JP2024511387A - マスクした活性化可能サイトカイン構成体ならびに関連する組成物及び方法 - Google Patents

マスクした活性化可能サイトカイン構成体ならびに関連する組成物及び方法 Download PDF

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ワン，シン
イブゲニビッチ ベレズノイ，アレクシー
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Abstract

本明細書において、活性化可能サイトカイン構成体であって、（ａ）第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第３の開裂可能部分（ＣＭ３）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の開裂可能部分（ＣＭ１）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）とを含み、ＣＭ１がＣＰ１とＤＤ１との間に置かれ、ＣＭ３がＰＭ１とＣＰ１との間に置かれる、第１のモノマー構成体、及び（ｂ）第２のモノマー構成体が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の開裂可能部分（ＣＭ２）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）とを含み、ＣＭ２がＣＰ２とＤＤ２との間に置かれる、第２のモノマー構成体を含み、ＤＤ１及びＤＤ２は互いに結合し、ＡＣＣが、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２の活性の対照レベルと比較して、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２の活性の低減を特徴とする、活性化可能サイトカイン構成体が提供される。【選択図】図１

Description

本開示は、バイオテクノロジー分野に関するものであり、より具体的には、活性化可能サイトカイン構成体に関する。
サイトカインは、ウイルス感染及び／またはその他の抗原刺激に応答して、大部分の有核細胞から産生及び分泌される、天然に存在する低分子タンパク質及び糖タンパク質のファミリーである。インターフェロンは、サイトカインのサブクラスである。インターフェロンは、現在、３種の主要なクラス、すなわちＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン及びＩＩＩ型インターフェロンに分類される。インターフェロンは、細胞表面にある特定の膜受容体に結合することによって、その細胞活性を発揮する。
インターフェロン療法には、多くの臨床上の利点がある。例えば、インターフェロンは、免疫系を上方制御すること、また抗ウイルス特性及び抗増殖特性を有することが知られている。これらの生物学的性質のために、インターフェロンは、ウイルス感染症及び悪性腫瘍の治療のための治療薬として臨床的に用いられてきた。さらに、インターフェロンは、患者生来の免疫系をリクルートして、がん細胞を識別し、攻撃するために有用である。したがって、インターフェロン療法は、肝炎、カポジ肉腫、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫及びその他の疾患状態の治療など、がん及び抗ウイルスの治療で広く用いられてきた。ただし、インターフェロンの全身投与には、用量依存的毒性、とりわけ強いインフルエンザ様症状、神経症状、肝臓毒性、骨髄抑制及び不整脈などが伴う。黒色腫患者の試験では、ペンブロリズマブとペグ化ＩＦＮａとの併用により、治験責任医師による評価で、６０．５％の奏効率（「ＯＲＲ」）が得られた。この併用治療はまた、ペグ化ＩＦＮａの用量低減を必要とする、４９％のＧ３／Ｇ４の有害事象を伴った（Ｄａｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１８）。これらの望ましくない副作用のために、インターフェロン療法の投薬量は制限され、インターフェロン療法の中断または遅延につながることもある。
インターロイキンは、サイトカインの別のサブクラスである。インターロイキンは、細胞の成長、分化及び運動性を制御する。インターロイキンは、免疫応答、例えば炎症などの刺激に特に重要である。インターロイキンは、がん、自己免疫性疾患及びその他の疾患の治療に用いられてきた。例えば、インターロイキン－２（ＩＬ２）は、黒色腫、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、神経芽細胞腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）の治療に適応され、また急性冠症候群、急性骨髄性症候群（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝疾患、基底細胞癌、膀胱癌、乳癌、カンジダ症、大腸癌、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜腫、ＨＩＶの発見（ＨＩＶ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）、虚血性心疾患、関節リウマチ、鼻咽頭腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、全身性エリテマトーデス、結核及びその他の疾患を含む状態にも有用であるとみなされている。その他のインターロイキン、とりわけＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２及びＩＬ－２１などは、がん及びその他の疾患の治療薬となる可能性がある。インターロイキン療法は、とりわけインフルエンザ様症状、吐き気、嘔吐、下痢、低血圧及び不整脈など、望ましくない副作用を伴うことが多い。
したがって、所望の標的に対するサイトカイン療法の特異性及び選択性の向上というニーズ及び要望は、大きな関心事である。サイトカイン療法の疾患部位への標的化を高めることで、全身性の機構に基づく毒性を低減させ、より幅広い治療的実用性につながる可能性がある。
本開示は、活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、（ａ）第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、ＣＭ１がＣＰ１とＤＤ１との間に置かれ、ＣＭ３がＰＭ１とＣＰ１との間に置かれる第１のモノマー、ならびに（ｂ）第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の開裂可能部分（ＣＭ２）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含み、ＣＭ２がＣＰ２とＤＤ２との間に置かれる第２のモノマーを含有し、ＣＭ１、ＣＭ２及びＣＭ３がプロテアーゼの基質として機能し、ＤＤ１及びＤＤ２は互いに結合し、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照のレベルと比較して、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の低減を特徴とする、活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）を提供する。ＣＭ１、ＣＭ２及びＣＭ３を切断するプロテアーゼ（複数可）は、疾患のある組織（例えば、腫瘍組織）においては、健康な組織と比較して、過剰発現している場合がある。ＡＣＣは、疾患のある組織（例えば、腫瘍微小環境）においては、サイトカインが活性を発揮できるように、ＣＭ１、ＣＭ２及び／またはＣＭ３の開裂を受けて活性化してもよく、一方で健康な組織では、サイトカイン活性は低下する。したがって、本明細書で提供されるＡＣＣは、従来のサイトカイン療法と比較して毒性の低減をもたらし、サイトカインのより高い有効投薬量を可能にし、及び／またはサイトカインの治療域を広げることができる。
本明細書において、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含有する活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、（ａ）第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、ＣＭ１がＣＰ１とＤＤ１との間に置かれ、ＣＭ３がＰＭ１とＣＰ１との間に置かれ、（ｂ）第２のモノマー構成体が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の開裂可能部分（ＣＭ２）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含み、ＣＭ２がＣＰ２とＤＤ２との間に置かれ、ＤＤ１及びＤＤ２が互いに結合し、それによって第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体が二量体を形成し、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照のレベルと比較して、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの低減した活性レベルを有することを特徴とする、活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）が提供される。
いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）及び第４の開裂可能部分（ＣＭ４）をさらに含み、ＣＭ４はＰＭ２とＣＰ２との間に置かれる。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、ＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１、ＣＭ１及びＤＤ１を含む第１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＣＰ２、ＣＭ２及びＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２、ＣＭ２及びＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＭ１は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンである；ＰＭ１は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンαである；ＰＭ１は、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンβである；ＰＭ１は、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンγである；ＰＭ１は、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－１２である；ＰＭ１は、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７、４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－１５である；ＰＭ１は、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－２である；またはＰＭ１は、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－２１である。いくつかの実施形態では、ＰＭ２は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンである；ＰＭ２は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンαである；ＰＭ２は、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンβである；ＰＭ２は、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンγである；ＰＭ２は、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－１２である；ＰＭ２は、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７、４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－１５である；ＰＭ２は、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－２である；またはＰＭ２は、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－２１である。いくつかの実施形態では、ＰＭ１は、配列番号３２８～３２９、３２３及び３３１～４７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＭ２は、配列番号３２８～３２９、３２３及び３３１～４７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、１対のＦｃドメイン；ヒトＩＬ－１５受容体（ＩＬ１５Ｒα）のアルファ鎖からのスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメイン及び可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼ及びバルスター；プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）；変異ＲＮａｓｅＩフラグメントベースのアダプタ／ドッキングタグモジュール；エピトープ及びシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）；エピトープ及び単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）；タンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン及びＳＮＡＰ２５の相互作用に基づく可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）モジュール；抗原結合ドメイン及びエピトープからなる群から選択される対である。
いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、１対のＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、１対のＦｃドメインは、１対のヒトＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメインまたはヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインはそれぞれ、配列番号３と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインはそれぞれ、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２はそれぞれ、配列番号３１８及び３１９を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、グリコシル化を排除するための、及び／またはＦｃ－γ受容体結合を低減させるための変異を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、変異Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇを含む；いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、２３４番目及び／または２３５番目で変異、例えばＬ２３５Ｅ、またはＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＩｇＧ１内）、またはＦ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＩｇＧ４内）を含む；いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、もしくはＰ３３１Ｓ、またはこれらの組み合わせを含むＩｇＧ２のＦｃドメインである（全てＥＵナンバリングに準拠する）。
遺伝子操作したヒトＦｃドメインの追加例は、当業者に周知である。少なくとも１種のアミノ酸の変異がＦｃ機能の低下をもたらすＩｇ重鎖定常領域アミノ酸の例としては、重鎖定常領域の２２８、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２５２、２５４、２５６、２６５、２７０、２９７、３１８、３２０、３２２、３２７、３２９、３３０及び３３１番目のアミノ酸の変異が挙げられるが、これらに限定されない（ＥＵナンバリングに準拠する）。変異アミノ酸の組み合わせの例もまた、当該技術分野において知られており、例えばＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓなど２３４、２３５及び３３１番目のアミノ酸における変異の組み合わせ、またはＥ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ及びＫ３２２Ａなど３１８、３２０及び３２２番目のアミノ酸における変異の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
遺伝子操作したＦｃドメインのさらなる例としては、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６ ＩｇＧ１；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ ＩｇＧ１；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ ＩｇＧ１；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；１本の重鎖におけるＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ ＩｇＧ１、及び反対の重鎖におけるＤ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ、Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ ＩｇＧ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ ＩｇＧ１；Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ ＩｇＧ１；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ ＩｇＧ１；Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ ＩｇＧ１；Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７ＱまたはＮ２９７Ｇ ＩｇＧ１；Ｌ２３５Ｅ ＩｇＧ１；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ ＩｇＧ１；Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ ＩｇＧ４；Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ ＩｇＧ２；Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ ＩｇＧ２；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ ＩｇＧ１；Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ ＩｇＧ１；Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ ＩｇＧ１；Ｎ３２５Ｓ／Ｌ３２８Ｆ ＩｇＧ１などが挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作したＦｃドメインは、Ｎ２９７Ａ ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ｑ ＩｇＧ１及びＳ２２８Ｐ ＩｇＧ４からなる群から選択される１種以上の置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＤ１は抗原結合ドメインを含み、ＤＤ２は対応するエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗Ｈｉｓタグ抗原結合ドメインであり、ＤＤ２はＨｉｓタグを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２の少なくとも一方は、非ポリペプチドポリマー及び小分子からなる群から選択される、二量体化ドメインの置換基を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、互いに共有結合した非ポリペプチドポリマーを含む。いくつかの実施形態では、非ポリペプチドポリマーは硫黄含有ポリエチレングリコールであり、ＤＤ１及びＤＤ２は、１個以上のジスルフィド結合を介して互いに共有結合されている。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２の少なくとも一方は、小分子を含む。いくつかの実施形態では、小分子はビオチンである。いくつかの実施形態では、ＤＤ１はビオチンを含み、ＤＤ２はアビジンを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は、成熟サイトカインである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２はそれぞれ、成熟サイトカイン配列を含み、シグナルペプチドをさらに含む。シグナルペプチドは、本明細書において「シグナル配列」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、それぞれ独立して、インターフェロン、インターロイキン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＭＳＰからなる群から選択され、所望によりＣＰ１及び／またはＣＰ２は、独立してＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ β、ＩＦＮ γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４－１ＢＢ－Ｌ、ＯＸ４０、及びＯＸ４０Ｌから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は同一である。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は異なる。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は、いずれもインターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は、異なるインターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は同一のインターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１またはＣＰ２の一方はインターフェロンであり、もう一方のＣＰ１またはＣＰ２は、インターフェロン以外のサイトカインである。いくつかの態様では、一方または両方のサイトカインは、単量体サイトカインである。いくつかの態様では、一方または両方のインターフェロンは、単量体インターフェロンである。いくつかの態様では、ＣＰ１またはＣＰ２の一方は単量体インターフェロンであり、もう一方のＣＰ１またはＣＰ２は異なるサイトカインである。いくつかの態様では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、変異体サイトカイン配列を含有する。いくつかの態様では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、ユニバーサルサイトカイン配列を含有する。いくつかの態様では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、サイトカイン活性を保持するトランケートされた配列を含有する。
いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、ヒト野生型成熟インターフェロンである。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンであってよく、例えばインターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、インターフェロン－ω及びインターフェロン－τが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、インターフェロン－αである。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂ及びインターフェロンα－ｎ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、インターフェロンα－２ｂである。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、変異体インターフェロンである。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、内因性プロテアーゼ開裂部位が、１種以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によって機能不全にされている変異体インターフェロンである。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、例えば、異なるサイトカインサブタイプのハイブリッド配列、またはキメラサイトカイン配列、またはヒト化サイトカイン配列を有しているユニバーサルサイトカイン分子である。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、ユニバーサルインターフェロン分子である。いくつかの実施形態では、インターフェロン（複数可）は、ユニバーサルインターフェロンα、例えばインターフェロンα１及びインターフェロンα２ａのハイブリッドである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンβである。いくつかの実施形態では、インターフェロンβは、インターフェロンβ－１ａ及びインターフェロンβ－１ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、ＩＦａｂドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターロイキンを含む。いくつかの実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６及びＩＬ－１７からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１及び／またはＣＭ２は、合計約３個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１及びＣＭ２は、異なるプロテアーゼの基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１及びＣＭ２は、同一のプロテアーゼの基質を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（複数可）は、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツベイン－２（Ｏｔｕｂａｉｎ－２）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７）、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン（ｍａｒａｐｓｉｎ）、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３及びＴＭＰＲＳＳ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（複数可）は、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、及びＭＭＰ－１４からなる群から選択される。
好適な開裂可能部分は、ＷＯ２０１０／０８１１７３、ＷＯ２０１５／０４８３２９、ＷＯ２０１５／１１６９３３、ＷＯ２０１６／１１８６２９及びＷＯ２０２０／１１８１０９において開示され、これらの明細書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１及び／またはＣＭ２は、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５）、ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号６）、ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号７）、ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号８）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）、ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）、ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）、ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）、ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）、ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）、ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）、ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）、ＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３１）、ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３２）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３４）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３５）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３６）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号３７）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号４１）、ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）、ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）、ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）、ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）、ＩＳＳＧＬ（配列番号４６）、ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４７）、ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５１）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５２）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５６）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６１）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６２）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６４）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６５）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６６）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６９）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７２）、ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）、ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）、ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）、ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）、ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）、ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）、ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）、ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）、ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）、ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）、ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）、ＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号８５）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号８６）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号８７）、ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号８８）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号８９）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号９０）、ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号９１）、ＲＧＰＡ（配列番号９２）、ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号９３）、ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号９４）、ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号９５）、ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号９６）、ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号９７）、ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号９８）、ＰＬＧＬ（配列番号９９）、及びＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）及びＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（複数可）は対象の腫瘍によって産生され、例えばプロテアーゼは、対象の健康な組織内よりも、腫瘍内でより多量に産生される。いくつかの実施形態では、対象はがんを有すると診断または特定されている。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体において、ＣＰ１及びＣＭ１は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体において、ＣＭ１及びＤＤ１は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体において、ＣＰ２及びＣＭ２は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体において、ＣＭ２及びＤＤ２は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、ＣＭ１に直接的に隣接しているＣＰ１及びＤＤ１に直接的に隣接しているＣＭ１を含み、ＣＭ１は配列番号５～１００からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＣＭ２に直接的に隣接しているＣＰ２及びＤＤ２に直接的に隣接しているＣＭ２を含み、ＣＭ２は配列番号５～１００からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、ＣＭ１に直接的に隣接しているＣＰ１及びＤＤ１に直接的に隣接しているＣＭ１を含み、ＣＭ１は１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４個以下の長さのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＣＭ２に直接的に隣接しているＣＰ２及びＤＤ２に直接的に隣接しているＣＭ２を含み、ＣＭ２は１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４個以下の長さのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、サイトカイン（それぞれＣＭ１及びＣＭ２）が、１０、９、８、７、６、５または４個以下の長さのアミノ酸である開裂可能部分（それぞれＣＭ１及びＣＭ２）に直接的に隣接し、開裂可能部分が、ヒトＩｇＧのＦｃ領域である二量体化ドメイン（それぞれＤＤ１及びＤＤ２）に直接的に隣接するようにそれぞれ構成され、Ｆｃ領域のＮ末端が、第２のＦｃドメインとのジスルフィド結合に参加するヒンジ領域における最初のシステイン残基（Ｎ末端からＣ末端方向への読み取り）（例えば、ＥＵナンバリングを用いて、ヒトＩｇＧ１のシステイン２２６）となる。いくつかの態様では、二量体化ドメインは、上部ヒンジの残基が欠失したＩｇＧのＦｃ領域である。例えば、Ｆｃは、Ｎ末端配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号３３０）、ＥＲＫ、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号３６５）またはＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号３１７）が欠失した変異体である。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、少なくとも１個のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のリンカーは、ＰＭ１とＣＭ３との間に配置されたリンカーＬ１及び／またはＣＭ３とＣＰ１との間に配置されたリンカーＬ２である。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、少なくとも１個のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のリンカーは、ＰＭ２とＣＭ４との間に配置されたリンカーＬ３及び／またはＣＭ４とＣＰ２との間に配置されたリンカーＬ４である。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体はリンカーＬ１を含み、第２のモノマー構成体はリンカーＬ３を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ３は同一である。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体はリンカーＬ２を含み、第２のモノマー構成体はリンカーＬ４を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ２及びＬ４は同一である。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、ＣＰ１とＣＭ１との間のリンカー及び／またはＣＭ１とＤＤ１との間のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＣＰ２とＣＭ２との間のリンカー及び／またはＣＭ２とＤＤ２との間のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、各リンカーは、１個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸の全長を有する。いくつかの実施形態では、各リンカーは、少なくとも５個のアミノ酸の全長を有する。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、少なくとも１個のリンカーを含み、各リンカーは独立して、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）；ＧＧＧＳ（配列番号２）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）；ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）；ＧＳ；ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）；ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）；ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）；ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）；ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、各ｎは少なくとも１である整数である；ＧＧＳＧ（配列番号２２９）；ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）；ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１；ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）；ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）；ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１、ＣＭ１、及びＣＭ１のＣ末端に直接または間接的に連結されたＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端からＮ末端の方向で、ＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１、ＣＭ１、及びＣＭ１のＮ末端に直接または間接的に連結されたＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２、ＣＭ２、及びＣＭ２のＣ末端に直接または間接的に連結されたＤＤ２を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端からＮ末端の方向で、ＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２、ＣＭ２、及びＣＭ２に直接または間接的に連結されたＤＤ２を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＣＰ１、任意選択的リンカー、ＣＭ１、任意選択的リンカー及びＤＤ１を含み、ＤＤ１はＩｇＧのＦｃ領域であり、Ｆｃ領域のＮ末端は、第２のＦｃドメインとのジスルフィド結合に参加するヒンジ領域における最初のシステイン残基（Ｎ末端からＣ末端方向への読み取り）であり（例えば、ＥＵナンバリングを用いて、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のシステイン２２６）、ＣＰ１とＤＤ１のＮ末端システインとの間に配置されるＣＭ１及び任意のリンカー（複数可）（「連結領域」）は、合わせて１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４個以下のアミノ酸、好ましくは１０個以下のアミノ酸、特に好ましくは７個以下のアミノ酸の全長を有する。いくつかのこのような実施形態では、第１のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＰＭ１、任意選択的リンカー、ＣＭ３、及びＣＰ１のＮ末端に結合した任意選択的リンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＣＰ２、任意選択的リンカー、ＣＭ２、任意選択的リンカー及びＤＤ２を含み、ＤＤ２はＩｇＧのＦｃ領域であり、Ｆｃ領域のＮ末端は、第２のＦｃドメインとのジスルフィド結合に参加するヒンジ領域における最初のシステイン残基（Ｎ末端からＣ末端方向への読み取り）であり（例えば、ＥＵナンバリングを用いて、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のシステイン２２６）、ＣＰ２とＤＤ２のＮ末端システインとの間に配置されるＣＭ２及び任意のリンカー（複数可）（「連結領域」）は、合わせて１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４個以下のアミノ酸、好ましくは１０個以下のアミノ酸、特に好ましくは７個以下のアミノ酸の全長を有する。いくつかのこのような実施形態では、第２のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＰＭ２、任意選択的リンカー、ＣＭ４、及びＣＰ２のＮ末端に結合した任意選択的リンカーをさらに含む。いくつかの態様では、ペプチドマスクと開裂可能部分との間に、リンカーまたはスペーサーは存在しない。いくつかの態様では、サイトカインタンパク質と開裂可能部分との間に、リンカーまたはスペーサーは存在しない。いくつかの態様では、開裂可能部分と二量体化ドメインとの間に、リンカーまたはスペーサーは存在しない。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体が同一であり、配列番号３２１のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体である。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体はそれぞれ、配列番号３２１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端の方向で、配列番号３２３；任意選択的な０～１０個のアミノ酸である柔軟なリンカー；配列番号４１、配列番号６８及び配列番号１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ；任意選択的な０～１０個のアミノ酸である柔軟なリンカー；配列番号１；配列番号４１、配列番号６８及び配列番号１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のＣＭ；ならびに二量体化ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性は、表面プラズモン共鳴を使用して決定される、その同族受容体に対するＣＰ１及び／またはＣＰ２の結合親和性である。例えば、ＣＰ１またはＣＰ２がインターフェロンである場合、同族受容体は、インターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）であってよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性は、リンパ腫細胞の増殖レベルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性は、リンパ腫細胞における、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路の活性化レベルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞で分泌されるアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生レベルである。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及びＣＰ２活性の少なくとも１つが、対照のレベルと比較して少なくとも２倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性が、対照のレベルと比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、３０００倍、または４０００倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２活性の少なくとも１つが、対照のレベルと比較して少なくとも５０００倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性の対照レベルは、ＡＣＣをプロテアーゼ（複数可）に曝露した後の、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性の対照レベルは、対応する野生型成熟サイトカインの、対応するＣＰ１及び／またはＣＰ２活性である。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、プロテアーゼ（複数可）への曝露後に、切断産物を生成することを特徴とし、切断産物は、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性は、抗増殖活性である。いくつかの実施形態では、対照レベルは野生型成熟サイトカインのＥＣ５０値であり、ＥＣ５０（野生型対照レベル）に対するＥＣ５０（切断産物）の比率は、約１０未満、または約９未満、または約８未満、または約７未満、または約６未満、または約５未満、または約４未満、または約３未満、または約２未満、または約１．５未満であるか、または約１に等しい。いくつかの実施形態では、切断産物のＥＣ５０は、野生型成熟サイトカインのＥＣ５０とほぼ同一であり、これは開裂の後、ＣＰ１及び／またはＣＰ２活性が、完全に回復する、またはほぼ完全に回復することを示している。
本明細書において、本明細書に記載のＡＣＣのいずれか１つを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本組成物は、薬学的組成物である。本明細書においては、本明細書に記載される組成物のいずれか１つの、少なくとも１回の用量を含むキットもまた提供される。
本明細書において、治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか１つ、または本明細書に記載される組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象はがんを有すると特定または診断されている。いくつかの非限定的な実施形態では、がんは、カポジ肉腫、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫、神経芽細胞腫、基底細胞癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌である。いくつかの非限定的な実施形態では、がんはリンパ腫である。いくつかの非限定的な実施形態では、リンパ腫はバーキットリンパ腫である。
本明細書において、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか１つのＣＰ１及びＣＭ１を含むポリペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されるＤＤ１のいずれか１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されるＰＭ１及びＣＭ３のいずれか１つをさらに含む。本明細書において、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか１つのＣＰ２及びＣＭ２を含むポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。モノマーが同一である場合、本開示は、二量体化してＡＣＣを形成するモノマーをコードする単一の核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されるＤＤ２のいずれか１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されるＰＭ２及びＣＭ４のいずれか１つをさらに含む。特定の実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、同一のＣＰ、ＣＭ及びＤＤ構成成分を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、同一のポリペプチド（すなわち、同一のアミノ酸配列）によってコードされる。多くの場合、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体が同一のアミノ酸配列を含むとき、それらは、同一の核酸（すなわち、同一の核酸配列）によってコードされる。これらの実施形態のいくつかにおいて、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、同一の核酸によってコードされる。本明細書においては、本明細書に記載される核酸のいずれか１つを含むベクターもまた提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。本明細書においては、本明細書に記載される核酸のいずれか１つ、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１つを含む細胞もまた提供される。
本明細書において、核酸の対であって、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか１つの、第１のモノマー構成体のＣＰ１及びＣＭ１を含むポリペプチドと、第２のモノマー構成体のＣＰ２及びＣＭ２を含むポリペプチドと、を一緒になってコードする核酸の対が提供される。本明細書において、核酸の対であって、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか１つの、第１のモノマー構成体のＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１及びＣＭ１を含むポリペプチドと、第２のモノマー構成体のＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２及びＣＭ２を含むポリペプチドと、を一緒になってコードする核酸の対もまた提供される。本明細書において、本明細書に記載される核酸の対のいずれか１つを一緒になって含むベクターの対もまた提供される。いくつかの実施形態では、ベクターの対は、発現ベクターの対である。本明細書においては、本明細書に記載される核酸の対のいずれか１つ、または本明細書に記載されるベクターの対のいずれか１つを含む細胞もまた提供される。その他の実施形態では、本発明は、ベクターの対を含むベクターを提供する。
本明細書において、ＡＣＣを作製する方法であって、本明細書に記載されるいずれか１個の細胞を、液体培地中で、ＡＣＣを作製するのに十分な条件下にて培養することと、細胞または液体培地からＡＣＣを回収することとを含む、ＡＣＣを生成する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞または液体培地から回収したＡＣＣを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、単離したＡＣＣを薬学的組成物に調製することをさらに含む。
本明細書において、本明細書に記載の方法のいずれか１つで作製したＡＣＣが提供される。本明細書において、本明細書に記載のＡＣＣのいずれか１つを含む組成物もまた提供される。本明細書において、本明細書に記載される組成物のいずれか１つの組成物もまた提供され、組成物は薬学的組成物である。本明細書において、本明細書に記載される組成物のいずれか１つの、少なくとも１回の用量を含むキットもまた提供される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、本明細書で使用するための方法及び材料を記載する。当該技術分野で知られている他の好適な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定するものであるとは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
用語「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語のうちの１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。一例として、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、１個以上の細胞を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、数値または範囲で明記される量を修飾するために使用されるとき、数値だけでなく、当業者に既知の、その値からの合理的な逸脱も示す。例えば、適切な場合、±２０％、±１０％または±５％は、詳述された値が意図する意味の範囲内である。
濃度、量及びその他の数値データは、本明細書において、範囲形式で表されてよい、または示されてよい。係る範囲形式は便宜上及び簡略性のためのみに使用され、したがって範囲の制限として明示的に列挙された数値だけでなく、あたかも各数値及び部分的な範囲が明示的に列挙されるかのように、その範囲内に包含された全ての個々の数値または部分的な範囲もまた含むと柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。実例として、「約０．０１～２．０」の数値の範囲は、約０．０１～約２．０という明示的に列挙された値だけでなく、示された範囲内の個々の数値及び部分的な範囲もまた含むと解釈されるべきである。したがって、この数値の範囲内には、個々の値、例えば０．５、０．７及び１．５など、ならびに部分的な範囲、例えば０．５～１．７、０．７～１．５、及び１．０～１．５などが含まれる。さらに、このような解釈は、記載されている範囲の幅または特性に関係なく適用されるべきである。加えて、全ての百分率は、特に明記しない限り、重量％であると留意されたい。
本開示の範囲を理解する上で、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びそれらの派生形は、本明細書で使用する場合、記載された特徴、要素、構成成分、グループ、整数及び／または工程の存在を規定するが、その他の記載されていない特徴、要素、構成成分、グループ、整数及び／または工程の存在を排除しない、オープンエンドの用語であることを意図する。上記は、類似の意味を有する単語、例えば用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの派生形にも適用される。用語「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及びその派生形は、本明細書で使用する場合、記載された特徴、要素、構成成分、グループ、整数及び／または工程の存在を規定するが、その他の記載されていない特徴、要素、構成成分、グループ、整数及び／または工程の存在を排除する、クローズドの用語であることを意図する。用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、本明細書で使用する場合、記載された特徴、要素、構成成分、グループ、整数及び／または工程の存在の規定に加えて、特徴、要素、構成成分、グループ、整数及び／または工程の基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない存在の規定を意図する。これらの移行句のいずれか１つ（すなわち、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」）への言及は、具体的には用いられていない、その他の移行句のいずれかへの置き換えに対する直接的な支持を提供すると理解される。例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」から「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」への修正は、本開示を通して開示される任意の要素がこのように定義されるために、直接的な支持が見いだされる。この定義に基づいて、本明細書に開示される、または参照によって組み込まれる任意の要素は、特許請求される発明に含まれてもよく、または除外されてもよい。
