BR112020002706A2 - agentes de ligação a clec9a e uso dos mesmos - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere, em parte, a agentes que ligam a Clec9A e seu uso como agentes de diagnóstico e terapêuticos. A presente invenção se refere ainda a composições farmacêuticas compreendendo os agentes de ligação a Clec9A e seu uso no tratamento de várias doenças.
Description
“AGENTES DE LIGAÇÃO A CLEC9A E USO DOS MESMOS”
[001] O presente pedido reivindica o benefício e a prioridade doPedido de Patente Provisório US 62/542. 944, depositado em 9 de agosto de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[002] A presente invenção refere-se, em parte, a agentes de ligação que se ligam a Clec9A e seu uso como agentes terapêuticos e de diagnóstico.
[003] Os conteúdos do arquivo de texto enviado eletronicamente com este são incorporados ao presente documento a título de referência, em sua totalidade:Uma cópia de formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome de arquivo:ORN-033PC_ST25, data da criação:8 de agosto de 2018; tamanho do arquivo:808 KB).
[004] As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos (APCs) que processam antígenos e os exibem para outras células do sistema imunológico. Especificamente, as células dendríticas são capazes de capturar e apresentar antígenos em suas superfícies para ativar células T, como células T citotóxicas (CTLs). Além disso, as células dendríticas ativadas são capazes de recrutar células imunes adicionais, como macrófagos, eosinófilos, células assassinas naturais e células T, como células T assassinas naturais.
[005] Dado o importante papel das células dendríticas na imunidade, as funções das células dendríticas descarriladas têm sido implicadas em doenças como câncer e doenças autoimunes, como esclerose múltipla. Por exemplo, as células cancerígenas podem evitar a detecção e destruição imunes, prejudicando a funcionalidade das células dendríticas através da prevenção do recrutamento e ativação das células dendríticas. Além disso, células dendríticas foram encontradas no cérebro durante a inflamação do sistema nervoso central e podem estar envolvidas na patogênese de doenças autoimunes no cérebro.
[006] Consequentemente, permanece a necessidade de terapias aprimoradas para doenças, incluindo câncer e esclerose múltipla, modificando as funções das células dendríticas.
[007] Em vários aspectos, a presente invenção refere-se a agentes de ligação a Clec9A possuindo pelo menos uma fração de direcionamento que se liga especificamente a Clec9A. Em várias modalidades, esses agentes de ligação a Clec9A se ligam, mas não modulam funcionalmente (por exemplo, neutralizam parcial ou totalmente) o Clec9A. Portanto, em várias modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A têm, por exemplo, recrutamento direto ou indireto de uma célula que expressa Clec9A para um sítio de interesse, enquanto ainda permite que a célula que expressa Clec9A sinalize via Clec9A (isto é a ligação do agente de ligação Clec9A não reduz nem elimina a sinalização de Clec9A no sítio de interesse). Numa modalidade, a fração de direcionamento é um anticorpo de domínio único (VHH). Em várias modalidades, o agente de ligação Clec9A compreende ainda um agente de sinalização, por exemplo, sem limitação, um interferon, uma interleucina e um fator de necrose tumoral, que pode ser modificado para atenuar a atividade. Em várias modalidades, o agente de ligação Clec9A compreende frações de direcionamento adicionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, antígenos, receptor) de interesse. Numa modalidade, os outros alvos (por exemplo, antígenos, receptor) de interesse estão presentes nas células tumorais. Em outra modalidade, os outros alvos (por exemplo, antígenos, receptor) de interesse estão presentes nas células imunológicas. Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A pode recrutar direta ou indiretamente uma célula imune (por exemplo, uma célula dendrítica) para um sítio de ação (como, por exemplo não limitativo, o microambiente do tumor). Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A facilita a apresentação de antígenos (por exemplo, antígenos tumorais) por células dendríticas.
[008] Em várias modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A encontram uso no tratamento de várias doenças ou distúrbios, como câncer, infecções, distúrbios imunológicos e outras doenças e distúrbios, e a presente invenção abrange vários métodos de tratamento.
[009] A Figura 1 representa a sequência nucleotídica de 66 diferentes VHHs específicos para Clec9A humano. Foram introduzidas lacunas para alinhar sequências. As sequências da Figura 1 recebem identificadores de sequência, como mostrado no Exemplo 1.
[010] A Figura 2 mostra as sequências de aminoácidos de 66 diferentes VHHs específicas para Clec9A humano. As regiões determinantes da complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3), conforme indicado, são definidas de acordo com Kabat. Foram introduzidas lacunas para alinhar sequências. Os 66 VHHs diferentes acima pertencem a 25 grupos CDR3 diferentes (ver a Figura 3). Os VHHs pertencentes ao mesmo grupo são muito semelhantes e suas sequências de aminoácidos sugerem que são de células B relacionadas clonalmente, resultantes de hipermutação somática ou da mesma célula B, mas diversificadas devido a erros de RT e / ou PCR durante a construção da biblioteca. Os VHHs pertencentes ao mesmo grupo reconhecem o mesmo epítopo, mas suas outras características (por exemplo, afinidade, potência, estabilidade, rendimento de expressão, etc.) podem ser diferentes. As sequências da Figura 2 recebem identificadores de sequência, como mostrado no Exemplo 1.
[011] A Figura 3 fornece uma tabela que descreve que os 66 VHHs diferentes pertenciam a 25 grupos CDR3 diferentes.
[012] A Figura 4 mostra a ligação de vários VHHs a células T Hek293 transfectadas com Clec9A humano.
[013] A Figura 5 mostra um ensaio de sinalização de células dendríticas humanas pSTAT1. As quimeras estudadas eram vários Clec9A VHH anti-humano / IFNα R149A humano. Duas doses dos agentes foram estudadas:100 ng / ml e 500 ng / ml. PBS foi o controle e os dados são expressos como uma alteração dobrada da porcentagem de células dendríticas pSTAT1 + (dados são uma média de um conjunto de dados triplicado).
[014] A Figura 6 mostra a purificação e produção de frações de direcionamento Clec9A R1CHCL50, 3LEC89 e variantes das mesmas.
[015] As Figuras 7A-B são gráficos que mostram a atividade biológica de proteínas quiméricas que possuem frações de direcionamento Clec9A (R1CHCL50 e 3LEC89) e frações de sinalização de IFNα2 (R149A) humano mutado contra células HL116 e HL116-hClec9A.
[016] A Figura 8 é um gráfico mostrando a atividade antitumoral in vivo de AFN baseado em CLEC9A (por exemplo, 2LEC16-hIFNa2_R149A, 3LEC22-hIFNa2_R149A, 1LEC28-hIFNa2_R149A, 3LEC30-hIFNa2_R149A, and 3LEC89-hIFNa2_R149A) em camundongos com sistema imunológico humanizado com tumor RL.
[017] A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de agentes (por exemplo, anticorpos como, por exemplo não limitativo, VHHs) que reconhecem e se ligam a Clec9A. Em algumas modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A fazem parte de uma proteína quimérica ou de fusão com uma ou mais frações de direcionamento e / ou um ou mais agentes de sinalização. Em algumas modalidades, esses agentes de ligação a Clec9A se ligam a, mas não modulam funcionalmente Clec9A.
[018] Em algumas modalidades, esses agentes de ligação a Clec9A podem se ligar e recrutar direta ou indiretamente células imunes a sítios que necessitam de ação terapêutica (por exemplo, um tumor ou microambiente tumoral). Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A aprimoram a apresentação de antígeno tumoral para elicitar uma resposta imune antitumoral eficaz.
[019] Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A modulam a apresentação de antígeno. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A temperam a resposta imune para evitar ou reduzir a autoimunidade. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A fornecem imunossupressão. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A causam um aumento na razão de Tregs para células T CD8 + e / ou células T CD4 + em um paciente. Em algumas modalidades, os presentes métodos se referem à redução de células T autorreativas em um paciente.
[020] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os agentes de ligação a Clec9A e seu uso no tratamento de várias doenças, incluindo câncer, doenças autoimunes e / ou neurodegenerativas. Agentes de Ligação a Clec9A
[021] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A é um agente à base de proteína capaz de ligação específica a Clec9A. Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A é um agente à base de proteína capaz de ligação específica a Clec9A sem modulação funcional (por exemplo, neutralização parcial ou total) de Clec9A. Clec9A é um receptor do tipo lectina do tipo C do grupo V (CTLR) expresso na superfície de um subconjunto de células dendríticas (i. e., células dendríticas BDCA3+) especializadas para a captação e processamento de materiais de células mortas. Clec9A reconhece um componente conservado dentro de células nucleadas e não nucleadas, expostas quando as membranas celulares são danificadas. O Clec9A é expresso na superfície celular como um dímero glicosilado e pode mediar a endocitose, mas não a fagocitose. O Clec9A possui um motivo semelhante a ativação à base de tirosina, imunorreceptor citoplasmático, que pode recrutar Syk quinase e induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias (ver Huysamen et al. (2008), JBC, 283:16693-701).
[022] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção compreende uma fração de direcionamento tendo um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece um epítopo presente em Clec9A. Numa modalidade, o domínio de reconhecimento de antígeno reconhece um ou mais epítopos lineares presentes em Clec9A. Como aqui utilizado, um epítopo linear refere-se a qualquer sequência contínua de aminoácidos presentes no Clec9A. Em outra modalidade, o domínio de reconhecimento de antígeno reconhece um ou mais epítopos conformacionais presentes em Clec9A. Como utilizado neste documento, um epítopo de conformação refere-se a uma ou mais seções de aminoácidos (que podem ser descontínuos) que formam uma superfície tridimensional com características e / ou formas e / ou estruturas terciárias capazes de serem reconhecidas por um domínio de reconhecimento de antígeno.
[023] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da presente invenção pode se ligar às formas completas e / ou maduras e / ou isoformas e / ou variantes de emenda e / ou fragmentos e / ou quaisquer outros análogos, variantes naturais ou sintéticos, ou mutantes de Clec9A humano. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção pode se ligar a qualquer forma do Clec9A humano, incluindo formas monoméricas, diméricas, heterodiméricas, multiméricas e associadas. Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A se liga à forma monomérica de Clec9A. Numa outra modalidade, o agente de ligação a Clec9A se liga a uma forma dimérica de Clec9A. Em uma modalidade adicional, o agente de ligação a Clec9A se liga à forma glicosilada de Clec9A, que pode ser monomérica ou dimérica.
[024] Numa modalidade, o presente agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento com um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece um ou mais epítopos presentes no Clec9A humano. Em uma modalidade, o Clec9A humano compreende a sequência de aminoácidos de:
ESKEEMDFITGSLRKIKGSYDYWVGLSQDGHSGRWLWQDGSSPSPGLLPAE RSQSANQVCGYVKSNSLLSSNCSTWKYFICEKYALRSSV (SEQ ID NO:1).
[025] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento capaz de ligação específica. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento tendo um domínio de reconhecimento de antígeno, como um anticorpo ou derivados dos mesmos. Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que é um anticorpo. Em várias modalidades, o anticorpo é uma proteína multimérica de comprimento completo que inclui duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada inclui uma região variável (por exemplo, VH) e pelo menos três regiões constantes (por exemplo, CH1, CH2 e CH3), e cada cadeia leve inclui uma região variável (VL) e uma região constante (CL). As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo. Cada região variável compreende três regiões hipervariáveis, também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs), flanqueadas por quatro regiões estruturais relativamente conservadas (FRs). As três CDRs, referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, contribuem para a especificidade de ligação ao anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou humano.
[026] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que é um derivado ou formato de anticorpo. Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que é um anticorpo de domínio único, um anticorpo recombinante apenas de cadeia pesada (VHH), um anticorpo de cadeia única (scFv), um anticorpo de cadeia pesada de tubarão (VNAR), uma microproteína (proteína do nó de cisteína, knottin), uma DARPin;
uma Tetranectina; um Aficorpo; um Transcorpo; um Anticalina; uma AdNectina; uma Afilina; um Afímero, um Microcorpo; um aptâmero; uma alterase; um anticorpo plástico; um filômero; um estradocorpo; um maxicorpo; um evicorpo; um finômero, uma proteína de repetição do tatu, um domínio de Kunitz, um avímero, um atrímero, um procorpo, um imunocorpo, um triomabe, um troicorpo; um pepcorpo; um vacicorpo, um UniCorpo; um DuoCorpo, um Fv, um Fab, um Fab′, um F(ab′)2, uma molécula mimética peptídica ou uma molécula sintética, conforme descrito em Patente US ou Publicação de Patente US 7.417.130, US 2004/132094, US 5.831.012, US 2004/023334, US 7.250.297, US 6.818.418, US 2004/209243, US 7.838.629, US 7.186.524, US 6.004.746, US 5.475.096, US 2004/146938, US 2004/157209, US 6.994.982, US 6.794.144, US 2010 / 239633, US 7.803.907, US 2010/119446 e / ou US 7.166.697, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Ver também, Storz MAbs. 2011 May-Jun; 3(3):310–317.
[027] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que é um anticorpo de domínio único, como um VHH. O VHH pode ser derivado de, por exemplo, um organismo que produz anticorpo VHH, como um camelídeo, um tubarão ou o VHH pode ser um VHH projetado. Os VHHs são proteínas terapêuticas derivadas de anticorpos que contêm as propriedades estruturais e funcionais únicas dos anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. A tecnologia VHH é baseada em anticorpos totalmente funcionais de camelídeos que não possuem cadeias leves. Esses anticorpos de cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3).
[028] Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende um VHH. Em algumas modalidades, o VHH é um VHH humanizado ou VHH camelizado.
[029] Em algumas modalidades, o VHH compreende um domínio VH totalmente humano, por exemplo um HUMABODY (Crescendo Biologics, Cambridge, Reino Unido). Em algumas modalidades, o domínio VH totalmente humano, por exemplo um HUMABODY é monovalente, bivalente ou trivalente. Em algumas modalidades, o domínio VH totalmente humanopor exemplo, um HUMABODY é mono- ou multi-específico, como monoespecífico, biespecífico ou triespecífico. Domínios VH totalmente humanos ilustrativos, por exemplo um HUMABODIES são descritos em, por exemplo, WO2016 / 113555 e WO2016 / 113557, cuja divulgação inteira é incorporada por referência.
[030] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que é uma VHH compreendendo uma única cadeia de aminoácidos com quatro "regiões estruturais" ou FRs e três "regiões determinantes complementares" ou CDRs. Como utilizado neste documento, "região de estrutura" ou "FR" refere-se a uma região no domínio variável que está localizada entre as CDRs. Como utilizado neste documento, "região determinante complementar" ou "CDR" refere-se a regiões variáveis em VHHs que contêm as sequências de aminoácidos capazes de se ligar especificamente a alvos antigênicos.
[031] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um VHH com um domínio variável compreendendo pelo menos uma sequência de CDR1, CDR2 e / ou CDR3. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma VHH com uma região variável compreendendo pelo menos uma sequência FR1, FR2, FR3 e FR4.
[032] Em algumas modalidades, a sequência CDR1 é selecionada de: GRISSINSMG (SEQ ID NO:2); GSITSINAMG (SEQ ID NO:3); GRFFRVNAMG (SEQ ID NO:4); GSSDSINAMG (SEQ ID NO:5); GSVFSINAWG (SEQ ID NO:6); GSILSINSMG (SEQ ID NO:7); VSISSINSMG (SEQ ID NO:8); GRVFSINAMG (SEQ ID NO:9); VNIDTLNSMA (SEQ ID NO:10); GGISSINSMG (SEQ ID NO:11); GSMHSVNSMA (SEQ ID NO:12); GDISSINAMG (SEQ ID NO:13); GSIFSIDAMG (SEQ ID NO:14); GSIFSINAMG (SEQ ID NO:15); GSIFSIAAMG (SEQ ID NO:16); GNIASITAMG (SEQ ID NO:17); GFTFDDYAIG (SEQ ID NO:18); GSISSINAMG (SEQ ID NO:19); VSIFRSYFMG (SEQ ID
NO:20); GSIVSINAIG (SEQ ID NO:21); RSFSSFNAMG (SEQ ID NO:22); GSFSSINAMG (SEQ ID NO:23); GTSFSINGMA (SEQ ID NO:24); GRTFSTYAMG (SEQ ID NO:25); GRIFDINAMG (SEQ ID NO:26); GTLFSINGMA (SEQ ID NO:27); GSIDSINAMG (SEQ ID NO:28); GRAFSTNSMG (SEQ ID NO:29); GSIISINSMG (SEQ ID NO:30); RNFFSINAMG (SEQ ID NO:31); GSIVSINSMG (SEQ ID NO:32); GSIIGINSMG (SEQ ID NO:33); GRTFPGYVMA (SEQ ID NO:34); GRTFSINAMG (SEQ ID NO:35); GRTLSSYTIG (SEQ ID NO:36); GSFFSINAMG (SEQ ID NO:37); GSIFSINSMG (SEQ ID NO:38); GSIFSFNAMG (SEQ ID NO:39); GRTFSTYAMA (SEQ ID NO:40); VNIGSLNSMV (SEQ ID NO:41); GRTLSNYAVG (SEQ ID NO:42); GSVFSINAMG (SEQ ID NO:43); GSIFEINSIG (SEQ ID NO:44); GSIFNINSMG (SEQ ID NO:45); VNIGTLNSMA (SEQ ID NO:46); GRIGSINSMG (SEQ ID NO:47); GRTLSNYAVA (SEQ ID NO:48); RSFFSFNAMG (SEQ ID NO:49); GIIFSINAMG (SEQ ID NO:50); GRIFSVNAMG (SEQ ID NO:51); GRTFSSYAMA (SEQ ID NO:52); GSFSSINVMG (SEQ ID NO:53); INSMG (SEQ ID NO:54); INAMG (SEQ ID NO:55); VNAMG (SEQ ID NO:56); INAWG (SEQ ID NO:57); LNSMA (SEQ ID NO:58); VNSMA (SEQ ID NO:59); IDAMG (SEQ ID NO:60); IAAMG (SEQ ID NO:61); SITAMG (SEQ ID NO:62); DYAIG (SEQ ID NO:63); SYFMG (SEQ ID NO:64); INAIG (SEQ ID NO:65); FNAMG (SEQ ID NO:66); INGMA (SEQ ID NO:67); TYAMG (SEQ ID NO:68); TNSMG (SEQ ID NO:69); GYVMA (SEQ ID NO:70); SYTIG (SEQ ID NO:71); TYAMA (SEQ ID NO:72); LNSMV (SEQ ID NO:73); NYAVG (SEQ ID NO:74); INSIG (SEQ ID NO:75); NYAVA (SEQ ID NO:76); SYAMA (SEQ ID NO:77); e INVMG (SEQ ID NO:78).
[033] Em algumas modalidades, a sequência CDR2 é selecionada de: AITNGGAKTYADSVKG (SEQ ID NO:79); AITSGGRLSYADSVKG (SEQ ID NO:80); AITNGGQTAYADSVKG (SEQ ID NO:81); AITSGGRSTYIDSAKG (SEQ ID NO:82); AITNQGRIAYAPSVNG (SEQ ID NO:83); AITNDGRTTYVDSVKG (SEQ ID NO:84); AVTVGGRYAYADSAKN (SEQ ID NO:85); AITNQGATTYADSVKG (SEQ ID NO:86);
GITGSGQITYANSVRG (SEQ ID NO:87); AITNGGRTVYGDSVKG (SEQ ID NO:88); AITSGGRLAYAPSVNG (SEQ ID NO:89); AITNGGRTTYVDSVKG (SEQ ID NO:90); AITTGGRTTYVDSVKG (SEQ ID NO:91); AITNQGRLTYADSVKG (SEQ ID NO:92); AITSGGRRAYADSVKG (SEQ ID NO:93); AITSASASRTTYADSVKG (SEQ ID NO:94); CISRSDGSTYYDDSVKG (SEQ ID NO:95); AITNQGRVTYADSVKG (SEQ ID NO:96); AITDGGRLAYADSAKG (SEQ ID NO:97); SITNQGIRNYSTSVMG (SEQ ID NO:98); AITNQGRTTYADSVKG (SEQ ID NO:99); AITNGGRIAYGIAVNG (SEQ ID NO:100); AITNGGRIAYSDSAKG (SEQ ID NO:101); GITSDGSTGYADSVKG (SEQ ID NO:102); AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:103); AITDQGRLAYADSAKG (SEQ ID NO:104); AITNGGQTTYADSVKG (SEQ ID NO:105); AITTGGRTAYVDSVKG (SEQ ID NO:106); AITSQGRITLADSVKG (SEQ ID NO:107); AITVDGRLAYADSAKH (SEQ ID NO:108); AITNGGRIAYGTSVMG (SEQ ID NO:109); AITNGGQIAYADSVKG (SEQ ID NO:110); AITDQGRTTYADSVKG (SEQ ID NO:111); GITTQGRITYGNSVRG (SEQ ID NO:112); AITSGGRTTYVDSVKG (SEQ ID NO:113); AINWRGGDTYYADSVKG (SEQ ID NO:114); AITDGGAKTYADSVKG (SEQ ID NO:115); AITNQGRLSYVDSVKG (SEQ ID NO:116); AITNQGRRTYADSVKG (SEQ ID NO:117); AITNGGRIAYTDSVKG (SEQ ID NO:118); AITNGGRTTYADSVKG (SEQ ID NO:119); AITDGGRLTYADSAKG (SEQ ID NO:120); AISWSGGSTEYHDSVKG (SEQ ID NO:121); AITNQGRIAYADSVKG (SEQ ID NO:122); AINWSSGGISYSNSAKG (SEQ ID NO:123); AITGQGRTTYADSVKG (SEQ ID NO:124); AITNGGQIVYADSVKG (SEQ ID NO:125); AITTQGRTTYEDSVKG (SEQ ID NO:126); AITSGGITNYANSVQG (SEQ ID NO:127); AITVGGRLAYADSAKG (SEQ ID NO:128); GITGGGQITYANSVRG (SEQ ID NO:129); AITSQGRSTYADSAKG (SEQ ID NO:130); AITNGGATVYADSVKG (SEQ ID NO:131); AITDGGRLTYADSAKN (SEQ ID NO:132); AINWSSGGISYSNAAKG (SEQ ID NO:133); AITNXGRTTYADSVKG (SEQ ID NO:134); AIWWASGGISYANSAKG (SEQ ID NO:135); AITNQGAPTYADSVKG (SEQ ID NO:136); RITNLGLPNYADSVTG (SEQ ID
NO:137); RITNLGLPNYADSVKG (SEQ ID NO:138); AITNGGAKT (SEQ ID NO:139); AITSGGRLS (SEQ ID NO:140); AITNGGQTA (SEQ ID NO:141); AITSGGRST (SEQ ID NO:142); ITNQGRIA (SEQ ID NO:143); ITNQGRIAYAPSVNG (SEQ ID NO:144); AITNDGRTT (SEQ ID NO:145); AVTVGGRYA (SEQ ID NO:146); AITNQGATT (SEQ ID NO:147); GITGSGQIT (SEQ ID NO:148); AITNGGRTV (SEQ ID NO:149); AITSGGRLA (SEQ ID NO:150); AITNGGRTT (SEQ ID NO:151); AITTGGRTT (SEQ ID NO:152); AITNQGRLT (SEQ ID NO:153); AITSGGRRA (SEQ ID NO:154); AITSASASRTT (SEQ ID NO:155); CISRSDGSTY (SEQ ID NO:156); AITNQGRVT (SEQ ID NO:157); AITDGGRLA (SEQ ID NO:158); SITNQGIRN (SEQ ID NO:159); AITNQGRTT (SEQ ID NO:160); AITNGGRIA (SEQ ID NO:161); GITSDGSTG (SEQ ID NO:162); AISWSGGSTY (SEQ ID NO:163); AITDQGRLA (SEQ ID NO:164); AITNGGQTT (SEQ ID NO:165); AITTGGRTA (SEQ ID NO:166); AITSQGRIT (SEQ ID NO:167); AITVDGRLA (SEQ ID NO:168); AITNGGQIA (SEQ ID NO:169); AITDQGRTT (SEQ ID NO:170); GITTQGRIT (SEQ ID NO:171); AITSGGRTT (SEQ ID NO:172); AINWRGGDTY (SEQ ID NO:173); AITDGGAKT (SEQ ID NO:174); AITNQGRLS (SEQ ID NO:175); AITNQGRRT (SEQ ID NO:176); AITDGGRLT (SEQ ID NO:177); AISWSGGSTE (SEQ ID NO:178); AITNQGRIA (SEQ ID NO:179); AINWSSGGIS (SEQ ID NO:180); AITGQGRTT (SEQ ID NO:181); AITNGGQIV (SEQ ID NO:182); AITTQGRTT (SEQ ID NO:183); AITSGGITN (SEQ ID NO:184); AITVGGRLA (SEQ ID NO:185); GITGGGQIT (SEQ ID NO:186); AITSQGRST (SEQ ID NO:187); AITNGGATV (SEQ ID NO:188); AITNXGRTT (SEQ ID NO:189); AIWWASGGIS (SEQ ID NO:190); AITNQGAPT (SEQ ID NO:191); e RITNLGLPN (SEQ ID NO:192).
[034] Em algumas modalidades, a sequência CDR3 é selecionada de: FTRRDDY (SEQ ID NO:193); FQSSGID (SEQ ID NO:194); WAADYQQY (SEQ ID NO:195); WNRDRQQY (SEQ ID NO:196); KPTPVYGSTVGDY (SEQ ID NO:197); FTRDKDY (SEQ ID NO:198);
WDRDRQQY (SEQ ID NO:199); FTRTDDY (SEQ ID NO:200); YDRSSTPY (SEQ ID NO:201); FTRGDDY (SEQ ID NO:202); LNSATTY (SEQ ID NO:203); YTRDEDY (SEQ ID NO:204); FTRDEDY (SEQ ID NO:205); KWYDPLVIEYYDN (SEQ ID NO:206); KADHNDY (SEQ ID NO:207); FRSGADDY (SEQ ID NO:208); EVPSTYSCSGFREDY (SEQ ID NO:209); FAASGMEY (SEQ ID NO:210); WTTDRQQY (SEQ ID NO:211); FAGWGKEDY (SEQ ID NO:212); FSPTGDY (SEQ ID NO:213); KPTPVYGSTVGDY (SEQ ID NO:214); KASPVYGSTVEDY (SEQ ID NO:215); STPRGDSY (SEQ ID NO:216); EAEGSGREGNFYERS (SEQ ID NO:217); WDRDRQQY (SEQ ID NO:218); FTRSDDY (SEQ ID NO:219); STPRGDSY (SEQ ID NO:220); FTRDTDY (SEQ ID NO:221); WTTLGTF (SEQ ID NO:222); WVRDGQQY (SEQ ID NO:223); KAIPVYGSTVEDY (SEQ ID NO:224); KAAATHLSTVADY (SEQ ID NO:225); FGRFDDY (SEQ ID NO:226); WGVKTGPESGSGTL (SEQ ID NO:227); FTRDEDY (SEQ ID NO:228); RLTTEYDYAY (SEQ ID NO:229); FTRGNDY (SEQ ID NO:230); FQSSGID (SEQ ID NO:231); FSPTDDF (SEQ ID NO:232); KAIPIYGSTAEDY (SEQ ID NO:233); FSLTDDY (SEQ ID NO:234); WTRDRQQY (SEQ ID NO:235); FTRDEDF (SEQ ID NO:236); EVEGSGREGNFYGA (SEQ ID NO:237); PGWDY (SEQ ID NO:238); YDRSATAY (SEQ ID NO:239); ASSVLSGTVDY (SEQ ID NO:240); FAADGMEY (SEQ ID NO:241); KAAASYVSTVADY (SEQ ID NO:242); TAKDDY (SEQ ID NO:243); FTGWGKEDY (SEQ ID NO:244); WAADYQQY (SEQ ID NO:245); YDRSATPY (SEQ ID NO:246); WARDRQQY (SEQ ID NO:247); WTKDRQQY (SEQ ID NO:248); FTRTYDY (SEQ ID NO:249); ASSILSGTVDY (SEQ ID NO:250); WAADYQQY (SEQ ID NO:251); KPAPVYGSTVGDY (SEQ ID NO:252); FAADGMEY (SEQ ID NO:253); FGSGGG (SEQ ID NO:254); ASSVLSGTADY (SEQ ID NO:255); VALKAEY (SEQ ID NO:256); e EAEGSGREGNFYERS (SEQ ID NO:257).
[035] Em várias modalidades exemplificativas, o agente de ligação a Clec9A compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das seguintes sequências: 1LEC 7 (SEQ ID NO:258)
RELVAAITNGGAKTYADSVKGRFTISTDNAGNTVYLQMDSLRPEDTAVYYCKA FTRRDDYWGQGTQITVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 9 (SEQ ID NO:259)
RELVAAITSGGRLSYADSVKGRFTISRDNAESTVALQMNSLKPEDTAVYSCAA FQSSGIDWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 26 (SEQ ID NO:260)
QRELVAAITNGGQTAYADSVKGRFTISKESARNTVHLQMSSLKPEDTAVYYCT IWAADYQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 27 (SEQ ID NO:261)
RELVAAITSGGRSTYIDSAKGRATISRDNARNTAYLQMSSLKAEDTAVYYCTIW NRDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 28 (SEQ ID NO:262)
QRELVAAITNQGRIAYAPSVNGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCN AKPTPVYGSTVGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 30 (SEQ ID NO:263)
RELVAAITNDGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYWCKA FTRDKDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 38 (SEQ ID NO:264)
RELVAAVTVGGRYAYADSAKNRFTISRDDAQNTVHLQMSSLRAEDTAVYYCTI WDRDRQQYWGXGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 42 (SEQ ID NO:265)
QRELVAAITNQGATTYADSVKGRFTISRDTAGNTVYLQMNSLRPEDTAVHYCK AFTRTDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 51 (SEQ ID NO:266)
RELVAGITGSGQITYANSVRGRFTVSRDNAKSTVYLQMNTLQPEDTAVYYCAA YDRSSTPYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 61 (SEQ ID NO:267)
RELVAAITNGGRTVYGDSVKGRFTISRDSAGNTVHLQMDSLRPEDTGVYYCK AFTRGDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 62 (SEQ ID NO:268)
QRELVAAITSGGRLAYAPSVNGRFTISRDYAKNTIHLQMNSLEPEDTAVYYCA ALNSATTYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 63 (SEQ ID NO:269)
RELVAAITNGGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKA YTRDEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 64 (SEQ ID NO:270)
RELVAAITTGGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKA FTRDEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 70 (SEQ ID NO:271)
RELVAAITNQGRLTYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMDSLKPEDTAVYYCNA KWYDPLVIEYYDNWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 84 (SEQ ID NO:272)
RELVAAITSGGRRAYADSVKGRFTISRDNDENTVALQMNSLKPEDTDVYYCNA KADHNDYWGQGTQITVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 88 (SEQ ID NO:273)
ELVAAITSASASRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCK GFRSGADDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 91 (SEQ ID NO:274)
HEGVSCISRSDGSTYYDDSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCA AEVPSTYSCSGFREDYKGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 92 (SEQ ID NO:275)
RELVAAITNQGRVTYADSVKGRFTISRDGAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKV FAASGMEYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 1LEC 94 (SEQ ID NO:276)
RELVAAITDGGRLAYADSAKGRFTISREDTRNTVHLQMSSLKAEDTAVYYCTI WTTDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 6 (SEQ ID NO:277)
RELVASITNQGIRNYSTSVMGRFTISRDDVKNTVSLQMNSLKPEDSAVYYCKG FAGWGKEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 13 (SEQ ID NO:278)
RELVAAITNQGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLEPEDTAIYYCKG FSPTGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 16 (SEQ ID NO:279)
ERELVAAITNGGRIAYGIAVNGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNA KPTPVYGSTVGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 20 (SEQ ID NO:280)
RELVAAITNGGRIAYSDSAKGRFTISRDSAKNTMYLQMNSLKPEDTDVYYCNA KASPVYGSTVEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 23 (SEQ ID NO:281)
QRELVGGITSDGSTGYADSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYC GTSTPRGDSYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 24 (SEQ ID NO:282)
ERGLVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTIFRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYY CAAEAEGSGREGNFYERSWYQGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHH; 2LEC 26 (SEQ ID NO:283)
RELVAAITDQGRLAYADSAKGRFTISRENARNTLHLQMSSLKAEDTAVYYCTI WDRDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 38 (SEQ ID NO:284)
RELVAAITNGGQTTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRSDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 48 (SEQ ID NO:285)
RELVGGITSDGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCGT STPRGDSYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 53 (SEQ ID NO:286)
RELVAAITTGGRTAYVDSVKGRFTISRDAAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYSCKA FTRDTDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 54 (SEQ ID NO:287)
QRELVAAITSQGRITLADSVKGRFTISSDNTKNTVFLQMNSLKPEDTAVYYCNA WTTLGTFGGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 55 (SEQ ID NO:288)
RELVAAITVDGRLAYADSAKHRFTISKESARNTVHLHMSSLKPEDTAVYYCTIW VRDGQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 59 (SEQ ID NO:289)
RELVAAITNGGRIAYGTSVMGRFTISRDDAKNTVDLQMNSLRPEDTAVYYCNA KAIPVYGSTVEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 60 (SEQ ID NO:290)
QRELVAAITNGGQIAYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTDVYYCN AKAAATHLSTVADYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 61 (SEQ ID NO:291)
RELVAAITDQGRTTYADSVKGRFTISRDDAKNKNTVYLQMNSLKAEDTAVYAC KAFGRFDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 62 (SEQ ID NO:292)
RELVAGITTQGRITYGNSVRGRFTISGDNAKNTVYLQMKSLKPEDTAVYYCSA WGVKTGPESGSGTLEGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 63 (SEQ ID NO:293)
ELVAAITSGGRTTYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKAF TRDEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 67 (SEQ ID NO:294)
EREFAAAINWRGGDTYYADSVKGRFTISRDNVKNTVFLQMNSLKPEDTAVYF CAARLTTEYDYAYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 68 (SEQ ID NO:295)
RELVAAITDGGAKTYADSVKGRFTISTDNAGNTVYLQMDSLRPEDTAVYYCKA FTRGNDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 76 (SEQ ID NO:296)
RELVAAITNQGRLSYVDSVKGRFTISRDNAANTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA FQSSGIDWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 83 (SEQ ID NO:297)
RELVAAITNQGRRTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKSEDTAVYYCKG FSPTDDFWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 88 (SEQ ID NO:298)
RELVAAITNGGRIAYTDSVKGRFTISNDNAKNTVYLQMNSLKPEDTDVYYCNA KAIPIYGSTAEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 89 (SEQ ID NO:299)
RELVAAITNGGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCKG FSLTDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 90 (SEQ ID NO:300)
RELVAAITDGGRLTYADSAKGRFTISRENTRNTVHLQMSSLKAEDTADYYCTI WTRDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 93 (SEQ ID NO:301)
RELVAAITTGGRTTYVDSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCKA FTRDEDFWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 2LEC 95 (SEQ ID NO:302)
RDLVAAISWSGGSTEYHDSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYC AAEVEGSGREGNFYGASWYPGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHH; 3LEC 4 (SEQ ID NO:303)
RELVAAITNQGRIAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGR PGWDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 6 (SEQ ID NO:304)
RELVAGITGSGQITYANSVRGRFTVSRDIAKSTAYLQMNTLKPEDTAVYYCAA YDRSATAYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 9 (SEQ ID NO:305)
QREFVAAINWSSGGISYSNSAKGRFALSRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYY CAAASSVLSGTVDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 11 (SEQ ID NO:306)
RELVAAITGQGRTTYADSVKGRFTISRDGAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKV FAADGMEYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 13 (SEQ ID NO:307)
QRELVAAITNGGQIVYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCN AKAAASYVSTVADYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 15 (SEQ ID NO:308)
RELVAAITTQGRTTYEDSVKGRFTISRDGAQNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCKA WTAKDDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 22 (SEQ ID NO:309)
ELVAAITSGGITNYANSVQGRSTISRDNVNNTVYLQMNSLKPEDSAVYYCKGF TGWGKEDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 23 (SEQ ID NO:310)
RELVAAITVGGRLAYADSAKGRFTISKESARNTVHLQMSSLKPEDTAVYYCTI WAADYQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 27 (SEQ ID NO:311)
RELVAGITGGGQITYANSVRGRFTVSRDIAKSTAYLQMNTLKPEDTAVYYCAA YDRSATPYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 30 (SEQ ID NO:312)
RELVAAITSQGRSTYADSAKGRFTISLGNARNTVNLQMSSLKTEDTAVYYCTI WARDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 36 (SEQ ID NO:313)
REMVAAITNGGATVYADSVKGRFTISRDNAGNTVDLHMNSLRPEDSAVYYCK AFTRGDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 55 (SEQ ID NO:314)
RELVAAITDGGRLTYADSAKNRFTISRENTRNTVHLQMSSLKAEDTAVYYCTI WTKDRQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 57 (SEQ ID NO:315)
RELVAAITNGGAKTYADSVKGRFTISRDGAGNTVYLQMDNLRPEDTAVYYCKA FTRTYDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 61 (SEQ ID NO:316)
QREFVAAINWSSGGISYSNAAKGRFALSRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYY CAAASSILSGTVDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 62 (SEQ ID NO:317)
REMVAAITNGGATVYADSVKGRFTISRDNAGNTVDLHMNSLRPEDSAVYYCTI WAADYQQYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 66 (SEQ ID NO:318)
QRELVAAITNGGRIAYGTSVMGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCN AKPAPVYGSTVGDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 69 (SEQ ID NO:319)
QRELVAAITNGGQTAYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCK VFAADGMEYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 76 (SEQ ID NO:320)
ELVAAITNXGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNAF GSGGGVGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 82 (SEQ ID NO:321)
RELVAAIWWASGGISYANSAKGRFVLSRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYC AAASSVLSGTADYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; 3LEC 89 (SEQ ID NO:322)
QRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCK AFTRGDDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH; ou 3LEC 94 (SEQ ID NO:323)
[036] Em várias modalidades exemplares, o agente de ligação a Clec9A compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências fornecidas acima sem a sequência de etiqueta de histidina terminal (isto é, HHHHHH; SEQ ID NO:324).
[037] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento Clec9A compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:258-323 (fornecida acima) sem a etiqueta HA (isto é, YPYDVPDYGS; SEQ ID NO:325).
[038] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento Clec9A compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:258-323 (fornecida acima) sem o ligante AAA (isto é, AAA).
[039] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento Clec9A compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:258-323 (fornecida acima) sem o ligante AAA, a etiqueta HA e a sequência terminal de etiqueta de histidina (isto é, AAAYPYDVPDYGSHHHHHH; SEQ ID NO:326).
[040] Em várias modalidades exemplificativas, o agente de ligação a Clec9A compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das seguintes sequências:
R1CHCL50:
RELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:327); R1CHCL50_opt1 (E1D-A74S-K83R-Q108L):
RELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:328); R1CHCL50_opt2 (E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q):
RELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:329); R1CHCL50_opt3 (E1D-A74S-K83R-Q108L-T64K):
RELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:330); R1CHCL50_opt4 (E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q-T64K):
RELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:331); 3LEC_89 (tipo selvagem):
QRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCK AFTRGDDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:332); 3LEC_89_opt1 (E1D-Q5V-Q108L):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:333); 3LEC_89_opt2 (E1D-Q5V-Q108L-A74S):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:334); 3LEC_89_opt3 (E1D-Q5V-Q108L-G75K):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:335); e 3LEC_89_opt4 (E1D-Q5V-Q108L-A74S-G75K):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:336).
[041] Numa modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-Clec9A como divulgado em Tullett et al., JCI Insight. 2016; 1(7):e87102, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência.
[042] Em várias modalidades, a presente invenção contempla o uso de quaisquer análogos naturais ou sintéticos, mutantes, variantes, alelos, homólogos e ortólogos (aqui referidos coletivamente como "análogos") do agente de ligação a Clec9A da invenção, como aqui descrito. Em várias modalidades, a sequência de aminoácidos do agente de ligação a Clec9A inclui ainda um análogo de aminoácido, um derivado de aminoácido ou outros aminoácidos não clássicos.
[043] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento compreendendo uma sequência que é pelo menos 60% idêntica a qualquer uma das sequências aqui divulgadas. Por exemplo, o agente de ligação a Clec9A pode compreender uma fração de direcionamento compreendendo uma sequência que é pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 61%, pelo menos cerca de 62%, pelo menos cerca de 63%, pelo menos cerca de 64%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 66%, pelo menos cerca de 67%, pelo menos cerca de 68%, pelo menos cerca de 69%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 71%, pelo menos cerca de 72%, pelo menos cerca de 73%, pelo menos cerca de 74%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 76%, pelo menos cerca de 77%, pelo menos cerca de 78%, pelo menos cerca de 79%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, em pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das sequências divulgadas neste documento (por exemplo, cerca de 60%, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%, de identidade de sequência com qualquer uma das sequências divulgadas neste documento, por exemplo, SEQ ID NOs:327-336).
[044] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo uma ou mais mutações de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências aqui divulgadas. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez, ou quinze, ou vinte mutações de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências aqui divulgadas. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser selecionadas independentemente de substituições, inserções, deleções e truncamentos.
[045] Em algumas modalidades, as mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos e podem incluir substituições conservadoras e / ou não conservadoras.
[046] As "substituições conservadoras" podem ser feitas, por exemplo, com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos de aminoácidos envolvidos. Os 20 aminoácidos de ocorrência natural podem ser agrupados nos seguintes seis grupos padrão de aminoácidos:(1) hidrofóbico:Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos:Asp, Glu; (4) básicos:His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia:Gli, Pro; e (6) aromáticos:Trp, Tyr, Phe.
[047] Como utilizado neste documento, "substituições conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado dentro do mesmo grupo dos seis grupos de aminoácidos padrão mostrados acima. Por exemplo, a troca de Asp por Glu mantém uma carga negativa no polipeptídeo assim modificado. Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas entre si com base na sua capacidade de interromper as hélices α.
[048] Como utilizado neste documento, "substituições não conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado em um grupo diferente dos seis grupos de aminoácidos padrão (1) a (6) mostrados acima.
[049] Em várias modalidades, as substituições também podem incluir aminoácidos não clássicos. Aminoácidos não clássicos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, selenocisteína, pirrolisina, N-β-alanina de formilmetionina, GABA e ácido δ-aminolevulínico, ácido 4-aminobenzoico (PABA), D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, Ácido 2-amino-butírico, γ-Abu, ε-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosme, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, T-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclo- hexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos projetados, tais como β-metil aminoácidos, α-metil aminoácidos, N α-metil aminoácidos e análogos de aminoácidos em geral.
[050] Em várias modalidades, a mutação de aminoácido pode estar nas CDRs da fração de direcionamento (por exemplo, as regiões CDR1, CDR2 ou CDR3). Em outra modalidade, a alteração de aminoácidos pode estar nas regiões estruturais (FRs) da fração de direcionamento (por exemplo, nas regiões FR1, FR2, FR3 ou FR4).
[051] A modificação das sequências de aminoácidos pode ser alcançada utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio ou mutagênese baseada em PCR. Essas técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989 and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.,
1989.
[052] Em várias modalidades, as mutações não reduzem substancialmente a capacidade do presente agente de ligação a Clec9A de se ligar especificamente a Clec9A. Em várias modalidades, as mutações não reduzem substancialmente a capacidade do agente de ligação a Clec9A de se ligar especificamente a Clec9A e sem modular funcionalmente (por exemplo, neutralizar parcial ou totalmente) o Clec9A.
[053] Em várias modalidades, a afinidade de ligação do agente de ligação a Clec9A da invenção para as formas de comprimento total e / ou maduras e / ou isoformas e / ou variantes de emenda e / ou fragmentos e / ou formas monoméricas e / ou diméricas e / ou quaisquer outros análogos, variantes ou mutantes de ocorrência natural ou sintéticos (incluindo formas monoméricas e / ou diméricas) do Clec9A humano podem ser descritos pela constante de dissociação de equilíbrio (KD). Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que se liga às formas de comprimento completo e / ou maduras e / ou isoformas e / ou variantes de emenda e / ou fragmentos e / ou quaisquer outros análogos, variantes naturais ou sintéticos, ou mutantes (incluindo formas monoméricas e / ou diméricas) de Clec9A humano com um KD inferior a cerca de 1 μM, cerca de 900 nM, cerca de 800 nM, cerca de 700 nM, cerca de 600 nM, cerca de 500 nM, cerca de 400 nM, cerca de 300 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 90 nM, cerca de 80 nM, cerca de 70 nM, cerca de 60 nM, cerca de 50 nM, cerca de 40 nM, cerca de 30 nM, cerca de 20 nM, cerca de 10 nM ou cerca de 5 nM ou cerca de 1 nM.
[054] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que se liga, mas não modula funcionalmente (por exemplo, neutraliza parcial ou totalmente) o antígeno de interesse, isto é, Clec9A. Por exemplo, em várias modalidades, a fração de direcionamento do agente de ligação a Clec9A simplesmente direciona o antígeno, mas não modula substancialmente funcionalmente (por exemplo, inibir parcial ou totalmente, reduzir ou neutralizar) um efeito biológico que o antígeno tem. Em várias modalidades, a fração de direcionamento do agente de ligação a Clec9A se liga a um epítopo que é fisicamente separado de um sítio de antígeno que é importante para sua atividade biológica (por exemplo, um sítio ativo de um antígeno).
[055] Essa ligação sem modulação significativa da função encontra uso em várias modalidades da presente invenção, incluindo métodos nos quais o presente agente de ligação a Clec9A é usado para recrutar direta ou indiretamente células imunes ativas para um sítio de necessidade através de um antígeno efetor. Por exemplo, em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A pode ser usado para recrutar direta ou indiretamente células dendríticas via Clec9A para uma célula tumoral em um método de redução ou eliminação de um tumor (por exemplo, o agente de ligação a Clec9A pode compreender uma fração de direcionamento tendo um domínio de reconhecimento de antígeno anti-Clec9A e uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento (por exemplo, domínio de reconhecimento de antígeno) direcionado contra um antígeno ou receptor de tumor). Em tais modalidades, é desejável recrutar direta ou indiretamente células dendríticas, mas não modular ou neutralizar funcionalmente a atividade Clec9A. Nestas modalidades, a sinalização de Clec9A é uma parte importante do efeito de redução ou eliminação do tumor.
[056] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A aprimora a apresentação de antígeno por células dendríticas. Por exemplo, em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A recruta direta ou indiretamente células dendríticas via Clec9A para uma célula tumoral, onde os antígenos tumorais são subsequentemente endocitados e apresentados na célula dendrítica para indução de respostas potentes de células T humorais e citotóxicas.
[057] Em outras modalidades (por exemplo, relacionadas ao tratamento de doenças autoimunes ou neurodegenerativas), o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que se liga e neutraliza o antígeno de interesse, isto é, Clec9A. Por exemplo, em várias modalidades, os presentes métodos podem inibir ou reduzir a sinalização ou expressão de Clec9A, por exemplo, para causar uma redução na resposta imune. Agentes terapêuticos que compreendem os atuais agentes de ligação a Clec9A Quimeras e fusões com agentes de sinalização
[058] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção faz parte de uma quimera ou fusão com um ou mais agentes de sinalização. Por conseguinte, a presente invenção fornece proteínas quiméricas ou de fusão que incluem, por exemplo, uma fração de direcionamento contra Clec9A e um ou mais agentes de sinalização.
[059] Em várias modalidades, o agente de sinalização é modificado para ter afinidade ou atividade reduzida para um ou mais de seus receptores, o que permite atenuação da atividade (inclusive agonismo ou antagonismo) e / ou evita sinalização não específica ou sequestro indesejável da proteína de fusão ou quimérica. Em várias modalidades, o agente de sinalização é antagônico em sua forma de tipo selvagem e possui uma ou mais mutações que atenuam sua atividade antagônica. Em várias modalidades, o agente de sinalização é antagônico devido a uma ou mais mutações, por exemplo, um agente de sinalização agonística é convertido em um agente de sinalização antagônico e, tal agente de sinalização convertido, opcionalmente, também possui uma ou mais mutações que atenuam sua atividade antagônica (por exemplo, conforme descrito em WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência).
[060] Por conseguinte, em várias modalidades, o agente de sinalização é uma forma modificada (por exemplo, mutante) do agente de sinalização tendo uma ou mais modificações (por exemplo, mutações). Em várias modalidades, as mutações permitem que o agente de sinalização modificado tenha uma ou mais atividades atenuadas, como uma ou mais de afinidade de ligação reduzida, atividade endógena reduzida e bioatividade específica reduzida em relação à não mutada, isto é, a forma selvagem do agente de sinalização (por exemplo, comparando o mesmo agente de sinalização em uma forma de tipo selvagem versus uma forma modificada (por exemplo, mutante)). Em algumas modalidades, as mutações que atenuam ou reduzem a ligação ou afinidade incluem aquelas mutações que reduzem ou eliminam substancialmente a ligação ou atividade. Em algumas modalidades, as mutações que atenuam ou reduzem a ligação ou afinidade são diferentes daquelas mutações que reduzem ou eliminam substancialmente a ligação ou atividade. Consequentemente, em várias modalidades, as mutações permitem que o agente de sinalização tenha segurança aprimorada, por exemplo toxicidade sistêmica reduzida, efeitos colaterais reduzidos e efeitos fora do alvo reduzidos em relação ao não mutado, isto é, agente de sinalização de tipo selvagem (por exemplo, comparando o mesmo agente de sinalização) numa forma de tipo selvagem versus uma forma modificada (por exemplo, mutante)).
[061] Como descrito aqui, o agente pode ter segurança aprimorada devido a uma ou mais modificações, por exemplo, mutações. Em várias modalidades, segurança aprimorada significa que a presente proteína quimérica fornece menor toxicidade (por exemplo, toxicidade sistêmica e / ou toxicidades associadas a tecidos / órgãos); e / ou efeitos colaterais reduzidos ou substancialmente eliminados; e / ou aumento da tolerabilidade, eventos adversos reduzidos ou substancialmente eliminados; e / ou efeitos fora do alvo reduzidos ou substancialmente eliminados; e / ou uma janela terapêutica aumentada.
