WO2007037430A1 - Ｔ細胞接着分子およびそれに対する抗体 - Google Patents

Ｔ細胞接着分子およびそれに対する抗体 Download PDF

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WO2007037430A1
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Hideaki Ogasawara
Keiko Mizuno
Yoshihisa Arita
Miyuki Nishimura
Toshio Imai
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
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    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a sputum cell adhesion molecule expressed on bone marrow-derived rod cells and a gene thereof, and a ligand for the adhesion molecule (receptor) expressed on the sputum cell and a gene thereof.
  • the invention also relates to antibodies against the adhesion molecule or the ligand and uses thereof.
  • the present invention further relates to a screening method using the adhesion molecule.
  • Oscar Ostoclast-associated receptor
  • FcR y chain a molecule involved in osteoclast differentiation.
  • Oscar is an immunoglobulin-like receptor that associates with the FcR y chain
  • CD80-CD28, CD40-CD40L are molecules that are expressed on rod cells, adhere to T cells, and are involved in the immune response interaction between T cells and rod cells.
  • the present inventors have now identified a gene that is specifically expressed on bone marrow-derived rod cells by the subtraction method.
  • the present inventors also confirmed that the protein encoded by the gene binds to the FcR y chain, which is an IgE receptor, that the expression of the protein is enhanced by LPS stimulation, and that antibody cross-linking stimulation to the protein
  • the rod-shaped cells are activated by It was found that the protein has a function of adhering to T cells, and that the antibody against the protein has a therapeutic effect on a collagen-induced arthritis model, which is a disease model of rheumatoid arthritis.
  • the present inventors further identified a gene for ligand for the protein expressed on ⁇ cells. The present invention is based on these findings.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 2 having one or more conservative substitutions A membrane protein or secreted protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 (hereinafter referred to as the novel protein of the first aspect according to the present invention). Provided.
  • a membrane protein or secreted protein (hereinafter, the novel protein according to the second aspect of the present invention) is also selected Is provided):
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are inserted, substituted or deleted, or added to one or both ends thereof;
  • polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, one or a plurality of nucleotides are inserted, substituted or deleted, or one or more at one or both ends thereof
  • a membrane protein or secreted protein (hereinafter referred to as TARM (T cell-interacting Activating Receptor on My eloid cells) selected from the following), (x), (xi), and (xii) And a functional fragment thereof (hereinafter referred to as the antibody of the first aspect according to the present invention! /).
  • (Ix) Membrane protein or secretion comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12. Protein;
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or It is encoded by a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a polynucleotide that is hybridized under stringent conditions, and is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, a membrane protein or secreted protein having a function equivalent to that of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12; and
  • the novel ligand protein (hereinafter referred to as the present invention) is selected as a ligand of the novel protein according to the present invention.
  • the novel ligand protein or TARM—L (TARM ligand) protein, which has the power S):
  • amino acid sequence comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, and represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16
  • a polynucleotide encoding the novel ligand protein according to the present invention is provided.
  • the present invention also provides a polynucleotide in which the following (xvii), (xviii), (xix), and (xx) forces are also selected:
  • polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15, one or a plurality of nucleotides are inserted, substituted or deleted, or one or both at one or both ends thereof
  • an antibody against the novel ligand protein according to the present invention and a functional fragment thereof (hereinafter referred to as the antibody of the second aspect according to the present invention and! / ⁇ ⁇ ) are provided.
  • the antibody of the first aspect and the second aspect of the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as “the antibody of the present invention") or a functional fragment thereof.
  • an autoimmune disease therapeutic agent and a T cell adhesion inhibitor comprising an active ingredient
  • a method for screening a substance that inhibits adhesion between TARM protein and sputum cells, a salt thereof, or a solvate thereof is provided.
  • a method for screening a substance or a salt thereof, or a solvate thereof, which inhibits the activity of rod-shaped cells, is provided.