本明細書で使用する場合、便宜上、複数の化合物、要素または工程が一般的な一覧において提示されてよい。ただし、これらの一覧は、一覧の各メンバーが別個の一意のメンバーとして個別に識別されるかのように解釈されるべきである。したがって、このような一覧の個別のメンバーは、そうでないという表示がない場合、単に一般的なグループでの提示のみに基づいて、同じ一覧の任意のその他のメンバーと同等に、事実上存在するものとして解釈されるべきでない。
さらに、特定の分子、構成体、組成物、要素、部分、賦形剤、疾患、状態、特性、ステップなどは、本開示のある特定の実施形態もしくは態様、または別個の段落もしくはセクションの文脈で議論されてよい。これは単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、このような任意の開示は、等しく適用可能であり、本開示及び特許請求の範囲のどこかに見いだされる、任意のその他の実施形態または態様と組み合わせることを意図すると理解され、これらは全て、出願日における出願及び特許請求する発明を形成する。例えば、構成体、組成物もしくは方法に関して記載された構成体、分子、方法ステップ、キット、または組成物の一覧は、本開示の任意のその他の部分に記載される構成体、組成物、配合物及び方法に関連した実施形態の直接的な支持を、それらの方法ステップ、有効な薬剤、キットまたは組成物が、その実施形態または態様の文脈またはセクションにおいて再列挙されていない場合であっても、見いだすことが意図され、直接的な支持を見いだす。
特に指定のない限り、「タンパク質をコードする核酸配列」は、互いの縮重バージョンであるため、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。
用語「Ｎ末端に置かれる」は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列における第１のドメインまたは配列の位置について第２のドメインまたは配列と比較して言及する場合、第１のドメインまたは配列は、第２のドメインまたは配列よりも、ポリペプチドの一次アミノ酸配列のＮ末端の近くに位置することを意味する。いくつかの実施形態では、第１のドメインまたは配列と第２のドメインまたは配列との間に、さらなる配列及び／またはドメインがあってもよい。
用語「Ｃ末端に置かれる」は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列における第１のドメインまたは配列の位置について第２のドメインまたは配列と比較して言及する場合、第１のドメインまたは配列は、第２のドメインまたは配列よりも、ポリペプチドの一次アミノ酸配列のＣ末端の近くに位置することを意味する。いくつかの実施形態では、第１のドメインまたは配列と第２のドメインまたは配列との間に、さらなる配列及び／またはドメインがあってもよい。
用語「外因性」は、細胞、組織または生物体の外側から導入される、または由来する任意の物質で、それが導入される同じ細胞、組織または生物体によって産生されない、または由来しない物質を意味する。
用語「形質導入された」、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」は、外因性核酸が細胞に導入または移入されるプロセスを意味する。「形質導入された」、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞（例えば、哺乳動物細胞）は、本明細書に記載される活性化可能サイトカイン構成体のいずれかをコードする外因性核酸を含有する外因性核酸（例えば、ベクター）を用いて形質導入された、トランスフェクトされた、または形質転換された細胞である。
用語「核酸」は、１本鎖または２本鎖の形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）または、これらの組み合わせを意味する。特に限定されない限り、この用語は、参照のヌクレオチドと類似した結合特性を有する、天然のヌクレオチドの周知の類似体を含有する核酸を包含する。特に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列に加えて相補的配列も暗に包含する。本明細書に記載される核酸のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。本明細書に記載される核酸のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。
当該技術分野において既知の、標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介変異誘発によって、ヌクレオチド配列への修飾を導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパルテート及びグルタメート）、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジン）、非極性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファン）、無電荷極性アミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシン）、親水性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、グルタミン、グルタメート、ヒスチジン、リシン、セリン及びスレオニン）、疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリン）が挙げられる。アミノ酸のその他のファミリーとしては、脂肪族ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリン及びスレオニン）、アミドファミリー（例えば、アスパラギン及びグルタミン）、脂肪族ファミリー（例えば、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン）、ならびに芳香族ファミリー（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」、または「と免疫反応する」という語句は、活性化可能抗原結合タンパク質複合体が、所望の標的抗原の１個以上の抗原決定基と反応し、その他のポリペプチドと反応しない、または極めて低い親和性、例えば約１０－６Ｍ以上で結合することを意味する。
用語「治療」は、疾患の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。いくつかの実施形態では、治療される疾患はがんであり、がんの少なくとも１つの症状を緩和するためのものである。
例示される活性化可能サイトカイン構成体の概略図である。 例示される活性化可能サイトカイン構成体の概略図である。 例示される活性化可能サイトカイン構成体の概略図である。 例示される活性化可能サイトカイン構成体の概略図である。 ペプチドマスクなしのサイトカイン構成体、ＩＦＮα－２ｂ－ｈＩｇＧ４ Ｆｃ（開裂可能部分１２０４ｄＬまたは開裂可能部分１４９０を有する）と、プロテアーゼ（ｕＰＡまたはＭＴ－ＳＰ１）との開裂反応を示し、この反応により、モノマーの成熟ＩＦＮα－２ｂが生成される。 プロテアーゼｕＰａ及びＭＭＰ１４による、サイトカイン構成体（ＰｒｏＣ４４０）の活性化を示す。 プロテアーゼｕＰａ及びＭＭＰ１４による、サイトカイン構成体（ＰｒｏＣ４４０）の活性化を示す。ＭＭＰ１４及びｕＰＡ開裂可能部位を有するＰｒｏＣ４４０の配列（配列番号３１６）を示す。 プロテアーゼｕＰａ及びＭＭＰ１４による、サイトカイン構成体（ＰｒｏＣ４４０）の活性化を示す。 Ａは、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を用いてインビトロで試験した、サイトカイン構成体（ＰｒｏＣ４４０）の活性を示す。Ｂは、Ｄａｕｄｉ細胞を用いてインビトロで試験した、サイトカイン構成体（ＰｒｏＣ４４０）の活性を示す。 イタリック体での任意選択のシグナル配列（配列番号２４４）、二重下線でのマスキングペプチド配列、太字体での開裂可能部分の配列、及び下線での成熟ＩＦＮα－２ｂの配列を有する、マスクしたサイトカイン構成体、ＰｒｏＣ７３２（配列番号３２１）の配列を示す。 イタリック体での任意選択のシグナル配列（配列番号２４４）、二重下線でのマスキングペプチド配列、太字体での開裂可能部分配列、及び下線での成熟ＩＦＮα－２ｂの配列を有する、サイトカインと二量体化ドメインとの間に開裂可能部分配列がない、マスクしたサイトカイン構成体、ＰｒｏＣ７３３（配列番号３２２）の配列を示す。 サイトカイン構成体、ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ７３３の概略図を示す。 ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を使用して試験した、サイトカイン構成体（ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ７３３）の活性を示す。 ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を使用して試験した、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ７３２（Ｐｂ－ＩＦＮα－２ｂとも称される）の活性を示す。 サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２８６の構造の概略図と、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイにおいて、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα－２ｂ）の活性と比較した、ＰｒｏＣ２８６の活性とを示す。ＰｒｏＣ２８６及びＳｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）は、同様レベルの活性を示し、これは、ＰｒｏＣ２８６が、ハムスター試験において、ＩＦＮα－２ｂの忍容性を評価するためのＳｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）対照の代用物として用いられ得ることを示唆していた。 サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２９１の構造の概略図と、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイにおいて、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）の活性と比較したＰｒｏＣ２９１の活性とを示す。ＰｒｏＣ２９１は、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）及びＰｒｏＣ２８６と比較して、有意に低下した活性を示した。 ＩＦＮａ対照（組み換えインターフェロンα、天然に存在しないＩ型インターフェロン）；ＰｒｏＣ４４０の活性なサイトカイン切断産物（ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ）；Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）（「ＰＥＧ－ＩＦＮａ２ｂ」）；及びＰｒｏＣ４４０の比活性と、インビボでの用量漸増試験、例えば、用量を０．０８、０．４、２、１０及び１５ｍｇ／ｋｇ（「ｍｐｋ」）で増加させる試験で、予測される毒性用量とを示す。 ゴールデンシリアンハムスターで実施した、異なる用量での忍容性試験において、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２８６、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２または対照（ヒトＩｇＧ４）の異なる投与量に応答した、動物の体重損失プロファイルを示す。試験した各構成体の、２ｍｇ／ｋｇ（「２ｍｐｋ」）の用量のデータを示す。 ゴールデンシリアンハムスターで実施した、異なる用量での忍容性試験において、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２８６、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２または対照（ヒトＩｇＧ４）の異なる投与量に応答した、動物の体重損失プロファイルを示す。試験した各構成体の、１０ｍｇ／ｋｇ（「１０ｍｐｋ」）の用量のデータを示す。 ゴールデンシリアンハムスターで実施した、異なる用量での忍容性試験において、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２８６、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２または対照（ヒトＩｇＧ４）の異なる投与量に応答した、動物の体重損失プロファイルを示す。試験した各構成体の、１５ｍｇ／ｋｇ（「１５ｍｐｋ」）の用量のデータを示す。 マスクしていないＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃ（ＰｒｏＣ２８６）を投薬した動物における、ＩＮＦａ２ｂ媒介毒性を示す。これは、ＡＬＰの上昇、及びＩＦＮａ２ｂ一重マスク（ＰｒｏＣ４４０）及び二重マスク（ＰｒｏＣ７３２）の治療指数の上昇に相当する。 忍容性試験における、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２８６、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２または対照（ヒトＩｇＧ４）の異なる投与量（２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ及び１５ｍｐｋ）に応答したゴールデンシリアンハムスターの、臨床的化学分析（アルカリフォスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ、及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ）の結果を示す。 忍容性試験における、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ２８６、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２または対照（ヒトＩｇＧ４）の異なる投与量（２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ及び１５ｍｐｋ）に応答したゴールデンシリアンハムスターの、血液学分析（網状赤血球数、好中球数及び白血球細胞（ＷＢＣ）数）の結果を示す。 Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイから決定した、ペプチドマスクなしのＩＦＮα－２ｂ－Ｆｃ融合タンパク質の活性への、連結領域（ＬＲ）の長さの影響を示す。 ＡＣＣ ＰｒｏＣ８５９マウス交差反応性インターフェロン（上）の構造、Ｂ１６マウス黒色腫細胞アッセイにおけるＡＣＣ ＰｒｏＣ８５９の抗増殖作用、及びＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３アッセイにおけるＡＣＣ ＰｒｏＣ８５９の活性を示す。 連結領域（ＬＲ）及びマスク連結領域（ＭＬＲ）の描写を含む、サイトカイン構成体を図式的に示す。 初代ヒト細胞への、ＰｒｏＣ７３２の活性化依存的な作用を示す。上段は、活性化ＰｒｏＣ７３２による骨髄性細胞中のＩＰ－１０の誘発を示し、下段は、Ｔ及びＮＫリンパ球中のＩＦＮ－γの誘発を示す。 Ｄａｕｄｉ異種移植モデルにおける、マスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ７３２）の、濃度を上昇させたときのインビボ有効性を示す。 ｕＰＡ処置済みＰｒｏＣ１５４９開裂不可のマスクした構成体と比較した、ＩＦＮａ－Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）によるマウス脾細胞のインビトロ活性化を示す。 マスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ７３２）及びｕＰＡで活性化したＰｒｏＣ７３２の、ハムスター黒色腫細胞生存率への影響を示す。 マスクした活性化可能ＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）の、１０、５０及び２００μｇでの抗腫瘍活性を示す。 開裂不可のマスクしたＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１５４９）に対する、マスクしたＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）のインビボ活性化を示す。 対照ナイーブマウスにおけるＭＣ３８腫瘍細胞移植（上段、図２４Ａ）と比較した、活性化可能ＩＦＮａ Ａ／Ｄ（２００μｇのＰｒｏＣ１０２３）で過去に処置したマウスにおける、ＭＣ３８腫瘍細胞再移植に応答した免疫記憶（下段、図２４Ｂ）を示す。 マスクしたＰｒｏ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（切断されていないＰｒｏＣ７３２）、マスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂ（ｕＰＡ処置済みＰｒｏＣ７３２）またはＰｅｇ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標））を使用した、Ｉ型インターフェロンシグネチャーの活性化依存的誘発の比較を示す。 二重マスクしたＩＮＦ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ７３２）及びＰｒｏＣ２８６、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ６５９の、ハムスターにおける薬物動態を示す。 ＰＢＳ対照と比較した、２０μｇの腫瘍内注入及び２００μｇの全身投与での一重マスクした活性化可能ＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ８５９）の抗腫瘍活性を示す。 Ｂ１６マウス黒色腫細胞でのＩＦＮａレポーターアッセイにおいて、一重マスクしたＰｒｏＣ８５９と比較した、二重マスクしたＰｒｏＣ１０２３の活性を示す。 Ｂ１６マウス黒色腫細胞でのＩＦＮａレポーターアッセイにおいて、ＰｒｏＣ１５４９と比較したＰｒｏＣ１０２３の活性を示す。 Ｂ１６マウス黒色腫細胞でのＩＦＮａレポーターアッセイにおいて、ＰｒｏＣ１５４９と比較したＰｒｏＣ１０２３の活性を示す。 ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を使用してインビトロで試験した、単量体の二重マスクしたＰｒｏＣ１２３９及び二量体の二重マスクしたＰｒｏＣ７３２の活性を示す。 ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を使用してインビトロで試験した、切断されていない状態、及びｕＰａまたはＭＴＳＰ１を用いたプロテアーゼ活性化後における、ＰｒｏＣ７３２、ＰｒｏＣ１５５０及びＰｒｏＣ１５５２の活性を示す。 ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３を使用して、組み換えＩＦＮａ２ｂ、単量体ＩＦＮａ２ｂ（ＰｒｏＣ６５７）、活性化ホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ（ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ）及びホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ（ＰｒｏＣ４４０）の活性を示す。 用量を増加させた、ＰｒｏＣ４４０（上段）及びペグインターフェロン（下段）の抗腫瘍活性を示す。 二重マスクした活性化可能でないＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１５４９）と比較した、１０μｇ、５０μｇ及び２００μｇでの、二重マスクした活性化可能ＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）の抗腫瘍活性を示す。 Ａは、ＰＢＳ対照と比較した、１０、５０及び２００μｇでのＰｒｏＣ１０２３の抗腫瘍活性を示す。Ｂは、活性化可能でないＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１５４９）と比較した、２００μｇでのＰｒｏＣ１０２３の抗腫瘍活性を示す。 ＭＭＰによる、ＮＳＵＢ（ＰｒｏＣ６４９）活性の回復を示す。 ｕＰＡによる、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ１２９９の条件付き活性化を示す。 ＩＦＮａＡＤ（配列番号４８１）と比較したＩＦＮａ２ｂ（配列番号１）及び、ＰｒｏＣ７３２と比較して、ＰｒｏＣ１３０１は活性化に耐性があることを示す。 濃度の関数としての、ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ１３０１の腫瘍成長抑制活性を示す。 腫瘍組織によるＰｒｏＣ７３２活性化のアッセイ（図３７Ａ）及びその結果を示す。蛍光標識したＰｒｏＣ７３２を、腫瘍組織切片上で、３７℃でインキュベートした。回収した溶液を、続いて、活性分子の定量化を可能にするキャピラリ電気泳動（図３７Ｃ）を通して、及びＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデル（図３７Ｂ）を使用して分析した。酵素的に不活性な試料を、対照組織として使用した。 腫瘍組織によるＰｒｏＣ７３２活性化のアッセイ（図３７Ａ）及びその結果を示す。蛍光標識したＰｒｏＣ７３２を、腫瘍組織切片上で、３７℃でインキュベートした。回収した溶液を、続いて、活性分子の定量化を可能にするキャピラリ電気泳動（図３７Ｃ）を通して、及びＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデル（図３７Ｂ）を使用して分析した。酵素的に不活性な試料を、対照組織として使用した。 腫瘍組織によるＰｒｏＣ７３２活性化のアッセイ（図３７Ａ）及びその結果を示す。蛍光標識したＰｒｏＣ７３２を、腫瘍組織切片上で、３７℃でインキュベートした。回収した溶液を、続いて、活性分子の定量化を可能にするキャピラリ電気泳動（図３７Ｃ）を通して、及びＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデル（図３７Ｂ）を使用して分析した。酵素的に不活性な試料を、対照組織として使用した。 腫瘍組織とのインキュベート後にＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデルによって分析した、ＰｒｏＣ７３２（図３８Ａ）及び組み換えＩＦＮ－ａ２ｂ（図３８Ｂ）分子の生理活性の変化を示す。１０ｎｇ／ｍＬのＰｒｏＣ７３２の、または１ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＦＮ－ａ２ｂの、０時間の値と比較して計算した生理活性の倍数変化を示す。腫瘍組織の不存在下で、２４時間インキュベートしたＰｒｏＣ７３２及びＩＦＮ－ａ２ｂタンパク質の生理活性を示す。それぞれの線は、インキュベートの前及び２４時間後に分析した、個々の試料（１００～０．０１ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度）をつないでいる。 腫瘍組織とのインキュベート後にＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデルによって分析した、ＰｒｏＣ７３２（図３８Ａ）及び組み換えＩＦＮ－ａ２ｂ（図３８Ｂ）分子の生理活性の変化を示す。１０ｎｇ／ｍＬのＰｒｏＣ７３２の、または１ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＦＮ－ａ２ｂの、０時間の値と比較して計算した生理活性の倍数変化を示す。腫瘍組織の不存在下で、２４時間インキュベートしたＰｒｏＣ７３２及びＩＦＮ－ａ２ｂタンパク質の生理活性を示す。それぞれの線は、インキュベートの前及び２４時間後に分析した、個々の試料（１００～０．０１ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度）をつないでいる。 腫瘍組織とのインキュベート後にＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデルによって分析した、ＰｒｏＣ７３２（図３８Ａ）及び組み換えＩＦＮ－ａ２ｂ（図３８Ｂ）分子の生理活性の変化を示す。１０ｎｇ／ｍＬのＰｒｏＣ７３２の、または１ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＦＮ－ａ２ｂの、０時間の値と比較して計算した生理活性の倍数変化を示す。腫瘍組織の不存在下で、２４時間インキュベートしたＰｒｏＣ７３２及びＩＦＮ－ａ２ｂタンパク質の生理活性を示す。それぞれの線は、インキュベートの前及び２４時間後に分析した、個々の試料（１００～０．０１ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度）をつないでいる。 非ヒト霊長類における、マスクしたＩＮＦ－ａ２ｂ及び対照分子の薬物動態を示す。カニクイザル（各群Ｎ＝２）を、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２の、単回、皮下投与で処置した。示された時点で血漿試料を収集し、総ＰｒｏＣ７３２濃度について分析した結果を示す。 非ヒト霊長類における、マスクしたＩＮＦ－ａ２ｂ及び対照分子の薬物動態を示す。カニクイザル（各群Ｎ＝２）を、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２の、単回、皮下投与で処置した。ＭＳＤ Ｖ－ｐｌｅｘアッセイで測定した、血清中のＩＰ－１０の濃度を示す。 非ヒト霊長類における、マスクしたＩＮＦ－ａ２ｂ及び対照分子の薬物動態を示す。カニクイザル（各群Ｎ＝２）を、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２の、単回、皮下投与で処置した。投与後１日目及び７日目の、循環Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ及びＩＰ－１０の濃度を、互いに対してプロットした図である。 インビトロでの、インターフェロンα受容体に対する活性化Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの結合を示す。ヒトＩＦＮＡＲ１、ヒトＩＦＮＡＲ２、カニクイザルＩＦＮＡＲ１、またはカニクイザルＩＦＮＡＲ２タンパク質を、固定した抗ヒトＦｃでコーティングしたチップ上に捕らえた。２５ｎＭ～１．５６２５μＭの範囲の濃度の活性化ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 インビトロでの、インターフェロンα受容体に対する活性化Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの結合を示す。ヒトＩＦＮＡＲ１、ヒトＩＦＮＡＲ２、カニクイザルＩＦＮＡＲ１、またはカニクイザルＩＦＮＡＲ２タンパク質を、固定した抗ヒトＦｃでコーティングしたチップ上に捕らえた。２５ｎＭ～１．５６２５μＭの範囲の濃度の活性化ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 インビトロでの、インターフェロンα受容体に対する活性化Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの結合を示す。ヒトＩＦＮＡＲ１、ヒトＩＦＮＡＲ２、カニクイザルＩＦＮＡＲ１、またはカニクイザルＩＦＮＡＲ２タンパク質を、固定した抗ヒトＦｃでコーティングしたチップ上に捕らえた。２５ｎＭ～１．５６２５μＭの範囲の濃度の活性化ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 インビトロでの、インターフェロンα受容体に対する活性化Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの結合を示す。ヒトＩＦＮＡＲ１、ヒトＩＦＮＡＲ２、カニクイザルＩＦＮＡＲ１、またはカニクイザルＩＦＮＡＲ２タンパク質を、固定した抗ヒトＦｃでコーティングしたチップ上に捕らえた。２５ｎＭ～１．５６２５μＭの範囲の濃度の活性化ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 一重マスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子の、ヒトＩＦＮＡＲ２への結合を示す。固定した抗ヒトＦｃでコーティングしたチップ上に、リガンドを捕らえた。２５ｎＭ～１．５６２５μＭの範囲の濃度のＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 一重マスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子の、ヒトＩＦＮＡＲ２への結合を示す。固定した抗ヒトＦｃでコーティングしたチップ上に、リガンドを捕らえた。２５０ｎＭ～１５．６２５μｍの範囲の濃度のマスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子（ＰｒｏＣ１９７６）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 一重マスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子の、ヒトＩＦＮＡＲ２への結合を示す。固定した抗ヒスチジン抗体でコーティングしたチップ上に、リガンドを捕らえた。２５ｎＭ～１．５６２５μＭの範囲の濃度のＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 一重マスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子の、ヒトＩＦＮＡＲ２への結合を示す。固定した抗ヒスチジン抗体でコーティングしたチップ上に、リガンドを捕らえた。２５０ｎＭ～１５．６２５μｍの範囲の濃度のマスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子（ＰｒｏＣ４４０）を、リガンドを捕らえたチップ上に送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成した。 非ヒト霊長類において、ＰｒｏＣ７３２によって誘発される、濃度を基準とした遺伝子発現プロファイル変化を示す。カニクイザル（各群Ｎ＝２）を、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２の、単回、皮下投与で処置した。処置した動物からのＰＢＭＣをハーベストし、バルクＲＮＡｓｅｑによって分析した。 カニクイザル（各群Ｎ＝２）を、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２の、単回、皮下投与で処置した。処置した動物からのＰＢＭＣをハーベストし、バルクＲＮＡｓｅｑによって分析した。読み取り数の変化が＞３である場合、遺伝子は発現が変動しているものとした。 ＰｒｏＣ１０２３が、腫瘍組織内の免疫細胞を優先的に活性化することを示す。処置の６日後、腫瘍及び組織をハーベストし、フローサイトメトリーによって分析した。生存可能なＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞でゲーティングした。 ＰｒｏＣ７３２の複数回の投与後、ＰｒｏＣ７３２の忍容性が良好であることを示す。雄のゴールデンシリアンハムスター（Ｎ＝５）に、ＰｒｏＣ７３２またはマスクなしのＦｃ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ２８６）融合タンパク質を、週１回の投与で、３回、腹腔内注射で処置し、投与前、及び投与後は週２回、体重変化及び生存をモニタリングした。 非ヒト霊長類において、ＰｒｏＣ７３２のマスキングが、サイトカイン／ケモカイン放出を弱めることを示す。
本明細書において、対応するサイトカインの少なくとも１つの活性レベルの低下を示すが、活性化条件に曝露後、実質的に回復した活性を有するサイトカイン産物を産生する活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）が提供される。本発明の活性化可能サイトカイン構成体は、患部組織への曝露に際して選択的に活性化し、正常組織においては活性化しないように設計され得る。このように、これらの化合物は、特定のサイトカインベースの治療に伴う毒性が潜在的に少ない、サイトカインベースの治療の利点を与える可能性を有する。
本明細書においては、関連する中間体、組成物、キット、核酸及び組み換え細胞、ならびに本明細書に記載の活性化可能サイトカインのいずれかの使用方法及び作製方法をはじめとする関連する方法もまた提供される。
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載される特定の要素及び構造的方向性を有するＡＣＣが、特にがん治療におけるサイトカインの安全性及び治療指数を向上させるのに、潜在的に有効であると思われることを見いだした。サイトカインは生来の免疫系及び適応免疫系の調節因子であり、前臨床モデルにおいて幅広い抗腫瘍活性を有する一方で、臨床的な成功は、全身性毒性及び標的組織への乏しい全身曝露によって限定されている。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載される特定の要素及び構造的方向性を有するＡＣＣが、サイトカイン治療に伴う全身性毒性を低減させ、標的化及び標的組織への曝露を改善すると思われることを見いだした。このように、本開示は、本明細書に記載される特定の要素及び構造的方向性を有するＡＣＣを、対象に投与することによって、サイトカイン治療の標的介在性の薬物消失（ＴＭＤＤ）を低減させる方法を提供する。このように、本発明は、投与されるサイトカイン投与量の有意な割合が、正常組織によって分離されるという問題を解決する。この分離は、体循環中の利用可能な投与量の割合が、従来のサイトカイン治療において、標的組織、例えばがん性組織に到達するのを制限するため問題である。本発明のサイトカイン構成体は、標的結合を腫瘍組織に限局し、それによって力価を維持し、副作用を低減させ、新しい標的機会を可能にし、認可された標的の治療域を改善し、創薬不可能な標的の治療域を作り出し、複数の結合様式を提供する。本開示は安全かつ有効な全身送達を可能にし、それによって従来の全身性サイトカイン療法の用量依存的毒性を回避し、また腫瘍内注入の必要性を回避する。本開示は、局部的な抗ウイルス性活性、免疫調節性活性、抗増殖活性及びプロアポトーシス活性を与えるための手段を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を二量体化することで、サイトカイン活性のより大きな低減が達成されることを見いだし、また驚くべきことに、活性化可能構成体のもう一方の末端にペプチドマスクを付加することによって、極めて高いマスキング効率を伴って、サイトカイン活性が実質的に低減し得ることを発見した。例えば、図１０Ａ～図１０Ｃを参照されたい。
出願人の、２０２０年４月１０日に出願された米国仮出願第６３／００８，５４２号、及び２０２１年３月１６日に出願された米国仮出願第６３／１６１，８８９号は、親和性ペプチドマスクのない特定の活性化可能サイトカイン構成体について記載しているものであり、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
活性化可能サイトカイン構成体
本発明の活性化可能なサイトカイン構成体（ＡＣＣ）は、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含む二量体複合体である。モノマー構成成分の二量体化は、１対の二量体化ドメインによって促進される。一態様では、各モノマー構成体は、サイトカインタンパク質（ＣＰ）、１個以上の開裂可能部分（ＣＭ）、二量体化ドメイン（ＤＤ）、及びペプチドマスク（ＰＭ）を含有する。本発明の発明者らは、二量体化ドメイン及びペプチドマスクを含むＡＣＣ構造は、改善されたマスキング効率を有し、サイトカインのオフターゲット効果、及び望ましくない活性、及び／または毒性のある副作用を最小限にする、または取り除くことを、予想外に見いだした。
特定の一実施形態において、本発明は、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含有する活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
（ａ）第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ２）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、
ＣＭ１がＣＰ１とＤＤ１との間に置かれ、ＣＭ２がＰＭ１とＣＰ１との間に置かれ、
（ｂ）第２のモノマー構成体が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の開裂可能部分（ＣＭ３）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含み、
ＣＭ３がＣＰ２とＤＤ２との間に置かれ、
ＤＤ１及びＤＤ２が互いに結合し、それによって第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体が二量体を形成し、
ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照のレベルと比較して、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの低減した活性レベルを有することを特徴とする、活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）を提供する。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）と、ＰＭ２とＣＰ２との間に置かれる第４の開裂可能部分（ＣＭ４）をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、互いに結合してホモ二量体を形成する。その他の実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれにおいて、ＣＰ、ＣＭ、ＰＭまたはＤＤ構成成分の少なくとも１個は同一でなく、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は互いに結合してヘテロ二量体を形成する。
用語「活性化可能」は、サイトカイン構成体に関して用いられる場合、１つ以上の活性の第１のレベルを示し、１個以上の開裂可能部分の開裂を引き起こす状態への曝露に際して、１つ以上の活性の第２のレベルを示すサイトカイン構成体の産生がもたらされるサイトカイン構成体であって、活性の第２のレベルが活性の第１のレベルよりも大きい、サイトカイン構成体を意味する。活性の非限定例としては、本明細書に記載される、または当該技術分野において既知のサイトカインの例示的な活性のいずれかが挙げられる。
用語「成熟サイトカインタンパク質」は、本明細書において、シグナル配列を欠くサイトカインタンパク質を意味する。シグナル配列は、本明細書において「シグナルペプチド」とも呼ばれる。サイトカインタンパク質（ＣＰ）は、成熟サイトカインタンパク質、またはシグナルペプチドを有するサイトカインタンパク質であってよい。したがって、いくつかの態様において、本発明に開示のＡＣＣは、成熟サイトカインタンパク質配列を含有してよい。いくつかの態様では、本発明に開示のＡＣＣは、成熟サイトカインタンパク質配列、及び付加的にシグナル配列を含有してよい。いくつかの態様では、本発明に開示のＡＣＣは、本明細書で引用されるシグナル配列を含有する、または欠く、本明細書にて開示される配列を含有してよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号２４２、配列番号２４３及び配列番号２４４からなる群から選択される。
用語「開裂可能部分」及び「ＣＭ」は、本明細書では交換可能に使用され、アミノ酸配列に配列特異的なプロテアーゼの基質が含まれるペプチドを意味する。ＣＭとして使用するのに好適な開裂可能部分としては、当該技術分野において既知であるプロテアーゼ基質のいずれかが挙げられる。例示的な開裂可能部分は、下記により詳細に記載される。
用語「ペプチドマスク」及び「ＰＭ」は、本明細書では交換可能に使用され、サイトカインタンパク質の１つ以上の活性を低減または阻害する、５０個未満のアミノ酸のアミノ酸配列を意味する。ＰＭはサイトカインに結合して、サイトカインがその受容体と相互作用するのを制限し得る。いくつかの実施形態では、ＰＭは、４０個以下の長さのアミノ酸である。好ましい実施形態では、ＰＭは、２０個以下の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＰＭは、１９、１８、１７、１６または１５個以下の長さのアミノ酸である。いくつかの態様では、ＰＭは少なくとも１３個のアミノ酸（１３～４９個の任意の数を含む）を有する。いくつかの態様では、ＰＭは少なくとも１４個のアミノ酸（１４～４９個の任意の数を含む）を有する。いくつかの態様では、ＰＭは少なくとも１５個のアミノ酸（１５～４９個の任意の数を含む）を有する。特定の態様では、ＰＭ内のアミノ酸の数は、サイトカインタンパク質に結合するアミノ酸としてカウントされてよい。例えば、ＰＭは、大きなポリペプチドを除外する。例えば、ＰＭは、潜在型関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）ではない。例えば、ＰＭはサイトカインではない。例えば、ＰＭはサイトカインの受容体ではない。例えば、ＰＭはサイトカインの受容体のフラグメントではない。いくつかの態様では、ＰＭは、サイトカインの受容体と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有しない。例えば、ＰＭはアルブミンではない。例えば、ＰＭは、５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドを除外する。いくつかの態様では、ＰＭは、２５個を超えるアミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドを除外する。いくつかの態様では、ＰＭは、２０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドを除外する。いくつかの態様では、ＰＭは、１５個を超えるアミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドを除外する。いくつかの態様では、ＰＭは、柔軟なＮ末端またはＣ末端尾部領域を形成するアミノ酸を含まない。
用語「二量体化ドメイン」及び「ＤＤ」は、本明細書では交換可能に使用され、１対の二量体化ドメインの１つのメンバーを意味し、対の各メンバーは、１個以上の共有または非共有結合的相互作用を介してもう一方に結合できる。第１のＤＤと第２のＤＤは同じでも異なっていてもよい。ＤＤ１及び／またはＤＤ２として使用するために好適な例示的なＤＤは、本明細書の以下に、より詳細に記載されている。
本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、アミノ酸配列がプロテアーゼの基質でないペプチドを意味する。例示的なリンカーは、以下により詳細に記載される。
本明細書で使用する場合、用語「連結領域」または「ＬＲ」とは、サイトカインのＣ末端と、二量体化ドメイン間の相互作用の近位点にＮ末端にて隣接するアミノ酸残基との間のアミノ酸残基の伸展を意味する（すなわち、連結領域は、サイトカインのＣ末端アミノ酸、または対応する第２のモノマーのＤＤとの相互作用の近位点を形成するＤＤのＮ末端アミノ酸を含有しない）。例えば、ＤＤが１対のＦｃドメインである場合、連結領域は、サイトカインのＣ末端と、第２のＦｃドメインとのジスルフィド結合に参加するＦｃの最初のＮ末端システイン残基（例えば、ＥＵナンバリングに準拠して、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインのシステイン２２６）との間のアミノ酸残基の伸展である。二量体化ドメインがポリペプチドでない場合、連結領域は、サイトカインのＣ末端から最後のアミノ酸までのアミノ酸残基の伸展である。例えば、ＤＤがビオチン－ストレプトアビジンの対である場合、ビオチン含有モノマーの連結領域は、サイトカインのＣ末端とビオチン分子との間のアミノ酸残基の伸展であり、ストレプトアビジン含有モノマーの連結領域は、サイトカインのＣ末端とストレプトアビジン分子との間のアミノ酸残基の伸展である。
本明細書で使用する場合、用語「マスク連結領域」または「ＭＬＲ」は、ＰＭとＣＰとの間のアミノ酸残基の伸展を意味する。ＭＬＲは、ＣＰのＮ末端からＰＭのＣ末端に及ぶ。したがって、ＭＬＲは、ＰＭ、ＰＭ及びリンカー、またはＰＭ及び２個のリンカーを含有してよい。いくつかの態様では、ＭＬＲは、１５～２２個のアミノ酸に及ぶ。いくつかの態様では、ＭＬＲは、１６～２１個のアミノ酸に及ぶ。いくつかの態様では、ＭＬＲは、１７～２０個のアミノ酸に及ぶ。いくつかの態様では、ＭＬＲは、１８～２０個のアミノ酸に及ぶ。いくつかの態様では、ＭＬＲは、１５、１６、１７、１８、１８、２０、２１または２２個のアミノ酸に及ぶ。
本明細書で使用する場合、用語「マスキング効率」は、対照サイトカインの活性によって分離される、切断されていないＡＣＣの活性（例えば、ＥＣ５０）を意味し、対照サイトカインは、ＡＣＣの切断産物、またはＡＣＣのＣＰとして用いられるサイトカインであってよい。少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性のレベルが低減したＡＣＣは、１０を超えるマスキング効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＣは、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、または５０００を超えるマスキング効率を有する。
本明細書で使用する場合、用語「スペーサー」は、本明細書において、成熟ＡＣＣの遊離末端に、例えばシグナルペプチドと成熟ＡＣＣのＮ末端との間に組み込まれるアミノ酸残基またはペプチドを意味する。いくつかの態様では、スペーサー（または「ヘッダー」）は、グルタミン（Ｑ）残基を含有してよい。いくつかの態様では、スペーサー内の残基は、アミノペプチダーゼ及び／またはエキソペプチダーゼ活性を最小限にして、Ｎ末端アミノ酸の開裂を防ぐ。例示的かつ非限定的なスペーサーアミノ酸配列は、以下：ＱＧＱＳＧＳ（配列番号２４６）；ＧＱＳＧＳ（配列番号２４７）；ＱＳＧＳ（配列番号２４８）；ＳＧＳ；ＧＳ；Ｓ；ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号２４９）；ＧＱＳＧＱＧ（配列番号２５１）；ＱＳＧＱＧ（配列番号２５２）；ＳＧＱＧ（配列番号２５３）；ＧＱＧ；ＱＧ；Ｇ；ＱＧＱＳＧＱ（配列番号２５４）；ＧＱＳＧＱ（配列番号２５５）；ＱＳＧＱ（配列番号２５６）；ＱＧＱＳＧ（配列番号２５７）；ＱＧＱＳ（配列番号２５８）；ＳＧＱ；ＧＱ；及びＱの例示的なアミノ酸配列のいずれかを含んでよい、またはからなってよい。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は省略されてもよい。
本明細書で使用される場合、サイトカインまたはＦｃドメインなどのポリペプチドは、野生型ポリペプチド（例えば、天然に存在するポリペプチド）、または野生型ポリペプチドの変異体であってよい。変異体は、変異体が野生型ポリペプチドの基本的な機能または活性を保持するという条件で、野生型ポリペプチドの１個以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失及び／または付加によって変性されたポリペプチドであってよい。一部の例では、変異体は、野生型ポリペプチドと比較して、変更された（例えば、増大または低減した）機能または活性を有してよい。いくつかの態様では、変異体は、野生型ポリペプチドの機能的フラグメントであってよい。用語「機能的フラグメント」は、完全長のポリペプチド配列よりも、より少ないアミノ酸を含有し得るが、活性（例えば、サイトカイン活性）を与えるために十分なポリペプチド鎖の長さを含有するポリペプチド（例えば、サイトカイン）の配列を意味する。
第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、例えば１個以上のリンカーなど、追加の要素をさらに含んでもよい。追加の要素については、以下でさらに詳細に記載する。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれにおけるＣＰ、ＣＭ、ＰＭ及びＤＤ構成成分の組織は、各モノマー構成体において同一の順序で配置されてよい。ＣＰ１、ＣＭ１、ＰＭ１及びＤＤ１構成成分は、対応するＣＰ２、ＣＭ２、ＰＭ２及びＤＤ２と比較して、例えば、ＣＰ、ＣＭ及びＰＭ構成成分（及びＤＤ構成成分がポリペプチドである実施形態ではＤＤ構成成分）の分子量、大きさ、アミノ酸配列などの観点から同一または異なってもよい。したがって、得られる二量体は、対称または非対称のモノマー構成体構成成分を有してよい。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体は、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＮ末端からＣ末端に、ＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１、ＣＭ１、及びＣＭ１のＣ末端に直接または間接的（リンカーを介して）に連結されるＤＤ１を含む。その他の実施形態では、第１のモノマー構成体は、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＣ末端からＮ末端に、ＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１、ＣＭ１、及びＣＭ１のＮ末端に直接または間接的（リンカーを介して）に連結されるＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＮ末端からＣ末端に、ＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２、ＣＭ２、及びＣＭ２のＣ末端に直接または間接的（リンカーを介して）に連結されるＤＤ２を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体は、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＣ末端からＮ末端に、ＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２、ＰＭ２、及びＣＭ２のＮ末端に直接または間接的（リンカーを介して）に連結されるＤＤ２を含む。一例では、第１のモノマー構成体は、ＰＭ１、ＣＭ３、ＣＰ１、ＣＭ１及びＤＤ１を含む第１のポリペプチドを含む。一例では、第２のモノマー構成体は、ＣＰ２、ＣＭ２及びＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む。別の例では、第２のモノマー構成体は、ＰＭ２、ＣＭ４、ＣＰ２、ＣＭ２及びＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＰ及びＤＤ構成成分は、プロテアーゼによって開裂可能でないリンカーによって連結される。例えば、ＣＰ及びＤＤ構成成分は、開裂不可基質配列（ＮＳＵＢ）によって連結されてよい。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体の一方はＣＰとＤＤとの間にＮＳＵＢを含み、もう一方はＣＰとＤＤとの間にＣＭを含む。いくつかの態様では、リンカーは、グリシン残基及びセリン残基を含有してよいが、プロテアーゼ開裂に影響されやすくないアミノ酸基質配列であり得る。開裂不可リンカー配列の例は、米国特許第１０，６１１，８４５Ｂ２号に記載されるものが挙げられ、同明細書は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような場合には、ＣＰ及び／またはＤＤは、プロテアーゼのための切断部位を有してもよい。
本開示のＡＣＣの例は、以下の式によって提示され得る（モノマー１／モノマー２の形態で、各モノマーにおけるＮ末端からＣ末端）。
ＰＭ１－ＣＭ３－ＣＰ１－ＣＭ１－ＤＤ１／ＰＭ２－ＣＭ４－ＣＰ２－ＣＭ２－ＤＤ２
ＰＭ１－ＣＭ３－ＣＰ１－ＣＭ１－ＤＤ１／ＣＰ２－ＣＭ２－ＤＤ２
ＤＤ１－ＣＭ１－ＣＰ１－ＣＭ３－ＰＭ１／ＤＤ２－ＣＭ２－ＣＰ２－ＣＭ４－ＰＭ２
ＤＤ１－ＣＭ１－ＣＰ１－ＣＭ３－ＰＭ１／ＤＤ２－ＣＭ２－ＣＰ２
ＡＣＣは、構成成分間に１個以上のリンカーを含んでもよい。例えば、ＡＣＣは、ＰＭとＣＰとの間に、及び／またはＣＰとＤＤとの間に１個以上のリンカーを含んでよい。したがって、本明細書で使用する場合、及び特に指定のない限り、ＡＣＣ構成成分間の各ダッシュ（－）は、直接的な連結または１個以上のリンカーを介した連結を示す。
いくつかの態様では、ＡＣＣがＮ－ＰＭ－ＣＭ１－ＣＰ－ＣＭ２－ＤＤ－Ｃの方向性を有する場合、ＡＣＣのＮ末端からサイトカインのＮ末端アミノ酸までのアミノ酸の全体スパンは、１７～７１個のアミノ酸の長さである。いくつかの態様では、ＡＣＣがＮ－ＤＤ－ＣＭ１－ＣＰ－ＣＭ２－ＰＭ－Ｃの方向性を有する場合、ＡＣＣのＣ末端からサイトカインのＣ末端アミノ酸までのアミノ酸の全体スパンは、１７～７１個のアミノ酸の長さである。
特定の実施形態では、第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、二量体の各メンバーの構成成分が、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＮ末端からＣ末端に、同じ順序で構成されるように方向付けられる。例示的なＡＣＣの概略図を、図１において提供する。図１を参照して、ＡＣＣは、Ｎ末端からＣ末端で、（１）ＰＭ１ １１９、ＣＭ３ １１７、ＣＰ１ １１５、ＣＭ１ １１３及びＤＤ１ １１１を有する第１のモノマー構成体１１０と；（２）所望によりＰＭ２ １２９及びＣＭ４ １２７、ＣＰ２ １２５、ＣＭ２ １２３及びＤＤ２ １２１を有する第２のモノマー構成体１２０と；（３）第２のモノマー構成体１２０に第１のモノマー構成体１１０を結合させる１個以上の共有または非共有結合（
Figure 2024511387000002
 ）と、を含む。ＡＣＣは、構成成分間に、１個以上の任意選択的リンカー１１２、１１４、１１６、１１８、１２２、１２４、１２６及び１２８をさらに含んでよい。一例では、ＤＤ１ １１１及びＤＤ２ １２１は同一である。別の例では、ＤＤ１ １１１及びＤＤ２ １２１は異なる。
ＡＣＣの構成成分を反対の方向で構成した、さらなる例示的なＡＣＣの概略図を図２に提供する。図２を参照して、ＡＣＣは、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＮ末端からＣ末端に、（１）ＤＤ１ ２１１、ＣＭ１ ２１３、ＣＰ１ ２１５、ＣＭ３ ２１７及びＰＭ１ ２１９を有する第１のモノマー構成体２１０と；（２）ＤＤ２ ２２１、ＣＭ２ ２２３、ＣＰ２ ２２５、ならびに所望によりＣＭ４ ２２７及びＰＭ２ ２２９を有する第２のモノマー構成体２２０と；（３）第２のモノマー構成体２２０に第１のモノマー構成体２１０を結合させる１個以上の共有または非共有結合（
Figure 2024511387000003
 ）と、を含む。ＡＣＣは、構成成分間に、１個以上の任意選択的リンカー２１２、２１４、２１６、２１８、２２２、２２４、２２６及び２２８をさらに含んでよい。一例では、ＤＤ１ ２１１及びＤＤ２ ２２１は同一である。別の例では、ＤＤ１ ２１１及びＤＤ２ ２２１は異なる。
別の例示的なＡＣＣの概略図を、図３において提供する。図３を参照して、ＡＣＣは、Ｎ末端からＣ末端で、（１）ＰＭ１ ３１９、ＣＭ３ ３１７、ＣＰ１ ３１５、ＣＭ１ ３１３及びＤＤ１ ３１１を有する第１のモノマー構成体３１０と；（２）ＣＰ２ ３２５、ＣＭ２ ３２３及びＤＤ２ ３２１、ならびに所望によりＰＭ２ ３２９及びＣＭ４ ３２７を有する第２のモノマー構成体３２０と、を含む。ＤＤ１ ３１１及びＤＤ２ ３２１は、結合パートナー、例えばリガンド／受容体の対または抗原／抗原結合ペプチドの対であり、その結果、ＤＤ１及びＤＤ２は、共有結合または非共有結合で一緒に結合される。ＡＣＣは、構成成分間に、１個以上の任意選択的リンカー３１２、３１４、３１６、３１８、３２２、３２４、３２６及び３２８をさらに含んでよい。一例では、ＤＤ１ ３１１及びＤＤ２ ３２１は同一である。別の例では、ＤＤ１ ３１１及びＤＤ２ ３２１は異なる。
代替的な態様では、ＣＰ１ ３１５及びＣＰ２ ３２５として示される２個の部分のいずれかは、サイトカイン活性を欠く、トランケートされたサイトカインタンパク質である。例えば、ＣＰ１またはＣＰ２は、野生型インターフェロンα２ｂの最初の１５１個のアミノ酸を有する、トランケートされたインターフェロンα２ｂであってよい。代替的な態様では、ＣＰ１ ３１５及びＣＰ２ ３２５として示される２個の部分のいずれかは、サイトカイン活性を欠く変異サイトカインタンパク質である。例えば、ＣＰ１またはＣＰ２は、Ｌ１３０Ｐの変異を有する、トランケートされたインターフェロンα２ｂであってよい（例えば、配列番号３２９）。代替的な態様では、ＣＰ１ ３１５及びＣＰ２ ３２５として示される２個の部分のいずれかは、サイトカイン活性を欠くポリペプチド配列、例えばシグナル部分及び／またはスタブ（ｓｔｕｂ）配列である。代替的な態様では、ＣＰ１ ３１５及びＣＰ２ ３２５として示される２個の部分の第１の部分は、ＣＰ１ ３１５及びＣＰ２ ３２５として示される２個の部分の第２の部分に、高い親和性で結合し、第２の部分の対照レベルと比較して、第２の部分のサイトカイン活性を低減させるポリペプチド配列である。
構成成分を反対の方向で構成した、別の例示的なＡＣＣの概略図を図４に提供する。図４を参照して、ＡＣＣは、ＣＰ及びＣＭ構成成分のＮ末端からＣ末端に、（１）ＤＤ１ ４１１、ＣＭ１ ４１３、ＣＰ１ ４１５、ＣＭ３ ４１７及びＰＭ１ ４１９を有する第１のモノマー構成体４１０と；（２）ＤＤ２ ４２１、ＣＭ２ ４２３、ＣＰ２ ４２５、ならびに所望によりＣＭ４ ４２７及びＰＭ２ ４２９を有する第２のモノマー構成体４２０と、を含む。ＤＤ１ ４１１及びＤＤ２ ４２１は、結合パートナー、例えばリガンド／受容体の対または抗原／抗原結合ペプチドの対であり、その結果、ＤＤ１及びＤＤ２は、共有結合または非共有結合で一緒に結合される。ＡＣＣは、構成成分間に、１個以上の任意選択的リンカー４１２、４１４、４１６、４１８、４２２、４２４、４２６及び４２８をさらに含んでよい。一例では、ＤＤ１ ４１１及びＤＤ２ ４２１は同一である。別の例では、ＤＤ１ ４１１及びＤＤ２ ４２１は異なる。
ＡＣＣ構造は、成熟サイトカインタンパク質構成成分が、活性化後に実質的にサイトカイン活性が損なわれないように活性を低減させるのに、極めて有効であることが発見された。ＡＣＣ内のＣＰの活性は、ＡＣＣの構造（例えば、二量体構造）及びＡＣＣ内のペプチドマスク（複数可）の両方によって低減されてよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＣの活性化条件は、ＤＤ及びＰＭの両方からＣＰを切り離すことができる、１種以上のプロテアーゼに曝露することである。例えば、１種以上のプロテアーゼは、ＣＰとＰＭとの間のＣＭ、及びＣＰとＤＤとの間のＣＭを切断してよい。実施例に示されるように、ＡＣＣの活性化は、サイトカイン活性の実質的な回復をもたらした。これらの結果は、ＡＣＣの状況内で、サイトカイン構成成分のコンフォメーションが、不可逆的には変えられなかったことを示唆している。重要なことに、本発明者らは、本発明の構造は、二量体化ドメイン、及びサイトカインタンパク質に対する特異的な結合親和性を有する１種以上のペプチドマスクの両方を利用して、ペプチドマスク単独でまたは二量体化ドメイン単独での使用以上に、実質的なマスキング効果を達成したと思われることを発見した。
