DE69020544T2

DE69020544T2 - Cd3-spezifischer rekombinanter antikörper.

Info

Publication number: DE69020544T2
Application number: DE69020544T
Authority: DE
Inventors: John Robert High Wycombe Buckinghamshire Hp14 3Rn Adair; Diljeet Singh London Wc1 Athwal; Linda Kay Somerville Nj 08876 Jolliffe; Robert Allan Lawrenceville Nj 08648 Zivin
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1996-01-18
Anticipated expiration: 2010-12-22
Also published as: ES2079638T3; WO1991009967A1; DE69033857D1; HU912752D0; ES2165864T3; JPH11243955A; US7244832B2; US20060073136A1; US7262050B2; ATE208794T1; NO985468D0; JP3242913B2; US20040076627A1; NO985468L; FI108917B; JPH05500312A; ZA9110129B; ES2074701T3; NO316074B1; FI913927A0

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Antikörpermolekül (RAM) und betrifft insbesondere ein humanisiertes Antikörpermolekül (HAM) mit Spezifität für ein in dem T-Zellen-Rezeptor-CD3-Komplex der meisten T-Zellen vorliegendes Antigen, betrifft weiters ein Verfahren zur Herstellung desselben unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie und betrifft dessen therapeutische Verwendung.
In der vorliegenden Anmeldung wird der Ausdruck "rekombinantes Antikörpermolekül" (RAM) verwendet, um einen Antikörper zu beschreiben, der bei einem Verfahren hergestellt wird, bei dem der Einsatz von rekombinanter DNA-Technologie erfolgt, wobei beliebige Analoga natürlicher Immunglobuline und Fragmente derselben umfaßt sind. Der Ausdruck "humanisiertes Antikörpermolekül" (HAM) wird verwendet, um ein Molekül mit einer Antigen-Bindungsstelle zu beschreiben, die von einem Immunglobulin einer nicht-humanen Spezies stammt, wobei restliche von Immunglobulin abgeleitete Teile des Moleküls aus einem humanen Immunglobulin stammen. Die Antigen- Bindungsstelle kann entweder vollständige variable Bereiche, die an konstante Bereiche fusioniert sind, oder eine oder mehrere komplementaritätsbestimmende Regionen, die auf geeignete Rahmenregionen in den variablen Bereichen aufgepfropft sind, umfassen. Die Abkürzung "MAb" wird verwendet, um einen monoklonalen Antikörper zu bezeichnen.
In der Beschreibung wird auf eine Reihe von Veröffentlichungen durch Zahlen hingewiesen. Die Veröffentlichungen sind in zahlenmäßiger Reihenfolge am Ende der Beschreibung aufgelistet.