  • a method for screening a substance that inhibits complex formation between a TARM protein and an FcR ⁇ chain, or a salt thereof, or a solvate thereof, is provided.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of mouse TARM genes (ml to 4 and si).
  • the underline represents the immunoglobulin (IG) loop structure part, and the bold type represents the transmembrane part.
  • IG immunoglobulin
  • FIG. 2 shows the results of analysis of TARM mRNA expression in mouse tissue by primer set 1 using real-time PCR.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of real-time PCR analysis of TARM mRNA expression in various cells using primer set 1.
  • FIG. 4 A shows the structure and amino acid number of the extracellular region used for the production of anti-TARM protein antibody.
  • B is a diagram showing the results of examination of the specificity of the antibody for TARM protein.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of mouse protein expression in bone marrow-derived rod cells.
  • Figure 7 shows the results of an analysis of mouse protein expression in c-kit positive peritoneal mast cells.
  • FIG. 8 shows the results of analysis of mouse TARM protein expression in mouse lymph node-derived cells by LPS inflammation stimulation. Arrows indicate mouse TARM protein expression.
  • FIG. 9A is a diagram showing the induction of IL-6 production from mature bone marrow rod cells by anti-TARM protein antibody stimulation.
  • B is a diagram showing the induction of MCP-1 production from immature bone marrow rod cells by anti-TARM protein antibody stimulation.
  • FIG. 10 shows the increase in FcR ⁇ chain accompanying the increase in expression of mouse TARM protein on the cell surface.
  • FIG. 11 shows the results of analyzing the complex formation of mouse TARM protein and FcR ⁇ chain by immunoprecipitation.
  • FIG. 12 shows the results of an expression analysis of molecules that bind to mouse TARM protein in activated sputum cells.
  • FIG. 13 is a view showing the adhesion ability of activated T cells to mouse TARM protein.
  • FIG. 14 shows inhibition of adhesion of Th2 cells to mouse TARM protein by anti-mouse TARM protein antibody.
  • FIG. 15 is a diagram showing changes in appearance and body weight over time in a collagen-induced arthritis model administered with an anti-mouse TARM protein antibody.
  • FIG. 16 shows the effect of anti-mouse TARM protein antibody administration on plasma serum amyloid A concentration in a collagen-induced arthritis model.
  • FIG. 17 shows the effect of administration of an anti-mouse TARM protein antibody on the anti-collagen antibody titer in plasma of a collagen-induced arthritis model.
  • FIG. 18 shows the results of real-time PCR analysis of TARM protein mRNA expression in human tissues.
  • FIG. 19 shows the amino acid sequence of human-derived TARM protein. Underline is Imnog Represents the lobulin (Ig) loop structure, and bold indicates the transmembrane portion. The boxed portion represents a sequence that differs between hTARM and LOC441864.
  • FIG. 20 shows the ability of activated T cells to adhere to human TARM protein, and the inhibition of adhesion of T cells to human TARM protein by anti-human TARM protein antibody.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the expression of molecules that bind to mouse TARM protein in cell lines.
  • B is a diagram showing the results of pruning mRNA expression of ENSMUSG00000035095, which is a mTARM-L candidate molecule, in a mouse cell line by real-time PCR.
  • FIG. 22A is a view showing specific binding of a mouse TARM-AP chimeric protein to mTARM-L-expressing B300. 19 cells. B shows specific cell adhesion of mTARM-L expressing B300. 19 cells to mouse TARM-AP chimeric protein.
  • FIG. 23 shows the results of analyzing the homology of human and mouse TARM-L proteins.
  • FIG. 24 shows the results of analyzing the homology between human TARM protein and mouse TARM protein (m3).
  • mouse-derived gene has five isoforms.
  • glycoforms include ml, m2, m3, and m4 as genes for membrane-bound proteins (membrane proteins), and si as a gene for secretory proteins (secretory proteins).