ＡＣＣは、各種の成熟サイトカインタンパク質、開裂可能部分、ペプチドマスク及び二量体化ドメインのいずれかを、それぞれＣＰ１、ＣＰ２、ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ４、ＰＭ１、ＰＭ２、ＤＤ１、及びＤＤ２として用いてよい。例えば、当該技術分野において既知である、各種の成熟サイトカインタンパク質、またはそれらの配列及び／またはトランケート型変異体のいずれかは、ＡＣＣのＣＰ１及びＣＰ２構成成分の一方または両方としての使用に好適であり得る。成熟サイトカインタンパク質、ＣＰ１及びＣＰ２は、同一または異なってもよい。ある特定の実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は同一である。その他の実施形態では、ＣＰ１及びＣＰ２は異なる。ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２のＮ末端及び／またはＣ末端の一方または両方で、追加のアミノ酸残基を含んでよい。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、それぞれ独立して、インターフェロン（例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ及びインターフェロンωなど）、インターロイキン（例えばＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－２１など）、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＥＰＯｏ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＭＳＰなど、ならびにそれらの配列及び／またはトランケート型変異体からなる群から選択される成熟サイトカインタンパク質を含んでよい。特に、併用で用いられるＡＣＣは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４－１ＢＢ－Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌを含有してよい。例えば、このようなタンパク質の配列としては表１１の配列が挙げられ、配列の追加の例は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎから入手できる。本発明のＡＣＣでの使用に好適なトランケート型変異体としては、サイトカイン活性を保持する、任意の、Ｎ末端またはＣ末端にてトランケートされたサイトカインが挙げられる。本発明にて用いられる例示的なトランケート型変異体としては、当該技術分野において既知であるトランケートされたサイトカインポリペプチドのいずれか（例えば、Ｓｌｕｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６０：１０１９－１０３０，２００６及びＵＳ２００９／００２５１０６参照）、ならびにサイトカイン活性を保持する、１～約４０個のアミノ酸、１～約３５個のアミノ酸、１～約３０個のアミノ酸、１～約２５個のアミノ酸、１～約２０個のアミノ酸、１～約１５個のアミノ酸、１～約１０個のアミノ酸、１～約８個のアミノ酸、１～約６個のアミノ酸、１～約４個のアミノ酸が、Ｎ及び／またはＣ末端にてトランケートされたサイトカインポリペプチドが挙げられる。前述の実施形態のいくつかでは、トランケートされたＣＰは、Ｎ末端にてトランケートされたＣＰである。その他の実施形態では、トランケートされたＣＰは、Ｃ末端にてトランケートされたＣＰである。特定の実施形態は、トランケートされたＣＰは、Ｃ末端及びＮ末端にてトランケートされたＣＰである。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、それぞれ独立して、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、及び配列番号２０９からなる群から選択されるサイトカイン参照配列と、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）であるアミノ酸配列を含む。配列同一性のパーセンテージは、シーケンスアライメントプログラム、例えばインターネット上でＮＣＢＩウェブサイトに一般公開されているＢＬＡＳＴプログラムセットを用いてアライメントしたときの、２個以上のペプチド配列間におけるアミノ酸配列の同一性レベルを意味する。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０も参照されたい。いくつかの態様では、ＡＣＣは、インターフェロンα２ｂ変異体、例えば、配列番号１と比較して、Ｌ１３０の位置における変異、例えばＬ１３０Ｐ変異を有するインターフェロンα２ｂ分子（例えば、配列番号３２９）を、ＣＰ１またはＣＰ２として含有する。いくつかの態様では、ＡＣＣは、Ｉ２４、Ｆ６４、Ｉ６０、Ｉ６３、Ｆ６４、Ｗ７６、Ｉ１１６、Ｌ１１７、Ｆ１２３もしくはＬ１２８、またはこれらの組み合わせの位置における変異を有する、インターフェロンα２ｂ変異体を含有する。例えば、インターフェロンα２ｂ変異体は、Ｉ１１６がＴ、ＮもしくはＲに；Ｌ１２８がＮ、ＨもしくはＲに；Ｉ２４がＰもしくはＱに；Ｌ１１７Ｈ；またはＬ１２８Ｔ、またはこれらの組み合わせの変異を含有してよい。いくつかの態様では、インターフェロンα２ｂ変異体は、Ｉ２４Ｑ、Ｉ６０Ｔ、Ｆ６４Ａ、Ｗ７６Ｈ、Ｉ１１６Ｒ及びＬ１２８Ｎ、またはこれらのサブセットの変異を含有してよい。いくつかの態様では、ＡＣＣは、ＣＰ１及びＣＰ２のいずれかとして、サイトカイン活性を欠くトランケートされたインターフェロンα２ｂ分子を含有する。例えば、トランケートされたインターフェロンα２ｂは、インターフェロンα２ｂの１５１個以下のアミノ酸、例えば野生型インターフェロンα２ｂ配列のＮ末端からＣ末端までの１～１５１個、１～１５０個、１～１４９個、１～１４８個．．．１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、または２～１５１個、３～１５１個、４～１５１個、５～１５０個、６～１４９個、７～１４８個、８～１４７個のいずれか１つのアミノ酸、またはこれらのアミノ酸もしくは変異体の任意の介在配列からなってよい。
ある特定の実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターフェロンを含む。本発明の構成体での、ＣＰ１及び／またはＣＰ２としての使用に好適なインターフェロンとしては、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω及びインターフェロンτが挙げられる。いくつかの実施形態では、インターフェロンがインターフェロンαである場合、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂまたはインターフェロンα－ｎ３であってよい。インターフェロンαのさらなる例としては、インターフェロンα－１、インターフェロンα－４、インターフェロンα－５、インターフェロンα－６、インターフェロンα－７、インターフェロンα－８、インターフェロンα－１０、インターフェロンα－１３、インターフェロンα－１４、インターフェロンα－１６、インターフェロンα－１７及びインターフェロンα－２１が挙げられる。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、組み換えまたは精製インターフェロンαである。特定の実施形態では、インターフェロンがインターフェロンβである場合、インターフェロンβ－１ａ及びインターフェロンβ－１ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２はＩＦａｂドメインを含み、これはインターフェロンαまたはインターフェロンβにおいて見いだされる保存的タンパク質ドメインである。ＩＦａｂドメインは、インターフェロンのサイトカイン放出及び抗ウイルス機能を担っている。例示的なＩＦａｂ配列は、配列番号４８２～４９１に提供される。一例では、ＣＰ１及びＣＰ２は、異なるインターフェロンである。別の例では、ＣＰ１及びＣＰ２は同一のインターフェロンである。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターフェロン活性を示し、配列番号１、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５からなる群から選択されるインターフェロンα参照配列に、少なくとも８０％同一である、少なくとも８２％同一である、少なくとも８４％同一である、少なくとも８６％同一である、少なくとも８８％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、少なくとも９８％同一である、または少なくとも９９％同一である、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。ある特定の実施形態では、インターフェロンα参照配列は、配列番号１（ヒトインターフェロンα－２ｂ）である。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する成熟αインターフェロンを含む。特定の実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１のアミノ酸配列を有する成熟ヒトαインターフェロンを含む。上述した実施形態のいくつかにおいて、ＣＰ１及びＣＰ２は、同一のアミノ酸配列を含む。
その他の実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターフェロン活性を示し、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９からなる群から選択されるインターフェロンβ参照配列に、少なくとも８０％同一である、少なくとも８２％同一である、少なくとも８４％同一である、少なくとも８６％同一である、少なくとも８８％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、少なくとも９８％同一である、または少なくとも９９％同一である、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。特定の実施形態では、インターフェロンβ参照配列は、配列番号１０６及び配列番号１０７からなる群から選択されるヒトインターフェロンβ参照配列である。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する成熟βインターフェロンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１及びＣＰ２は同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターフェロン活性を示し、配列番号１１０（ヒトインターフェロンω）に相当するインターフェロンω参照配列に、少なくとも８０％同一である、少なくとも８２％同一である、少なくとも８４％同一である、少なくとも８６％同一である、少なくとも８８％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、少なくとも９８％同一である、または少なくとも９９％同一である、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。ある特定の実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する成熟ヒトωインターフェロンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１及びＣＰ２は同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターロイキン活性を示し、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるインターロイキン参照配列に、少なくとも８０％同一である、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する成熟インターロイキンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１及びＣＰ２は同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、インターロイキン活性を示し、配列番号１１１（ヒトＩＬ－１α）、配列番号１１３（ヒトＩＬ－１β）、配列番号１１５（ヒトＩＬ－１ＲＡ）、配列番号１１７（ヒトＩＬ－１８）、配列番号１１９（ヒトＩＬ－２）、配列番号１２１（ヒトＩＬ－４）、配列番号１２３（ヒトＩＬ－７）、配列番号１２５（ヒトＩＬ－９）、配列番号１２７（ヒトＩＬ－１３）、配列番号１２９（ヒトＩＬ－１５）、配列番号１３１（ヒトＩＬ－３）、配列番号１３３（ヒトＩＬ－５）、配列番号１３７（ヒトＩＬ－６）、配列番号１３９（ヒトＩＬ－１１）、配列番号１４３（ヒトＩＬ－１２α）、配列番号１４４（ヒトＩＬ－１２β）、配列番号１５１（ヒトＩＬ－１０）、配列番号１５３（ヒトＩＬ－２０）；配列番号１５５（ヒトＩＬ－１４）、配列番号１５７（ヒトＩＬ－１６）及び配列番号１５９（ヒトＩＬ－１７）からなる群から選択されるインターロイキン参照配列に、少なくとも８０％同一である、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含有する。これらの特定の実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、配列番号１１１（ヒトＩＬ－１α）、配列番号１１３（ヒトＩＬ－１β）、配列番号１１５（ヒトＩＬ－１ＲＡ）、配列番号１１７（ヒトＩＬ－１８）、配列番号１１９（ヒトＩＬ－２）、配列番号１２１、配列番号１２３（ヒトＩＬ－７）、配列番号１２５（ヒトＩＬ－９）、配列番号１２７（ヒトＩＬ－１３）、配列番号１２９（ヒトＩＬ－１５）、配列番号１３１（ヒトＩＬ－３）、配列番号１３３（ヒトＩＬ－５）、配列番号１３７（ヒトＩＬ－６）、配列番号１３９（ヒトＩＬ－１１）、配列番号１４３（ヒトＩＬ－１２α）、配列番号１４４（ヒトＩＬ－１２β）、配列番号１５１（ヒトＩＬ－１０）、配列番号１５３（ヒトＩＬ－２０）；配列番号１５５（ヒトＩＬ－１４）、配列番号１５７（ヒトＩＬ－１６）及び配列番号１５９（ヒトＩＬ－１７）からなる群からのアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１及びＣＰ２は同一のアミノ酸配列を含む。
用いられるサイトカインタンパク質の配列におけるアミノ酸の数は、用いられる特定のサイトカインタンパク質に応じて変動してよい。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、合計、約１０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸または約６５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２は、成熟野生型ヒトサイトカインタンパク質である。
ＡＣＣの各モノマー構成体は、各種の二量体化ドメインのいずれかを用いてよい。好適なＤＤとしては、高分子型（例えば、合成ポリマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなど）及び小分子型（約１キロダルトン未満、時には約８００ダルトン未満の分子量を有する非高分子部分）の部分の両方が挙げられる。１対のＤＤは、互いに結合することが当該技術分野において既知である、任意の部分の対であってよい。
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、ヒトＩＬ－１５受容体のアルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）からのスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメイン及び可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼ及びバルスター；プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）；変異ＲＮａｓｅＩフラグメントベースのアダプタ／ドッキングタグ分子；１対の抗原結合ドメイン（例えば、１対のシングルドメイン抗体）；可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）；タンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン及びＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくモジュール；シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及び対応するエピトープ；抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体などの１本鎖抗体）及び対応するエピトープ；コイルドコイルポリペプチド構造（例えば、Ｆｏｓ－Ｊｕｎコイルドコイル構造、酸／塩基コイルドコイルヘリックス、Ｇｌｕ－Ｌｙｓコイルドコイルヘリックス、ロイシンジッパー構造）、ビオチン及びアビジンまたはストレプトアビジン、アミン／アルデヒド、レクチン／炭水化物のような小分子が結合した対；互いに結合できる１対のポリマー、例えば１対の硫黄またはチオール含有ポリマー（例えば、１対のＦｃドメイン、１対のチオール化ヒト血清アルブミンポリペプチドなど）；などからなる群から選択される１対のメンバーである。
いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、非ポリペプチドポリマーである。非ポリペプチドポリマーは、互いに共有結合していてよい。いくつかの例では、非ポリペプチドポリマーは、硫黄含有ポリマー、例えば硫黄含有ポリエチレングリコールであってよい。このような場合、ＤＤ１及びＤＤ２は、１個以上のジスルフィド結合を介して、互いに共有結合していてよい。
１対のＤＤ１及びＤＤ２が、１対のエピトープ及び抗原結合ドメインのメンバーである場合、エピトープは、天然または非天然のエピトープであってよい。例示的な非天然のエピトープとしては、例えば、ポリＨｉｓペプチド（例えば、Ｈｉｓタグなど）などの非天然のペプチドが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、１対のＦｃドメインである。本明細書で使用する場合、「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリンの単一の重鎖の隣接するアミノ酸配列、例えばＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＤのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４ドメインなどを意味する。１対のＦｃドメインが一緒に結合して、免疫グロブリンのＦｃ領域を形成する。
いくつかの実施形態では、１対のＦｃドメインは、１対のヒトＦｃドメイン（例えば、１対の野生型ヒトＦｃドメイン）である。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン）、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン）、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン）、またはヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン）である。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、配列番号３に少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）配列を含む。
いくつかの実施形態では、１対のＦｃドメインは、Ｆｃドメインのノブ変異体及びホール変異体を含む。ノブ及びホール変異体は、互いに相互作用して二量体化を促進してよい。いくつかの実施形態では、ノブ及びホール変異は、２個のＦｃドメイン間の境界面内に（例えば、ＣＨ３ドメインに）、１個以上のアミノ酸修飾を含んでよい。一例では、修飾には、抗体重鎖の一方におけるアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ、及び所望によりアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ、ならびに抗体重鎖のもう一方におけるアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及び所望によりＹ３４９Ｃが含まれる（Ｋａｂａｔ番号付けシステムのＥＵインデックスに準拠して番号付け）。ノブアンドホール変異体の例としては、配列番号３１８及び３１９のＦｃ変異体、ならびに米国特許第５，７３１，１６８号、同第７，６９５，９３６号、及び同第１０，６８３，３６８号に記載されるものが挙げられ、同明細書は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、それぞれ配列番号３１８及び３１９に、少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＤ１及び／またはＤＤ２は、血清半減期延長部分（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質に結合するポリペプチド）をさらに含むことができる。半減期延長部分の例としては、ヘキサ－ｈａｔ ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）グルタチオンアフィニティー、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ストレップタグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、Ｓ－ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ、Ｅ２Ｔａｇ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、ＡＵ１及びＡＵ５エピトープ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕエピトープ、ＫＴ３エピトープ、ＩＲＳエピトープ、Ｂｔａｇエピトープ、プロテインキナーゼ－Ｃエピトープ、ならびにＶＳＶエピトープが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＤＤ１及び／またはＤＤ２はそれぞれ、合計、約５個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸～約８０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約１２０個のアミノ酸、約１２０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１２０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１２０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約１２０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約１２０個のアミノ酸～約１４０個のアミノ酸、約１４０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１４０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１４０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約１４０個のアミノ酸～約１６０個のアミノ酸、約１６０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１６０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１６０個のアミノ酸～約１８０個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸または約２００個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、それぞれ、２個のシステイン残基を含有するヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ＤＤ１及びＤＤ２は、それぞれ、Ｎ末端が、第２のＦｃドメインとのジスルフィド結合に参加するヒンジ領域における最初のシステイン残基（Ｎ末端からＣ末端方向への読み取り）である、Ｆｃドメインである（例えば、ＥＵナンバリングを使用して、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のシステイン２２６）。
いくつかの態様では、ＣＰ構成成分とＤＤ構成成分との間に、及び／またはＣＰ構成成分とＰＭ構成成分との間に、直接的にまたは間接的に（例えばリンカーを介して）置かれるのは、プロテアーゼの基質を含む開裂可能部分である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、それぞれ独立して、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＥＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、キマーゼ、クルジパイン、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、レグマイン、オツベイン－２（Ｏｔｕｂａｉｎ－２）、エラスターゼ、ＦＶＩＩａ、ＦｉＸＡ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ヘプシン、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ラクトフェリン、マラプシン（Ｍａｒａｐｓｉｎ）、マトリプターゼ－２、メプリン、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ネプリライシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ及びｕＰＡ、ならびにこれらの２個以上の任意の組み合わせからなる群から選択されるプロテアーゼの基質を含んでよい。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかの、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＭのいずれかを切断するプロテアーゼは、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツベイン－２（Ｏｔｕｂａｉｎ－２）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン（ｍａｒａｐｓｉｎ）、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３及びＴＭＰＲＳＳ４、ならびにこれらの２個以上の任意の組み合わせであることができる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、及びＭＭＰ－１４の群から選択される。
既知の基質を有するプロテアーゼのレベルの上昇が、多数のがんにて報告されている。例えば、Ｌａ Ｒｏｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９０（７）：１４１４－１４２１，２００４を参照されたい。本明細書で用いられるＣＭ構成成分での使用に好適な基質としては、がん細胞及び組織中により広く見いだされる基質が挙げられる。したがって、特定の実施形態において、ＣＭはそれぞれ独立して、がんに関連する疾患組織中でより広く見いだされるプロテアーゼの基質を含む。いくつかの実施形態では、がんは、胃癌、乳癌、骨肉腫及び食道癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは乳癌である。いくつかの実施形態では、がんは、ＨＥＲ２陽性癌である。いくつかの実施形態では、がんは、カポジ肉腫、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫、神経芽細胞腫、基底細胞癌、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、ＢＣＧ耐性筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）、子宮内膜癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、食道癌、胆嚢癌、神経膠腫、頭頸部癌、子宮癌、子宮頸癌または精巣癌などである。上述した実施形態のいくつかでは、ＣＭ構成成分は、腫瘍組織中により行き渡っているプロテアーゼ（複数可）の基質を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、それぞれ独立して、配列番号５～配列番号１００、及びそれらのＣ末端及びＮ末端トランケート型変異体からなる群から選択される配列を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、及びＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群から選択される配列を含有する。
特定の実施形態では、ＣＭ１及び／またはＣＭ１は、ＡＱＮＬＬＧＭＹ（配列番号２６４）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号２６５）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２６６）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２６７）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２６８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２６９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７０）、ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２７１）、ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７２）、ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７４）、ならびにそれらのＣ末端及びＮ末端トランケート型変異体からなる群から選択される配列を含有する。ＣＭの例としては、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６０２８９３２４号、第ＵＳ２０１９０２８４２８３号、公開番号ＷＯ２０１０／０８１１７３、ＷＯ２０１５／０４８３２９、ＷＯ２０１５／１１６９３３、ＷＯ２０１６／１１８６２９及びＷＯ２０２０／１１８１０９に記載されるものもさらに挙げられ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＣＭにおける使用が好適な上述したアミノ酸配列のトランケート型変異体は、対応するプロテアーゼの認識部位を保持する任意のトランケート型変異体である。これらには、プロテアーゼの認識部位を保持する、上述したアミノ酸配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸、または前述のアミノ酸配列の少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個のアミノ酸を含むＣ末端及び／またはＮ末端トランケート型変異体が挙げられる。特定の実施形態では、上述したアミノ酸配列のトランケート型変異体は、上記のいずれかに相当するが、１～約１０個のアミノ酸、１～約９個のアミノ酸、１～約８個のアミノ酸、１～約７個のアミノ酸、１～約６個のアミノ酸、１～約５個のアミノ酸、１～約４個のアミノ酸、または１～約３個のアミノ酸がＣ末端及び／またはＮ末端にてトランケートされたアミノ酸配列であり、（１）少なくとも３個のアミノ酸残基を有し；（２）プロテアーゼの認識部位を保持するものである。前述の実施形態のいくつかでは、トランケートされたＣＭは、Ｎ末端にてトランケートされたＣＭである。いくつかの実施形態では、トランケートされたＣＭは、Ｃ末端にてトランケートされたＣＭである。いくつかの実施形態では、トランケートされたＣは、Ｃ末端及びＮ末端にてトランケートされたＣＭである。
本明細書に記載される、活性化可能サイトカイン構成体のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＭは、合計約３個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＣＭは合計、約３個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸～約５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、または約２０個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸を含んでよい。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、異なるプロテアーゼの基質を含む複数のＣＭを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、同一のプロテアーゼの基質である複数のＣＭを含んでよい。一例では、各ＣＰとＰＭとの間のＣＭ（複数可）は、互いに同一のプロテアーゼの基質であってよく、各ＣＰとＤＤとの間のＣＭ（複数可）は、互いに同一のプロテアーゼの基質であってよいが、ＣＰとＰＭとの間のＣＭ（複数可）とは異なるプロテアーゼの基質であってよい。別の例では、ＣＰとＰＭとの間のＣＭ（複数可）及びＣＰとＤＤとの間のＣＭ（複数可）は、同一のプロテアーゼの基質を含んでよい。別の例では、ＣＰとＰＭとの間のＣＭ（複数可）は、異なるプロテアーゼの基質を含んでよい。別の例では、ＣＰとＰＭとの間のＣＭ（複数可）は、同一のプロテアーゼの基質を含んでよい。別の例では、ＣＰとＤＤとの間のＣＭ（複数可）は、異なるプロテアーゼの基質を含んでよい。別の例では、ＣＰとＤＤとの間のＣＭ（複数可）は、同一のプロテアーゼの基質を含んでよい。
第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、１個以上のリンカーなど、１個以上の追加の構成成分を含んでよい。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＣＰ１とＣＭ１との間に配置されるリンカーを含有できる。いくつかの実施形態では、第１のモノマーにおいて、ＣＰ１及びＣＭ１は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＣＭ１とＤＤ１との間に配置されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーにおいて、ＣＭ１及びＤＤ１は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＣＰ１とＣＭ３との間に配置されるリンカーを含有できる。いくつかの実施形態では、第１のモノマーにおいて、ＣＰ１及びＣＭ３は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＣＰ１とＰＭ１との間に配置されるリンカーを含有できる。いくつかの実施形態では、第１のモノマーにおいて、ＣＰ１及びＰＭ１は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸の全長を有する。いくつかの実施形態では、ＣＰ１とＤＤ１との間に配置されるＣＭ及び任意のリンカーは、合わせて３～１５個のアミノ酸、または３～１０個のアミノ酸、または３～７個のアミノ酸の全長を有する。
いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、ＣＰ２とＣＭ２との間に配置されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーにおいて、ＣＰ２及びＣＭ２は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、ＣＭ２とＤＤ２との間に配置されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーにおいて、ＣＭ２（例えば、本明細書に記載される開裂可能部分のいずれか）及びＤＤ２（例えば、本明細書に記載されるＤＤのいずれか）は、互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、ＣＰ２とＣＭ４との間に配置されるリンカーを含有できる。いくつかの実施形態では、第２のモノマーにおいて、ＣＰ２及びＣＭ４は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、ＣＰ２とＰＭ２との間に配置されるリンカーを含有できる。いくつかの実施形態では、第２のモノマーにおいて、ＣＰ２及びＰＭ２は互いに直接的に隣接する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸の全長を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ２とＤＤ２との間に配置されるＣＭ及び任意のリンカーは、合わせて３～１５個のアミノ酸、または３～１０個のアミノ酸、または３～７個のアミノ酸の全長を有する。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー及び／または第２のモノマーは、合計、約５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸～約１５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸～約２５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸～約３５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約３５０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸～約４５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約４５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸～約５５０個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約５５０個のアミノ酸～約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸～約６５０個のアミノ酸、約６５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約６５０個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸、約６５０個のアミノ酸～約７００個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸～約７５０個のアミノ酸または約７５０個のアミノ酸～約８００個のアミノ酸を含有できる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、１個以上のリンカー（例えば、柔軟なリンカー）を活性化可能サイトカイン構成体に導入して、ドメイン間の、部分間の、部分とドメインとの間の接合点の１個以上において、またはリンカーが有益であろう任意のその他の接合点において、柔軟性を提供することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣが立体構造的に拘束される構成体として提供される場合、柔軟なリンカーを挿入して、切断されていない活性化可能サイトカイン構成体における構造の構成及び維持を促進することができる。本明細書に記載されるリンカーはいずれも、所望の柔軟性を提供して、標的（例えば、サイトカインの受容体）の結合の阻害を促進する、またはプロテアーゼによるＣＭの開裂を促進することができる。いくつかの実施形態では、リンカーが、柔軟なリンカーに加えて、より柔軟でない構造を付与する１個以上の部分を含有して、所望のＡＣＣを提供できるように、ＡＣＣ中に含有されるリンカーは完全にまたは部分的に柔軟である。一部のリンカーはシステイン残基を含有してもよく、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、構成体の柔軟性を低減させてよい。リンカーまたは連結領域の長さを低減させると、ＡＣＣ中の成熟サイトカインタンパク質の活性が低減することが判明している（例えば、ペプチド親和性マスクのないＡＣＣのデータを示す図１６を参照）。ほとんどの場合、リンカーの長さは、アミノ酸の数を、Ｎ末端からＣ末端の方向に、前の構成成分のＣ末端アミノ酸に隣接するリンカーのＮ末端から、次の構成成分のＮ末端アミノ酸と隣接するリンカーのＣ末端まで（すなわち、リンカーの長さが、前の構成成分のＣ末端アミノ酸、または次の構成成分のＮ末端アミノ酸のいずれも含有しない場所）を数えることによって決定される。リンカーが、Ｆｃドメインを含むＤＤのＮ末端で用いられる実施形態では、リンカーの長さは、前の構成成分のＣ末端アミノ酸に隣接するリンカーのＮ末端から、第２のＦｃドメインとのジスルフィド結合に参加するＦｃヒンジ領域の最初のシステインと隣接するリンカーのＣ末端まで（すなわち、リンカーの長さが、前の構成成分のＣ末端アミノ酸、またはＦｃヒンジ領域の最初のシステインを含有しない場所）のアミノ酸の数を数えることによって決定される。
本開示及び図１８から明らかなように、本開示のＡＣＣは、ＣＰと、二量体化ドメイン間の相互作用の近位点との間のアミノ酸の伸展を含有する。アミノ酸のその伸展は、上記の定義のように、連結領域（ＬＲ）を指してよい。
いくつかの実施形態では、付加的なアミノ酸配列が、いずれかのＡＣＣの、いずれかのドメインに、Ｎ末端にてまたはＣ末端にて置かれてよい。例としては、標的部位（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体のリガンド）、及び血清半減期延長部分（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））などの血清タンパク質に結合するポリペプチド）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される、活性化可能サイトカイン構成体のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、合計約１個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸（例えば、約１個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約８個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約６個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約５個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約４個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約３個のアミノ酸、約１個のアミノ酸～約２個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約８個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約６個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約４個のアミノ酸、約２個のアミノ酸～約３個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約８個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約６個のアミノ酸、約４個のアミノ酸～約５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約８個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約６個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸～約８個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約８個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１２個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸～約１４個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸～約１６個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸～約１８個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約２２個のアミノ酸、約２２個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約２２個のアミノ酸～約２４個のアミノ酸、または約２４個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸）を含有できる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、合計約１個のアミノ酸、約２個のアミノ酸、約３個のアミノ酸、約４個のアミノ酸、約５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸、約７個のアミノ酸、約８個のアミノ酸、約９個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１１個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１３個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１７個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１９個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約２１個のアミノ酸、約２２個のアミノ酸、約２３個のアミノ酸、約２４個のアミノ酸、または約２５個のアミノ酸を含有する。
驚くべきことに、出願人は、ＣＰとＤＤとの間にいかなるリンカーも含まないＡＣＣが、連結領域にリンカーまたは付加的な配列を含有するＡＣＣと比較して、野生型成熟サイトカインに関するサイトカイン活性の最も著しい低減を示すことを発見した。例えば、図１６（ペプチド親和性マスクのないＡＣＣのデータを示す）を参照されたい。さらに、ＣＰとＤＤとの間にリンカーがない構成も、依然として、ＣＰとＤＤとの間に置かれるＣＭの有効な開裂を可能にする。例えば、図７Ａ、図７Ｂ、図１０Ａ～図１０Ｃを参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰとＤＤとの間にいかなるリンカーも含まず、ＣＰとＤＤとの間のＣＭは、１０、９、８、７、６、５、４または３個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＬＲにおけるアミノ酸の合計数は、２５個以下のアミノ酸、例えば、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３個以下のアミノ酸、または３～１０個のアミノ酸、または５～１５個のアミノ酸、または７～１２個のアミノ酸、または３～２５個のアミノ酸に包含される範囲から選択されるアミノ酸の任意の範囲または特定の数を含む。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）残基が豊富であることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリン（ＳｅｒまたはＳ）残基が豊富であることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリン残基が豊富であることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個以上のグリシン－セリン残基対（ＧＳ）（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のＧＳ対）を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）（配列番号２）配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のＧＧＧＳ配列）を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２１６）配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のＧＧＧＧＳ配列）を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＧＧＳＧ）（配列番号２２９）配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のＧＧＳＧ配列）を有する。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）、ＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）、ＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）、ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）、ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）、及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）のいずれか１個、または１個以上の組み合わせを含有する。
リンカーの非限定的例は、ＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）、及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）に、少なくとも７０％同一である（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）配列を含有できる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、ＧＳ、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、ＧＧＳＧ（配列番号２２９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）の群から選択される配列を含有し、ｎは、少なくとも１の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、及びＧＳからなる群から選択される配列を含有する。本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）の群から選択される配列を含有する。本明細書に記載される、活性化可能サイトカイン構成体のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）の群から選択される配列を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む。リンカーの追加例としては、表１１に列挙されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリンカー配列を含有できる（例えば、本明細書に記載される、または当該技術分野において既知の、例示的なリンカー配列のいずれかと同一または異なるリンカー配列）。いくつかの実施形態では、リンカーは、スルホＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ及びスルホＳＭＰＢを含み、リンカーは一級アミンスルフヒドリルと反応する。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照のレベルと比較して、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、対照レベルは、組み換えＣＰ１及び／またはＣＰ２（例えば、市販の組み換えＣＰ１及び／またはＣＰ２、組み換え野生型ＣＰ１及び／またはＣＰ２など）の活性レベルであることができる。いくつかの実施形態では、対照レベルは、ＡＣＣの切断（活性化）形態の活性レベルであることができる。特定の実施形態では、対照レベルは、ペグ化ＣＰ１及び／またはＣＰ２の活性レベルであることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性は、表面プラズモン共鳴（例えば、リン酸緩衝食塩水中で、摂氏２５度で行われる）を使用して決定される、その同族受容体に対するＣＰ１及び／またはＣＰ２の結合親和性である。特定の実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞の増殖レベルである。その他の実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞における、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路の活性化レベルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞における、ＳＥＡＰの産生レベルである。さらなる実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性は、例えばＲＮＡｓｅｑ解析（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４（１８）：５９００－５９０６，２００８；Ｈｉｌｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５２５５－５２６３，２００３を参照）を使用した、サイトカインで刺激された遺伝子誘導のレベルである。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性が、少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２活性の対照レベルと比較して、少なくとも２倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性が、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルと比較して、少なくとも５倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性が、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルと比較して、少なくとも１０倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性が、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルと比較して、少なくとも２０倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性が、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルと比較して、少なくとも３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、５０００倍または５，０００倍低いことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性が、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルと比較して、少なくとも１～２０倍低い、２００～２０００倍低い、３００～２０００倍低い、４００～２０００倍低い、５００～２０００倍低い、１０００～２０００倍低い、１５００～２０００倍低い、１００～１５００倍低い、２００～１５００倍低い、３００～１５００倍低い、４００～１５００倍低い、５００～１５００倍低い、１０００～１５００倍低い、１００～１０００倍低い、２００～１０００倍低い、３００～１０００倍低い、４００～１０００倍低い、５００～１０００倍低い、１０００～５０００倍低い、２０００～５０００倍低い、３０００～５０００倍低い、４０００～５０００倍低い、１０００～４０００倍低い、２０００～４０００倍低い、３０００～４０００倍低い、１０００～３０００倍低い、２０００～３０００倍低い、または１０００～２０００倍低いことを特徴とする。
いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルは、プロテアーゼ（複数可）によるＣＭの開裂に続いてＡＣＣから放出されるＣＰ１及び／またはＣＰ２の活性である（「切断産物」）。いくつかの実施形態では、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルは、対応する野生型成熟サイトカインの活性（例えば、組み換え野生型成熟サイトカイン）である。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼとともにＡＣＣをインキュベートすると、活性化サイトカイン産物（複数可）が産生され、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、無処置のＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも、少なくとも１倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも、少なくとも２倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも、少なくとも５倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも、少なくとも１０倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも、少なくとも２０倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物（複数可）のＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性は、ＡＣＣのＣＰ１及び／またはＣＰ２の１つ以上の活性よりも、少なくとも１～２０倍大きい、２００～２０００倍大きい、３００～２０００倍大きい、４００～２０００倍大きい、５００～２０００倍大きい、１０００～２０００倍大きい、１５００～２０００倍大きい、１００～１５００倍大きい、２００～１５００倍大きい、３００～１５００倍大きい、４００～１５００倍大きい、５００～１５００倍大きい、１０００～１５００倍大きい、１００～１０００倍大きい、２００～１０００倍大きい、３００～１０００倍大きい、４００～１０００倍大きい、５００～１０００倍大きい、１０００～５０００倍大きい、２０００～５０００倍大きい、３０００～５０００倍大きい、４０００～５０００倍大きい、１０００～４０００倍大きい、２０００～４０００倍大きい、３０００～４０００倍大きい、１０００～３０００倍大きい、２０００～３０００倍大きい、または１０００～２０００倍大きい。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３２１または３２２に、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一である配列を含有できる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３２１または３２２をコードする核酸に、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一である配列を含有する核酸にコードされることができる。いくつかの態様では、ＡＣＣは、このような配列を含有してもよいが、それらの配列のシグナル配列を含まない場合もある。シグナル配列は、特に限定されない。シグナル配列のいくつかの非限定例としては、例えば、配列番号２４４及びその他の配列の対応する残基及びヌクレオチド、または別の種もしくは細胞株からのシグナル配列と置換されたものが挙げられる。シグナル配列のその他の例としては、ＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ（配列番号２４２）及びＭＡＬＴＦＡＬＬＶＡＬＬＶＬＳＣＫＳＳＣＳＶＧ（配列番号２４３）が挙げられる。
