、デンマーク）から市販）中に16
重量％のジブチルフタレート（メルク−シュンクハル
ト）を分散させることにより調製された貯蔵分散体。
−エチルカルビトール（メルク） −アルギン酸ナトリウム。２％の貯蔵水溶液（シグ
マ）を用いた。
−ヘパリンナトリウム。２％の貯蔵水溶液（ノボイン
ダストリーA/S）を用いた。
−グルコースオキシダーゼ。4.78mg/mlの貯蔵溶液（2
40Upr.mg）（セルバ）。
試 験 第Ｉ表に示す組成の混合物から製造した単一層膜を用
いて試験を行った。
二種類センサーを製造した。一つは、配合物１を用
い、室温で24時間乾燥した（センサー１と称す）。他方
は配合物２を用い、60℃で１時間熱処理した（センサー
２称とする）。
第Ｉ表から、フェロセンアルデヒドをポリマーマトリ
ックスに配合することは可能であることが分る。
これらの単一センサーは、以下の実施例２で言及され
る多層センサーよりも効果的には製造されない。と言う
のは、不安定さのために廃棄されねばならないものもあ
るからである。
コンディショニングに次いで、センサーを試験緩衝液
中でテストしたが、この液中に少量のグルコースを添加
し緩衝液中複数のグルコース濃度を得た。上記の二種の
単一層センサ−の試験結果を第II表に示す。
センサー２について、また豚に対して生体内試験を行
った。センサーをベンフロン（Venflon商標）カテーテ
ルを介して耳の静脈内に導入した。血液サンプルを他方
の耳からときどき採取し、次いでセンサーにおいて観察
された電流と血中グルコース濃度との間の相互関係を決
定するため標準分析によりグルコース濃度を測定した。
この試験結果は次のとおりであった。すなわち、セン
サーにおける電流は3nAから12nAに変化し、一方対照測
定値は、2.4mMグルコースから25mMグルコースに変化し
た。これは以下の内容を示す。通常、センサーの測定値
を信頼する前に、センサーをその場で較正する必要があ
るからである。
実施例２ 多層の針状電極 ａ）電極の物理的構造 第３図に示されるように、多層の電極の物理的構造
は、膜内の層の数を除いて単一層のタイプと同一であっ
た。
ｂ）膜内に固定化された酵素の調製および適用 次の手順に従って、多層膜を製造した。
第３図に示される各層A,B,C,Dを、所望の数の層A,B,
C,Dを適用するとき加熱処理が行われる以外を除いて単
一層の電極に対すると同様に適用した。各層の組成は、
通常同一であるが、１個又は２個の最外側の層には酵素
はない。
再び、センサーは試験緩衝液中で試験および／または
使用する前にコンディショニング処理されねばならな
い。
試 験 この実施例に対しては、新しい混合物っを用いた。一
つは膜の外側層に対してグルコースオキシダーゼがない
ものであり、もう一つは内側層に対してグルコースオキ
シダーゼを含有するものである。
二種の混合物の組成を、次の第III表に示す。
これらの混合物から一系列のセンサーを作成したが、
このセンサーは混合物４からの２個の内側層と混合物３
からの２個の外側層とを含んでいた。
層を例１で記載したと同様の方法で適用したが、但し
次のコーティングの適用前に個々の層を室温で約５分間
乾燥せしめ、次いで最後に４層の膜を65℃で45分間熱処
理した。
この４層針状センサーの構造を第３図に示す。この図
に示されるように、膜A,B,C,D以外の他の全ての点にお
いて、構造は第一図に示される単一層センサーの構成と
同一である。
単一層電極の製造と比較して、多層電極は、使用可能
な電極の「出来高」に関してより成功したものであるこ
とが判明した。
この製造方法によるセンサーを、コンディショニング
後にそれらの応答性について例１と同様にテストした。
このテストの結果を第IV表に示す。
長期安定性 このバッチからの多数のセンサーを、5mMのグルコー
スを含有する試験緩衝液内に23℃で装入し次いで少なく
とも80時間結果を監視することにより「長期」安定性に
対して試験した。
このテストにより、該期間中電流は0.5％未満で変化
していることが判明した。
透過性制御 アルギネート含量の変化による応答依存性を決定する
ため、一ロットのセンサーを作成したが、このセンサー
の膜は混合物４から作成した２個の層と100部のアルギ
ン酸ナトリウム溶液を10部のアルギン酸ナトリウム溶液
および90部の水で置き代えて変成した混合物３から作成
した２個の層を含んでなる。
この試験結果を第Ｖ表に示す。
第Ｖ表から以下の内容が明らかである。すなわち、膜
中でのアルギネート含量を減少させることにより、膜の
グルコース透過性を制御することによるセンサーの感度
減少が可能となった。

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリマーマトリックス中にポリペプチドを
    固定化する方法であって、次の工程： ａ）該ポリペプチド並びにヘパリン、アルギン酸および
    アルブミンから成る群から選ばれる透過性変性剤を、水
    性ポリウレタン分散体に添加しって該ポリペプチドが溶
    解した水性分散体を調製する工程； ｂ）該分散体を１種又はそれ以上の所望形状の物体に造
    形する工程； ｃ）該造形品を、乾燥の目的のため、室温で約５分ない
    し約200分の時間放置する工程；および所望により ｄ）該造形品を、約40℃ないし約80℃の温度で約30ない
    し約30時間の時間熱処理に委ねる工程 を含んでなる、前記方法。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドが、酵素である、請求の
    範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】前記酵素が、グルコースオキシダーゼ、カ
    タラーゼおよびラクターゼから成る群から選ばれる請求
    の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】可塑剤を工程ａ）における該水性分散体に
    添加する、請求の範囲第１〜第３項のいずれかに記載の
    方法。
  5. 【請求項５】前記可塑剤が、ジブチルフタレートであ
    る、請求の範囲第５項記載の方法。
  6. 【請求項６】高沸点溶剤である融合助剤を、工程ａ）に
    おける水性分散体に添加する、請求の範囲第１〜第５項
    のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】前記融合助剤が、エチルカルビトール、ブ
    チルカルビトールおよびＮ−メチル−２−ピロリドンか
    ら成る群から選ばれる、請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】請求の範囲第１項記載の方法により、ポリ
    ペプドが、ヘパリン、アルギン酸およびアルブミンから
    選ばれる透過性変性剤を含んでなるポリウレタンマトリ
    ックス中に物理的包括により固定化されている高分子
    膜。
  9. 【請求項９】前記ポリペプチドが酵素である、請求の範
    囲第８項に記載の膜。
  10. 【請求項１０】前記酵素が、グリコースオキシダーゼ、
    カタラーゼ、およびラクターゼから成る群から選ばれ、
    好まくしくはグルコースオキシダーゼである、請求の範
    囲第９項記載の膜。
  11. 【請求項１１】アノード、カソードおよび検知表面を含
    んでなる電気化学的センサーであって、該検知表面が、
    請求の範囲第８〜第10項のいずれか１項に記載の膜の一
    層又は複数層によってコードされている、前記電気化学
    的センサー。
  12. 【請求項１２】請求の範囲第11項記載の電気化学的セン
    サーであって、前記一層又は複数層が、その層と同一の
    組成であるが、但し固定化ポリペプチドを有していな
    い、一層又は複数の外層を更に有している、前記センサ
    ー。
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