ES2400520T3

ES2400520T3 - Molécula de adhesión a las células T y anticuerpo contra la molécula

Info

Publication number: ES2400520T3
Application number: ES06810939T
Authority: ES
Inventors: Hideaki Ogasawara; Keiko Mizuno; Yoshihisa Arita; Miyuki Nishimura; Toshio Imai
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2026-09-29
Also published as: KR20080068039A; RU2396275C2; CA2624135C; IL190488A; KR101026016B1; BRPI0616438A2; NO20081503L; WO2007037430A1; AU2006295717B2; IL190488A0; DK1939288T3; EP1939288A1; JP5106111B2; MY150639A; CA2624135A1; CN101316930B; HK1119448A1; IL211031A0; EP1939288A4; JPWO2007037430A1

Abstract

Un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora seleccionada de las siguientes (ix), (x), (xi) y (xii)o un fragmento funcional de la misma: (ix) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; (x) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidosestán insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a uno o los dos extremos, y quees funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; (xi) una proteína de membrana o secretora que es codificada por un polinucleótido que se hibrida encondiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a unaproteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; y (xii) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% omás de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuenciade aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

Description

Molécula de adhesión a las células T y anticuerpo contra la molécula.

Campo Técnico

5 Una molécula de adhesión a las células T se expresa en células dendríticas derivadas de médula ósea por un gen de la misma, y un ligando para la molécula de adhesión (receptor) se expresa en células T por un gen de la misma. La presente invención se refiere a un anticuerpo contra la molécula de adhesión o el ligando y un uso del mismo. Ademáes, la presente invención se refiere también a un método de cribado que utiliza la molécula de adhesión.

Técnica Anterior

10 En los últimos años, se ha publicado que una molécula clonada como activador de las células dendríticas que se expresa en las células T es una citoquina importante para regulación de la diferenciación de los osteoclastos (Yasuda, H., et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:3597-3602). De este modo, se ha esclarecido que un sistema inmune está asociado estrechamente con el metabolismo óseo.

Los estudios en la regulación del metabolismo óseo por moléculas reguladoras del sistema inmune han progresado

15 rápidamente, y se ha esclarecido también la transducción de señales asociada con la regulación de la diferenciación de los osteoclastos.

Por ejemplo, como una molécula implicada en la diferenciación de los osteoclastos, se ha dado a conocer Oscar (receptor asociado a los osteoclastos). Se ha publicado también hasta la fecha que Oscar es un receptor semejante a inmunoglobulina, que está asociado con la cadena FcRγ y transmite una señal a la fosfolipasa Cγ por la vía de un

20 motivo ITAM de la cadena FcRγ (Kim, N., et al. (2002) J Exp Med 195:201-209).

Adicionalmente, diversas interacciones tales como CD80-CD28, CD40-CD40L o ICAM1-LFA1 han sido consignadas para moléculas que se expresan en células dendríticas y se adhieren a una célula T de tal modo que se implican en una interacción concerniente a una respuesta inmune entre células T y células dendríticas.

Sumario de la Invención

25 Los autores de la presente invención han identificado un gen que se expresa específicamente en células dendríticas derivadas de la médula ósea por un método de sustracción. Asimismo, los inventores han encontrado que una proteína codificada por el gen arriba mencionado se fija a la cadena FcRγ constituyendo el receptor IgE, que la expresión de la proteína arriba mencionada se intensifica por estímulo con LPS, que las células dendríticas se activan por estímulo de reticulación de anticuerpos a la proteína arriba mencionada, que la proteína arriba

30 mencionada tiene una función de adherencia a una célula T, y que un anticuerpo contra la proteína arriba mencionada tiene un efecto terapéutico en un modelo de artritis inducida por colágeno que es un modelo de la enfermedad artritis reumatoide. Los inventores han identificado además un gen de un ligando para la proteína arriba mencionada, que se expresa en las células T. La presente invención está basada en estos descubrimientos.

Una proteína de membrana o secretora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,

35 SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 que contiene una o más sustituciones conservadoras (a la que se hace referencia en lo sucesivo como una primera proteína).

Una proteína de membrana o secretora adicional se selecciona de las (i), (ii), (iii) y (iv) siguientes (a la que se hace referencia en lo sucesivo como una segunda proteína):

40 (i) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(ii) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a uno o ambos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

45 (iii) una proteína de membrana o secretora que es codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y

(iv) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de

identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y que es funcionalmente equivalente a una proteína 50 constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Un polinucleótido codifica las nuevas proteínas de las realizaciones primera y segunda de acuerdo con la presente invención. 2

El polinucleótido se selecciona de los (v), (vi), (vii) y (viii) siguientes:

(v): un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9;

(vi): un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 en la cual uno o más nucleótidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más nucleótidos se añaden a uno o ambos

5 extremos, y que codifica una proteína de membrana o secretora funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(vii) un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, y que codifica una proteína de membrana o secretora funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y

10 (viii) un polinucleótido que tiene 90% o más de identidad con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, y que codifica una proteína de membrana o secretora funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

La presente invención proporciona un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora seleccionada de las siguientes (ix), (x), (xi) y (xii) (a la que se hace referencia ocasionalmente en lo sucesivo como una proteína TARM

15 (Receptor de Activación interactivo con las células T en células Mieloides)), y un fragmento funcional de la misma (al que se hace referencia en lo sucesivo como un anticuerpo de una primera realización de acuerdo con la presente invención):

(ix) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

20 (x) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a uno o los dos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

25 (xi) una proteína de membrana o secretora que es codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; y

30 (xii) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

35 Una proteína ligando que es un ligando para la proteína de acuerdo con la presente invención, se selecciona de las siguientes (xiii), (xiv), (xv) y (xvi) (a la que se hace referencia ocasionalmente en lo sucesivo como una proteína ligando o una proteína TARM-L (ligando TARM));

(xiii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16;

(xiv) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 en la cual

40 uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a uno o a los dos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16;

(xv) una proteína que está codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido

que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, y que es funcionalmente equivalente 45 a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16; y

(xvi) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.

Un polinucleótido codifica la proteína ligando.

50 La presente invención proporciona también un polinucleótido seleccionado de los siguientes (xvii), (xviii), (xix) y (xx):

(xvii) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15; (xviii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 en el cual uno o más nucleótidos se han insertado, sustituido o delecionado, o uno o más nucleótidos se han añadido en uno o los dos extremos, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16;

5 (xix) un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16; y

(xx) un polinucleótido que tiene 70% o más de identidad con un polinucleótido que comprende la secuencia de

nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una 10 proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.

La presente invención proporciona un anticuerpo contra la proteína ligando seleccionada de (xiii), (xiv), (xv) y (xvi), y un fragmento funcional de la misma (al que se hace referencia en lo sucesivo como un anticuerpo de una segunda realización de acuerdo con la presente invención).

La presente invención proporciona un agente terapéutico para enfermedades autoinmunes que comprende, como

15 ingredientes activos, los anticuerpos de las realizaciones primera y segunda de acuerdo con la presente invención (en lo sucesivo, puede hacerse referencia a ambos anticuerpos como “anticuerpos de acuerdo con la presente invención “), o fragmentos funcionales de los mismos.

La presente invención proporciona los métodos de cribado siguientes.

De acuerdo con un método de cribado de una segunda realización de acuerdo con la presente invención, se

20 proporciona un método para cribado de una sustancia que inhibe la activación de una zona dendrítica o una sal de la misma, o un solvato de la misma, que comprende los pasos de:

(d): poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención con una célula dendrítica en presencia o ausencia de una sustancia de test; y

(e): medir el nivel de activación de dicha célula dendrítica.

25 Según un método de cribado de una tercera realización de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para cribado de una sustancia que inhibe la formación de un complejo entre una proteína TARM y la cadena FcRγ o una sal de la misma, o un solvato de la misma, que comprende los pasos de:

(g) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional de mismo de acuerdo con la presente invención con una célula dendrítica en presencia o ausencia de una sustancia de test; y

30 (h) medir el nivel de expresión de la cadena FcRγ en dicha célula dendrítica.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de los genes TARM de ratón (m1 a 4 y s1), en donde el subrayado indica una región con estructura de bucle de inmunoglobulina (IG) y el tipo negrita indica una región transmembranal.

35 La Figura 2 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de mRNA de TARM en tejidos de ratón por PCR en tiempo real utilizando el juego de cebadores 1.

La Figura 3 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de mRNA de TARM en diversos tipos de células por PCR en tiempo real utilizando el juego de cebadores 1.

La Figura 4A muestra la estructura y los números de aminoácidos de una región extracelular utilizada en la

40 producción de anticuerpos anti-TARM. La Figura 4B muestra los resultados obtenidos por estudio de la especificidad del anticuerpo arriba mencionado para la proteína TARM.

La Figura 5 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de proteínas de ratón en células dendríticas derivadas de médula ósea.

La Figura 6 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de proteínas de ratón en células derivadas 45 de tejidos inmunes de ratón normal.

La Figura 7 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de la proteína de ratón en células cebadas peritoneales positivas al kit c.

La Figura 8 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de la proteína TARM de ratón en células de ganglios linfáticos de ratón por estímulo inflamatorio con LPS, en donde las flechas indican la expresión de la

50 proteína TARM de ratón.

La Figura 9A muestra la inducción de la producción de IL-6 a partir de células dendríticas de médula ósea madura por estímulo del anticuerpo anti-TARM. La Figura 9B muestra la inducción de la producción de MCP-1 a partir de células dendríticas de médula ósea inmaduras por estímulo del anticuerpo anti-TARM.

La Figura 10 muestra los aumentos en la cadena FcRγ asociados con aumentos en la expresión de la proteína 5 TARM de ratón en la superficie celular.

La Figura 11 muestra los resultaos obtenidos por análisis de la formación de un complejo entre la proteína TARM de ratón y la cadena FcRγ por un método de inmunoprecipitación.

La Figura 12 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de moléculas que se fijan a la proteína TARM de ratón en células T activadas.

10 La Figura 13 muestra la aptitud de las células T activadas para adherirse a la proteína TARM de ratón.

La Figura 14 muestra la inhibición de la adhesión de las células Th2 a la proteína TARM de ratón por anticuerpos anti-TARM de ratón.

La Figura 15 muestra los hallazgos externos y cambios en los pesos corporales a lo largo del tiempo de un modelo de artritis inducida por colágeno, al cual se ha administrado un anticuerpo anti-TARM de ratón.

15 La Figura 16 muestra el efecto de la administración del anticuerpo anti-TARM de ratón al modelo de artritis inducida por colágeno sobre las concentraciones de amiloide A del suero en plasma del mismo.

La Figura 17 muestra el efecto de la administración del anticuerpo anti-TARM de ratón al modelo de artritis inducida por colágeno sobre los títulos de anticuerpos anti-colágeno en plasma del mismo.

La Figura 18 muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de mRNA de la proteína TARM en tejidos 20 humanos por PCR en tiempo real.

La Figura 19 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína TARM humana, en donde el subrayado indica una región con estructura de bucle de inmunoglobulina (Ig), el tipo negrita indica una región transmembranal, y la parte encuadrada indica secuencias diferentes entre hTARM y LOC441864.

La Figura 20 muestra la capacidad de las células T activadas para adherirse a la proteína TARM humana, y la 25 inhibición de la adhesión de las células T a la proteína TARM humana por anticuerpos anti-TARM humanos.

La Figura 21A muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión de moléculas que se fijan a la proteína TARM de ratón en líneas de células de ratón. La Figura 21B muestra los resultados obtenidos por análisis de la expresión del mRNA de ENSMUSG00000035095, una molécula candidato mTARM-L en líneas de células de ratón por PCR en tiempo real.

30 La Figura 22A muestra la fijación específica de la proteína quimérica TARM-AP de ratón a células B300.19 que expresan mTARM-L. La Figura 22B muestra la adhesión celular específica de células B300.19 que expresan mTARM-L a la proteína quimérica TARM-AP de ratón.

La Figura 23 muestra los resultados obtenidos por análisis de homología entre las proteínas TARM-L humana y de ratón.

35 La Figura 24 muestra los resultados obtenidos por análisis de homología entre la proteína TARM humana y la proteína TARM de ratón (m3).

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención se describirá en detalle a continuación. Las descripciones que siguen se dan exclusivamente como ejemplos para explicar la presente invención, y por consiguiente no debe considerarse que tales ejemplos 40 limiten la presente invención sólo a las realizaciones de la presente invención. Todos los términos tecnológicos, términos científicos y términos técnicos utilizados en la presente memoria descriptiva tienen los mismos significados que los comprendidos generalmente por las personas expertas en el campo técnico al que se refiere la presente invención. Dichos términos se utilizan para el propósito de explicar sólo realizaciones específicas, y por consiguiente no debe considerarse que limiten la presente invención. La presente invención puede llevarse a cabo en diversas

45 realizaciones, a no ser que se desvíen de la esencia de la misma. Todas las referencias y documentos de patente de la técnica anterior tales como solicitudes de patente o publicaciones de patente citadas en esta memoria se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad, y pueden utilizarse para llevar a cabo la presente invención.

[Proteínas y polinucleótidos]

50 Entre los genes que se expresan específicamente en células dendríticas derivadas de la médula ósea, que se han identificado, un gen derivado de ratón tiene 5 tipos de isoformas. Tales isoformas de un gen derivado de ratón incluyen m1, m2, m3 y m4 que son genes de proteínas fijadas a la membrana (proteínas de membrana), y s1 que es un gen de proteína de tipo secretor (proteína secretora). Las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de tales isoformas corresponden a los números de secuencia siguientes:

m1 SEQIDNOS:11y 12

5 m2 SEQIDNOS:1y2

m3 SEQIDNOS:3y 4

m4 SEQIDNOS:5y 6

s1 SEQIDNOS:7y 8

Entre los genes que se expresan específicamente en células dendríticas derivadas de la médula ósea, puede

10 mencionarse un tipo de gen de proteína de membrana como un gen derivado de humano. La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen son como se muestra en SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente.

Dado que la secuencia de nucleótidos del gen codifica un péptido señal, una proteína codificada por el gen arriba mencionado forma una proteína de membrana o una proteína secretora. El terminal C de la proteína de membrana

15 de acuerdo con la presente invención está modificado (por ejemplo, por deleción de una porción transmembranal), a fin de obtener una proteína secretora. El terminal C de la proteína secretora de acuerdo con la presente invención está modificado (por ejemplo, por adición de una porción transmembranal al mismo, a fin de obtener una proteína de membrana.

En la presente memoria descriptiva, las expresiones “uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o

20 delecionados, o añadidos a uno o ambos extremos” y “uno o más nucleótidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más nucleótidos están añadidos a uno o ambos extremos” significa que la modificación se ha llevado a cabo de acuerdo con métodos técnicos bien conocidos tales como mutagénesis orientada, o por sustitución de un número plural de aminoácidos o nucleótidos en la medida en que se regeneran naturalmente. El número de aminoácidos o nucleótidos a modificar puede ser, por ejemplo, 1 a 30, preferiblemente 1 a 20, más

25 preferiblemente 1 a 10, aún más preferiblemente 1 a 5, y de modo particularmente preferible 1 ó 2.

La secuencia de aminoácidos modificada puede ser preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una o más (preferiblemente una o varias, o 1, 2, 3 ó 4) sustituciones conservadoras en la secuencia de aminoácidos.