これらの活性化可能サイトカイン構成体のさまざまな例示的な態様を以下に記載する。これらは、本明細書で提供される方法において、制限なく、任意の組み合わせで使用できる。活性化可能サイトカイン構成体及び活性化可能サイトカイン構成体の作製方法の例示的な態様を、以下に記載する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、特定のプロテアーゼとともに使用するために選択される。プロテアーゼは、腫瘍細胞によって産生されるプロテアーゼであってよい（例えば、腫瘍細胞は、健康な組織よりも、多量のプロテアーゼを発現してよい）。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、カテプシンのようなシステインプロテアーゼ、ＨｔｒＡ１、レグマイン、マトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、好中球エラスターゼ、ＴＭＰＲＳＳ３またはＴＭＰＲＳＳ４などのＴＭＰＲＳＳ、トロンビン、及びｕ－型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼとも称される）の群から選択される、少なくとも１種のプロテアーゼの基質である。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の基質である。ＭＭＰの例としては、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６及びＭＭＰ２７が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、及びＭＭＰ１９の基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭはＭＭＰ７の基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭはＭＭＰ９の基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭはＭＭＰ１４の基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは２種以上のＭＭＰの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくともＭＭＰ９及びＭＭＰ１４の基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、同一のＭＭＰの２個以上の基質を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも２個以上のＭＭＰ９基質を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも２個以上のＭＭＰ１４基質を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰの基質であり、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）；ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）；ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）；ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）；ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）；ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）；ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）；ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）；ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）；ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）；ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）；ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）；ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）；ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）；ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）；ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）；ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）；ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）；ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）；ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）；及び／またはＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）の配列を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、トロンビンの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、トロンビンの基質であり、ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）またはＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）の配列を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）；ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）；ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）；ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）；ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）；ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）；ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）；ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）；ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）；及びＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）の群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、好中球エラスターゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、セリンプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ｕＰＡの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、レグマインの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、マトリプターゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、システインプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、カテプシンなどのシステインプロテアーゼの基質である。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号２７５）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号２７６）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号２７７）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２７８）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２６６）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２６７）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２６８）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２７９）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２６９）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７０）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２７１）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７２）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７３）及び／またはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７４）の配列を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭは、配列番号５～配列番号１００からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）及びＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）の群から選択される配列を含む。
いくつかの態様では、ＡＣＣは、第１のモノマーであって、配列番号１及び１０１～２０９からなる群から選択されるＣＰ１と、配列番号５～１００及び２６４～３０８からなる群から選択されるＣＭ１と、配列番号３２８～３２９、３２３及び３３１～４７９からなる群から選択されるＰＭ１と、配列番号５～１００及び２６４～３０８からなる群から選択されるＣＭ３と、ＤＤ１と、を含む第１のモノマーを含有し、第１のモノマーは、配列番号１及び１０１～２０９からなる群から選択されるＣＰ２と、配列番号５～１００及び２６４～３０８からなる群から選択されるＣＭ２と、配列番号３２８～３２９、３２３及び３３１～４７９から選択されるＰＭ２と、配列番号５～１００及び２６４～３０８からなる群から選択されるＣＭ３と、ＤＤ２と、を含む第２のモノマーと二量体化される。いくつかの態様では、ＡＣＣは、ＣＰ１とＣＭ１との間に、ＣＰ１とＰＭ１との間に、ＣＰ１とＣＭ３との間に、ＰＭ１とＣＭ３との間に、及び／またはＣＭ１とＤＤ１との間に、配列番号２及び２１０～２６３からなる群から選択されるリンカーを含有し、かつＣＰ２とＣＭ２との間に、ＣＰ２とＰＭ２との間に、ＣＰ２とＣＭ４との間に、ＰＭ２とＣＭ４との間に、及び／またはＣＭ２とＤＤ２との間に、配列番号２及び２１０～２６３からなる群から選択されるリンカーを含有してよい。いくつかの態様では、ＰＭ１は、表１０に従うＣＰ１とともに使用するために選択され、ＰＭ２は、表１０に従うＣＰ２とともに使用するために選択される。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３または配列番号４に、少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有するＤＤ１及び／またはＤＤ２を含有する。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３１８または配列番号３１９に、少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有するＤＤ１を含有する。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３１８または配列番号３１９に、少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有するＤＤ２を含有する。
本明細書におけるＡＣＣの一方または両方のモノマーは、１個以上のペプチドマスク（ＰＭ）を含んでよく、ペプチドマスクは、ＣＰが結合パートナー（例えば、受容体）に結合することを妨げることができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣが活性化されないときは、ＡＣＣ中のＰＭはＣＰが標的に結合するのを防ぐが、ＡＣＣが活性化されると、ＰＭは、実質的にまたは著しく、ＣＰが結合パートナーに結合することを妨げない。いくつかの実施形態では、ＰＭは、ＣＭ、及び所望により本明細書に記載される１個以上のリンカーによってＣＰに連結される。
いくつかの実施形態では、ＰＭはＣＰと相互作用して、それによってＣＰと結合パートナーとの間の相互作用を低減または阻害してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＭはＣＰに特異的に結合しない場合があり、むしろ非特異的相互作用、例えば立体障害を介して結合パートナーへのＣＰの結合を妨げる。例えば、ＡＣＣの三次または四次構造によって、ＰＭが電荷ベースの相互作用を介してＣＰをマスクし、それによってＰＭを適切な位置に保持して、結合パートナーがＣＰに近づくことを妨げることが可能となるように、ＰＭは切断されていないＡＣＣ中に置かれ得る。
ＰＭの構造的特性は、例えば、タンパク質が標的に結合するのを妨げるのに必要となる最少アミノ酸配列、対象である標的タンパク質－タンパク質結合の対、サイトカインの大きさ、リンカーの有無などの要因に従って選択され得る。
ＰＭは、スクリーニング手順を介して、さまざまなＰＭを有する候補ＡＣＣのライブラリから、特定及び／またはさらに最適化され得る。例えば、ＣＰ及びＣＭは、所望の酵素／標的の組み合わせを提供するように選択されることができ、ＰＭのアミノ酸配列は、切換可能な表現型を提供するＰＭを特定するための、以下に記載されるスクリーニング手順によって特定できる。例えば、ランダムなペプチドライブラリ（例えば、約２～約４０個以上のアミノ酸を含むペプチドライブラリ）を、本明細書にて開示されるスクリーニング法で使用して、好適なＰＭを特定してよい。特定の実施形態では、ＣＰに対する特定の結合親和性を有するＰＭを、候補ＰＭからなるペプチドスキャフォールドのライブラリであって、各スキャフォールドが膜貫通タンパク質及び候補ＰＭによって構成されるライブラリを提供することを含むスクリーニング手順を介して、特定できる。続いて、ライブラリを、タンパク質の全体または一部、例えば完全長のタンパク質、天然に存在するタンパク質フラグメント、またはタンパク質を含有する非天然のフラグメント（対象である結合パートナーに結合できる）と接触させて、検出可能に結合したタンパク質を有する１種以上の候補ＰＭを特定してよい。スクリーニングは、１回以上の磁気活性化ソーティング（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化ソーティング（ＦＡＣＳ）、ならびに、例えばＵＳ２０２００３０８２４３Ａ１に記載されているような、ＣＰに対するＰＭの結合親和性の決定及び続くマスキング効率の決定によって行われてよく、同明細書は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＭは、連結されたＣＰに一意のものである。ＰＭの例としては、サイトカインまたはタンパク質フラグメント（例えば、親和性ペプチドマスク）の結合ドメインに結合することに特定してスクリーニングされたＰＭが挙げられる。サイトカインに一意であり、結合パートナー／標的の結合ドメインに特異的に及び／または選択的に結合するＰＭを得るための、ＰＭをスクリーニングする方法が本明細書で提供され、タンパク質ディスプレイ法を含むことができる。表１０には、さまざまな例示的なＣＰとともに使用するのに好適な、例示的なＰＭが開示されている。
いくつかの実施形態では、ＣＰがＰＭに連結され、ＣＰの天然の結合パートナーがある場合、例えば実施例１に記載されているようなマスキング効率アッセイで測定するとき、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間、または５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０日間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月間以上、ＣＰの結合パートナーに対する結合は起こらない、または実質的に結合は起こらない、またはＣＰの結合パートナーに対する結合は、ＰＭに連結されていないＣＰの結合と比較して、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または５０％以下である。
本開示によって企図されるＰＭは、１～５０個のアミノ酸にわたってよい（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０または４０個のアミノ酸、または４０、３０、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４または３個以下のアミノ酸）。一部の例では、ＰＭは、８～１５個のアミノ酸の長さであってよい。
ＰＭは、遺伝的にコードされた、または遺伝的にコードされていないアミノ酸を含有してよい。遺伝的にコードされていないアミノ酸の例は、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸及びγ－アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＰＭは、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％または１％以下の遺伝的にコードされていないアミノ酸を含有する。
ＰＭに連結されているときの、サイトカインの標的または結合パートナーに対する結合親和性は、ＰＭに連結されていないときの、サイトカインの結合パートナーに対する結合親和性よりも、少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１，０００倍、２，５００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、５００，０００倍、１，０００，０００倍、５，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、５０，０００，０００倍以上低く、またはＰＭに連結されていないときの、サイトカインの結合パートナーに対する結合親和性よりも、５～１０倍、１０～１００倍、１０～１，０００倍、１０～１０，０００倍、１０～１００，０００倍、１０～１，０００，０００倍、１０～１０，０００，０００倍、１００～１，０００倍、１００～１０，０００倍、１００～１００，０００倍、１００～１，０００，０００倍、１００～１０，０００，０００倍、１，０００～１０，０００倍、１，０００～１００，０００倍、１，０００～１，０００，０００倍、１０００～１０，０００，０００倍、１０，０００～１００，０００倍、１０，０００～１，０００，０００倍、１０，０００～１０，０００，０００倍、１００，０００～１，０００，０００倍、または１００，０００～１０，０００，０００倍低くなり得る。
サイトカインがＰＭに連結され、結合パートナーの存在下である場合、サイトカインの結合パートナーに対する特異的結合は、ＰＭに連結されていないサイトカインのその結合パートナーに対する特異的結合と比較して、低減される、または阻害される。ＰＭに連結されていないサイトカインのその結合パートナーへの結合と比較するとき、ＰＭに連結されているときの、結合パートナーに結合するサイトカインの能力は、例えば実施例１に記載されているような、インビボまたはマスキング効率アッセイにおいて、例えばＵＳ２０２００３０８２４３Ａ１に記載されているような、インビトロ免疫吸着アッセイで測定されるとき、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間、または５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０日間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月間以上、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びさらには１００％低減されることができる。
ＰＭのサイトカインに対するＫＤは、サイトカインの、サイトカインの結合パートナーに対するＫＤよりも、通常大きくてよい。ＰＭのサイトカインに対するＫＤは、サイトカインの、サイトカインの結合パートナーに対するＫＤよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００倍またはさらには１０，０００，０００倍大きくてよい。あるいは、ＰＭのサイトカインに対する結合親和性は、サイトカインの、サイトカインの結合パートナーに対する結合親和性よりも、通常低くてよい。ＰＭのサイトカインに対する結合親和性は、サイトカインの、サイトカインの結合パートナーに対する結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００倍またはさらには１０，０００，０００倍低くてよい。
いくつかの実施形態では、ＰＭは、ＣＰの天然に存在する結合パートナー（例えば、ＣＰの受容体）の、少なくとも部分的なまたは完全なアミノ酸配列を含む。ＰＭは、天然に存在する結合パートナーのフラグメントであってよい。フラグメントは、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％または２０％以下の、天然に存在する結合パートナーとの核酸またはアミノ酸配列相同性を保持してよい。
いくつかの実施形態では、ＰＭは、天然に存在しないアミノ酸配列、または天然に存在する結合パートナーもしくは標的タンパク質のアミノ酸配列を含有しないアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＰＭは、ＣＰの天然の結合パートナーではない。ＰＭは、ＣＰへの結合親和性及び／または結合活性が、少なくともわずかに低下しているというアミノ酸の変化を含有する、ＣＰの修飾された結合パートナーであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＭは、ＣＰの天然の結合パートナーとの核酸またはアミノ酸相同性を含有しない、または実質的に含有しない。その他の実施形態では、ＰＭは、ＣＰの天然の結合パートナーに、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％以下類似している。
いくつかの実施形態では、ＰＭは、配列番号３２８～３２９、３２３及び３３１～４７９から選択される配列に、少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を含む。インターフェロン、好ましくはＩＦＮ－αである、ＣＰとともに使用するための例示的なＰＭは、コンセンサス配列：ＴＤＶＤＹＹＲＥＷＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号３６１）を含有でき、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、表１０に列挙される１対のＰＭ１及びＣＰ１、または１対のＰＭ２及びＣＰ２を含んでよく、この表は、具体的な例示的サイトカインとともに使用するための例となるＰＭを含有する。いくつかの例では、ＰＭ１は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンである；ＰＭ１は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンαである；ＰＭ１は、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンβである；ＰＭ１は、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はインターフェロンγである；ＰＭ１は、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－１２である；ＰＭ１は、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７、４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－１５である；ＰＭ１は、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－２である；またはＰＭ１は、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ１はＩＬ－２１である。いくつかの例では、ＰＭ２は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンである；ＰＭ２は、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンαである；ＰＭ２は、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンβである；ＰＭ２は、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はインターフェロンγである；ＰＭ２は、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－１２である；ＰＭ２は、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７、４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－１５である；ＰＭ２は、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－２である；またはＰＭ２は、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつＣＰ２はＩＬ－２１である。
いくつかの実施形態では、ＰＭは不活性サイトカインを含んでよい。例えば、不活性サイトカインは、ＡＣＣのＣＰ構成成分と相互作用して、ＣＰとＣＰの結合パートナーとの間の相互作用を妨げてよい。一例では、不活性サイトカインは、変異、例えばＬ１３０Ｐの変異を有するＩＦＮα－２ｂ（配列番号３２９）を含んでよい。別の例では、不活性サイトカインは、野生型サイトカインのトランケート型、例えば１～１５０個のアミノ酸を有するＩＦＮα－２ｂ（配列番号３２８）であってよい。
いくつかの実施形態では、ＰＭは、一度サイトカインから切り離され、遊離状態になってから、生物活性または治療効果、例えば結合能力を有してよい。例えば、遊離のペプチドは、同一または異なる結合パートナーと結合できる。特定の実施形態では、遊離のＰＭ（切り離されたＰＭ）は、治療効果を発揮して、本明細書で開示される組成物に二次機能を提供することができる。いくつかの実施形態では、ＰＭは、一度サイトカインから切り離され、遊離状態になってから、有利には生物活性を示さなくてよい。例えば、いくつかの実施形態では、遊離状態のＰＭは、対象において免疫応答を誘発しない。
試薬へのコンジュゲート
本開示は、付加的な要素、例えば対象である細胞または組織への送達を促進する標的部位、試薬（例えば、治療薬、抗腫瘍薬）、毒素、またはこれらのフラグメントなど、を本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかに含有する方法及び材料も提供する。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、細胞毒性剤、例えば限定されないが、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはこれらのフラグメント）または放射性同位体など、にコンジュゲートすることができる。本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、活性化可能サイトカイン構成体は、細胞毒性剤、例えば限定されないが、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはこれらのフラグメント）または放射性同位体など、にコンジュゲートすることができる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な例示的細胞毒性剤としては、ドラスタチン及びそれらの誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、デスメチルアウリスタチンＥ（ＤＭＡＥ）、アウリスタチンＦ、デスメチルアウリスタチンＦ（ＤＭＡＦ）、ドラスタチン１６（ＤｍＪ）、ドラスタチン１６（Ｄｐｖ）、アウリスタチン誘導体（例えば、アウリスタチンチラミン、アウリスタチンキノロン）、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ－１、ＤＭ－４）、メイタンシノイド誘導体、デュオカルマイシン、α－アマニチン、ツルボスタチン、フェンスタチン、ヒドロキシフェンスタチン、スポンギスタチン５、スポンギスタチン７、ハリスタチン１、ハリスタチン２、ハリスタチン３、ハロコンプスタチン、ピロロベンズイミダゾール（ＰＢＩ）、シブロスタチン６、ドクサリフォーム（ｄｏｘａｌｉｆｏｒｍ）、セマドチン類似体（ＣｅｍＣＨ２－ＳＨ）、シュードモナス毒素Ａ（ＰＥＳ８）変異体、シュードモナス毒素Ａ（ＺＺ－ＰＥ３８）変異体、ＺＪ－１０１、アンスラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブリオスタチン、カンプトセシン、７－置換カンプトテシン、１０，１１－ジフルオロメチレンジオキシカンプトセシン、コンブレタスタチン、デブロモアプリシアトキシン、ＫａｈａＭｉｄｅ－Ｆ、ディスコデルモライド、及びエクテイナシジンが挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な酵素的に活性な毒素としては、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｉｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｆｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｉａｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（例えば、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－８）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロティーズ（ｃｒｏｔｉｒｓ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲイオニン（ｇｅｉｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｉｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な抗悪性腫瘍薬としては、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、チオテパ、ビサントレン、ノバントロン、チオグアニン、プロカルバジン及びシタラビンが挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な抗ウイルス薬としては、アシクロビル、ヴィラＡ及びシンメトレルが挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な抗真菌薬としては、ナイスタチンが挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的なコンジュゲート可能な検出試薬としては、フルオレセイン及びその誘導体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられる。
本明細書に記載される活性化可能サイトカイン構成体のいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な抗菌薬としては、アミノグリコシド、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン及びトブラマイシンが挙げられる。
本明細書に記載される活性化可能サイトカイン構成体のいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な、３β，１６β，１７α－トリヒドロキシコレスタ－５－エン－２２－オン１６－Ｏ－（２－Ｏ－４－メトキシベンゾイル－β－Ｄ－キシロピラノシル）－（１－－＞３）－（２－Ｏ－アセチル－α－Ｌ－アラビノピラノシド）（ＯＳＷ－１）としては、Ｏ６－ベンジルグアニンのｓ－ニトロベンジロキシカルボニル誘導体、トポシソメラーゼ（ｔｏｐｏｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）阻害剤、ヘミアステルリン、セファロタキシン、ホモハリントニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｉｏｎｉｎｅ）、ピロロベンゾジアゼピンダイマー（ＰＢＤ）、官能化ピロロベンゾジアゼピン、カリケアミシン（ｃａｌｃｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｉｉｔｏｘｉｎｓ）、タキサン、及びビンカアルカロイドが挙げられる。
本明細書に記載される活性化可能サイトカイン構成体のいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な、例示的な放射性医薬品としては、１２３Ｉ、８９Ｚｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、２０１Ｔ１、６２Ｃｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、３８Ｋ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１３３Ｘｅ、１１Ｃ及び９９ｍＴｃ（テクネチウム）が挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な例示的な重金属としては、バリウム、金及び白金が挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかにコンジュゲートすることができる、非限定的な例示的な抗マイコプラズマ剤としては、タイロシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンＢ、アンピシリン、スルファニルアミド、ポリミキシン及びクロラムフェニコールが挙げられる。
当業者は、多種多様な可能性がある部分を、本明細書に記載の活性化可能サイトカイン構成体のいずれかにコンジュゲートできることを理解するであろう。コンジュゲートには、ＡＣＣ及びその他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、２個の分子を結合することになる、任意の化学反応が含まれ得る。コンジュゲートには、多くの化学的反応機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合及び錯化が含まれ得る。いくつかの実施形態では、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的な縮合によって、または外部の架橋分子の組み込みによってのいずれかで達成できる。多くの二価または多価の結合剤が、本明細書に記載の活性化可能サイトカイン構成体のいずれかのコンジュゲートに有用である。例えば、コンジュゲートは、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、琥珀酸イミドエステル、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを含有できる。いくつかの実施形態では、活性化可能サイトカイン構成体は、１個以上の非天然アミノ酸残基を含有して、またはそれ以外の場合には導入して、コンジュゲートに好適な部位を提供することができる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤及び／またはコンジュゲートは、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）によって、抗原結合ドメインに付着される。多くのがんは高レベルのグルタチオン、すなわち還元剤を自然に放出するため、がん組織微小環境に存在するグルタチオンはジスルフィド結合を還元することができ、その後に、送達部位で薬剤及び／またはコンジュゲートが放出される。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、コンジュゲートが、標的部位内（例えば、疾患組織（例えば、がん組織））で、補体の存在下で標的に結合すると、リンカーにコンジュゲート及び／または薬剤を付着しているアミドまたはエステル結合は切断され、活性化状態でのコンジュゲート及び／または薬剤の放出が得られる。これらのコンジュゲート及び／または薬剤は、対象に投与されると、コンジュゲート及び／または薬剤の標的部位（例えば、疾患組織（例えば、がん組織））での送達及び放出を達成することになる。これらのコンジュゲート及び／または薬剤は、本明細書に記載されるコンジュゲート及び／または薬剤のいずれかのインビボ送達のために特に有効である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、補体系の酵素によって開裂可能ではない。例えば、コンジュゲート及び／または薬剤は、補体活性化によって標的細胞が最終的に溶解されるため、補体活性化なしで放出される。そのような実施形態では、コンジュゲート及び／または薬剤は、標的細胞に送達されることになる（例えば、ホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質または遺伝子）。さらに、リンカーは血清プロテアーゼによって穏やかに開裂しやすくなり、コンジュゲート及び／または薬剤は、標的部位でゆっくりと放出される。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、コンジュゲート及び／または薬剤は、コンジュゲート及び／または薬剤が標的部位（例えば、疾患組織（例えば、がん組織））に送達されるが、コンジュゲート及び／または薬剤は放出されないように設計される。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、コンジュゲート及び／または薬剤は、直接または開裂不可リンカーを介してのいずれかで、抗原結合ドメインに付着される。例示的な開裂不可リンカーとしては、アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸）、ペプチド、または、後に抗原結合ドメインへの付着に利用できる官能基を含有するように本明細書に記載される方法によって修飾されてよい、その他の有機化合物が挙げられる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、薬剤のコンジュゲートの少なくとも１個の点を含有する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの全ての使用可能な点が、薬剤へのコンジュゲートに利用できる。いくつかの実施形態では、１個以上のコンジュゲートの点としては、ジスルフィド結合に関与する硫黄原子、鎖間ジスルフィド結合に関与する硫黄原子、鎖間スルフィド結合に関与する硫黄原子であるが鎖内ジスルフィド結合に関与する硫黄原子ではない硫黄原子、及び／またはシステイン、もしくは硫黄原子を含有するその他のアミノ酸残基の硫黄原子が挙げられるが、これらに限定されない。このような場合、残基は、タンパク質構成体構造中に天然に存在してよく、または限定されることなく、部位特異的変異誘発、化学変換、もしくは非天然のアミノ酸の誤取込などの方法を用いて、タンパク質構成体に組み込まれてもよい。
本開示は、コンジュゲート用のＡＣＣを調製する方法及び材料も提供する。本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、１個以上の鎖間ジスルフィド結合を含有するように修飾される。例えば、ＡＣＣ内のジスルフィド結合は、還元剤、例えば限定されることなく、ＴＣＥＰ、ＤＴＴまたはβ－メルカプトエタノールなどへの曝露後に、還元されることができる。場合によっては、ジスルフィド結合の還元は、部分的な還元のみである。本明細書で使用する場合、用語「部分的還元」は、ＡＣＣが還元剤と接触し、コンジュゲートの、全ての利用可能な部位の一部が還元される状況を意味する（例えば、全てのジスルフィド結合が還元されるわけではない）。いくつかの実施形態では、活性化可能サイトカイン構成体は、還元剤との接触後に、コンジュゲートの全ての利用可能な部位が９９％未満（例えば、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）還元される場合、部分的に還元される。いくつかの実施形態では、１個以上の鎖間ジスルフィド結合における還元を有するＡＣＣが、遊離チオールと反応性である薬剤にコンジュゲートされる。
本開示は、また、治療薬をＡＣＣの特定の位置にコンジュゲートする方法及び材料を提供する。本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、治療薬がＡＣＣに、ＡＣＣ上の特定の位置でコンジュゲートすることができるように、ＡＣＣは修飾される。例えば、ＡＣＣは、ＡＣＣへのコンジュゲートを促進するように、部分的に還元され得る。このような場合、ＡＣＣの部分的還元は、ＡＣＣのコンジュゲート部位が還元されないように存在する。いくつかの実施形態では、ＡＣＣ上のコンジュゲート部位（複数可）は、タンパク質構成体上の特定の位置における薬剤のコンジュゲートを促進するように選択される。還元剤を用いた処置に際し、さまざまな要因がＡＣＣの「還元レベル」に影響し得る。例えば、本明細書に記載される方法及び材料を用いてＡＣＣの部分的還元を達成するためには、限定されないが、ＡＣＣに対する還元剤の比、インキュベートの長さ、インキュベート温度、及び／または還元反応溶液のｐＨの最適化が必要となり得る。任意の適切な要因の組み合わせ（例えば、ＡＣＣに対する還元剤の比、還元剤とのインキュベートの長さ及び温度、及び／または還元剤のｐＨ）を用いて、ＡＣＣの部分的還元を達成できる（例えば、利用可能なコンジュゲート部位の全体的な還元、または特定のコンジュゲート部位の還元）。
ＡＣＣに対する還元剤の有効な比率は、薬剤へのコンジュゲートを可能にする様式で、ＡＣＣを少なくとも部分的に還元する（例えば、利用可能なコンジュゲート部位の全体的な還元、または特定のコンジュゲート部位の還元）、任意の比率であることができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣに対する還元剤の比は、約２０：１～１：１、約１０：１～１：１、約９：１～１：１、約８：１～１：１、約７：１～１：１、約６：１～１：１、約５：１～１：１、約４：１～１：１、約３：１～１：１、約２：１～１：１、約２０：１～１：１．５、約１０：１～１：１．５、約９：１～１：１．５、約８：１～１：１．５、約７：１～１：１．５、約６：１～１：１．５、約５：１～１：１．５、約４：１～１：１．５、約３：１～１：１．５、約２：１～１：１．５、約１．５：１～１：１．５、または約１：１～１：１．５の範囲であることになる。いくつかの実施形態では、比率は、約５：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比率は、約５：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比率は、約４：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比率は、約４：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比率は、約８：１～約１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比率は、約２．５：１～１：１の範囲である。
還元剤でＡＣＣを処置するための有効なインキュベート時間及び温度は、薬剤のＡＣＣへのコンジュゲートを可能にする様式で、ＡＣＣを少なくとも部分的に還元する（例えば、利用可能なコンジュゲート部位の全体的な還元、または特定のコンジュゲート部位の還元）、任意の時間及び温度であることができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣを処置するためのインキュベート時間及び温度は、３７℃で約１時間～３７℃で約１２時間（または、その任意の部分的な範囲）の範囲であることになる。
還元剤でＡＣＣを処置するための還元反応の有効なｐＨは、ＡＣＣの薬剤へのコンジュゲートを可能にする様式で、ＡＣＣを少なくとも部分的に還元する（例えば、利用可能なコンジュゲート部位の全体的な還元、または特定のコンジュゲート部位の還元）、任意のｐＨであることができる。
部分的に還元されたＡＣＣがチオール含有薬剤と接触すると、その薬剤は、ＡＣＣ内の鎖間のチオールにコンジュゲートすることができる。薬剤は、チオール含有試薬（例えば、システインまたはＮ－アセチルシステイン）を用いて、チオールを含有するように修飾できる。例えば、ＡＣＣは、約３７℃で約１時間、ＡＣＣに対する還元剤の所望の比率における、還元剤（例えば、ＴＥＰＣ）とのインキュベート後に、部分的に還元され得る。ＡＣＣに対する還元剤の有効な比率は、チオール含有薬剤のコンジュゲートを可能にする様式で、ＡＣＣ内に位置する少なくとも２個の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元する（例えば、利用可能なコンジュゲート部位の全体的な還元、または特定のコンジュゲート部位の還元）、任意の比率であることができる。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、いかなる鎖内ジスルフィド結合の還元も回避する様式で、還元剤によって還元される。本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、いかなる鎖内ジスルフィド結合の還元も回避し、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を還元する様式で、還元剤によって還元される。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣはまた、ＡＣＣにコンジュゲートした薬剤を含有できる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされる薬剤は、治療薬である。
いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構成体にコンジュゲートされる薬剤）は、検出可能部分、例えば標識またはその他のマーカーなどである。例えば、薬剤は、放射性標識したアミノ酸、標識したアビジン（例えば、光学的または熱量測定法によって検出され得る、蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得る１種以上のビオチニル部分、１種以上の放射性同位元素もしくは放射性核種、１種以上の蛍光標識、１種以上の酵素標識、及び／または１種以上の化学発光剤である、または、これらを含有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、スペーサー分子によって付着される。
いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構成体にコンジュゲートされる細胞毒性剤）は、炭水化物部分、スルフヒドリル基、アミノ基またはカルボキシレート基を用いて、ＡＣＣに連結される。
薬剤にコンジュゲートした、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構成体にコンジュゲートされる細胞毒性剤）は、リンカー及び／またはＣＭ（開裂可能配列とも称される）を介して、ＡＣＣにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構成体にコンジュゲートされる細胞毒性剤）は、ＡＣＣ内のシステインまたはリシンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構成体にコンジュゲートされる細胞毒性剤）は、ＡＣＣの別の残基、例えば本明細書にて開示した残基にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リンカーは、チオール含有リンカーである。リンカー及び／またはＣＭの、いくつかの非限定例を表１に示す。


Figure 2024511387000004
当業者は、多種多様な可能性がある部分を、本開示のＡＣＣに連結できることを理解するであろう。（例えば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）参照。これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）一般に、薬剤（例えば、細胞毒性剤）の、ＡＣＣへの有効なコンジュゲートは、ＡＣＣに薬剤をコンジュゲートし、一方で薬剤及びＡＣＣが機能性を保持することも可能にする、任意の化学反応によって達成できる。
薬剤にコンジュゲートした、ＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、各種の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、ＡＣＣに薬剤をコンジュゲートすることができ、限定されることなく、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などが挙げられる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。いくつかの実施形態では、炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）キレート剤を用いて、ＡＣＣに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートできる。（例えば、ＷＯ９４／１１０２６参照）。
好適なリンカー及びＣＭは、文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載している、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）参照）。オリゴペプチドリンカーを経由してＡＣＣに結合されたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載している、米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。いくつかの実施形態では、好適なリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジル－ジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ＃２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．Ｃａｔ．＃２１６５－Ｇ）；及び（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートしたスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．＃２４５１０）が挙げられる。追加のリンカーとしては、ＳＭＣＣ、スルホＳＭＣＣ、ＳＰＤＢまたはスルホＳＰＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。
上記のリンカー及びＣＭは、異なる属性を有する構成成分を含有し、したがって、異なる生理化学的特性を有するコンジュゲートがもたらされる。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホＮＨＳエステルよりも、より安定している。ＮＨＳエステル含有のリンカーは、スルホＮＨＳエステルよりも可溶性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害型のジスルフィド結合を含有し、安定性の高いコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合は、ジスルフィド結合がインビトロで切断されるため、一般的にその他の結合より安定性が低く、利用可能なコンジュゲートが得られることが少ない。スルホＮＨＳは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を高めることができる。カルボイミジドカップリング（例えば、ＥＤＣ）をスルホＮＨＳと結合させて用いる場合、カルボイミジドカップリング反応単独よりも、加水分解により抵抗性のあるエステルを形成する。
ＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤を、ＡＣＣのアミノ酸配列に包含される修飾されたアミノ酸配列を用いて、ＡＣＣにコンジュゲートすることができる。ＡＣＣのアミノ酸配列内の特定の位置で、コンジュゲート可能なアミノ酸を挿入することによって、コンジュゲートした薬剤（例えば、細胞毒性剤）の配置及び／または投薬量が制御されるように、タンパク質構成体が設計され得る。例えば、ＡＣＣは、反応性チオール基を提供し、タンパク質の折り畳み及び／またはアセンブリに負の影響を及ぼさず、抗原結合特性を変えない、第１のモノマー、第２のモノマー、第３のモノマー及び／または第４のモノマー上の位置で、システインアミノ酸残基を含有するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＡＣＣのアミノ酸配列内に、１個以上の非天然アミノ酸残基を含有するように修飾され、コンジュゲートに好適な部位を提供することができる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＡＣＣのアミノ酸配列内に、酵素的に活性化可能なペプチド配列を含有するように修飾され得る。
核酸
本明細書において、本明細書に記載のＡＣＣのいずれかの、第１のモノマー構成体（または、第１のモノマー構成体のタンパク質の部分）（例えば、明細書に記載される第１のモノマー構成体のいずれか）、及び第２のモノマー構成体（または、第２のモノマー構成体のタンパク質の部分）（例えば、本明細書に記載される第２のモノマー構成体のいずれか）をコードする配列を含有する核酸が提供される。いくつかの実施形態では、１対の核酸は、第１のモノマー構成体（または、第１のモノマー構成体のタンパク質の部分）及び第２のモノマー構成体（または、第２のモノマー構成体のタンパク質の部分）を一緒になってコードする。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体（または、第１のモノマー構成体のタンパク質の部分）をコードする核酸配列は、第２のモノマー構成体（または、第２のモノマー構成体のタンパク質の部分）をコードする核酸配列と、少なくとも７０％同一である（例えば、少なくとも７２％同一である、少なくとも７４％同一である、少なくとも７６％同一である、少なくとも７８％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８２％同一である、少なくとも８４％同一である、少なくとも８６％同一である、少なくとも８８％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、少なくとも９８％同一である、少なくとも９９％同一である、または１００％同一である）。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体のタンパク質の部分をコードする核酸は、ＰＭ１、ＣＰ１、ＣＭ１及びＣＭ３部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２のモノマーのタンパク質の部分をコードする核酸は、ＣＰ２及びＣＭ２部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２のモノマーのタンパク質の部分をコードする核酸は、ＣＰ２、ＣＭ２、ＰＭ２及びＣＭ４部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、１対の核酸は、第１のモノマー構成体のタンパク質の部分及び第２のモノマー構成体のタンパク質の部分を一緒になってコードし、タンパク質の部分は、続いて、それぞれＤＤ１及びＤＤ２部分にコンジュゲートされる（後続のコンジュゲートステップにおいて）。
いくつかの実施形態では、第１のモノマー構成体をコードする核酸は、ＤＤ１部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構成体をコードする核酸は、ＤＤ２部分を含むポリペプチドをコードする。
ベクター
本明細書において、本明細書に記載の核酸のいずれかを含有するベクター及びベクターのセットが提供される。当業者は、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを作製するために、好適なベクターまたはベクターのセット（例えば、発現ベクター）を選択すること、及びベクターまたはベクターのセットを使用して、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを発現させることができるであろう。例えば、ベクターまたはベクターのセットの選択では、ベクター（複数可）は、細胞の染色体に組み込まれ、及び／またはそこで複製できる必要があり得るため、細胞は考慮されなければならない。ＡＣＣを生成するために使用可能な例示的なベクターを、以下にも記載する。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、細胞内（例えば、本明細書に記載される細胞のいずれか）で、組み換えタンパク質（例えば、第１のまたは第２のモノマー）の発現を誘導できるポリヌクレオチドを意味する。「ベクター」は、宿主細胞内に核酸及びそれらのフラグメントを送達することができ、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサ、ポリ（Ａ）シグナル）を含有する。外因性ポリヌクレオチドは、発現されるために、発現ベクターに挿入されてよい。用語「ベクター」はまた、人工染色体、プラスミド、レトロウイルス及びバキュロウイルスベクターも包含する。
本明細書に記載される核酸のいずれか１つを含有し、細胞（例えば、哺乳動物細胞）を形質転換するのに好適なベクターを作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ．，Ｅｄｓ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９３を参照されたい。
ベクターの非限定例としては、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、ならびにウイルスベクター（例えば、任意のアデノウイルスベクター（例えば、ｐＳＶまたはｐＣＭＶベクター）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクター）、ならびに任意のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、発現のための十分なシス活性エレメントを含有でき、発現のための他のエレメントは、宿主哺乳動物細胞によって、またはインビトロの発現系において供給され得る。当業者は、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを作製するために好適なベクター及び哺乳動物細胞を選択できるであろう。
本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、組み換えＤＮＡ技術及び真核生物または原核生物の種における発現を使用して、生合成的に作られてよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかの、第１のモノマー及び第２のモノマーをコードする核酸を含有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
いくつかの実施形態では、１対のベクターは、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかの、第１のモノマー及び第２のモノマーを一緒になってコードする１対の核酸を一緒になって含有する。いくつかの実施形態では、ベクターの対は、発現ベクターの対である。
細胞
本明細書においては、本明細書に記載される核酸のいずれかを含有する、本明細書に記載されるベクターまたはベクターのセットのいずれかを含有する宿主細胞もまた提供される。
本明細書に記載されるいずれかのＡＣＣは、任意の細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって生成できる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、げっ歯動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞もしくはモルモット細胞）、またはヒト以外の霊長類細胞である。
核酸及びベクター（例えば、本明細書に記載されるベクターのいずれかまたはベクターのセットのいずれか）を、細胞内に導入する方法は、当該技術分野において既知である。細胞内に核酸を導入するために使用可能な方法の非限定例としては、リポフェクション、形質移入、リン酸カルシウム形質移入、カチオン性ポリマー形質移入、ウイルス性形質導入（例えば、アデノウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入）、ナノ粒子形質移入及びエレクトロポレーションが挙げられる。
いくつかの実施形態では、導入ステップは、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを構成するモノマーをコードする核酸を含有するベクター（例えば、本明細書に記載されるベクターまたはベクターのセットのいずれか）を細胞内に導入することを含む。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であることができる。本明細書で使用する場合、用語「真核細胞」は、異なる、膜結合性の核を有する細胞を意味する。このような細胞としては、例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯動物、ヒト以外の霊長類もしくはヒト）、昆虫、真菌または植物の細胞が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。いくつかの実施形態では、真核細胞は、より高等な真核細胞、例えば哺乳動物、トリ、植物または昆虫の細胞である。哺乳動物細胞の非限定例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか１つの、第１のモノマー及び第２のモノマーをコードする核酸を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかの、第１のモノマー及び第２のモノマーを一緒になってコードする、１対の核酸を含有する。
活性化可能サイトカイン構成体の作製方法
本明細書において、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを作製する方法であって、（ａ）本明細書に記載される組み換え宿主細胞のいずれかを、液体培地中で、ＡＣＣを作製するのに十分な条件下にて培養することと、（ｂ）宿主細胞及び／または液体培地からＡＣＣを回収することと、を含む、方法が提供される。
細胞を培養する方法は、当該技術分野において周知である。細胞は、インビトロで、細胞増殖、細胞分化及び細胞成長に好都合である条件下にて維持できる。例えば、細胞は、細胞（例えば、本明細書に記載される細胞のいずれか）を、必要な成長因子及び、細胞生存力及び成長を支援するのに十分な補助剤を含有する細胞培地に接触させることによって培養できる。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、回収したＡＣＣを単離することをさらに含む。単離方法の非限定例としては、硫安沈殿、ポリエチレングリコール沈殿、サイズ排除クロマトグラフィ、リガンド－親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、アニオンまたはカチオン）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィが挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＰ１、ＣＭ１、ＰＭ２及びＣＭ３を含有する第１のモノマー構成体のタンパク質の部分と、ＣＰ２及びＣＭ２、所望によりＰＭ２及びＣＭ４を含有する第２のモノマー構成体のタンパク質の部分と、を生成でき、タンパク質の部分は、続いて、それぞれＤＤ１及びＤＤ２部分にコンジュゲートされる。
