CN111511764A - Clec9a结合剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地涉及结合Clec9A的剂以及所述剂作为诊断剂和治疗剂的用途。本发明进一步涉及包含所述Clec9A结合剂的药物组合物以及所述药物组合物在治疗各种疾病中的用途。

Description

CLEC9A结合剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月9日提交的美国临时专利申请号62/542,944的权益和优先权，所述申请的内容特此以引用方式整体并入。
技术领域
本发明部分地涉及结合Clec9A的结合剂及其作为治疗剂和诊断剂的用途。
以电子方式提交的文本文件的说明
与本文一起以电子方式提交的文本文件的内容以引用方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：ORN-033PC_ST25；创建日期：2018年8月8日；文件大小：808KB)。
背景技术
树突状细胞(DC)是抗原呈递细胞(APC)，这些细胞处理抗原并将抗原展示给免疫系统的其他细胞。具体而言，树突状细胞能够捕获抗原并且将所述抗原呈递在其表面上以激活T细胞，诸如细胞毒性T细胞(CTL)。此外，激活的树突状细胞能够募集额外的免疫细胞，诸如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞和T细胞(诸如天然杀伤T细胞)。
鉴于树突状细胞在免疫中的重要作用，树突状细胞的功能脱轨已牵涉到诸如癌症和自身免疫性疾病(诸如多发性硬化)的疾病中。举例来说，癌细胞可以通过防止树突状细胞募集和激活而损坏树突状细胞的功能性，从而逃避免疫检测和破坏。此外，在中枢神经系统发炎的过程中，在脑中发现了树突状细胞，这些树突状细胞可能参与了脑中自身免疫性疾病的发病机理。
因此，仍然需要通过修饰树突状细胞功能来治疗包括癌症和多发性硬化在内的疾病的改善疗法。
发明内容
在各个方面，本发明涉及具有至少一个特异性地结合至Clec9A的靶向部分的Clec9A结合剂。在各个实施方案中，这些Clec9A结合剂结合至Clec9A，但不在功能上调节(例如，部分或完全中和)Clec9A。因此，在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂用于例如将表达Clec9A的细胞直接或间接地募集至目标位点，同时仍允许表达Clec9A的细胞经由Clec9A进行信号传导(即，所述Clec9A结合剂的结合不会降低或消除所述目标位点处的Clec9A信号传导)。在一个实施方案中，所述靶向部分是单结构域抗体(VHH)。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂还包含信号传导剂，例如但不限于干扰素、白介素和肿瘤坏死因子，所述信号传导剂可以经过修饰以减弱活性。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合至其他目标靶标(例如抗原、受体)的另外的靶向部分。在一个实施方案中，所述其他目标靶标(例如抗原、受体)存在于肿瘤细胞上。在另一个实施方案中，所述其他目标靶标(例如抗原、受体)存在于免疫细胞上。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以将免疫细胞(例如树突状细胞)直接或间接地募集至作用位点(作为非限制性实例，诸如肿瘤微环境)。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂促进树突状细胞对抗原(例如肿瘤抗原)的呈递。
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可用于治疗各种疾病或病症，诸如癌症、感染、免疫病症以及其他疾病和病症，并且本发明涵盖各种治疗方法。
附图说明
图1描绘了66种不同的人Clec9A特异性VHH的核苷酸序列。引入缺口以便对准序列。给图1的序列指定如实施例1中所示的序列标识符。
图2示出了66种不同的人Clec9A特异性VHH的氨基酸序列。所指示的互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)是根据Kabat加以定义。引入缺口以便对准序列。以上66种不同的VHH属于25个不同的CDR3组(参见图3)。属于同一组的VHH非常相似，并且它们的氨基酸序列表明它们来自由于体细胞高频突变而产生的克隆相关的B细胞，或者来自相同B细胞但由于文库构建期间的RT和/或PCR误差而多样化。属于同一组的VHH识别相同表位，但它们的其他特征(例如亲和力、效能、稳定性、表达产率等)可能不同。给图2的序列指定如实施例1中所示的序列标识符。
图3提供了描绘属于25个不同的CDR3组的66种不同的VHH的表。
图4示出了各种VHH与经人Clec9A转染的Hek293 T细胞的结合。
图5示出了人树突状细胞pSTAT1信号传导测定。所研究的嵌合体是各种抗人Clec9A VHH/人IFNαR149A。研究了诸剂的两个剂量：100ng/ml和500ng/ml。PBS是对照物，并且数据表示为pSTAT1+树突状细胞的百分比的倍数变化(数据是一式三份数据集的平均值)。
图6示出了Clec9A靶向部分R1CHCL50、3LEC89以及它们的变体的纯化和产生。
图7A-图7B是示出了具有Clec9A靶向部分(R1CHCL50和3LEC89)和突变的人IFNα2(R149A)信号传导部分的嵌合蛋白针对HL116和HL116-hClec9A细胞的生物活性的图。
图8是示出了基于CLEC9A的AFN(例如2LEC16-hIFNa2_R149A、3LEC22-hIFNa2_R149A、1LEC28-hIFNa2_R149A、3LEC30-hIF Na2_R149A和3LEC89-hIFNa2_R149A)在具有RL肿瘤的具有人源化免疫系统的小鼠中的体内抗肿瘤活性的图。
具体实施方式
本发明部分地基于识别并结合至Clec9A的剂(例如抗体，作为非限制性实例，诸如VHH)的发现。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是具有一个或多个靶向部分和/或一种或多种信号传导剂的嵌合或融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，这些Clec9A结合剂结合至Clec9A，但不在功能上调节Clec9A。
在一些实施方案中，这些Clec9A结合剂可以结合免疫细胞并将所述免疫细胞直接或间接地募集至需要治疗作用的位点(例如肿瘤或肿瘤微环境)。在一些实施方案中，Clec9A结合剂增强肿瘤抗原呈递以引发有效的抗肿瘤免疫应答。
在一些实施方案中，Clec9A结合剂调节抗原呈递。在一些实施方案中，Clec9A结合剂调和免疫应答以避免或降低自身免疫性。在一些实施方案中，Clec9A结合剂提供免疫阻抑。在一些实施方案中，Clec9A结合剂使得患者的Treg与CD8+T细胞和/或CD4+T细胞的比率增加。在一些实施方案中，本发明的方法涉及减少患者的自身反应性T细胞。
本发明提供了包含所述Clec9A结合剂的药物组合物以及所述药物组合物在治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病中的用途。
Clec9A结合剂
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是能够特异性地结合至Clec9A的基于蛋白质的剂。在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是能够特异性地结合至Clec9A而不在功能上调节(例如，部分或完全中和)Clec9A的基于蛋白质的剂。Clec9A是专门用于吸收和处理来自死细胞的材料的在树突状细胞子集(即BDCA3+树突状细胞)的表面上表达的第V组C型凝集素样受体(CTLR)。Clec9A识别有核细胞和无核细胞内在细胞膜受损时得以暴露的保守组分。Clec9A在细胞表面表达为糖基化二聚体，并且可以介导内吞作用，而不是吞噬作用。Clec9A具有可以募集Syk激酶并且诱导促炎性细胞因子产生的基于细胞质免疫受体酪氨酸的激活样基序(参见Huysamen等人(2008),JBC,283:16693-701)。
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含具有抗原识别结构域的靶向部分，所述抗原识别结构域识别Clec9A上存在的表位。在一个实施方案中，所述抗原识别结构域识别Clec9A上存在的一个或多个线性表位。如本文所使用，线性表位是指Clec9A上存在的任何连续氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗原识别结构域识别Clec9A上存在的一个或多个构象表位。如本文所使用，构象表位是指形成具有能够被抗原识别结构域识别的特征和/或形状和/或三级结构的三维表面的一个或多个氨基酸区段(可能是不连续的)。
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以结合至人Clec9A的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体。在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以结合至人Clec9A的任何形式，包括单体形式、二聚体形式、异二聚体形式、多聚体形式和相关形式。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂结合至Clec9A的单体形式。在另一个实施方案中，所述Clec9A结合剂结合至Clec9A的二聚体形式。在另一个实施方案中，所述Clec9A结合剂结合至Clec9A的糖基化形式，所述糖基化形式可以是单体形式或二聚体形式。
在一个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含具有抗原识别结构域的靶向部分，所述抗原识别结构域识别人Clec9A上存在的一个或多个表位。在一个实施方案中，所述人Clec9A包含以下氨基酸序列：
MHEEEIYTSLQWDSPAPDTYQKCLSSNKCSGACCLVMVISCVFCMGLLTASIFLGVKLLQVSTIAMQQQEKLIQQERALLNFTEWKRSCALQMKYCQAFMQNSLSSAHNSSPCPNNWIQNRESCYYVSEIWSIWHTSQENCLKEGSTLLQIESKEEMDFITGSLRKIKGSYDYWVGLSQDGHSGRWLWQDGSSPSPGLLPAERSQSANQVCGYVKSNSLLSSNCSTWKYFICEKYALRSSV(SEQ ID NO:1)。
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含能够特异性结合的靶向部分。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含具有抗原识别结构域的靶向部分，诸如抗体或其衍生物。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是抗体。在各个实施方案中，所述抗体是包括两条重链和两条轻链的全长多聚体蛋白。每条重链包括一个可变区(例如VH)和至少三个恒定区(例如CH1、CH2和CH3)，并且每条轻链包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。可变区决定了抗体的特异性。每个可变区包括由四个相对保守的框架区(FR)侧接的三个高变区，也称为互补性决定区(CDR)。所述三个CDR(称为CDR1、CDR2和CDR3)有助于抗体结合特异性。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是抗体衍生物或抗体形式。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微量蛋白(半胱氨酸结蛋白、打结素(knottin))、DARPin；四连接素(Tetranectin)；Affibody；反式体(Transbody)；抗运载蛋白(Anticalin)；AdNectin；Affilin；Affimer；微型体(Microbody)；适体；奥特瑞斯(alterase)；塑性抗体；费洛体(phylomer)；斯塔都体(stradobody)；巨型体(maxibody)；伊维体(evibody)；菲诺体(fynomer)、犰狳重复蛋白、库尼茨型结构域(Kunitz domain)、高亲合性多聚体(avimer)、阿特里体(atrimer)、普罗体(probody)、免疫体(immunobody)、曲奥单抗(triomab)、特洛伊体(troybody)；佩普体(pepbody)；疫苗体(vaccibody)、单特异性体(UniBody)；双特异性体(DuoBody)、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、肽模拟分子或合成分子，如以下美国专利号或专利公布号中所描述：US 7,417,130、US 2004/132094、US 5,831,012、US 2004/023334、US 7,250,297、US 6,818,418、US 2004/209243、US 7,838,629、US 7,186,524、US 6,004,746、US 5,475,096、US 2004/146938、US 2004/157209、US 6,994,982、US 6,794,144、US 2010/239633、US 7,803,907、US 2010/119446和/或US 7,166,697，所述专利的内容特此以引用方式整体并入。还参见Storz MAbs.2011年5月-6月；3(3):310-317。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是单结构域抗体，诸如VHH。所述VHH可以来源于例如产生VHH抗体的生物体，诸如骆驼、鲨鱼，或者所述VHH可以是设计的VHH。VHH是抗体来源的治疗性蛋白质，它们含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能性质。VHH技术是基于来自骆驼的缺乏轻链的完全功能抗体。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。
在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含VHH。在一些实施方案中，所述VHH是人源化VHH或骆驼化VHH。
在一些实施方案中，所述VHH包含完全人VH结构域，例如HUMABODY(CrescendoBiologics,Cambridge,UK)。在一些实施方案中，完全人VH结构域(例如HUMABODY)是单价、二价或三价的。在一些实施方案中，所述完全人VH结构域(例如HUMABODY)是单特异性或多特异性的，诸如单特异性、双特异性或三特异性的。说明性的完全人VH结构域(例如HUMABODY)描述于例如WO2016/113555和WO2016/113557中，所述文献的全部内容以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是包含具有四个“框架区”或FR和三个“互补决定区”或CDR的单个氨基酸链的VHH。如本文所使用，“框架区”或“FR”是指可变结构域中位于CDR之间的区域。如本文所使用，“互补决定区”或“CDR”是指VHH中含有能够特异性地结合至抗原性靶标的氨基酸序列的可变区。
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含具有包含至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列的可变结构域的VHH。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含具有包含至少一个FR1、FR2、FR3和FR4序列的可变区的VHH。
在一些实施方案中，所述CDR1序列选自：
GRISSINSMG(SEQ ID NO:2)；GSITSINAMG(SEQ ID NO:3)；GRFFRVNAMG(SEQ ID NO:4)；GSSDSINAMG(SEQ ID NO:5)；GSVFSINAWG(SEQ ID NO:6)；GSILSINSMG(SEQ ID NO:7)；VSISSINSMG(SEQ ID NO:8)；GRVFSINAMG(SEQ ID NO:9)；VNIDTLNSMA(SEQ ID NO:10)；GGISSINSMG(SEQ ID NO:11)；GSMHSVNSMA(SEQ ID NO:12)；GDISSINAMG(SEQ ID NO:13)；GSIFSIDAMG(SEQ ID NO:14)；GSIFSINAMG(SEQ ID NO:15)；GSIFSIAAMG(SEQ ID NO:16)；GNIASITAMG(SEQ ID NO:17)；GFTFDDYAIG(SEQ ID NO:18)；GSISSINAMG(SEQ ID NO:19)；VSIFRSYFMG(SEQ ID NO:20)；GSIVSINAIG(SEQ ID NO:21)；RSFSSFNAMG(SEQ ID NO:22)；GSFSSINAMG(SEQ ID NO:23)；GTSFSINGMA(SEQ ID NO:24)；GRTFSTYAMG(SEQ ID NO:25)；GRIFDINAMG(SEQ ID NO:26)；GTLFSINGMA(SEQ ID NO:27)；GSIDSINAMG(SEQ ID NO:28)；GRAFSTNSMG(SEQ ID NO:29)；GSIISINSMG(SEQ ID NO:30)；RNFFSINAMG(SEQ ID NO:31)；GSIVSINSMG(SEQ ID NO:32)；GSIIGINSMG(SEQ ID NO:33)；GRTFPGYVMA(SEQ ID NO:34)；GRTFSINAMG(SEQ ID NO:35)；GRTLSSYTIG(SEQ ID NO:36)；GSFFSINAMG(SEQ ID NO:37)；GSIFSINSMG(SEQ ID NO:38)；GSIFSFNAMG(SEQ ID NO:39)；GRTFSTYAMA(SEQ ID NO:40)；VNIGSLNSMV(SEQ ID NO:41)；GRTLSNYAVG(SEQ ID NO:42)；GSVFSINAMG(SEQ ID NO:43)；GSIFEINSIG(SEQ ID NO:44)；GSIFNINSMG(SEQ ID NO:45)；VNIGTLNSMA(SEQ ID NO:46)；GRIGSINSMG(SEQ ID NO:47)；GRTLSNYAVA(SEQ ID NO:48)；RSFFSFNAMG(SEQ ID NO:49)；GIIFSINAMG(SEQ ID NO:50)；GRIFSVNAMG(SEQ ID NO:51)；GRTFSSYAMA(SEQ ID NO:52)；GSFSSINVMG(SEQ ID NO:53)；INSMG(SEQ ID NO:54)；INAMG(SEQ ID NO:55)；VNAMG(SEQ IDNO:56)；INAWG(SEQ ID NO:57)；LNSMA(SEQ ID NO:58)；VNSMA(SEQ ID NO:59)；IDAMG(SEQID NO:60)；IAAMG(SEQ ID NO:61)；SITAMG(SEQ ID NO:62)；DYAIG(SEQ ID NO:63)；SYFMG(SEQ ID NO:64)；INAIG(SEQ ID NO:65)；FNAMG(SEQ ID NO:66)；INGMA(SEQ ID NO:67)；TYAMG(SEQ ID NO:68)；TNSMG(SEQ ID NO:69)；GYVMA(SEQ ID NO:70)；SYTIG(SEQ ID NO:71)；TYAMA(SEQ ID NO:72)；LNSMV(SEQ ID NO:73)；NYAVG(SEQ ID NO:74)；INSIG(SEQ IDNO:75)；NYAVA(SEQ ID NO:76)；SYAMA(SEQ ID NO:77)；和INVMG(SEQ ID NO:78)。
在一些实施方案中，所述CDR2序列选自：
AITNGGAKTYADSVKG(SEQ ID NO:79)；AITSGGRLSYAD SVKG(SEQ ID NO:80)；AITNGGQTAYADSVKG(SEQ ID NO:81)；AITSGGRSTYIDSAKG(SEQ ID NO:82)；AITNQGRIAYAPSVNG(SEQ ID NO:83)；AITNDGRTTYVDSVKG(SEQ ID NO:84)；AVTVGGRYAYADSAKN(SEQ ID NO:85)；AITNQGATTYADSVKG(SEQ ID NO:86)；GITGSGQITYANSVRG(SEQ ID NO:87)；AITNGGRTVYGDSVKG(SEQ ID NO:88)；AITSGGRLAYAPSVNG(SEQ ID NO:89)；AITNGGRTTYVDSVKG(SEQ ID NO:90)；AITTGGRTTYVDSVKG(SEQ ID NO:91)；AITNQGRLTYADSVKG(SEQ ID NO:92)；AITSGGRRAYADSVKG(SEQ ID NO:93)；AITSASASRTTYADSVKG(SEQ ID NO:94)；CISRSDGSTYYDDSVKG(SEQ ID NO:95)；AITNQGRVTYADSVKG(SEQ IDNO:96)；AITDGGRLAYADSAKG(SEQ ID NO:97)；SITNQGIRNYSTSVMG(SEQ ID NO:98)；AITNQGRTTYADSVKG(SEQ IDNO:99)；AITNGGRIAYGIAVNG(SEQ ID NO:100)；AITNGGRIAYSDSAKG(SEQ ID NO:101)；GITSDGSTGYADSVKG(SEQ ID NO:102)；AISWSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:103)；AITDQGRLAYADSAKG(SEQ ID NO:104)；AITNGGQTTYADSVKG(SEQ ID NO:105)；AITTGGRTAYVDSVKG(SEQ ID NO:106)；AITSQGRITLADSVKG(SEQ ID NO:107)；AITVDGRLAYADSAKH(SEQ ID NO:108)；AITNGGRIAYGTSVMG(SEQ ID NO:109)；AITNGGQIAYADSVKG(SEQ ID NO:110)；AITDQGRTTYADSVKG(SEQ ID NO:111)；GITTQGRITYGNSVRG(SEQ ID NO:112)；AITSGGRTTYVDSVKG(SEQ ID NO:113)；AINWRGGDTYYADSVKG(SEQ ID NO:114)；AITDGGAKTYADSVKG(SEQ IDNO:115)；AITNQGRLSYVDSVKG(SEQ ID NO:116)；AITNQGRRTYADSVKG(SEQ ID NO:117)；AITNGGRIAYTDSVKG(SEQ ID NO:118)；AITNGGRTTYADSVKG(SEQ ID NO:119)；AITDGGRLTYADSAKG(SEQ ID NO:120)；AISWSGGSTEYHDSVKG(SEQ ID NO:121)；AITNQGRIAYADSVKG(SEQ ID NO:122)；AINWSSGGISYSNSAKG(SEQ ID NO:123)；AITGQGRTTYADSVKG(SEQ ID NO:124)；AITNGGQIVYADSVKG(SEQ ID NO:125)；AITTQGRTTYEDSVKG(SEQ ID NO:126)；AITSGGITNYANSVQG(SEQ ID NO:127)；AITVGGRLAYADSAKG(SEQ ID NO:128)；GITGGGQITYANSVRG(SEQ ID NO:129)；AITSQGRSTYADSAKG(SEQ ID NO:130)；AITNGGATVYADSVKG(SEQ ID NO:131)；AITDGGRLTYADSAKN(SEQ ID NO:132)；AINWSSGGISYSNAAKG(SEQ ID NO:133)；AITNXGRTTYADSVKG(SEQ ID NO:134)；AIWWASGGISYANSAKG(SEQ ID NO:135)；AITNQGAPTYADSVKG(SEQ ID NO:136)；RITNLGLPNYADSVTG(SEQ IDNO:137)；RITNLGLPNYADSVKG(SEQ ID NO:138)；AITNGGAKT(SEQID NO:139)；AITSGGRLS(SEQ ID NO:140)；AITNGGQTA(SEQ ID NO:141)；AITSGGRST(SEQ IDNO:142)；ITNQGRIA(SEQ ID NO:143)；ITNQGRIAYAPSVNG(SEQ ID NO:144)；AITNDGRTT(SEQID NO:145)；AVTVGGRYA(SEQ IDNO:146)；AITNQGATT(SEQ ID NO:147)；GITGSGQIT(SEQ IDNO:148)；AITNGGRTV(SEQ ID NO:149)；AITSGGRLA(SEQ ID NO:150)；AITNGGRTT(SEQ IDNO:151)；AITTGGRTT(SEQ ID NO:152)；AITNQGRLT(SEQ ID NO:153)；AITSGGRRA(SEQ IDNO:154)；AITSASASRTT(SEQ ID NO:155)；CISRSDGSTY(SEQ ID NO:156)；AITNQGRVT(SEQ IDNO:157)；AITDGGRLA(SEQ ID NO:158)；SITNQGIRN(SEQ ID NO:159)；AITNQGRTT(SEQ IDNO:160)；AITNGGRIA(SEQ ID NO:161)；GITSDGSTG(SEQ ID NO:162)；AISWSGGSTY(SEQ IDNO:163)；AITDQGRLA(SEQ ID NO:164)；AITNGGQTT(SEQ ID NO:165)；AITTGGRTA(SEQ IDNO:166)；AITSQGRIT(SEQ ID NO:167)；AITVDGRLA(SEQ ID NO:168)；AITNGGQIA(SEQ IDNO:169)；AITDQGRTT(SEQ ID NO:170)；GITTQGRIT(SEQ ID NO:171)；AITSGGRTT(SEQ IDNO:172)；AINWRGGDTY(SEQ ID NO:173)；AITDGGAKT(SEQ ID NO:174)；AITNQGRLS(SEQ IDNO:175)；AITNQGRRT(SEQ ID NO:176)；AITDGGRLT(SEQ ID NO:177)；AISWSGGSTE(SEQ IDNO:178)；AITNQGRIA(SEQ ID NO:179)；AINWSSGGIS(SEQ ID NO:180)；AITGQGRTT(SEQ IDNO:181)；AITNGGQIV(SEQ ID NO:182)；AITTQGRTT(SEQ ID NO:183)；AITSGGITN(SEQ IDNO:184)；AITVGGRLA(SEQ ID NO:185)；GITGGGQIT(SEQ ID NO:186)；AITSQGRST(SEQ IDNO:187)；AITNGGATV(SEQ ID NO:188)；AITNXGRTT(SEQ ID NO:189)；AIWWASGGIS(SEQ IDNO:190)；AITNQGAPT(SEQ ID NO:191)；和RITNLGLPN(SEQ ID NO:192)。
在一些实施方案中，所述CDR3序列选自：
FTRRDDY(SEQ ID NO:193)；FQSSGID(SEQ ID NO:194)；WAADYQQY(SEQ ID NO:195)；WNRDRQQY(SEQ ID NO:196)；KPTPVYGSTVGDY(SEQ ID NO:197)；FTRDKDY(SEQ ID NO:198)；WDRDRQQY(SEQ ID NO:199)；FTRTDDY(SEQ ID NO:200)；YDRSSTPY(SEQ ID NO:201)；FTRGDDY(SEQ ID NO:202)；LNSATTY(SEQ ID NO:203)；YTRDEDY(SEQ ID NO:204)；FTRDEDY(SEQ ID NO:205)；KWYDPLVIEYYDN(SEQ ID NO:206)；KADHNDY(SEQ ID NO:207)；FRSGADDY(SEQ ID NO:208)；EVPSTYSCSGFREDY(SEQ ID NO:209)；FAASGMEY(SEQ ID NO:210)；WTTDRQQY(SEQ ID NO:211)；FAGWGKEDY(SEQ ID NO:212)；FSPTGDY(SEQ ID NO:213)；KPTPVYGSTVGDY(SEQ ID NO:214)；KASPVYGSTVEDY(SEQ ID NO:215)；STPRGDSY(SEQ ID NO:216)；EAEGSGREGNFYERS(SEQ ID NO:217)；WDRDRQQY(SEQ ID NO:218)；FTRSDDY(SEQ IDNO:219)；STPRGDSY(SEQ ID NO:220)；FTRDTDY(SEQ ID NO:221)；WTTLGTF(SEQ ID NO:222)；WVRDGQQY(SEQ ID NO:223)；KAIPVYGSTVEDY(SEQ ID NO:224)；KAAATHLSTVADY(SEQID NO:225)；FGRFDDY(SEQ ID NO:226)；WGVKTGPESGSGTL(SEQ ID NO:227)；FTRDEDY(SEQID NO:228)；RLTTEYDYAY(SEQ ID NO:229)；FTRGNDY(SEQ ID NO:230)；FQSSGID(SEQ IDNO:231)；FSPTDDF(SEQ ID NO:232)；KAIPIYGSTAEDY(SEQ ID NO:233)；FSLTDDY(SEQ IDNO:234)；WTRDRQQY(SEQ ID NO:235)；FTRDEDF(SEQ ID NO:236)；EVEGSGREGNFYGA(SEQ IDNO:237)；PGWDY(SEQ ID NO:238)；YDRSATAY(SEQ ID NO:239)；ASSVLSGTVDY(SEQ ID NO:240)；FAADGMEY(SEQ ID NO:241)；KAAASYVSTVADY(SEQ ID NO:242)；TAKDDY(SEQ ID NO:243)；FTGWGKEDY(SEQ ID NO:244)；WAADYQQY(SEQ ID NO:245)；YDRSATPY(SEQ ID NO:246)；WARDRQQY(SEQ ID NO:247)；WTKDRQQY(SEQ ID NO:248)；FTRTYDY(SEQ ID NO:249)；ASSILSGTVDY(SEQ ID NO:250)；WAADYQQY(SEQ ID NO:251)；KPAPVYGSTVGDY(SEQ ID NO:252)；FAADGMEY(SEQ ID NO:253)；FGSGGG(SEQ ID NO:254)；ASSVLSGTADY(SEQ ID NO:255)；VALKAEY(SEQ ID NO:256)；和EAEGSGREGNFYERS(SEQ ID NO:257)。
在各个示例性实施方案中，所述Clec9A结合剂包含选自以下序列的氨基酸序列：
1LEC 7(SEQ ID NO:258)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSINSMGWYRQAPGNQRELVAAITNGGAKTYADSVKGRFTISTDNAGNTVYLQMDSLRPEDTAVYYCKAFTRRDDYWGQGTQITVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 9(SEQ ID NO:259)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSITSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITSGGRLSYADSVKGRFTISRDNAESTVALQMNSLKPEDTAVYSCAAFQSSGIDWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 26(SEQ ID NO:260)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRFFRVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGQTAYADSVKGRFTISKESARNTVHLQMSSLKPEDTAVYYCTIWAADYQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 27(SEQ ID NO:261)
QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCAASGSSDSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITSGGRSTYIDSAKGRATISRDNARNTAYLQMSSLKAEDTAVYYCTIWNRDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 28(SEQ ID NO:262)
QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAASGSVFSINAWGWYRQAPGKQRELVAAITNQGRIAYAPSVNGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAKPTPVYGSTVGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 30(SEQ ID NO:263)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSILSINSMGWYRPALGNQRELVAAITNDGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYWCKAFTRDKDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 38(SEQ ID NO:264)
QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASVSISSINSMGWYRQAPGKERELVAAVTVGGRYAYADSAKNRFTISRDDAQNTVHLQMSSLRAEDTAVYYCTIWDRDRQQYWGXGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 42(SEQ ID NO:265)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRVFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGATTYADSVKGRFTISRDTAGNTVYLQMNSLRPEDTAVHYCKAFTRTDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 51(SEQ ID NO:266)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASVNIDTLNSMAWYRQAPGKQRELVAGITGSGQITYANSVRGRFTVSRDNAKSTVYLQMNTLQPEDTAVYYCAAYDRSSTPYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 61(SEQ ID NO:267)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGISSINSMGWYRQAPGNQRELVAAITNGGRTVYGDSVKGRFTISRDSAGNTVHLQMDSLRPEDTGVYYCKAFTRGDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 62(SEQ ID NO:268)
QVQLQESGGGLVQPGGFLSLSCAASGSMHSVNSMAWYRQVPGKQRELVAAITSGGRLAYAPSVNGRFTISRDYAKNTIHLQMNSLEPEDTAVYYCAALNSATTYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 63(SEQ ID NO:269)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAATGDISSINAMGWHRPARGNERELVAAITNGGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKAYTRDEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 64(SEQ ID NO:270)
QVQLQESGGGLVRAGGSLRLSCAASGSIFSIDAMGWYRPAHGEQRELVAAITTGGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKAFTRDEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 70(SEQ ID NO:271)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGRLTYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMDSLKPEDTAVYYCNAKWYDPLVIEYYDNWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 84(SEQ ID NO:272)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSIAAMGWYRQAPGKQRELVAAITSGGRRAYADSVKGRFTISRDNDENTVALQMNSLKPEDTDVYYCNAKADHNDYWGQGTQITVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 88(SEQ ID NO:273)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAIGNIASITAMGWYRQAPGKQRELVAAITSASASRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCKGFRSGADDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 91(SEQ ID NO:274)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRQAPGKEHEGVSCISRSDGSTYYDDSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEVPSTYSCSGFREDYKGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 92(SEQ ID NO:275)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSISSINAMGWYRQAPGNQRELVAAITNQGRVTYADSVKGRFTISRDGAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKVFAASGMEYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
1LEC 94(SEQ ID NO:276)
QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCAASVSIFRSYFMGWYRQAPGKQRELVAAITDGGRLAYADSAKGRFTISREDTRNTVHLQMSSLKAEDTAVYYCTIWTTDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 6(SEQ ID NO:277)
QVQLQESGGGWVQPGGSLRLSCAATGSIVSINAIGWYRQAPGKQRELVASITNQGIRNYSTSVMGRFTISRDDVKNTVSLQMNSLKPEDSAVYYCKGFAGWGKEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 13(SEQ ID NO:278)
QVQLQESGGGLVQAGASLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLEPEDTAIYYCKGFSPTGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 16(SEQ ID NO:279)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCLASRSFSSFNAMGWYRQAPGKERELVAAITNGGRIAYGIAVNGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAKPTPVYGSTVGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 20(SEQ ID NO:280)
QVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSFSSINAMGYYRQAPGKQRELVAAITNGGRIAYSDSAKGRFTISRDSAKNTMYLQMNSLKPEDTDVYYCNAKASPVYGSTVEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 23(SEQ ID NO:281)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTSFSINGMAWYRQAPGGQRELVGGITSDGSTGYADSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCGTSTPRGDSYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 24(SEQ ID NO:282)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTYAMGWFRQAPGKERGLVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTIFRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEAEGSGREGNFYERSWYQGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHH；
2LEC 26(SEQ ID NO:283)
QVQLQESGGGLVETGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITDQGRLAYADSAKGRFTISRENARNTLHLQMSSLKAEDTAVYYCTIWDRDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 38(SEQ ID NO:284)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFDINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGQTTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRSDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 48(SEQ ID NO:285)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGTLFSINGMAWYRQAPGKRRELVGGITSDGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCGTSTPRGDSYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 53(SEQ ID NO:286)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIDSINAMGWYRPALGEQRELVAAITTGGRTAYVDSVKGRFTISRDAAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYSCKAFTRDTDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 54(SEQ ID NO:287)
QVQLQESGGGLAQPGGSLQLSCAASGRAFSTNSMGWYRQASGKQRELVAAITSQGRITLADSVKGRFTISSDNTKNTVFLQMNSLKPEDTAVYYCNAWTTLGTFGGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 55(SEQ ID NO:288)
QVQLQESGGGLVQTGESLSLSCAVASGSIISINSMGWYRQAPEKQRELVAAITVDGRLAYADSAKHRFTISKESARNTVHLHMSSLKPEDTAVYYCTIWVRDGQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 59(SEQ ID NO:289)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRNFFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGRIAYGTSVMGRFTISRDDAKNTVDLQMNSLRPEDTAVYYCNAKAIPVYGSTVEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 60(SEQ ID NO:290)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRFFRVNAMGWYRQVPGKQRELVAAITNGGQIAYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTDVYYCNAKAAATHLSTVADYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 61(SEQ ID NO:291)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIVSINSMGWYRQAPGKQRELVAAITDQGRTTYADSVKGRFTISRDDAKNKNTVYLQMNSLKAEDTAVYACKAFGRFDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 62(SEQ ID NO:292)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAYGSIFSINAMGWYRQAPGKERELVAGITTQGRITYGNSVRGRFTISGDNAKNTVYLQMKSLKPEDTAVYYCSAWGVKTGPESGSGTLEGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 63(SEQ ID NO:293)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIIGINSMGYYRTAPGKQRELVAAITSGGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKAFTRDEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 67(SEQ ID NO:294)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFPGYVMAWFRQSPGQEREFAAAINWRGGDTYYADSVKGRFTISRDNVKNTVFLQMNSLKPEDTAVYFCAARLTTEYDYAYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 68(SEQ ID NO:295)
QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITDGGAKTYADSVKGRFTISTDNAGNTVYLQMDSLRPEDTAVYYCKAFTRGNDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 76(SEQ ID NO:296)
QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCVVSGRTFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGRLSYVDSVKGRFTISRDNAANTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAFQSSGIDWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 83(SEQ ID NO:297)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTLSSYTIGWYRQAPGKQRELVAAITNQGRRTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKSEDTAVYYCKGFSPTDDFWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 88(SEQ ID NO:298)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGSFFSINAMGWYRQAPGNQRELVAAITNGGRIAYTDSVKGRFTISNDNAKNTVYLQMNSLKPEDTDVYYCNAKAIPIYGSTAEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 89(SEQ ID NO:299)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINSMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCKGFSLTDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 90(SEQ ID NO:300)
QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGSIFSFNAMGWYRQAPGKQRELVAAITDGGRLTYADSAKGRFTISRENTRNTVHLQMSSLKAEDTADYYCTIWTRDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 93(SEQ ID NO:301)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRPALGEQRELVAAITTGGRTTYVDSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKAFTRDEDFWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
2LEC 95(SEQ ID NO:302)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTFSTYAMAWFRQAPGKERDLVAAISWSGGSTEYHDSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCAAEVEGSGREGNFYGASWYPGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHH；
3LEC 4(SEQ ID NO:303)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGRIAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGRPGWDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 6(SEQ ID NO:304)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASVNIGSLNSMVWYRQSPGKQRELVAGITGSGQITYANSVRGRFTVSRDIAKSTAYLQMNTLKPEDTAVYYCAAYDRSATAYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 9(SEQ ID NO:305)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRVSCAASGRTLSNYAVGWWRQAPGKQREFVAAINWSSGGISYSNSAKGRFALSRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAAASSVLSGTVDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 11(SEQ ID NO:306)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSISSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITGQGRTTYADSVKGRFTISRDGAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKVFAADGMEYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 13(SEQ ID NO:307)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRFFRVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGQIVYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCNAKAAASYVSTVADYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 15(SEQ ID NO:308)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSVFSINAMGWYRQAPEKQRELVAAITTQGRTTYEDSVKGRFTISRDGAQNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCKAWTAKDDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 22(SEQ ID NO:309)
QVQLQESGGGRVQPGGSLRLSCAAIGSIFEINSIGWYRQAPGKQRELVAAITSGGITNYANSVQGRSTISRDNVNNTVYLQMNSLKPEDSAVYYCKGFTGWGKEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 23(SEQ ID NO:310)
QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGSIFNINSMGWYRQAPGKQRELVAAITVGGRLAYADSAKGRFTISKESARNTVHLQMSSLKPEDTAVYYCTIWAADYQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 27(SEQ ID NO:311)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASVNIGTLNSMAWYREAPGKQRELVAGITGGGQITYANSVRGRFTVSRDIAKSTAYLQMNTLKPEDTAVYYCAAYDRSATPYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 30(SEQ ID NO:312)
QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGSIFSINSMGWYRQAPGKQRELVAAITSQGRSTYADSAKGRFTISLGNARNTVNLQMSSLKTEDTAVYYCTIWARDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 36(SEQ ID NO:313)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIGSINSMGWYRQAPGKQREMVAAITNGGATVYADSVKGRFTISRDNAGNTVDLHMNSLRPEDSAVYYCKAFTRGDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 55(SEQ ID NO:314)
QVQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGSIFSFNAMGWYRQAPGKQRELVAAITDGGRLTYADSAKNRFTISRENTRNTVHLQMSSLKAEDTAVYYCTIWTKDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 57(SEQ ID NO:315)