La secuencia de nucleótidos modificada puede ser preferiblemente una secuencia de nucleótidos que tiene una o más (por ejemplo una o varias, o 1, 2, 3 ó 4) mutaciones que no afectan a las funciones de una proteína constituida

30 por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En la presente memoria descriptiva, el término “sustitución conservadora” significa que uno o varios residuos de aminoácidos están sustituidos con otros residuos de aminoácidos químicamente similares, de tal modo que las funciones de una proteína no se modifican sustancialmente. Ejemplos de una sustitución conservadora de este tipo incluyen un caso en el que un residuo hidrófobo se sustituye por otro residuo hidrófobo y un caso en el que cierto 35 residuo polar se sustituye por otro residuo polar que tiene la misma carga eléctrica. Para cada tipo de aminoácidos, aminoácidos funcionalmente similares que pueden sustituirse de dicho modo se conocen en el presente campo técnico. Ejemplos de aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina, y metionina. Ejemplos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, y cisteína. Ejemplos de aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen

40 arginina, histidina y lisina. Ejemplos de aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

En la presente memoria descriptiva, el término “hibridación” significa hibridarse con un polinucleótido diana en condiciones severas. Específicamente, puede citarse como ejemplo un polinucleótido que tenga al menos 70% o más, preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 85% o más, todavía más preferiblemente 90% o más, y más 45 preferiblemente aún 95% o más, de modo particularmente preferible 98% o más, y muy preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia del nucleótido diana, cuando dicha identidad se calcula utilizando un parámetro por defecto (inicialización) con software de investigación de homología tal como FASTA, BLAST, o Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)]. Adicionalmente, el término “en condiciones severas” significa condiciones en las cuales una reacción se lleva a cabo en un tampón de hibridación que puede ser utilizado comúnmente por las 50 personas expertas en la técnica, a una temperatura de 40ºC a 70ºC, y preferiblemente 60ºC a 65ºC, y el producto de reacción se lava luego con una solución de lavado que tiene una concentración de sal de 15 a 300 mmol/l, y preferiblemente 15 a 60 mmol/l. Dichas temperatura y concentración de sal pueden ajustarse adecuadamente dependiendo de la longitud de una sonda utilizada. Además, las condiciones para lavado del producto obtenido por hibridación pueden ser 0,2 ó 2 x SSC, 0,1% SDS y una temperatura de 20ºC a 68ºC. Es posible determinar 55 condiciones severas (severidad alta) o condiciones moderadas (severidad baja) estableciendo una diferencia con una concentración de sal o una temperatura aplicada durante el lavado. Cuando dicha diferencia de hibridación se

establece con una concentración de sal, puede utilizarse 0,2 x SSC 0,1% SDS como tampón de lavado severo (tampón de lavado de severidad alta), y puede utilizarse 2 x SSC, 0,1% SDS como tampón de lavado moderado (tampón de lavado de severidad baja). Por otra parte, cuando dicha diferencia se establece con cierta temperatura, se aplica una temperatura de 68ºC en el caso de severidad alta, aplicándose una temperatura de 42ºC en el caso de

5 severidad moderada, y aplicándose la temperatura ambiente (20ºC a 25ºC) en el caso de severidad baja. En los tres casos anteriores, la reacción puede llevarse a cabo en 0,2 x SSC, 0,1% SDS.

En general, la pre-hibridación se lleva a cabo en las mismas condiciones que las correspondientes a la hibridación. Sin embargo, la hibridación y el prelavado no se llevan a cabo siempre en las mismas condiciones.

La hibridación puede realizarse de acuerdo con un método conocido. En el caso de utilizarse una genoteca

10 disponible comercialmente, la hibridación puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en las instrucciones incluidas con ella.

En la presente memoria descriptiva, el término “identidad” (al que se hace referencia ocasionalmente como “homología”) con relación a secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos significa el grado de coincidencia entre las secuencias comparadas en términos de residuos de aminoácidos o residuos de nucleótidos

15 que constituyen tales secuencias. En tal caso, la presencia de una holgura y la propiedad de los aminoácidos se toman en consideración (Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726-730 (1983)). Para el cálculo de la homología, pueden utilizarse productos de software de investigación de homología disponibles comercialmente tales como BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183: 63-69 (1990)), o Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)].

20 El valor numérico de dicha “identidad” puede calcularse utilizando un programa de búsqueda de homología conocido por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, dicho valor numérico como identidad puede calcularse utilizando un parámetro por defecto (inicialización) en el algoritmo de homología BLAST ((herramienta de búsqueda de alineación local básica) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

25 En la segunda proteína, una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 puede ser una secuencia de aminoácidos que tenga preferiblemente 95% o más, de modo particularmente preferible 98% o más, y muy preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos arriba mencionada.

En el polinucleótido que codifica la segunda proteína, una secuencia de nucleótidos que tenga 90% o más de

30 identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 puede ser una secuencia de nucleótidos que tenga preferiblemente 95% o más, de modo particularmente preferible 98% o más, y de modo muy preferible 99% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos arriba mencionada.

El anticuerpo para uso de la primera realización de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos que tenga 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,

35 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 puede ser una secuencia de aminoácidos que tenga preferiblemente un 80% o más, más preferiblemente 85% o más, de modo aún más preferible 90% o más, todavía más preferiblemente 95% o más, de modo particularmente preferible 98% o más, y muy preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos arriba mencionada.

En la presente invención, si se da la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,

40 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, puede determinarse fácilmente una secuencia de nucleótidos que codifica la misma. Así, pueden seleccionarse diversas secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con lo anterior, un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12

45 incluye no sólo una parte de la secuencia entera de DNA de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, sino también una secuencia de DNA que codifica los mismos aminoácidos, que tiene un codón que tiene una relación de degeneración con ella como una secuencia de DNA. Existe una secuencia de RNA correspondiente a la secuencia de DNA.

Un ejemplo del polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID

50 NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 es un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

En la presente memoria descriptiva, si una proteína es funcionalmente equivalente o no a la proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 55 o SEQ ID NO: 12 puede determinarse por evaluación de un fenómeno biológico o funciones asociadas con la expresión de la proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12. Por ejemplo, ello puede determinarse dejando que la

proteína en cuestión se exprese por una técnica de recombinación genética y evaluando luego si la proteína mencionada anteriormente funciona o no como receptor de activación de las células dendríticas. La proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 interacciona con las células T y tiene la función de activar las células

5 dendríticas. Así, para la evaluación mencionada anteriormente, pueden utilizarse como índice las funciones siguientes:

-: función de mediación de la adhesión de las células T (Ejemplos 5, 6, 10 y 11);

-: función de activación de las células dendríticas por estímulo de reticulación de anticuerpos (Ejemplo 3);

-: función de la formación de complejo con la cadena FcRγ (Ejemplo 4); o

10 - uso combinado de varias o todas las funciones arriba mencionadas.

[Proteína y polinucleótido ligandos nuevos]

Entre los genes que se expresan específicamente en las células T activadas como ligandos para proteínas TARM, que se identificaron en la presente invención, puede mencionarse un tipo de gen de proteína de membrana como gen derivado de ratón. La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos de una proteína

15 codificada por el gen son como se muestra en SEQ ID NOs: 13 y 14, respectivamente. Además, entre los genes que se expresan específicamente en las células T activadas como ligandos para proteínas TARM, puede mencionarse un tipo de gen de proteína de membrana como un gen derivado de humano. La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen son como se muestra en SEQ ID NOs: 15 y 16, respectivamente.

20 En la proteína ligando, una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 puede ser una secuencia de aminoácidos que tenga preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 85% o más, todavía más preferiblemente 90% o más, más preferiblemente aún 95% o más, de modo particularmente preferible 98% o más, y muy preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de proteína de aminoácidos arriba mencionada.

25 En un polinucleótido que codifica la proteína ligando, una secuencia de nucleótidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 puede ser una secuencia de nucleótidos que tenga preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 85% o más, todavía más preferiblemente 90% o más, más preferiblemente aún 95% o más, de modo particularmente preferible 98% o más, y muy preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de os arriba mencionada.

30 Si se da la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, puede determinarse fácilmente una secuencia de nucleótidos que codifique la misma. De este modo, pueden seleccionarse diversas secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.

De acuerdo con lo anterior, un polinucleótido que codifica una proteína que comprenda la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 incluye no sólo una parte o la totalidad de la secuencia de DNA de SEQ ID NO:

35 13 o SEQ ID NO: 15, sino también una secuencia de DNA que codifique los mismos aminoácidos, que tiene un codón que guarda una relación de degeneración con aquélla como una secuencia de DNA. Una secuencia de RNA corresponde a dicha secuencia de DNA.

Un ejemplo del polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ

40 ID NO: 15.

En la presente memoria descriptiva, si cierta proteína es funcionalmente equivalente o no a la proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 puede determinarse por evaluación de un fenómeno biológico o funciones asociadas con la expresión de la proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16. Por ejemplo, ello puede determinarse dejando que la proteína

45 determinada se exprese por una técnica de recombinación genética y evaluando luego si la proteína arriba mencionada funciona o no como ligando en una célula T para un receptor de activación de las células dendríticas. La proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 se fija a una proteína TARM. Así pues, para la evaluación arriba mencionada, puede utilizarse como índice la función de fijación a una proteína TARM de este tipo (Ejemplo 12).

50 La proteína ligando tiene una región transmembranal simple, y se expresa en la superficie de la célula en una dirección en la cual el lado N-terminal de la misma puede localizarse en el espacio extracelular. De acuerdo con lo anterior, utilizando la proteína arriba mencionada, pueden producirse anticuerpos contra la proteína arriba mencionada.

La proteína puede comprender un polinucleótido constituido por al menos seis residuos de aminoácidos o la 55 totalidad de la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1 a 159 de SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 1 a 158 de SEQ ID NO: 16. La proteína arriba mencionada contiene una porción que corresponde a la región extracelular de la secuencia de aminoácidos de una proteína TARM-L, y por tanto puede utilizarse la misma como un antígeno para la producción de anticuerpos contra la proteína arriba mencionada.

La proteína ligando puede utilizarse para producir anticuerpos contra la proteína ligando arriba mencionada.

5 [Anticuerpos]

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede reconocer específicamente una proteína TARM o una proteína TARM-L. De acuerdo con ello, es preferible que una proteína TARM o una proteína TARM-L utilizada para obtener el anticuerpo de acuerdo con la presente invención tenga la antigenicidad de TARM o TARM-L. Una proteína TARM o proteína TARM-L de este tipo incluye una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de 10 una proteína TARM o una proteína TARM-L en la cual uno o más residuos de aminoácidos están delecionados, insertados, sustituidos, o añadidos. Se ha comprobado que una proteína de este tipo mantiene la misma actividad biológica que la de la proteína original (Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Zoller y Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-13). Se ha publicado un método de producción de una proteína 15 determinada por deleción, inserción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos con respecto a la proteína original, al tiempo que se mantiene la antigenicidad de la proteína original. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína mutante se prepara por mutagénesis orientada, y se deja que se exprese luego una proteína, en caso apropiado (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987-1997), Sección 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al.

20 (1995) Gene 152: 271-5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92; Kramer y Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67; Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6).

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye también anticuerpos específicos para una parte de la proteína TARM o proteína TARM-L.

Es decir, dicha proteína TARM o proteína TARM-L utilizada para obtener el anticuerpo de acuerdo con la presente

25 invención incluye no sólo un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de longitud total de la proteína TARM o la proteína TARM-L, sino también un fragmento de polipéptido que tiene al menos seis residuos de aminoácido (por ejemplo, 6, 8, 10, 12, 15 o más residuos de aminoácido) de la proteína TARM o la proteína TARM-

L. En la presente memoria descriptiva, el tipo de fragmento de polipéptido de la proteína TARM o la proteína TARM-

L no está limitado particularmente, siempre que el mismo posea la antigenicidad de la proteína TARM o la proteína 30 TARM-L.

Un fragmento de polipéptido preferido puede sr un fragmento de polipéptido tal como el terminal amino o el terminal carboxilo de la proteína TARM o la proteína TARM-L. El sitio del determinante antigénico de un polipéptido se estima por un método de análisis de la hidrofobicidad/hidrofilia en la secuencia de aminoácidos de una proteína (Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-22) o un método de análisis de una estructura secundaria (Chou-Fasman

35 (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76). Después de ello, un sitio de determinante antigénico de este tipo puede confirmarse utilizando un programa de computadora (Anal. Biochem. 151: 540-6 (1985)), o por aplicación de medios tales como un método PEPSCAN de síntesis de un péptido corto y confirmación de la antigenicidad del mismo (Publicación de Patente Japonesa Expuesta a Examen Público No. 500684/1985).

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención es preferiblemente un anticuerpo que tenga influencia sobre las

40 funciones de la proteína TARM o la proteína TARM-L. por ejemplo, los significados de la expresión “que tiene cierta influencia sobre las funciones de la proteína TARM” incluyen: activación de las células dendríticas por el estímulo de reticulación de la proteína TARM por el anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención (Ejemplo 3); inhibición de la adhesión de las células T a la proteína TARM por fijación del anticuerpo arriba mencionado a la proteína TARM (Ejemplos 6 y 11); e inhibición de la formación de un complejo entre la proteína

45 TARM y la cadena FcRγ por fijación del anticuerpo arriba mencionado a la proteína TARM (Ejemplo 4). Por ejemplo, los significados de la expresión “que tiene cierta influencia sobre las funciones de la proteína TARM-L” incluyen inhibición de la fijación de la proteína TARM-L a la proteína TARM por fijación del anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención a la proteína TARM-L.

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye: un anticuerpo monoclonal obtenido por utilización de la

50 proteína TARM o la proteína TARM-L como antígeno e inmunización de un mamífero tal como un ratón con el antígeno arriba mencionado; un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado producidos por recombinación genética; y un anticuerpo humano producido utilizando un animal transgénico productor de anticuerpos humanos o análogo. Cuando el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se administra como medicamento a un humano, se utiliza preferiblemente un anticuerpo humano en términos de efectos secundarios.

55 El “anticuerpo humano” significa un anticuerpo en el cual todas las regiones se derivan de humanos. Un anticuerpo de este tipo puede producirse por introducción de un gen de anticuerpo humano en un ratón. Un anticuerpo humano de este tipo puede producirse con referencia a los métodos descritos, por ejemplo, en Nature Genetics, Vol. 7, pp. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, pp. 146-156, 1997; Publicación de Patente Japonesa Expuesta a Examen Público No. 504365/1992; Publicación de Patente Japonesa Expuesta a Examen Público No.

509137/1995; Publicación Internacional WO94/25585; Nature, Vol. 368, pp. 856-859, 1994; y Publicación de Patente Japonesa Expuesta a Examen Público No. 500233/1994. Adicionalmente, un anticuerpo humano de este tipo puede producirse también por un método de presentación de fago. El mismo se puede producir con referencia al método escrito en Marks, J. D. et al.: J. Mol. Biol., vol. 222, 581-597, 1991, por ejemplo.

5 El “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo producido por trasplante (injerto de CDR) sólo de la secuencia génica del sitio de presentación de antígeno (CDR; región determinante de la complementariedad) de un anticuerpo de ratón en un gen de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado de este tipo puede producirse con referencia a elementos descritos en la Publicación de Patente Japonesa Expuesta a Examen Público No. 506458/1992 y la Patente Japonesa Expuesta a Examen Público No. 296890/1987, por ejemplo.

10 El “anticuerpo quimérico” es un anticuerpo producido por ligación de la región variable de un anticuerpo de ratón a la región constante de un anticuerpo humano. Específicamente, se inmuniza un ratón con un antígeno, y se separa por corte del gen del anticuerpo monoclonal de ratón una región variable de anticuerpo (región V) que se fija al antígeno. La región V así obtenida se deja ligar luego a un gen de región constante de anticuerpo (región C) derivada de médula ósea humana, a fin de producir un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico de este tipo puede

15 producirse con referencia al método escrito en la Publicación de Patente Japonesa No. 73280/1991, por ejemplo.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención puede obtenerse utilizando un método bien conocido por las personas expertas en la técnica (v.g. "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).

Como inmunógeno puede utilizarse un fragmento de la proteína TARM o la proteína TARM-L. En caso contrario,

20 puede utilizarse también un antígeno sintético basado en la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. Un anticuerpo de este tipo puede utilizarse en la forma de un complejo con una proteína portadora. Con objeto de preparar un complejo de un antígeno con una proteína portadora pueden utilizarse diversos tipos de agentes de acoplamiento. Pueden utilizarse aldehído glutárico, carbodiimida, un éster activo de maleimida, y análogos. La proteína portadora puede ser un producto utilizado comúnmente tal como seroalbúmina bovina, tiroglobulina o

25 hemocianina, y el acoplamiento se realiza generalmente a una ratio de 1 a 5.

