KR101850971B1 - 그래피틱 물질 및 휘발성 유기화합물에 선택적으로 결합하는 펩티드 - Google Patents
그래피틱 물질 및 휘발성 유기화합물에 선택적으로 결합하는 펩티드 Download PDFInfo
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Abstract
X2SX1AAX2X3P(서열번호 1), X2X2PX3X2AX3P(서열번호 2), SX1AAX2X3P(서열번호 3) 또는 X2PX3X2AX3P(서열번호 4)를 포함하는 그래피틱 물질 또는 휘발성 유기화합물에 결합하는 펩티드를 제공한다.
Description
그래피틱 물질 및 휘발성 유기화합물에 선택적으로 결합하는 펩티드에 관한 것이다.
최근 그래핀, 탄소 나노 튜브 등 저차원 탄소 물질의 우수한 전기적, 열적, 광학적, 기계적 특성을 다양한 용도에 응용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 일반적으로 나노 탄소 물질의 특성을 개질하기 위해서는 화학 반응을 이용하여 표면을 영구적으로 바꾸는 방법이 선택되고 있으나, 화학 반응을 이용하여 표면을 영구적으로 개질시키는 경우 저차원 탄소 물질의 고유한 특성, 예를 들어 빠른 전기전도도 등이 크게 저하될 수 있다.
이를 해결하기 위한 방법으로서 분자 인식 방법은 바이오 물질이 지닌 선택성을 이용하여 화학적인 반응을 거치지 않고도 원하는 물질과 결합할 수 있는 방법으로써 자연계에 존재하는 DNA 상보적 서열(complementary sequence)간의 결합, 항원-항체 등의 예에서 찾아볼 수 있다. 최근에는 나노 탄소 물질과 분자인식을 통하여 결합하는 펩티드를 이용하여 나노 탄소 물질의 기능 저하를 최소화하면서 탄소물질의 표면을 응용에 맞게 개질하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나 실제로 발견된 펩티드를 이용하여 나노 탄소물질을 기능화한 예는 이미 바이오 센서에서 보고된 것으로서 대체로 그 응용이 극히 제한적이라는 문제가 있다. 이는 나노탄소 물질을 기능화 하는데 사용되는 펩티드의 양이 많이 필요한 반면 펩티드 자체의 크기가 작아서 펩티드간의 시너지 효과를 기대하기 어렵기 때문이다.
휘발성 유기화합물(Volatile organic compounds, VOCs)은 건강에 매우 유해한 환경인자로, 예를 들어 벤젠의 경우 일정량 이상을 지속적으로 흡입하였을 경우 백혈병을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 유해인자인 휘발성 유기화합물을 검출하기 위해서 다양한 가스 센서가 연구되어왔다. 개발된 가스 센서들은 높은 감도를 갖고 상온에서도 분석이 가능하나, 선택성이 매우 낮다는 문제가 있었다.
이에, 우수한 나노 탄소 물질의 특성의 파괴는 최소화하면서 추가로 여러 가지 기능을 부여할 수 있는 새로운 방법을 개발하고자 하는 요구가 높아지고 있다. 또한, 휘발성 유기화합물에 대한 선택성이 우수하고, 상온에서도 안정적이며 공기 중에 존재하는 벤젠, 톨루엔과 같은 휘발성 유기화합물을 효과적으로 포집할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.
일 양상은 X2SX1AAX2X3P(서열번호 1), X2X2PX3X2AX3P(서열번호 2), SX1AAX2X3P(서열번호 3) 및 X2PX3X2AX3P(서열번호 4)의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 세트를 제공한다.
다른 양상은 상기 펩티드 또는 펩티드 세트가 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이된 파지를 제공한다.
다른 양상은 상기 펩티드 또는 펩티드 세트 또는 상기 파지가 결합된 그래피틱 물질을 제공한다.
다른 양상은 상기 펩티드 또는 펩티드 세트 또는 상기 파지가 고정된 기판을 포함하는 휘발성 유기화합물의 검출 또는 제거 장치를 제공한다.
다른 양상은 시료를 상기 펩티드 또는 펩티드 세트 또는 상기 파지와 접촉시키는 단계를 포함하는 시료 내 존재하는 휘발성 유기화합물을 검출하거나 제거하는 방법을 제공한다.
일 양상은 X2SX1AAX2X3P(서열번호 1), X2X2PX3X2AX3P(서열번호 2), SX1AAX2X3P(서열번호 3) 및 X2PX3X2AX3P(서열번호 4)의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 세트를 제공한다.
또한, 상기 펩티드 또는 펩티드 세트는 서열번호 5 내지 8의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 세트 일 수 있다.
상기 펩티드 또는 펩티드 세트의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에는 파지의 외피 단백질의 연속되는 아미노산 서열이 연결될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 펩티드 또는 펩티드 세트는 길이가 5 내지 60 개의 아미노산 서열, 7 내지 55개의 아미노산 서열, 7 내지 40 개의 아미노산 서열, 7 내지 30개의 아미노산 서열, 7 내지 20개의 아미노산 서열, 또는 7 내지 10개의 아미노산 서열일 수 있다.
상기 펩티드는 개시된 펩티드의 보존적 치환을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)" 이란 단백질 또는 펩티드의 생물물리학적 특성을 변화시키기 않으면서 제1 아미노산 잔기가 제2의 상이한 아미노산 잔기로 치환되는 것으로서, 여기서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 생물물리학적 특징이 유사한 곁사슬을 가지는 것을 의미할 수 있다. 유사한 생물물리학적 특징으로는 소수성, 전하, 극성, 또는 수소 결합을 제공 또는 수용할 수 있는 능력을 포함할 수 있다. 보존적 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 친수성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 및 글루타민), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판, 티로신 및 히스티딘), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있을 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 펩티드에서 X1은 W, Y, F 또는 H이고, X2는 D, E, N 또는 Q이고, X3는 I, L 또는 V일 수 있다.
다른 양상은 X2SX1AAX2X3P(서열번호 1), X2X2PX3X2AX3P(서열번호 2), SX1AAX2X3P(서열번호 3) 및 X2PX3X2AX3P(서열번호 4)의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 세트가 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이된 파지를 제공한다.
상기 펩티드 또는 펩티드 세트에 대해서는 상기한 바와 같다.
용어 "파지(phage)" 또는 "박테리오파지(bacteriophage)"는 호환적으로 사용되며, 박테리아를 감염시키고, 박테리아 내에서 복제되는 바이러스를 의미할 수 있다. 파지 또는 박테리오파지는 그래피틱 물질 또는 휘발성 유기화합물과 선택적 또는 특이적으로 결합하는 펩티드를 디스플레이(display)하기 위해 사용될 수 있다. 상기 파지는 그래피틱 물질에 결합능을 갖는 펩티드가 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이되도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 본 발명에서 용어 "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 그래피틱 물질에 결합능을 갖는 펩티드를 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이하기 위해 파지에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 파지를 의미할 수 있다. 상기 유전적 변형은 상기 펩티드를 코딩하는 외래 유전자가 도입되는 것을 포함한다. 상기 파지는 필라멘트성 파지(Filamentous phage)일 수 있으며, 예를 들면, M13 파지, F1 파지, Fd 파지, If1 파지, Ike 파지, Zj/Z 파지, Ff 파지, Xf 파지, Pf1 파지 또는 Pf3 파지일 수 있다.
본 발명에서 용어 "파지 디스플레이(phage display)"는 파지 또는 파지미드(phagemid) 입자의 표면에 기능적 외래 펩티드 또는 단백질의 표시(display)를 의미할 수 있다. 상기 파지의 표면은 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편를 의미할 수 있다. 또한 상기 파지는 상기 기능적 외래 펩티드의 C-말단이 파지의 외피 단백질의 N-말단에 연결되거나, 또는 상기 펩티드가 파지의 외피 단백질의 연속되는 아미노산 서열 사이에 삽입되거나 또는 외피 단백질의 연속되는 아미노산 서열의 일 부분을 치환한 것인 파지일 수 있다. 상기 펩티드가 외피 단백질에 삽입 또는 치환되는 연속되는 아미노산 서열의 위치는 외피 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 50번 위치, 1 내지 40번 위치, 1 내지 30번 위치, 1 내지 20번 위치, 1 내지 10번 위치, 2 내지 8번 위치, 2 내지 4번 위치, 2 내지 3번 위치, 3 내지 4번 위치 또는 2번 위치일 수 있다. 또한, 상기 외피 단백질은 p3, p6, p8 또는 p9 일 수 있다. 예를 들면, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 펩티드의 C-말단이 M13 파지의 몸통 즉, 파지의 끝이 아닌, 길이 방향의 몸체에에 존재하는 50개의 아미노산 길이의 p8(서열번호 19)의 N-말단에 연결된 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 펩티드가 M13 파지의 외피 단백질 p8의 2 내지 4번 위치의 아미노산 서열(즉, EGD), 2 내지 3번, 3 내지 4번, 또는 2번 위치의 아미노산 서열을 대신하여 연결된 것일 수 있다.