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3LEC 61(SEQ ID NO:316)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRVSCAASGRTLSNYAVAWFRQAPGKQREFVAAINWSSGGISYSNAAKGRFALSRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAAASSILSGTVDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 62(SEQ ID NO:317)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIGSINSMGWYRQAPGKQREMVAAITNGGATVYADSVKGRFTISRDNAGNTVDLHMNSLRPEDSAVYYCTIWAADYQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 66(SEQ ID NO:318)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSFFSFNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGRIAYGTSVMGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCNAKPAPVYGSTVGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 69(SEQ ID NO:319)
QVQLQESGGGLVQPGGSPRLSCAASGRFFRVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNGGQTAYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCKVFAADGMEYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 76(SEQ ID NO:320)
QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAASGIIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAITNXGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNAFGSGGGVGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 82(SEQ ID NO:321)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTLSNYAVAWFRQAPGKQRELVAAIWWASGGISYANSAKGRFVLSRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAAASSVLSGTADYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
3LEC 89(SEQ ID NO:322)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；或
3LEC 94(SEQ ID NO:323)
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGMERELVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEAEGSGREGNFYERSWYQGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH。
在各个示例性实施方案中，所述Clec9A结合剂包含选自以上提供的序列中的任一者而没有末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:324)。
在一些实施方案中，所述Clec9A靶向部分包含选自SEQ ID No:258-323(以上提供)而没有HA标签的氨基酸序列(即，YPYDVPDYGS；SEQ ID NO:325)。
在一些实施方案中，所述Clec9A靶向部分包含选自SEQ ID No:258-323(以上提供)而没有AAA接头(即AAA)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Clec9A靶向部分包含选自SEQ ID No:258-323(以上提供)而没有AAA接头、HA标签和末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即，AAAYPYDVPDYGSHHHHHHH；SEQ ID NO:326)。
在各个示例性实施方案中，所述Clec9A结合剂包含选自以下序列的氨基酸序列：
R1CHCL50：
QVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:327)；
R1CHCL50_opt1(E1D-A74S-K83R-Q108L)：
DVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:328)；
R1CHCL50_opt2(E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:329)；
R1CHCL50_opt3(E1D-A74S-K83R-Q108L-T64K)：
DVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:330)；
R1CHCL50_opt4(E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q-T64K)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:331)；
3LEC_89(野生型)：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:332)；
3LEC_89_opt1(E1D-Q5V-Q108L)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:333)；
3LEC_89_opt2(E1D-Q5V-Q108L-A74S)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:334)；
3LEC_89_opt3(E1D-Q5V-Q108L-G75K)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:335)；和
3LEC_89_opt4(E1D-Q5V-Q108L-A74S-G75K)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:336)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如在Tullett等人,JCI Insight.2016；1(7):e87102中公开的抗Clec9A抗体，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在各个实施方案中，本发明设想了如本文所描述的本发明的Clec9A结合剂的任何天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直系同源物(本文中统称为“类似物”)的用途。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂的氨基酸序列还包括氨基酸类似物、氨基酸衍生物或其他非经典氨基酸。
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少60％同一性的序列。举例来说，所述Clec9A结合剂可以包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列(例如，与本文公开的序列(例如SEQ ID NO:327-336)中的任一者具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)。
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分包含相对于本文公开的序列中的任一者具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分包含相对于本文公开的序列中的任一者具有一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个、或七个、或八个、或九个、或十个、或十五个、或二十个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
可以例如基于在所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性方面的相似性进行“保守取代”。20种天然存在的氨基酸可以分组至以下六个标准氨基酸组中：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所使用，“保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组中的同一组内所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。举例来说，Asp交换为Glu使得经如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸能够破坏α螺旋，它们可以彼此取代。
如本文所使用，“非保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。
在各个实施方案中，所述取代还可以包括非经典氨基酸。示例性非经典氨基酸总体上包括但不限于硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计师氨基酸诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。
在各个实施方案中，氨基酸突变可以在靶向部分的CDR(例如，CDR1区、CDR2区或CDR3区)中。在另一个实施方案中，氨基酸变化可以在靶向部分的框架区(FR)(例如，FR1区、FR2区、FR3区或FR4区)中。
可以使用本领域中的任何已知技术，例如定点诱变或基于PCR的诱变来实现对氨基酸序列的修饰。此类技术描述于例如以下文献中：Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.,1989和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1989。
在各个实施方案中，所述突变基本上不降低本发明的Clec9A结合剂特异性地结合至Clec9A的能力。在各个实施方案中，所述突变基本上不降低本发明的Clec9A结合剂特异性地结合至Clec9A并且不在功能上调节(例如，部分或完全中和)Clec9A的能力。
在各个实施方案中，可以用平衡解离常数(KD)来描述本发明的Clec9A结合剂对人Clec9A的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或单体和/或二聚体形式和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体(包括单体和/或二聚体形式)的结合亲和力。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分结合至人Clec9A的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体(包括单体和/或二聚体形式)，其中KD低于约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、或约5nM、或约1nM。
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含靶向部分，所述靶向部分结合目标抗原但不在功能上调节(例如，部分或完全中和)目标抗原，即Clec9A。举例来说，在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂的靶向部分仅仅靶向所述抗原但基本上不在功能上调节(例如，部分或完全抑制、降低或中和)所述抗原具有的生物效应。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂的靶向部分结合在物理上与对抗原的生物活性重要的抗原位点(例如，抗原的活性位点)隔开的表位。
此类无显著功能调节的结合可用于本发明的各个实施方案中，包括使用本发明的Clec9A结合剂经由效应抗原将活性免疫细胞直接或间接地募集至所需位点的方法。举例来说，在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以用在减小或消除肿瘤的方法中以便经由Clec9A将树突状细胞直接或间接地募集至肿瘤细胞(例如，所述Clec9A结合剂可以包含具有抗Clec9A抗原识别结构域的靶向部分和具有针对肿瘤抗原或受体的识别结构域(例如抗原识别结构域)的靶向部分)。在此类实施方案中，需要直接或间接地募集树突状细胞但不在功能上调节或中和Clec9A活性。在这些实施方案中，Clec9A信号传导是肿瘤减小或消除作用的重要部分。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂增强了树突状细胞的抗原呈递。举例来说，在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂经由Clec9A将树突状细胞直接或间接地募集至肿瘤细胞，其中随后将肿瘤抗原内吞并且呈递在所述树突状细胞上以便诱导有效的体液应答和细胞毒性T细胞应答。
在其他实施方案(例如，涉及治疗自身免疫性或神经退行性疾病)中，所述Clec9A结合剂包含结合并且中和目标抗原，即Clec9A的靶向部分。举例来说，在各个实施方案中，本发明的方法可以抑制或减少Clec9A信号传导或表达，例如，以致使免疫应答减少。
包含本发明的Clec9A结合剂的治疗剂
具有信号传导剂的嵌合体和融合物
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是具有一种或多种信号传导剂的嵌合体或融合物的一部分。因此，本发明提供了包括例如针对Clec9A的靶向部分和一种或多种信号传导剂的嵌合或融合蛋白。
在各个实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以便对其受体中的一种或多种具有降低的亲和力或活性，从而允许减弱活性(包括激动或拮抗)和/或预防非特异性信号传导或者嵌合或融合蛋白的不理想螯合。在各个实施方案中，所述信号传导剂在其野生型形式下具有拮抗性，并且携带一个或多个减弱其拮抗活性的突变。在各个实施方案中，所述信号传导剂由于一个或多个突变而具有拮抗性，例如激动性信号传导剂被转化成拮抗性信号传导剂，并且任选地，这种经过转化的信号传导剂还携带一个或多个减弱其拮抗活性的突变(例如，如WO 2015/007520中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。
因此，在各个实施方案中，所述信号传导剂是具有一个或多个突变(例如多个突变)的信号传导剂的修饰(例如突变)形式。在各个实施方案中，所述突变允许经修饰的信号传导剂相对于信号传导剂的未突变，即野生型形式具有一种或多种减弱的活性，诸如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性中的一者或多者(例如，比较同一种信号传导剂的野生型形式对比修饰(例如突变)形式)。在一些实施方案中，减弱或降低结合或亲和力的突变包括基本上降低或消除结合或活性的那些突变。在一些实施方案中，减弱或降低结合或亲和力的突变不同于基本上降低或消除结合或活性的那些突变。结果，在各个实施方案中，所述突变允许信号传导剂相对于未突变，即野生型信号传导剂具有提高的安全性，例如，降低的全身性毒性、减少的副作用和减少的脱靶效应(例如，比较同一种信号传导剂的野生型形式对比修饰(例如突变体)形式)。
如本文所描述，该剂由于一个或多个修饰(例如突变)而可以具有提高的安全性。在各个实施方案中，提高的安全性意指本发明的嵌合蛋白提供了较低的毒性(例如全身毒性和/或组织/器官相关毒性)；和/或减轻或基本上消除的副作用；和/或增加的耐受性、减轻或基本上消除的不良事件；和/或减少或基本上消除的脱靶效应；和/或增加的治疗窗。
在各个实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以具有一个或多个降低其对其受体中的一种或多种的结合亲和力或活性的突变。在一些实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以具有一个或多个基本上降低或消除对所述受体的结合亲和力或活性的突变。在一些实施方案中，所述野生型信号传导剂提供的活性是在所述受体处的激动作用(例如，激活治疗部位的细胞效应)。举例来说，所述野生型信号传导剂可以激活其受体。在此类实施方案中，所述突变使得经修饰的信号传导剂在所述受体处的激活活性被降低或消除。举例来说，所述突变可以使得所述经修饰的信号传导剂向靶细胞递送减弱的激活信号，或者可以消除所述激活信号。在一些实施方案中，所述野生型信号传导剂提供的活性是在所述受体处的拮抗作用(例如阻断或阻遏治疗部位的细胞效应)。举例来说，所述野生型信号传导剂可以拮抗或抑制所述受体。在这些实施方案中，所述突变使得所述经修饰的信号传导剂在所述受体处的拮抗活性被降低或消除。举例来说，所述突变可以使得所述经修饰的信号传导剂向靶细胞递送减弱的抑制信号，或者可以消除所述抑制信号。在各个实施方案中，所述信号传导剂由于一个或多个突变而具有拮抗性，例如将激动性信号传导剂转化成拮抗性信号传导剂(例如，如WO 2015/007520中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)，并且任选地，这种经转化的信号传导剂还携带一个或多个降低其对其受体中的一种或多种的结合亲和力或活性，或者基本上降低或消除对其受体中的一种或多种的结合亲和力或活性的突变。
在一些实施方案中，与一个或多个如本文所描述的靶向部分(例如，针对Clec9A的靶向部分)连接能恢复所述受体处被降低的亲和力或活性。在其他实施方案中，一个或多个所述靶向部分的活性基本上不能恢复所述受体处被降低的亲和力或活性。
在各个实施方案中，本发明的嵌合蛋白减少了脱靶效应，因为它们的信号传导剂具有削弱或消除在受体处的结合亲和力或活性的突变。在各个实施方案中，观察到副作用相对于例如野生型信号传导剂存在这种减少。在各个实施方案中，所述信号传导剂对靶细胞具有活性，因为所述一个或多个靶向部分补偿了实质性激活所需的结合(例如但不限于和/或亲合力)的缺失/不足。在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对治疗活性位点的途径基本上无活性，并且其效应基本上针对特异性靶向的细胞类型，从而大大减少了不希望的副作用。
在一些实施方案中，所述信号传导剂可以包括一个或多个减弱或减少对一个受体(即，治疗受体)的结合或亲和力的突变以及一个或多个基本上降低或消除第二受体处的结合或活性的突变。在此类实施方案中，这些突变可以处在相同或不同的位置上(即，相同突变或多个突变)。在一些实施方案中，减少一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变与基本上降低或消除另一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变不同。在一些实施方案中，减少一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变与基本上降低或消除另一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变相同。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有经修饰的信号传导剂，所述经修饰的信号传导剂兼具减弱治疗受体处的结合和/或活性且因此允许更受控制的中靶治疗效果(例如相对于野生型信号传导剂)的突变与基本上降低或消除另一个受体处的结合和/或活性且因此减少副作用(例如相对于野生型信号传导剂)的突变。
在一些实施方案中，利用靶向部分(例如，针对Clec9A的靶向部分或本文中所描述的任何其他靶向部分)基本上不能恢复结合或活性的实质性降低或消除。在一些实施方案中，利用靶向部分能恢复结合或活性的实质性降低或消除。在各个实施方案中，基本上降低或消除第二受体处的结合或活性还可以防止另一个受体介导的不利效应。可选地或另外地，基本上降低或消除另一个受体处的结合或活性改善了治疗效果，因为治疗性嵌合蛋白的降低或消除的螯合远离治疗作用位点。举例来说，在一些实施方案中，这就回避了对高剂量的能补偿另一个受体处的损失的本发明嵌合蛋白的需要。这种降低剂量的能力还提供了较低的副作用可能性。
在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述信号传导剂对其受体中的一种或多种具有降低、基本上降低或消除的亲和力，例如结合(例如KD)和/或激活(例如，当所述经修饰的信号传导剂是其受体的激动剂时，可测量为例如KA和/或EC50)和/或抑制(例如，当所述经修饰的信号传导剂是其受体的拮抗剂时，可测量为例如KI和/或IC50)。在各个实施方案中，免疫调节剂受体处降低的亲和力允许减弱活性(包括激动或拮抗)。在此类实施方案中，相对于野生型信号传导剂，所述经修饰的信号传导剂对受体具有约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％，或约10％-20％、约20％-40％、约50％、约40％-60％、约60％-80％、约80％-100％的亲和力。在一些实施方案中，相对于所述野生型信号传导剂，所述结合亲和力至少低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、低约6倍、低约7倍、低约8倍、低约9倍、低至少约10倍、低至少约15倍、低至少约20倍、低至少约25倍、低至少约30倍、低至少约35倍、低至少约40倍、低至少约45倍、低至少约50倍、低至少约100倍、低至少约150倍，或低约10-50倍、低约50-100倍、低约100-150倍、低约150-200倍或低超过200倍。
在所述经修饰的信号传导剂具有降低一个受体处的结合且基本上降低或消除第二受体处的结合的突变的实施方案中，经修饰的信号传导剂对一个受体的结合亲和力的减弱或降低程度低于对另一个受体的亲和力的实质性降低或消除。在一些实施方案中，经修饰的信号传导剂对一个受体的结合亲和力的减弱或降低比对另一个受体的亲和力的实质性降低或消除低约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在各个实施方案中，实质性降低或消除是指在结合亲和力和/或活性方面存在比减弱或降低更大程度的降低。
在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变使所述信号传导剂的内源活性例如相对于所述野生型信号传导剂降至约75％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约25％、或约20％、或约10％、或约5％、或约3％、或约1％。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述信号传导剂对其受体具有降低的亲和力，比所述一个或多个靶向部分对其一个或多个受体的结合亲和力更低。在一些实施方案中，这种结合亲和力差异存在于相同细胞上的信号传导剂/受体与靶向部分/受体之间。在一些实施方案中，这种结合亲和力差异允许所述信号传导剂(例如突变的信号传导剂)具有局部化中靶效应并且使构成在野生型信号传导剂情况下观察到的副作用的基础的脱靶效应最小化。在一些实施方案中，这种结合亲和力低至少约2倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或低至少约25倍、或至少约50倍、或至少约100倍、或至少约150倍。
可以使用本领域中已知的方法来测量受体结合活性。举例来说，可以通过对结合数据进行斯卡查德图分析和计算机拟合(例如Scatchard,1949)或通过如Brecht等人(1993)所描述在流经条件下进行反射干涉光谱法来评定亲和力和/或结合活性，所有文献的全部内容特此以引用方式并入。
在各个实施方案中，所述信号传导剂是免疫调节剂，例如白介素、干扰素和肿瘤坏死因子中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是白介素或经修饰的白介素，包括例如IL-1；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-8；IL-9；IL-10；IL-11；IL-12；IL-13；IL-14；IL-15；IL-16；IL-17；IL-18；IL-19；IL-20；IL-21；IL-22；IL-23；IL-24；IL-25；IL-26；IL-27；IL-28；IL-29；IL-30；IL-31；IL-32；IL-33；IL-35；IL-36或者它们的片段、变体、类似物或家族成员。白介素是由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞合成的一组多功能细胞因子。已知的功能包括刺激免疫细胞(例如T辅助细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)的增殖、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的趋化性和/或干扰素的抑制。可以使用本领域中已知的测定法来测定白介素活性：Matthews等人,Lymphokines and Interferens:A Practical Approach,Clemens等人编辑,IRL Press,Washington,D.C.1987,第221-225页；以及Orencole和Dinarello(1989)Cytokine 1,14-20。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是干扰素或干扰素诸如I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素的修饰形式。说明性干扰素包括例如干扰素-α-1、干扰素-α-2、干扰素-α-4、干扰素-α-5、干扰素-α-6、干扰素-α-7、干扰素-α-8、干扰素-α-10、干扰素-α-13、干扰素-α-14、干扰素-α-16、干扰素-α-17和干扰素-α-21、干扰素-β以及干扰素-γ、干扰素κ、干扰素ε、干扰素τ和干扰素ω。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是肿瘤坏死因子(TNF)或者肿瘤坏死因子(TNF)或TNF家族中的蛋白质，包括但不限于TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TRAIL的修饰形式。
本文所描述的野生型信号传导剂的氨基酸序列在本领域中是众所周知的。因此，在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含与本文所描述的信号传导剂的已知野生型氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含与本文所描述的信号传导剂的任何氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括如本文其他部分所描述的保守和/或非保守取代。在各个实施方案中，所述取代还可以包括如本文其他部分所描述的非经典氨基酸。
如本文所描述，所述经修饰的信号传导剂携带影响一个或多个受体处的亲和力和/或活性的突变。在各个实施方案中，存在对治疗受体，例如通过其介导期望的治疗效果(激动或拮抗)的受体的降低的亲和力和/或活性。在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂携带基本上降低或消除在受体，例如通过其不介导期望的治疗效果(例如，由于结合的混杂性的结果)的受体处的亲和力和/或活性的突变。如本文所描述的任何经修饰的信号传导剂的受体，例如细胞因子、生长因子和激素之一都是本领域中已知的。
提供在受体处降低的亲和力和/或活性(例如激动性)的说明性突变见于WO 2013/107791和PCT/EP2017/061544(例如，关于干扰素)、WO 2015/007542(例如，关于白介素)和WO 2015/007903(例如，关于TNF)中，各文献的全部内容特此以引用方式并入。提供在受体处降低的亲和力和/或活性(例如拮抗性)的说明性突变见于WO 2015/007520中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述信号传导剂对I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、趋化因子受体、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族中的受体中、TGF-β受体、免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体和/或酪氨酸激酶超家族中的受体具有降低的亲和力和/或活性。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是I型细胞因子受体。I型细胞因子受体在本领域中是已知的，并且包括但不限于IL2(β亚单位)、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、IL12、GM-CSF、G-CSF、LIF、CNTF的受体，以及促血小板生成素(TPO)、催乳素和生长激素的受体。说明性I型细胞因子受体包括但不限于GM-CSF受体、G-CSF受体、LIF受体、CNTF受体、TPO受体和I型IL受体。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是II型细胞因子受体。II型细胞因子受体是由异源亚单位构成的多聚体受体，并且是主要用于干扰素的受体。此受体家族包括但不限于干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ、IL10、IL22和组织因子的受体。说明性II型细胞因子受体包括但不限于IFN-α受体(例如IFNAR1和IFNAR2)、IFN-β受体、IFN-γ受体(例如IFNGR1和IFNGR2)和II型IL受体。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是G蛋白偶联受体。趋化因子受体是具有七个跨膜结构并与G蛋白偶联以进行信号转导的G蛋白偶联受体。趋化因子受体包括但不限于CC趋化因子受体、CXC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体和XC趋化因子受体(XCR1)。示例性趋化因子受体包括但不限于CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CSCR6、CXCR7、XCR1和CX3CR1。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是TNFR家族成员。肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员共享由围绕CXXCXXC核心基序的三个二硫键形成的富半胱氨酸结构域(CRD)，从而形成细长分子。示例性肿瘤坏死因子受体家族成员包括：CDl 20a(TNFRSFlA)、CD 120b(TNFRSFlB)、淋巴毒素β受体(LTBR、TNFRSF3)、CD 134(T NFRSF4)、CD40(CD40、TNFRSF5)、FAS(FAS、TNFRSF6)、TNF RSF6B(TNFRSF6B)、CD27(CD27、TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD137(TNFRSF9)、TNFRSFlOA(TNFRSFlOA)、TNFRSFlOB、(T NFRSFlOB)、TNFRSFlOC(TNFRSFlOC)、TNFRSFlOD(TNFRSFlO D)、RANK(TNFRSFI lA)、骨保护素(TNFRSFlIB)、TNFRSF12A(T NFRSF12A)、TNFRSF13B(TNFRSF13B)、TNFRSF13C(TNFRSF13C)、TNFRSF14(TNFRSF14)、神经生长因子受体(NGFR、TNFRSF16)、TNFRSF17(TNFRSF17)、TNFRSF18(TNFRSF18)、TNFRSF19(TNFRSF19)、TNFRSF21(TNFRSF21)和TNFRSF25(TNFRSF25)。在一个实施方案中，所述TNFR家族成员是CD120a(TNFRSF1A)或TNF-R1。在另一个实施方案中，所述TNFR家族成员是CD 120b(TNFRSFlB)或TNF-R2。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是TGF-β受体。TGF-β受体是单程丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β受体包括但不限于TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是Ig超家族受体。免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体与免疫球蛋白享有结构同源性。Ig超家族中的受体包括但不限于白介素-1受体、CSF-1R、PDGFR(例如PDGFRA和PDGFRB)和SCFR。
在各个实施方案中，所述信号传导剂的受体是酪氨酸激酶超家族受体。所述酪氨酸激酶超家族中的受体在本领域中是众所周知的。大约有58种已知的受体酪氨酸激酶(RTK)，分为20个亚家族。所述酪氨酸激酶超家族中的受体包括但不限于FGF受体及其各种同种型，诸如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR5。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是干扰素α。在此类实施方案中，所述经修饰的IFN-α剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-α剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
干扰素α的突变形式对本领域技术人员是已知的。在一个说明性实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是具有氨基酸序列SEQ ID NO:337的等位基因形式IFN-α2a。
在一个说明性实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是具有氨基酸序列SEQ IDNO:338的等位基因形式IFN-α2b(它在氨基酸位置23处与IFN-α2a不同)。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体(IFN-α2a或IFN-α2b)在144-154位的一个或多个氨基酸，诸如氨基酸位置148、149和/或153处发生突变。在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体包含选自L153A、R149A和M148A的一个或多个突变。此类突变体描述于例如WO2013/107791和Piehler等人,(2000)J.Biol.Chem,275:40425-33中，所有文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体对IFNAR1具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体包含选自如WO2010/030671中所描述的F64A、N65A、T69A、L80A、Y85A和Y89A的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体包含选自如WO2008/124086中所描述的K133A、R144A、R149A和L153A的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体包含选自如WO2015/007520和WO2010/030671中所描述的R120E和R120E/K121E的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在此类实施方案中，所述IFN-α2突变体拮抗野生型IFN-α2活性。在此类实施方案中，所述突变IFN-α2对IFNAR1具有降低的亲和力和/或活性，而保留对IFNR2的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含(1)选自R120E和R120E/K121E的一个或多个突变，不希望受理论束缚，所述突变能产生拮抗效应；和(2)选自K133A、R144A、R149A和L153A的一个或多个突变，不希望受理论束缚，所述突变允许减弱例如IFNAR2处的效应。在一个实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含R120E和L153A。
在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含一个或多个突变，所述一个或多个突变选自如WO 2013/059885中所公开的L15A、A19W、R22A、R23A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、D35A、Q40A、D114R、L117A、R120A、R125A、K134A、R144A、A145G、A145M、M148A、R149A、S152A、L153A和N156A，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或L30A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或R33A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或M148A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或L153A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变N65A、L80A、Y85A和/或Y89A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变N65A、L80A、Y85A、Y89A和/或D114A。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是干扰素β。在此类实施方案中，所述经修饰的干扰素β剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的干扰素β剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在说明性实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IFN-β。在各个实施方案中，所述IFN-β涵盖IFN-β的功能性衍生物、类似物、前体、同种型、剪接变体或片段。在各个实施方案中，所述IFN-β涵盖来源于任何物种的IFN-β。在一个实施方案中，嵌合蛋白包含小鼠IFN-β的修饰形式。在另一个实施方案中，嵌合蛋白包含人IFN-β的修饰形式。人IFN-β是包含166个氨基酸残基的分子量为约22kDa的多肽。人IFN-β的氨基酸序列是SEQ ID NO:339。
在一些实施方案中，所述人IFN-β是呈人IFN-β的糖基化形式的IFN-β-1a。在一些实施方案中，所述人IFN-β是呈人IFN-β的非糖基化形式的IFN-β-1b，它具有Met-1缺失和Cys-17至Ser突变。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-β对IFNAR的IFNAR1亚单位的结合或亲和力。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β在IFNAR1处具有降低的亲和力和/或活性。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-β是人IFN-β，并且在位置F67、R71、L88、Y92、I95、N96、K123和R124处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变是选自F67G、F67S、R71A、L88G、L88S、Y92G、Y92S、I95A、N96G、K123G和R124G的取代。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含F67G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含K123G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含F67G和R71A突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含L88G和Y92G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含Y92G、I95A和N96G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含K123G和R124G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含F67G、L88G和Y92G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含F67S、L88S和Y92S突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-β对IFNAR的IFNAR2亚单位的结合或亲和力。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β在IFNAR2处具有降低的亲和力和/或活性。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-β是人IFN-β，并且在位置W22、R27、L32、R35、V148、L151、R152和Y155处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变是选自W22G、R27G、L32A、L32G、R35A、R35G、V148G、L151G、R152A、R152G和Y155G的取代。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含W22G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含L32A突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含L32G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含R35A突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含R35G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含V148G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含R152A突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含R152G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含Y155G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含W22G和R27G突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含L32A和R35A突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含L151G和R152A突变。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-β包含V148G和R152A突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有以下突变中的一者或多者：R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K和R152H。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有以下突变中的一者或多者：R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K和R152H，结合C17S或C17A。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有以下突变中的一者或多者：R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K和R152H，结合本文所描述的任何其他IFN-β突变。
人IFN-β的晶体结构是已知的，并且描述于Karpusas等人,(1998)PNAS,94(22):11813-11818中。具体而言，已显示人IFN-β的结构包括五个α螺旋(即A、B、C、D和E)和四个连接这些螺旋的环区(即AB、BC、CD和DE环)。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-β在A、B、C、D、E螺旋和/或AB、BC、CD和DE环中具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-β在治疗受体诸如IFNAR处的结合亲和力或活性。示例性突变描述于WO2000/023114和US20150011732中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置15、16、18、19、22和/或23处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置28-30、32和33处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置36、37、39和42处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是人IFN-β，所述人IFN-β在氨基酸位置64和67处包含丙氨酸取代并且在位置68处包含丝氨酸取代。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置71-73处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置92、96、99和100处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置128、130、131和134处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一个示例性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置149、153、156和159处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含339和在W22处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在R27处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在W22处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R27处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在L32处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在R35处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在L32处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R35处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在F67处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在R71处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在F67处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R71处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在L88处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在F67处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在L88处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在L88处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在I95处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在N96处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在I95处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在N96处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在K123处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在R124处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在K123处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R124处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在L151处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在R152处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在L151处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R152处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在V148处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和甲硫氨酸(M)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在V148处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R152处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFNβ包含SEQ ID NO:339和在Y155处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，本发明涉及一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：(a)经修饰的IFN-β，所述经修饰的IFN-β具有氨基酸序列SEQ ID NO:339和在位置W22处的突变，其中该突变是脂族疏水性残基；和(b)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分包含特异性地结合至目标抗原或受体(例如Clec9A)的识别结构域，所述经修饰的IFN-β和所述一个或多个靶向部分任选地与一个或多个接头连接。在各个实施方案中，在位置W22处的突变是选自G、A、L、I、M和V的脂族疏水性残基。在各个实施方案中，在位置W22处的突变是G。
其他示例性IFNβ突变体提供在PCT/EP2017/061544中，所述文献的全部公开内容以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是干扰素γ。在此类实施方案中，所述经修饰的干扰素γ剂对干扰素γ受体(IFNGR)，即IFNGR1和IFNGR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的干扰素γ剂对干扰素γ受体(IFNGR)，即IFNGR1和IFNGR2链具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
IFN-γ是II型类干扰素的唯一成员。作为先天免疫应答的一部分，IFN-γ主要由天然杀伤(NK)和天然杀伤T(NKT)细胞产生。CD4 Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞也产生IFN-γ。激活的IFN-γ形成二聚体，所述二聚体通过由IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚单位构成的异二聚体受体(即，IFN-γ受体或IFN-γR)起作用。IFN-γ受体1是主要的配体结合亚单位，而IFN-γ受体2是信号转导所必需的，并且还增加了IFN-γ受体1对它的配体的亲和力。IFN-γ二聚体与受体的结合激活了JAK-STAT信号传导途径，从而引发各种生物效应。
在各个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含IFN-γ的修饰形式作为信号传导剂。在各个实施方案中，所述IFN-γ涵盖IFN-γ的功能性衍生物、类似物、前体、同种型、剪接变体或片段。在各个实施方案中，所述IFN-γ涵盖来源于任何物种的IFN-γ。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含小鼠IFN-γ的修饰形式。在另一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含人IFN-γ的修饰形式。
人IFN-γ是包含166个氨基酸残基的多肽。在一个实施方案中，所述人IFN-γ具有氨基酸序列SEQ ID NO:340，其中信号肽包含前23个氨基酸。
如本文所使用，人IFN-γ还可以指没有N端信号肽的成熟人IFN-γ。在该实施方案中，所述成熟的人IFN-γ包含143个氨基酸并具有氨基酸序列SEQ ID NO:341。
在一些实施方案中，所述人IFN-γ是人IFN-γ的糖基化形式。在一些实施方案中，所述人IFN-γ是人IFN-γ的非糖基化形式。
IFN-γ的序列在本领域中是已知的。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含与IFN-γ的已知野生型氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO:340的人IFN-γ具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO:341的人IFN-γ具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
可以例如基于在所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性方面的相似性进行“保守取代”。20种天然存在的氨基酸可以分组至以下六个标准氨基酸组中：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所使用，“保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组中的同一组内所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。举例来说，Asp交换为Glu使得经如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸能够破坏α螺旋，它们可以彼此取代。
如本文所使用，“非保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。
在各个实施方案中，所述取代还可以包括非经典氨基酸(总体上例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计师氨基酸诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物)。
在各个实施方案中，所述IFN-γ经过修饰以具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述突变允许所述经修饰的IFN-γ相对于IFN-γ的未突变(例如野生型)形式具有一种或多种减弱的活性，诸如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性中的一者或多者。例如，相对于IFN-γ的未突变(例如野生型)形式，所述一种或多种减弱的活性，诸如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性可以处在治疗受体诸如IFN-γ受体处。结果，在各个实施方案中，所述突变允许所述经修饰的可溶性剂相对于IFN-γ的未突变(例如野生型)形式具有降低的全身性毒性、减少的副作用和减少的脱靶效应。
在各个实施方案中，所述IFN-γ经过修饰以具有降低其在治疗受体诸如包括IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚单位在内的IFN-γ受体处的结合亲和力和/或活性的突变。在一些实施方案中，所述野生型IFN-γ提供的活性是在所述治疗受体处的激动作用(例如，激活治疗部位的细胞效应)。例如，所述野生型IFN-γ可以激活治疗受体。在此类实施方案中，所述突变使得所述经修饰的IFN-γ在所述治疗受体处的激活活性被降低。