Ejemplos de un animal a inmunizar incluyen un ratón, una rata, un conejo, un cobayo, y un hámster. Un método de inoculación incluye administración subcutánea, administración intramuscular, y administración intraperitoneal. Para la administración, puede mezclarse un antígeno con adyuvante completo de Freund, o adyuvante incompleto de Freund. La administración se realiza generalmente una vez cada dos a cinco semanas.

30 Las células productoras de anticuerpos obtenidas del bazo o de ganglios linfáticos del animal inmunizado se someten a fusión celular con células de mieloma, y se aíslan luego como hibridomas. Como tales células de mieloma, pueden utilizarse células derivadas de un ratón, una rata, un humano o análogos, y preferiblemente se derivan de la misma especie que las células productoras de anticuerpos. Sin embargo, existen también casos en los que dicha fusión celular puede llevarse a cabo incluso entre las células de especies diferentes.

35 La fusión celular puede llevarse a cabo por un método conocido tal como el método descrito en Nature, 256, 495, 1975.

Ejemplos de un promotor de fusión incluyen polietilenglicol y virus Sendai. En general, la fusión celular puede llevarse a cabo dejando que las células productoras de anticuerpos reaccionen con células de mieloma utilizando polietilenglicol (peso molecular medio: 1000 a 4000) que tiene una concentración de aproximadamente 20% a 50% a

40 una temperatura comprendida entre 20ºC y 40ºC, y preferiblemente entre 30ºC y 37ºC, a una ratio del número de células productoras de anticuerpos al número de células de mieloma que es por regla general aproximadamente 1:1 a 10:1, durante aproximadamente 1 a 10 minutos.

Para el cribado de los hibridomas productores de anticuerpos pueden utilizarse diversos tipos de métodos inmunoquímicos. Ejemplos de un método inmunoquímico de este tipo incluyen: un método ELISA que utiliza una

45 microplaca recubierta con la proteína TARM o la proteína TARM-L; un método EIA que utiliza una microplaca recubierta con un anticuerpo anti-inmunoglobulina; un método de inmunotransferencia que implica someter a electroforesis una muestra que contiene la proteína TARM y utilizar luego una membrana de microcelulosa.

Adicionalmente, para cribado de tales hibridomas productores de anticuerpos, puede aplicarse un método de cribado de los hibridomas basado en si el anticuerpo arriba mencionado tiene o no influencia sobre las funciones de la 50 proteína TARM o la proteína TARM-L, en lugar del método inmunoquímico arriba mencionado. Los hibridomas productores de anticuerpos pueden cribarse basándose en la influencia del anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención sobre las funciones de la proteína TARM, por ejemplo, basándose en si las células dendríticas son activadas o no por el estímulo de reticulación de la proteína TARM por el anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención (Ejemplo 3), o si la función de la proteína TARM de 55 mediación de la adhesión de las células T puede ser inhibida o no por fijación del anticuerpo arriba mencionado a la proteína TARM (Ejemplos 6 y 11), o si la formación de un complejo entre la proteína TARM y la cadena FcRγ puede ser inhibida o no por fijación del anticuerpo arriba mencionado a la proteína TARM (Ejemplo 4). Los hibridomas productores de anticuerpos pueden cribarse también basándose en la influencia del anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención sobre las funciones de la proteína TARM-L, por ejemplo, basándose en si la función de la proteína TARM de fijación a la proteína TARM-L puede ser inhibida o no por fijación del anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención a la proteína TARM-L. Por este método de cribado puede seleccionarse un anticuerpo que tiene influencia sobre las funciones de la proteína TARM 5 o la proteína TARM-L, que es una realización preferida del anticuerpo de la presente invención,. Además, este método de cribado puede llevarse a cabo como un método de cribado secundario, que se realiza después del método de cribado inmunoquímico arriba mencionado en el cual se selecciona un hibridoma productor de anticuerpos basándose en si el mismo produce o no un anticuerpo que se fija a la proteína TARM o a la proteína TARM-L. Adicionalmente, la clonación se lleva a cabo en un pocillo de este tipo mediante, por ejemplo, un método 10 de dilución limitante, a fin de obtener clones. La selección y el cultivo de tales hibridomas se llevan a cabo generalmente en un medio para células animales (v.g. RPMI1640) que contiene 10% a 20% de suero de bovino fetal, al cual se añade HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina). Los clones así obtenidos se trasplantan a la cavidad peritoneal de ratones SCID, a los cuales se ha administrado previamente pristano. Diez a catorce días más tarde, se recoge ascitis que contiene una concentración elevada de anticuerpos monoclonales, y puede utilizarse la

15 misma como materia prima en la purificación de anticuerpos. De otro modo, se cultivan los clones arriba mencionados, y el cultivo obtenido puede utilizarse también como materia prima en la purificación de anticuerpos.

Un anticuerpo monoclonal puede purificarse por un método conocido de purificación de inmunoglobulinas. Por ejemplo, dicha purificación de un anticuerpo monoclonal puede realizarse fácilmente por medios tales como un método de fraccionamiento con sulfato de amonio, un método de fraccionamiento con PEG, un método de

20 fraccionamiento con etanol, uso de un cambiador de aniones, o cromatografía de afinidad utilizando una columna de proteína A, una columna de proteína G, y una proteína TARM.

El “fragmento funcional” de la presente invención significa una parte de un anticuerpo (un fragmento parcial), que reconoce específicamente la proteína de la presente invención. Ejemplos específicos de un fragmento funcional de este tipo incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, un fragmento de región variable (Fv), un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo

25 monocatenario (scFv), y un polímero de los mismos.

Ejemplos preferidos del anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención incluyen un anticuerpo contra la nueva proteína de la primera realización de acuerdo con la presente invención, y un fragmento funcional del mismo.

Tales ejemplos preferidos del anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención incluyen

30 también anticuerpos contra la nueva proteína de la segunda realización de acuerdo con la presente invención, y un fragmento funcional de la misma.

Tales ejemplos preferidos del anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención incluyen adicionalmente anticuerpos contra las proteínas siguientes:

(ix’) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

35 (x’) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se han insertado, sustituido o delecionado, o uno o más aminoácidos se han añadido a uno o ambos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

(xi’) una proteína de membrana o secretora que está codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones

40 severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y

(xii’) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

45 Un ejemplo más preferido del anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 que contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de la misma.

Un ejemplo específico es un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma depositado bajo el No. de acceso 50 FERM BP-10376.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un hibridoma (@TARM#6.11) depositado en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Organismo Depositario de Patentes Internacionales (AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japón), bajo el No. de acceso FERM BP-10376 en fecha 15 de julio, 2005.

Otro ejemplo más preferido del anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional del mismo.

5 Un ejemplo preferido del anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 que contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional del mismo.

Otro ejemplo preferido del anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención es un

10 anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 que contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional del mismo.

Un ejemplo más preferido del anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo que reconoce una región de un polipéptido que se expresa en el espacio extracelular de la proteína

15 TARM-L, o un fragmento funcional del mismo. Un ejemplo de un anticuerpo de este tipo es un anticuerpo contra una proteína que comprende un polipéptido constituido por al menos seis residuos de aminoácido o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 159 de SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos de 1 a 158 de SEQ ID NO: 16, o un fragmento funcional del mismo.

[Uso del anticuerpo y composición farmacéutica]

20 Enfermedades Autoinmunes

Dado que las células T, que son linfocitos asociados con respuestas inmunes, actúan sinérgicamente con células dendríticas que tienen una función presentadora de antígeno para tales células T, las células T juegan un papel en diversas respuestas inmunes (Kroczek, RA., et al., (2004) Current Opinion in Immunology 16: 321-327). Como se describe más adelante en los ejemplos, se descubrió que la expresión de una proteína TARM en las células 25 dendríticas se incrementaba por estímulo inflamatorio (Ejemplo 2), y que las células dendríticas se adherían a las células T por la vía de la proteína TARM (Ejemplos 5 y 10). Adicionalmente, se confirmó que las células dendríticas eran activadas por la proteína TARM sometida a estímulos de reticulación, y que se inducía la producción de IL-6 (Ejemplo 3). Se ha publicado que la producción excesiva de IL-6 está asociada con enfermedades autoinmunes (Ishihara, K., et al. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13: 357-368). Además, la adhesión de las células T a

30 las células dendríticas se reprimía notablemente por los anticuerpos contra la proteína TARM (Ejemplos 6 y 11).

Adicionalmente, en los ejemplos que se describen más adelante, se confirmó que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención tenía realmente un efecto terapéutico sobre un modelo de artritis inducida por colágeno (Ejemplo 7). El modelo de artritis inducida por colágeno es un modelo de artritis reumatoide, que es una enfermedad autoinmune.

35 De acuerdo con lo anterior, el anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Un ejemplo de tales enfermedades autoinmunes es la artritis reumatoide.

Análogamente, se considera que la adhesión de las células T a las células dendríticas es reprimida por los anticuerpos contra una proteína TARM-L. De acuerdo con lo anterior, el anticuerpo de la segunda realización de

40 acuerdo con la presente invención es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

La presente invención proporciona el uso del anticuerpo de acuerdo con la presente invención para producir un agente terapéutico para tratamiento de enfermedades autoinmunes.

La presente invención proporciona un método para tratamiento de enfermedades autoinmunes que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de acuerdo con la presente invención a

45 mamíferos con inclusión de un humano.

Agente para Inhibición de la Adhesión de las Células T

Como se describe más adelante en los ejemplos, la adhesión de las células T a las células dendríticas era reprimida significativamente por anticuerpos contra una proteína TARM (Ejemplos 6 y 11). De acuerdo con lo anterior, el anticuerpo de la primera realización de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como agente para la

50 inhibición de la adhesión de las células T.

Análogamente, se considera que la adhesión de las células T a las células dendríticas es reprimida por los anticuerpos contra una proteína TARM-L. De acuerdo con lo anterior, el anticuerpo de la segunda realización de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como agente para inhibición de la adhesión de las células T.

En la presente memoria descriptiva, el término “adhesión de las células T” significa la adhesión de las células T a células dendríticas, es decir, la fijación de una proteína TARM expresada en células dendríticas a una proteína TARM-L expresada en células T. Por inhibición de la fijación de una proteína TARM expresada en células dendríticas a una proteína TARM-L expresada en células T utilizando el agente para inhibición de la adhesión de las

5 células T de acuerdo con la presente invención, puede reprimirse una respuesta inmune generada como resultado de la interacción entre las células dendríticas y las células T, tal como activación, crecimiento y diferenciación de las células dendríticas y las células T, así como la producción de citoquinas/quimioquinas.

Composición Farmacéutica

La ruta de administración del anticuerpo de acuerdo con la presente invención no está limitada particularmente. El 10 anticuerpo arriba mencionado puede administrarse a mamíferos con inclusión de un humano por administración oral

o administración parenteral (v.g. inyección intravenosa, inyección intramuscular, administración subcutánea, administración rectal, administración percutánea, y administración local). Entre ellas, es preferible la administración parenteral, y en particular la inyección intravenosa.

La forma de dosificación para administración oral y administración parenteral, y el método de producción de las

15 mismas son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. La forma de dosificación para administración oral y administración parenteral puede producirse por un proceso convencional, por ejemplo, por mezcla del anticuerpo de acuerdo con la presente invención con, por ejemplo, un portador farmacéuticamente aceptable.

Como un portador farmacéuticamente aceptable de este tipo, se utiliza una sustancia que es empleada comúnmente en el campo de la formulación de fármacos y que no reacciona con el anticuerpo de acuerdo con la presente 20 invención,. Portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, un excipiente, aglomerante, desintegrador, lubricante, agente colorante, y agente saborizante utilizados comúnmente; y, en caso necesario, un estabilizador, un emulsionante, un promotor de absorción, un agente tensioactivo, un ajustador de pH, un antiséptico, un antioxidante, un extendedor, un agente humidificante, un activador de la superficie, un dispersante, un tampón, un conservante, un solubilizador, y un agente balsámico, y puede formularse de acuerdo con un método

25 convencional por mezcladura de los ingredientes utilizados comúnmente como materias primas para preparaciones farmacéuticas.

Ejemplos de una forma de dosificación para administración parenteral incluyen preparaciones inyectables (v.g. un producto de inyección por goteo, un producto de inyección intravenosa, un producto de inyección intramuscular, un producto de inyección subcutánea, y un producto de inyección percutánea), preparaciones externas (v.g. un

30 ungüento, una cataplasma, una loción), un supositorio, un inhalante, gotas oftálmicas, un ungüento oftálmico, gotas nasales, gotas para el oído, y un agente liposómico.

Una preparación inyectable se prepara por ejemplo por disolución del anticuerpo de acuerdo con la presente invención en agua destilada utilizada para inyecciones. En caso necesario pueden añadirse a una preparación inyectable de este tipo un solubilizador, un tampón, un agente de ajuste del pH, un agente de isotonización, un

35 agente balsámico, un conservante, un estabilizador, etc. Adicionalmente, una preparación inyectable de este tipo puede producirse en la forma de un producto liofilizado, que se prepara en el momento de su utilización.

Ejemplos de una forma de dosificación para administración oral incluyen formas de dosificación sólidas y líquidas tales como una tableta, una tableta recubierta, una píldora, una píldora pequeña, un granulado, un polvo, una cápsula, un jarabe, una emulsión, una suspensión, una inyección, o una pastilla.

40 La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede contener adicionalmente otros agentes terapéuticamente eficaces. En caso necesario, pueden añadirse también componentes tales como un promotor del flujo sanguíneo, un germicida, un antiflogístico, un activador celular, vitaminas, aminoácidos, un humidificador, o un fármaco queratolítico. En tales casos, la ratio del ingrediente activo al portador puede modificarse dentro de un intervalo de 1 a 90% en peso.

45 Una dosis del anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser determinada por un médico de clínica basándose en diversos factores tales como la ruta de administración, el tipo de enfermedad, el grado de los síntomas, la edad, el sexo y el peso corporal del paciente, la gravedad de la enfermedad, los hallazgos farmacéuticos tales como la farmacocinética, y características toxicológicas, la presencia o ausencia de uso de un sistema de suministro de fármaco, y la posibilidad de ser administrado como una porción de la combinación con

50 otros agentes, y puede ser generalmente de 1 a 5000 mg/día, preferiblemente 10 a 2000 mg/día, y más preferiblemente 50 a 2000 mg/día, para administración oral, y 1 a 5000 mg/día, preferiblemente 5 a 2000 mg/día, y más preferiblemente 50 a 2000 mg/día, para administración por inyección, en cada caso para un adulto (peso 60 kg), que se administran una o varias veces al día. Cuando se administra a un niño, la dosis puede ser menor que la administrada a un adulto. Un método de administración que se aplica actualmente, puede ser cambiado por decisión

55 de un médico de clínica, y por tanto la dosis aplicada puede desviarse del intervalo arriba mencionado.

[Método de cribado] Método para cribado de una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a una proteína TARM

De acuerdo con el método de cribado de la primera realización de la presente invención, se proporciona un método de cribado para cribado de una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a una proteína TARM.

La proteína TARM se expresa en las células dendríticas, y está asociada con una interacción que está implicada en

5 la respuesta inmune entre células dendríticas y células T. Adicionalmente, como resultado del estímulo de reticulación que se añade a la proteína TARM, puede inducirse la producción de IL-6 que puede causar la enfermedad autoinmune. De acuerdo con lo anterior, el método de cribado de la primera realización de la presente invención puede utilizarse para cribado de una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a la proteína TARM, y puede utilizarse preferiblemente para cribado de una sustancia útil para el tratamiento de la enfermedad

10 autoinmune, y más específicamente la artritis reumatoide.

El método de cribado de la primera realización de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente el paso de (c) comparar la actividad de fijación en presencia de una sustancia de test con la que existe en ausencia de una sustancia de test, después del paso (b).

En el paso (c), cuando la actividad de fijación en presencia de una sustancia de test es menor que la

15 correspondiente en ausencia de una sustancia de test, y preferiblemente cuando la misma es menor que 50%, puede determinarse que la sustancia de test inhibe la fijación de las células T a la proteína de acuerdo con la presente invención.