本明細書に記載される組成物及び方法は、二量体化ドメイン間のジスルフィド結合の形成を可能にし、ＡＣＣの二量体化を形成及び維持する、非還元または部分的な還元条件の使用を伴ってよい。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、単離したＡＣＣを薬学的組成物に調製することをさらに含む。さまざまな製剤が、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される。本明細書に記載される単離したＡＣＣのいずれかは、任意の投与経路用（例えば、静脈内、腫瘍内、皮下、皮内、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所用）、経粘膜、または筋肉内）に調製できる。
本明細書において、本明細書に記載の方法のいずれかで作製したＡＣＣも提供される。本明細書記載の方法のいずれかによって作製したＡＣＣのいずれかを含有する組成物（例えば、薬学的組成物）もまた提供される。本明細書においては、本明細書に記載される組成物（例えば、薬学的組成物）のいずれかの、少なくとも１回の用量を含有するキットもまた提供される。
治療方法
本明細書において、対象の疾患（例えば、がん（例えば、本明細書に記載されるがんのいずれか））を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを、対象に投与することを含む方法が提供される。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、ウサギ、ブタ、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターもしくはモルモット）、ヒト以外の霊長類（例えば、シミアン（例えば、サル（例えば、ヒヒ、マーモセット）、もしくは類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータンもしくはテナガザル））、またはヒトである。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、対象は、疾患（例えば、がん（例えば、本明細書に記載のがんのいずれか））を有すると、予め特定または診断されている。
本明細書で使用する場合、用語「治療する」は、対象（例えば、本明細書に記載される対象のいずれか）において、疾患（例えば、がん（例えば、本明細書に記載されるがんのいずれか））の重症度、頻度または、１つ以上（例えば、１、２、３、４または５つ）の症状もしくは兆候の数を低減することを含む。疾患ががんであるいくつかの実施形態では、治療によって、がんを有する対象における、がん増殖の低減、がん進行の阻害、がん転移の阻害、またはがん再発のリスク低減がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本発明の開示の方法及び使用は、静脈内、点滴、腫瘍内、皮下、腹腔内、皮内、経口（例えば、吸入）、鼻孔内、経皮（例えば、局所用）、経粘膜、及び／または筋肉内など、任意の投与経路を含む。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、疾患は、がんである。本明細書においては、治療を必要とする対象（例えば、本明細書に記載される、または当該技術分野において既知の、例示的な対象のいずれか）の治療方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか、または本明細書に記載される組成物のいずれか（例えば、薬学的組成物）を投与することを含む、方法もまた提供される。
これらの方法のいくつかの実施形態では、対象はがんを有すると特定または診断されている。がんの非限定的例としては、固形腫瘍、血液腫瘍、肉腫、骨肉腫、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、白血病（例えば、毛様細胞性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ））、脊髄形成異常性症候群（ＭＤＳ）、カポジ肉腫、網膜芽細胞腫、胃癌、尿路上皮性癌、肺癌、腎細胞癌、胃及び食道癌、膵臓癌、前立腺癌、脳の癌、大腸癌、骨癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、鼻咽頭腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮細胞頭頸部癌、子宮体癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、及び肝細胞癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんはリンパ腫である。いくつかの実施形態では、リンパ腫はバーキットリンパ腫である。いくつかの態様では、対象は、家族性癌症候群、例えばリフラウメニ症候群、家族性乳癌・卵巣癌（ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の変異）症候群などを有すると特定または診断されている。開示される方法は、非固形癌の治療にも有用である。例示的な固形腫瘍としては、各種の臓器系、例えば肺、乳房、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、泌尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮、または精巣の腫瘍）、咽頭、前立腺及び卵巣などの悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌及び癌腫）が挙げられる。例示的な腺癌としては、結腸直腸癌、腎細胞腫、肝臓癌、肺の非小細胞癌、及び小腸の癌が挙げられる。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって記載される例示的ながんとしては、成人急性リンパ球性白血病；小児急性リンパ球性白血病；成人急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；小児副腎皮質癌；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍；肛門癌；星細胞腫（小児、小脳）；星細胞腫（大脳、小児）；肝外胆管癌；膀胱癌；小児膀胱癌；骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫；小児脳幹部グリオーマ；脳腫瘍（成人）；脳腫瘍、小児脳幹部グリオーマ；脳腫瘍、星細胞腫（小児、小脳）；脳腫瘍、星細胞腫（大脳）／小児悪性神経膠腫；脳腫瘍、小児上衣細胞腫；脳腫瘍、髄芽腫（小児）；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児）；脳腫瘍、視覚路及び視床下部グリオーマ（小児）；脳腫瘍、（小児、その他）；乳癌；乳癌及び妊娠；小児乳癌；男性乳癌；小児気管支腺腫／カルチノイド；小児カルチノイド腫瘍；消化管カルチノイド腫瘍；副腎皮質癌；膵島細胞癌；原発不明癌；原発性中枢神経系リンパ腫；小脳星細胞腫（小児）；大脳星細胞腫／悪性神経膠腫（小児）；子宮頸癌；小児がん；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；大腸癌；小児結腸直腸癌；悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮体癌；上衣細胞腫（小児）；上皮性卵巣癌；食道癌；小児食道癌；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼の癌、眼内の黒色腫；眼の癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃部（胃）癌；小児胃部（胃）癌；消化管カルチノイド腫瘍；小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；妊娠性絨毛性腫瘍；小児脳幹部グリオーマ；視覚路及び視床下部グリオーマ（小児）；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；成人原発性肝細胞性（肝臓）癌；小児原発性肝細胞性（肝臓）癌；成人ホジキンリンパ腫；小児ホジキンリンパ腫；妊娠中のホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部及び視覚路グリオーマ（小児）；眼内の黒色腫；膵島細胞癌（内分泌膵）；カポジ肉腫；腎臓癌；喉頭癌；小児喉頭癌；成人急性リンパ芽球性白血病；小児急性リンパ芽球性白血病；成人急性骨髄性白血病；小児急性骨髄性白血病；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；毛様細胞性白血病；口唇及び口腔癌；成人原発性肝癌；小児原発性肝癌；非小細胞肺癌；小細胞肺癌；成人急性リンパ球性白血病；小児急性リンパ球性白血病；慢性リンパ性白血病；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫；成人ホジキンリンパ腫；小児ホジキンリンパ腫；妊娠中のホジキンリンパ腫；成人非ホジキンリンパ腫；小児非ホジキンリンパ腫；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；男性乳癌；悪性中皮腫（成人）；悪性中皮腫（小児）；悪性胸腺腫；髄芽腫（小児）；黒色腫；眼内の黒色腫；メルケル細胞癌；悪性中皮腫；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腺腹（小児）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；脊髄形成異常性症候群；慢性骨髄性白血病；小児急性骨髄性白血病；多発性骨髄腫；骨髄増殖性疾患（慢性）；鼻腔及び副鼻腔癌；鼻咽頭癌；小児鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；成人非ホジキンリンパ腫；小児非ホジキンリンパ腫；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；口腔癌（小児）；口腔及び口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；小児卵巣癌；上皮性卵巣癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣の低悪性度腫瘍；膵臓癌；小児膵臓癌；膵臓癌、膵島細胞；副鼻腔及び鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児）；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠及び乳癌；妊娠及びホジキンリンパ腫；妊娠及び非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経原発悪性リンパ腫；成人原発性肝癌；小児原発性肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎細胞（腎臓）癌；小児腎細胞癌；腎盂及び尿管、移行細胞癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫（小児）；唾液腺癌；小児唾液腺癌；肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；カポジ肉腫；肉腫（骨肉腫）／骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、小児横紋筋肉腫；成人軟部肉腫；小児軟部肉腫；セーザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌（小児）；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；成人軟部肉腫；小児軟部肉腫；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；胃（胃部）癌；小児胃（胃部）癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児）；悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫；精巣癌；小児胸腺腫；悪性胸腺腫；甲状腺癌；小児甲状腺癌；腎盂及び尿管、移行細胞癌；妊娠性絨毛性腫瘍；原発不明癌（小児）；小児の普通でない癌；尿管及び腎盂、移行細胞癌；尿道癌；子宮肉腫；膣癌；視覚路及び視床下部グリオーマ（小児期）；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
さらなる例示的ながんとしては、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）が挙げられる。
上記のがんの転移もまた、本明細書に記載される方法に従って、治療または予防できる。
いくつかの実施形態では、これらの方法は、対象におけるがんの１つ以上の症状の数、重症度、または頻度の低減をもたらすことができる（例えば、治療前の対象における、がんの１つ以上の症状の数、重症度または頻度と比較して）。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、対象に、追加の治療薬（例えば、表２に列挙される１種以上の治療薬）を投与することをさらに含む。

Figure 2024511387000005
Figure 2024511387000006
Figure 2024511387000007
Figure 2024511387000008
組成物／キット
本明細書においては、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか、及び１種以上（例えば、１、２、３、４または５種）の薬学的に許容される担体（例えば、本明細書に記載の、薬学的に許容される担体のいずれか）、希釈剤または賦形剤を含む、組成物（例えば、薬学的組成物）もまた提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを含有する組成物（例えば、薬学的組成物）は、無菌バイアルまたは予め充填したシリンジ中に配置できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを含有する組成物（例えば、薬学的組成物）は、異なる投与経路（例えば、静脈、皮下、筋肉内、腹腔内、または腫瘍内）用に調製できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかは、１種以上の緩衝剤（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））、アミノ酸（例えば、グリシン）、１種以上の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストランもしくはマンニトール）、１種以上の酸化防止剤、１種以上のキレート剤（例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン）、１種以上の防腐剤、及び／または薬学的に許容される担体（例えば、静菌水、ＰＢＳまたは生理食塩水）を含有できる。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、医薬品の投与と適合する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌性剤、抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを意味する。このような担体の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び約５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかは、身体からの急速な排除に対して保護する担体、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムなどの徐放性製剤及び制御放出製剤とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような薬学的組成物及び製剤の調製方法は、当業者にとって明らかである。
本明細書においては、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれか、本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを含有する組成物のいずれか、または本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを含有する薬学的組成物のいずれか、を含有するキットもまた提供される。本明細書に記載されるＡＣＣに加えて、表２から選択される１種以上の第２の治療薬を含有するキットもまた提供される。第２の治療薬（複数可）は、ＡＣＣとは別の投与形態で提供されてよい。あるいは、第２の治療薬（複数可）は、ＡＣＣと一緒に調製されてよい。
本明細書に記載されるキットのいずれも、組成物（例えば、薬学的組成物）のいずれか、及び／または本明細書に記載されるＡＣＣのいずれかを使用するための説明書を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための説明書を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される組成物（例えば、薬学的組成物）のいずれかの、少なくとも１回の用量を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかを投与するためのシリンジを提供できる。
本開示は、以下の項目の任意の１つまたは任意の組み合わせを含む、及びその裏付けを見いだす。
１．第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含有する活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
（ａ）前記第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、前記ＣＭ１は前記ＣＰ１と前記ＤＤ１との間に置かれ、前記ＣＭ３は前記ＰＭ１と前記ＣＰ１との間に置かれ、
（ｂ）前記第２のモノマー構成体が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の開裂可能部分（ＣＭ２）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含み、前記ＣＭ２は前記ＣＰ２と前記ＤＤ２との間に置かれ、
前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が互いに結合し、それによって前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体の二量体を形成する、前記活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）。
２．前記第２のモノマー構成体が、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）及び第４の開裂可能部分（ＣＭ４）をさらに含み、前記ＣＭ４が前記ＰＭ２と前記ＣＰ２との間に置かれる、項目１に記載のＡＣＣ。
３．前記第１のモノマー構成体が、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含む第１のポリペプチドを含み、所望により前記第１のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＰＭ１－ＣＭ３－ＣＰ１－ＣＭ１－ＤＤ１の構造的配置を含み、前記ＡＣＣの構成成分間の各ダッシュ（－）は、直接的な連結または１個以上のリンカーを介した連結を示す、項目１または２に記載のＡＣＣ。
４．前記第２のモノマー構成体が、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む、項目１～３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５．前記第２のモノマー構成体が、前記ＰＭ２、前記ＣＭ４、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含み、所望により前記第２のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＰＭ２－ＣＭ４－ＣＰ２－ＣＭ２－ＤＤ２の構造的配置を含む、項目２に記載のＡＣＣ。
６．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、それぞれ独立して、インターフェロン、インターロイキン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＭＳＰからなる群から選択され、所望により前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２は、独立して、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ β、ＩＦＮ γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４－１ＢＢ－Ｌ、ＯＸ４０、及びＯＸ４０Ｌから選択される、項目１～５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
７．前記ＰＭ１が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンである；
前記ＰＭ１が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンαである；
前記ＰＭ１が、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンβである；
前記ＰＭ１が、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンγである；
前記ＰＭ１が、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－１２である；
前記ＰＭ１が、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７及び４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－１５である；
前記ＰＭ１が、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－２である；または
前記ＰＭ１が、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－２１である、項目１～６のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８．前記ＰＭ２が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンである；
前記ＰＭ２が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンαである；
前記ＰＭ２が、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンβである；
前記ＰＭ２が、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンγである；
前記ＰＭ２が、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－１２である；
前記ＰＭ２が、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７及び４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－１５である；
前記ＰＭ２が、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－２である；または
前記ＰＭ２が、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－２１である、項目２～７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
９．ＰＭ１、ＰＭ２またはＰＭ１及びＰＭ２が、配列番号３２３を含む、項目２～８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０．ＰＭ１、ＰＭ２またはＰＭ１及びＰＭ２が、配列番号３３１を含む、項目２～９のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１１．ＰＭ１、ＰＭ２またはＰＭ１及びＰＭ２が、配列番号３３２を含む、項目２～１０のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１２．ＰＭ１とＣＰ１との間に、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸を含むマスク連結領域を含む、項目２～１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１３．ＰＭ２とＣＰ２との間に、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸を含むマスク連結領域を含む、項目２～１２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、１対のＦｃドメイン；ヒトＩＬ－１５受容体のアルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）からのスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメイン及び可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼ及びバルスター；ＰＫＡ及びＡＫＡＰ；変異ＲＮａｓｅＩフラグメントベースのアダプタ／ドッキングタグモジュール；エピトープ及びｓｄＡｂ；エピトープ及びｓｃＦｖ；タンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン及びＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュール；抗原結合ドメイン及びエピトープからなる群から選択される１対である、項目１～１３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が１対のＦｃドメインである、項目１４に記載のＡＣＣ。
１６．前記１対のＦｃドメインが、１対のヒトＦｃドメインである、項目１５に記載のＡＣＣ。
１７．前記ヒトＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメインまたはヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、項目１６に記載のＡＣＣ。
１８．前記ヒトＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、項目１７に記載のＡＣＣ。
１９．前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３と少なくとも８０％同一である配列を含む、項目１６に記載のＡＣＣ。
２０．前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３と少なくとも９０％同一である配列を含む、項目１９に記載のＡＣＣ。
２１．前記ヒトＦｃドメインが配列番号３を含む、項目２０に記載のＡＣＣ。
２２．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、それぞれ、配列番号３１８及び３１９を含む、項目１４に記載のＡＣＣ。
２３．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が同一である、項目１～２１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２４．前記ＤＤ１が抗原結合ドメインを含み、前記ＤＤ２が対応するエピトープを含む、項目１４に記載のＡＣＣ。
２５．前記抗原結合ドメインが抗Ｈｉｓタグ抗原結合ドメインであり、前記ＤＤ２がＨｉｓタグを含む、項目２４に記載のＡＣＣ。
２６．前記抗原結合ドメインが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、項目２４に記載のＡＣＣ。
２７．前記抗原結合ドメインが、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、項目２４に記載のＡＣＣ。
２８．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２の少なくとも一方が、非ポリペプチドポリマー及び小分子からなる群から選択される二量体化ドメイン置換基を含む、項目１４に記載のＡＣＣ。
２９．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、互いに共有結合されている非ポリペプチドポリマーを含む、項目２８に記載のＡＣＣ。
３０．前記非ポリペプチドポリマーが、硫黄含有ポリエチレングリコールであり、前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、１個以上のジスルフィド結合を介して互いに共有結合されている、項目２９に記載のＡＣＣ。
３１．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２の少なくとも一方が小分子を含む、項目２８に記載のＡＣＣ。
３２．前記小分子がビオチンである、項目３１に記載のＡＣＣ。
３３．前記ＤＤ１がビオチンを含み、前記ＤＤ２がアビジンを含む、項目３２に記載のＡＣＣ。
３４．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が成熟サイトカインである、項目１～３３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
３５．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２がシグナルペプチドを含む、項目１～３３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
３６．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が同一である、項目１～３５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
３７．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が異なる、項目１～３５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
３８．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２がインターフェロンである、項目１～３５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
３９．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２がインターフェロンである、項目３８に記載のＡＣＣ。
４０．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が異なるインターフェロンである、項目３８に記載のＡＣＣ。
４１．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が同一のインターフェロンである、項目３８に記載のＡＣＣ。
４２．前記インターフェロン（複数可）が、ヒト野生型成熟インターフェロンである、項目３８～４１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
４３．前記インターフェロン（複数可）が、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－ω及びインターフェロン－τからなる群から選択される、項目３８～４２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
４４．前記インターフェロンがインターフェロン－αである、項目４３に記載のＡＣＣ。
４５．前記インターフェロン（複数可）が、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂ及びインターフェロンα－ｎ３からなる群から選択される、項目４４に記載のＡＣＣ。
４６．前記インターフェロン（複数可）がインターフェロンα－２ｂである、項目４５に記載のＡＣＣ。
４７．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含む、項目４６に記載のＡＣＣ。
４８．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含む、項目４７に記載のＡＣＣ。
４９．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、配列番号１の配列を含む、項目４８に記載のＡＣＣ。
５０．前記インターフェロンがインターフェロンβである、項目４３に記載のＡＣＣ。
５１．前記インターフェロンβが、インターフェロンβ－１ａ及びインターフェロンβ－１ｂからなる群から選択される、項目５０に記載のＡＣＣ。
５２．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、ＩＦａｂドメインを含む、項目１～５１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５３．前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、インターロイキンを含む、項目１～３８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５４．前記インターロイキンが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６及びＩＬ－１７からなる群から選択される、項目５３に記載のＡＣＣ。
５５．前記ＣＭ１及び／または前記ＣＭ２のそれぞれが、合計約３個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸を含む、項目１～５４のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５６．前記ＣＭ１、前記ＣＭ２、前記ＣＭ３及び前記ＣＭ４の１個以上が、異なるプロテアーゼの基質を含む、項目１～５５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５７．前記ＣＭ１、前記ＣＭ２及び前記ＣＭ３が、同一のプロテアーゼの基質を含む、項目１～５６のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５８．前記プロテアーゼ（複数可）が、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツベイン－２（Ｏｔｕｂａｉｎ－２）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン（ｍａｒａｐｓｉｎ）、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３及びＴＭＰＲＳＳ４からなる群から選択される、項目１～５７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
５９．前記プロテアーゼ（複数可）が、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、及びＭＭＰ－１４からなる群から選択される、項目５８に記載のＡＣＣ。
６０．前記ＣＭ１、前記ＣＭ２、前記ＣＭ３及び／または前記ＣＭ４が、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５）、ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号６）、ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号７）、ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号８）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）、ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）、ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）、ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）、ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）、ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）、ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）、ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）、ＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３１）、ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３２）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３４）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３５）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３６）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号３７）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号４１）、ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）、ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）、ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）、ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）、ＩＳＳＧＬ（配列番号４６）、ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４７）、ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５１）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５２）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５６）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６１）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６２）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６４）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６５）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６６）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６９）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７２）、ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）、ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）、ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）、ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）、ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）、ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）、ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）、ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）、ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）、ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）、ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）、ＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号８５）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号８６）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号８７）、ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号８８）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号８９）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号９０）、ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号９１）、ＲＧＰＡ（配列番号９２）、ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号９３）、ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号９４）、ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号９５）、ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号９６）、ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号９７）、ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号９８）、ＰＬＧＬ（配列番号９９）、及びＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）からなる群から選択される配列を含む、項目１～５７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６１．前記ＣＭ１、前記ＣＭ２、前記ＣＭ３及び／または前記ＣＭ４が、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）、及びＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群から選択される配列を含む、項目６０に記載のＡＣＣ。
６２．前記プロテアーゼ（複数可）が、対象の腫瘍によって産生される、項目１～６１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６３．前記対象が、がんを有すると診断または特定されている、項目６２に記載のＡＣＣ。
６４．前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１が、前記第１のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、項目１～６３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６５．前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１が、前記第１のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、項目１～６４のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６６．前記ＣＰ２及び前記ＣＭ２が、前記第２のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、項目１～６５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６７．前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２が、前記第２のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、項目１～６６のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６８．前記第１のモノマー構成体が、少なくとも１個のリンカーを含む、項目１～６３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
６９．前記少なくとも１個のリンカーが、前記ＰＭ１と前記ＣＭ３との間に配置されたリンカーＬ１及び／または前記ＣＭ３と前記ＣＰ１との間に配置されたリンカーＬ２である、項目６８に記載のＡＣＣ。
７０．前記第２のモノマー構成体が、少なくとも１個のリンカーを含む、項目６８に記載のＡＣＣ。
７１．前記少なくとも１個のリンカーが、前記ＰＭ２と前記ＣＭ４との間に配置されたリンカーＬ３及び／または前記ＣＭ４と前記ＣＰ２との間に配置されたリンカーＬ４である、項目７０に記載のＡＣＣ。
７２．前記第１のモノマー構成体がリンカーＬ１を含み、前記第２のモノマー構成体がリンカーＬ３を含む、項目７１に記載のＡＣＣ。
７３．Ｌ１及びＬ３が同一である、項目７２に記載のＡＣＣ。
７４．前記第１のモノマー構成体がリンカーＬ２を含み、前記第２のモノマー構成体がリンカーＬ４を含む、項目７１に記載のＡＣＣ。
７５．Ｌ２及びＬ４が同一である、項目７４に記載のＡＣＣ。
７６．各リンカーが、１個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸の全長を有する、項目６８～７５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
７７．各リンカーが、少なくとも５個のアミノ酸の全長を有する、項目７６に記載のＡＣＣ。
７８．前記第１のモノマー構成体が、少なくとも１個のリンカーを含み、各リンカーは独立して、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）；ＧＧＧＳ（配列番号２）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）；ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）；ＧＳ；ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）；ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）；ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）；ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）；ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、各ｎは少なくとも１である整数である；ＧＧＳＧ（配列番号２２９）；ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）；ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１；ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）；ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）；ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；ＳＧＧＧ（配列番号３２７）；及びＳＧＧＧＧ（配列番号４９２）からなる群から選択される、項目６８に記載のＡＣＣ。
７９．前記リンカーが、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む、項目７８に記載のＡＣＣ。
８０．前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含む、項目１～７９のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８１．前記第１のポリペプチドが、Ｃ末端からＮ末端方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含む、項目１～７９のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８２．前記第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端方向で、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む、項目１～８１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８３．前記第２のポリペプチドが、Ｃ末端からＮ末端方向で、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む、項目１～８２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８４．前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が同一である、項目１～３６、３８、３９、または４１～８３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８５．前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端方向で、前記ＰＭ１、任意選択的リンカー、前記ＣＭ３、任意選択的リンカー、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含み、前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１が互いに直接的に隣接し、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１が互いに直接的に隣接し、前記ＣＭ１が１０個以下のアミノ酸のペプチドであり、前記第２のモノマー構成体が前記第１のモノマー構成体と同一であり、前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が、少なくとも２個のジスルフィド結合を介して、互いに共有結合されている、項目１～７９のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８６．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、それぞれ、ＥＵナンバリングに準拠して番号を付けたとき、システイン２１６でＮ末端を有するヒトＦｃドメインである、項目８５に記載のＡＣＣ。
８７．前記ＣＭ１が、７個以下のアミノ酸のペプチドである、項目８５または８６に記載のＡＣＣ。
８８．前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目８５～８７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
８９．少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２の活性の対照レベルと比較して、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの低減した活性レベルを有することを特徴とする、項目１～８８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
９０．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２活性が、リンパ腫細胞の増殖レベルである、項目８９に記載のＡＣＣ。
９１．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２活性が、リンパ腫細胞における、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路の活性化レベルである、項目８９に記載のＡＣＣ。
９２．前記少なくとも１つの活性が、リンパ腫細胞における、ＳＥＡＰの産生レベルである、項目８９に記載のＡＣＣ。
９３．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも２倍低いことを特徴とする、項目８９に記載のＡＣＣ。
９４．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも５倍低いことを特徴とする、項目９３に記載のＡＣＣ。
９５．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも１０倍低いことを特徴とする、項目９４に記載のＡＣＣ。
９６．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも５００倍低いことを特徴とする、項目９５に記載のＡＣＣ。
９７．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性の前記対照レベルが、前記ＡＣＣを前記プロテアーゼ（複数可）に曝露した後の、前記ＡＣＣの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の活性である、項目８９～９５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
９８．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性の前記対照レベルが、対応する野生型成熟サイトカインの、対応する前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性である、項目８９～９７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
９９．前記ＡＣＣが、前記プロテアーゼ（複数可）への曝露後に切断産物を生成することを特徴とし、前記切断産物が、前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の活性を含む、項目８９～９８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１００．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の活性が、抗増殖活性である、項目９９に記載のＡＣＣ。
１０１．前記対照レベルがＥＣ５０値であり、ＥＣ５０（対照レベル）に対するＥＣ５０（切断産物）の比率が、約１０未満、または約９未満、または約８未満、または約７未満、または約６未満、または約５未満、または約４未満、または約３未満、または約２未満、または約１．５未満、または約１．０未満である、項目１００に記載のＡＣＣ。
１０２．前記第１のモノマー構成体は、前記ＣＰ１及び前記ＤＤ１が、１８個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１８個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ３を含有することを特徴とする、項目１～１０１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０３．前記第２のモノマー構成体は、前記ＣＰ２及び前記ＤＤ２が、１８個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１８個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ２を含有することを特徴とする、項目１～１０２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０４．前記ＰＭ１が、５０個未満のアミノ酸を含む、項目１～１０３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０５．前記ＰＭ２が、５０個未満のアミノ酸を含む、項目２～１０４のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０６．前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、１９個未満のアミノ酸である、項目１０５に記載のＡＣＣ。
１０７．前記ＰＭ１が潜在型関連ペプチドではなく、かつ前記ＰＭ２が潜在型関連ペプチドではない、項目１～１０３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０８．前記ＰＭ１がサイトカインの受容体ではなく、前記ＰＭ２がサイトカインの受容体ではない、及び／またはサイトカインの受容体と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有しない、項目１～１０３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１０９．前記ＰＭ１がサイトカインの受容体のフラグメントではなく、及び／またはサイトカインの受容体と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有しない、項目１～１０３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１１０．前記ＰＭ２がサイトカインの受容体のフラグメントではない、項目１～１０３及び１０９のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１１１．前記ＰＭ１がアルブミンではなく、かつ前記ＰＭ２がアルブミンではない、項目１～１０３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１１２．項目１～１１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣを含む、組成物。
１１３．薬学的組成物である、項目１１２に記載の組成物。
１１４．項目１１２または１１３の組成物の、少なくとも１回の用量を含む、容器、バイアル、シリンジ、注射ペンまたはキット。
１１５．治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の、項目１～９６のいずれか１項のＡＣＣ、または項目１１２もしくは１１３の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
１１６．前記対象が、がんを有すると特定または診断されている、項目１１５に記載の方法。
１１７．前記がんがリンパ腫である、項目１１６に記載の方法。
１１８．前記リンパ腫が、バーキットリンパ腫である、項目１１７に記載の方法。
１１９．項目１～１１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣの前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１を含むポリペプチドをコードする核酸。
１２０．前記ポリペプチドが、項目１～２１または項目２８～１１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせのＤＤ１をさらに含む、項目１０９に記載の核酸。
１２１．項目１～１１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣの前記ＣＰ２及び前記ＣＭ２を含むポリペプチドをコードする核酸。
１２２．前記ポリペプチドが、項目１～２１または項目２８～１１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせのＤＤ２をさらに含む、項目１１１に記載の核酸。
１２３．項目１１９～１２２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせの核酸を含む、ベクター。
１２４．発現ベクターである、項目１２３に記載のベクター。
１２５．項目１１９～１２２のいずれか１項もしくはいずれかの組み合わせの核酸、または項目１２３もしくは１２４のベクターを含む、細胞。