在一些实施方案中，与靶向部分连接能恢复所述治疗受体(例如，IFN-γ受体)处被降低的亲和力和/或活性。在其他实施方案中，与靶向部分连接基本上不能恢复所述治疗受体处被降低的亲和力和/或活性。在各个实施方案中，本发明的治疗性嵌合蛋白减少了脱靶效应，因为所述IFN-γ具有削弱在治疗受体处的结合亲和力和/或活性的突变。在各个实施方案中，观察到副作用相对于例如野生型IFN-γ存在这种减少。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ对治疗活性位点的途径基本上无活性，并且其效应基本上针对特异性靶向的细胞类型，从而大大减少了不希望的副作用。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述IFN-γ对一种或多种治疗受体(例如，IFN-γ受体)具有减弱或降低的亲和力和/或活性，例如，结合(例如KD)和/或激活(可测量为例如KA和/或EC50)。在各个实施方案中，治疗受体处降低的亲和力和/或活性允许减弱来自治疗受体的活性和/或信号传导。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-γ对IFN-γ受体1亚单位的结合或亲和力和/或生物活性。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ在IFN-γ受体1亚单位处具有降低的亲和力和/或活性。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是人IFN-γ，所述人IFN-γ在涉及与IFN-γ受体1亚单位结合的氨基酸残基处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是人IFN-γ，所述人IFN-γ在位于与IFN-γ受体1亚单位的界面处的氨基酸处具有一个或多个突变。在各个实施方案中，所述一个或多个突变处在选自但不限于以下的氨基酸处：Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119和K125(各自相对于SEQ ID NO:341，它是野生型人IFN-γ，并且缺少其N端信号序列)。在一些实施方案中，所述一个或多个突变是选自V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G(各自相对于SEQ ID NO:341)的取代。在实施方案中，所述一个或多个突变是选自V22A、A23G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G的取代。
在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含突变A23G和D24G。在另一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含突变I114A和A118G。在另一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含突变V5E、S20E、A23F和G26Q。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有以下突变中的一者或多者：残基A23的缺失、残基D24的缺失、S20I取代、A23V取代、D21K取代和D24A取代。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-γ对IFN-γ受体2亚单位的结合或亲和力和/或生物活性。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-γ对IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚单位的结合或亲和力和/或生物活性。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有一个或多个降低其对IFN-γ受体1的结合或亲和力和/或生物活性的突变和一个或多个基本上降低或消除其对IFN-γ受体2的结合或亲和力和/或生物活性的突变。在一些实施方案中，具有这种经修饰的IFN-γ的嵌合蛋白可以提供靶标选择性IFN-γ受体1活性(例如，经由通过靶向部分进行的靶向能恢复IFN-γ受体1活性)。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ具有一个或多个降低其对IFN-γ受体1的结合或亲和力和/或生物活性的突变和一个或多个降低其对IFN-γ受体1的结合或亲和力和/或生物活性的突变。在一些实施方案中，具有这种经修饰的IFN-γ的嵌合蛋白可以提供靶标选择性IFN-γ受体1和/或IFN-γ受体1活性(例如，经由通过靶向部分进行的靶向能恢复IFN-γ受体1和IFN-γ受体2活性)。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ在C端被截短。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，所述成熟IFN-γ包含具有C端缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:341。在此类实施方案中，所述成熟IFN-γ可以包含至少约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24、或约25个氨基酸残基的C端截短。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，所述成熟IFN-γ包含具有5个氨基酸的C端缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:341。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，所述成熟IFN-γ包含具有7个氨基酸的C端缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:341。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，所述成熟IFN-γ包含具有14个氨基酸的C端缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:341。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，所述成熟IFN-γ包含具有15个氨基酸的C端缺失的氨基酸序列SEQ IDNO:341。在一个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，所述成熟IFN-γ包含具有16个氨基酸的C端缺失的氨基酸序列SEQ ID NO:341。可用于本发明的具有C端截短的另外的经修饰的IFN-γ描述于Haelewyn等人,Biochem.J.(1997),324:591-595和Lundell等人,Protein Eng.(1991)4:335-341，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ是如例如在Randal等人(2001)Structure 9:155-163和Randal等人(1998)Protein Sci.7:1057-1060中所述的单链IFN-γ，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述单链IFN-γ包含第一IFN-γ链，所述第一IFN-γ链在其C末端连接至第二IFN-γ链的N端。在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和第二IFN-γ链通过如本文其他部分所描述的接头连接。
在一些实施方案中，所述第一IFN-γ链包含至少约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24、或约25个氨基酸残基的C端截短。在一个实施方案中，所述第一IFN-γ链包含约24个氨基酸残基的C端截短。在一些实施方案中，所述第二IFN-γ链包含至少约1个、约2个、约3个、约4个或约5个氨基酸残基的N端截短。在一个实施方案中，所述第二IFN-γ链包含约3个氨基酸残基的N端截短。在一些实施方案中，所述第二IFN-γ链包含至少约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24、或约25个氨基酸残基的C端截短。在各个实施方案中，如本文其他部分所描述，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链在Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119和K125处包含一个或多个氨基酸突变。在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含一个或多个选自以下的取代：V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G。在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含一个或多个选自以下的取代：V22A、A23G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G。在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含A23G和D24G取代。在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含I114A和A118G取代。在另一个实施方案中，所述突变是V5E、S20E、A23F和G26Q。
在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含一个或多个如本文所公开的取代，并且所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含如本文所公开的C端截短。
在各个实施方案中，所述第一IFN-γ链和/或所述第二IFN-γ链包含如本文所公开的一个或多个取代和如本文所公开的C端截短。
人IFN-γ的晶体结构是已知的，并且描述于例如Ealick等人,(1991)Science,252:698-702中。具体而言，已显示人IFN-γ的结构包括六个α螺旋的核心和在C端区域的延伸的未折叠序列。在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ在所述一个或多个螺旋中具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-γ在治疗受体(例如IFN-γ受体)处的结合亲和力和/或生物活性。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ相对于野生型IFN-γ对治疗受体(例如IFN-γ受体或其IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚单位中的任一者)具有约约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％，或约10％-20％、约20％-40％、约50％、约40％-60％、约60％-80％、约80％-100％的亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，相对于所述野生型IFN-γ，所述结合亲和力和/或生物活性至少低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、低约6倍、低约7倍、低约8倍、低约9倍、低至少约10倍、低至少约15倍、低至少约20倍、低至少约25倍、低至少约30倍、低至少约35倍、低至少约40倍、低至少约45倍、低至少约50倍、低至少约100倍、低至少约150倍，或低约10-50倍、低约50-100倍、低约100-150倍、低约150-200倍或低超过200倍。
在各个实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含一个或多个突变，所述一个或多个突变使所述IFN-γ的内源活性例如相对于所述野生型IFN-γ降至约75％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约25％、或约20％、或约10％、或约5％、或约3％、或约1％。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述经修饰的IFN-γ对受体具有降低的亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-γ对受体的结合亲和力和/或生物活性低于靶向部分对其受体的结合亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，这种结合亲和力和/或生物活性差异存在于相同细胞上的经修饰的IFN-γ/受体与靶向部分/受体之间。在一些实施方案中，这种结合亲和力和/或生物活性差异允许所述经修饰的IFN-γ具有局部化中靶效应并且使构成在野生型IFN-γ情况下观察到的副作用的基础的脱靶效应最小化。在一些实施方案中，所述结合亲和力和/或生物活性低至少约2倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或低至少约25倍、或至少约50倍、或至少约100倍、或至少约150倍。
可以使用本领域中已知的方法来测量受体结合活性。举例来说，可以通过对结合数据进行斯卡查德图分析和计算机拟合(例如Scatchard,1949)或通过如Brecht等人(1993)所描述在流经条件下进行反射干涉光谱法来评定亲和力和/或结合活性，所有文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是共有干扰素。通过扫描几种人非等位基因IFN-α亚型的序列并且在每个相应位置分配最常观察到的氨基酸，可以生成共有干扰素。所述共有干扰素在166个氨基酸中有20个氨基酸与IFN-α2b不同(88％同源性)，并且与IFN-β比较显示在30％以上的氨基酸位置具有同一性。在各个实施方案中，所述共有干扰素包含以下氨基酸序列SEQ ID NO:342。
在一些实施方案中，所述共有干扰素包含氨基酸序列SEQ ID NO:343，该氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:342相差一个氨基酸，即，SEQ ID NO:343缺少SEQ ID NO:342的起始甲硫氨酸残基。
在各个实施方案中，所述共有干扰素包括所述共有干扰素的修饰形式，即共有干扰素变体，作为信号传导剂。在各个实施方案中，所述共有干扰素涵盖所述共有干扰素的功能性衍生物、类似物、前体、同种型、剪接变体或片段。
在一个实施方案中，所述共有干扰素变体选自美国专利号4,695,623、4,897,471、5,541,293和8,496,921中公开的共有干扰素变体，所有这些文献的全部内容特此以引用方式并入。例如，所述共有干扰素变体可以包含如美国专利号4,695,623、4,897,471和5,541,293中所公开的IFN-CON2或IFN-CON3的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述共有干扰素变体包含IFN-CON2的氨基酸序列，SEQ ID NO:344。
在一个实施方案中，所述共有干扰素变体包含IFN-CON3的氨基酸序列，SEQ IDNO:345。
在一个实施方案中，所述共有干扰素变体包含美国专利号8,496,921中公开的任一变体的氨基酸序列。例如，所述共有变体可以包含氨基酸序列SEQ ID NO:346。
在另一个实施方案中，所述共有干扰素变体可以包含氨基酸序列SEQ ID NO:347。
在一些实施方案中，所述共有干扰素变体可以是PEG化的，即包含PEG部分。在一个实施方案中，所述共有干扰素变体可以包含连接在SEQ ID NO:347的S156C位置处的PEG部分。
在一些实施方案中，工程化干扰素是人IFN-α2a的变体，在序列SEQ ID NO:348的约41位插入Asp产生了SEQ ID NO:349(这导致相对于IFN-α2a序列，序列的重新编号)和以下突变：Arg23Lys、Leu26Pro、Glu53Gln、Thr54Ala、Pro56Ser、Asp86Glu、Ile104Thr、Gly106Glu、Thr110Glu、Lys117Asn、Arg125Lys和Lys136Thr。本文中描述共有干扰素的所有实施方案均等同地应用于该工程化干扰素。
在各个实施方案中，所述共有干扰素变体包含具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
在各个实施方案中，所述取代还可以包括非经典氨基酸(总体上例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计师氨基酸诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物)。
在各个实施方案中，所述共有干扰素经过修饰以具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述突变允许所述共有干扰素变体相对于所述共有干扰素(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO:345或346的共有干扰素)的未突变(例如野生型)形式具有一种或多种减弱的活性，诸如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性中的一者或多者。例如，相对于所述共有干扰素的未突变(例如野生型)形式，所述一种或多种减弱的活性，诸如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性可以处在治疗受体诸如IFNAR处。结果，在各个实施方案中，所述突变允许所述共有干扰素变体相对于所述共有干扰素的未突变(例如野生型)形式具有降低的全身性毒性、减少的副作用和减少的脱靶效应。
在各个实施方案中，所述共有干扰素经过修饰以具有降低其对治疗受体诸如IFNAR的结合亲和力或活性的突变。在一些实施方案中，所述共有干扰素提供的活性是在所述治疗受体处的激动作用(例如，激活治疗部位的细胞效应)。例如，所述共有干扰素可以激活治疗受体。在此类实施方案中，所述突变使得所述共有干扰素变体在所述治疗受体处的激活活性被降低。
在一些实施方案中，与靶向部分连接能恢复所述治疗受体处被降低的亲和力或活性。在其他实施方案中，与靶向部分连接基本上不能恢复所述治疗受体处被降低的亲和力或活性。在各个实施方案中，本发明的基于Fc的治疗性嵌合蛋白减少了脱靶效应，因为所述共有干扰素变体具有削弱在治疗受体处的结合亲和力或活性的突变。在各个实施方案中，观察到副作用相对于例如野生型共有干扰素存在这种减少。在各个实施方案中，所述共有干扰素变体对治疗活性位点的途径基本上无活性，并且其效应基本上针对特异性靶向的细胞类型，从而大大减少了不希望的副作用。
在各个实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述共有干扰素变体对一种或多种治疗受体具有减弱或降低的亲和力，例如，结合(例如KD)和/或激活(可测量为例如KA和/或EC50)。在各个实施方案中，治疗受体处降低的亲和力允许减弱来自治疗受体的活性和/或信号传导。
在各个实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述共有干扰素变体对IFNAR的IFNAR1亚单位的结合或亲和力。在一个实施方案中，所述共有干扰素变体在IFNAR1处具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述共有干扰素变体对IFNAR的IFNAR2亚单位的结合或亲和力。在一些实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述共有干扰素变体对IFNAR1和IFNAR2亚单位的结合或亲和力。
在一些实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个降低其对IFNAR1的结合或亲和力的突变和一个或多个基本上降低或消除其对IFNAR2的结合或亲和力的突变。在一些实施方案中，具有这种共有干扰素变体的基于Fc的嵌合蛋白可以提供靶标选择性IFNAR1活性(例如，经由通过靶向部分(例如SIRPα)进行的靶向能恢复IFNAR1活性)。
在一些实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个降低其对IFNAR2的结合或亲和力的突变和一个或多个基本上降低或消除其对IFNAR1的结合或亲和力的突变。在一些实施方案中，具有这种共有干扰素变体的基于Fc的嵌合蛋白可以提供靶标选择性IFNAR2活性(例如，经由通过靶向部分(例如SIRPα)进行的靶向能恢复IFNAR2活性)。
在一些实施方案中，所述共有干扰素变体具有一个或多个降低其对IFNAR1的结合或亲和力的突变和一个或多个基本上降低其对IFNAR2的结合或亲和力的突变。在一些实施方案中，具有这种共有干扰素变体的基于Fc的嵌合蛋白可以提供靶标选择性IFNAR1和/或IFNAR2活性(例如，经由通过靶向部分(例如SIRPα)进行的靶向能恢复IFNAR1和/或IFNAR2活性)。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:346，所述共有干扰素经过修饰以在145-155位的一个或多个氨基酸(诸如氨基酸位置149、150和/或154)处具有突变。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:346，所述共有干扰素经过修饰以在145-155位的一个或多个氨基酸(诸如氨基酸位置149、150和/或154)处具有突变，所述取代任选地是疏水性的并且选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施方案中，所述共有干扰素突变体包含一个或多个选自M149A、R150A和L154A且相对于SEQ ID NO:342的突变。
在一个实施方案中，相对于SEQ ID NO:342，所述共有干扰素经过修饰以在氨基酸位置121(即，K121)处具有突变。在一个实施方案中，相对于SEQ ID NO:342，所述共有干扰素包含K121E突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是强有力的生长因子，它在生理性和病理性血管生成中起主要作用，调控血管通透性，并且可以充当表达VEGF受体的细胞上的生长因子。除其他功能外，另外的功能还包括刺激巨噬细胞谱系和内皮细胞中的细胞迁移。VEGF生长因子家族中存在若干成员，以及至少三个受体(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)。VEGF家族的成员可以结合并激活不止一种VEGFR类型。例如，VEGF-A结合VEGFR-1和VEGFR-2，而VEGF-C结合VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2激活能调控血管生成，而VEGFR-3激活与淋巴管生成相关联。主要的促血管生成信号是由VEGFR-2激活产生的。据报道，VEGFR-1激活可能与血管生成中的负作用相关联。还已经报道，VEGFR-1信号传导对于经由骨髓来源的VEGFR-1阳性细胞(有助于在骨中形成转移前龛)的体内肿瘤进展是重要的。已经开发了若干种基于VEGF-A指导的/中和的治疗性抗体的疗法，这些疗法主要用于依赖血管生成的各种人类肿瘤的治疗。但这些疗法并非没有副作用。考虑到这些疗法作为一般的非细胞/组织特异性VEGF/VEGFR相互作用抑制剂来起作用，这可能不足为奇。因此，将VEGF(例如，VEGF-A)/VEGFR-2抑制限制于特定的靶细胞(例如肿瘤血管内皮细胞)是合乎需要的。
在一些实施方案中，所述VEGF是VEGF-A、VEGF-B、VEFG-C、VEGF-D或VEGF-E以及它们的同种型，包括VEGF-A的各种同种型，诸如VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189和VEGF206。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)和/或VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)和/或VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有降低的亲和力和/或活性，并且/或者对VEGFR-1(Flt-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。这样的实施方案可用于例如伤口愈合方法或与缺血相关的疾病(不希望受理论束缚，这些疾病受VEGFR-2对内皮细胞功能和血管生成的影响介导)的治疗中。在各个实施方案中，避免了结合至与癌症和促炎活性相关的VEGFR-1(Flt-1)。在各个实施方案中，VEGFR-1(Flt-1)充当诱饵受体，因此大幅降低或消除了在该受体处的亲和力，从而避免了治疗剂的螯合。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性，并且/或者对VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述VEGF是VEGF-C或VEGF-D。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-3具有降低的亲和力和/或活性。或者，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-3具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
促血管生成疗法在各种疾病(例如缺血性心脏病、出血等)中也很重要，并且包括基于VEGF的疗法。VEGFR-2的激活具有促血管生成作用(作用于内皮细胞)。VEFGR-1的激活能刺激炎性细胞(包括例如巨噬细胞)迁移并导致炎症相关的高血管通透性。VEFGR-1的激活还可以促进骨髓相关的肿瘤微生境形成。因此，在这种情况下，选择用于VEGFR-2激活的基于VEGF的治疗剂将是合乎需要的。另外，期望细胞特异性靶向例如内皮细胞。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-2具有降低的亲和力和/或活性(例如拮抗性)，并且/或者对VEGFR-1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。举例来说，当经由与肿瘤内皮细胞标记物(例如PSMA等)结合的靶向部分靶向肿瘤血管内皮细胞时，这种构建体会特异性地抑制此类标记物阳性细胞上的VEGFR-2激活，而不会激活在途中和靶细胞上的VEGFR-1(如果活性被消除)，由此消除了对炎症反应的诱导。相较于VEGF-A中和疗法，这将为许多肿瘤类型提供更具选择性且更安全的抗血管生成疗法。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-2具有降低的亲和力和/或活性(例如激动性)，并且/或者对VEGFR-1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，通过靶向血管内皮细胞，这样的构建体促进血管生成而不引起VEGFR-1相关的炎症反应诱导。因此，这样的构建体将具有靶向的促血管生成效应，并且基本上降低了由VEGFR-2以及VEGR-1的全身性激活所引起的副作用的风险。
在一个说明性实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是VEGF165，所述VEGF165具有氨基酸序列VEGF 165(野生型)(SEQ ID NO:350)。
在另一个说明性实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是VEGF165b，所述VEGF165b具有氨基酸序列VEGF 165b(野生型)(SEQ ID NO:351)。
在这些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂在氨基酸I83处具有突变(例如，在I83处的取代突变，例如I83K、I83R或I83H)。不希望受理论束缚，据信此类突变可导致降低的受体结合亲和力。参见，例如，美国专利号9,078,860，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是TNF-α。TNF是一种多效性细胞因子，它有许多种不同的功能，包括调控细胞生长、分化、细胞凋亡、肿瘤发生、病毒复制、自身免疫性、免疫细胞功能和迁移、炎症以及败血性休克。它结合至靶细胞上的两种独特的膜受体：TNFR1(p55)和TNFR2(p75)。TNFR1表现出非常广泛的表达模式，而TNFR2优先表达在淋巴细胞、Treg、内皮细胞、某些神经元、小胶质细胞、心肌细胞和间质干细胞的某些群体上。响应于受体激活而激活非常独特的生物学途径，但也存在一定的重叠。通常，不希望受理论束缚，TNFR1信号传导与细胞凋亡(细胞死亡)的诱导相关，而TNFR2信号传导与细胞存活信号的激活(例如，NFkB途径的激活)相关。TNF的施用具有全身性毒性，并且这主要是由于TNFR1配接。然而，应当注意，TNFR2的激活还与多种活性相关，同TNFR1一样，在开发基于TNF的治疗剂的情形下，对TNF靶向和活性的控制非常重要。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。TNFR1表达于大部分组织中，并且参与细胞死亡信号传导，而相形之下，TNFR2参与细胞存活信号传导。因此，在针对癌症治疗方法的实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在这些实施方案中，可以使所述嵌合蛋白靶向需要细胞凋亡的细胞，例如肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞。在针对促进细胞存活的方法的实施方案中，举例来说，在用于治疗神经退行性病症的神经发生中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。换句话说，在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含允许有利于死亡或存活信号的经修饰的TNF-α剂。
在一些实施方案中，所述嵌合蛋白具有经修饰的TNF，所述经修饰的TNF对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，与野生型TNF和/或仅携带促使对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性的一个或多个突变的嵌合体相比，这种嵌合体是更有效的细胞凋亡诱导剂。在一些实施方案中，这种嵌合体可用于诱导肿瘤细胞死亡或肿瘤血管内皮细胞死亡(例如，用于治疗癌症)。此外，在一些实施方案中，举例来说，这些嵌合体避免或减少经由TNFR2激活Treg细胞，因此进一步支持TNFR1介导的体内抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，所述嵌合蛋白具有经修饰的TNF，所述经修饰的TNF对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，这种嵌合体在可能是各种疾病设定，包括但不限于刺激神经发生下的特定治疗目标的一些细胞类型中是更有效的细胞存活激活剂。另外，此类有利于TNFR2的嵌合体还可用于治疗自身免疫性疾病(例如克罗恩氏病、糖尿病、MS、结肠炎等和本文所描述的众多其他自身免疫性疾病)。在一些实施方案中，所述嵌合体靶向自身反应性T细胞。在一些实施方案中，所述嵌合体促进了Treg细胞激活和对细胞毒性T细胞的间接阻抑。
在一些实施方案中，所述嵌合体例如通过激活TNFR2和/或避免TNFR1而引起自身反应性T细胞的死亡(例如，对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性的经修饰的TNF)。不希望受理论束缚，这些自身反应性T细胞让其细胞凋亡/存活信号例如被NFkB途径活性/信号传导变化改变。在一些实施方案中，所述嵌合体引起具有NFkB途径损伤或修饰的自身反应性T细胞的死亡，所述损伤或修饰构成所述自身反应性T细胞的细胞死亡(细胞凋亡)/存活信号性质不平衡的基础，并且任选地改变了对某些诱导死亡的信号(例如，TNFR2激活)的易感性。
在一些实施方案中，基于TNFR-2的嵌合体在诸多疾病中具有额外的治疗应用，所述疾病包括各种自身免疫性疾病、心脏病、脱髓鞘和神经退行性病症，以及感染性疾病等等。
在一个实施方案中，所述野生型TNF-α具有氨基酸序列SEQ ID NO:352。
在此类实施方案中，所述经修饰的TNF-α剂在一个或多个氨基酸位置29、31、32、84、85、86、87、88、89、145、146和147处具有突变，从而产生了具有降低的受体结合亲和力的经修饰的TNF-α。参见例如美国专利号7,993,636，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的人TNF-α部分在如例如WO/2015/007903中所描述的一个或多个氨基酸位置R32、N34、Q67、H73、L75、T77、S86、Y87、V91、I97、T105、P106、A109、P113、Y115、E127、N137、D143、A145和E146处具有突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号根据人TNF序列，Genbank登记号BAG70306，版本BAG70306.1，Gl:197692685)。在一些实施方案中，所述经修饰的人TNF-α部分具有选自L29S、R32G、R32W、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、T77A、S86G、S86T、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、Y87H、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G、A145R、A145T、E146D、E146K和S147D的取代突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有选自Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F和Y87H的突变。在另一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有选自I97A、I97Q和I97S的突变。在另一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有选自Y115A和Y115G的突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有E146K突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有Y87H和E146K突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有Y87H和A145R突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有R32W和S86T突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有R32W和E146K突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有L29S和R32W突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有D143N和A145R突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有D143N和A145R突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有A145T、E146D和S147D突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有A145T和S147D突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的TNF-α剂具有选自如WO2008/124086中所描述的N39Y、S147Y和Y87H的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的人TNF-α部分具有如PCT/IB2016/001668中所描述的提供受体选择性的突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，TNF突变是TNF-R1选择性的。在一些实施方案中，TNF-R1选择性的TNF突变处在位置R32、S86和E146中的一个或多个处。在一些实施方案中，TNF-R1选择性的TNF突变是R32W、S86T和E146K中的一者或多者。在一些实施方案中，TNF-R1选择性的TNF突变是R32W、R32W/S86T、R32W/E146K和E146K中的一者或多者。在一些实施方案中，TNF突变是TNF-R2选择性的。在一些实施方案中，TNF-R2选择性的TNF突变处在位置A145、E146和S147中的一个或多个处。在一些实施方案中，TNF-R2选择性的TNF突变是A145T、A145R、E146D和S147D中的一者或多者。在一些实施方案中，TNF-R2选择性的TNF突变在A145R、A145T/S147D和A145T/E146D/S147D中的一者或多者。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是TNF-β。TNF-β可以与LT-β(LT-α1β2)形成同源三聚体或异源三聚体。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2和/或疱疹病毒进入介体(HEVM)和/或LT-βR具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型TNF-β具有氨基酸序列SEQ ID NO:353。
在此类实施方案中，所述经修饰的可溶性剂可以在106-113位的一个或多个氨基酸处包含突变，从而产生对TNFR2具有降低的受体结合亲和力的经修饰的TNF-β。在一个实施方案中，所述经修饰的可溶性剂在氨基酸位置106-113处具有一个或多个取代突变。在说明性实施方案中，所述取代突变选自Q107E、Q107D、S106E、S106D、Q107R、Q107N、Q107E/S106E、Q107E/S106D、Q107D/S106E和Q107D/S106D。在另一个实施方案中，所述经修饰的可溶性剂在位置106-113处具有约1至约3个氨基酸的插入。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它可以是如WO 2015/007903中所描述的单链三聚体形式，所述文献的全部内容以引用的方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它在TNFR1处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它还任选地对TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它在TNFR2处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它还任选地对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。此类实施方案的构建体可用于例如以细胞特异性方式阻遏TNF应答的方法中。在一些实施方案中，所述拮抗性TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)是如WO 2015/007903中所描述的单链三聚体形式。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是TRAIL。在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂对DR4(TRAIL-RI)和/或DR5(TRAIL-RII)和/或DcR1和/或DcR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂对DR4(TRAIL-RI)和/或DR5(TRAIL-RII)和/或DcR1和/或DcR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型TRAIL具有氨基酸序列SEQ ID NO:354。
在此类实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以在氨基酸位置T127-R132、E144-R149、E155-H161、Y189-Y209、T214-1220、K224-A226、W231、E236-L239、E249-K251、T261-H264和H270-E271处包含突变(编号根据人序列，Genbank登记号NP_003801，版本10NP_003801.1，Gl：4507593；参见上文)。
在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以包含一个或多个突变，所述一个或多个突变基本上降低了所述经修饰的TRAIL剂对TRAIL-R1的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以特异性地结合TRIL-R2。示例性突变包括在一个或多个氨基酸位置Y189、R191、Q193、H264、I266和D267处的突变。举例来说，所述突变可以是Y189Q、R191K、Q193R、H264R、I266L和D267Q中的一者或多者。在一个实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂包含突变Y189Q、R191K、Q193R、H264R、I266L和D267Q。
在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以包含一个或多个突变，所述一个或多个突变基本上降低了所述经修饰的TRAIL剂对TRAIL-R2的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以特异性地结合TRIL-R1。示例性突变包括在一个或多个氨基酸位置G131、R149、S159、N199、K201和S215处的突变。举例来说，所述突变可以是G131R、R149I、S159R、N199R、K201H和S215D中的一者或多者。在一个实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂包含突变G131R、R149I、S159R、N199R、K201H和S215D。另外的TRAIL突变描述于例如Trebing等人,(2014)Cell Death and Disease,5:e1035，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是TGFα。在此类实施方案中，所述经修饰的TGFα剂对表皮生长因子受体(EGFR)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的TGFα剂对表皮生长因子受体(EGFR)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是TGFβ。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂任选地对TGFBR3具有降低或基本上降低或消除的亲和力和/或活性，不希望受理论束缚，所述TGFBR3可以充当TGF-β受体的配体的储库。在一些实施方案中，相对于TGFBR2，TGFβ可能更倾向于TGFBR1，或者相对于TGFBR1，TGFβ可能更倾向于TGFBR2。相似地，不希望受理论束缚，LAP可以充当TGF-β受体的配体的储库。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性，并且/或者对潜在型相关肽(LAP)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，此类嵌合体可用于卡-恩二氏病(Camurati-Engelmann disease)或与不适当的TGFβ信号转导相关的其他疾病。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它在TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3中的一者或多者处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入本文)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它还任选地在TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3中的一者或多者处具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它在TGFBR1和/或TGFBR2处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入本文)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它还任选地在TGFBR3处具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是白介素。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-1。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-1α或IL-1β。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R1和/或IL-1RAcP具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R1和/或IL-1RAcP具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。举例来说，在一些实施方案中，本发明的经修饰的IL-1剂避免IL-1R2处的相互作用，并且因此基本上降低其作为治疗剂的引诱剂和/或接收剂的功能。
在一个实施方案中，所述野生型IL-1β具有IL-1β(成熟形式，野生型)的氨基酸序列(SEQ ID NO:355)。
IL1是促炎性细胞因子和重要的免疫系统调控剂。它是CD4T细胞应答的有效激活剂，能增加Th17细胞的比例以及产生IFNγ和IL-4的细胞的扩增。IL-1还是CD8+T细胞的有效调控剂，从而增强抗原特异性CD8+T细胞扩增、分化、移行至外围和记忆。IL-1受体包含IL-1R1和IL-1R2。结合至IL-1R1和经由IL-1R1进行信号传导构成了IL-1借以介导许多种其生物学(和病理学)活性的机制。IL1-R2可以起诱饵受体的作用，从而降低IL-1用于相互作用和经由IL-1R1进行信号传导的可用性。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1对IL-1R1具有降低的亲和力和/或活性(例如激动活性)。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1对IL-1R2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，存在可恢复的IL-1/IL-1R1信号传导，并且防止了IL-R2处治疗性嵌合体的损失，并且因此减少了所需IL-1的剂量(例如，相对于野生型或仅携带针对IL-R1的减毒突变的嵌合体)。此类构建体可用于例如治疗癌症，包括例如刺激免疫系统以建立抗癌应答的方法中。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1对IL-1R1具有降低的亲和力和/或活性(例如拮抗活性，例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1对IL-1R2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，存在不可恢复的IL-1/IL-1R1信号传导，并且防止了IL-R2处治疗性嵌合体的损失，并且因此减少了所需IL-1的剂量(例如，相对于野生型或仅携带针对IL-R1的减毒突变的嵌合体)。此类构建体可用于例如治疗自身免疫性疾病，包括例如阻抑免疫系统的方法中。
在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂具有氨基酸52-54缺失，这就产生了对I型IL-1R具有降低的结合亲和力并且具有降低的生物活性的经修饰的人IL-1β。参见例如WO 1994/000491，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述经修饰的人IL-1β具有选自A117G/P118G、R120X、L122A、T125G/L126G、R127G、Q130X、Q131G、K132A、S137G/Q138Y、L145G、H146X、L145A/L147A、Q148X、Q148G/Q150G、Q150G/D151A、M152G、F162A、F162A/Q164E、F166A、Q164E/E167K、N169G/D170G、I172A、V174A、K208E、K209X、K209A/K210A、K219X、E221X、E221S/N224A、N224S/K225S、E244K、N245Q的一个或多个取代突变(其中X可以是任何氨基酸变化，例如非保守变化)，从而表现出降低的与IL-1R的结合，如例如WO2015/007542和WO/2015/007536中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号基于人IL-1β序列，Genbank登记号NP_000567，版本NP-000567.1，Gl：10835145)。在一些实施方案中，所述经修饰的人IL-1β可以具有选自R120A、R120G、Q130A、Q130W、H146A、H146G、H146E、H146N、H146R、Q148E、Q148G、Q148L、K209A、K209D、K219S、K219Q、E221S和E221K的一个或多个突变。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变Q131G和Q148G。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变Q148G和K208E。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和Q131G。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146A。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146N。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146R。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146E。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146G。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和K208E。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G、F162A和Q164E。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-2。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-2Rα和/或IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-2Rα具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。此类实施方案可能有关于癌症的治疗，例如当所述经修饰的IL-2在IL-2Rβ和/或IL-2Rγ处具有激动性时。举例来说，本发明的构建体可能有利于减弱具有IL2受体β和γ的CD8+T细胞的激活(这可以提供抗肿瘤效应)，而不利于具有IL2受体α、β和γ的Treg(这可以提供免疫阻抑、促肿瘤效应)。此外，在一些实施方案中，偏好IL-2Rβ和/或IL-2Rγ超过IL-2Rα避免了诸多IL-2副作用，诸如肺水肿。而且，基于IL-2的嵌合体可用于治疗自身免疫性疾病，例如当所述经修饰的IL-2在IL-2Rβ和/或IL-2Rγ处具有拮抗性(例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)时。举例来说，本发明的构建体可能有利于减弱对具有IL2受体β和γ的CD8+T细胞的抑制(并且因此阻遏免疫应答)，而不利于具有IL2受体α、β和γ的Treg。或者，在一些实施方案中，携带IL-2的嵌合体有利于Treg的激活，并且因此有利于免疫阻抑，而不利于CD8+T细胞的激活。举例来说，这些构建体可用于治疗疾病或将受益于免疫阻抑的疾病，例如自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，所述嵌合蛋白具有如本文所描述的针对Clec9A+树突状细胞的靶向部分以及对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对IL-2Rα具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性的经修饰的IL-2剂。在一些实施方案中，这些构建体提供靶向性Clec9A+树突状细胞活性，并且一般对Treg细胞无活性(或具有基本上降低的活性)。在一些实施方案中，此类构建体与野生型IL-2相比具有增强的免疫刺激效应(例如，不希望受理论束缚，通过不刺激Treg)，同时消除或降低了与IL-2相关的全身毒性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-2具有IL-2(成熟形式，野生型)的氨基酸序列(SEQ ID NO:356)。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-2剂在氨基酸L72(L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R或L72K)、F42(F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R或F42K)和Y45(Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K)处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为与所述野生型IL-2相比，这些经修饰的IL-2剂对高亲和力IL-2受体具有降低的亲和力并且保留对中亲和力IL-2受体的亲和力。参见例如美国专利公布号2012/0244112，所述美国专利公布的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂在氨基酸R38、F42、Y45和E62处具有一个或多个突变。举例来说，所述经修饰的IL-2剂可以包含R38A、F42A、Y45A和E62A中的一者或多者。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以在C125处包含突变。举例来说，所述突变可以是C125S。在此类实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以对IL-2Rα具有基本上降低的亲和力和/或活性，如例如在Carmenate等人(2013)The Journal of Immunology,190:6230-6238中所描述，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，在R38、F42、Y45和/或E62处具有突变的所述经修饰的IL-2剂能够诱导效应细胞的扩增，所述效应细胞包括CD8+T细胞和NK细胞而不是Treg细胞。在一些实施方案中，在R38、F42、Y45和/或E62处具有突变的所述经修饰的IL-2剂相比野生型IL-2剂毒性更低。包含对IL-2Rα具有基本上降低的亲和力和/或活性的所述经修饰的IL-2剂的嵌合蛋白可以用于例如肿瘤学中。在其他实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以对IL-2Rβ具有基本上降低的亲和力和/或活性，如在例如WO2016/025385中所描述，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在此类实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以诱导Treg细胞而不是效应细胞(诸如CD8+T细胞和NK细胞)的扩增。包含对IL-2Rβ具有基本上降低的亲和力和/或活性的所述经修饰的IL-2剂的嵌合蛋白可以例如用于治疗自身免疫性疾病中。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以在氨基酸N88、D20和/或A126处包含一个或多个突变。举例来说，所述经修饰的IL-2剂可以包含N88R、N88I、N88G、D20H、Q126L和Q126F中的一者或多者。