El término "contacto" en el paso (a) no está limitado particularmente, siempre que se deje que una proteína TARM entre directamente en contacto con las células T. Por ejemplo, el mismo puede llevarse a cabo por un método de

20 adición de las células T marcadas a una placa sobre la cual se ha inmovilizado la proteína TARM, o por un método de adición de la proteína TARM marcada a una placa que contiene células T.

Las células T son preferiblemente células T activadas, y más preferiblemente células Th2 activadas.

En el paso (b), la actividad de fijación puede medirse por un método conocido. Por ejemplo, las células T marcadas se añaden a una placa sobre la cual se ha inmovilizado una proteína TARM, y se cultivan luego las mismas durante

25 cierto periodo de tiempo. Después de ello, las células no adheridas se eliminan por lavado o métodos análogos, y se mide luego el nivel de las células adheridas, midiendo de este modo la actividad de fijación.

Para la marcación arriba mencionada, se puede utilizar por ejemplo un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente (con inclusión de una proteína fluorescente), una sustancia luminiscente, etc.. Ejemplos de un radioisótopo utilizado en esta memoria incluyen [3H], [14C], [125I], [35S]. Ejemplos de una enzima utilizada en esta 30 memoria incluyen β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y luciferasa. Ejemplos de una sustancia fluorescente utilizada en esta memoria incluyen isotiocianato de fluoresceína, BODIPY, y Calceína-AM (Dojindo Laboratories). Asimismo, como proteína fluorescente, pueden utilizarse GFP y análogas. Con relación a tales enzimas y proteínas fluorescentes, el gen de las mismas puede introducirse en una célula y puede expresarse luego en ella. Ejemplos de una sustancia luminiscente utilizada en esta memoria incluyen luciferina y lucigenina. En

35 algunos casos, puede utilizarse un sistema biotina-avidina para permitir que el ligando mencionado anteriormente se fije a una sustancia marcadora.

Además, se añaden células T sin marcar, y las células T adheridas pueden detectarse luego por un anticuerpo que es específico para las células T, tal como un anticuerpo anti-CD3, o por un anticuerpo que es específico para una célula T adyuvante, tal como un anticuerpo anti-CD4.

40 Con relación a la actividad de fijación, las células añadidas se han medido previamente, y la misma puede expresarse en la forma de la ratio de las células adheridas a las células añadidas.

Método para cribado de una sustancia que inhibe la activación de una célula dendrítica

De acuerdo con el método de cribado de la segunda realización de la presente invención, se proporciona un método de cribado para cribado de una sustancia que inhibe la activación de una célula dendrítica.

45 Las células dendríticas pueden ser activadas por una proteína TARM sometida a estímulo de reticulación (Ejemplos 3 y 4). De acuerdo con lo anterior, un sistema de células dendríticas que se ha sometido a estímulo de reticulación con un anticuerpo TARM puede utilizarse para cribado de una sustancia que inhibe la activación de las células dendríticas.

Como se ha expuesto anteriormente, se demostró que la enfermedad autoinmune está causada por activación de

50 las células dendríticas. Así, el método de acuerdo con la presente invención para cribado de una sustancia que inhibe la activación de las células dendríticas puede utilizarse para activado de una sustancia útil para el tratamiento de, preferiblemente, la enfermedad autoinmune, y más preferiblemente la artritis reumatoide.

Cuando se aplica un estímulo de reticulación a una proteína TARM que se expresa en las células dendríticas, las células dendríticas se activan. En tal caso, la proteína TARM forma un complejo con la cadena FcRγ conocida como molécula de transducción de señales, y se induce la producción de IL-6 que causa enfermedades autoinmunes o MCP-1 que actúa como factor quimiotáctico para los monocitos. De acuerdo con lo anterior, en el paso (e) del método de cribado de la segunda realización de acuerdo con la presente invención, el nivel de activación de las células dendríticas puede medirse utilizando como índice la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida por las células

5 dendríticas. De otro modo, el nivel de activación de las células dendríticas puede medirse utilizando como índice el nivel de expresión de la cadena FcRγ en las células dendríticas.

En el método de cribado de la segunda realización de acuerdo con la presente invención, cuando el nivel de activación de las células dendríticas se mide utilizando como índice la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida por las células dendríticas, el método de cribado puede comprender adicionalmente el paso de (f-1) comparar la cantidad de

10 IL-6 y/o MCP-1 producida en presencia de una sustancia de test con la de IL-6 y/o MCP-1 producida en ausencia de una sustancia de test, después del paso (e). En el paso (f-1), cuando la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en presencia de una sustancia de test es menor que la de IL-6 y/o MCP-1 producida en ausencia de una sustancia de test, y preferiblemente cuando aquélla es menor que 50%, puede determinarse que la sustancia de test inhibe la activación de las células dendríticas.

15 En el método de cribado de la segunda realización de acuerdo con la presente invención, cuando el nivel de activación de las células dendríticas se mide utilizando como índice el nivel de expresión de la cadena FcRγ en las células dendríticas, el método de cribado puede comprender adicionalmente el paso de (f-2) comparar el nivel de expresión de la cadena FcRγ en presencia de una sustancia de test con el de la cadena FcRγ en ausencia de una sustancia de test, después del paso (e).

20 En el paso (f-2), cuando el nivel de expresión de la cadena FcRγ en presencia de una sustancia de test es menor que el de la cadena FcRγ en ausencia de una sustancia de test, y preferiblemente cuando aquél es menor que 50%, puede determinarse que la sustancia de test inhibe la activación de las células dendríticas.

En el paso (d), el término "contacto" no está limitado particularmente, siempre que una proteína TARM en las células dendríticas se someta a estímulo de reticulación con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Por

25 ejemplo, el contacto puede llevarse a cabo por cultivo de las células dendríticas en un medio que contiene el anticuerpo de acuerdo con la presente invención.

En el paso (e), la cantidad de una proteína producida o el nivel de expresión puede medirse de acuerdo con un método conocido. Puede utilizarse también un kit disponible comercialmente.

Método para cribado de una sustancia que inhibe la formación de complejo entre una proteína TARM y la cadena 30 FcRγ

De acuerdo con el método de cribado de la tercera realización de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para cribado de una sustancia que inhibe una formación de complejo entre una proteína TARM y la cadena FcRγ.

La proteína TARM se expresa en las células dendríticas y forma un complejo con la cadena FcRγ que se ha hecho

35 bien conocido como molécula de transducción de señales. Además, se ha sugerido que la cadena FcRγ forma un complejo con la proteína TARM, de tal modo que la expresión de aquélla en la superficie celular aumenta. De acuerdo con lo anterior, el método de cribado de acuerdo con la presente invención puede utilizarse para cribado de una sustancia que inhibe la formación de complejo entre la proteína TARM y la cadena FcRγ, y puede utilizarse preferiblemente para cribado con respecto a una sustancia útil para el tratamiento de, preferiblemente,

40 enfermedades autoinmunes, y más preferiblemente la artritis reumatoide.

El método de cribado de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente el paso de (i) comparar el nivel de expresión de la cadena FcRγ en presencia de una sustancia de test con el de la cadena FcRγ en ausencia de una sustancia de test, después del paso (h).

En el paso (i), cuando el nivel de expresión de la cadena FcRγ en presencia de una sustancia de test es menor que

45 el de la cadena FcRγ en ausencia de una sustancia de test, y preferiblemente cuando aquél es menor que 50%, puede determinarse que la sustancia de test inhibe la formación de complejo entre la proteína de acuerdo con la presente invención y la cadena FcRγ.

En el paso (g), el término "contacto" no está limitado particularmente, siempre que las células dendríticas en las cuales se han expresado una proteína TARM y la cadena FcRγ se dejen entrar directamente en contacto con el

50 anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, aquél puede llevarse a cabo por cultivo de las células dendríticas en un medio que contiene el anticuerpo de acuerdo con la presente invención.

En el paso (h), el nivel de expresión puede medirse de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, el nivel de expresión puede medirse utilizando citometría de flujo.

En la presente memoria descriptiva, los ejemplos de la "sustancia de test" incluye un compuesto sintético de peso 55 molecular bajo, una proteína, un péptido sintético, un polipéptido purificado o parcialmente purificado, un anticuerpo, uno sustancia liberadora de bacterias (con inclusión de un metabolito bacteriano), y un ácido nucleico (antisentido, ribozima, RNAi, etc.). Ejemplos preferidos incluyen un compuesto o una sal del mismo, o un solvato del mismo (v.g., un hidrato), pero los ejemplos no se limitan a éstos. La "sustancia de test" puede ser una sustancia nueva o una sustancia conocida.

5 EJEMPLOS

La presente invención se describirá en detalle en los ejemplos que siguen. Sin embargo, los ejemplos descritos a continuación no tienen por objeto limitar el alcance de la presente invención. En los ejemplos, la "proteína TARM" y la "proteína TARM-L" pueden designarse a veces simplemente como "TARM" y "TARM-L", respectivamente. Además, la proteína TARM derivada de ratón y la proteína TARM derivada de humano pueden designarse

10 simplemente a veces como "mTARM" y "hTARM", respetivamente.

[Ejemplo 1] Aislamiento del gen TARM de ratón y análisis de la expresión

(1) Aislamiento del gen mTARM

Células T CD4 extraídas de bazo de ratón se diferenciaron en Th1 o Th2 por cultivo in vitro. Se preparó un fragmento de cDNA para utilización como impulsor o comprobador a partir de Th1 o Th2. Después de ello, se llevó a

15 cabo una búsqueda Blast utilizando la secuencia de fragmentos de cDNA obtenidos durante un paso de conducción de un método de sustracción de alta sensibilidad (N-RDA). Como resultado, se obtuvo un gen que codificaba una proteína de la membrana celular que tenía funciones desconocidas (No. de acceso a GenBank™ NM_177363).

Se diseñaron los cebadores siguientes basándose en la secuencia de GenBank™ (NM_177363) y se analizó la expresión del gen mTARM en diversos órganos de un ratón.

20 mTARM F1: GTGACTTTGCAGTGCCAGAA (SEQ ID NO.: 17)

mTARM R1: TGCACAGGAGTTGAGTGTCC (SEQ ID NO.: 18)

Se sintetizó cDNA monocatenario a partir del RNA total de cada órgano (Promega) utilizando el kit PCR de RNA (TAKARA). Utilizando dicho cDNA monocatenario como molde, se realizó una PCR en tiempo real empleando ABI7700 (Applied Biosystems). La PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la composición

25 siguiente (12,5 μl de QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), 0,25 μl de uracil-DNA-glicosilasa (Invitrogen), 0,125 μl de cebador mTARM F 100 μM, 0,125 μl de mTARM R 100 μM, 2,5 μl de cDNA molde (diluido 10 veces), y 7,25 μl de agua destilada). Para cada PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 10 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción constituido por 94ºC–30 segundos y 60ºC–1 minuto. Como resultado, se encontró que mTARM se expresaba en el riñón.

30 Así, utilizando el RNA total del riñón, se llevaron a cabo 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA-Ends) y 3'-RACE para tratar de determinar la secuencia del gen de longitud total de mTARM.

En primer lugar, se sintetizó cDNA bicatenario a partir del RNA total del riñón de ratón utilizando el kit de síntesis de cDNA (TAKARA), y se purificó luego el cDNA utilizando el kit de purificación PCR Qiaquick (QIAGEN). Subsiguientemente, se añadió a ello un adaptador ad29 (un producto obtenido por reasociación de ad29S

35 (acatcactccgt; SEQ ID NO: 19) y ad29A

(acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgtt-gatacttcagcgtagct; SEQ ID NO: 20)), a fin de producir un molde de RACE.

La primera PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón 10x ExTaq, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,25 μl de ExTaq, 0,5 μl de cebador 100 μM (5'PCR4), 0,5 μl de cebador especifico Gene 100 μM, 1 μl de cDNA al que se había añadido el adaptador ad29 (diluido 25 veces), y 38,75 μl de

40 agua destilada).

Se utilizaron como cebadores las secuencias siguientes:

5’PCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO.: 21)

mTARM_RACE_5’_4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO.: 22), o

mTARM_RACE_3’_4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO.: 23)

45 Dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 30 veces un ciclo de reacción constituido por 94ºC-30 segundos, 65ºC-1 minuto y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 5 minutos.

La segunda PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón 10x ExTaq, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,25 μl de ExTaq, 0,5 μl de cebador 100 μM (5'PCR1), 0,5 μl de cebador

50 especifico Gene 100 μM, 1 μl del producto de la primera PCR (diluido 100 veces), y 38,75 μl de agua destilada).

Se utilizaron como cebadores las secuencias siguientes:

5’PCR1: GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG (SEQ ID NO.: 24)

mTARM_RACE_5’_3: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO.: 25), o mTARM_RACE_3’_3: CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCTTTC (SEQ ID NO.: 26)

5 Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 25 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 5 minutos. El fragmento de cDNA amplificado se clonó en pCR2.1 (Invitrogen), y se determinó la secuencia de nucleótidos del mismo utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100 (Applied Biosystems).

Como resultado, se obtuvieron dos tipos de cDNAs en 5'RACE, y se obtuvieron tres tipos de cDNAs en 3'RACE, 10 esclareciéndose así la presencia de isoformas de remodelación.

Utilizando la información de secuencias de nucleótidos obtenida por RACE, se diseñaron cebadores para amplificar las isoformas de remodelación. Se sintetizó cDNA bicatenario a partir del RNA total de médula ósea de ratón utilizando el kit de síntesis de cDNA (TAKARA), y se purificó luego el cDNA utilizando de kit de purificación PCR Qiaquick (QIAGEN). Se llevó a cabo la PCR utilizando una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl

15 de tampón ExTaq 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,25 μl de ExTaq, 0,5 μl de cebador 5' 100 μM, 0,5 μl de cebador 3' 100 μM, 1 μl de cDNA (diluido 25 veces), y 38,75 μl de agua destilada).

Se utilizaron como cebadores las secuencias siguientes:

mTARM_5’UTR: GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC (SEQ ID NO.: 27)

mTARM_3’UTR-1: GTCCAGATATGTCCAGGCCTCTG (SEQ ID NO.: 28), o

20 mTARM_3’UTR-2: TTCAGTTATTTTACCAGGGTTTA (SEQ ID NO.: 29)

Para la PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 5 minutos. Con dos tipos de cebadores, pudieron confirmarse seis tipos de isoformas de remodelación. Como resultado, se obtuvieron productos de amplificación en cinco tipos de seis combinaciones de isoformas de

25 remodelación supuestas. El fragmento de cDNA amplificado se clonó en pCR2.1 (Invitrogen), y se determinó la secuencia de nucleótidos del mismo utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100.

Como resultado, se descubrió que estaban presentes isoformas de remodelación que codificaban cuatro tipos de genes TARM fijados a la membrana (m1, m2, m3 y m4) y un solo tipo de gen TARM de tipo secretor (s1) (Figura 1).

(2) Análisis de la expresión de genes mTARM

30 Se analizó la expresión de los genes mTARM en tejidos de ratón normales. Como se ha descrito arriba, dado que estaban presentes las isoformas de remodelación, se diseñaron tres tipos de juegos de cebadores. Juego 1 (los cebadores se diseñaron de tal modo que pudieran amplificar específicamente las isoformas m1 y m2.) mTARM_qF2: TCTGTGATAGACAACCATCT (SEQ ID NO.: 30) mTARM_qR2: GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO.: 31)

35 Juego 2 (los cebadores se diseñaron de tal forma que pudieran amplificar específicamente las isoformas m3 y m4.) mTARM_qF4: ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA (SEQ ID NO.: 32) mTARM_qR3: TCATTTTTCTCCTGGGGCAC (SEQ ID NO.: 33) Juego 3 (los cebadores se diseñaron de tal modo que pudieran amplificar específicamente la isoforma s1.) mTARM_qF3: GATCTCTGTGATAGATGCAAG (SEQ ID NO.: 34)

40 mTARM_qR2: GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO.: 35) Utilizando el kit PCR de RNA (TAKARA), se sintetizó cDNA monocatenario a partir del RNA total preparado de cada órgano de ratón utilizando el kit RNeasy mini (QIAGEN) o a partir del RNA total adquirido de cada órgano (Promega). Utilizando como molde el cDNA monocatenario así sintetizado, se llevó a cabo una PCR en tiempo real utilizando ABI7700. La PCR se llevó a cabo utilizando un solución de reacción con la composición siguiente (12,5 μl 45 de QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), 0,25 μl de uracil-DNA-glicosilasa (Invitrogen), 0,125 μl de cebador F 100 μM, 0,125 μl de cebador R 100 μM, 2,5 μl de cDNA molde (diluido 10 veces), y 7,25 μl de agua destilada).

Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 10 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos y 60ºC-1 minuto.

Como resultado, se encontró que mTARM se expresaba fuertemente en la médula ósea (Figura 2).

Subsiguientemente, se analizó la expresión de mTARM en diversos tipos de células.

5 Utilizando el kit RNeasy mini (QIAGEN), se preparó RNA total a partir de cada una de las células separadas y purificadas de bazo de ratón, células cultivadas in vitro, y diversos tipos de células. Después de ello, se sintetizó cDNA monocatenario a partir del RNA total utilizando el kit PCR de RNA (TAKARA). Utilizando el cDNA monocatenario como molde, se llevó a cabo una PCR en tiempo real utilizando ABI7700 de la misma manera que para el análisis de expresión en tejidos normales de ratón.

10 Como resultado, se encontró que mTARM se expresaba fuertemente en células dendríticas derivadas de médula ósea (Figura 3).

[Ejemplo 2] Preparación del anticuerpo contra TARM de ratón y análisis de la expresión

(1) Preparación de células que expresaban mTARM

Se preparó un vector de expresión del gen mTARM como sigue.

15 Se diseñaron cebadores basados en la secuencia de nucleótidos de la isoforma m1.

mTARM F2: cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT (SEQ ID NO.: 36)

mTARM R2: gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG (SEQ ID NO.: 37)

Utilizando el kit PCR de RNA (TAKARA), se sintetizó cDNA monocatenario a partir del RNA total de la médula ósea. El cDNA monocatenario así sintetizado se utilizó como molde. La PCR se llevó a cabo utilizando una solución de 20 reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,5 μl de polimerasa Pyrobest (TAKARA), 0,5 μl de cada uno de los cebadores 100 μM, 1 μl de cDNA, 2,5 μl de DMSO, y 36 μl de agua destilada). Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 2 minutos. El cDNA amplificado se clonó en pBlueScriptII SK(+) (Stratagene), y se confirmó luego la

25 secuencia de nucleótidos del mismo utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100. El fragmento de cDNA obtenido se insertó en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27):3050-3058), a fin de preparar un vector de expresión del gen mTARM.

Se preparó un retrovirus recombinante como sigue.

Se suspendieron 3x106 células 293/EBNA-1 (Invitrogen) en un medio (D-MEM/10% FBS), se pusieron en una

30 cápsula de 10cm, y se cultivaron luego en una incubadora de CO2 durante 24 horas. Al día siguiente, se cambió el medio con medio nuevo, y se añadió luego al mismo la solución de transfección preparada como se describe más adelante, a fin de realizar la transfección. La solución de transfección se preparó por adición de 600 μl de OPTI-MEM (GIBCO BRL) y 24 μl de TransIT LT1 (TaKaRa) en un tubo de 5 ml para mezclarlas, incubando a continuación la mixtura a la temperatura ambiente durante 5 minutos, y añadiendo finalmente 9 μg de un vector de expresión y 9 μg

35 de pCL-Eco (Imgenex) utilizado como vector de empaquetamiento a la mixtura de reacción, seguido por incubación de la mixtura a la temperatura ambiente durante 5 minutos. 48 horas más tarde, se recuperó el sobrenadante de cultivo, y se realizó luego una filtración con un filtro de 0,45 μm, a fin de obtener una solución de virus recombinante.

Se infectaron células B300.19 (EMBO J. (1984) 3:1209-1219) con este virus recombinante como se describe más adelante, a fin de preparar células que expresaban mTARM. Se añadieron las 1x106 células B300.19 a un tubo de 40 15 ml, y se centrifugaron luego las mismas a 1200 rpm a 25ºC durante 5 minutos. Después de ello, se desechó el sobrenadante de cultivo por aspiración. Se añadió a las células una solución obtenida por adición de la mixtura de 2 μl de Polibrene (10 mg/ml) y 2 μl de 2-mercaptoetanol 55 μM a 2 ml de la solución de virus recombinante. La mixtura obtenida se centrifugó luego a 2500 rpm a 30ºC durante 2 horas, a fin de que las células se infectaran con el virus recombinante. Una vez terminada la infección, se desechó la solución de virus recombinante, y se añadió a la misma

45 un medio (RPMI-1640/10%FBS/2-mercaptoetanol 55μM), seguido por cultivo. Las células EGFP-positivas se separaron por clasificación celular, a fin de obtener células que expresaban mTARM.

(2) Preparación de la región extracelular de mTARM fusionada a la proteína quimérica para SEAP o Fc.

En primer lugar, se preparó como sigue un vector pcDNA 3.1 (+)SEAP(His)10-Neo.

El sitio endógeno SalI de un vector pcDNA 3.1(+)-Neo (Invitrogen) se digirió con SalI, y seguidamente se hizo romo y

50 se religó, a fin de delecionarlo. El fragmento de cDNA de SEAP(His)10 se amplificó por PCR utilizando pDREF-SEAP His6-Hyg (J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521) como molde y utilizando también un cebador 5' adicionado de HindIII y un cebador 3' adicionado de XhoI. El fragmento de cDNA obtenido se digirió con HindIII y HhoI, y se insertó luego en el vector pcDNA 3.1(+)-Neo en el cual se había delecionado el sitio SalI.

Subsiguientemente, se amplificó la región extracelular de mTARM por PCR utilizando cDNA de longitud total de mTARM como molde y utilizando también un cebador 5' adicionado de SalI (mTARM_F2: SEQ ID NO: 36)) y un 5 cebador 3' adicionado de NotI (mTARM_R3: cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat (SEQ ID NO: 38)).

La PCR se llevó a cabo en una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,5 μl de polimerasa Pyrobest (TAKARA), 0,5 μl de cada uno de los cebadores 100 μM, 1 μl de cDNA, 2,5 μl de DMSO, y 36 μl de agua destilada). Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente,

10 se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 2 minutos. El cDNA amplificado se clonó en pBlueScriptII. SK(+) (Stratagene), y se determinó luego la secuencia de nucleótidos del mismo utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100. El fragmento de cDNA obtenido se digirió con SalI y NotI, y se insertó luego en el vector de expresión arriba mencionado, vector pcDNA 3.1(+)-SEAP(His)10-Neo, a fin de preparar un vector de expresión mTARM-AP.

De este modo, la región extracelular de mTARM se fusiona a través de un enlazador de tres aminoácidos (Ala-Ala

15 Ala) a la fosfatasa alcalina placentaria humana de tipo secretor que tiene un identificador de diez histidinas (His)10 en el terminal C de la misma que se expresa como una proteína quimérica secretora (a la que se hace referencia en lo sucesivo como una proteína quimérica AP). El vector de expresión de la proteína quimérica AP obtenido se introdujo en células 293/EBNA-1 utilizando TransIT LT1 (TAKARA), y las mismas se cultivaron luego durante 4 ó 5 días. Después de ello, se recuperó por centrifugación el sobrenadante de cultivo, y la proteína quimérica AP secretada en

20 el sobrenadante se filtró luego con un filtro de 0,22 μm. Después de ello, se añadieron a lo anterior Hepes (pH 7,4) y azida de sodio a concentraciones finales de 20 mM y 0,02%, respectivamente, y el producto obtenido se guardó a 4ºC. La concentración de la proteína quimérica AP se calculó por medida de la actividad de fosfatasa alcalina utilizando el ensayo del gen informador quimioluminiscente Aurora AP (ICN).

(3) Preparación de anticuerpo monoclonal contra mTARM

25 Para uso como antígeno en inmunización, se purificó primeramente la proteína quimérica mTARM-AP.

Dicha purificación se llevó a cabo utilizando la identificador histidina existente en el terminal C de la proteína quimérica AP y utilizando el kit HisTrap (Amersham Biosciences). Se añadió un sobrenadante de cultivo que contenía la proteína quimérica mTARM-AP a una columna HP formadora de quelatos HiTrap de 1 ml (Amersham Biosciences), seguido por lavado con una solución de imidazol 10 mM. Después de ello, la proteína quimérica

30 mTARM-AP se eluyó de la columna utilizando una solución de imidazol 500 mM. La concentración de la proteína quimérica mTARM-AP se calculó por medida de la actividad enzimática utilizando el ensayo del gen informador quimioluminiscente Aurora AP (ICN) y por cuantificación de la proteína utilizando el kit Protein Assay II (BIO-RAD).

La proteína quimérica mTARM-AP obtenida se mezcló con TiterMax, y se inmunizaron luego con ella ratas WKY (Japan SLC, Inc.). Se aislaron linfocitos de las ratas así inmunizadas. Los linfocitos se mezclaron con células de 35 mieloma P3 (ATCC), de tal modo que la ratio de las células de mieloma P3 a los linfocitos fuese 1:5. Después de ello, se realizó una fusión celular utilizando una solución en PEG1500 (Boehringer). Se seleccionaron hibridomas en un medio HAT (Invitrogen), y un sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos se sometió a cribado por ELISA sándwich utilizando una proteína quimérica mTARM-Fc. Se llevó a cabo la clonación, y se obtuvieron tres tipos de clones (#6, #21, y #37) de los pocillos positivos. Las células B300.19, en las cuales se había introducido

40 mTARM-IRES-EGFP, se dejaron reaccionar con los anticuerpos anti-mTARM, seguido por análisis FACS. Como resultado, los anticuerpos generados reaccionaban sólo con las células B300.19 en las cuales se expresaba EGFP (Figura 4B), confirmándose así la especificidad de los anticuerpos anti-mTARM.

Hibridomas que producían los anticuerpos monoclonales anti-mTARM #6, #21, y #37 obtenidos se inocularon en la cavidad peritoneal de ratones atímicos, y se obtuvo luego ascitis. Después de ello, se purificaron los anticuerpos

45 utilizando una columna de Proteína G. El hibridoma que producía el anticuerpo monoclonal anti-MTARM #6 se depositó en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Organismo Depositario de Patentes Internacionales, bajo el No. de acceso FERM BP-10376.

(4) Expresión de la proteína TARM en células dendríticas derivadas de médula ósea cultivadas

Utilizando el anticuerpo monoclonal (mAb) obtenido, se analizó la expresión de una proteína TARM en las 50 superficies celulares de las células dendríticas derivadas de médula ósea cultivadas.

Dichas células dendríticas derivadas de médula ósea cultivadas se prepararon por el método siguiente. Las células de médula ósea de ratones macho C57BL/6 (Japan SLC, Inc.) se suspendieron en un medio (RPMI1640/10% FBS/piruvato de sodio 1 mM/2-mercaptoetanol 55 μM) que contenía GM-CSF de ratón (20 ng/ml) (R&D Systems) a una concentración de 2 x 106 células/10 ml. Las células se pusieron en cápsulas de 10 cm sin recubrimiento, y se 55 cultivaron luego. Tres días más tarde, se añadieron 10 ml de medio que contenía GM-CSF de ratón (20 ng/ml), y se continuó ulteriormente el cultivo. Tres días más tarde, se recuperaron 10 ml de la solución de cultivo y se centrifugaron luego. Después de ello, los agregados de células se suspendieron en 10 ml de medio nuevo que

contenía GM-CSF de ratón (20 ng/ml), y la suspensión obtenida se devolvió luego a las cápsulas de 10 cm originales sin recubrimiento, seguido por cultivo durante 2 días. Las células dendríticas inmaduras así obtenidas se suspendieron en un medio que contenía LPS (100 ng/ml) (Sigma) a una concentración de 1 x 107 células/10 ml. Las células se pusieron en cápsulas de 10 cm, y se cultivaron luego durante un día, a fin de obtener células dendríticas

5 maduras.

Las células dendríticas inmaduras derivadas de la médula ósea se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1% FBS/EDTA 1 mM) que contenía 5% de suero de ratón, y se dejaron reaccionar luego con anticuerpo #6 o anticuerpo #21 (10 μg/ml). Después de ello, las células se incubaron con anticuerpo secundario de burro anti-IgG de rata marcado con PE (Jackson), seguido por medición con FACSCalibur (Becton Dickinson). Como resultado, tanto el

10 anticuerpo #6 como el anticuerpo #21 exhibían reacciones positivas que eran más acusadas que la obtenida con IgG de rata utilizada como control negativo.

Así pues, con objeto de analizar en detalle las células que expresaban mTARM, el anticuerpo #6 se marcó fluorescentemente con el kit de marcación del anticuerpo monoclonal Alexa 647 (Molecular Probe). Subsiguientemente, las células dendríticas inmaduras o células dendríticas maduras obtenidas por estímulo con LPS 15 se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1% FBS/EDTA 1 mM) que contenía 5% de suero de ratón y 5% de suero de rata. Se añadió solución de bloqueo FcR (BD Pharmingen) a la suspensión y se incubó en hielo durante 10 minutos. Después de ello, la mixtura de reacción se dejó reaccionar en hielo durante 30 minutos con un anticuerpo anti-mTARM marcado fluorescentemente, un anticuerpo marcador de células dendríticas anti-CD11c, y un anticuerpo marcador de activación anti-CD40, y se midió luego el nivel de expresión de la proteína mTARM

20 utilizando FACSCalibur.

Como resultado, se descubrió que la proteína mTARM se expresaba tanto en las células dendríticas inmaduras como en las maduras, que la expresión de la proteína mTARM se incrementaba en las células dendríticas maduras de la médula ósea más bien que en las células dendríticas inmaduras, y que la proteína mTARM se expresaba fuertemente en células en las cuales se expresaba el marcador de activación CD40 (Figura 5).

25 (5) Expresión de la proteína TARM en ratones normales.

Dado que se confirmó la expresión de mTARM en las células dendríticas derivadas de la médula ósea, se analizó luego la expresión de una proteína mTARM en los tejidos inmunes de ratones normales.

Se prepararon células a partir de médula ósea, sangre periférica, bazo, ganglio linfático mesentérico y parche de Peyer de ratones macho C57BL/6. Las células así preparadas se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1%

30 FBS/EDTA 1 mM) que contenía 5% de suero de ratón y 5% de suero de rata. Se añadieron solución de bloqueo de FcR a la suspensión y se incubó en hielo durante 10 minutos. Después de ello, la mixtura de reacción se dejó reaccionar en hielo durante 30 minutos con un anticuerpo anti-mTARM marcado fluorescentemente y varios tipos de anticuerpos marcadores de linaje celular marcados fluorescentemente, y se midió luego el nivel de expresión de la proteína mTARM utilizando FACSCalibur.

35 Como resultado, en los tejidos inmunes de ratones normales, no se observó la expresión de la proteína mTARM en la totalidad de las células T CD3+, células DX5+ NK, células mieloides CD11b+ y células dendríticas CD11c+ en el bazo (SP), y células B B220+, monocitos/macrófagos F4/80+, neutrófilos SSC high/Gr1+ y eosinófilos SSC high/F4/80+ en sangre periférica (PBL) (Figura 6).

Por ello, se analizó la expresión de la proteína mTARM en tejidos periféricos de ratón normal utilizando células 40 preparadas a partir de la cavidad peritoneal de los mismos.

Como resultado, no se observó la expresión de la proteína mTARM en células T CD3+, células DX5+ NK, células dendríticas CD11c+, células B B220+, monocitos/macrófagos F4/80+ y neutrófilos SSC high/Gr1+ procedentes de la cavidad peritoneal. Sin embargo, se observó dicha expresión en una parte de las células mieloides CD11b+. Por ello, se realizó un análisis ulterior. Como resultado, se descubrió que la proteína mTARM se expresaba en las

45 células cebadas c-kit+ (Figura 7).