[062] Em várias modalidades, o agente de sinalização é modificado para ter uma ou mais mutações que reduzem sua afinidade ou atividade de ligação para um ou mais de seus receptores. Em algumas modalidades, o agente de sinalização é modificado para ter uma ou mais mutações que reduzem substancialmente ou eliminam a afinidade ou atividade de ligação para os receptores. Em algumas modalidades, a atividade fornecida pelo agente de sinalização de tipo selvagem é agonismo no receptor (por exemplo, ativação de um efeito celular no sítio da terapia). Por exemplo, o agente de sinalização de tipo selvagem pode ativar seu receptor. Em tais modalidades, as mutações resultam no agente de sinalização modificado para ter atividade de ativação reduzida ou diminuída no receptor. Por exemplo, as mutações podem resultar no agente de sinalização modificado para entregar um sinal de ativação reduzido a uma célula alvo ou o sinal de ativação pode ser ablado. Em algumas modalidades, a atividade fornecida pelo agente de sinalização de tipo selvagem é antagonismo no receptor (por exemplo, bloqueio ou amortecimento de um efeito celular no sítio da terapia). Por exemplo, o agente de sinalização de tipo selvagem pode antagonizar ou inibir o receptor. Nessas modalidades, as mutações resultam no agente de sinalização modificado para ter uma atividade de antagonização reduzida ou diminuída no receptor. Por exemplo, as mutações podem resultar no agente de sinalização modificado para entregar um sinal inibitório reduzido a uma célula alvo ou o sinal inibitório pode ser ablado. Em várias modalidades, o agente de sinalização é antagônico devido a uma ou mais mutações, por exemplo, um agente de sinalização agonística é convertido em um agente de sinalização antagônico (por exemplo, como descrito em WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) e, esse agente de sinalização convertido, opcionalmente, também carrega uma ou mutações que reduzem sua afinidade ou atividade de ligação para um ou mais de seus receptores ou que reduzem ou eliminam substancialmente a afinidade ou atividade de ligação para um ou mais de seus receptores.
[063] Em algumas modalidades, a afinidade ou atividade reduzida no receptor é restaurável por ligação com uma ou mais das frações de direcionamento, conforme descrito aqui (por exemplo, a fração de direcionamento contra Clec9A). Em outras modalidades, a afinidade ou atividade reduzida no receptor não é substancialmente restaurável pela atividade de uma ou mais das frações de direcionamento.
[064] Em várias modalidades, as proteínas quiméricas da presente invenção reduzem os efeitos fora do alvo porque seus agentes de sinalização têm mutações que enfraquecem ou diminuem a afinidade ou atividade de ligação em um receptor. Em várias modalidades, esta redução nos efeitos colaterais é observada em relação com, por exemplo, os agentes de sinalização de tipo selvagem. Em várias modalidades, o agente de sinalização é ativo nas células alvo porque a(s) fração(ões) de direcionamento compensa a ligação ausente / insuficiente (por exemplo, sem limitação e / ou avidez) necessária para a ativação substancial. Em várias modalidades, o agente de sinalização modificado é substancialmente inativo en route para o sítio da atividade terapêutica e tem seu efeito substancialmente em tipos de células especificamente direcionados, o que reduz grandemente os efeitos colaterais indesejados.
[065] Em algumas modalidades, o agente de sinalização pode incluir uma ou mais mutações que atenuam ou reduzem a ligação ou afinidade para um receptor (isto é, um receptor terapêutico) e uma ou mais mutações que reduzem ou ablam substancialmente a ligação ou atividade em um segundo receptor. Em tais modalidades, essas mutações podem estar na mesma ou em posições diferentes (isto é, a mesma mutação ou múltiplas mutações). Em algumas modalidades, as mutações que reduzem a ligação e / ou a atividade em um receptor são diferentes das mutações que reduzem ou ablam substancialmente em outro receptor. Em algumas modalidades, as mutações que reduzem a ligação e / ou a atividade em um receptor são as mesmas que as mutações que reduzem ou ablam substancialmente em outro receptor. Em algumas modalidades, as presentes proteínas quiméricas têm um agente de sinalização modificado que possui ambas as mutações que atenuam a ligação e / ou a atividade em um receptor terapêutico e, portanto, permitem um efeito terapêutico no alvo mais controlado (por exemplo, agente de sinalização relativo de tipo selvagem) e mutações que reduzem substancialmente ou eliminam a ligação e / ou atividade em outro receptor e, portanto, reduzem os efeitos colaterais (por exemplo, em relação ao agente de sinalização de tipo selvagem).
[066] Em algumas modalidades, a redução ou ablação substancial da ligação ou atividade não é substancialmente restaurável com uma fração de direcionamento (por exemplo, uma fração de direcionamento contra Clec9A ou qualquer outra fração de direcionamento descrita aqui). Em algumas modalidades, a redução ou ablação substancial da ligação ou atividade é restaurável com uma fração de direcionamento. Em várias modalidades, reduzir ou eliminar substancialmente a ligação ou atividade em um segundo receptor também pode impedir efeitos deletérios que são mediados pelo outro receptor. Alternativamente, ou além disso, reduzir ou eliminar substancialmente a ligação ou atividade no outro receptor faz com que o efeito terapêutico melhore, pois há um sequestro reduzido ou eliminado das proteínas quiméricas terapêuticas longe do sítio da ação terapêutica. Por exemplo, em algumas modalidades, isso evita a necessidade de altas doses das proteínas quiméricas presentes que compensam a perda no outro receptor. Essa capacidade de reduzir a dose fornece ainda uma menor probabilidade de efeitos colaterais.
[067] Em várias modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma ou mais mutações que fazem com que o agente de sinalização tenha afinidade reduzida, substancialmente reduzida ou ablada, por exemplo ligação (por exemplo KD) e / ou ativação (por exemplo, quando o agente de sinalização modificado é um agonista de seu receptor, mensurável como, por exemplo, KA e/ou EC50) e / ou inibição (por exemplo, quando o agente de sinalização modificado é um antagonista de seu receptor, mensurável como, por exemplo, KI e/ou IC50), para um ou mais de seus receptores. Em várias modalidades, a afinidade reduzida no receptor do agente imumodulador permite a atenuação da atividade (incluindo agonismo ou antagonismo). Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado tem cerca de 1%, ou cerca de 3%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 10% -20%, cerca de 20 % -40%, cerca de 50%, cerca de 40% -60%, cerca de 60% -80%, cerca de 80% -100% da afinidade para o receptor em relação ao agente de sinalização de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é pelo menos cerca de 2 vezes inferior, cerca de 3 vezes inferior, cerca de 4 vezes inferior, cerca de 5 vezes inferior, cerca de 6 vezes inferior, cerca de 7 vezes inferior, cerca de 8 vezes inferior, cerca de 9 vezes inferior, pelo menos cerca de 10 vezes inferior, pelo menos cerca de 15 vezes inferior, pelo menos cerca de 20 vezes inferior, pelo menos cerca de 25 vezes inferior, pelo menos cerca de 30 vezes inferior, pelo menos cerca de 35 vezes inferior, pelo menos cerca de 40 vezes inferior, pelo menos cerca de 45 vezes inferior, pelo menos cerca de 50 vezes inferior, pelo menos cerca de 100 vezes inferior, pelo menos cerca de 150 vezes inferior ou cerca de 10- 50 vezes inferior, cerca de 50-100 vezes inferior, cerca de 100-150 vezes inferior, cerca de 150-200 vezes inferior ou mais de 200 vezes inferior em relação ao agente de sinalização de tipo selvagem.
[068] Nas modalidades em que o agente de sinalização modificado tem mutações que reduzem a ligação em um receptor e reduzem ou ablam substancialmente a ligação em um segundo receptor, a atenuação ou redução na afinidade de ligação de um agente de sinalização modificado para um receptor é menor que a redução ou ablação substancial em afinidade para o outro receptor. Em algumas modalidades, a atenuação ou redução na afinidade de ligação de um agente de sinalização modificado para um receptor é menor que a redução ou ablação substancial na afinidade para o outro receptor em cerca de 1% ou cerca de 3%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95%. Em várias modalidades, a redução ou ablação substancial refere-se a uma redução maior na afinidade e / ou atividade de ligação que atenuação ou redução.
[069] Em várias modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma ou mais mutações que reduzem a atividade endógena do agente de sinalização para cerca de 75%, ou cerca de 70%, ou cerca de 60%, ou cerca de 50%, ou cerca de 40%, ou cerca de 30%, ou cerca de 25%, ou cerca de 20%, ou cerca de 10%, ou cerca de 5%, ou cerca de 3%, ou cerca de 1%, por exemplo, em relação ao agente de sinalização de tipo selvagem.
[070] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma ou mais mutações que fazem com que o agente de sinalização tenha afinidade reduzida para seu receptor que é menor do que a afinidade de ligação da(s) fração (ões) de direcionamento para seus receptores. Em algumas modalidades, esse diferencial de afinidade de ligação está entre agente / receptor de sinalização e fração / receptor de direcionamento na mesma célula. Em algumas modalidades, esse diferencial de afinidade de ligação permite que o agente de sinalização, por exemplo, agente de sinalização mutado, tenha efeitos localizados no alvo e minimize efeitos fora do alvo que estão subjacentes aos efeitos colaterais observados com o agente de sinalização de tipo selvagem. Em algumas modalidades, essa afinidade de ligação é pelo menos cerca de 2 vezes, ou pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 15 vezes inferior, ou pelo menos cerca de 25 vezes, ou pelo menos pelo menos cerca de 50 vezes inferior, ou pelo menos cerca de 100 vezes, ou pelo menos cerca de 150 vezes.
[071] A atividade de ligação ao receptor pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade e / ou a atividade de ligação podem ser avaliadas por análise de plotagem de Scatchard e ajuste por computador de dados de ligação (por exemplo, Scatchard, 1949) ou por espectroscopia de interferência refletométrica sob fluxo através de condições, conforme descrito por Brecht et al. (1993), o conteúdo total de todos aqui incorporado por referência.
[072] Em várias modalidades, o agente de sinalização é um agente de imunomodulação, por exemplo, um ou mais de um fator de interleucina, interferon e necrose tumoral.
[073] Em algumas modalidades, o agente de sinalização é uma interleucina ou uma interleucina modificada, incluindo, por exemplo, IL-1; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-10; IL-11; IL-12; IL-13; IL-14; IL-15; IL-16; IL-17; IL-18; IL-19; IL-20; IL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-25; IL-26; IL-27; IL-28; IL- 29; IL-30; IL-31; IL-32; IL-33; IL-35; IL-36 ou um fragmento, variante, análogo ou membro da família do mesmo. As interleucinas são um grupo de citocinas multifuncionais sintetizadas por linfócitos, monócitos e macrófagos. As funções conhecidas incluem estimular a proliferação de células imunes (por exemplo, células T auxiliares, células B, eosinófilos e linfócitos), quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos T e / ou inibição de interferons. A atividade da interleucina pode ser determinada usando ensaios conhecidos na técnica:Matthews et al., em Lymphokines and Interferens:A Practical Approach, Clemens et al., eds, IRL
Press, Washington, D. C. 1987, pp. 221-225; and Orencole & Dinarello (1989) Cytokine 1, 14-20.
[074] Em algumas modalidades, o agente de sinalização é um interferon ou uma versão modificada de um interferon, como interferon tipos I, II e III. Interferons ilustrativos, incluindo, por exemplo, interferon-α-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 e 21, interferon-β e interferon-γ, interferon κ, interferon ε, interferon , e interferon .
[075] Em algumas modalidades, o agente de sinalização é um fator de necrose tumoral (TNF) ou uma versão modificada de um fator de necrose tumoral (TNF) ou uma proteína da família TNF, incluindo, entre outros, TNF-α, TNF-β, LT-β, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, e TRAIL.
[076] As sequências de aminoácidos dos agentes de sinalização de tipo selvagem aqui descritos são bem conhecidas na técnica. Por conseguinte, em várias modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 61%, ou pelo menos cerca de 62%, ou pelo menos cerca de 63%, ou pelo menos cerca de 64%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 66%, ou pelo menos cerca de 67%, ou pelo menos cerca de 68%, ou pelo menos cerca de 69%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 71%, ou pelo menos cerca de 72%, ou pelo menos cerca de 73%, ou pelo menos cerca de 74%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82% ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 89%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de
96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos de tipo selvagem conhecidas dos agentes de sinalização aqui descritos (por exemplo, cerca de 60%, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência).
[077] Em várias modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 61%, ou pelo menos cerca de 62%, ou pelo menos cerca de 63%, ou pelo menos cerca de 64%, ou pelo menos pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 66%, ou pelo menos cerca de 67%, ou pelo menos cerca de 68%, ou pelo menos cerca de 69%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 71%, ou pelo menos cerca de 72%, ou pelo menos cerca de 73%, ou pelo menos cerca de 74%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 89%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos, cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, de identidade de sequência com quaisquer sequências de aminoácidos dos agentes de sinalização descritos aqui (por exemplo, cerca de 60%, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência).
[078] Em várias modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma sequência de aminoácidos tendo uma ou mais mutações de aminoácidos. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser selecionadas independentemente de substituições, inserções, deleções e truncamentos. Em algumas modalidades, as mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos e podem incluir substituições conservadoras e / ou não conservadoras, como descrito em outras partes deste documento. Em várias modalidades, as substituições também podem incluir aminoácidos não clássicos como descrito em outras partes deste documento.
[079] Como aqui descrito, os agentes de sinalização modificados apresentam mutações que afetam a afinidade e / ou atividade em um ou mais receptores. Em várias modalidades, há afinidade e / ou atividade reduzida em um receptor terapêutico, por exemplo, um receptor através do qual um efeito terapêutico desejado é mediado (por exemplo, agonismo ou antagonismo). Em várias modalidades, os agentes de sinalização modificados apresentam mutações que reduzem ou ablam substancialmente a afinidade e / ou atividade em um receptor, por exemplo, um receptor através do qual um efeito terapêutico desejado não é mediado (por exemplo, como resultado de promiscuidade de ligação). Os receptores de quaisquer agentes de sinalização modificados, por exemplo, uma das citocinas, fatores de crescimento e hormônios como aqui descritos, são conhecidos na técnica.
[080] Mutações ilustrativas que fornecem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, agonística) em um receptor são encontradas em WO 2013/107791 e PCT / EP2017 / 061544 (por exemplo, no que diz respeito a interferons), em WO 2015/007542 (por exemplo, no que diz respeito a interleucinas), e WO 2015/007903 (por exemplo, com relação ao TNF), o conteúdo total de cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Mutações ilustrativas que fornecem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, antagônicas) em um receptor terapêutico são encontradas em WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[081] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma ou mais mutações que fazem com que o agente de sinalização tenha afinidade e / ou atividade reduzida para um receptor de citocina tipo I, um receptor de citocina tipo II, um receptor de quimiocina, um receptor na superfamília do Receptor de Fator de Necrose Tumoral (TNFR), receptores TGF- beta, um receptor na superfamília da imunoglobulina (Ig) e / ou um receptor na superfamília da tirosina quinase.
[082] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um receptor de citocina Tipo I. Os receptores de citocina tipo I são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, receptores para IL2 (subunidade beta), IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, IL12, GM-CSF, G-CSF, LIF, CNTF e também os receptores de Trombopoietina (TPO), Prolactina e Hormônio do crescimento. Os receptores ilustrativos de citocina tipo I incluem, mas não estão limitados a, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor LIF, receptor CNTF, receptor TPO e receptores IL do tipo I.
[083] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um receptor de citocina Tipo II. Os receptores de citocina tipo II são receptores multiméricos compostos por subunidades heterólogas e são receptores principalmente para interferons. Esta família de receptores inclui, mas não está limitada a, receptores para interferon-α, interferon-β e interferon-γ, IL10, IL22 e fator de tecido. Os receptores de citocina tipo II ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, receptor de IFN-α (por exemplo, IFNAR1 e IFNAR2), receptor de IFN-β, receptor de IFN-γ (por exemplo, IFNGR1 e IFNGR2) e receptores de IL do tipo II.
[084] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um receptor acoplado à proteína G. Os receptores de quimiocinas são receptores acoplados à proteína G com sete estruturas transmembranares e acoplados à proteína G para transdução de sinal. Os receptores de quimiocina incluem, mas não estão limitados a, receptores de quimiocina CC, receptores de quimiocina CXC, receptores de quimiocina CX3C e receptor de quimiocina XC (XCR1). Exemplos de receptores de quimiocinas incluem, mas não estão limitados a, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR3B, CXCR4, CXCR5, CSCR6, CXCR7, XCR1 e CX3CR1.
[085] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um membro da família TNFR. Os membros da família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) compartilham um domínio rico em cisteína (CRD) formado por três ligações dissulfeto que envolvem um motivo central de CXXCXXC, criando uma molécula alongada. Exemplos de membros da família de receptores de fatores de necrose tumoral incluem:CDl 20a (TNFRSFlA), CD 120b (TNFRSFlB), Receptor beta de linfotoxina (LTBR, TNFRSF3), CD 134 (TNFRSF4), CD40 (CD40, TNFRSF5), FAS (FAS, TNFRSF6), TNFRSF6B (TNFRSF6B), CD27 (CD27, TNFRSF7), CD30 (TNFRSF8), CD137 (TNFRSF9), TNFRSFlOA (TNFRSFlOA), TNFRSFlOB, (TNFRSFlOB), TNFRSFlOC (TNFRSFlOC), TNFRSFlOD (TNFRSFlOD), RANK (TNFRSFI lA), Osteoprotegerina (TNFRSFl IB), TNFRSF12A (TNFRSF12A), TNFRSF13B (TNFRSF13B), TNFRSF13C (TNFRSF13C), TNFRSF14 (TNFRSF14), Receptor do fator de crescimento nervoso (NGFR, TNFRSF16), TNFRSF17 (TNFRSF17),
TNFRSF18 (TNFRSF18), TNFRSF19 (TNFRSF19), TNFRSF21 (TNFRSF21), e TNFRSF25 (TNFRSF25). Numa modalidade, o membro da família TNFR é CD120a (TNFRSF1A) ou TNF-R1. Em outra modalidade, o membro da família TNFR é CD 120b (TNFRSFlB) ou TNF-R2.
[086] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um receptor de TGF-beta. Os receptores TGF-beta são receptores de passagem única de serina / treonina-quinase. Os receptores de TGF-beta incluem, mas não estão limitados a, TGFBR1, TGFBR2 e TGFBR3.
[087] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um receptor da superfamília de Ig. Os receptores da superfamília de imunoglobulinas (Ig) compartilham homologia estrutural com imunoglobulinas. Os receptores na superfamília Ig incluem, mas não estão limitados a, receptores de interleucina-1, CSF-1R, PDGFR (por exemplo, PDGFRA e PDGFRB) e SCFR.
[088] Em várias modalidades, o receptor para o agente de sinalização é um receptor da superfamília da tirosina quinase. Os receptores na superfamília da tirosina quinase são bem conhecidos na técnica. Existem cerca de 58 tirosina-quinases receptoras conhecidas (RTKs), agrupadas em 20 subfamílias. Os receptores na superfamília da tirosina quinase incluem, mas não estão limitados a, receptores de FGF e suas várias isoformas, como FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 e FGFR5.
[089] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é o interferon α. Em tais modalidades, o agente IFN-α modificado possui afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor IFN-α / β (IFNAR), isto é, cadeias IFNAR1 e / ou IFNAR2. Em algumas modalidades, o agente IFN-α modificado tem afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para o receptor IFN-α / β (IFNAR), isto é, cadeias IFNAR1 e / ou IFNAR2.
[090] As formas mutantes de interferon α são conhecidas do versado na técnica. Em uma modalidade ilustrativa, o agente de sinalização modificado é a forma alélica IFN-α2a tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:337.
[091] Em uma modalidade ilustrativa, o agente de sinalização modificado é a forma alélica IFN-α2b com a sequência de aminoácidos de (que difere de IFN-α2a na posição de aminoácido 23) SEQ ID NO:338.
[092] Em algumas modalidades, o referido mutante de IFN-α2 (IFN-α2a ou IFN-α2b) é mutado em um ou mais aminoácidos nas posições 144- 154, como nas posições de aminoácidos 148, 149 e / ou 153. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 compreende uma ou mais mutações selecionadas de L153A, R149A e M148A. Tais mutantes são descritos, por exemplo, em WO2013/107791 e Piehler et al., (2000) J. Biol. Chem, 275:40425- 33, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[093] Em algumas modalidades, os mutantes de IFN-α2 têm afinidade e / ou atividade reduzida para IFNAR1. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 compreende uma ou mais mutações selecionadas de F64A, N65A, T69A, L80A, Y85A e Y89A, conforme descrito em WO2010 / 030671, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[094] Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 compreende uma ou mais mutações selecionadas de K133A, R144A, R149A e L153A, conforme descrito em WO2008 / 124086, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[095] Em algumas modalidades, o mutante IFN-α2 compreende uma ou mais mutações selecionadas de R120E e R120E / K121E, conforme descrito em WO2015 / 007520 e WO2010 / 030671, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em tais modalidades, o referido mutante de IFN-α2 antagoniza a atividade de IFN-α2 de tipo selvagem. Em tais modalidades, o referido IFN-α2 mutante tem afinidade e / ou atividade reduzida para IFNAR1 enquanto a afinidade e / ou atividade de IFNR2 é mantida.
[096] Em algumas modalidades, o mutante IFN-α2 humano compreende (1) uma ou mais mutações selecionadas de R120E e R120E /
K121E, as quais, sem desejar estar vinculadas pela teoria, criam um efeito antagônico e (2) uma ou mais mutações selecionadas de K133A, R144A, R149A e L153A, que, sem querer estar vinculadas pela teoria, permitem um efeito atenuado em, por exemplo, IFNAR2. Numa modalidade, o mutante de IFN-α2 humano compreende R120E e L153A.
[097] Em algumas modalidades, o mutante IFN-α2 humano compreende uma ou mais mutações selecionadas de, L15A, A19W, R22A, R23A, L26A, F27A, L30A, L30V, K31A, D32A, R33K, R33A, R33Q, H34A, D35A, Q40A, D114R, L117A, R120A, R125A, K134A, R144A, A145G, A145M, M148A, R149A, S152A, L153A e N156A como divulgado em WO 2013/059885, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 humano compreende as mutações H57Y, E58N, Q61S e / ou L30A, conforme divulgado em WO 2013/059885. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 humano compreende as mutações H57Y, E58N, Q61S e / ou R33A, conforme divulgado em WO 2013/059885. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 humano compreende as mutações H57Y, E58N, Q61S e / ou M148A, conforme divulgado em WO 2013/059885. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 humano compreende as mutações H57Y, E58N, Q61S e / ou L153A, conforme divulgado em WO 2013/059885. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 humano compreende as mutações N65A, L80A, Y85A, e/ou Y89A, conforme divulgado em WO 2013/059885. Em algumas modalidades, o mutante de IFN-α2 humano compreende as mutações N65A, L80A, Y85A, Y89A e / ou D114A, conforme divulgado em WO 2013/059885.
[098] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é o interferon β. Em tais modalidades, o agente de interferon β modificado possui afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor IFN-α / β (IFNAR), isto é, cadeias IFNAR1 e / ou IFNAR2. Em algumas modalidades, o agente de interferon β modificado tem afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para o receptor IFN-α / β (IFNAR), isto é, cadeias IFNAR1 e / ou IFNAR2.
[099] Numa modalidade ilustrativa, o agente de sinalização modificado é o IFN-β. Em várias modalidades, o IFN-β abrange derivados funcionais, análogos, precursores, isoformas, variantes de emenda ou fragmentos de IFN-β. Em várias modalidades, o IFN-β abrange o IFN-β derivado de qualquer espécie. Numa modalidade, a proteína quimérica compreende uma versão modificada do IFN-β de camundongo. Numa outra modalidade, a proteína quimérica compreende uma versão modificada do IFN-β humano. O IFN-β humano é um polipeptídeo com um peso molecular de cerca de 22 kDa compreendendo 166 resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos do IFN-β humano é a SEQ ID NO:339.
[0100] Em algumas modalidades, o IFN-β humano é o IFN-β-1a, que é uma forma glicosilada do IFN-β humano. Em algumas modalidades, o IFN- β humano é IFN-β-1b, que é uma forma não glicosilada de IFN-β humano que possui uma deleção de Met-1 e uma mutação de Cys-17 para Ser.
[0101] Em várias modalidades, o IFN-β modificado tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade para a subunidade IFNAR1 do IFNAR. Numa modalidade, o IFN-β modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida no IFNAR1. Em várias modalidades, o IFN-β modificado é o IFN-β humano e possui uma ou mais mutações nas posições F67, R71, L88, Y92, I95, N96, K123 e R124. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações são substituições selecionadas de F67G, F67S, R71A, L88G, L88S, Y92G, Y92S, I95A, N96G, K123G e R124G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação F67G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação K123G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações F67G e R71A. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações L88G e Y92G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações Y92G, I95A e N96G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações K123G e R124G. Numa modalidade,
o IFN-β modificado compreende as mutações F67G, L88G, e Y92G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações F67S, L88S, e Y92S
[0102] Em algumas modalidades, o IFN-β modificado tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade para a subunidade IFNAR2 do IFNAR. Numa modalidade, o IFN-β modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida no IFNAR2. Em várias modalidades, o IFN-β modificado é o IFN-β humano e tem uma ou mais mutações nas posições W22, R27, L32, R35, V148, L151, R152 e Y155. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações são substituições selecionadas de W22G, R27G, L32A, L32G, R35A, R35G, V148G, L151G, R152A, R152G e Y155G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação W22G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação L32A. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação L32G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação R35A. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação R35G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação V148G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação R152A. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação R152G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação Y155G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações W22G e R27G. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende a mutação L32A e R35A. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações L151G e R152A. Numa modalidade, o IFN-β modificado compreende as mutações V148G e R152A.
[0103] Em algumas modalidades, o IFN-β modificado tem uma ou mais das seguintes mutações:R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K e R152H. Em algumas modalidades, o IFN-β modificado tem uma ou mais das seguintes mutações:R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K e R152H em combinação com C17S ou C17A.
[0104] Em algumas modalidades, o IFN-β modificado tem uma ou mais das seguintes mutações:R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T,
E149K e R152H em combinação com qualquer uma das outras mutações de IFN-β descritas aqui.
[0105] A estrutura cristalina do IFN-β humano é conhecida e é descrita em Karpusas et al., (1998) PNAS, 94(22):11813–11818. Especificamente, foi demonstrado que a estrutura do IFN-β humano inclui cinco hélices α (isto é, A, B, C, D e E) e quatro regiões de alça que conectam essas hélices (isto é, AB, BC, CD e Alças DE). Em várias modalidades, o IFN-β modificado possui uma ou mais mutações nas hélices A, B, C, D, E e / ou nas alças AB, BC, CD e DE que reduzem sua afinidade ou atividade de ligação em um receptor terapêutico como o IFNAR. Mutações exemplificativas são descritas em WO2000 / 023114 e US20150011732, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN- β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 15, 16, 18, 19, 22 e / ou 23. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 28-30, 32 e 33. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 36, 37, 39 e 42. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 64 e 67 e uma substituição de serina na posição 68. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 71-73. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN- β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 92, 96, 99 e 100. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 128, 130, 131 e 134. Em uma modalidade exemplificativa, o IFN-β modificado é o IFN-β humano compreendendo substituições de alanina nas posições de aminoácidos 149, 153, 156, e 159. Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende 339 e uma mutação em
W22, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0106] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em R27, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0107] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em W22, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em R27, a mutação sendo um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0108] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em L32, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0109] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em R35, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0110] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em L32, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em R35, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0111] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em F67, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0112] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em R71, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0113] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em F67, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em R71, a mutação sendo um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0114] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em L88, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0115] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em Y92, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0116] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em F67, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em L88, a mutação sendo um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em Y92, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0117] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em L88, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em Y92, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0118] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em I95, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em Y92, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0119] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em N96, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em Y92, a mutação sendo um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0120] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em Y92, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em I95, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em N96, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0121] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em K123, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0122] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em R124, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0123] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em K123, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em R124, a mutação sendo um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0124] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em L151, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0125] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em R152, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0126] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em L151, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em R152, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0127] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em V148, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), e metionina (M).
[0128] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em V148, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V) e uma mutação em R152, a mutação sendo um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0129] Em algumas modalidades, o IFNβ mutante compreende a SEQ ID NO:339 e uma mutação em Y155, sendo a mutação um resíduo hidrofóbico alifático selecionado de glicina (G), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M) e valina (V).
[0130] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma proteína quimérica que compreende:(a) um IFN-β modificado, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:339 e uma mutação na posição W22, em que a mutação é um resíduo hidrofóbico alifático; e (b) uma ou mais frações de direcionamento, as referidas frações de direcionamento compreendendo domínios de reconhecimento que se ligam especificamente a antígenos ou receptores de interesse (por exemplo, Clec9A), o IFN-β modificado e a uma ou mais frações de direcionamento estão opcionalmente conectadas com um ou mais ligantes. Em várias modalidades, a mutação na posição W22 é um resíduo hidrofóbico alifático é selecionado de G, A, L, I, M e V. Em várias modalidades, a mutação na posição W22 é G.
[0131] Mutantes de IFNβ exemplificativos adicionais são fornecidos em PCT / EP2017 / 061544, cuja divulgação inteira é incorporada por referência aqui.
[0132] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é o interferon γ. Em tais modalidades, o agente interferon γ modificado possui afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor interferon-gama (IFNGR), isto é, as cadeias IFNGR1 e IFNGR2. Em algumas modalidades, o agente interferon y modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para o receptor interferon-gama (IFNGR), isto é, cadeias IFNGR1 e / ou IFNGR2.
[0133] O IFN-γ é o único membro da classe de interferons do tipo II. O IFN-γ é produzido predominantemente por células assassinas naturais (NK) e assassina naturais T (NKT) como parte da resposta imune inata. O IFN-γ também é produzido por células T efetoras de linfócitos T citotóxicos CD4 Th1 e CD8 (CTL), macrófagos, células dendríticas e células B. O IFN-γ ativado forma um dímero que atua através de um receptor heterodimérico (isto é, receptor de IFN-γ ou IFN-γR) composto pelas subunidades do receptor 1 de IFN-γ e do receptor 2 de IFN-γ. O receptor 1 de IFN-γ é a principal subunidade de ligação ao ligante, enquanto o receptor 2 de IFN-γ é necessário para a transdução de sinal e também aumenta a afinidade do receptor 1 de IFN-γ pelo seu ligante. A ligação do dímero IFN-γ ao receptor ativa a via de sinalização JAK-STAT para provocar vários efeitos biológicos.
[0134] Em várias modalidades, o agente de sinalização modificado compreende uma versão modificada de IFN-γ como um agente de sinalização. Em várias modalidades, o IFN-γ abrange derivados funcionais, análogos, precursores, isoformas, variantes de emenda ou fragmentos de IFN-γ. Em várias modalidades, o IFN-γ abrange o IFN-γ derivado de qualquer espécie. Numa modalidade, o agente de sinalização modificado compreende uma versão modificada do IFN-γ de camundongo. Em outra modalidade, o agente de sinalização modificado compreende uma versão modificada do IFN-γ humano.
[0135] O IFN-γ humano é um polipeptídeo compreendendo 166 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o IFN-γ humano tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:340, em que o peptídeo sinal compreende os primeiros 23 aminoácidos.
[0136] Como utilizado neste documento, o IFN-γ humano também pode se referir ao IFN-γ humano maduro sem o peptídeo de sinal N-terminal. Nesta modalidade, o IFN-γ humano maduro compreende 143 aminoácidos e possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341.
[0137] Em algumas modalidades, o IFN-γ humano é uma forma glicosilada de IFN-γ humano. Em algumas modalidades, o IFN-γ humano é uma forma não glicosilada de IFN-γ humano.
[0138] As sequências de IFN-γ são conhecidas na técnica. Em várias modalidades, o IFN-γ modificado compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 61%, ou pelo menos cerca de 62%, ou pelo menos cerca de 63%, ou pelo menos cerca de 64%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 66%, ou pelo menos cerca de 67%, ou pelo menos cerca de 68%, ou pelo menos cerca de 69%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 71%, ou pelo menos pelo menos cerca de 72%, ou pelo menos cerca de 73%, ou pelo menos cerca de 74%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 89%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com as sequências conhecidas de aminoácidos de tipo selvagem de IFN-γ (por exemplo, cerca de 60%, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64% ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85% ou cerca de 86%, ou cerca de 87% ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência).
[0139] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 61%, ou pelo menos cerca de 62%, ou pelo menos cerca de 63%, ou pelo menos cerca de 64%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 66%, ou pelo menos cerca de 67%, ou pelo menos cerca de 68%, ou pelo menos cerca de 69%, ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 71%,, ou pelo menos pelo menos cerca de 72%, ou pelo menos cerca de 73%, ou pelo menos cerca de 74%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 89%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com IFN-γ humano com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:340 (por exemplo, cerca de 60%, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência).
[0140] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 61%, ou pelo menos cerca de 62%, ou pelo menos cerca de 63%, ou pelo menos cerca de 64%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 66%, ou pelo menos cerca de 67%, ou pelo menos cerca de 68%, ou pelo menos cerca de 69%, ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 71%,, ou pelo menos pelo menos cerca de 72%, ou pelo menos cerca de
73%, ou pelo menos cerca de 74%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 89%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com IFN-γ humano com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 (por exemplo, cerca de 60%, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90% ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência).
[0141] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado compreende uma sequência de aminoácidos tendo uma ou mais mutações de aminoácidos. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser selecionadas independentemente de substituições, inserções, deleções e truncamentos.
[0142] Em algumas modalidades, as mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos e podem incluir substituições conservadoras e / ou não conservadoras.
[0143] As "substituições conservadoras" podem ser feitas, por exemplo, com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos de aminoácidos envolvidos. Os 20 aminoácidos de ocorrência natural podem ser agrupados nos seguintes seis grupos padrão de aminoácidos:(1) hidrofóbico:Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos:Asp, Glu; (4) básicos:His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia:Gli, Pro; e (6) aromáticos:Trp, Tyr, Phe.
[0144] Como utilizado neste documento, "substituições conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado dentro do mesmo grupo dos seis grupos de aminoácidos padrão mostrados acima. Por exemplo, a troca de Asp por Glu mantém uma carga negativa no polipeptídeo assim modificado. Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas entre si com base na sua capacidade de interromper as hélices α.
[0145] Como utilizado neste documento, "substituições não conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado em um grupo diferente dos seis grupos de aminoácidos padrão (1) a (6) mostrados acima.
[0146] Em várias modalidades, as substituições podem também incluir aminoácidos não-clássicos (por exemplo, selenocisteína, pirrolisina, N- formilmetionina-p-alanina, GABA e ácido δ-amino-levulínico, ácido 4- aminobenzoico (PABA), isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido 2,4- diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, Ácido 2- amino-butírico, γ-Abu, ε-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosme, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, T-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, β-alanina, Fluoro-aminoácidos, aminoácidos criadores, como β-aminoácidos de metil, aminoácidos de C-α-metil, aminoácidos de N-a-metil e análogos de aminoácidos em geral).
[0147] Em várias modalidades, o IFN-γ é modificado para ter uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, as mutações permitem que o IFN- γ modificado tenha uma ou mais atividades atenuadas, como uma ou mais afinidades de ligação reduzidas, atividade endógena reduzida e bioatividade específica reduzida em relação à não mutada, por exemplo, a forma de tipo selvagem de IFN-γ. Por exemplo, a uma ou mais atividades atenuadas, como afinidade de ligação reduzida, atividade endógena reduzida e bioatividade específica reduzida em relação a não mutada, por exemplo, a forma selvagem de IFN-γ pode estar em um receptor terapêutico, como o receptor de IFN-γ. Consequentemente, em várias modalidades, as mutações permitem que o agente solúvel modificado tenha toxicidade sistêmica reduzida, efeitos colaterais reduzidos e efeitos fora do alvo reduzidos em relação a não mutado, por exemplo, a forma selvagem de IFN-γ.
[0148] Em várias modalidades, o IFN-γ é modificado para ter uma mutação que reduz sua afinidade e / ou atividade de ligação em um receptor terapêutico, como o receptor de IFN-γ, compreendendo as subunidades do receptor de IFN-γ 1 e do receptor de IFN-γ 2. Em algumas modalidades, a atividade fornecida pelo IFN-γ de tipo selvagem é agonismo no receptor terapêutico (por exemplo, ativação de um efeito celular no sítio da terapia). Por exemplo, o IFN-γ de tipo selvagem pode ativar o receptor terapêutico. Em tais modalidades, a mutação resulta no IFN-γ modificado para ter atividade de ativação reduzida no receptor terapêutico.
[0149] Em algumas modalidades, a afinidade e / ou atividade reduzida no receptor terapêutico (por exemplo, receptor de IFN-γ) é restaurável por ligação com uma fração de direcionamento. Em outras modalidades, a afinidade e / ou atividade reduzida no receptor terapêutico não é substancialmente restaurável por ligação com a fração de direcionamento. Em várias modalidades, as proteínas quiméricas terapêuticas da presente invenção reduzem os efeitos fora do alvo porque o IFN-γ possui mutações que enfraquecem a afinidade e / ou atividade de ligação em um receptor terapêutico.
Em várias modalidades, isso reduz os efeitos colaterais observados com, por exemplo, o IFN-γ de tipo selvagem. Em várias modalidades, o IFN-γ modificado é substancialmente inativo en route para o sítio da atividade terapêutica e tem seu efeito substancialmente em tipos de células especificamente direcionados, o que reduz grandemente os efeitos colaterais indesejados.
[0150] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado tem uma ou mais mutações que fazem com que o IFN-γ tenha afinidade e / ou atividade atenuadas ou reduzidas, por exemplo, ligação (por exemplo, KD) e / ou ativação (mensurável como, por exemplo, KA e / ou EC50) para um ou mais receptores terapêuticos (por exemplo, receptor de IFN-γ). Em várias modalidades, a afinidade e / ou atividade reduzida no receptor terapêutico permite atenuação da atividade e / ou sinalização do receptor terapêutico.
[0151] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade por e / ou atividade biológica para a subunidade do receptor 1 do IFN-γ. Numa modalidade, o IFN-γ modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida na subunidade do receptor 1 do IFN-γ. Em várias modalidades, o IFN-γ modificado é o IFN-γ humano que possui uma ou mais mutações nos resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação à subunidade do receptor 1 do IFN-γ. Em algumas modalidades, o IFN- γ modificado é o IFN-γ humano que possui uma ou mais mutações nos aminoácidos localizados na interface com a subunidade do receptor 1 do IFN-γ. Em várias modalidades, as uma ou mais mutações estão nos aminoácidos selecionados de, mas não se limitam a Q1, V5, E9, K12, H19, S20, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119 e K125 (cada um com relação à SEQ ID NO:341, que é um IFN-γ humano de tipo selvagem e que não possui sua sequência de sinal N-terminal). Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações são substituições selecionadas de V5E, S20E, V22A, A23G, A23F, D24G, G26Q, H111A, H111D, I114A, Q115A e A118G (cada uma com relação à SEQ ID NO:341). Nas modalidades, as uma ou mais mutações são substituições selecionadas de V22A, A23G, D24G, H111A, H111D, I114A, Q115A e A118G.
[0152] Numa modalidade, o IFN-γ modificado compreende as mutações A23G e D24G. Em outra modalidade, o IFN-γ modificado compreende as mutações I114A e A118G. Em uma modalidade adicional, o IFN-γ modificado compreende as mutações V5E, S20E, A23F e G26Q.
[0153] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado possui uma ou mais das seguintes mutações: exclusão do resíduo A23, exclusão do resíduo D24, uma substituição S20I, uma substituição A23V, uma substituição D21K e uma substituição D24A.
[0154] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade e / ou atividade biológica para a subunidade do receptor 2 de IFN-γ.
[0155] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade e / ou atividade biológica para ambas as subunidades do receptor 1 de IFN-γ e do receptor 2 de IFN-γ.
[0156] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado possui uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade e / ou atividade biológica para o receptor 1 de IFN-γ e uma ou mais mutações que reduzem ou ablam substancialmente a ligação ou sua afinidade e / ou atividade biológica para o receptor 2 de IFN-γ. Em algumas modalidades, as proteínas quiméricas com esse IFN-γ modificado podem fornecer atividade do receptor 1 de IFN-γ seletivo para o alvo (por exemplo, a atividade do receptor 1 de IFN-γ é restaurável via direcionamento através da fração de direcionamento).
[0157] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade e / ou atividade biológica para o receptor 1 de IFN-γ e uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade e / ou atividade biológica para o receptor 1 de IFN-γ. Em algumas modalidades, as proteínas quiméricas com esse IFN-γ modificado podem fornecer atividade do receptor 1 de IFN-γ seletivo para o alvo e / ou atividade do receptor 1 de IFN-γ (por exemplo, as atividades do receptor 1 de IFN-γ e do receptor 2 de IFN-γ são restauráveis via direcionamento através da fração de segmentação).
[0158] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado é truncado no C-terminal. Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado é o IFN-γ maduro que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 com deleções do terminal C-terminal. Em tais modalidades, o IFN-γ maduro pode compreender um truncamento C-terminal de pelo menos cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24 ou cerca de 25 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o IFN-γ modificado é o IFN-γ maduro que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 com deleções no C-terminal de 5 aminoácidos. Em uma modalidade, o IFN-γ modificado é o IFN-γ maduro que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 com deleções no C-terminal de 7 aminoácidos. Em uma modalidade, o IFN-γ modificado é o IFN- γ maduro que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 com deleções no C-terminal de 14 aminoácidos. Em uma modalidade, o IFN-γ modificado é o IFN-γ maduro que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 com deleções C-terminais de 15 aminoácidos. Em uma modalidade, o IFN-γ modificado é o IFN-γ maduro que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:341 com deleções no C-terminal de 16 aminoácidos. IFN-γ modificado adicional com truncamentos no C-terminal que podem ser utilizados na presente invenção é descrito em Haelewyn et al., Biochem. J. (1997), 324:591-595 and Lundell et al., Protein Eng. (1991) 4:335- 341, todo o conteúdo é aqui incorporado por referência.
[0159] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado é um IFN-γ de cadeia única, como descrito, por exemplo, em Randal et al. (2001) Structure
9:155-163 and Randal et al. (1998) Protein Sci. 7:1057-1060, todo o conteúdo é aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, a cadeia única de IFN-γ compreende uma primeira cadeia de IFN-γ ligada no seu C-terminal ao N- terminal de uma segunda cadeia de IFN-γ. Em várias modalidades, a primeira e a segunda cadeias de IFN-γ são ligadas por um ligante, como descrito aqui em outro lugar.
[0160] Em algumas modalidades, a primeira cadeia de IFN-γ compreende um truncamento C-terminal de pelo menos cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24 ou cerca de 25 resíduos de aminoácidos. Numa modalidade, a primeira cadeia de IFN-γ compreende um truncamento C- terminal de cerca de 24 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a segunda cadeia de IFN-γ compreende um truncamento no N-terminal de pelo menos cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4 ou cerca de 5 resíduos de aminoácidos. Numa modalidade, a segunda cadeia de IFN-γ compreende um truncamento no N-terminal de cerca de 3 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a segunda cadeia de IFN-γ compreende um truncamento C- terminal de pelo menos cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24 ou cerca de 25 resíduos de aminoácidos. Em várias modalidades, as primeira e / ou segunda cadeias de IFN-γ compreendem uma ou mais mutações de aminoácidos em Q1, V5, E9, K12, H19, S20, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119 e K125, como aqui descrito em outra parte. Em várias modalidades, a primeira e / ou a segunda cadeia de IFN-γ compreendem uma ou mais substituições selecionadas de V5E, S20E, V22A, A23G, A23F, D24G, G26Q, H111A, H111D, I114A, Q115A e A118G. Em várias modalidades, a primeira e / ou a segunda cadeia de IFN-γ compreendem uma ou mais substituições selecionadas de V22A, A23G, D24G, H111A, H111D, I114A, Q115A e A118G. Em várias modalidades, a primeira e / ou a segunda cadeia de IFN-γ compreendem a substituição de A23G e D24G. Em várias modalidades, a primeira e / ou a segunda cadeia de IFN-γ compreendem a substituição I114A e A118G. Em outra modalidade, as mutações são V5E, S20E, A23F e G26Q.
[0161] Em várias modalidades, uma primeira e / ou segunda cadeia de IFN-γ compreende uma ou mais substituições como aqui divulgadas e a primeira e / ou segunda cadeia de IFN-γ compreende um truncamento C- terminal, como aqui divulgado.
[0162] Em várias modalidades, uma primeira e / ou segunda cadeia de IFN-γ compreende uma ou mais substituições, como divulgadas aqui e um truncamento C-terminal, como divulgado aqui.
[0163] A estrutura cristalina do IFN-γ humano é conhecida e é descrita em, por exemplo, Ealick et al., (1991) Science, 252:698-702. Especificamente, demonstrou-se que a estrutura do IFN-γ humano inclui um núcleo de seis hélices α e uma sequência desdobrada estendida na região C- terminal. Em várias modalidades, o IFN-γ modificado possui uma ou mais mutações em uma ou mais hélices que reduzem sua afinidade de ligação e / ou atividade biológica em um receptor terapêutico (por exemplo, receptor de IFN-γ).
[0164] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado tem cerca de 1%, ou cerca de 3%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 10%-20%, cerca de 20%-40%, cerca de 50%, cerca de 40%-60%, cerca de 60%-80%, cerca de 80%-100% da afinidade e / ou atividade biológica para o receptor terapêutico (por exemplo, receptor IFN-γ ou qualquer uma das suas subunidades do receptor 1 de IFN-γ e do receptor 2 de IFN-γ) em relação ao IFN-γ de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação e/ou atividade biológica é pelo menos cerca de 2 vezes inferior, cerca de 3 vezes inferior, cerca de 4 vezes inferior, cerca de 5 vezes inferior, cerca de 6 vezes inferior, cerca de 7 vezes inferior, cerca de 8 vezes inferior, cerca de 9 vezes inferior, pelo menos cerca de 10 vezes inferior, pelo menos cerca de 15 vezes inferior, pelo menos cerca de 20 vezes inferior, pelo menos cerca de 25 vezes inferior, pelo menos cerca de 30 vezes inferior, pelo menos cerca de 35 vezes inferior, pelo menos cerca de 40 vezes inferior, pelo menos cerca de 45 vezes inferior, pelo menos cerca de 50 vezes inferior, pelo menos cerca de 100 vezes inferior, pelo menos cerca de 150 vezes inferior ou cerca de 10- 50 vezes inferior, cerca de 50-100 vezes inferior, cerca de 100-150 vezes inferior, cerca de 150-200 vezes inferior ou mais de 200 vezes inferior em relação ao IFN-γ de tipo selvagem.
[0165] Em várias modalidades, o IFN-γ modificado compreende uma ou mais mutações que reduzem a atividade endógena do IFN-γ para cerca de 75%, ou cerca de 70%, ou cerca de 60%, ou cerca de 50%, ou cerca de 40%, ou cerca de 30%, ou cerca de 25%, ou cerca de 20%, ou cerca de 10%, ou cerca de 5%, ou cerca de 3%, ou cerca de 1%, por exemplo, em relação ao IFN-γ de tipo selvagem.
[0166] Em algumas modalidades, o IFN-γ modificado compreende uma ou mais mutações que fazem com que o IFN-γ modificado tenha afinidade reduzida e / ou atividade biológica para um receptor. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação do IFN-γ modificada e / ou atividade biológica para um receptor é menor que a afinidade de ligação e / ou atividade biológica da fração de direcionamento para o seu receptor. Em algumas modalidades, essa afinidade de ligação e / ou diferencial de atividade biológica está entre o IFN-γ / receptor modificado e a fração / receptor de direcionamento na mesma célula. Em algumas modalidades, essa afinidade de ligação e / ou atividade biológica, diferencial permite que o IFN-γ modificado tenha efeitos localizados no alvo e minimize os efeitos fora do alvo subjacentes aos efeitos colaterais observados com o IFN-γ de tipo selvagem. Em algumas modalidades, essa afinidade de ligação e/ou atividade biológica é pelo menos cerca de 2 vezes, ou pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 15 vezes inferior, ou pelo menos cerca de 25 vezes, ou pelo menos pelo menos cerca de 50 vezes inferior, ou pelo menos cerca de 100 vezes, ou pelo menos cerca de 150 vezes inferior.
[0167] A atividade de ligação ao receptor pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade e / ou a atividade de ligação podem ser avaliadas por análise de plotagem de Scatchard e ajuste por computador de dados de ligação (por exemplo, Scatchard, 1949) ou por espectroscopia de interferência refletométrica sob fluxo através de condições, conforme descrito por Brecht et al. (1993), o conteúdo total de todos aqui incorporado por referência.
[0168] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado é um interferon de consenso. O interferon de consenso é gerado pela varredura das sequências de vários subtipos humanos de IFN-α não alélico e atribuindo o aminoácido observado com mais frequência em cada posição correspondente. O interferon de consenso difere do IFN-α2b em 20 dos 166 aminoácidos (88% de homologia), e a comparação com o IFN-β mostra identidade em mais de 30% das posições de aminoácidos. Em várias modalidades, o interferon de consenso compreende a seguinte sequência de aminoácidos SEQ ID NO:342.
[0169] Em algumas modalidades, o interferon de consenso compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:343, que difere da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:342 por um aminoácido, isto é, SEQ ID NO:343 não possui o resíduo de metionina inicial de SEQ ID NO:342.
[0170] Em várias modalidades, o interferon de consenso compreende uma versão modificada do interferon de consenso, isto é, uma variante de interferon de consenso, como um agente de sinalização. Em várias modalidades, a variante de interferon de consenso abrange derivados funcionais, análogos, precursores, isoformas, variantes de emenda ou fragmentos do interferon de consenso.
[0171] Em uma modalidade, as variantes de interferon de consenso são selecionadas das variantes de interferon de consenso divulgadas emPatentes US 4. 695. 623, 4. 897. 471, 5. 541. 293 e 8. 496. 921, cujo conteúdo total é incorporado a título de referência. Por exemplo, a variante de interferon de consenso pode compreender a sequência de aminoácidos de IFN-CON2 ou IFN-CON3, conforme divulgado emPatentes US 4. 695. 623, 4. 897. 471 e 5.
541. 293. Em uma modalidade, a variante de interferon de consenso compreende a sequência de aminoácidos de IFN-CON2, SEQ ID NO:344.
[0172] Em uma modalidade, a variante de interferon de consenso compreende a sequência de aminoácidos de IFN-CON3, SEQ ID NO:345.
[0173] Em uma modalidade, a variante de interferon de consenso compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das variantes divulgadas emPatente US 8. 496. 921. Por exemplo, a variante de consenso pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:346.
[0174] Em outra modalidade, a variante de interferon de consenso pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:347.
[0175] Em algumas modalidades, a variante de interferon de consenso pode ser PEGuilada, isto é, compreende uma fração de PEG. Em uma modalidade, a variante de interferon de consenso pode compreender uma fração de PEG ligada na posição S156C da SEQ ID NO:347.