在各个实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以在D109或C125处包含突变。举例来说，所述突变可以是D109C或C125S。在一些实施方案中，可以将在D109或C125处具有突变的经修饰的IL-2用于附接至PEG部分。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-3。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-3受体具有降低的亲和力和/或活性，所述IL-3受体是与跟普通β(βc或CD131)亚单位配对的独特α链的异源二聚体。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-3受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性，所述IL-3受体是与跟普通β(βc或CD131)亚单位配对的独特α链的异源二聚体。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-4。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对1型和/或2型IL-4受体具有降低的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对1型和/或2型IL-4受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。1型IL-4受体由具有普通γ链的IL-4Rα亚单位构成并且特异性地结合IL-4。2型IL-4受体包括与被称为IL-13Rα1的不同亚单位结合的IL-4Rα亚单位。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对2型IL-4受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-4具有IL-4(成熟形式，野生型)的氨基酸序列(SEQ ID NO:357)。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-4剂在氨基酸R121(R121A、R121D、R121E、R121F、R121H、R121I、R121K、R121N、R121P、R121T、R121W)、E122(E122F)、Y124(Y124A、Y124Q、Y124R、Y124S、Y124T)和S125(S125A)处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为这些经修饰的IL-4剂维持I型受体介导的活性，但是显著降低了其他受体介导的生物活性。参见例如美国专利号6,433,157，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-6。IL-6通过细胞表面I型细胞因子受体复合物进行信号传导，所述复合物包括配体结合IL-6R链(CD126)和信号转导组分gp130。IL-6还可以结合至IL-6R的可溶形式(sIL-6R)，后者是IL-6R的细胞外部分。sIL-6R/IL-6复合物可能参与神经突长出和神经元存活，并且因此可能在通过髓鞘再生进行的神经再生中非常重要。因此，在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-6R/gp130和/或sIL-6R具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-6R/gp130和/或sIL-6R具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-6具有IL-6(成熟形式，野生型)的氨基酸序列(SEQ ID NO:358)。
在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂在氨基酸58、160、163、171或177处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为这些经修饰的IL-6剂表现出降低的对IL-6Rα的结合亲和力和降低的生物活性。参见例如WO 97/10338，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-10。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-10受体1和IL-10受体2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-10受体1和IL-10受体2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-11。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-11Rα和/或IL-11Rβ和/或gp130具有降低的亲和力和/或活性。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-11Rα和/或IL-11Rβ和/或gp130具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-12。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2具有降低的亲和力和/或活性。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-13。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-4受体(IL-4Rα)和IL-13Rα1具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-4受体(IL-4Rα)或IL-13Rα1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-13具有IL-13(成熟形式，野生型)的氨基酸序列(SEQ ID NO:359)。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-13剂在氨基酸13、16、17、66、69、99、102、104、105、106、107、108、109、112、113和114处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为这些经修饰的IL-13剂表现出降低的生物活性。参见例如WO 2002/018422，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-18。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-18Rα和/或IL-18Rβ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-18Rα和/或IL-18Rβ具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对II型IL-18Rα，即缺乏信号传导所需的TIR结构域的IL-18Rα同种型具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-18具有IL-18(野生型)的氨基酸序列(SEQ IDNO:360)。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-18剂可以在选自如WO/2015/007542中所描述的Y37-K44、R49-Q54、D59-R63、E67-C74、R80、M87-A97、N 127-K129、Q139-M149、K165-K171、R183和Q190-N191的氨基酸或氨基酸区域处包含一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号基于人IL-18序列，Genbank登记号AAV38697，版本AAV38697.1，Gl：54696650)。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IL-33。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ST-2受体和IL-1RAcP具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ST-2受体和IL-1RAcP具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-33具有氨基酸序列SEQ ID NO:361。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-33剂可以在选自如WO/2015/007542中所描述的I113-Y122、S127-E139、E144-D157、Y163-M183、E200、Q215、L220-C227和T260-E269的氨基酸或氨基酸区域处包含一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号基于人序列，Genbank登记号NP_254274，版本NP_254274.1，Gl：15559209)。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是表皮生长因子(EGF)。EGF是有效生长因子家族的成员。成员包括EGF、HB-EGF，以及其他成员，诸如TGFα、双调蛋白、神经调节蛋白、上皮调节蛋白、β细胞蛋白。EGF家族受体包括EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3和ErbB4。这些受体可以充当同源二聚体和/或异源二聚体受体亚型。不同的EGF家族成员对各种受体亚型表现出不同的选择性。举例来说，EGF与ErbB1/ErbB1、ErbB1/ErbB2、ErbB4/ErbB2和其他一些异源二聚体亚型相关。HB-EGF具有相似的模式，但它也与ErbB4/4相关。积极或消极地调节EGF(EGF样)生长因子信号传导具有相当大的治疗意义。举例来说，在EGFR信号构成主要的促进生长信号的各种癌症的治疗中，抑制EGFR信号是有意义的。或者，在例如促进伤口愈合(急性和慢性)、口腔粘膜炎(各种癌症疗法，包括但不限于放射疗法的主要副作用)中，刺激EGFR信号传导具有治疗意义。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4具有降低的亲和力和/或活性。此类实施方案可用于例如治疗伤口的方法中。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂结合至一个或多个ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4并拮抗这些受体的活性。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4具有降低的亲和力和/或活性，这允许以减弱的方式拮抗这些受体的活性。此类实施方案可用于例如癌症的治疗中。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1具有降低的亲和力和/或活性。ErbB1是激酶抑制剂的治疗靶标-这些激酶抑制剂大多数具有副作用，因为它们的选择性不高(例如，吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、布加替尼(brigatinib)和艾克替尼(icotinib))。在一些实施方案中，与靶向EGF受体的其他药剂相比，减弱的拮抗性ErbB1信号传导更具中靶性并且具有更少的副作用。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1具有降低的亲和力和/或活性(例如拮抗性，例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)并且/或者对ErbB4或可能与其相互作用的其他亚型具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。通过经由靶向部分进行特异性靶向，将实现对ErbB1/ErbB1受体激活的细胞选择性阻抑(拮抗作用，例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)，而不牵涉可能与抑制相关副作用有关的其他受体亚型。因此，与在体内抑制所有细胞类型中的EGFR活性的EGFR激酶抑制剂相比，这种构建体将提供细胞选择性(例如，由于受体扩增、过度表达等原因而具有激活的EGFR信号传导的肿瘤细胞)抗EGFR(ErbB1)药物作用，且副作用减少。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB4和/或可能与其相互作用的其他亚型具有降低的亲和力和/或活性(例如激动性)。通过经由靶向部分靶向特定靶细胞，实现了ErbB1信号传导的选择性激活(例如上皮细胞)。在一些实施方案中，这种构建体可用于治疗伤口(促进愈合)且副作用减少，尤其可用于治疗慢性疾患和治疗剂局部施用以外的应用(例如全身性伤口愈合)。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施方案中，所述经修饰的胰岛素或胰岛素类似物对胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的胰岛素或胰岛素类似物对胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。胰岛素受体处减弱的应答允许控制糖尿病、肥胖症、代谢紊乱等，而直接远离IGF1或IGF2受体则避免了前癌的影响。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是胰岛素样生长因子I或胰岛素样生长因子II(IGF-1或IGF-2)。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IGF-1。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对胰岛素受体和/或IGF1受体具有降低的亲和力和/或活性。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂可以结合至IGF1受体并且拮抗该受体的活性。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IGF1受体具有降低的亲和力和/或活性，这允许以减弱的方式拮抗该受体的活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对胰岛素受体和/或IGF1受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IGF2受体具有降低的亲和力和/或活性，这允许以减弱的方式拮抗该受体的活性。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对胰岛素受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性，并且因此不干扰胰岛素信号传导。在各个实施方案中，这适用于癌症治疗。在各个实施方案中，本发明的剂可以防止IR同种型A引起对癌症治疗的抗性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对Clec9A的靶向部分和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所描述的修饰或突变的信号传导剂中的任一种。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对树突状细胞上的Clec9A的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对Clec9A的靶向部分和(ii)针对检查点抑制剂标记物的靶向部分，以及本文所描述的修饰或突变的干扰素中的任一种。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对树突状细胞上的Clec9A的靶向部分和针对PD-1的第二靶向部分。
在各个实施方案中，所述信号传导剂是毒素或有毒的酶。在一些实施方案中，所述毒素或有毒的酶来源于植物和细菌。说明性的毒素或有毒的酶包括但不限于白喉毒素、假单胞菌毒素、炭疽毒素、核糖体灭活蛋白(RIP)诸如篦麻毒素和肥皂草素、葫莲根毒素、相思子毒素、白树毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。另外的毒素包括Mathew等人,(2009)Cancer Sci100(8):1359-65中所公开的那些，全部公开内容特此以引用方式并入。在此类实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以用于以细胞类型特异性方式诱导细胞死亡。在此类实施方案中，所述毒素可以经过修饰，例如突变以降低所述毒素的亲和力和/或活性以便减弱效应，如针对本文的其他信号传导剂所描述。
具有信号传导剂的多特异性嵌合体和融合物
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是具有一种或多种如本文所描述的信号传导剂和/或一个或多个额外靶向部分的嵌合体或融合物的一部分。因此，本发明提供了包括一种或多种信号传导剂和针对Clec9A的靶向部分和/或一个或多个额外靶向部分的嵌合或融合蛋白。
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是多特异性的，即所述Clec9A结合剂包含两个或更多个靶向部分，所述靶向部分具有识别并结合两个或更多个靶标(例如抗原或受体或表位)的识别结构域。在此类实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以包含两个或更多个靶向部分，所述靶向部分具有识别并结合相同抗原上或不同抗原上的两个或更多个表位的识别结构域。在各个实施方案中，此类多特异性Clec9A结合剂表现出诸多有利性质，诸如增加的亲合力和/或提高的选择性。在一个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含两个靶向部分并且是双特异性的，即结合并识别相同抗原上或不同抗原上的两个表位。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含两个或更多个靶向部分，各靶向部分是如本文所描述的抗体或抗体衍生物。在一个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含至少一个包含针对Clec9A的抗原识别结构域的VHH和一个包含针对肿瘤抗原的抗原识别结构域的抗体或抗体衍生物。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂具有靶向不同抗原或受体的两个或更多个靶向部分，并且一个靶向部分可以减弱其抗原或受体，例如所述靶向部分以低亲和力或亲合力结合其抗原或受体(包括例如以比其他靶向部分对其抗原或受体具有的亲和力或亲合力低的亲和力或亲合力，举例来说，结合亲和力之间的差异可以是约10倍、或25倍、或50倍、或100倍、或300倍、或500倍、或1000倍、或5000倍；举例来说，较低亲和力或亲合力靶向部分能以中至高nM或低至中μM范围内的KD结合其抗原或受体，而较高亲和力或亲合力靶向部分能以中至高pM或低至中nM范围内的KD结合其抗原或受体)。举例来说，在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含减毒的靶向部分，所述减毒的靶向部分针对混杂抗原或受体，从而可以改善对目标细胞的靶向(例如经由其他靶向部分)并且防止多个类型的细胞，包括疗法未靶向的那些细胞的效应(例如通过以比这些实施方案中提供的亲和力更高的亲和力结合混杂抗原或受体)。
可以使用本领域中已知的方法来构建本发明的多特异性Clec9A结合剂，参见例如美国专利号9,067,991、美国专利公布号20110262348和WO 2004/041862，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一个说明性实施方案中，可以通过化学交联，例如通过如Blattler等人,Biochemistry 24,1517-1524和EP294703所描述使氨基酸残基与有机衍生化剂反应来构建本发明的包含两个或更多个靶向部分的多特异性Clec9A结合剂，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在另一个说明性实施方案中，通过基因融合，即构建包括个别靶向部分的多肽的单多肽来构建包含两个或更多个靶向部分的多特异性Clec9A结合剂。举例来说，可以形成单多肽构建体，所述构建体编码具有针对Clec9A的抗原识别结构域的第一VHH和具有针对肿瘤抗原的抗原识别结构域的第二抗体或抗体衍生物。PCT专利申请WO 96/34103中公开了一种用于产生二价或多价VHH多肽构建体的方法，所述专利申请的全部内容特此以引用方式并入。在另一个说明性实施方案中，可以通过使用接头来构建本发明的多特异性Clec9A结合剂。举例来说，具有针对Clec9A的抗原识别结构域的第一VHH的羧基端可以连接至具有针对肿瘤抗原的抗原识别结构域的第二抗体或抗体衍生物的氨基端(或反之亦然)。本文描述了可以使用的示例性接头。在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂的组分没有使用接头而直接与彼此连接。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂识别并结合至Clec9A和在一个或多个免疫细胞上发现的一个或多个抗原，所述免疫细胞可以包括但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤T细胞)、B淋巴细胞、浆细胞、树突状细胞或它们的子集。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂特异性地结合至目标抗原并且有效地直接或间接地募集一个或多个免疫细胞。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂识别并结合至Clec9A和在肿瘤细胞上发现的一个或多个抗原。在这些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以将免疫细胞直接或间接地募集至肿瘤细胞或肿瘤微环境。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂可以将免疫细胞，例如可以杀死和/或阻抑肿瘤细胞的免疫细胞(例如CTL)直接或间接地募集至作用位点(作为非限制性实例，诸如肿瘤微环境)。
在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂能够或可用于涉及改变有利于肿瘤的免疫攻击的免疫细胞平衡的方法中。举例来说，本发明的Clec9A结合剂可以改变临床重要部位处的免疫细胞比率，从而有利于可以杀死和/或阻抑肿瘤的细胞(例如T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如M1巨噬细胞)、嗜中性粒细胞、B细胞、树突状细胞或它们的子集，并且对抗保护肿瘤的细胞(例如骨髓来源的阻抑细胞(MDSC)、调控T细胞(Treg)、肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或它们的子集)。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂能够增加效应T细胞与调控T细胞的比率。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与肿瘤细胞相关的抗原的识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集肿瘤细胞。举例来说，在一些实施方案中，将肿瘤细胞募集至可以杀死和/或阻抑肿瘤细胞的一个或多个效应细胞(例如本文所描述的免疫细胞)。在一些实施方案中，所述靶向部分例如通过与它们各自的在肿瘤和Clec9A阳性免疫细胞(例如树突状细胞)上的抗原相互作用的两个靶向部分直接或间接地将T细胞募集至肿瘤细胞。
肿瘤细胞或癌细胞是指细胞或组织的不受控制的生长和/或细胞存活时间的异常增加和/或对干扰身体器官和系统的正常功能的细胞凋亡的抑制。举例来说，肿瘤细胞包括良性和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。说明性肿瘤细胞包括但不限于以下细胞：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝脏癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)性NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小未分裂细胞性NHL；巨大肿块性NHL(bulky disease NHL)；套细胞性淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌瘤和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征(Meigs’syndrome)。
肿瘤细胞或癌细胞还包括但不限于癌瘤，例如各种亚型，包括例如腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、肉瘤(包括例如骨和软组织)、白血病(包括例如急性骨髓性、急性成淋巴细胞性、慢性骨髓性、慢性淋巴细胞性和毛细胞)、淋巴瘤和骨髓瘤(包括例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、轻链、非分泌性、MGUS和浆细胞瘤)和中枢神经系统癌症(包括例如脑(例如神经胶质瘤(例如星形细胞瘤、寡枝神经胶质瘤和室管膜瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经瘤和脊髓肿瘤(例如脑膜瘤和纤维神经瘤)。
说明性肿瘤抗原包括但不限于MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE家族肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎儿球蛋白、E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白、β-连锁蛋白和γ-连锁蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头状瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、NA、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1CT-7、c-erbB-2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD56、CD70、CD74、CD138、AGS16、MUC1、GPNMB、Ep-CAM、PD-L1、PD-L2、PMSA和BCMA(TNFRSF17)。在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含结合这些肿瘤抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂识别并结合至Clec9A以及在肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，所述多特异性Clec9A结合剂将CTL直接或间接地募集至所述肿瘤细胞或肿瘤微环境。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂具有靶向两种不同的细胞(例如，以形成突触)或相同的细胞(例如，以得到更浓的信号传导剂效果)的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与T细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集T细胞。在一个实施方案中，所述抗原识别结构域特异性地结合至效应T细胞。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域直接或间接地募集效应T细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。说明性效应T细胞包括细胞毒性T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD8+、CD45RO+)；CD4+效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+、CCR7+、CD62L高、IL-7R/CD127+)；CD8+效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD8+、CCR7+、CD62L高、IL-7R/CD127+)；效应记忆T细胞(例如CD62L低、CD44+、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+、CCR7低)；中枢记忆T细胞(例如CCR7+、CD62L+、CD27+；或CCR7高、CD44+、CD62L高、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+)；CD62L+效应T细胞；CD8+效应记忆T细胞(TEM)，包括早期效应记忆T细胞(CD27+CD62L-)和晚期效应记忆T细胞(CD27-CD62L-)(分别是TemE和TemL)；CD127(+)CD25(低/-)效应T细胞；CD127(-)CD25(-)效应T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞(TSCM)(例如CD44(低)CD62L(高)CD122(高)sca(+))；TH1效应T细胞(例如CXCR3+、CXCR6+和CCR5+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-12R+、IFNγR+、CXCR3+)、TH2效应T细胞(例如CCR3+、CCR4+和CCR8+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-4R+、IL-33R+、CCR4+、IL-17RB+、CRTH2+)；TH9效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+)；TH17效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+、IL-23R+、CCR6+、IL-1R+)；CD4+CD45RO+CCR7+效应T细胞、ICOS+效应T细胞；CD4+CD45RO+CCR7(-)效应T细胞；和分泌IL-2、IL-4和/或IFN-γ的效应T细胞。
说明性目标T细胞抗原包括例如(并且在适当时包括细胞外结构域)：CD8、CD3、SLAMF4、IL-2Rα、4-1BB/TNFRSF9、IL-2Rβ、ALCAM、B7-1、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMFS、CEACAM1、IL-6R、CCR3、IL-7Rα、CCR4、CXCRl/IL-S RA、CCR5、CCR6、IL-10Rα、CCR 7、IL-l 0Rβ、CCRS、IL-12Rβ1、CCR9、IL-12Rβ2、CD2、IL-13Rα1、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CDS5j、ILT3/CDS5k、ILT4/CDS5d、ILT5/CDS5a、鲁特格林(lutegrin)α4/CD49d、CDS、整合素αE/CD103、CD6、整合素αM/CD 11b、CDS、整合素αX/CD11c、整合素β2/CDlS、KIR/CD15S、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD2S、KIR2DL3、CD30/TNFRSFS、KIR2DL4/CD15Sd、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CDS3、白三烯B4-R1、CDS4/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、普通γ链/IL-2Rγ、骨调素、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择素、CXCR3、SIRPβ1、CXCR4、SLAM、CXCR6、TCCR/WSX-1、DNAM-1、促胸腺生成素、EMMPRIN/CD147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、FcγRIII/CD16、TIM-6、TNFR1/TNFRSF1A、粒溶素、TNF RIII/TNFRSF1B、TRAIL Rl/TNFRSFlOA、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAILR3/TNFRSF10C、IFN-γR1、TRAILR4/TNFRSF10D、IFN-γR2、TSLP、IL-1R1和TSLP R。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性T细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含针对CD8的靶向部分，所述靶向部分是包含具有四个“框架区”或FR和三个“互补决定区”或CDR的单个氨基酸链的VHH。如本文所使用，“框架区”或“FR”是指可变结构域中位于CDR之间的区域。如本文所使用，“互补决定区”或“CDR”是指VHH中含有能够特异性地结合至抗原靶标的氨基酸序列的可变区。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含针对CD8的VHH，所述VHH具有包含至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列的可变结构域。
在一些实施方案中，所述CDR1序列选自SEQ ID NO:362或(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，所述CDR2序列选自(SEQ ID NO:363)或(SEQ ID NO:364)。
在一些实施方案中，所述CDR3序列选自SEQ ID NO:365)或(SEQ ID NO:366)或(SEQ ID NO:367)。
在各个实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：R3HCD27(SEQ ID NO:368)或R3HCD129(SEQ ID NO:369)或R2HCD26(SEQ ID NO:370)。
在各个实施方案中，所述CD8靶向部分包含具有可变结构域的VHH，所述可变结构域包含如下文所描述的至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列。
在一些实施方案中，所述CDR1序列选自SEQ ID NO:371至SEQ ID NO:438或SEQ IDNO:52。
在一些实施方案中，所述CDR2序列选自SEQ ID NO:439至SEQ ID NO:507。
在一些实施方案中，所述CDR3序列选自SEQ ID NO:508至SEQ ID NO:576。
在各个实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：1CDA 7(SEQ ID NO:577)或1CDA 12(SEQ ID NO:578)或1CDA 14(SEQ ID NO:579)或1CDA 15(SEQID NO:580)或1CDA 17(SEQ ID NO:581)或1CDA 18(SEQ ID NO:582)或1CDA 19(SEQ IDNO:583)或1CDA 24(SEQ ID NO:584)或1CDA 26(SEQ ID NO:585)或1CDA 28(SEQ ID NO:586)或1CDA 37(SEQ ID NO:587)或1CDA 43(SEQ ID NO:588)或1CDA 45(SEQ ID NO:589)或1CDA 47(SEQ ID NO:590)或1CDA 48(SEQ ID NO:591)或1CDA 58(SEQ ID NO:592)或1CDA 65(SEQ ID NO:593)或1CDA 68(SEQ ID NO:594)或1CDA 73(SEQ ID NO:595)或1CDA75(SEQ ID NO:596)或1CDA 86(SEQ ID NO:597)或1CDA 87(SEQ ID NO:598)或1CDA 88(SEQ ID NO:599)或1CDA 89(SEQ ID NO:600)或1CDA 92(SEQ ID NO:601)或1CDA 93(SEQID NO:602)或2CDA 1(SEQ ID NO:603)或2CDA 5(SEQ ID NO:604)或2CDA 22(SEQ ID NO:605)或2CDA 28(SEQ ID NO:606)或2CDA 62(SEQ ID NO:607)或2CDA 68(SEQ ID NO:608)或2CDA 73(SEQ ID NO:609)或2CDA 74(SEQ ID NO:610)或2CDA 75(SEQ ID NO:611)或2CDA 77(SEQ ID NO:612)或2CDA 81(SEQ ID NO:613)或2CDA 87(SEQ ID NO:614)或2CDA88(SEQ ID NO:615)或2CDA 89(SEQ ID NO:616)或2CDA 91(SEQ ID NO:617)或2CDA 92(SEQ ID NO:618)或2CDA 93(SEQ ID NO:619)或2CDA 94(SEQ ID NO:620)或2CDA 95(SEQID NO:621)或3CDA 3(SEQ ID NO:622)或3CDA 8(SEQ ID NO:623)或3CDA 11(SEQ ID NO:624)或3CDA 18(SEQ ID NO:625)或3CDA 19(SEQ ID NO:626)或3CDA 21(SEQ ID NO:627)或3CDA 24(SEQ ID NO:628)或3CDA 28(SEQ ID NO:629)或3CDA 29(SEQ ID NO:630)或3CDA 31(SEQ ID NO:631)或3CDA 32(SEQ ID NO:632)或3CDA 33(SEQ ID NO:633)或3CDA37(SEQ ID NO:634)或3CDA 40(SEQ ID NO:635)或3CDA 41(SEQ ID NO:636)或3CDA 48(SEQ ID NO:637)或3CDA 57(SEQ ID NO:638)或3CDA 65(SEQ ID NO:639)或3CDA 70(SEQID NO:640)或3CDA 73(SEQ ID NO:641)或3CDA 83(SEQ ID NO:642)或3CDA 86(SEQ IDNO:643)或3CDA 88(SEQ ID NO:644)或3CDA 90(SEQ ID NO:645)。在各个示例性实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自以上序列中的任一者而没有末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:324)。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自SEQ ID No:577-645(以上提供)而没有HA标签的氨基酸序列(即，YPYDVPDYGS；SEQ ID NO:325)。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自SEQ ID No:577-645(以上提供)而没有AAA接头(即AAA)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自SEQ ID No:577-645(以上提供)而没有AAA接头、HA标签和末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即AAAYPYDVPDYGSHHHHHH；SEQID NO:326)。在各个实施方案中，所述CD8靶向部分包含在美国专利公布号2014/0271462中所描述的氨基酸序列，所述专利公布的全部内容以引用方式并入。在各个实施方案中，所述CD8靶向部分包含在美国专利公布号2014/0271462的表0.1、表0.2、表0.3和/或图1A-图12I中所描述的氨基酸序列，所述专利公布的全部内容以引用方式并入。在各个实施方案中，所述CD8靶向部分包含SEQ ID NO:646或647的HCDR1的HCDR1、和/或SEQ ID NO:646或647的HCDR1的HCDR2、和/或SEQ ID NO:646或647的HCDR1的HCDR3、和/或SEQ ID NO:648的LCDR1的LCDR1、和/或SEQ ID NO:648的LCDR1的LCDR2、和/或SEQ ID NO:648的LCDR1的LCDR3，如下文所提供。
在各个实施方案中，本发明设想使用如本文所描述的针对CD8的靶向部分的任何天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直系同源物(本文中统称为“类似物”)。在各个实施方案中，所述针对CD8的靶向部分的氨基酸序列还包括氨基酸类似物、氨基酸衍生物或其他非经典氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与B细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集B细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。说明性目标B细胞抗原包括例如CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD70、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDw130、CD138、CDw150和B细胞成熟抗原(BCMA)。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性B细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与天然杀伤细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集天然杀伤细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。说明性目标天然杀伤细胞抗原包括例如TIGIT、2B4/SLAMF4、KIR2DS4、CD155/PVR、KIR3DL1、CD94、LMIR1/CD300A、CD69、LMIR2/CD300c、CRACC/SLAMF7、LMIR3/CD300LF、Kir1α、DNAM-1、LMIR5/CD300LB、Fc-εRII、LMIR6/CD300LE、Fc-γRl/CD64、MICA、Fc-γRIIB/CD32b、MICB、Fc-γRIIC/CD32c、MULT-1、Fc-γRIIA/CD32a、结合素-2/CD112、Fc-γRIII/CD16、NKG2A、FcRH1/IRTA5、NKG2C、FcRH2/IRTA4、NKG2D、FcRH4/IRTA1、NKp30、FcRH5/IRTA2、NKp44、Fc受体样蛋白3/CD16-2、NKp46/NCR1、NKp80/KLRF1、NTB-A/SLAMF6、Rae-1、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1δ、H60、Rae-1ε、ILT2/CD85j、Rae-1γ、ILT3/CD85k、TREM-1、ILT4/CD85d、TREM-2、ILT5/CD85a、TREM-3、KIR/CD158、TREML1/TLT-1、KIR2DL1、ULBP-1、KIR2DL3、ULBP-2、KIR2DL4/CD158d和ULBP-3。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性NK细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与巨噬细胞/单核细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集巨噬细胞/单核细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。说明性目标巨噬细胞/单核细胞抗原包括例如SIRP1a、B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、普通β链、整合素α4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整合素αX/CDllc、CCL6/C10、整合素β2/CD18、CD155/PVR、整合素β3/CD61、CD31/PECAM-1、胶乳素、CD36/SR-B3、白三烯B4R1、CD40/TNFRSF5、LIMPIIISR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、EMMPRIN/CD147、MGL2、内皮素/CD105、骨激活素/GPNMB、Fc-γRI/CD64、骨调素、Fc-γRIIB/CD32b、PD-L2、Fc-γRIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、Fc-γRIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、Fc-γRIII/CD16、SLAM、GM-CSF Rα、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-γRl、TLR4、IFN-γR2、TREM-l、IL-l RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREML1/TLT-1、2B4/SLAMF 4、IL-10Rα、ALCAM、IL-10Rβ、氨基肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、普通β链、ILT3/CD85k、Clq R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、CD206、整合素α4/CD49d、CCR5、整合素αM/CDll b、CCR8、整合素αX/CDllc、CD155/PVR、整合素β2/CD18、CD14、整合素β3/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4-R1、CD68、LIMPIIISR-B2、CD84/SLAMF5、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、CD163、LMIR3/CD300LF、凝血因子III/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、EMMPRIN/CD147、MMR、内皮素/CD105、NCAM-L1、Fc-γRI/CD64、PSGL-1、Fc-γRIIIICD16、RP105、G-CSFR、L-选择素、GM-CSF Rα、Siglec-3/CD33、HVEM/TNFRSF14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-l、IL-6R、TREM-2、CXCRl/IL-8RA、TREM-3和TREMLl/TLT-1。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性巨噬细胞/单核细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与树突状细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集树突状细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。说明性目标树突状细胞抗原包括例如CLEC9A、XCR1、RANK、CD36/SRB3、LOX-1/SR-E1、CD68、MARCO、CD163、SR-A1/MSR、CD5L、SREC-1、CL-Pl/COLEC12、SREC-II、LIMPIIISRB2、RP105、TLR4、TLR1、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-IBB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23p40、4-氨基-1,8-萘二甲酰胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-氧代-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、鲁特格林α4/CD49d、Aag、整合素β2/CD18、AMICA、朗格汉斯蛋白(Langerin)、B7-2/CD86、白三烯B4 Rl、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8、LMIR2/CD300c、Clq R1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4-a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAMLl、CD2F-10/SLAMF9、骨激活素GPNMB、Chern 23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、CLEC-8、Siglec-2/CD22、CRACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、DEC-205、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、Dectin-1/CLEC7A、Siglec-F、Dectin-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD148、SIGNR4、DLEC、SLAM、EMMPRIN/CD147、TCCR/WSX-1、Fc-γR1/CD64、TLR3、Fc-γRIIB/CD32b、TREM-1、Fc-γRIIC/CD32c、TREM-2、Fc-γRIIA/CD32a、TREM-3、Fc-γRIII/CD16、TREML1/TLT-1、ICAM-2/CD102、DEC205和辣椒素R1。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性DC抗原中的一者或多者的靶向部分。
在各个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少60％同一性的氨基酸序列。举例来说，所述嵌合蛋白可以包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％同一性(例如，与本文公开的序列中的任一者具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至选自但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的免疫细胞上的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域直接或间接地募集巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与巨核细胞和/或血小板相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。说明性目标巨核细胞和/或血小板抗原包括例如GP IIb/IIIa、GPIb、vWF、PF4和TSP。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性巨核细胞和/或血小板抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与红细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。说明性目标红细胞抗原包括例如CD34、CD36、CD38、CD41a(血小板糖蛋白IIb/IIIa)、CD41b(GPIIb)、CD71(转铁蛋白受体)、CD105、血型糖蛋白A、血型糖蛋白C、c-kit、HLA-DR、H2(MHC-II)和恒河猴抗原。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性红细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与肥大细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。说明性目标肥大细胞抗原包括例如SCFR/CD117、FcεRI、CD2、CD25、CD35、CD88、CD203c、C5R1、CMAl、FCERlA、FCER2、TPSABl。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性肥大细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与嗜碱性粒细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。说明性目标嗜碱性粒细胞抗原包括例如FcεRI、CD203c、CD123、CD13、CD107a、CD107b和CD164。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性嗜碱性粒细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与嗜中性粒细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。说明性目标嗜中性粒细胞抗原包括例如7D5、CD10/CALLA、CD13、CD16(FcRIII)、CD18蛋白(LFA-1、CR3和p150、95)、CD45、CD67和CD177。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性嗜中性粒细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至与嗜酸性粒细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。说明性目标嗜酸性粒细胞抗原包括例如CD35、CD44和CD69。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性嗜酸性粒细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至本领域技术人员已知的任何适当抗原或受体或细胞表面标记物的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述抗原或细胞表面标记物是组织特异性标记物。说明性组织特异性标记物包括但不限于内皮细胞表面标记物，诸如ACE、CD14、CD34、CDH5、ENG、ICAM2、MCAM、NOS3、PECAMl、PROCR、SELE、SELP、TEK、THBD、VCAMl、VWF；平滑肌细胞表面标记物，诸如ACTA2、MYHlO、MYHl 1、MYH9、MYOCD；成纤维细胞(基质)细胞表面标记物，诸如ALCAM、CD34、COLlAl、COL1A2、COL3A1、FAP、PH-4；上皮细胞表面标记物，诸如CDlD、K6IRS2、KRTlO、KRT13、KRT17、KRT18、KRT19、KRT4、KRT5、KRT8、MUCl、TACSTDl；新生血管标记物，诸如CD13、TFNA、α-vβ-3(αVβ3)、E-选择素；和脂肪细胞表面标记物，诸如ADIPOQ、FABP4和RETN。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含结合这些说明性抗原中的一者或多者的靶向部分。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至T细胞上表达的检查点标记物的抗原识别结构域的靶向部分，所述检查点标记物是例如PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、TIM3和A2aR中的一者或多者。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至检查点标记物的抗原识别结构域的靶向部分，所述检查点标记物是例如PD-1/PD-L1或PD-L2、CD28/CD80或CD86、CTLA4/CD80或CD86、ICOS/ICOSL或B7RP1、BTLA/HVEM、KIR、LAG3、CD137/CD137L、OX40/OX40L、CD27、CD40L、TIM3/Gal9和A2aR中的一者或多者。
作为非限制性实例，在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含(i)针对CD8的靶向部分；(ii)针对T细胞上表达的检查点标记物的靶向部分，所述检查点标记物是例如PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、Cd27、CD40L、TIM3和A2aR中的一者或多者；和/或(iii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所描述的经修饰的(例如突变的)信号传导剂中的任一种。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂具有一个或多个针对PD-1的靶向部分。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂具有一个或多个选择性地结合PD-1多肽的靶向部分。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含一个或多个选择性地结合PD-1多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或融合蛋白。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含针对PD1的VHH，所述VHH具有包含至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列的可变结构域。
在一些实施方案中，所述PD1 CDR1序列选自SEQ ID NO:649至SEQ ID NO:662。
在一些实施方案中，所述PD1 CDR2序列选自SEQ ID NO:663至SEQ ID NO:676。
在一些实施方案中，所述PD1 CDR3序列选自SEQ ID NO:677至SEQ ID NO:689。
在各个示例性实施方案中，所述PD1靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：2PD23(SEQ ID NO:690)或2PD26(SEQ ID NO:691)或2PD90(SEQ ID NO:692)或2PD106(SEQID NO:693)或2PD16(SEQ ID NO:694)或2PD71(SEQ ID NO:695)或2PD152(SEQ ID NO:696)或2PD12(SEQ ID NO:697)或3PD55(SEQ ID NO:698)或3PD82(SEQ ID NO:699)或2PD8(SEQID NO:700)或2PD27(SEQ ID NO:701)或2PD82(SEQ ID NO:702)或3PD36(SEQ ID NO:703)。