(6) Inducción de la expresión de la proteína TARM en células dendríticas por estímulo inflamatorio con LPS

La proteína mTARM se expresaba en las células dendríticas cultivadas, pero dicha expresión de la proteína mTARM no se observaba en las células dendríticas preparadas a partir de tejidos linfoides y periféricos de ratón. Por ello, se consideró que la expresión de la proteína mTARM era inducida por estímulo inflamatorio in vivo. Por tanto, se

50 administraron intraperitonealmente 100 μg de LPS a ratones macho C57BL/6. 14 a 18 horas más tarde, se recuperaron las células del ganglio linfático mesentérico, y se analizó luego la expresión de la proteína mTARM.

Como resultado, se observó la expresión de la proteína mTARM en células dendríticas mieloides CD11c+/CD11b+ que habían sido desplazadas al ganglio linfático mesentérico por el estímulo inflamatorio con LPS (Figura 8). De acuerdo con ello, se descubrió que la proteína mTARM no se expresaba en la superficie celular de las células 55 dendríticas in vivo en condiciones normales, pero que se expresaba selectivamente en células dendríticas, y en

particular, en células dendríticas mieloides durante una inflamación. Por ello, se sugirió que la proteína mTARM funcionaba en las células dendríticas durante la inflamación.

[Ejemplo 3] Activación de células dendríticas cultivadas derivadas de médula ósea por el anticuerpo anti-TARM

La mTARM se expresaba selectivamente en células dendríticas. Por ello, se analizó la activación de dichas células 5 dendríticas por el estímulo de reticulación de mTARM.

Las células dendríticas inmaduras o células dendríticas maduras derivadas de la médula ósea se suspendieron a una concentración de 1 x 108 células en 350 μl de un tampón MACS (PBS/1% FBS/EDTA 2 mM). Se añadieron a la suspensión 50 μl de solución de bloqueo FcR (Miltenyi) y se incubaron a 4ºC durante 10 minutos. Se añadieron después 100 μl de microperlas CD11c (Miltenyi) a la mixtura de reacción y se incubaron a 4ºC durante 30 minutos. 10 Se separaron luego las células CD11c+ y se purificaron utilizando Auto MACS (Miltenyi). Un anticuerpo F(ab)'2 anti-IgG de rata (10 μg/ml) (Jackson) se inmovilizó en una placa de 96 pocillos a 37ºC durante 2 horas, y la placa se lavó luego con PBS. Después de ello, el anticuerpo anti-mTARM #6, #21, o IgG de rata (10 μg/ml) utilizado como control negativo se inmovilizó en la placa a 37ºC durante 1 hora. Se lavó luego la placa con PBS, y las células dendríticas CD11c+ purificadas se cultivaron en un medio, o en un medio que contenía un anticuerpo agonista anti-CD40 (BD

15 Pharmingen) a una concentración final de 2 μg/ml. 24 ó 48 horas más tarde, se recuperó el sobrenadante de cultivo, y se detectaron luego las citoquinas utilizando el kit DuoSet ELISA Development (R&D).

Como resultado, se descubrió que el anticuerpo anti-mTARM inducía la producción de IL-6 a partir de células dendríticas maduras derivadas de médula ósea a un nivel similar al del anticuerpo anti-CD40, y tenía un efecto adictivo con el anticuerpo anti-CD40 (Figura 9A). Análogamente, el anticuerpo arriba mencionado podía inducir 20 también la producción de IL-6 a partir de células dendríticas inmaduras. Además, el anticuerpo anti-mTARM inducía la producción de MCP-1 a partir de células dendríticas de médula ósea inmaduras, pero el anticuerpo anti-CD40 no inducía dicha producción de MCP-1 (Figura 9B). La inducción de la producción de MCP-1 por el anticuerpo antimTARM no se observaba en las células dendríticas maduras de la médula ósea. Ulteriormente, se analizó también la inducción de la producción de IL-12, TNFα, IL-1β, IL-10, y KC, pero el anticuerpo anti-mTARM carecía de efectos

25 significativos tanto sobre las células dendríticas inmaduras como sobre las células dendríticas maduras.

Por los resultados anteriores, se confirmó que mTARM está asociado en las células dendríticas con la producción de citoquinas y quimioquinas específicas (v.g. IL-6 y MCP-1).

[Ejemplo 4] Formación de complejos entre TARM y la cadena FcRγ

Se descubrió que mTARM funcionaba como un receptor activador de las células dendríticas. A continuación, se

30 examinó una molécula transductora de señales. La mTARM tiene una región transmembranal similar a la de Oscar, que está implicada en la diferenciación de los osteoclastos. Se ha llegado a conocer también que Oscar forma un complejo con la cadena FcRγ, una molécula de transducción de señales bien conocida como componente del receptor IgE. Se ha considerado que la interacción entre un aminoácido básico en la región transmembranal de Oscar y un aminoácido de carácter ácido de la cadena FcRγ está implicado en la asociación arriba mencionada. La

35 mTARM tiene también un aminoácido básico en su región transmembranal. Por otra parte, DAP10 y DAP12 son conocidos como moléculas transductoras de señales de activación que tienen un aminoácido de carácter ácido en su región transmembranal, como en el caso de la cadena FcRγ. Por ello, se analizó la proximidad de una formación de complejos entre la cadena FcRγ, DAP10 o DAP12, y la mTARM.

Cada uno de los vectores de expresión de la cadena FcRγ, DAP10 y DAP12 se produjo por inserción de un

40 fragmento de cDNA amplificado utilizando los cebadores siguientes que se diseñaron basándose en las secuencias de nucleótidos que se muestran en NM_010185, AF072846 y NM_011662 de GenBank™ en un vector de expresión pMXII IRES-Puro diseñado de tal modo que una secuencia de identificación Flag unida al terminal N puede expresarse sobre una superficie celular.

FcRγ F: cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT (SEQ ID NO.: 39)

45 FcRγ R: gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT (SEQ ID NO.: 40)

DAP10 F: cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC (SEQ ID NO.: 41)

DAP10 R: gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT (SEQ ID NO.: 42)

DAP12 F: cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT (SEQ ID NO.: 43)

DAP12 R: gcgggcggccgcTCATCTGTAATATTGCCTCTGTGT (SEQ ID NO.: 44)

50 Después de ello, se preparó un retrovirus recombinante por un método similar al aplicado para preparar las células que expresaban mTARM, y se infectaron luego con el retrovirus recombinante células B300.19 que expresaban mTARM. Después de ello, las células se cultivaron en presencia de puromicina, y se seleccionaron luego las células infectadas. Los transfectantes de B300.19 obtenidos se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1% FBS/EDTA 1 mM) y se dejaron reaccionar con el anticuerpo #6 y un anticuerpo anti-Flag de ratón (Sigma) a una concentración final de 10 μg/ml. Después de ello, se dejó reaccionar con un anticuerpo secundario de burro anti-IgG de rata marcado con PE (Jackson) y un anticuerpo secundario de burro anti-IgG de ratón marcado con Cy5 (Jackson), seguido por la medida del nivel de expresión utilizando FACSCalibur (Becton Dickinson).

Como resultado, se descubrió que cuando la mTARM y la cadena FcRγ se expresaban simultáneamente, el nivel de

5 expresión de la cadena FcRγ en la superficie celular aumentaba, a medida que aumentaba el nivel de expresión de la mTARM en la superficie celular. Los niveles de expresión de DAP10 y DAP12 en la superficie celular no dependían del nivel de expresión de la mTARM. De acuerdo con ello, se sugirió que el nivel de expresión de la cadena FcRγ en la superficie celular se incrementaba por su formación de un complejo con la mTARM (Figura 10).

Se analizaron después bioquímicamente las proteínas que se fijaban a mTARM.

10 Se solubilizaron transfectantes B300.19 en un tampón de lisis celular que contenía 1% de digitonina (1% digitonina/Tris/HCl 50 mM (pH 7,5)/NaCl 150 mM/NaF 5 mM/ortovanadato 1 mM/Complete™ (Roche)). La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando un anticuerpo anti-Flag, y se realizó luego análisis por inmunotransferencia utilizando el anticuerpo #6 anti-mTARM.

Como resultado, se encontró que la mTARM se inmunoprecipitaba junto con la cadena FcRγ, pero DAP10 o DAP12

15 no se inmunoprecipitaban junto con la mTARM (Figura 11A). La inmunoprecipitación de la cadena FcRγ, DAP10 y DAP12 por el anticuerpo anti-Flag se confirmó por análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-Flag. Adicionalmente, se confirmó la expresión de mTARM, una cadena FcRγ identificada con Flag, DAP10 y DAP12 en los transfectantes B300.19 por análisis de inmunotransferencia de lisados celulares utilizando el anticuerpo #6 antimTARM o el anticuerpo anti-Flag. En conformidad con ello, se descubrió que la cadena FcRγ formaba un complejo

20 con la mTARM en los transfectantes B300.19.

Además, células dendríticas maduras derivadas de médula ósea se solubilizaron en un tampón de lisis celular que contenía 1% de digitonina. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando IgG de rata como control negativo, anticuerpo #21 anti-mTARM, un anticuerpo anti-CD54 y un anticuerpo anti-cadena FcRγ, y se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-cadena FcRγ.

25 Como resultado, se encontró que la cadena FcRγ se inmunoprecipitaba junto con la mTARM, y que otra proteína de la membrana celular CD54 y la cadena FcRγ no se co-inmunoprecipitaban (Figura 11B). Conforme a ello, se descubrió que la cadena FcRγ y la mTARM formaban un complejo en células dendríticas maduras.

A partir de estos resultados, se sugirió que la activación de las células dendríticas por el estímulo de reticulación de mTARM está mediada por transducción de señales por la cadena FcRγ.

30 [Ejemplo 5] Adhesión de linfocitos activados a TARM inmovilizada

(1) Expresión de moléculas fijadoras de mTARM en las células T activadas

Se ha llegado a saber que las células dendríticas actúan como células presentadoras de antígeno e interaccionan con las células T. Por ello, es tentador especular que las moléculas que se fijan a mTARM se expresan en las células T y que la activación de las células dendríticas está regulada por tales moléculas. Por esta razón, se analizó

35 la presencia o ausencia de las moléculas fijadoras de mTARM en las células T.

Se suspendieron 4x107 células esplénicas de ratones macho C57BL/6 en 70 μl de un tampón MACS (PBS/1% FBS/EDTA 2 mM), y se añadieron a la suspensión 10 μl de solución de bloqueo de FcR (Miltenyi). La mixtura se incubó luego a 4ºC durante 10 minutos. Se añadieron ulteriormente 100 μl de microperlas CD4 (Miltenyi) a la mixtura de reacción y se incubaron a 4ºC durante 15 minutos. Después de ello, se utilizó Auto MACS para obtener células T 40 CD4+ en reposo. Las células CD4+, que se habían purificado con MACS, se suspendieron en un medio (RPMI 1640/10% FBS/Piruvato de sodio 1 mM/2-mercaptoetanol 55 μM) a una concentración de 1x106 células/ml. Después de ello, se añadió la suspensión a una placa, en la cual se había inmovilizado un anticuerpo anti-CD3 (eBiosciencie) con una solución de 1 μg/ml a 37ºC durante 2 horas, y se estimuló en presencia de 2 μg/ml de un anticuerpo anti-CD28 (Pharmingen). Cuando las células T CD4+ se diferenciaron en Th1, dicho estímulo del anticuerpo anti-CD3 se 45 llevó a cabo en presencia de IL-12 de ratón (10 ng/ml (Peprotech) y un anticuerpo anti-IL-4 de ratón (10 μg/ml) (MP4-25D2; Pharmingen). Cuando las células T CD4+ se diferenciaron en Th2, dicho estímulo del anticuerpo anti-CD3 se llevó a cabo en presencia de IL-4 de ratón (15 ng/ml) (Genzyme) y un anticuerpo anti-IL-12 de ratón (15 μg/ml) (24910.1; Pharmingen). Dos días después del estímulo, en el caso de Th1, se añadieron IL-2 de ratón (20 ng/ml) (Genzyme) e IL-12 de ratón (10 ng/ml), seguido por cultivo. En el caso de Th2, se añadieron IL-2 de ratón (20

50 ng/ml) e IL-4 de ratón (15 ng/ml), seguido por cultivo. La diferenciación en Th1 y Th2 se confirmó por producción de IFN-γ e IL-4, respectivamente.

Células T CD4+ en reposo inmediatamente después de la purificación con MACS y células T CD4+ activadas 2 y 8 días después del estímulo con CD3 se utilizaron para analizar la actividad de fijación de una proteína quimérica mTARM-AP en la superficie de la célula. Estas células se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1% FBS) y se 55 dejaron reaccionar en hielo 30 minutos con la proteína quimérica mTARM-AP o la proteína AP utilizada como control negativo a una concentración final de 30 μg/ml. Después de ello, se añadió un anticuerpo anti-PLAP de conejo

(diluido 6000 veces) (COSMO BIO Co. Ltd.), y se dejó reaccionar luego con ello en hielo durante 30 minutos. Por último, se añadió un anticuerpo de burro anti-IgG de conejo (H+L) marcado con PE (diluido 50 veces) (Jackson), y se dejó reaccionar luego con ello en hielo durante 30 minutos. La actividad de fijación de la proteína quimérica mTARM-AP se midió utilizando FACSCalibur.

5 Como resultado, se descubrió que las moléculas de fijación de mTARM no se expresaban en una célula T CD4+ en reposo, pero que dicha expresión se inducía en las células T CD4+ activadas (Figura 12). Las moléculas de fijación de mTARM se habían expresado ya dos días después del estímulo, y la expresión de las mismas se mantenía también ocho días después del estímulo. Tales moléculas de fijación de mTARM se expresaban tanto en condiciones de diferenciación de Th1 como de Th2. Ocho días más tarde, la expresión de la molécula de fijación de

10 mTARM en las células Th2 tendía a ser más fuerte que la correspondiente a las células Th1 (Figura 12).

(2) Adhesión de las células T activadas a la proteína recombinante mTARM

A continuación, se analizó la posibilidad de la función de la mTARM como molécula de adhesión a las células T activadas.

En primer lugar se añadieron 50 μl de anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (10 μg/ml) (Seradyn) a cada pocillo de una

15 placa ELISA de 96 pocillos (Nunc) y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos para inmovilización. Después de lavado con PBS, se bloqueó un sitio de fijación inespecífica con Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd.). Se añadió una proteína quimérica AP (10 nM) a cada pocillo y se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos para inmovilización. 6 a 9 días después del estímulo, las células T activadas se suspendieron en un tampón de adhesión celular (RPMI1640/0,5% BSA/HEPES 20 mM (pH 7,4)), seguido por marcación fluorescente con Calcein-AM

20 (Dojindo Laboratories). Después de ello, se añadieron a cada pocillo las 1 x 105 células y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Las células no adheridas se eliminaron por lavado, y se añadió luego a lo anterior un tampón de lisis celular (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)/1% Triton X-100). Después de ello, se realizó la medición a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de detección de 535 nm utilizando Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer), y se cuantificaron luego las células adheridas. Con relación al nivel de

25 adhesión celular, la ratio de las células adheridas a las células añadidas se expresó como porcentaje.

Como resultado, se descubrió que la mTARM funcionaba como una molécula de adhesión a las células T activadas (Figura 13). Tanto las células Th1 como las Th2 exhibían actividad de adhesión a la mTARM. La actividad de adhesión de las células Th2 a la mTARM tendía a ser mayor que la de las células Th1 a la mTARM.

[Ejemplo 6] Actividad inhibidora de la adhesión celular del anticuerpo anti-TARM

30 Se analizó el efecto de los anticuerpos anti-TARM sobre la adhesión celular de las células Th2 a la mTARM.

Se añadieron 10 μg/ml de anticuerpo anti-mTARM a células Th2 y se pretrataron a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de ello, las células resultantes se añadieron a una placa sobre la cual se había inmovilizado una proteína quimérica mTARM-AP, y se analizó la actividad de adhesión celular en presencia del anticuerpo.