[0176] Em algumas modalidades, o interferon engenheirado é uma variante do IFN-α2a humano, com uma inserção de Asp na posição aproximadamente 41 na sequência SEQ ID NO:348 para produzir a SEQ ID NO:349 (que resultou em uma renumeração da sequência relativa à sequência de IFN-α2a) e as seguintes mutações de Arg23Lys, Leu26Pro, Glu53Gln, Thr54Ala, Pro56Ser, Asp86Glu, Ile104Thr, Gly106Glu, Thr110Glu, Lys117Asn, Arg125Lys e Lys136Thr. Todas as modalidades aqui descritas que descrevem interferons de consenso se aplicam igualmente a esse interferon engenheirado.
[0177] Em várias modalidades, a variante de interferon de consenso compreende uma sequência de aminoácidos tendo uma ou mais mutações de aminoácidos. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser selecionadas independentemente de substituições, inserções, deleções e truncamentos.
[0178] Em algumas modalidades, as mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos e podem incluir substituições conservadoras e / ou não conservadoras.
[0179] Em várias modalidades, as substituições podem também incluir aminoácidos não-clássicos (por exemplo, selenocisteína, pirrolisina, N- formilmetionina-p-alanina, GABA e ácido δ-amino-levulínico, ácido 4- aminobenzoico (PABA), isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido 2,4- diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, Ácido 2- amino-butírico, γ-Abu, ε-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosme, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, T-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, β-alanina, Fluoro-aminoácidos, aminoácidos criadores, como β-aminoácidos de metil, aminoácidos de C-α-metil, aminoácidos de N-a-metil e análogos de aminoácidos em geral).
[0180] Em várias modalidades, o interferon de consenso é modificado para ter uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, as mutações permitem que a variante de interferon de consenso tenha uma ou mais atividades atenuadas, como uma ou mais de afinidade de ligação reduzida, atividade endógena reduzida e bioatividade específica reduzida em relação em relação a não mutada, por exemplo, a forma de tipo selvagem do interferon de consenso (por exemplo, o interferon de consenso tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:345 ou 346). Por exemplo, a uma ou mais atividades atenuadas, como afinidade de ligação reduzida, atividade endógena reduzida e bioatividade específica reduzida em relação a não mutada, por exemplo, a forma de tipo selvagem do interferon de consenso, podem estar em um receptor terapêutico como o IFNAR. Consequentemente, em várias modalidades, as mutações permitem que a variante de interferon de consenso tenha toxicidade sistêmica reduzida, efeitos colaterais reduzidos e efeitos fora do alvo reduzidos em relação a não mutada, por exemplo, a forma de tipo selvagem do interferon de consenso.
[0181] Em várias modalidades, o interferon de consenso é modificado para ter uma mutação que reduz sua afinidade ou atividade de ligação a um receptor terapêutico como o IFNAR. Em algumas modalidades, a atividade fornecida pelo interferon de consenso é agonismo no receptor terapêutico (por exemplo, ativação de um efeito celular no sítio da terapia). Por exemplo, o interferon de consenso pode ativar o receptor terapêutico. Em tais modalidades, a mutação resulta na variante de interferon de consenso para ter atividade ativada reduzida no receptor terapêutico.
[0182] Em algumas modalidades, a afinidade ou atividade reduzida no receptor terapêutico é restaurável por ligação com uma fração de direcionamento. Em outras modalidades, a afinidade ou atividade reduzida no receptor terapêutico não é substancialmente restaurável por ligação com a fração de direcionamento. Em várias modalidades, as proteínas quiméricas terapêuticas baseadas em Fc da presente invenção reduzem os efeitos fora do alvo porque a variante de interferon de consenso possui mutações que enfraquecem a afinidade ou atividade de ligação em um receptor terapêutico. Em várias modalidades, isso reduz os efeitos colaterais observados com, por exemplo, o interferon de consenso de tipo selvagem. Em várias modalidades, a variante de interferon de consenso modificada é substancialmente inativa en route para o sítio da atividade terapêutica e tem seu efeito substancialmente em tipos de células especificamente direcionados, o que reduz grandemente os efeitos colaterais indesejados.
[0183] Em várias modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que fazem com que a variante de interferon de consenso tenha afinidade atenuada ou reduzida, por exemplo,
ligação (por exemplo, KD) e / ou ativação (mensurável como, por exemplo, KA e / ou EC50) para um ou mais receptores terapêuticos. Em várias modalidades, a afinidade reduzida no receptor terapêutico permite atenuação da atividade e / ou sinalização do receptor terapêutico.
[0184] Em várias modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade para a subunidade IFNAR1 de IFNAR. Numa modalidade, a variante de interferon de consenso reduziu a afinidade e / ou atividade no IFNAR1. Em algumas modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade para a subunidade IFNAR2 de IFNAR. Em algumas modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade para ambas as subunidades IFNAR1 e IFNAR2.
[0185] Em algumas modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade por IFNAR1 e uma ou mais mutações que reduzem ou ablam substancialmente a ligação ou sua afinidade por IFNAR2. Em algumas modalidades, proteínas quiméricas à base de Fc com essa variante de interferon de consenso podem fornecer atividade IFNAR1 seletiva ao alvo (por exemplo, a atividade IFNAR1 é restaurável via direcionamento através da fração de direcionamento, por exemplo, SIRPα).
[0186] Em algumas modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou sua afinidade por IFNAR2 e uma ou mais mutações que reduzem substancialmente ou ablam a ligação ou sua afinidade por IFNAR1. Em algumas modalidades, as proteínas quiméricas baseadas em Fc com essa variante de interferon de consenso podem fornecer atividade IFNAR2 seletiva ao alvo (por exemplo, a atividade IFNAR2 é restaurável via direcionamento através da fração de direcionamento, por exemplo, SIRPα).
[0187] Em algumas modalidades, a variante de interferon de consenso tem uma ou mais mutações que reduzem sua ligação ou afinidade por IFNAR1 e uma ou mais mutações que reduzem sua ligação a ou sua afinidade por IFNAR2. Em algumas modalidades, proteínas quiméricas à base de Fc com essa variante de interferon de consenso podem fornecer atividade IFNAR1 e/ou IFNAR2 seletiva ao alvo (por exemplo, a atividade IFNAR1 e/IFNAR2 é restaurável via direcionamento através da fração de direcionamento, por exemplo, SIRPα).
[0188] Em algumas modalidades, o interferon de consenso é modificado para ter uma mutação em um ou mais aminoácidos nas posições 145-155, como nas posições de aminoácidos 149, 150 e / ou 154, com referência à SEQ ID NO:346. Em algumas modalidades, o interferon de consenso é modificado para ter uma mutação em um ou mais aminoácidos nas posições 145-155, como nas posições de aminoácidos 149, 150 e / ou 154, com referência à SEQ ID NO:346, as substituições sendo opcionalmente hidrofóbicas e selecionadas de alanina, valina, leucina e isoleucina. Em algumas modalidades, o mutante de interferon de consenso compreende uma ou mais mutações selecionadas de M149A, R150A e L154A e, com referência à SEQ ID NO:342.
[0189] Em uma modalidade, o interferon de consenso é modificado para ter uma mutação na posição de aminoácido 121 (isto é, K121), com referência à SEQ ID NO:342. Em uma modalidade, o interferon de consenso compreende uma mutação K121E, com referência à SEQ ID NO:342.
[0190] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). O VEGF é um fator de crescimento potente que desempenha papéis importantes na angiogênese fisiológica, mas também patológica, regula a permeabilidade vascular e pode atuar como um fator de crescimento nas células que expressam os receptores VEGF. Funções adicionais incluem, entre outras, estimulação da migração celular na linhagem de macrófagos e células endoteliais. Existem vários membros da família de fatores de crescimento VEGF, bem como pelo menos três receptores (VEGFR-1, VEGFR -2 e VEGFR -3). Os membros da família VEGF podem ligar e ativar mais de um tipo VEGFR. Por exemplo, o VEGF-A liga o VEGFR-1 e -2, enquanto o VEGF-C pode ligar o VEGFR-2 e -3. A ativação do VEGFR-1 e -2 regula a angiogênese, enquanto a ativação do VEGFR-3 está associada à linfangiogênese. O principal sinal pró-angiogênico é gerado a partir da ativação do VEGFR-2. Foi relatado que a ativação do VEGFR- 1 está possivelmente associada a um papel negativo na angiogênese. Também foi relatado que a sinalização de VEGFR-1 é importante para a progressão de tumores in vivo através de células positivas para VEGFR-1 derivadas da medula óssea (contribuindo para a formação de nicho pré-metastático no osso). Várias terapias baseadas em anticorpos terapêuticos neutralizantes / direcionados ao VEGF-A foram desenvolvidas, principalmente para uso no tratamento de vários tumores humanos baseados na angiogênese. Embora estes não sejam sem efeitos colaterais. Isto pode não ser surpreendente, considerando que estes funcionam como inibidores gerais de interação VEGF / VEGFR não específicos de células / tecidos. Por isso, seria desejável restringir a inibição de VEGF (por exemplo, VEGF-A) / VEGFR-2 a células alvo específicas (por exemplo, células endoteliais da vasculatura tumoral).
[0191] Em algumas modalidades, o VEGF é VEGF-A, VEGF-B, VEFG-C, VEGF-D ou VEGF-E e suas isoformas incluindo as várias isoformas de VEGF-A, como VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, e VEGF206. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para VEGFR-1 (Flt-1) e / ou VEGFR-2 (KDR / Flk-1). Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para VEGFR- 1 (Flt-1) e / ou VEGFR-2 (KDR / Flk-1). Em uma modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para VEGFR-2 (KDR / Flk-1) e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para VEGFR-1 (Flt-1). Tal modalidade encontra uso, por exemplo, em métodos de cicatrização de feridas ou tratamento de doenças relacionadas à isquemia (sem desejar estar vinculado à teoria, mediada pelos efeitos do VEGFR-2 na função da célula endotelial e na angiogênese). Em várias modalidades, a ligação ao VEGFR-1 (Flt-1), que está ligada a cânceres e atividades pró-inflamatórias, é evitada. Em várias modalidades, o VEGFR-1 (Flt- 1) atua como um receptor de chamariz e, portanto, reduz ou elimina substancialmente a afinidade nesse receptor, evitando o sequestro do agente terapêutico. Em uma modalidade, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada por VEGFR-1 (Flt-1) e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada por VEGFR-2 (KDR / Flk-1) . Em algumas modalidades, o VEGF é VEGF-C ou VEGF-D. Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o VEGFR-3. Alternativamente, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o VEGFR-3.
[0192] As terapias proangiogênicas também são importantes em várias doenças (por exemplo, cardiopatia isquêmica, sangramento etc.) e incluem terapêuticas baseadas em VEGF. A ativação do VEGFR-2 é pró- angiogênica (atuando nas células endoteliais). A ativação do VEFGR-1 pode causar estimulação da migração de células inflamatórias (incluindo, por exemplo, macrófagos) e levar à permeabilidade hipervascular associada à inflamação. A ativação do VEFGR-1 também pode promover a formação de nicho de tumor associado à medula óssea. Assim, seria desejável neste caso Seletivo terapêutico baseado em VEGF para ativação de VEGFR-2. Além disso, o direcionamento específico de células, por exemplo, para células endoteliais, seria desejável.
[0193] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, antagônica) para o VEGFR-2 e / ou tem afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para o VEGFR-1. Quando direcionado para células endoteliais da vasculatura tumoral por meio de uma fração de direcionamento que se liga a um marcador de célula endotelial do tumor (por exemplo, PSMA e outros), esse construto inibe a ativação do VEGFR-2 especificamente nessas células positivas para marcadores, sem ativar o VEGFR-1 en route e nas células alvo (se a atividade for diminuída), eliminando assim a indução de respostas inflamatórias, por exemplo. Isso forneceria uma terapia antiangiogênica mais seletiva e segura para muitos tipos de tumores em comparação às terapias neutralizantes do VEGF-A.
[0194] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, agonística) para o VEGFR-2 e / ou tem afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para o VEGFR-1. Através do direcionamento para células endoteliais vasculares, esse construto, em algumas modalidades, promove a angiogênese sem causar indução de respostas inflamatórias associada ao VEGFR-1. Portanto, tal construto teria como alvo efeitos proangiogênicos com risco substancialmente reduzido de efeitos colaterais causados pela ativação sistêmica de VEGFR-2, bem como de VEGR-1.
[0195] Em uma modalidade ilustrativa, o agente de sinalização modificado é VEGF165, que tem a sequência de aminoácidos VEGF 165 (tipo selvagem) (SEQ ID NO:350).
[0196] Em outra modalidade ilustrativa, o agente de sinalização modificado é o VEGF165b, que tem a sequência de aminoácidos VEGF 165b (tipo selvagem) (SEQ ID NO:351).
[0197] Nestas modalidades, o agente de sinalização modificado tem uma mutação no aminoácido I83 (por exemplo, uma mutação de substituição em I83, por exemplo, I83K, I83R ou I83H). Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que tais mutações possam resultar em afinidade reduzida de ligação ao receptor. Ver, por exemplo, Patente USPatente US 9. 078. 860, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0198] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é TNF-α. O TNF é uma citocina pleiotrópica com muitas funções diversas,
incluindo regulação do crescimento celular, diferenciação, apoptose, tumorigênese, replicação viral, autoimunidade, funções e tráfico de células imunes, inflamação e choque séptico. Liga-se a dois receptores de membrana distintos nas células-alvo:TNFR1 (p55) e TNFR2 (p75). O TNFR1 exibe um padrão de expressão muito amplo, enquanto o TNFR2 é expresso preferencialmente em certas populações de linfócitos, Tregs, células endoteliais, certos neurônios, microglia, miócitos cardíacos e células-tronco mesenquimais. Vias biológicas muito distintas são ativadas em resposta à ativação do receptor, embora também exista alguma sobreposição. Como regra geral, sem desejar estar vinculado à teoria, a sinalização de TNFR1 está associada à indução de apoptose (morte celular) e a sinalização de TNFR2 está associada à ativação de sinais de sobrevida celular (por exemplo, ativação da via NFkB). A administração de TNF é sistemicamente tóxica, e isso se deve em grande parte ao envolvimento do TNFR1. No entanto, deve-se notar que a ativação do TNFR2 também está associada a uma ampla faixa de atividades e, como o TNFR1, no contexto do desenvolvimento de terapêuticas baseadas em TNF, é importante o controle sobre o direcionamento e a atividade do TNF.
[0199] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para TNFR1 e / ou TNFR2. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para TNFR1 e / ou TNFR2. O TNFR1 é expresso na maioria dos tecidos e está envolvido na sinalização da morte celular, enquanto, por outro lado, o TNFR2 está envolvido na sinalização da sobrevivência celular. Por conseguinte, em modalidades direcionadas a métodos de tratamento de câncer, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para TNFR1 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada por TNFR2. Nestas modalidades, as proteínas quiméricas podem ser direcionadas para uma célula para a qual é desejada apoptose, por exemplo, uma célula tumoral ou uma célula endotelial da vasculatura tumoral. Em modalidades direcionadas a métodos de promoção da sobrevida celular, por exemplo, na neurogênese para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade reduzidas por TNFR2 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada por TNFR1. Em outras palavras, as presentes proteínas quiméricas, em algumas modalidades, compreendem o agente TNF-α modificado que permite favorecer os sinais de morte ou sobrevida.
[0200] Em algumas modalidades, a proteína quimérica tem um TNF modificado com afinidade e / ou atividade reduzida para TNFR1 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para TNFR2. Tal quimera, em algumas modalidades, é um indutor de apoptose mais potente em comparação com um TNF de tipo selvagem e / ou quimera que possui apenas mutação(es), causando afinidade e / ou atividade reduzida para o TNFR1. Tal quimera, em algumas modalidades, encontra uso na indução de morte celular de tumor ou morte celular endotelial de vasculatura tumoral (por exemplo, no tratamento de cânceres). Além disso, em algumas modalidades, essas quimeras evitam ou reduzem a ativação de células T reg via TNFR2, por exemplo, suportando ainda mais a atividade antitumoral mediada por TNFR1 in vivo.
[0201] Em algumas modalidades, a proteína quimérica tem um TNF modificado com afinidade e / ou atividade reduzida para TNFR2 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para TNFR1. Tal quimera, em algumas modalidades, é um ativador mais potente da sobrevida celular em alguns tipos de células, que pode ser um objetivo terapêutico específico em várias situações de doença, incluindo, sem limitação, estimulação da neurogênese. Além disso, essas quimeras favoráveis ao TNFR2 também são úteis no tratamento de doenças autoimunes (por exemplo, Crohn, diabetes, MS, colite etc. e muitas outras aqui descritas). Em algumas modalidades, a quimera é direcionada para células T autorreativas. Em algumas modalidades, a quimera promove a ativação de células Treg e a supressão indireta de células T citotóxicas.
[0202] Em algumas modalidades, a quimera causa a morte de células T autorreativas, por exemplo, pela ativação de TNFR2 e / ou evitação de TNFR1 (por exemplo, um TNF modificado com afinidade e / ou atividade reduzida para TNFR2 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para TNFR1). Sem querer estar vinculado à teoria, essas células T autorreativas têm seus sinais de apoptose / sobrevida alterados, por exemplo, pela atividade da via NFkB / alterações de sinalização. Em algumas modalidades, a quimera causa a morte de células T autorreativas com lesões ou modificações na via NFkB, subjacentes a um desequilíbrio de suas propriedades de morte celular (apoptose) / sinalização de sobrevida e, opcionalmente, susceptibilidade alterada a certos sinais indutores de morte (por exemplo, ativação do TNFR2).
[0203] Em algumas modalidades, uma quimera baseada em TNFR2 tem aplicações terapêuticas adicionais em doenças, incluindo várias doenças autoimunes, doenças cardíacas, distúrbios desmielinizantes e neurodegenerativos e doenças infecciosas, entre outros.
[0204] Em uma modalidade, o TNF-α de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:352.
[0205] Em tais modalidades, o agente TNF-α modificado possui mutações em uma ou mais posições de aminoácidos 29, 31, 32, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 145, 146 e 147 que produz um TNF-α modificado com afinidade de ligação ao receptor reduzida. Ver, por exemplo,Patente US 7. 993. 636, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0206] Em algumas modalidades, a fração TNF-α humana modificada tem mutações em uma ou mais posições de aminoácidos R32, N34, Q67, H73, L75, T77, S86, Y87, V91, I97, T105, P106, A109, P113, Y115, E127, N137, D143, A145 e E146, como descrito, por exemplo, em WO / 2015/007903, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência (numeração de acordo com a sequência TNF humana, número de acessão ao Genbank BAG70306, versão BAG70306. 1 Gl:197692685). Em algumas modalidades, a fração TNF-α humana modificada tem mutações de substituição selecionadas de L29S, R32G, R32W, N34G, Q67G, H73G, L75G, L75A, L75S, T77A, S86G, S86T, Y87Q, Y87L, Y87A, Y87F, Y87H, V91G, V91A, I97A, I97Q, I97S, T105G, P106G, A109Y, P113G, Y115G, Y115A, E127G, N137G, D143N, A145G, A145R, A145T, E146D, E146K, e S147D. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação selecionada de Y87Q, Y87L, Y87A, Y87F e Y87H. Em outra modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação selecionada de I97A, I97Q e I97S. Em uma modalidade adicional, a porção TNF-α humana tem uma mutação selecionada de Y115A e Y115G. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação E146K. Em uma modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação Y87H e E146K. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação Y87H e A145R. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação R32W e S86T. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação R32W e E146K. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação L29S e R32W. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação D143N e A145R. Numa modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação D143N e A145R. Em uma modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação A145T, E146D e S147D. Em uma modalidade, a fração TNF-α humana tem uma mutação A145T e S147D.
[0207] Em algumas modalidades, o agente TNF-α modificado possui uma ou mais mutações selecionadas de N39Y, S147Y e Y87H, conforme descrito em WO2008 / 124086, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0208] Em algumas modalidades, a porção TNF-α humana modificada possui mutações que fornecem seletividade ao receptor, conforme descrito em PCT / IB2016 / 001668, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, as mutações no TNF são seletivas ao TNF-R1. Em algumas modalidades, as mutações no TNF que são seletivas ao TNF-R1 estão em uma ou mais das posições R32, S86 e E146. Em algumas modalidades, as mutações no TNF que são seletivas ao TNF-R1 são uma ou mais de R32W, S86T e E146K. Em algumas modalidades, as mutações no TNF que são seletivas ao TNF-R1 são uma ou mais de R32W, R32W / S86T, R32W / E146K e E146K. Em algumas modalidades, as mutações no TNF são seletivas ao TNF-R2. Em algumas modalidades, as mutações no TNF que são seletivas ao TNF-R2 estão em uma ou mais das posições A145, E146 e S147. Em algumas modalidades, as mutações no TNF que são seletivas ao TNF-R2 são uma ou mais de A145T, A145R, E146D e S147D. Em algumas modalidades, as mutações no TNF que são seletivas ao TNF-R2 são uma ou mais de A145R, A145T / S147D e A145T / E146D / S147D.
[0209] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é TNF-β. O TNF-β pode formar um homotrímero ou um heterotrímero com LT-β (LT-α1β2). Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para TNFR1 e / ou TNFR2 e / ou vírus do herpes (HEVM) e / ou LT-βR.
[0210] Em uma modalidade, o TNF-β de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:353.
[0211] Em tais modalidades, o agente solúvel modificado pode compreender mutações em um ou mais aminoácidos nas posições 106-113, que produzem um TNF-β modificado com afinidade de ligação ao receptor reduzida ao TNFR2. Numa modalidade, o agente solúvel modificado tem uma ou mais mutações de substituição nas posições de aminoácidos 106-113. Em modalidades ilustrativas, as mutações de substituição são selecionadas de Q107E, Q107D, S106E, S106D, Q107R, Q107N, Q107E / S106E, Q107E / S106D, Q107D / S106E e Q107D / S106D. Em outra modalidade, o agente solúvel modificado tem uma inserção de cerca de 1 a cerca de 3 aminoácidos nas posições 106-113.
[0212] Em algumas modalidades, o agente modificado é um membro da família TNF (por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que pode ser uma versão trimérica de cadeia única, conforme descrito em WO 2015/007903, cujo conteúdo total é incorporado por referência.
[0213] Em algumas modalidades, o agente modificado é um membro da família TNF (por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que possui afinidade e / ou atividade reduzida, isto é, atividade antagônica (por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) em TNFR1. Nestas modalidades, o agente modificado é um membro da família TNF (por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que também, opcionalmente, possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada por TNFR2. Em algumas modalidades, o agente modificado é um membro da família TNF (por exemplo TNF-alfa, TNF-beta) que possui afinidade e / ou atividade reduzida, isto é atividade antagônica (por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) em TNFR2. Nestas modalidades, o agente modificado é um membro da família TNF (por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que também, opcionalmente, possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada por TNFR1. Os construtos de tais modalidades encontram uso em, por exemplo, métodos de amortecimento da resposta de TNF de uma maneira específica da célula. Em algumas modalidades, o membro antagonista da família TNF (por exemplo, TNF- alfa, TNF-beta) é uma versão trimérica de cadeia única, conforme descrito em WO 2015/007903.
[0214] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é TRAIL. Em algumas modalidades, o agente TRAIL modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para DR4 (TRAIL-RI) e / ou DR5 (TRAIL-RII) e / ou DcR1 e / ou DcR2. Em algumas modalidades, o agente TRAIL modificado tem afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para DR4 (TRAIL-RI) e / ou DR5 (TRAIL-RII) e / ou DcR1 e / ou DcR2.
[0215] Em uma modalidade, o TRAIL do tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:354.
[0216] Em tais modalidades, o agente TRAIL modificado pode compreender uma mutação nas posições de aminoácidos T127-R132, E144- R149, E155-H161, Y189-Y209, T214-1220, K224-A226, W231, E236-L239, E249-K251, T261-H264 e H270-E271 (Numeração baseada na sequência humana, número de acessão ao Genbank NP _003801, versão 10 NP _003801. 1, Gl:4507593; ver acima).
[0217] Em algumas modalidades, o agente TRAIL modificado pode compreender uma ou mais mutações que reduzem substancialmente sua afinidade e / ou atividade para TRAIL-R1. Em tais modalidades, o agente TRAIL modificado pode se ligar especificamente ao TRIL-R2. Mutações exemplificativas incluem mutações em uma ou mais posições de aminoácidos Y189, R191, Q193, H264, I266 e D267. Por exemplo, as mutações podem ser uma ou mais de Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L e D267Q. Numa modalidade, o agente TRAIL modificado compreende as mutações Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L e D267Q.
[0218] Em algumas modalidades, o agente TRAIL modificado pode compreender uma ou mais mutações que reduzem substancialmente sua afinidade e / ou atividade para TRAIL-R2. Em tais modalidades, o agente TRAIL modificado pode se ligar especificamente ao TRIL-R1. Mutações exemplificativas incluem mutações em uma ou mais posições de aminoácidos G131, R149, S159, N199, K201 e S215. Por exemplo, as mutações podem ser uma ou mais de G131R, R149I, S159R, N199R, K201H e S215D. Em uma modalidade, o agente TRAIL modificado compreende as mutações G131R, R149I, S159R, N199R, K201H e S215D. Mutações TRAIL adicionais são descritas em, por exemplo, Trebing et al., (2014) Cell Death and Disease, 5:e1035, cuja divulgação completa é aqui incorporada por referência.
[0219] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é TGFα. Em tais modalidades, o agente TGFα modificado possui afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Em algumas modalidades, o agente TGFα modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR).
[0220] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é TGFβ. Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para TGFBR1 e / ou TGFBR2. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para TGFBR1 e/ou TGFBR2. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui opcionalmente afinidade e / ou atividade reduzida ou substancialmente reduzida ou ablada para TGFBR3 que, sem desejar estar vinculado à teoria, pode atuar como um reservatório de ligante para receptores de TGF-beta. Em algumas modalidades, o TGFβ pode favorecer o TGFBR1 sobre o TGFBR2 ou o TGFBR2 sobre o TGFBR1. Da mesma forma, o LAP, sem desejar estar vinculado à teoria, pode atuar como um reservatório de ligante para os receptores de TGF-beta. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para TGFBR1 e / ou TGFBR2 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou ablada para peptídeo associado à latência (LAP). Em algumas modalidades, essas quimeras encontram uso na doença de Camurati-Engelmann ou em outras doenças associadas à sinalização inadequada de TGFβ.
[0221] Em algumas modalidades, o agente modificado é um membro da família TGF (por exemplo TGFα, TGFβ) que possui afinidade e / ou atividade reduzida, isto é, atividade antagônica (por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) em um ou mais de TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3. Nestas modalidades, o agente modificado é um membro da família TGF (por exemplo, TGFα, TGFβ) que também possui, opcionalmente, afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída em um ou mais de TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3.
[0222] Em algumas modalidades, o agente modificado é um membro da família TGF (por exemplo, TGFα, TGFβ) que possui afinidade e / ou atividade reduzida, isto é, atividade antagônica (por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) em TGFBR1 e / ou TGFBR2. Nestas modalidades, o agente modificado é um membro da família TGF (por exemplo, TGFα, TGFβ) que também, opcionalmente, possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída em TGFBR3.
[0223] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é uma interleucina. Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-1. Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-1α ou IL-1β. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-1R1 e / ou IL-1RAcP. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-1R1 e / ou IL-1RAcP. Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-1R2. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-1R2. Por exemplo, em algumas modalidades, os presentes agentes de IL-1 modificados evitam a interação no IL-1R2 e, portanto, reduzem substancialmente sua função como chamariz e / ou afundamento para agentes terapêuticos.
[0224] Em uma modalidade, o IL-1β de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de IL-1 beta (forma madura, tipo selvagem) (SEQ ID NO:355).
[0225] A IL1 é uma citocina pró-inflamatória e um importante regulador do sistema imunológico. É um potente ativador das respostas das células T CD4, aumenta a proporção de células Th17 e a expansão das células produtoras de IFNγ e IL-4. A IL-1 também é um potente regulador das células T
CD8+, melhorando a expansão, diferenciação, migração de células T CD8 + específicas para o antígeno e a periferia e a memória. Os receptores de IL-1 compreendem IL-1R1 e IL-1R2. A ligação e a sinalização através da IL-1R1 constituem o mecanismo pelo qual a IL-1 medeia muitas de suas atividades biológicas (e patológicas). A IL1-R2 pode funcionar como um receptor de chamariz, reduzindo assim a disponibilidade de IL-1 para interação e sinalização através da IL-1R1.
[0226] Em algumas modalidades, a IL-1 modificada tem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, atividade agonística) para IL-1R1. Em algumas modalidades, a IL-1 modificada possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-1R2. Em tais modalidades, há sinalização restaurável de IL-1 / IL-1R1 e prevenção de perda de quimeras terapêuticas em IL-R2 e, portanto, uma redução na dose de IL-1 necessária (por exemplo, em relação ao tipo selvagem ou quimera que suporta apenas uma mutação de atenuação para IL-R1). Tais construtos encontram uso em, por exemplo, métodos de tratamento de câncer, incluindo, por exemplo, estimular o sistema imunológico a montar uma resposta anticâncer.
[0227] Em algumas modalidades, a IL-1 modificada tem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo atividade antagônica, por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) para IL-1R1. Em algumas modalidades, a IL-1 modificada possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-1R2. Em tais modalidades, há sinalização de IL-1 / IL-1R1 não restaurável e prevenção de perda de quimeras terapêuticas em IL-R2 e, portanto, uma redução na dose de IL-1 necessária (por exemplo, em relação ao tipo selvagem ou quimera que suporta apenas uma mutação de atenuação para IL- R1). Tais construtos encontram uso em, por exemplo, métodos de tratamento de doenças autoimunes, incluindo, por exemplo, suprimir o sistema imunológico.
[0228] Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado possui uma deleção dos aminoácidos 52-54 que produz uma IL-1β humana modificada com afinidade de ligação reduzida para IL-1R do tipo I e atividade biológica reduzida.
Ver, por exemplo, WO 1994/000491, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
Em algumas modalidades, a IL-1β humana modificada tem uma ou mais mutações de substituição selecionadas de A117G/P118G, R120X, L122A, T125G/L126G, R127G, Q130X, Q131G, K132A, S137G/Q138Y, L145G, H146X, L145A/L147A, Q148X, Q148G/Q150G, Q150G/D151A, M152G, F162A, F162A/Q164E, F166A, Q164E/E167K, N169G/D170G, I172A, V174A, K208E, K209X, K209A/K210A, K219X, E221X, E221 S/N224A, N224S/K225S, E244K, N245Q (onde X pode ser qualquer alteração no aminoácido, por exemplo, uma alteração não conservadora), que exibe ligação reduzida a IL-1R, conforme descrito, por exemplo, nos documentos WO2015 / 007542 e WO / 2015 / 007536, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência (base de numeração na sequência IL-1 β humana, número de acessão ao Genbank NP_000567, versão NP-000567. 1, Gl:10835145). Em algumas modalidades, a IL-1β humana modificada pode ter uma ou mais mutações selecionadas de R120A, R120G, Q130A, Q130W, H146A, H146G, H146E, H146N, H146R, Q148E, Q148G, Q148L, K209A, K209D, K219S, K219Q, E221S e E221K.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações Q131G e Q148G.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações Q148G e K208E.
Numa modalidade, a IL- 1β humana modificada compreende as mutações R120G e Q131G.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações R120G e H146A.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações R120G e H146N.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações R120G e H146R.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações R120G e H146E.
Numa modalidade, a IL- 1β humana modificada compreende as mutações R120G e H146G.
Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações R120G e
K208E. Numa modalidade, a IL-1β humana modificada compreende as mutações R120G, F162A e Q164E.
[0229] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
2. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-2Rα e / ou IL-2Rβ e / ou IL-2Rγ. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-2Rβ e/ou IL-2Rγ. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-2Rα. Tais modalidades podem ser relevantes para o tratamento de câncer, por exemplo, quando a IL-2 modificada é agonística em IL-2Rβ e / ou IL-2Rγ. Por exemplo, os presentes construtos podem favorecer a ativação atenuada de células T CD8+ (que podem fornecer um efeito antitumoral), que possuem receptores de IL2 β e γ e desfavorecem T regs (que podem fornecer um efeito imunossupressor e pró-tumoral), que tem receptores de IL2 α, β e γ. Além disso, em algumas modalidades, as preferências por IL- 2Rβ e / ou IL-2Rγ em relação a IL-2Rα evitam efeitos colaterais da IL-2, como edema pulmonar. Além disso, as quimeras baseadas em IL-2 são úteis para o tratamento de doenças autoimunes, por exemplo, quando a IL-2 modificada é antagônica (por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) em IL-2Rβ e / ou IL-2Rγ. Por exemplo, os presentes construtos podem favorecer a supressão atenuada de células T CD8+ (e, portanto, amortecer a resposta imune), que possuem receptores de IL2 β e γ e desfavorecem Tregs que possuem receptores de IL2 α, β e γ. Alternativamente, em algumas modalidades, as quimeras portadoras de IL-2 favorecem a ativação de Tregs, portanto, a supressão imunológica e a ativação do desfavorecimento das células T CD8 + . Por exemplo, esses construtos são úteis no tratamento de doenças ou doenças que se beneficiariam da supressão imunológica, por exemplo, distúrbios autoimunes.
[0230] Em algumas modalidades, a proteína quimérica tem frações de direcionamento, conforme descrito neste documento, direcionadas para células dendríticas Clec9A+, bem como um agente de IL-2 modificado com afinidade e / ou atividade reduzida para IL-2Rβ e / ou IL-2Rγ e / ou substancialmente reduzido ou afinidade e / ou atividade ablada para IL-2Rα. Em algumas modalidades, esses construtos fornecem atividade celular dendrítica Clec9A+ direcionada e são geralmente inativas (ou têm atividade substancialmente reduzida) em relação às células T reg . Em algumas modalidades, esses construto têm efeito estimulatório imune aprimorado em comparação com a IL-2 de tipo selvagem (por exemplo, sem desejar estar vinculado à teoria, por não estimular Tregs), enquanto elimina ou reduz a toxicidade sistêmica associada à IL-2.
[0231] Em uma modalidade, o IL-2 de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de IL-2 (forma madura, tipo selvagem) (SEQ ID NO:356).
[0232] Em tais modalidades, o agente de IL-2 modificado possui uma ou mais mutações nos aminoácidos L72 (L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R ou L72K), F42 (F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R ou F42K) e Y45 (Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R ou Y45K). Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que esses agentes de IL-2 modificados tenham afinidade reduzida para o receptor de IL-2 de alta afinidade e preservem a afinidade para o receptor de IL- 2 de afinidade intermediária, em comparação com o tipo selvagem IL-2. Ver, por exemplo, a Publicação de Patente US 2012/0244112, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0233] Em algumas modalidades, o agente de IL-2 modificado possui uma ou mais mutações nos aminoácidos R38, F42, Y45 e E62. Por exemplo, o agente de IL-2 modificado pode compreender um ou mais de R38A, F42A, Y45A e E62A. Em algumas modalidades, o agente IL-2 modificado pode compreender uma mutação em C125. Por exemplo, a mutação pode ser C125S.
Em tais modalidades, o agente de IL-2 modificado pode ter afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida para IL-2Rα, como descrito em, por exemplo, Carmenate et al. (2013) The Journal of Immunology, 190:6230-6238, cuja divulgação completa é aqui incorporada por referência. Em algumas modalidades, o agente de IL-2 modificado com mutações em R38, F42, Y45 e / ou E62 é capaz de induzir uma expansão de células efetoras, incluindo células T CD8 + e células NK, mas não células Treg. Em algumas modalidades, o agente de IL-2 modificado com mutações em R38, F42, Y45 e / ou E62 é menos tóxico que os agentes de IL-2 de tipo selvagem. Uma proteína quimérica compreendendo o agente de IL-2 modificado com afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida para IL-2Rα pode encontrar aplicação em oncologia, por exemplo. Em outras modalidades, o agente de IL-2 modificado pode ter afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida para IL-2Rβ, como descrito em, por exemplo, WO2016 / 025385, cuja divulgação completa é aqui incorporada por referência. Em tais modalidades, o agente de IL-2 modificado pode induzir uma expansão de células Treg, mas não células efetoras, como células T CD8+ e células NK. Uma proteína quimérica compreendendo o agente IL-2 modificado com afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida para IL-2Rβ pode encontrar aplicação no tratamento de doenças autoimunes, por exemplo. Em algumas modalidades, o agente de IL-2 modificado pode compreender uma ou mais mutações nos aminoácidos N88, D20 e / r A126. Por exemplo, o agente de IL-2 modificado pode compreender um ou mais de N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L e Q126F.
[0234] Em várias modalidades, o agente IL-2 modificado pode compreender uma mutação em D109 ou C125. Por exemplo, a mutação pode ser D109C ou C125S. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada com uma mutação em D109 ou C125 pode ser utilizada para ligação a uma fração de PEG.
[0235] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
3. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor de IL-3, que é um heterodímero com uma cadeia alfa única emparelhada com a subunidade beta comum (beta c ou CD131). Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor de IL-3, que é um heterodímero com uma cadeia alfa única emparelhada com a subunidade beta comum (beta c ou CD131).
[0236] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
4. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para os receptores do tipo 1 e / ou tipo 2 da IL-4. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para os receptores de IL-4 do tipo 1 e / ou tipo 2. Os receptores de IL-4 do tipo 1 são compostos da subunidade IL-4Rα com uma cadeia y comum e se ligam especificamente a IL-4. Os receptores de IL-4 do tipo 2 incluem uma subunidade IL-4Rα ligada a uma subunidade diferente conhecida como IL-13Rα1. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para os receptores de IL-4 do tipo 2.
[0237] Em uma modalidade, o IL-4 de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de IL-4 (forma madura, tipo selvagem) (SEQ ID NO:357).
[0238] Em tais modalidades, o agente de IL-4 modificado tem uma ou mais mutações nos aminoácidos R121 (R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W), E122 (E122F), Y124 ( Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S, Y124T) e S125 (S125A). Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que esses agentes de IL-4 modificados mantenham a atividade mediada pelo receptor tipo I, mas reduz significativamente a atividade biológica mediada pelos outros receptores. Ver, por exemplo, a Patente US 6. 433. 157, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0239] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
6. A IL-6 sinaliza através de um complexo receptor de citocina do tipo I da superfície celular, incluindo a cadeia IL-6R de ligação ao ligando (CD126) e o componente transdutor de sinal gp130. A IL-6 também pode se ligar a uma forma solúvel de IL-6R (sIL-6R), que é a porção extracelular da IL-6R. O complexo sIL- 6R / IL-6 pode estar envolvido no crescimento e sobrevida de neurites e, portanto, pode ser importante na regeneração nervosa por remielinização. Por conseguinte, em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-6R / gp130 e / ou sIL-6R. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-6R / gp130 e / ou sIL- 6R.
[0240] Em uma modalidade, o IL-6 de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de IL-6 (forma madura, tipo selvagem) (SEQ ID NO:358).
[0241] Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado tem uma ou mais mutações nos aminoácidos 58, 160, 163, 171 ou 177. Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que esses agentes de IL-6 modificados exibam afinidade de ligação reduzida a IL-6Ralfa e atividade biológica reduzida. Ver, por exemplo, WO 97/10338, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0242] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
10. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor 1 de IL-10 e receptor 2 de IL-10. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor 1 de IL-10 e receptor 2 de IL-10
[0243] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
11. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-11Rα e / ou IL-11Rβ e / ou gp130. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-11Rα e / ou IL-11Rβ e / ou gp130.
[0244] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
12. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-12Rβ1 e / ou IL-12Rβ2. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-12Rβ1 e / ou IL-12Rβ2.
[0245] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
13. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor de IL-4 (IL-4Rα) e IL-13Rα1. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor de IL-4 (IL- 4Rα) ou IL-13Rα1.
[0246] Em uma modalidade, o IL-13 de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de IL-13 (forma madura, tipo selvagem) (SEQ ID NO:359).
[0247] Em tais modalidades, o agente de IL-13 modificado possui uma ou mais mutações nos aminoácidos 13, 16, 17, 66, 69, 99, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113 e 114. Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que esses agentes de IL-13 modificados exibam atividade biológica reduzida. Ver, por exemplo, WO 2002/018422, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0248] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
18. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para IL-18Rα e/ou IL-18Rβ. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-18Rα e/ou IL-18Rβ. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para IL-18Rα tipo II, que é uma isoforma de IL-18Rα que não possui o domínio TIR necessário para sinalização.
[0249] Em uma modalidade, o IL-18 de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de IL-18 (tipo selvagem) (SEQ ID NO:360).
[0250] Em tais modalidades, o agente de IL-18 modificado pode compreender uma ou mais mutações em aminoácidos ou regiões de aminoácidos selecionadas de Y37-K44, R49-Q54, D59-R63, E67-C74, R80, M87-A97, N 127- K129, Q139-M149, K165-K171, R183 e Q190-N191, conforme descrito em WO / 2015/007542, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência (numeração baseada na sequência de IL-18 humana, número de acessão ao Genbank AAV38697, versão AAV38697. 1, Gl:54696650).
[0251] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IL-
33. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor ST-2 e IL-1RAcP. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor ST-2 e IL-1RAcP.
[0252] Em uma modalidade, o IL-33 de tipo selvagem tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:361.
[0253] Em tais modalidades, o agente de IL-33 modificado pode compreender uma ou mais mutações em aminoácidos ou regiões de aminoácidos selecionadas de I113-Y122, S127-E139, E144-D157, Y163-M183, E200, Q215, L220-C227 e T260 -E269, conforme descrito em WO / 2015/007542, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência (numeração baseada na sequência humana, número de acessão ao Genbank NP_254274, versão NP_254274. 1, Gl: 15559209).
[0254] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é o fator de crescimento epidérmico (EGF). O EGF é um membro de uma família de fatores de crescimento potentes. Os membros incluem EGF, HB-EGF e outros, como TGFalpha, anfiregulina, neuregulinas, epiregulina, betacelulina. Os receptores da família EGF incluem EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 e ErbB4. Estes podem funcionar como subtipos de receptores homodiméricos e / ou heterodiméricos. Os diferentes membros da família EGF exibem seletividade diferencial para os vários subtipos de receptores. Por exemplo, EGF associa-se a ErbB1 / ErbB1, ErbB1 / ErbB2, ErbB4 / ErbB2 e alguns outros subtipos heterodiméricos. O HB-EGF tem um padrão semelhante, embora também se associe ao ErbB4/4. A modulação da sinalização do fator de crescimento de EGF (semelhante a EGF), positiva ou negativamente, é de considerável interesse terapêutico. Por exemplo, a inibição da sinalização de EGFRs é de interesse no tratamento de vários cânceres em que a sinalização de EGFR constitui um importante sinal promotor de crescimento. Alternativamente, a estimulação da sinalização de EGFRs é de interesse terapêutico, por exemplo, na promoção de cicatrização de feridas (aguda e crônica), mucosite oral (um efeito colateral importante de várias terapias contra o câncer, incluindo, sem limitação, terapia de radiação).
[0255] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para ErbB1, ErbB2, ErbB3 e / ou ErbB4. Tais modalidades encontram uso, por exemplo, em métodos de tratamento de feridas. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado se liga a um ou mais ErbB1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 e antagoniza a atividade do receptor. Em tais modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para ErbB1, ErbB2, ErbB3 e / ou ErbB4, o que permite que a atividade do receptor seja antagonizada de maneira atenuada. Tais modalidades encontram uso em, por exemplo, tratamentos de câncer. Numa modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para ErbB1. ErbB1 é o alvo terapêutico dos inibidores de quinase - a maioria tem efeitos colaterais porque não são muito seletivos (por exemplo, gefitinibe, erlotinibe, afatinibe, brigatinibe e icotinibe). Em algumas modalidades, a sinalização de ErbB1 antagonista atenuada é mais no alvo e tem menos efeitos colaterais do que outros agentes direcionados a receptores para EGF.
[0256] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, antagônica por exemplo, atividade antagônica natural ou atividade antagônica que é o resulado de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) para ErbB1 e / ou afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para ErbB4 ou outros subtipos com os quais ele possa interagir. Por meio de direcionamento específico via fração de direcionamento, a supressão seletiva de células (antagonismo por exemplo atividade antagônica natural ou atividade antagônica resultante de uma ou mais mutações, ver, por exemplo, WO 2015/007520, o conteúdo total deste documento é incorporado por referência) da ativação do receptor ErbB1 / ErbB1 seria alcançada - sem envolver outros subtipos de receptores potencialmente associados a efeitos colaterais associados à inibição. Portanto, ao contrário dos inibidores de EGFR quinase, que inibem a atividade de EGFR em todos os tipos de células no corpo, esse construto forneceria uma célula seletiva (por exemplo, célula tumoral com sinalização de EGFR ativada devido à amplificação do receptor, superexpressão etc.) efeito da droga anti-EGFR (ErbB1) com efeitos colaterais reduzidos.
[0257] Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida (por exemplo, agonística) para ErbB4 e / ou outros subtipos com os quais ele pode interagir. Através do direcionamento para células-alvo específicas através da fração de direcionamento, é alcançada uma ativação seletiva da sinalização de ErbB1 (por exemplo, células epiteliais). Tal construto encontra uso, em algumas modalidades, no tratamento de feridas (promover cicatrização) com efeitos colaterais reduzidos, especialmente para tratamento de condições crônicas e aplicação diferente da aplicação tópica de um tratamento terapêutico (por exemplo, cicatrização sistêmica de feridas).
[0258] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é insulina ou análogos de insulina. Em algumas modalidades, a insulina modificada ou análogo da insulina tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor de insulina e / ou receptor de IGF1 ou IGF2. Em algumas modalidades, a insulina modificada ou análogo da insulina tem afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor de insulina e / ou receptor de IGF1 ou IGF2. A resposta atenuada no receptor de insulina permite o controle do diabetes, obesidade, distúrbios metabólicos e semelhantes, enquanto se afasta do receptor de IGF1 ou IGF2, evita efeitos pró-câncer.
[0259] Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é o fator de crescimento tipo insulina I ou fator de crescimento tipo insulina II (IGF-1 ou IGF-2). Numa modalidade, o agente de sinalização modificado é IGF-1. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor de insulina e / ou receptor de IGF1. Numa modalidade, o agente de sinalização modificado pode se ligar ao receptor IGF1 e antagonizar a atividade do receptor. Em tal modalidade, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor IGF1, o que permite que a atividade do receptor seja antagonizada de uma maneira atenuada. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor de insulina e / ou receptor de IGF1. Em algumas modalidades, o agente de sinalização modificado tem afinidade e / ou atividade reduzida para o receptor de IGF2, o que permite que a atividade do receptor seja antagonizada de maneira atenuada. Numa modalidade, o agente de sinalização modificado possui afinidade e / ou atividade substancialmente reduzida ou diminuída para o receptor de insulina e, portanto, não interfere na sinalização de insulina. Em várias modalidades, isso se aplica ao tratamento de câncer. Em várias modalidades, os presentes agentes podem impedir que a isoforma IR A cause resistência aos tratamentos contra o câncer.
[0260] Em uma modalidade, a presente proteína quimérica tem (i) uma fração de direcionamento contra Clec9A e (ii) uma fração de direcionamento que é direcionada contra uma célula tumoral, juntamente com qualquer um dos agentes de sinalização modificados ou mutantes aqui descritos. Em uma modalidade, a presente proteína quimérica tem uma fração de direcionamento direcionada contra Clec9A em células dendríticas e uma segunda fração de direcionamento direcionada contra PD-L1 ou PD-L2 em células tumorais.
[0261] Em uma modalidade, a presente proteína quimérica tem (i) uma fração de direcionamento contra Clec9A e (ii) uma fração de direcionamento que é direcionada contra um marcador inibidor de ponto de verificação, juntamente com qualquer um dos interferons modificados ou mutantes aqui descritos. Em uma modalidade, a presente proteína quimérica tem uma fração de direcionamento direcionada contra Clec9A em células dendríticas e uma segunda fração de direcionamento direcionada contra PD-1.
[0262] Em várias modalidades, o agente de sinalização é uma toxina ou enzima tóxica. Em algumas modalidades, a toxina ou enzima tóxica é derivada de plantas e bactérias. As toxinas ilustrativas ou enzimas tóxicas incluem, mas não estão limitadas a, toxina da difteria, toxina de Pseudomonas, toxina de antraz, proteínas inativadoras de ribossomo (RIPs), como ricina e saporina, modeccina, abrina, gelonina e proteína antiviral de uva-de-rato. Toxinas adicionais incluem aquelas divulgadas em Mathew et al., (2009) Cancer Sci 100(8):1359-65, todas as divulgações são aqui incorporadas por referência. Em tais modalidades, as proteínas quiméricas da invenção podem ser utilizadas para induzir a morte celular de maneira específica do tipo celular. Em tais modalidades, a toxina pode ser modificada, por exemplo, mutada, para reduzir a afinidade e / ou atividade da toxina para um efeito atenuado, como descrito com outros agentes de sinalização neste documento. Quimeras e fusões multi-específicas com agentes de sinalização
[0263] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção faz parte de uma quimera ou fusão com um ou mais agentes de sinalização, como descrito aqui e / ou uma ou mais frações de direcionamento adicionais. Por conseguinte, a presente invenção fornece proteínas quiméricas ou de fusão que incluem um ou mais agentes de sinalização e uma fração de direcionamento contra Clec9A e / ou uma ou mais frações de direcionamento adicionais.
[0264] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção é multi-específico, isto é, o agente de ligação a Clec9A compreende duas ou mais frações de direcionamento com domínios de reconhecimento que reconhecem e ligam dois ou mais alvos, por exemplo, antígenos, receptores ou epítopos. Em tais modalidades, o agente de ligação Clec9A da invenção pode compreender mais duas frações de direcionamento com domínios de reconhecimento que reconhecem e ligam dois ou mais epítopos no mesmo antígeno ou em antígenos diferentes. Em várias modalidades, esses agentes de ligação a Clec9A multi-específicos exibem propriedades vantajosas, como avidez aumentada e / ou seletividade aprimorada. Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A da invenção compreende duas frações de direcionamento e é biespecífico, isto é, liga e reconhece dois epítopos no mesmo antígeno ou em antígenos diferentes.
[0265] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multi- específico da invenção compreende duas ou mais frações de direcionamento, com cada fração de direcionamento sendo um anticorpo ou um derivado de anticorpo, conforme descrito aqui. Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A multi-específico da invenção compreende pelo menos um VHH compreendendo um domínio de reconhecimento de antígeno contra Clec9A e um anticorpo ou derivado de anticorpo compreendendo um domínio de reconhecimento de antígeno contra um antígeno tumoral.