在各个示例性实施方案中，所述PD1靶向部分包含选自以上序列中的任一者而没有末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:324)。
在一些实施方案中，所述PD1靶向部分包含选自SEQ ID No:690-703(以上提供)而没有HA标签的氨基酸序列(即，YPYDVPDYGS；SEQ ID NO:325)。
在一些实施方案中，所述PD1靶向部分包含选自SEQ ID No:690-703(以上提供)而没有AAA接头(即AAA)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述PD1靶向部分包含选自SEQ ID No:690-703(以上提供)而没有AAA接头、HA标签和末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即AAAYPYDVPDYGSHHHHHH；SEQID NO:326)。在一个实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-1抗体喷罗珠单抗(pembrolizumab)(又名MK-3475、KEYTRUDA)或其片段。喷罗珠单抗和其他人源化抗PD-1抗体公开于Hamid等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335中，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的喷罗珠单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:704的重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:705的轻链。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-1抗体纳武单抗(nivolumab)(又名BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、OPDIVO)或其片段。纳武单抗(克隆5C4)和其他特异性地结合至PD-1的人单克隆抗体公开于US 8,008,449和WO 2006/121168中，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，纳武单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:706的重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:707的轻链。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-1抗体皮地利珠单抗(pidilizumab)(又名CT-011、hBAT或hBAT-1)或其片段。皮地利珠单抗和其他人源化抗PD-I单克隆抗体公开于US 2008/0025980和WO 2009/101611中，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自US 2008/0025980的SEQ ID NO:15-18的氨基酸序列：US 2008/0025980的SEQ ID No:15(SEQ ID NO:708)；US 2008/0025980的SEQ ID No:16(SEQ ID NO:709)；US 2008/0025980的SEQ ID No:17(SEQ ID NO:710)；US 2008/0025980的SEQ ID No:18(SEQ ID NO:711)；和/或重链，所述重链包含选自US 2008/0025980的SEQID NO:20-24的氨基酸序列：US 2008/0025980的SEQ ID No:20(SEQ ID NO:712)；US 2008/0025980的SEQ ID No:21(SEQ ID NO:713)；US 2008/0025980的SEQ ID No:22(SEQ ID NO:714)；US 2008/0025980的SEQ ID No:23(SEQ ID NO:715)；US 2008/0025980的SEQ ID No:24(SEQ ID NO:716)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含含有US 2008/0025980的SEQ ID NO:18的轻链和含有US 2008/0025980的SEQ ID NO:22的重链。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含AMP-514(又名MEDI-0680)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含WO2010/027827和WO 2011/066342中公开的PD-L2-Fc融合蛋白AMP-224，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在这种实施方案中，所述靶向部分可以包括包含WO2010/027827的SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:717)的靶向结构域和/或包含WO2010/027827的SEQ ID NO:83(SEQ ID NO:718)的B7-DC融合蛋白。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含肽AUNP 12或US 2011/0318373或8,907,053中公开的任何其他肽。举例来说，所述靶向部分可以包含具有SEQ ID NO:719的序列的AUNP 12(即，US 2011/0318373的化合物8或SEQ ID NO:49)：
SNTSESFK(SNTSESF)FRVTQLAPKAQIKE-NH2
Figure BDA0002443639310001081
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-1抗体1E3或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1E3或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:720的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:721的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-1抗体1E8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1E8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:722的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:723的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-1抗体1H3或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1H3或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:724的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:725的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如例如US 8,907,065和WO 2008/071447中所公开的针对PD-1的VHH，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，所述针对PD-1的VHH包含US 8,907,065的SEQ ID NO:347-351：US 8,907,065的SEQID No:347(SEQ ID NO:726)；US 8,907,065的SEQ ID No:348(SEQ ID NO:727)；US 8,907,065的SEQ ID No:349(SEQ ID NO:728)；US 8,907,065的SEQ ID No:350(SEQ ID NO:729)；US 8,907,065的SEQ ID No:351(SEQ ID NO:730)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US2011/0271358和WO2010/036959中所公开的抗PD-1抗体或其片段中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自US2011/0271358的SEQ ID NO:25-29的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID No:25(SEQ ID NO:731)；US2011/0271358的SEQ ID No:26(SEQ ID NO:732)；US2011/0271358的SEQ ID No:27(SEQ ID NO:733)；US2011/0271358的SEQ ID No:28(SEQ ID NO:734)；US2011/0271358的SEQ ID No:29(SEQ ID NO:735)；和/或轻链，所述轻链包含选自US2011/0271358的SEQ ID NO:30-33的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID No:30(SEQ ID NO:736)；US2011/0271358的SEQ ID No:31(SEQ ID NO:737)；US2011/0271358的SEQ ID No:32(SEQ ID NO:738)；US2011/0271358的SEQ ID No:33(SEQ ID NO:739)。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含一个或多个选自TSR-042(Tesaro,Inc.)、REGN2810(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)、PDR001(NovartisPharmaceuticals)和BGB-A317(BeiGene Ltd.)的针对PD-1的抗体或其抗体片段。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂具有一个或多个针对PD-L1的靶向部分。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂具有一个或多个选择性结合PD-L1多肽的靶向部分。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含一个或多个选择性地结合PD-L1多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或者融合蛋白。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含针对PD-L1的VHH，所述VHH具有包含至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列的可变结构域。
在一些实施方案中，所述PD-L1 CDR1序列选自SEQ ID NO:740至SEQ ID NO:770。
在一些实施方案中，所述PD-L1 CDR2序列选自SEQ ID NO:771至SEQ ID NO:801。
在一些实施方案中，所述PD-L1 CDR3序列选自SEQ ID NO:802至SEQ ID NO:832。
在各个示例性实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：2LIG2(SEQ ID NO:833)或2LIG3(SEQ ID NO:834)或2LIG16(SEQ ID NO:835)或2LIG22(SEQID NO:836)或2LIG27(SEQ ID NO:837)或2LIG29(SEQ ID NO:838)或2LIG30(SEQ ID NO:839)或2LIG34(SEQ ID NO:840)或2LIG35(SEQ ID NO:841)或2LIG48(SEQ ID NO:842)或2LIG65(SEQ ID NO:843)或2LIG85(SEQ ID NO:844)或2LIG86(SEQ ID NO:845)或2LIG89(SEQ ID NO:846)或2LIG97(SEQ ID NO:847)或2LIG99(SEQ ID NO:848)或2LIG109(SEQ IDNO:849)或2LIG127(SEQ ID NO:850)或2LIG139(SEQ ID NO:851)或2LIG176(SEQ ID NO:852)或2LIG189(SEQ ID NO:853)或3LIG3(SEQ ID NO:854)或3LIG7(SEQ ID NO:855)或3LIG8(SEQ ID NO:856)或3LIG9(SEQ ID NO:857)或3LIG18(SEQ ID NO:858)或3LIG20(SEQID NO:859)或3LIG28(SEQ ID NO:860)或3LIG29(SEQ ID NO:861)或3LIG30(SEQ ID NO:862)或3LIG33(SEQ ID NO:863)。
在各个示例性实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自以上序列中的任一者而没有末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:324)。
在一些实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自SEQ ID No:833-863(以上提供)而没有HA标签的氨基酸序列(即，YPYDVPDYGS；SEQ ID NO:325)。
在一些实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自SEQ ID No:833-863(以上提供)而没有AAA接头(即AAA)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自SEQ ID No:833-863(以上提供)而没有AAA接头、HA标签和末端组氨酸标签序列的氨基酸序列(即AAAYPYDVPDYGSHHHHHH；SEQ ID NO:326)。在一个实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-L1抗体MEDI4736(又名度伐鲁单抗(durvalumab))或其片段。MEDI4736对PD-L1具有选择性，并且阻断PD-L1与PD-1和CD80受体的结合。用于本文提供的方法中的MEDI4736及其抗原结合片段包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。MEDI4736的序列公开于WO/2016/06272中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:864)的重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:865的轻链。
在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包含含有的氨基酸序列即WO/2016/06272的SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:866)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO/2016/06272的SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:867)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-L1抗体阿特朱单抗(atezolizumab)(又名MPDL3280A、RG7446)或其片段。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的阿特朱单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:868的重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:869的轻链。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-L1抗体阿维鲁单抗(avelumab)(又名MSB0010718C)或其片段。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的阿维鲁单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:870的重链和/或含有氨基酸序列SEQ IDNO:871的轻链。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体BMS-936559(又名12A4、MDX-1105)或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的BMS-936559或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:872的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQID NO:873的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体3G10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3G10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:874的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:875的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体10A5或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的10A5或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:876的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:877的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体5F8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的5F8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:878的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:879的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体10H10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的10H10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:880的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:881的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体1B12或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1B12或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:882的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:883的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体7H1或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的7H1或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:884的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:885的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体11E6或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的11E6或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:886的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:887的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体12B7或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的12B7或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:888的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:889的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体13G4或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的13G4或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:890的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:891的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-L1抗体1E12或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1E12或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:892的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:893的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-L1抗体1F4或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1F4或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:894的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:895的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-L1抗体2G11或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2G11或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:896的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:897的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738中所公开的抗PD-L1抗体3B6或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3B6或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:898的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:899的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US 2014/0044738和WO2012/145493中所公开的抗PD-L1抗体3D10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3D10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQID NO:900的重链可变区和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:901的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US2011/0271358和WO2010/036959中所公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自US2011/0271358的SEQ ID No:34-38的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID No:34(SEQID NO:902)；US2011/0271358的SEQ ID No:35(SEQ ID NO:903)；US2011/0271358的SEQ IDNo:36(SEQ ID NO:904)；US2011/0271358的SEQ ID No:37(SEQ ID NO:905)；US2011/0271358的SEQ ID No:38(SEQ ID NO:906)；和/或轻链，所述轻链包含选自US2011/0271358的SEQ ID No:39-42的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID No:39(SEQ ID NO:907)；US2011/0271358的SEQ ID No:40(SEQ ID NO:908)；US2011/0271358的SEQ ID No:41(SEQID NO:909)；US2011/0271358的SEQ ID No:42(SEQ ID NO:910)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体2.7A4或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.7A4或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:2(SEQ ID NO:911)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:7(SEQ ID NO:912)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体2.9D10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.9D10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:12(SEQ ID NO:913)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:17(SEQ ID NO:914)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体2.14H9或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.14H9或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:22(SEQ ID NO:915)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:27(SEQ ID NO:916)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体2.20A8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.20A8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:32(SEQ ID NO:917)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:37(SEQ ID NO:918)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体3.15G8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3.15G8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:42(SEQ ID NO:919)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:47(SEQ ID NO:920)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体3.18G1或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3.18G1或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:52(SEQ ID NO:921)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:57(SEQ ID NO:922)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353以及US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体2.7A4OPT或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.7A4OPT或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:62(SEQID NO:923)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:67(SEQID NO:924)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的抗PD-L1抗体2.14H9OPT或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.14H9OPT或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:72(SEQ ID NO:925)的重链可变区和/或含有氨基酸序列即WO 2011/066389的SEQ ID No:77(SEQ ID NO:926)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含WO2016/061142中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自WO2016/061142的SEQ IDNo:18、30、38、46、50、54、62、70和78的氨基酸序列：WO2016/061142的SEQ ID No:18(SEQ IDNO:927)；WO2016/061142的SEQ ID No:30(SEQ ID NO:928)；WO2016/061142的SEQ ID No:38(SEQ ID NO:929)；WO2016/061142的SEQ ID No:46(SEQ ID NO:930)；WO2016/061142的SEQ ID No:50(SEQ ID NO:931)；WO2016/061142的SEQ ID No:54(SEQ ID NO:932)；WO2016/061142的SEQ ID No:62(SEQ ID NO:933)；WO2016/061142的SEQ ID No:70(SEQ IDNO:934)；WO2016/061142的SEQ ID No:78(SEQ ID NO:935)；和/或轻链，所述轻链包含选自WO2016/061142的SEQ ID No:22、26、34、42、58、66、74、82和86的氨基酸序列：WO2016/061142的SEQ ID No:22(SEQ ID NO:936)；WO2016/061142的SEQ ID No:26(SEQ ID NO:937)；WO2016/061142的SEQ ID No:34(SEQ ID NO:938)；WO2016/061142的SEQ ID No:42(SEQ ID NO:939)；WO2016/061142的SEQ ID No:58(SEQ ID NO:940)；WO2016/061142的SEQID No:66(SEQ ID NO:941)；WO2016/061142的SEQ ID No:74(SEQ ID NO:942)；WO2016/061142的SEQ ID No:82(SEQ ID NO:943)；WO2016/061142的SEQ ID No:86(SEQ ID NO:944)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含WO2016/022630中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自WO2016/022630的SEQ IDNo:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42和46的氨基酸序列：WO2016/022630的SEQ ID No:2(SEQ ID NO:945)；WO2016/022630的SEQ ID No:6(SEQ ID NO:946)；WO2016/022630的SEQID No:10(SEQ ID NO:947)；WO2016/022630的SEQ ID No:14(SEQ ID NO:948)；WO2016/022630的SEQ ID No:18(SEQ ID NO:949)；WO2016/022630的SEQ ID No:22(SEQ ID NO:950)；WO2016/022630的SEQ ID No:26(SEQ ID NO:951)；WO2016/022630的SEQ ID No:30(SEQ ID NO:952)；WO2016/022630的SEQ ID No:34(SEQ ID NO:953)；WO2016/022630的SEQID No:38(SEQ ID NO:954)；WO2016/022630的SEQ ID No:42(SEQ ID NO:955)；WO2016/022630的SEQ ID No:46(SEQ ID NO:956)；和/或轻链，所述轻链包含选自WO2016/022630的SEQ ID No:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48的氨基酸序列：WO2016/022630的SEQID No:4(SEQ ID NO:957)；WO2016/022630的SEQ ID No:8(SEQ ID NO:958)；WO2016/022630的SEQ ID No:12(SEQ ID NO:959)；WO2016/022630的SEQ ID No:16(SEQ ID NO:960)；WO2016/022630的SEQ ID No:20(SEQ ID NO:961)；WO2016/022630的SEQ ID No:24(SEQ ID NO:962)；WO2016/022630的SEQ ID No:28(SEQ ID NO:963)；WO2016/022630的SEQID No:32(SEQ ID NO:964)；WO2016/022630的SEQ ID No:36(SEQ ID NO:965)；WO2016/022630的SEQ ID No:40(SEQ ID NO:966)；WO2016/022630的SEQ ID No:44(SEQ ID NO:967)；WO2016/022630的SEQ ID No:48(SEQ ID NO:968)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含WO2015/112900中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自WO 2015/112900的SEQ IDNo:38、50、82和86的氨基酸序列：WO 2015/112900的SEQ ID No：38(SEQ ID NO:969)；WO2015/112900的SEQ ID No:50(SEQ ID NO:970)；WO 2015/112900的SEQ ID No:82(SEQ IDNO:971)；WO 2015/112900的SEQ ID No:86(SEQ ID NO:972)；和/或轻链，所述轻链包含选自WO 2015/112900的SEQ ID No:42、46、54、58、62、66、70、74和78的氨基酸序列：WO 2015/112900的SEQ ID No:42(SEQ ID NO:973)；WO 2015/112900的SEQ ID No:46(SEQ ID NO:974)；WO 2015/112900的SEQ ID No:54(SEQ ID NO:975)；WO 2015/112900的SEQ ID No:58(SEQ ID NO:976)；WO 2015/112900的SEQ ID No:62(SEQ ID NO:977)；WO 2015/112900的SEQ ID No:66(SEQ ID NO:978)；WO 2015/112900的SEQ ID No:70(SEQ ID NO:979)；WO2015/112900的SEQ ID No:74(SEQ ID NO:980)；WO 2015/112900的SEQ ID No:78(SEQ IDNO:981)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含WO 2010/077634和US 8,217,149中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列即WO2010/077634的SEQ ID No:20(SEQ ID NO:982)的重链区和/或含有氨基酸序列即WO 2010/077634的SEQ ID No:21(SEQ ID NO:983)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含可获自如US 20120039906中所公开的可在CNCM寄存编号CNCM I-4122、CNCM I-4080和CNCM I-4081下获取的杂交瘤的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如例如US 8,907,065和WO 2008/071447中所公开的针对PD-L1的VHH，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，所述针对PD-L1的VHH包含US 8,907,065的SEQ ID No:394-399：US 8,907,065的SEQ ID No:394(SEQ ID NO:984)；US 8,907,065的SEQ ID No:395(SEQ ID NO:985)；US 8,907,065的SEQ ID No:396(SEQ ID NO:986)；US 8,907,065的SEQ ID No:397(SEQ ID NO:987)；US 8,907,065的SEQ ID No:398(SEQ ID NO:988)；US 8,907,065的SEQ ID No:399(SEQ ID NO:989)。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂具有一个或多个针对PD-L2的靶向部分。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂具有一个或多个选择性结合PD-L2多肽的靶向部分。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含一个或多个选择性地结合PD-L2多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或者融合蛋白。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如例如US 8,907,065和WO 2008/071447中所公开的针对PD-L2的VHH，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，所述针对PD-1的VHH包含US 8,907,065的SEQ ID No:449-455：US 8,907,065的SEQID No:449(SEQ ID NO:990)；US 8,907,065的SEQ ID No:450(SEQ ID NO:991)；US 8,907,065的SEQ ID No:451(SEQ ID NO:992)；US 8,907,065的SEQ ID No:452(SEQ ID NO:993)；US 8,907,065的SEQ ID No:453(SEQ ID NO:994)；US 8,907,065的SEQ ID No:454(SEQ IDNO:995)；US 8,907,065的SEQ ID No:455(SEQ ID NO:996)。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含如US2011/0271358和WO2010/036959中所公开的抗PD-L2抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自US2011/0271358的SEQ ID No:43-47的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID No:43(SEQID NO:997)；US2011/0271358的SEQ ID No:44(SEQ ID NO:998)；US2011/0271358的SEQ IDNo:45(SEQ ID NO:999)；US2011/0271358的SEQ ID No:46(SEQ ID NO:1000)；US2011/0271358的SEQ ID No:47(SEQ ID NO:1001)；和/或轻链，所述轻链包含选自US2011/0271358的SEQ ID No:48-51的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID No:48(SEQ ID NO:1002)；US2011/0271358的SEQ ID No:49(SEQ ID NO:1003)；US2011/0271358的SEQ ID No:50(SEQ ID NO:1004)；US2011/0271358的SEQ ID No:51(SEQ ID NO:1005)。
在各个实施方案中，本发明的靶向部分可以包含与本文公开的序列中的任一者具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％同一性(例如，与本文公开的序列中的任一者具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)的靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的序列。
在各个实施方案中，本发明的靶向部分可以包含如本文所公开的靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、互补性决定区(CDR)和框架区序列的任何组合。
选择性地结合或靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的其他抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或者融合蛋白公开于以下文献中：WO 2011/066389、US 2008/0025980、US 2013/0034559、US 8,779,108、US 2014/0356353、US 8,609,089、US 2010/028330、US 2012/0114649、WO 2010/027827、WO 2011,/066342、US 8,907,065、WO 2016/062722、WO 2009/101611、WO2010/027827、WO 2011/066342、WO 2007/005874、WO 2001/014556、US2011/0271358、WO 2010/036959、WO 2010/077634、US 8,217,149、US 2012/0039906、WO 2012/145493、US 2011/0318373、美国专利号8,779,108、US 20140044738、WO 2009/089149、WO2007/00587、WO 2016061142、WO 2016,02263、WO 2010/077634和WO 2015/112900，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在各个实施方案中，本发明技术的多特异性Clec9A结合剂包含针对信号调控蛋白α-1(SIRP1α)的靶向部分。SIRP1α(也称为SIRPα)属于细胞免疫受体家族，该家族包括抑制性(SIRPα)成员、激活性(SIRPβ)成员、非信号传导性(SIRPγ)成员和可溶性(SIRPδ)成员。SIRP1α主要在髓样细胞上表达，髓样细胞包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突状细胞(DC)、肥大细胞以及它们的前体，包括造血干细胞。SIRP1α充当抑制受体，与广泛表达的跨膜糖蛋白CD47相互作用以调控吞噬作用。具体而言，在靶细胞上表达的CD47结合巨噬细胞上的SIRP1α可产生负调控所述靶细胞的吞噬作用的抑制信号。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分是特异性地识别并结合巨噬细胞上的SIRP1α的靶向部分。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分是特异性地识别并结合单核细胞上的SIRP1α的靶向部分。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分是特异性地识别并结合TAM(肿瘤相关巨噬细胞)上的SIRP1α的靶向部分。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分是特异性地识别并结合树突状细胞(包括但不限于cDC2和pDC)上的SIRP1α的靶向部分。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含具有识别SIRP1α的识别结构域的靶向部分。在一个实施方案中，所述识别结构域识别SIRP1α上存在的一个或多个线性表位。如本文所使用，线性表位是指SIRP1α上存在的任何连续氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述识别结构域识别SIRP1α上存在的一个或多个构象表位。如本文所使用，构象表位是指形成具有能够被抗原识别结构域识别的特征和/或形状和/或三级结构的三维表面的一个或多个氨基酸区段(可能是不连续的)。
在一些实施方案中，所述SIRP1α靶向部分可以结合至SIRP1α的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体。在一个实施方案中，所述SIRP1α是人SIRP1α。在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分可以结合至人SIRP1α的任何形式，包括单体形式、二聚体形式、异二聚体形式、多聚体形式和相关形式。在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分结合至SIRP1α的单体形式。在另一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分结合至SIRP1α的二聚体形式。
在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含识别人SIRP1α上存在的一个或多个表位的识别结构域。在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含识别具有信号肽序列的人SIRP1α的识别结构域。示例性的人SIRP1α多肽是SEQ ID NO:1006。
在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含识别没有信号肽序列的人SIRP1α的识别结构域。没有信号肽序列的示例性人SIRP1α多肽是SEQ ID NO:1007。
在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含识别编码人SIRP1α同种型2的多肽(SEQ ID NO:1008)的识别结构域。
在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含识别编码人SIRP1α同种型4的多肽(SEQ ID NO:1009)的识别结构域。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分可以是能够特异性结合的任何基于蛋白质的剂，诸如抗体或其衍生物。在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含抗体。在各个实施方案中，抗体是包括两条重链和两条轻链的全长多聚体蛋白。每条重链包括一个可变区(例如VH)和至少三个恒定区(例如CH1、CH2和CH3)，并且每条轻链包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。可变区决定了抗体的特异性。每个可变区包括由四个相对保守的框架区(FR)侧接的三个高变区，也称为互补性决定区(CDR)。所述三个CDR(称为CDR1、CDR2和CDR3)有助于抗体结合特异性。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含抗体衍生物或抗体形式。在一些实施方案中，所述SIRP1α靶向部分是单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微量蛋白(半胱氨酸结蛋白、打结素(knottin))、DARPin；四连接素(Tetranectin)；Affibody；反式体(Transbody)；抗运载蛋白；AdNectin；Affilin；微型体(Microbody)；肽适体；奥特瑞斯(alterase)；塑性抗体；费洛体(phylomer)；斯塔都体(stradobody)；巨型体(maxibody)；伊维体(evibody)；菲诺体(fynomer)、犰狳重复蛋白、库尼茨型结构域(Kunitz domain)、高亲合性多聚体(avimer)、阿特里体(atrimer)、普罗体(probody)、免疫体(immunobody)、曲奥单抗(triomab)、特洛伊体(troybody)；佩普体(pepbody)；疫苗体(vaccibody)、单特异性体(UniBody)；Affimer、双特异性体(DuoBody)、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、肽模拟分子或合成分子，如以下美国专利号或专利公布号中所描述：US 7,417,130、US 2004/132094、US 5,831,012、US 2004/023334、US7,250,297、US 6,818,418、US 2004/209243、US 7,838,629、US 7,186,524、US 6,004,746、US 5,475,096、US 2004/146938、US 2004/157209、US 6,994,982、US 6,794,144、US 2010/239633、US 7,803,907、US 2010/119446和/或US 7,166,697，所述专利的内容特此以引用方式整体并入。还参见Storz MAbs.2011年5月-6月；3(3):310-317。
在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含单结构域抗体，诸如来自例如产生VHH抗体的生物体(诸如骆驼、鲨鱼)的VHH，或者设计的VHH。VHH是抗体来源的治疗性蛋白质，它们含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能性质。VHH技术是基于来自骆驼的缺乏轻链的完全功能抗体。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。
在一个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含VHH。在一些实施方案中，所述VHH是人源化VHH或骆驼化VHH。
在一些实施方案中，所述VHH包含完全人VH结构域，例如HUMABODY(CrescendoBiologics,Cambridge,UK)。在一些实施方案中，完全人VH结构域(例如HUMABODY)是单价、二价或三价的。在一些实施方案中，所述完全人VH结构域(例如HUMABODY)是单特异性或多特异性的，诸如单特异性、双特异性或三特异性的。说明性的完全人VH结构域(例如HUMABODY)描述于例如WO2016/113555和WO2016/113557中，所述文献的全部内容以引用方式并入。
举例来说，在一些实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含一个或多个选择性地结合SIRP1α的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽、VHH或融合蛋白。在一些实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含特异性地结合至SIRP1α的抗体或其衍生物。在一些实施方案中，所述SIRP1α靶向部分是特异性地结合至SIRP1α的骆驼重链抗体(VHH)。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分可以包含已知识别并结合至SIRP1α的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、互补性决定区(CDR)和框架区序列的任何组合。
在各个实施方案中，本发明技术设想使用本文所描述的SIRP1α靶向部分的任何天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直系同源物(本文中统称为“类似物”)。在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分的氨基酸序列还包括氨基酸类似物、氨基酸衍生物或其他非经典氨基酸。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含相对于已知识别并结合至SIRP1α的任何靶向部分序列具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分包含相对于已知识别并结合至SIRP1α的任何靶向部分序列具有一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个、或七个、或八个、或九个、或十个、或十五个、二十个、三十个、四十个或五十个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
可以例如基于在所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性方面的相似性进行“保守取代”。20种天然存在的氨基酸可以分组至以下六个标准氨基酸组中：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所使用，“保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组中的同一组内所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。举例来说，Asp交换为Glu使得经如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸能够破坏α螺旋，它们可以彼此取代。
如本文所使用，“非保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。
在各个实施方案中，所述取代还可以包括非经典氨基酸。示例性的非经典氨基酸大体上包括但不限于硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计师氨基酸诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。
在各个实施方案中，氨基酸突变可以在靶向部分的CDR(例如，CDR1区、CDR2区或CDR3区)中。在另一个实施方案中，氨基酸变化可以在靶向部分的框架区(FR)(例如，FR1区、FR2区、FR3区或FR4区)中。
可以使用本领域中的任何已知技术，例如定点诱变或基于PCR的诱变来实现对氨基酸序列的修饰。此类技术描述于例如以下文献中：Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.,1989和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1989。
在各个实施方案中，所述突变基本上不降低所述SIRP1α靶向部分特异性地识别并结合至SIRP1α的能力。在各个实施方案中，所述突变基本上不降低所述SIRP1α靶向部分特异性地结合至SIRP1α并且不在功能上调节(例如，部分或完全中和)SIRP1α的能力。