다른 양상은 X2SX1AAX2X3P(서열번호 1), X2X2PX3X2AX3P(서열번호 2), SX1AAX2X3P(서열번호 3) 및 X2PX3X2AX3P(서열번호 4)의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 세트 또는 상기 펩티드가 디스플레이된 파지가 결합된 그래피틱 물질을 제공한다.
상기 펩티드 또는 펩티드 세트 및 파지에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "그래피틱 물질(graphitic materials)"은 탄소원자가 육각형 모양으로 배열되어 있는 표면, 즉 그래피틱 표면(graphitic surface)을 지니는 물질을 의미할 수 있다. 상기 그래피틱 물질은 그래피틱 표면을 포함하는 물질이라면 물리적, 화학적 성질, 구조적 특성에 상관없이 그래피틱 물질에 포함될 수 있다. 상기 그래피틱 물질은 예를 들면 그래파이트, 그래핀, 고배향성 열분해흑연(HOPG), 탄소나노튜브, 풀러린 등 육각형으로 배열된 탄소원자를 포함하는 표면을 가지고 있는 물질을 포함할 수 있다.
상기 그래피틱 물질에 결합하는 펩티드는 펩티드의 라이브러리를 통해 선별될 수 있으며, 예를 들면, 파지 디스플레이 기법을 통해 선별될 수 있다. 파지 디스플레이 기법을 통해 펩티드가 유전적으로 파지의 외피 단백질에 연결, 삽입 또는 치환되어 파지의 외부에 디스플레이되고, 펩티드는 비리온 내의 유전 정보에 의해 암호화될 수 있다. 디스플레이된 단백질 및 그를 암호화하는 DNA에 의해 다양한 변이체의 단백질을 스크리닝하여 선별할 수 있으며, 그를 "바이오패닝(biopanning)"이라고 부른다. 요약하여 바이오패닝 기법은 다양한 변이체가 디스플레이된 파지를 고정화된 타겟(예를 들면, 그래피틱 물질)과 반응시키고, 결합하지 않은 파지를 세척한 후, 파지와 타겟 사이의 결합 상호작용을 파괴하여 특이적으로 결합된 파지를 용리(elution)하는 방법을 포함한다. 용리된 파지의 일부는 DNA 시퀀싱 및 펩티드 식별을 위하여 남겨두고, 나머지는 인 비보(in vivo)상에서 증폭하고 다음 라운드를 위한 서브 라이브러리를 만들어 상기 과정을 반복할 수 있다.
따라서, 본 발명은 펩티드를 디스플레이하는 파지 라이브러리를 제공하는 단계; 상기 파지 라이브러리를 그래피틱 물질과 반응시키는 단계; 상기 반응에서 결합하지 않은 파지를 제거하는 단계; 및 상기 파지 라이브러리 중 그래피틱 물질과 결합하는 파지를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 선별된 파지를 숙주 세포 내에서 증폭하여 상기 과정을 반복하는 단계, 및 증폭되거나 복제된 파지 또는 발현된 펩티드를 분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있는 그래피틱 표면과 결합하는 펩티드의 선별 방법을 제공할 수 있다.
그래피틱 물질과 결합하는 펩티드의 선별 방법에 있어서, 상기 파지는 M13 파지, F1 파지, Fd 파지, If1 파지, Ike 파지, Zj/Z 파지, Ff 파지, Xf 파지, Pf1 파지 또는 Pf3 파지일 수 있으며, 상기 펩티드 라이브러리는 예를 들면, M13 파지의 p8 펩티드 라이브러리일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 p8은 파지당 약 2700개의 복제수를 가지고 있으므로, p8 펩티드 라이브러리는 효율적으로 증폭시킬 수 있고, 추가적인 단백질 정제과정이 필요 없다.
그래피틱 물질에 특이적으로 결합하는 펩티드가 선별된 후에는, 상기 펩티드 자체 또는 상기 펩티드가 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이된 파지가 결합된 그래피틱 물질을 제조할 수 있다.
상기 펩티드 자체 또는 상기 펩티드가 디스플레이된 파지가 결합된 그래피틱 물질을 제조하는 방법은 투석 방법, 침지 코팅법, 스핀 코팅법, 적하법, 그라비아 인쇄법, 스크린 인쇄법, 철판 인쇄법, 다이 코팅법, 커튼 코팅법, 잉크젯트법, 스프레이 코팅법, 스퍼터법, 또는 진공 증착법을 포함할 수 있다. 상기 침지 코팅법은 용액(예를 들면, 증류수, PBS, TBS)에 일 구체예에 따른 따른 펩티드가 디스플레이된 파지를 첨가하여 파지 용액을 제조하는 단계; 및 상기 파지 용액에 그래피틱 물질을 담그는 단계를 포함할 수 있다. 또한 투석 방법은 증류수에 계면 활성제를 첨가한 후, 그래피틱 물질을 안정화시켜 콜로이드 용액을 제조하는 단계; 및 반투과성 막을 갖는 용기 안에 상기 콜로이드 용액 및 상기 파지 용액을 일정 몰비율로 혼합한 후 투석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 파지 용액에 사용되는 용매의 pH가 높을수록 파지간의 정전기적 배척력이 커지므로 파지 간의 간격이 커질 수 있다. 또한 파지의 농도가 높을수록 그래피틱 물질 상에 배열될 파지간의 간격은 더 조밀해 줄 수 있다. 그러므로, 통상의 기술자는 필요에 따라 pH와 파지의 농도를 조절함으로써 그래피틱 물질 상에 배열되는 파지의 수 및 간격 등을 조절할 수 있다.
또한, 상기 투석 방법에 있어서, 콜로이드 용액은 그래피틱 물질이 분산 또는 용해된 수용액일 수 있다. 상기 콜로이드 용액은 그래피틱 물질을 계면 활성제가 포함된 용액에 넣고 안정화시켜 제조할 수 있다. 계면 활성제는 그래피틱 물질을 안정화시킬 수 있고, 펩티드 또는 파지와 친화적인 계면 활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면 활성제의 예는 소듐 콜레이트, SDS (sodium dodecyl sulfate), DOC (sodium deoxycholate), 노니데트(Nonidet) P-40, 트리톤(Triton) X-100, 또는 트윈(Tween) 20®을 포함할 수 있다. 또한, 통상의 기술자는 목적하는 특성에 따라 상기 콜로이드 물질 및 파지 용액의 혼합 몰 비율을 조절할 수 있다.
상기 그래피틱 물질이 그래핀 시트 또는 탄소나노튜브인 경우, 상기 그래피틱 물질은 시트의 형태를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 그래피틱 물질의 내부 구조는 퍼콜레이트 네트워크(percolated network) 구조를 갖는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어 "퍼콜레이트 네트워크(percolated network)"는 무작위적 전도성 또는 비전도성 연결로 구성된 격자 구조를 의미할 수 있다. 시트의 형태인 경우 시트의 두께는 예를 들면, 40 내지 350 nm일 수 있고, 면적은 0.001 내지 1000 cm2일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 펩티드는 그래피틱 물질과 특이적으로 결합하므로, 이들 그래피틱 물질의 특성을 손상시키지 않는 비파괴적인 방법으로 추가적인 기능 부여를 할 수 있다. 또한, 필라멘트성 파지의 외피 단백질에 상기 펩티드를 디스플레이한 경우에는 그래피틱 물질과의 접촉면이 넓어 더욱 강한 결합력을 제공할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 파지는 파지 자체의 필라멘트성 구조를 이용하여 그래피틱 표면상에 방향성을 갖고 배열될 수 있다. 예를 들면 특정 방향으로 일렬로 배열될 수 있으며, 이 경우 파지의 외피 단백질에 위치한 펩티드와 그래피틱 표면과의 결합력이 상승함과 동시에 일자로 정렬될 수 있다. 일자로 정렬된 파지는 그래피틱 표면에 비등방적 (anisotropic) 기능화를 부여할 수 있다. 상기와 같은 일자 정렬구조 외에도 스멕틱(smectic)구조와 같은 층상구조, 네마틱(nematic) 구조, 나선구조, 격자구조 등 특정 방향성을 갖는 구조를 형성할 수 있으므로, 파지의 배열 구조에 따라 그래피틱 표면상에 다양한 기능을 부여할 수 있다.