１２６．項目１～１１１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせの、第１のモノマー構成体の前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１を含むポリペプチドと、第２のモノマー構成体の前記ＣＰ２及び前記ＣＭ２を含むポリペプチドと、を一緒になってコードする１対の核酸。
１２７．項目１２６の１対の核酸を一緒になって含む、１対のベクター。
１２８．１対の発現ベクターである、項目１２７に記載の１対のベクター。
１２９．項目１２６の１対の核酸、または項目１２７もしくは１２８の１対のベクターを含む、細胞。
１３０．ＡＣＣを作製する方法であって、
ａ．項目１２５または１２９の細胞を、液体培地中で、前記ＡＣＣを作製するのに十分な条件下にて培養することと、
ｂ．前記細胞または前記液体培地から前記ＡＣＣを回収することと、
を含む、前記方法。
１３１．前記細胞または前記液体培地から回収した前記ＡＣＣを単離することをさらに含む、項目１３０に記載の方法。
１３２．単離した前記ＡＣＣを薬学的組成物に調製することをさらに含む、項目１３１に記載の方法。
１３３．項目１３０に記載の方法によって作製されるＡＣＣ。
１３４．項目１３３に記載のＡＣＣを含む組成物。
１３５．薬学的組成物である、項目１３４に記載の組成物。
１３６．項目１３４または１３５に記載の組成物の、少なくとも１回の用量を含む、容器、バイアル、シリンジ、注射ペンまたはキット。
１３７．前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２活性が、表面プラズモン共鳴を使用して決定される、その同族の受容体に対する前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の結合親和性である、項目８９～１０１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１３８．第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含む活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
（ａ）前記第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含むポリペプチドであり、
（ｂ）前記第２のモノマー構成体が、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）と、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の及び第４の開裂可能部分（ＣＭ２及びＣＭ４）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含むポリペプチドであり、
（ｃ）前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端の方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含み、さらに、
（ｉ）前記ＰＭ１は２０個以下のアミノ酸を含み、かつ前記ＣＰ１に結合し、
（ｉｉ）前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１は互いに直接的に隣接し、
（ｉｉｉ）前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１は互いに直接的に隣接し、
（ｉｖ）前記ＣＭ１は１２個以下のアミノ酸を含み、
（ｖ）前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３はそれぞれプロテアーゼの基質として機能し、
（ｖｉ）前記ＣＰ１は成熟インターフェロンであり、
（ｄ）さらに、
（ｉ）前記第２のモノマー構成体は、前記第１のモノマー構成体と同一であり、
（ｉｉ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２は、１対のヒトＩｇＧのＦｃドメインであり、
（ｉｉｉ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して互いに結合し、それによって前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のホモ二量体を形成し、
（ｅ）対応する野生型インターフェロンまたは対応するペグ化インターフェロンと比較して、インターフェロン活性の低減したレベルを有することを特徴とする、
前記活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）。
１３９．前記ＣＰ１が成熟インターフェロン－αであり、前記ＰＭ１が配列番号３２３と少なくとも８５％同一である配列を含む、項目１３８に記載のＡＣＣ。
１４０．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３が、それぞれ独立して、ウロキナーゼ（ｕＰａ）及び／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の基質として機能する、項目１３８または１３９に記載のＡＣＣ。
１４１．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３が、それぞれ独立して、ウロキナーゼ（ｕＰａ）及び／またはＭＭＰ－１４の基質として機能する、項目１４０に記載のＡＣＣ。
１４２．前記成熟インターフェロンが、成熟ヒトインターフェロンαである、項目１３８～１４１のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４３．前記成熟インターフェロンαが、成熟インターフェロンα－２ｂである、項目１３８～１４２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４４．前記成熟インターフェロンαが、野生型成熟インターフェロンα－２ｂのトランケート形態である、項目１３８～１４３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４５．前記成熟インターフェロンが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、項目１３８～１４４のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４６．前記成熟インターフェロンが、配列番号１の配列を含む、項目１３８～１４５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４７．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、８個以下のアミノ酸を含む、項目１３８～１４６のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４８．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３が同一である、項目１３８～１４７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１４９．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、配列番号４１と少なくとも８５％同一である配列を含む、項目１３８～１４８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５０．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、配列番号４１、配列番号６８及び配列番号１００からなる群から選択される配列を含む、項目１３８～１４８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５１．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、１対のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、項目１３８～１５０のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５２．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、ＥＵナンバリングによって番号を付けたとき、システイン２２６のＮ末端側でトランケートされた、１対のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、項目１５１に記載のＡＣＣ。
１５３．前記ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングによって番号を付けたとき、Ｓ２２８Ｐの変異を含む、項目１５１または１５２に記載のＡＣＣ。
１５４．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２がそれぞれ、配列番号３と少なくとも９５％同一である配列を含む、項目１３８～１５３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５５．前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２がそれぞれ、配列番号３の配列を含む、項目１３８～１５４のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５６．前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が、少なくとも２個のジスルフィド結合を介して互いに共有結合している、項目１３８～１５５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５７．前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が、少なくとも３個のジスルフィド結合を介して互いに共有結合している、項目１５６に記載のＡＣＣ。
１５８．前記第１のモノマー構成体が、前記Ｎ末端において第１のシグナル配列をさらに含み、前記第２のモノマー構成体が、前記Ｎ末端において第２のシグナル配列をさらに含む、項目１３８～１５７のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１５９．前記第１のシグナル配列及び前記第２のシグナル配列がそれぞれ、配列番号２４４と少なくとも９５％同一である配列を含む、項目１５８に記載のＡＣＣ。
１６０．前記第１のシグナル配列及び前記第２のシグナル配列がそれぞれ、配列番号２４４の配列を含む、項目１５９に記載のＡＣＣ。
１６１．前記第１のモノマー構成体が、前記第１のシグナル配列と前記ＰＭ１との間に置かれる第１のスペーサーをさらに含み、前記第２のモノマー構成体が、前記第２のシグナル配列と前記ＰＭ２との間に置かれる第２のスペーサーをさらに含む、項目１５８～１６０のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１６２．前記第１のスペーサー及び前記第２のスペーサーがそれぞれ、配列番号２５６と少なくとも８０％同一である配列を含む、項目１６１に記載のＡＣＣ。
１６３．前記第１のスペーサー及び前記第２のスペーサーがそれぞれ、配列番号２５６の配列を含む、項目１６２に記載のＡＣＣ。
１６４．前記ＰＭ１と前記ＣＭ３との間のリンカーＬ１、及び／または前記ＣＭ３と前記ＣＰ１との間のリンカーＬ２をさらに含み、前記Ｌ１及び前記Ｌ２が、それぞれ独立して、配列番号２７（ｎ＝１）と少なくとも８０％同一である配列、配列番号３２４と少なくとも８０％同一である配列を含む、または存在しない、項目１３８～１６３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１６５．前記Ｌ１が配列番号２７（ｎ＝１）の配列を含み、前記Ｌ２が配列番号３２４の配列を含む、項目１６４に記載のＡＣＣ。
１６６．１２個以下のアミノ酸を含む連結領域を含む、項目１３８～１６５のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１６７．前記連結領域が、７～１２個のアミノ酸を含む、項目１６６に記載のＡＣＣ。
１６８．前記連結領域が、７個のアミノ酸を含む、項目１６６に記載のＡＣＣ。
１６９．野生型インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも２０００倍の低減を特徴とする、項目１３８～１６８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１７０．野生型インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも４０００倍の低減を特徴とする、項目１６９に記載のＡＣＣ。
１７１．野生型インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも５０００倍の低減を特徴とする、項目１７０に記載のＡＣＣ。
１７２．ペグ化インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも２０００倍の低減を特徴とする、項目１３８～１６８のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１７３．前記インターフェロン活性の低減が、リンパ腫細胞の抗増殖アッセイにおいて、前記ＡＣＣのＥＣ５０を、前記野生型インターフェロンまたは前記ペグ化インターフェロンのＥＣ５０と比較することによって決定される、項目１３８～１７２のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１７４．前記インターフェロン活性の低減が、インターフェロン反応性ＨＥＫ２９３細胞中の、分泌型胚性アルカリフォスファターゼ産生誘発のアッセイにおいて、前記ＡＣＣのＥＣ５０を、前記野生型インターフェロンまたは前記ペグ化インターフェロンのＥＣ５０と比較することによって決定される、項目１３８～１７３のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１７５．ＣＭ１及びＣＭ３が基質として機能する前記プロテアーゼ（複数可）への曝露後に、切断産物を生成し、前記切断産物に対する、前記対応する野生型インターフェロンの前記インターフェロン活性の比率が約２未満であることをさらに特徴とする、項目１３８～１７４のいずれか１項に記載のＡＣＣ。
１７６．前記切断産物のＥＣ５０が、前記対応する野生型インターフェロンのＥＣ５０とほぼ同一である、項目１７５に記載のＡＣＣ。
１７７．前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体がそれぞれ、配列番号３２１と少なくとも９５％同一である配列を含む、または前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のそれぞれが、配列番号３２１の配列を含む、もしくは配列番号３２１と同一であり、前記ＡＣＣが、野生型インターフェロンα－２ｂと比較して、インターフェロン活性の少なくとも１０００倍の低減を特徴とし、前記ＡＣＣが、ｕＰＡへの曝露後に、切断産物を生成することをさらに特徴とし、前記切断産物が、野生型インターフェロンα－２ｂとほぼ同一のインターフェロン活性を有し、インターフェロン活性が、リンパ腫細胞の抗増殖アッセイにおいて、またはインターフェロン反応性ＨＥＫ２９３細胞中の、分泌型胚性アルカリフォスファターゼ産生誘発アッセイにおいて測定される、項目１３８に記載のＡＣＣ。
１７８．第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含む活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
（ａ）前記第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、
（ｂ）前記第２のモノマー構成体が、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）と、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の及び第４の開裂可能部分（ＣＭ２及びＣＭ４）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含むポリペプチドであり、
（ｃ）前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端の方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含むポリペプチドであり、さらに、
（ｉ）前記ＰＭ１は配列番号３２３と少なくとも８５％同一である配列を含み、
（ｉｉ）前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１は互いに直接的に隣接し、
（ｉｉｉ）前記ＣＭ１は配列番号４１と少なくとも８５％同一である配列を含み、
（ｉｖ）前記ＣＰ１は配列番号１と少なくとも８５％同一である配列を含み、
（ｄ）さらに、
（ｉ）前記第２のモノマー構成体は、前記第１のモノマー構成体と同一であり、
（ｉｉ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２は、１対のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインであり、
（ｅ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して互いに共有結合し、それによって前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のホモ二量体を形成し、
（ｆ）ペグ化インターフェロンα－２ｂのインターフェロンα活性と比較して、インターフェロンα活性の低減したレベルを有することを特徴とする、
前記活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）。
１７９．前記ＰＭ２が、配列番号３２３、３３１または３３２の１つと、少なくとも８５％、９０％または９５％同一である配列を含む、項目１７８に記載のＡＣＣ。
１８０．前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体がそれぞれ、配列番号３２１と少なくとも９５％同一である配列を含む、または前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のそれぞれが、配列番号３２１の配列を含む、もしくは配列番号３２１と同一であり、前記ＡＣＣが、野生型インターフェロンα－２ｂまたはペグ化インターフェロンα－２ｂのいずれかと比較して、インビボでより低い毒性を示す、項目１３８に記載のＡＣＣ。
１８１．項目１３８～１８０のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣを含む、組成物。
１８２．薬学的組成物である、項目１８１に記載の組成物。
１８３．項目１８１または１８２に記載の組成物の、少なくとも１回の用量を含む、容器、バイアル、シリンジ、注射ペンまたはキット。
１８４．治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の、項目１３８～１７９のいずれか１項もしくはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ、または項目１８１もしくは１８２の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
１８５．前記対象が、がんを有すると特定または診断されている、項目１８４に記載の方法。
１８６．項目１３８～１７９のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣの、前記第１のモノマーを含むポリペプチドをコードする核酸。
１８７．項目１８６に記載の核酸を含むベクター。
１８８．発現ベクターである、項目１８７に記載のベクター。
１８９．項目１８６の核酸、または項目１８７もしくは１８８のベクターを含む、哺乳動物細胞。
１９０．ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、項目１８９に記載の哺乳動物細胞。
１９１．項目１８９または１９０の哺乳動物細胞中に前記ＡＣＣを発現させることと、発現された前記ＡＣＣを精製することと、を含む、ＡＣＣを製造する方法。
１９２．前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、腫瘍組織中に過剰発現するプロテアーゼの基質として機能する、項目１３８～１８０のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９３．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、配列番号３２３を含む、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９４．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、配列番号３３１を含む、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９５．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、配列番号３３２を含む、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９６．前記ＣＰ１及び前記ＤＤ１が、１５個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１５個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ３を含有する、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９７．前記第２のモノマー構成体は、前記ＣＰ２及び前記ＤＤ２が１５個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１５個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ２を含有することを特徴とする、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９８．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２、または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、潜在型関連ペプチドではない、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
１９９．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２、または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、サイトカインではない、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２００．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２、または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２がサイトカインの受容体ではなく、及び／またはサイトカインの受容体と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有しない、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０１．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２、または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、サイトカインの受容体のフラグメントではない、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０２．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２、または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、アルブミンではない、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０３．前記ＰＭ１、前記ＰＭ２、または前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２が、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０個未満のアミノ酸である、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０４．前記ＡＣＣが、以下の特性：
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、ＰＭ１－ＣＭ３－ＣＰ１－ＣＭ１－ＤＤ１及びＣＰ２－ＣＭ２－ＤＤ２を含み、前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２は二量体化される構造的配置；
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、ＰＭ１－ＣＭ３－ＣＰ１－ＣＭ１－ＤＤ１及びＰＭ２－ＣＭ４－ＣＰ２－ＣＭ２－ＤＤ２を含み、前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２は二量体化される構造的配置；
（ｉｉｉ）前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、４０個未満のアミノ酸である；
（ｉｖ）前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２の受容体ではない；
（ｖ）前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、サイトカインの受容体と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有しない；
（ｖｉ）前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２の受容体のフラグメントではない；
（ｖｉｉ）前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、１３～４９個のアミノ酸である；
（ｖｉｉｉ）前記第１のモノマー構成体は、前記ＣＰ１及び前記ＤＤ１が１８個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１８個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ３を含有することを特徴とする；
（ｉｘ）前記ＡＣＣがＮ－ＰＭ－ＣＭ１－ＣＰ－ＣＭ２－ＤＤＣの方向性を有する場合、前記ＡＣＣのＮ末端から前記サイトカインのＮ－末端アミノ酸までのアミノ酸の全体スパンは、１７～７１個のアミノ酸の長さであり、前記ＡＣＣがＮ－ＤＤ－ＣＭ１－ＣＰ－ＣＭ２－ＰＭ－Ｃの方向性を有する場合、前記ＡＣＣのＣ末端から前記サイトカインのＣ末端アミノ酸までのアミノ酸の全体スパンは、１７～７１個のアミノ酸の長さである；及び／または
（ｘ）前記第２のモノマー構成体は、前記ＣＰ２及び前記ＤＤ２が１８個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１８個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ２を含有することを特徴とする；
の少なくとも１つを有することを特徴とする、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０５．前記第１のモノマー構成体が、１個のみのペプチドマスクを有する、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０６．前記第２のモノマー構成体が、１個のみのペプチドマスクを有する、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０７．前記第１のモノマー構成体が１個のみのペプチドマスクを有し、かつ前記第２のモノマー構成体が１個のみのペプチドマスクを有する、先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣ。
２０８．先行項目のいずれか１項またはいずれかの組み合わせであるＡＣＣを投与することを含む、ＩＰ－１０放出を弱めることをそれを必要とする対象において行う方法。
本発明を以下の実施例にさらに記載するが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：サイトカイン構成体例のインビトロ特性評価
活性化可能サイトカイン構成体ＰｒｏＣ４４０を、組み換え法によって作製した。ＰｒｏＣ４４０の第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれが配列番号３１６のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列（例えば、配列番号２４４）、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、配列番号１００のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、及びＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリングに準拠する）までトランケートされ、Ｓ２２８Ｐの変異を含有するヒトＩｇＧ４のＦｃ（配列番号３）に相当する、二量体化ドメインを含む。
宿主細胞を、配列番号３１６の配列を有するポリヌクレオチドで形質転換し、その後、得られた組み換え宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを調製した。得られた発現ポリペプチドの二量体化によって、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ４４０が産生された。
ＰｒｏＣ４４０の活性を、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞及びＤａｕｄｉ細胞を使用して、インビトロで試験した。それぞれ、図７Ａ及び図７Ｂを参照されたい。
ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＳＴＡＴ２遺伝子及びＩＲＦ９遺伝子を用いた安定な形質移入によって作製し、完全に活性なＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を得た。この細胞は、ＩＦＮα／β誘発性ＩＳＧ５４プロモータの制御下での誘発性ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリフォスファターゼ）レポーター遺伝子も特徴である。導入遺伝子発現を維持するために、細胞を、１０％のＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、３０μｇ／ｍＬのブラストサイジン、１００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）及び１００μｇ／ｍＬのノルモシン（ｎｏｒｍｏｃｉｎ）を補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭａｘ培地において培養した。これらの細胞にＩ型ＩＦＮを添加すると、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路が活性化され、その後に、上清中で、アルカリフォスファターゼ活性の比色検出法であるＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液を使用してすぐに評価できる、ＳＥＡＰ産生が誘発される。
Ｄａｕｄｉ細胞は、ヒトＢ細胞リンパ芽球由来の細胞株である。Ｄａｕｄｉ細胞を、２×１０５細胞／ｍＬの濃度で、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地において調製し、５０μＬのアリコートを、ピペットで白色の平底９６穴プレートのウェル（１０Ｋ／ウェル）へと取った。試験するＰｒｏＣ４４０または対照を、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地において希釈した。２検体の５倍段階希釈を生成し、そこから５０μＬを各ウェルに添加した。３７℃で３日間のインキュベート後に、生存率キットを使用して細胞内でのＡＴＰの濃度を、残存する生存可能な細胞の数の間接的な概算として測定した。１００μＬのｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ ｇｌｏをプレートに直接添加し、続いてプレートをオービタルシェーカー上に、１０分間置いた。このインキュベート後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて、発光シグナルを直接的に測定した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いたＳ字状フィットの非線形回帰によって、用量反応曲線を作成し、ＥＣ５０値を得た。
ＨＥＫ２９３細胞及びＤａｕｄｉ細胞を使用したアッセイの両方において、ＰｒｏＣ４４０の活性は、幹細胞ＩＦＮα－２ｂ（ヒト組み換えＩＦＮ－α２ｂ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能、カタログ番号７８０７７．１）と比較して、少なくとも１，０００倍低下していた（図７Ａ及び図７Ｂ）。これは、ヒトＩｇＧのＦｃに相当する、開裂可能な二量体化ドメインの融合が、ＰｒｏＣ４４０構成体のＩＦＮα－２ｂに対する立体化学的マスキングを提供したことを示している。ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化により、組み換えサイトカインと同等のレベルまで活性が回復した。ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ及び幹細胞ＩＦＮα－２ｂのＥＣ５０値を、ＩＦＮα／βアッセイ結果から計算し、以下の表３に提供する。
Figure 2024511387000009
 ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ及び幹細胞ＩＦＮα－２ｂのＥＣ５０値を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイ結果から計算し、以下の表４に提供する。
Figure 2024511387000010
ｕＰａを用いた、開裂可能部分における予想される部位での開裂を、電気泳動及び質量分析によって確認した（図６Ａ及び図６Ｂ）。結果は、ｕＰａプロテアーゼが、ＰｒｏＣ４４０活性化可能サイトカイン構成体内の開裂可能部分の切断に有効であったことを示唆している。ｕＰａ活性化への感応性に加えて、ＰｒｏＣ４４０は、ＭＭＰ１４によって切断された（図６Ａ～図６Ｃ）。図６Ａは、ゲル電気泳動の結果を表す。左の列は、プロテアーゼに曝露されていないＰｒｏＣ４４０を示し、中央の列は、プロテアーゼｕＰＡに曝露したＰｒｏＣ４４０を示し、右の列は、ＭＭＰ１４に曝露したＰｒｏＣ４４０を示す。質量分析によって、開裂可能部分の近くの、ＩＦＮα－２ｂのＣ末端の端で、ＭＭＰ１４切断部位を特定した（図６Ｂ）。ＭＭＰ１４を用いたプロテアーゼ活性化も、組み換えサイトカインと同等のレベルまで活性を回復させた（図６Ｃ）。データは、ＰｒｏＣ４４０が、ｕＰａまたはＭＭＰ１４などのプロテアーゼによる、内因性及び遺伝子操作した開裂可能部分の切断後に、完全な活性を取り戻したことを示している。
活性化可能サイトカイン構成体ＰｒｏＣ７３２を、組み換え法によって作製した。ＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれ図８に示すアミノ酸配列（例示的な任意のシグナル配列を有する配列番号３２１）を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スペーサー（ＱＳＧＱ）配列、ＩＦＮα－２ｂマスキングペプチド（配列番号３２３）、リンカー（配列番号３２４）、配列番号４１（ＬＳＧＲＳＤＮＩ）のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、リンカー（配列番号２２７、式中、ｎ＝１）、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、配列番号４１のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、及びＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリングに準拠する）までトランケートされた、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ（配列番号３）に相当するＤＤを含む。
別の活性化可能サイトカイン構成体ＰｒｏＣ７３３を、組み換え法によって作製した。ＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれ図９に示すアミノ酸配列（例示的な任意のシグナル配列を有する配列番号３２２）を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スペーサー（ＱＳＧＱ）配列、ＩＦＮα－２ｂマスキングペプチド（配列番号３２３）、リンカー（配列番号３２４）、配列番号４１のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、リンカー（配列番号２２７、式中、ｎ＝１）、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、完全なヒンジ配列を含有する、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ（配列番号４）に相当するＤＤを含む。ＰｒｏＣ７３３構成体は、サイトカイン配列とＤＤとの間の開裂可能部分がないため、以下で議論するように、ＰｒｏＣ７３３構成体は部分的のみ活性化可能である。
宿主細胞を、それぞれ配列番号３２１及び３２２の配列をコードするポリヌクレオチドで形質転換し、その後、得られた組み換え宿主細胞を培養することによって、マスクしたサイトカイン構成体ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ７３３を調製した。得られた発現ポリペプチドの二量体化によって、サイトカイン構成体ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ７３３がそれぞれ産生された。
ＰｒｏＣ７３２、ＰｒｏＣ７３３及びＰｒｏＣ４４０の活性を、上述したように、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を使用して、インビトロで試験した。ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ７３３の活性は、ＰｒｏＣ４４０と比較して、さらに低下した（図１０Ａ～図１０Ｃ）。これは、サイトカイン活性がＰｒｏＣ４４０においてすでに著しく低下したとしても、ペプチドマスクの付加が、二量体化ドメインを介した立体化学的マスキングによる、さらなるマスキング強度を提供したことを示している。驚くべきことに、マスキングペプチド（ＰＭ）の付加はＤＤによる立体化学的マスキングを妨げず、そしてＤＤもＰＭによるマスキングを妨げないようである。ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化によって、ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化後のＰｒｏＣ４４０のレベルと同等のレベルまで、ＰｒｏＣ７３２の活性が回復した。これは、ＰｒｏＣ７３２が、プロテアーゼ活性化に際し、マスクされていないＩＦＮα－２ｂ活性の完全な強度を取り戻したことを示している。
ＰｒｏＣ７３３は、開裂可能部分を介してＩＦＮα－２ｂに付着する親和性ペプチドマスクを含有し、ＩＦＮα－２ｂのＣ末端はヒトＩｇＧのＦｃに直接融合している（サイトカインとＦｃ領域との間に挿入される開裂可能部分なし）。ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化によって、ＰｒｏＣ７３３の活性を、非活性ＰｒｏＣ４４０のレベルと同等のレベルまで回復させた。これは、開裂可能なヒトＩｇＧのＦｃまたはＩＦＮα－２ｂ二量体化による束縛によって提供される立体化学的マスキングに加えて、開裂可能な親和性ペプチドマスクが、ＩＦＮα－２ｂにさらなるマスキング強度を提供することをさらに示している。ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰａ、ＰｒｏＣ７３２、ＰｒｏＣ７３２＋ｕＰａ、ＰｒｏＣ７３３及びＰｒｏＣ７３３＋ｕＰａのＥＣ５０値を、ＩＦＮα／β分析結果から計算し、以下の表５に提供する。
Figure 2024511387000011
ＨＥＫレポーターアッセイにおけるＡＣＣのマスキング効率（開裂しないＡＣＣのＥＣ５０を、開裂したＡＣＣのＥＣ５０と比較して測定した）は、次のとおりである：
ＰｒｏＣ４４０：１３５８倍
ＰｒｏＣ７３２：７３８０倍
ＰｒｏＣ７３３：６０倍
したがって、ペプチドマスク、及び二量体化ドメインを通した立体化学的マスキングの両方を含むＡＣＣにおいて、例えば図１０Ｃに示すように、高レベルのマスキング効率（例えば、＞５，０００倍）を達成できる。
図４２Ａ～図４２Ｄにて示すように、ペプチドマスク（図４２Ａ（ペプチドマスクなし）対図４２Ｂ（ペプチドマスクあり））及びＦｃマスク（図４２Ｃ（Ｆｃマスクなし）対図４２Ｄ（Ｆｃマスクあり））のそれぞれは、ＡＣＣの受容体への結合に影響を及ぼす。データを考慮すると、本開示のＡＣＣの二重マスキング構造を用いることにより、相乗的な活性が得られている。組み換えＩＦＮａ２ｂ、モノマーＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃ、活性化ホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃ、及びホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃの活性を、上述したようにＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を用いて、インビトロで試験した。組み換えＩＦＮａ２ｂ、モノマーＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃ、活性化ホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃ、及びホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃを、上述のように調製した。ホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃの活性は、組み換えＩＦＮａ２ｂと比較して実質的に低減したが、プロテアーゼ活性化によって、組み換えＩＦＮａ２ｂと同程度のレベルまで回復した（図３１）。図３１はまた、活性化及び非活性ホモ二量体ＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃで観察される活性の間のおよそ中間値で、モノマーＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃが活性を示したことも示している。
さらに、ＰｒｏＣ４４０は、ｕＰＡで処置したＰｒｏＣ４４０と比較して、実質的に低下した活性を示す（図３５Ａ）。同一の分子であるが、ＮＳＵＢ基質を有する場合は、ＭＭＰに反応して回復した活性を有し、これは潜在的な開裂部位の存在を示している（図３５Ａ）。ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ１２９９（Ｌ１６１の欠失）の活性は、ともにｕＰＡによって回復した（図３５Ｂ）。Ｌ１６１（ＭＭＰ１４開裂部位内）の欠失は、ＭＭＰ１４またはｕＰＡの存在下でさえ、ＰｒｏＣ１３０１（ＮＳＵＢ基質）の活性化を妨げる（図３５Ｃ）。
実施例２：サイトカイン構成体のインビボ忍容性
ヒトＩＦＮα－２ｂはハムスターＩＦＮα受容体と交差反応し、ハムスターにおいて活性であることが以前から示されている（Ａｌｔｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８６）。ＩＦＮα－２ｂ含有サイトカイン構成体の忍容性を評価するために、０．４ｍｇ／ｋｇの開始用量で、ゴールデンシリアンハムスターに投薬した。動物は、１回分の用量の試験物質を与えられ、許容されない毒性が確認されない限り、投薬後最大７日まで試験を継続した。開始用量（０．４ｍｐｋ）は、ＩＦＮα対照（組み換えインターフェロンα、すなわちＡｍｇｅｎによって、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）の名称で製造される天然に存在しないＩ型インターフェロン）が、ハムスター（１２５ｇｒ）において、体重低下、食物消費量の低下、及び骨髄抑制を誘発すると予想される用量と等しい用量を示す。開始用量が許容された場合、動物は、２ｍｇ／ｋｇの「中用量」に移され、許容される限り、３回分の用量の試験物質を与えられた。許容された場合、動物は、１０ｍｇ／ｋｇの「高用量」に移され、許容される限り、３回分の用量の試験物質を与えられた。許容された場合、動物は、１５ｍｇ／ｋｇの「より高用量」に移された。各段階で試験用量が許容されなかった場合は、動物は、一段階低い用量に移された。開始用量が許容されなかった場合は、動物は、０．０８ｍｇ／ｋｇの「より低用量」に移された。動物には、マスクしていないＩＦＮα－２ｂ Ｆｃ融合構成体ＰｒｏＣ２８６も投薬した。陰性対照として、動物にヒトＩｇＧ４を投与した。
ＰｒｏＣ２８６（ＣｈＩｇＧ４ ５ＡＡ １２０４ＤＮＩｄＬ ＩＦＮａ２ｂ）も、組み換え法によって調製した。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれが配列番号３２６のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号３１７）ヒンジ配列を含有するヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ（配列番号４）に相当するＤＤ、リンカー（配列番号３２７）、配列番号１００のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、リンカー（配列番号２２８）、及びヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質を含む。
ＰｒｏＣ２９１（ＮｈＩｇＧ４ ５ＡＡ １２０４ＤＮＩｄＬ ＩＦＮａ２ｂ）も、組み換え法によって調製した。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれが配列番号４９６のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、リンカー（配列番号４９２）、ＣＭ（配列番号１００）、リンカー（ＧＧＧＳ）、ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号３１７）ヒンジ配列を含有するヒトＩｇＧ４のＦｃ領域（配列番号４）を含む。
ＰｒｏＣ２８６及びＰｒｏＣ２９１の活性を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイにおいて、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）（ＰＥＧ－ＩＦＮ－α２ｂ）の活性と比較した（図１１Ａ～図１１Ｂ）。このアッセイでは、図１１Ａに示すように、ＰｒｏＣ２８６及びＳｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）は、同様の活性レベルを示している。これは、ＰｒｏＣ２８６が、購入可能なペグ化ＩＦＮ－α２ｂと同様の活性を有し、ハムスター試験においてＩＦＮα－２ｂの忍容性を評価するための、Ｓｙｌａｔｒｏｎ対照の代用物として用いられ得ることを示している。ＰｒｏＣ２９１は、ＰｒｏＣ２８６及びＳｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）と比較して活性の低下を示し、これは、ＦｃのＮ末端側のＩＦＮの構造的方向性が、活性の低減のために重要であったことを示している。つまり、ＤＤが１対のＦｃドメインである場合、サイトカインをＤＤのＮ末端側へ置くこと（ＰｒｏＣ２９１における様な）で、サイトカインがＤＤのＣ末端側へ置かれる（ＰｒｏＣ２８６における様な）よりも、サイトカイン活性のより大きな低減が提供され得る。
図１３Ａ～図１３Ｃに示す用量を、１日目に動物に投薬した。非許容用量（ＤＬＴ）に達しない限り、動物での試験を１週間継続した。投与前、及び投与後６時間、２４時間、７２時間、７日目に、動物ごとに臨床的観察、体重及び温度測定を行った。血液学分析及び化学分析のための血液試料を、投与後７２時間、７日目に、動物ごとに収集した。血液学分析及び化学分析は、試料採取の直後に行った。血液学分析として、血液塗抹標本、白血球百分率、ヘマトクリット、ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球容積、血小板数、赤血球数、赤血球分配幅、網状赤血球数及び白血球数を評価した。臨床的化学パネルには、アラニンアミノ基転移酵素、アルブミン、アルブミン／グロブリン比、アルカリフォスファターゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、カルシウム、塩化物、コレステロール、クレアチンキナーゼ、クレアチン、γ‐グルタミルトランスフェラーゼ、グロブリン、グルコース、無機リン、カリウム、ナトリウム、総ビリルビン、総タンパク質、トリグリセリド、尿素、窒素及びＣ反応性タンパク質の測定が含まれた。忍容性試験における毒性の根拠を、図１３Ａ～図１３Ｃ、図１４及び図１５に要約する。
全体として、ＰｒｏＣ２８６構成体を投薬した動物は、２ｍｐｋ（すなわち、２ｍｇ／ｋｇ）で投薬したときは、平均５％の体重損失、及び１０ｍｐｋ及び１５ｍｐｋで投薬したときは、１５％の体重損失を示した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。ＰｒｏＣ２８６を１５ｍｐｋで投薬した１匹の動物は、投与７日後（試験終了時）に２０％の体重損失を示した。これは、許容できない用量とみなされる。これに対して、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２を２ｍｐｋ及び１０ｍｐｋで投薬した動物は、体重損失を示さなかった（図１３Ａ～図１３Ｂ）。ＰｒｏＣ４４０を１５ｍｐｋで投薬した動物は、平均５％の体重損失を示した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。ＰｒｏＣ７３２を１５ｍｐｋで投薬した動物は、体重損失を示さなかった（図１３Ｃ）。これは、ＰｒｏＣ４４０に関するＩＦＮα－２ｂの受容体に対するマスキングが、ＩＦＮα－２ｂに媒介される体重損失を制限することを示している。マスクされていないＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃを１５ｍｐｋで投薬した動物は、マスクした及び二重マスクしたＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃを投薬した動物と比較して、高いＡＬＰを示した（０．４ｍｐｋでＡＬＰの上昇を検出）。ハムスター毒性モデルにおいて、マスクしたＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃは、１５ｍｇ／ｋｇまで忍容性が良好であったことを結果は示している。
理論に拘束されることを望むものではないが、ＤＤのＮ末端にインターフェロンを置くこと、及び比較的短いＬＲを用いることが、ＰｒｏＣ４４０に関してサイトカイン活性を阻害し、ペグ化ＩＦＮα－２ｂ（Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標））またはＰｒｏＣ２８６と比較して、インターフェロンの毒性を低下させると考えられている。予期せぬことに、ＰｒｏＣ７３２に関して、サイトカインのＮ末端でのペプチド親和性マスクの付加により、少なくとも１５ｍｐｋの用量で、ＩＦＮａ－２ｂに媒介される体重損失が完全に抑止される。開裂可能ペプチドマスク及び開裂可能二量体化ドメインの両方の使用は、このように毒性を低下させ、より高いレベルでの投与を可能にし、これにより、このサイトカイン治療の治療域を向上する可能性がある。
臨床的化学に関しては、ＰｒｏＣ２８６を投薬した動物は、全ての用量（０．４ｍｐｋ、２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ及び１５ｍｐｋ）で、投与７日後（試験終了時）に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の著しい上昇を示した（図１４）。動物に、１０ｍｐｋまたは１５ｍｐｋのＰｒｏＣ４４０またはＰｒｏＣ７３２を投薬したときは、ＡＬＰの有意な上昇は測定されなかった（図１４）。ＡＬＴの上昇は、肝臓毒性のマーカーである。ＩＦＮα－２ｂは、肝臓毒性を生じさせることが示されている。これは、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２に関して、ＩＦＮα－２ｂのその受容体への結合のマスキングが、ＩＦＮａ－２ｂが媒介する肝臓毒性を制限することを示している。
血液学に関しては、投与３日後及び投与７日後（試験終了時）、ＰｒｏＣ２８６を２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ及び１５ｍｐｋで投薬した動物は、網状赤血球数、好中球数及び白血球細胞（ＷＢＣ）数の有意な低下を示した（図１５）。これらの低下は、ＩＦＮａ－２ｂに媒介される骨髄毒性を連想させる。投与３日後、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２を投薬した動物は、網状赤血球数、好中球数及び白血球細胞（ＷＢＣ）数の低下を示した（図１５）。全体として、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２を投薬した動物で観察された造血細胞の低下レベルは、ＰｒｏＣ２８６を投薬した動物で観察される低下レベルほど重大ではない。投与７日後（試験終了時）に、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ４４０を投薬した動物では、網状赤血球数、好中球数及び白血球細胞（ＷＢＣ）数の全体的なレベルは、正常レベル、または陰性対照ＩｇＧ４を投薬した動物で観察されたものと同様のレベルに戻っている（図１５）。ＰｒｏＣ２８６を投薬した動物では、網状赤血球数、好中球数及び白血球細胞（ＷＢＣ）数のレベルは低いままである。これは、ＰｒｏＣ４４０及びＰｒｏＣ７３２に関して、ＩＦＮα－２ｂのその受容体へのマスキングが、ＩＦＮａ－２ｂが媒介する骨髄毒性を制限することを示している。
実施例３．さまざまな長さのリンカーを有するサイトカイン構成体の、がん細胞に対するインビトロ抗増殖作用
ＩＦＮａ－２ｂとｈＩｇＧ４ Ｆｃとの間にさまざまな長さのリンカーを有する、またはリンカーがないＩＦＮａ－２ｂ－ｈＩｇＧ４のＦｃ融合構成体の抗増殖作用を、Ｄａｕｄｉ細胞を用いてインビトロで試験した。実施例１に記載されるＤａｕｄｉ細胞アッセイを使用して、試験を実施した。
この実験で試験した融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、成熟ＩＦＮα－２ｂサイトカイン配列、任意選択的リンカー及び／または開裂可能部分、ならびに配列番号４のヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン（Ｆｃ配列のＮ末端がアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣ…（配列番号５００）（配列番号４の最初の１１個のアミノ酸）から開始するように、完全なヒンジ領域を含む）を含有する。ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号３１７；配列番号４の最初の７個のアミノ酸）配列は、これらの構成体の「連結領域」に７個のアミノ酸を与える。第１の構成体（連結領域＝７）は、リンカーまたは開裂可能部分を有せず、その配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に、配列番号１、それが縮合する配列番号４からなる。第２の構成体（連結領域＝１２）は、５アミノ酸リンカーＳＧＧＧＧ（配列番号４９２）を有し、ＣＭを有せず、その配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に、配列番号１、それが縮合する配列番号４９２、それが縮合する配列番号４からなる。第３の構成体（連結領域＝１８）は、７アミノ酸ＣＭ（ＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号１００）及び４アミノ酸リンカーＧＧＧＳ（配列番号２２８）を含有し、その配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に、配列番号１、それが縮合する配列番号１００、それが縮合する配列番号２、それが縮合する配列番号４からなる。第４の構成体（連結領域＝２３）は、５アミノ酸リンカー、７アミノ酸ＣＭ及び４アミノ酸リンカーを含有し、その配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に、配列番号１、それが縮合する配列番号４９２、それが縮合する配列番号１００、それが縮合する配列番号２、それが縮合する配列番号４からなる。第５の構成体（連結領域＝２４）は、１３アミノ酸ＣＭ（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号６８）及び４アミノ酸リンカーを含有し、その配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に、配列番号１、それが縮合する配列番号６８、それが縮合する配列番号２、それが縮合する配列番号４からなる。
図１６は、Ｄａｕｄｉ細胞における上記ＡＣＣの活性を示す。本実施例で試験したＡＣＣは、ＡＣＣに付着されるペプチド親和性マスクを有しなかった。サイトカインとＦｃドメインとの間の、柔軟なリンカーの長さ及び連結領域（ＬＲ）の長さが、（切断されていない）ＡＣＣの活性に影響を及ぼしたことを、データは示している。リンカーがない、または短いリンカーを有し、それに応じて短いＬＲを有する構成体は、低下したサイトカイン活性を示し、一方でより長いリンカーを有し、したがってより長いＬＲを有する構成体は、より高いレベルのサイトカイン活性を有する。
実施例４．さらなる活性化可能サイトカイン構成体のインビトロ特性評価
ペプチドマスクなしの、さらなる活性化可能サイトカイン構成体も、組み換え法によって調製した。これらのＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、同一であった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、配列番号１００（ＳＧＲＳＤＮＩ）のアミノ酸配列を有する開裂可能部分（ＣＭ）、及びヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ（配列番号３を含む）に相当する二量体化ドメインを含む。さらに、これらのＡＣＣは、ＣＰとＣＭとの間に、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧ（配列番号４９２）を有するリンカーを含有する、または含有しない。これらのＡＣＣは、ＣＭとＤＤとの間に、アミノ酸配列ＧＧＧＳ（配列番号２２８）を有するリンカーを含有する、または含有しない。これらのＡＣＣはまた、システイン２２６（ＥＵナンバリングによる）のＮ末端側である、ＤＤのヒンジの一部を含有する、または含有しない。これらのさらなる活性化可能サイトカイン構成体を表６に記載する。

Figure 2024511387000012
Figure 2024511387000013
柔軟なリンカーがなく、Ｃｙｓ２２６までトランケートされたＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有するＡＣＣ（すなわち７個のアミノ酸の連結領域を含む）である、ＰｒｏＣ４４０の活性と、さまざまな柔軟なリンカー及びＦｃ領域配列を含有する（すなわち７個を超えるアミノ酸を有する連結領域を含む）さらなるＡＣＣの活性とを、上述したように、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞及びＤａｕｄｉ細胞を使用して、インビトロで試験した。両方のアッセイにおいて、ＰｒｏＣ４４０の活性（例えば、抗増殖作用）は、より長い連結領域を有する他の全てのＡＣＣと比較して低下した。より長い連結領域は、サイトカインと、対応する第２のモノマーにＤＤを結合する最初のアミノ酸（すなわちＩｇＧ４のＣｙｓ２２６、ＥＵナンバリングによる）との間に、さまざまな追加の配列を含有する。ＡＣＣのＥＣ５０値を、ＩＦＮα／βアッセイ結果から計算し、以下の表７に提供する。
Figure 2024511387000014
 ＡＣＣのＥＣ５０値を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイ結果から計算し、以下の表８に提供する。
Figure 2024511387000015
表７～表８のデータはまた、連結領域の長さを変化させることによって、（切断されていない）ＡＣＣの活性は調節され得ることを示している。
この実施例４で試験したＡＣＣは、ペプチドマスクを含まない。本明細書で報告される、ＰｒｏＣ４４０をＰｒｏＣ７３２と比較している実験結果に基づくと、切断されていないＡＣＣの活性は、サイトカイン構成体のＮ末端に開裂可能部分及びペプチドマスクを付加することによって、さらに低下し得る。同様に、ＰｒｏＣ４４０をＰｒｏＣ７３２と比較している本明細書のデータに基づくと、Ｎ末端にＣＭ及びＰＭをさらに含むＡＣＣは、ＰＭを含まないＡＣＣと比較して、マスキング効率が上昇し得る。