[0266] Em várias modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A multi-específicos têm duas ou mais frações de direcionamento que direcionam antígenos ou receptores diferentes, e uma fração de direcionamento pode ser atenuada por seu antígeno ou receptor, por exemplo, a fração de direcionamento liga seu antígeno ou receptor com uma baixa afinidade ou avidez (incluindo, por exemplo, uma afinidade ou avidez menor que a afinidade ou avidez que a outra fração de direcionamento possui pelo seu antígeno ou receptor, por exemplo, a diferença entre as afinidades de ligação pode ser cerca de 10 vezes, ou 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 300 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, 5000 vezes, 5000 vezes; por exemplo, a menor fração de afinidade ou avidez pode ligar seu antígeno ou receptor a um KD na faixa de médio a alto nM ou baixo a médio-µM, enquanto a fração de maior afinidade ou avidez pode ligar seu antígeno ou receptor a um KD na faixa de médio a alto pM ou baixo a médio- nM). Por exemplo, em algumas modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A multi-específicos compreendem uma fração de direcionamento atenuada que é direcionada contra um antígeno ou receptor promíscuo, que pode melhorar o direcionamento para uma célula de interesse (por exemplo, através da outra fração de direcionamento) e impedir efeitos em múltiplos tipos de células, incluindo aquelas que não são direcionadas para terapia (por exemplo, ligando antígeno promíscuo ou receptor a uma afinidade mais alta do que o que é fornecido nessas modalidades).
[0267] O agente de ligação a Clec9A multi-específico da invenção pode ser construído usando métodos conhecidos na técnica, ver, por exemplo,Patente US 9. 067. 991,Publicação de Patente US 20110262348 e WO 2004/041862, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A multi-específico da invenção compreendendo duas ou mais frações de direcionamento pode ser construído por reticulação química, por exemplo, pela reação de resíduos de aminoácidos com um agente de derivação orgânico, conforme descrito por Blattler et al., Biochemistry 24, 1517-1524 e EP294703, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência. Em outra modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A multi-específico compreendendo duas ou mais frações de direcionamento é construído por fusão genética, isto é, construindo um único polipeptídeo que inclui os polipeptídeos das frações de direcionamento individuais. Por exemplo, pode ser formado um único construto polipeptídico que codifica um primeiro VHH com um domínio de reconhecimento de antígeno contra Clec9A e um segundo anticorpo ou derivado de anticorpo com um domínio de reconhecimento de antígeno contra um antígeno tumoral. Um método para a produção de construtos polipeptídicos VHH bivalentes ou multivalentes é divulgado no pedido de patente PCT WO 96/34103, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Numa outra modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A multi-específico da invenção pode ser construído usando ligantes. Por exemplo, o terminal carboxi de um primeiro VHH com um domínio de reconhecimento de antígeno contra Clec9A pode ser ligado ao terminal amino de um segundo anticorpo ou derivado de anticorpo com um domínio de reconhecimento de antígeno contra um antígeno tumoral (ou vice-versa). Ligantes exemplificativos que podem ser usados são descritos aqui. Em algumas modalidades, os componentes do agente de ligação a Clec9A multi-específico da invenção estão diretamente ligados um ao outro sem o uso de ligantes.
[0268] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multi- específico da invenção reconhece e se liga a Clec9A e um ou mais antígenos encontrados em uma ou mais células imunes, que podem incluir, sem limitação, megacariócitos, trombócitos, eritrócitos, mastócitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, células assassinas naturais, linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos, células T auxiliares, células T assassinas naturais), linfócitos B, células plasmáticas, células dendríticas ou subconjuntos. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A se liga especificamente a um antígeno de interesse e recruta direta ou indiretamente de maneira eficaz uma ou mais células imunes.
[0269] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multi- específico da invenção reconhece e se liga a Clec9A e um ou mais antígenos encontrados nas células tumorais. Nestas modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A podem recrutar direta ou indiretamente uma célula imune para uma célula tumoral ou para o microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A podem recrutar direta ou indiretamente uma célula imune, por exemplo, uma célula imune que pode matar e / ou suprimir uma célula tumoral (por exemplo, um CTL), para um sítio de ação (como, por exemplo não limitativo, o microambiente do tumor).
[0270] Em algumas modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A são capazes ou encontram uso em métodos que envolvem a alteração do equilíbrio de células imunes em favor do ataque imune de um tumor. Por exemplo, os atuais agentes de ligação a Clec9A podem alterar a razão de células imunes em um sítio de importância clínica em favor de células que podem matar e / ou suprimir um tumor (por exemplo, células T, linfócitos T citotóxicos, células T auxiliares, assassinas naturais (NK), células T assassinas naturais (NKT), macrófagos antitumorais (por exemplo, macrófagos M1), neutrófilos, células B, células dendríticas ou subconjuntos e em oposição a células que protegem tumores (por exemplo, células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), células T regulatórias (Tregs); neutrófilos associados a tumores (TANs), macrófagos M2, macrófagos associados a tumores (TAMs) ou subconjuntos dos mesmos). Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A é capaz de aumentar uma razão de células T efetoras para células T regulatórias.
[0271] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multi-específico da invenção compreende uma fração de direcionamento com um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um antígeno associado às células tumorais. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente células tumorais. Por exemplo, em algumas modalidades, o recrutamento da célula tumoral é para uma ou mais células efetoras (por exemplo, uma célula imune como aqui descrita) que podem matar e / ou suprimir a célula tumoral. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente células T para uma célula tumoral, por exemplo, em virtude das duas frações de direcionamento interagindo com seus respectivos antígenos em um tumor e em uma célula imune positiva para Clec9A (por exemplo, células dendríticas).
[0272] Células tumorais ou células cancerígenas referem-se a um crescimento descontrolado de células ou tecidos e / ou um aumento anormal na sobrevida celular e / ou inibição da apoptose que interfere no funcionamento normal dos órgãos e sistemas corporais.
Por exemplo, as células tumorais incluem cânceres benignos e malignos, pólipos, hiperplasia, bem como tumores dormentes ou micrometástases.
As células tumorais ilustrativas incluem, entre outras, células de: carcinoma de células basais, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer no cérebro e no sistema nervoso central; câncer de mama; câncer do peritoneu; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer do cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer da cabeça e pescoço; câncer gástrico (incluindo câncer gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intra-epitelial; câncer do rim ou renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; câncer do pulmão (por exemplo, câncer de células pequenas do pulmão, câncer de células não pequenas do pulmão, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão); melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer da cavidade oral (lábios, língua, boca e faringe); câncer do ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carcinoma da glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; câncer uterino ou do endométrio; câncer do sistema urinário; câncer vulvar; linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin, bem como o linfoma de células B (incluindo linfoma não-Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL) NHL; NHL folicular/de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células não clivadas pequenas de alto grau; linfoma relacionados a AIDS; e macroglobulinemia; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células capilares; leucemia dos mieloblastos crônica; bem como outros carcinomas e sarcomas; e distúrbio linfoproliferativo pós- transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada com facomatose, edema (por exemplo aquele associado com tumores cerebrais) e síndrome de Meigs.
[0273] As células tumorais ou cancerígenas também incluem, mas não estão limitados a, carcinomas, por exemplo vários subtipos, incluindo, por exemplo, adenocarcinoma, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células de transição), sarcomas (incluindo, por exemplo, tecido ósseo e tecido mole), leucemias (incluindo, por exemplo, mieloide aguda, linfoblástica agudo, mieloide crônica, linfocítica crônica e pilosa), linfomas e mielomas (incluindo, por exemplo, linfomas de Hodgkin e não- Hodgkin, cadeia leve, não secretora, MGUS e plasmocitomas) e câncer do sistema nervoso central (incluindo, por exemplo, cérebro (por exemplo gliomas (por exemplo astrocitoma, oligodendroglioma e ependimoma), meningioma, adenoma pituitário e neuromas e tumores da medula espinhal (por exemplo meningiomas e neurofibroma).
[0274] Os antígenos tumorais ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, MART-1 / Melan-A, gp100, Dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteína de ligação à adenosina desaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno colorretal (CRC)-0017-1A / GA733, antígeno carcinoembrionário (CEA) e seus epítopos imunogênicos CAP-1 e CAP-2, etv6, aml1, antígeno específico da próstata (PSA) e seus epítopos imunogênicos PSA-1, PSA-2 e PSA-3, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor de células T / cadeia CD3-zeta, família MAGE de antígenos tumorais (por exemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE -A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE- A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE- C5), família GAGE de antígenos tumorais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2 / neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteína, E-caderina, α-catenina, β-catenina e γ-caten in, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de polipose coli adenomatosa (APC), fodrina, Conexina 37, idiotipo Ig, p15, gp75, gangliosídeos GM2 e GD2, produtos virais, como o vírus do papiloma humano proteínas, família Smad de antígenos tumorais, lmp-1, NA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, fosforilase do glicogênio cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 CT-7, c-erbB-2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, MUC1, GPNMB, Ep-CAM, PD-L1, PD-L2, PMSA e BCMA (TNFRSF17). . Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos tumorais.
[0275] Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A multi-específico reconhece e se liga a Clec9A, bem como a um antígeno em uma célula tumoral. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multi-específico recruta direta ou indiretamente CTLs para a célula tumoral ou o microambiente tumoral.
[0276] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A multi-específico possui frações de direcionamento que direcionam duas células diferentes (por exemplo, para fazer uma sinapse) ou a mesma célula (por exemplo, para obter um efeito do agente de sinalização mais concentrado).
[0277] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado às células T. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente células T. Numa modalidade, os domínios de reconhecimento de antígeno se ligam especificamente a células T efetoras. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de antígeno recruta direta ou indiretamente células T efetoras, por exemplo, em algumas modalidades, para um sítio terapêutico (por exemplo, um sítio com uma ou mais células ou células da doença a serem moduladas para um efeito terapêutico). As células T efetoras ilustrativas incluem células T citotóxicas (por exemplo αβ TCR, CD3+, CD8+, CD45RO+); células T efetoras
CD4+ (por exemplo, αβ TCR, CD3+, CD4+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); células T efetoras CD8+ (por exemplo, αβ TCR, CD3+, CD8+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); células T efetoras de memória (por exemplo, CD62Llow, CD44+, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+, CCR7low); células T de memória central (por exemplo, CCR7+, CD62L+, CD27+; ou CCR7hi, CD44+, CD62Lhi, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+); células T efetoras CD62L+ ; células T de memória efetoras CD8+ (TEM) incluindo células T de memória efetora iniciais (CD27 + CD62L−) incluindo células T de memória efetora tardias (CD27− CD62L−) (TemE e TemL, respectivamente); células T efetoras CD127(+)CD25(low/-); células T efetoras CD127(-)CD25(-); células efetoras de memória de células-tronco CD8+ (TSCM) (por exemplo, CD44(low)CD62L(high)CD122(high)sca(+)); Células T efetoras TH1 (por exemplo, CXCR3+, CXCR6+ e CCR5+; ou αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-12R+, IFNγR+, CXCR3+), células T efetoras TH2 (por exemplo, CCR3+, CCR4+ e CCR8+; ou αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-4R+, IL-33R+, CCR4+, IL-17RB+, CRTH2+); células T efetoras TH9 (por exemplo, αβ TCR, CD3+, CD4+); células T efetoras TH17 (por exemplo, αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-23R+, CCR6+, IL-1R+); células T efetoras CD4+CD45RO+CCR7+, céluas T efetoras ICOS+ ; células T efetoras CD4+CD45RO+CCR7(-); e células T efetoras que secretam IL-2, IL-4 e / ou IFN-γ.
[0278] Os antígenos de células T ilustrativos de interesse incluem, por exemplo (e inclusive os domínios extracelulares, quando aplicável):CD8, CD3, SLAMF4, IL-2Rα, 4-1BB / TNFRSF9, IL-2R β, ALCAM, B7-1, IL-4R, B7-H3, BLAME / SLAMFS, CEACAM1, IL-6R, CCR3, IL-7Rα, CCR4, CXCRl / IL-S RA, CCR5, CCR6, IL-10R α, CCR 7, IL-10R β, CCRS, IL-12R β 1, CCR9, IL-12 R β 2, CD2, IL-13R α1, IL-13, CD3, CD4, ILT2 / CDS5j, ILT3 / CDS5k, ILT4 / CDS5d, ILT5 / CDS5a, lutegrina α 4 / CD49d, CDS, Integrina α E / CD103, CD6, Integrina α M / CD 11 b, CDS, Integrina α X / CD11c, Integrina β 2 / CDlS, KIR / CD15S, CD27 / TNFRSF7, KIR2DL1, CD2S, KIR2DL3, CD30 / TNFRSFS, KIR2DL4 / CD15Sd, CD31 / PECAM-1, KIR2DS4, ligante CD40 / TNFSF5, LAG-3, CD43, LAIR1, CD45, LAIR2, CDS3, leucotrieno B4-R1, CDS4 / SLAMF5, NCAM-L1,
CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229 / SLAMF3, NKG2D 10 / SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A / SLAMF6, Cadeia γ comum / IL-2 R γ, Osteopontina, CRACC / SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK / TNFRSF11A, CX3CR1, CX3CL1, L-Selectina, CXCR3, SIRP β 1, CXCR4, SLAM, CXCR6, TCCR / WSX- 1, DNAM-1, Timopoietina, EMMPRIN / CD147, TIM-1, EphB6, TIM-2, Fas / TNFRSF6 TIM-3, Fas Ligand / TNFSF6, TIM-4, Fcγ RIII / CD16, TIM-6, TNFR1 / TNFRSF1A, Granulisina, TNF RIII / TNFRSF1B, TRAIL Rl / TNFRSFlOA, ICAM- 1 / CD54, TRAIL R2 / TNFRSF10B, ICAM-2 / CD102, TRAILR3 / TNFRSF1A, IFN-γR1, TRAILR4 / TNFRSF10D, IFN-γ R2, TSLP, IL-1 R1 e TSLP R. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de células T ilustrativos.
[0279] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento contra CD8 que é uma VHH compreendendo uma única cadeia de aminoácidos com quatro "regiões estruturais" ou FRs e três "regiões determinantes complementares" ou CDRs. Como utilizado neste documento, "região de estrutura" ou "FR" refere-se a uma região no domínio variável que está localizada entre as CDRs. Como utilizado neste documento, "região determinante complementar" ou "CDR" refere-se a regiões variáveis em VHHs que contêm as sequências de aminoácidos capazes de se ligar especificamente a alvos antigênicos.
[0280] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende um VHH contra CD8 com um domínio variável compreendendo pelo menos uma sequência de CDR1, CDR2 e / ou CDR3.
[0281] Em algumas modalidades, a sequência CDR1 é selecionada de SEQ ID NO:362 ou (SEQ ID NO:18).
[0282] Em algumas modalidades, a sequência CDR2 é selecionada de (SEQ ID NO:363) ou (SEQ ID NO:364).
[0283] Em algumas modalidades, a sequência CDR3 é selecionada de SEQ ID NO:365) ou (SEQ ID NO:366) ou (SEQ ID NO:367).
[0284] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das seguintes sequências R3HCD27 (SEQ ID NO:368) ou R3HCD129 (SEQ ID NO:369) ou R2HCD26 (SEQ ID NO:370).
[0285] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma VHH com um domínio variável compreendendo pelo menos uma sequência de CDR1, CDR2 e / ou CDR3, conforme descrito abaixo.
[0286] Em algumas modalidades, a sequência CDR1 é selecionada de SEQ ID NO:371 a SEQ ID NO:438 ou SEQ ID NO:52.
[0287] Em algumas modalidades, a sequência CDR2 é selecionada de SEQ ID NO:439 a SEQ ID NO:507.
[0288] Em algumas modalidades, a sequência CDR3 é selecionada de SEQ ID NO:508 a SEQ ID NO:576.
[0289] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das seguintes sequências 1CDA 7 (SEQ ID NO:577) ou 1CDA 12 (SEQ ID NO:578) ou 1CDA 14 (SEQ ID NO:579) ou 1CDA 15 (SEQ ID NO:580) ou 1CDA 17 (SEQ ID NO:581) ou 1CDA 18 (SEQ ID NO:582) ou 1CDA 19 (SEQ ID NO:583) ou 1CDA 24 (SEQ ID NO:584) ou 1CDA 26 (SEQ ID NO:585) ou 1CDA 28 (SEQ ID NO:586) ou 1CDA 37 (SEQ ID NO:587) ou 1CDA 43 (SEQ ID NO:588) ou 1CDA 45 (SEQ ID NO:589) ou 1CDA 47 (SEQ ID NO:590) ou 1CDA 48 (SEQ ID NO:591) ou 1CDA 58 (SEQ ID NO:592) ou 1CDA 65 (SEQ ID NO:593) ou 1CDA 68 (SEQ ID NO:594) ou 1CDA 73 (SEQ ID NO:595) ou 1CDA 75 (SEQ ID NO:596) ou 1CDA 86 (SEQ ID NO:597) ou 1CDA 87 (SEQ ID NO:598) ou 1CDA 88 (SEQ ID NO:599) ou 1CDA 89 (SEQ ID NO:600) ou 1CDA 92 (SEQ ID NO:601) ou 1CDA 93 (SEQ ID NO:602) ou 2CDA 1 (SEQ ID NO:603) ou 2CDA 5 (SEQ ID NO:604) ou 2CDA 22 (SEQ ID NO:605) ou 2CDA 28 (SEQ ID NO:606) ou 2CDA 62 (SEQ ID NO:607) ou 2CDA 68 (SEQ ID NO:608) ou 2CDA 73 (SEQ
ID NO:609) ou 2CDA 74 (SEQ ID NO:610) ou 2CDA 75 (SEQ ID NO:611) ou 2CDA 77 (SEQ ID NO:612) ou 2CDA 81 (SEQ ID NO:613) ou 2CDA 87 (SEQ ID NO:614) ou 2CDA 88 (SEQ ID NO:615) ou 2CDA 89 (SEQ ID NO:616) ou 2CDA 91 (SEQ ID NO:617) ou 2CDA 92 (SEQ ID NO:618) ou 2CDA 93 (SEQ ID NO:619) ou 2CDA 94 (SEQ ID NO:620) ou 2CDA 95 (SEQ ID NO:621) ou 3CDA 3 (SEQ ID NO:622) ou 3CDA 8 (SEQ ID NO:623) ou 3CDA 11 (SEQ ID NO:624) ou 3CDA 18 (SEQ ID NO:625) ou 3CDA 19 (SEQ ID NO:626) ou 3CDA 21 (SEQ ID NO:627) ou 3CDA 24 (SEQ ID NO:628) ou 3CDA 28 (SEQ ID NO:629) ou 3CDA 29 (SEQ ID NO:630) ou 3CDA 31 (SEQ ID NO:631) ou 3CDA 32 (SEQ ID NO:632) ou 3CDA 33 (SEQ ID NO:633) ou 3CDA 37 (SEQ ID NO:634) ou 3CDA 40 (SEQ ID NO:635) ou 3CDA 41 (SEQ ID NO:636) ou 3CDA 48 (SEQ ID NO:637) ou 3CDA 57 (SEQ ID NO:638) ou 3CDA 65 (SEQ ID NO:639) ou 3CDA 70 (SEQ ID NO:640) ou 3CDA 73 (SEQ ID NO:641) ou 3CDA 83 (SEQ ID NO:642) ou 3CDA 86 (SEQ ID NO:643) ou 3CDA 88 (SEQ ID NO:644) ou 3CDA 90 (SEQ ID NO:645). Em várias modalidades exemplificativas, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências acima sem a sequência de etiqueta de histidina terminal (isto é, HHHHHH; SEQ ID NO:324).
[0290] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:577-645 (fornecida acima) sem a etiqueta HA (isto é, YPYDVPDYGS; SEQ ID NO:325).
[0291] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:577-645 (fornecida acima) sem o ligante AAA (isto é, AAA).
[0292] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:577-645 (fornecida acima) sem o ligante AAA, a etiqueta HA e a sequência terminal de etiqueta de histidina (ou seja, AAAYPYDVPDYGSHHHHHH; SEQ ID NO:326). Em várias modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos descrita na Publicação de Patente US 2014/0271462, cujo conteúdo total é incorporado por referência. Em várias modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende uma sequência de aminoácidos descrita na Tabela 0. 1, Tabela 0. 2, Tabela 0. 3 e / ou Figuras 1A-12I da Publicação de Patente US 2014/0271462, cujo conteúdo total é incorporado por referência. Em várias modalidades, a fração de direcionamento de CD8 compreende um HCDR1 de um HCDR1 de SEQ ID NO:646 ou 647 e / ou um HCDR2 de HCDR1 da SEQ ID NO:646 ou 647 e / ou um HCDR3 de HCDR1 da SEQ ID NO:646 ou 647 e / ou um LCDR1 de LCDR1 da SEQ ID NO:648 e / ou um LCDR2 de LCDR1 da SEQ ID NO:648 e / ou um LCDR3 de LCDR1 da SEQ ID NO:648, conforme fornecido abaixo.
[0293] Em várias modalidades, a presente invenção contempla o uso de quaisquer análogos naturais ou sintéticos, mutantes, variantes, alelos, homólogos e ortólogos (aqui referidos coletivamente como "análogos") da fração de direcionamento direcionada contra CD8, como aqui descrito. Em várias modalidades, a sequência de aminoácidos da fração de direcionamento direcionada contra CD8 inclui ainda um análogo de aminoácido, um derivado de aminoácido ou outros aminoácidos não clássicos.
[0294] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado às células B. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente células B, por exemplo, em algumas modalidades, para um sítio terapêutico (por exemplo, um sítio com uma ou mais células ou células da doença a serem moduladas para um efeito terapêutico). Os antígenos de células B de interesse ilustrativos incluem, por exemplo, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD38, CD39, CD40, CD70, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD78, CD79a / b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD89, CD98, CD126, CD127, CDw130, CD138, CDw150 e antígeno de maturação de células B (BCMA). Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de células B ilustrativos.
[0295] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado às células Assassinas Naturais. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente células Assassinas Naturais, por exemplo, em algumas modalidades, para um sítio terapêutico (por exemplo, um sítio com uma ou mais células ou células da doença a serem moduladas para um efeito terapêutico). Os antígenos de células assassinas naturais ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, TIGIT, 2B4/SLAMF4, KIR2DS4, CD155/PVR, KIR3DL1, CD94, LMIR1/CD300A, CD69, LMIR2/CD300c, CRACC/SLAMF7, LMIR3/CD300LF, Kir1alfa, DNAM-1, LMIR5/CD300LB, Fc-épsilon RII, LMIR6/CD300LE, Fc-γ Rl/CD64, MICA, Fc-γ RIIB/CD32b, MICB, Fc-γ RIIC/CD32c, MULT-1, Fc-γ RIIA/CD32a, Nectin-2/CD112, Fc-γ RIII/CD16, NKG2A, FcRH1/IRTA5, NKG2C, FcRH2/IRTA4, NKG2D, FcRH4/IRTA1, NKp30, FcRH5/IRTA2, NKp44, tipo Receptor Fc 3/CD16-2, NKp46/NCR1, NKp80/KLRF1, NTB-A/SLAMF6, Rae-1, Rae-1 α, Rae-1 β, Rae-1 delta, H60, Rae-1 épsilon, ILT2/CD85j, Rae-1 γ, ILT3/CD85k, TREM-1, ILT4/CD85d, TREM-2, ILT5/CD85a, TREM-3, KIR/CD158, TREML1/TLT-1, KIR2DL1, ULBP-1, KIR2DL3, ULBP-2, KIR2DL4/CD158d e ULBP-3. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de células NK ilustrativos.
[0296] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos macrófagos / monócitos. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente macrófagos / monócitos, por exemplo, em algumas modalidades, para um sítio terapêutico (por exemplo, um sítio com uma ou mais células ou células da doença a serem moduladas para um efeito terapêutico). Os antígenos de macrófagos / monócitos ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, SIRP1a, B7-1 / CD80, ILT4 / CD85d, B7-H1, ILT5 / CD85a, cadeia β comum, Integrina α 4 / CD49d, BLAME / SLAMF8, Integrina α X / CDllc, CCL6 / C10, Integrina β 2 / CD18, CD155 / PVR, Integrina β 3 / CD61, CD31 / PECAM- 1, Látex, CD36 / SR-B3, Leucotrieno B4 R1, CD40 / TNFRSF5, LIMPIIISR-B2, CD43, LMIR1 / CD300A, CD45, LMIR2 / CD300c, CD68, LMIR3 / CD300LF, CD84 / SLAMF5, LMIR5 / CD300LB, CD97, LMIR6 / CD300LE, CD163, LRP-1, CD2F-10 / SLAMF9, MARCO, CRACC / SLAMF7, MD-1, ECF-L, MD-2, EMMPRIN / CD147, MGL2, Endoglin / CD105, Osteoativivina / GPNMB, Fc-γ RI / CD64, Osteopontina, Fc-γ RIIB / CD32b, PD-L2, Fc-γ RIIC / CD32c, Siglec-3 / CD33, Fc-γ RIIA / CD32a, SIGNR1 / CD209, Fc-γ RIII / CD16, SLAM, GM-CSF R α, TCCR / WSX-1, ICAM-2 / CD102, TLR3, IFN-γ Rl, TLR4, IFN-gannna R2, TREM-l, IL-lRII, TREM-2, ILT2 / CD85j, TREM-3, ILT3 / CD85k, TREML1 / TLT- 1, 2B4 / SLAMF 4, IL-10R α, ALCAM, IL-10 R β, AminopeptidaseN / ANPEP, ILT2 / CD85j, Cadeia β comum, ILT3 / CD85k, Clq R1 / CD93, ILT4 / CD85d, CCR1, ILT5 / CD85a, CCR2, CD206, Integrina α 4 / CD49d, CCR5, Integrina α M / CDll b, CCR8, Integrina α X / CDllc, CD155 / PVR, Integrina β 2 / CD18, CD14, Integrina β 3 / CD61, CD36 / SR-B3, LAIR1, CD43, LAIR2, CD45, Leucotrieno B4-R1, CD68, LIMPIIISR-B2, CD84 / SLAMF5, LMIR1 / CD300A, CD97, LMIR2 / CD300c, CD163, LMIR3 / CD300LF, Fator de coagulação III / Fator de tecidos, LMIR5 / CD300LB, CX3CR1, CX3CL1, LMIR6 / CD300LE, CXCR4, LRP-1, CXCR6, M-CSF R, DEP-1 / CD148, MD-1, DNAM-1, MD-2, EMMPRIN / CD147, MMR, Endoglin / CD105, NCAM-L1, Fc-γ RI / CD64, PSGL-1, Fc-γ RIIIICD16, RP105, G-CSF R, L-Selectina, GM-CSF R α, Siglec-3 / CD33, HVEM / TNFRSF14, SLAM, ICAM-1 / CD54, TCCR / WSX-1, ICAM-2 / CD102, TREM-l, IL-6R, TREM-2, CXCRl / IL-8 RA, TREM-3 e TREMLl / TLT-1. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de macrófagos / monócitos ilustrativos.
[0297] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado às células dendríticas. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento recruta direta ou indiretamente células dendríticas, por exemplo, em algumas modalidades, para um sítio terapêutico (por exemplo, um sítio com uma ou mais células ou células da doença a serem moduladas para um efeito terapêutico). Antígenos de células dendríticas ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, CLEC9A, XCR1, RANK, CD36 / SRB3, LOX-1 / SR-E1, CD68, MARCO, CD163, SR-A1 / MSR, CD5L, SREC-1, CL-Pl / COLEC12, SREC-II, LIMPIIISRB2, RP105, TLR4, TLR1, TLR5, TLR2, TLR6, TLR3, TLR9, ligante de 4-IBB / TNFSF9, IL-12 / IL-23 p40, 4-Amino-1,8-naftalimida, ILT2 / CD85j, CCL21 / 6Ckine, ILT3 / CD85k, 8-oxo-dG, ILT4 / CD85d, 8D6A, ILT5 / CD85a, A2B5, lutegrina α 4 / CD49d, Aag, Integrina β 2 / CD18, AMICA, Langerin, B7 -2 / CD86, Leucotrieno B4 Rl, B7-H3, LMIR1 / CD300A, BLAME / SLAMF8, LMIR2 / CD300c, Clq R1 / CD93, LMIR3 / CD300LF, CCR6, LMIR5 / CD300LB CCR7, LMIR6 / CD300LE, CD40/TNFRSF5, MAG/Siglec-4-a, CD43, MCAM, CD45, MD-1, CD68, MD-2, CD83, MDL-1 / CLEC5A, CD84 / SLAMF5, MMR, CD97, NCAMLl, CD2F-10 / SLAMF9, Osteoactivin GPNMB, Chern 23, PD-L2, CLEC-1, RP105, CLEC-2, CLEC-8, Siglec-2 / CD22, CRACC / SLAMF7, Siglec-3 / CD33, DC-SIGN, DEC-205, Siglec-5, DC -SIGNR / CD299, Siglec-6, DCAR, Siglec-7, DCIR / CLEC4A, Siglec-9, DEC-205, Siglec-10, Dectin-1 / CLEC7A, Siglec-F, Dectina-2 / CLEC6A, SIGNR1 / CD209, DEP-1 / CD148, SIGNR4, DLEC, SLAM, EMMPRIN / CD147, TCCR / WSX-1, Fc-γ R1 / CD64, TLR3, Fc-γ RIIB / CD32b, TREM-1, Fc -γ RIIC / CD32c, TREM-2, Fc-γ RIIA / CD32a, TREM-3, Fc-γRIII / CD16, TREML1 / TLT-1, ICAM-2 / CD102, DEC205 e Vanilloid R1. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de células DC ilustrativos.
[0298] Em várias modalidades, a presente proteína quimérica compreende uma fração de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica a qualquer uma das sequências aqui divulgadas. Por exemplo, a proteína quimérica pode compreender uma fração de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 61%, pelo menos cerca de 62%, pelo menos cerca de 63%, pelo menos cerca de 64%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 66%, pelo menos cerca de 67%, pelo menos cerca de 68%, pelo menos cerca de 69%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 71%, pelo menos cerca de 72%, pelo menos cerca de 73%, pelo menos cerca de 74%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 76%, pelo menos cerca de 77%, pelo menos cerca de 78%, pelo menos cerca de 79%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das sequências aqui divulgadas (por exemplo, cerca de 60% ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%,
ou cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência para qualquer uma das sequências aqui divulgada).
[0299] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que liga especificamente um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) em células imunes selecionadas de, mas não se limitando a megacariócitos, trombócitos, eritrócitos mastócitos, basófilos, neutrófilos e eosinófilos. Em algumas modalidades, os domínios de reconhecimento de antígeno recrutam direta ou indiretamente megacariócitos, trombócitos, eritrócitos, mastócitos, basófilos, neutrófilos e eosinófilos, por exemplo, em algumas modalidades, para um sítio terapêutico (por exemplo, um local com uma ou mais células ou células da doença modulado para um efeito terapêutico).
[0300] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos megacariócitos e / ou trombócitos. Os antígenos de megacariócitos e / ou trombócitos ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, GP IIb / IIIa, GPIb, vWF, PF4 e TSP. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de megacariócitos e / ou trombócitos ilustrativos.
[0301] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos eritrócitos. Os antígenos eritrocitários ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, antígenos de CD34, CD36, CD38, CD41a (glicoproteína plaquetária IIb / IIIa), CD41b (GPIIb), CD71 (receptor transferrina), CD105, glicoforina A, glicoforina C, c-kit, HLA-DR, H2 (MHC-II) e Rhesus. Em várias modalidades, o agente de ligação a
Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos eritrocitários ilustrativos.
[0302] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos mastócitos. Antígenos de mastócitos ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, SCFR/CD117, FcRI, CD2, CD25, CD35, CD88, CD203c, C5R1, CMAl, FCERlA, FCER2, TPSABl. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de mastócitos.
[0303] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos basófilos. Os antígenos de basófilos ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, FcRI, CD203c, CD123, CD13, CD107a, CD107b, e CD164. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos basófilos.
[0304] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos neutrófilos. Os antígenos de neutrófilos ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, 7D5, CD10 / CALLA, CD13, CD16 (FcRIII), proteínas CD18 (LFA-1, CR3 e p150, 95), CD45, CD67 e CD177. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de neutrófilos.
[0305] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) associado aos eosinófilos. Antígenos de eosinófilos ilustrativos de interesse incluem, por exemplo, CD35, CD44 e CD69. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos de eosinófilos.
[0306] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a qualquer antígeno ou receptor apropriado ou marcadores de superfície celular conhecidos pelo versado na técnica. Em algumas modalidades, o antígeno ou marcador de superfície celular é um marcador específico de tecido. Marcadores ilustrativos específicos de tecido incluem, mas não estão limitados a, marcadores de superfície celular endotelial, como ACE, CD14, CD34, CDH5, ENG, ICAM2, MCAM, NOS3, PECAMl, PROCR, SELE, SELP, TEK, THBD, VCAMl, VWF ; marcadores da superfície celular de músculo liso como ACTA2, MYHlO, MYHl 1, MYH9, MYOCD; marcadores da superfície celular de fibroblasto (estroma), tais como ALCAM, CD34, COLlAl, COL1A2, COL3A1, FAP, PH-4; marcadores epiteliais da superfície celular, tais como CDlD, K6IRS2, KRTlO, KRT13, KRT17, KRT18, KRT19, KRT4, KRT5, KRT8, MUCl, TACSTDl; marcadores de neovasculatura, tais como CD13, TFNA, Alpha-v beta-3 (αVβ3), E-selectina; e marcadores de superfície de adipócitos, como ADIPOQ, FABP4 e RETN. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que liga um ou mais desses antígenos.
[0307] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um marcador de ponto de verificação expresso em uma célula T, por exemplo,
um ou mais de PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, TIM3 e A2aR.
[0308] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento que possui um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a um marcador de ponto de verificação, por exemplo, um ou mais de PD-1/PD- L1 or PD-L2, CD28/CD80 ou CD86, CTLA4/ CD80 or CD86, ICOS/ICOSL ou B7RP1, BTLA/HVEM, KIR, LAG3, CD137/CD137L, OX40/OX40L, CD27, CD40L, TIM3/Gal9, e A2aR.
[0309] A título de exemplo não limitativo, em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A multiespecífico compreende uma fração de direcionamento direcionada contra (i) CD8; (ii) um marcador de ponto de verificação expresso em uma célula T, por exemplo, um ou mais de PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, Cd27, CD40L, TIM3 e A2aR e / ou (iii) uma fração de direcionamento é direcionada contra uma célula tumoral, juntamente com qualquer um dos agentes de sinalização modificados (por exemplo, mutantes) aqui descritos.
[0310] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A multiespecífico possui uma ou mais frações de direcionamento direcionadas contra PD-1. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A tem uma ou mais frações de direcionamento que se ligam seletivamente a um polipeptídeo PD-1. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um ou mais anticorpos, derivados ou formatos de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos ou proteínas de fusão que se ligam seletivamente a um polipeptídeo PD-1.
[0311] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende um VHH contra PD1 com um domínio variável compreendendo pelo menos uma sequência de CDR1, CDR2 e / ou CDR3.
[0312] Em algumas modalidades, a sequência PD1 CDR1 é selecionada de SEQ ID NO:649 a SEQ ID NO:662.
[0313] Em algumas modalidades, a sequência PD1 CDR2 é selecionada de SEQ ID NO:663 a SEQ ID NO:676.
[0314] Em algumas modalidades, a sequência PD1 CDR3 é selecionada de SEQ ID NO:677 a SEQ ID NO:689.
[0315] Em várias modalidades exemplificativas, a fração de direcionamento de PD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das seguintes sequências:2PD23 (SEQ ID NO:690) ou 2PD26 (SEQ ID NO:691) ou 2PD90 (SEQ ID NO:692) ou 2PD106 (SEQ ID NO:693) ou 2PD16 (SEQ ID NO:694) ou 2PD71 (SEQ ID NO:695) ou 2PD152 (SEQ ID NO:696) ou 2PD12 (SEQ ID NO:697) ou 3PD55 (SEQ ID NO:698) ou 3PD82 (SEQ ID NO:699) ou 2PD8 (SEQ ID NO:700) ou 2PD27 (SEQ ID NO:701) ou 2PD82 (SEQ ID NO:702) ou 3PD36 (SEQ ID NO:703).
[0316] Em várias modalidades exemplificativas, a fração de direcionamento de PD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das acima sem a sequência de etiqueta de histidina terminal (isto é, HHHHHH; SEQ ID NO:324).
[0317] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de PD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:690-703 (fornecida acima) sem a etiqueta HA (isto é, YPYDVPDYGS; SEQ ID NO:325).
[0318] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de PD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:690-703 (fornecida acima) sem o ligante AAA (isto é, AAA).
[0319] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de PD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:690-703 (fornecida acima) sem o ligante AAA, a etiqueta HA e a sequência terminal de etiqueta de histidina (ou seja, AAAYPYDVPDYGSHHHHHH; SEQ ID NO:326). Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-1 pembrolizumabe (também conhecido como MK-3475, KEYTRUDA) ou fragmentos dos mesmos. O pembrolizumabe e outros anticorpos anti-PD-1 humanizados são divulgados em Hamid, et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2):134-44, US 8. 354. 509 e WO 2009/114335, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o pembrolizumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:704 e / ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:705.
[0320] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-1, nivolumabe (também conhecido como BMS- 936558, MDX-1106, ONO-4538, OPDIVO), ou fragmentos dos mesmos. Nivolumabe (clone 5C4) e outros anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a PD-1 são divulgados em US 8. 008. 449 e WO 2006/121168, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o nivolumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:706 e / ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:707.
[0321] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-1 pidilizumabe (também conhecido como CT- 011, hBAT ou hBAT-1), ou fragmentos dos mesmos. O pidilizumabe e outros anticorpos monoclonais anti-PD-I humanizados são divulgados em US 2008/0025980 e WO 2009/101611, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende regiões variáveis de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS:15-18 de US 2008/0025980:SEQ ID No:15 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:708); SEQ ID No:16 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:709); SEQ ID No:17 de US
2008/0025980 (SEQ ID NO:710); SEQ ID No:18 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:711); e / ou uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS:20-24 de US 2008/0025980:SEQ ID No:20 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:712); SEQ ID No:21 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:713); SEQ ID No:22 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:714); SEQ ID No:23 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:715); SEQ ID No:24 de US 2008/0025980 (SEQ ID NO:716
[0322] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 18 de US 2008/0025980 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 22 de US 2008/0025980.
[0323] Numa modalidade, a fração de direcionamento compreende AMP-514 (também conhecido como MEDI-0680).
[0324] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende a proteína de fusão PD-L2-Fc AMP-224, que é divulgada em WO2010 / 027827 e WO 2011/066342, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em tal modalidade, a fração de direcionamento pode incluir um domínio de direcionamento que compreende a SEQ ID NO: 4 de WO2010 / 027827 (SEQ ID NO:717) e / ou a proteína de fusão B7-DC que compreende a SEQ ID NO: 83 de WO2010 / 027827 (SEQ ID NO:718).
[0325] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o peptídeo AUNP 12 ou qualquer um dos outros peptídeos divulgados em US 2011/0318373 ou 8. 907. 053. Por exemplo, a fração de direcionamento pode compreender AUNP 12 (isto é, Composto 8 ou SEQ ID NO: 49 de US 2011/0318373) que tem a sequência de SEQ ID NO:719: SNTSESFK(SNTSESF)FRVTQLAPKAQIKE-NH2 ou .
[0326] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-1 1E3, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 1E3 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:720; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:721.
[0327] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-1 1E8, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 1E8 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:722; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:723.
[0328] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-1 1H3, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 1H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:724; e/ou região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:725.
[0329] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende um VHH direcionado contra PD-1 como divulgado, por exemplo, em US 8. 907. 065 e WO 2008/071447, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, os VHHs contra PD-1 compreendem SEQ ID NOS:347-351 de US 8. 907. 065:SEQ ID No:347 de US
8. 907. 065 (SEQ ID NO:726); SEQ ID No:348 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:727); SEQ ID No:349 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:728); SEQ ID No:350 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:729); SEQ ID No:351 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:730).
[0330] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-1, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US2011 / 0271358 e WO2010 / 036959, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS:25-29 de US2011 / 0271358:SEQ ID No:25 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:731); SEQ ID No:26 de US2011 / 0271358 (SEQ ID NO:732); SEQ ID No:27 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:733); SEQ ID No:28 de US2011 / 0271358 (SEQ ID NO:734); SEQ ID No:29 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:735); e / ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS:30-33 de US2011 / 0271358:SEQ ID No:30 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:736); SEQ ID No:31 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:737); SEQ ID No:32 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:738); SEQ ID No:33 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:739).
[0331] Em várias modalidades, o presente agente de ligação Clec9A multiespecífico compreende um ou mais anticorpos direcionados contra PD-1, ou fragmentos de anticorpos, selecionados de TSR-042 (Tesaro,
Inc.),REGN2810 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.),PDR001 (Novartis Pharmaceuticals) e BGB-A317 (BeiGene Ltd.)
[0332] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A multiespecífico possui uma ou mais frações de direcionamento direcionadas contra PD-L1. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A tem uma ou mais frações de direcionamento que se ligam seletivamente a um polipeptídeo PD-L1. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um ou mais anticorpos, derivados ou formatos de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos ou proteínas de fusão que se ligam seletivamente a um polipeptídeo PD-L1.
[0333] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende um VHH contra PD-L1 com um domínio variável compreendendo pelo menos uma sequência de CDR1, CDR2 e / ou CDR3.
[0334] Em algumas modalidades, a sequência PD-L1 CDR1 é selecionada de SEQ ID NO:740 a SEQ ID NO:770.
[0335] Em algumas modalidades, a sequência PD-L1 CDR2 é selecionada de SEQ ID NO:771 a SEQ ID NO:801.
[0336] Em algumas modalidades, a sequência PD-L1 CDR3 é selecionada de SEQ ID NO:802 a SEQ ID NO:832.
[0337] Em várias modalidades exemplificativas, a fração de direcionamento de PD-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das seguintes sequências:2LIG2 (SEQ ID NO:833) ou 2LIG3 (SEQ ID NO:834) ou 2LIG16 (SEQ ID NO:835) ou 2LIG22 (SEQ ID NO:836) ou 2LIG27 (SEQ ID NO:837) ou 2LIG29 (SEQ ID NO:838) ou 2LIG30 (SEQ ID NO:839) ou 2LIG34 (SEQ ID NO:840) ou 2LIG35 (SEQ ID NO:841) ou 2LIG48 (SEQ ID NO:842) ou 2LIG65 (SEQ ID NO:843) ou 2LIG85 (SEQ ID NO:844) ou 2LIG86 (SEQ ID NO:845) ou 2LIG89 (SEQ ID NO:846) ou 2LIG97 (SEQ ID NO:847) ou 2LIG99 (SEQ ID NO:848) ou 2LIG109 (SEQ ID NO:849) ou 2LIG127 (SEQ ID NO:850) ou 2LIG139 (SEQ ID NO:851) ou 2LIG176 (SEQ ID NO:852) ou
2LIG189 (SEQ ID NO:853) ou 3LIG3 (SEQ ID NO:854) ou 3LIG7 (SEQ ID NO:855) ou 3LIG8 (SEQ ID NO:856) ou 3LIG9 (SEQ ID NO:857) ou 3LIG18 (SEQ ID NO:858) ou 3LIG20 (SEQ ID NO:859) ou 3LIG28 (SEQ ID NO:860) ou 3LIG29 (SEQ ID NO:861) ou 3LIG30 (SEQ ID NO:862) ou 3LIG33 (SEQ ID NO:863).
[0338] Em várias modalidades exemplificativas, a fração de direcionamento de PD-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências acima sem a sequência de etiqueta de histidina terminal (isto é, HHHHHH; SEQ ID NO:324).
[0339] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de PD-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:833-863 (fornecida acima) sem a etiqueta HA (isto é, YPYDVPDYGS; SEQ ID NO:325).
[0340] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de PD-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:833-863 (fornecida acima) sem o ligante AAA (isto é, AAA).
[0341] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de PD-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:833-863 (fornecida acima) sem o ligante AAA, a etiqueta HA e a sequência terminal de etiqueta de histidina (ou seja, AAAYPYDVPDYGSHHHHHH; SEQ ID NO:326). Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 MEDI4736 (também conhecido como durvalumabe), ou fragmentos dos mesmos. MEDI4736 é seletivo para PD-L1 e bloqueia a ligação de PD-L1 aos receptores PD-1 e CD80. MEDI4736 e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve ou cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve. A sequência de MEDI4736 é divulgada em WO / 2016/06272, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o MEDI4736 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de (SEQ ID NO:864); e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:865.
[0342] Em modalidades ilustrativas, o MEDI4736 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 de WO / 2016/06272 (SEQ ID NO:866); e / ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 de WO / 2016/06272 (SEQ ID NO:867).
[0343] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 atezolizumabe (também conhecido como MPDL3280A, RG7446), ou fragmentos dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o atezolizumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de: SEQ ID NO:868; e / ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID NO:869.
[0344] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 avelumabe (também conhecido como MSB0010718C), ou fragmentos dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o avelumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:870; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:871.
[0345] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 BMS-936559 (também conhecido 12A4, MDX-1105), ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o BMS-936559 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:872; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:873.
[0346] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 3G10 ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 3G10 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:874; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:875.
[0347] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 10A5, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 10A5 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:876; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:877.
[0348] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 5F8, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 5F8 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:878; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:879.
[0349] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 10H10, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 10H10 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:880; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO:881.
[0350] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 1B12, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 1B12 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:882; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:883.
[0351] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 7H1, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 7H1 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:884; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:885.
[0352] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 11E6, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 11E6 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:886; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:887.
[0353] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 12B7, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 12B7 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:888; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:889.
[0354] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 13G4, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em US 2013/0309250 e WO2007 / 005874, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 13G4 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:890; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:891.
[0355] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 1E12, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 1E12 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:892; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:893.
[0356] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 1F4, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 1F4 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:894; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:895.
[0357] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2G11, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2G11 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:896; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:897.
[0358] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 3B6, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 3B6 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:898;e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:899.
[0359] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 3D10, ou fragmentos do mesmo, como divulgado no US 2014/0044738 e WO2012/145493, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 3D10 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:900); e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:901.
[0360] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1, conforme divulgado em US2011 / 0271358 e WO2010 / 036959, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:34-38 de US2011 / 0271358:SEQ ID No:34 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:902); SEQ ID No:35 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:903); SEQ ID No:36 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:904); SEQ ID No:37 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:905); SEQ ID No:38 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:906); e / ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:39- 42 de US2011 / 0271358:SEQ ID No:39 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:907); SEQ ID No:40 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:908); SEQ ID No:41 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:909); SEQ ID No:42 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:910).
[0361] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2. 7A4, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2. 7A4 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:2 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:911; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:7 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:912).
[0362] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2. 9D10, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2. 9D10 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:12 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:913; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:17 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:914).
[0363] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2. 14H9, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2. 14H9 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:22 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:915; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:27 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:916).
[0364] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2. 20A8, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2. 20A8 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:32 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:917; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:37 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:918).
[0365] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 3. 15G8, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 3. 15G8 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:42 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:919; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:47 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:920).
[0366] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 3. 18G1, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 3. 18G1 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:52 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:921); e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:57 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:922).
[0367] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2. 7A4OPT, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8,779,108, e US2014/0356353, e US2014/0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2. 7A4OPT ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:62 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:923; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:67 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:924).
[0368] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende o anticorpo anti-PD-L1 2. 14H9OPT, ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado em WO 2011/066389, US8. 779. 108 e US2014 / 0356353, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, o 2. 14H9OPT ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região variável cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:72 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:925; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:77 de WO 2011/066389 (SEQ ID NO:926).
[0369] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1, conforme divulgado em WO2016/061142, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:18, 30, 38, 46, 50, 54, 62, 70, e 78 de WO2016/061142:SEQ ID No:18 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:927); SEQ ID No:30 de WO2016/061142 (SEQ ID NO:928); SEQ ID No:38 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:929); SEQ ID No:46 de WO2016/061142 (SEQ ID NO:930); SEQ ID No:50 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:931); SEQ ID No:54 de WO2016/061142 (SEQ ID NO:932); SEQ ID No:62 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:933); SEQ ID No:70 de WO2016/061142 (SEQ ID NO:934); SEQ ID No:78 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:935); e / ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:22, 26, 34, 42, 58, 66, 74, 82, e 86 de WO2016/061142:SEQ ID No:22 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:936); SEQ ID No:26 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:937); SEQ ID No:34 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:938); SEQ ID No:42 de WO2016/061142 (SEQ ID NO:939); SEQ ID No:58 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:940); SEQ ID No:66 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:941); SEQ ID No:74 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:942); SEQ ID No:82 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:943); SEQ ID No:86 de WO2016 / 061142 (SEQ ID NO:944).
[0370] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1, conforme divulgado em
WO2016/022630, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 e 46 de WO2016 / 022630:SEQ ID No:2 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:945); SEQ ID No:6 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:946); SEQ ID No:10 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:947); SEQ ID No:14 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:948); SEQ ID No:18 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:949); SEQ ID No:22 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:950); SEQ ID No:26 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:951); SEQ ID No:30 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:952); SEQ ID No:34 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:953); SEQ ID No:38 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:954); SEQ ID No:42 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:955); SEQ ID No:46 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:956); e / ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 e 48 de WO2016 / 022630:SEQ ID No:4 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:957); SEQ ID No:8 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:958); SEQ ID No:12 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:959); SEQ ID No:16 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:960); SEQ ID No:20 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:961); SEQ ID No:24 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:962); SEQ ID No:28 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:963); SEQ ID No:32 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:964); SEQ ID No:36 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:965); SEQ ID No:40 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:966); SEQ ID No:44 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:967); SEQ ID No:48 de WO2016 / 022630 (SEQ ID NO:968).
[0371] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1, conforme divulgado em WO2015/112900, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:38, 50, 82 e 86 de WO 2015/112900:SEQ ID No:38 de WO2015 / 112900 (SEQ ID NO:969); SEQ ID No:50 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:970); SEQ ID No:82 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:971); SEQ ID No:86 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:972); e / ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:42, 46, 54, 58, 62, 66, 70, 74 e 78 de WO 2015/112900:SEQ ID No:42 de WO2015 / 112900 (SEQ ID NO:973); SEQ ID No:46 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:974); SEQ ID No:54 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:975); SEQ ID No:58 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:976); SEQ ID No:62 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:977); SEQ ID No:66 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:978); SEQ ID No:70 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:979); SEQ ID No:74 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:980); SEQ ID No:78 de WO 2015/112900 (SEQ ID NO:981).
[0372] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 divulgados em WO 2010/077634 e US 8. 217. 149, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas,o anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma região cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:20 de WO 2010/077634 (SEQ ID NO:982; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de:SEQ ID No:21 de WO 2010/077634 (SEQ ID NO:983).
[0373] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 obtidos a partir do hibridoma acessível sob os números de depósito de CNCM CNCM I-4122, CNCM I-4080 e CNCM I-4081, conforme divulgado em US 20120039906, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência.