다른 양상은 X2SX1AAX2X3P(서열번호 1), X2X2PX3X2AX3P(서열번호 2), SX1AAX2X3P(서열번호 3) 및 X2PX3X2AX3P(서열번호 4)의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 세트를 포함하는 휘발성 유기화합물의 검출 또는 제거용 조성물을 제공한다.
상기 펩티드 또는 펩티드 세트는 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이된 것일 수 있다, 또한, 상기 펩티드 또는 펩티드 세트, 또는 상기 파지는 그래피틱 물질에 결합된 것일 수 있다. 상기 펩티드, 파지 및 그래피틱 물질에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "휘발성 유기화합물(Volatile organic compound)"이라 함은, 공기 중에서 일정한 온도와 압력에 의하여 지속적으로 휘발, 배출되는 액체, 기체, 고체의 유기화합물을 의미할 수 있으며, 탄소와 수소로 구성된 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소, 또는 질소나 황함유 탄화수소 등 상온이나 상압에서 기체 상태로 존재하는 유기화합물을 포함할 수 있다.
상기 휘발성 유기화합물은 방향족기를 포함하는 탄화수소류일 수 있다. 또한, 상기 방향족기를 포함하는 탄화수소류는 벤젠기를 포함하는 탄화수소류일 수 있다. 또한, 상기 벤젠기를 포함하는 탄화수소류는 벤젠의 수소 원자 중 적어도 하나가 C1 내지 C10의 알킬기, 알케닐기, 알키닐기로 치환된 탄화수소류일 수 있다. 또한, 상기 벤젠기를 포함하는 탄화수소류는 C6 내지 C7의 탄소수를 갖는 탄화수소류일 수 있다.
상기 휘발성 유기화합물의 예는 아세트알데히드, 아세틸렌, 아세틸렌 디클로라이드, 아크롤레인, 아크릴로니트릴, 벤젠, 1,3-부타디엔, 부탄, 1-부텐, 2-부텐, 사염화탄소, 클로로포름, 시클로헥산, 1,2-디클로로에탄, 디에틸아민, 디메틸아민, 에틸렌, 포름알데히드, n-헥산, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메틸에틸케톤, 메틸렌클로라이드, 엠티비이(MTBE), 프로필렌, 프로필렌옥사이드, 1,1,1-트리콜로로에탄, 트리클로로에틸렌, 가솔린, 납사, 원유(crude oil), 아세트산, 에틸벤젠, 니트로벤젠, 톨루엔, 테트라클로로에틸렌, 자일렌 또는 스틸렌을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열, 보다 구체적으로, 일 구체예에 따른 서열번호 5 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 휘발성 유기화합물 중 벤젠에 선택적으로 결합할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열, 보다 구체적으로, 일 구체예에 따른 서열번호 6 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 휘발성 유기화합물 중 톨루엔에 선택적으로 결합할 수 있다.
또한 다른 양상은 상기 펩티드 또는 펩티드 세트를 포함하는 휘발성 유기화합물의 검출 또는 제거 장치를 제공한다.
상기 검출 또는 제거 장치는 기판을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 펩티드 또는 펩티드 세트는 기판 상에 고정화된 것일 수 있다. 또한, 상기 검출 또는 제거 장치는 일 구체예에 따른 펩티드 또는 펩티드 세트가 파지의 외피 단백질 또는 그의 일부에 디스플레이된 파지, 또는 상기 펩티드 또는 펩티드 세트 또는 파지가 결합된 그래피틱 물질이 상기 기판 상에 고정화되거나, 또는 코팅된 것일 수 있다.
기판은 전도성 기판 또는 절연 기판일 수 있으며, 적어도 하나 이상의 전극이 배치된 절연 기판일 수 있다. 상기 하나 이상의 전극은 제1 전극, 제2 전극, 또는 제3 전극일 수 있고, 작업 전극, 상대 전극, 또는 기준 전극일 수 있다. 또한 상기 전극은 상기 작업 전극, 상대 전극, 또는 기준 전극에 더하여, 보조 전극 및 인식 전극을 더 포함할 수 있다. 상기 펩티드 또는 파지가 결합된 그래피틱 물질이 하나 이상의 전극이 배치된 절연 기판 상에 형성될 때, 상기 그래피틱 물질은 제1 전극, 또는 작업 전극, 또는 그들의 일부에 배치될 수 있다.
상기 기판의 예는 은, 은에폭시, 팔라듐, 구리, 금, 백금, 은/염화은, 은/은이온, 수은/산화수은, 전도성 탄소, 반도체 기판, 산화물 기판, 폴리머 기판을 포함할 수 있다.
또한, 상기 기판은 투명 유연 기판일 수 있다. 투명 유연 기판의 예는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리에테르설폰(polyethersulfone, PES), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리(스티렌설포네이트)(poly(styrenesulfonate)), 폴리이미드(polyimide), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리에스테르(polyester), 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether, PFPE), 폴리카보네이트(polycarbonate), 또는 상기 고분자의 조합으로부터 제조된 기판일 수 있다.
도 12를 참조하여 설명하면, 상기 휘발성 유기화합물 검출 또는 제거 장치는 제1 덕트(100) 및 제2 덕트(200), 또는 포접부(300)를 더 포함할 수 있다.
제1 덕트(100)는 내부에 유로가 형성되어 시료가 유입된다. 제1 덕트(100)는 미세채널, 또는 미세유로인 것일 수 있다. 제1 덕트(100)는 제1 관, 제2 관, 또는 제3 관으로 구성될 수 있으며, 제1 관은 시료인 공기 또는 액체가 들어오는 곳, 예를 들면, 시설 또는 동물의 입에 연결될 수 있다. 제2 관은 제1 관의 후단에 연결될 수 있고, 제3 관은 제2 관의 후단에 연결될 수 있다. 제3 관은 제2 관과 직경이 동일한 제1 부와, 후방으로 진행할수록 직경이 점진적으로 확대되는 원추형의 제2 부를 포함할 수 있다.
상기 장치는 또한 상기 제1 덕트(100)의 내부에 배치되거나 또는 제1 덕트(100)와 연결될 수 있는 전처리부를 포함할 수 있고, 제1 덕트(100)의 후방에 배치된 포접부(300)를 포함할 수 있다. 전처리부는 제1 덕트(100)로 유입되는 시료의 습도 조절 또는 분진 제거를 위한 것일 수 있다. 전처리부의 일 예로 제1 덕트(100) 내부로 수분을 공급하기 위한 수분공급부, 제1 덕트(100)를 통과하는 시료의 습도를 측정하는 습도 센서, 또는 오염 공기 중에 포함된 분진을 제거하기 위한 필터를 포함할 수 있다. 필터는 시료 중의 고형성분이나 이물질을 제거하기 위한 것으로, 섬유질 필터를 사용할 수 있다.
상기 포접부(300)는 휘발성 유기화합물을 검출 또는 제거하기 위한 것으로, 상기 펩티드 또는 펩티드 세트, 상기 파지가 고정된 기판을 포함하는 센서를 포함할 수 있다.
도 13을 참조하여 설명하면, 포접부의 일예는 캔틸레버 센서(30)일 수 있다. 이 경우 휘발성 유기화합물 결합층(10), 예를 들면, 일 구체예에 따른 펩티드, 또는 파지가 캔틸레버 센서 상에 기판(20)을 통해 고정화된 것일 수 있다. 기판(20)에 대해서는 상기한 바와 같다. 상기 캔틸레버 센서(30)는 캔틸레버의 질량 및 스프링 상수 변화에 의해 발현되는 공진 주파수의 변화를 측정하는 동적 모드(dynamic mode)일 수 있고, 또는 캔틸레버 센서 상에서 발생하는 특이 반응에 의한 표면 스트레스 변화에 의해 발생하는 변위를 측정하는 정적 모드(static mode)일 수 있다. 상기 캔틸레버 센서는 상기 센서의 휨 현상 또는 공진 주파수의 변화를 측정하는 회로, 상기 캔틸레버의 진동에 따른 변화상태를 전기적인 센싱 신호로 전환하는 압전 센서, 또는 상기 전기적인 센싱 신호를 통해 상기 캔틸레버의 고유 진동수 변화 상태를 측정하는 회로를 더 포함할 수 있다.