  • the base sequence and amino acid sequence of each isoform correspond to the following SEQ ID NOs.
  • the human-derived gene includes a gene of one kind of membrane protein.
  • the base sequence of this gene and the amino acid sequence of the protein encoded thereby are described in SEQ ID NOs: 9 and 10.
  • the protein encoded by the gene forms a membrane protein or a secreted protein.
  • the membrane protein according to the present invention can be made into a secreted protein by modifying its C-terminus (for example, by deleting the transmembrane portion).
  • the secreted protein according to the present invention can be made into a membrane protein by modifying its C-terminus (for example, by adding a transmembrane portion).
  • the number of amino acid and nucleotide modifications is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: LO, further preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 2. be able to.
  • the modified amino acid sequence is preferably an amino acid sequence having one or more (preferably 1 or several, or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions. it can.
  • the modified base sequence is represented by SEQ ID NO: 10 in which the base sequence is one or more (eg, one, several, or 1, 2, 3, or 4). It can be a base sequence having a mutation that does not affect the function of a protein consisting of an amino acid sequence.
  • “conservative substitution” refers to the substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid such that the function of the protein is not substantially altered. It means replacing with a residue. For example, when one hydrophobic residue is substituted with another hydrophobic residue, one polar residue is substituted with another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, norine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenenolealanin, and methionine.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • hybridize means to hybridize to a target polynucleotide under stringent conditions.
  • a default (initial setting) parameter by homology search software such as FASTA, BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)]
  • Target nucleotide sequence and at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably Includes a polynucleotide having 99% or more identity.
  • under stringent conditions means that the temperature is 40 ° C. to 70 ° C., preferably 60 ° C.
  • a hybridization buffer that can be usually used by those skilled in the art.
  • Performing the reaction and washing in a washing solution such as salt concentration force Sl 5 to 300 mmol ZL, preferably 15 to 60 mmol ZL Can be done according to law.
  • the temperature and salt concentration can be appropriately adjusted according to the length of the probe used.
  • the conditions for washing the hybridized material are as follows:
  • 0.2 or 2 X SSC, 0.1% SDS temperature 20–68 ° C.
  • the conditions are stringent (high stringency) or mild (low stringency)
  • 0.2 X SSC, 0.1% SDS as a stringency wash buffer
  • 2 X SSC as a low stringency wash buffer
  • 0 X Can be done with 1% SDS.
  • 0.2 X SSC and 0.1% SDS may be used.
  • the hybridization can be performed according to a known method.
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • identity in terms of amino acid sequences and nucleotide sequences refers to the amino acids constituting each sequence among the sequences to be compared. It is used to mean the degree of agreement between acid residues or nucleotide residues. At this time, the presence of the gap and the nature of the amino acid are considered (Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 7 26-730 (1983)).
  • BLAST Altschul: J. Mol. Biol.
  • identity can be calculated using a homology search program known to those skilled in the art.
  • BLAST Basic local alignment search tool
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is preferably 95% or more, particularly preferably It can be an amino acid sequence having 98% or more, and most preferably 99% or more identity.
  • the base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 is preferably 95% In particular, it can be a nucleotide sequence having an identity of 98% or more, and most preferably 99% or more, most preferably.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 is given.
  • nucleotide sequence encoding the amino acid sequence is easily determined and is represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12.
  • nucleotide sequences encoding can be selected.
  • polynucleotide to be used is a part or all of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11, It also means a DNA sequence that encodes the same amino acid and has a degenerate codon as the DNA sequence. In the present invention, RNA sequences corresponding to these are further included.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or sequence Preferred examples of the polynucleotide encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by No. 12 include SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, Alternatively, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 can be mentioned.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12. Whether the protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12. It can be determined by evaluating biological phenomena or functions related to expression, for example, by expressing the protein by genetic recombination techniques and evaluating whether it functions as an activation receptor for rod cells. Can be determined.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 interacts with T cells, and is in a hooked state. Since it has a function of activating cells, the following function can be used as an index for evaluation:
  • a mouse-derived gene includes a gene of one kind of membrane protein.