実施例５．ユニバーサルサイトカイン構成体
ユニバーサル活性化可能サイトカイン構成体を、本明細書に記載の組み換え法によって調製した。ユニバーサルＡＣＣは、図１７に示すように、ヒト細胞及びマウス細胞の両方に活性を有する、ユニバーサルインターフェロン配列（ＰｒｏＣ８５９）を有する。ユニバーサルＡＣＣは二量体である。このＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれが配列番号４８０のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、ＩＦＮα１とＩＦＮα２ａとのハイブリッド（配列番号４８１）であるユニバーサルインターフェロン分子に相当する成熟サイトカインタンパク質、配列番号１００のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、及びヒトＩｇＧのＦｃ（配列番号３）に相当する二量体化ドメインを含む。
ユニバーサルサイトカイン構成体の活性を、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞及びＢ１６マウス黒色腫細胞を使用して、インビトロで試験した。ＰｒｏＣ８５９の活性は、マウスＩＦＮａ４と比較して、少なくとも１５０倍低下した。ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化によって、図１７（下部パネル）に示されるように、マウスＩＦＮａ４と同等レベルに活性を回復させた。ＡＣＣ ＰｒｏＣ８５９、ＡＣＣ ＰｒｏＣ８５９＋ｕＰＡ及びマウスＩＦＮα４のＥＣ５０値を分析結果から計算し、図１７（下部パネル）に提供する。
Figure 2024511387000016
本開示によるユニバーサルＩＦＮ及びペプチドマスクを有するＡＣＣは、本明細書に記載の組み換え法によって調製されてよい。ペプチドマスクをユニバーサルインターフェロンに連結して、ＡＣＣのサイトカイン活性を、ＰｒｏＣ８５９と比較してさらに低下させる。このＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれアミノ酸配列を有するポリペプチドである。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列（例えば、配列番号２４２～２４４の１個）、マスキングペプチド（例えば、配列番号３２３、３２８～４７９からなる群から選択されるＰＭのいずれか１個）、任意選択的リンカー（例えば、配列番号２または配列番号２１０～２６３から選択されるいずれか１個）、開裂可能部分（例えば、配列番号５～１００及び２６４～２７９から選択されるいずれか１個）、任意選択的リンカー（例えば、配列番号２、２１０～２６３、３２４、３２５、３２７から選択されるいずれか１個）、ＩＦＮα１とＩＦＮα２ａとのハイブリッド（配列番号４８１）である、ユニバーサルインターフェロン分子に相当する成熟サイトカインタンパク質、配列番号１００のアミノ酸配列を有する開裂可能部分、及びヒトＩｇＧのＦｃ（配列番号３）に相当する二量体化ドメインを含む。ユニバーサルＡＣＣの活性を、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞及びＢ１６マウス黒色腫細胞を使用して、インビトロで試験する。本明細書で報告される、ＰｒｏＣ４４０をＰｒｏＣ７３２と比較している実験結果に基づくと、親和性マスク（ＰＭ）の存在により、切断されていないＡＣＣのサイトカイン活性が、ＰｒｏＣ８５９と比較してさらに低下するだろうが、ＣＭがプロテアーゼによって切断されると、サイトカイン活性の完全な回復が可能になり、それによってさらに毒性を低下させ、治療域を改善すると予想される。
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で提示された結果に基づいて、発明者は、サイトカインのＣ末端で、比較的短いＬＲを有するＤＤを使用することに加えて、サイトカインのＮ末端で親和性マスク（ＰＭ）を使用することで、前述の特定の実施例において例示されたインターフェロン－αサイトカインに加えて、サイトカインのサイトカイン活性への有意なマスキングが提供されるだろうと想定している。上述のように、本明細書に記載される発明は、本明細書で議論されるさまざまなサイトカインタンパク質を含む活性化可能サイトカイン構成体を包含する。非限定例として、本発明のＡＣＣに用いられるＣＰは、配列番号１０１～２０９に列挙されるうちのいずれか、及びそれらの変異体であってよい。特に、単量体サイトカインは、本明細書に記載されるＡＣＣにおける使用に好適である。本明細書において提供される結果に基づいて、本発明のＡＣＣは、対応する野生型サイトカインと比較して、サイトカイン活性の低下を示すこととなり、関連したプロテアーゼ（複数可）によるＡＣＣの開裂に際し、切断産物は、対応する野生型サイトカインのサイトカイン活性に類似したサイトカイン活性を取り戻すことになると考えられる。
実施例６：非ヒト霊長類におけるサイトカイン構成体の忍容性
従来の半減期が延長されたＩＦＮ－ａ２ｂ（ペグ化ＩＦＮ－ａ２ｂ－参照ＰＥＧ－ＩＦＮ ＢＬＡ＃９９－１４８、ＲＭＳ＃１０３９４９４試験９５０２８）（ＰＥＧ－ＩＦＮ，ＰＥＧ－ＩＮＴＲＯＮ（商標））を用いた、カニクイザルにおける過去の試験で、１１７，７２１ｕｇ／ｍ２の単回の皮下投与量（およそ９．８ｍｇ／ｋｇ）が、複数の動物の一過性食欲不振、低体温、低血圧及び死亡を伴ったことが報告された。ペグ化ＩＦＮ－ａ２ｂを用いたそれらの過去の試験において、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、雄で約４．９ｍｇ／ｋｇ（５８，８６０μｇ／ｍ２）及び雌で約２．５ｍｇ／ｋｇ（２９，４４０μｇ／ｍ２）であったと報告された。
本実施例では、ペプチドマスクしたＩＦＮα－２ｂ ＡＣＣ構成体（ＰｒｏＣ７３２）の、非ヒト霊長類における忍容性を評価するために、体重１ｋｇあたり０．０３、０．３０、３．０及び１５ｍｇの用量で、皮下投与を介してカニクイザルに投薬した。サル（各群Ｎ＝２、性別は混合）は、マスクしたＡＣＣの１回の投薬を受け、投与後１４～２８日まで試験を継続した。図３９に示すように、血漿濃度を経時的に測定した。
全ての動物を、少なくとも１日２回（午前／午後）、健康障害、病的状態、死亡数、外傷、生存率、ならびに食物及び水の入手可能性／アクセスしやすさの兆候のためにケージ脇で観察した。投与後約４８時間（３日目）、及び、７日目、１５日目、２２日目及び２９日目に、適切な抗凝固チューブに、全血を採取した。
血液学パラメータには、白血球数、平均赤血球容積、白血球百分率・絶対数、平均赤血球ヘモグロビン、赤血球数、平均赤血球ヘモグロビン濃度、ヘモグロビン、血小板数、ヘマトクリット、赤血球分布幅、網状赤血球数が含まれた。
臨床的化学パラメータには、ナトリウム、カリウム、塩化物、アルカリフォスファターゼ、アラニンアミノ基転移酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、総コレステロール、トリグリセリド、総タンパク質、アルブミン、グロブリン（計算値）、アルブミン／グロブリン比（計算値）、カルシウム、無機リン、総ビリルビンが含まれた。
評価するサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０が含まれた。血漿中ＩＰ－１０の濃度を、ＭＳＤ Ｖ－ＰＬＥＸアッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって、図４０Ａに示すように測定し、図４０Ｂに示すように、ＰｒｏＣ７３２血漿濃度に対してプロットした。
さらに、全血試料の一部を、採取後２４～３６時間以内のフローサイトメトリーによる分析のために、分析研究所に一晩で輸送した。ＦＡＣ評価には、生存率／ＣＤ２０／ＣＤ４５／ＣＤ１４／ＣＤ３／ＣＤ１５９ａ／ＣＤ４／Ｋｉ６７／ＣＤ８／ＰＤ－Ｌ１が含まれた。
全体として、ＰｒｏＣ７３２で処置した動物は、全ての用量レベルで、副作用の臨床的兆候を示さなかった。食欲不振、低体温、低血圧または体重損失の兆候はなかった。投与後３日、７日、１５日に実施した臨床生化学及び血液学分析では、全てのパラメータの、事前に設定した正常範囲からの逸脱は示されなかったが、１件の例外があった。１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２で処置した１匹の動物は、薬剤投与の３日後に、高いＡＳＴパラメータを示した。ペプチドマスクしたＩＦＮα－２ｂ ＡＣＣ構成体（ＰｒｏＣ７３２、Ｐｂ－ＩＦＮ－α２ｂとも称される）は、カニクイザル中で線形の薬物動態及び半減期の延長を示し、１５ｍｇ／ｋｇの用量まで忍容性が良好だった。これらの結果を、以下の表に要約する。
Figure 2024511387000017
全体として、これらの結果は、本開示の条件付きマスクしたＩＦＮ－ａ２ｂでは、従来の半減期延長ＩＦＮ－ａ２ｂと比較したとき、雄及び雌において、最も高い１５ｍｇ／ｋｇの試験用量まで忍容性が上昇したことを示した。
実施例７：ＰＢＭＣによって誘発されたＣＸＣＬ１０及びＩＦＮ－γ放出のインビトロ特性評価
健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、ＣＸＣＬ－１０及びＩＦＮ－γの誘発された放出を、未処置ＰＢＭＣ、及びペプチドマスキングしたＩＦＮα－２ｂ ＡＣＣ構成体（ＰｒｏＣ７３２）、またはＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下で５時間のインビトロプロテアーゼ処置によって活性化したＰｒｏＣ７３２、１ｎｇ／ｍｌ（図１９、上段）または１０ｎｇ／ｍｌ（図１９、下段）の用量で処置したＰＢＭＣを使用して、インビトロで評価した。細胞を、ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ１４で染色し、固定／透過化処理し、ＣＸＣＬ１０及びＩＦＮ－γの細胞内発現で染色した。ゲーティングは、生存可能な単核細胞（図１９、上段）または、生存可能なＣＤ１９陰性リンパ球（図１９、下段）に基づいた。これらの結果は、ＰｒｏＣ７３２が、ＰＢＭＣからのＣＸＣＬ１０及びＩＧＮ－γの放出を、活性化依存的な様式で誘発することを示している。
実施例８：マスクしたＩＦＮα－２ｂによるインビボ腫瘍抑制
マスクしたＩＦＮα－２ｂ ＡＣＣ構成体（ＰｒｏＣ７３２）の腫瘍抑制作用を、無血清培地（１：１のＭａｔｒｉｇｅｌ）において成長させた１０×１０６のＤａｕｄｉ細胞を皮下移植したＢｅｉｇｅ／ＳＣＩＤマウスを使用して、インビボで評価した。図２０に示されるグラフのｘ軸に示されるように、試験の間、週２回、腫瘍測定値を記録した。マウス（各群ｎ＝８）を、５週間の間、１週間に１回、ＰＢＳ（対照）またはＰｒｏＣ７３２、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの用量で処置した。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達してから、処置を開始した。図２０に示されるように、条件付き活性ＰｒｏＣ７３２で処置したマウスで、平均腫瘍体積の用量依存的な低減が観察された。ＰｒｏＣ７３２は、０．１ｍｇ／ｋｇの低い用量で、試験２０日まで完全な退縮を誘発し、０．５ｍｇ／ｋｇの用量は、試験の間、完全な退縮を誘発した。
図３６は、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ１３０１が、用量依存的に腫瘍体積成長を阻害したことを示している。ＰｒｏＣ４４０、ＰｒｏＣ７３２及びＰｒｏＣ１３０１は、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で、完全な腫瘍抑制を示した。
実施例９：ＩＦＮα Ａ／Ｄによるマウス脾細胞のインビトロ活性化
マスクした活性化可能ＩＦＮα Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）または開裂不可のＩＦＮα Ａ／Ｄが、マウス脾細胞においてＩＰ－１０の放出を刺激する能力を、インビトロで試験した。ＩＦＮα Ａ／Ｄ（配列番号４８１）を、Ｒｅｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｈｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２；２５７：１１４９７－５０２）に記載されているように調製し、同文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。プロテアーゼ開裂部位を、開裂不可のリンカー配列で置き換えることによって、対照である、開裂不可のＩＦＮα Ａ／Ｄを作成した。マスクした活性化可能ＩＦＮα Ａ／Ｄを、１：２５０のモル比で、ｕＰＡとともにインキュベートすることによってインビトロで活性化した。マウス脾細胞を、プロテアーゼ処置を伴う及びプロテアーゼ処置を伴わない、マスクした活性化可能ＩＦＮα Ａ／Ｄによって、または開裂不可のＩＦＮα Ａ／Ｄによって、２４時間処置した。ＩＰ－１０濃度を、標準的なＥＬＩＳＡ法によって、従来の方法を使用して決定した。
図２１に示されるように、ｕＰＡで処置した、マスクした活性化可能ＩＦＮα Ａ／Ｄは、マウス脾細胞ＩＰ－１０の放出を誘発した。対照である、開裂不可のＩＦＮα Ａ／Ｄ、及びｕＰＡ処置されていない、マスクした活性化可能ＩＦＮα Ａ／Ｄは、ＩＰ－１０刺激の類似のレベルを示し、これは、ｕＰＡ処置した、マスクした活性化可能ＩＦＮα Ａ／Ｄで検出されたＩＰ－１０濃度を大きく下回った。図２１の結果は、マウス脾細胞ＩＰ－１０放出の刺激は、条件付きで、マスクしたＩＦＮα Ａ／Ｄの活性化に依存することを示している。
実施例１０：マスクしたＩＦＮ－α２ｂの、インビトロでのハムスター細胞生存率への作用
マスクした活性化可能ＩＦＮα－２ｂ ＡＣＣ構成体（ＰｒｏＣ７３２）による処置に応答した、ハムスター黒色腫ＲＰＭＩ１８４６細胞の細胞生存率を、ｕＰＡプロテアーゼで活性化したＰｒｏＣ７３２による処置と比較して、インビトロで評価した。ＲＰＭＩ１８４６細胞を、マスクなし及びマスクしたＡＣＣによって、図２２に示されるように、濃度を上昇させて処置した。ＲＰＭＩ１８４６細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して、標準的なアッセイプロトコルに準拠して決定した。
図２２に示されるように、ハムスター黒色腫ＲＰＭＩ１８４６細胞は、マスクがないＰｒｏＣ２８６と比較して、マスクした活性化可能ＰｒｏＣ７３２の実質的により高い用量に耐えることができた。ＰｒｏＣ７３２上のマスク部分は、サイトカイン構成体の濃度の関数としての細胞生存率を、実質的に右へとシフトさせた。これらの結果は、ハムスター細胞の、ヒトＩＦＮ－ａ２ｂの作用への感応性と、ＰｒｏＣ７３２の向上したインビトロの細胞忍容性を示している。
ＰｒｏＣ１３０１（配列番号２４０）は、ＭＭＰ１４及びｕＰＡへの活性化耐性を示した。ハムスター黒色腫ＲＰＭＩ１８４６細胞の生存率は、ｕＰＡによるＰｒｏＣ７３２の活性化を受けて低下した（図２２）。活性化耐性のあるＰｒｏＣ１３０１では、細胞生存率の活性化依存的な低下は観察されなかった（図３５Ｃ）。
実施例１１：条件付きで活性なＩＮＦａ－Ａ／Ｄのインビボ特性評価
二重マスクしたＩＮＦａ－Ａ／Ｄ ＰｒｏＣ１０２３、及びその改質版である、潜在的に開裂性が低下したＰｒｏＣ１５４９を、実施例１に記載されるように調製した。
マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄの抗腫瘍活性を、ＭＣ３８腫瘍モデルを使用して、インビボで試験した。マウス（各群Ｎ＝５）に、無血清培地中の１．５ｘ１０６のＭＣ３８細胞を皮下移植した。試験の間、週２回、体重及び腫瘍測定値を記録した。平均腫瘍体積が８０ｍｍ３に達したとき、マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）を皮下注射によって、１週間につき２回、またはマスクした開裂不可のＩＦＮａ－Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１５４９）を腹膜内に、１週間に１回、示された用量レベルでマウスに投薬した。
マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄは、５０～２００ｕｇの用量レベルで抗腫瘍活性を示した。５０ｕｇの投与で有意な腫瘍成長阻害が得られ、一方で２００ｕｇの投与でも、動物の６０％で腫瘍の拒絶が得られた（図２３Ａ）。開裂不可の構成体（ＰｒｏＣ１５４９）は類似の反応を媒介しなかったため、マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）の抗腫瘍作用は、タンパク質分解性の活性化に依存していた（図２３Ｂ）。
マスクしたＩＦＮａ２ｂは、用量を増やすことで腫瘍体積を低下させた。マスクしたＩＦＮａ２ｂは、上述のように調製した。マスクしたＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃは、０．０２ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍進行を予防し、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍退縮を誘発した（図３２）。図３２に示すとおり、マスクしたＩＦＮａ２ｂ／Ｆｃは、ペグインターフェロンに類似した抗腫瘍活性を示した。
１日目、４日目、８日目、１１日目及び１５日目に投薬して、マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄの抗腫瘍活性を上述のように試験した。腫瘍体積を、図２７のグラフに示される時点で評価した。
さらに、マスクしたＩＦＮａ２ｂは、２０μｇ及び２００μｇで、対照と比較して抗腫瘍活性を示した（図３３）。１日目、４日目、８日目、１１日目及び１５日目に投薬して、マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄの抗腫瘍活性を上述のように試験した。腫瘍体積を、図２７のグラフに示される時点で評価した。
図３３に示すとおり、二重マスクしたＩＦＮａ ＡＤは、１０、５０及び２００μｇの用量で、開裂不可バージョンと比較して、腫瘍体積を低下させた（図３３）。
図３４Ａに示すとおり、Ｐｒｏ ＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）は、用量依存的に腫瘍体積成長を阻害した。図３４Ｂに示すように、２００μｇのＩＦＮａ Ａ／Ｄ ＮＳＵＢ（ＰｒｏＣ１５４９）が、同一用量のＰｒｏ ＩＦＮａ Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）と比較して、抗腫瘍活性の低下を示しており、阻害には活性化が必要である。
実施例１２．ＩＦＮａ－Ａ／Ｄ処置マウスの免疫記憶
ナイーブマウス（Ｎ＝５；図２４Ａ）、または２００μｇの用量のＰｒｏＣ１０２３を用いたＩＦＮａ－Ａ／Ｄ処置の後に、ＭＣ３８腫瘍を拒絶したマウス（Ｎ＝３；図２４Ｂ）に対して、初回の処置の５６日後に、１．５×１０６のＭＣ３８細胞を再度移植した。腫瘍成長は、週２回モニタリングした。２００ｕｇ／用量のＩＦＮａ－Ａ／Ｄでの処置後に腫瘍を拒絶したマウスに対して、初回の処置の５６日後にＭＣ３８腫瘍を再度移植した。再移植の間、マウスにはいかなる処置も行わなかった。再移植後、全５匹の対照動物では、ＭＣ３８腫瘍は進行的に成長した（図２４Ａ）が、以前にＩＦＮａ－Ａ／Ｄ処置したマウスでは、３匹中の１匹のみの腫瘍が成長し、そのマウスの腫瘍は、２００μｇの用量のＰｒｏＣ１０２３で以前に処置されているこれらのマウスにおける抗腫瘍免疫記憶の形成と一致して、有意に遅い成長を示した（図２４Ｂ）。
マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄは、活性化依存的、免疫介在的にＭＣ３８腫瘍成長を抑制すると、結果は示している。
実施例１３：マスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂによる、Ｉ型インターフェロンシグネチャーの活性化依存的誘発
二重マスクしたＩＮＦａ－ａ２ｂ（配列番号３２１、ＰｒｏＣ７３２）を、上述のように、ｕＰＡとの処置によって活性化した。ペグ化ＩＦＮ－ａ２ｂ（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）は、販売者から購入した。
４人の健康なドナーからのＰＢＭＣは、低温保存され、解凍後、少なくとも８０％の生存率を有する単細胞懸濁液として販売者から購入した。各ドナーからのＰＢＭＣを、１ｕｇ／ｍＬ（高用量）のマスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（切断されていないＰｒｏＣ７３２）、または１０ｎｇ／ｍＬのマスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（切断されていないＰｒｏＣ７３２）、マスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂ（ｕＰＡ処置したＰｒｏＣ７３２）、またはＰｅｇ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（Ｓｙｌａｔｒｏｎ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）を用いて、２４時間、インビトロで処置した。処置した細胞からのバルクｍＲＮＡに、ペアエンド１５０ｃ ＲＮＡｓｅｑハイスループットシーケンシングを行った。Ｓｕｂｒｅａｄパッケージｖ．１．５．２．を用いることによって、固有の遺伝子ヒット数を計算した。ＤＥＳｅｑ２を用いて、示された試料の群間の遺伝子発現を比較した。Ｗａｌｄ検定を使用して、ｐ値及びｌｏｇ２倍数変化を生成した。調整したｐ値＜０．０５及び絶対ｌｏｇ２倍数変化＞１を有する遺伝子が、それぞれの比較で、発現変動遺伝子と呼ばれた。
Figure 2024511387000018
マスクしたＩＦＮ－ａ２ｂを用いたＰＢＭＣの処置は、遺伝子発現変化をもたらさなかったが、一方で活性化ＩＦＮ－ａ２ｂは、４人の全ドナーにおいて、一貫して多数の遺伝子を上方制御及び下方制御した（図２５）。結果は、４１８遺伝子の発現の統計的に有意な増加と、一方では７７遺伝子が下方制御されたことを示している（表９）。遺伝子オントロジー分析により、ＩＦＮ－ａ２ｂの既知の標的、例えばＣＸＣＬ１０、Ｔｒａｉｌ及び２´ＯＡＳの発現増強など、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の活性化に伴うパターンが明らかになった。ペグ化ＩＦＮ－ａ２ｂを用いた処置は、全てのドナーにおいて、同様数の遺伝子を誘発及び抑制した。活性化ＩＦＮ－ａ２ｂで処置したＰＭＢＣと、Ｐｅｇ－ＩＦＮ－ａ２ｂで処置したＰＭＢＣと、の発現プロファイル間の直接的な比較により、２つの処置に違いはなかったことが明らかになった。
この結果は、初代ヒト免疫細胞における、マスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂによる、インターフェロンシグナル伝達の活性化依存的誘発と一致している。高用量のマスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ及びマスクなしのインターフェロンによって誘発される遺伝子発現の変化は最小限であり、これは、二重マスキングが、受容体との新しい相互作用を引き起こさずに、サイトカインのシグナル伝達の潜在能力を低下させたことを示している。
実施例１４：マスクしたＩＦＮ－ａ２ｂの薬物動態学的特性
二重マスクしたＩＮＦａ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ７３２）、立体化学的にマスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（配列番号３１６、ＰｒｏＣ４４０）、その開裂不可の対照（ＰｒｏＣ６５９）、またはＦｃ－ＩＦＮ－ａ２ｂ融合分子（ＰｒｏＣ２８６）を、前述のようにゴールデンシリアンハムスターに投与した。血液試料を、投与後６時間、２４時間、７２時間または７日目に採取した。ＩＦＮ－ａ２ｂの濃度は、ＥＬＩＳＡ法（Ｍａｂｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を使用して測定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用して、ノンコンパートメント薬物動態学的分析（Ｃｅｒｔａｒａ，ＵＳＡ）を実施した。
全ての試験した分子の薬物動態学的プロファイルは、投与した用量に比例する血清濃度の上昇を示している（図２６）。各用量レベルで、マスクしたＩＦＮ－ａ２ｂと、対照タンパク質との薬物の曝露は、類似していた。ノンコンパートメント分析により、循環半減期が、１．９８～６．３８日の範囲で、平均４．３日であることが明らかになった（表１０）。
結果は、ＩＦＮ－ａ２ｂのインビボでの線形薬物動態学的特性、ならびに無修飾ＩＦＮ－ａ２ｂ（２．３時間）及び１２ｋＤａのペグ分子とコンジュゲートしたＰｅｇ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（４．３時間）の公表されたデータと比較して、延長した半減期を示している。
全ての試験した分子の薬物動態学的プロファイルは、投与した用量に比例する血清濃度の上昇を示している。


Figure 2024511387000019
マスクなし、一重マスク、二重マスクしたＩＦＮａ２ｂ、及びＮＳＵＢ対照ＩＦＮａ２ｂを、上述のようにゴールデンシリアンハムスターに投与した。血液試料を、投与後６時間、２４時間、７２時間または７日目に採取した。ＩＦＮａ２ｂの濃度は、ＥＬＩＳＡ法（Ｍａｂｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を使用して測定した。
全ての試験した分子の薬物動態学的プロファイルは、投与した用量に比例する濃度の上昇を示している（図２６）。
実施例１５：ユニバーサルサイトカイン構成体例のインビトロ特性評価
ユニバーサル活性化可能サイトカイン構成体を、本明細書に記載の組み換え法によって調製した。ユニバーサルＡＣＣは、ヒト細胞及びマウス細胞の両方に活性を有する、ユニバーサルインターフェロン配列（ＰｒｏＣ１０２３）を有する。ユニバーサルＡＣＣは二量体である。このＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれが配列番号２３５のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スペーサー（ＱＳＧＱ）配列（配列番号２５６）、ＩＦＮα－２ｂマスキングペプチド（ＴＤＶＤＹＹＲＥＷＳＷＴＱＶＳ）（配列番号３２３）、リンカー（ＧＳＳＧＧＳ）（配列番号３２４）、アミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号４１）を有する開裂可能部分、リンカー（（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、式中ｎ＝１）、ＩＦＮα１とＩＦＮα２ａとのハイブリッド（配列番号４８１）である、ユニバーサルインターフェロン分子に相当する成熟サイトカインタンパク質、アミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号４１）を有する開裂可能部分、及びＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリングに準拠する）までトランケートされた、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ（配列番号３）に相当するＤＤを含む。
別のユニバーサルサイトカイン構成体ＰｒｏＣ１５４９を、組み換え法によって作製した。このＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれＰｒｏＣ１５４９（例示的な任意のシグナル配列を有する）のアミノ酸配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スペーサー（例えば、ＱＳＧＱ）配列、ＩＦＮα－２ｂマスキングペプチド（ＴＤＶＤＹＹＲＥＷＳＷＴＱＶＳ）（配列番号３２３）、リンカー（ＧＳＳＧＧＳ）（配列番号３２４）、配列番号２１１のアミノ酸配列を有する開裂不可部分、リンカー（（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、式中ｎ＝１）、ＩＦＮα１とＩＦＮα２ａとのハイブリッド（配列番号４８１）である、ユニバーサルインターフェロン分子に相当する成熟サイトカインタンパク質、アミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号５０１）を有する開裂不可部分、及び完全なヒンジ配列（配列番号３）を含有する、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃに相当するＤＤを含む。ＰｒｏＣ１５４９構成体は、サイトカイン配列とＤＤとの間に加えて、マスキングペプチドとサイトカインとの間の開裂可能部分を欠いているため、以下で論じるように、活性化可能ではない。
別のユニバーサル活性化可能サイトカイン構成体ＰｒｏＣ８５９を、本明細書に記載の組み換え法によって調製した。ＰｒｏＣ８５９は、ヒト細胞及びマウス細胞の両方に活性を有する、ユニバーサルインターフェロン配列を有する。ＰｒｏＣ８５９は二量体である。ＰｒｏＣ８５９の第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は同一であり、それぞれがＰｒｏＣ８５９のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドであった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、ＩＦＮα１とＩＦＮα２ａとのハイブリッド（配列番号４８１）である、ユニバーサルインターフェロン分子に相当する成熟サイトカインタンパク質、アミノ酸配列（ＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号１００）を有する開裂可能部分、及びヒトＩｇＧのＦｃ（配列番号３）に相当する二量体化ドメインを含む。ＰｒｏＣ１０２３とは異なり、ＰｒｏＣ８５９はペプチドマスキング部分を含まない。
ユニバーサルサイトカイン構成体ＰｒｏＣ１０２３及びＰｒｏＣ８５９の活性を、Ｂ１６マウス黒色腫細胞を使用して、インビトロで試験した。ＰｒｏＣ１０２３の活性は、ＰｒｏＣ８５９と比較して、さらに低下した（図２８Ａ）。これは、サイトカイン活性がＰｒｏＣ８５９においてすでに著しく低下していたとしても、ペプチドマスクの付加が、二量体化ドメインを介した立体化学的マスキングによる、さらなるマスキング強度を提供したことを示している。驚くべきことに、マスキングペプチド（ＰＭ）の付加はＤＤによる立体化学的マスキングを妨げず、そしてＤＤもＰＭによるマスキングを妨げないようである。ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化によって、ｕＰａを用いたプロテアーゼ活性化後のＰｒｏＣ８５９のレベルと同等のレベルまで、ＰｒｏＣ１０２３の活性が回復した。これは、ＰｒｏＣ１０２３が、プロテアーゼ活性化に際し、マスクされていないユニバーサルＩＦＮα活性の完全な強度を取り戻したことを示している。
ＨＥＫレポーターアッセイにおけるＡＣＣのマスキング効率（開裂しないＡＣＣのＥＣ５０を、開裂したＡＣＣのＥＣ５０と比較して測定した）は、次のとおりである：
ＰｒｏＣ１０２３：１３８７倍
ＰｒｏＣ８５９：７００倍
ユニバーサルサイトカイン構成体ＰｒｏＣ１０２３及びＰｒｏＣ１５４９の活性を、Ｂ１６マウス黒色腫細胞を使用して、インビトロで試験した。ＰｒｏＣ１０２３及びＰｒｏＣ１５４９は、非活性化状態では、シグナル伝達活性の類似した低下を示した（図２８Ｂ及び図２８Ｃ）。ｕＰａまたはＭＭＰ１４を用いたプロテアーゼ活性化に際して、開裂不可のＰｒｏＣ１５４９の活性は低いままであり、プロテアーゼ活性化のないＰｒｏＣ１５４９に類似しているが、一方でＰｒｏＣ１０２３の活性は、プロテアーゼ活性化後、プロテアーゼ活性化のないＰｒｏＣ１０２３及びＰｒｏＣ１５４９と比較して著しく上昇した（図２８Ｂ及び図２８Ｃ）。これは、ＰｒｏＣ１５４９がプロテアーゼ活性化に耐性があり、ユニバーサル活性化可能サイトカイン構成体のプロテアーゼ依存的活性化を示すための対照として用いられ得ることを示している。
実施例１６：さらなるヘテロ二量体ＡＣＣのインビトロ特性評価
ＡＣＣ ＰｒｏＣ１２３９（Ｐｒｏ－ＩＦＮ ４９ＣＳ １２０４ ＩＦＮａ２ｂ ０ １２０４ ０ Ｇ４ Ｋｎｏｂ Ｓｔｕｂ Ｈｏｌｅ）もまた、組み換え法によって調製した。このＡＣＣの第１のモノマー構成体は、ＰｒｏＣ１２３９アーム１のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドである。このＡＣＣの第１のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スペーサー（ＱＳＧＱ）配列（配列番号２５６）、ＩＦＮα－２ｂマスキングペプチド（ＴＤＶＤＹＹＲＥＷＳＷＴＱＶＳ）（配列番号３２３）、リンカー（ＧＳＳＧＧＳ）（配列番号３２４）、アミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号４１）を有する開裂可能部分、リンカー（（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、式中ｎ＝１）、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、アミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＮＩ）（配列番号４１）を有する開裂可能部分、及びＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリングに準拠する）までトランケートされた、ノブ変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ（配列番号３１８）に相当するＤＤ、を含む。このＡＣＣの第２のモノマー構成体は、ＰｒｏＣ１２３９アーム２のアミノ酸配列、及びそのＮ末端におけるシグナル配列を有するポリペプチドである。第２のモノマー構成体は、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スタブ部分（ＳＤＮＩ）（配列番号３２０）、ホール変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ（配列番号３１９）に相当する二量体化ドメインを有する。
ＰｒｏＣ１２３９及びＰｒｏＣ７３２の活性を、上述したように、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を用いてインビトロで試験した。ＰｒｏＣ１２３９の活性は、ＰｒｏＣ７３２と比較して穏やかに低下した（図２９）。
実施例１７：さまざまな開裂可能リンカーを有するさらなるＡＣＣのインビトロ特性評価
さまざまな開裂可能リンカーを有するさらなる活性化可能サイトカイン構成体もまた、組み換え法によって調製した。これらのＡＣＣの第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体は、同一であった。第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端で、シグナル配列、スペーサー（ＱＳＧＱ）配列（配列番号２５６）、ＩＦＮα－２ｂマスキングペプチド（ＴＤＶＤＹＹＲＥＷＳＷＴＱＶＳ）（配列番号３２３）、リンカー（ＧＳＳＧＧＳ）（配列番号３２４）、開裂可能部分、リンカー（（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、式中ｎ＝１）、ヒトインターフェロンα－２ｂ（配列番号１）に相当する成熟サイトカインタンパク質、開裂可能部分、及びＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリングに準拠する）までトランケートされた、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ（配列番号３）に相当するＤＤ、を含む。ＡＣＣで使用したさまざまな開裂可能リンカーを、以下の表に記載する：


Figure 2024511387000020
ＰｒｏＣ７３２、ＰｒｏＣ１５５０及びＰｒｏＣ１５５２の活性を、上述したように、ＩＦＮ反応性ＨＥＫ２９３細胞を用いてインビトロで試験した。ｕＰａまたはＭＴＳＰ１のいずれかを用いたプロテアーゼ活性化に際し、全ての活性化可能サイトカイン構成体は類似した活性の上昇を示し、これは、図３０に示すように、全ての活性化サイトカイン構成体が、プロテアーゼ処置に際して同一レベルの活性を取り戻したことを示唆している。
実施例１８：インビトロでの、インターフェロンα受容体に対する活性化Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの結合
Ｐｂ－ＩＮＦ－ａ２ｂを、ｕＰＡを用いてインビトロで活性化し、クロマトグラフィによって、活性フラクションを精製した（ＰｒｏＣ１６４０）。ヒト（ＰｒｏＣ１８２２）及びカニクイザル（ＰｒｏＣ１８２４）のインターフェロンα受容体１、ならびにヒト（ＰｒｏＣ１８２３）及びカニクイザル（ＰｒｏＣ１８２５）のＩＦＮＡＲ２を、組み換えタンパク質として発現させ、精製した。表面プラズモン共鳴法を使用して、インビトロでの結合を実施した。固定した抗ヒトＦｃまたは抗ヒスチジン抗体でコーティングしたチップ上に、リガンドを捕らえた。マルチサイクルカイネティクス解析法を可能にする再生条件を確立した。リガンドを捕らえたチップ上に異なる濃度のアナライトを送液し、マルチサイクルカイネティクスのセンサーグラムを生成し、１：１の結合モデルを使用して、運動速度定数及び親和性定数を得るために分析した。
ＰｒｏＣ１６４０は、ヒト及びカニクイザルＩＦＮＡＲ１に結合したが、分子の解離が極めて遅いため、現法では、相互作用の親和性及び特異性を決定できなかった。ＩＦＮ－ａ２ｂの活性化フラクションの、ヒトＩＦＮＡＲ２及びカニクイザルＩＦＮＡＲ２への結合を検出した。図４１Ａ～図４１Ｄにて示すように、ＰｒｏＣ７３２は、類似した親和性を伴って、ヒト及びカニクイザルのインターフェロンα受容体ＩＦＮＡＲ２に結合する。図４１Ａは、経時的なヒトＩＦＮＡＲ１応答を示す。図４１Ｂは、経時的なカニクイザルＩＦＮＡＲ１応答を示す。図４１Ｃは、経時的なヒトＩＦＮＡＲ２応答を示す。図４１Ｄは、経時的なカニクイザルＩＦＮＡＲ２応答を示す。
下表に示すように、ヒトＩＦＮＡＲ２に対する親和性は２．７ｎＭであり、カニクイザルＩＦＮＡＲ２に対する親和性は９．３ｎＭであった。
Figure 2024511387000021
 確認試験のために、活性化Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１６４０）の、Ｆｃ標識二量体ＩＦＮＡＲ２（ＰｒｏＣ１７１８）への結合を分析した。ＰｒｏＣ１６４０のＰｒｏＣ１７１８との相互作用のＫｄは、２．３ｎＭであった。
したがって、ヒトＩＦＮ－ａ２ｂは、類似した親和性を伴って、ヒト及びカニクイザルのＩＦＮＡＲ２に結合する。リガンドの形態及び結合価は、測定結果に影響を与えなかった。
実施例１９：一重マスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子のＩＦＮＡＲ２への結合
マスクしたＰｂ－ＩＮＦ－ａ２ｂの、ヒトＩＦＮＡＲ２への結合を、上述のように実施した。ペプチドマスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ１９７６）と、マスクなしのバージョン（ＰｒｏＣ１６４０）との直接的な比較により、約５０倍の親和性の差が示された（それぞれ１３０．８ｎＭ対２．７ｎＭ）。さらに、立体化学的にマスクした分子（ＰｒｏＣ４４０）は、マスクなしの分子と比較して、大幅に低下した親和性（ｋＤ＝１０１．１ｎＭ）を伴ってＩＦＮＡＲ２に結合する。図４２Ａ～図４２Ｄにて示すように、ペプチドマスク（図４２Ａ（ペプチドマスクなし）対図４２Ｂ（ペプチドマスクあり））及びＦｃマスク（図４２Ｃ（Ｆｃマスクなし）対図４２Ｄ（Ｆｃマスクあり））のそれぞれは、ＡＣＣの受容体への結合に影響を及ぼす。データを考慮すると、本開示のＡＣＣの二重マスキング構造を用いることにより、相乗的な活性が得られている。したがって、親和性及び立体化学的マスキングの両方が、ＩＦＮ－ａ２ｂの、ＩＦＮＡＲ２への結合を低下させる。
実施例２０：腫瘍組織によるＡＣＣ活性化
蛍光標識したＰｒｏＣ７３２を、酵素によって活性な腫瘍試料または低い活性の対照組織とともに、３７℃で、図３７Ａに示され、（Ｈｏｗｎｇ，Ｂ，Ｗｉｎｔｅｒ，ＭＢ，ＬｅＰａｇｅ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０２１；１３：１３９０）に記載されるように、インキュベートした。２時間または１６時間のインキュベート後に回収したタンパク質を、活性化状態（キャピラリ電気泳動）及び生理活性（ＨＥＫ青色レポーターアッセイ）について分析した。回収した溶液を、続いて、活性な分子または低い活性の対照組織の定量化を可能にするキャピラリ電気泳動（図３７Ｂ）を通して、またはＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデル（図３７Ｃ）を使用して、分析した。酵素的に不活性な試料を、対照組織として使用した。結果は、腫瘍微小環境におけるＰｒｏＣ７３２の活性化を示している。
低い活性の対照組織ではない乳房癌腫瘍試料とのインキュベートにより、立体化学的（Ｆｃフラグメント）マスク及び親和性（ＣＳ４９ペプチド）マスクの解放後に生成されると考えられる分子に相当するタンパク質産物の出現が得られた（図３７Ｂ）。ペプチドマスクの解放は先に検出され、一方でＦｃマスクの分離は、後の時点でより顕著だった。対照組織ではない乳房癌組織とともにインキュベートしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ試料は、ＩＦＮ経路活性化アッセイにおいて上昇した力価を示した（図３７Ｃ）。１６時間のインキュベートは、２時間のインキュベートと比較して、より高い力価となった。
観察結果は、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ分子からの、立体化学的及びペプチドマスクの時間依存的解放と一致し、したがって腫瘍組織によるＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂのタンパク質分解性の活性化と一致している。
実施例２１：腫瘍組織とのインキュベート後の、インターフェロン分子の生理活性の変化
完全にマスクしたＰｂ－ＩＮＦ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ７３２）タンパク質、またはインビトロ活性化（ＰｒｏＣ１６４０）ＩＦＮ－ａ２ｂタンパク質を、腫瘍試料とともにインキュベートした。２時間、６時間または２４時間のインキュベート後に回収したタンパク質を、ＨＥＫ青色レポーターアッセイを使用して、生理活性について分析した。
酵素によって活性な腫瘍組織とのインキュベートは、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの活性化及び生理活性の増強をもたらした。反対に、腫瘍組織とのインキュベートは、潜在的に分子のタンパク質分解によって、マスクなしのインターフェロンの生理活性を低下させた。Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ及びマスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂの対照試料の生理活性は、腫瘍の不存在下でのインキュベートに際して変化しなかった。図３８Ａ～図３８Ｃにて示すように、ＰｒｏＣ７３２または組み換えＩＦＮ－ａ２ｂを、ＴＮＢＣ及び頭頸部（「Ｈ＆Ｎ」）腫瘍組織切片上で、または腫瘍のないガラス領域において、３７℃でインキュベートした。回収した溶液を、続いてＨＥＫ青色ＩＦＮＡレポーターモデルによって分析した。図３８Ａ及び図３８Ｂは、１０ｎｇ／ｍＬのＰｒｏＣ７３２の、または１ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＦＮ－ａ２ｂの、０時間の値と比較して計算した生理活性の倍数変化を示す。図３８Ｃは、腫瘍組織の不存在下で、２４時間インキュベートしたＰｒｏＣ７３２及びＩＦＮ－ａ２ｂタンパク質の生理活性を示す。各線は、インキュベートの前及び２４時間後に分析した、個々の試料（１００～０．０１ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度）をつないでいる。
この結果は、腫瘍組織への曝露は、インビトロでのマスクなしのインターフェロン分子を分解し得ることを示唆している。マスクしたＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂは、腫瘍への曝露後、その生理活性を保持し、増強する。
実施例２２：非ヒト霊長類における、マスクしたＩＮＦ－ａ２ｂ及び対照分子の薬物動態
カニクイザルにおけるＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂのＰＫ／ＰＤ特性を理解するために、動物（各群Ｎ＝２）を、０．０３、０．３、３または１５ｍｇ／ｋｇのＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの、単回、皮下投与で処置した。示された時点で血漿試料を収集し、総Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ濃度について分析した。血清中のＩＰ－１０の濃度を、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＭＳＤ Ｖ－ｐｌｅｘアッセイで測定した。
ＰｒｏＣ７３２の投与は、投与の２４時間後での最初の測定から、薬物の血漿濃度が用量依存的に上昇するという結果になった（図３９）。Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの血漿濃度は、投与後、少なくとも２週間維持された。
ＩＰ－１０の血清濃度の上昇を、処置した動物において、投与後２４時間の早い段階で検出した（図４０Ａ）。上昇の大きさは、用量レベルと相関があり、１５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの投与は、それぞれ８ｎｇ／ｍＬ及び４ｎｇ／ｍＬを上回るＩＰ－１０濃度という結果になった。投与の７日後、ＩＰ－１０の血清レベルは、最も高い用量レベルを処置したサルを除く全ての動物において、生理的濃度に戻った。投与後１日目及び７日目の、循環Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ及びＩＰ－１０の濃度を、互いに対してプロットした（図４０Ｂ）。
結果は、非ヒト霊長類における、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの延長した半減期と一致している。高用量Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂでの処置後の、ＩＰ－１０の一過性の上昇は、この分子が、高用量レベルで与えられた非ヒト霊長類において、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路を活性化できることを示唆している。
実施例２３：非ヒト霊長類において、Ｐｂ－ＩＮＦ－ａ２ｂによって誘発される遺伝子発現プロファイルの変化
カニクイザルを、前述のように、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂで処置した。投与の２４時間後に、ＰＢＭＣを全血から単離した。カニクイザルにおいて、ＰｒｏＣ７３２によって誘発される遺伝子発現プロファイル変化を分析した。カニクイザル（各群Ｎ＝２）を、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２の、単回、皮下投与で処置した。単離した細胞からのバルクｍＲＮＡに、ペアエンド１５０ｃ ＲＮＡｓｅｑハイスループットシーケンシングを行った。Ｓｕｂｒｅａｄパッケージｖ．１．５．２．を用いることによって、固有の遺伝子ヒット数を計算した。ＤＥＳｅｑ２を用いて、示された試料の群間の遺伝子発現を比較した。Ｗａｌｄ検定を使用して、ｐ値及びｌｏｇ２倍数変化を生成した。調整したｐ値＜０．０５及び絶対倍数変化＞３を有する遺伝子が、それぞれの比較で、発現変動遺伝子と呼ばれた。
Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの投与は、全ての用量レベルで、循環白血球中の３５遺伝子の上方制御を伴った（図４３）。投与されるＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの用量レベルの上昇（それぞれ０．３、３及び１５ｍｇ／ｋｇ）によって、さらなる数（３、１２及び４７）の遺伝子が上方制御された。上方制御された遺伝子の多くは、Ｉ型インターフェロンによって誘発されることが知られる、ＩＳＧ、すなわちインターフェロン誘導遺伝子と特定される群に属する。上方制御された遺伝子の個々の分析により、誘発の用量依存的パターンが示され、大部分の明白な変化は、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの最も高い用量レベルと関連付けられた。図４４は、遺伝子発現の用量依存的変化を示す。読み取り数の変化が＞３である場合、遺伝子は発現変動遺伝子と呼ばれた。
この結果は、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂによる、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達のインビボ活性化と一致している。
実施例２４：Ｐｂ－ＩＮＦａ－Ａ／Ｄのインビボ特性評価
マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄ（ＰｒｏＣ１０２３）の抗腫瘍活性を、ＭＣ３８腫瘍モデルを使用して、インビボで試験した。マウス（各群Ｎ＝１０）に、無血清培地中の１．５ｘ１０６のＭＣ３８細胞を皮下移植した。試験の間、週２回、体重及び腫瘍測定値を記録した。平均腫瘍体積が８０ｍｍ３に達したとき、示した量のＰｒｏＣ１０２３を、１回の皮下注射によってマウスに投薬した。マスクしたＩＦＮａ－Ａ／Ｄが、５０～２００ｕｇの用量レベルで抗腫瘍活性を示すことは、前もって立証した。５０ｕｇの投与で有意な腫瘍成長阻害が得られ、一方で２００ｕｇの投与でも、動物の６０％で腫瘍の拒絶が得られた。この実験では、投与の６日後、動物を安楽死させ、腫瘍、腫瘍流入領域リンパ節及び脾臓を収集し、単細胞懸濁液へと処理した。組成物及び腫瘍免疫浸潤の活性化を、全細胞で、生存可能なＣＤ４５＋ＣＤ３＋のサブセットでゲーティングして実施したフローサイトメトリーによって分析した。
Ｐｂ－ＩＦＮａ－Ａ／Ｄで処置したマウスにおいて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中にあるが、末梢組織中にはないＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットは、殺腫瘍性活性と関連付けられたエフェクター分子の産生など、増強された活性化を示した（図４５）。グランザイムＢは、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達によって誘発され得る、細胞傷害性Ｔ細胞のエフェクター分子である。Ｐｂ－ＩＦＮａ－Ａ／Ｄの投与は、腫瘍におけるグランザイムＢ陽性及びＣＤ６９陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の、有意な上昇と関連付けられ、一方で腫瘍流入領域リンパ節を含む末梢組織においては、大きな変化はなかった。
したがって、このデータは、Ｐｂ－ＩＦＮａ－Ａ／Ｄが、腫瘍における免疫活性化を媒介するが、末梢組織では媒介しないことを示している。免疫活性化のパターンは、Ｉ型インターフェロンの公表されている作用と、概して一致していた。腫瘍にとって好ましい免疫活性化の様式は、腫瘍による、タンパク質分解性開裂を介したＡＣＣの活性化を示す。観察結果は、Ｐｂ－ＩＦＮａ－Ａ／ＤによるＭＣ３８腫瘍成長抑制の免疫介在性反応機構と一致している。
実施例２５：Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂのインビボ忍容性
ヒトＩＦＮα－２ｂはハムスターＩＦＮα受容体と交差反応し、ハムスターにおいて活性であることが以前から示されている（Ａｌｔｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８６）。マスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂ－Ｆｃ融合（ＰｒｏＣ２８６）または一重（立体化学的）マスクしたＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ４４０）と比較した、１回の投与後のハムスターにおける、ＰｒｏＣ７３２の向上した忍容性は、実施例２に示した。本実施例２５では、複数回の投与後のゴールデンシリアンハムスターにおける、Ｐｂ－ＩＦＮα－２ｂの忍容性を決定した。
動物（各群Ｎ＝５）に、１５または３０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのＰｒｏＣ７３２、または７．５または１５ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのマスクなしのＩＦＮ－ａ２ｂ－Ｆｃ融合タンパク質（ＰｒｏＣ２８６）を、週１回、合計３回、腹腔内に投薬した。臨床的観察、体重及び温度の測定を、投与前、その後は週２回行った。マスクなしのＩＦＮ分子（ＰｒｏＣ２８６）を投与した動物は、１回目の投与後、３日という早い段階で著しい体重損失を示した（図４６）。１５ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ２８６を投与した最初の動物は、過剰な体重損失（＞２５％）のために、１０日目に安楽死させ、全てのその他の動物は、１１日目～１９日目の間に、過剰な体重損失、不動及び昏睡のため安楽死させたか、または死体で発見された。マスクなしのＩＮＦ－ａ２ｂの、より低い（７．５ｍｇ／ｋｇ）用量で処置した動物でも、同様の観察結果であった。これに対して、最大３０ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ７３２で処置した動物には、著しい体重損失または病的状態を示した動物はいなかった。
この結果は、本開示で使用される二重マスキング構造を使用することによる、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの安全性の上昇と一致している。
実施例２６：Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂの単回投与で処置したカニクイザルにおける、サイトカイン及びケモカイン放出の低下
カニクイザルにおける、Ｐｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂのマスキング作用を理解するために、動物（各群Ｎ＝２）に、１ｍｇ／ｋｇのＰｂ－ＩＦＮ－ａ２ｂ（ＰｒｏＣ７３２）、または１ｍｇ／ｋｇもしくは０．１ｍｇ／ｋｇのマスクなしの対照分子ＰｒｏＣ２８６を、単回、皮下投与で処置した。血漿試料を示された時点で収集し、マルチプレックスＭＳＤ Ｖ－ｐｌｅｘアッセイを使用して、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１ｂ及びＩＬ－１２ｐ７０濃度について分析した。
図４７に示されるように、ＰｒｏＣ７３２の投与は、投与６時間後の血漿ＩＰ－１０及びＭＩＰ－１ｂレベルの上昇という結果になった。マスクなしの分子によって処置した動物では、高用量レベル及び低用量レベルで、全ての測定した分子の血漿濃度は高くなった。投与の２４時間後、ＰｒｏＣ７３２で処置した動物において、ＩＰ－１０のわずかな上昇のみが認められた。反対に、１ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ２８６を与えられた動物は、ＩＰ－１０レベルの著しい上昇を示した。０．１ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＣ２８６の投与２４時間後に観察されたＩＰ－１０の上昇は、１０倍高い用量のＰｒｏＣ７３２によって誘発された上昇よりも大きかった。
マスクなしのサイトカイン－Ｆｃ融合と比較して、ＰｒｏＣ７３２で処置した非ヒト霊長類では、Ｉ型インターフェロン応答のバイオマーカーの誘発が減衰したことを、結果は示している。この観察結果は、マスキング作用と一致している。

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他の実施形態
本発明を上記の発明を実施するための形態に関連して説明してきたが、前述の説明は例示を意図しており、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点及び修正は、以下の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (192)

  1. 第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含有する活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
    （ａ）前記第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、前記ＣＭ１は前記ＣＰ１と前記ＤＤ１との間に置かれ、前記ＣＭ３は前記ＰＭ１と前記ＣＰ１との間に置かれ、
    （ｂ）前記第２のモノマー構成体が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の開裂可能部分（ＣＭ２）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含み、前記ＣＭ２は前記ＣＰ２と前記ＤＤ２との間に置かれ、
    前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が互いに結合し、それによって前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体の二量体を形成し、
    以下の特性：
    （ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、ＰＭ１－ＣＭ３－ＣＰ１－ＣＭ１－ＤＤ１及びＣＰ２－ＣＭ２－ＤＤ２を含み、ＤＤ１及びＤＤ２は二量体化される構造的配置；
    （ｉｉ）前記第１のモノマー構成体は、前記ＣＰ１及び前記ＤＤ１が１８個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１８個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ３を含有することを特徴とする；
    （ｉｉｉ）前記第２のモノマー構成体は、前記ＣＰ２及び前記ＤＤ２が１８個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１８個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ２を含有することを特徴とする；
    （ｉｖ）ＰＭ１及びＰＭ２のそれぞれが、４０個未満のアミノ酸である；
    （ｖ）ＰＭ１及びＰＭ２のそれぞれが、１３～４９個のアミノ酸である；及び／または
    （ｖｉ）ＰＭ１及びＰＭ２のそれぞれが、前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２の受容体ではなく、ＰＭ１及びＰＭ２のそれぞれが、前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２の受容体のフラグメントではない、
    の少なくとも１つを有する、前記活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）。
  2. 前記第２のモノマー構成体が、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）及び第４の開裂可能部分（ＣＭ４）をさらに含み、前記ＣＭ４が前記ＰＭ２と前記ＣＰ２との間に置かれる、請求項１に記載のＡＣＣ。
  3. 前記第１のモノマー構成体が、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含む第１のポリペプチドを含む、請求項１または２に記載のＡＣＣ。
  4. 前記第２のモノマー構成体が、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  5. 前記第２のモノマー構成体が、前記ＰＭ２、前記ＣＭ４、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む、請求項２に記載のＡＣＣ。
  6. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、それぞれ独立して、インターフェロン、インターロイキン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＭＳＰからなる群から選択され、所望により前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２は、独立して、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ β、ＩＦＮ γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４－１ＢＢ－Ｌ、ＯＸ４０、及びＯＸ４０Ｌから選択される、請求項１～５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  7. 前記ＰＭ１が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンである；
    前記ＰＭ１が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンαである；