시료가 상기 포접부(300)를 통과하면서 시료 내에 존재하는 휘발성 유기화합물이 상기 검출회로(400)를 통해 검출될 수 있다. 본 발명에서 용어 "휘발성 유기 화합물의 검출"은 시료 내의 휘발성 유기화합물의 정성적, 반-정량적 및 정량적 검출을 포함할 수 있다. 정성적 평가에서, 결과는 시료 내에 휘발성 유기화합물이 검출되는지 여부를 나타낸다. 반-정량적 평가에서, 결과는 시료 내에 휘발성 유기화합물이 미리 정의된 어떤 경계값 이상 존재하는지 여부를 나타낸다. 정량적 평가에서, 결과는 시료 내에 존재하는 휘발성 유기화합물의 양의 수치적 표시이다.
또한, 상기 포접부(300)의 후방에는 제2 덕트(200)가 연결된다. 제2 덕트(200)는 미세채널, 또는 미세유로인 것일 수 있다. 제2 덕트(200)는 제4 관 및 제5 관으로 구성된 것일 수 있다. 제4 관은 제3 관과 대칭되는 구조를 갖는 것일 수 있다. 즉, 제4 관은 제2 부와 동일한 직경을 갖는 제3 부와, 제3 부의 후단에 형성되며 후방으로 진행할수록 직경이 점진적으로 축소되는 원추형의 제4 부와, 제4 부의 후단에 형성된 제5 부를 포함할 수 있다.
제5 관은 제4 관의 제5 부와 연결되어 일정 길이 연장된다. 제5 부에는 송풍팬이 설치될 수 있다. 송풍팬은 제2 덕트의 외부에 설치된 모터와 연결된 것일 수 있다. 송풍팬에 의해 시료는 제1 덕트(100)로 유입되어 제2 덕트(200)를 통해 외부로 배출될 수 있다. 이때 시료 내에 존재하는 휘발성 유기 화합물은 포접부(300)를 통과하면서 휘발성 유기화합물이 검출되거나 제거될 수 있다.
또한 다른 양상은 상기 펩티드 또는 펩티드 세트에 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 시료 내에 존재하는 휘발성 유기화합물을 검출하거나 제거하는 방법을 제공한다.
상기 검출하는 방법은 분석하고자 하는 시료를 제공하는 단계; 상기 시료를 상기 펩티드 또는 펩티드 세트, 상기 파지, 또는 상기 그래피틱 물질과 접촉시키는 단계; 또는 상기 접촉된 시료로부터 시료 내 존재하는 휘발성 유기화합물-펩티드 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제거하는 방법은 분석하고자 하는 시료를 제공하는 단계; 상기 시료를 상기 펩티드 또는 펩티드 세트, 상기 파지, 또는 상기 그래피틱 물질과 접촉시키는 단계; 또는 상기 접촉된 시료로부터 시료 내 존재하는 휘발성 유기화합물-펩티드 복합체가 형성된 후, 상기 복합체가 제거되는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분석하고자 하는 시료는 시료 내에 휘발성 유기화합물의 존재가 의심되는 것일 수 있으며, 액체, 공기 또는 사람의 날숨일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 시료 내에 존재하는 휘발성 유기화합물을 상기 펩티드 또는 펩티드 세트와 결합시키는 단계로, 상기 펩티드 또는 펩티드 세트와 시료를 혼합하는 것일 수 있다. 상기 혼합은 펩티드 또는 펩티드 세트가 고정화된 기판에 상기 시료를 흘려보내는 것일 수 있다. 또한, 상기 혼합은 액체 매질 중 또는 공기 중에서 수행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 액체 매질은 버퍼, 용매, 또는 증류수 등을 포함할 수 있다.
상기 검출하는 단계는 시료 내에 존재하는 휘발성 유기화합물의 존재 여부 를 검출하는 단계로, 시료 내의 휘발성 유기화합물을 정성적, 반-정량적 및 정량적으로 검출하는 것일 수 있다. 상기 검출하는 단계는 전기화학적 기법, 광학적 기법 또는 질량 분석 기법을 통해 수행할 수 있다. 상기 전기화학적 기법을 통한 검출 단계는 시료와 펩티드의 접촉 전후, 즉 휘발성 유기화합물과 펩티드의 결합 전후에 나타나는 전자 전달 정도를 감응하여 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 광학적 기법을 통한 검출 단계는 펩티드에 형광 물질을 표지하여 휘발성 유기화합물-펩티드 복합체의 형광을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 상기 질량 분석 기법을 통한 검출 단계는 시료와 펩티드의 접촉 전후, 즉 휘발성 유기화합물과 펩티드의 결합 전후에 나타나는 질량의 차이를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 휘발성 유기화합물 검출용 조성물, 검출 장치, 또는 검출 방법은 사람의 날숨에 존재하는 휘발성 유기화합물의 존재 여부를 검출하는데 사용됨으로써, 질병을 진단하는 센서로 활용할 수 있다. 예를 들면, 폐암에 걸린 환자의 날숨에는 휘발성 유기화합물(예를 들면, 벤젠 또는 톨루엔등)이 검출된다. 따라서, 일 구체예에 따른 휘발성 유기화합물 검출용 조성물, 검출 장치, 또는 검출 방법은 질병 진단용 센서, 예를 들면 폐암 진단용 키트, 폐암 진단용 센서, 또는 폐암 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 펩티드, 및 상기 펩티드가 디스플레이된 파지는 그래피틱 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 우수한 결합력을 갖고, 경제적이고, 비파괴적인 방법으로 그래피틱 물질에 다양한 기능을 부여할 수 있다.
다른 양상에 따른 펩티드는 휘발성 유기화합물에 대한 선택성이 우수하며, 상온에서도 안정적이므로 공기 중에 존재하는 휘발성 유기화합물을 효과적으로 검출하거나 제거할 수 있다.
도 1은 일구체예에 따른 M13 파지의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 펩티드의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 펩티드의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 펩티드의 아미노산 서열과 소수성 특성과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 일구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 파지를 그래핀의 표면에 정렬시킨 후 원자력 현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 일구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 파지를 그래핀의 표면에 정렬시킨 후 원자력 현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소나노튜브의 제조과정 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소 나노튜브의 형성 원리를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 9는 일구체예에 따른 펩티드의 벤젠에 대한 액상 및 기상에서의 친화력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 일 구체예에 따른 펩티드의 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스에 대한 반응성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 일 구체예에 따른 펩티드의 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스에 대한 반응성을 포집된 가스의 농도를 정량분석하여 나타낸 도면이다(B:benzene, T:toluene, X:xylene, H:hexane, A: acetone, E:ehtanol).
도 12는 일 구체예에 따른 휘발성 유기화합물 검출 또는 제거 장치의 구조를 나타낸 개념도이다.
도 13은 일 구체예에 따른 휘발성 유기화합물의 검출 또는 제거 장치의 센서를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 펩티드의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 펩티드의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 펩티드의 아미노산 서열과 소수성 특성과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 일구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 파지를 그래핀의 표면에 정렬시킨 후 원자력 현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 일구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 파지를 그래핀의 표면에 정렬시킨 후 원자력 현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소나노튜브의 제조과정 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소 나노튜브의 형성 원리를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 9는 일구체예에 따른 펩티드의 벤젠에 대한 액상 및 기상에서의 친화력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 일 구체예에 따른 펩티드의 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스에 대한 반응성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 일 구체예에 따른 펩티드의 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스에 대한 반응성을 포집된 가스의 농도를 정량분석하여 나타낸 도면이다(B:benzene, T:toluene, X:xylene, H:hexane, A: acetone, E:ehtanol).
도 12는 일 구체예에 따른 휘발성 유기화합물 검출 또는 제거 장치의 구조를 나타낸 개념도이다.
도 13은 일 구체예에 따른 휘발성 유기화합물의 검출 또는 제거 장치의 센서를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
그래피틱
물질에 선택적으로 결합하는 펩티드
의
선별
1.
M13
파지 디스플레이
p8
펩티드 라이브러리의 제조
그래피틱 물질에 선택적으로 결합하는 펩티드를 선별하기 위해, M13 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리를 제조하였다.