[0374] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende um VHH direcionado contra PD-L1 como divulgado, por exemplo, em US 8. 907. 065 e WO 2008/071447, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, os VHHs contra PD- L1 compreendem SEQ ID NOS:394-399 de US 8. 907. 065:SEQ ID No:394 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:984); SEQ ID No:395 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:985); SEQ ID No:396 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:986); SEQ ID No:397 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:987); SEQ ID No:398 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:988); SEQ ID No:399 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:989).
[0375] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A multiespecífico possui uma ou mais frações de direcionamento direcionadas contra PD-L2. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A tem uma ou mais frações de direcionamento que se ligam seletivamente a um polipeptídeo PD-L2. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um ou mais anticorpos, derivados ou formatos de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos ou proteínas de fusão que se ligam seletivamente a um polipeptídeo PD-L2.
[0376] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende um VHH direcionado contra PD-L2 como divulgado, por exemplo, em US 8. 907. 065 e WO 2008/071447, cujas divulgações totais são aqui incorporadas por referência. Em modalidades ilustrativas, os VHHs contra PD-1 compreendem SEQ ID Nos:449-455 de US 8. 907. 065:SEQ ID No:449 de US 8.
907. 065 (SEQ ID NO:990); SEQ ID No:450 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:991); SEQ ID No:451 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:992); SEQ ID No:452 de US 8.
907. 065 (SEQ ID NO:993); SEQ ID No:453 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:994); SEQ ID No:454 de US 8. 907. 065 (SEQ ID NO:995); SEQ ID No:455 de US 8.
907. 065 (SEQ ID NO:996).
[0377] Em uma modalidade, a fração de direcionamento compreende qualquer um dos anticorpos anti-PD-L2, conforme divulgado em US2011 / 0271358 e WO2010 / 036959, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em modalidades ilustrativas, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nos métodos aqui fornecidos compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:43-47 de US2011 / 0271358:SEQ ID No:43 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:997):SEQ ID No:44 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:998); SEQ ID No:45 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:999); SEQ ID No:46 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:1000); SEQ ID No:47 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:1001); e / ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos:48- 51 de US2011 / 0271358:SEQ ID No:48 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:1002); SEQ ID No:49 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:1003); SEQ ID No:50 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:1004); SEQ ID No:51 de US2011/0271358 (SEQ ID NO:1005).
[0378] Em várias modalidades, as frações de direcionamento da invenção podem compreender uma sequência que direciona PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2 que é pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 61%, pelo menos cerca de 62%, pelo menos cerca de 63%, pelo menos cerca de 64%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 66%, pelo menos cerca de 67%, pelo menos cerca de 68%, pelo menos cerca de 69%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 71%, pelo menos cerca de 72%, pelo menos cerca de 73%, pelo menos cerca de 74%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 76%, pelo menos cerca de 77%, pelo menos cerca de 78%, pelo menos cerca de 79%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das sequências aqui divulgadas (por exemplo, uma cerca de 60, ou cerca de 61%, ou cerca de 62%, ou cerca de 63%, ou cerca de 64%, ou cerca de 65%, ou cerca de 66%, ou cerca de 67%, ou cerca de 68%, ou cerca de 69%, ou cerca de 70%, ou cerca de 71%, ou cerca de 72%, ou cerca de 73%, ou cerca de 74%, ou cerca de 75%, ou cerca de 76%, ou cerca de 77%, ou cerca de 78%, ou cerca de 79%, ou cerca de 80%, ou cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou cerca de 88%, ou cerca de 89%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências aqui divulgadas).
[0379] Em várias modalidades, as frações de direcionamento da invenção podem compreender qualquer combinação de cadeia pesada, cadeia leve, região variável de cadeia pesada, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia leve, região determinante de complementaridade (CDR) e sequências de região de estrutura que direcionam PD-1, PD- L1 e / ou PD-L2 como aqui divulgado.
[0380] Anticorpos adicionais, derivados ou formatos de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos ou proteínas de fusão que se ligam ou direcionam seletivamente PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2 são divulgados em WO 2011/066389, US 2008/0025980, US 2013/0034559, US 8. 779. 108, US 2014/0356353, US 8.
609. 089, US 2010/028330, US 2012/0114649, WO 2010/027827, WO 2011,/066342, US 8,907,065, WO 2016/062722, WO 2009/101611, WO2010/027827, WO 2011/066342, WO 2007/005874, WO 2001/014556, US2011/0271358, WO 2010/036959, WO 2010/077634, US 8. 217. 149, US 2012/0039906, WO 2012/145493, US 2011/0318373, US8. 779. 108, US 20140044738, WO 2009/089149, WO 2007/00587, WO 2016061142, WO 2016. 02263, WO 2010/077634 e WO 2015/112900, cujas divulgações completas são aqui incorporadas por referência.
[0381] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da presente tecnologia compreende uma fração de direcionamento contra a proteína regulatória de sinal α-1 (SIRP1α). SIRP1α (também conhecido como SIRPα) pertence a uma família de receptores imunes celulares que engloba membros inibidores (SIRPα), ativadores (SIRPβ), não sinalizantes (SIRPγ) e solúveis (SIRPδ). O SIRP1α é expresso principalmente em células mieloides, incluindo macrófagos, granulócitos, células dendríticas mieloides (DCs), mastócitos e seus precursores, incluindo células-tronco hematopoiéticas. O SIRP1α atua como um receptor inibitório que interage com uma glicoproteína transmembranar CD47 amplamente expressa para regular a fagocitose. Em particular, a ligação de SIRP1α nos macrófagos por CD47 expressa nas células alvo, gera um sinal inibitório que regula negativamente a fagocitose da célula alvo.
[0382] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α é uma fração de direcionamento que reconhece e liga especificamente SIRP1α em macrófagos.
[0383] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α é uma fração de direcionamento que reconhece e liga especificamente SIRP1α em monócitos.
[0384] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α é uma fração de direcionamento que reconhece e se liga especificamente a SIRP1α em TAMs (Macrófagos Associados a Tumores).
[0385] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α é uma fração de direcionamento que reconhece e liga especificamente SIRP1α em células dendríticas, incluindo, sem limitação, cDC2 e pDC.
[0386] Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende uma fração de direcionamento tendo um domínio de reconhecimento que reconhece SIRP1α. Numa modalidade, o domínio de reconhecimento reconhece um ou mais epítopos lineares presentes em SIRP1α. Como aqui utilizado, um epítopo linear refere-se a qualquer sequência contínua de aminoácidos presentes em SIRP1α. Em outra modalidade, o domínio de reconhecimento reconhece um ou mais epítopos conformacionais presentes em SIRP1α. Como utilizado neste documento, um epítopo de conformação refere- se a uma ou mais seções de aminoácidos (que podem ser descontínuos) que formam uma superfície tridimensional com características e / ou formas e / ou estruturas terciárias capazes de serem reconhecidas por um domínio de reconhecimento de antígeno.
[0387] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento SIRP1α pode se ligar às formas de corpo inteiro e / ou maduras e / ou isoformas e / ou variantes de emenda e / ou fragmentos e / ou quaisquer outros análogos, variantes ou mutantes de SIRP1α de ocorrência natural ou sintética. Numa modalidade, o SIRP1α é SIRP1α humano. Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α pode se ligar a qualquer forma do SIRP1α humano, incluindo formas monoméricas, diméricas, heterodiméricas, multiméricas e associadas. Em uma modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α se liga à forma monomérica de SIRP1α. Em outra modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α se liga a uma forma dimérica de SIRP1α.
[0388] Em uma modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um domínio de reconhecimento que reconhece um ou mais epítopos presentes no SIRP1α humano. Em uma modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um domínio de reconhecimento que reconhece SIRP1α humano com uma sequência de peptídeo sinal. Um polipeptídeo SIRP1α humano exemplificativo é SEQ ID NO:1006.
[0389] Em uma modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um domínio de reconhecimento que reconhece SIRP1α humano sem uma sequência de peptídeo sinal. Um polipeptídeo de SIRP1α humano exemplificativo sem uma sequência de peptídeo sinal é SEQ ID NO:1007.
[0390] Em uma modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um domínio de reconhecimento que reconhece um polipeptídeo que codifica a isoforma 2 de SIRP1α humano (SEQ ID NO:1008).
[0391] Em uma modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um domínio de reconhecimento que reconhece um polipeptídeo que codifica a isoforma 4 de SIRP1α humano (SEQ ID NO:1009).
[0392] Em várias modalidades, as frações de direcionamento de SIRP1α podem ser qualquer agente à base de proteína capaz de ligação específica, como um anticorpo ou derivados dos mesmos. Numa modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um anticorpo. Em várias modalidades, o anticorpo é uma proteína multimérica de comprimento completo que inclui duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada inclui uma região variável (por exemplo, VH) e pelo menos três regiões constantes (por exemplo, CH1, CH2 e CH3), e cada cadeia leve inclui uma região variável (VL) e uma região constante (CL). As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo. Cada região variável compreende três regiões hipervariáveis, também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs), flanqueadas por quatro regiões estruturais relativamente conservadas (FRs). As três CDRs, referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, contribuem para a especificidade de ligação ao anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou humano.
[0393] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento SIRP1α compreende derivados ou formatos de anticorpo. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α é um anticorpo de domínio único, um anticorpo recombinante apenas de cadeia pesada (VHH), um anticorpo de cadeia única (scFv), um anticorpo de cadeia pesada de tubarão (VNAR), uma microproteína (proteína do nó de cisteína, knottin), uma DARPin; uma Tetranectina; um Aficorpo; um Transcorpo; um Anticalina; uma AdNectina; uma Afilina; um Microcorpo; um aptâmero de peptídeo; uma alterase; um anticorpos plástico; um filômero; um estradocorpo; um maxicorpo; um evicorpo; um finômero, uma proteína de repetição do tatu, um domínio de Kunitz, um avímero, um atrímero, um procorpo, um imunocorpo, um triomabe, um troicorpo; um pepcorpo; um vacicorpo, um UniCorpo; Afímeros, um DuoCorpo, um Fv, um Fab, um Fab′, um F(ab′)2, uma molécula mimética peptídica ou uma molécula sintética, conforme descrito em Patente US ou Publicação de Patente US
7.417.130, US 2004/132094, US 5.831.012, US 2004/023334, US 7.250.297, US
6.818.418, US 2004/209243, US 7.838.629, US 7.186.524, US 6.004.746, US
5.475.096, US 2004/146938, US 2004/157209, US 6.994.982, US 6.794.144, US 2010 / 239633, US 7.803.907, US 2010/119446 e / ou US 7.166.697, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Ver também, Storz MAbs. 2011 May-Jun; 3(3):310–317.
[0394] Em uma modalidade, o direcionamento de SIRP1α compreende um anticorpo de domínio único, como o VHH de, por exemplo, um organismo que produz o anticorpo VHH, como um camelídeo, um tubarão ou um VHH projetado. Os VHHs são proteínas terapêuticas derivadas de anticorpos que contêm as propriedades estruturais e funcionais únicas dos anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. A tecnologia VHH é baseada em anticorpos totalmente funcionais de camelídeos que não possuem cadeias leves. Esses anticorpos de cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3).
[0395] Numa modalidade, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um VHH. Em algumas modalidades, o VHH é um VHH humanizado ou VHH camelizado.
[0396] Em algumas modalidades, o VHH compreende um domínio VH totalmente humano, por exemplo um HUMABODY (Crescendo Biologics, Cambridge, Reino Unido). Em algumas modalidades, o domínio VH totalmente humano, por exemplo um HUMABODY é monovalente, bivalente ou trivalente. Em algumas modalidades, o domínio VH totalmente humanopor exemplo, um HUMABODY é mono- ou multi-específico, como monoespecífico, biespecífico ou triespecífico. Domínios VH totalmente humanos ilustrativos, por exemplo um HUMABODIES são descritos em, por exemplo, WO 2016 / 113555 e WO2016 / 113557, cuja divulgação inteira é incorporada por referência.
[0397] Por exemplo, em algumas modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um ou mais anticorpos, derivados ou formatos de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos, VHHs ou proteínas de fusão que se ligam seletivamente a SIRP1α. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende um anticorpo ou derivado do mesmo que se liga especificamente a SIRP1α. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α é um anticorpo de cadeia pesada de camelídeo (VHH) que se liga especificamente a SIRP1α.
[0398] Em várias modalidades, as frações de direcionamento de SIRP1α podem compreender qualquer combinação de região variável de cadeia pesada, cadeia leve, cadeia pesada, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia leve, região determinante de complementaridade (CDR) e sequências de região de estrutura que são conhecidas por reconhecer e se ligar a SIRP1α.
[0399] Em várias modalidades, a presente tecnologia contempla o uso de quaisquer análogos naturais ou sintéticos, mutantes, variantes, alelos, homólogos e ortólogos (aqui referidos coletivamente como "análogos") da fração de direcionamento de SIRP1α aqui descrita. Em várias modalidades, a sequência de aminoácidos da fração de direcionamento de SIRP1α inclui ainda um análogo de aminoácido, um derivado de aminoácido ou outros aminoácidos não clássicos.
[0400] Em várias modalidades, as frações de direcionamento de SIRP1α compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo uma ou mais mutações de aminoácidos em relação a qualquer sequência de fração de direcionamento que é conhecida por reconhecer e se ligar a SIRP1α. Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α compreende uma sequência de aminoácidos tendo uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez, ou quinze, vinte, trinta, quarenta ou cinquenta mutações de aminoácidos em relação a qualquer sequência da fração de direcionamento, que é conhecida por reconhecer e se ligar a SIRP1α. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser selecionadas independentemente de substituições, inserções, deleções e truncamentos.
[0401] Em algumas modalidades, as mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos e podem incluir substituições conservadoras e / ou não conservadoras.
[0402] As "substituições conservadoras" podem ser feitas, por exemplo, com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos de aminoácidos envolvidos. Os 20 aminoácidos de ocorrência natural podem ser agrupados nos seguintes seis grupos padrão de aminoácidos:(1) hidrofóbico:Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos:Asp, Glu; (4) básicos:His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia:Gli, Pro; e (6) aromáticos:Trp, Tyr, Phe.
[0403] Como utilizado neste documento, "substituições conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado dentro do mesmo grupo dos seis grupos de aminoácidos padrão mostrados acima. Por exemplo, a troca de Asp por Glu mantém uma carga negativa no polipeptídeo assim modificado. Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas entre si com base na sua capacidade de interromper as hélices α.
[0404] Como utilizado neste documento, "substituições não conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado em um grupo diferente dos seis grupos de aminoácidos padrão (1) a (6) mostrados acima.
[0405] Em várias modalidades, as substituições também podem incluir aminoácidos não clássicos. Aminoácidos não clássicos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, selenocisteína, pirrolisina, N-β-alanina de formilmetionina, GABA e ácido δ-aminolevulínico, ácido 4-aminobenzoico (PABA), D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, Ácido 2-amino-butírico, γ-Abu, ε-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosme, citrulina,
homocitrulina, ácido cisteico, T-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclo- hexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos projetados, tais como β-metil aminoácidos, α-metil aminoácidos, N α-metil aminoácidos e análogos de aminoácidos em geral.
[0406] Em várias modalidades, a mutação de aminoácido pode estar nas CDRs da fração de direcionamento (por exemplo, as regiões CDR1, CDR2 ou CDR3). Em outra modalidade, a alteração de aminoácidos pode estar nas regiões estruturais (FRs) da fração de direcionamento (por exemplo, nas regiões FR1, FR2, FR3 ou FR4).
[0407] A modificação das sequências de aminoácidos pode ser alcançada utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio ou mutagênese baseada em PCR. Essas técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989 and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.,
1989.
[0408] Em várias modalidades, as mutações não reduzem substancialmente a capacidade da unidade de direcionamento de SIRP1α de reconhecer e se ligar especificamente a SIRP1α. Em várias modalidades, as mutações não reduzem substancialmente a capacidade da fração de direcionamento de SIRP1α de se ligar especificamente a SIRP1α e sem modular funcionalmente (por exemplo, neutralização parcial ou totalmente) de SIRP1α.
[0409] Em várias modalidades, a fração de direcionamento SIRP1α se liga, mas não modula funcionalmente o antígeno de interesse, isto é, SIRP1α. Por exemplo, em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α simplesmente direciona o antígeno, mas não modula substancialmente funcionalmente (por exemplo, inibe substancialmente, reduz ou neutraliza) um efeito biológico que o antígeno tem. Em várias modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α se liga a um epítopo que é fisicamente separado de um sítio de antígeno que é importante para sua atividade biológica (por exemplo, um sítio ativo de um antígeno).
[0410] Em outras modalidades, a fração de direcionamento de SIRP1α se liga e modula funcionalmente o antígeno de interesse, isto é, SIRP1α. Por exemplo, em várias modalidades, a fração de direcionamento dee SIRP1α direciona o antígeno, isto é, SIRP1α, e modula funcionalmente (por exemplo, inibe, reduzi ou neutraliza) um efeito biológico que o antígeno tem. Essa ligação, juntamente com a modulação funcional, pode ser útil em várias modalidades da presente invenção, incluindo métodos nos quais a presente proteína quimérica é usada para recrutar direta ou indiretamente células imunes ativas para um sítio de necessidade através de um antígeno efetor.
[0411] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento tendo um domínio de reconhecimento de antígeno que se liga especificamente a XCR1, por exemplo, em DCs. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A multiespecífico da invenção compreende uma fração de direcionamento tendo um domínio de reconhecimento de antígeno que compreende todo ou parte de XCL1.
[0412] Em várias modalidades, os agentes de ligação de Clec9A multiespecíficos têm frações de direcionamento com domínios de reconhecimento que se ligam especificamente a um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) que faz parte de uma estrutura não celular. Em algumas modalidades, o antígeno ou receptor não é um componente integral de uma célula ou estrutura celular intacta. Em algumas modalidades, o antígeno ou receptor é um antígeno ou receptor extracelular. Em algumas modalidades, o alvo é um marcador não proteico e não celular, incluindo, sem limitação, ácidos nucleicos, inclusive DNA ou RNA, como, por exemplo, DNA liberado a partir de células tumorais necróticas ou depósitos extracelulares, como o colesterol.
[0413] Em algumas modalidades, o alvo (por exemplo, antígeno, receptor) de interesse faz parte do componente não celular do estroma ou da matriz extracelular (ECM) ou dos marcadores associados a ele. Como utilizado neste documento, estroma refere-se à estrutura conectiva e de suporte de um tecido ou órgão. O estroma pode incluir uma compilação de células como fibroblastos / miofibroblastos, glial, epitélio, gordura, imune, vascular, músculo liso e células imunes, juntamente com a matriz extracelular (ECM) e moléculas extracelulares. Em várias modalidades, o alvo (por exemplo, antígeno, receptor) de interesse faz parte do componente não celular do estroma, como a matriz extracelular e moléculas extracelulares. Como utilizado neste documento, a ECM refere-se aos componentes não celulares presentes em todos os tecidos e órgãos. A ECM é composta por uma grande coleção de componentes bioquimicamente distintos, incluindo, sem limitação, proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos e polissacarídeos. Esses componentes da ECM são geralmente produzidaos por células adjacentes e secretados na ECM por exocitose. Uma vez secretados, os componentes do ECM geralmente se agregam para formar uma rede complexa de macromoléculas. Em várias modalidades, a proteína quimérica da invenção compreende uma fração de direcionamento que reconhece um alvo (por exemplo, um antígeno ou receptor ou molécula não proteica) localizado em qualquer componente da ECM. Os componentes ilustrativos da ECM incluem, sem limitação, os proteoglicanos, os polissacarídeos não proteoglicanos, as fibras e outras proteínas da ECM ou as não proteínas da ECM, por exemplo, polissacarídeos e / ou lipídeos ou moléculas associadas à ECM (por exemplo, proteínas ou não proteínas, por exemplo, polissacarídeos, ácidos nucleicos e / ou lipídeos).
[0414] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) nos proteoglicanos da ECM. Proteoglicanos são proteínas glicosiladas. A unidade proteoglicana básica inclui uma proteína principal com uma ou mais cadeias de glicosaminoglicano covalentemente ligadas (GAG). Os proteoglicanos têm uma carga negativa líquida que atrai íons de sódio com carga positiva (Na+), que atrai moléculas de água por osmose, mantendo a ECM e as células residentes hidratadas. Os proteoglicanos também podem ajudar a capturar e armazenar fatores de crescimento na ECM. Os proteoglicanos ilustrativos que podem ser direcionados pelas proteínas quiméricas da invenção incluem, mas não estão limitados a, sulfato de heparano, sulfato de condroitina e sulfato de queratano. Numa modalidade, a fração de direcionamento reconhece um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) em polissacarídeos não proteoglicanos, como o ácido hialurônico.
[0415] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um alvo (por exemplo, antígeno, receptor) nas fibras da ECM. As fibras da ECM incluem fibras de colágeno e fibras de elastina. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um ou mais epítopos em colágenos ou fibras de colágeno. Os colágenos são as proteínas mais abundantes na ECM. Os colágenos estão presentes na ECM como proteínas fibrilares e fornecem suporte estrutural às células residentes. Em uma ou mais modalidades, a fração de direcionamento reconhece e se liga a vários tipos de colágenos presentes na ECM, incluindo, sem limitação, colágenos fibrilares (tipos I, II, III, V, XI), colágeno facitativo (tipos IX, XII, XIV), colágenos de cadeia curta (tipos VIII, X), colágeno da membrana basal (tipo IV) e / ou colágeno tipos VI, VII ou XIII. As fibras de elastina fornecem elasticidade aos tecidos, permitindo que se estiquem quando necessário e depois retornem ao seu estado original. Em algumas modalidades, a fração de reconhecimento reconhece um ou mais epítopos nas fibras de elastina ou elastina.
[0416] Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece uma ou mais proteínas de ECM incluindo, mas não se limitando a, uma tenascina, uma fibronectina, uma fibrina, uma laminina, ou uma nidogena/entactina.
[0417] Numa modalidade, a fração de direcionamento reconhece e se liga à tenascina. A família de glicoproteínas da tenascina (TN) inclui pelo menos quatro membros, tenascina-C, tenascina-R, tenascina-X e tenascina W. As estruturas primárias das proteínas da tenascina incluem vários motivos comuns ordenados na mesma sequência consecutiva: repetições do heptado amino-terminal, repetições do tipo fator de crescimento epidérmico (EGF), repetições do domínio de fibronectina tipo III e domínio globular do tipo carboxil- terminal do fibrinogênio. Cada membro proteico está associado a variações típicas no número e natureza de repetições do tipo EGF e fibronectina tipo III. As variantes de isoformas também existem particularmente em relação à tenascina- C. São conhecidas mais de 27 variantes de emenda e / ou isoformas da tenascina-C. Numa modalidade particular, a fração de direcionamento reconhece e se liga à tenascina-CA1. Da mesma forma, a tenascina-R também possui várias variantes de emenda e isoformas. A tenascina-R geralmente existe como dímeros ou trímeros. A tenascina-X é o maior membro da família das tenascinas e é conhecida por existir como trímeros. Tenascina-W existe como trímeros. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um ou mais epítopos em uma proteína tenascina. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece as formas monoméricas e / ou diméricas e / ou triméricas e / ou hexaméricas de uma proteína tenascina.
[0418] Numa modalidade, as frações de direcionamento reconhecem e se ligam à fibronectina. As fibronectinas são glicoproteínas que conectam células com fibras de colágeno na ECM, permitindo que as células se movam através da ECM. Após ligação às integrinas, as fibronectinas se desdobram para formar dímeros funcionais. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece as formas monoméricas e / ou diméricas da fibronectina. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um ou mais epítopos na fibronectina. Em modalidades ilustrativas, a fração de direcionamento reconhece o domínio extracelular A da fibronectina (EDA) ou o domínio extracelular B da fibronectina (EDB). Níveis elevados de EDA estão associados a várias doenças e distúrbios, incluindo psoríase, artrite reumatoide, diabetes e câncer. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece a fibronectina que contém a isoforma EDA e pode ser utilizada para direcionar a proteína quimérica para células doentes, incluindo células cancerígenas. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece a fibronectina que contém a isoforma EDB. Em várias modalidades, essas frações de direcionamento podem ser utilizadas para direcionar a proteína quimérica para células tumorais, incluindo a neovasculatura do tumor.
[0419] Numa modalidade, a fração de direcionamento reconhece e se liga à fibrina. A fibrina é outra substância proteica frequentemente encontrada na rede matricial da ECM. A fibrina é formada pela ação da protease trombina no fibrinogênio, que causa a polimerização da fibrina. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um ou mais epítopos na fibrina. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece as formas monoméricas e polimerizadas de fibrina.
[0420] Numa modalidade, a fração de direcionamento reconhece e se liga à laminina. A laminina é um componente importante da lâmina basal, que é uma base da rede de proteínas para células e órgãos. As lamininas são proteínas heterotriméricas que contêm uma cadeia α, uma cadeia β e uma cadeia γ. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece um ou mais epítopos na laminina. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece as formas monomérica, dimérica e trimérica da laminina.
[0421] Numa modalidade, a fração de direcionamento reconhece e se liga a um nidogênio ou entactina. Os nidogênios / entactinas são uma família de glicoproteínas sulfatadas e altamente conservadas. Eles compõem o principal componente estrutural das membranas basais e funcionam para ligar as redes laminina e colágeno IV nas membranas basais. Os membros desta família incluem o nidogênio-1 e o nidogênio-2. Em várias modalidades, a fração de direcionamento reconhece um epítopo no nidogênio-1 e / ou nidogênio-2.
[0422] Em várias modalidades, a fração de direcionamento compreende um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece um epítopo presente em qualquer um dos alvos (por exemplo, proteínas ECM) aqui descritas. Numa modalidade, o domínio de reconhecimento de antígeno reconhece um ou mais epítopos lineares presentes na proteína. Como aqui utilizado, um epítopo linear refere-se a qualquer sequência contínua de aminoácidos presentes na proteína. Em outra modalidade, o domínio de reconhecimento de antígeno reconhece um ou mais epítopos conformacionais presentes na proteína. Como utilizado neste documento, um epítopo de conformação refere-se a uma ou mais seções de aminoácidos (que podem ser descontínuos) que formam uma superfície tridimensional com características e / ou formas e / ou estruturas terciárias capazes de serem reconhecidas por um domínio de reconhecimento de antígeno.
[0423] Em várias modalidades, a fração de direcionamento pode se ligar às formas completas e / ou maduras e / ou isoformas e / ou variantes de emenda e / ou fragmentos e / ou quaisquer outros análogos, variantes ou mutantes naturais ou sintéticos de qualquer um dos alvos (por exemplo, proteínas ECM) aqui descritos. Em várias modalidades, a fração de direcionamento pode se ligar a qualquer forma das proteínas aqui descritas, incluindo formas monoméricas, diméricas, triméricas, tetraméricas, heterodiméricas, multiméricas e associadas. Em várias modalidades, a fração de direcionamento pode se ligar a quaisquer formas pós-traducionais modificadas das proteínas aqui descritas, como formas glicosiladas e / ou fosforiladas.
[0424] Em várias modalidades, a fração de direcionamento compreende um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece moléculas extracelulares, como DNA. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento compreende um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece o DNA. Numa modalidade, o DNA é derramado no espaço extracelular a partir de células tumorais necróticas ou apoptóticas ou outras células doentes.
[0425] Em várias modalidades, a fração de direcionamento compreende um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece uma ou mais estruturas não celulares associadas a placas ateroscleróticas. São conhecidos dois tipos de placas ateroscleróticas. A placa fibro-lipídica (fibro-
gordurosa) é caracterizada por um acúmulo de células carregadas de lipídeos sob a íntima das artérias. Abaixo do endotélio, há uma tampa fibrosa cobrindo o núcleo ateromatoso da placa. O núcleo inclui células carregadas de lipídeos (macrófagos e células musculares lisas) com alto teor de colesterol no tecido e éster de colesterol, fibrina, proteoglicanos, colágeno, elastina e detritos celulares. Em placas avançadas, o núcleo central da placa geralmente contém depósitos extracelulares de colesterol (liberados de células mortas), que formam áreas de cristais de colesterol com fendas vazias em forma de agulha. Na periferia da placa existem células espumosas e capilares mais jovens. Uma placa fibrosa também está localizada sob a íntima, dentro da parede da artéria, resultando em espessamento e expansão da parede e, às vezes, estreitamento localizado e irregular do lúmen com alguma atrofia da camada muscular. A placa fibrosa contém fibras de colágeno (eosinofílica), precipitados de cálcio (hematoxilinofílico) e células carregadas de lipídeos. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece e se liga a um ou mais dos componentes não celulares dessas placas, como fibrina, proteoglicanos, colágeno, elastina, detritos celulares e cálcio ou outros depósitos ou precipitados minerais. Em algumas modalidades, os detritos celulares são um ácido nucleico, por exemplo, DNA ou RNA, liberado a partir de células mortas.
[0426] Em várias modalidades, a fração de direcionamento compreende um domínio de reconhecimento de antígeno que reconhece uma ou mais estruturas não celulares encontradas nas placas cerebrais associadas a doenças neurodegenerativas. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece e se liga a uma ou mais estruturas não celulares localizadas nas placas amiloides encontradas no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer. Por exemplo, a fração de direcionamento pode reconhecer e se ligar ao peptídeo amiloide beta, que é um componente principal das placas amiloides. Em algumas modalidades, a fração de direcionamento reconhece e se liga a uma ou mais estruturas não celulares localizadas nas placas do cérebro encontradas em pacientes com doença de Huntington. Em várias modalidades,
a fração de direcionamento reconhece e se liga a uma ou mais estruturas não celulares encontradas em placas associadas a outras doenças neurodegenerativas ou músculo-esqueléticas, como demência corporal de Lewy e miosite do corpo de inclusão.
[0427] Ligantes e grupos funcionais
[0428] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A pode incluir um ou mais grupos funcionais, resíduos ou frações. Em várias modalidades, o um ou mais grupos funcionais, resíduos ou porções são ligados ou fundidos geneticamente a qualquer um dos agentes de sinalização ou frações de direcionamento descritas aqui. Em algumas modalidades, esses grupos funcionais, resíduos ou frações conferem uma ou mais propriedades ou funcionalidades desejadas ao agente de ligação a Clec9A da invenção. Exemplos de tais grupos funcionais e de técnicas para introduzi-los no agente de ligação a Clec9A são conhecidos na técnica, por exemplo, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).
[0429] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A pode por conjugado e / ou fundido com outro agente para prolongar a meia-vida ou melhorar as propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A pode ser fundido ou conjugado com um ou mais de PEG, XTEN (por exemplo, como rPEG), ácido polissiálico (POLYXEN), albumina (por exemplo, albumina sérica humana ou HAS), proteína semelhante à elastina (ELP), PAS, HAP, GLK, CTP, transferrina e semelhantes. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A pode ser fundido ou conjugado com um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, como um fragmento Fc. Por exemplo, a proteína quimérica pode ser fundida ao terminal N ou ao terminal C do domínio Fc da imunoglobulina humana (Ig) G. Em várias modalidades, cada uma das proteínas quiméricas individuais é fundida com um ou mais dos agentes descritos em BioDrugs (2015) 29:215–239, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0430] Em algumas modalidades, os grupos funcionais, resíduos ou frações compreendem um polímero farmacologicamente aceitável adequado, como poli(etilenoglicol) (PEG) ou derivados dos mesmos (como metoxipoli(etilenoglicol) ou mPEG). Em algumas modalidades, a ligação da fração PEG aumenta a meia-vida e / ou reduz a imunogenicidade da proteína de ligação a Clec9A. Geralmente, qualquer forma adequada de peguilação pode ser usada, como a peguilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, anticorpos de domínio único, como VHHs); ver, por exemplo, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); por Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), por Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) e em WO / 04060965, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência. Vários reagentes para a peguilação de proteínas também estão disponíveis comercialmente, por exemplo, na Nektar Therapeutics, EUA. Em algumas modalidades, a pegilação direcionada ao sítio é usada, em particular por meio de um resíduo de cisteína (ver, por exemplo, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003), cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência). Por exemplo, para este fim, o PEG pode ser ligado a um resíduo de cisteína que ocorre naturalmente no agente de ligação a Clec9A da invenção. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção é modificado para introduzir adequadamente um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG pode ser fundida ao amino e / ou terminal carboxi do agente de ligação a Clec9A, utilizando técnicas conhecidas na técnica.
[0431] Em algumas modalidades, os grupos funcionais, resíduos ou frações compreendem glicosilação ligada a N ou ligada a O. Em algumas modalidades, a glicosilação ligada a N ou ligada a O é introduzida como parte de uma modificação co-traducional e / ou pós-traducional.
[0432] Em algumas modalidades, os grupos funcionais, resíduos ou frações compreendem uma ou mais etiquetas detectáveis ou outros grupos ou frações geradores de sinal. Marcadores e técnicas adequados para anexá- los, usá-los e detectá-los são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, marcadores fluorescentes (como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, fitoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina e metais fluorescentes como Eu ou outros metais da série dos lantanídeos), marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminescentes ou marcadores bioluminescentes (como luminal, isoluminol, éster acridinium teromático, imidazol, sais de acridinium, éster oxalato, dioxetano ou GFP e seus análogos), rádio-isótopos, metais, quelatos de metais ou cátions metálicos ou outros metais ou cátions metálicos que são particularmente adequados para uso em diagnóstico e imageamento in vivo, in vitro ou in situ, bem como cromóforos e enzimas (como malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-V- esteroide isomerase, álcool de levedura desidrogenase, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, biotinavidina peroxidase, peroxidase de rabanete, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-VI-fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolina esterase). Outros marcadores adequados incluem frações que podem ser detectadas usando espectroscopia de NMR ou ESR. Tais VHHs e polipeptídeos marcados da invenção podem, por exemplo, ser usados para ensaios in vitro, in vivo ou in situ (incluindo imunoensaios conhecidos per se, como ELISA, RIA, EIA e outros "ensaios em sanduíche", etc.) também para fins de diagnóstico e imageamento in vivo, dependendo da escolha do marcador específico.
[0433] Em algumas modalidades, os grupos funcionais, resíduos ou frações compreendem uma etiqueta que é anexada ou fundida geneticamente ao agente de ligação a Clec9A. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A pode incluir uma única etiqueta ou múltiplas etiquetas. A etiqueta, por exemplo, é um peptídeo, açúcar ou molécula de DNA que não inibe ou impede a ligação do agente de ligação a Clec9A a Clec9A ou a qualquer outro antígeno de interesse, como antígenos tumorais. Em várias modalidades, a etiqueta tem pelo menos cerca de: três a cinco aminoácidos, cinco a oito aminoácidos, oito a doze aminoácidos, doze a quinze aminoácidos ou quinze a vinte aminoácidos. Etiquetas ilustrativas são descritas, por exemplo, emPublicação de Patente US US2013 / 0058962. Em algumas modalidades, a etiqueta é uma etiqueta de afinidade, como a etiqueta glutationa-S-transferase (GST) e histidina (His). Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende uma etiqueta His.
[0434] Em algumas modalidades, os grupos funcionais, resíduos ou frações compreendem um grupo quelante, por exemplo, para quelar um dos metais ou cátions metálicos. Grupos quelantes adequados, por exemplo, incluem, sem limitação, ácido dietil-enetriamina-pentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
[0435] Em algumas modalidades, os grupos funcionais, resíduos ou frações compreendem um grupo funcional que é uma parte de um par de ligação específico, como o par de ligação biotina-(estreptina)avidina. Um tal grupo funcional pode ser utilizado para ligar o agente de ligação a Clec9A da invenção a outra proteína, polipeptídeo ou composto químico que está ligado à outra metade do par de ligação, isto é, através da formação do par de ligação. Por exemplo, um agente de ligação a Clec9A da invenção pode ser conjugado com biotina e ligado a outra proteína, polipeptídeo, composto ou transportador conjugado com avidina ou estreptavidina. Por exemplo, um tal agente de ligação a Clec9A conjugado pode ser usado como repórter, por exemplo, em um sistema de diagnóstico onde um agente produtor de sinal detectável é conjugado com avidina ou estreptavidina. Tais pares de ligação podem, por exemplo, também ser utilizados para ligar o agente de ligação a Clec9A a um transportador, incluindo veículos adequados para fins farmacêuticos. Um exemplo não limitativo são as formulações lipossômicas descritas por Cao and Suresh, Journal of Drug Targeting, 8, 4, 257 (2000). Esses pares de ligação também podem ser utilizados para ligar um agente terapeuticamente ativo ao agente de ligação a Clec9A da invenção.
[0436] Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A compreende opcionalmente um ou mais ligantes. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A inclui um ligante que conecta cada região de ligação e / ou frações de direcionamento. Em algumas modalidades, o agente de ligação Clec9A inclui um ligante que conecta cada agente de sinalização e fração de direcionamento (ou, se houver mais de uma fração de direcionamento, um agente sinalizador para uma das frações de direcionamento). Em algumas modalidades, o ligante pode ser utilizado para ligar vários grupos funcionais, resíduos ou frações, como aqui descrito, ao agente de ligação a Clec9A. Em algumas modalidades, o ligante é um único aminoácido ou uma pluralidade de aminoácidos que não afeta ou reduz as características de estabilidade, orientação, ligação, neutralização e / ou depuração das regiões de ligação e da proteína de ligação. Em várias modalidades, o ligante é selecionado de um peptídeo, uma proteína, um açúcar ou um ácido nucleico.
[0437] Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A compreende um ligante que conecta a fração de direcionamento e o agente de sinalização. Em algumas modalidades, a presente proteína quimérica compreende um ligante dentro do agente de sinalização (por exemplo, no caso de TNF de cadeia única, que pode compreender dois ligantes para produzir um trímero).
[0438] A invenção contempla o uso de uma variedade de sequências de ligação. Em várias modalidades, o ligante pode ser derivado de proteínas de múltiplos domínios que ocorrem naturalmente ou são ligantes empíricos como descrito, por exemplo, em Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2):153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65 (10): 1357-1369, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, o ligante pode ser projetado utilizando-se bancos de dados de projeção de ligantes e programa de computador, como os descritos por Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 and Crasto et al., (2000), Protein Eng. 13(5):309- 312, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em várias modalidades, o ligante pode ser funcional. Por exemplo, sem limitação, o ligante pode funcionar para melhorar a dobragem e / ou estabilidade, melhorar a expressão, melhorar a farmacocinética e / ou melhorar a bioatividade do presente agente de ligação a Clec9A.
[0439] Em algumas modalidades, o ligante é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o ligante tem menos do que cerca de 100 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, o ligante pode ter menos do que cerca de 100, cerca de 95, cerca de 90, cerca de 85, cerca de 80, cerca de 75, cerca de 70, cerca de 65, cerca de 60, cerca de 55, cerca de 50, cerca de 45, cerca de 40, cerca de 35, cerca de 30, cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 12, cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o ligante é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o ligante tem mais do que cerca de 100 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, o ligante pode ter mais do que cerca de 100, cerca de 95, cerca de 90, cerca de 85, cerca de 80, cerca de 75, cerca de 70, cerca de 65, cerca de 60, cerca de 55, cerca de 50, cerca de 45, cerca de 40, cerca de 35, cerca de 30, cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 12, cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o ligante é flexível. Em outra modalidade, o ligante é rígido.
[0440] Em algumas modalidades, o comprimento do ligante permite a ligação eficiente de uma fração de direcionamento e do agente de sinalização aos seus receptores. Por exemplo, em algumas modalidades, o comprimento do ligante permite a ligação eficiente de uma das frações de direcionamento e o agente de sinalização aos receptores na mesma célula, bem como a ligação eficiente da outra fração de direcionamento a outra célula. Pares de células ilustrativos são fornecidos em outras partes deste documento.
[0441] Em algumas modalidades, o comprimento do ligante é pelo menos igual à distância mínima entre os sítios de ligação de uma das frações de direcionamento e o agente de sinalização para os receptores na mesma célula. Em algumas modalidades, o comprimento do ligante é pelo menos duas ou três vezes ou quatro vezes ou cinco vezes ou dez vezes, ou vinte vezes ou 25 vezes ou 50 vezes ou cem vezes ou mais a distância mínima entre os sítios de ligação de uma das frações de direcionamento e o agente de sinalização para os receptores na mesma célula.
[0442] Em algumas modalidades, um ligante conecta as duas frações de direcionamento entre si e esse ligante tem um comprimento curto e um ligante conecta uma fração de direcionamento e um agente de sinalização que esse ligante é mais longo que o ligante que liga as duas frações de direcionamento. Por exemplo, a diferença no comprimento de aminoácidos entre o ligante que conecta as duas frações de direcionamento e o ligante que conecta uma fração de direcionamento e um agente de sinalização pode ser de cerca de 100, cerca de 95, cerca de 90, cerca de 85, cerca de 80, cerca de 75, cerca de 70, cerca de 65, cerca de 60, cerca de 55, cerca de 50, cerca de 45, cerca de 40, cerca de 35, cerca de 30, cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 12, cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante é flexível. Em outra modalidade, o ligante é rígido.
[0443] Em várias modalidades, o ligante é substancialmente constituído por resíduos de glicina e serina (por exemplo, cerca de 30%, ou cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95% ou cerca de 97% de glicinas e serinas). Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é (Gly4Ser)n, onde n é de cerca de 1 a cerca de 8, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 (SEQ ID NOs:1010-1017). Em uma modalidade, a sequência do ligante é GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:1018). Ligantes ilustrativos adicionais incluem, mas não estão limitados a, ligantes com a sequência LE, GGGGS (SEQ ID NO:1010), (GGGGS)n (n=1-4) (SEQ ID NOs:1010-1013), (Gly)8 (SEQ ID NO:1019), (Gly)6 (SEQ ID NO:1020), (EAAAK)n (n=1-3) (SEQ ID NOs:1021-1023):,A(EAAAK)nA (n = 2-5) (SEQ ID NO:1024-1027), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO:1024), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A (SEQ ID NO:1028), PAPAP (SEQ ID NO:1029), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:1030), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO:1031), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO:1032) e (XP)n, com X designando qualquer aminoácido, por exemplo, Ala, Lys ou Glu. Em várias modalidades, o ligante é (GGS)n (n = 1-20) (SEQ ID NO:1033 - SEQ ID NO:1052). Em algumas modalidades, o ligante é G. Em algumas modalidades, o ligante é AAA. Em algumas modalidades, o ligante é (GGGGS)n (n = 9-20) (SEQ ID NOs:1053- 1064).
[0444] Em algumas modalidades, o ligane é um ou mais de GGGSE (SEQ ID NO:1065), GSESG (SEQ ID NO:1066), GSEGS (SEQ ID NO:1067), GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS (SEQ ID NO:1068) e um ligante de G, S e E aleatoriamente colocados a cada 4 intervalos de aminoácidos.
[0445] Em algumas modalidades, um agente de ligação a Clec9A está ligado a um agente de sinalização modificado. Em várias modalidades exemplificativas, o agente de ligação a Clec9A está ligado a um IFNα2 modificado. A título de exemplo, em algumas modalidades, um agente de ligação a Clec9A ligado a um IFNα2 modificado é representado como R1CHCL50- ligante-hIFNα2_R149A ou 3LEC89-ligante-hIFNα2_R149A, em que o ligante é qualquer um dos ligantes divulgados acima.
[0446] Em algumas modalidades, o ligante é uma região de dobradiça de um anticorpo (por exemplo, de IgG, IgA, IgD e IgE, incluindo subclasses (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e IgA1 e IgA2)). Em várias modalidades, o ligante é uma região de dobradiça de um anticorpo (por exemplo, de IgG, IgA, IgD e IgE, incluindo subclasses (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e IgA1 e IgA2)). A região de dobradiça, encontrada nos anticorpos de classe IgG, IgA, IgD e IgE, atua como um espaçador flexível, permitindo que a porção Fab se mova livremente no espaço. Em contraste com as regiões constantes, os domínios das dobradiças são estruturalmente diversos, variando tanto na sequência quanto no comprimento entre as classes e subclasses de imunoglobulinas. Por exemplo, o comprimento e a flexibilidade da região de dobradiça variam entre as subclasses da IgG. A região de dobradiça de IgG1 engloba os aminoácidos 216-231 e, por ser livremente flexível, os fragmentos Fab podem girar em torno de seus eixos de simetria e se mover dentro de uma esfera centrada na primeira das duas pontes de dissulfeto da inter-cadeia pesada. A IgG2 tem uma dobradiça mais curta do que a IgG1, com 12 resíduos de aminoácidos e quatro pontes de dissulfeto. A região de dobradiça da IgG2 não possui um resíduo de glicina, é relativamente curta e contém uma dupla hélice rígida de poli-prolina, estabilizada por pontes de dissulfeto de inter-cadeia pesada extra. Essas propriedades restringem a flexibilidade da molécula da IgG2. A IgG3 difere das outras subclasses pela sua única região de dobradiça estendida (cerca de quatro vezes maior que a dobradiça da IgG1), contendo 62 aminoácidos (incluindo 21 prolinas e 11 cisteínas), formando uma dupla hélice de polipropilina inflexível. Na IgG3, os fragmentos Fab são relativamente distantes do fragmento Fc, proporcionando à molécula maior flexibilidade. A dobradiça alongada da IgG3 também é responsável pelo seu peso molecular mais elevado em comparação com as outras subclasses. A região da dobradiça da IgG4 é mais curta do que a da IgG1 e sua flexibilidade é intermediária entre a da IgG1 e da IgG2. A flexibilidade das regiões de dobradiça diminui na ordem IgG3> IgG1> IgG4> IgG2.
[0447] De acordo com estudos cristalográficos, a região de dobradiça de imunoglobulina pode ser subdividida funcionalmente em três regiões: a região de dobradiça superior, a região central e a região de dobradiça inferior. Ver Shin et al., 1992 Immunological Reviews 130:87. A região de dobradiça superior inclui aminoácidos da extremidade carboxil de C H1 até o primeiro resíduo na dobradiça que restringe o movimento, geralmente o primeiro resíduo de cisteína que forma uma ligação dissulfeto entre as cadeias pesadas. O comprimento da região de dobradiça superior se correlaciona com a flexibilidade segmentar do anticorpo. A região de dobradiça do núcleo contém as pontes de dissulfeto da cadeia inter-pesada, e a região de dobradiça inferior se une à extremidade do terminal amino do domínio CH2e inclui resíduos em CH2. Id. A região central da dobradiça de IgG1 humana de tipo selvagem contém a sequência Cys-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO:1069), que, quando dimerizada pela formação da ligação dissulfeto, resulta em um octapeptídeo cíclico que atua como um pivô, conferindo flexibilidade. Em várias modalidades, o presente ligante compreende, um, dois ou três da região da dobradiça superior, a região central e a região da dobradiça inferior de qualquer anticorpo (por exemplo, de IgG, IgA, IgD e IgE, incluindo subclasses (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e IgA1 e IgA2)). A região de dobradiça também pode conter um ou mais sítios de glicosilação, que incluem vários tipos de sítios estruturalmente distintos para fixação de carboidratos. Por exemplo, IgA1 contém cinco sítios de glicosilação dentro de um segmento de 17 aminoácidos da região de dobradiça, conferindo resistência do polipeptídeo da região de dobradiça às proteases intestinais, considerada uma propriedade vantajosa para uma imunoglobulina secretora. Em várias modalidades, o ligante da presente invenção compreende um ou mais sítios de glicosilação. Em várias modalidades, o ligante é um domínio ligante- CH2-CH3 de um anticorpo de IgG4 humana.
[0448] Se desejado, o presente agente de ligação a Clec9A pode ser ligado a uma região Fc do anticorpo, compreendendo um ou ambos de domínios de CH2 and CH3, e opcionalmente uma região de dobradiça. Por exemplo, os vetores que codificam os presentes agentes de ligação a Clec9A ligados como uma única sequência nucleotídica a uma região Fc podem ser usados para preparar esses polipeptídeos.
[0449] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante sintético, como PEG.
[0450] Em várias modalidades, o ligante pode ser funcional. Por exemplo, sem limitação, o ligante pode funcionar para melhorar a dobragem e / ou estabilidade, melhorar a expressão, melhorar a farmacocinética e / ou melhorar a bioatividade do presente agente de ligação a Clec9A. Em outro exemplo, o ligante pode funcionar para direcionar o agente de ligação a Clec9A para um tipo ou local de célula em particular.
[0451] Modificações e produção de agentes de ligação a Clec9A
[0452] Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende uma fração de direcionamento que é um VHH. Em várias modalidades, o VHH não está limitado a uma fonte biológica específica ou a um método específico de preparação. Por exemplo, o VHH geralmente pode ser obtido:(1) isolando o domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada de ocorrência natural; (2) pela expressão de uma sequência nucleotídica que codifica um domínio VHH de ocorrência natural; (3) por "humanização" de um domínio VHH de ocorrência natural ou pela expressão de um ácido nucleico que codifica tal domínio VHH humanizado; (4) por "camelização" de um domínio VH de ocorrência natural de qualquer espécie animal, como de uma espécie de mamífero, como de um ser humano, ou pela expressão de um ácido nucleico que codifica esse domínio VH camelizado; (5) por "camelização" de um "anticorpo de domínio" ou "Dab", conforme descrito na técnica, ou pela expressão de um ácido nucleico que codifica esse domínio VH camelizado; (6) usando técnicas sintéticas ou semissintéticas para preparar proteínas, polipeptídeos ou outras sequências de aminoácidos conhecidas na técnica; (7) preparando um ácido nucleico que codifica um VHH usando técnicas para síntese de ácidos nucleicos conhecidas na técnica, seguidas pela expressão do ácido nucleico assim obtido; e / ou (8) por qualquer combinação de um ou mais dos seguintes.
[0453] Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende um VHH que corresponde aos domínios V HH de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural dirigidos contra Clec9A humano. Em algumas modalidades, essas sequências de VHHgeralmente podem ser geradas ou obtidas imunizando adequadamente uma espécie de Camelídeo com uma molécula Clec9A, (isto é, de modo a aumentar uma resposta imune e / ou anticorpos da cadeia pesada dirigidos contra Clec9A), obtendo uma amostra biológica adequada do Camelídeo (como uma amostra de sangue ou qualquer amostra de células B) e gerando sequências VHH dirigidas contra Clec9A, a partir da amostra, usando quaisquer técnicas conhecidas adequadas.
Em algumas modalidades, os domínios VHH de ocorrência natural contra Clec9A podem ser obtidos a partir de bibliotecas ingênuas de sequência de VHH de Camelídeo, por exemplo, rastreando uma biblioteca usando Clec9A ou pelo menos uma parte, fragmento, determinante antigênico ou epítopo usando uma ou mais técnicas de rastreamento conhecidas na técnica.