Hintergrund der Erfindung

Seit vielen Jahren sind natürliche Immunglobuline ebenso hekannt wie die verschiedenen Fragmente derselben, wie etwa das Fab-, das (Fab')&sub2;- und das Fc-Fragment, die durch enzymatische Spaltung abgeleitet werden können. Natürliche Immunglobuline umfassen im allgemeinen ein Y-förmiges Molekül mit einer Antigen-Bindungsstelle in Richtung zum Ende jedes oberen Armes. Der Rest der Struktur und insbesondere der Stamm des Y vermittelt die mit den Immunglobulinen assoziierten Effektor-Funktionen.
Natürliche Immunglobuline wurden in Assays, in der Diagnose und in begrenzterem Ausmaß in der Therapie verwendet. Jedoch waren diese Verwendungszwecke, speziell in der Therapie, bis vor kurzem durch die polyklonale Natur der natürlichen Immunglobuline eingeschränkt. Ein deutlicher Schritt in Richtung zur Nützung des Potentials der Immunglobuline als therapeutische Mittel war die Entdeckung von Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit definierter Spezifität (Lit. 1). Die meisten MAbs werden jedoch durch Fusionen von Nagetier-Milzzellen mit Nagetier- Myelomzellen hergestellt. Im wesentlichen stellen sie daher Nagetier-Proteine dar. Es gibt nur sehr wenige Berichte über die Herstellung von humanen MAbs.
Da die meisten zur Verfügung stehenden MAbs von Nagetieren stammen, wirken sie für Menschen natürlicherweise als Antigen und können daher eine unerwünschte Immun-Reaktion hervorrufen, die HAMA- (Human-Antimaus-Antikörper) -Reaktion genannt wird. Daher ist die Verwendung von Nagetier-MAbs als therapeutische Mittel bei Menschen inherent durch die Tatsache beschränkt, daß der Mensch eine immunologische Reaktion gegenüber dem MAb bilden wird und den Antikörper entweder zur Gänze abstossen oder zumindest dessen Wirksamkeit herabsetzen wird. In der Praxis dürfen MAbs, die aus Nagetieren stammen, nicht bei mehr als einer oder einigen Behandlungen an Patienten verwendet werden, da sich rasch eine HAMA-Reaktion entwickelt, die den MAb ebenso unwirksam macht, wie sie auch Anlaß für unerwünschte Reaktionen ist.
Es wurden daher Vorschläge gemacht, nicht-humane MAbs für Menschen weniger antigen wirkend zu machen. Solche Verfahren können im allgemeinen als "Humanisierungs"-Verfahren bezeichnet werden. Diese Verfahren bedienen sich im allgemeinen der Verwendung einer rekombinanten DNA-Technologie zur Manipulation von DNA-Sequenzen, die für die Polypeptidketten des Antikörpermoleküls codieren.
Bei früheren Verfahren zur Humanisierung von MAbs erfolgte eine Produktion von chimärischen Antikörpern, wobei eine Antigen-Bindungsstelle, die die vollständigen variablen Bereiche von einem Antikörper umfaßt, an konstante Bereiche, die von einem anderen Antikörper stammen, gebunden ist. Verfahren zur Durchführung solcher Chimärisationsverfahren sind beschrieben in EP0120694 (Celltech Limited), EP0125023 (Genentech Inc. und City of Hope), EP-A-0 171496 (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0 173 494 (Stanford University) und WO 86/01533 (Celltech Limited). Diese letztgenannte Anmeldung von Celltech (WO 86/01533) offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpermoleküls mit den variablen Bereichen eines Maus-MAb und den konstanten Bereichen aus einem humanen Immunglobulin. Solche humanisierte chimärische Antikörper enthalten jedoch immer noch einen deutlichen Anteil an nicht-humaner Aminosäuresequenz, d.h. die vollständigen nicht-humanen variablen Bereiche, und können daher immer noch eine gewisse HAMA-Reaktion hervorrufen, insbesondere wenn sie während eines längeren Zeitraums verabreicht werden [Begent al al Br. J. Cancer, 62:487 (1990)].
Die WO 86/01533 beschreibt auch die Herstellung eines Antikörpermoleküls, das die variablen Bereiche eines Maus-MAb, die CH1- und CL-Bereiche eines humanen Immunglobulins und ein nicht von Immunglobulin stammendes Protein anstelle des Fc-Teils des humanen Immunglobulins umfaßt.
Bei einer anderen Methode, die in der EP-A-0239400 (Winter) beschrieben ist, wurden die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines murinen MAb auf die Rahmenregionen der variablen Bereiche eines humanen Immunglobulins durch stellengelenkte Mutagenese unter Verwendung langer Oligonukleotide aufgepfropft. Es liegen drei CDRs (CDR1, CDR2 und CDR3) in jeder der variablen Regionen der schweren und leichten Kette vor. Derartige CDR-gepfropfte humanisierte Antikörper neigen viel weniger dazu, eine HAMA-Reaktion hervorzurufen, als humanisierte chimärische Antikörper, was auf den wesentlich geringeren Anteil an nicht-humaner Aminosäuresequenz zurückzuführen ist, den sie enthalten.
Die früheste Arbeit auf den Gebiet der Humanisierung von MAbs durch CDR-Pfropfung wurde an MAbs durchgeführt, die synthetische Antigene, wie etwa die NP- oder NIP-Antigene, erkennen. Jedoch sind Beispiele, in welchen ein muriner MAb, der Lysozym erkennt, bzw. ein Ratten-MAb, der ein Antigen auf humanen T-Zellen erkennt, durch CDR-Pfropfung humanisiert wurden, von Verhoeyen et al. (Lit. 2) und Riechmann et al. (Lit. 3) beschrieben. Die Herstellung von CDR-gepfropftem Antikörper gegen das Antigen auf humanen T-Zellen ist auch in der WO 89/07452 (Medical Research Council) beschrieben.
In Riechmann et al. wurde gefunden, daß der Transfer von CDR-Regionen allein (definiert nach den Literaturstellen Kabat 4 und 5) nicht ausreichend war, um zufriedenstellende Antigen-Bindungsaktivität in dem CDR-gepfropften Produkt zu ergeben. Riechmann et al. fanden, daß es notwendig war, einen Serin-Rest an der Position 27 der humanen Sequenz in den entsprechenden Ratten-Phenylalanin-Rest umzuwandeln, um ein CDR-gepfropftes Produkt zu gewinnen, das eine zufriedenstellende Antigen-Bindungsaktivität aufweist. Dieser Rest an der Position 27 der schweren Kette liegt innerhalb der Strukturschleife im Anschluß an CDR1. Ein weiteres Konstrukt, das zusätzlich eine Veränderung eines humanen Serins in Ratten-Tyrosin an der Position 30 der schweren Kette enthielt, wies keine signifikant veränderte Bindungsaktivität gegenüber dem humanisierten Antikörper mit der Anderung von Serin zu Phenylalanin an der Position 27 allein auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Veränderungen an Resten der humanen Sequenz außerhalb der CDR-Regionen, insbesondere in der Schleife im Anschluß an CDR1, notwendig sein können, um eine wirksame Antigen-Bindungsaktivität für CDR-gepfropfte Antikörper, die komplexere Antigene erkennen, zu gewinnen. Aber auch so war die Bindungsaffinität der besten erhaltenen CDR-gepfropften Antikörper immer noch deutlich geringer als die des ursprünglichen MAb.
Vor kurzem beschrieben Queen et al. (Lit. 6) die Herstellung eines humanisierten Antikörpers, der an den Interleukin 2 Rezeptor bindet, durch Vereinigung der CDRs eines murinen MAb (Anti-Tac) mit humanen Immunglobulin-Rahmenregionen und konstanten Regionen. Die humanen Rahmenregionen wurden ausgewählt, um maximale Homologie mit der Anti-Tac MAb-Sequenz zu erreichen. Zusätzlich dazu wurden Computermodelle verwendet, um Rahmen-Aminosäurereste zu identifizieren, von denen angenommen wird, daß sie mit den CDRs oder mit dem Antigen in Wechselwirkung treten, und es wurden Maus-Aminosäuren an diesen Positionen in dem humanisierten Antikörper verwendet.
In der WO 90/07861 schlagen Queen et al. vier Kriterien zur Planung humanisierter Immunglobuline vor. Das erste Kriterium besteht darin, als humanen Akzeptor den Rahmen aus einem speziellen humanen Immunglobulin zu verwenden, das unüblicherweise homolog mit dem zu humanisierenden nicht-humanen Donor-Immunglobulin ist, oder einen Konsensus-Rahmen aus vielen humanen Antikörpern zu verwenden. Das zweite Kriterium besteht in der Verwendung der Donor-Aminosäure anstelle des Akzeptors, wenn der humane Akzeptor-Rest unüblich ist und der Donor-Rest typisch für humane Sequenzen bei einem spezifischen Rest des Rahmens ist. Das dritte Kriterium ist die Verwendung des Donor-Rahmen-Aminosäurerestes statt des Akzeptors in Positionen unmittelbar angrenzend an die CDRs. Das vierte Kriterium ist die Verwendung des Donor- Aminosäurerestes an Rahmenpositionen, für welche vorhergesagt ist, daß die Aminosäure in einem drei-dimensionalen Immunglobulin-Modell innerhalb von etwa 3 Å ein Seitenkettenatom aufweist und zur Wechselwirkung mit dem Antigen oder mit den CDRs des humanisierten Immunglobulins befähigt ist. Es wird vorgeschlagen, daß die Kriterien 2, 3 oder 4 zusätzlich mit oder alternierend zu Kriterium 1 verwendet werden und einzeln oder in beliebiger Kombination zur Anwendung kommen können.
Die WO 90/07861 beschreibt detailliert die Herstellung eines einzelnen CDR-gepfropften humanisierten Antikörpers, eines humanisierten Antikörpers mit Spezifität für das p55 Tac Protein des IL-2-Rezeptors. Die Kombination aller vier Kriterien, die oben genannt sind, wurde zum Planen dieses humanisierten Antikörpers eingesetzt, wobei die Rahmen der variablen Region des humanen Antikörpers Eu (Lit. 4 und 5) als Akzeptor verwendet wurden. In dem entstehenden humanisierten Antikörper waren die Donor- CDRs so wie sie von Kabat et al. (Lit. 4 und 5) definiert waren, und zusätzlich dazu wurden die murinen Donor-Reste anstelle der humanen Akzeptor-Reste an den Positionen 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103, 104, 105 und 107 in der schweren Kette und an den Positionen 48, 60 und 63 in der leichten Kette der Rahmen der variablen Region verwendet. Von dem gewonnenen humanisierten Anti-Tac Antikörper wird berichtet, daß er eine Affinität für p55 von 3 x 10&sup9; M&supmin;¹ aufweist, was etwa einem Drittel der des murinen MAb entspricht.
OKT3 ist ein Maus IgG2a/k MAb, der ein Antigen in dem T-Zellen- Rezeptor-CD3-Komplex erkennt und in vielen Ländern auf der Welt zur Verwendung als ein Immunosuppressionsmittel bei der Behandlung von akuter Allograft-Abstoßung anerkannt ist [Chatenoud et al. (Lit. 7) und Jeffers et al. (Lit. 8)]. Im Hinblick auf die murine Natur dieses MAb kann sich bei der Verwendung eine bedeutende HAMA-Reaktion jedoch mit einer größeren Anti-Idiotyp-Komponente aufbauen. Natürlich wäre es äußerst wünschenswert, diese unerwünschte HAMA-Reaktion durch gecignete Humanisierung oder eine andere rekombinante DNA-Manipulation dieses sehr nützlichen Antikörpers zu verringern oder zu verhindern, und somit dessen Einsatzbereich zu erweitern. Es wäre auch wünschenswert, die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie allgemeiner auf diesen nützlichen Antikörper zur Herstellung von RAM-Produkten anzuwenden.
Außerdem haben wir die Herstellung von CDR-gepfropften humanisierten Antikörpermolekülen weiter untersucht und haben eine Hierarchie innerhalb der Positionen des Rahmens der variablen Regionen identifiziert (d.h. außerhalb sowohl der Kabat- CDRs als auch der Strukturschleifen der variablen Regionen), an welchen die Aminosäure-Identitäten der Reste wesentlich für die Gewinnung von CDR-gepfropften Produkten mit zufriedenstellender Bindungsaffinität sind. Das hat uns die Möglichkeit gegeben, ein Protokoll zur Gewinnung zufriedenstellender CDR-gepfropfter Produkte zu erstellen, das unabhängig von dem Ausmaß der Homologie zwischen dem Donor-Immunglobulin und dem Akzeptor-Rahmen sehr weitgehend angewendet werden kann. Die Gruppe der Reste, die wir als solche mit kritischer Bedeutung identifiziert haben, fällt mit den durch Queen et al. (Lit. 6) identifizierten Resten zusammen.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Anti-CD3-Antikörpermolekül zur Verfügung, das Affinität für das Antigen CD3 besitzt und eine zusammengesetzte schwere Kette und eine komplementäre leichte Kette umfaßt, wobei diese zusammengesetzte schwere Kette einen variablen Bereich aufweist, der Akzeptor-Rahmenreste einer schweren Kette eines Antikörpers und Donor-Antigen-Bindungsreste einer schweren Kette eines Antikörpers enthält, wobei dieser Donor-Antikörper Mfinität für das genannte CD3 Antigen aufweist, worin, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem, in der genannten zusammengesetzten schweren Kette mindestens die Aminosäurereste 5, 7, 8, 10, 12 bis 17, 19, 21, 22, 40, 42 bis 44, 66, 68, 70, 74, 75, 77, 79, 81, 83 bis 85, 89, 90, 92, 105, 109, 111 und 113 Akzeptor-Reste und mindestens die Aminosäurereste 23, 24, 31 bis 35, 49 bis 58 und 95 bis 102 Donor-Reste sind.
In der Regel ist der Donor-Anti-CD3-Antikörper ein Nagetier-MAb.
Der erfindungsgemäße Antikörper kann Antigen-Bindungsreste von einem beliebigen geeigneten Anti-CD3-Antikörper, in der Regel einem Nagetier-Anti-CD3- MAb, z.B. einem Maus- oder Ratten-Anti-CD3-MAb, umfassen. Vorzugsweise ist der Donor-Anti-CD3-Antikörper der spezifische Anti-CD3-MAb (OKT3), der im folgenden speziell unter Bezugnahme auf die Figuren 1 und 2 beschrieben ist.
Vorzugsweise sind in dem Antikörpermolekül die Aminosäurereste 71, 73 und 78 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich Donor-Reste.
Wünschenswerterweise sind die Aminosäurereste 26 bis 30 und 59 bis 65 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich Donor-Reste.
Weiters ist es wünschenswert, wenn mindestens einer der Aminosäurereste 1, 3 und 76 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor- Rest ist.
Vorzugsweise ist mindestens einer der Aminosäurereste 36 (wenn kein Tryptophan), 94 (wenn kein Arginin), 104 und 106 (wenn keine Glycine) und 107 (wenn kein Threonin) in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest und der meiste.
Vorzugsweise ist mindestens einer der Aminosäurereste 2, 4, 6, 38, 46, 67 und 69 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest.
Gewünschtenfalls ist mindestens einer der Aminosäurereste 18, 20, 80, 82 und 86 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Akzeptor Rest.
Weiters ist gewünschtenfalls mindestens einer der Aminosäurereste 37 (wenn er kein Valin ist, jedoch ein größeres Seitenkettenvolumen oder eine Ladung oder Polarität hat), 39 (wenn kein Glutamin), 45 (wenn kein Leucin), 47 (wenn kein Tryptophan), 91 (wenn kein Phenylalanin oder Tyrosin), 93 (wenn kein Alanin) und 103 (wenn kein Tryptophan) in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest.
Gegebenenfalls ist mindestens einer der Aminosäurereste 9, 11, 41, 87, 108, 110 und 112 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Anti- CD3-Antikörpermolekül mit Affinität für das CD3 Antigen zur Verfügung, welches eine zusammengestzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfaßt, wobei die genannte zusammengesetzte leichte Kette einen variablen Bereich aufweist, der Akzeptor- Rahmenreste einer leichten Kette eines Antikörpers und Donor-Antigen-Bindungsreste einer leichten Kette eines Antikörpers enthält, wobei dieser Donor-Antikörper Affinität für das genannte CD3 Antigen hat, worin, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem, in der genannten zusammengesetzten leichten Kette mindestens die Aminosäurereste 5, 7 bis 9, 11, 13 bis 18, 20, 22, 23, 39, 41 bis 43, 57, 59, 61, 72, 74 bis 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104, 106 und 107 Akzeptor-Reste und mindestens die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.
Vorzugsweise umfaßt der Antikörper gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung eine leichte Kette gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung.
Vorteilhafterweise sind die Aminosäurereste 1 und 3 und 60 und 70 (wenn Rest 60 eine Salzbrücke mit Rest 54 und wenn Rest 70 eine Salzbrücke mit Rest 24 bilden kann) in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste.
Vorzugsweise ist zumindest einer der Aminosäurereste 6 (wenn kein Glutamin), 35 (wenn kein Tryptophan), 62 (wenn kein Phenylalanin oder Tyrosin), 64, 66, 68, 99 und 101 (wenn keine Glyzine) und 102 (wenn kein Threonin) in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich ein Donor-Rest. Wünschenswerterweise ist mindestens einer der Aminosäurereste 2, 4, 37, 45 und 47 zusätzlich ein Donor-Rest. Gegebenenfalls ist mindestens einer der Aminosäurereste 19, 21 und 73 zusätzlich ein Donor-Rest.
Vorzugsweise sind die Aminosäurereste 36 (wenn kein Tyrösin), 38 (wenn kein Glutamin), 44 (wenn kein Prolin), 49 (wenn kein Tyrosin), 85, 87 (wenn kein Tyrosin) und 98 (wenn kein Phenylalanin) in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste.
Wünschenswerterweise ist mindestens einer der Aminosäurereste 10, 12, 40, 80, 83, 103 und 105 in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich ein Donor-Rest.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung zur Verfügung, die das Antikörpermolekül entweder gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel enthält.
In der obigen Beschreibung der vorliegenden Erfindung und im folgenden wird auf Antikörper-Produkte Bezug genommen, die Akzeptor-Rahmenregionen und Donor-Antigen-Bindungsregionen umfassen. Es ist ersichtlich, daß die Erfindung in weitem Rahmen allgemein auf Anti-CD3-Antikörper anwendbar ist. Somit können die Donor- und Akzeptor-Antikörper Anti-CD3-Antikörper sein, die von Tieren der gleichen Spezies und sogar der gleichen Antikörper-Klasse oder -Unterklasse abgeleitet sind. Üblicher ist es jedoch, wenn die Donor- und Akzeptor-Antikörper von Tieren unterschiedlicher Spezies stammen. In der Regel ist der Donor-Anti-CD3-Antikörper ein nichthumaner Antikörper, wie etwa ein Nagetier-MAb, und der Akzeptor-Antikörper ist ein humaner Antikörper.
Die oben angegebenen und an anderer Stelle in der vorliegenden Anmeldung befindlichen Bezeichnungen der Reste sind nach der Kabat-Numerierung beziffert (Lit. 4 und 5). Somit entsprechen die Reste-Bezeichnungen nicht immer direkt der linearen Numerierung der Aminosäurereste. Die tatsächliche lineare Aminosäuresequenz kann weniger oder zusätzliche Aminosäuren im Vergleich zu der strikten Kabat-Numerierung aufweisen, was einer Verkürzung einer Strukturkomponente der grundlegenden Struktur des variablen Bereichs oder einem Einsatz in dieselbe, sei es nun in den Rahmen oder in die CDR, entspricht. Zum Beispiel enthält der variable Bereich der schweren Kette des Anti-Tac-Antikörpers nach der Beschreibung von Queen et al. (Lit. 6) ein einziges Aminosäure-Insert (Rest 52a) hinter dem Rest 52 von CDR2 und ein Drei-Aminosäure-Insert (Reste 82a, 82b und 82c) hinter dem Rahmenrest 82, gemäß der Kabat- Numerierung. Die korrekte Kabat-Numerierung der Reste kann für einen gegehenen Antikörper bestimmt werden, indem an Homologie-Regionen der Sequenz des Antikörpers mit einer "Standard" Kabat-numerierten Sequenz abgeglichen wird.
Die erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle können umfassen: ein komplettes Antikörpermolekül mit schweren und leichten Ketten voller Länge; ein Fragment derselben, wie etwa ein Fab-, (Fab')&sub2;- oder Fv-Fragment; oder einen Einzelketten- Antikörper, z.B. ein Einzelketten-Fv, in welchem die variablen Regionen der schweren und leichten Kette durch eine Peptid-Verbindung miteinander verbunden sind; oder ein beliebiges anderes Antikörper-Produkt mit Anti-CD3-Bindungsspezifität. In ähnlicher Weise kann die variable Region der schweren und leichten Kette mit anderen Antikörper- Bereichen je nach Gegebenheit kombiniert sein.
Es können an den schweren oder leichten Ketten der erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle auch ein Effektor- oder Reporter-Molekül angeknüpft sein. Zum Beispiel kann daran ein Makrozyklus zur Chelat-Bildung eines Schwermetallatoms oder ein Toxin, wie etwa Ricin, durch eine kovalente Brückenstruktur gebunden sein.
Andererseits können die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung eines Immunglobulin-Moleküls verwendet werden, in welchem das Fc- Fragment oder der CH3-Bereich eines kompletten Immunglobulin-Moleküls durch eine Peptidbindung, ein funktionelles Nicht-Immunglobulin-Protein, wie etwa ein Enzym- oder Toxin-Molekül, ersetzt sein oder dieses gebunden enthalten.
In den erfindungsgemäßen Antikörpermolekülen kann eine beliebige geeignete Akzeptor-Rahmensequenz der variablen Region im Hinblick auf die Klasse/den Typ des Donor-Antikörpers verwendet werden, aus welchem die Antigen-Bindungsregionen abgeleitet sind. Vorzugsweise ist die verwendete Art des Akzeptor-Rahmens von gleicher(m)/ähnlicher(m) Klasse/Typ wie der Donor-Antikörper. Geeigneterweise kann der Rahmen so ausgewählt werden, daß die Homologie mit der Donor-Antikörpersequenz maximiert/optimiert wird, insbesondere an Positionen, die nahe zu den CDRs oder angrenzend an sie liegen. Ein hohes Ausmaß an Homologie zwischen Donor- und Akzeptor- Sequenzen ist für die Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich. Die vorliegende Erfindung identifiziert eine Hierarchie der Positionen der Rahmenreste, an welcher Donor-Reste wesentlich oder wünschenswert sein können, um Antikörpermoleküle zu gewinnen, die zufriedenstellende Bindungseigenschaften aufweisen. Vorteilhafterweise gibt die vorliegende Erfindung die Möglichkeit der Herstellung von Antikörpermolekülen mit Bindungsaffinitäten, die ähnlich und in manchen Fällen sogar besser sind als das entsprechende Donor-Antikörper-Produkt, z.B. OKT3-Produkt. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle Bindungsaffinitäten von mindestens etwa 10&sup5; M&supmin;¹, vorzugsweise von mindestens etwa 10&sup8; M&supmin;¹ und insbesondere innerhalb des Bereichs von 10&sup8;-10¹² M&supmin;¹. Im Prinzip ist die vorliegende Erfindung auf eine beliebige Kombination von Donor- und Akzeptor-Antikörpern anwendbar, unabhängig von dem Ausmaß der Homologie zwischen ihren Sequenzen. Ein Protokoll zur Anwendung der Erfindung auf ein beliebiges Paar von Donor-Akzeptor-Antikörpern wird später angegeben. Beispiele von humanen Rahmen, die verwendet werden können, sind KOL, NEWM, REI, EU, LAY und POM (Lit. 4 und 5). Zum Beispiel KOL und NEWM für die schwere Kette und REI für die leichte Kette und EU, LAY und POM für beide, sowohl schwere als auch leichte Kette.
Es können auch die Bereiche der konstanten Region der erfindungsgemäßen Produkte im Hinblick auf die vorgeschlagene Funktion des Antikörpers ausgewählt werden, insbesondere hinsichtlich der Effektor-Funktionen, die erforderlich sein können. Zum Beispiel können die Bereiche der konstanten Region humane IgA, IgE, IgG oder IgM Bereiche sein. Insbesondere können Bereiche der konstanten Region von humanem IgG verwendet werden, vor allem von den IgG1 und IgG3 Isotypen, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Verwendungen gedacht ist und Antikörper-Effektor-Funktionen erforderlich sind. Andererseits können die IgG2 und IgG4 Isotpyen verwendet werden, wenn das Antikörpermolekül für therapeutische Zwecke gedacht ist und Antikörper-Effektor-Funktionen nicht erforderlich sind, z.B. für einfache Blockierung des T.Zellen-Rezeptor-CD3-Komplexes.
Der Rest der Antikörpermoleküle muß nicht nur Proteinsequenzen aus Immunglobulinen enthalten. Zum Beispiel kann ein Gen konstruiert werden, in welchem eine für einen Teil einer humanen Immunglobulin-Kette codierende DNA-Sequenz an eine DNA-Sequenz fusioniert ist, die für die Aminosäuresequenz eines Polypeptid- Effektor- oder -Reporter-Moleküls codiert.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Antikörpermolekül durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt.
Die allgemeinen Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die Transfektionsverfahren und Züchtungsmethoden sind an sich allgemein bekannt und stellen keinen Teil der Erfindung dar. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in den Literaturstellen 9 und 10 angegeben.
Die DNA-Sequenzen, die für die Anti-CD3-Donor-Aminosäuresequenz codieren, können durch allgemein in der Fachwelt bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel können die Anti-CD3-Codierungssequeiizen durch genomisches Klonen oder cDNA-Klonierung von geeigneten Hybridom-Zell-Linien gewonnen werden, z.B. die im folgenden speziell beschriebene OKT3 Zell-Linie. Positive Klone können durch geeignete Sonden für die in Rede stehenden Gene von schweren und leichten Kette gescreent werden. Es kann auch PCR-Klonierung verwendet werden.
DNA, die für Akzeptor-Sequenzen, z.B. humane Akzeptor-Sequenzen, codiert, kann auf beliebige geeignete Weise gewonnen werden. Zum Beispiel sind DNA-Sequenzen, die für bevorzugte humane Akzeptor-Rahmen codieren, wie etwa KOL, REI, EU und NEWM, für die Fachleute auf diesem Gebiet allgemein erhältlich.
Die Standardverfahren der Molekularbiologie können zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle codieren, eingesetzt werden. Gewünschte DNA-Sequenzen können vollständig oder teilweise durch Einsatz von Oligonukleotid-Syntheseverfahren synthetisiert werden. Es können stellengelenkte Mutagenese und Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahren je nach Eignung eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Oligonukleotid-gelenkte Synthese nach der Beschreibung von Jones et al. (Lit. 17) verwendet werden. Es kann auch Oligonukleotid-gelenkte Mutagenese einer vorher herausgeschnittenen variablen Region, wie zum Beispiel von Verhoeyen et al. (Lit. 2) oder Riechmann et al. (Lit. 3) beschrieben wurde, verwendet werden. Auch die enzymatische Auffüllung von mit Lücken versehenen Oligonukleotiden unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase, wie zum Beispiel von Queen et al. (Lit. 6) beschrieben wurde, kann Anwendung finden.
Es kann jedes geeignete Wirtszellen/Vektor-System zur Expression der für die schweren und leichten Ketten codierenden DNA-Sequenzen verwendet werden. Es können bakterielle, z.B. E. coli, und andere mikrobielle Systeme Einsatz finden, insbesondere für die Expression von Antikörper-Fragmenten, wie etwa Fab- und (Fab')&sub2;-Fragmenten, sowie insbesondere FV-Fragmenten und Einzelketten-Antikörper-Fragmenten, z.B. Einzelketten-FVs. Expressionssysteme eukaryotischer, z.B. von Säugetieren stammender, Wirtszellen können insbesondere für die Herstellung größerer Antikörpermoleküle, inklusive vollständiger Antikörpermoleküle, verwendet werden. Geeignete Säugetier-Wirtszellen umfassen CHO-Zellen und Myelom- oder Hybridom-Zell-Linien.
Für die Herstellung von erfindunsgsgemäßen Antikörpermolekülen, die sowohl schwere als auch leichte Ketten umfassen, kann die Zell-Linie mit zwei Vektoren transfiziert werden. Der erste Vektor kann ein Operon, das für ein von einer leichten Kette stammendes Polypeptid codiert, und der zweite Vektor kann ein Operon, das für ein von einer schweren Ketten stammendes Polypeptid codiert, enthalten. Vorzugsweise sind die Vektoren identisch mit Ausnahme der Codierungssequenzen und selektierbaren Marker, um weitestgehend zu gewährleisten, daß jede Polypeptid-Kette gleichermaßen exprimiert wird. Andererseits kann auch ein einzelner Vektor verwendet werden, wobei dieser Vektor Sequenzen enthält, die für Polypeptide sowohl von leichten Ketten als auch von schweren Ketten codieren.
Die DNA in den Codierungssequenzen für die leichten und schweren Ketten kann cDNA oder genomische DNA oder heides enthalten. Es ist jedoch bevorzugt, wenn die für die schwere oder leichte Kette codierende DNA-Sequenz zumindest teilweise genomische DNA enthält. Besonders bevorzugt umfaßt die für die schwere oder leichte Kette codierende Sequenz eine Fusion von cDNA und genomischer DNA.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Moleküle enthalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellt diese eine therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung zur Verfügung, die ein Molekül gemäß den vorhergehenden Aspekten der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel enthält.
Die vorliegende Erfindung kann für beliebige therapeutische Einsätze verwendet werden, bei welchen Anti-CD3-Antikörper, z.B. OKT3, bisher verwendet wurden oder in der Zukunft verwendet werden können. Zum Beispiel können die Produkte als Immunosuppressionsmittel, z.B. bei der Behandlung von akuter Allograft-Abstoßung, eingesetzt werden.
Ein bevorzugtes Protokoll zur Gewinnung von schweren und leichten Antikörper-Ketten in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist im folgenden gemeinsam mit dem Grundprinzip dargelegt, gemäß welchem wir dieses Protokoll erstellt haben. Dieses Protokoll und das Grundprinzip sind ohne Vorurteil hinsichtlich der allgemeinen Verwendbarkeit der Erfindung nach obiger Beschreibung und Definition angegeben.