우선, M13KE 벡터(NEB, product#N0316S)(서열번호 9)의 1381번째 염기쌍(base pair)인 C의 G로의 부위특이적 변이(site-directed mutation)를 위하여, 서열번호 10 및 11의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 M13HK 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 M13HK 벡터는 제한효소 BspHI (NEB, product# R0517S) 및 BamHI 제한효소(NEB, product#R3136T)를 사용하여 이중 절단(double-digested)되었고, 남극 포스파타아제(Antarctic phosphatase)를 사용하여 탈인산화시켰다. 탈인산화된 벡터를 이중-절단 DNA 두플렉스(duplex)로 16℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 연결시켰다. 이후 산물을 정제하고, 농축하였다. 전기컴피턴트 세포(electorcompetent cell) (XL-1 Blue, Stratagene)를 18 kV/cml에서 2 ㎕의 농축된 연결된 벡터 용액으로 전기천공법으로 형질전환하였고, 총 5개의 형질전환을 라이브러리 구축을 위해 수행하였다. 이후, 형질전환된 세포는 60분 동안 배양되었고, 다수의 형질전환체의 분획은 X-갈/이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)/테트라사이클린(Tet)을 함유하는 아가 플레이트에 플레이팅되어 라이브러리의 다양성을 결정하였다. 남아있는 세포는 진탕 배양기에서 8시간 동안 증폭되었다. 상기 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리의 제작에는 서열번호 12 및 13의 올리고뉴클리오티드를 사용하였다.
일 구체예에 따라 제조된 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리의 염기서열은 4.8×107 pfu(plaque form unit)가지의 다양성을 가지며 각각의 서열당 1.3×105개 정도의 복제수(copy number)를 지녔다.
도 1은 일구체예에 따른 M13 파지의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 약 880 nm의 길이 및 약 6.5 nm의 직경을 갖고, M13 파지는 6407 뉴클레오티드의 단일 사실 DNA로 구성되어 있으며, 이는 2700 복제수의 p8 단백질(50개의 아미노산 잔기)의 메이저 외피 단백질(major coat protein) 및 5 복제수 이하의 p3(427개의 아미노산 잔기), p6(112개의 아미노산 잔기), p7(33개의 아미노산 잔기), 및 p9(32개의 아미노산 잔기)의 마이너 외피 단백질(minor coat protein)의해 싸여있음을 알 수 있다. 일 구체예에 따른 펩티드 라이브러리는 p8의 2 내지 4번 위치의 아미노산 서열(즉, EGD)을 치환하여 디스플레이된다.
상기한 바와 같이, 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리를 사용하는 경우, p8 외피 단백질은 약 2700개의 많은 양의 복제수를 가지고 있으므로 제조과정에서 파지를 사용하여 손쉽게 증폭시킬 수 있어 추가적인 단백질 정제과정이 필요 없어, 펩티드의 제조 비용을 절약할 수 있음을 알 수 있다. 또한, p8 외피 단백질은 M13파지의 몸통에 위치하고 있어 펩티드가 표현될 수 있는 면적이 상대적으로 매우 넓으며, 필라멘트성 형태를 가지고 있으므로, 그래피틱 물질과 결합시 펩티드의 접촉면이 널어 강한 결합력을 제공할 수 있음을 알 수 있다.
2. 펩티드
의
선별(
screening
)
상기 실시예 1의 1에서 제조한 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리를 바이오 패닝(bio-panning) 방법에 의해 그래핀과 결합하는 펩티드를 선별하였다.
먼저, 직경이 1cm 인 HOPG (highly ordered pyrolytic graphite) 기판(제조사: SPI product#439HP-AB)을 준비하였다. 이때 HOPG 기판은 입자크기(grain size)가 100μm 이하의 비교적 큰 HOPG 기판을 사용하였다. 기존에는 그래피틱 표면으로써 생산과정에서 대부분 표면이 손상되는 탄소나노튜브필름 표면 등을 사용하였기 때문에, 결합력이 높은 펩티드를 도출하기 어렵다는 단점이 있었다. 이에 그를 보완화기 위하여, 그래피틱 표면을 갖는 물질인 HOPG를 실험 전에 기판으로부터 테이프로 떼어내어 깨끗한(fresh) 표면을 얻어 샘플 표면의 산화 등으로 인한 결함을 최소화시켰다. 그 다음, 상기 실시예 1의 1에서 제조한 4.8×1010 pfu(4.8×10 7 가지 다양성, 각 서열마다 복제수 1000개)의 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리를 100 ㎕의 TBS(Tris-Buffered Saline) 완충액에 준비한 다음 HOPG 표면과 1시간 동안 100rpm으로 진탕배양기에서 반응(conjugating)시켰다. 1 시간 후 용액을 제거한 다음, TBS에서 10번 반복 세척하였다. 세척된 HOPG 표면에 산성 완충액으로서 pH 2.2의 Tris-HCl을 8분 동안 반응시켜 비선택적으로 반응하는 펩티드를 용리(elution)한 후, 미드-로그(mid-log) 상태인 XL-1 blue E. coli 배양물(culture)로 30분 동안 용리시켰다. 용리된 배양물의 일부는 DNA 시퀀싱(DNA sequencing) 및 펩티드 식별(peptide identification)을 위하여 남겨두고 나머지는 증폭(amplification)해서 다음 라운드를 위한 서브 라이브러리(sub-library)를 만들었다. 이때 만들어진 서브 라이브러리를 이용하여 상기의 과정을 반복하였다. 한편, 남겨둔 플라크는 DNA를 분석하여 p8 펩티드 서열을 구하고, 이때 얻어진 서열을 분석하여 그래피틱 표면과 반응하는 펩티드 서열 4개를 얻었고, 그를 음성 대조군과 함께, 하기 표 1로 나타내었다.
| 서열번호 | 아미노산 서열 |
| P8GB#1(서열번호 5) | DSWAADIP |
| P8GB#3(서열번호 14) | DTKWTGGE |
| P8GB#5(서열번호 6) | DNPIQAVP |
| P8GB#6(서열번호 15) | VTAVPNDT |
| P8GB#8(M13HK, 음성 대조군, 서열번호 16) | EGE |
3. 결합력(
binding
affinity
)의 비교
상기 실시예 1의 2에서 선별한 펩티드 서열 P8GB#1, 3, 5, 6 및 8의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.
먼저, 상기 실시예 1의 2에서 사용된 바이오 패닝 방법을 사용하여 펩티드 서열 P8GB#1, 3, 5, 6 및 8을 각각 포함하는 M13 파지를 제작하고, 이를 동일한 조건에서 HOPG와 반응시킨 다음, 세척 후 남아 있는 파지의 개수를 비교함으로써 결합력을 비교하였다. 즉, 상기 5가지의 펩티드 서열을 각각 100μl TBS 완충액에 준비한 다음 HOPG 표면과 1시간 동안 100rpm으로 진탕배양기에서 반응시켰다. 1 시간 후 용액을 제거한 다음, TBS에서 10번 반복 세척하였다. 세척된 HOPG 표면에 산성 완충액으로서 pH 2.2의 Tris-HCl을 8분 동안 반응시켜 비선택적으로 반응하는 펩티드를 용리(elution)한 후, 미드-로그(mid-log) 상태인 XL-1 blue E. coli 배양물(culture)을 30분 동안 용리시켰다. 용리된 배양물 내의 각 5가지 펩티드 서열의 개수를 타이터(titer) 방법을 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 그래프로 나타내었다.
도 2는 일 구체예에 따른 펩티드의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 펩티드인 P8GB#1(서열번호 5)은 P8GB#8 (M13HK, 음성 대조군)보다 약 9.6배, P8GB#5(서열번호 6)는 약 2.9배 정도 강한 결합력을 가진다는 것을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 일 구체예에 따른 펩티드가 동일한 M13 파지 디스플레이 p8 펩티드 라이브러리에서 유래된 다른 서열을 갖는 펩티드보다도 매우 높은 결합력을 가짐을 알 수 있었다.
또한, 추가적으로 상기의 결합력 비교의 결과, P8GB#1 및 P8GB#5에서 첫 번째 아미노산 서열인 아스파르트산은 결합력에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 판단하여, 그를 제거한 GP1(서열번호 7) 및 GP2(서열번호 8)에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 대조군과 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교하였고, 그 결과를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 펩티드의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 펩티드인 GP1(서열번호 7) 및 GP2(서열번호 8)는 각각 P8GB#1 및 P8GB#5와 동일한 정도의 결합력을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
4. 펩티드 서열의 특성 분석
상기 실시예 1의 3에 나타낸 바와 같이, P8GB#1 및 #5가 P8GB#3 및 #6보다 현저히 높은 결합력을 갖는 원리를 분석하기 위하여, 각 펩티드 서열의 소수성 특성을 카이트-두리틀 스케일(Kyte-Doolittle scale)을 사용하여 분석하고(window size=5), 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 세로축의 스케일 값이 (+)일수록 소수성을, (-)일수록 친수성이 강함을 의미한다.