在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分结合目标抗原但不在功能性上调节目标抗原，即SIRP1α。举例来说，在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分仅仅靶向所述抗原但基本上不在功能上调节(例如，基本上抑制、降低或中和)所述抗原具有的生物效应。在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分结合在物理上与对抗原的生物活性重要的抗原位点(例如，抗原的活性位点)隔开的表位。
在其他实施方案中，所述SIRP1α靶向部分结合目标抗原并在功能性上调节目标抗原，即SIRP1α。举例来说，在各个实施方案中，所述SIRP1α靶向部分靶向所述抗原(即SIRP1α)但不在功能上调节(例如，抑制、降低或中和)所述抗原具有的生物效应。此类伴有功能调节的结合可用于本发明的各个实施方案中，包括使用本发明的嵌合蛋白经由效应抗原将活性免疫细胞直接或间接地募集至所需位点的方法。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有特异性地结合至例如DC上的XCR1的抗原识别结构域的靶向部分。在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂包含具有包含XCL1的全部或部分的抗原识别结构域的靶向部分。
在各个实施方案中，本发明的多特异性Clec9A结合剂存在具有特异性地结合至作为非细胞结构的一部分的靶标(例如抗原、受体)的识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述抗原或受体不是完整细胞或细胞结构的组成组分。在一些实施方案中，所述抗原或受体是细胞外抗原或受体。在一些实施方案中，所述靶标是非蛋白质非细胞标记物，包括但不限于核酸，包括DNA或RNA，诸如例如从坏死的肿瘤细胞或细胞外沉积物诸如胆固醇释放的DNA。
在一些实施方案中，目标靶标(例如抗原、受体)是基质或细胞外基质(ECM)的非细胞组分的一部分或与所述非细胞组分相关的标记物。如本文所使用，基质是指组织或器官的连接和支撑构架。基质可以包括细胞诸如成纤维细胞/成肌纤维细胞、神经胶质、上皮、脂肪、免疫、血管、平滑肌和免疫细胞以及细胞外基质(ECM)和细胞外分子的汇集。在各个实施方案中，目标靶标(例如抗原、受体)是基质诸如细胞外基质和细胞外分子的非细胞组分的一部分。如本文所使用，ECM是指所有组织和器官内存在的非细胞组分。ECM是由生物化学上独特的组分，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖和多糖的大集合构成。ECM的这些组分通常由相邻的细胞产生并且经由胞吐作用分泌至ECM中。一旦分泌后，ECM组分便往往聚集而形成复杂的巨分子网状结构。在各个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含识别位于ECM的任何组分上的靶标(例如抗原或受体或非蛋白质分子)的靶向部分。ECM的说明性组分包括但不限于蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、纤维和其他ECM蛋白质或ECM非蛋白质，例如多糖和/或脂质，或ECM相关分子(例如蛋白质或非蛋白质，例如多糖、核酸和/或脂质)。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别ECM蛋白聚糖上的靶标(例如抗原、受体)。蛋白聚糖是糖基化的蛋白质。碱性蛋白聚糖单元包括具有一个或多个共价附接的糖胺聚糖(GAG)链的核心蛋白质。蛋白聚糖具有净负电荷，由此吸引带正电的钠离子(Na+)，后者经由渗透作用吸引水分子，从而保持ECM和驻留细胞含水。蛋白聚糖还可能有助于捕获和存储ECM内的生长因子。本发明的嵌合蛋白可以靶向的说明性蛋白聚糖包括但不限于硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素。在一个实施方案中，所述靶向部分识别非蛋白聚糖多糖诸如透明质酸上的靶标(例如抗原、受体)。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别ECM纤维上的靶标(例如抗原、受体)。ECM纤维包括胶原蛋白纤维和弹性蛋白纤维。在一些实施方案中，所述靶向部分识别胶原蛋白或胶原蛋白纤维上的一个或多个表位。胶原蛋白是ECM中最丰富的蛋白质。胶原蛋白呈纤维状蛋白形式存在于ECM中并且提供结构支撑以驻留细胞。在一个或多个实施方案中，所述靶向部分识别并且结合至ECM内存在的各种类型的胶原蛋白，包括但不限于纤维状胶原蛋白(I型、II型、III型、V型、XI型)、间杂有三螺旋的原纤维相关的胶原蛋白(facit collagen)(IX型、XII型、XIV型)、短链胶原蛋白(VIII型、X型)、基底膜胶原蛋白(IV型)和/或VI型、VII型或XIII型胶原蛋白。弹性蛋白纤维给组织提供弹性，允许它们在需要时拉伸然后回到它们的原始状态。在一些实施方案中，所述靶向部分识别弹性蛋白或弹性蛋白纤维上的一个或多个表位。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别一种或多种ECM蛋白质，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白(laminin)或巢蛋白(nidogen)/内联蛋白(entactin)。
在一个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至肌腱蛋白。肌腱蛋白(TN)家族的糖蛋白包括至少四个成员，即肌腱蛋白C、肌腱蛋白R、肌腱蛋白X和肌腱蛋白W。肌腱蛋白的一级结构包括若干个普通基序，所述基序按顺序处于同一连续序列中：氨基端七价重复序列、表皮生长因子(EGF)样重复序列、纤连蛋白III型结构域重复序列和羧基端纤维蛋白原样球形结构域。每一个蛋白质成员与EGF样重复序列和纤连蛋白III型重复序列的数目和特性的典型变异相关。同种型变体还特别相对于肌腱蛋白C存在。已知肌腱蛋白C的超过27种剪接变体和/或同种型。在一个特定实施方案中，所述靶向部分识别并结合至肌腱蛋白CA1。类似地，肌腱蛋白R还具有不同的剪接变体和同种型。肌腱蛋白R通常呈二聚体或三聚体形式存在。肌腱蛋白X是肌腱蛋白家族中最大的成员，并且已知呈三聚体形式存在。肌腱蛋白W呈三聚体形式存在。在一些实施方案中，所述靶向部分识别肌腱蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述靶向部分识别肌腱蛋白的单体和/或二聚体和/或三聚体和/或六聚体形式。
在一个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至纤连蛋白。纤连蛋白是连接细胞与ECM中的胶原蛋白纤维，从而允许细胞移动通过ECM的糖蛋白。在结合至整合素后，纤连蛋白展开从而形成功能二聚体。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤连蛋白的单体和/或二聚体形式。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤连蛋白上的一个或多个表位。在说明性实施方案中，所述靶向部分识别纤连蛋白细胞外结构域A(EDA)或纤连蛋白细胞外结构域B(EDB)。EDA水平升高与各种疾病和病症相关，所述疾病和病症包括牛皮癣、类风湿性关节炎、糖尿病和癌症。在一些实施方案中，所述靶向部分识别含有EDA同种型的纤连蛋白，并且可以用于使所述嵌合蛋白靶向病变细胞，包括癌细胞。在一些实施方案中，所述靶向部分识别含有EDB同种型的纤连蛋白。在各个实施方案中，此类靶向部分可以用于使所述嵌合蛋白靶向肿瘤细胞，包括肿瘤新生血管。
在一个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至纤维蛋白。纤维蛋白是ECM的基质网状结构中经常发现的另一种蛋白质物质。纤维蛋白是由于纤维蛋白原上引起纤维蛋白聚合的蛋白酶凝血酶的作用而形成。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤维蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤维蛋白的单体以及聚合形式。
在一个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至层粘连蛋白。层粘连蛋白是基底层的主要组分，所述基底层是细胞和器官的蛋白质网状结构的基础。层粘连蛋白是含有α链、β链和γ链的异源三聚体蛋白。在一些实施方案中，所述靶向部分识别层粘连蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述靶向部分识别层粘连蛋白的单体、二聚体以及三聚体形式。
在一个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至巢蛋白或内联蛋白。巢蛋白/内联蛋白是高度保守的硫酸化糖蛋白家族。它们组成了基底膜的主要结构组分，并且功能是连接基底膜中的层粘连蛋白与胶原蛋白IV网状结构。这个家族的成员包括巢蛋白-1和巢蛋白-2。在各个实施方案中，所述靶向部分识别巢蛋白-1和/或巢蛋白-2上的表位。
在各个实施方案中，所述靶向部分包含识别本文所描述的靶标(例如ECM蛋白质)中的任一者上存在的表位的抗原识别结构域。在一个实施方案中，所述抗原识别结构域识别所述蛋白质上存在的一个或多个线性表位。如本文所使用，线性表位是指所述蛋白质上存在的任何连续氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗原识别结构域识别所述蛋白质上存在的一个或多个构象表位。如本文所使用，构象表位是指形成具有能够被抗原识别结构域识别的特征和/或形状和/或三级结构的三维表面的一个或多个氨基酸区段(可能是不连续的)。
在各个实施方案中，所述靶向部分可以结合至本文所描述的靶标(例如ECM蛋白质)中的任一者的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体。在各个实施方案中，所述靶向部分可以结合至本文所描述的蛋白质的任何形式，包括单体、二聚体、三聚体、四聚体、异源二聚体、多聚体和缔合形式。在各个实施方案中，所述靶向部分可以结合至本文所描述的蛋白质的任何翻译修饰后的形式，诸如糖基化和/或磷酸化形式。
在各个实施方案中，所述靶向部分包含识别细胞外分子诸如DNA的抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述靶向部分包含识别DNA的抗原识别结构域。在一个实施方案中，所述DNA从坏死或凋亡的肿瘤细胞或其他病变细胞脱落至细胞外间隙中。
在各个实施方案中，所述靶向部分包含识别一个或多个与动脉粥样硬化斑块相关的非细胞结构的抗原识别结构域。已知两种类型的动脉粥样硬化斑块。纤维脂质(纤维脂肪)斑块的特征是载满脂质的细胞积聚在动脉内膜下面。内皮下面有覆盖所述斑块的动脉粥样化核心的纤维帽。所述核心包括具有升高的组织胆固醇和胆固醇酯含量的载满脂质的细胞(巨噬细胞和平滑肌细胞)、纤维蛋白、蛋白聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白和细胞碎屑。在晚期斑块中，所述斑块的中心核心通常含有细胞外胆固醇沉积物(从死细胞释放)，所述细胞外胆固醇沉积物形成具有中空针样裂缝的胆固醇晶体的区域。在所述斑块外围是较年轻的泡沫状细胞和毛细管。纤维性斑块还局部化在内膜下、在动脉壁内，从而引起壁变厚和膨胀，并且有时引起内腔的多斑局部化变窄与一定程度的肌肉层萎缩。纤维性斑块含有胶原蛋白纤维(嗜酸性)，使钙(嗜苏木精性)和载满脂质的细胞沉淀。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至这些斑块的一种或多种非细胞组分，诸如纤维蛋白、蛋白聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、细胞碎屑和钙或其他无机沉积物或沉淀物。在一些实施方案中，所述细胞碎屑是从死细胞释放的核酸，例如DNA或RNA。
在各个实施方案中，所述靶向部分包含识别与神经退行性疾病相关的脑斑块中发现的一个或多个非细胞结构的抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至位于阿尔茨海默氏病患者脑中发现的淀粉样斑块中的一个或多个非细胞结构。举例来说，所述靶向部分可以识别并且结合至作为淀粉样斑块的主要组分的肽淀粉样β。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至位于亨廷顿氏病患者中发现的脑斑块中的一个或多个非细胞结构。在各个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至与其他神经退行性或肌肉骨骼疾病诸如路易体痴呆和包涵体肌炎相关的斑块中发现的一个或多个非细胞结构。
接头和官能团
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂可以包括一个或多个官能团、残基或部分。在各个实施方案中，所述一个或多个官能团、残基或部分连接或基因融合至本文所描述的信号传导剂或靶向部分中的任一者。在一些实施方案中，此类官能团、残基或部分赋予本发明的Clec9A结合剂以一种或多种所期望的性质或功能性。此类官能团和用于将它们引入至Clec9A结合剂中的技术的实例在本领域中是已知的，举例来说，参见Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1980)。
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂可以通过与另一种剂缀合和/或融合以延长半衰期或以其他方式改善药效学和药物动力学性质。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂可以与PEG、XTEN(例如呈rPEG形式)、聚唾液酸(POLYXEN)、白蛋白(例如，人血清白蛋白或HAS)、弹性蛋白样蛋白(ELP)、PAS、HAP、GLK、CTP、转铁蛋白等等中的一者或多者融合或缀合。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂可以与抗体或抗体片段诸如Fc片段融合或缀合。举例来说，所述嵌合蛋白可以融合至人免疫球蛋白(Ig)G的Fc结构域的N端或C端。在各个实施方案中，个别嵌合蛋白中的每一者与BioDrugs(2015)29:215-239中描述的剂中的一者或多者融合，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含合适的药理学上可接受的聚合物，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。在一些实施方案中，PEG部分的连接增加半衰期和/或降低Clec9A结合蛋白的免疫原性。一般来说，可以使用聚乙二醇化的任何合适的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段的聚乙二醇化(包括但不限于单结构域抗体，诸如VHH)；参见例如Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese和Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris和Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)和WO/04060965，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。用于蛋白质的聚乙二醇化的各种试剂还可以得自市面，例如，得自美国的NektarTherapeutics。在一些实施方案中，使用定点聚乙二醇化，具体而言，经由半胱氨酸残基(参见例如Yang等人,Protein Engineering,16,10,761-770(2003)，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。举例来说，出于这个目的，PEG可以连接至本发明的Clec9A结合剂中天然存在的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂经过修饰以便适当地引入一个或多个供连接PEG用的半胱氨酸残基，或者包含一个或多个供连接PEG用的半胱氨酸残基的氨基酸序列可以使用本领域中已知的技术融合至所述Clec9A结合剂的氨基和/或羧基端。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含N连接或O连接的糖基化。在一些实施方案中，引入所述N连接或O连接的糖基化作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含一个或多个可检测标记或其他信号产生基团或部分。合适的标记和适用于连接、使用和检测它们的技术在本领域中是已知的，并且包括但不限于荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝素、邻苯二甲醛以及荧光胺和荧光金属诸如Eu或其他镧系金属)、磷光标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)、热性吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP以及它们的类似物)、放射性同位素、金属、金属螯合物或金属阳离子或者特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的其他金属或金属阳离子，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、生物素亲和素过氧化物酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、催化酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰化胆碱脂酶)。其他合适的标记包括可以使用NMR或ESR光谱加以检测的部分。本发明的此类标记的VHH和多肽可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，诸如ELISA，RIA、EIA和其他“夹心测定”等)以及体内诊断和成像目的，取决于对具体标记的选择。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含附接或基因融合至所述Clec9A结合剂的标签。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂可以包括单个标签或多个标签。举例来说，所述标签是不抑制或防止Clec9A结合剂与Clec9A或任何其他目标抗原诸如肿瘤抗原的结合的肽、糖或DNA分子。在各个实施方案中，所述标签是至少约：三个至五个氨基酸长、五个至八个氨基酸长、八个至十二个氨基酸长、十二个至十五个氨基酸长或十五个至二十个氨基酸长。说明性标签描述于诸如美国专利公布号US2013/0058962。在一些实施方案中，所述标签是亲和力标签，诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含His标签。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含螯合基团，例如，以螯合金属或金属阳离子之一。合适的螯合基团例如包括但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含作为特异性结合对，诸如生物素-(链霉)亲和素结合对的一个部分的官能团。这种官能团可以用来连接本发明的Clec9A结合剂与跟所述结合对的另一半结合(即，通过形成结合对)的另一个蛋白质、多肽或化学化合物。举例来说，本发明的Clec9A结合剂可以缀合至生物素，并且连接至与亲和素或链霉亲和素缀合的另一个蛋白质、多肽、化合物或载体。举例来说，这种缀合的Clec9A结合剂可以用作例如诊断系统中的报告子，其中可检测信号产生剂缀合至亲和素或链霉亲和素。此类结合对还可以例如用于使Clec9A结合剂结合至载体，包括适用于药物目的的载体。一个非限制性实例是Cao和Suresh,Journal of Drug Targeting,8,4,257(2000)描述的脂质体制剂。此类结合对还可以用于连接治疗活性剂与本发明的Clec9A结合剂。
在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂任选地包含一个或多个接头。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包括连接各结合区和/或靶向部分的接头。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包括连接各信号传导剂和靶向部分(或者在存在超过一个靶向部分时将信号传导剂连接至所述靶向部分之一)的接头。在一些实施方案中，所述接头可以用于连接如本文所描述的各种官能团、残基或部分与Clec9A结合剂。在一些实施方案中，所述接头是不影响或降低结合区和结合蛋白的稳定性、取向、结合、中和和/或清除率特征的单个氨基酸或多个氨基酸。在各个实施方案中，所述接头选自肽、蛋白质、糖或核酸。
在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂包含连接所述靶向部分和所述信号传导剂的接头。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含处于所述信号传导剂内的接头(例如，在单链TNF的情况下，所述嵌合蛋白可以包含两个接头以产生三聚体)。
本发明设想多种接头序列的用途。在各个实施方案中，所述接头可以来源于天然存在的多结构域蛋白或者是如例如以下文献中描述的经验接头：Chichili等人,(2013),Protein Sci.22(2):153-167；Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，可以使用接头设计数据库和计算机程序，诸如以下文献中描述的那些来设计所述接头：Chen等人,(2013),AdvDrug Deliv Rev.65(10):1357-1369和Crasto等人,(2000),Protein Eng.13(5):309-312，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在各个实施方案中，所述接头可以是功能性的。举例来说但不限于，所述接头可以发挥功能以改善本发明的Clec9A结合剂的折叠和/或稳定性，改善表达，改善药物动力学，并且/或者改善生物活性。
在一些实施方案中，所述接头是多肽。在一些实施方案中，所述接头少于约100个氨基酸长。举例来说，所述接头可以是少于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、或约2个氨基酸长。在一些实施方案中，所述接头是多肽。在一些实施方案中，所述接头超过约100个氨基酸长。举例来说，所述接头可以是超过约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、或约2个氨基酸长。在一些实施方案中，所述接头是柔性的。在另一个实施方案中，所述接头是刚性的。
在一些实施方案中，所述接头长度允许靶向部分和信号传导剂与其受体的有效结合。举例来说，在一些实施方案中，所述接头长度允许所述靶向部分中的一个和所述信号传导剂与相同细胞上的受体的有效结合以及另一个靶向部分与另一个细胞的有效结合。本文其他部分提供了说明性细胞对。
在一些实施方案中，所述接头长度至少等于所述靶向部分中的一个和所述信号传导剂与相同细胞上的受体的结合位点之间的最小距离。在一些实施方案中，所述接头长度是所述靶向部分中的一个和所述信号传导剂与相同细胞上的受体的结合位点之间的最小距离的至少两倍、或三倍、或四倍、或五倍、或十倍、或二十倍、或25倍、或50倍、或一百倍、或更多倍。
在一些实施方案中，一个接头将两个靶向部分彼此连接并且这种接头具有较短长度，而一个接头连接靶向部分和信号传导剂，这种接头比连接两个靶向部分的接头更长。举例来说，连接两个靶向部分的接头与连接靶向部分和信号传导剂的接头之间的氨基酸长度差异可以是约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、或约2个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头是柔性的。在另一个实施方案中，所述接头是刚性的。
在各个实施方案中，所述接头基本上由甘氨酸和丝氨酸残基构成(例如约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％甘氨酸和丝氨酸)。举例来说，在一些实施方案中，所述接头是(Gly4Ser)n，其中n是约1至约8，例如1、2、3、4、5、6、7或8(SEQ ID NO:1010-1017)。在一个实施方案中，所述接头序列是GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1018)。其他说明性接头包括但不限于具有序列LE、GGGGS(SEQ ID NO:1010)、(GGGGS)n(n＝1-4)(SEQ ID NO:1010-1013)、(Gly)8(SEQ ID NO:1019)、(Gly)6(SEQ ID NO:1020)、(EAAAK)n(n＝1-3)(SEQ ID NO:1021-1023):、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID N O:1024-1027)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:1024)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO:1028)、PAPAP(SEQ ID NO:1029)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:1030)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:1031)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:1032)和(XP)n的接头，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。在各个实施方案中，所述接头是(GGS)n(n＝1-20)(SEQ ID NO:1033-SEQ ID NO:1052)。在一些实施方案中，所述接头是G。在一些实施方案中，所述接头是AAA。在一些实施方案中，所述接头是(GGGGS)n(n＝9-20)(SEQ ID NO:1053-1064)。
在一些实施方案中，所述接头是GGGSE(SEQ ID NO:1065)、GSESG(SEQ ID NO:1066)、GSEGS(SEQ ID NO:1067)、GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(SEQ ID NO:1068)和每4个氨基酸间隔随机放置G、S和E的接头中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂连接至经修饰的信号传导剂。在各个示例性实施方案中，所述Clec9A结合剂连接至经修饰的IFNα2。举例来说，在一些实施方案中，连接至经修饰的IFNα2的Clec9A结合剂表示为R1CHCL50-接头-hIFNα2_R149A或3LEC89--接头-hIFNα2_R149A，其中所述接头是以上公开的接头中的任一者。
在一些实施方案中，所述接头是抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的铰链区。在各个实施方案中，所述接头是抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的铰链区。IgG、IgA、IgD和IgE类抗体中发现的铰链区充当柔性间隔基，从而允许Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，所述铰链结构域在结构上具有多样性，在序列和长度方面都因免疫球蛋白类别和子类而各异。举例来说，铰链区的长度和柔性因IgG子类而各异。IgG1的铰链区涵盖氨基酸216-231，而且因为它自由灵活，Fab片段可以关于其对称轴旋转并且在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球体内移动。IgG2具有比IgG1短的铰链，具有12个氨基酸残基和四个二硫桥。IgG2的铰链区缺乏甘氨酸残基，相对较短，并且含有通过额外的重链间二硫桥加以稳定的刚性聚脯氨酸双螺旋。这些性质约束了IgG2分子的柔性。IgG3因其独特的延长铰链区(长达IgG1铰链的约四倍)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成非柔性聚脯氨酸双螺旋而不同于其他子类。在IgG3中，Fab片段相对远离Fc片段，从而赋予所述分子以更大的柔性。IgG3中的细长铰链还负责其与其他子类相比具有较高分子量。IgG4的铰链区比IgG1的短，并且其柔性介于IgG1与IgG2的柔性之间。铰链区的柔性按降序报告为IgG3>IgG1>IgG4>IgG2。
根据结晶学研究，免疫球蛋白铰链区可以在功能上进一步细分为三个区域：上铰链区、核心区和下铰链区。参见Shin等人,1992Immunological Reviews 130:87。上铰链区包括从CH1的羧基端至铰链中约束运动的第一个残基，一般是形成介于两个重链之间的链间二硫键的第一个半胱氨酸残基的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的区段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥，而下铰链区接合CH2结构域的氨基端并且包括CH2中的残基。同前。野生型人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO:1069)，所述序列当通过二硫键形成发生二聚时产生环状八肽，认为所述环状八肽充当枢轴，因此赋予柔性。在各个实施方案中，本发明的接头包含任何抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的上铰链区、核心区和下铰链区中的一者或两者或三者。铰链区还可以含有一个或多个糖基化位点，所述糖基化位点包括众多类型的结构独特的位点以供碳水化合物附接用。举例来说，IgA1含有铰链区的17个氨基酸区段内的五个糖基化位点，从而赋予铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性，这被视为分泌免疫球蛋白的有利性质。在各个实施方案中，本发明的接头包含一个或多个糖基化位点。在各个实施方案中，所述接头是人IgG4抗体的铰链-CH2-CH3结构域。
在需要时，本发明的Clec9A结合剂可以连接至包含CH2和CH3结构域中的一者或两者和任选地铰链区的抗体Fc区。举例来说，编码作为单个核苷酸序列连接至Fc区的本发明Clec9A结合剂的载体可用于制备此类多肽。
在一些实施方案中，所述接头是合成的接头，诸如PEG。
在各个实施方案中，所述接头可以是功能性的。举例来说但不限于，所述接头可以发挥功能以改善本发明的Clec9A结合剂的折叠和/或稳定性，改善表达，改善药物动力学，并且/或者改善生物活性。在另一个实例中，所述接头可以发挥功能以使所述Clec9A结合剂靶向特定的细胞类型或位置。
Clec9A结合剂的修饰和产生
在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含作为VHH的靶向部分。在各个实施方案中，所述VHH不局限于特定的生物学来源或特定的制备方法。举例来说，所述VHH一般可以通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过编码此类人源化VHH结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，诸如来自哺乳动物物种，诸如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(5)通过如本领域中描述的“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(6)通过使用合成或半合成技术来制备本领域中已知的蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用本领域中已知的核酸合成技术来制备编码VHH的核酸，随后表达如此获得的核酸；和/或(8)通过上述一项或多项的任何组合。
在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含对应于针对人Clec9A的天然存在的重链抗体的VHH结构域的VHH。在一些实施方案中，一般可以通过以下方式来产生或获得此类VHH序列：通过用Clec9A分子适当地使一种骆驼免疫(即，以便产生免疫应答和/或针对Clec9A的重链抗体)；通过从所述骆驼获得合适的生物样品(诸如血液样品或任何B细胞样品)；以及通过以所述样品为起始物，使用任何合适的已知技术来产生针对Clec9A的VHH序列。在一些实施方案中，针对Clec9A的天然存在的VHH结构域可以获自骆驼VHH序列的天然文库，举例来说，通过使用本领域中已知的一种或多种筛选技术，使用Clec9A或其至少一个部分、片段、抗原决定子或表位对此类文库进行筛选。举例来说，此类文库和技术描述于WO9937681，WO0190190、WO03025020和WO03035694中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，可以使用来源于天然VHH文库的经过改善的合成或半合成文库，诸如通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术而获自天然VHH文库的VHH文库，如例如WO0043507中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，用于获得针对Clec9A的VHH序列的另一种技术包括适当地使能够表达重链抗体的转基因哺乳动物免疫(即，以便产生免疫应答和/或针对Clec9A的重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(诸如血液样品，或任何B细胞样品)，然后使用任何合适的已知技术，以所述样品为起始物来产生针对Clec9A的VHH序列。举例来说，出于这个目的，可以使用WO02085945中和WO04049794中描述的表达重链抗体的小鼠以及其他方法和技术(所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。
在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含已经“人源化”，即通过将天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(且具体来说是框架序列中)的一个或多个氨基酸残基置换为来自人的常规4链抗体的VH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。这可以使用本领域中已知的人源化技术来进行。在一些实施方案中，可能的人源化取代或人源化取代的组合可以通过本领域中已知的方法来确定，例如，通过在VHH的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间进行比较。在一些实施方案中，对所述人源化取代进行选择，以使所得人源化VHH仍保留有利的功能性质。一般来说，作为人源化的结果，本发明的VHH相较于对应的天然存在的VHH结构域可以变得更“像人的”，同时仍保留有利性质，诸如降低的免疫原性。在各个实施方案中，本发明的人源化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式来获得，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始物质的多肽获得的多肽。
在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含已经“骆驼化”，即通过将来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基置换为骆驼重链抗体的VHH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。在一些实施方案中，此类“骆驼化”取代被插入在形成和/或存在于VH-VL界面上的氨基酸位置上和/或在所谓的骆驼科标志残基上(参见例如WO9404678，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在一些实施方案中，用作起始物质或起始点以供产生或设计骆驼化VHH用的VH序列是来自哺乳动物的VH序列，例如，人的VH序列，诸如VH3序列。在各个实施方案中，所述骆驼化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式获得(即，如以上第(1)-(8)点所指示)，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VH结构域作为起始物质的多肽而获得的多肽。
在各个实施方案中，“人源化”与“骆驼化”可以通过以下方式来进行：分别提供编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，然后用本领域中已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子，以这种方式使得新的核苷酸序列分别编码“人源化”或“骆驼化”VHH。然后可以用本领域中已知的方式表达这种核酸，以便提供本发明的所期望的VHH。或者，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，分别可以设计本发明的所期望的人源化或骆驼化VHH的氨基酸序列，然后使用本领域中已知的肽合成技术从头合成。而且，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，分别可以设计编码所期望的人源化或骆驼化VHH的核苷酸序列，然后使用本领域中已知的核酸合成技术从头合成，此后可以用本领域中已知的方式表达如此获得的核酸，以便提供本发明的所期望的VHH。以天然存在的VH序列或VHH序列为起始物获得本发明的VHH和/或编码所述VHH的核酸的其他合适的方法和技术在本领域中是已知的，并且可以例如包括以合适的方式组合一种或多种天然存在的VH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列和/或CDR序列)、一种或多种天然存在的VHH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列或CDR序列)和/或一个或多个合成或半合成序列，以便提供本发明的VHH或者编码所述VHH的核苷酸序列或核酸。
本文中描述了用于产生本发明的Clec9A结合剂的方法。举例来说，编码本发明的Clec9A结合剂的DNA序列可以使用本领域中已知的方法化学合成。合成DNA序列可以连接至其他适当的核苷酸序列，包括例如表达控制序列，以产生编码所期望的Clec9A结合剂的基因表达构建体。因此，在各个实施方案中，本发明提供了包含编码本发明的Clec9A结合剂的核苷酸序列的分离的核酸。
编码本发明的Clec9A结合剂的核酸可以并入(连接)至表达载体中，所述表达载体可以通过转染、转化或转导技术而引入宿主细胞中。举例来说，可以通过反转录病毒转导将编码本发明的Clec9A结合剂的核酸引入至宿主细胞中。说明性宿主细胞是大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以使转化的宿主细胞在允许宿主细胞表达编码本发明的Clec9A结合剂的基因的条件下生长。因此，在各个实施方案中，本发明提供了包含编码本发明的Clec9A结合剂的核酸的表达载体。在各个实施方案中，本发明额外提供了包含此类表达载体的宿主细胞。
具体的表达和纯化条件将取决于所采用的表达系统而变化。举例来说，如果在大肠杆菌中表达基因，那么首先通过将工程化的基因置于合适的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游而将它克隆至表达载体中。在另一个实例中，如果将要在真核宿主细胞，例如CHO细胞中表达工程化的基因，那么首先将它插入含有例如合适的真核启动子、分泌信号、增强子和各种内含子的表达载体中。可以使用转染、转化或转导技术将基因构建体引入至宿主细胞中。
本发明的Clec9A结合剂可以通过使经编码所述Clec9A结合剂的表达载体转染的宿主细胞在允许表达所述蛋白质的条件下生长来产生。在表达后，可以使用本领域中众所周知的技术，例如亲和力标签诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签或通过色谱法来收集并且纯化所述蛋白质。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含His标签。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂包含His标签和允许切割所述His标签的蛋白水解裂解位点。
因此，在各个实施方案中，本发明提供了一种编码本发明的Clec9A结合剂的核酸。在各个实施方案中，本发明提供了一种包含编码本发明的Clec9A结合剂的核酸的宿主细胞。
在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂或包含其的嵌合蛋白可以在体内例如患者中表达。举例来说，在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂或包含其的嵌合蛋白可以呈编码本发明的Clec9A结合剂或包含其的嵌合蛋白的核酸形式施用。在各个实施方案中，所述核酸是DNA或RNA。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂或包含其的嵌合蛋白是由经修饰的mRNA，即包含一个或多个经修饰的核苷酸的mRNA编码。在一些实施方案中，所述经修饰的mRNA包含一个或多个在美国专利号8,278,036中发现的修饰，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述经修饰的mRNA包含m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ和2'-O-甲基-U中的一者或多者。在一些实施方案中，本发明涉及施用编码一种或多种本发明的嵌合蛋白的经修饰的mRNA。在一些实施方案中，本发明涉及包含所述经修饰的mRNA的基因治疗载体。在一些实施方案中，本发明涉及包括所述基因治疗载体的基因治疗方法。在各个实施方案中，所述核酸呈溶瘤病毒，例如腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、新城疫病毒或牛痘的形式。
药学上可接受的盐和赋形剂
本文所描述的Clec9A结合剂(和/或任何其他治疗剂)可以具有能与无机或有机酸反应的充分碱性的官能团，或能与无机或有机碱反应的羧基，以形成药学上可接受的盐。如本领域中众所周知，药学上可接受的酸加成盐是由药学上可接受的酸形成。此类盐包括例如以下文献中列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)和The Handbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,andUse.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，所述文献特此以引用方式整体并入。
作为非限制性实例，药学上可接受的盐包括硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯代苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二甲酸盐、己炔-1,4-二甲酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、酞酸盐、对苯二酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴代苯磺酸盐、氯代苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐和酒石酸盐。
术语“药学上可接受的盐”还指具有酸性官能团，诸如羧酸官能团的本发明组合物与碱形成的盐。合适的碱包括但不限于碱金属诸如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属诸如钙和镁的氢氧化物；其他金属诸如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，诸如未经取代或经羟基取代的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺、二环己基胺；三丁胺；吡啶；N-甲基，N-乙基胺；二乙基胺；三乙基胺；单(2-OH-低级烷基胺)、双(2-OH-低级烷基胺)或三(2-OH-低级烷基胺)(诸如单(2-羟基乙基)胺、双(2-羟基乙基)胺或三(2-羟基乙基)胺)、2-羟基-叔丁胺或三(羟甲基)甲胺、N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺(诸如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺)或三(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡萄糖胺；和氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸等等。
在一些实施方案中，本文所描述的组合物呈药学上可接受的盐的形式。
药物组合物和调配物
在各个实施方案中，本发明有关于包含本文所描述的Clec9A结合剂(和/或任何其他治疗剂)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，本发明有关于包含本发明的Clec9A结合剂的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明有关于包含本文所描述的任何其他治疗剂的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明有关于包含本发明的Clec9A结合剂与本文所描述的任何其他治疗剂的组合的药物组合物。本文所描述的任何药物组合物都可以作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分施用至受试者。此类组合物可以任选地包含适量的药学上可接受的赋形剂，以便提供用于适当施用的形式。
在各个实施方案中，药物赋形剂可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。所述药物赋形剂可以是例如生理盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲等等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至受试者时，所述药学上可接受的赋形剂是无菌的。当经静脉内施用本文所描述的任何剂时，水是可用的赋形剂。还可以采用生理盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为液体赋形剂，具体来说，用于可注射溶液。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。本文所描述的任何剂在需要时还可以包含微量润湿剂或乳化剂或pH值缓冲剂。合适的药物赋形剂的其他实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro编辑,第19版1995)中，所述文献以引用方式并入本文。
本发明包括所描述的药物组合物(和/或其他治疗剂)的各种调配物形式。本文所描述的任何发明药物组合物(和/或其他治疗剂)可以呈溶液、悬浮液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、丹剂、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、明胶胶囊、粉剂、持续释放调配物、栓剂、乳液、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉剂、冷冻悬浮液、干燥粉剂的形式或任何其他合用的形式。在一个实施方案中，所述组合物呈胶囊剂形式。在另一个实施方案中，所述组合物呈片剂形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制为呈软凝胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制为呈明胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制为液体。
在必要时，本发明的药物组合物(和/或其他剂)还可以包括增溶剂。所述剂还可以与如本领域中已知的合适的媒介物或递送装置一起递送。本文概述的组合疗法可以在单个递送媒介物或递送装置中共同递送。
本发明的包含本发明药物组合物(和/或其他剂)的调配物可能适宜呈单位剂型的形式存在，并且可以通过制药领域中众所周知的任何方法来制备。此类方法一般包括使所述治疗剂与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。典型地，所述调配物是通过使所述治疗剂均匀地并且密切地与液体载体、细粉状固体载体或二者缔合，然后在必要时将产物成形为所期望的制剂的剂型(例如湿式或干式造粒、粉末掺合物等，随后使用本领域中已知的常规方法进行制片)来制备。
在各个实施方案中，本文所描述的任何药物组合物(和/或其他剂)根据常规程序配制为适合于本文所描述的施用模式的组合物。
施用途径包括例如：口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、直肠、通过吸入或局部。施用可以是局部的或全身的。在一些实施方案中，所述施用是通过口服实现。在另一个实施方案中，所述施用是通过肠胃外注射。施用模式可以留给医师判断，并且部分取决于医学病状的部位。在大部分情况下，施用使得本文所描述的任何剂释放至血流中。
在一个实施方案中，本文所描述的Clec9A结合剂根据常规程序配制为适合于口服施用的组合物。举例来说，用于口服递送的组合物可以呈片剂、糖锭、水性或油性悬浮液、颗粒剂、粉剂、乳液、胶囊剂、糖浆或酏剂形式。口服施用的组合物可以包含一种或多种剂，例如甜味剂，诸如果糖、阿斯巴特(aspartame)或糖精；调味剂，诸如薄荷油、冬青油或樱桃油；着色剂；和防腐剂，以提供药学上可口的制剂。此外，在呈片剂或丸剂形式时，所述组合物可以经过包衣以延迟胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时间段内提供持续作用。在本文所描述的渗透活性驱动的任何Clec9A结合剂周围的选择性渗透膜还适用于口服施用的组合物。在后面的这些平台中，来自于所述胶囊剂周围的环境的流体被驱动化合物吸入，所述驱动化合物膨胀从而通过孔口置换所述剂或剂组合物。与立即释放调配物的尖峰分布相反，这些递送平台可以提供本质上零阶的递送分布。时间延迟材料诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯也是可用的。口服组合物可以包括标准赋形剂，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。在一个实施方案中，所述赋形剂属于药物等级。悬浮液以及活性化合物可以含有悬浮剂，诸如例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂土、琼脂、黄芪胶等以及它们的混合物。
适用于肠胃外施用(例如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮液、分散液、乳液等等。它们还可以制造为呈无菌固体组合物(例如冻干组合物)形式，所述形式可以在即将使用前溶解或悬浮在无菌可注射介质中。它们可以含有例如本领域中已知的悬浮剂或分散剂。适用于肠胃外施用的调配物组分包括无菌稀释剂诸如注射用水、生理盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如EDTA；缓冲液诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张力调节剂诸如氯化钠或葡萄糖。
对于静脉内施用而言，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。所述载体在制造和存储条件下应当是稳定的，并且应当经过防腐以免受微生物影响。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。
本文提供的组合物可以单独或与其他合适的组分组合而制成气雾剂调配物(即，“喷雾”)以便经由吸入施用。气雾剂制剂可以放入加压可接受的推进剂诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等中。
本文所描述的任何发明药物组合物(和/或其他剂)可以通过控制释放或持续释放手段或通过本领域普通技术人员众所周知的递送装置施用。实例包括但不限于美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,556中所描述的那些，各美国专利以引用的方式整体并入本文。此类剂型可用于使用例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体、微球体或它们的组合提供一种或多种活性成分的控制释放或持续释放，从而在变化的比例下提供所期望的释放分布。可以容易地选择本领域技术人员已知的合适的控制释放或持续释放调配物，包括本文所描述的那些，以便与本文所描述的剂的活性成分一起使用。本发明因此提供了适合口服施用的单个单位剂型，诸如但不限于适合于控制释放或持续释放的片剂、胶囊剂、囊形片和胶囊片。
可以通过各种条件包括但不限于pH值变化、温度变化来刺激、通过适当的光的波长、酶的浓度或可用性、水的浓度或可用性或者其他生理条件或化合物来刺激活性成分的控制释放或持续释放。
在另一个实施方案中，控制释放系统可以放在欲治疗的目标区域的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications of ControlledRelease,同上,第2卷,第115-138页(1984))。可以使用Langer,1990,Science 249:1527-1533)的综述中讨论的其他控制释放系统。
药物调配物优选地是无菌的。可以例如通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物被冻干的情况下，可以在冻干和复水之前或之后进行过滤灭菌。
施用和剂量
应当了解，根据本发明施用的Clec9A结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的实际剂量将根据具体剂型和施用模式而变化。本领域技术人员可以考虑能调节Clec9A结合剂的作用的许多因素(例如体重、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、受试者的状况、药物组合、遗传倾向和反应敏感性)。可以连续地或者以最大耐受剂量内的一个或多个离散剂量进行施用。本领域技术人员可以使用常规剂量施用测试来确定给定条件组的最佳施用速率。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的合适的剂量在约0.01mg/kg至约10g/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约1g/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约100mg/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的范围内，例如约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg体重、约100mg/kg体重、约1g/kg体重、约10g/kg of体重，包括所有值和介于这些值之间的范围。
所述Clec9A结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的个别剂量可以呈含有例如每个单位剂型约0.01mg至约100g、约0.01mg至约75g、约0.01mg至约50g、约0.01mg至约25g、约0.01mg至约10g、约0.01mg至约7.5g、约0.01mg至约5g、约0.01mg至约2.5g、约0.01mg至约1g、约0.01mg至约100mg、约0.1mg至约100mg、约0.1mg至约90mg、约0.1mg至约80mg、约0.1mg至约70mg、约0.1mg至约60mg、约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约40mg活性成分、约0.1mg至约30mg、约0.1mg至约20mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约0.1mg至约3mg、约0.1mg至约1mg或每个单位剂型约5mg至约80mg的单位剂型的形式施用。举例来说，单位剂型可以是约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约2.5g、约5g、约10g、约25g、约50g、约75g、约100g，包括所有值和介于这些值之间的范围。
在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂是以每天约0.01mg至约100g、每天约0.01mg至约75g、每天约0.01mg至约50g、每天约0.01mg至约25g、每天约0.01mg至约10g、每天约0.01mg至约7.5g、每天约0.01mg至约5g、每天约0.01mg至约2.5g、每天约0.01mg至约1g、每天约0.01mg至约100mg、每天约0.1mg至约100mg、每天约0.1mg至约95mg、每天约0.1mg至约90mg、每天约0.1mg至约85mg、每天约0.1mg至约80mg、每天约0.1mg至约75mg、每天约0.1mg至约70mg、每天约0.1mg至约65mg、每天约0.1mg至约60mg、每天约0.1mg至约55mg、每天约0.1mg至约50mg、每天约0.1mg至约45mg、每天约0.1mg至约40mg、每天约0.1mg至约35mg、每天约0.1mg至约30mg、每天约0.1mg至约25mg、每天约0.1mg至约20mg、每天约0.1mg至约15mg、每天约0.1mg至约10mg、每天约0.1mg至约5mg、每天约0.1mg至约3mg、每天约0.1mg至约1mg或每天约5mg至约80mg的量施用。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂是以约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约2.5g、约5g、约7.5g、约10g、约25g、约50g、约75g、约100g的每日剂量施用，包括所有值和介于这些值之间的范围。