Protokoll

Als erstes ist es notwendig, die für die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Donor-Antikörpers codierende DNA zu sequenzieren, um deren Aminosäuresequenzen zu bestimmen. Es ist auch notwendig, die geeigneten variablen Regionen der schweren und leichten Kette des Akzeptors mit bekannter Aminosäuresequenz auszuwählen. Die CDR-gepfropfte Kette wird dann, ausgehend von der Grundlage der Akzeptorsequenz, entworfen. Es ist einzusehen, daß in manchen Fällen die Donor- und Akzeptor-Aminosäurereste an einer bestimmten Position identisch sein können und daß dadurch keine Anderung des Akzeptor-Rahmenrestes erforderlich ist.
1. Als ein erster Schritt werden Donor-Reste statt Akzeptor-Resten in den CDRs eingesetzt. Zu diesem Zweck sind die CDRs vorzugsweise wie folgt definiert:
Schwere Kette - CDR1: Reste 26-35
- CDR2: Reste 50-65
- CDR3: Reste 95-102
Leichte Kette - CDR1: Reste 24-34
- CDR2: Reste 50-56
- CDR3: Reste 89-97
Die Positionen, an welchen Donor-Reste an die Stelle des Akzeptors im Rahmen eingesetzt werden sollen, werden dann wie folgt ausgewählt, wobei in erster Linie auf die schwere Kette und anschließend auf die leichte Kette Bezug genommen wird.

2. Schwere Kette

2.1 Man wähle Donor-Reste an allen Positionen 23, 24, 49, 71, 73 und 78 der schweren Kette oder allen Positionen 23, 24 und 49 (71, 73 und 78 sind immer entweder alle Donor oder alle Akzeptor).
2.2 Man prüfe, ob die folgenden die gleiche Aminosäure in den Donor- und Akzeptor- Sequenzen aufweisen, und sofern dies nicht der Fall ist, wähle man vorzugsweise den Donor; 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 und 107.
2.3 Zur weiteren Optimierung der Affinität beachte man die Auswahl von Donor-Resten bei einer, mehreren oder beliebigen von:
i. 1,3
ii. 72, 76
iii. Wenn 48 einen Unterschied zwischen Donor- und Akzeptor-Sequenzen zeigt, bedenke man 69
iv. Wenn bei 48 der Donor-Rest gewählt ist, bedenke man 38 und 46
v. Wenn bei 69 der Donor-Rest gewählt ist, bedenke man 80 und dann 20
vi. 67
vii. Wenn bei 67 der Donor-Rest gewählt ist, bedenke man 82 und dann 18
viii. 91
ix. 88
x. 9, 11, 41, 87, 108, 110, 112

3. Leichte Kette

3.1 Man wähle den Donor bei 46, 48, 58 und 71
3.2 Man prüfe, ob die folgenden die gleiche Aminosäure in den Donor- und Akzeptor- Sequenzen aufweisen, sofern dies nicht der Fall ist, wähle man vorzugsweise den Donör: 2, 4, 6, 35, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69 inklusive, 85, 87, 98, 99, 101 und 102
3.3 Zur weiteren Optimierung der Affinität beachte man die Auswahl von Donor-Resten bei einer, mehreren oder beliebigen von:
i. 1,3
ii. 63
iii. 60, wenn 60 und 54 zur Bildung einer möglichen Salzbrücke imstande sind
iv. 70, wenn 70 und 24 zur Bildung einer möglichen Salzbrücke imstande sind
v. 73 und 21, wenn 47 einen Unterschied zwischen Donor und Akzeptor aufweist
vi. 37 und 45, wenn 47 einen Unterschied zwischen Donor und Akzeptor aufweist
vii. 10, 12, 40, 80, 103, 105

Grundprinzip

Zur Übertragung der Bindungsstelle eines Antikörpers in einen unterschiedlichen Akzeptor-Rahmen muß eine Anzahl von Faktoren beachtet werden.

1. Die Erstreckung der CDRs

Die CDRs (Komplementäre Determinierende Regionen) wurden durch Wu und Kabat (Lit. 4 und 5) auf der Grundlage einer Analyse der Variabilität verschiedener Regionen von variablen Antikörper-Regionen definiert. Es wurden drei Regionen pro Bereich erkannt. In der leichten Kette sind es die Sequenzen 24-34, 50-56, 89-97 (Numerierung nach Kabat (Lit. 4), Eu Index) inklusive und in der schweren Kette die Sequenzen 31-35, 50-65 und 95-102 inklusive.
Als die Antikörperstrukturen verfügbar wurden, wurde es ersichtlich, daß diese CDR-Regionen in der Hauptsache den Schleifen-Regionen entsprachen, die sich von dem β-Faß-Rahmen der variablen Bereiche der leichten und schweren Ketten erstreckten. Für H1 bestand insofern eine Diskrepanz, als die Schleife von 26 bis 32 inklusive bestand und für H2 war die Schleife bei 52 bis 56 und bei L2 von 50 bis 53. Mit der Ausnahme von H1 umfaßten die CDR-Regionen jedoch die Schleifen-Regionen und erstreckten sich in die β-Strang-Rahmen. In H1 neigt der Rest 26 dazu, ein Serin zu sein, 27 ein Phenylalanin oder Tyrosin, Rest 29 ist in den meisten Fällen ein Phenylalanin. Die Reste 28 und 30, die Oberflächenreste darstellen, die dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, könnten bei der Antigenbindung beteiligt sein. Eine vorsichtige Definition von H1 CDR würde daher die Reste 26-35 einschließen, um sowohl die Schleifen-Region als die hypervariablen Reste 33-35 zu umfassen.
Es ist von Interesse, auf das Beispiel von Riechmann et al. (Lit. 3) hinzuweisen, der die Auswahl der Reste 31-35 für CDR-H1 verwendete. Um wirksame Antigenbindung hervorzurufen, mußte auch der Rest 27 aus dem Donor (Ratten) Antikörper beschafft werden.