도 4는 일 구체예에 따른 펩티드의 아미노산 서열과 소수성 특성과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 펩티드인 P8GB#1 및 P8GB#5는 모두 아미노산 서열 중 5~6번째 서열구간에서 0.6 이상의 높은 소수성 값을 나타내는 것을 알 수 있다. 이때, P8GB#1이 P8GB#5보다 높은 결합력을 나타내는 것은 P8GB#1의 방향족기인 트립토판(Tryptophan, W) 때문으로 판단된다. 즉, P8GB#1의 서열에는 그래피틱 표면과 반응성이 좋은 방향족기가 아미노산 서열의 가운데 위치함으로써 결합력이 높은 것으로 판단된다. 이에 반해, P8GB#3 및 P8GB#6은 아미노산 서열의 가운데, 즉 5~6번째 서열 구간에서 낮은 소수성 값을 나타내기 때문에 그래피틱 표면과의 결합력도 낮게 나타난 것으로 판단된다. 비록 P8GB#3의 경우 방향족기인 트립토판을 갖고 있지만, P8GB#3은 5~6번째 서열이 낮은 소수성을 갖고 있고 소수성 특성과 방향족기의 특성 중 소수성 특성이 방향족기의 특성보다 더 강한 영향력을 갖기 때문이다. 또한, P8GB#6의 경우 시퀀스의 일부가 소수성 특성을 지니지만 5, 6번 위치의 아미노산이 친수성이어서 오히려 결합력은 음성 대조군인 P8GB#8(EGE)보다 낮은 것을 알 수 있다. 이는 추가로 삽입시킨 P8GB#6의 펩티드가 원래 파지의 비특이적 바인딩까지 억제시키기 때문으로 판단된다.
실시예
2. 펩티드
가
디스플레이된
M13
파지가
결합된
그래피틱
물질의 제조
1. 펩티드가 디스플레이된
M13
파지가
결합된
그래핀의
제조
본 발명의 일 실시예로서 서열번호 1의 펩티드가 디스플레이된 M13 파지를 정렬시킨 그래핀을 제조하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 사용된 바이오 패닝 방법을 사용하여 펩티드 서열 P8GB#1(서열번호 5)을 포함하는 M13 파지를 제작하고, pH가 높을수록 파지간의 정전기적 배척력(electrostatic repulsive force)이 커지므로 파지 간의 간격이 커질 수 있다는 것을 고려하여, pH를 7.0으로 맞춘 초순수 증류수로 농도가 1 X 1013 viral particle/ml인 파지 용액을 제조하였다. 이때 파지 용액의 농도는 하기의 수학식 1로 계산할 수 있다.
[수학식 1]
파지 농도(viral particla/ml) = 1.6 X 1016 X O.D. viral solution/7237
그 다음, 테이핑(Taping) 방법을 이용하여 그래핀(제품명:Kish graphite 제조사:Covalent)을 SiO2/Si 기판(제품명:EPI-Prime Si wafer with 300 nm dry oxidized SiO2, 제조사:SILTRON INC, Korea) 상에 올렸다. 그래핀이 올려져 있는 기판을 상기에서 제조한 P8GB#1 펩티드가 디스플레이된 파지 용액에 담근 다음, 10 μm/min의 속도로 상기 기판을 다시 용액 밖으로 끌어올렸다(dip-coating method). 그리고 이 끌어올린 기판의 표면에 펩티드의 결합에 의해 파지가 배열된 모습을 원자력 현미경(Atomic Force Microscope, AFM)으로 관찰하고, 그 이미지를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6은 일구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 파지를 그래핀의 표면에 정렬시킨 후 원자력 현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, AFM으로 나노물질의 표면을 측정하는 경우 표면의 높이가 높을수록 밝게 나타나는데, SiO2 기판은 검정색을 나타내는 것으로 보아 명도가 낮고, 그래핀은 명도가 높음을 알 수 있다. 이는 일 구체예에 따른 펩티드를 포함하는 파지가 SiO2 기판 위에는 결합되어 있지 않고 그래핀 표면 위에만 결합되어 있어 명도가 더 높게 나타났기 때문인 것으로, 상기의 결과로 일 구체예에 따른 펩티드가 그래핀 표면에 대하여 높은 선택성과 특이성을 지님을 알 수 있다.
한편, 도 5에서 그래핀 표면상에 존재하는 큰 원은 공기 버블에 의해 생긴 구멍으로서, 그 아래로 그래핀 표면이 드러나 있다. 이에 파지는 공기 버블을 제외한 그래핀 표면을 한 층으로 잘 덮고 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 공기버블 주위에는 공기 버블에 의해 고정화된 파지가 그래핀과 직접적으로 결합하지 않고 그래핀과 결합한 파지 위에 이층으로 결합된 형태를 나타내고 있음을 알 수 있다. 특히 도 5의 오른쪽 사진을 보면, 공기 버블 주위의 파지 위에 있는 파지는 서로 밀쳐내는 힘이 있으므로 접촉을 최소화하고 있기 때문에 개별 파지가 잘 나타난 반면, 그래핀과 붙어 있는 파지는 파지에 포함된 펩티드와 그래핀과의 결합력이 강하므로 그 결합 면적을 최대화하기 위하여 옆으로 퍼져 있다. 즉, 개별 파지가 뚜렷하게 나타나지 않고 그래피틱 표면에 파지들이 배열된 하나의 구조로 일체화되어, 그 자체로서 기능화된 시스템을 형성하였음을 알 수 있다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 그래핀 상에 일정 방향으로 배열된 파지 자체의 정렬구조가 파지와 그래핀 결합에 의한 파지 형태 변화에도 불구하고 배열된 모습이 잘 드러나 있음을 알 수 있다. 즉, 일 구체예에 따른 펩티드는 M13 파지의 외피 단백질 중 몸통부분인 p8에 디스플레이되어 있으므로, 이 펩티드의 그래핀 표면에 대한 강한 결합력에 의해 파지가 실 모양으로 누운 형태로 배열되어 있다. 특히, 상기 실 모양의 파지들이 모두 동일한 방향으로 방향성을 갖고 일렬로 정렬되어 있음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 파지를 그래피틱 표면을 갖는 물질에 방향성을 갖도록 배열할 경우, 그래피틱 표면을 갖는 물질자체를 비등방적으로 기능화시킬 수 있음을 알 수 있다.
2. 펩티드가 디스플레이된
M13
파지가
결합된
탄소나노튜브의 제조
2.1. 콜로이드 용액의 제조
먼저, 증류수에 계면 활성제인 소듐 콜레이트(sodium-cholate)를 2% w/v의 농도로 첨가한 수용액을 제조한 다음, 탄소나노튜브(제조사:Nanointegris, SuperPure SWNTs, solution형태, 농도: 250 ㎍/ml)를 48시간 동안 투석하여 단겹탄소나노튜브(Single-Wall Carbon nanotube)를 소듐 콜레이트로 안정화시킨 콜로이드 용액을 제조하였다.
이때 탄소나노튜브(CNT)의 평균 길이를 1μm, 평균 지름을 1.4 nm로 가정했을 때, 상기 콜로이드 용액에 포함된 단겹탄소나노튜브 개수의 계산식은 다음과 같다.
[수학식 2]
단겹탄소나노튜브 개수(개/ml) = 농도 ㎍/ml X 3 X 1011 CNT
상기 수학식에 의하면 상기 콜로이드 용액에 포함된 단겹탄소나노튜브 개수는 (7.5 × 1013)개/ml임을 알 수 있다.
2.2. 펩티드가 디스플레이된 파지의 제조
펩티드가 디스플레이된 파지는 두 가지의 방법으로 제조하였다. 상기 실시예 1의 2와 동일한 방법으로 펩티드가 디스플레이된 파지를 제조하거나, 유전자 재조합 방법을 통하여 제조하였다.