Tais bibliotecas e técnicas são, por exemplo, descritas em WO9937681, WO0190190, WO03025020 e WO03035694, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
Em algumas modalidades, bibliotecas sintéticas ou semissintéticas mehoradas derivadas de bibliotecas de VHH ingênuas podem ser usadas, como bibliotecas de VHH obtidas de bibliotecas VHH por técnicas como mutagênese aleatória e / ou embaralhamento de CDR, como por exemplo, descrito em WO0043507, cujo conteúdo total é incorporado por referência.
Em algumas modalidades, outra técnica para obter sequências VHH dirigidas contra um Clec9A envolve imunizar adequadamente um mamífero transgênico que é capaz de expressar anticorpos de cadeia pesada (isto é, de modo a aumentar uma resposta imune e / ou anticorpos da cadeia pesada direcionados contra Clec9A), obtendo uma amostra biológica adequada do mamífero transgênico (como uma amostra de sangue ou qualquer amostra de células B) e gerando sequências VHH dirigidas contra Clec9A a partir da amostra, utilizando quaisquer técnicas conhecidas adequadas.
Por exemplo, para este fim, os camundongos que expressam anticorpos da cadeia pesada e os métodos e técnicas adicionais descritos em WO02085945 e em WO04049794 (cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência) podem ser utilizados.
[0454] Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende um VHH que foi "humanizado", isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da sequência de VHH de ocorrência natural (e em particular nas sequências estruturais) por uma ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) no domínio VH de um anticorpo convencional de 4 cadeias de um ser humano. Isso pode ser realizado usando técnicas de humanização conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, possíveis substituições humanizantes ou combinações de substituições humanizantes podem ser determinadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por uma comparação entre a sequência de um VHH e a sequência de um domínio VH humano de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as substituições humanizantes são escolhidas de modo que os VHHs humanizados resultantes ainda retenham propriedades funcionais vantajosas. Geralmente, como resultado da humanização, os VHHs da invenção podem se tornar mais "semelhantes a humanos", mantendo ainda propriedades favoráveis, como uma imunogenicidade reduzida, em comparação com os domínios de VHH de ocorrência natural correspondentes. Em várias modalidades, os VHHs humanizados da invenção podem ser obtidos de qualquer maneira adequada conhecida na técnica e, portanto, não são estritamente limitados a polipeptídeos que foram obtidos utilizando um polipeptídeo que compreende um domínio VHH de ocorrência natural como material de partida.
[0455] Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende um VHH que foi "camelizado", isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de um domínio VH de ocorrência natural de um anticorpo convencional de 4 cadeias por um ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada de um camelídeo. Em algumas modalidades, essas substituições "camelizantes" são inseridas nas posições de aminoácidos que se formam e / ou estão presentes na interface VH-
VL e / ou nos chamados resíduos de marca registrada de Camelidae (ver, por exemplo, WO9404678, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência). Em algumas modalidades, a sequência de VH que é usada como material ou ponto de partida para gerar ou projetar o VHH camelizado é uma sequência de VH de um mamífero, por exemplo, a sequência de VH de um ser humano, como uma sequência VH3. Em várias modalidades, os VHHs camelizados podem ser obtidos de qualquer maneira adequada conhecida na técnica (isto é, como indicado nos pontos (1) - (8) acima) e, portanto, não estão estritamente limitados aos polipeptídeos que foram obtidos usando um polipeptídeo que compreende um domínio de VH de ocorrência natural como material de partida.
[0456] Em várias modalidades, "humanização" e "camelização" podem ser realizadas fornecendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, e depois alterando, de uma maneira conhecida na técnica, um ou mais códons na sequência nucleotídica de forma que a nova sequência nucleotídica codifique uma VHH "humanizada" ou "camelizada", respectivamente. Este ácido nucleico pode então ser expresso de uma maneira conhecida na técnica, de modo a fornecer o VHH desejado da invenção. Alternativamente, com base na sequência de aminoácidos de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, a sequência de aminoácidos do VHH humanizado ou camelizado desejada da invenção, respectivamente, pode ser projetada e depois sintetizada de novo usando técnicas para síntese de peptídeos conhecidas na técnica. Além disso, com base na sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, uma sequência nucleotídica que codifica o VHH humanizado ou camelizado desejada, respectivamente, pode ser projetada e sintetizada de novo usando técnicas para síntese de ácidos nucleicos conhecidas na técnica, após as quais o ácido nucleico assim obtido pode ser expresso de uma maneira conhecida na técnica, de modo a proporcionar o VHH desejado da invenção. Outros métodos e técnicas adequados para obter os VHHs da invenção e / ou ácidos nucleicos que os codificam, a partir de sequências de VH ou sequências de VHH de ocorrência natural, são conhecidos na técnica e podem, por exemplo, compreender combinar uma ou mais partes de uma ou mais sequências de VH de ocorrência natural (como uma ou mais sequências de FR e / ou sequências de CDR), uma ou mais partes de uma ou mais sequências de VHH de ocorrência natural (como uma ou mais sequências de FR ou sequências de CDR) e / ou uma ou mais sequências sintéticas ou semissintéticas, de maneira adequada, de modo a fornecer um VHH da invenção ou uma sequência nucleotídica ou ácido nucleico que codifica a mesma.
[0457] Os métodos para produzir os agentes de ligação a Clec9A da invenção são descritos aqui. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam os agentes de ligação a Clec9A da invenção podem ser quimicamente sintetizadas usando métodos conhecidos na técnica. As sequências de DNA sintético podem ser ligadas a outras sequências nucleotídicas apropriadas, incluindo, por exemplo, sequências de controle de expressão, para produzir construtos de expressão genética que codificam os agentes de ligação a Clec9A desejados. Por conseguinte, em várias modalidades, a presente invenção fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o agente de ligação a Clec9A da invenção.
[0458] Os ácidos nucleicos que codificam o agente de ligação a Clec9A da invenção podem ser incorporados (ligados) a vetores de expressão, que podem ser introduzidos nas células hospedeiras através de técnicas de transfecção, transformação ou transdução. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam o agente de ligação a Clec9A da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras por transdução retroviral. Células hospedeiras ilustrativas são células E. coli, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim embrionário humano 293 (HEK 293), células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma. As células hospedeiras transformadas podem ser cultivadas sob condições que permitem que as células hospedeiras expressem os genes que codificam o agente de ligação a Clec9A da invenção. Por conseguinte, em várias modalidades, a presente invenção fornece vetores de expressão compreendendo ácidos nucleicos que codificam o agente de ligação Clec9A da invenção. Em várias modalidades, a presente invenção adicional fornece células hospedeiras compreendendo esses vetores de expressão.
[0459] As condições específicas de expressão e purificação variarão dependendo do sistema de expressão empregado. Por exemplo, se um gene deve ser expresso em E. coli, ele é primeiro clonado em um vetor de expressão, posicionando o gene engenheirado a jusante de um promotor bacteriano adequado, por exemplo, Trp ou Tac, e uma sequência de sinal procariótica. Em outro exemplo, se o gene engenheirado deve ser expresso em células hospedeiras eucarióticas, por exemplo, células CHO, ele é primeiro inserido em um vetor de expressão contendo, por exemplo, um promotor eucariótico adequado, um sinal de secreção, intensificadores e vários íntrons. O construto do gene pode ser introduzido nas células hospedeiras usando técnicas de transfecção, transformação ou transdução.
[0460] O agente de ligação a Clec9A da invenção pode ser produzido através do crescimento de uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica o agente de ligação a Clec9A sob condições que permitem a expressão da proteína. Após a expressão, a proteína pode ser colhida e purificada utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, etiquetas de afinidade, tais como etiquetas de glutationa-S-transferase (GST) e histidina (His) ou por cromatografia. Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende uma etiqueta His. Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A compreende uma etiqueta His e um sítio proteolítico para permitir a clivagem da etiqueta His.
[0461] Por conseguinte, em várias modalidades, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica um agente de ligação a Clec9A da presente invenção. Em várias modalidades, a presente invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica um agente de ligação a Clec9A da presente invenção.
[0462] Em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A ou proteína quimérica compreendendo o mesmo pode ser expresso in vivo, por exemplo, em um paciente. Por exemplo, em várias modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A ou proteína quimérica compreendendo o mesmo pode ser administrado na forma de ácido nucleico que codifica os presentes agentes de ligação a Clec9A ou proteínas quiméricas compreendendo o mesmo. Em várias modalidades, o ácido nucleico é DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A ou proteína quimérica compreendendo o mesmo é codificado por um mRNA modificado, isto é, um mRNA compreendendo um ou mais nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, o mRNA modificado compreende uma ou modificações encontradas emPatente US 8. 278. 036, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, o mRNA modificado compreende um ou mais de m5C, m5U, m6A, s2U, Ψ e 2'-O-metil-U. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à administração de um mRNA modificado que codifica uma ou mais das presentes proteínas quiméricas. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a vetores de terapia genética compreendendo os mesmos. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a métodos de terapia genética compreendendo os mesmos. Em várias modalidades, o ácido nucleico está na forma de um vírus oncolítico, por exemplo, um adenovírus, reovírus, sarampo, herpes simplex, vírus da doença de Newcastle ou vaccinia.
[0463] Sais e excipientes farmaceuticamente aceitáveis
[0464] Os agentes de ligação a Clec9A (e / ou quaisquer outros agentes terapêuticos) descritos aqui podem possuir um grupo funcional suficientemente básico, que pode reagir com um ácido inorgânico ou orgânico, ou um grupo carboxil, que pode reagir com uma base inorgânica ou orgânica, para formar um sal farmaceuticamente aceitável. Um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável é formado a partir de um ácido farmaceuticamente aceitável, como é bem conhecido na técnica. Tais sais incluem os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico listados em, por exemplo, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) e The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.),Verlag, Zurich (Switzerland) 2002, que estão incorporados por meio deste em sua totalidade por referência.
[0465] Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, a título de exemplo não limitativo, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, clorofluorobaclorato de sódio, pamo- toluitrossulfonato, clorofluorobaclorato de sódio, pamo-tolueno-sulfato de trifosfato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno- 2-benzoato, isobutirato, fenilbutirato, α-hidroxibutirato, butino-1,4-dicarboxilato, hexino-1,4-dicarboxilato, caprato, caprilato, cinamato hippurato, malato, hidroxialeato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, ftalato, teraphthalato, propiolato, propionato, fenilpropionato, sebacato, suberato, p- bromobenzenossulfonato, clorobenzenossulfonato, etilsulfonato, 2- hidroxietilsulfonato, metilsulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, naftaleno-1,5-sulfonato, xilenosulfonato e tartarato.
[0466] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" também se refere a um sal das composições da presente invenção tendo um grupo funcional ácido, como um grupo funcional ácido carboxílico, e uma base. As bases adequadas incluem, mas não estão limitadas a, hidróxidos de metais alcalinos, como sódio, potássio e lítio; hidróxidos de metais alcalino-terrosos, como cálcio e magnésio; hidróxidos de outros metais, como alumínio e zinco; amoníaco e aminas orgânicas, tais como mono-, di- ou tri-alquilaminas não substituídas ou substituídas por hidroxi, diciclo-hexilamina; tributilamina; piridina; N-metil, N- etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis- ou tris- (2-OH-alquilaminas inferiores), tais como mono-; bis- ou tris- (2-hidroxietil) amina, 2-hidroxi-terc- butilamina ou tris- (hidroximetil) metilamina, N, N-di-alquil inferior-N-(hidroxil- alquil inferior)-aminas, tais como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina ou tri-(2- hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; e aminoácidos, tais como arginina, lisina e semelhantes.
[0467] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas estão na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.
[0468] Composições e Formulações Farmacêuticas
[0469] Em várias modalidades, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo os agentes de ligação Clec9A (e / ou quaisquer outros agentes terapêuticos) aqui descritos e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo os presentes agentes de ligação a Clec9A. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo quaisquer outros agentes terapêuticos aqui descritos. Numa outra modalidade, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo uma combinação dos presentes agentes de ligação a Clec9A e quaisquer outros agentes terapêuticos aqui descritos. Quaisquer composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas a um sujeito como um componente de uma composição que compreende um transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem opcionalmente compreender uma quantidade adequada de um excipiente farmaceuticamente aceitável, de modo a fornecer a forma para administração adequada.
[0470] Em várias modalidades, excipientes farmacêuticos podem ser líquidos, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem animal, vegetal, de petróleo ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral,
óleo de sésamo e semelhantes. Os excipientes farmacêuticos podem ser, por exemplo, salina, goma arábica, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia e similares. Além disso, agentes auxiliares, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes podem ser usados. Em uma modalidade, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são estéreis quando administrados a um sujeito. A água é um excipiente útil quando qualquer agente aqui descrito é administrado por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como excipientes líquidos, especificamente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados também incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. Qualquer agente descrito neste documento, se desejado, também pode compreender quantidades menores de agentes umidificantes ou emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH. Outros exemplos de excipientes farmacêuticos adequados estão descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995), aqui incorporado por referência.
[0471] A presente invenção inclui as composições farmacêuticas descritas (e / ou agentes terapêuticos adicionais) em várias formulações. Qualquer composição farmacêutica inventiva (e / ou agentes terapêuticos adicionais) aqui descrita pode assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, gotas, comprimidos, pílulas, peletes, cápsulas, cápsulas contendo líquidos, cápsulas de gelatina, pós, formulações de liberação sustentada, supositórios, emulsões, aerossóis, sprays, suspensões, pó liofilizado, suspensão congelada, pó dessecado ou qualquer outra forma adequada para uso. Numa modalidade, a composição está na forma de uma cápsula. Numa outra modalidade, a composição está na forma de um comprimido. Em ainda outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada na forma de uma cápsula de gel macio. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada na forma de uma cápsula de gelatina. Em ainda outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada como um líquido.
[0472] Onde necessário, as composições farmacêuticas da invenção (e / ou agentes adicionais) também podem incluir um agente solubilizante. Além disso, os agentes podem ser distribuídos com um veículo ou dispositivo de distribuição adequado, como conhecido na técnica. As terapias combinadas descritas aqui podem ser codistribuídas em um único veículo ou dispositivo de entrega.
[0473] As formulações compreendendo as composições farmacêuticas inventivas (e / ou agentes adicionais) da presente invenção podem ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitárias e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Tais métodos incluem geralmente a etapa de associar os agentes terapêuticos a um transportador, que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Tipicamente, as formulações são preparadas associando uniformemente e intimamente o agente terapêutico a um transportador líquido, um transportador sólido finamente dividido ou ambos, e então, se necessário, moldando o produto em formas de dosagem da formulação desejada (por exemplo, granulação a úmido ou a seco, misturas de pó, etc., seguido de comprimidos usando métodos convencionais conhecidos na técnica).
[0474] Em várias modalidades, quaisquer composições farmacêuticas (e / ou agentes adicionais) aqui descritas são formuladas de acordo com procedimentos de rotina como uma composição adaptada para um modo de administração aqui descrito.
[0475] As vias de administração incluem, por exemplo: oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, retal, por inalação ou tópica. A administração pode ser local ou sistêmica. Em algumas modalidades, a administração é realizada oralmente. Em uma outra modalidade, a administração é por injeção parenteral. O modo de administração pode ser deixado ao critério do médico e depende em parte do local da condição médica. Na maioria dos casos, a administração resulta na liberação de qualquer agente aqui descrito na corrente sanguínea.
[0476] Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A aqui descrito é formulado de acordo com procedimentos de rotina como uma composição adaptada para administração oral. As composições para distribuição oral podem estar na forma de comprimidos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, grânulos, pós, emulsões, cápsulas, xaropes ou elixires, por exemplo. As composições administradas por via oral podem compreender um ou mais agentes opcionais, por exemplo, agentes adoçantes, tais como frutose, aspartame ou sacarina; agentes aromatizantes, tais como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria, ou cereja; agentes corantes; e agentes conservantes, para fornecer uma preparação farmaceuticamente agradável. Além disso, onde na forma de comprimido ou pílula, as composições podem ser revestidas para retardar a desintegração e a absorção no trato gastrointestinal proporcionando, desse modo, uma ação sustentada durante um período prolongado de tempo. Membranas seletivamente permeáveis que circundam um ativo osmoticamente acionador de quaisquer agentes de ligação a Clec9A aqui descritos também são adequadas para composições administradas por via oral. Nestas plataformas posteriores, o fluido do ambiente ao redor da cápsula é embebido pelo composto potente, que incha para deslocar o agente ou a composição agente por uma abertura. Estas plataformas de distribuição podem fornecer um perfil de distribuição de essencialmente ordem zero, em oposição aos perfis de pico ou formulações de liberação imediata. Também pode ser úteis um material com retardo no tempo tal como monoestearato de glicerol ou estearato de glicerol. As composições orais podem incluir excipientes padrão, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, e carbonato de magnésio. Numa modalidade, os excipientes são de grau farmacêutico. As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, como, por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar, tragacanto, etc. e misturas dos mesmos.
[0477] As formas de dosagem adequadas para administração parenteral (por exemplo, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea e intra-articular) incluem, por exemplo, soluções, suspensões, dispersões, emulsões e semelhantes. Eles também podem ser fabricados na forma de composições sólidas estéreis (por exemplo, composição liofilizada), que podem ser dissolvidas ou suspensas em meio injetável estéril imediatamente antes do uso. Eles podem conter, por exemplo, agentes de suspensão ou dispersão conhecidos na técnica. Os componentes da formulação adequados para administração parenteral incluem um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como EDTA; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose.
[0478] Para a administração intravenosa, transportadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou tampão salino fosfato (PBS). O transportador deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra micro-organismos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão incluindo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), e suas misturas apropriadas.
[0479] As composições aqui fornecidas, sozinhas ou em combinação com outros componentes adequados, podem ser transformadas em formulações de aerossol (isto é, "nebulizadas") para serem administradas por inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.
[0480] Quaisquer composições farmacêuticas inventivas (e / ou agentes adicionais) aqui descritas podem ser administradas por meios de liberação controlada ou de liberação sustentada ou por dispositivos de distribuição que são bem conhecidos dos versados na técnica. Os exemplos incluem, mas não se limitam aos descritos emPatentes US 3.845.770; 3.916.899;
3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548;
5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; e 5.733.556, cada uma das quais é incorporada aqui por referência na sua totalidade. Tais formas de dosagem podem ser úteis para fornecer liberação controlada ou sustentada de um ou mais ingredientes ativos usando, por exemplo, hidropropil celulose, hidropropilmetil celulose, polivinilpirrolidona, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos multicamadas, micropartículas, lipossomas, microesferas ou uma combinação dos mesmos para fornecer o perfil de liberação desejado em proporções variadas. Formulações adequadas de liberação controlada ou sustentada conhecidas dos versados na técnica, incluindo as aqui descritas, podem ser prontamente selecionadas para uso com os ingredientes ativos dos agentes aqui descritos. A invenção fornece, assim, formas de dosagem em unidade única apropriadas para administração oral, tais como, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, gelcaps e cápsulas que são adaptadas para liberação controlada ou sustentada.
[0481] A liberação controlada ou sustentada de um ingrediente ativo pode ser estimulada por várias condições, incluindo, entre outras, alterações no pH, mudanças na temperatura, estimulação por um comprimento de onda apropriado da luz, concentração ou disponibilidade de enzimas, concentração ou disponibilidade de água, ou outras condições ou compostos fisiológicos.
[0482] Em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado próximo à área alvo a ser tratada, exigindo apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249:1527-1533) podem ser usados.
[0483] As formulações farmacêuticas são preferencialmente estéreis. A esterilização pode ser realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde a composição é liofilizada, a esterilização por filtro pode ser realizada antes ou após a liofilização e reconstituição.
[0484] Administração e Dosagem
[0485] Será apreciado que a dose real do agente de ligação a Clec9A e / ou quaisquer agentes terapêuticos aqui descritos a serem administrados de acordo com a presente invenção variará de acordo com a forma de dosagem particular e o modo de administração. Muitos fatores que podem modificar a ação do agente de ligação a Clec9A (por exemplo, peso corporal, gênero, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, condição do sujeito, combinações de drogas, disposição genética e sensibilidades de reação) podem ser levado em consideração pelos versados na técnica. A administração pode ser realizada continuamente ou em uma ou mais doses distintas dentro da dose máxima tolerada. As taxas ideais de administração para um determinado conjunto de condições podem ser determinadas pelos versados na técnica usando testes de administração de dosagem convencionais.
[0486] Em algumas modalidades, uma dosagem adequada do agente de ligação a Clec9A e / ou quaisquer agentes terapêuticos aqui descritos está em uma faixa de cerca de 0,01 mg / kg a cerca de 10 g / kg de peso corporal do sujeito, cerca de 0,01 mg / kg a cerca de 1 g / kg de peso corporal do sujeito, cerca de 0,01 mg / kg a cerca de 100 mg / kg de peso corporal do sujeito, cerca de 0,01 mg / kg a cerca de 10 mg / kg de peso corporal do sujeito, por exemplo, cerca de 0,01 mg / kg, cerca de 0,02 mg / kg, cerca de 0,03 mg / kg, cerca de 0,04 mg / kg, cerca de 0,05 mg / kg, cerca de 0,06 mg / kg, cerca de 0,07 mg / kg, cerca de 0,08 mg / kg, cerca de 0,09 mg / kg, cerca de 0,1 mg / kg, cerca de 0,2 mg / kg, cerca de 0,3 mg / kg, cerca de 0,4 mg / kg, cerca de 0,5 mg / kg,
cerca de 0,6 mg / kg, cerca de 0,7 mg / kg, cerca de 0,8 mg / kg, cerca de 0,9 mg / kg, cerca de 1 mg / kg, cerca de 1,1 mg / kg, cerca de 1,2 mg / kg, cerca de 1,3 mg / kg, cerca de 1,4 mg / kg, cerca de 1,5 mg / kg, cerca de 1,6 mg / kg, cerca de 1,7 mg / kg, cerca de 1,8 mg / kg, 1,9 mg / kg, cerca de 2 mg / kg, cerca de 3 mg / kg, cerca de 4 mg / kg, cerca de 5 mg / kg, cerca de 6 mg / kg, cerca de 7 mg / kg, cerca de 8 mg / kg, cerca de 9 mg / k g, cerca de 10 mg / kg de peso corporal, cerca de 100 mg / kg de peso corporal, cerca de 1 g / kg de peso corporal, cerca de 10 g / kg de peso corporal, incluindo todos os valores e faixas intermediários.
[0487] Doses individuais do agente de ligação a Clec9A e / ou qualquer agente terapêutico aqui descrito podem ser administradas em formas de dosagem unitárias contendo, por exemplo, de cerca de 0,01 mg a cerca de 100 g, de cerca de 0,01 mg a cerca de 75 g, de cerca de 0,01 mg a cerca de 50 g, de cerca de 0,01 mg a cerca de 25 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 10 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 7,5 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 5 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 5 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 2,5 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 1 g, cerca de 0,01 mg a cerca de 100 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 90 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 80 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 70 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 60 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 50 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 40 mg de ingrediente ativo, de cerca de 0,1 mg a cerca de 30 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 20 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 5 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 3 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 1 mg por forma de dosagem unitária ou de cerca de 5 mg a cerca de 80 mg por forma de dosagem unitária. Por exemplo, uma forma de dosagem unitária pode ser de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,02 mg, cerca de 0,03 mg, cerca de 0,04 mg, cerca de 0,05 mg, cerca de 0,06 mg, cerca de 0,07 mg, cerca de 0,08 mg, cerca de 0,09 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 0,2 mg, cerca de 0,3 mg, cerca de 0,4 mg, cerca de 0,5 mg, cerca de 0,6 mg, cerca de 0,7 mg, cerca de 0,8 mg, cerca de 0,9 mg, cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 3 mg, cerca de 4 mg,
cerca de 5 mg, cerca de 6 mg, cerca de 7 mg, cerca de 8 mg, cerca de 9 mg cerca de 10 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 500 mg, cerca de 1 g, cerca de 2,5 g, cerca de 5 g, cerca de 10 g, cerca de 25 g, cerca de 50 g, cerca de 75 g, cerca de 100 g, incluindo todos os valores e intervalos intermediários.
[0488] Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A e / ou quaisquer agentes terapêuticos aqui descritos são administrados em uma quantidade de cerca de 0,01 mg a cerca de 100 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 75 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 50 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 25 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 10 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 7,5 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 5 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 2,5 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 1 g por dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 100 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 95 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 90 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 85 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 80 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 75 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 70 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 65 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 60 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 55 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 50 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 45 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 40 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 35 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 30 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 25 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 20 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 15 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 5 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 3 mg por dia, de cerca de 0,1 mg a cerca de 1 mg por dia, ou de cerca de 5 mg a cerca de 80 mg por dia. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A é administrado em uma dose diária de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,02 mg, cerca de 0,03 mg, cerca de 0,04 mg, cerca de 0,05 mg, cerca de 0,06 mg, cerca de 0,07 mg, cerca de 0,08 mg, cerca de 0,09 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 0,2 mg, cerca de 0,3 mg, cerca de 0,4 mg, cerca de 0,5 mg, cerca de 0,6 mg, cerca de 0,7 mg, cerca de 0,8 mg, cerca de 0,9 mg, cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 3 mg, cerca de 4 mg, cerca de 5 mg, cerca de 6 mg, cerca de 7 mg, cerca de 8 mg, cerca de 9 mg cerca de 10 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 500 mg, cerca de 1 g, cerca de 2,5 g, cerca de 5 g, cerca de 7,5 g, cerca de 10 g, cerca de 25 g, cerca de 50 g, cerca de 75 g, cerca de 100 g, incluindo todos os valores e intervalos intermediários.
[0489] De acordo com certas modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente de ligação a Clec9A e/ou quaisquer agentes terapêuticos aqui descritos pode ser administrada, por exemplo, mais de uma vez por dia (por exemplo, cerca de duas vezes, cerca de três vezes, cerca de quatro vezes, cerca de cinco vezes, cerca de seis vezes, cerca de sete vezes, cerca de oito vezes, cerca de nove vezes ou cerca de dez vezes por dia), cerca de uma vez por dia, quase todos os dias, cerca de a cada três dia, cerca de uma vez por semana, cerca de uma vez a cada duas semanas, cerca de uma vez por mês, cerca de uma vez a cada dois meses, cerca de uma vez a cada três meses, cerca de uma vez a cada seis meses ou cerca de uma vez por ano.
[0490] Terapia combinada e agentes terapêuticos adicionais
[0491] Em várias modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção é coadministrada em conjunto com agentes terapêuticos adicionais. A administração concomitante pode ser simultânea ou sequencial.
[0492] Numa modalidade, o agente terapêutico adicional e o agente de ligação a Clec9A da presente invenção são administrados a um sujeito simultaneamente. O termo "simultaneamente", conforme usado aqui, significa que o agente terapêutico adicional e o agente de ligação a Clec9A são administrados com uma separação de tempo de não mais que cerca de 60 minutos, como não mais que cerca de 30 minutos, não mais que cerca de 20 minutos, não mais que 10 minutos, não mais que 5 minutos ou mais que 1 minuto. A administração do agente terapêutico adicional e do agente de ligação a Clec9A pode ser por administração simultânea de uma única formulação (por exemplo, uma formulação compreendendo o agente terapêutico adicional e o agente de ligação a Clec9A) ou de formulações separadas (por exemplo, uma primeira formulação incluindo o agente terapêutico adicional e uma segunda formulação incluindo o agente de ligação a Clec9A).
[0493] A coadministração não requer que os agentes terapêuticos sejam administrados simultaneamente, se o tempo de sua administração for tal que as atividades farmacológicas do agente terapêutico adicional e do agente de ligação a Clec9A se sobreponham no tempo, exercendo assim um efeito terapêutico combinado. Por exemplo, o agente terapêutico adicional e o agente de ligação a Clec9A podem ser administrados sequencialmente. O termo "sequencialmente", como utilizado neste documento, significa que o agente terapêutico adicional e o agente de ligação a Clec9A são administrados com uma separação de tempo de mais de cerca de 60 minutos. Por exemplo, o tempo entre a administração sequencial do agente terapêutico adicional e o agente de ligação a Clec9A pode ser superior a cerca de 60 minutos, superior a cerca de 2 horas, superior a cerca de 5 horas, superior a cerca de 10 horas, superior a cerca de 1 dia, superior a cerca de 2 dias, superior a cerca de 3 dias, superior a cerca de 1 semana ou superior a cerca de 2 semanas ou superior a cerca de um mês. Os tempos ideais de administração dependerão das taxas de metabolismo, excreção e / ou atividade farmacodinâmica do agente terapêutico adicional e do agente de ligação a Clec9A sendo administrado. O agente terapêutico adicional ou a célula do agente de ligação a Clec9A podem ser administrados primeiro.
[0494] A coadministração também não requer que os agentes terapêuticos sejam administrados ao sujeito pela mesma via de administração. Em vez disso, cada agente terapêutico pode ser administrado por qualquer via apropriada, por exemplo, parenteral ou não parenteral.
[0495] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A aqui descrito atua sinergicamente quando coadministrado com outro agente terapêutico. Em tais modalidades, o agente de ligação a Clec9A e o agente terapêutico adicional podem ser administrados em doses inferiores às doses empregadas quando os agentes são utilizados no contexto da monoterapia.
[0496] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a agentes quimioterapêuticos como agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, sem limitação, essa combinação dos presentes agentes de ligação Clec9A e agente quimioterapêutico encontra uso no tratamento de cânceres, como aqui descrito em outra parte. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem, sem limitação, agentes alquilantes como tiotepa e CYTOXAN ciclofosfamida; sulfonatos de alquila como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoaminas e metilamelaminaes, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolmelamina; acetogeninas (por exemplo, bulatacina e bulatacinona); um camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético); briostatina, estatina de cally; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos, adozelesin, carzelesin e bizelesin); criptoficina (por exemplo, criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatin; duocarmicin (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; um sarcodicti-ina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como o clorambucil, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos como a enedi-ina de antibióticos (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina ômega II (vide, por exemplo, Agnew, Chem.
Intl.
Ed.
Engl., 33:183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo da neocarzinostatina e cromóforos antibióticos relacionados à cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autorramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina-dactinomicina, ADRIAMICINA doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxi doxorrubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, marcomicina, mitomicinas tais como quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como minoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatone; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; um epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil- hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (por exemplo, toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manustustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, TAXOL paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ),ABRAXANE sem cromóforo, formulação de nanopartículas de paclitaxel manipulada por albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), e TAXOTERE doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucil; GEMZAR gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP- 16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINA. vinorelbina; novantrone; tenoposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (Camptosar, CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinotecano com 5-FU e leucovorina); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatina, incluindo o regime de tratamento com oxaliplatina (FOLFOX); lapatinib (Tykerb); inibidores de PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva)) e VEGF-A que reduzem a proliferação celular e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores. Além disso, os métodos de tratamento podem incluir ainda o uso de radiação. Além disso, os métodos de tratamento podem incluir ainda o uso de terapia fotodinâmica.
[0497] Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a terapias combinadas utilizando o agente de ligação a Clec9A e um agente quimioterapêutico. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à administração do agente de ligação a Clec9A a um paciente em tratamento com um agente quimioterapêutico. Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico é um agente intercalante de DNA, como, sem limitação, doxorrubicina, cisplatina, daunorrubicina e epirrubicina. Numa modalidade, o agente intercalante de DNA é doxorrubicina.
[0498] Em modalidades ilustrativas, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando coadministrado com doxorrubicina. Numa modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando coadministrado com doxorrubicina para uso no tratamento de tumores ou câncer.
Por exemplo, a coadministração do agente de ligação a Clec9A e doxorrubicina pode atuar sinergicamente para reduzir ou eliminar o tumor ou câncer, ou retardar o crescimento e / ou progressão e / ou metástase do tumor ou câncer. Em modalidades ilustrativas, a combinação do agente de ligação a Clec9A e doxorrubicina pode exibir perfis de segurança aprimorados quando comparados aos agentes utilizados isoladamente no contexto da monoterapia. Em modalidades ilustrativas, o agente de ligação a Clec9A e a doxorrubicina podem ser administrados em doses inferiores às doses empregadas quando os agentes são utilizados no contexto da monoterapia. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um interferon mutado, como um IFNα mutado. Em modalidades ilustrativas, o IFNα mutado compreende uma ou mais mutações nas posições 148, 149 e 153 com referência à SEQ ID NO:337 ou SEQ ID NO:338, como as substituições M148A, R149A e L153A.
[0499] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à terapia combinada com um ou mais agentes imunomoduladores, por exemplo, sem limitação, agentes que modulam o ponto de verificação imune. Em várias modalidades, o agente imunomodulador direciona um ou mais de PD-1, PD-L1 e PD-L2. Em várias modalidades, o agente imunomodulador é inibidor de PD-1. Em várias modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo específico para um ou mais de PD-1, PD-L1 e PD-L2. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo como, por meio de não limitação, nivolumabe (ONO-4538 / BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), pembrolizumabe (KEYTRUDA, MERCK), pidilizumabe (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL328OA (ROCHE). Em algumas modalidades, o agente imunomodulador direciona um ou mais de CD137 ou CD137L. Em várias modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo específico para um ou mais CD137 ou CD137L. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo como, a título não limitativo, urelumabe (também conhecido como BMS-663513 e anticorpo anti-4-
1BB). Em algumas modalidades, a presente proteína quimérica é combinada com urelumabe (opcionalmente com um ou mais de nivolumabe, lirilumabe e urelumabe) para o tratamento de tumores sólidos e / ou linfoma não Hodgkins de células B e / ou câncer de cabeça e pescoço e / ou mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um agente que direciona um ou mais de CTLA-4, AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 e PPP2R5A. Em várias modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo específico para um ou mais de CTLA-4, AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 e PPP2R5A. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo tal como, por meio de não limitação, ipilimumabe (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) e / ou tremelimumabe (Pfizer). Em algumas modalidades, a presente proteína quimérica é combinada com ipilimumabe (opcionalmente com bavituximabe) para o tratamento de um ou mais de melanoma, câncer de próstata e câncer de pulmão. Em várias modalidades, o agente imunomodulador direciona CD20. Em várias modalidades, o agente imunomodulador é um CD20 específico de anticorpo. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um anticorpo como, por meio de não limitação, Ofatumumabe (GENMAB), obinutuzumabe (GAZYVA), AME-133v (APPLIED MOLECULAR EVOLUTION), Ocrelizumabe (GENENTECH), TRU -015 (TRUBION / EMERGENTE), veltuzumabe (IMMU-106).
[0500] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à terapia de combinação usando o agente de ligação a Clec9A e um inibidor de ponto de verificação. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à administração do agente de ligação a Clec9A a um paciente em tratamento com um inibidor de ponto de verificação. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um agente que direciona um ou mais de PD-1, PD-L1, PD- L2 e CTLA-4 (incluindo qualquer um dos anti-PD-1, anti-PD-L1, anti -PD-L2 e agentes anti-CTLA-4 aqui descritos). Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um ou mais de nivolumabe (ONO-4538 / BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), pembrolizumabe
(KEYTRUDA, MERCK), pidilizumabe (CT-011, CURE TECH), MK -3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL328OA (ROCHE), ipilimumab (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) e tremelimumab (Pfizer). Numa modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um anticorpo contra PD-L1.
[0501] Em modalidades ilustrativas, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando coadministrado com o anticorpo anti-PD-L1. Numa modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando coadministrado com o anticorpo anti-PD-L1 para uso no tratamento de tumores ou câncer. Por exemplo, a coadministração do agente de ligação a Clec9A e o anticorpo anti-PD-L1 pode atuar sinergicamente para reduzir ou eliminar o tumor ou câncer, ou retardar o crescimento e / ou progressão e / ou metástase do tumor ou câncer. Em algumas modalidades, a combinação do agente de ligação a Clec9A e o anticorpo anti-PD-L1 pode exibir perfis de segurança aprimorados quando comparados aos agentes utilizados isoladamente no contexto da monoterapia. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A e o anticorpo anti-PD-L1 podem ser administrados em doses inferiores às doses empregadas quando os agentes são utilizados no contexto de monoterapia. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um interferon mutado, como um IFNα mutado. Em modalidades ilustrativas, o IFNα mutado compreende uma ou mais mutações nas posições 148, 149 e 153 com referência à SEQ ID NO:337 ou SEQ ID NO:338, como as substituições M148A, R149A e L153A.
[0502] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a terapias combinadas utilizando o agente de ligação a Clec9A e um agente imunossupressor. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à administração do agente de ligação a Clec9A a um paciente em tratamento com um agente imunossupressor. Numa modalidade, o agente imunossupressor é TNF.
[0503] Em modalidades ilustrativas, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando coadministrado com TNF. Numa modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando coadministrado com TNF para uso no tratamento de tumores ou câncer. Por exemplo, a coadministração do agente de ligação a Clec9A e TNF pode atuar sinergicamente para reduzir ou eliminar o tumor ou câncer, ou retardar o crescimento e / ou progressão e / ou metástase do tumor ou câncer. Em algumas modalidades, a combinação do agente de ligação a Clec9A e TNF pode exibir perfis de segurança aprimorados quando comparados aos agentes utilizados isoladamente no contexto da monoterapia. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A e TNF podem ser administrados em doses inferiores às doses empregadas quando os agentes são utilizados no contexto da monoterapia. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A compreende um interferon mutado, como um IFNα mutado. Em modalidades ilustrativas, o IFNα mutado compreende uma ou mais mutações nas posições 148, 149 e 153 com referência à SEQ ID NO:337 ou SEQ ID NO:338, como as substituições M148A, R149A e L153A.
[0504] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A atua sinergicamente quando usado em combinação com a terapia com células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR). Numa modalidade ilustrativa, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando usado em combinação com a terapia com células T CAR no tratamento de tumor ou câncer. Em uma modalidade, o agente de ligação a Clec9A atua sinergicamente quando usado em combinação com a terapia com células T CAR no tratamento de tumores sanguíneos. Numa modalidade, o agente de ligação a Clec9A age sinergicamente quando usado em combinação com a terapia com células T CAR no tratamento de tumores sólidos. Por exemplo, o uso do agente de ligação a Clec9A e células T CAR pode atuar sinergicamente para reduzir ou eliminar o tumor ou câncer, ou retardar o crescimento e / ou progressão e / ou metástase do tumor ou câncer. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção induz a divisão de células T CAR. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção induz a proliferação de células T CAR. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A da invenção impede a anergia das células T CAR.
[0505] Em várias modalidades, a terapia de células T CAR compreende células T CAR que direcionam antígenos (por exemplo, antígenos tumorais), como, entre outros, anidrase carbônica IX (CAIX), 5T4, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD47, CS1, CD138, Lewis-Y, L1-CAM, MUC16, ROR-1, IL13Rα2, gp100, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno de maturação de células B (BCMA), vírus do papiloma humano tipo 16 E6 (HPV-16 E6), CD171, receptor alfa de folato (FR-α), GD2, receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), mesotelina, EGFRvIII, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA) e receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF-R2), bem como outros antígenos tumorais bem conhecidos na técnica. Antígenos tumorais ilustrativos adicionais incluem, mas não estão limitados a, MART-1 / Melan-A, gp100, Dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteína de ligação à adenosina desaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno associado ao colorretal (CRC) -0017-1A / GA733, antígeno carcinoembrionário (CEA) e seus epítopos imunogênicos CAP-1 e CAP-2, etv6, aml1, antígeno específico da próstata (PSA) e seus epítopos imunogênicos PSA- 1, PSA-2 e PSA-3, receptor de células T / cadeia CD3-zeta, família MAGE de antígenos tumorais (por exemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE- A9, MAGE-A10, MAGE- A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE -C3, MAGE-C4, MAGE-C5), família GAGE de antígenos tumorais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE- 4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE -8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2 / neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteína, E-caderina, α-catenina, β-catenina e γ-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de polipose coli adenomatosa (APC), fodrina, Conexina 37, idiotipo Ig, p15, gp75, gangliosídeos
GM2 e GD2, produtos virais, como proteínas do vírus do papiloma humano, família Smad de antígenos tumorais, lmp-1, NA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, glicogênio fosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP- 1 CT-7, c-erbB-2, CD19, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, MUC1, GPNMB, Ep-CAM, PD-L1 e PD-L2.
[0506] A terapia de células T CAR exemplificativa inclui, mas não se limita a, JCAR014 (Juno Therapeutics), JCAR015 (Juno Therapeutics), JCAR017 (Juno Therapeutics), JCAR018 (Juno Therapeutics), JCAR020 (Juno Therapeutics), JCAR023 (Juno Therapeutics), JCAR024 (Juno Therapeutics), CTL019 (Novartis), KTE-C19 (Kite Pharma), BPX-401 (Bellicum Pharmaceuticals), BPX-501 (Bellicum Pharmaceuticals), BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals), bb2121 (Bluebird Bio), Células da Bela Adormecida CD-19 (Ziopharm Oncology), UCART19 (Cellectis), UCART123 (Cellectis), UCART38 (Cellectis), UCARTCS1 (Cellectis), OXB-302 (Oxford BioMedica, MB-101 (Mustang Bio) e células T CAR desenvolvidas pela Innovative Cellular Therapeutics.
[0507] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A é usado em um método de tratamento de esclerose múltipla (MS) em combinação com uma ou mais terapêuticas de MS, incluindo, mas não se limitando a, 3 interferons, acetato de L, acetato de L, interferon T, IFN-ß- 2 (USPublicação de Patente No. 2002/0025304), espirogermânios (por exemplo, N-(3- dimetilaminopropil)-2-aza-8,8-dimetil-8-germanespiro [4:5] decano, N-(3- dimetilaminopropil)-2 -aza-8,8-dietil-8-germaspiro [4:5] decano, N-(3- dimetilaminopropil)-2-aza-8,8-dipropil-8-germaspiro [4:5] decano e N- (3- dimetilaminopropil)-2-aza-8, 8-dibutil-8-germaspiro [4:5] decano), análogos da vitamina D (por exemplo, 1,25 (OH) 2D3, (ver, por exemplo,Patente US 5. 716. 946)), prostaglandinas (por exemplo, latanoprost, brimonidina, PGE1, PGE2 e PGE3, ver, por exemplo,S. Publicação de Patente US 2002/0004525), tetraciclina e derivados (por exemplo, minociclina e doxiciclina, ver, por exemplo,Publicação de Patente US 20020022608), um anticorpo de ligação ao
VLA-4 (ver, por exemplo,Publicação de Patente US 2009/0202527), hormônio adrenocorticotrófico, corticosteroide, prednisona, metilprednisona, 2- clorodesoxiadenosina, mitoxantrona, sulfassalazina, metotrexato, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, fumarato, anticorpo anti-CD20id (por exemplo, rituximaidina).
[0508] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A é usado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos que tratam um ou mais sintomas ou efeitos colaterais da MS. Tais agentes incluem, entre outros, amantadina, baclofeno, papaverina, meclizina, hidroxizina, sulfametoxazol, ciprofloxacina, docusato, polinaolina, dantroleno, desmopressina, dexametasona, tolterodina, fenilamina, oxibutilamina, bisacinodazina, oxacibutinina, bisacinoxina isoniazida, vardenafil, nitrofurantoína, mucilóide hidrofílico de psyllium, alprostadil, gabapentina, nortriptilina, paroxetina, brometo de propantelina, modafinil, fluoxetina, fenazopiridina, metilprednisolona, carbamazepina, imipramina e diafilepam, soro.
[0509] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A é usado em um método de tratamento da esclerose múltipla em combinação com uma ou mais das terapias de modificação da doença (DMTs) descritas aqui (por exemplo, os agentes da Tabela A). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um efeito terapêutico aprimorado em comparação com o uso de um ou mais dos DMTs aqui descritos (por exemplo, os agentes listados na Tabela A abaixo) sem o um ou mais agentes de ligação divulgados. Em uma modalidade, a combinação do agente de ligação a Clec9A e o um ou mais DMTs produz efeitos terapêuticos sinérgicos.
Tabela A:Terapias ilustrativas para modificação de doenças
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual Todo dia; pílula tomada oralmente; 7 teriflunomida AUBAGIO (GENZYME) mg ou 14 mg.
AVONEX (BIOGEN Uma vez por semana; injeção interferon beta-1a IDEC) intramuscular (no músculo); 30 mcg BETASERON (BAYER HEALTHCARE Dia sim dia não; injeção subcutânea interferon beta-1b PHARMACEUTICALS, (sob a pele); 250 mcg.
INC.) Todo dia; injeção subcutânea (sob a acetato de COPAXONE (TEVA pele); 20 mg (20. 000 mcg) OU três glatiramer NEUROSCIENCE) vezes por semana; injeção subcutânea (sob a pele); 40 mg (40. 000 mcg) EXTAVIA (NOVARTIS Dia sim dia não; injeção subcutânea interferon beta-1b PHARMACEUTICALS (sob a pele); 250 mcg.
CORP.) GILENYA (NOVARTIS Todo dia; cápsula tomada por via oral; fingolimod PHARMACEUTICALS 0,5 mg.
CORP.) Alemtuzumabe Infusão intravenosa em cinco dias (anticorpo LEMTRADA consecutivos, seguida por infusão monoclonal anti- (GENZYME) intravenosa em três dias consecutivos CD52) um ano depois (12 mg) Quatro vezes por ano por infusão IV em uma instalação médica.
Limite de NOVANTRONE (EMD mitoxantrona dose cumulativa ao longo da vida de SERONO) aproximadamente 8 a 12 doses durante 2 a 3 anos (140 mg / m2). interferon PLEGRIDY (BIOGEN A cada 14 dias; injeção subcutânea peguilado beta-1a IDEC) (sob a pele); 125 mcg REBIF (EMD SERONO, Três vezes por semana; injeção interferon beta-1a INC.) subcutânea (sob a pele); 44 mcg Duas vezes ao dia; cápsula tomada por fumarato de TECFIDERA (BIOGEN via oral; 120 mg por uma semana e dimetil (BG-12) IDEC) 240 mg depois Natalizumabe (antagonista do A cada quatro semanas por infusão anticorpo TYSABRI (BIOGEN intravenosa em uma instalação de monoclonal IDEC) infusão registrada; 300 mg humanizado VLA-4) DMTs em Desenvolvimento
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual Amilorida (direciona o canal PAR iônico de detecção PHARMACEUTICAL, de ácido-1 do PERRIGO COMPANY, Oral canal de sódio SIGMAPHARM epitelial de sódio LABORATORIES Na + / H +) ATX-MS-1467 (direciona respostas de células T classe II APITOPE / MERCK do complexo Intradérmico Subcutâneo
SERONO principal de histocompatibilid ade à proteína básica de mielina) BAF312 (direciona a distribuição de células T da distribuição de NOVARTIS PHARMA Oral células B dos receptores 1- fosfato de esfingosina (S1P) (S1P1 e S1P5)) BGC20-0134 (direciona citocinas pró- BTG PLC Oral inflamatórias e anti- inflamatórias) BIIB033 (direciona LINGO-1 ("repetição rica Infusão intravenosa usada nos ensaios em leucina e BIOGEN de Fase I e Fase II Injeção subcutânea domínio contendo usada no ensaio de Fase I imunoglobulina, proteína que interage com o receptor Nogo"))
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual Cladribina (direciona a síntese e reparo de DNA das células T CD4+ e repara a molécula de adesão intracelular-1 E- selectina Citocinas pró- inflamatórias interleucina 2 e MERCK SERONO Oral interleucina 2R Citocinas pró- inflamatórias interleucina 8 e secreção de citocinas
RANTES secreção de citocinas Migração de monócitos e linfócitos) Ciclofosfamida (direciona as
BAXTER células T, HEALTHCARE Pulsos intravenosos orais mensais particularmente as
CORPORATION células T auxiliares CD4 +) Daclizumabe (anticorpo monoclonal humanizado que BIOGEN IDEC/ABBVIE Projetado para ser injeção IM uma vez direciona o BIOTHERAPEUTICS por mês imunomodulador CD25 de células T) Dalfampridina ACORDA Um comprimido a cada 12 horas (direciona canais THERAPEUTICS / (liberação prolongada), 10 mg duas de potássio BIOGEN IDEC vezes ao dia dependentes de
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual voltagem Degenerina / canais de sódio epiteliais Canais de cálcio tipo L que contêm a subunidade Cavbeta3) Dronabinol (direciona o receptor ABBVIE INC.
Oral canabinoide CB1 receptor canabinoide CB2) Firategrast (direciona GLAXOSMITHKLINE Oral Alpha4beta1 integrina) GNbAC1MSRV- Env (direciona a proteína do GENEURO SA / Infusão intravenosa envelope do SERVIER retrovírus associado à MS) Idebenona A dose oral em ensaio clínico para (direciona SANTHERA PPMS é 2250 mg por dia (dose de 750 espécies reativas PHARMACEUTICALS mg, 3 vezes por dia) de oxigênio) Imilecleucel-T (direciona células OPEXA Subcutâneo Dado 5 vezes por ano, de T autorreativas THERAPEUTICS / acordo com informações do fabricante específicas da MERCK SERONO mielina) Projetado para ser comprimido oral de Laquinimod TEVA 0,6 mg ou 1,2 mg, tomado diariamente Masitinibe (direciona o receptor KIT (um fator de célula- AB SCIENCE Oral tronco, também chamado c-KIT), bem como
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual seleciona outros mastócitos de tirosina-quinases) MEDI-551 (direciona CD19, um antígeno específico de célula B que faz parte do complexo receptor de células B e que funciona na determinação do limiar para ativação de células B células B Plasmablastos, células B que MEDIMMUNE Subcutâneo intravenoso expressam CD19 (mas não CD20) e que secretam grandes quantidades de anticorpos; a depleção de blastos de plasma pode ser útil em doenças autoimunes que envolvem autoanticorpos patogênicos) Minociclina (direciona metaloproteinases Disponível como cápsulas da matriz de VARIOUS preenchidas com peletes e uma migração de suspensão oral leucócitos de microglia de células T)
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual MIS416 (direciona Receptores de reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno do sistema imunológico inato INNATE Células mielóides IMMUNOTHERAPEUTI Intravenosa do sistema CS imunológico inato, que podem ser capazes de remodelar a atividade desregulada do sistema imunológico que ocorre em SPMS) Micofenolato de mofetil (direciona FABRICADO PELA Oral a síntese de GENENTECH purina) Naltrexona (direciona os Administrado em doses baixas (3 a 4,5 receptores mg por dia) na forma oral como
VARIOUS opioides receptor "Naltrexona em dose baixa" (ou semelhante a Toll- "LDN") 4) Ocrelizumabe e Ofatumumabe (anticorpos monoclonais ROCHE / GSK Projetado para infusão IV humanizados direcionados à supressão de células B CD20
ONO ONO-4641 PHARMACEUTICAL Oral (direciona o CO.