2. Nicht-CDR-Reste, die zur Antigenbindung heitragen

Durch Prüfung der verfügbaren Röntgenstrukturen konnten wir eine Anzahl von Resten identifizieren, die eine Wirkung auf die bloße Antigenbindung ausüben und durch das Experiment demonstriert werden können. Diese Reste können in eine Anzahl von Gruppen unterteilt werden.
2.1 Oberflächenreste nahe den CDR [alle mit der Numerierung nach Kabat et al. (Lit. 4)].
2.1.1. Schwere Kette - Schlüsselreste sind 23, 71 und 73. Andere Rest, die zu einem geringeren Ausmaß beitragen können, sind 1, 3 und 76. Schließlich wird 25 in der Regel konserviert, jedoch sollte der murine Rest verwendet werden, wenn eine Differenz vorliegt.
2.1.2 Leichte Kette - Viele Reste nahe den CDRs, z.B. 63, 65, 67 und 69 sind konserviert. Wenn sie konserviert sind, hat wahrscheinlich keiner der Oberflächenreste in der leichten Kette eine größere Wirkung. Wenn jedoch der murine Rest an diesen Positionen unüblich ist, dann wäre es von Vorteil, den voraussichtlichen Beitrag näher zu analysieren. Andere Reste, die ebenfalls zur Bindung beitragen können, sind 1 und 3 sowie auch 60 und 70, wenn die Reste an diesen Positionen und an 54 bzw. 24 möglicherweise zur Bildung einer Salzbrücke imstande sind, d.h. 60 + 54; 70 + 24.
2.2 Packungsreste nahe den CDRs.
2.2.1. Schwere Kette - Schlüsselreste sind 24, 49 und 78. Andere Schlüsselreste wären 36, wenn dies nicht ein Tryptophan ist, 94, wenn kein Arginin, 104 und 106, wenn keine Glycine, und 107, wenn kein Threonin. Reste, die einen weiteren Beitrag zur stabilen Packung der schweren Kette darstellen können und somit zur verbesserten Affinität bewirken, sind 2, 4, 6, 38, 46, 67 und 69. 67 bildet die Packung gegen den CRD-Rest 63 und von diesem Paar könnten sowohl beide murin oder beide human sein. Schließlich sind Reste, die zur Packung in dieser Region, jedoch von einem längeren Bereich her, beitragen, 18, 20, 80, 82 und 86. 82 packt gegen 67 und seinerseits packt 18 gegen 82. 80 packt gegen 69 und seinerseits packt 20 gegen 80. 86 bildet ein H-Bindungsnetzwerk mit 38 und 46. Viele der Maus-Mensch-Unterschiede erscheinen geringfügig, z.B. Leu-Ile, könnten jedoch eine geringfügige Wirkung auf die korrekte Packung ausüben, die sich in einer veränderten Positionierung der CDRs ausdrückt.
2.2.2. Leichte Kette - Schlüsselreste sind 48, 58 und 71. Andere Schlüsselreste wären 6, wenn kein Glutamin, 35, wenn kein Tryptophan, 62, wenn kein Phenylalanin oder Tyrosin, 64, 66, 68, 99 und 101, wenn keine Glycine, und 102, wenn kein Threonin. Reste, die einen weiteren Beitrag darstellen, sind 2, 4, 37, 45 und 47. Schließlich stellen die Reste 73 und 21 und 19 Packungsbeiträge von großer Distanz einer geringeren Natur dar.
2.3. Reste an der Grenzfläche des variablen Bereichs zwischen schwerer und leichter Kette - Sowohl in den leichten als auch in den schweren Ketten sind die meisten der Nicht-CDR-Grenzflächenreste konserviert. Wenn ein konservierter Rest durch einen Rest unterschiedlichen Charakters, z.B. in Größe oder Ladung, ersetzt wird, sollte er als der murine Rest zur Rückhaltung in Betracht gezogen werden.
2.3.1. Schwere Kette - Reste, die in Betracht gezogen werden müssen, sind 37, wenn der Rest kein Valin ist, sondern ein größeres Seitenkettenvolumen oder eine Ladung oder Polarität aufweist. Andere Reste sind 39, wenn kein Glutamin, 45, wenn kein Leucin, 47, wenn kein Tryptophan, 91, wenn kein Phenylalanin oder Tyrosin, 93, wenn kein Alanin, und 103, wenn kein Tryptophan. Rest 89 ist auch an der Grenzfläche, ist jedoch nicht in einer Position, wo die Seitenkette von großer Wirkung sein könnte.
2.3.2. Leichte Kette - Reste, die in Betracht gezogen werden müssen, sind 36, wenn kein Tyrosin, 38, wenn kein Glutamin, 44, wenn kein Prolin, 46, 49, wenn kein Tyrosin, Rest 85, Rest 87, wenn kein Tyrosin, und 98, wenn kein Phenylalanin.
2.4. Grenzfläche variable-konstante Region - Der Ellbogenwinkel zwischen variablen und konstanten Regionen kann durch Veränderungen in der Packung der Schlüsselreste in der variablen Region gegen die konstante Region beeinflußt werden, wodurch die Position von VL und VH im Hinblick zueinander beeinflußt werden kann. Daher ist es wichtig, die Reste anzugeben, die möglicherweise in Kontakt mit der konstanten Region stehen. In der schweren Kette werden die möglicherweise in Kontakt mit der variablen Region stehenden Oberflächenreste von murinen zu humanen Antikörpern konserviert, weshalb die mit der variablen Region in Kontakt stehenden Reste die V-C Wechselwirkung beeinflussen können. In der leichten Kette variieren die an einer Reihe der Kontaktpunkte der konstanten Region gefundenen Aminosäuren und die V & C Regionen sind nicht in so enger Nachbarschaft wie die schwere Kette. Daher können die Einflüsse der V-C Grenzfläche der leichten Kette geringer sein.
2.4.1. Schwere Kette - Kontaktreste sind 7, 11, 41, 87, 108, 110, 112.
2.4.2. Leichte Kette - In der leichten Kette sind die möglicherweise kontaktierenden Reste 10, 12, 40, 80, 83, 103 und 105.
Die obige Analyse, gemeinsam mit unserer beträchtlichen Erfahrung in praktischen Experimenten der CDR-Pfropfung einer Reihe unterschiedlicher Antikörper führte uns zu dem oben angegebenen Protokoll.
Es wird nun die vorliegende Erfindung in nur beispielhafter Weise, unter Bezugnahme auf die angeschlossenen Figuren 1 - 13 beschrieben.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt DNA- und Aminosäuresequenzen der leichten Kette von OKT3;
Figur 2 zeigt DNA- und Aminosäuresequenzen der schweren Kette von von OKT3;
Figur 3 zeigt die Ausrichtung der Aminosäureseguenz der leichten variablen Region von OKT3 mit der der leichten variablen Region des humanen Antikörpers REI;
Figur 4 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuresequenz der schweren variablen Region von OKT3 mit der der schweren variablen Region des humanen Antikörpers KOL;
Figur 5 zeigt die Aminosäuresequenzen der schweren variablen Region von OKT3, KOL und verschiedenen entsprechenden CDR-Pfropfungen;
Figur 6 zeigt die Aminosäuresequenzen der leichten variablen Region von OKT3, REI und verschiedenen entsprechenden CDR-Pfropfungen;
Figur 7 zeigt eine graphische Darstellung von Bindungsassay-Ergebnissen für verschiedene gepfropfte OKT3 Antikörper;
Figur 8 zeigt eine graphische Darstellung von Blockierungsassay-Ergebnissen für verschiedene gepfropfte OKT3 Antikörper;
Figur 9 zeigt eine ähnliche graphische Darstellung von Blockierungsassay-Ergebnissen;
Figur 10 zeigt ähnliche graphische Darstellungen sowohl für Bindungs assay- als auch für Blockierungsassay-Ergebnisse;
Figur 11 zeigt weitere ähnliche graphische Darstellungen von sowohl Bindungsassay- als auch Blockierungsassay-Ergebnissen;
Figur 12 zeigt eine graphische Darstellung von Kompetitionsassay-Ergebnissen für einen minimal gepfropften OKT3 Antikörper im Vergleich mit dem murinen OKT3 Vergleichsstandard und
Figur 13 zeigt eine ähnliche graphische Darstellung von Kompetitions assay-Ergebnissen, wobei ein vollständig gepfropfter OKT3 Antikörper mit dem murinen Referenzstandard verglichen wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

BEISPIEL

MATERIAL UND METHODEN

1. EINGANGSZELLEN

Hybridom-Zellen, die den Antikörper OKT3 produzieren, wurden von Ortho zur Verfügung gestellt (Saatpartie 4882.1) und wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles Medium ohne Antibiotikum (DMEM), das mit Glutamin und 5 % fetalem Kalbsserum ergänzt war, gezüchtet und aufgeteilt, um sowohl einen überzüchteten Uberstand zur Bewertung als auch Zellen zur RNA-Extraktion zur Verfügung zu haben. Es zeigte sich, daß der überzüchtete Überstand 250 ug/ml murinen IgG2a/Kappa Antikörper enthielt. Der Überstand war negativ hinsichtlich muriner lambda leichter Kette und schwerer Kette von IgG1, IgG2b, IgG3, IgA und IgM. 20 ml Überstand wurden untersucht, um zu bestätigen, daß der vorliegende Antikörper OKT3 war.

2. MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN

Grundlegende molekularbiologische Verfahren erfolgten nach der Beschreibung von Maniatis et al. (Lit. 9) mit geringfügigen Veränderungen in manchen Fällen. Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Beschreibung von Sanger et al. (Lit. 11) und nach dem Amersham International Plc Handbuch der Sequenzierung durchgeführt. Stellengelenkte Mutagenese erfolgte nach der Beschreibung in Kramer et al. (Lit. 12) und in dem Handbuch der Anglian Biotechnology Ltd.. Untersuchungen über COS Zell-Expression und metabolische Kennzeichnung erfolgten nach der Beschreibung in Whittle et al. (Lit. 13).
3. UNTERSUCHUNGS-ASSAYS

3.1. AUFBAU-ASSAYS

Die Aufbau-Assays wurden an Überständen aus transfizierten COS-Zellen durchgeführt, um die Menge an vorliegendem intaktem IgG zu bestimmen.

3.1.1. COS ZELLEN, DIE MIT MURINEN OKT3 GENEN TRANSFIZIERT SIND

Der Aufbau-Assay für intaktes Maus IgG in COS Zellüberständen war ein ELISA mit den folgenden Bedingungen:
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit F(ab')&sub2; Ziegen Anti- Maus IgG Fc beschichtet. Die Platten wurden mit Wasser gewaschen und die Proben wurden eine 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Platten wurden gewaschen und F(ab')&sub2; Ziegen Anti-Maus IgG F(ab')&sub2; (mit HRPO konjugiert) wurde dann zugesetzt. Zur Sichtbarmachung der Reaktion wurde Substrat zugesetzt. Als Standard wurde UPC10, ein Maus IgG2a Myelom, verwendet.

3.1.2. COS- UND CHO-ZELLEN, DIE MIT CHIMÄRISCHEN ODER CDR- GEPFROPFTEN OKT3 GENEN TRANSFIZIERT SIND

Der Aufbau-Assay für chimärische oder CDR-gepfropfte Antikörper in COS-Zellüberständen war ein ELISA mit den folgenden Bedingungen:
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit F(ab')&sub2; Ziegen Anti- Human IgG Fc beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und die Proben zugesetzt, worauf 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Platten wurden gewaschen und es wurde eine monoklonale Maus Anti-Human Kappa Kette 1 Stunde lang hei Raumtemperatur zugesetzt. Die Platten wurden gewaschen und es wurde F(ab')&sub2; Ziegen Anti-Maus IgG Fc (mit HRPO konjugiert) zugesetzt. Zur Sichtbarmachung der Reaktion wurde Enzymsubstrat zugesetzt. Als Standard wurde chimärisches B72.3 (IgG4) (Lit. 13) verwendet. Die Verwendung einer monoklonalen Anti-Kappa Kette in diesem Assay ergibt gepfropfte Antikörper, die von dem chimärischen Standard abgelesen werden.