Como resultado, la adhesión de las células Th2 a la proteína quimérica mTARM-AP se reprimía significativamente 35 en la totalidad de los anticuerpos anti-mTARM #6, #21 y #37 (Figura 14).

[Ejemplo 7] Efecto terapéutico del anticuerpo anti-TARM en el modelo de artritis inducida por colágeno

Un modelo de Artritis Inducida por Colágeno (CIA) es un modelo de la enfermedad autoinmune artritis reumatoide. Dado que se detectan células T y anticuerpos CD4+ que reaccionan con el colágeno tipo II, se considera que ambos cooperan para provocar la artritis. Adicionalmente, se ha publicado que la sensibilidad al modelo CIA está ligada a

40 las moléculas del MHC clase II. La TARM es una molécula de activación que se expresa en células dendríticas, e induce adhesión celular de las células T activadas por la vía de moléculas que se fijan a TARM. En consonancia con ello, se ha considerado que la interacción entre tales células dendríticas y las células T activadas es inhibida por un anticuerpo anti-TARM, a fin de suprimir posiblemente una respuesta inmune asociada con células dendríticas o con las células T activadas. Por ello, se analizó el efecto terapéutico del anticuerpo anti-TARM en el modelo CIA.

45 Una solución al 3% de colágeno tipo II derivado de una articulación de bovino (Collagen Gijutsu Kenshukai) y adyuvante completo de Freund (Difco) se mezclaron en cantidades iguales para producir una emulsión. Después de ello, se administraron intracutáneamente 100 μl de la emulsión (150 μg/ratón) en la base de la cola de un ratón DBA/1J de 5 semanas (Charles River Laboratories Japan, Inc.), de tal modo que el ratón se inmunizó el día -21 (inmunización inicial) y el día 0 (refuerzo). A partir del refuerzo, se administró el anticuerpo anti- mTARM #6 por vía

50 intravenosa a una dosis de 500 μg dos veces por semana. A partir de 3 días después del refuerzo, se llevaron a cabo la determinación del peso corporal y la evaluación externa. El día 13 se sacrificó el ratón. Se evaluaron los hallazgos externos utilizando el registro siguiente. A saber, 0: normal; 1: eritema e hinchamiento moderado confinados a la parte media del pie (tarso) o la articulación del tobillo; 3: eritema e hinchamiento moderado que se extendían desde el tobillo a la articulación metatarsiana; 4: eritema e hinchamiento severo en toda la porción que iba

55 desde el tobillo al pie y a los dedos.

Por consiguiente, como resultado de la administración del anticuerpo anti-mTARM, se observaron un alivio claro en los síntomas y la supresión de la reducción del peso corporal (Figura 15).

Por otra parte, se recogió sangre heparinizada de la vena cava inferior de los ratones sacrificados, y se midieron la concentración de amiloide A del suero (SAA) en plasma y el título de anticuerpos para colágeno. SAA es una

5 proteína plasmática producida en las células hepáticas por la acción de las citoquinas producidas por el estímulo inflamatorio. La concentración de SAA en plasma se utiliza como índice de inflamación. El título de anticuerpos para colágeno se utiliza como índice de una respuesta inmune específica del antígeno.

La concentración de SAA en plasma se midió por un kit ELISA (BioSource) utilizando el plasma diluido 8.000 veces.

Adicionalmente, se midió el título de anticuerpos para colágeno en plasma como sigue.

10 Primeramente, se añadieron 50 μl de una solución de colágeno tipo II derivado de articulación de bovino de 5 μg/ml a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos (Nunc) y se incubaron a 4ºC durante una noche para inmovilización. Después de ello, se lavó el pocillo con T-PBS (0,02% Tween 20/PBS), y se bloqueó luego un sitio de fijación inespecífica con 1% BSA/PBS. Se lavó el pocillo 3 veces con T-PBS, y se añadieron luego a cada pocillo 50 μl de plasma que se había diluido 100.000 veces con T-PBS, seguido por incubación a la temperatura ambiente

15 durante 2 horas. Después de ello, se lavó 3 veces el pocillo con T-PBS, y se añadieron a cada pocillo 50 μl de cada una de anti-IgG1 biotinilada de ratón (BD) e anti-IgG2a biotinilada de ratón (BD) que se habían diluido 1000 veces con T-PBS, seguido por incubación a la temperatura ambiente durante 2 horas. El pocillo se lavó 3 veces con T-PBS, y se añadieron luego a cada pocillo 50 μl de estreptavidina marcada con HRP (Pierce) que se había diluido 5000 veces con T-PBS, seguido por a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de ello, se añadió un

20 sustrato cromógeno y se reveló.

Como resultado, la concentración de SAA en plasma se redujo por administración del anticuerpo anti-mTARM (Figura 16). Sin embargo, el título de anticuerpos anti-colágeno en plasma no se modificaba por administración del anticuerpo anti-mTARM (Figura 17).

[Ejemplo 8] Determinación de la secuencia del gen TARM humano de longitud total

25 A fin de identificar un gen TARM humano, se llevó a cabo una búsqueda BLAST utilizando la secuencia del gen TARM de ratón. Como resultado, se descubrió una secuencia que presentaba alta homología con la secuencia de cDNA TARM de ratón (No. de Acceso a GenBank XM _497642). Sin embargo, no existía secuencia señal alguna en una secuencia de aminoácidos (LOC441864) codificada por dicha XM _497642, y por tanto no se consideró que la secuencia mencionada anteriormente funcione como una proteína de la membrana celular. Se consideró que XM

30 _497642 es una secuencia supuesta y que la estimación de una secuencia de cDNA a partir de la secuencia genómica es incorrecta. Por ello, se intentó determinar la secuencia del gen de longitud total de TARM humana. Se identificaron tejidos de expresión de TARM, y se estimó la secuencia de longitud total del cDNA TARM por realización de 5'-y 3'-RACE. Después de ello, basándose en la secuencia de una región que codificaba la proteína TARM, se diseñaron cebadores, y se aisló luego el cDNA de longitud total.

35 (1) Análisis de la expresión del gen TARM humano

Primeramente, se analizó la expresión de hTARM en tejidos humanos. Basándose en el Acceso a GenBank: XM _497642, se diseñaron cebadores.

hTARM F1: TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO.: 45)

hTARM R1: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO.: 46)

40 Se sintetizó cDNA monocatenario a partir del RNA total de cada órgano humano (Clontech) utilizando el kit PCR de RNA (TAKARA). Empleando dicho cDNA monocatenario como molde, se realizó una PCR en tiempo real utilizando ABI7700. La PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la composición siguiente (12,5 μl de QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), 0,25 μl de Uracil DNA Glicosilasa (Invitrogen), 0,125 μl de cebador F 100 μM, 0,125 μl de cebador R 100 μM, 2,5 μl de cDNA molde (diluido 10 veces) y 7,25 μl de agua

45 destilada). Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 10 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos y 60ºC-1 minuto.

Como resultado, se encontró que el gen hTARM, como en el caso del gen mTARM, se expresaba fuertemente en médula ósea (Figura 18).

(2) Aislamiento del gen TARM humano

50 Dado que el gen hTARM se expresaba en médula ósea, se utilizó el RNA total de la médula ósea para llevar a cabo 5'-RACE y 3'-RACE, a fin de intentar determinar la secuencia de un gen de longitud total del hTARM.

Primeramente, se sintetizó cDNA bicatenario a partir del RNA total de la médula ósea utilizando el kit de síntesis de CDNA (TAKARA), y se purificó luego el cDNA utilizando el kit de purificación PCR Qiaquick (Qiagen).

Subsiguientemente, se añadió al mismo un adaptador ad29, y el producto así obtenido se utilizó como molde en RACE. La primera PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón ExTaq 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,25 μl de ExTaq, 0,5 μl de cebador 100 μM (5' PCR4), 0,5 μl de cebador específico Gene 100 μM, 1 μl de cDNA al que se había añadido el adaptador ad29 (diluido 25 veces), y 38,75 μl de

5 agua destilada).

Se utilizaron como cebadores las secuencias siguientes:

5’PCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO.: 21)

hTARM_RACE_5’_4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO.: 47), o

hTARM_RACE_3’_4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO.: 48)

10 Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 30 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-1 minuto, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 5 minutos.

La segunda PCR se realizó utilizando una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón ExTaq 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,25 μl de ExTaq, 0,5 μl de cebador 100 μM (5' PCR1), 0,5 μl de cebador específico

15 Gene 100 μM, 1 μl del producto de la primera PCR (diluido 100 veces), y 38,75 μl de agua destilada).

Se utilizaron como cebadores las secuencias siguientes:

5’PCR1: (SEQ ID NO.: 24),

h29B140 F1: TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO.: 49), o

h29B140 R1: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO.: 50)

20 Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 25 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 5 minutos. El fragmento de cDNA amplificado se clonó en pCR2.1 (Invitrogen), y se determinó la secuencia de nucleótidos del mismo utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100.

Como resultado, se obtuvieron secuencias de nucleótidos 5' y 3', que eran completamente diferentes de la 25 secuencia que se muestra en XM_497642 (SEQ ID NO: 9).

Se diseñaron los cebadores siguientes utilizando la información de secuencia de nucleótidos obtenida por RACE:

h29B140_Sall-Kozac_F:

cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO.: 51)

h29B140_NotI-R: cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC (SEQ ID NO.: 52)

30 Con estos cebadores, se llevó a cabo una PCR utilizando cDNA monocatenario sintetizado a partir del RNA total de la médula ósea utilizando el kit PCR de RNA (TAKARA) como molde. La PCR se llevó a cabo en una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,5 μl de polimerasa Pyrobest (TAKARA), 0,5 μl de cada uno de cebadores 100 μM, 1 μl de cDNA, 2,5 μl de DMSO, y 36 μl de agua destilada). Para dicha PCR, después del tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacción

35 consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 2 minutos. El cDNA amplificado se clonó en pBlueScriptII SK(+) (Stratagene), y se determinó luego la secuencia de nucleótidos del mismo utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100. La secuencia de nucleótidos obtenida del cDNA hTARM era idéntica a la secuencia determinada por RACE (SEQ ID NO: 9). La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) codificada por el cDNA hTARM tenía una secuencia señal necesaria para funcionar

40 como proteína de la membrana celular en el terminal N de la misma. El hTARC y la secuencia de aminoácidos codificada por XM_497642 (LOC441864) tenía terminal N y terminal C diferentes. De acuerdo con lo anterior, se descubrió que dicha secuencia de cDNA supuesta, XM_497642, estimada a partir de la secuencia genómica no existía realmente, y que el cDNA de hTARM era un gen real que codificaba la proteína de la membrana celular hTARM (Figura 19).

45 [Ejemplo 9] Preparación de anticuerpos contra TARM humana

(1) Preparación de células que expresan TARM humana

Se preparó un vector de expresión del gen TARM humano por inserción del cDNA de hTARM obtenido en el Ejemplo 8 en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058).

Se preparó un retrovirus recombinante como sigue:

Se suspendieron células 293/EBNA-1 (Invitrogen) de 3 x 106 células en un medio (D-MEM/10% FBS), y se pusieron en cápsulas de cultivo de 10 cm, después de lo cual se cultivaron en una incubadora de CO2 durante 24 horas. Al día siguiente, se cambió el medio con un medio nuevo, y se añadió luego a ello una solución de transfección 5 preparada como se describe más adelante, a fin de realizar la transfección. La solución de transfección se preparó por adición de 600 μl de OPTI-MEM (GIBCO BRL) y 24 μl de TransIT LT1 (TaKaRa) en un tubo de 5 ml para mezclarlos, seguido por incubación de la mixtura a la temperatura ambiente durante 5 minutos, y adición posterior de 9 μg de un vector de expresión y 9 μg de pCL-Eco (Imgenex) utilizado como vector de empaquetamiento para la mixtura de reacción, seguido por incubación de la mixtura a la temperatura ambiente durante 5 minutos. 48 horas

10 después, se recuperó el sobrenadante de cultivo, y se realizó luego una filtración con un filtro de 0,45 μm, a fin de obtener una solución de virus recombinante.

Se infectaron células B300.19 con este virus recombinante como se describe más adelante, a fin de preparar células que expresaran hTARM. Las 1 x 106 células B300.19 se añadieron a un tubo de 15 ml, y se centrifugaron luego las mismas a 1200 rpm a 25ºC durante 5 minutos. Después de ello, se desechó el sobrenadante de cultivo por 15 aspiración. Se añadió a las células una solución obtenida por adición de 2 μl de Polybrene (10 mg/ml) y 2 μl de 2mercaptoetanol 55 μM a 2 ml de la solución de virus recombinante. La mixtura obtenida se centrifugó luego a 2500 rpm a 30ºC durante 2 horas, a fin de que las células se infectaran con el virus recombinante. Una vez completada la infección, la solución de virus recombinante se desechó, y se añadió a ello un medio (RPMI-1640/10% FBS/2mercaptoetanol 55 μM), seguido por cultivo. Las células EGFP-positivas se separaron por selección de células, a fin

20 de obtener células que expresaran hTARM.

(2) Preparación de una proteína quimérica fusionada a la región extracelular de hTARM para SEAP o Fc

La región extracelular de hTARM se amplificó por PCR utilizando cDNA de longitud total de hTARM como molde y utilizando también un cebador 5' adicionado de SalI

(h29B140_SalI-Kozac_F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO: 51)) y un 25 cebador 3' adicionado de NotI

(h29B140_NotI_SEAP_R: gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTCGATGT (SEQ ID NO: 53)).

La PCR se llevó a cabo en una solución de reacción con la composición siguiente (5 μl de tampón 10x, 4 μl de dNTP 2,5 mM, 0,5 μl de polimerasa Pyrobest (TAKARA), 0,5 μl de cada uno de los cebadores 100 μM, 1 μl de cDNA, 2,5 μl de DMSO, y 36 μl de agua destilada). Para dicha PCR, después de tratamiento a 94ºC durante 5 minutos, se repitió

30 35 veces un ciclo de reacción consistente en 94ºC-30 segundos, 65ºC-30 segundos, y 72ºC-5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72ºC durante 2 minutos. El cDNA amplificado se clonó en pBlueScriptII SK(+) (Stratagene), y la secuencia de nucleótidos del mismo se confirmó luego utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100. El fragmento de cDNA obtenido se digirió con SalI y NotI, y se insertó luego en el vector pcDNA 3.1(+)-SEAP (His)10-Neo descrito en el Ejemplo 2, a fin de preparar un vector de expresión hTARM-AP.

35 Para ello, la región extracelular de hTARM se fusiona a través de un enlazador de tres aminoácidos (Ala-Ala-Ala) a fosfatasa alcalina placentaria humana de tipo secretor que tiene un identificador 10-histidina (His)10 en el terminal C de la misma para expresarse como proteína quimérica secretora (a la que se hace referencia en lo sucesivo como proteína quimérica AP). El vector de expresión de la proteína quimérica AP obtenido se introdujo en células 293/EBNA-1 utilizando TransIT LT1 (TAKARA) y se cultivaron luego las mismas durante 4 ó 5 días. Después de ello,

40 se recuperó por centrifugación el sobrenadante de cultivo, y la proteína quimérica AP secretada en el sobrenadante se filtró luego con un filtro de 0,22 μm. Se añadieron luego a lo anterior Hepes (pH 7,4) y azida de sodio a concentraciones finales de 20 mM y 0,02%, respectivamente, y el producto obtenido se guardó a 4ºC. La concentración de la proteína quimérica AP se calculó por medición de la actividad de fosfatasa alcalina utilizando el ensayo del gen informador quimioluminiscente Aurora AP (ICN).

45 (3) Preparación del anticuerpo monoclonal contra hTARM

Para uso como antígeno en inmunización, se purificó primeramente la proteína quimérica hTARM-AP.