    前記ＰＭ１が、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンβである；
    前記ＰＭ１が、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がインターフェロンγである；
    前記ＰＭ１が、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－１２である；
    前記ＰＭ１が、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７、４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－１５である；
    前記ＰＭ１が、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－２である；または
    前記ＰＭ１が、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ１がＩＬ－２１である、
    請求項１～６のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  8. 前記ＰＭ２が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンである；
    前記ＰＭ２が、配列番号３２８、３２９、３２３及び３３１～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンαである；
    前記ＰＭ２が、配列番号３３１～３６０、３６２～３６４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンβである；
    前記ＰＭ２が、配列番号３３１～３６０、３６６～３６９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がインターフェロンγである；
    前記ＰＭ２が、配列番号３７０～３７４からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－１２である；
    前記ＰＭ２が、配列番号３７５～３８２、４６９～４７７、４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－１５である；
    前記ＰＭ２が、配列番号３８３～４６８、４６９～４７８からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－２である；または
    前記ＰＭ２が、配列番号４７８及び４７９からなる群から選択される配列を含み、かつ前記ＣＰ２がＩＬ－２１である、
    請求項２～７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  9. ＰＭ１、ＰＭ２またはＰＭ１及びＰＭ２が、配列番号３２３を含む、請求項２～８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  10. ＰＭ１、ＰＭ２またはＰＭ１及びＰＭ２が、配列番号３３１を含む、請求項２～９のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  11. ＰＭ１、ＰＭ２またはＰＭ１及びＰＭ２が、配列番号３３２を含む、請求項２～１０のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  12. ＰＭ１とＣＰ１との間に、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸を含むマスク連結領域を含む、請求項２～１１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  13. ＰＭ２とＣＰ２との間に、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸を含むマスク連結領域を含む、請求項２～１２のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  14. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、１対のＦｃドメイン；ヒトＩＬ－１５受容体のアルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）からのスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメイン及び可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼ及びバルスター；ＰＫＡ及びＡＫＡＰ；変異ＲＮａｓｅＩフラグメントベースのアダプタ／ドッキングタグモジュール；エピトープ及びｓｄＡｂ；エピトープ及びｓｃＦｖ；タンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン及びＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュール；抗原結合ドメイン及びエピトープからなる群から選択される対である、請求項１～１３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  15. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が１対のＦｃドメインである、請求項１４に記載のＡＣＣ。
  16. 前記１対のＦｃドメインが、１対のヒトＦｃドメインである、請求項１５に記載のＡＣＣ。
  17. 前記ヒトＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメインまたはヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１６に記載のＡＣＣ。
  18. 前記ヒトＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１７に記載のＡＣＣ。
  19. 前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１６に記載のＡＣＣ。
  20. 前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１９に記載のＡＣＣ。
  21. 前記ヒトＦｃドメインが配列番号３を含む、請求項２０に記載のＡＣＣ。
  22. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、それぞれ、配列番号３１８及び３１９を含む、請求項１４に記載のＡＣＣ。
  23. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が同一である、請求項１～２１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  24. 前記ＤＤ１が抗原結合ドメインを含み、前記ＤＤ２が対応するエピトープを含む、請求項１４に記載のＡＣＣ。
  25. 前記抗原結合ドメインが抗Ｈｉｓタグ抗原結合ドメインであり、前記ＤＤ２がＨｉｓタグを含む、請求項２４に記載のＡＣＣ。
  26. 前記抗原結合ドメインが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２４に記載のＡＣＣ。
  27. 前記抗原結合ドメインが、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項２４に記載のＡＣＣ。
  28. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２の少なくとも一方が、非ポリペプチドポリマー及び小分子からなる群から選択される二量体化ドメイン置換基を含む、請求項１４に記載のＡＣＣ。
  29. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、互いに共有結合されている非ポリペプチドポリマーを含む、請求項２８に記載のＡＣＣ。
  30. 前記非ポリペプチドポリマーが、硫黄含有ポリエチレングリコールであり、前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、１個以上のジスルフィド結合を介して互いに共有結合されている、請求項２９に記載のＡＣＣ。
  31. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２の少なくとも一方が小分子を含む、請求項２８に記載のＡＣＣ。
  32. 前記小分子がビオチンである、請求項３１に記載のＡＣＣ。
  33. 前記ＤＤ１がビオチンを含み、前記ＤＤ２がアビジンを含む、請求項３２に記載のＡＣＣ。
  34. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が成熟サイトカインである、請求項１～３３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  35. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２がシグナルペプチドを含む、請求項１～３３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  36. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が同一である、請求項１～３５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  37. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が異なる、請求項１～３５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  38. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２がインターフェロンである、請求項１～３５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  39. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２がインターフェロンである、請求項３８に記載のＡＣＣ。
  40. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が異なるインターフェロンである、請求項３８に記載のＡＣＣ。
  41. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が同一のインターフェロンである、請求項３８に記載のＡＣＣ。
  42. 前記インターフェロン（複数可）が、ヒト野生型成熟インターフェロンである、請求項３８～４１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  43. 前記インターフェロン（複数可）が、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－ω及びインターフェロン－τからなる群から選択される、請求項３８～４２のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  44. 前記インターフェロンがインターフェロン－αである、請求項４３に記載のＡＣＣ。
  45. 前記インターフェロン（複数可）が、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂ及びインターフェロンα－ｎ３からなる群から選択される、請求項４４に記載のＡＣＣ。
  46. 前記インターフェロン（複数可）がインターフェロンα－２ｂである、請求項４５に記載のＡＣＣ。
  47. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項４６に記載のＡＣＣ。
  48. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項４７に記載のＡＣＣ。
  49. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、配列番号１の配列を含む、請求項４８に記載のＡＣＣ。
  50. 前記インターフェロンがインターフェロンβである、請求項４３に記載のＡＣＣ。
  51. 前記インターフェロンβが、インターフェロンβ－１ａ及びインターフェロンβ－１ｂからなる群から選択される、請求項５０に記載のＡＣＣ。
  52. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、ＩＦａｂドメインを含む、請求項１～５１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  53. 前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２が、インターロイキンを含む、請求項１～３８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  54. 前記インターロイキンが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６及びＩＬ－１７からなる群から選択される、請求項５３に記載のＡＣＣ。
  55. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ２のそれぞれが、合計約３個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸を含む、請求項１～５４のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  56. 前記ＣＭ１、前記ＣＭ２、前記ＣＭ３及び前記ＣＭ４の１個以上が、異なるプロテアーゼの基質を含む、請求項１～５５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  57. 前記ＣＭ１、前記ＣＭ２及び前記ＣＭ３が、同一のプロテアーゼの基質を含む、請求項１～５６のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  58. 前記プロテアーゼ（複数可）が、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツベイン－２（Ｏｔｕｂａｉｎ－２）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン（ｍａｒａｐｓｉｎ）、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３及びＴＭＰＲＳＳ４からなる群から選択される、請求項１～５７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  59. 前記プロテアーゼ（複数可）が、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、及びＭＭＰ－１４からなる群から選択される、請求項５８に記載のＡＣＣ。
  60. 前記ＣＭ１、前記ＣＭ２、前記ＣＭ３及び／または前記ＣＭ４が、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５）、ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号６）、ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号７）、ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号８）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）、ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）、ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）、ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）、ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）、ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）、ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）、ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）、ＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３１）、ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３２）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３４）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３５）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３６）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号３７）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号４１）、ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）、ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）、ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）、ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）、ＩＳＳＧＬ（配列番号４６）、ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４７）、ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５１）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５２）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５６）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６１）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６２）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６４）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６５）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６６）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６９）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７２）、ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）、ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）、ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）、ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）、ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）、ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）、ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）、ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）、ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）、ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）、ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）、ＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号８５）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号８６）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号８７）、ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号８８）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号８９）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号９０）、ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号９１）、ＲＧＰＡ（配列番号９２）、ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号９３）、ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号９４）、ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号９５）、ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号９６）、ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号９７）、ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号９８）、ＰＬＧＬ（配列番号９９）、及びＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）からなる群から選択される配列を含む、請求項１～５７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  61. 前記ＣＭ１、前記ＣＭ２、前記ＣＭ３及び／または前記ＣＭ４が、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）、及びＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群から選択される配列を含む、請求項６０に記載のＡＣＣ。
  62. 前記プロテアーゼ（複数可）が、対象の腫瘍によって産生される、請求項１～６１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  63. 前記対象が、がんを有すると診断または特定されている、請求項６２に記載のＡＣＣ。
  64. 前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１が、前記第１のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、請求項１～６３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  65. 前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１が、前記第１のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、請求項１～６４のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  66. 前記ＣＰ２及び前記ＣＭ２が、前記第２のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、請求項１～６５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  67. 前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２が、前記第２のモノマー構成体において、互いに直接的に隣接する、請求項１～６６のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  68. 前記第１のモノマー構成体が、少なくとも１個のリンカーを含む、請求項１～６３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  69. 前記少なくとも１個のリンカーが、前記ＰＭ１と前記ＣＭ３との間に配置されたリンカーＬ１及び／または前記ＣＭ３と前記ＣＰ１との間に配置されたリンカーＬ２である、請求項６８に記載のＡＣＣ。
  70. 前記第２のモノマー構成体が、少なくとも１個のリンカーを含む、請求項６８に記載のＡＣＣ。
  71. 前記少なくとも１個のリンカーが、前記ＰＭ２と前記ＣＭ４との間に配置されたリンカーＬ３及び／または前記ＣＭ４と前記ＣＰ２との間に配置されたリンカーＬ４である、請求項７０に記載のＡＣＣ。
  72. 前記第１のモノマー構成体がリンカーＬ１を含み、前記第２のモノマー構成体がリンカーＬ３を含む、請求項７１に記載のＡＣＣ。
  73. Ｌ１及びＬ３が同一である、請求項７２に記載のＡＣＣ。
  74. 前記第１のモノマー構成体がリンカーＬ２を含み、前記第２のモノマー構成体がリンカーＬ４を含む、請求項７１に記載のＡＣＣ。
  75. Ｌ２及びＬ４が同一である、請求項７４に記載のＡＣＣ。
  76. 各リンカーが、１個のアミノ酸～約１５個のアミノ酸の全長を有する、請求項６８～７５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  77. 各リンカーが、少なくとも５個のアミノ酸の全長を有する、請求項７６に記載のＡＣＣ。
  78. 前記第１のモノマー構成体が、少なくとも１個のリンカーを含み、各リンカーは独立して、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）；ＧＧＧＳ（配列番号２）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）；ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）；ＧＳ；ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）；ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）；ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）；ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）；ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、各ｎは少なくとも１である整数である；ＧＧＳＧ（配列番号２２９）；ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）；ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１；ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）；ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）；ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；ＳＧＧＧ（配列番号３２７）；及びＳＧＧＧＧ（配列番号４９２）からなる群から選択される、請求項６８に記載のＡＣＣ。
  79. 前記リンカーが、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む、請求項７８に記載のＡＣＣ。
  80. 前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含む、請求項１～７９のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  81. 前記第１のポリペプチドが、Ｃ末端からＮ末端方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含む、請求項１～７９のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  82. 前記第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端方向で、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む、請求項１～８１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  83. 前記第２のポリペプチドが、Ｃ末端からＮ末端方向で、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２及び前記ＤＤ２を含む、請求項１～８２のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  84. 前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が同一であり、前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のそれぞれが、１個のみのペプチドマスクを有する、請求項１～３６、３８、３９または４１～８３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  85. 前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端方向で、前記ＰＭ１、任意選択的リンカー、前記ＣＭ３、任意選択的リンカー、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含み、前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１が互いに直接的に隣接し、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１が互いに直接的に隣接し、前記ＣＭ１が１０個以下のアミノ酸のペプチドであり、前記第２のモノマー構成体が前記第１のモノマー構成体と同一であり、前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が、少なくとも２個のジスルフィド結合を介して、互いに共有結合されている、請求項１～７９のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  86. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２がそれぞれ、ＥＵナンバリングに準拠して番号を付けたとき、システイン２１６でＮ末端を有するヒトＦｃドメインである、請求項８５に記載のＡＣＣ。
  87. 前記ＣＭ１が、７個以下のアミノ酸のペプチドである、請求項８５または８６に記載のＡＣＣ。
  88. 前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８５～８７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  89. 少なくとも１つのＣＰ１及び／またはＣＰ２の活性の対照レベルと比較して、ＣＰ１及び／またはＣＰ２の少なくとも１つの低減した活性レベルを有することを特徴とする、請求項１～８８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  90. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２活性が、リンパ腫細胞の増殖レベルである、請求項８９に記載のＡＣＣ。
  91. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２活性が、リンパ腫細胞における、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路の活性化レベルである、請求項８９に記載のＡＣＣ。
  92. 前記少なくとも１つの活性が、リンパ腫細胞における、ＳＥＡＰの産生レベルである、請求項８９に記載のＡＣＣ。
  93. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも２倍低いことを特徴とする、請求項８９に記載のＡＣＣ。
  94. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも５倍低いことを特徴とする、請求項９３に記載のＡＣＣ。
  95. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも１０倍低いことを特徴とする、請求項９４に記載のＡＣＣ。
  96. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性が、前記対照のレベルと比較して、少なくとも５００倍低いことを特徴とする、請求項９５に記載のＡＣＣ。
  97. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性の前記対照レベルが、前記ＡＣＣを前記プロテアーゼ（複数可）に曝露した後の、前記ＡＣＣの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の活性である、請求項８９～９５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  98. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の前記対照レベルが、対応する野生型成熟サイトカインの、対応する前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２活性である、請求項８９～９７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  99. 前記ＡＣＣが、前記プロテアーゼ（複数可）への曝露後に切断産物を生成することを特徴とし、前記切断産物が、前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の活性を含む、請求項８９～９８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  100. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の活性が、抗増殖活性である、請求項９９に記載のＡＣＣ。
  101. 前記対照レベルがＥＣ５０値であり、ＥＣ５０（対照レベル）に対するＥＣ５０（切断産物）の比率が、約１０未満、または約９未満、または約８未満、または約７未満、または約６未満、または約５未満、または約４未満、または約３未満、または約２未満、または約１．５未満、または約１．０未満である、請求項１００に記載のＡＣＣ。
  102. 前記第１のモノマー構成体は、前記ＣＰ１及び前記ＤＤ１が、１２個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１２個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ３を含有することを特徴とする、請求項１～１０１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  103. 前記第２のモノマー構成体は、前記ＣＰ２及び前記ＤＤ２が、１２個以下のアミノ酸の連結領域によって連結され、前記１２個以下のアミノ酸の連結領域が前記ＣＭ２を含有することを特徴とする、請求項１～１０２のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  104. 前記ＰＭ１が、５０個未満のアミノ酸を含む、請求項１～１０３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  105. 前記ＰＭ２が、５０個未満のアミノ酸を含む、請求項２～１０４のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  106. 前記ＰＭ１及び前記ＰＭ２のそれぞれが、１９個未満のアミノ酸である、請求項１０５に記載のＡＣＣ。
  107. 前記ＰＭ１が潜在型関連ペプチドではなく、かつ前記ＰＭ２が潜在型関連ペプチドではない、請求項１～１０３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  108. 前記ＰＭ１がサイトカインではなく、かつ前記ＰＭ２がサイトカインではない、請求項１～１０３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  109. 前記ＰＭ１がサイトカインの受容体ではなく、かつサイトカインの受容体のフラグメントではない、請求項１～１０３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  110. 前記ＰＭ２がサイトカインの受容体ではなく、かつサイトカインの受容体のフラグメントではない、請求項１～１０３及び１０９のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  111. 前記ＰＭ１がアルブミンではなく、かつ前記ＰＭ２がアルブミンではない、請求項１～１０３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  112. 請求項１～１１１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣを含む、組成物。
  113. 薬学的組成物である、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 請求項１１２または１１３に記載の組成物の、少なくとも１回の用量を含む、容器、バイアル、シリンジ、注射ペンまたはキット。
  115. 治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の、請求項１～９６のいずれか１項に記載のＡＣＣ、または請求項１１２もしくは１１３に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  116. 前記対象が、がんを有すると特定または診断されている、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記がんがリンパ腫である、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記リンパ腫が、バーキットリンパ腫である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 請求項１～１１１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣの、前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１を含むポリペプチドをコードする核酸。
  120. 前記ポリペプチドが、請求項１～２１または請求項２８～１１１のいずれか１項または組み合わせに記載のＤＤ１をさらに含む、請求項１０９に記載の核酸。
  121. 請求項１～１１１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣの、前記ＣＰ２及び前記ＣＭ２を含むポリペプチドをコードする核酸。
  122. 前記ポリペプチドが、請求項１～２１または請求項２８～１１１のいずれか１項または組み合わせに記載のＤＤ２をさらに含む、請求項１１１に記載の核酸。
  123. 請求項１１９～１２２のいずれか１項または組み合わせに記載の核酸を含む、ベクター。
  124. 発現ベクターである、請求項１２３に記載のベクター。
  125. 請求項１１９～１２２のいずれか１項もしくは組み合わせに記載の核酸、または請求項１２３もしくは１２４に記載のベクターを含む、細胞。
  126. 請求項１～１１１のいずれか１項または組み合わせに記載の、第１のモノマー構成体の前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１を含むポリペプチドと、第２のモノマー構成体の前記ＣＰ２及び前記ＣＭ２を含むポリペプチドと、を一緒になってコードする１対の核酸。
  127. 請求項１２６に記載の１対の核酸を一緒になって含む、１対のベクター。
  128. １対の発現ベクターである、請求項１２７に記載の１対のベクター。
  129. 請求項１２６に記載の１対の核酸、または請求項１２７もしくは１２８に記載の１対のベクターを含む、細胞。
  130. ＡＣＣを作製する方法であって、
    ａ．請求項１２５または１２９に記載の細胞を、液体培地中で、前記ＡＣＣを作製するのに十分な条件下にて培養することと、
    ｂ．前記細胞または前記液体培地から前記ＡＣＣを回収することと、
    を含む、前記方法。
  131. 前記細胞または前記液体培地から回収した前記ＡＣＣを単離することをさらに含む、請求項１３０に記載の方法。
  132. 単離した前記ＡＣＣを薬学的組成物に調製することをさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. 請求項１３０に記載の方法によって作製されるＡＣＣ。
  134. 請求項１３３に記載のＡＣＣを含む組成物。
  135. 薬学的組成物である、請求項１３４に記載の組成物。
  136. 請求項１３４または１３５に記載の組成物の、少なくとも１回の用量を含む、容器、バイアル、シリンジ、注射ペンまたはキット。
  137. 前記少なくとも１つの前記ＣＰ１及び前記ＣＰ２活性が、表面プラズモン共鳴を使用して決定される、その同族の受容体に対する前記ＣＰ１及び／または前記ＣＰ２の結合親和性である、請求項８９～１０１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  138. 第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含む活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
    （ａ）前記第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含むポリペプチドであり、
    （ｂ）前記第２のモノマー構成体が、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）と、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の及び第４の開裂可能部分（ＣＭ２及びＣＭ４）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含むポリペプチドであり、
    （ｃ）前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端の方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含み、さらに、
    （ｉ）前記ＰＭ１は２０個以下のアミノ酸を含み、かつ前記ＣＰ１に結合し、
    （ｉｉ）前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１は互いに直接的に隣接し、
    （ｉｉｉ）前記ＣＰ１及び前記ＣＭ１は互いに直接的に隣接し、
    （ｉｖ）前記ＣＭ１は１２個以下のアミノ酸を含み、
    （ｖ）前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３はプロテアーゼの基質として機能し、
    （ｖｉ）前記ＣＰ１は成熟インターフェロンであり、
    （ｄ）さらに、
    （ｉ）前記第２のモノマー構成体は、前記第１のモノマー構成体と同一であり、
    （ｉｉ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２は、１対のヒトＩｇＧのＦｃドメインであり、
    （ｉｉｉ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して互いに結合し、それによって前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のホモ二量体を形成し、
    （ｅ）対応する野生型インターフェロンまたは対応するペグ化インターフェロンと比較して、インターフェロン活性の低減したレベルを有することを特徴とする、
    前記活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）。
  139. 前記ＣＰ１が成熟インターフェロンαであり、前記ＰＭ１が配列番号３２３と少なくとも８５％同一である配列を含む、請求項１３８に記載のＡＣＣ。
  140. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３が、それぞれ独立して、ウロキナーゼ（ｕＰａ）及び／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の基質として機能する、請求項１３８または１３９に記載のＡＣＣ。
  141. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３が、それぞれ独立して、ウロキナーゼ（ｕＰａ）及び／またはＭＭＰ－１４の基質として機能する、請求項１４０に記載のＡＣＣ。
  142. 前記成熟インターフェロンが、成熟ヒトインターフェロンαである、請求項１３８～１４１のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  143. 前記成熟インターフェロンαが、成熟インターフェロンα－２ｂである、請求項１３８～１４２のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  144. 前記成熟インターフェロンαが、野生型成熟インターフェロンα－２ｂのトランケート形態である、請求項１３８～１４３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  145. 前記成熟インターフェロンが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１３８～１４４のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  146. 前記成熟インターフェロンが、配列番号１の配列を含む、請求項１３８～１４５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  147. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、８個以下のアミノ酸を含む、請求項１３８～１４６のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  148. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３が同一である、請求項１３８～１４７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  149. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、配列番号４１と少なくとも８５％同一である配列を含む、請求項１３８～１４８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  150. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、配列番号４１、配列番号６８及び配列番号１００からなる群から選択される配列を含む、請求項１３８～１４８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  151. 前ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、１対のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１３８～１５０のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  152. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、ＥＵナンバリングによって番号を付けたとき、システイン２２６のＮ末端側でトランケートされた、１対のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１５１に記載のＡＣＣ。
  153. 前記ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングによって番号を付けたとき、Ｓ２２８Ｐの変異を含む、請求項１５１または１５２に記載のＡＣＣ。
  154. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２がそれぞれ、配列番号３と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１３８～１５３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  155. 前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２がそれぞれ、配列番号３の配列を含む、請求項１３８～１５４のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  156. 前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が、少なくとも２個のジスルフィド結合を介して互いに共有結合している、請求項１３８～１５５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  157. 前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体が、少なくとも３個のジスルフィド結合を介して互いに共有結合している、請求項１５６に記載のＡＣＣ。
  158. 前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端において第１のシグナル配列をさらに含み、前記第２のモノマー構成体が、Ｎ末端において第２のシグナル配列をさらに含む、請求項１３８～１５７のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  159. 前記第１のシグナル配列及び前記第２のシグナル配列がそれぞれ、配列番号２４４と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１５８に記載のＡＣＣ。
  160. 前記第１のシグナル配列及び前記第２のシグナル配列がそれぞれ、配列番号２４４の配列を含む、請求項１５９に記載のＡＣＣ。
  161. 前記第１のモノマー構成体が、前記第１のシグナル配列と前記ＰＭ１との間に置かれる第１のスペーサーをさらに含み、前記第２のモノマー構成体が、前記第２のシグナル配列と前記ＰＭ２との間に置かれる第２のスペーサーをさらに含み、前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のそれぞれが、１個のみのペプチドマスクを有する、請求項１５８～１６０のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  162. 前記第１のスペーサー及び前記第２のスペーサーがそれぞれ、配列番号２５６と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１６１に記載のＡＣＣ。
  163. 前記第１のスペーサー及び前記第２のスペーサーがそれぞれ、配列番号２５６の配列を含む、請求項１６２に記載のＡＣＣ。
  164. 前記ＰＭ１と前記ＣＭ３との間のリンカーＬ１、及び／または前記ＣＭ３と前記ＣＰ１との間のリンカーＬ２をさらに含み、前記Ｌ１及び前記Ｌ２が、それぞれ独立して、配列番号２７（ｎ＝１）と少なくとも８０％同一である配列、配列番号３２４と少なくとも８０％同一である配列を含む、または存在しない、請求項１３８～１６３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  165. 前記Ｌ１が配列番号２７（ｎ＝１）の配列を含み、前記Ｌ２が配列番号３２４の配列を含む、請求項１６４に記載のＡＣＣ。
  166. １２個以下のアミノ酸を含む連結領域を含む、請求項１３８～１６５のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  167. 前記連結領域が、７～１２個のアミノ酸を含む、請求項１６６に記載のＡＣＣ。
  168. 前記連結領域が、７個のアミノ酸を含む、請求項１６６に記載のＡＣＣ。
  169. 野生型インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも２０００倍の低減を特徴とする、請求項１３８～１６８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  170. 野生型インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも４０００倍の低減を特徴とする、請求項１６９に記載のＡＣＣ。
  171. 野生型インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも５０００倍の低減を特徴とする、請求項１７０に記載のＡＣＣ。
  172. ペグ化インターフェロンαと比較して、インターフェロンα活性の少なくとも２０００倍の低減を特徴とする、請求項１３８～１６８のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  173. 前記インターフェロン活性の低減が、リンパ腫細胞の抗増殖アッセイにおいて、前記ＡＣＣのＥＣ５０を、前記野生型インターフェロンまたは前記ペグ化インターフェロンのＥＣ５０と比較することによって決定される、請求項１３８～１７２のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  174. 前記インターフェロン活性の低減が、インターフェロン反応性ＨＥＫ２９３細胞中の、分泌型胚性アルカリフォスファターゼ産生誘発のアッセイにおいて、前記ＡＣＣのＥＣ５０を、前記野生型インターフェロンまたは前記ペグ化インターフェロンのＥＣ５０と比較することによって決定される、請求項１３８～１７３のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。
  175. ＣＭ１及びＣＭ３が基質として機能する前記プロテアーゼ（複数可）への曝露後に、切断産物を生成し、前記切断産物に対する、前記対応する野生型インターフェロンの前記インターフェロン活性の比率が約２未満であることをさらに特徴とする、請求項１３８～１７４のいずれかに記載のＡＣＣ。
  176. 前記切断産物のＥＣ５０が、前記対応する野生型インターフェロンのＥＣ５０とほぼ同一である、請求項１７５に記載のＡＣＣ。
  177. 前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体がそれぞれ、配列番号３２１と少なくとも９５％同一である配列を含む、または前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のそれぞれが、配列番号３２１の配列を含み、前記ＡＣＣが、野生型インターフェロンα－２ｂと比較して、インターフェロン活性の少なくとも１０００倍の低減を特徴とし、前記ＡＣＣが、ｕＰＡへの曝露後に、切断産物を生成することをさらに特徴とし、前記切断産物が、野生型インターフェロンα－２ｂとほぼ同一のインターフェロン活性を有し、インターフェロン活性が、リンパ腫細胞の抗増殖アッセイにおいて、またはインターフェロン反応性ＨＥＫ２９３細胞中の、分泌型胚性アルカリフォスファターゼ産生誘発アッセイにおいて測定される、請求項１３８に記載のＡＣＣ。
  178. 第１のモノマー構成体及び第２のモノマー構成体を含む活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）であって、
    （ａ）前記第１のモノマー構成体が、第１のペプチドマスク（ＰＭ１）と、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）と、第１の及び第３の開裂可能部分（ＣＭ１及びＣＭ３）と、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ１）と、を含み、
    （ｂ）前記第２のモノマー構成体が、第２のペプチドマスク（ＰＭ２）と、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）と、第２の及び第４の開裂可能部分（ＣＭ２及びＣＭ４）と、第２の二量体化ドメイン（ＤＤ２）と、を含むポリペプチドであり、
    （ｃ）前記第１のモノマー構成体が、Ｎ末端からＣ末端の方向で、前記ＰＭ１、前記ＣＭ３、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１を含むポリペプチドであり、さらに、
    （ｉ）前記ＰＭ１は配列番号３２３と少なくとも８５％同一である配列を含み、
    （ｉｉ）前記ＣＭ１及び前記ＤＤ１は互いに直接的に隣接し、
    （ｉｉｉ）前記ＣＭ１は配列番号４１と少なくとも８５％同一である配列を含み、
    （ｉｖ）前記ＣＰ１は配列番号１と少なくとも８５％同一である配列を含み、
    （ｄ）さらに、
    （ｉ）前記第２のモノマー構成体は、前記第１のモノマー構成体と同一であり、
    （ｉｉ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２は、１対のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインであり、
    （ｅ）前記ＤＤ１及び前記ＤＤ２が、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して互いに共有結合し、それによって前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のホモ二量体を形成し、
    （ｆ）ペグ化インターフェロンα－２ｂのインターフェロンα活性と比較して、インターフェロンα活性の低減したレベルを有することを特徴とする、
    前記活性化可能サイトカイン構成体（ＡＣＣ）。
  179. 前記ＰＭ２が、配列番号３２３、３３１または３３２の１つと、少なくとも８５％、９０％または９５％同一である配列を含む、請求項１７８に記載のＡＣＣ。
  180. 前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体がそれぞれ、配列番号３２１と少なくとも９５％同一である配列を含む、または前記第１のモノマー構成体及び前記第２のモノマー構成体のそれぞれが、配列番号３２１の配列を含み、前記ＡＣＣが、野生型インターフェロンα－２ｂまたはペグ化インターフェロンα－２ｂのいずれかと比較して、インビボでより低い毒性を示す、請求項１３８に記載のＡＣＣ。
  181. 請求項１３８～１８０のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣを含む、組成物。
  182. 薬学的組成物である、請求項１８１に記載の組成物。
  183. 請求項１８１または１８２に記載の組成物の、少なくとも１回の用量を含む、容器、バイアル、シリンジ、注射ペンまたはキット。
  184. 治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の、請求項１３８～１７９のいずれか１項もしくは組み合わせに記載のＡＣＣ、または請求項１８１もしくは１８２に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  185. 前記対象が、がんを有すると特定または診断されている、請求項１８４に記載の方法。
  186. 請求項１３８～１７９のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣの前記第１のモノマーを含むポリペプチドをコードする核酸。
  187. 請求項１８６に記載の核酸を含む、ベクター。
  188. 発現ベクターである、請求項１８７に記載のベクター。
  189. 請求項１８６に記載の核酸、または請求項１８７もしくは１８８のベクターを含む、哺乳動物細胞。
  190. ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１８９に記載の哺乳動物細胞。
  191. 請求項１８９または１９０に記載の哺乳動物細胞中にＡＣＣを発現させることと、前記発現されたＡＣＣを精製することと、を含む、ＡＣＣを製造する方法。
  192. 前記ＣＭ１及び前記ＣＭ３がそれぞれ、腫瘍組織中に過剰発現するプロテアーゼの基質として機能する、請求項１３８～１８０のいずれか１項または組み合わせに記載のＡＣＣ。

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