3.2. ASSAY FÜR ANTIGEN-BINDUNGSAKTIVITÄT

Material aus COS Zellüberständen wurde auf OKT3 Antigen-Bindungsaktivität an CD3 positiven Zellen in einem direkten Assay geprüft. Das Vorgehen war wie folgt:
HUT 78 Zellen (humane T-Zell-Linie, CD3 positiv) wurde in Kultur gehalten. Es wurden Monoschichten von HUT 78 Zellen auf ELISA Platten mit 96 Vertiefungen präpariert, wobei Poly-L-Lysin und Glutaraldehyd verwendet wurden. Es wurden die Proben zu den Monoschichten 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zugesetzt.
Die Platten wurden vorsichtig unter Verwendung von PBS gewaschen. Als geeignet für humanisierte oder murine Proben wurde F(ab¹)&sub2; Ziegen Anti-Human IgG Fc (mit HRPO konjugiert) oder F(ab')&sub2; Ziegel Anti-Maus IgG Fc (mit HRPO konjugiert) zugesetzt. Zur Sichtbarmachung der Reaktion wurde Substrat zugesetzt. Der negative Vergleich für den Zell-basierenden Assay war chimärisches B72.3. Der positive Vergleich war murines Orthomun OKT3 oder chimärisches OKT3, wenn dieses verfügbar war. Dieser Zell-basierende Assay war schwierig durchzuführen und es wurde ein anderer Assay für CDR-gepfropftes OKT3 entwickelt, der empfindlicher und leichter durchzuführen war:
In diesem System wurde CDR-gepfropfter OKT3, der von COS Zellen produziert worden war, auf seine Fähigkeit zur Bindung an die CDR-positive HPB-ALL (human peripheral blood acute lymphozytic leukemia) Zell-Linie untersucht. Es wurde auch auf seine Fähigkeit zur Blockierung der Bindung von murinem OKT3 an diese Zellen untersucht. Die Bindung wurde durch folgendes Verfahren gemessen: HPB-ALL Zellen wurden aus der Gewebskultur geerntet. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4ºC mit verschiedenen Verdünnungen von Test-Antikörper, positivem Vergleichs-Antikörper oder negativem Vergleichs-Antikörper inkubiert. Die Zellen wurden einmal gewaschen und 1 Stunde lang bei 4ºC mit einem HTC-gekennzeichneten Ziegen Anti-Human IgG (Fc-spezifisch, Maus-absorbiert) inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und durch Cytofluorographie analysiert. Chimärischer OKT3 wurde als ein positiver Vergleich für die direkte Bindung verwendet. Zellen, die mit Mock-transfiziertem COS Zellüberstand und anschließend mit FITC-gekennzeichnetem Ziegen Anti-Human IgG inkubiert waren, lieferten den negativen Vergleich. Zur Untersuchung der Fähigkeit von CDR- gepfropftem OKT3 zur Blockierung von muriner OKT3-Bindung wurden die HPB-ALL Zellen während 1 Stunde bei 4ºC mit verschiedenen Verdünnungen von Test-Antikörper oder Vergleichs-Antikörper inkubiert. Es wurde eine fixierte, sättigende Menge von FITC OKT3 zugesetzt. Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 4ºC inkubiert, zweimal gewaschen und durch Cytofluorographie analysiert.
FITC-gekennzeichnetes OKT3 wurde als ein positiver Vergleich zur Bestimmung der maximalen Bindung verwendet. Ungekennzeichnetes murines OKT3 diente als Vergleichsstandard für die Blockierung. Negative Vergleiche waren ungefärbte Zellen mit oder ohne Mock-transfiziertem Zellüberstand. Die Fähigkeit der CDR-gepfropften leichten Kette von OKT3 zur Bindung von CD3-positiven Zellen und zur Blockierung der Bindung von murinem OKT3 wurde anfänglich in Kombination mit der chimärischen schweren Kette von OKT3 getestet. Die chimärische schwere Kette von OKT3 ist aus der variablen Region von murinem OKT3 und der konstanten Region von humanem IgG4 zusammengesetzt. Das Gen der chimärischen schweren Kette wird in dem gleichen Expressionsvektor exprimiert, der für die CDR-gepfropften Gene verwendet wird. Der Expressionsvektor für die CDR-gepfropfte leichte Kette und der Expressionsvektor für die chimärische schwere Kette wurden gemeinsam in COS Zellen co-transfiziert. Der vollständig chimärische Antikörper OKT3 (chimärische leichte Kette und chimärische schwere Kette) erwies sich als vollständig zur Bindung von CD3 positiven Zellen und zur Blockierung der Bindung von murinem OKT3 an diese Zellen befähigt.

3.3 BESTIMMUNG DER RELATIVEN BINDUNGSAFFINITÄT

Die relativen Bindungsaffinitäten von CDR-gepfropften monoklonalen Anti-CD3 Antikörpern wurden durch Kompetitionsbindung (Lit. 6) unter Verwendung der humanen T-Zell-Linie HPB-ALL als Quelle für das CD3 Antigen und von Fluorescein-konjugiertem murinem OKT3 (Fl-OKT3) mit bekannter Bindungsaffinität als Tracer-Antikörper bestimmt. Die Bindungsaffinität von Fl-OKT3 Tracer-Antikörper wurde durch einen direkten Bindungsassay bestimmt, in welchem steigende Mengen von Fl-OKT3 mit HPB-ALL (5x10&sup5;) in PBS mit 5 % fetalem Kalbsserum bei 4ºC während 60 Minuten inkubiert wurden. Die Zellen wurden gewaschen und die Fluoreszenzintensität auf einem FACSCAN Strömungszytometer, das mit quantitativen Mikroperlen-Standards geeicht war (Strömungszytometrie-Standards, Reasearch Triangle Park, NC), bestimmt. Die Fluoreszenzintensität pro Antikörpermolekül (Verhältnis F/P) wurde unter Verwendung von Mikroperlen bestimmt, die eine vorherbestimmte Anzahl von Maus IgG Antikörper-Bindungsstellen aufwiesen (Einfache Zell-Perlen, Strömungszytometrie-Standards). F/P ist gleich der Fluoreszenzintensität von Perlen, die mit Fl-OKT3 gesättigt sind, dividiert durch die Anzahl der Bindungsstellen pro Perle. Die Menge von gebundenem und freiem Fl-OKT3 wurde aus der mittleren Fluoreszenzintensität pro Zelle errechnet und das Verhältnis von gebunden/frei wurde gegen die Anzahl der Mole von gebundenem Antikörper aufgetragen. Eine Geradenangleichung wurde zur Bestimmung der Affinität der Bindung verwendet (absoluter Wert der Neigung).
Für die kompetitive Bindung wurden steigende Mengen des konkurrierenden Antikörpers zu einer untergesättigten Dosis von Fl-OKT3 zugesetzt und mit 5x10&sup5; HPB-ALL in 200 ul PBS mit 5 % fetalem Kalbsserum bei 4ºC während 60 Minuten inkubiert. Die Fluoreszenzintensitäten der Zellen wurden mit einem FACScan Strömungs zytometer gemessen, das mit quantitativen Mikroperlen-Standards geeicht war.Die Konzentrationen von gebundenem und freiem Fl-OKT3 wurden berechnet. Die Affinitäten der konkurrierenden Antikörper wurden aus der Gleichung [X]-[OKT3] = (1/Kx) - (1/Ka), in welcher Ka die Affinitat von murinem OKT3, Kx die Affinitat des konkurrierenden x, [ ] die Konzentration des konkurrierenden Antikörpers, bei welcher gebundene/freie Bindungen R/2 betragt und R die maximale gebundene/freie Bindung ist.

4. ERRICHTUNG EINER cDNA BIBLIOTHEK

4.1. HERSTELLUNG VON mRNA UND SYNTHESE VON cDNA

OKT3 produzierende Zellen wurden nach obiger Beschreibung gezüchtet und es wurden 1,2 x 10&sup9; Zellen geerntet und die mRNA unter Verwendung des Guanidin/LiCl Extraktionsverfahrens extrahiert. cDNA wurde durch Primierung von Oligo-dT zur Schaffung einer cDNA mit voller Lange hergestellt. Die cDNA wurde methyliert und zur Klonierung wurden EcoR1 Linker zugesetzt.

4.2. ERRICHTUNG DER BIBLIOTHEK

Die cDNA Bibliothek wurde an pSP65 Vektor-DNA ligiert, die mit EcoR1 geschnitten worden war, und die 5'-Phosphatgruppen wurden durch Intestinale Kalbs- Phosphatase entfernt (Ecor1/CIP). Die Ligation wurde zur Transformierung von Escherichia coli (E.coli) HB1O1 mit hoher Transformationseffizienz verwendet. Es wurde eine cDNA-Bibliothek hergestellt. 3600 Kolonien wurden hinsichtlich der leichten Kette und 10000 Kolonien hinsichtlich der schweren Kette gescreent.

5. SCREENING

Positive E.coli Kolonien, die entweder für Sonden schwerer oder leichter Ketten positiv waren, wurden durch Oligonukleotid-Screening unter Verwendung der Oligonukleotide:
5' TCCAGATGTTAACTGCTCAC für die leichte Kette, die einer Sequenz in der konstanten Maus-Kappa-Region komplementär ist, und 5' CAGGGGCCAGTGGATGGATAGAC für die schwere Kette, die einer Sequenz in der Region des konstanten CH1 Bereichs von murinem IgG2a komplementär ist, identifiziert. 12 Klone leichter Ketten und 9 Klone schwerer Ketten wurden identifiziert und für das Screening der zweiten Runde verwendet. Positive Klone aus der zweiten Screening- Runde wurden gezüchtet und die DNA wurde präpariert. Die Größen der Gen-Inserte wurden durch Gelelektrophorese abgeschätzt und Inserte einer Größe, die imstande war, eine cDNA voller Länge zu enthalten, wurden für die DNA-Sequenzierung in M13 subgeklont.

6. DNA SEQUENZIERUNG

Es wurden Klone in M13 erhalten, die vier Größeklassen sowohl für schwere als auch leichte Ketten darstellten. Es wurde die DNA-Sequenz für die 5'- untranslatierten Regionen, die Signalsequenzen, die variablen Regionen und die 3'- untranslatierten Regionen von cDNAs voller Länge [Figuren 1(a) und 2(a)] erhalten und die ensprechenden Aminosäuresequenzen vorhergesagt [(Figuren 1(b) und 2(b)]. In Figur 1(a) sind die untranslatierten DNA-Regionen in Großbuchstaben angegeben und in beiden Figuren 1 und 2 sind die Signal-Sequenzen unterstrichen.

7. KONSTRUKTION VON cDNA EXPRESSIONSVEKTOREN

Die Celltech Expressionsvektoren heruhen auf dem Plasmid pEE6hCMV (Lit. 14). Ein Polylinker für den Einsatz von Genen, die exprimiert werden sollen, wurde hinter dem größeren unmittelbaren frühen Promotor/Verstärker des humanen Cytomegalovirus (hCMV) eingesetzt. Marker-Gene zur Selektion des Plasmids in transfizierten eukaryotischen Zellen können als BamH1 Kassetten an der einzigartigen BamH1 Stelle von pEE6 hCMV eingesetzt werden; zum Beispiel der Neo-Marker zur Schaffung von pEE6 hCMV Neo. Es ist eine ubliche Praxis, die neo- und gpt-Marker vor der Einsetzung des jeweiligen Gens einzusetzen, während der GS-Marker wegen der Anwesenheit interner EcoR1 Stellen in der Kassette zuletzt eingesetzt wird.
Die selektierbaren Marker werden von dem SV40 späten Promotor exprimiert, der auch einen Replikationsursprung zur Verfügung stellt, sodaß die Vektoren zur Expression in dem transienten Expressionssystem der COS-Zellen verwendet werden können.
Die Maus-Sequenzen wurden aus den oben als ECOR1 Fragmente beschriebenen auf M13 basierenden Vektoren herausgeschnitten und in sowohl pEE6-hCMV-neo für die schwere Kette als auch in EE6-hCMV-gpt für die leichte Kette geklont, um die Vektoren pJA136 bzw. pJA135 zu ergeben.

8. EXPRESSION DER cDNAs IN COS-ZELLEN

Die Plasmide pJA135 und pJA136 wurden in COS Zellen co-transfiziert und es zeigte sich, daß der Überstand aus dem transienten Expressionsversuch einen zusammengesetzten Antikörper enthielt, der an mit T-Zellen angereicherte Lymphozyten band. Metabolische Kennzeichnungsversuche unter Verwendung von ³&sup5;S-Methionin ergaben Expression und Aufbau von schweren und leichten Ketten.

9. KONSTRUKTION VON CHIMÄRISCHEN GENEN

Die Konstruktion von chimärischen Genen folgte einer bereits oben beschriehenen Strategie [Whittle et al. (Lit 13)]. Eine Restriktionsstelle nahe dem 3'-Ende der Sequenz des variablen Bereichs wird identifiziert und dazu verwendet, einen Oligonukleotid-Adapter, der für den Rest der murinen variablen Region und eine geeignete Restriktionsstelle zur Anbindung der konstanten Region der Wahl codiert, angehängt.

9.1. KONSTRUKTION DES GENS DER LEICHTEN KETTE

Die cDNA-Sequenz der murinen leichten Kette enthält eine Aval-Stelle nahe dem 3'-Ende der variablen Region [Fig. 1(a)]. Der Hauptteil der Sequenz der variablen Region wurde als ein 396 bp EcoR1-Aval-Fragment isoliert. Es wurde ein Oligonukleotid-Adapter entworfen, um den Rest der 3'-Region der variablen Region aus der Aval-Stelle zu ersetzen und die 5'-Reste der humanen konstanten Region bis zu und inklusive einer einzigartigen Nar1-Stelle, die vorher durch Engineering in die konstante Region eingebracht worden war, zu umfassen.
Es wurde eine Hind111-Stelle eingesetzt, um als ein Marker für den Einsatz des Linkers zu wirken.
Der Linker wurde an das VL-Fragment ligiert und das 413 bp EcoR1-Nar1 adaptierte Fragment wurde aus der Ligationsmischung herausgereinigt.
Die konstante Region wurde als ein Narl-Bamhl Fragment von einem M13 Klon NW361 isoliert und mit der DNA der variablen Region in einen mit Ecor1/BamH1/C1P pSP65 behandelten Vektor in einer Dreiwegsreaktion ligiert, um das Plasmid JA143 zu ergeben. Nach der Transformation in E.coli wurden die Klone isoliert und die Linker- und Verbindungsssequenzen wurden durch die Anwesenheit der Hind111-Stelle und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

9.2. KONSTRUKTION DES GENS DER LEICHTEN KETTE - VERSION 2

Die Konstruktion des ersten chimärischen Leicht-Ketten-Gens produziert eine Fusion von Maus- und humanen Aminosäuresequenzen an der Verbindungsstelle von variabler und konstanter Region. Im Fall der leichten Kette von OKT3 sind die Aminosäuren an der chimärischen Verbindung:
Diese Sequenzanordnung führt eine mögliche Stelle für Asparagin (Asn) verbundene (N-verbundene) Glykosilierung an der Verbindungsstelle V-C ein. Daher wurde eine zweite Version des chimärischen Leicht-Ketten-Oligonukleotid-Adapters entworfen, in welcher das Threonin (Thr), die erste Aminosäure der humanen konstanten Region, durch die äquivalente Aminosäure aus der murinen konstanten Region, Alanin (Ala), ersetzt wurde.
Es war keine interne Hind111-Stelle in diesem Adapter enthalten, um die beiden chimärischen Leicht-Ketten-Gene zu differenzieren.
Das Fragment der variablen Region wurde als ein 376 bp EcoR1-Aval- Fragment isoliert. Der Oligonukleotid-Linker wurde an mit Nar1 geschnittenes pNW361 ligiert und dann die adaptierte 396bp konstante Region isoliert, nachdem das modifizierte pNW361 mit EcoR1 neuerlich geschnitten worden war. Das Fragment der variablen Region und das Fragment der modifizierten konstanten Region wurden direkt in mit Ecor1/CIP behandeltes pEE6hCMVneo ligiert, um pJA137 zu ergeben.
Anfänglich hatten alle untersuchten Klone das Insert in unkorrekter Orientierung. Daher wurde das Insert neuerlich isoliert und neuerlich geklont, um das Insert umzudrehen und das Plasmid pJA141 zu ergeben. Es wurden mehrere Klone mit dem Insert in der korrekten Orientierung erhalten und die Adapter-Sequenz des einen wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

9.3. KONSTRUKTION DES GENS DER SCHWEREN KETTE

9.3.1. AUSWAHL DES GEN-ISOTYPS DER SCHWEREN KETTE

Der für die schwere Kette ausgewählte Isotpy der konstanten Region war humanes IgG4.