Dicha purificación se llevó a cabo utilizando el marcador histidina existente en el terminal C de la proteína quimérica AP y empleando el Kit His Trap (Amersham Biosciences). Se añadió un sobrenadante de cultivo que contenía la proteína quimérica hTARM-AP a una columna HP de 1 ml de formación de quelatos HiTrap (Amersham

50 Biosciences), seguido por lavado con una solución de imidazol 10 mM. Después de ello, la proteína hTARM-AP se eluyó de la columna utilizando una solución de imidazol 500 mM. La concentración de la proteína quimérica hTARM-AP se calculó por medición de la actividad enzimática utilizando el ensayo del gen informador quimioluminiscente Aurora AP (ICN) y por cuantificación de proteínas utilizando el kit Protein Assay II (BIO-RAD).

Subsiguientemente, se utilizó como antígeno la proteína quimérica hTARM-AP obtenida, y se inmunizaron ratones

55 Balb/c con la proteína mencionada anteriormente por Kohjin Bio Co. Ltd. Se aislaron linfocitos de los ratones inmunizados, y los linfocitos aislados se mezclaron luego con células de mieloma P3U1. Después de ello, se analizó

la fusión celular por un método PEG. Utilizando un sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos, se realizó el cribado por ELISA con una proteína quimérica hTARM-Fc. Se realizó la clonación a partir de los pocillos positivos, y se obtuvieron 6 tipos de clones (#11, #18, #19, #22, #26, y #40). Como resultado del análisis de la especificidad por FACS, se encontró que todos los clones reaccionaban solamente con células B300.19 que expresaban hTARM, y 5 que los mismos no reaccionaban con las células B300.19 parentales. Se inocularon en la cavidad peritoneal de un ratón atímico hibridomas que producían los anticuerpos monoclonales anti-hTARM #11, #18, #19, #22, #26, y #40, y se obtuvo ascitis de los mismos. Después de ello, los anticuerpos se purificaron utilizando una columna de Proteína

A.

[Ejemplo 10] Adhesión de células T humanas activadas a la proteína recombinante hTARM

10 Se recogió sangre periférica humana utilizando heparina, y se añadió a ella Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) en una cantidad igual de la sangre periférica humana, y se aislaron células mononucleares por centrifugación en gradiente de densidad a 400 x g durante 30 minutos. Las células aisladas se suspendieron en un tampón MACS (PBS/1% FBS/EDTA 2 mM); y se añadió solución de bloqueo FcR (Miltenyi) a 5 μl/1 x 107 células a la suspensión. La mixtura obtenida se dejó reaccionar a 4ºC durante 15 minutos. Se utilizaron el kit de aislamiento

15 humano CD25+CD4+ Treg (Miltenyi) y Auto MACS para obtener células T CD4+ en reposo. Se añadieron un anticuerpo de ratón anti-CD25 humana marcado con PE (Miltenyi) y un anticuerpo de ratón anti-CD4 humano marcado con FITC (Miltenyi), cada uno en una cantidad de 1/11 de la solución, a las células CD4+ que se habían purificado con MACS. Se dejaron reaccionar luego los mismos a 4ºC durante 20 minutos. Después de ello, se utilizó FACS Aria (BD Biosciences) para obtener células T CD4+ CD25-. Las células T CD4+ CD25- se activaron utilizando

20 el kit de activación/expansión de células T humano (Miltenyi). A partir de 3 días después del estímulo, se añadió IL-2 humana (2 ng/ml) a las células. Utilizando células T CD4-positivas activadas obtenidas en los días sexto y octavo después del estímulo, se analizó la posibilidad de la función de la proteína quimérica hTARM-AP como molécula de adhesión a las células T activadas.

En primer lugar, se añadieron 50 μl de anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (10 μg/ml) (Seradyn) a cada pocillo de una

25 placa ELISA de 96 pocillos (Nunc) y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos para inmovilización. Después de lavado con PBS, se bloqueó un sitio de fijación inespecífico con Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd.). Se añadió una proteína quimérica AP (1 nM) a cada pocillo y se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos para inmovilización. Las células T activadas se suspendieron en un tampón de adhesión celular (RPMI1640/0,5% BSA/HEPES 20 mM/2 ME 55nM (pH 7,4)), seguido por marcación fluorescente con Calcein-AM (Dojindo

30 Laboratories). Después de ello, se añadieron las 5 x 104 células a cada pocillo y se incubaron luego a 37ºC durante 1 hora. Las células no adheridas se eliminaron por lavado, y se añadió luego a ello un tampón de lisis celular (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)/1% Triton X-100). Se realizó después la medición a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de detección de 535 nm utilizando Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer), y se cuantificaron las células adheridas. Con relación al nivel de adhesión celular, la ratio de las

35 células adheridas a las células añadidas se expresó como porcentaje.

Como resultado, se descubrió que la hTARM funcionaba como una molécula de adhesión a las células T humanas activadas (Figura 20).

[Ejemplo 11] Actividad inhibidora de la adhesión celular del anticuerpo anti-TARM

Se analizó el efecto de los anticuerpos anti-TARM sobre la adhesión celular de las células T humanas activadas a la 40 hTARM.

Se añadió una proteína quimérica AP a cada pocillo y se incubó luego a la temperatura ambiente durante 30 minutos para inmovilización. Después de ello, se añadieron 10 μg/ml de cada uno de los anticuerpos anti-hTARM (#11, #18, #19, #22, #26, y #40) a cada pocillo y se pre-trataron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. se añadieron luego células T activadas marcadas fluorescentemente a ello, y se analizó la actividad de adhesión celular en

45 presencia de cada anticuerpo. Debe indicarse que se utilizó un anticuerpo anti-IgG2a como control para #11, #19, #26, y #40, y se utilizó un anticuerpo anti-IgG2b como control para #18 y #22.

Como resultado, se encontró que la adhesión de las células T activadas a la proteína quimérica hTARM-AP reprimía significativamente en presencia de los anticuerpos anti-hTARM #18, #19, #22 y #26, y que se observaba una represión parcial de dicha adhesión en presencia de los anticuerpos anti-hTARM #11 y #40 (Figura 20).

50 [Ejemplo 12] Identificación del nuevo ligando mTARM-L para mTARM

(1) Selección de moléculas candidato mTARM-L (ligando mTARM)

Las moléculas de fijación de mTARM están presentes en las células T activadas (Ejemplo 5). Por ello, se analizó la presencia o ausencia de las moléculas de fijación de mTARM en líneas de células derivadas de células inmunes de ratón (L5178Y-R, BW5147, y Raw264.7) por el método descrito en el Ejemplo 5.

Como resultado, se descubrió que las moléculas de fijación de mTARM se expresaban fuertemente en las células L5178Y-R, pero que las mismas se expresaban escasamente en las células BW5147 y las células Raw264.7 (Figura 21A).

Subsiguientemente, basándose en la hipótesis de que un ligando desconocido para la mTARM pertenecía a la

5 superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF), se investigó la base de datos de Mouse Ensemble. Concentrando la atención en 47 candidatos de IgSF, se examinó la expresión en células inmunes por PCR en tiempo real. Se aisló el RNA total de las células L5178Y-R, las células BW5147, y las células Raw264.7 utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). La PCR en tiempo real se llevó a cabo en presencia de SYBR-Green utilizando el Sistema de Detección de Secuencias ABI7700 (PE Applied-Biosystems).

10 Como resultado, la expresión de mRNA de ENSMUSG00000035095 (A530065I17Rik, NM_176953) (utilizando el cebador #2558: CAGCTGGCAAGAGGAACAGT (SEQ ID NO: 54) y el cebador #2559: GAGCATCGGCACTTATCTCC (SEQ ID NO: 55)) exhibía una correlación con la actividad de fijación de la proteína quimérica mTARM-AP a las células (Figura 22B). Sin embargo, no existía ninguna región transmembranal en una secuencia de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095, y por ello no se consideró que funcionara

15 como una proteína de la membrana celular. Esta secuencia de aminoácidos era una secuencia supuesta, y por ello se consideró que la estimación de una secuencia de cDNA a partir de la secuencia genómica era incorrecta. Por tanto, se intentó primeramente identificar un producto génico humano homólogo. Utilizando una secuencia de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095, se llevó a cabo una investigación en bases de datos. Como resultado, se descubrió una secuencia de aminoácidos humana LOC196264 que exhibía alta homología con la

20 secuencia de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095. Esta secuencia de aminoácidos estaba relacionada con una proteína de la membrana celular que contenía una región con estructura de bucle de inmunoglobulina. De acuerdo con ello, se consideró que LOC196264 era la secuencia de aminoácidos humana de longitud total de un candidato TARM-L. Subsiguientemente, utilizando la secuencia de aminoácidos de LOC196264, se realizó una búsqueda tblastn en la base de datos. Como resultado, se descubrió una región que codificaba una

25 secuencia que exhibía homología con la secuencia de aminoácidos de LOC196264 en la secuencia de nucleótidos genómica del clon BAC de ratón AC122305. Se estimaron a partir de esta secuencia la secuencia de cDNA y la secuencia de aminoácidos de un candidato TARM-L de ratón, con lo que se diseñaron los cebadores siguientes y se aisló cDNA codificante de una proteína de longitud total.

30 Se utilizó como molde el RNA total de Th1 el día 2, y el cDNA se amplificó por el método descrito en el Ejemplo 1. El cDNA amplificado se insertó en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058), y se preparó luego un vector de expresión del gen candidato mTARM-L. Se utilizó el Analizador de Secuencias ABI3100 para determinar la secuencia de nucleótidos del mismo (SEQ ID NO: 13).

(2) Identificación de mTARM-L

35 A continuación, con objeto de examinar si el candidato mTARM-L era o no un ligando desconocido para TARM, se prepararon células en las cuales debía expresarse esta molécula por el método descrito en el Ejemplo 2. La actividad de fijación de la proteína quimérica mTARM-AP en la superficie celular de células que expresaban el candidato mTARM-L y la actividad de adhesión de las células que expresaban el candidato mTARM-L a la mTARM inmovilizada se midieron por el método descrito en el Ejemplo 5.

40 Como resultado, la mTARM-AP se fijaba específicamente a las células B300.19 que expresaban EGFP+ mTARM-L, pero no se fijaba a las células B300.19, en las que se había introducido un vector de control EGFP+ (Figura 22A). La AP utilizada como control negativo no se fijaba a dichas células B300.19 que expresaban EGFP+ mTARM-L (Figura 22B).

Se examinó además la actividad de adhesión de las células B300.19 que expresaban la mTARM-L a AP y la

45 proteína quimérica mTARM-AP. Como resultado, se encontró que las células arriba mencionadas se adherían sólo a la proteína quimérica mTARM-AP (Figura 22A).

Así pues, los resultados anteriores demostraban que la molécula candidato mTARM-L era realmente un ligando nuevo para TARM. Este ligando se designó mTARM-L (Ligando TARM).

Con relación a hTARM-L, se diseñaron los cebadores siguientes basados en la secuencia de nucleótidos de

50 NM_198275 que codificaba la secuencia de aminoácidos de LOC196264, y se aisló cDNA codificante de la proteína de longitud total:

#2721: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCAGAGAGGAGCAGCTGGA(SEQ ID NO.: 58)

#2722: GCGGGCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA (SEQ ID NO.: 59) Utilizando el RNA total de la médula ósea como molde, se amplificó el cDNA por el método descrito en el Ejemplo 1. El cDNA amplificado se insertó en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058) para preparar un vector de expresión del gen TARM-L, y se determinó luego la secuencia de nucleótidos del mismo (SEQ ID NO: 15), utilizando el Analizador de Secuencias ABI3100.

Las TARM-L humana y de ratón se sometieron a análisis de homología con ClustalW. Los resultados se muestran en la Figura 23. La hTARM-L estaba constituida por 235 aminoácidos, y la mTARM-L estaba constituida por 237 aminoácidos. Las mismas tienen 86% de homología. Por otra parte, mTARM m3 (293 aminoácidos) mostraba la homología máxima con la hTARM (271 aminoácidos) con un porcentaje de 50% (Figura 24).

LISTADO DE SECUENCIAS

Moléculas de adhesión a las células T y anticuerpos para las mismas

cebador cebador

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora seleccionada de las siguientes (ix), (x), (xi) y (xii)

o un fragmento funcional de la misma:

(ix) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 5 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

(x) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a uno o los dos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ

10 ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

(xi) una proteína de membrana o secretora que es codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:

15 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; y

(xii) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

20 para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.
2. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que es un anticuerpo contra una proteína de membrana o proteína secretora seleccionada de las siguientes (i), (ii), (iii) y (iv), o un fragmento funcional del mismo:

25 (i) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(ii) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a uno o ambos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

30 (iii) una proteína de membrana o secretora que es codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y

(iv) una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o

más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y que es funcionalmente equivalente a una 35 proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
3. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 2, que es un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de la misma.

40 4. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que es un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora seleccionada de las siguientes (ix'), (x'), (xi') y (xii'), o un fragmento funcional de la misma:

(ix') una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

(x') una de proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

45 12 en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos están añadidos a uno o ambos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

(xi') una de proteína de membrana o secretora que está codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y que es 50 funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y

(xii') una de proteína de membrana o secretora que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70%

o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
5. El anticuerpo o un fragmento funcional del mi0smo para uso de acuerdo con la reivindicación 4, que es un anticuerpo contra una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 que contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de la misma.

5 6. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 5, que es producido por un hibridoma depositado bajo el No. de acceso FERM BP-10376.
7.

El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento es para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide.
8.

Un hibridoma depositado bajo el No. de acceso FERM BP-10376.

10 9. Un anticuerpo contra una proteína seleccionada de las siguientes (xiii), (xiv), (xv) y (xvi), o un fragmento funcional del mismo:

(xiii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16;

(xiv) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos se añaden a

15 uno o ambos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16;

(xv) una proteína que está codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 16, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID

20 NO: 16; y

(xvi) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.
10. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 9, para uso en el tratamiento 25 de enfermedades autoinmunes.
11.

El anticuerpo o fragmento funcional del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 10, para utilización en el tratamiento de la artritis reumatoide.
12.

Un método para cribado de una sustancia que inhibe la activación de una célula dendrítica o una sal de la misma, o un solvato de la misma, que comprende los pasos de:

30 (d) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con una célula dendrítica en presencia o ausencia de una sustancia de test; y

(e) medir el nivel de activación de dicha célula dendrítica.
13. Un método de cribado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde, en el paso (e), el nivel de activación de

dicha célula dendrítica se mide utilizando como índice la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida por la célula 35 dendrítica.
14. El método de cribado de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende adicionalmente el paso de (f-1) comparar la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en presencia de una sustancia de test con la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en ausencia de una sustancia de test, después del paso (e).
15.

El método de cribado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde, en el paso (e), el nivel de activación de 40 una célula dendrítica se mide utilizando como índice el nivel de expresión de la cadena FcRγ en la célula dendrítica.
16. El método de cribado de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende adicionalmente el paso de (f-2) comparar el nivel de expresión de la cadena FcRγ en presencia de una sustancia de test con el nivel de expresión de la cadena FcRγ en ausencia de una sustancia de test, después del paso (e).
17.

Un método de cribado de una sustancia que inhibe una formación de complejo entre una proteína TARM y la 45 cadena FcRγ o una sal de la misma, o un solvato de la misma, que comprende los pasos de:

(g) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con una célula dendrítica en presencia o ausencia de una sustancia de test; y

(h) medir el nivel de expresión de la cadena FcRγ en dicha célula dendrítica,

en donde dicha proteína TARM es una proteína de membrana o secretora seleccionada de las siguientes (ix), (x), (xi) y (xii):

(ix) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

5 (x) una proteína de membrana o secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; en la cual uno o más aminoácidos están insertados, sustituidos o delecionados, o uno o más aminoácidos están añadidos uno o ambos extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12;

10 (xi) una proteína de membrana o secretora que es codificada por un polinucleótidos que se hibrida en condiciones severas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, y que es funcionalmente equivalente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; y

15 (xii) una proteína de membrana o secretora que una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; y que es funcionalmente equivalente a una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12.
18. El método de cribado de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende adicionalmente el paso de (i)

20 comparar el nivel de expresión de la cadena FcRγ en presencia de una sustancia de test con el nivel de expresión de la cadena FcRγ en ausencia de una sustancia de test, después del paso (h).