  • the nucleotide sequence of this gene and the amino acid sequence of the protein encoded thereby are described in SEQ ID NOs: 13 and 14.
  • human-derived genes include genes for one type of membrane protein. The nucleotide sequence of this gene and the amino acid sequence of the protein encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 Is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and particularly preferably 80% or more. It can be an amino acid sequence having preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity.
  • the base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 is preferably 80% Or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • nucleotide sequence encoding the amino acid sequence is easily determined, and represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. It is possible to select various nucleotide sequences encoding the amino acid sequence to be determined.
  • the polynucleotide encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 is the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15.
  • it means a DNA sequence encoding the same amino acid and having a degenerate codon as a DNA sequence.
  • RNA sequences corresponding to these are also included.
  • polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 The polynucleotide which comprises is mentioned.
  • whether or not it has a function equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 is the amino acid represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 It can be determined by evaluating biological phenomena or functions related to the expression of the protein consisting of the sequence. For example, the protein is expressed by genetic recombination technology and activated on the T cell of the active receptor of the rod cell. It can be determined by assessing whether it functions as a ligand. Since the protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 binds to the TARM protein In the evaluation, for example, the function of binding to TARM protein (Example 12) can be used as an index.
  • the novel ligand protein according to the present invention is a single-transmembrane protein and is expressed on the cell surface with the N-terminal side oriented extracellularly. Therefore, an antibody against the protein can be produced using the protein.
  • At least 6 amino acid residues of the 1st to 159th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or the 1st to 158th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 are left.
  • a protein comprising a polypeptide consisting of a group or all of them is provided. Since the protein comprises a portion corresponding to the extracellular region of the amino acid sequence of TARM-L protein, it can be used as an antigen for producing an antibody against the protein.
  • the antibody according to the present invention can specifically recognize TARM protein or TARM-L protein. Therefore, the TARM protein or TARM-L protein for obtaining the antibody according to the present invention has the antigenicity of TARM or TARM-L! / If so, the amino acid sequence of the TARM protein or TARM-L protein In which one or a plurality of amino acid residues are deleted, inserted, substituted or added. It is known that such proteins maintain the same biological activity as the original protein (Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Z oiler and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487—500; Wang et al.
  • the antibody according to the present invention also includes an antibody specific for a part of TARM protein or TARM-L protein.
  • the TARM protein or TARM-L protein for obtaining the antibody of the present invention includes, in addition to the polypeptide having the full-length amino acid sequence of the TARM protein or TARM-L protein, the TARM protein or TARM-L protein.
  • Polypeptide fragments having the same sequence as at least 6 amino acid residues or more are also included.
  • the polypeptide fragment of TARM protein or TA RM-L protein in the present specification may be any fragment as long as it has the antigenicity of TARM protein or TARM-L protein.
  • Preferable fragments include polypeptide fragments such as the amino terminus and carboxyl terminus of TARM protein or TARM-L protein.
  • Polypeptide antigenic determinant is a method of analyzing hydrophobic Z hydrophilicity on the amino acid sequence of proteins (Kyt e-Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-22), analyzing secondary structure (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76) and further computer program (An al. Biochem. 151: 540-6 (1985) or short !, peptide synthesis).
  • the antigenicity can be confirmed by a method such as PEPSCAN method (Japanese Patent Publication No. 60-500684).
  • the antibody according to the present invention is preferably an antibody that affects the function of the TARM protein or TARM-L protein.
  • the TARM protein function is affected by, for example, activation of the rod cells by cross-linking stimulation of the TARM protein with the antibody of the first aspect according to the present invention (Example 3). Binding of TARM protein to T cells (Example 6 and Example 11), and binding of the antibody to TARM protein allows the TARM protein to bind to the FcR y chain. Inhibiting body formation (Example 4).