유전자 재조합 방법을 통한 서열번호 5의 펩티드가 p8에 디스플레이된 M13 파지는 서열번호 17 및 18의 프라이머를 사용하여 95℃에서 2분 동안 어닐링(annealing)하여 25℃로 0.1℃/s의 속도로 냉각시킨 다음, BspHI과 BamHI 제한효소로 절단(digestion)시킨 (37℃에서 2시간 동안 효소 반응시킨 후 65℃에서 20 동안 효소를 비활성화시킴) M13HK 벡터를 T4 DNA 리가아제(NEB, product# M0202S)로 16℃에서 12시간 동안 반응시켜 원형(circular) 벡터를 얻었다. 연결된(Ligated) 원형 DNA는 전기천공법(electroporation)으로 전기천공적격(electro-competent) E.coli (XL-1 Blue cell line, Agilent, product# 200228)에 삽입한 후 37℃ 진탕 배양기에서 6 시간 동안 배양하여 유전자 재조합된 M13 파지를 증폭하였다 (Agilent, product# 200228 product manual 방법을 따름). 파지와 대장균이 섞여 있는 배양물에서 파지를 정제하기 위해서 배양액을 8000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하여 상등액(supernatant)만 떠내었다. 이때 상등액에 파지가 포함되어 있으므로, 분리된 상등액에 20% w/v으로 준비된 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, Molecular weight 8000, Promega corporation, product# V3011)/NaCl 용액을 상등액 용액의 1/6 부피로 섞은 다음 4℃에 16시간 정도 반응시킨 후 12000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하였다. 이때 원심 분리된 용액에서 상등액을 버리고 바닥에 가라앉은 물질이 파지로, 남은 파지를 TBS(Dako, product# S3001)에 녹여서 파지 용액을 얻었다. 이때 파지 용액의 농도는 상기 수학식 1로 계산하였다.
상기의 방법으로 얻어진 파지 용액을 대장균을 이용하여 반복적으로 증폭할 수 있으며, 이때 대장균은 XL-1 블루 셀 라인(XL-1 blue cell line)을 얼리-로그(early-log, overnight culture를 1/100로 희석한 배양액) 상태로 사용하여 파지를 증폭하였다. 증폭된 파지 정제 방법은 상기의 방법과 동일하다.
2.3. 펩티드
가
디스플레이된
M13
파지가
결합된
탄소나노튜브의 제조
상기 제조한 콜로이드 용액과 상기 서열번호 5의 펩티드가 디스플레이된 M13 파지를 포함하는 파지용액을 4:1의 몰비율로 혼합하였다.
그 다음, 투석을 위하여 반투과성 멤브레인(semipermeable dialysis membrane; SpectrumLab, MWCO 12,000~14,000, product # 132 700) 튜브 안에 상기 혼합물을 각각 넣은 다음, 상기 각 멤브레인 튜브를 이온농도(NaCl)가 0.1 mM인 3차 증류수(저항 > 18 Mohm cm)에 대하여 투석을 진행하였다. 투석 시작 후 약 16시간이 지나자 상기 멤브레인 튜브 면을 따라서 얇은 전자 시트가 형성되었다. 그 다음, 상기 각 멤브레인 튜브를 3차 증류수에 옮겨 넣고 멤브레인 튜브의 멤브레인을 비틀어 전자 시트를 떼어내어 건조하였다. 상기 제조된 전자 시트의 두께는 약 100 nm 이었다.
도 7은 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소나노튜브의 제조과정 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 계면활성제가 포함된 용액에 첨가시켜 안정화된 콜로이드 물질에 탄소나노뷰브가 분산 또는 용해되어 있음을 알 수 있다. 단겹탄소나노튜브와 약 1개의 M13 파지가 결합하여 최종적으로는 탄소나노뷰브와 M13 파지가 퍼콜레이트 네트워크(percolated network)의 구조를 갖는 시트가 형성됨을 확인할 수 있다.
도 8은 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소 나노튜브의 형성 원리를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 펩티드가 디스플레이된 M13 파지가 결합된 탄소나노튜브의 형성은 멤브레인 튜브 안에 파지 용액 및 콜로이드 용액의 혼합물을 넣고 투석 용액에 대하여 투석함으로써 형성됨을 알 수 있다. 투석이 진행되는 동안 멤브레인 안과 바깥의 농도차에 의한 확산 효과로 인하여 콜로이드 물질 내의 탄소나노튜브의 표면에 붙어서 탄소 물질을 안정화시켰던 계면 활성제의 튜브 내의 농도가 낮아지게 되는데 이러한 확산에 의한 묽힘 현상은 멤브레인 근처가 가장 크다. 한편, 탄소나노튜브와 강한 결합력을 갖는 펩티드가 디스플레이된 M13 파지는 탄소나노뷰브를 둘러싼 계면 활성제의 농도가 낮아져야 탄소타나노튜브와 반응을 시작할 수 있게 되므로, 투석이 일정 시간 진행되면 이러한 결합은 묽힘 현상이 가장 활발한 멤브레인 근처에서 일어나게 된다. 이러한 원리로 투석 방법을 사용하여 시트를 형성할 수 있다.
실시예
3. 휘발성 유기화합물에 대한 친화력 평가
상기 실시예 1에서 선별한 펩티드 GP1(서열번호 7) 및 GP2(서열번호 8)가 휘발성 유기 화합물과 선택적으로 반응하는지 확인하기 위해서 액상 및 기상에서의 친화력을 분석하였다.
1. 벤젠에 대한 친화력 평가
먼저, 벤젠이 고정화된 HOPG 표면을 갖는 기판에 GP1 또는 GP2가 디스플레이된 파지를 각각 처리하여 벤젠과 결합한 파지의 개수(PFU)를 확인하였고, 그의 결과를 도 9의 A에 나타내었다.
그 다음, 마이크로 캔틸레버 시스템을 사용하여 기상평가를 실시하였다. 캔틸레버 시스템은 4개의 부분으로 이루어져 있고, 각 부분은 3개의 캔틸레버를 포함한다. 분리된 부분은 캔틸레버의 독립적인 기능화를 가능하게 한다. 제4 부분의 캔틸레버는 기준(reference)로 사용되었다. 펩티드 고정화를 위하여 Cr (10 nm)/Au (50 nm) 층을 마이크로캔틸레버 상에 적층하였다. 표면상에 존재하는 오염물을 제거하기 위해 피란하 용액(piranha solution)(4:1 ratio of H2SO4 (98.08%) and H2O2 (34.01%)) 중 세척하였고, 탈이온수로 씻어내었다. 티올화된 펩티드(Thiolated peptide) (10 μM 용액의 50 ㎕)를 상온에서 5시간 동안 캔틸레버의 금 표면상에 고정화시켰다. 펩티드-컨쥬게이트 마이크로캔틸레버를 DI/에탄올로 세척하였고, 질소하에서 건조시켰다. 측정을 위해, 펩티드-컨쥬게이트 마이크로캔틸레버는 기체의 흐름을 위한 입구 및 출구를 갖는 챔버 내에 수용되었다. 측정 동안의 습도는 챔 버내에 연결된 센서에 의해 모니터되었다. 매스 플로우 컨트롤러(Mass Flow Controller) (MFC)를 사용하여 모든 기체의 속도는 100 standard cubic centimeter per minute (sccm)로 제어되었다. 측정 전에, 마이크로 캔틸레버는 100 sccm에서 하룻밤동안 질소에 의해 안정화되었다. 이후 벤젠가스를 흘려주면서 10분 동안 흘려주면서 공진주파수(△Hz)의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 9의 B 에 나타내었다.
추가적으로, 마이크로 캔틸레버 센서에 습도를 약 9% 및 약 1%로 벤젠가스를 주입하였고, 그 결과를 도 9의 C에 나타내었다.
도 9는 일구체예에 따른 펩티드의 벤젠에 대한 액상 및 기상에서의 친화력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9의 A에 나타낸 바와 같이, 액상에서 GP1 펩티드는 벤젠에 친화력을 보이는 반면 GP2 펩티드는 벤젠과의 반응이 약한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 9의 B에 나타낸 바와 같이, 캔틸레버에 타겟물질이 결합하여 공진 주파수가 낮아졌음을 알 수 있다. 상기의 결과로 펩티드가 고정화된 캔틸레버와 고정화되어 있지 않은 기준 캔틸레버의 공진 주파수의 차이는 흘려주는 가스의 농도와 비례하며 이러한 원리가 가스 센서에 적용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 9의 C에 나타낸 바와 같이, 캔틸레버 센서에 습도가 9%정도로 벤젠가스를 주입한 결과, 공진주파수가 크게 변화하였다. 반면에 습도가 1% 미만일 때는 공진주파수 차이가 없는 것을 알 수 있다. 상기의 결과로 펩티드는 습도가 있는 환경에서 활성을 보이는 것을 의미하는 것으로, GP1 펩티드 및 벤젠 기체가 친화력을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
2. 6종의 가스에 대한 반응성 평가
상기 실시예 1에서 선별한 펩티드 서열 GP1 및 GP2를 상기 실시예 3의 1과 동일한 방법으로 각각 캔틸레버 센서에 고정화 한 후, 센서에 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스를 주입하여 반응성을 각각 평가하였다. 이때 반응시간은 10분, 질소배출시간 (N2 purging time)은 25분이었다. 가스 주입은 벤젠(4032 ppm), 톨루엔(5026 ppm), 자일렌 (6039 ppm), 헥산 (5299 ppm), 아세톤(8798 ppm), 에탄올(1473 ppm) 순으로 각각 주입하였으며, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10은 일 구체예에 따른 펩티드의 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스에 대한 반응성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, GP1은 벤젠에 가장 크게 반응하고 GP2의 경우 톨루엔에 크게 반응함을 확인할 수 있었다. 이는 GP1은 휘발성 유기화합물 중에서도 벤젠에 대한 선택성이 우수하고, GP2는 톨루엔에 대한 선택성이 우수함을 의미한다.