Frequência / Via de Distribuição / Nome Genérico Marca / Empresa Dose habitual receptor 1-fosfato de esfingosina) Fenitoína Intramuscular Intravenoso (opção (direciona canais PFIZER menos favorecida) Oral de sódio) Ponesimod ACTELION A ser determinado Raltegravir (direciona a terminase da Comprimido oral de 400 mg duas embalagem do MERCK vezes ao dia, de acordo com DNA do informações do fabricante herpesvírus retroviral da integrase) REDHILL BIOPHARMA 95 mg de claritromicina, 45 mg de RHB-104 LIMITED rifabutina e 10 mg de clofazimina Riluzol (direciona a neurotransmissão glutamatérgica Captação e COVIS PHARMA / liberação de Oral
SANOFI glutamato Proteína quinase C de canais de sódio dependentes de voltagem)
[0510] A progressão da doença MS pode ser mais intensa e mais prejudicial nos estágios iniciais da progressão da doença. Consequentemente, ao contrário de muitas políticas de reembolso e prática médica à luz de, por exemplo, redução de custos e efeitos colaterais, pode ser mais benéfico para o status de doença de longo prazo de um paciente iniciar o tratamento com os DMTs mais intensivas, por exemplo, as chamadas terapias de segunda linha. Em algumas modalidades, um paciente é tratado com um regime do agente de ligação a Clec9A em combinação com uma terapia de segunda linha. Essa combinação é usada para reduzir o perfil de efeitos colaterais de uma ou mais terapias de segunda linha. Em algumas modalidades, a combinação é usada para reduzir a dose da frequência de administração de uma ou mais terapias de segunda linha. Por exemplo, as doses dos agentes listados na Tabela A fornecidas acima podem ser reduzidas em cerca de 50% ou cerca de 40% ou cerca de 30% ou cerca de 25% no contexto da combinação e / ou a frequência da dosagem pode ser reduzido para metade da frequência ou um terço da frequência ou pode ser reduzido de, por exemplo, diariamente para todos os outros dias ou semanalmente, todos os dias para semanal ou quinzenal, semanal para quinzenal ou mensal, etc. Por conseguinte, em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A aumenta a adesão do paciente, permitindo regimes de tratamento mais convenientes. Além disso, alguns DMTs têm uma sugestão de limitação da dose ao longo da vida, por exemplo, para mitoxantrona, a dose cumulativa ao longo da vida deve ser estritamente limitada a 140 mg/m2, ou 2 a 3 anos de terapia. Em algumas modalidades, a suplementação com o agente de ligação a Clec9A preserva o acesso do paciente ao mitoxantrona, permitindo uma dosagem mais baixa ou menos frequente com este DMT.
[0511] Em algumas modalidades, o paciente é um paciente ingênuo, que não recebeu tratamento com um ou mais DMTs, e o agente de ligação a Clec9A é usado para amortecer os efeitos colaterais de uma terapia de segunda linha. Consequentemente, o paciente ingênuo é capaz de se beneficiar dos benefícios a longo prazo de uma terapia de segunda linha no início da doença. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A é usado como uma terapia de entrada que precede o uso de uma terapia de segunda linha. Por exemplo, o agente de ligação a Clec9A pode ser administrado por um período inicial de tratamento de cerca de 3 meses para estabilizar a doença e, em seguida, o paciente pode ser transferido para uma terapia de manutenção de um agente de segunda linha.
[0512] Geralmente, acredita-se que pacientes ingênuos têm maior probabilidade de responder à terapia em comparação com pacientes que receberam e talvez tenham falhado em um ou mais DMT. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9a encontra uso em pacientes que receberam e talvez tenham falhado em um ou mais DMT. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A aumenta o efeito terapêutico em pacientes que receberam e talvez tenham falhado em um ou mais DMT e podem permitir que esses pacientes respondam como pacientes ingênuos.
[0513] Em algumas modalidades, o paciente recebeu ou está recebendo tratamento com um ou mais DMTs e não está respondendo bem. Por exemplo, o paciente pode ser refratário ou pouco responsivo a um ou mais DMTs. Em algumas modalidades, o paciente é refratário ou pouco responsivo a um ou mais de teriflunomida (AUBAGIO (GENZYME)); interferon beta-1a (AVONEX (BIOGEN IDEC); interferon beta-1b (BETASERON (BAYER HEALTHCARE PHARMACEUTICALS, INC.); acetato de glatiramer (COPAXONE (TEVA NEUROSCIENCE); interferon beta-1b (EXTAVIA (NOVARTIS PHARMACEUTICALS CORP); GILENYA (NOVARTIS PHARMACEUTICALS CORP.); Alemtuzumabe (LEMTRADA (GENZYME); mitoxantrona (NOVANTRONE (EMD SERONO); interferon beta-1a peguilado (PLEGRIDY (BIOGEN IDEC)); interferon beta-1a (REBIF (EMD SERONO, INC.) fumarato (BG-12) (TECFIDERA (BIOGEN IDEC) e natalizumabe (TYSABRI (BIOGEN IDEC). Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados resulta em um benefício terapêutico de um ou mais DMTs no paciente e, portanto, reduz ou elimina a não responsividade ao DMT. Por exemplo, isso pode poupar a terapia do paciente com um ou mais DMTs em doses ou frequências mais altas.
[0514] Em pacientes com doença mais agressiva, uma abordagem é um modelo de tratamento por indução, em que uma terapia com forte eficácia, mas com fortes preocupações de segurança, seria dada primeiro, seguida por uma terapia de manutenção. Um exemplo desse modelo pode incluir o tratamento inicial com alemtuzumabe, seguido por IFN-β, GA ou BG-12. Em algumas modalidades, o um ou mais agente de ligação divulgado é usado para evitar a necessidade de alternar terapias para manutenção. Em algumas modalidades, o um ou mais agente de ligação divulgado é usado como terapia de manutenção para um ou mais DMTs, incluindo terapias de segunda linha. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados é usado como primeira terapia em uma indução, seguido por outro DMT como uma terapia de manutenção - como, por exemplo, uma terapia de primeira linha.
[0515] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem ser administrados por um período inicial de tratamento de cerca de 3 meses para estabilizar a doença e, em seguida, o paciente pode ser transferido para uma terapia de manutenção de um agente de primeira linha.
[0516] Em várias modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados é usado para reduzir um ou mais efeitos colaterais de um DMT, incluindo, sem limitação, qualquer agente aqui divulgado. Por exemplo, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem ser usados em um regime que permite poupar a dose para um ou mais DMTs e, portanto, resulta em menos efeitos colaterais. Por exemplo, em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do AUBAGIO ou agentes relacionados, que podem incluir queda de cabelo, diarreia, gripe, náusea, testes hepáticos anormais e dormência ou formigamento incomum nas mãos ou pés (parestesias), níveis de glóbulos brancos, que podem aumentar o risco de infecções; aumento da pressão arterial; e lesão hepática grave. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do AVONEX ou agentes relacionados que incluem sintomas do tipo gripe após injeção, depressão, anemia leve, anormalidades hepáticas, reações alérgicas e problemas cardíacos. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do BETASERON ou de agentes relacionados que incluem sintomas do tipo gripe após injeção, reações no local da injeção, reações alérgicas, depressão, anormalidades hepáticas e baixa contagem de glóbulos brancos. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais da COPAXONA ou agentes relacionados que incluem reações no local da injeção, vasodilatação (dilatação dos vasos sanguíneos); dor no peito; uma reação imediatamente após a injeção, que inclui ansiedade, dor no peito, palpitações, falta de ar e rubor.
Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do EXTAVIA ou de agentes relacionados que incluem sintomas do tipo gripe após injeção, reações no local da injeção, reações alérgicas, depressão, anormalidades hepáticas e baixa contagem de glóbulos brancos.
Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do GILENYA ou agentes relacionados que incluem dor de cabeça, gripe, diarreia, dor nas costas, elevações das enzimas hepáticas, tosse, frequência cardíaca mais lenta após a primeira dose, infecções e inchaço nos olhos.
Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais de LEMTRADA ou agentes relacionados que incluem erupção cutânea, dor de cabeça, febre, congestão nasal, náusea, infecção do trato urinário, fadiga, insônia, infecção do trato respiratório superior, urticária, prurido, distúrbios da glândula tireoide, infecção fúngica, dor nas articulações, extremidades e costas, diarreia, vômito, rubor e reações à infusão (incluindo náuseas, urticária, coceira, insônia, calafrios, rubor, fadiga, falta de ar, alterações na paladar, indigestão, tontura, dor). Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do NOVANTRONE ou de agentes relacionados que incluem a urina azul esverdeado 24 horas após a administração; infecções, supressão da medula óssea (fadiga, hematomas, baixa contagem de células sanguíneas), náusea, queda de cabelo, infecções da bexiga, feridas na boca e danos graves no fígado e no coração.
Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do PLEGRIDY ou agentes relacionados que incluem sintomas do tipo gripe após injeção, reações no local da injeção, depressão, anemia leve, anormalidades hepáticas, reações alérgicas e problemas cardíacos. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do REBIF ou de agentes relacionados que incluem sintomas do tipo gripe após injeção, reações no local da injeção, anormalidades hepáticas, depressão, reações alérgicas e baixa contagem de glóbulos vermelhos ou brancos. Em algumas modalidades, um ou mais agentes de ligação divulgados podem reduzir um ou mais efeitos colaterais do TECFIDERA ou agentes relacionados que incluem rubor (sensação de calor ou prurido e rubor na pele), problemas gastrointestinais (náusea, diarreia, dor abdominal), erupção cutânea, proteína na urina, enzimas hepáticas elevadas; e redução na contagem de linfócitos no sangue (glóbulo branco). Em algumas modalidades, o um ou mais agente de ligação divulgado pode reduzir um ou mais efeitos colaterais do TYSABRI ou agentes relacionados que incluem dor de cabeça, fadiga, infecções do trato urinário, depressão, infecções do trato respiratório, dor nas articulações, dor de estômago, desconforto abdominal, diarreia, vaginite, dor nos braços ou pernas, erupção cutânea, reações alérgicas ou de hipersensibilidade dentro de duas horas da infusão (tonturas, febre, erupção cutânea, comichão, náusea, rubor, pressão arterial baixa, dificuldade em respirar, dor no peito).
[0517] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à terapia combinada com um ou mais agentes quiméricos descritos em WO 2013/10779, WO 2015/007536, WO 2015/007520, WO 2015/007542 e WO 2015/007903, cujo conteúdo total são incorporados por referência em sua totalidade.
[0518] Em algumas modalidades, incluindo, sem limitação, aplicações de doenças infecciosas, a presente invenção refere-se a anti- infecciosos como agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, o anti-infeccioso é um agente antiviral incluindo, mas não limitado a, Abacavir, Aciclovir, Adefovir, Amprenavir, Atazanavir, Cidofovir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Efavirenz, Elvitegravir, Emtricitabina, Enfuvirtida, Etravirina, Famciclovir e Foscarnet. Em algumas modalidades, o anti-infeccioso é um agente anti-bacteriano incluindo, mas não limitado a, antibióticos de cefalosporina (cefalexina, cefuroxima, cefadroxil, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandole, cefoxitina, cefprozil e ceftobiprole); antibióticos de fluoroquinolona (cipro, Levaquina, floxina, tequina, avelox e norflox); antibióticos de tetraciclina (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina e doxiciclina); antibióticos de penicilina (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina e meticilina); antibióticos de monobactam (aztreonam); e antibióticos de carbapenem (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina e meropenem). Em algumas modalidades, os anti-infecciosos incluem agentes anti-maláricos (por exemplo, cloroquina, quinina, mefloquina, primaquina, doxiciclina, artemeter/lumefantrina, atovaquona/proguanil e sulfadoxina/pirimetamina), metronidazol, tinidazol, ivermectina, pamoato de pirantel e albendazol.
[0519] Em algumas modalidades, inclusive, sem limitação, de aplicações autoimunes, o agente terapêutico adicional é um agente imunossupressor. Em algumas modalidades, o agente imunossupressor é um agente anti-inflamatório, como um agente anti-inflamatório esteroide ou um agente anti-inflamatório não esteroide (NSAID). Os esteroides, particularmente os corticosteroides adrenais e seus análogos sintéticos, são bem conhecidos na técnica. Exemplos de corticosteroides úteis na presente invenção incluem, sem limitação, hidroxiltriamcinolona, alfa-metil desxametasona, beta-metil betametasona, dipropionato de beclometasona, benzoato de betametasona, dipropionato de betametasona, bvalerato de betametasona, valerato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexametasona, diacetato de diflorasona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, acetonido de fluclorolona, pivalato de flumetasona,acetonido de fluosinolona, fluocinonida, éster de flucortina butílico, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinonida, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metilprednisolona, acetonida de triancinolona, cortisona, cortodoxona, flucetonida, fludrocortisona, diacetato de difluorosona, fluradrenolona acetonida, medrisona, amcinafel, amcinafida, betametasona e o equilíbrio de seus ésteres,
cloroprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, difluprednato, flucloronido, flunisolida, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, hidrocortisona, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona. (NSAIDS) que podem ser utilizados na presente invenção, incluem, entre outros, ácido salicílico, ácido acetilsalicílico, salicilato de metil, salicilato de glicol, salicilmidas, ácido benzil-2,5-diacetoxibenzoico, ibuprofeno, fulindac, naproxeno, cetoprofeno, etofenamato, fenilbutazona e indometacina. Em algumas modalidades, o agente imunossupressor pode ser citostático, como agentes alquilantes, antimetabólitos (por exemplo, azatioprina, metotrexato), antibióticos citotóxicos, anticorpos (por exemplo, basiliximabe, daclizumabe e muromonabe), anti-imunofilinas (por exemplo, ciclosporina, tacrolimus, tacrolimus), interferons, opioides, proteínas de ligação ao TNF, micofenolatos e pequenos agentes biológicos (por exemplo, fingolimod, mriocina). Agentes anti-inflamatórios adicionais são descritos, por exemplo, emPatente US 4. 537. 776, cujo conteúdo total é incorporado por referência aqui.
[0520] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A aqui descrito inclui derivados que são modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula à composição, de modo que a ligação covalente não impeça a atividade da composição. Por exemplo, mas não a título limitativo, os derivados incluem composição que foi modificada por, entre outros, glicosilação, lipidação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos conhecidos de proteção / bloqueio, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outras proteínas, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, entre outras, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc.
[0521] Em ainda outras modalidades, o agente de ligação a Clec9A aqui descrito compreende ainda um agente citotóxico, compreendendo, em modalidades ilustrativas, uma toxina, um agente quimioterapêutico, um radioisótopo e um agente que causa apoptose ou morte celular. Tais agentes podem ser conjugados com uma composição aqui descrita.
[0522] O agente de ligação a Clec9A aqui descrito pode, portanto, ser modificado pós-traducionalmente para adicionar frações efetoras, como ligantes químicos, frações detectáveis, como por exemplo corantes fluorescentes, enzimas, substratos, materiais bioluminescentes, materiais radioativos e porções quimioluminescentes ou porções funcionais, como por exemplo estreptavidina, avidina, biotina, uma citotoxina, um agente citotóxico e materiais radioativos.
[0523] Agentes citotóxicos ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina; agentes de alquilação, tais como mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosoureia, ciclotosfamida, mecloretamina, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina- platina (II) (DDP) cisplatina e carboplatina (paraplatina); antraciclinas incluindo daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona e bisantreno; antibióticos incluindo dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, caliqueamicina, mitramicina e antramicina (AMC); e agentes antimitóticos, tais como os alcaloides de vinca, vincristina e vinblastina. Outros agentes citotóxicos incluem paclitaxel (taxol), ricina, pseudomonas exotoxina, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídeo, emetina, etoposídeo, tenoposídeo, colchicina, di-hidroxi antracina diona, 1-desidrotestosterona, glucocorticides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiureia, asparaginase, corticosteroides, mitotano (O,P'- (DDD)), interferons e misturas desses agentes citotóxicos.
[0524] Outros agentes citotóxicos incluem, entre outros, quimioterápicos, como carboplatina, cisplatina, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracil, mitomicina C, actinomicina D,
ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas do VEGF, EGFR taxóis, irinotecano, 5-fluorouracil, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalano, alcaloides de vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina), mustinos, inibidores de tirosina quinase, radioterapia, antagonistas de hormônios sexuais, moduladores seletivos de receptores de andrógenos, moduladores seletivos de receptores de estrogênio, moduladores seletivos de receptores de estrogênio, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por exemplo IL-12 ou IL-2), antagonistas de IL-12R, anticorpos monoclonais conjugados com toxina, anticorpos monoclonais específicos para antígenos tumorais, Erbitux, Avastina, Pertuzumabe, anticorpos anti-CD20, Rituxano, ocrelizumabe, ofatumumabe, DXL625, HERCEPTIN® ou qualquer combinação dos mesmos. Enzimas tóxicas de plantas e bactérias como ricina, toxina da difteria e toxina de Pseudomonas podem ser conjugadas com os agentes terapêuticos (por exemplo, anticorpos) para gerar reagentes de morte específicos do tipo de célula (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
[0525] Outros agentes citotóxicos incluem ribonucleases citotóxicas, conforme descrito por Goldenberg emPat. US 6.653.104. Modalidades da invenção também se referem a radioimunoconjugados em que um radionuclídeo que emite partículas alfa ou beta está acoplado de forma estável ao agente de ligação a Clec9A, com ou sem o uso de um agente formador de complexo. Tais radionuclídeos incluem emissores beta, como Fósforo-32, Escândio-47, Cobre-67, Gálio-67, Ítrio-88, Ítrio-90, Iodo-125, Iodo-131, Samário- 153, Lutécio-177, Rênio e 186 ou Rênio-188 e emissores alfa, como Astatina- 211, Chumbo-212, Bismuto-212, Bismuto-213 ou Actínio-225.
[0526] Frações detectáveis ilustrativas incluem ainda, mas não estão limitadas a, peroxidase de rábano silvestre, acetilcolinesterase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase e luciferase. Outros materiais fluorescentes ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, rodamina, fluoresceína,
isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, cloreto de dansil e ficoeritrina. Frações quimioluminescentes ilustrativas adicionais incluem, mas não estão limitadas a, luminol. Outros materiais bioluminescentes ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, luciferina e aequorina. Outros materiais radioativos ilustrativos incluem, entre outros, Iodo-125, Carbono-14, Enxofre-35, Trítio e Fósforo-32. Métodos de Tratamento
[0527] Os métodos e composições aqui descritos têm aplicação no tratamento de várias doenças e distúrbios, incluindo, entre outros, câncer, infecções, distúrbios imunológicos e doenças ou condições inflamatórias.
[0528] Além disso, qualquer um dos presentes agentes pode ser para uso no tratamento ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de várias doenças e distúrbios, incluindo, entre outros, câncer, infecções, distúrbios imunológicos, doenças ou condições inflamatórias e doenças autoimunes.
[0529] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se ao tratamento ou a um paciente com câncer. Como utilizado neste documento, câncer refere-se a qualquer crescimento descontrolado de células que possa interferir com o funcionamento normal dos órgãos e sistemas corporais e inclui tumores primários e metastáticos. Tumores primários ou cânceres que migram de sua localização original e geram órgãos vitais podem eventualmente levar à morte do sujeito através da deterioração funcional dos órgãos afetados. Uma metástase é uma célula ou grupo de células cancerígenas, distinta da localização do tumor primário, resultante da disseminação de células cancerígenas do tumor primário para outras partes do corpo. As metástases podem eventualmente resultar na morte de um sujeito. Por exemplo, os cânceres podem incluir cânceres benignos e malignos, pólipos, hiperplasia, bem como tumores dormentes ou micrometástases.
[0530] Os cânceres ilustrativos que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a, carcinoma de células basais, câncer do trato biliar;
câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer no cérebro e no sistema nervoso central; câncer de mama; cancro do peritoneu; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer do cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; cancro do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; cancro da cabeça e pescoço; câncer gástrico (incluindo cancro gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intra-epitelial; cancro do rim ou renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; cancro do pulmão (por exemplo, cancro de células pequenas do pulmão, cancro de células não pequenas do pulmão, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão); melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer da cavidade oral (lábios, língua, boca e faringe); cancro do ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; cancro do sistema respiratório; carcinoma da glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; cancro uterino ou do endométrio; cancro do sistema urinário; cancro vulvar; linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin, bem como o linfoma de células B (incluindo linfoma não Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL) NHL; NHL folicular/de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células não clivadas pequenas de alto grau; linfoma relacionados a AIDS; e macroglobulinemia; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML), leucemia de células pilosas; leucemia dos mieloblastos crônica; bem como outros carcinomas e sarcomas; e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada com facomatose, edema (por exemplo aquele associado com tumores cerebrais) e síndrome de Meigs.
[0531] Em várias modalidades, a presente invenção fornece agentes de ligação a Clec9A que fazem parte de uma quimera que compreende ainda agentes de sinalização modificados para o tratamento de câncer. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A da invenção reduzem e /
ou eliminam significativamente tumores. Em algumas modalidades, os presentes agentes de ligação a Clec9A reduzem e / ou eliminam significativamente os tumores quando administrados a um sujeito em combinação com outros agentes anticâncer, como agentes quimioterapêuticos, inibidores do ponto de verificação e agentes imunossupressores. Em várias modalidades, a combinação de agentes de ligação a Clec9A e outros agentes anticâncer reduziu sinergicamente o tamanho do tumor e / ou células tumorais eliminadas.
[0532] Em várias modalidades, a presente invenção refere-se a terapias de combinação de câncer com um agente de ligação a Clec9A que faz parte de uma quimera compreendendo uma ou mais frações de direcionamento e um ou mais agentes de sinalização modificados. Por conseguinte, a presente invenção fornece proteínas quiméricas ou de fusão que incluem, por exemplo, uma fração de direcionamento contra Clec9A e um ou mais agentes de sinalização e seus usos em combinação com agentes anticâncer.
[0533] Por exemplo, em várias modalidades, a presente invenção refere-se a terapias combinadas para câncer envolvendo quimeras de um agente de ligação a Clec9A aqui descrito e um agente de sinalização modificado, incluindo, sem limitação, um interferon humano mutado, como IFN alfa, incluindo interferon alfa 2 humano.
[0534] Em outras modalidades, o presente agente de ligação a Clec9A é parte de uma quimera que compreende várias frações de direcionamento e, portanto, está presente em formatos biespecíficos ou triespecíficos. Por exemplo, em várias modalidades, a presente invenção refere- se a terapias combinadas para câncer envolvendo quimeras de um agente de ligação a Clec9A e um agente de ligação de inibidor de ponto de verificação (por exemplo, anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-PD-L2 ou anti-CTLA) aqui descrito e um agente de sinalização modificado, incluindo, sem limitação, um interferon humano mutado, como IFN alfa, incluindo interferon alfa 2 humano.
[0535] Em várias modalidades, o agente de sinalização é modificado para ter afinidade ou atividade reduzida para um ou mais de seus receptores, o que permite atenuação da atividade (inclusive agonismo ou antagonismo) e / ou evita sinalização não específica ou sequestro indesejável da proteína quimérica. Em algumas modalidades, a afinidade ou atividade reduzida no receptor é restaurável por ligação com uma ou mais das frações de direcionamento descritas aqui.
[0536] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se ao tratamento de, ou um paciente com uma infecção microbiana e / ou infecção crônica. Infecções ilustrativas incluem, mas não estão limitadas a, HIV / AIDS, tuberculose, osteomielite, hepatite B, hepatite C, vírus ou parvovírus Epstein- Barr, vírus de leucemia de células T, síndrome de supercrescimento bacteriano, infecções por fungos ou parasitas.
[0537] Em várias modalidades, as presentes composições são usadas para tratar ou prevenir uma ou mais doenças ou condições inflamatórias, como inflamação, inflamação aguda, inflamação crônica, doença respiratória, aterosclerose, reestenose, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, choque séptico, reumatoide artrite, doença inflamatória intestinal, doença inflamatória pélvica, dor, doença inflamatória ocular, doença celíaca, Síndrome de Leigh, Deficiência de Glicerol Cinase, Eosinofilia Familiar (FE), ataxia espástica autossômica recessiva, doença inflamatória laríngea; Tuberculose, colecistite crônica, bronquiectasia, silicose e outras pneumoconioses.
[0538] Em várias modalidades, a presente invenção tem aplicação no tratamento de doenças autoimunes e / ou neurodegenerativas.
[0539] Em várias modalidades, as presentes composições são usadas para tratar ou prevenir uma ou mais condições caracterizadas por atividade CTL indesejável e / ou condições caracterizadas por altos níveis de morte celular. Por exemplo, em várias modalidades, as presentes composições são usadas para tratar ou prevenir uma ou mais condições associadas à resposta imune descontrolada ou hiperativa.
[0540] Em várias modalidades, as presentes composições são usadas para tratar ou prevenir uma ou mais doenças ou condições autoimunes e / ou neurodegenerativas, como MS, diabetes mellitus, lúpus, doença celíaca, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome de Guillain-Barre, esclerodermia, Síndrome de Goodpasture, granulomatose de Wegener, epilepsia autoimune, encefalite de Rasmussen, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, hepatite autoimune, doença de Addison, tireoidite de Hashimoto, fibromialgia, síndrome de Menier; rejeição de transplante (por exemplo, prevenção de rejeição de enxerto) anemia perniciosa, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso, miastenia grave, síndrome de Reiter, doença de Grave e outras doenças autoimunes.
[0541] Em várias modalidades, a presente invenção é usada para tratar ou prevenir várias doenças autoimunes e / ou neurodegenerativas. Em algumas modalidades, as doenças autoimunes e / ou neurodegenerativas selecionadas a partir da MS (incluindo, sem limitação, os subtipos aqui descritos), a doença de Alzheimer (incluindo, sem limitação, Alzheimer de início precoce, Alzheimer de início tardio e doença de Alzheimer familiar (FAD), Doença de Parkinson e parkinsonismo (incluindo, sem limitação, Doença de Parkinson idiopática, Parkinsonismo vascular, Parkinsonismo induzido por drogas, Demência com corpos de Lewy, Parkinson herdado, Parkinson juvenil), Doença de Huntington, Esclerose lateral amiotrófica (ALS, incluindo, sem limitação, ALS esporádica, ALS familiar, ALS do Pacífico Ocidental, ALS juvenil, doença de Hiramaya).
[0542] Em várias modalidades, a presente invenção é usada para tratar ou prevenir a MS. Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9a, conforme descrito aqui, são usados para eliminar e reduzir vários sintomas de MS. Os sintomas ilustrativos associados à esclerose múltipla, que podem ser prevenidos ou tratados com as composições e métodos aqui descritos, incluem: neurite óptica, diplopia, nistagmo, dismetria ocular, oftalmoplegia internuclear, fosfenos do movimento e som, defeito pupilar aferente, paresia, monoparesia, paraparesia, hemiparesia, quadraparesia, plegia, paraplegia, hemiplegia, tetraplegia, quadraplegia, espasticidade, disartria, atrofia muscular, espasmos,
cãibras, hipotonia, clonia, mioclonia, mioquimia, síndrome das pernas inquietas, pé caído, reflexos disfuncionais, parestesia, anestesia, neuralgia, dor neuropática e neurogênica, sinais de L'hermitte, disfunção proprioceptiva, neuralgia do trigêmeo, ataxia, tremor de intenção, dismetria, ataxia vestibular, vertigem, ataxia da fala, distonia, disdiadococinesia, micção frequente, espasticidade da bexiga, bexiga flácida, dissinergia do detrusor-esfíncter, disfunção erétil, anorgasmia, frigidez, constipação, urgência fecal, incontinência fecal, depressão, disfunção cognitiva, demência, alterações de humor, labilidade emocional, euforia, síndrome bipolar, ansiedade, afasia, disfasia, fadiga, sintoma de Uhthoff, refluxo gastroesofágico e distúrbios do sono. A mitigação ou melhoria ou um mais desses sintomas em um sujeito podem ser alcançados por um ou mais agentes, conforme descrito aqui.
[0543] Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9A, conforme descrito aqui, são usados para tratar ou prevenir a síndrome clinicamente isolada (CIS). Uma síndrome clinicamente isolada (CIS) é um ataque monossintomático único compatível com a MS, como neurite óptica, sintomas do tronco cerebral e mielite parcial. Pacientes com CIS que experimentam um segundo ataque clínico são geralmente considerados como tendo esclerose múltipla clinicamente definida (CDMS). Mais de 80 por cento dos pacientes com lesões CIS e MRI desenvolvem MS, enquanto aproximadamente 20 por cento têm um processo autolimitado. Pacientes que experimentam um único ataque clínico consistente com a MS podem ter pelo menos uma lesão consistente com esclerose múltipla antes do desenvolvimento de esclerose múltipla clinicamente definida. Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9a atualmente descritos são usados para tratar CIS para que não se desenvolva em MS, incluindo, por exemplo, RRMS.
[0544] Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9A, conforme descrito aqui, são usados para tratar ou prevenir a síndrome radiologicamente isolada (RIS). Em RIS, achados acidentais de imagem sugerem desmielinização inflamatória na ausência de sinais ou sintomas clínicos. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A é usado para tratar RIS para que não se desenvolva em MS, incluindo, por exemplo, RRMS.
[0545] Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9A, como aqui descritos, são usados para tratar uma ou mais de esclerose múltipla benigna; esclerose múltipla recidivante-remitente (RRMS); esclerose múltipla progressiva secundária (SPMS); esclerose múltipla recidivante progressiva (PRMS); e esclerose múltipla progressiva primária (PPMS).
[0546] A esclerose múltipla benigna é um diagnóstico retrospectivo, caracterizado por 1-2 exacerbações com recuperação completa, sem incapacidade duradoura e sem progressão da doença por 10 a 15 anos após o início inicial. A esclerose múltipla benigna pode, no entanto, progredir para outras formas de esclerose múltipla. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9a é usado para tratar a esclerose múltipla benigna, para que não se desenvolva em MS.
[0547] Pacientes que sofrem de RRMS experimentam exacerbações esporádicas ou recidivas, bem como períodos de remissão. Lesões e evidências de perda axonal podem ou não ser visíveis na MRI para pacientes com RRMS. Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9a, como aqui descritos, são usados para tratar RRMS. Em algumas modalidades, RRMS inclui pacientes com RRMS; pacientes com SPMS e recaídas sobrepostas; e pacientes com CIS que mostram disseminação da lesão em varreduras MRI subsequentes de acordo com os critérios do McDonald's. Uma recaída clínica, que também pode ser usada aqui como "recaída", "recaída confirmada" ou "recaída clinicamente definida", é o aparecimento de uma ou mais novas anormalidades neurológicas ou o reaparecimento de uma ou mais anormalidades neurológicas observadas anteriormente. Essa mudança no estado clínico deve durar pelo menos 48 horas e ser imediatamente precedida por um estado neurológico relativamente estável ou melhorado, de pelo menos 30 dias. Em algumas modalidades, um evento é contado como uma recaída quando os sintomas do sujeito são acompanhados por alterações neurológicas objetivas observadas, consistentes com um aumento de pelo menos 1,00 na pontuação da Escala de Status de Incapacidade Expandida (EDSS) ou uma nota na pontuação de duas ou mais das sete FS ou duas notas na pontuação de uma das FS em comparação com a avaliação anterior.
[0548] O SPMS pode evoluir a partir de RRMS. Os pacientes acometidos por SPMS apresentam recaídas, um grau decrescente de recuperação durante remissões, remissões menos frequentes e déficits neurológicos mais pronunciados que os pacientes com RRMS. Os ventrículos aumentados, que são marcadores para atrofia do corpo caloso, centro da linha média e medula espinhal, são visíveis em MRI de pacientes com SPMS. Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9a, conforme descrito aqui, são usados para tratar RRMS, para que não se desenvolva em SPMS.
[0549] O PPMS é caracterizado por uma progressão constante de déficits neurológicos crescentes, sem ataques ou remissões distintas. Lesões cerebrais, dano difuso da medula espinhal e evidência de perda axonal são evidentes na MRI de pacientes com PPMS. O PPMS apresenta períodos de exacerbações agudas enquanto prossegue ao longo de um curso de aumento de déficits neurológicos sem remissões. As lesões são evidentes em MRI de pacientes que sofrem de PRMS. Em várias modalidades, o agente de ligação a Clec9A, conforme descrito aqui, é usado para tratar RRMS e / ou SPMS, para que não se desenvolva em PPMS.
[0550] Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A como aqui descritos são usados em um método de tratamento de formas recorrentes de MS. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A é usado em um método de tratamento de formas recorrentes de MS para retardar o acúmulo de incapacidade física e / ou reduzir a frequência de exacerbações clínicas e, opcionalmente, para pacientes que sofreram um primeiro episódio clínico e têm características de MRI compatíveis com MS. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9a, conforme descrito neste documento, são usados em um método de tratamento de piora da MS remitente-
recorrente, MS recorrente-progressiva ou MS secundária-progressiva para reduzir a incapacidade neurológica e / ou a frequência de exacerbações clínicas. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A reduzem a frequência e / ou gravidade das recaídas.
[0551] Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9A são usados em um método de tratamento de formas recorrentes de MS em pacientes que tiveram uma resposta inadequada a (ou são refratários a) uma, duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez ou mais terapias de modificação de doenças (DMTs).
[0552] Em várias modalidades, os sintomas do sujeito podem ser avaliados quantitativamente, como por EDSS, ou diminuir a frequência de recaídas, ou aumentar o tempo para progressão sustentada ou melhorar o comportamento da ressonância magnética (MRI) em estudos frequentes de ressonância magnética e comparar a medição do status do paciente antes e após o tratamento. Em um tratamento bem-sucedido, o status do paciente terá melhorado (por exemplo, o número de medição do EDSS ou a frequência de recaídas diminuirá ou o tempo para progressão sustentada aumentará ou as varreduras MRI mostrarão menos patologia).
[0553] Em algumas modalidades, o paciente pode ser avaliado, por exemplo, antes, durante ou depois de receber os agentes de ligação a Clec9a, por exemplo, para indícios de responsividade. Vários indícios clínicos ou outros de eficácia do tratamento, por exemplo, pontuação no EDSS; varredura MRI; número, taxa ou gravidade da recaída; composto funcional de esclerose múltipla (MSFC); inventário de qualidade de vida em esclerose múltipla (MSQLI); Teste de adição em série com marcapasso (PASAT); teste de modalidades de dígitos de símbolos (SDMT); Teste de caminhada de 25 pés; Teste de peg de 9 buracos; acuidade visual de baixo contraste; Escala de Impacto de Fadiga Modificada; pontuação expandida do status da incapacidade (EDSS); composto funcional de esclerose múltipla (MSFC); Inventário de Depressão de Beck; e o teste de recuperação espacial 7/24 podem ser usados. Em várias modalidades, os agentes de ligação a Clec9A causam uma melhoria em uma ou mais dessas medidas. Além disso, o paciente pode ser monitorado em vários momentos durante um regime. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a Clec9a causam uma melhoria da doença, avaliada pela disseminação de MacDonald no espaço e no tempo. Por exemplo, para disseminação no espaço, imageamento de lesões, como, a título de ilustração, os critérios de imagem Barkhof-Tintore MR, podem ser usadas, incluindo pelo menos uma lesão que aumenta o gadolínio ou 9 lesões T2 hiperintensas; pelo menos uma lesão infratentorial; pelo menos uma lesão justacortical; pelo menos cerca de três lesões periventriculares; e lesão medular. Para disseminação no tempo, a MRI também pode ser usada; por exemplo, se uma varredura MRI do cérebro realizada ≥ 3 meses após um evento clínico inicial demonstrar uma nova lesão que aumenta o gadolínio, isso pode indicar um novo evento inflamatório no CNS, porque a duração do aprimoramento do gadolínio na MS geralmente é menor que 6 semanas. Se não houver lesões que aumentem o gadolínio, mas uma nova lesão em T2 (presumindo uma MRI no momento do evento inicial), pode ser necessária uma repetição da ressonância magnética após mais 3 meses com a demonstração de uma nova lesão em T2 ou lesão que aprimora o gadolínio.
[0554] Em algumas modalidades, os efeitos da doença são avaliados usando qualquer uma das medidas descritas em Lavery, et al. Multiple Sclerosis International, Vol 2014 (2014), Article ID 262350, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[0555] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A resulta em um ou mais de:(a) prevenção de agravamento da incapacidade definida como deterioração de 1,0 ponto no EDSS, (b) aumento no tempo de recaída, (c) redução ou estabilização do número e / ou volume de lesões que aumentam o gadolínio, (d) diminuição da taxa de recaída anualizada, (e) aumento da duração e gravidade da recaída pela pontuação de NRS, (f) diminuição da atividade da doença medida pela ressonância magnética (taxa anual de lesões novas ou em expansão), (g) menor número médio de recaídas em 1 ano ou 2 anos, (h) progressão sustentada da doença, medida pelo EDSS em 3 meses, (i) prevenção da conversão em CDMS, (j) nenhuma ou poucas lesões T2 novas ou melhoradoras, (k) alteração mínima no volume hiperintenso da lesão em T2, (l) aumento do tempo para a MS definida pelo McDonald, (m) prevenção da progressão da incapacidade, medida pela piora sustentada de EDSS em 12 semanas, (n) redução no tempo de recaída em 96 semanas e (o) redução ou estabilização da atrofia cerebral (por exemplo, variação percentual em relação à linha de base).
[0556] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em uma taxa reduzida de recaída (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou maior redução na taxa de recaída) em comparação com a taxa de recaída antes da administração (por exemplo, em comparação com a taxa de recaída após a administração por 12 meses ou por menos de 12 meses, por exemplo, cerca de 10, ou cerca de 8, ou cerca de 4, ou cerca de 2 meses ou menos) de tratamento, ou antes do início do tratamento, quando medido entre 3-24 meses (por exemplo, entre 6-18 meses, por exemplo, 12 meses) após uma recaída anterior.
[0557] Numa modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar na prevenção de um aumento na pontuação de EDSS a partir de um estado de pré-tratamento. A Escala de Status de Incapacidade Expandida de Kurtzke (EDSS) é um método para quantificar a incapacidade na esclerose múltipla. O EDSS substituiu as escalas de status de incapacidade anteriores, que costumavam agrupar pessoas com MS nos colchetes inferiores. O EDSS quantifica a incapacidade em oito sistemas funcionais (FS) e permite que os neurologistas atribuam uma Pontuação de Sistema Funcional (FSS) em cada um deles. Os sistemas funcionais são: piramidal, cerebelar, tronco cerebral, sensorial, intestinal e bexiga, visual e cerebral.
[0558] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em uma pontuação EDSS diminuída
(por exemplo, uma diminuição de 1, 1,5, 2, 2,5, 3 pontos ou mais, por exemplo, durante pelo menos três meses, seis meses, um ano ou mais) em comparação com a pontuação EDSS após a administração dos agentes de ligação a Clec9a (por exemplo, por 12 meses ou por menos de 12 meses, por exemplo, menos de 10, 8, 4 ou menos meses ou antes do início do tratamento).
[0559] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em um número reduzido de novas lesões em geral ou de qualquer tipo (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% de redução), em comparação com o número de novas lesões após a administração dos agentes de ligação a Clec9A por 12 meses ou por menos de 12 meses, por exemplo, menos de 10, 8, 4 ou menos meses ou antes do início do tratamento;
[0560] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em um número reduzido de lesões em geral ou de qualquer tipo (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% de redução), em comparação com o número de lesões após a administração dos agentes de ligação a Clec9a por 12 meses ou por menos de 12 meses, por exemplo, menos de 10, 8, 4 ou menos meses, ou antes do início do tratamento;
[0561] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em uma taxa reduzida de aparecimento de novas lesões em geral ou de qualquer tipo (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% de taxa reduzida), comparado com a taxa de aparecimento de novas lesões após administração por 12 meses ou menos de 12 meses, por exemplo, menos de 10, 8, 4 ou menos meses ou antes do início do tratamento;
[0562] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em um aumento reduzido na área da lesão em geral ou de qualquer tipo (por exemplo, aumento de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%), em comparação com um aumento na área da lesão após a administração por 12 meses ou menos de 12 meses, por exemplo, menos de 10, 8, 4 ou menos meses ou antes do início do tratamento.
[0563] Em uma modalidade, os agentes de ligação a Clec9A são administrados e são eficazes para resultar em uma incidência ou sintoma reduzido de neurite óptica (por exemplo, visão melhorada), em comparação com a incidência ou sintoma de neurite óptica após a administração por 12 meses ou por menos de 12 meses, por exemplo, menos de 10, 8, 4 ou menos meses ou antes do início do tratamento.
[0564] Em várias modalidades, os métodos da invenção são úteis no tratamento de um sujeito humano. Em algumas modalidades, o humano é um ser humano pediátrico. Em outras modalidades, o ser humano é um ser humano adulto. Em outras modalidades, o ser humano é um ser humano geriátrico. Em outras modalidades, o ser humano pode ser referido como um paciente. Em algumas modalidades, o humano é uma fêmea. Em algumas modalidades, o humano é um homem.
[0565] Em certas modalidades, o humano tem uma idade no intervalo de cerca de 1 a cerca de 18 meses, de cerca de 18 a cerca de 36 meses, de cerca de 1 a cerca de 5 anos, de cerca de 5 a cerca de 10 anos, de cerca de 10 a cerca de 15 anos, de cerca de 15 a cerca de 20 anos, de cerca de 20 a cerca de 25 anos, de cerca de 25 a cerca de 30 anos, de cerca de 30 a cerca de 35 anos, de cerca de 35 a cerca de 40 anos, de cerca de 40 a cerca de 45 anos, de cerca de 45 a cerca de 50 anos, de cerca de 50 a cerca de 55 anos, de cerca de 55 a cerca de 60 anos, de cerca de 60 a cerca de 65 anos, de cerca de 65 a cerca de 70 anos, de cerca de 70 a cerca de 75 anos, de cerca de 75 a cerca de 80 anos, de cerca de 80 a cerca de 85 anos, de cerca de 85 a cerca de 90 anos, de cerca de 90 a cerca de 95 anos ou de cerca de 95 a cerca de 100 anos. Em várias modalidades, o humano tem uma idade superior a 30 anos. Imunomodulação
[0566] Em várias modalidades, as presentes composições são capazes de, ou encontram uso em métodos de imunomodulação. Por exemplo,
em várias modalidades, os presentes métodos de tratamento podem envolver a imunomodulação. Em algumas modalidades, a imunemodulação envolve sinalização de IFN, incluindo sinalização de IFN modificada, no contexto de uma célula dendrítica (DC).
[0567] Em várias modalidades, é fornecido um agente de ligação a Clec9a multiespecífico. Em algumas modalidades, esse agente de ligação a Clec9a multiespecífico da invenção reconhece e se liga a Clec9A e um ou mais antígenos encontrados em uma ou mais células imunes, que podem incluir, sem limitação, megacariócitos, trombócitos, eritrócitos, mastócitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, células assassinas naturais, linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos, células T auxiliares, células T assassinas naturais), linfócitos B, células plasmáticas, células dendríticas ou subconjuntos. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A se liga especificamente a um antígeno de interesse e recruta direta ou indiretamente de maneira eficaz uma ou mais células imunes.
[0568] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9a se liga especificamente a um antígeno de interesse e recruta direta ou indiretamente efetivamente uma ou mais células imunológicas para causar um efeito imunossupressor, por exemplo, o agente de ligação a Clec9a recruta direta ou indiretamente uma célula imune imunossupressora. Em algumas modalidades, a célula imune imunossupressora é uma célula T regulatória (ou "Tregs" que, como utilizada neste documento, refere-se a uma subpopulação de células T que modula o sistema imunológico, anula a doença autoimune, mantém a tolerância a autoantígenos e impede a respostas imunes ao tumor). Outras células imunes imunossupressoras incluem células supressoras mieloides (ou "MSC"), as quais, como utilizadas neste documento, se referem a uma população heterogênea de células, definida por sua origem mieloide, estado imaturo e capacidade de suprimir potentemente as respostas das células T); neutrófilos associados a tumores (ou "TANs" que, como utilizados neste documento, se referem a um subconjunto de neutrófilos que são capazes de suprimir as respostas imunes);
macrófagos associados a tumores (ou "TAMs" que, como utilizados neste documento, se referem a um subconjunto de macrófagos que podem reduzir uma resposta imune), macrófagos M2 e / ou mastócitos indutores de tumores (que, como utilizado neste documento, refere-se a um subconjunto de população celular heterogênea, de longa duração e derivada da medula óssea). Além disso, as células imunes imunossupressoras incluem células Th2 e células Th17. Além disso, as células imunes imunossupressoras incluem células imunes, por exemplo, células CD4+ e/ou CD8+, expressando um ou mais receptores inibidores de pontos de verificação (por exemplo, receptores, incluindo CTLA-4, B7-H3, B7-H4, TIM-3, expressos em células imunes que impedem ou inibem respostas imunes descontroladas). Ver Stagg, J. et. al., Immunotherapeutic approach in triple-negative breast cancer. Ther Adv Med Oncol. (2013) 5(3):169- 181).
[0569] Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9a estimula a proliferação de células T regulatórias (Treg). As células Treg são caracterizadas pela expressão do fator de transcrição de Foxp3 (Forkhead box p3). A maioria das células Treg é CD4+ e CD25+ e pode ser considerada um subconjunto de células T auxiliares, embora uma população pequena possa ser CD8+. Assim, a resposta imune que deve ser modulada por um método da invenção pode compreender a indução da proliferação de células Treg, opcionalmente em resposta a um antígeno. Assim, o método pode compreender administrar ao sujeito uma composição compreendendo o antígeno, em que o antígeno está associado a um agente de ligação com afinidade por Clec9A. O antígeno pode ser administrado com um adjuvante que promove a proliferação de células Treg.
[0570] Na medida em que este método envolve estimular a proliferação e diferenciação de células Treg em resposta a um antígeno específico, pode ser considerado um método para estimular uma resposta imune. No entanto, considerando que as células Treg podem ser capazes de modular a resposta de outras células do sistema imunológico contra um antígeno de outras maneiras, por exemplo, inibindo ou suprimindo sua atividade, o efeito no sistema imunológico como um todo pode ser modular (por exemplo, suprimir ou inibir) a resposta contra esse antígeno. Assim, os métodos deste aspecto da invenção podem igualmente ser referidos como métodos de modular (por exemplo, inibir ou suprimir) uma resposta imune contra um antígeno.
[0571] Em algumas modalidades, os métodos inibem ou suprimem terapeuticamente ou profilaticamente uma resposta imune indesejável contra um antígeno específico, mesmo em um sujeito com imunidade preexistente ou com uma resposta imune contínua a esse antígeno. Isso pode ser particularmente útil, por exemplo, no tratamento de doenças autoimunes.
[0572] Sob certas condições, também pode ser possível tolerar um sujeito contra um antígeno específico direcionando o antígeno para uma célula apresentadora de antígeno que expresse Clec9A. A invenção fornece, assim, um método para induzir tolerância em um sujeito a um antígeno, compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo o antígeno, em que o antígeno está associado a um agente de ligação com afinidade por Clec9A e em que o antígeno é administrado na ausência de um adjuvante. A tolerância neste contexto envolve tipicamente a depleção de células imunes que de outra forma seria capaz de responder a esse antígeno ou induzir uma redução duradoura na capacidade de resposta a um antígeno nessas células imunes.
[0573] Pode ser particularmente desejável aumentar uma resposta Treg contra um antígeno ao qual o sujeito exibe, ou corre o risco de desenvolver, uma resposta imune indesejável. Por exemplo, pode ser um autoantígeno contra o qual ocorre uma resposta imune em uma doença autoimune. Exemplos de doenças autoimunes nas quais antígenos específicos foram identificados como potencialmente patogenicamente significativos incluem esclerose múltipla (proteína básica da mielina), diabetes mellitus dependente de insulina (ácido glutâmico descarboxilase), diabetes mellitus resistente à insulina (receptor de insulina), doença celíaca (gliadina) penfigoide bolhoso (colágeno tipo XVII), anemia hemolítica autoimune (proteína Rh), trombocitopenia autoimune (GpIIb /
IIIa), miaestenia gravis (receptor de acetilcolina), doença de Graves (receptor do hormônio estimulador da tireoide), glomerulonefrite, tais como doença de Goodpasture (colágeno alfa3 (IV) NC1) e anemia perniciosa (fator intrínseco). Alternativamente, o antígeno alvo pode ser um antígeno exógeno que estimula uma resposta que também causa danos aos tecidos hospedeiros. Por exemplo, a febre reumática aguda é causada por uma resposta de anticorpo a um antígeno estreptocócico que reage de maneira cruzada com um antígeno de célula muscular cardíaca. Assim, esses antígenos, ou fragmentos ou epítopos particulares dos mesmos, podem ser antígenos adequados para utilização na presente invenção.
[0574] Em algumas modalidades, os presentes agentes, ou métodos que utilizam esses agentes, interrompem a sinalização de Clec9A (por exemplo, via neutralização de Clec9A), por exemplo, reduzindo ou inibindo a ligação de Clec9A ao seu ligando. Algumas doenças autoimunes são caracterizadas por níveis incomumente altos de morte celular e acredita-se que respostas imunes contra autoantígenos associados a essas células possam contribuir para a patogênese dessas condições. Os antagonistas de Clec9A podem, portanto, ser usados para impedir que Clec9A se ligue ao ligando exposto em células mortas e moribundas (por exemplo, aquelas que sofrem morte celular imunogênica) e, portanto, podem inibir ou impedir a estimulação das respostas imunes contra esses antígenos.
[0575] Em várias modalidades, os presentes agentes ou métodos que utilizam esses agentes reduzem ou suprimem células T autorreativas. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9a multiespecífico, opcionalmente através de um sinal de interferon no contexto de uma quimera, causa essa imunossupressão. Em algumas modalidades, o agente de ligação aClec9a multiespecífico estimula a sinalização e / ou expressão de PD-L1 ou PD-L2 que podem suprimir células T autorreativas. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A, opcionalmente através de um sinal de interferon no contexto de uma quimera, causa essa imunossupressão. Em algumas modalidades, o agente de ligação a Clec9A estimula a sinalização e / ou expressão de PD-L1 ou PD-L2 que pode suprimir células T autorreativas.
[0576] Em várias modalidades, os presentes métodos compreendem modular a razão de células T regulatórias para células T efetoras em favor da imunossupressão, por exemplo, para tratar doenças autoimunes. Por exemplo, os presentes métodos, em algumas modalidades, reduzem e / ou suprimem uma ou mais das células T citotóxicas; células T efetoras de memória; células T de memória central; células efetoras de memória de células-tronco CD8+ ; células T efetoras TH1; células T efetoras TH2; células T efetoras TH9; células T efetoras TH17. Por exemplo, os métodos presentes, em algumas modalidades, aumentam e / ou estimulam uma ou mais células T regulatórias CD4+CD25+FOXP3+, células T regulatórias CD4+CD25+, células T regulatórias CD4+CD25-, células T regulatórias CD4+CD25high, células T regulatórias TIM- 3+PD-1+, gene-3 de ativação de linfócitos (LAG-3), células T regulatórias+, células T regulatórias CTLA-4/CD152+, células T regulatórias de neuropilina-1 (Nrp-1)+, células T regulatórias CCR4+CCR8+, células T regulatórias CD62L (L- selectin)+, células T regulatórias CD45RBlow, células T regulatórias CD127low, células T regulatórias LRRC32/GARP+, células T regulatórias CD39+, células T regulatórias GITR+, células T regulatórias LAP+, células T regulatórias 1B11+, células T regulatórias BTLA+,células T regulatórias tipo 1 (células Tr1), células T auxiliares tipo 3 (Th3), células regulatórias do fenótipo de células T assassinas naturais (NKTregs), células T regulatórias CD8+, células T regulatórias CD8+CD28- e/ou células T regulatórias que secretam IL-10, IL-35, TGF-β, TNF- α, Galectina-1, IFN-γ e / ou MCP1.