  • the effect of TARM-L protein is, for example, that the binding of TARM-L protein to TARM protein is inhibited by binding of the antibody of the second aspect according to the present invention to TARM-L protein. It is to be.
  • the antibody according to the present invention includes a TARM protein or TARM-L protein as an antigen, a monoclonal antibody obtained by immunizing a mammal such as a mouse with the antigen, a chimeric antibody produced using a gene recombination technique And human-type antibodies, and human antibodies produced using human antibody-producing transgenic animals and the like.
  • a mammal such as a mouse
  • human antibodies produced using human antibody-producing transgenic animals and the like.
  • Human antibody is an antibody derived from all regions.
  • a human antibody can be prepared by introducing a human antibody gene into a mouse. For example, Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Tokuhei Hei 4 504365 Publication; Tokuhei Hei 7-509137 Publication; W094Z25585 No. Gazette; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; and JP-T 6-500233. Moreover, it can also produce using a phage display method. For example, it can be prepared by referring to the method described in Marks, J. D. et al: J. Mol. Biol, Vol. 222, p.581-597, 1991.
  • a “human antibody” is an antibody in which only the gene sequence of the antigen binding site (CDR; complementarity determining region) of a mouse antibody is transplanted (CDR grafting) into a human antibody gene. For example, it can be produced by referring to the methods described in JP-A-4 506458 and JP-A-62-296890.
  • Chimeric antibody is an antibody in which the variable region of a mouse antibody is linked to the constant region of a human antibody. Specifically, the antigen variable is immunized to the mouse, and the antibody variable region (V region) that binds to the antigen is excised from the mouse monoclonal antibody gene and bound to the antibody constant region (C region) gene derived from human bone marrow. Can be produced. For example, it can be produced by referring to the method described in JP-B-3-73280.
  • the monoclonal antibody according to the present invention can be obtained by a method well known to those skilled in the art (for example, Current Protocols in Molecular Biology JQohn Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Labora tory (1988)) 0
  • Examples of immunizing antigens include TARM protein or TARM-L protein fragments. Can be used. Alternatively, those synthesized based on the above amino acid sequences can be used.
  • the antigen may be used as a complex with a carrier protein.
  • various condensing agents can be used. Daltaraldehyde, carpositimide, maleimide active ester, etc. can be used.
  • Carrier proteins are usually used such as bovine serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin etc. Usually 1 ⁇
  • a method of coupling at a ratio of 5 times is used.
  • mice examples include mice, rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, and the inoculation method includes subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal administration.
  • the administration which can be mixed with complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant, is usually performed once every 2 to 5 weeks.
  • Spleen or lymph node strength of the immunized animal The antibody-producing cells obtained are fused with myeloma cells and isolated as a hyperidoma.
  • myeloma cells those derived from mice, rats, humans and the like are used, and those derived from the same species as antibody-producing cells are preferred.
  • Manipulation of cell fusion can be performed according to a known method, for example, Nature, 256, 495, 1975.
  • Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol and Sendai virus.
  • polyethylene glycol average molecular weight 1000 to 4000 having a concentration of 20 to 50% is used, and 20 to 40 ° C, preferably At a temperature of 30 to 37 ° C, the ratio of the number of antibody-producing cells to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 10: 1, and cell fusion can be performed by reacting for about 1 to 10 minutes. .
  • ELISA method using microplate coated with TARM protein or TARM-L protein
  • EIA method using microplate coated with anti-immunoglobulin antibody
  • electrophoresis of sample containing TARM protein nitrocellulose transfer membrane
  • nitrocellulose transfer membrane examples include V and Ruminoblot.
  • the antibody affects the function of TARM protein or TARM-L protein in screening for antibody-producing and bridolioma. It can be screened depending on whether or not.