도 11은 일 구체예에 따른 펩티드의 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산, 아세톤, 에탄올의 6종의 가스에 대한 반응성을 포집된 가스의 농도를 정량분석하여 나타낸 도면이다(B:benzene, T:toluene, X:xylene, H:hexane, A: acetone, E:ehtanol).
도 11a에 나타낸 바와 같이, 도 10의 결과와 동일하게 GP1이 벤젠가스에 대한 반응성이 우수하고, 도 11에 나타낸 바와 같이, GP2는 톨루엔 가스에 대한 반응이 우수한 것으로 나타났다.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<130> PN109039
<150> KR 2014-0135860
<151> 2014-10-08
<160> 19
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> X is W, Y, F or H
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)
<223> X is D, E, N or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)
<223> X is I, L, or V
<400> 1
Xaa Ser Xaa Ala Ala Xaa Xaa Pro
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> X is I, L, or V
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)
<223> X is I, L, or V
<400> 2
Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ala Xaa Pro
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> X is W, Y, F, or H
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)
<223> X is I, L, or V
<400> 3
Ser Xaa Ala Ala Xaa Xaa Pro
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> X is I, L, or V
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> X is D, E, N, or Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)
<223> X is I, L, or V
<400> 4
Xaa Pro Xaa Xaa Ala Xaa Pro
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<400> 5
Asp Ser Trp Ala Ala Asp Ile Pro
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<400> 6
Asp Asn Pro Ile Gln Ala Val Pro
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<400> 7
Ser Trp Ala Ala Asp Ile Pro
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide selectively binding to graphitic materials and volatile
organic compounds
<400> 8
Asn Pro Ile Gln Ala Val Pro
1 5
<210> 9
<211> 7222
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cloning vector M13KE
<400> 9
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240
tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540
aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500
attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560
ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtg gtacctttct 1620
attctcactc ggccgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680
ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740
tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800
gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860
ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920
ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980
accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040
agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100
aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160
atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220
atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280
ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340
gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400
attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460
aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520
ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580
gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640
taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700
ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760
tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820
ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880
attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940
taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000
gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060
tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120
ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180
ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240
tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300
ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360
ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgc ggtaatgatt 3420
cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480
cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540
aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600
gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660
ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720
ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780
ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840
ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900
atttaggtca gaagatgaaa ttaactaaaa tatatttgaa aaagttttct cgcgttcttt 3960
gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020
aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080
agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140
gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200
ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260
gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320
gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380
actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaattt ctttatttct 4440
gttttacgtg caaataattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500
aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560
gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgt tactcaaact 4620
tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaatt gtttgtaaag 4680
tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatct attagttgtt 4740
agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800
actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860
ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920
ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980
gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040
attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt tccttttatt 5100
actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160
caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220
ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280
actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340
ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400
atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460
tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa 5880
caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940
caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120
cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 6180
tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc 6240
atgcctgcag gtcctcgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 6300
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 6360
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 6420
gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 6480
ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 6540
tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 6600
cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 6660
cgcgaattat ttttgatggc gttcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 6720
taatgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 6780
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 6840
acgattaccg ttcatcgatt ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc 6900
ctttgtagat ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatt aatttatcag ctagaacggt 6960
tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt tctcaccctt ttgaatcttt 7020
acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc 7080
ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag ggtcataatg tttttggtac 7140
aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg 7200
cctgtatgat ttattggatg tt 7222
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BamH I_SM_upper which is a primer used for site-directed mutation
<400> 10
aaggccgctt ttgcgggatc ctcaccctca gcagcgaaag a 41
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BamH I_SM_lower which is a primer used for site-directed mutation
<400> 11
tctttcgctg ctgagggtga ggatcccgca aaagcggcct t 41
<210> 12
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BamM13HK_P8_primer which is an extension primer used for
preparation
<400> 12
ttaatggaaa cttcctcatg aaaaagtctt tagtcctcaa agcctctgta gccgttgcta 60
ccctcgttcc gatgctgtct ttcgctgctg 90
<210> 13
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M13HK_P8 which is a library oligonucleotide used for preparation
<220>
<221> variation
<222> (1)..(95)
<223> n is a, g, c or t
<220>
<221> variation
<222> (1)..(95)
<223> m is a or c
<400> 13
aaggccgctt ttgcgggatc cnnmnnmnnm nnmnnmnnmn nmncagcagc gaaagacagc 60
atcggaacga gggtagcaac ggctacagag gcttt 95
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P8GB#3
<400> 14
Asp Thr Lys Trp Thr Gly Gly Glu
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P8GB#6
<400> 15
Val Thr Ala Val Pro Asn Asp Thr
1 5
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P8GB#8
<400> 16
Glu Gly Glu
1
<210> 17
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> insert for coding a peptide having binding affinity to graphitic
materials
<400> 17
catgaaaaag tcttttgtcc tcaaagcctc tgtagccgtt gctaccctcg ttccgatgct 60
gtctttcgct gctgattctt gggctgcgga tattccg 97
<210> 18
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> insert for coding a peptide having binding affinity to graphitic
materials
<400> 18
gatccggaat atccgcagcc caagaatcag gcagcgaaag acagcatcgg aacgagggta 60
gcaacggcta cagaggcttt gaggacaaag acttttt 97
<210> 19
<211> 50
<212> PRT
<213> P8 protein of M13 phage
<400> 19
Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Leu Gln Ala
1 5 10 15
Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile
20 25 30
Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys
35 40 45
Ala Ser
50
Claims (17)
- 그래피틱 물질에 특이적으로 결합하는 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 7 내지 60개의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로서, 상기 펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것이 아닌 것인 펩티드.
- 삭제
- 청구항 1의 펩티드가 파지의 외피 단백질(coat protein) 또는 그의 단편에 디스플레이된 파지.
- 삭제
- 청구항 3에 있어서, 상기 파지는 M13 파지, F1 파지, Fd 파지, If1 파지, Ike 파지, Zj/Z 파지, Ff 파지, Xf 파지, Pf1 파지 또는 Pf3 파지인 것인 파지.
- 청구항 3에 있어서, 상기 펩티드의 C-말단이 파지의 외피 단백질의 N-말단에 연결되거나, 또는 상기 펩티드가 파지의 외피 단백질의 연속되는 아미노산 서열 사이에 삽입되거나 또는 외피 단백질의 연속되는 아미노산 서열을 치환한 것인 파지.
- 청구항 6에 있어서, 상기 외피 단백질은 M13 파지의 p3, p6, p8 및 p9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 외피 단백질인 것인 파지.
- 청구항 1의 펩티드가 결합된 그래피틱 물질(graphitic material).
- 청구항 8에 있어서, 상기 펩티드는 파지의 외부 단백질 또는 그의 단편에 디스플레이되어 결합된 것인 그래피틱 물질.
- 청구항 8에 있어서, 상기 그래피틱 물질은 그래파이트(graphite), 그래핀(graphene), 고배향성 열분해흑연(Highly oriented pyrolytic graphite; HOPG), 탄소나노튜브(carbon nanotubes) 및 풀러린(fullerene)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것인 그래피틱 물질.
- 청구항 8에 있어서, 상기 그래피틱 물질은 시트(sheet)의 형태인 것인 그래피틱 물질.
- 청구항 8에 있어서, 상기 그래피틱 물질의 내부 구조는 퍼콜레이트 네트워크(percolated network)의 구조를 갖는 것인 그래피틱 물질.
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| US20050277160A1 (en) * | 2002-10-04 | 2005-12-15 | Kiyotaka Shiba | Peptide capable of binding to nanographite structures |
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