根据本发明的某些实施方案，包含所述Clec9A结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的药物组合物可以施用例如每天超过一次(例如每天约两次、约三次、约四次、约五次、约六次、约七次、约八次、约九次或约十次)、约每天一次、约每隔一天一次、约每第三天一次、约一周一次、约每两周一次、约每个月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每六个月一次或约每年一次。
组合疗法和其他治疗剂
在各个实施方案中，将本发明的药物组合物与其他一种或多种治疗剂联合共同施用。共同施用可以同时或依序进行。
在一个实施方案中，将所述其他治疗剂和本发明的Clec9A结合剂同时施用给受试者。如本文所使用，术语“同时”意指所述其他治疗剂和Clec9A结合剂的施用时间间隔不超过约60分钟，诸如不超过约30分钟、不超过约20分钟、不超过约10分钟、不超过约5分钟或不超过约1分钟。所述其他治疗剂和Clec9A结合剂的施用可以通过同时施用单一制剂(例如包含所述其他治疗剂和Clec9A结合剂的调配物)或独立的调配物(例如包括所述其他治疗剂的第一调配物和包括Clec9A结合剂的第二调配物)来进行。
共同施用不需要同时施用各治疗剂，只要其施用时程使得所述其他治疗剂和Clec9A结合剂的药理学活性在时间上重叠，由此发挥组合治疗作用即可。举例来说，所述其他治疗剂和Clec9A结合剂可以依序施用。如本文所使用，术语“依序”意指所述其他治疗剂和Clec9A结合剂的施用时间间隔超过约60分钟。举例来说，依序施用所述其他治疗剂与Clec9A结合剂之间的时间可以间隔超过约60分钟、超过约2小时、超过约5小时、超过约10小时、超过约1天、超过约2天、超过约3天、超过约1周或超过约2周或超过约一个月。最佳的施用时间将取决于代谢速率、排泄速率和/或所施用的其他治疗剂和Clec9A结合剂的药物动力学活性。可以先施用所述其他治疗剂或Clec9A结合剂。
共同施用也不需要通过相同施用途径向受试者施用所述治疗剂。实际上，各治疗剂可以通过任何适当的途径，例如经肠胃外或非肠胃外施用。
在一些实施方案中，本文所描述的Clec9A结合剂当与另一种治疗剂共同施用时协同起作用。在此类实施方案中，所述Clec9A结合剂和其他治疗剂的施用剂量可以低于当各剂用于单一疗法情形时所采用的剂量。
在一些实施方案中，本发明有关于化学治疗剂作为其他治疗剂。举例来说但不限于，本发明的Clec9A结合剂与化学治疗剂的这种组合可用于治疗癌症，如本文中其他部分所描述。化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(例如布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵抑素(cally statin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycin)(例如，念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔抑素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB 1-TM1)；伊斯罗宾(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫斯汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如卡利奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡利奇霉素γl和卡利奇霉素ωl(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色素蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、佐柔比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星)、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉芬酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡芦睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，诸如氨鲁米特(minoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(例如T-2毒素、粘液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇(taxoid)，例如TAXOL太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE太平洋紫杉醇的不含聚氧乙烯化蓖麻油(Cremophor)的经白蛋白工程化的纳米粒子制剂(American PharmaceuticalPartners,Schaumberg,111.)以及TAXOTERE多西他赛(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE.长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar、CPT-11)(包括伊立替康与5-FU的治疗方案)和亚叶酸(leucovorin))；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；亚叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)(Tarceva))和VEGF-A的抑制剂；以及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，治疗方法还可以包括使用辐射。另外，治疗方法还可以包括使用光动力疗法。
因此，在一些实施方案中，本发明涉及使用所述Clec9A结合剂和化疗剂的组合疗法。在一些实施方案中，本发明涉及对利用化疗剂进行治疗的患者施用所述Clec9A结合剂。在一些实施方案中，所述化疗剂是DNA插入剂，诸如但不限于多柔比星、顺铂、佐柔比星和表柔比星。在一个实施方案中，所述DNA插入剂是多柔比星。
在说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与多柔比星共同施用时协同作用。在一个说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与多柔比星共同施用以用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。举例来说，共同施用所述Clec9A结合剂和多柔比星可以协同作用，以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂与多柔比星的组合当与单独用在单一疗法的情形下的所述剂相比时可以表现出提高的安全特性。在说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂和多柔比星可以按比当所述剂用在单一疗法的情形下时所采用的剂量更低的剂量施用。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含突变的干扰素，诸如突变的IFNα。在说明性实施方案中，所述突变的IFNα相对于SEQ ID NO:337或SEQ ID NO:338在位置148、149和153处包含一个或多个突变，诸如取代M148A、R149A和L153A。
在一些实施方案中，本发明涉及利用一种或多种免疫调节剂，例如但不限于调节免疫检查点的剂的组合疗法。在各个实施方案中，所述免疫调节剂靶向PD-1、PD-L1和PD-L2中的一者或多者。在各个实施方案中，所述免疫调节剂是PD-1抑制剂。在各个实施方案中，所述免疫调节剂是对PD-1、PD-L1和PD-L2中的一者或多者具有特异性的抗体。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于，纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO，BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA，MERCK)、皮地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL328OA(ROCHE)。在一些实施方案中，所述免疫调节剂靶向CD137或CD137L中的一者或多者。在各个实施方案中，所述免疫调节剂是对CD137或CD137L中的一者或多者具有特异性的抗体。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于乌瑞鲁单抗(urelumab)(又称为BMS-663513和抗4-1BB抗体)。在一些实施方案中，将本发明的嵌合蛋白与乌瑞鲁单抗(任选地与纳武单抗、利丽单抗(lirilumab)和乌瑞鲁单抗中的一者或多者)组合以治疗实体肿瘤和/或B细胞非霍奇金氏淋巴瘤和/或头颈癌和/或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是靶向以下一者或多者的剂：CTLA-4、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A。在各个实施方案中，所述免疫调节剂是对以下一者或多者具有特异性的抗体：CTLA-4、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010、MDX-101，Yervoy，BMS)和/或曲美目单抗(tremelimumab)(Pfizer)。在一些实施方案中，将本发明的嵌合蛋白与伊匹单抗(任选地与巴维昔单抗(bavituximab))组合以治疗黑素瘤、前列腺癌和肺癌中的一者或多者。在各个实施方案中，所述免疫调节剂靶向CD20。在各个实施方案中，所述免疫调节剂是对CD20具有特异性的抗体。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于，奥法木单抗(GENMAB)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(GAZYVA)、AME-133v(APPLIED MOLECULAR EVOLUTION)、奥瑞珠单抗(GENENTECH)、TRU-015(TRUBION/EMERGENT)、维妥珠单抗(veltuzumab)(IMMU-106)。
在一些实施方案中，本发明涉及使用所述Clec9A结合剂和检查点抑制剂的组合疗法。在一些实施方案中，本发明涉及对利用检查点抑制剂进行治疗的患者施用所述Clec9A结合剂。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是靶向PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4中的一者或多者的剂(包括本文所描述的抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4剂中的任一种)。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO，BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA，MERCK)、皮地利珠单抗(CT-011，CURETECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL328OA(ROCHE)、伊匹单抗(MDX-010、MDX-101，Yervoy，BMS)和曲美目单抗(Pfizer)。在一个实施方案中，所述检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
在说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与所述抗PD-L1抗体共同施用时协同作用。在一个说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与所述抗PD-L1抗体共同施用以用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。举例来说，共同施用所述Clec9A结合剂和所述抗PD-L1抗体可以协同作用以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂与所述抗PD-L1抗体的组合当与单独用在单一疗法的情形下的所述剂相比时可以表现出提高的安全特性。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂和所述抗PD-L1抗体可以按比当所述剂用在单一疗法的情形下时所采用的剂量更低的剂量施用。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含突变的干扰素，诸如突变的IFNα。在说明性实施方案中，所述突变的IFNα相对于SEQ ID NO:337或SEQ ID NO:338在位置148、149和153处包含一个或多个突变，诸如取代M148A、R149A和L153A。
在一些实施方案中，本发明涉及使用所述Clec9A结合剂和免疫阻抑剂的组合疗法。在一些实施方案中，本发明涉及对利用免疫阻抑剂进行治疗的患者施用所述Clec9A结合剂。在一个实施方案中，所述免疫阻抑剂是TNF。
在说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与TNF共同施用时协同作用。在一个说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与TNF共同施用以用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。举例来说，共同施用所述Clec9A结合剂和TNF可以协同作用以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂与TNF的组合当与单独用在单一疗法的情形下的所述剂相比时可以表现出提高的安全特性。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂和TNF可以按比当所述剂用在单一疗法的情形下时所采用的剂量更低的剂量施用。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂包含突变的干扰素，诸如突变的IFNα。在说明性实施方案中，所述突变的IFNα相对于SEQ ID NO:337或SEQID NO:338在位置148、149和153处包含一个或多个突变，诸如取代M148A、R149A和L153A。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂当与嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法组合使用时协同作用。在一个说明性实施方案中，所述Clec9A结合剂当与CAR T细胞疗法组合用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂当与CAR T细胞疗法组合用于治疗基于血液的肿瘤时协同作用。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂当与CAR T细胞疗法组合用于治疗实体肿瘤时协同作用。举例来说，使用所述Clec9A结合剂和CAR T细胞可以协同作用以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂诱导CAR T细胞分裂。在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂诱导CAR T细胞增殖。在各个实施方案中，本发明的Clec9A结合剂预防CAR T细胞无应答。
在各个实施方案中，所述CAR T细胞疗法包含靶向诸多抗原(例如肿瘤抗原)，诸如但不限于碳酸酐酶IX(CAIX)、5T4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD47、CS1、CD138、Lewis-Y、L1-CAM、MUC16、ROR-1、IL13Rα2、gp100、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、第16型人乳头状瘤病毒E6(HPV-16E6)、CD171、叶酸受体α(FR-α)、GD2、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EGFRvIII、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、癌胚抗原癌胚抗原(CEA)和血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)以及本领域中众所周知的其他肿瘤抗原的CAR T细胞。其他说明性肿瘤抗原包括但不限于MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、T细胞受体/CD3-ζ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE家族肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎儿球蛋白、E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白、β-连锁蛋白和γ-连锁蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头状瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、NA、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1CT-7、c-erbB-2、CD19、CD37、CD56、CD70、CD74、CD138、AGS16、MUC1、GPNMB、Ep-CAM、PD-L1和PD-L2。
示例性CAR T细胞疗法包括但不限于JCAR014(Juno Therapeutics)、JCAR015(Juno Therapeutics)、JCAR017(Juno Therapeutics)、JCAR018(Juno Therapeutics)、JCAR020(Juno Therapeutics)、JCAR023(Juno Therapeutics)、JCAR024(JunoTherapeutics)、CTL019(Novartis)、KTE-C19(Kite Pharma)、BPX-401(BellicumPharmaceuticals)、BPX-501(Bellicum Pharmaceuticals)、BPX-601(BellicumPharmaceuticals)、bb2121(Bluebird Bio)、CD-19睡美人细胞(Ziopharm Oncology)、UCART19(Cellectis)、UCART123(Cellectis)、UCART38(Cellectis)、UCARTCS1(Cellectis)、OXB-302(Oxford BioMedica、MB-101(Mustang Bio)和由InnovativeCellular Therapeutics开发的CAR T细胞。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂与一种或多种多发性硬化(MS)治疗剂组合用于治疗MS的方法中，所述MS治疗剂包括但不限于3-干扰素、L醋酸、T-干扰素、IFN-β-2(美国专利公布号2002/0025304)、螺旋锗(例如N-(3-二甲基氨基丙基)-2-氮杂-8,8-二甲基-8-锗螺[4:5]癸烷、N-(3-二甲基氨基丙基)-2-氮杂-8,8-二乙基-8-锗螺[4:5]癸烷、N-(3-二甲基氨基丙基)-2-氮杂-8,8-二丙基-8-锗螺[4:5]癸烷和N-(3-二甲基氨基丙基)-2-氮杂-8,8-二丁基-8-锗螺[4:5]癸烷)、维生素D类似物(例如1,25(OH)2D3(参见例如美国专利号5,716,946))、前列腺素(例如拉坦前列素(latanoprost)、溴莫尼定(brimonidine)、PGE1、PGE2和PGE3，参见例如美国专利公布号2002/0004525)、四环素和衍生物(例如米诺环素(minocycline)和多西环素(doxycycline)，参见例如美国专利公布号20020022608)、VLA-4结合抗体(参见例如美国专利公布号2009/0202527)、促肾上腺皮质激素、皮质类固醇、强的松(prednisone)、甲基强的松(methylprednisone)、2-氯脱氧腺苷、米托蒽醌、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine)、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、富马酸盐、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗(rituximab))和盐酸泰札尼啶(tizanidine hydrochloride)。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂与治疗MS的一种或多种症状或副作用的一种或多种治疗剂组合使用。此类剂包括但不限于金刚胺、巴氯芬(baclofen)、罂粟碱(papaverine)、美克洛嗪(meclizine)、羟嗪、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、环丙沙星(ciprofloxacin)、多库酯(docusate)、匹莫林(pemoline)、丹曲林(dantrolene)、去氨加压素(desmopressin)、地塞米松(dexamethasone)、托特罗定(tolterodine)、苯妥英(phenyloin)、奥昔布宁(oxybutynin)、比沙可啶(bisacodyl)、文拉法辛(venlafaxine)、阿米替林(amitriptyline)、六亚甲基四胺(methenamine)、氯硝西泮(clonazepam)、异烟肼(isoniazid)、伐地那非(vardenafil)、呋喃妥英(nitrofurantoin)、车前子亲水胶浆(psyllium hydrophilic mucilloid)、前列地尔(alprostadil)、加巴喷丁(gabapentin)、去甲替林(nortriptyline)、帕罗西汀(paroxetine)、溴丙胺太林(propanthelinebromide)、莫达非尼(modafinil)、氟西汀(fluoxetine)、非那吡啶(phenazopyridine)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、卡马西平(carbamazepine)、丙咪嗪(imipramine)、地西泮(diazepam)、西地那非(sildenafil)、安非他酮(bupropion)和舍曲林(sertraline)。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂与本文所描述的一种或多种疾病修饰疗法(DMT)(例如，表A的剂)组合用于治疗多发性硬化的方法中。在一些实施方案中，本发明提供了与使用本文所描述的一种或多种DMT(例如，下表A中列出的剂)而不使用一种或多种所公开的结合剂相比有所改善的治疗效果。在一个实施方案中，所述Clec9A结合剂与所述一种或多种DMT的组合产生了协同治疗效果。
表A：说明性疾病修饰疗法
Figure BDA0002443639310001661
Figure BDA0002443639310001671
Figure BDA0002443639310001681
Figure BDA0002443639310001691
Figure BDA0002443639310001701
MS疾病进展在疾病进展的初期阶段可能是最密集并且最具破坏性的。因此，与许多报销政策和根据例如成本和副作用减轻观点的医生实践相反，用最密集DMT开始治疗，例如所谓的第二线疗法可能对患者的长期疾病状态最有益。在一些实施方案中，用所述Clec9A结合剂与第二线疗法组合的方案来治疗患者。使用这种组合来降低一种或多种第二线疗法的副作用特性。在一些实施方案中，使用所述组合来降低一种或多种第二线疗法的剂量或施用频率。举例来说，在所述组合的情形下，上文提供的表A中列出的剂的剂量可以减少约50％、或约40％、或约30％、或约25％，和/或给药频率可以降至往常的一半或往常的三分之一，或者可以从例如每天一次减至每隔一天一次或每周一次、从每隔一天一次减至每周一次或每两周一次、从每周一次减至每两周一次或每个月一次等等。因此，在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂通过允许更方便的治疗方案而增加了患者依从性。此外，一些DMT有建议终生剂量限制，例如，对于米托蒽醌，终生累积剂量应当严格限制在140mg/m2，或者治疗2至3年。在一些实施方案中，补充所述Clec9A结合剂通过允许这种DMT的较低或较少频率给药来保证患者有权使用米托蒽醌。
在一些实施方案中，所述患者是还没有接受利用一种或多种DMT的治疗的未治疗患者，并且所述Clec9A结合剂是用于缓冲第二线疗法的副作用。因此，所述未治疗患者在疾病最初时能够受益于第二线疗法的长期益处。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂用作使用第二线疗法之前的进入疗法。举例来说，所述Clec9A结合剂可以施用约3个月的初步治疗周期以稳定疾病，然后所述患者可以过渡至第二线剂的维持疗法。
总体上认为未治疗患者与已经接受过一种或多种DMT并且可能失败了的患者相比更可能对疗法作出应答。在一些实施方案中，所述Clec9a结合剂可用于已经接受过一种或多种DMT并且可能失败了的患者。举例来说，在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂增加了在已经接受过一种或多种DMT并且可能失败了的患者中的治疗效果，并且可能允许这些患者像未治疗患者那样应答。
在一些实施方案中，所述患者已经接受或正在接受利用一种或多种DMT的治疗并且应答不佳。举例来说，所述患者可能对一种或多种DMT无感受或应答不良。在一些实施方案中，所述患者可能对以下一者或多者无感受或应答不良：特立氟胺(AUBAGIO(GENZYME))；干扰素β-1a(AVONEX(BIOGEN IDEC)；干扰素β-1b(BETASERON(BAYER HEALTHCAREPHARMACEUTICALS、INC.)；醋酸格拉替雷(COPAXONE(TEVA NEUROSCIENCE)；干扰素β-1b(EXTAVIA(NOVARTIS PHARMACEUTICALS CORP.)；芬戈莫德(GILENYA(NOVARTISPHARMACEUTICALS CORP.)；阿仑单抗(LEMTRADA(GENZYME)；米托蒽醌(NOVANTRONE(EMDSERONO)；聚乙二醇化干扰素β-1a(PLEGRIDY(BIOGEN IDEC)；干扰素β-1a(REBIF(EMDSERONO、INC.)；富马酸二甲酯(BG-12)(TECFIDERA(BIOGEN IDEC)；和那他珠单抗(TYSABRI(BIOGEN IDEC)。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂在患者中获得了一种或多种DMT的治疗益处，并且因此减轻或消除了对所述DMT的无应答。举例来说，这可以免除利用一种或多种DMT以较高剂量或频率对患者进行治疗。
在患有更具侵袭性的疾病的患者中，一种方法是诱导治疗模型，其中首先将给予具有强功效但存在强安全性隐患的疗法，然后给予维持疗法。这种模型的一个实例可以包括利用阿仑单抗进行初步治疗，然后是IFN-β、GA或BG-12。在一些实施方案中，使用一种或多种所公开的结合剂以防止需要变换维持疗法。在一些实施方案中，使用一种或多种所公开的结合剂作为一种或多种DMT，包括第二线疗法的维持疗法。在一些实施方案中，使用一种或多种所公开的结合剂作为第一疗法用于诱导，然后进行作为维持疗法的另一种DMT，例如第一线疗法。
在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以施用约3个月的初步治疗周期以稳定疾病，然后所述患者可以过渡至第一线剂的维持疗法。
在各个实施方案中，使用一种或多种所公开的结合剂来减轻DMT，包括但不限于本文公开的任何剂的一种或多种副作用。举例来说，一种或多种所公开的结合剂可以用于方案中而允许剂量节约一种或多种DMT并且因此使得较少副作用。举例来说，在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻AUBAGIO或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用可以包括头发稀疏、腹泻、流感、恶心、肝脏检验异常和手部或足部罕见性麻木或刺痛(感觉异常)、能增加感染风险的白细胞水平；血压增高；和严重肝脏损伤。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻AVONEX或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括注射后的流感样症状、抑郁、轻微贫血、肝脏异常、过敏反应和心脏问题。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻BETASERON或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括注射后的流感样症状、注射部位反应、过敏反应、抑郁、肝脏异常和低白细胞计数。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻COPAXONE或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括注射部位反应、血管舒张(血管膨胀)；胸痛；注射后立即出现的反应，包括焦虑、胸痛、心悸、气短和面部潮红。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻EXTAVIA或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括注射后的流感样症状、注射部位反应、过敏反应、抑郁、肝脏异常和低白细胞计数。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻GILENYA或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括头痛、流感、腹泻、背痛、肝脏酶升高、咳嗽、第一个剂量后心率减缓、感染和眼部肿胀。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻LEMTRADA或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括皮疹、头痛、发烧、鼻充血、恶心、尿路感染、疲劳、失眠、上呼吸道感染、荨麻疹、瘙痒、甲状腺病症、真菌感染、关节、四肢和背部疼痛、腹泻、呕吐、面部潮红和输液反应(包括恶心、荨麻疹、瘙痒、失眠、寒战、面部潮红、疲劳、气短、味觉变化、消化不良、眩晕、疼痛)。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻NOVANTRONE或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括施用后24小时尿液呈蓝绿色；感染、骨髓阻抑(疲劳、瘀伤、低血细胞计数)、恶心、头发稀疏、膀胱感染、口腔溃疡以及严重肝脏和心脏损伤。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻PLEGRIDY或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括注射后的流感样症状、注射部位反应、抑郁、轻微贫血、肝脏异常、过敏反应和心脏问题。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻REBIF或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括注射后的流感样症状、注射部位反应、肝脏异常、抑郁、过敏反应和低红细胞或白细胞计数。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻TECFIDERA或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括面部潮红(热觉或瘙痒和皮肤泛红)、胃肠问题(恶心、腹泻、腹痛)、皮疹、尿蛋白、肝酶升高；和血液淋巴细胞(白细胞)计数减少。在一些实施方案中，一种或多种所公开的结合剂可以减轻TYSABRI或相关剂的一种或多种副作用，所述副作用包括头痛、疲劳、尿路感染、抑郁、呼吸道感染、关节疼痛、胃部不适、腹部不适、腹泻、阴道炎、臂痛或腿痛、皮疹、输液两小时内的过敏或超敏反应(眩晕、发烧、皮疹、瘙痒、恶心、面部潮红、低血压、呼吸困难、胸痛)。
在一些实施方案中，本发明涉及利用WO 2013/10779、WO 2015/007536、WO 2015/007520、WO 2015/007542和WO 2015/007903中所描述的一种或多种嵌合剂的组合疗法，所述文献的全部内容特此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，包括但不限于感染性疾病应用，本发明涉及抗感染剂作为其他治疗剂。在一些实施方案中，所述抗感染剂是抗病毒剂，包括但不限于阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦(Adefovir)、安普那韦(Amprenavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、西多福韦(Cidofovir)、达芦那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、去羟肌苷(Didanosine)、多可沙诺(Docosanol)、依非韦仑(Efavirenz)、埃替格韦(Elvitegravir)、恩曲他滨(Emtricitabine)、恩福韦地(Enfuvirtide)、依曲韦林(Etravirine)、泛昔洛韦(Famciclovir)和膦甲酸盐(Foscarnet)。在一些实施方案中，抗感染剂是抗细菌剂，包括但不限于头孢菌素类抗生素(头孢胺苄(cephalexin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟胺苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)和头孢托罗酯(ceftobiprole))；氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinoloneantibiotics)(环丙沙星(cipro)、左氟沙星(Levaquin)、氧氟沙星(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)和诺氟沙星(norflox))；四环素类抗生素(四环素、米诺环素(minocycline)、羟四环素(oxytetracycline)和去氧环素(doxycycline))；青霉素类抗生素(阿莫西林(amoxicillin)、胺苄西林(ampicillin)、青霉素V、双氯西林(dicloxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、万古霉素(vancomycin)和甲氧西林(methicillin))；单酰胺环类抗生素(胺曲南(aztreonam))；以及碳青霉烯类抗生素(厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)/西司他丁(cilastatin)和美罗培南(meropenem))。在一些实施方案中，抗感染剂包括抗疟药(例如氯喹(chloroquine)、奎宁(quinine)、甲氟喹(mefloquine)、伯胺喹(primaquine)、去氧环素(doxycycline)、蒿甲醚(artemether)/苯芴醇(lumefantrine)、阿托伐醌(atovaquone)/氯胍(proguanil)和磺胺多辛(sulfadoxine)/乙胺嘧啶(pyrimethamine))、甲硝唑(metronidazole)、替硝唑(tinidazole)、伊维菌素(ivermectin)、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)和阿苯达唑(albendazole)。
在一些实施方案中，包括但不限于自身免疫应用，所述其他治疗剂是免疫阻抑剂。在一些实施方案中，所述免疫阻抑剂是消炎剂，诸如类固醇类消炎剂或非类固醇类消炎剂(NSAID)。类固醇，特别是肾上腺皮质类固醇及其合成类似物在本领域中是众所周知的。可用于本发明中的皮质类固醇的实例包括但不限于羟基曲安西龙(hydroxyltriamcinolone)、α-甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、β-甲基地塞米松、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、苯甲酸倍他米松(betamethasone benzoate)、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、戊酸氯倍他索(clobetasol valerate)、地奈德(desonide)、去羟米松(desoxy methasone)、地塞米松(dexamethasone)、二乙酸二氟拉松(diflorasonediacetate)、戊酸二氟可龙(diflucortolone valerate)、氟氢缩松(fluadren olone)、氟氯奈德(fluclorolone acetonide)、特戊酸氟美松(flumethason e pivalate)、氟轻松(fluosinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟可丁酯(flucortinebutylester)、氟可龙(fluocortolone)、醋酸氟泼尼定(fluprednidene/fluprednylidene)、氟氢缩松(flurandrenolone)、哈西奈德(halcinonide)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、丁酸氢化可的松(hydrocortisone butyrate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、可托多松(cortodoxon e)、醋酸氟轻松、氟氢可的松(fludrocortisone)、二醋酸二氟拉松(diflu orosone diacetate)、丙酮化氟雄诺龙(fluradrenolone acetonide)、甲羟松(medrysone)、安西缩松(amcinafel)、安西非特(amcinafide)、倍他米松及其相应酯、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯可托龙(clocortelone)、克西诺龙(clescinolone)、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯(diflupredn ate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米龙(fluorome thalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethason e)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍他米松。可以用于本发明中的(NSAID)包括但不限于水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酰胺、苯甲基-2,5-二乙酰氧基苯甲酸、布洛芬(ibuprofen)、舒林酸(fulindac)、萘普生(naproxen)、酮洛芬(ketoprofen)、依托芬那酯(etofenamate)、保泰松(phenylbutazone)和吲哚美辛(indomethacin)。在一些实施方案中，所述免疫阻抑剂可以是细胞抑制剂，诸如烷化剂、抗代谢物(例如硫唑喋呤、甲氨蝶呤)、细胞毒性抗生素、抗体(例如巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizu mab)和莫罗单抗(muromonab))、抗免疫亲和素(anti-immunophilin)(例如环孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus))、干扰素、阿片类、TNF结合蛋白、霉酚酸酯以及小生物剂(例如芬戈莫德、多球壳素(myriocin))。其他消炎剂描述于例如美国专利号4,537,776中，所述文献的完整内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，本文所描述的Clec9A结合剂包括经过修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子共价附接至该组合物以使得共价附接不会妨碍该组合物的活性。举例来说但不限于，衍生物包括通过特别是糖基化、脂化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护基团/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其他蛋白质等进行修饰的组合物。可以利用已知技术，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等进行多种化学修饰中的任一种。
在其他实施方案中，本文所描述的Clec9A结合剂还包含细胞毒性剂，在说明性实施方案中，所述细胞毒性剂包含毒素、化疗剂、放射性同位素以及引起细胞凋亡或细胞死亡的剂。此类剂可以与本文所描述的组合物缀合。
因此，本文所描述的Clec9A结合剂可以经历翻译后修饰以添加效应子部分，诸如化学接头；可检测部分，诸如荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料和化学发光部分；或功能性部分，诸如链霉亲合素、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性材料。
说明性细胞毒性剂包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巯基喋呤、6-硫鸟喋呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪；烷化剂，诸如氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C、顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂和卡铂(伯尔定)；蒽环霉素，包括佐柔比星(先前的道诺霉素)、多柔比星(阿霉素)、地托比星、卡米诺霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素，包括放线菌素D(dactinomycin/actinomycin D)、博来霉素、刺孢霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)；以及抗有丝分裂剂，诸如长春生物碱类(vincaalkaloid)、长春新碱(vincristine)和长春花碱(vinblastine)。其他细胞毒性剂包括太平洋紫杉醇(紫杉醇)、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙锭、依米丁(emetine)、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基蒽二酮、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦(O,P'-(DDD))、干扰素，以及这些细胞毒性剂的混合物。
其他细胞毒性剂包括但不限于化疗剂，诸如卡铂、顺铂、太平洋紫杉醇、吉西他滨、刺孢霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱、博来霉素、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂、铂、紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、亚叶酸、类固醇、环磷酰胺、美法仑、长春生物碱类(例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)、莫司汀类、酪氨酸激酶抑制剂、放射疗法、性激素拮抗剂、选择性雄激素受体调节剂、选择性雌激素受体调节剂、PDGF拮抗剂、TNF拮抗剂、IL-1拮抗剂、白介素(例如IL-12或IL-2)、IL-12R拮抗剂、毒素缀合的单克隆抗体、肿瘤抗原特异性单克隆抗体、爱必妥(Erbitux)、阿瓦斯丁(Avastin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、抗CD20抗体、美罗华(Rituxan)、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、DXL625、
Figure BDA0002443639310001771
或它们的任何组合。来自植物和细菌的有毒酶，诸如蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌毒素可以与这些治疗剂(例如抗体)缀合以产生细胞类型特异性杀伤试剂(Youle等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:5483(1980)；Gilliland等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:4539(1980)；Krolick等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:5419(1980))。
其他细胞毒性剂包括如Goldenberg在美国专利号6,653,104中所描述的细胞毒性核糖核酸酶。本发明的实施方案还涉及放射免疫缀合物，其中在使用或不使用复合物形成剂的情况下，发射α或β粒子的放射性核种稳定偶合至Clec9A结合剂。此类放射性核素包括β-发射体，诸如磷-32、钪-47、铜-67、镓-67、钇-88、钇-90、碘-125、碘-131、钐-153、镥-177、铼-186或铼-188；以及α发射体，诸如砹-211、铅-212、铋-212、铋-213或锕-225。
说明性可检测部分还包括但不限于辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶。其他说明性荧光材料包括但不限于罗丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形酮、二氯三嗪基胺、藻红蛋白和丹磺酰氯。其他说明性化学发光部分包括但不限于鲁米诺。其他说明性生物发光材料包括但不限于荧光素和水母发光蛋白。其他说明性放射性材料包括但不限于碘-125、碳-14、硫-35、氚和磷-32。
治疗方法
本文所描述的方法和组合物可应用于治疗各种疾病和病症，包括但不限于癌症、感染、免疫病症和炎症性疾病或疾患。
另外，任何本发明的剂都可以用于治疗各种疾病和病症，或制造用于治疗各种疾病和病症的药物，所述疾病和病症包括但不限于癌症、感染、免疫病症、炎症性疾病或疾患，以及自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本发明涉及对患癌患者的治疗或患癌患者。如本文所使用，癌症是指可能干扰身体器官和系统的正常功能的任何不受控制的细胞生长，并且包括原发性和转移性肿瘤两种。原发性肿瘤或癌症从其原始位置迁移并且种在重要器官可以通过受影响器官的功能减退而最终导致受试者死亡。转移是由于癌细胞从原发性肿瘤播散至身体其他部分而在远离原发性肿瘤位置出现的一个癌细胞或一组癌细胞。转移最终可能导致受试者死亡。举例来说，癌症可以包括良性和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。
可以治疗的说明性癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小非核裂细胞NHL；巨大肿块性NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌瘤和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。
在各个实施方案中，本发明提供了供治疗癌症用的Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂是嵌合体的一部分，所述嵌合体还包含经修饰的信号传导剂。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂显著减小和/或消除肿瘤。在一些实施方案中，本发明的Clec9A结合剂当与其他抗癌剂诸如化疗剂、检查点抑制剂和免疫阻抑剂组合施用至受试者时显著减小和/或消除肿瘤。在各个实施方案中，Clec9A结合剂与其他抗癌剂的组合协同减小肿瘤大小和/或消除肿瘤细胞。
在各个实施方案中，本发明涉及利用Clec9A结合剂的癌症组合疗法，所述Clec9A结合剂是嵌合体的一部分，所述嵌合体包含一个或多个靶向部分和一种或多种经修饰的信号传导剂。因此，本发明提供了包括例如针对Clec9A的靶向部分和一种或多种信号转导剂的嵌合或融合蛋白及其与抗癌剂组合的用途。
举例来说，在各个实施方案中，本发明有关于癌症组合疗法，所述癌症组合疗法涉及本文所描述的Clec9A结合剂与经修饰的信号传导剂，包括但不限于突变的人干扰素诸如IFNα，包括人干扰素α2的嵌合体。
在其他实施方案中，本发明的Clec9A结合剂是包含多个靶向部分且因此呈双特异性或三特异性形式存在的嵌合体的一部分。举例来说，在各个实施方案中，本发明有关于癌症组合疗法，所述癌症组合疗法涉及Clec9A结合剂与本文所描述的检查点抑制剂结合剂(例如抗PD-L1、抗PD-1、抗PD-L2或抗CTLA)和经修饰的信号传导剂(包括但不限于突变的人干扰素诸如IFNα，包括人干扰素α2)的嵌合体。
在各个实施方案中，所述信号转导剂经过修饰以便对其受体中的一者或多者具有降低的亲和力或活性，从而允许减弱活性(包括激动或拮抗)和/或预防非特异性信号转导或者嵌合蛋白的不理想螯合。在一些实施方案中，通过与本文所描述的一个或多个靶向部分连接可恢复所述受体处的降低的亲和力或活性。
在一些实施方案中，本发明涉及对患有微生物感染和/或慢性感染的患者的治疗，或患有微生物感染和/或慢性感染的患者。说明性感染包括但不限于HIV/AIDS，结核病、骨髓炎、乙型肝炎、丙型肝炎、爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)或细小病毒、T细胞白血病病毒、细菌过度生长综合征、真菌或寄生虫感染。
在各个实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防一种或多种炎症性疾病或疾患，诸如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸道疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特异性皮炎、脓毒性休克、类风湿性关节炎、炎症性肠病、炎症性盆腔病、疼痛、眼部炎症性疾病、乳糜泻、莱氏综合征(Leigh Syndrome)、甘油激酶缺乏症、家族性嗜酸性粒细胞增多症(FE)、常染色体隐性痉挛性共济失调、喉部炎症性疾病；结核病、慢性胆囊炎、支气管扩张、硅肺病和其他尘肺病。
在各个实施方案中，本发明适用于治疗自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病。
在各个实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防以不合需要的CTL活性为特征的一种或多种疾患和/或以高细胞死亡水平为特征的疾患。举例来说，在各个实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防与不受控制或过度活化的免疫应答相关的一种或多种疾患。
在各个实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防一种或多种自身免疫性和/或神经退行性疾病或疾患，诸如MS、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、硬皮病、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、自身免疫性癫痫、拉斯马森氏脑炎(Rasmussen's encephalitis)、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、艾迪森氏病(Addison's disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、纤维肌痛症、美尼尔氏综合征(Menier's syndrome)；移植排斥(例如，预防同种异体移植排斥)、恶性贫血、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、皮肌炎、修格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、红斑狼疮、重症肌无力、瑞特氏综合征(Reiter's syndrome)、格雷夫氏病(Grave's disease)和其他自身免疫性疾病。
在各个实施方案中，本发明用于治疗或预防各种自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病选自MS(包括但不限于本文所描述的亚型)、阿尔茨海默氏病(包括但不限于早期发作阿尔茨海默氏病、晚期发作阿尔茨海默氏病和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)、帕金森氏病和帕金森症(包括但不限于特发性帕金森氏病、血管帕金森症、药物诱发的帕金森症、路易体痴呆、遗传性帕金森氏病、青少年帕金森氏病)、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS，包括但不限于偶发性ALS、家族性ALS、西太平洋ALS、青少年ALS、西拉玛雅病(Hiramaya Disease))。
在各个实施方案中，本发明用于治疗或预防MS。在各个实施方案中，如本文所描述的Clec9a结合剂用于消除和减少多种MS症状。可以用本文所描述的组合物和方法加以预防或治疗的与多发性硬化相关的说明性症状包括：视神经炎、复视、眼球震颤、眼辨距不良、核间性眼肌麻痹、动作和声音幻视、瞳孔传入缺陷、局部麻痹、单肢轻瘫、下肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、瘫痪、截瘫、偏瘫、四肢瘫痪、四肢麻痹、痉挛、构音障碍、肌肉萎缩、肌痉挛、抽筋、肌张力低下、阵挛、肌阵挛、肌纤维震颤、不宁腿综合征、足下垂、反射功能失调、感觉异常、麻木、神经痛、神经病理性和神经原性疼痛、拉赫米特氏征象(l'hermitte’s sign)、本体感受性功能障碍、三叉神经痛、共济失调、意向性震颤、辨距不良、前庭性共济失调、眩晕、语言共济失调、肌张力障碍、轮替运动障碍、频繁排尿、膀胱痉挛、弛缓性膀胱、逼尿肌-括约肌协同失调、勃起功能障碍、性快感缺乏、性冷淡、便秘、便急、大便失禁、抑郁、认知功能障碍、痴呆、情绪起伏、情绪不稳、欣快症、双极性综合征、焦虑、失语症、言语障碍、疲劳、乌特霍夫氏症状(Uhthoff's symptom)、胃食管反流和睡眠障碍。受试者的这些症状中的一种或多种的减轻或改善可以通过如本文所描述的一种或多种剂来实现。
在各个实施方案中，使用如本文所描述的Clec9A结合剂来治疗或预防临床孤立综合征(CIS)。临床孤立综合征(CIS)是与MS并立的单一单症状发病，诸如视神经炎、脑干症状和部分性脊髓炎。经历第二次临床发病的CIS患者一般被视为患有临床确定型多发性硬化(CDMS)。具有CIS和MRI病变的患者中超过80％继续发展成MS，而大约20％存在自我限制性过程。经历符合MS的单次临床发病的患者可能存在至少一种符合多发性硬化的病变，随后发展成临床确定型多发性硬化。在各个实施方案中，使用本发明描述的Clec9a结合剂来治疗CIS，这样它就不会发展成MS，包括例如RRMS。
在各个实施方案中，使用如本文所描述的Clec9A结合剂来治疗或预防放射性孤立综合征(RIS)。在RIS中，影像学偶然性发现表明不存在临床征象或症状的炎症性脱髓鞘。在各个实施方案中，使用所述Clec9A结合剂来治疗RIS，这样它就不会发展成MS，包括例如RRMS。
在各个实施方案中，使用如本文所描述的Clec9A结合剂来治疗以下一者或多者：良性多发性硬化；复发-缓解型多发性硬化(RRMS)；继发性进行性多发性硬化(SPMS)；进行性复发性多发性硬化(PRMS)；和原发性进行性多发性硬化(PPMS)。
良性多发性硬化是以初次发作后10-15年内有1-2次病情恶化与完全康复、无持续性残疾和无疾病进展为特征的回顾性诊断。然而，良性多发性硬化可能进展成多发性硬化的其他形式。在各个实施方案中，使用所述Clec9a结合剂来治疗良性多发性硬化，这样它就不会发展成MS。
受RRMS困扰的患者经历偶发性恶化或复发以及缓解周期。对于RRMS患者，MRI上可能可见或可能不可见病变和轴突缺失证据。在各个实施方案中，使用如本文所描述的Clec9a结合剂来治疗RRMS。在一些实施方案中，根据麦克唐纳氏诊断标准(McDonald'scriteria)，RRMS包括RRMS患者、患有SPMS和叠加复发的患者，以及后续MRI扫描上显示病变播散的CIS患者。临床复发在本文中还可以用作“复发”、“确诊复发”或“临床确定型复发”，是一种或多种新的神经系统异常的显现或者一种或多种先前观测到的神经系统异常的再现。这种临床状态变化必须持续至少48小时并且紧接在至少30天的相对稳定或改善的神经系统状态之前。在一些实施方案中，当受试者的症状伴随有符合与先前的评估相比扩展残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale，EDSS)评分增加至少1.00或者七个FS中有两个或更多个的评分增加一个等级或者FS之一的评分增加两个等级的观测目标神经系统变化时，将事件计为复发。