  • the antibody of the first aspect according to the present invention affects the function of the TA RM protein, for example, whether or not the rod-shaped cells are activated by cross-linking stimulation of the TARM protein by the antibody of the first aspect according to the present invention ( Example 3)
  • the binding between the antibody and the TARM protein can inhibit the adhesion function between the TARM protein and the T cell (Example 6 and Example 11)
  • the antibody and the TARM protein Antibody-producing hyperpridoma can be screened on the basis of whether or not it has the ability to inhibit complex formation between the TARM protein and the FcR y chain by binding (Example 4).
  • the effect of the antibody of the second aspect according to the present invention on the function of the TARM-L protein for example, the binding of the TARM-L protein to the second aspect of the antibody according to the present invention and the TARM-L protein.
  • Antibody-producing hybridomas can be screened depending on whether the function of binding to proteins can be inhibited. By this screening method, an antibody that affects the function of TARM protein or TARM-L protein, which is a preferred embodiment of the antibody of the present invention, can be selected. Further, this screening may be performed as a secondary screening performed after the immunochemical method screening, which is selected based on the ability to produce an antibody that binds to the TARM protein or TARM-L protein.
  • Hypridoma is usually performed in a medium for animal cells (eg, RPMI1640) containing 10-20% fetal calf serum with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • the clones thus obtained can be transplanted into the abdominal cavity of SCID mice pre-administered with pristane, and ascites containing a high concentration of monoclonal antibody can be collected 10-14 days later and used as a raw material for antibody purification.
  • the clone can be cultured, and the culture can be used as a raw material for antibody purification.
  • Monoclonal antibodies can be purified using known methods for immunoglobulin purification. For example, ammonium sulfate fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method, use of anion exchanger, protein A column , Protein G column y, and affinity chromatography using TARM protein.
  • a "functional fragment” according to the present invention is a part (partial fragment) of an antibody, and is a tag of the present invention. It means something that specifically recognizes protein. Specifically, Fab, Fab ', F (ab'),
  • Fv Variable region fragment
  • scFv single chain antibody
  • Preference of the antibody of the first aspect according to the present invention U, for example, an antibody against the novel protein of the first aspect of the present invention and a functional fragment thereof.
  • antibodies of the first aspect according to the present invention U examples also include antibodies to the novel proteins of the second aspect according to the present invention and functional fragments thereof.
  • Preferred examples of the antibody of the first aspect according to the present invention further include antibodies against the following proteins.
  • ( ⁇ ′) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, one or more amino acids were inserted, substituted or deleted, or one or more amino acids were added to one or both ends.
  • a membrane protein or secreted protein comprising an amino acid sequence and having a function equivalent to that of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
  • ( ⁇ ') encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • SEQ ID NO: 12 comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence, and having the same function as the protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 12.
  • a membrane protein or secreted protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence, and having the same function as the protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 12.
  • More preferred examples of the antibody of the first aspect according to the present invention include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 having one or more conservative substitutions. Or an antibody to a secreted protein or a functional fragment thereof.
  • a specific example is a monoclonal antibody produced by a hybridoma commissioned under FERM BP-10376. [0072] Therefore, according to the present invention, on July 15, 2005, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, 305-8566, Ibaraki) FERM BP—Hybridoma deposited under 10376 (@TARM # 6.11) is provided.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or the amino acid represented by SEQ ID NO: 10 having one or more conservative substitutions is also included.
  • An antibody to a membrane protein or secreted protein comprising the sequence or a functional fragment thereof.
  • Preferred examples of the antibody of the second aspect according to the present invention include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a sequence represented by SEQ ID NO: 14 having one or more conservative substitutions. Examples thereof include an antibody against a membrane protein or secreted protein comprising a mino acid sequence or a functional fragment thereof.
  • Preferred examples of the antibody of the second aspect according to the present invention also include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 having one or more conservative substitutions. Or an antibody to a secreted protein or a functional fragment thereof.