[0577] Em algumas modalidades, os presentes métodos favorecem sinais inibitórios imunes sobre sinais estimulatórios imunes. Em algumas modalidades, os presentes métodos permitem reverter ou suprimir sinais de ativação imunes ou coestimulatórios. Em algumas modalidades, os presentes métodos permitem fornecer sinais inibitórios imunológicos. Por exemplo, em algumas modalidades, os presentes agentes e métodos reduzem os efeitos de um sinal imune estimulatório, que, sem limitação, é um ou mais de 4-1BB, OX- 40, HVEM, GITR, CD27, CD28, CD30, CD40, ligando ICOS; ligando OX-40, LIGHT (CD258), ligando GITR, CD70, B7-1, B7-2, ligando CD30, ligando CD40, ICOS, ligando ICOS, ligando CD137 e TL1A. Além disso, em algumas modalidades, os presentes agentes e métodos aumentam os efeitos de um sinal inibitório imune, que, sem limitação, é um ou mais de CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160 (também conhecido como BY55), CGEN-15049, quinases CHK 1 e CHK2, A2aR, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e / ou CEACAM-5) e vários ligandos da família B-7 (incluindo, entre outros, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7- H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 e B7-H7. Kits
[0578] A presente invenção também fornece kits para a administração de qualquer agente de ligação a Clec9A aqui descrito (por exemplo, com ou sem agentes terapêuticos adicionais). O kit é um conjunto de materiais ou componentes, incluindo pelo menos uma das composições farmacêuticas da invenção aqui descritas. Assim, em algumas modalidades, o kit contém pelo menos uma das composições farmacêuticas aqui descritas.
[0579] A natureza exata dos componentes configurados no kit depende da finalidade a que se destina. Numa modalidade, o kit é configurado com a finalidade de tratar sujeitos humanos.
[0580] Instruções para o uso pode ser incluído no kit. As instruções de uso incluem tipicamente uma expressão tangível que descreve a técnica a ser empregada no uso dos componentes do kit para efetivar um resultado terapêutico desejado, como o tratamento de câncer. Opcionalmente, o kit também contém outros componentes úteis, como diluentes, tampões, transportadores farmaceuticamente aceitáveis, seringas, cateteres, aplicadores, ferramentas de pipetagem ou medição, materiais de bandagem ou outros apetrechos úteis, que serão facilmente reconhecidos pelos versados na matéria.
[0581] Os materiais e componentes montados no kit pode ser fornecido para o praticante armazenado em alguma maneira conveniente e apropriada que preservem a sua operacionalidade e utilidade. Por exemplo, os componentes podem ser fornecidos em temperatura ambiente, refrigerada ou congelada. Os componentes estão tipicamente contidos em materiais de embalagem adequados. Em várias modalidades, o material de embalagem é construído por métodos conhecidos, de preferência para fornecer um ambiente estéril e livre de contaminantes. O material de embalagem pode ter um marcador externo que indica o conteúdo e / ou a finalidade do kit e / ou seus componentes. Definições
[0582] Como utilizado neste documento, "um", "uma" ou "o/a" pode significar um ou mais de um.
[0583] Além disso, o termo “cerca de” quando usado em conexão com uma indicação numérica referenciada significa a indicação numérica referenciada mais ou menos até 10% da indicação numérica referenciada. Por exemplo, o idioma "cerca de 50" cobre a faixa de 45 a 55.
[0584] Uma "quantidade efetiva", quando usada em conexão com usos médicos, é uma quantidade eficaz para fornecer um tratamento mensurável, prevenção ou redução na taxa de patogênese de uma doença de interesse.
[0585] Como utilizado neste documento, algo é "diminuído" se uma leitura da atividade e / ou efeito for reduzida em uma quantidade significativa, como pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, até e incluindo pelo menos cerca de 100%, na presença de um agente ou estímulo em relação à ausência de tal modulação. Como será entendido por um versado na técnica, em algumas modalidades, a atividade diminui e algumas leituras a jusante diminuem, mas outras podem aumentar.
[0586] Por outro lado, a atividade é "aumentada" se uma leitura da atividade e / ou efeito for aumentada em uma quantidade significativa, por exemplo, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, até e incluindo pelo menos cerca de 100% ou mais, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, na presença de um agente ou estímulo, em relação à ausência desse agente ou estímulo.
[0587] Como referido neste documento, todas as porcentagens de composição são em peso da composição total, a menos que especificado de outra forma. Conforme utilizado neste documento, a palavra "incluir" e suas variantes devem ser não limitativas, de modo que a recitação de itens em uma lista não exclua outros itens semelhantes que também podem ser úteis nas composições e métodos de essa tecnologia. Da mesma forma, os termos "pode" e "tem permissão" e suas variantes destinam-se a não ser limitativos, de modo que a recitação de que uma modalidade possa ou possa compreender determinados elementos ou características não exclua outras modalidades da presente tecnologia que não as contenham elementos ou características.
[0588] Embora o termo aberto "compreendendo", como sinônimo de termos como incluir, conter ou ter, seja usado aqui para descrever e reivindicar a invenção, a presente invenção, ou modalidades da mesma, pode ser descrita alternativamente usando termos alternativos como "consistindo em" ou "consistindo essencialmente em".
[0589] Conforme usado neste documento, as palavras "preferido" e "preferivelmente" se referem a modalidades da tecnologia que proporcionam certos benefícios, sob certas circunstâncias. No entanto, outras modalidades também podem ser preferidas, de acordo com as mesmas ou outras circunstâncias. Além disso, a recitação de uma ou mais modalidades preferidas não implica que outras modalidades não são úteis, e não se pretende excluir outras modalidades do escopo da tecnologia.
[0590] A quantidade de composições aqui descritas, necessária para alcançar um efeito terapêutico, pode ser determinada empiricamente de acordo com procedimentos convencionais para a finalidade específica. Geralmente, para administrar agentes terapêuticos para fins terapêuticos, os agentes terapêuticos são dados em uma dose farmacologicamente eficaz. Uma "quantidade farmacologicamente eficaz", "dose farmacologicamente eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para produzir o efeito fisiológico desejado ou quantidade capaz de atingir o resultado desejado, particularmente para o tratamento do distúrbio ou doença. Uma quantidade eficaz como utilizada neste documento incluiria uma quantidade suficiente para, por exemplo, atrasar o desenvolvimento de um sintoma do distúrbio ou doença, alterar o curso de um sintoma do distúrbio ou doença (por exemplo, retardar a progressão de um sintoma da doença), reduzir ou eliminar um ou mais sintomas ou manifestações do distúrbio ou doença e reverter um sintoma de um distúrbio ou doença. O benefício terapêutico também inclui interromper ou retardar a progressão da doença ou distúrbio subjacente, independentemente da melhoria ser realizada.
[0591] Quantidades efetivas, toxicidade e eficácia terapêutica podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal para cerca de 50% da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em cerca de 50% da população). A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada. A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50 / ED50. Em algumas modalidades, são preferidas composições e métodos que exibem grandes índices terapêuticos. Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro, incluindo, por exemplo, ensaios de cultura de células. Além disso, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui o IC50 conforme determinado na cultura de células ou em um modelo animal apropriado. Os níveis das composições descritas no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência. Os efeitos de qualquer dosagem específica podem ser monitorados por um bioensaio adequado. A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, conforme necessário, para se adequar aos efeitos observados do tratamento.
[0592] Em certas modalidades, o efeito resultará em uma alteração quantificável de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, o efeito resultará em uma alteração quantificável de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 50%, cerca de 70% ou mesmo cerca de 90% ou mais. O benefício terapêutico também inclui interromper ou retardar a progressão da doença ou distúrbio subjacente, independentemente da melhoria ser realizada.
[0593] Como utilizado neste documento, "métodos de tratamento" são igualmente aplicáveis ao uso de uma composição para o tratamento das doenças ou distúrbios aqui descritos e / ou composições para uso e / ou usos na fabricação de medicamentos para o tratamento das doenças ou distúrbios aqui descritos.
EXEMPLOS Exemplo 1. Construção e Avaliação de VHHs Específicos para Clec9A Humano Isolamento de VHHs específicos de antígeno
[0594] Uma biblioteca VHH foi construída a partir de um imunizado de uma lhama. Foram realizadas três rodadas consecutivas de panning de uma biblioteca VHH em solução usando células CHO-K1 transfectadas de maneira estável que expressam Clec9A humano. O enriquecimento para fagos específicos de antígeno foi avaliado após cada rodada de panning, comparando o número de partículas de fagomídeo eluídas de células transfectadas (saída) com o número de partículas de fagomídeo usadas para panning (entrada). A produção de fagos aumentou cerca de 10 vezes na 2 a rodada e cerca de 103- vezes na 3ª rodada, em comparação com a produção da 1a rodada.
O fago de entrada era sempre cerca de 1011 e a saída da primeira rodada era de 108 partículas de fago. 285 colônias selecionadas aleatoriamente das 1 a, 2a e 3a rodadas de panning (95 de cada rodada) foram sequenciadas e depois agrupadas com base nas sequências de CDR3. Utilizando extratos periplásmicos em bruto incluindo VHHs, 95 sequências únicas foram analisadas por citometria de fluxo quanto à especificidade para Clec9A humano utilizando células CHO-K1 transfectadas de forma estável com Clec9A humano.
As células CHO-K1 parentais não transfectadas serviram como célula de controle negativo.
Um VHH irrelevante foi utilizado como controle negativo de nanocorpos.
As experiências de citometria de fluxo revelaram que 66 VHHs diferentes, pertencentes a 25 grupos diferentes (ver Figura 3), eram específicos para Clec9A humano.
A Tabela B abaixo fornece uma descrição de 66 clones representando os 66 diferentes genes Clec9A VHH anti-humanos.
E. coli TG1 contendo pMECS de fagomídeo recombinante contendo sequências anti-Clec9A VHH anti- humanas, foi gerada e armazenada a -80°C.
O vetor pMECS codifica resistência à ampicilina.
Tabela B Cepa de E. coli + Nanocorpo (Nb) Nº de referência da NSF Vetor (estoque de glicerol) TG1, pMECS 1LEC 7 4826 TG1, pMECS 1LEC 9 4827 TG1, pMECS 1LEC 26 4828 TG1, pMECS 1LEC 27 4829 TG1, pMECS 1LEC 28 4830
TG1, pMECS 1LEC 30 4831 TG1, pMECS 1LEC 38 4832 TG1, pMECS 1LEC 42 4833 TG1, pMECS 1LEC 51 4834 TG1, pMECS 1LEC 61 4835 TG1, pMECS 1LEC 62 4836 TG1, pMECS 1LEC 63 4837 TG1, pMECS 1LEC 64 4838 TG1, pMECS 1LEC 70 4839 TG1, pMECS 1LEC 84 4840 TG1, pMECS 1LEC 88 4841 TG1, pMECS 1LEC 91 4842 TG1, pMECS 1LEC 92 4843 TG1, pMECS 1LEC 94 4844 TG1, pMECS 2LEC 6 4845 TG1, pMECS 2LEC 13 4846 TG1, pMECS 2LEC 16 4847 TG1, pMECS 2LEC 20 4848 TG1, pMECS 2LEC 23 4849 TG1, pMECS 2LEC 24 4850 TG1, pMECS 2LEC 26 4851 TG1, pMECS 2LEC 38 4852 TG1, pMECS 2LEC 48 4853 TG1, pMECS 2LEC 53 4854 TG1, pMECS 2LEC 54 4855 TG1, pMECS 2LEC 55 4856 TG1, pMECS 2LEC 59 4857 TG1, pMECS 2LEC 60 4858
TG1, pMECS 2LEC 61 4859 TG1, pMECS 2LEC 62 4860 TG1, pMECS 2LEC 63 4861 TG1, pMECS 2LEC67 4862 TG1, pMECS 2LEC 68 4863 TG1, pMECS 2LEC 76 4864 TG1, pMECS 2LEC 83 4865 TG1, pMECS 2LEC 88 4866 TG1, pMECS 2LEC 89 4867 TG1, pMECS 2LEC 90 4868 TG1, pMECS 2LEC 93 4869 TG1, pMECS 2LEC 95 4870 TG1, pMECS 3LEC 4 4871 TG1, pMECS 3LEC 6 4872 TG1, pMECS 3LEC 9 4873 TG1, pMECS 3LEC 11 4874 TG1, pMECS 3LEC 13 4875 TG1, pMECS 3LEC 15 4876 TG1, pMECS 3LEC 22 4877 TG1, pMECS 3LEC 23 4878 TG1, pMECS 3LEC 27 4879 TG1, pMECS 3LEC 30 4880 TG1, pMECS 3LEC 36 4881 TG1, pMECS 3LEC 55 4882 TG1, pMECS 3LEC 57 4883 TG1, pMECS 3LEC 61 4884 TG1, pMECS 3LEC 62 4885 TG1, pMECS 3LEC 66 4886
TG1, pMECS 3LEC 69 4887 TG1, pMECS 3LEC 76 4888 TG1, pMECS 3LEC 82 3889 TG1, pMECS 3LEC 89 4890 TG1, pMECS 3LEC 94 4891 Transformação de deformação não supressora (por exemplo, WK6) com pMECS recombinante
[0595] O gene VHH clonado no vetor pMECS continha a sequência de sinal PelB no N-terminal e na etiqueta HA e etiqueta His6 no C-terminal (líder PelB VHH-HA-His6). A sequência líder PelB direcionou o VHH para o espaço periplásmico da E. coli, e as etiquetas HA e His6 foram utilizados para a purificação e detecção do VHH (por exemplo, ELISA, Western Blot, etc.).
[0596] No vetor pMECS, a etiqueta His6 foi seguida por um códon âmbar de parada (TAG) e este códon âmbar de parada foi seguido pelo gene III do fago M13. Nas cepas supressoras de E. coli (por exemplo, TG1), o códon âmbar de parada foi lido como glutamina e, portanto, o VHH foi expresso como proteína de fusão com a proteína III do fago, que permitiu a exibição do VHH no revestimento do fago para panning. Nas cepas supressoras de TG1, a eficiência da supressão não é de 100% e, portanto, a expressão de VHHs nas cepas supressoras levou a dois tipos diferentes de moléculas de VHH, fundidas à proteína III e sem proteína III). Nas cepas de E. coli não supressoras (por exemplo, WK6), o códon âmbar de parada foi lido como códon de parada e, portanto, o VHH resultante não foi fundido com a proteína III.
[0597] Para expressar e purificar VHHs clonados no vetor pMECS, foi preparado pMECS contendo o gene VHH de interesse e o plasmídeo foi transformado em uma cepa não supressora (por exemplo, WK6). O VHH do clone resultante foi sequenciada usando o iniciador MP057 (5'- TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3') (SEQ ID NO:1070) para verificar a identidade do clone. A capacidade de ligação ao antígeno foi testada novamente por ELISA ou por qualquer outro ensaio apropriado. A cepa não supressora (por exemplo, WK6) contendo o vetor pMECS recombinante com o gene VHH foi usada para a expressão e purificação do VHH.
[0598] No vector pMECS, a etiqueta His6 foi clivada após armazenamento do VHH. Por conseguinte, o gene VHH foi reclonado do pMECS no vetor pHEN6c, se a etiqueta His6 fosse usado para detecção, etc. Especificamente, o gene VHH foi amplificado por PCR usando pMECS recombinante que abrigava o gene VHH como modelo e iniciadores A6E e PMCF. Os iniciadores A6E e PMCF foram os iniciadores estrutura1 e estrutura4, respectivamente. As sequências iniciadoras foram as seguintes: Iniciador A6E (5’ GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR* GGA GG 3’) (SEQ ID NO:1071). Iniciador PMCF (5’ CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’) (SEQ ID NO:1072). Iniciador reverso universal (5’ TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’) (SEQ ID NO:1073). Iniciador universal direto (5’ CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’) (SEQ ID NO:1074). *R significa A ou G. As sequências de reconhecimento PstI, NotI e BstEII (Eco91I) são mostradas em negrito, itálico e sublinhado, respectivamente.
[0599] O protocolo de amplificação incluiu cerca de 30 ciclos de PCR, cada ciclo incluiu 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C e 45 segundos a 72°C, seguidos por 10 minutos de extensão a 72°C no final da PCR. Um fragmento de cerca de 400 pb foi amplificado.
[0600] O produto de PCR foi purificado (por exemplo, pelo kit de purificação de Qiaquick PCR da Qiagen) e digerido durante a noite com PstI. O produto de PCR purificado foi digerido com BstEII durante a noite (ou com Eco91I de Fermentas). A temperatura usada para digestão variou. Por exemplo, a digestão com BstEII foi feita a 50°C ou 60°C, dependendo do fornecedor da enzima.
[0601] Para a ligação, o produto de PCR foi purificado. O vetor pHEN6c foi digerido com PstI por 3 horas, purificado como descrito acima e depois digerido com BstEII por 2 a 3 horas. Alternativamente, a digestão foi realizada usando Eco91I da Fermentas. O vetor digerido foi executado em gel de agarose a 1%, com a banda de vetor retirada do gel e purificada (por exemplo, pelo kit de extração de gel Qiaquick da Qiagen). O fragmento de PCR foi subsequentemente ligado ao vetor.
[0602] As células WK6 eletrocompetentes foram transformadas com a reação de ligação e os transformantes foram selecionados usando placas de LB / agar / ampicilina (100 g / ml) / glicose (1-2%). Os clones positivos foram pesquisados por PCR usando iniciadores universais reversos e universais para frente. Um fragmento de cerca de 550 pb foi amplificado, se o inserto estivesse presente. Para verificar a identidade dos clones, pelo menos 2 clones por cada VHH foram sequenciados usando iniciadores reversos universais. A capacidade de ligação ao antígeno foi testada novamente por ELISA ou por qualquer outro ensaio apropriado.
[0603] Seguindo o protocolo acima, foi gerado o gene VHH clonado no vetor pHEN6c que continha a sequência de sinal PelB no N-terminal e a cauda His6 no C-terminal. A sequência líder PelB direcionou o VHH para o espaço periplásmico daE. coli, e a etiqueta His foi utilizada para a purificação e detecção do VHH (por exemplo em ELISA, Western Blot, etc.). Expressão e purificação de VHHs
[0604] Expressão e purificação de VHHs foram realizadas. Especificamente, no dia 1, 10-20 ml de LB + ampicilina (100 µg / ml) + glicose (1%) foram inoculados com uma colônia WK6 recém-transformada. Esta pré- cultura foi incubada a 37°C durante a noite com agitação a 200-250 rpm. No dia 2, um meio de TB foi usado para expressar os VHHs. O meio de TB incluía, por litro:2,3 g de KH2PO4, 16,4 g fr K2HPO4. 3H2O, 12 g de Triptona (Duchefa Biochemie), 24 g de Levedura (Duchefa Biochemie), e 4 ml de glicerol a 100% (Duchefa Biochemie)
[0605] Um frasco agitador desconectado de 1 litro foi preenchido com 330 ml de TB e autoclavado. KH2PO4 e K2HPO4. 3H2O não foram autoclavados. Em vez disso, KH2PO4 e K2HPO4. 3H2O foram preparados, esterilizados por filtro e depois adicionados ao restante do meio que já era autoclavado. Cerca de 1 ml da pré-cultura foi adicionado a 330 ml de TB suplementado com 100 µg / ml de ampicilina, 2 mM de MgCl2 e 0,1% de glicose e posteriormente cresceu a 37°C com agitação (200-250 rpm) até um OD600 de 0,6 -0,9 ter sido atingido. Foi adicionado IPTG (concentração final de 1 mM) para induzir a expressão de VHH. A cultura foi incubada a 28°C com agitação durante a noite (cerca de 16 a 18 horas). O OD600 após a indução durante a noite era geralmente entre 25 e 30. Pelo menos 1 litro de cultura (3 garrafas) por clone foi preparado com um rendimento médio entre 1 e 15 mg / l.
[0606] A extração dos VHHs do periplasma de E. coli foi realizada no dia 3. As soluções utilizadas incluíram:TES:Tris 0,2 M, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, sacarose 0,5 M, TES / 4:TES diluído 4 vezes em água.
[0607] As culturas induzidas durante a noite foram centrifugadas durante 8 minutos a 8000 rpm. Os sedimentos celulares de cultura de 1 litro foram ressuspensos em 12 ml de TES por pipetagem para cima e para baixo e agitados durante 1 hora em gelo. Por cada 12 ml de TES utilizado, foram adicionados cerca de 18 ml de TES / 4 e incubados em gelo durante mais uma hora com agitação seguida de centrifugação durante 30 minutos a 8000 rpm a 4°C. O sobrenadante que continha proteínas extraídas do espaçamento periplásmico foi transferido para tubos de falcão frescos.
[0608] Os VHHs foram posteriormente purificados pelo IMAC, que utilizou a seguinte solução:Seleção HIS (SIGMA), PBS e NaAcetate 50 mM, pH 4,6.
[0609] His-select foi equilibrado com PBS. Especificamente, por extrato periplásmico derivado de 1 litro de cultura, foi adicionado 1 ml de resina (cerca de 2 ml de solução His-select) a um tubo de 50 ml de falcão. Também foi adicionado PBS ao volume final de 50 ml e misturado. A centrifugação foi realizada a 2000 rpm por 2 minutos e o sobrenadante foi descartado. A resina foi lavada com PBS duas vezes como descrito acima. O extrato periplásmico foi adicionado à resina, incubado por 30 minutos a 1 hora em temperatura ambiente com agitação suave. As amostras foram carregadas nas colunas PD-10 com um filtro no fundo (GE Healthcare, cat. No. 17-0435-01) e lavadas com 50 a 100 ml de PBS (50-100 ml de PBS por 1 ml de resina usada). A eluição foi realizada por 3 vezes, cada vez com 1 ml de PBS / imidazol 0,5 M por 1 ml de resina utilizada (para uma eluição eficiente, ressuspender as esferas e deixar durante a noite a 4°C com o fundo da coluna fechado). A diálise foi realizada durante a noite a 4°C contra PBS (ponto de corte 3500 daltons) para remover o imidazol. Para diálise eficiente, o tampão de diálise (PBS) foi trocado 2-3 vezes. Alternativamente, em vez de eluição com imidazol, os VHHs ligados podem ser eluídos com 10 ml de acetato de Na 50 mM, pH 4,6. Se 50 mM de acetato de Na, pH 4,6, foram utilizados para eluir VHHs, os VHHs eluídos foram imediatamente neutralizados com 1M Tris, pH 8,0, e não foi necessária diálise.
[0610] A quantidade de proteína foi estimada por medição de OD 280 da amostra eluída. O coeficiente de extinção de cada clone foi determinado pela ferramenta protParam sob análise de estrutura primária no servidor de proteômica Expasy. Uma purificação adicional de VHHs poderia ser alcançada por diferentes métodos. Por exemplo, as amostras poderiam ser concentradas (ponto de corte de Vivaspin 5000 MW, Vivascience) por centrifugação a 2000 rpm a 4°C até que um volume apropriado para carregamento em um Superdex 75 16/60 fosse obtido (máx. 4 ml). A amostra concentrada foi carregada em uma coluna Superdex 75 16/60 equilibrada com PBS. As frações de pico foram reunidas e as medições de OD280 foram realizadas para quantificação. Em geral, os VHHs eluíram após 85-95 minutos quando executados a 1 ml / min. Alíquotas de amostras de VHH concentradas foram armazenadas a -20°C a uma concentração de cerca de 1 mg / ml. Exemplo 2. Caracterização funcional de VHHs de ligação a Clec9A humano
[0611] As características de ligação de vários VHHs (como descrito no Exemplo 1) foram testadas por citometria de fluxo. As células HEK293-T foram transfectadas com um plasmídeo de expressão de Clec9A humano e coradas com os VHHs marcados com His a 2 µg / ml, seguidos de coloração com um anticorpo conjugado anti-His Fitc. A ligação foi medida detectando a fluorescência celular através de citometria de fluxo. Os resultados, como mostrado na Figura 4, mostram que os VHHs se ligam a Clec9A. Exemplo 3. Sinalização de células dendríticas induzida por quimeras anti-Clec9A VHH humanas
[0612] O termo "AcTaferon" é usado aqui para referenciar uma quimera baseada em interferon. No exemplo a seguir, a menos que indicado, as mutações no IFN são relativas ao IFN-α2 humano - SEQ ID NO: 2.
[0613] Foi realizado um ensaio de sinalização de células dendríticas pSTAT. As quimeras estudadas foram fusões anti-Clec9A VHH anti-humanas/ / IFN R149A humanas. Duas doses dos agentes foram estudadas:100 ng / ml e 500 ng / ml.
[0614] Os VHHs Clec9A anti-humanos utilizados neste Exemplo foram 2LEC13, 2LEC20, 2LEC38, 3LEC6 e 3LEC30.
[0615] Resumidamente, as PBMCs humanas foram isoladas a partir de sangue obtido de doadores saudáveis. Foram colhidos aproximadamente 120 ml de sangue de cada doador usando tubos revestidos com heparina (12 tubos). O sangue foi mantido à temperatura ambiente e processado imediatamente. Brevemente, o sangue foi diluído 1:1 com DPBS e 25 ml foram cuidadosamente mergulhados em 15 ml de linfólito H. Após centrifugação, os anéis das células mononucleares foram coletados e as células foram lavadas três vezes com DPBS (solução salina tamponada com fosfato fosfato de PBS Dulbecco, Wisent,
catálogo #311-425-LL) e contadas. As células dendríticas foram enriquecidas a partir da população de PBMC usando o "kit de enriquecimento de DC" contendo uma combinação de anticorpos monoclonais específicos da linhagem em PBS e uma suspensão de partículas magnéticas (número de catálogo STEMCELL Technologies 19251), de acordo com as instruções do fabricante.
[0616] As células dendríticas (DC) foram estimuladas por 15 minutos na presença ou ausência de itens e controles de teste (PBS) e o nível de STAT1 fosforilado (pSTAT1, especificamente pY701-STAT1) foi determinado em populações isoladas de células DC (Lin- (CD14 / CD16 / CD20 / CD56 / CD3) / HLA-DR +) por citometria de fluxo. Após a estimulação, as células foram fixadas (tampão de fixação BD Cytofix, BD Bioscience, catálogo # 554655), depois permeabilizadas com tampão Perm II (tampão PhosFlow Perm, BD Bioscience, catálogo # 558052). As células foram então coradas para phosphoSTAT1 e para marcadores de superfície DC (Lin- / HLA-DR +) (ver a Tabela C abaixo). As colorações intra-celulares e de superfície foram realizadas ao mesmo tempo. A citometria de fluxo e a aquisição dos dados foram realizadas após a lavagem das células com DPBS.
Tabela C:Lista de Fluorocromo Clone Finalidade Número anticorpos para Catálogo coloração por Fornecedor citometria de fluxoMarcador/Nome Produto pSTAT1 AlexaFluor647 4a Fosfto-STAT1 BD-562070 CD3 anti-humano PE UCHT1 Marcador BD-561809 células T Depleção linhagem CD14 anti-humano PE M5E2 Marcadores BD-555398 células T Depleção linhagem CD16 anti-humano PE B73.1 NK, Neutrófilos BD-561313 Marcador monócitos Depleção linhagem CD19 anti-humano PE HIB19 Marcadores BD-555413 células B Depleção linhagem CD56 anti-humano PE B159 Marcadores BD-555516 células NK Depleção linhagem
HLA-DR anti- FITC TU36 Marcador MHC BD-555560 humano II Discriminação
DC CD11c anti-humano BV421 B-Ly6 Discriminação BD-562561
DC Coloração célula Aqua N/Ap Corante ThermoFisher- morta Aqua Fixável viabilidade L34957 MORTA/VIVA IgG camundongo N/Ap N/Ap Bloqueador de ThermoFisher- normal receptor Fc 10400C Agente de bloqueio
[0617] A Figura 5 mostra os dados, expressos como uma variação dobrada da porcentagem de células dendríticas pSTAT + .
[0618] Este estudo mostra claramente que um construto de direcionamento de antígeno CLEC9A humano compreendendo um agente de sinalização de IFN cuja atividade é recuperável após o direcionamento de células (IFN R149A) promover a sinalização de IFN em células dendríticas humanas (conforme determinado pela indução de pSTAT1). Assim, o direcionamento do IFN para células dendríticas humanas usando uma fração de direcionamento direcionada ao antígeno CLEC9A humano resulta no desencadeamento de uma transdução de sinal pronunciada do IFN. Exemplo 4. Construção e Avaliação de VHHs Específicos para Clec9A Humano
[0619] As variantes de Clec9A VHH R1CHCL50 humano e 3LEC89 foram produzidas e analisadas. Os resíduos característicos típicos da estrutura VHH nas posições 37, 44, 45, 47 e 84 (US2008 / 0107601; tabela de numeração Kabat) não foram humanizados, enquanto o Q N-terminal em ambas as sequências foi modificado para D para evitar a formação de piroglutamato. Quatro sequências variantes de R1CHCL50 e 3LEC89 foram geradas e testadas. R1CHCL50 (tipo selvagem):
RELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:327); R1CHCL50_opt1 (E1D-A74S-K83R-Q108L):
RELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:328); R1CHCL50_opt2 (E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q):
RELVARITNLGLPNYADSVTGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:329); R1CHCL50_opt3 (E1D-A74S-K83R-Q108L-T64K):
RELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:330); R1CHCL50_opt4 (E1D-A74S-K83R-Q108L-H13Q-T64K):
RELVARITNLGLPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYL VALKAEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:331); 3LEC_89 (tipo selvagem):
QRELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCK AFTRGDDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:332); 3LEC_89_opt1 (E1D-Q5V-Q108L):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:333);
3LEC_89_opt2 (E1D-Q5V-Q108L-A74S):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSGNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:334); 3LEC_89_opt3 (E1D-Q5V-Q108L-G75K):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:335); e 3LEC_89_opt4 (E1D-Q5V-Q108L-A74S-G75K):
RELVAAITNQGAPTYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCKA FTRGDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:336). Produção e purificação
[0620] O tipo selvagem e as variantes (opt1 a opt4) foram sintetizados por GeneArt (ThermoFisher) e clonados no vetor pHEN6C para expressão periplásmica bacteriana com uma etiqueta his6 C-terminal. Os construtos resultantes foram transformados em células WK6. A expressão de VHH foi induzida durante a noite com IPTG 1 mM, células peletizadas e extratos periplásmicos preparados usando TES (Tris 0,2 M pH 8,0, EDTA 0,5 mM, sacarose 0,5 M) e tampões TES / 4. As proteínas foram purificadas a partir de extratos usando a resina de afinidade TALON Metal de acordo com as diretrizes do fabricante e o imidazol foi removido das amostras usando colunas PD10 (GE Healthcare). Os rendimentos médios variaram de 0,8 a 5 mg por litro de cultura (ver Figura 6 e Tabela D). Tabela D:Rendimento (mg por litro) R1CHCL50 2,69 R1CHCL50_opt1 (E1D-A74S-K83R- Q108L) 0,86
R1CHCL50_opt2 (E1D-A74S-K83R- Q108L-H13Q): 1,15 R1CHCL50_opt3 (E1D-A74S-K83R- Q108L-T64K): 1,30 R1CHCL50_opt4 (E1D-A74S-K83R- Q108L-H13Q-T64K): 1,53 3LEC89 4,31 3LEC_89_opt1 (E1D-Q5V-Q108L): 1,65 3LEC_89_opt2 (E1D-Q5V-Q108L-A74S) 2,45 3LEC_89_opt3 (E1D-Q5V-Q108L-G75K) 2,33 3LEC_89_opt4 (E1D-Q5V-Q108L-A74S- G75K) 1,39 Termoestabilidade e afinidade
[0621] As termoestabilidades dos VHH resultantes foram determinadas usando laranja SYPRO (Sigma-Aldrich) em um sistema LightCycler 480 (Roche), de acordo com as diretrizes do fabricante. As temperaturas de fusão, calculadas com o software Protein Melting Analysis (Roche), variaram de 75 a 83ºC e estão resumidas na Tabela E. Tabela E:Temperatura de fusão (°C) R1CHCL50 77,51 R1CHCL50_opt1 (E1D-A74S-K83R- Q108L) 78,51 R1CHCL50_opt2 (E1D-A74S-K83R- Q108L-H13Q): 79,38 R1CHCL50_opt3 (E1D-A74S-K83R- Q108L-T64K): 82,60 R1CHCL50_opt4 (E1D-A74S-K83R- Q108L-H13Q-T64K): 82,07 3LEC89 75,08
3LEC_89_opt1 (E1D-Q5V-Q108L): 73,14 3LEC_89_opt2 (E1D-Q5V-Q108L-A74S) 77,46 3LEC_89_opt3 (E1D-Q5V-Q108L-G75K) 77,35 3LEC_89_opt4 (E1D-Q5V-Q108L-A74S- G75K) 77,47 Afinidade:
[0622] As afinidades dos AFN's para Clec9A foram determinadas usando a tecnologia de interferometria de camada biológica em um sistema Octet (ForteBio). Para este fim, CLEC9A humano biotinilado foi capturado em um sensor de estreptavidina e a afinidade determinada para 3 concentrações de VHH (50, 100 e 200 nM). Os resultados de uma análise global das 3 concentrações testadas estão resumidos na Tabela F. Tabela F:Afinidades de VHH's para Clec9A humano VHH KD (M) Kon (1/Ms) Kdis (1/s) R1CHCL50 1. 719E-09 4. 10E+05 7. 05E-04 R1CHCL50_opt1 (E1D-A74S-K83R- 1. 291E-09 4. 92E+05 6. 35E-04 Q108L) R1CHCL50_opt2 (E1D-A74S-K83R- 1. 147E-09 6,30E +05 7. 23E-04 Q108L-H13Q): R1CHCL50_opt3 (E1D-A74S-K83R- 1. 786E-09 5. 59E+05 9. 98E-04 Q108L-T64K): R1CHCL50_opt4 (E1D-A74S-K83R- 2. 697E-09 4. 38E+05 1. 18E-03 Q108L-H13Q-T64K): 3LEC89 1. 74E-09 4. 16E+05 7. 25E-04 3LEC_89_opt1 (E1D-Q5V-Q108L): 2. 204E-09 3. 91E+05 8. 61E-04 3LEC_89_opt2 (E1D-Q5V-Q108L-A74S) 2. 413E-09 3. 38E+05 8. 17E-04 3LEC_89_opt3 (E1D-Q5V-Q108L-G75K) 2. 556E-09 4. 38E+05 1. 12E-03 3LEC_89_opt4 (E1D-Q5V-Q108L-A74S- 2. 352E-09 4. 17E+05 9. 82E-04 G75K)
Exemplo 5. Construção e avaliação de proteínas quiméricas direcionadas a Clec9A humano
[0623] As proteínas quiméricas compreendendo uma fração de Clec9A humana e uma fração de sinalização de IFNα2 humana mutada (R149A) foram construídas e analisadas. Construção, Produção e Purificação de Proteínas Quiméricas
[0624] Os R1CHCL50 e 3LEC89 de Clec9A VHH humano foram fundidos geneticamente com IFNα2 R149A humano através de um ligante (GGS)3. Os construtos foram sintetizados por GeneArt (ThermoFisher) e clonados no vetor pHEN6C para expressão periplásmica bacteriana. Após transformação nas células WK6, a expressão de AFN foi induzida durante a noite com IPTG 1 mM, células foram peletizadas e extratos periplásmicos preparados usando TES (Tris 0,2 M pH 8,0, EDTA 0,5 mM, sacarose 0,5 M) e tampões TES / 4. As proteínas foram purificadas a partir de extratos usando a resina de afinidade TALON Metal de acordo com as diretrizes do fabricante e o imidazol foi removido das amostras usando colunas PD10 (GE Healthcare). Afinidade:
[0625] Afinidades das proteínas quiméricas para Clec9A foram determinadas usando a tecnologia de interferometria de camada biológica em um sistema Octet (ForteBio). Para este fim, o CLEC9A humano biotinilado foi capturado em um sensor de estreptavidina e a afinidade foi determinada para 3 concentrações (12,5, 25 e 50 nM) de cada proteína quimérica. Os resultados de uma análise global das 3 concentrações testadas estão resumidos na Tabela G. Tabela G:Afinidades de proteínas quiméricas direcionadas a Clec9A humano Proteína quimérica KD (M) Kon (1/Ms) Kdis (1/s) R1CHCL50-(GGS)3-hIFNa2_R149A 1. 95E-09 1. 34E+05 2. 60E-04 3LEC89-(GGS)3-hIFNa2_R149A 1. 76E-09 2. 45E+05 4. 32E-04 Atividade biológica
[0626] O clone HL116 é derivado da linhagem celular HT1080 humana (ATCC CCL-121). Ele contém o gene da luciferase do vagalume controlado pelo promotor 6-16 indutível pelo IFN. As células HL116 parentais foram transfectadas com um vetor de expressão que codifica a sequência Clec9A humana. Os clones transfectados estáveis foram selecionados em meio contendo G418. As células parentais HL116 e HL116-hClec9A foram semeadas durante a noite a 20. 000 células por 96 poços e estimuladas com uma diluição em série de proteína quimérica por 6 horas. A atividade da luciferase foi medida em lisados celulares. Gráficos representativos são mostrados nas Figuras 7A-B. Como mostrado nas Figuras 7A-B, as proteínas quiméricas quase não tiveram atividade nas células H116 negativas para Clec9A. Mas a atividade das protéinas quiméricas foi recuperada em células H116 que expressam Clec9A. Exemplo 6. Eficácia in vivo de CLEC9A AcTaferons humanos
[0627] Os CLEC9A VHHs 2LEC 16, 3LEC 22, 1LEC 28, 3LEC 30 e 3LEC 89, que pertencem a 4 grupos de sequências diferentes, foram selecionados para serem avaliadas quanto à sua eficácia antitumoral in vivo em composições humanas de AcTaferon (AFN) direcionadas a VHH CLEC9A (por exemplo,, 2LEC16-hIFNa2_R149A, 3LEC22-hIFNa2_R149A, 1LEC28- hIFNa2_R149A, 3LEC30-hIFNa2_R149A ou 3LEC89-hIFNa2_R149A).
[0628] Modelo de tumor de linhagem celular de linfoma folicular RL humano (RL) em camundongos com sistema imunológico humanizado:Os camundongos com um sistema imunológico humanizado foram gerados de acordo com o seguinte protocolo. As células mononucleares foram coletadas após centrifugação em gradiente de densidade usando Lymphoprep de amostras de sangue de cordão humano HLA-A2+. Células-tronco hematopoiéticas (HSC) CD34+ humanas foram isoladas pela tecnologia MACS e examinadas quanto à pureza de CD34+ e contaminação por CD3+ usando FACS. HSC's com uma pureza de CD34> 80% foram injetados intra-hepaticamente em camundongos NSG com 2-3 dias de idade que foram submetidos a tratamento de irradiação mieloablativa a 100 cGy. De 8 a 12 semanas após a injeção do HSC, o enxerto de células humanas foi analisado com marcadores CD45 de panleucócitos humano e de camundongo, usando FACS e camundongos com > 5% de células CD45 humanas, de linfócitos totais viáveis no sangue, foram selecionados para implante de tumor. Doze semanas após a injeção de HSC, os camundongos foram injetados subcutaneamente com 2 x106 RL de células tumorais. Cinco dias depois, os camundongos foram tratados com Flt3L injetado peritonealmente diariamente até o dia 18. O tratamento com PBS (controle) ou 30 µg de AFNs direcionados para CLEC9A humano foi iniciado por administração perilesional diária a partir do dia 11 (quando os tumores atingiram tamanhos de cerca de 10 mm²) após a injeção do tumor.
[0629] Como mostrado na Figura 8, os AFNs direcionados por CLEC9A VHH tinham atividade antitumoral in vivo .
[0630] Enquanto a invenção tem sido descrita em conexão modalidades específicas da mesma, será compreendido que ela é também capaz de ainda outras modificações, e este pedido tem a intenção de cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção que segue, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais divergências da presente divulgação como conhecido e de costume na técnica da qual a invenção é pertinente, e como pode ser aplicado às características essenciais na técnica conhecida aqui apresentada anteriormente, e como segue no escopo das reivindicações anexadas.
[0631] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que a experimentação de rotina, que inúmeros equivalentes às modalidades específicas são descritos especificamente neste documento. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos no escopo das seguintes reivindicações.
[0632] Todas as patentes e publicações referidas aqui estão incorporados em sua totalidade por meio deste por referência.
[0633] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para preceder tal publicação em virtude de invenção prévia.
[0634] Neste documento, todos os cabeçalhos são simplesmente para a organização e não se destinam a limitar a divulgação de forma alguma. O conteúdo de qualquer seção individual pode ser igualmente aplicável a todas as seções.
REFERÊNCIAS A seguir, são incorporados por referência em sua totalidade: Hart DN (1997) Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response. Blood 90:3245-3287 Banchereau J and Steinman RM (1998) Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245-252 Bell D, Young JW and Banchereau J (1999) Dendritic cells. Advances in Immunology 72:255-324 Shortman K and Liu YJ (2002) Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Reviews Immunology 2:151-161 Poulin LF, Salio M, Griessinger E, Anjos-Afonso F, Craciun L, Chen JL, Keller AM, Joffre O, Zelenay S, Nye E, Le Moine A, Faure F, Donckier V, Sancho D, Cerundolo V, Bonnet D and Reis e Sousa C (2010) Characterization of human DNGR-1+ BDCA3+ leukocytes as putative equivalents of mouse CD8alpha+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine 207:1261-1271 Shortman K and Heath WR (2010) The CD8+ dendritic cell subset. Immunological Reviews 234:18-31 Den Haan JM, Lehar SM and Bevan MJ (2000) CD8(+) but not CD8(- ) dendritic cells cross-prime cytotoxic T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine 192:1685-1696 Heath WR, Belz GT, Behrens GM, Smith CM, Forehan SP, Parish IA, Davey GM, Wilson NS, Carbone FR and Villadangos JA (2004) Cross-
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Claims (52)
1. Agente de ligação a Clec9A, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com uma de SEQ ID NO:332.
2. Agente de ligação a Clec9A, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma fração de alvo compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3), em que: (a) CDR1 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:51; (b) CDR2 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:136; e (c) CDR3 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID Ns:202.
3. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de SEQ ID NOs:333-336.
4. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a fração de alvo é um anticorpo de comprimento completo, um anticorpo de domínio simples, um anticorpo de cadeia pesada apenas recombinante (VHH), um anticorpo de cadeia simples (scFv), um anticorpo de cadeia pesada apenas de tubarão (VNAR), uma microproteína, uma darpin, uma anticalina, uma adnectina, um aptâmero, um Fv, um Fab, um Fab', um F(ab')2, uma molécula mimética de peptídeo, um ligante natural para um receptor ou uma molécula sintética.
5. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a fração de alvo é um anticorpo de domínio simples.
6. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a fração de alvo compreende um VHH, um VHH humanizado ou um VHH camelizado.
7. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A compreende um ou mais agentes de sinalização.
8. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente de sinalização é selecionado de um ou mais de um interferon, uma interleucina e um fator de necrose tumoral, qualquer dos quais é opcionalmente modificado.
9. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A compreende uma ou mais frações de alvo adicionais.
10. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais frações de alvo adicionais reconhecem e opcionalmente modulam funcionalmente um antígeno tumoral.
11. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais frações de alvo adicionais reconhecem e opcionalmente modulam funcionalmente um antígeno em uma célula imune.
12. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula imune é selecionada de uma célula T, uma célula B, uma célula dendrítica, um macrófago, neutrófilo e uma célula NK.
13. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A recruta células T citotóxicas para células tumorais ou para o ambiente tumoral.
14. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A reconhece e liga a Clec9A sem modular substancialmente funcionalmente sua atividade.
15. Composição de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que codifica os agentes de ligação a Clec9A de qualquer uma das reivindicações acima.
16. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico da reivindicação 15.
17. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A é adequado para uso em um paciente tendo um ou mais de: câncer, infecções, distúrbios imunes e/ou doenças autoimunes.
18. Agente de ligação a Clec9A, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma fração de alvo compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3), em que: (a) CDR1 compreende uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOS:2-78; (b) CDR2 compreende uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOS:79-192; e (c) CDR3 compreende uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOS:193-257.
19. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fração de alvo é um anticorpo de comprimento completo, um anticorpo de domínio simples, um anticorpo de cadeia pesada apenas recombinante (VHH), um anticorpo de cadeia simples (scFv), um anticorpo de cadeia pesada apenas de tubarão (VNAR), uma microproteína, uma darpin, uma anticalina, uma adnectina, um aptâmero, um Fv, um Fab, um Fab', um F(ab') 2, uma molécula mimética de peptídeo, um ligante natural para um receptor ou uma molécula sintética.
20. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a fração de alvo é um anticorpo de domínio simples.
21. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a fração alvo compreende uma VHH, uma VHH humanizada ou uma VHH camelizada.
22. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com uma de SEQ ID NO:258-323 ou 327-336.
23. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A compreende um ou mais agentes de sinalização.
24. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente de sinalização é selecionado de um ou mais de um interferon, uma interleucina e um fator de necrose tumoral, qualquer dos quais é opcionalmente modificado.
25. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A compreende uma ou mais frações de alvo adicionais.
26. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais frações de alvo adicionais reconhecem e opcionalmente modulam funcionalmente um antígeno tumoral.
27. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais frações de alvo adicionais reconhecem e opcionalmente modulam funcionalmente um antígeno em uma célula imune.
28. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula imune é selecionada de uma célula T, uma célula B, uma célula dendrítica, um macrófago, neutrófilo e uma célula NK.
29. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A recruta células T citotóxicas para células tumorais ou para o ambiente tumoral.
30. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A reconhece e liga a Clec9A sem modular substancialmente funcionalmente sua atividade.
31. Composição de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que codifica os agentes de ligação a Clec9A de qualquer uma das reivindicações 18 a 30.
32. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico da reivindicação 31.
33. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 32, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A é adequado para uso em um paciente tendo um ou mais de: câncer, infecções, distúrbios imunes e/ou doenças autoimunes.
34. Método para tratar ou prevenir câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um agente de ligação a Clec9A de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 18 a 22 e um agente de sinalização selecionado de um ou mais de um interferon, uma interleucina e um fator de necrose tumoral.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o agente de sinalização é modificado.
36. Método, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de um ou mais de carcinoma de células basais, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer no cérebro e no sistema nervoso central; câncer de mama; cancro do peritôneo; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer do cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer de cabeça e pescoço;
câncer gástrico (incluindo cancro gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; câncer de rim ou renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão); melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer da cavidade oral (lábios, língua, boca e faringe); câncer ovariano; câncer pancreático; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carcinoma da glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; câncer uterino ou do endométrio; câncer do sistema urinário; câncer vulvar; linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não-Hodgkin (NHL) de baixo grau/folicular; NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células não clivadas pequenas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células de manto; linfoma relacionado a AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células capilares; leucemia mieloblástica crônica; bem como outros carcinomas e sarcomas; e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (por exemplo, aquele associado com tumores cerebrais) e síndrome de Meigs.
37. Método para tratar ou prevenir uma doença autoimune e/ou neurodegenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um agente de ligação a Clec9A de qualquer uma das reivindicações acima.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune e/ou neurodegenerativa é selecionada de esclerose múltipla, diabetes mellitus, lúpus, doença celíaca,
doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome de Guillain-Barre, esclerodermas, síndrome de Goodpasture, granulomatose de Wegener, epilepsia autoimune, encefalite de Rasmussen, Esclerose biliar primária, Colangite esclerosante, Hepatite autoimune, doença de Addison, tireoidite de Hashimoto, Fibromialgia, síndrome de Menier; rejeição de transplante (por exemplo, prevenção de rejeição de aloenxerto) anemia perniciosa, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso, miastenia grave, síndrome de Reiter, doença de Grave,
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune e/ou neurodegenerativa é esclerose múltipla.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a Clec9A leva à imunossupressão no paciente.
41. Proteína quimérica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um agente de ligação a Clec9A de qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou reivindicações 50 a 52; e (b) um IFN-α2 humano modificado, o referido IFN-α2 humano modificado tendo uma ou mais mutações que conferem segurança melhorada em comparação com um IFN-α2 tipo selvagem; e em que a fração de alvo e o agente de sinalização modificado estão opcionalmente conectados com um ou mais ligantes.
42. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o IFN-α2 humano modificado compreende uma ou mais mutações nas posições R120, M148, R149 e L153.
43. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o IFN-α2 humano modificado compreende uma ou mais mutações selecionadas de R120E, R149A e L153A.
44. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 41,
caracterizada pelo fato de que o IFN-α2 humano modificado compreende uma mutação R120E e qualquer de uma mutação R149A ou uma L153A.
45. Proteína quimérica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um agente de ligação a Clec9A de qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou reivindicações 50 a 52; e (b) um IFN-β humano modificado, o referido IFN-β humano modificado tendo uma ou mais mutações que conferem segurança melhorada em comparação com um IFN-β tipo selvagem; e em que a fração de alvo e o agente de sinalização modificado estão opcionalmente conectados com um ou mais ligantes.
46. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o IFN-β humano modificado compreende uma ou mais mutações nas posições W22, R27, L32, R35, V148, L151, R152 e Y155.
47. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o IFN-β humano modificado compreende uma ou mais mutações selecionadas de W22G, R27G, L32A, L32G, R35A, R35G, V148G, L151G, R152A, R152G.
48. Agente de ligação a Clec9A, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma fração de alvo compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3), em que: (a) CDR1 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:53; (b) CDR2 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs:137 ou 138; e (c) CDR3 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:256.
49. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com uma de SEQ ID NO:327.
50. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com as reivindicações 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de SEQ ID NOs:328-331
51. Uso de qualquer um dos agentes de ligação a Clec9A das reivindicações 1 a 30 ou reivindicações 50 a 52 ou qualquer uma das proteínas quiméricas das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar um ou mais de: câncer, infecções, distúrbios imunes e/ou doenças autoimunes.
52. Agente de ligação a Clec9A, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou reivindicações 50 a 52, ou uma proteína quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um ou mais de: câncer, infecções, distúrbios imunes e/ou doenças autoimunes.
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