9.3.2. GEN-KONSTRUKTION

Die cDNA-Sequenz der schweren Kette zeigte eine Ban1-Stelle nahe dem 3'-Ende der variablen Region [Fig. 2(a)]. Der Hauptteil der Sequenz der variablen Region wurde als ein 426bp EcoR1/C1P/Ban1 Fragment isoliert. Es wurde ein Oligonukleotid- Adapter entworfen, um den Rest der 3'-Region der variablen Region aus der Ban1-Stelle bis zu und inklusive einer einzigartigen Hind111-Stelle, die vorher durch Engineering in die ersten beiden Aminosäuren der konstanten Region eingesetzt worden war, zu ersetzen.
Der Linker wurde an das VH-Fragment ligiert und das EcoR1-Hind111 adaptierte Fragment wurde aus der Ligationsmischung gereinigt.
Die variable Region wurde an die konstante Region ligiert, indem pJA91 (Lit. ??) mit Ecor1 und Hind111 geschnitten wurde, wobei das Intron-Fragment entfernt und durch das VH ersetzt wurde, um pJA142 zu ergeben. Es wurden Klone nach der Transformierung in E.coli JM101 isoliert und die Linker- und Verbindungssequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. (Anmerkung: Die Hind111-Stelle wird beim Klonen verloren).

10. KONSTRUKTION VON CHIMÄRISCHEN EXPRESSIONSVEKTOREN

10.1. neo AND gpt VEKTOREN

Die chimärische leichte Kette (Version 1) wurde aus pJA143 als ein Ecor1-Fragment entfernt und in den mit EcoR1/C1P behandelten Expressionsvektor pEE6hCMVneo geklont, um pJA145 zu ergeben. Die Klone mit dem Insert in der korrekten Orientierung wurden durch Restriktionskartierung identifiziert.
Die chimärische leichte Kette (Version 2) wurde nach obiger Beschreibung konstruiert.
Das Gen der chimärischen schweren Kette wurde aus pJA142 als ein 2,5 kbp EcoR1/BamH1 Fragment isoliert und in das mit EcoR1/Bcl1/C1P behandelte Vektorfragment eines Derivats von pEE6hCMVgpt geklont, um das Plasmid pJA144 zu ergeben.

10.2. UNABHÄNGIGE GS VEKTOREN

GS Versionen von pJA141 und pJA144 wurden konstruiert, indem die neo- und gpt-Kassetten durch eine BamH1/Sal1/C1P Behandlung der Plasmide, Isolierung des Vektorfragments und Ligation an ein GS-haltiges Fragment aus dem Plasmid pRO49 ersetzt wurden, um den Leichte-Kette-Vektor pJA17g und den Schwere-Kette-Vektor pJA180 zu ergeben.

10.3. KONSTRUKTION DES GS EINZELVEKTORS

Einzelvektor-Konstruktionen, die die Gene der cL (chimärischen leichten), cH (chimärischen schweren) und GS-Gene auf einem Plasmid in der Reihenfolge cL-cH- GS oder cH-cL-GS enthalten und bei denen die Transkription der Gene vom Kopf zum Schwanz erfolgte, z.B. cL > cH > GS, wurden konstruiert. Diese Plasmide wurden hergestellt durch Behandlung von pJA171 oder pJA180 mit BamH1/C1P und Ligation in eine Bgl11/Hind111 hCMV Promotor-Kassette gemeinsam mit entweder- dem Hind111/BamH1 Fragment aus pJA141 in pJA180, um das cH-cL-GS-Plasmid pJA182 zu ergeben, oder dem Hind111/BamH1 Fragment aus pJA144 in pJA179, um das cL-cH- GS Plasmid pJA181 zu ergeben.

11. EXPRESSION VON CHIMÄRISCHEN GENEN

11.1. EXPRESSION IN COS ZELLEN

Das chimärische Antikörper-Plasmid pJA145 (cL) und pJA144 (cH) wurden in COS-Zellen co-transfiziert und es zeigte sich, daß der Überstand des transienten Expressionsversuchs zusammengebauten Antikörper enthielt, der an die humane T-Zell- Linie HUT 78 band. Metabolische Kennzeichnungsversuche unter Verwendung von ³&sup5;S- Methionin zeigten Expression und den Aufbau von schweren und leichten Ketten. Jedoch deutete die auf reduzierten Gelen beobachtete Mobilität der leichten Kette darauf hin, daß die mögliche Glykosylierungsstelle glykosyliert worden war. Expression in COS-Zellen in Anwesenheit von Tunicamycin zeigte eine Herabsetzung der Größe der leichten Kette zu jener Größe, die sich für vergleichende chimärische Antikörper und die murine leichte Kette von OKT3 gezeigt hatte. Daher wurde JA141 konstruiert und exprimiert. In diesem Fall zeigte die leichte Kette keine unterschiedliche Mobilität oder keine Größenverschiebung in Anwesenheit oder Abwesenheit von Tunicamycin. Diese zweite Version der chimärischen leichten Kette, wenn sie gemeinsam mit der chimärischen schweren (cH) Kette exprimiert wurde, ergab einen Antikörper, der gute Bindung an HUT 78 Zellen zeigte. In beiden Fällen war die Antigenbindung äquivalent der des Maus-Antikörpers.

11.2 EXPRESSION IN DEN OVARIENZELLEN CHINESISCHER HAMSTER (CHO)

Stabile Zell-Linien wurden aus den Plasmiden pJA141/pJA144 und aus pJA179/pJA180, pJA181 und pJA182 durch Transfektion in CHO-Zellen hergestellt.

12. CDR-PFROPFUNG

Die unternommenen Maßnahmen sollten versuchen, ausreichende Maus- Reste in eine humane variable Rahmenregion einzusetzen, um eine Antigen-Bindungsaktivität zu schaffen, die der von Maus- und chimärischen Antikörpern vergleichbar ist.

12.1. ANALYSE DER VARIABLEN REGION

Aus einer Überprüfung einer kleinen Datenbank von Strukturen von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen geht klar hervor, daß nur eine kleine Anzahl von Antikörperresten in direkten Kontakt mit dem Antigen kommt. Die anderen Reste können durch Positionierung der Kontaktreste in günstige Konfigurationen und auch durch Induktion einer stabilen Packung der einzelnen variablen Bereiche und stabile Wechselwirkung der variablen Bereiche der leichten und schweren Ketten zur Antigenbindung beitragen.
Die für die Übertragung ausgewählten Reste können auf eine Vielzahl von Wegen identifiziert werden:
(a) Durch Überprüfung der Antikörper-Kristallstrukturen durch Röntgenstrahlen kann die Antigen-Bindungsoberfläche hauptsächlich auf einer Reihe von Schleifen lokalisiert werden, von denen drei pro Bereich sich von dem B-Faß-Rahmen erstrecken.
(b) Durch Analyse der Sequenzen des variablen Bereichs des Antikörpers können Regionen mit Hypervariabilität [von Wu und Kabat (Lit. 5) als die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) bezeichnet] identifiziert werden. In den meisten, jedoch nicht in allen Fällen, entsprechen diese CDRs den oben genannten Schleifenregionen, erstrecken sich jedoch eine kurze Strecke darüberhinaus.
(c) Reste, die weder durch (a) noch durch (b) identifiziert sind, können zur Antigenbindung direkt oder indirekt beitragen, indem sie die Antigen-Bindungs stellen-Topologie beeinflussen oder eine stabile Packung der einzelnen variablen Bereiche induzieren und die Wechselwirkung zwischen den variablen Bereichen stabilisieren. Diese Reste können entweder durch Überlagerung der Sequenzen für einen gegebenen Antikörper auf einer bekannten Struktur und Betrachtung der Schlüsselreste für deren Beitrag oder durch Sequenz-Aneinanderreihungs-Analyse und Feststellung der "idiosynkratischen" Reste mit anschließender Prüfung von deren struktureller Lokalisierung und ähnlichen Effekten identifiziert werden.

12.1.1. LEICHTE KETTE

Figur 3 zeigt eine Aneinanderreihung von Sequenzen für die humane Rahmenregion RE1 und die leichte variable Region von OKT3. Die Strukturschleifen (LOOP) und die CDRs (KABAT), von denen angenommen wird, daß sie der Antigen- Bindungsregion entsprechen, sind angemerkt. Ebenso angemerkt sind eine Anzahl anderer Reste, die ebenfalls nach der Beschreibung von 13.1(c) zur Antigenbindung beitragen. Oberhalb der Sequenz in Figur 3 deutet der Reste-Typ auf die räumliche Anordnung jeder Restseitenkette hin, die durch Prüfung aufgelöster Strukturen aus der Röntgenkristallographie-Analyse stammt. Der Schlüssel zu dieser Restetyp-Bezeichnung ist der folgende:
N - nahe bei CDR (aus Röntgenstrukturen)
P - Packung
S - Oberfläche
I - Grenzfläche
Packung/Exponierter Teil
B - Vergrabene Nicht-Packung
E - Exponiert
* - Grenzfläche
? - Nicht-CDR-Reste, von denen verlangt sein kann, daß sie als Maus-Sequenz bleiben.
Die in Figur 3 unterstrichenen Reste sind Aminosäuren. RE1 wurde als der humane Rahmen gewählt, da die leichte Kette eine Kappa-Kette ist und die Kappa-variablen Regionen höhere Homologie mit den Maus-Sequenzen zeigen als eine Lambda leichte variable Region, z.B. KOL (siehe unten). RE1 wurde bevorzugt gegenüber anderen leichten Kappa-Ketten ausgewählt, da die Röntgenstruktur der leichten Kette bestimmt worden war, sodaß eine Strukturüherprüfung der einzelnen Reste erfolgen konnte.

12.1.2. SCHWERE KETTE

In ähnlicher Weise zeigt Figur 4 eine Aneinanderreihung von Sequenzen für die humane Rahmenregion KOL und die schwere variable Region von OKT3. Die Strukturschleifen und CDRs, von denen angenommen wird, daß sie der Antigen-Bindungsregion entsprechen, sind markiert. Ebenso markiert sind eine Anzahl anderer Reste, die ebenfalls zur Antigenbindung beitragen können, wie in 12.1(c) beschriehen ist. Der Schlüssel für den Reste-Typ und andere Indikatoren, die in Figur 4 verwendet sind, ist der gleiche, wie der in Figur 3 verwendete.
KOL wurde als Rahmen der schweren Kette gewählt, da die Röntgenstruktur bis zu einer besseren Auflösung als beispielsweise NEWM bestimmt worden war und auch die Sequenz-Anordnung der schweren variablen Region von OKT3 eine etwas bessere Homologie mit KOL als mit NEWM zeigte.

12.2. ENTWURF VON VARIABLEN GENEN

Die Bereiche der variablen Regionen wurden durch optimalen Codongebrauch der murinen variablen Region [Grantham und Perrin (Lit.15)] entworfen und verwendeten die B72.3 Signalsequenzen [Whittle et al. (Lit 13)]. Die Sequenzen wurden so entworfen, daß sie an die konstante Region in gleicher Weise banden, wie hei den oben beschriebenen chimärischen Genen. Manche Konstrukte enthielten die "Kozak Consensus-Sequenz" [Kozak (Lit. 16)] in direkter Verbindung mit dem 5' der Signalsequenz in dem Gen. Von diesem Sequenzmotiv wird angenommen, daß es eine vorteilhafte Rolle auf die Translationsinitiation in Eukaryoten hat.

12.3. GENKONSTRUKTION

Zum Aufbau der variablen Regionen stehen verschiedene Strategien zur Verfügung. Die Sequenz kann unter Verwendung von Oligonukleotiden in einer Weise zusammengesetzt werden, die ähnlich der von Jones et al. (Lit. 17) ist, oder durch gleichzeitigen Ersatz aller CDRs oder Schleifenregionen durch Oligonukleotid-gelenkte stellenspezifische Mutagenese in einer Weise ähnlich wie bei Verhoeyen et al. (Lit. 2). Es wurden beide Strategien verwendet und eine Liste von Konstruktionen ist in den Tabellen 1 und 2 und in Figuren 4 und 5 angegehen. Es hat sich in mehreren Fällen gezeigt, daß der Mutagenese-Versuch zu Deletionen und Umordnungen in dem umgewandelten Gen führte, währeiid der Erfolg des Aufbau-Versuchs sehr empfindlich hinsichtlich der Qualität der Oligonukleotide war.

13. KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN

Es wurden Gene aus Zwischenvektoren auf der Basis von M13 oder SP65 isoliert und in pEE6hCMVneo für die leichten Ketten und in pEE6hCMVgpt für die schweren Ketten in einer Weise geklont, wie sie oben für die chimärischen Gene beschrieben wurde. TABELLE 1 CDR-GEPFROFFTE GENKONSTRUKTE CODE MAUS-SEQUENZ GEHALT VERFAHREN ZUR KONSTRUKTION KOZAK SEQUENZ LEICHTE KETTE GESAMTHUMANER RAHMEN RE1 SCHWERE KETTE GESAMTHUMANER RAHMEN KOL human SDM und Genaufbau

LEGENDE

n.d. nicht durchgeführt
SDM Stellengelenkte Mutagenese
Genaufbau Variable Region, zur Gänze aus Oligonukleotiden aufgebaut
tw.(teilweiser) Genaufbau Variable Region, durch Kombination von Restriktionsfragmenten entweder aus anderen Genen, die ursprünglich durch SDM geschaffen wurden, und Genaufbau oder durch Oligonukleotid-Zusammenbau eines Teils der variablen Region und Rekonstruktion mit Restriktionsfragmenten aus anderen Genen, die ursprünglich durch SDM geschaffen wurden, und Genaufbau zusammengebaut.

14. EXPRESSION VON CDR-GEPFROPFTEN GENEN

14.1. HERSTELLUNG EINES ANTIKÖRPERS, BESTEHEND AUS GEPFROPFTEN LEICHTEN (gL) KETTEN MIT MURINEN SCHWEREN (mH) ODER CHIMÄRI- SCHEN SCHWEREN (cH) KETTEN

Alle gL Ketten in Verbindung mit mH oder cH lieferten vernünftige Mengen Antikörper. Der Einsatz der Kozak Consensus-Sequenz an einer Position 5' zu dem ATG (kgL Konstrukte) führte jedoch zu einer 2-5-fachen Besserung der reinen Expression. Uber eine ausgedehnte Reihe von Experimenten wurden die Expressionsgrade von etwa 200 ng/ml auf etwa 500 ng/ml für kgL/cH oder kgL/mH Kombinationen gesteigert.
Wenn die direkte Bindung an das Antigen auf HUT 78 Zellen gemessen wurde, führte ein Konstrukt, das dazu entworfen war, eine Maus-Sequenz auf der Basis einer Schleifenlänge (gL121) zu enthalten, in Verbindung mit mH oder cH nicht zu aktivem Antikörper. Ein Konstrukt, das dazu entworfen war, eine Maus-Sequenz auf der Basis von Kabat CDRs (gL221) zu umfassen, zeigte eine gewisse schwache Bindung in Verbindung mit mH oder cH. Wenn jedoch die Rahmenreste, 1, 3, 46, 47 von den humanen auf murine OKT3-Äquivalente auf der Basis der in Abschnitt 12.1 dargelegten Argumente verändert wurden, zeigte sich Antigenbindung, wenn beide neuen Konstrukte, die als 121A und 221A bezeichnet wurden, mit cH co-exprimiert wurden. Bei genauerer Prüfung der Wirkungen auf diese Reste scheint es, daß die Reste 1 und 3 keine Reste mit starkem Beitrag darstellen, da das Produkt des Gens gL221B wenig feststellbare Bindungsaktivität in Verbindung mit cH zeigt. Das Leicht-Ketten-Produkt von gL221C, in welchem Maus-Sequenzen bei 46 und 47 vorliegen, zeigt in Verbindung mit cH gute Bindungsaktivität.

14.2. HERSTELLUNG EINES ANTIKÖRPERS, BESTEHEND AUS GEPFROPFTEN SCHWEREN (gH) KETTEN MIT MURINEN LEICHTEN (mL) ODER CHIMÄRI- SCHEN LEICHTEN (cL) KETTEN

Die Expression der gH Gene erwies sich als schwerer zu erreichen als bei gL. Zuerst schien der Einschluß der Kozak-Sequenz keine deutliche Wirkung auf die Expression von gH Genen zu haben. Die Expression schien schwach verbessert zu sein, jedoch nicht im gleichen Ausmaß, wie dies für die gepfropften leichte Kette zu erkennen war.
Auch erwies es sich als schwierig aufzuzeigen, daß die Produktion von erwarteten Materialmengen auftritt, wenn die Schleifenauswahl (Aminosäure 26-32) für CDR1 verwendet wird, z.B. gH121, 131, 141, und es können über diese Konstrukte keine Schlüsse gezogen werden.
Außerdem war Co-Expression des gH 341 Gens mit cL oder mL unterschiedlich und neigte dazu, geringere Antikörpermengen zu produzieren, als bei Kombinationen von cH/cL oder mH/mL. Die Veränderungen zu gH341 zur Herstellung von gH341a und gH341B führen zu verstärkten Expressionsgraden.
Das kann entweder auf eine allgemeine Steigerung in dem Anteil der Maus-Sequenz in der variablen Region oder auf die Veränderung an Position 63 zurückzuführen sein, wo zur Vermeidung möglicher interner Packungsprobleme mit dem übrigen Teil des humanen Rahmens der Rest von Phenylalanin (Phe) wieder zur humanen Aminosäure Valin (Val) zurückgewandelt ist. Diese Anordnung tritt auch in gH331 und gH321 auf.
Wenn gH321 oder gH331 in Verbindung mit cL exprimiert wurden, wurde Antikörper produziert, Antikörper-Bindungsaktivität jeoch nicht festgestellt.
Wenn das konservativere Gen gH341 verwendet wurde, konnte Antigenbindung in Verbindung mit cL oder mL festgestellt werden, jedoch war die Aktivität nur geringfügig stärker als der Hintergrund.
Wenn weitere Maus-Reste auf der Grundlage der Argumente in 12.1 ersetzt wurden, konnte eindeutig Antigenbindung für den hergestellten Antikörper gezeigt werden, wenn kgH341A und kgH341B in Verbindung mit cL exprimiert wurden.

14.3. HERSTELLUNG VON VOLLSTÄNDIG CDR-GEPFROPFTEM ANTIKÖRPER

Das Gen kgL221a wurde mit kgH341, kgH341A oder kgH341B co-exprimiert. Für die Kombination kgH221A/kgH341 wurde bei einer normalen COS Zellexpression wenig Material produziert.
Für die Kombinationen kgL221A/kgH341A oder kgH221A/kgH341B waren die produzierten Antikörpermengen ähnlich wie denen bei gl/cH.
Bei manchen Versuchen konnte keine Antigen-Bindungsaktivität mit kgH221A/gH341 oder kgH221A/kgH341 Kombinationen festgestellt werden, obwohl die Expressionsgrade sehr niedrig waren.
Antigenbindung wurde festgestellt, wenn kgL221A/kgH341A oder kgH221A/kgH341B Kombinationen exprimiert wurden. Im Fall des aus der Kombination kgL221A/kgH341A produzierten Antikörpers war die Antigenbindung sehr ähnlich jener des chimärisehen Antikörpers.
Eine Analyse der obigen Ergebnisse ist im folgenden angegeben.

15. DISKUSSION DER ERGEBNISSE DER CDR-PFROPFUNG

In dem Design für den vollständig humanisierten Antikörper war es das Ziel, eine minimale Anzahl von Maus-Aminosäuren, die zu einer Antigenbindung an einen humanen Antikörper-Rahmen beitragen würden, zu übertragen.

15.1. LEICHTE KETTE

15.1.1. ERSTRECKUNG DER CDRs

Bei der leichten Kette sind die Regionen, die die Schleifen definieren, von denen es aus Strukturuntersuchungen anderer Antikörper bekannt ist, daß sie Antigenkontaktierende Reste enthalten, und jene hypervariablen Sequenzen, die von Kabat et al. (Lit. 4 und 5) als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) definiert sind, für CDR2 äquivalent. Für CDR1 erstreckt sich die hypervariable Region von den Resten 24- 34 inklusive, während sich die Strukturschleife von 26-32 inklusive erstreckt. Im Fall von OKT3 liegt nur eine Aminosäure-Differenz zwischen den beiden Optionen vor, und zwar bei Aminosäure 24, wo die Maus-Sequenz ein Serin ist und der humane Rahmen RE1 Glutamin aufweist. Für CDR3 erstreckt sich die Schleife von den Resten 91-96 inklusive, während sich die Kabat Hypervariabilität von den Resten 89-97 inklusive erstreckt. Für OKT3 sind die Aminosäuren 89, 90 und 97 die gleichen zwischen OKT3 und RE1 (Fig. 3). Wenn Konstrukte auf der Basis der Schleifenauswahl für CDR1 (gL121) und der Kabat-Auswahl (gL221) hergestellt und mit mH oder cH co-exprimiert wurden, konnte kein Beweis für Antigen-Bindungsaktivität bei gL121 gefunden werden, jedoch konnte spurenhafte Aktivität bei gL221 gefunden werden, was darauf hinweist, daß ein einziger Extra-Mausrest in der gepfropften variablen Region einen gewissen feststellbaren Effekt ausüben könnte. Beide Gen-Konstrukte wurden in dem transienten Expressionssystem in vernünftigem Ausmaß exprimiert.

15.1.2. RAHMENRESTE

Die verbleibenden Rahmenreste wurden dann weiter untersucht, insbesondere die Aminosäuren, von denen es aus der Röntgenanalyse anderer Antikörper bekannt war, daß sie nahe den CDRs waren, sowie jene Aminosäuren, die in OKT3 Unterschiede aus dem Consensus-Rahmen für die Maus-Untergruppe (Untergruppe VI) zeigten, mit welcher OKT3 die größte Homologie besitzt. Vier Positionen 1, 3, 46 und 47 wurden identifiziert und ihr möglicher Beitrag wurde durch Ersatz der humanen Aminosäure durch die Maus-Aminosäure an jeder Position überprüft. Daher wurden gL221A (gL221 + D1Q, Q3V, L46R, L47W, vgl. Figur 3 und Tabelle 1) hergestellt, in EE6hCMVneo geklont und mit cH co-exprimiert (pJA144). Der entstehende Antikörper wurde gut exprimiert und zeigte gute Bindungsaktivität. Wenn die verwandten Gene gL221B (gL221 + D1Q; Q3V) und gL221C (gL221 + L46R, L47W) hergestellt und in ähnlicher Weise untersucht wurden, zeigte sieh, obwohl beide Gene bei der Co-Expression mit cH Anti korper produzierten, eine gute Antigenbindung nur bei der Kombination gL221C/cH. Wenn das Gen gL121A (gL121 + D1Q, Q3V, L46R, L47W) hergestellt und mit cH coexprimiert wurde, wurde Antikörper produziert, der auch an Antigen band.

15.2. SCHWERE KETTE

15.2.1. ERSTRECKUNG DER CDRs

Für die schwere Kette stimmen die Analysen hinsichtlich der Schleifen und der Hypervariabilität nur bei CDR3 überein. Für CDR1 erstreckt sich die Schleifenregion von den Resten 26 bis 32 inklusive, wogegen sich die Kabat CDR von den Restens 31-35 inklusive erstreckt. Für CDR2 reicht die Schleifenregion von 50-58 inklusive, während die hypervariable Region die Aminosäuren 50-65 inklusive abdeckt. Daher wurden humanisierte schwere Ketten unter Verwendung des Rahmens aus dem Antikörper KOL und mit verschiedenen Kombinationen dieser CDR Auswahl konstruiert, inklusive einer kürzeren Auswahl für CDR2 von 50-56 inklusive, da hier eine gewissen Unbestimmtheit hinsichtlich der Definition des Endpunktes für die CDR2 Schleife rund um die Reste 56-58 bestand. Die Gene wurden ursprünglich mit mL oder cL co-exprimiert. Im Fall der gH Gene mit Schleifenauswahl für CDR1, z.B. gH121, gH131, gH141, wurde in den Kulturüberständen nur sehr wenig Antikörper gebildet. Da keine freie leichte Kette festgestellt wurde, wurde angenommen, daß der Antikörper hergestellt und innerhalb der Zelle zusammengebaut wurde, daß jedoch die schwere Kette in gewisser Weise anders, möglicherweise unkorrekt gefaltet war und der Antikörper daher intern abgebaut wurde. Bei manchen Versuchen konnten Spurenmengen von Antikörper bei 355 Kennzeichnungsstudien festgestellt werden.
Da kein reiner Antikörper produziert wurde, wurde die Analyse dieser Konstrukte nicht weiter verfolgt.
Wenn jedoch eine Kombination von Schleifenauswahl und Kabat-Auswahl für CDR1 untersucht wurde (murine Aminosäuren 26-35 inklusive), wobei die Reste 31 (Ser bis Arg), 33 (Ala bis Thr) und 35 (Tyr bis His) von den humanen Resten auf Mausreste verändert wurden und diese mit der ersten Serie verglichen wurden, wurde für gH321, kgH331 und kgH341 Antikörper produziert, wenn Co-Expression mit cL stattfand. Die Expression war im allgemeinen niedrig und konnte durch Einbau von Kozak Consensus-Sequenz 5' zu den ATG der Signalsequenz des Gens nicht deutlich verbessert werden, was sich von dem Fall der gL Gene unterscheidet, wo ein solcher Einbau zu einer 2-5-fachen Steigerung der Produktion des reinen Antikörpers führte. Es konnte jedoch nur im Fall von gH341/mL oder kgH341/cL geringfügige Antigen-Bindungsaktivität gezeigt werden. Wenn das kgH341 Gen mit kgL221A co-exprimiert wurde, war die reine Ausbeute des Antikörpers zu gering, um ein Signal über dem Hintergrund-Niveau des Antigen-Bindungsassays zu ergeben.