SPMS可能从RRMS演变而来。罹患SPMS的患者比RRMS患者更易复发、缓解期间康复的程度更弱、缓解的频率更低并且神经缺损更显著。SPMS患者的MRI上可见脑室扩大，这是胼胝体、中线中心和脊髓萎缩的标志。在各个实施方案中，使用如本文所描述的Clec9a结合剂来治疗RRMS，这样它就不会发展成SPMS。
PPMS以日益加重的神经缺损的稳定进展、不伴有明显发病或缓解为特征。PPMS患者的MRI上显见脑损伤、弥漫性脊髓损伤和轴突缺失证据。PPMS具有急性恶化期，同时沿一系列日益加重的神经缺损进展，不伴有缓解。罹患PRMS的患者的MRI上显见病变。在各个实施方案中，使用如本文所描述的Clec9A结合剂来治疗RRMS和/或SPMS，这样它就不会发展成PPMS。
在一些实施方案中，如本文所描述的Clec9A结合剂用于治疗MS的复发形式的方法中。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂用于治疗MS的复发形式的方法中，以减缓生理残疾的积累和/或降低临床恶化的频率，并且任选地用于已经经历过第一次临床急性发作且具有符合MS的MRI特征的患者。在一些实施方案中，如本文所描述的Clec9a结合剂用于治疗恶化的复发-缓解型MS、进行性-复发性MS或继发性-进行性MS的方法中以降低神经残疾和/或临床恶化的频率。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂降低了复发的频率和/或严重程度。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂用于治疗已经对一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种或更多种疾病修饰疗法(DMT)具有不充分应答的患者的MS的复发形式的方法中。
在各个实施方案中，可以定量评价受试者的症状，诸如通过EDSS，或复发频率的降低，或持续进展的时间的增加，或频繁连续MRI研究中的磁共振成象(MRI)表现的改善，并且比较所述患者在治疗前后的状态测量。在成功的治疗中，患者状态将会得到改善(例如，EDSS测量次数或复发频率将降低，或者持续进展的时间将增加，或者MRI扫描将显示较少病变)。
在一些实施方案中，可以例如在接受Clec9a结合剂之前、期间或之后评估例如患者的应答指标。可以使用治疗有效性的各种临床或其他指标，例如EDSS评分；MRI扫描；复发次数、复发率或严重程度；多发性硬化功能复合(MSFC)；多发性硬化生活品质报表(MSQLI)；步进式系列加法测验(Paced Serial Addition Test，PASAT)；符号数字模式测验(SDMT)；25英尺步行测验；9孔柱测验；低对比度视力；改良疲劳影响量表；扩展残疾状态评分(EDSS)；多发性硬化功能复合(MSFC)；白氏抑郁症量表(Beck Depression Inventory)；和7/24空间记忆测试。在各个实施方案中，所述Clec9A结合剂改善了这些量度中的一个或多个。此外，可以在方案期间的各个时间对患者进行监测。在一些实施方案中，所述Clec9a结合剂引起疾病改善，如通过麦克唐纳播散空间和时间所评价。举例来说，对于播散空间，可以使用病变成像，作为说明诸如巴克霍夫-丁托瑞(Barkhof-Tintore)MR成像标准，包括至少一个钆增强病变或9T2高信号病变；至少一个幕下病变；至少一个近皮质病变；至少约三个脑室周围病变；和脊髓病变。对于播散时间，也可以使用MRI；举例来说，如果初始临床事件后≥3月时进行的脑MRI扫描显示新的钆增强病变，那么这可能表明新的CNS炎性事件，因为MS中的钆增强持续时间通常少于6周。如果不存在除新的T2病变以外的钆增强病变(假设初始事件时的MRI)，那么再过3个月之后可能需要重复MR成像扫描，从而显示新的T2病变或钆增强病变。
在一些实施方案中，使用Lavery等人Multiple Sclerosis International,第2014卷(2014),文章编号262350中描述的任何量度来评价疾病影响，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂引起以下一项或多项：(a)预防被定义为恶化的残疾在EDSS上恶化1.0点；(b)增加复发时间；(c)减少或稳定钆增强病变的数目和/或体积；(d)减少年化复发率；(e)增加复发持续时间和严重程度(根据NRS评分)；(f)降低疾病活性，如通过MRI所测量(年度新病变或扩大病变率)；(g)降低1年或2年时的平均复发次数；(h)持续疾病进展，如通过3个月时的EDSS所测量；(i)预防转化成CDMS；(j)没有或有很少新或增强T2病变；(k)高信号T2病变体积存在最低限度的变化；(l)增加达到麦克唐纳定义的MS的时间；(m)预防残疾进展，如通过12周时EDSS的持续恶化所测量；(n)减少96周时复发的时间；和(o)减轻或稳定脑萎缩(例如相对于基线的百分比变化)。
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂，并且当在前一次复发后3-24个月之间(例如，在6-18个月之间，例如12个月)测量时有效地引起复发率与施用治疗前的复发率相比(例如，与施用12个月或不到12个月，例如约10或约8、或约4、或约2或更少月数后的复发率相比)或与开始治疗前的复发率相比有所降低(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更大程度的复发率降低)。
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地防止EDSS评分相对于治疗前状态有所增加。库茨科(Kurtzke)扩展残疾状态量表(EDSS)是对多发性硬化中的残疾进行定量的方法。EDSS替代过去惯于将患有MS的人归在较低等级中的先前残疾状态量表。EDSS对八个功能系统(FS)中的残疾进行了定量，并且允许神经病医师来指定这些中每一个的功能系统评分(FSS)。所述功能系统是：椎体、小脑、脑干、感知、肠和膀胱、视觉和大脑。
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地引起EDSS评分与施用Clec9a结合剂后(例如12个月或不到12个月，例如不到10、8、4或更少月数，或者在开始治疗前)的EDSS评分相比有所降低(例如，降低1、1.5、2、2.5、3点或更多，例如，在至少三个月、六个月、一年或更久的时间内)。
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地引起全体或任一种类型的新病变数目与施用Clec9A结合剂持续12个月或不到12个月，例如不到10、8、4或更少月数后或者开始治疗前的新病变数目相比有所减少(例如，减少了至少10％、20％、30％、40％)；
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地引起全体或任一种类型的新病变数目与施用Clec9a结合剂持续12个月或不到12个月，例如不到10、8、4或更少月数后或者开始治疗前的病变数目相比有所减少(例如，减少了至少10％、20％、30％、40％)；
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地引起全体或任一种类型的新病变出现率与施用12个月或不到12个月，例如不到10、8、4或更少月数后或者开始治疗前的新病变出现率相比有所降低(例如，出现率降低了至少10％、20％、30％、40％)；
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地引起全体或任一种类型的病变面积增加与施用12个月或不到12个月，例如不到10、8、4或更少月数后或者开始治疗前的病变面积增加相比有所减少(例如，增加减少了至少10％、20％、30％、40％)。
在一个实施方案中，施用所述Clec9A结合剂并且有效地引起视神经炎发病率或症状与施用12个月或不到12个月，例如不到10、8、4或更少月数后或者开始治疗前的视神经炎发病率或症状相比有所降低(例如，改善了视觉)。
在各个实施方案中，本发明的方法可用于治疗人受试者。在一些实施方案中，所述人是小儿。在其他实施方案中，所述人是成年人。在其他实施方案中，所述人是老年人。在其他实施方案中，所述人可以称为患者。在一些实施方案中，所述人是女性。在一些实施方案中，所述人是男性。
在某些实施方案中，所述人的年龄在约1至约18个月大、约18至约36个月大、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁的范围内。在各个实施方案中，所述人的年龄超过30岁。
免疫调节
在各个实施方案中，本发明的组合物能够或可用于免疫调节方法中。举例来说，在各个实施方案中，本发明的治疗方法可以包括本文所描述的免疫调节。在一些实施方案中，所述免疫调节包括在树突状细胞(DC)的情形下的IFN信号传导，包括经修饰的IFN信号传导。
在各个实施方案中，提供了多特异性Clec9a结合剂。在一些实施方案中，本发明的此类多特异性Clec9a结合剂识别并结合至Clec9A和在一个或多个免疫细胞上发现的一个或多个抗原，所述免疫细胞可以包括但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤细胞)、B淋巴细胞、浆细胞、树突状细胞或它们的子集。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂特异性地结合至目标抗原并且有效地直接或间接地募集一个或多个免疫细胞。
在一些实施方案中，所述Clec9a结合剂特异性地结合至目标抗原，并且有效地直接或间接地募集一个或多个免疫细胞以引起免疫阻抑作用，例如，所述Clec9a结合剂直接或间接地募集免疫阻抑性免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫阻抑性免疫细胞是调控T细胞(或“Treg”，如本文所使用，是指调节免疫系统、消除自身免疫性疾病、维持对自身抗原的耐受性以及阻碍抗肿瘤免疫应答的T细胞亚群)。其他免疫抑制性免疫细胞包括骨髓阻抑细胞(或“MSC”，如本文所使用，是指由其骨髓起源、不成熟状态和有效阻抑T细胞应答的能力定义的异质性细胞群)；肿瘤相关嗜中性粒细胞(或“TAN”，如本文所使用，是指能够阻抑免疫应答的嗜中性粒细胞子集)；肿瘤相关巨噬细胞(或“TAM”，如本文所使用，是指可以减少免疫应答的巨噬细胞子集)、M2巨噬细胞和/或诱导肿瘤的肥大细胞(如本文所使用，是指骨髓来源的长寿异质性细胞群的子集)。此外，免疫阻抑性免疫细胞包括Th2细胞和Th17细胞。另外，免疫阻抑性免疫细胞包括表达一个或多个检查点抑制受体(例如免疫细胞上表达的预防或抑制不受控制的免疫应答的受体，包括CTLA-4、B7-H3、B7-H4、TIM-3)的免疫细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞。参见Stagg,J.等人,Immunotherapeutic approach in triple-negative breast cancer.Ther Adv Med Oncol.(2013)5(3):169-181)。
在一些实施方案中，所述Clec9a结合剂刺激调控T细胞(Treg)增殖。Treg细胞以Foxp3(叉头框p3)转录因子的表达为特征。大部分Treg细胞是CD4+和CD25+，并且可以视为辅助T细胞的子集，但小群可能是CD8+。因此，将要通过本发明方法加以调节的免疫应答可以包括任选地响应于抗原而诱导Treg细胞的增殖。因此，所述方法可以包括对受试者施用包含所述抗原的组合物，其中所述抗原与对Clec9A具有亲和力的结合剂相关。所述抗原可以与促进Treg细胞增殖的佐剂一起施用。
只要这种方法包括响应于特定抗原而刺激Treg细胞的增殖和分化，它就可以被认为是一种刺激免疫应答的方法。然而，鉴于Treg细胞能够以其他方式调节免疫系统的其他细胞对抗原的应答，例如抑制或阻抑其活性，对免疫系统的作用总体上可以调节(例如阻抑或抑制)对该抗原的应答。因此，本发明的这个方面的方法同样可以被认为是调节(例如抑制或阻抑)对抗原的免疫应答的方法。
在一些实施方案中，所述方法治疗性地或预防性地抑制或阻抑对特定抗原的不合需要的免疫应答，甚至在预先存在针对该抗原的免疫力或持续免疫应答的受试者中亦如此。这可能特别有用，例如，在治疗自身免疫性疾病方面。
在某些条件下，还有可能通过使特定抗原靶向表达Clec9A的抗原呈递细胞而使受试者耐受所述抗原。本发明因此提供了一种用于诱导受试者对抗原的耐受性的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含所述抗原的组合物，其中所述抗原与对Clec9A具有亲和力的结合剂相关，并且其中所述抗原是在不存在佐剂的情况下施用。在这种情形下，耐受性典型地涉及消耗将能够以其他方式应答该抗原的免疫细胞或诱导此类免疫细胞对抗原的应答的持续减少。
可能特别需要产生针对受试者表现出不合需要的免疫应答或处在发展不合需要的免疫应答的风险下的抗原的Treg应答。举例来说，它可能是自身免疫性疾病中对其发生免疫应答的自身抗原。特定抗原已经被鉴定为可能对发病重要的自身免疫性疾病的实例包括多发性硬化(髓鞘碱性蛋白)、胰岛素依赖性糖尿病(谷氨酸脱羧酶)、胰岛素抗性糖尿病(胰岛素受体)、乳糜泻(醇溶蛋白)、大疱性类天疱疮(第XVII型胶原蛋白)、自身免疫性溶血性贫血(Rh蛋白)、自身免疫性血小板减少症(GpIIb/IIIa)、重症肌无力(乙酰胆碱受体)、格雷夫氏病(促甲状腺激素受体)、肾小球性肾炎诸如古德帕斯彻氏病(α3(IV)NC1胶原蛋白)和恶性贫血(内因子)。或者，靶抗原可能是外源性抗原，所述外源性抗原刺激还会引起对宿主组织的破坏的应答。举例来说，急性风湿热是由对与心肌细胞抗原交叉反应的链球菌抗原的抗体应答引起。因此这些抗原或其特定片段或表位可能是用于本发明的合适抗原。
在一些实施方案中，本发明的剂或使用这些剂的方法破坏了Clec9A信号传导(例如经由中和Clec9A)，例如通过降低或抑制Clec9A与其配体的结合。一些自身免疫性疾病以异常高水平的细胞死亡为特征，并且认为与这些细胞相关的对自身抗原的免疫应答可能促成了这些疾患的发病。因此可以使用Clec9A拮抗剂来防止Clec9A与死细胞和垂死的细胞(例如经历免疫原性细胞死亡的那些细胞)中暴露的配体结合，并且可以因此抑制或防止刺激对这些抗原的免疫应答。
在各个实施方案中，本发明的剂或使用这些剂的方法降低或阻抑自身反应性T细胞。在一些实施方案中，所述多特异性Clec9a结合剂在嵌合体的情形下任选地通过干扰素信号传导引起这种免疫阻抑。在一些实施方案中，所述多特异性Clec9a结合剂刺激可以阻抑自身反应性T细胞的PD-L1或PD-L2信号传导和/或表达。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂在嵌合体的情形下任选地通过干扰素信号传导引起这种免疫阻抑。在一些实施方案中，所述Clec9A结合剂刺激可以阻抑自身反应性T细胞的PD-L1或PD-L2信号传导和/或表达。
在各个实施方案中，本发明的方法包括对调控T细胞与效应T细胞的比进行调节以有利于免疫阻抑，例如，以治疗自身免疫性疾病。举例来说，在一些实施方案中，本发明的方法降低和/或抑制以下一者或多者：细胞毒性T细胞；效应记忆T细胞；中枢记忆T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞；TH1效应T细胞；TH2效应T细胞；TH9效应T细胞；TH17效应T细胞。举例来说，在一些实施方案中，本发明的方法增加和/或刺激以下一者或多者：CD4+CD25+FOXP3+调控T细胞、CD4+CD25+调控T细胞、CD4+CD25-调控T细胞、CD4+CD25高调控T细胞、TIM-3+PD-1+调控T细胞、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)+调控T细胞、CTLA-4/CD152+调控T细胞、神经纤毛蛋白-1(Nrp-1)+调控T细胞、CCR4+CCR8+调控T细胞、CD62L(L-选择素)+调控T细胞、CD45RB低调控T细胞、CD127低调控T细胞、LRRC32/GARP+调控T细胞、CD39+调控T细胞、GITR+调控T细胞、LAP+调控T细胞、1B11+调控T细胞、BTLA+调控T细胞、第1型调控T细胞(Tr1细胞)、第3型T辅助(Th3)细胞、天然杀伤T细胞表型调控细胞(NKTreg)、CD8+调控T细胞、CD8+CD28-调控T细胞和/或分泌IL-10、IL-35、TGF-β、TNF-α、半乳凝素-1、IFN-γ和/或MCP1的调控T细胞。
在一些实施方案中，本发明的方法有利于免疫抑制信号超过免疫刺激信号。在一些实施方案中，本发明的方法允许逆转或阻抑免疫激活或共刺激信号。在一些实施方案中，本发明的方法允许提供免疫抑制信号。举例来说，在一些实施方案中，本发明的剂和降低对免疫刺激信号的影响的方法不限于以下一种或多种：4-1BB、OX-40、HVEM、GITR、CD27、CD28、CD30、CD40、ICOS配体；OX-40配体、LIGHT(CD258)、GITR配体、CD70、B7-1、B7-2、CD30配体、CD40配体、ICOS、ICOS配体、CD137配体和TL1A。此外，在一些实施方案中，本发明的剂和增加对免疫抑制信号的影响的方法不限于以下一种或多种：CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160(又称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)和各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。试剂盒
本发明还提供了用于施用本文所描述的任何Clec9A结合剂(例如具有或没有其他治疗剂)的试剂盒。所述试剂盒是包括至少一种本文所描述的本发明药物组合物在内的材料或组分的组合体。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒含有至少一种本文所描述的药物组合物。
配置在试剂盒中的组分的确切特性取决于其预定目的。在一个实施方案中，所述试剂盒被配置用于治疗人受试者的目的。
在所述试剂盒中可以包括使用说明书。使用说明书典型地包括有形表示，其描述了使用所述试剂盒的组分实现所期望的治疗结果，诸如治疗癌症时将要采用的技术。任选地，所述试剂盒还含有本领域技术人员容易了解的其他有用组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、敷涂器、吸移工具或测量工具、包扎材料或其他有用的附件。
装配在试剂盒中的材料和组分可以提供给从业人员，以保持其可操作性和效用的任何便利且适合的方式储存。举例来说，这些组分可以在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供。这些组分典型地包含在合适的包装材料中。在各个实施方案中，包装材料是由众所周知的方法构造，优选地以提供无菌、无污染的环境。包装材料可以具有指示所述试剂盒和/或其组分的内含物和/或目的的外部标签。
定义
如本文所使用，“一个/一种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。
此外，术语“约”当与引用的数值指示结合使用时意指所引用的数值指示加或减所述引用的数值指示的至多10％。举例来说，语言“约50”覆盖45至55的范围。
“有效量”当与医学用途结合使用时是有效提供目标疾病的发病率的可测量治疗、预防或降低的量。
如本文所使用，如果活性和/或效应的读出在剂或刺激物存在下相对于不存在此类调节降低了显著量，诸如降低了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、多达并且包括至少约100％，那么某性质“降低”。如本领域普通技术人员所理解，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读出将降低但其他下游读出可以增加。
相反地，如果活性和/或效应的读出在剂或刺激物存在下相对于不存在此类剂或刺激物增加了显著量，例如增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、多达并且包括至少约100％或更多、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，那么活性“增加”。
如本文所提及，除非另外规定，否则全部组成百分比都以总组合物的重量计。如本文所使用，词语“包括”及其变化形式旨在是非限制性的，使得在列表中对项目的列举不应排除也可以用于这项技术的组合物和方法中的其他类似项目。类似地，术语“可以(can/may)”及其变化形式旨在是非限制性的，使得一个实施方案可以包含某些要素或特征的列举不排除本发明技术的不含有那些要素或特征的其他实施方案。
尽管开放性的术语“包含”作为术语诸如包括、含有或具有的同义词在本文中用以描述和要求本发明，但本发明或其实施方案可以可选地使用替代性术语如“由……组成”或“基本上由……组成”加以描述。
如本文所使用，词语“优选的”和“优选地”是指所述技术的在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，其他实施方案在相同或其他情况下也可以是优选的。此外，列举一个或多个优选实施方案不意指其他实施方案是无用的，并且不打算将其他实施方案从所述技术的范围中排除。
用于实现治疗效果所需要的本文所描述的组合物的量可以出于特定目的根据常规程序凭经验确定。一般来说，对于出于治疗目的而施用治疗剂而言，治疗剂是以药理学有效剂量给予。“药理学有效量”、“药理学有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生所期望的生理效应的量或能够实现所期望的结果、特别是用于治疗病症或疾病的量。如本文所使用，有效量将包括足以例如延迟病症或疾病的症状的发展、改变病症或疾病的症状的过程(例如，减缓疾病的症状的进展)、减少或消除病症或疾病的一种或多种症状或表现形式，以及逆转病症或疾病的症状的量。治疗益处还包括中断或减缓潜在疾病或病症的进展，无关于是否实现了改善。
有效量、毒性和治疗功效可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD50(约50％群体的致死剂量)和ED50(在约50％群体中具有治疗有效性的剂量)。剂量可以取决于所用剂型和所用施用途径而变化。毒性与治疗效果之间的剂量比率是治疗指数并且可以表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，展现较大治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量最初可以由体外测定(包括例如细胞培养物测定)加以估算。此外，剂量可以在动物模型中配制以实现包括如在细胞培养物中或在适当动物模型中测定的IC50的循环血浆浓度范围。所描述的组合物在血浆中的含量可以例如通过高效液相色谱法加以测量。任何特定剂量的效应都可以通过合适的生物测定来监测。剂量可以由医师确定并且根据需要调整以适应观察到的治疗效果。
在某些实施方案中，效应将引起至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约90％的可定量变化。在一些实施方案中，效应将引起约10％、约20％、约30％、约50％、约70％或甚至约90％或更大的可定量变化。治疗益处还包括中断或减缓潜在疾病或病症的进展，无关于是否实现了改善。
如本文所使用，“治疗方法”同样适用于组合物用于治疗本文所描述的疾病或病症的用途和/或组合物用于制造用以治疗本文所描述的疾病或病症的药物的一种和/或多种用途。
实施例
实施例1.人Clec9A特异性VHH的构建和评估
抗原特异性VHH的分离
从免疫的美洲驼构建VHH文库。使用表达人Clec9A的经稳定转染的CHO-K1细胞在溶液中对VHH文库进行连续三轮淘选。在每一轮淘选之后通过比较从经转染的细胞洗脱的噬菌粒数目(输出)与用于淘选的噬菌粒数目(输入)来评价抗原特异性噬菌体的富集。第2轮和第3轮中的噬菌体输出与第1轮的输出相比分别增加了约10倍和约103倍。输入噬菌体一直是约1011个，并且第一轮的输出是约108个噬菌体粒子。对来自第1轮、第2轮和第3轮淘选的285个随机选择的菌落(每一轮95个)进行测序，然后基于CDR3序列进行分组。使用包括VHH的粗周质提取物，用经人Clec9A稳定转染的CHO-K1细胞通过流式细胞术分析95个独特序列对人Clec9A的特异性。未转染的亲本CHO-K1细胞用作阴性对照细胞。不相关的VHH用作阴性纳米抗体对照物。流式细胞术实验揭示了属于25个不同的组(参见图3)的66种不同的VHH，这些VHH对人Clec9A具有特异性。以下表B提供了代表66种不同抗人Clec9A VHH基因的66个克隆的描述。生成了带有含抗人Clec9A VHH序列的重组人噬菌粒pMECS的大肠杆菌TG1，并且存储在-80℃下。载体pMECS编码氨苄西林抗性。
Figure BDA0002443639310001961
Figure BDA0002443639310001971
Figure BDA0002443639310001981
用重组pMECS转化非阻抑菌株(例如WK6)
pMECS载体中克隆的VHH基因含有处于N端的PelB信号序列和处于C端的HA标签和His6标签(PelB前导序列-VHH-HA-His6)。PelB前导序列将VHH引导至大肠杆菌的周质间隙，而HA和His6标签用于VHH的纯化和检测(例如用于ELISA、蛋白质印记等)。
在pMECS载体中，His6标签后接琥珀终止密码子(TAG)，此琥珀终止密码子后接M13噬菌体的基因III。在阻抑大肠杆菌菌株(例如TG1)中，琥珀终止密码子被读作谷氨酰胺，因此VHH被表达为与噬菌体蛋白III的融合蛋白，后者允许在噬菌体外壳上展示VHH以进行淘选。在TG1阻抑菌株中，阻抑效率不是100％，因此阻抑菌株中VHH的表达会产生两种不同类型的VHH分子，即与蛋白III融合的以及不含蛋白III的)。在非阻抑大肠杆菌菌株(例如WK6)中，琥珀终止密码子被读作终止密码子，因此所得VHH不与蛋白III融合。
为了表达并纯化pMECS载体中克隆的VHH，制备含有目标VHH的基因的pMECS，并将质粒转化成非阻抑菌株(例如WK6)。使用MP057引物(5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’)(SEQID NO:1070)对所得克隆的VHH进行测序，以验证所述克隆的同一性。通过ELISA或任何其他适当的测定法再测试抗原结合能力。含有具有VHH基因的重组pMECS载体的非阻抑菌株(例如WK6)用于VHH的表达和纯化。
在pMECS载体中，存储VHH后会切下His6标签。因此，如果要使用His6标签进行检测，则将VHH基因从pMECS再克隆到pHEN6c载体等中。具体而言，使用带有VHH基因作为模板的重组pMECS以及引物A6E和PMCF，通过PCR对VHH基因进行扩增。引物A6E和PMCF分别是框架1和框架4引物。引物序列如下：
●引物A6E(5’GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR*GGA GG 3’)(SEQ ID NO:1071)。
●引物PMCF(5’CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’)(SEQ IDNO:1072)。
●通用反向引物(5’TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’)(SEQ ID NO:1073)。
●通用正向引物(5’CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’)(SEQ ID NO:1074)。
*R代表A或G。PstI、NotI和BstEII(Eco91I)识别序列分别以粗体、斜体和下划线显示。
扩增方案包括约30个PCR循环，每一个循环包括在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下45秒，随后在PCR结束时，在72℃下延伸10分钟。扩增约400bp的片段。
对PCR产物进行纯化(例如通过得自Qiagen的Qiaquick PCR纯化试剂盒)，并且用PstI消化过夜。用BstEII(或用得自Fermentas的Eco91I)将经过纯化的PCR产物消化过夜。用于进行消化的温度可以变化。举例来说，在50℃或60℃下用BstEII进行消化，这取决于酶的供应商。
为了连接，对PCR产物进行纯化。用PstI将pHEN6c载体消化3小时，如以上所描述进行纯化，然后用BstEII消化2至3小时。或者，使用得自Fermentas的Eco91I进行消化。使经过消化的载体在1％琼脂糖凝胶上跑胶，从凝胶中切下载体带并且加以纯化(例如，利用得自Qiagen的Qiaquick凝胶提取试剂盒)。随后将PCR片段连接至载体。
利用连接反应对电感受态WK6细胞进行转化，并且使用LB/琼脂/氨苄西林(100μg/ml)/葡萄糖(1％-2％)平板来选择转化体。使用通用反向引物和通用正向引物通过PCR对阳性克隆进行筛选。如果存在插入物，则扩增约550bp的片段。为了验证克隆的同一性，使用通用反向引物对每个VHH的至少2个克隆进行测序。通过ELISA或任何其他适当的测定法再测试抗原结合能力。
按照以上方案，生成了pHEN6c载体中克隆的VHH基因，所述VHH基因含有处于N端的PelB信号序列和处于C端的His6尾。PelB前导序列将VHH引导至大肠杆菌的周质间隙，而His标签用于VHH的纯化和检测(例如用于ELISA、蛋白质印迹法等)。
VHH的表达和纯化
进行VHH的表达和纯化。具体而言，在第1天，给新鲜转化的WK6菌落接种10-20ml的LB+氨苄西林(100μg/ml)+葡萄糖(1％)。在37℃下，在以200-250rpm振荡的情况下将该预培养物孵育过夜。在第2天，使用TB培养基来表达VHH。每升TB培养基包括：2.3g KH2PO4、16.4gK2HPO4.3H2O、12g胰蛋白胨(Duchefa Biochemie)、24g酵母(Duchefa Biochemie)和4ml100％甘油(Duchefa Biochemie)。
将1升带挡板摇瓶装满330ml TB并进行高压蒸汽处理。未对KH2PO4和K2HPO4.3H2O进行高压蒸汽处理。作为代替，制备了KH2PO4和K2HPO4.3H2O，进行过滤灭菌，然后添加至已经高压蒸汽处理的剩余培养基中。将约1ml预培养物添加至补充有100μg/ml氨苄西林、2mMMgCl2和0.1％葡萄糖的330ml TB中，随后在37℃下在振荡(200-250rpm)下生长，直至OD600达到0.6-0.9。添加IPTG(终浓度为1mM)以诱导VHH表达。将培养物在28℃下在振荡下孵育过夜(约16-18小时)。过夜诱导后的OD600通常在25与30之间。制备每个克隆至少1升培养物(3瓶)，平均产量在1与15mg/l之间。
在第3天从大肠杆菌的周质中提取VHH。使用的溶液包括：TES：0.2M Tris pH 8.0、0.5mM EDTA、0.5M蔗糖；TES/4：在水中稀释4倍的TES。
将过夜诱导的培养物以8000rpm离心8分钟。通过上下吸液将来自1升培养物的细胞沉淀物重悬于12ml TES中，并在冰上振荡1小时。每使用12ml TES，添加约18ml TES/4，并且在冰上在振荡下再孵育一小时，然后在4℃下以8000rpm离心30分钟。将含有从周质间隙中提取的蛋白质的上清液转移到新鲜法尔康(falcon)管中。
随后通过IMAC利用以下溶液纯化VHH：HIS-select(SIGMA)、PBS和50mM乙酸钠pH4.6。
用PBS使His-select平衡。具体而言，每一种来源于1升培养物的周质提取物，将1ml树脂(约2ml His-select溶液)添加至50ml法尔康管中。还添加PBS，达到50ml的最终体积并且混合。以2000rpm离心2分钟，并且弃去上清液。如上所述，用PBS将树脂洗涤两次。将周质提取物添加至树脂中，在室温下在温和振荡下孵育30分钟至1小时。将样品装载在底部有过滤器的PD-10柱(GE healthcare，目录号17-0435-01)并且用50至100ml PBS(每1ml树脂使用50-100ml PBS)洗涤。进行3次洗脱，每一次每1ml树脂使用1ml PBS/0.5M咪唑(为了有效洗脱，重新悬浮珠粒，并且在4℃下放置过夜，其中柱底部闭合)。在4℃下进行针对PBS透析过夜(截止值3500道尔顿)以除去咪唑。为了进行有效透析，将透析缓冲液(PBS)更换2-3次。或者，作为用咪唑洗脱的代替，可以用10ml 50mM乙酸钠pH 4.6洗脱结合的VHH。如果使用50mM乙酸钠pH 4.6来洗脱VHH，则立即用1M Tris pH 8.0中和洗脱的VHH，并且不需要进行透析。
通过对洗脱的样品进行OD280测量来估计蛋白质的量。通过Expasy蛋白质组学服务器上的一级结构分析下的protParam工具来确定每一个克隆的消光系数。可以通过不同的方法来实现对VHH的进一步纯化。举例来说，可以通过在4℃下以2000rpm进行离心来浓缩样品(Vivaspin 5000MW截止值，Vivascience)，直至获得用于装载在Superdex 75 16/60上的适当体积(最大4ml)。将浓缩的样品加载在用PBS平衡过的Superdex 75 16/60柱上。汇集诸峰级分，并且进行OD280测量以进行定量。一般来说，当以1ml/min运行时，在85-95分钟后洗脱VHH。将浓缩的VHH样品的等分试样以约1mg/ml的浓度存储在-20℃下。
实施例2.人Clec9A结合VHH的功能表征
通过流式细胞术测试各种VHH的结合特征(如实施例1中所描述)。将HEK293-T细胞用人Clec9A表达质粒转染并用2μg/ml的带His标签的VHH染色，之后用抗His Fitc缀合的抗体染色。通过经由流式细胞术检测细胞荧光来测量结合。如图4所示，结果表明VHH与Clec9A结合。
实施例3.抗人Clec9A VHH嵌合体诱导的树突状细胞信号传导
术语“AcTaferon”在本文中用于指代基于干扰素的嵌合体。在以下实施例中，除非另外指明，否则IFN的突变是相对于人IFN-α2-SEQ ID NO:2的突变。
进行树突状细胞pSTAT信号传导测定。研究的嵌合体是抗人Clec9A VHH/人IFNR149A融合物。研究了诸剂的两个剂量：100ng/ml和500ng/ml。
在该实施例中使用的抗人Clec9A VHH是2LEC13、2LEC20、2LEC38、3LEC6和3LEC30。
简单来说，从获自健康供体的血液中分离出人PBMC。使用肝素涂覆的管(12个管)从每个供体收集大约120ml血液。将血液保存在室温下并且立即加以处理。简单来说，用DPBS对血液进行1:1稀释，并且将25ml轻缓地层铺至15ml淋巴细胞H上。在离心之后，收集单核细胞环，用DPBS(PBS杜氏磷酸盐缓冲生理盐水，Wisent，目录号311-425-LL)将细胞洗涤三次，并且计数。使用含有处于PBS中的谱系特异性单克隆抗体与磁性粒子悬浮液(STEMCELL Technologies，目录号19251)的组合的“DC富集试剂盒”，根据制造商的说明书从PBMC群体富集树突状细胞。
在存在或不存在测试项和对照物(PBS)的情况下将树突状细胞(DC)刺激15分钟，并且通过流式细胞术测定分离的DC细胞群体(Lin-(CD14/CD16/CD20/CD56/CD3)/HLA-DR+)中磷酸化STAT1(pSTAT1，具体来说是pY701-STAT1)的水平。刺激后，对细胞进行固定(BDCytofix固定缓冲液，BD Bioscience，目录号554655)，然后用Perm缓冲液II(BD PhosFlowPerm Buffer，BD Bioscience，目录#558052)进行渗透。然后针对磷酸化STAT1和DC表面标记物(Lin-/HLA-DR+)对细胞进行染色(参见下表C)。同时进行细胞内染色与表面染色。用DPBS洗涤细胞后，进行流式细胞术和数据获取。
表C：用于流式细胞术染色的抗体的清单
Figure BDA0002443639310002041
。
图5示出了表示为pSTAT+树突状细胞百分比的倍数变化的数据。
这项研究清楚地表明，包含可在细胞靶向后恢复活性的IFN信号传导剂(IFNR149A)的人CLEC9A抗原靶向构建体促进了人树突状细胞中的IFN信号传导(如通过pSTAT1诱导所测定)。因此，使用针对人CLEC9A抗原的靶向部分使IFN靶向人树突状细胞触发了明显的IFN信号转导。
实施例4.人Clec9A特异性VHH的构建和评估
产生了人Clec9A VHH R1CHCL50和3LEC89的变体并加以分析。驻留在位置37、44、45、47和84(US2008/0107601；Kabat编号一览表)上的典型VHH框架标志残基未被人源化，而两个序列中的N端Q均突变为D，以避免焦谷氨酸形成。产生了R1CHCL50和3LEC89的四个变体序列并加以测试。
R1CHCL50(野生型)：
QVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:327)；
R1CHCL50_opt1(E1D-A74S-K83R-Q108L)：
DVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:328)；
R1CHCL50_opt2(E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:329)；
R1CHCL50_opt3(E1D-A74S-K83R-Q108L-T64K)：
DVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:330)；
R1CHCL50_opt4(E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q-T64K)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFSSINVMGWYRQAPGKERELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYLVALKAEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:331)；
3LEC_89(野生型)：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:332)；
3LEC_89_opt1(E1D-Q5V-Q108L)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:333)；
3LEC_89_opt2(E1D-Q5V-Q108L-A74S)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:334)；
3LEC_89_opt3(E1D-Q5V-Q108L-G75K)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:335)；和
3LEC_89_opt4(E1D-Q5V-Q108L-A74S-G75K)：
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNAMGWYRQAPGKQRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKAFTRGDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:336)。
产生和纯化
通过GeneArt(ThermoFisher)合成野生型和变体(opt1至opt4)，并将它们克隆在具有C端his6标签的供细菌周质表达用的pHEN6C载体中。将所得构建体在WK6细胞中转染。用1mM IPTG诱导VHH表达过夜，使细胞沉淀，并且使用TES(0.2M Tris pH 8.0、0.5mM EDTA、0.5M蔗糖)和TES/4缓冲液制备周质提取物。根据制造商的指南使用TALON金属亲和树脂(TALON Metal affinity resin)从提取物中纯化蛋白质，并使用PD10柱(GE Healthcare)从样品中除去咪唑。每升培养物的平均产量为0.8至5mg(参见图6和表D)。
Figure BDA0002443639310002071
热稳定性和亲和力
根据制造商的指南，使用在LightCycler 480系统(Roche)上的SYPRO orange(Sigma-Aldrich)测定所得VHH的热稳定性。用蛋白质熔解分析软件(Protein MeltingAnalysis software，Roche)计算熔解温度，熔解温度的范围为75℃至83℃并且汇总在表E中。
Figure BDA0002443639310002072
亲和力
使用生物层干涉技术在Octet系统(ForteBio)上测定AFN对Clec9A的亲和力。为此，将生物素化的人CLEC9A捕获在链霉亲和素传感器上，并且测定3种浓度的VHH(50、100和200nM)的亲和力。对3种测试浓度的整体分析结果汇总在表F中。
Figure BDA0002443639310002081
实施例5.靶向人Clec9A的嵌合蛋白的构建和评估
构建包含人Clec9A靶向部分和突变的人IFNα2信号传导部分(R149A)的嵌合蛋白并加以分析。
嵌合蛋白的构建、产生和纯化
经由(GGS)3接头将人Clec9A VHH的R1CHCL50和3LEC89基因融合至人IFNα2R149A。通过GeneArt(ThermoFisher)合成构建体，并且将所述构建体克隆在供细菌周质表达用的pHEN6C载体中。在WK6细胞中转化后，用1mM IPTG诱导AFN表达过夜，使细胞沉淀，并且使用TES(0.2M Tris pH 8.0、0.5mM EDTA、0.5M蔗糖)和TES/4缓冲液制备周质提取物。根据制造商的指南使用TALON金属亲和树脂(TALON Metal affinity resin)从提取物中纯化蛋白质，并使用PD10柱(GE Healthcare)从样品中除去咪唑。
亲和力
使用生物层干涉技术在Octet系统(ForteBio)上测定嵌蛋白质对Clec9A的亲和力。为此，将生物素化的人CLEC9A捕获在链霉亲和素传感器上，并且测定3种浓度的各嵌合蛋白(12.5、25和50nM)的亲和力。对3种测试浓度的整体分析结果汇总在表G中。
Figure BDA0002443639310002091
生物活性
HL116克隆来源于人HT1080细胞系(ATCC CCL-121)。它含有由IFN诱导型6-16启动子控制的萤火虫荧光素酶基因。用编码人Clec9A序列的表达载体转染亲本HL116细胞。在含G418的培养基中选择稳定转染的克隆。将亲本HL116和HL116-hClec9A细胞以每96孔20,000个细胞接种过夜，并用连续稀释的嵌合蛋白刺激6小时。在细胞裂解物中测量荧光素酶活性。代表性图在图7A-图7B中示出。如图7A-图7B所示，所述嵌合蛋白对Clec9A阴性H116细胞几乎没有活性。但是所述嵌合蛋白的活性在表达Clec9A的H116细胞中得以恢复。
实施例6.人CLEC9A AcTaferon的体内功效
选择属于4个不同序列组的CLEC9A VHH 2LEC 16、3LEC 22、1LEC 28、3LEC 30和3LEC 89以评估它们在靶向人CLEC9A VHH的AcTaferon(AFN)组合物(例如，2LEC16-hIFNa2_R149A、3L EC22-hIFNa2_R149A、1LEC28-hIFNa2_R149A、3LEC30-hIFNa2_R149A或3LEC89-hIFNa2_R149A)中的体内抗肿瘤功效。
具有人源化免疫系统的小鼠中的人RL滤泡性淋巴瘤细胞系(RL)肿瘤模型：具有人源化免疫系统的小鼠是根据以下方案产生的。在使用Lymphoprep进行密度梯度离心后从HLA-A2+人脐带血样品中收集单核细胞。通过MACS技术分离人CD34+造血干细胞(HSC)，并使用FACS检测CD34+纯度和CD3+污染。在经历100cGy下的清髓性辐射治疗的2-3天龄NSG小鼠中肝内注射CD34纯度>80％的HSC。在HSC注射后8-12周，使用FACS以全白细胞人和小鼠CD45标记物分析人细胞移植，并选择总活血淋巴细胞中有>5％的人CD45细胞的小鼠来进行肿瘤植入。在HSC注射后12周，给小鼠皮下注射2x106个RL肿瘤细胞。五天后，通过每天腹膜注射Flt3L来治疗小鼠直至第18天。自肿瘤注射后的第11天(当肿瘤已经达到约10mm2的大小时)起，通过每天病灶周围施用开始利用PBS(对照物)或30μg靶向人CLEC9A的AFN的治疗。
如图8所示，靶向CLEC9A VHH的AFN具有体内抗肿瘤活性。
等效方案
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但应当理解，总体来说，按照本发明的原理，能够进行进一步修改并且本申请意在涵盖本发明的任何变化方案、用途或改编，并且包括如在本发明所属领域内的已知或惯用实践范围内和如可以应用于上文所阐述的基本特征和如在所附权利要求书范围内的对本公开的背离。
本领域技术人员仅仅使用常规实验就将认识到或者能够确定本文具体描述的具体实施方案的众多等效方案。此类等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围内。
以引用的方式并入
本文引用的所有专利和出版物特此都以引用方式整体并入。
本文讨论的出版物只提供其在本申请提交日期之前的公开内容。在本文中不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于此类出版物。
如本文所使用，所有标题都只用于组织，而非意在以任何方式限制本公开。任何个别部分的内容都可以同样适用于所有部分。
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Claims (52)

1.一种Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂包含与SEQ ID NO:332中的一者具有至少95％同一性的氨基酸序列。
2.一种Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂包含至少一个靶向部分，所述至少一个靶向部分包含三个互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，其中：
(a)CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:51；
(b)CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:136；并且
(c)CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:202。
3.如权利要求1所述的Clec9A结合剂，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:333-336。
4.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述靶向部分是全长抗体、单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微量蛋白、darpin、抗运载蛋白、adnectin、适体、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、肽模拟分子、受体的天然配体或合成分子。
5.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述靶向部分是单结构域抗体。
6.如权利要求5所述的Clec9A结合剂，其中所述靶向部分包括VHH、人源化VHH或骆驼化VHH。
7.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂包含一种或多种信号传导剂。
8.如权利要求7所述的Clec9A结合剂，其中所述信号传导剂选自干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的一者或多者，所述干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的任一者任选地被修饰。
9.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂包含一个或多个另外的靶向部分。
10.如权利要求9所述的Clec9A结合剂，其中所述一个或多个另外的靶向部分识别并任选地在功能上调节肿瘤抗原。
11.如权利要求10所述的Clec9A结合剂，其中所述一个或多个另外的靶向部分识别并任选地在功能上调节免疫细胞上的抗原。
12.如权利要求11所述的Clec9A结合剂，其中所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞。
13.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂将细胞毒性T细胞募集至肿瘤细胞或肿瘤环境。
14.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂识别并结合Clec9A而基本上不在功能上调节所述Clec9A的活性。
15.一种重组核酸组合物，所述重组核酸组合物编码如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂。
16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求15所述的核酸。
17.如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂适用于患有以下中的一者或多者的患者：癌症、感染、免疫病症和/或自身免疫性疾病。
18.一种Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂包含至少一个靶向部分，所述至少一个靶向部分包含三个互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，其中：
(a)CDR1包含选自SEQ ID NO:2-78中任一者的氨基酸序列；
(b)CDR2包含选自SEQ ID NO:79-192中任一者的氨基酸序列；并且
(c)CDR3包含选自SEQ ID NO:193-257中任一者的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的Clec9A结合剂，其中所述靶向部分是全长抗体、单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微量蛋白、darpin、抗运载蛋白、adnectin、适体、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、肽模拟分子、受体的天然配体或合成分子。
20.如权利要求18或19所述的Clec9A结合剂，其中所述靶向部分是单结构域抗体。
21.如权利要求20所述的Clec9A结合剂，其中所述靶向部分包括VHH、人源化VHH或骆驼化VHH。
22.如权利要求21所述的Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂包含与SEQ ID NO:258-323或327-336中的一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求18-22中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂包含一种或多种信号传导剂。
24.如权利要求23所述的Clec9A结合剂，其中所述信号传导剂选自干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的一者或多者，所述干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的任一者任选地被修饰。
25.如权利要求18-24中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂包含一个或多个另外的靶向部分。
26.如权利要求25所述的Clec9A结合剂，其中所述一个或多个另外的靶向部分识别并任选地在功能上调节肿瘤抗原。
27.如权利要求26所述的Clec9A结合剂，其中所述一个或多个另外的靶向部分识别并任选地在功能上调节免疫细胞上的抗原。
28.如权利要求27所述的Clec9A结合剂，其中所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞。
29.如权利要求18-28中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂将细胞毒性T细胞募集至肿瘤细胞或肿瘤环境。
30.如权利要求18-29中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂识别并结合Clec9A而基本上不在功能上调节所述Clec9A的活性。
31.一种重组核酸组合物，所述重组核酸组合物编码如权利要求18-30中任一项所述的Clec9A结合剂。
32.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求31所述的核酸。
33.如权利要求18-32中任一项所述的Clec9A结合剂，其中所述Clec9A结合剂适用于患有以下中的一者或多者的患者：癌症、感染、免疫病症和/或自身免疫性疾病。
34.一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含如权利要求1-6或18-22中任一项所述的Clec9A结合剂和选自干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的一者或多者的信号传导剂。
35.如权利要求34所述的方法，其中对所述信号传导剂进行修饰。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述癌症选自以下中的一者或多者：基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小非核裂细胞NHL；巨大肿块性NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌瘤和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。
37.一种用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的如以上权利要求中任一项所述的Clec9A结合剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病选自多发性硬化、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征、硬皮病、古德帕斯彻氏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、自身免疫性癫痫、拉斯马森氏脑炎、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、艾迪森氏病、桥本氏甲状腺炎、纤维肌痛症、美尼尔氏综合征；移植排斥(例如，预防同种异体移植排斥)恶性贫血、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、皮肌炎、修格连氏综合征、红斑狼疮、重症肌无力、瑞特氏综合征、格雷夫氏病。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病是多发性硬化。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述Clec9A结合剂导致所述患者中的免疫阻抑。
41.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：
(a)如权利要求1-30或权利要求50-52中任一项所述的Clec9A结合剂；和
(b)经修饰的人IFN-α2，所述经修饰的人IFN-α2与野生型IFN-α2相比具有赋予提高的安全性的一个或多个突变；并且
其中所述靶向部分和所述经修饰的信号传导剂任选地用一个或多个接头连接。
42.如权利要求41所述的嵌合蛋白，其中所述经修饰的人IFN-α2在位置R120、M148、R149和L153处包含一个或多个突变。
43.如权利要求42所述的嵌合蛋白，其中所述经修饰的人IFN-α2包含选自R120E、R149A和L153A的一个或多个突变。
44.如权利要求41所述的嵌合蛋白，其中所述经修饰的人IFN-α2包含R120E突变和R149A突变或L153A突变。
45.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：
(a)如权利要求1-30或权利要求50-52中任一项所述的Clec9A结合剂；和
(b)经修饰的人IFN-β，所述经修饰的人IFN-β与野生型IFN-β相比具有赋予提高的安全性的一个或多个突变；并且
其中所述靶向部分和所述经修饰的信号传导剂任选地用一个或多个接头连接。
46.如权利要求45所述的嵌合蛋白，其中所述经修饰的人IFN-β在位置W22、R27、L32、R35、V148、L151、R152和Y155处包含一个或多个突变。
47.如权利要求46所述的嵌合蛋白，其中所述经修饰的人IFN-β包含选自W22G、R27G、L32A、L32G、R35A、R35G、V148G、L151G、R152A、R152G的一个或多个突变。
48.一种Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂包含至少一个靶向部分，所述至少一个靶向部分包含三个互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，其中：
(a)CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；
(b)CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:137或138；并且
(c)CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:256。
49.如权利要求48所述的Clec9A结合剂，所述Clec9A结合剂包含与SEQ ID NO:327中的一者具有至少95％同一性的氨基酸序列。
50.如权利要求48或49所述的Clec9A结合剂，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:328-331。
51.如权利要求1-30或权利要求50-52所述的Clec9A结合剂中的任一种或如权利要求41-47所述的嵌合蛋白中的任一种在制造用于治疗以下中的一者或多者的药物中的用途：癌症、感染、免疫病症和/或自身免疫性疾病。
52.如权利要求1-30或权利要求50-52中任一项所述的Clec9A结合剂或如权利要求41-47中任一项所述的嵌合蛋白，所述Clec9A结合剂或所述嵌合蛋白用于治疗以下中的一者或多者：癌症、感染、免疫病症和/或自身免疫性疾病。
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