15.2.2. RAHMENRESTE

Wie im Fall der leichten Kette wurden auch für die schwere Kette die Rahmen neuerlich untersucht. Möglicherweise wegen der geringeren anfänglichen Homologie zwischen den murinen und humanen schweren variablen Bereichen im Vergleich zu den leichten Ketten erwiesen sich mehr Aminosäure-Positionen von Interesse. Es wurden zwei Gene kgH341A und kgH341B konstruiert, wobei 11 bzw. 8 humane Reste durch Mausreste im Vergleich zu gH341 ersetzt wurden und der CDR2 Rest 63 zu der humanen Aminosäure wegen einer möglichen Verbesserung der Bereichspackung zurückkehrte. Beide Fälle zeigten Antigenbindung, wenn in Kombination mit cL oder kgL221A, wobei das kgH341A Gen mit allen 11 Änderungen die bevorzugte Auswahl zu sein schien.

15.3. VORLAUFIGE SCHLUSSFOLGERUNGEN

Es hat sich daher für OKT3 gezeigt, daß für die Übertragung der Antigen- Bindungsfähigkeit auf den humanisierten Antikörper Mausreste außerhalb der CDR-Regionen, die durch die Kabat-Hypervariabilität definiert sind, oder Strukturschleifen-Auswahl für sowohl die leichten als auch die schweren Ketten erforderlich sind. Weniger Extrareste sind für die leichte Kette notwendig, was möglicherweise auf die höhere ursprüngliche Homologie zwischen den variablen Kappa-Regionen von Maus und Mensch zurückzuführen ist.
Von den Veränderungen waren sieben (1 und 3 von der leichten Kette und 6, 23, 71, 73 und 76 von der schweren Kette) aus der Kenntnis anderer Antikörperstrukturen als entweder teilweise exponiert oder auf der Antikörperoberfläche vorhergesagt. Es zeigte sich hier, daß die Reste 1 und 3 in der leichten Kette nicht absolut erforderlich als Maus-Sequenz sind; und für die schwere Kette zeigte sich, daß die gH341B schwere Kette in Kombination mit der 221A leichten Kette nur schwache Bindungsaktivität hervorrief. Daher war die Anwesenheit der Veränderungen 6, 23 und 24 notwendig, um eine Bindungsaffinität aufrechtzuerhalten, die der des murinen Antikörpers ähnlich ist. Es war daher wichtig, den einzelnen Beitrag der anderen 8 Mausreste des Gens kgH341A im Vergleich zu kgH341 zu untersuchen.

16. WEITERE CDR-PFROPFUNGSVERSUCHE

Zusätzliche Gene CDR-gepfropfter schwerer Kette wurden im wesentlichen nach obiger Beschreibung hergestellt. Unter Bezugnahme auf Tabelle 2 basierten die weiteren Gene der schweren Ketten auf gH341 (Plasmid pJA178) und gH341A (Plasmid pJA185) mit entweder Maus OKT3 oder Human KOL Resten bei 6, 23, 24, 48, 49, 63, 71, 73, 76, 78, 88 und 91, wie angegeben ist. Die CDR-gepfropften Leicht-Ketten- Gene, die bei diesen weiteren Versuchen verwendet wurden, waren gL221, gL221A, gL221B und gL221C, wie sie oben beschrieben sind. Tabelle 2 OKT3 SCHWERE KETTE CDR-PFROPFUNGEN 1. gH341 und Derivate REST NR. OKT3 LEICHTE KETTE CDR-PFROPFUNGEN 2. gL221 und Derivate REST NR. MURINE RESTE SIND UNTERSTRICHEN
Die Gene der CDR-gepfropften schweren und leichten Ketten wurden in COS-Zellen entweder miteinander in verschiedenen Kombinationen, aber ebenso auch mit den entsprechenden Genen muriner und chimärischer schwerer und leichter Ketten im wesentlichen nach der obigen Beschreibung co-exprimiert. Die entstehenden Antikörperprodukte wurden dann in Bindungs- und Blockierungs-Assays mit HPB-ALL-Zellen nach obiger Beschreibung untersucht.
Die Ergebnisse der Assays hinsichtlich verschiedener gepfropfter schwerer Ketten, die mit der leichten Kette von gL221C co-exprimiert worden waren, sind in den Figuren 7 und 8 (für die Konstrukte JA184, JA185, JA197 und JA198 - vgl. Tabelle 2), in Figur 9 (für die Konstrukte JA183, JA184, JA195 und JA197), in Figur 10 (für die chimärischen Konstrukte JA185, JA199, JA204, JA205, JA207, JA208 und JA209) und in Figur 11 (für die Konstrukte JA183, JA184, JA185, JA198, JA203, JA205 und JA206) angegeben.
Das gepfropfte Grundprodukt ohne jegliche Veränderungen von human zu murin in den variablen Rahmen, d.h. gL221, coexprimiert mit gH341 (JA178), sowie auch das "vollständig gepfropfte" Produkt, das die meisten Veränderungen von human zu murin in dem Rahmen der gepfropften schweren Kette aufweist, d.h. gL221C, co-exprimiert mit gH341A (JA185) wurden in einem Kompetitionsassay gegen den murinen OKT3 Vergleichsstandard unter Verwendung von HPB-ALL-Zellen auf relative Bindungsaffinität geprüft. Der verwendete Assay entsprach der obigen Beschreibung in Abschnitt 3.3. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 12 für das gepfropfte Grundprodukt und in Figur 13 für das vollständig gepfropfte Produkt angegeben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das gepfropfte Grundprodukt relativ geringe Bindungsfähigkeit im Vergleich zu dem murinen OKT3 Vergleichsstandard aufweist; wogegen das "vollständig gepfropfte" Produkt eine Bindungsfähigkeit besitzt, die der des murinen OKT3 Vergleichsstandards sehr ähnlich ist.
Die Ergebnisse des Bindungs- und Blockierungs-Assays deuten auffolgendes hin:
Die Konstrukte JA198 und JA207 scheinen die besten Bindungseigenschaften und ähnliche Bindungsfähigkeiten zu besitzen, wobei beide im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie die chimärischen und vollständig gepfropften gh341A Produkte aufweisen. Das deutet darauf hin, daß die Positionen 88 und 91 sowie die Position 76 für das Aufrechterhalten der OKT3 Bindungsfähigkeit nicht sehr kritisch ist; während mindestens einige der Positionen 6, 23, 24, 48, 49, 71, 73 und 78 von größerer Bedeutung sind.
Das ergab sich durch die Tatsache, daß JA209 und JA199, obwohl sie miteinander ähnliche Bindungsfähigkeit aufweisen eine geringere Bindungsfähigkeit als die Konstrukte JA198 und JA207 besitzen. Das weist auf die Bedeutung hin, in den Positionen 71, 73 und 78, die in den Konstrukten JA199 bzw. JA209 entweder vollstandig oder teilweise human sind, Maus-Reste zu haben.
Außerdem ist aus dem Vergleich der für die Konstrukte JA205 und JA183 erhaltenen Ergebnisse zu ersehen, daß eine Abnahme der Bindung von dem Konstrukt JA205 zu dem Konstrukt JA 183 besteht. Das weist auf die Bedeutung der Beibehaltung eines Maus-Restes an Position 23 hin, der einzigen Position, die zwischen JA205 und JA183 verändert ist.
Diese und andere Ergebnisse führen uns zu dem Schluß, daß es wichtig ist, von den 11 murinen Rahmenresten, die in dem Konstrukt gH341A (JA185) verwendet sind, Maus-Reste an allen Positionen 6, 23, 24, 48 und 49 und möglicherweise wegen einer maximalen Bindungaffinität bei 71, 73 und 78 beizubehalten.

LITERATURSTELLEN

1. Kohler & Milstein, Nature, 265, 295-497, 1975.
2. Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536, 1988.
3. Riechmann et al., Nature, 332, 323-324, 1988.
4. Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M., Göttesman, K.S., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, MH, USA.
5. Wu, T.T. und Kabat, E.A., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250.
6. Queen et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 10029-10033 und WO 90/07861.
7. Chatenoud et al., (1986), J. Immunol. 137, 803-838.
8. Jeffers et al., (1986), Transplantation, 41, 572-578.
9. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
10. Primrose und Old, Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford, 1980.
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13. Whittle, N., Adair, J., Lloyd, J.C., Jenkins, E., Devine, J., Schlom, J., Raubitshek, A., Colcher, D., Bodmer, M., 1987, Protein Engineering 1, 499.
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Claims

1. Ein Anti-CD3-Antikörpermolekül, das Affinität für das CD3 Antigen besitzt und eine zusammengesetzte schwere Kette und eine komplementäre leichte Kette umfaßt, wobei diese zusammengesetzte schwere Kette einen variablen Bereich aufweist, der überwiegend humane Akzeptor-Rahmenreste einer schweren Kette eines Antikörpers und nicht-humane Donor-Antigen-Bindungsreste einer schweren Kette eines Antikörpers enthält, wobei dieser Donor-Antikörper Mfinität für das genannte CD3 Antigen aufweist, worin, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem, in der genannten zusammengesetzten schweren Kette mindestens die Aminosäurereste 23, 24, 31 bis 35, 49 bis 58 und 95 bis 102 Donor-Reste sind.

2. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 1, in welchem die Aminosäurereste 71, 73 und 78 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

3. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Aminosäurereste 26 bis 30 und 59 bis 65 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

4. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 1, 3 und 76 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

5. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 36 (wenn kein Tryptophan), 94 (wenn kein Arginin), 104 und 106 (wenn keine Glycine) und 107 (wenn kein Threonin) in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

6. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 5, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 2, 4, 6, 38, 46, 67 und 69 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

7. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 18, 20, 80, 82 und 86 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

8. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 37 (wenn er kein Valin ist, jedoch ein größeres Seitenkettenvolumen oder eine Ladung oder Polarität hat), 39 (wenn kein Glutamin), 45 (wenn kein Leucin), 47 (wenn kein Tryptophan), 91 (wenn kein Phenylalanin oder Tyrosin), 93 (wenn kein Alanin) und 103 (wenn kein Tryptophan) in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

9. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 9, 11, 41, 87, 108, 110 und 112 in der genannten zusammengesetzten schweren Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

10. Ein Anti-CD3 Antikörpermolekül, das Affinität für das CD3 Antigen besitzt und eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfaßt, wobei die genannte zusammensetzte leichte Kette einen variablen Bereich aufweist, der überwiegend humane Akzeptor-Rahmenreste einer leichten Kette eines Antikörpers und nicht-humane Donor-Antigen-Bindungsreste einer leichten Kette eines Antikörpers enthält, wobei dieser Donor-Antikörper Mfinität für das genannte CD3 Antigen hat, worin, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem, in der genannten zusammensetzten leichten Kette mindestens die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.

11. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in welchem die genannte komplementäre leichte Kette eine zusammensetzte leichte Kette mit einem variablen Bereich ist, der überwiegend Akzeptor-Rahmenreste einer leichten Kette eines Antikörpers und Donor-Antigen-Bindungsreste einer leichten Kette eines Antikörpers aufweist, wobei der genannte Donor-Antikörper Affinität für das genannte CD3 Antigen hat, worin, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem, in der genannten zusammengesetzten leichten Kette mindestens die Aminosäurereste 24 bis 34, 46, 48, 50 bis 56, 58, 71 und 89 bis 97 Donor-Reste sind.

12. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 10 oder 11, in welchem die Aminosäurereste 1 und 3 und 60 und 70 (wenn Rest 60 eine Salzbrücke mit Rest 54 und wenn Rest 70 eine Salzbrücke mit Rest 24 bilden kann) in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

13. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 12, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 6 (wenn kein Glutamin), 35 (wenn kein Tryptophan), 62 (wenn kein Phenylalanin oder Tyrosin), 64, 66, 68, 99 und 101 (wenn keine Glycine) und 102 (wenn kein Threonin) in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

14. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 13, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 2, 4, 37, 45 und 47 in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

15. Das Antikörpermolekül nach Anspruch 14, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 19, 21 und 73 in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

16. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 15, in welchem die Aminosäurereste 36 (wenn kein Tyrosin), 44 (wenn kein Prolin), 49 (wenn kein Tyrosin), 85, 87 (wenn kein Tyrosin) und 98 (wenn kein Phenylalanin) in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich Donor-Reste sind.

17. Das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 16, in welchem mindestens einer der Aminosäurereste 10, 12, 40, 80, 83, 103 und 105 in der genannten zusammengesetzten leichten Kette zusätzlich ein Donor-Rest ist.

18. Eine therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel enthält.