  • the antibody of the second aspect according to the present invention include an antibody that recognizes a polypeptide portion expressed outside the TARM-L protein or a functional fragment thereof.
  • an antibody include, for example, at least 6 amino acid sequences of amino acids 1 to 159 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 and amino acids 1 to 158 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • Examples thereof include an antibody against a protein comprising an amino acid residue or an all-enforced polypeptide, or a functional fragment thereof.
  • ⁇ cells which are lymphocytes involved in the immune response, are known as cells having an antigen-presenting function for ⁇ cells! Are responsible for various immune responses (Kroczek, RA., Et al. (2004) Current Opinion in Immunology 16: 321-327).
  • TARM protein expression on rod cells by inflammatory stimuli Example 2
  • TARM protein stimulated by binding Example 5
  • IL-6 production was induced (Example 3).
  • Overproduction of IL 6 has been reported to be associated with autoimmune diseases (Ishihara. K., et al. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13: 357-368).
  • the antibody against TAR M protein significantly suppressed the adhesion between T cells and rod cells (Example 6 and Example 11).
  • the collagen-induced arthritis model is a model of rheumatoid arthritis, one of the autoimmune diseases.
  • the antibody of the first aspect according to the present invention is useful for the treatment of autoimmune diseases.
  • Examples of the autoimmune disease include rheumatoid arthritis.
  • the antibody against TARM-L protein suppresses adhesion between T cells and rod cells. Therefore, the antibody of the second aspect according to the present invention is useful for the treatment of autoimmune diseases.
  • an antibody according to the present invention for the manufacture of a therapeutic agent for an autoimmune disease.
  • a method for treating an autoimmune disease comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an antibody according to the present invention to mammals including humans.
  • the antibody against TARM protein significantly suppressed the adhesion between T cells and rod cells (Example 6 and Example 11). Therefore, the antibody of the first aspect according to the present invention can be used as a T cell adhesion inhibitor.
  • the antibody of the second aspect according to the present invention can be used as a T cell adhesion inhibitor.
  • T cell adhesion refers to adhesion between rod cells and rod cells, ie, TARM protein expressed on rod cells and TARM-L protein expressed on rod cells. Means a bond.
  • ⁇ cell adhesion inhibitor of the present invention to inhibit the binding between TARM protein expressed on rod cells and TARM-L protein expressed on T cells, interaction between rod cells and T cells It is possible to suppress the immune response generated by, for example, the activation, proliferation, differentiation, and cytodynamic inchemokine production of rod cells and T cells.
  • the mode of administration of the antibody according to the present invention is not particularly limited, and humans can be administered by any route of oral administration and parenteral administration (for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, topical administration). Parenteral administration, particularly intravenous injection is preferred.
  • Dosage forms for oral administration and parenteral administration and methods for producing the same are well known to those skilled in the art.
  • a conventional method is obtained.
  • the pharmaceutically acceptable carrier for example, a substance that is commonly used in the pharmaceutical field and does not react with the antibody according to the present invention is used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, commonly used excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring agents, and if necessary, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, interfaces.
  • Activators, pH adjusters, preservatives, antioxidants, extenders, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. can be used. In general, it is possible to formulate by a conventional method by blending ingredients used as raw materials for pharmaceutical preparations.
  • the dosage form for parenteral administration includes injectable preparations (for example, intravenous injection, intravenous injection, muscle injection, subcutaneous injection, intradermal injection), and external preparations (for example, ointment, And suppositories, ophthalmic preparations, eye ointments, nasal drops, ear drops, and ribosomes.
  • injectable preparations for example, intravenous injection, intravenous injection, muscle injection, subcutaneous injection, intradermal injection
  • external preparations for example, ointment, And suppositories, ophthalmic preparations, eye ointments, nasal drops, ear drops, and ribosomes.
  • an injectable preparation is usually prepared by dissolving the antibody according to the present invention in distilled water for injection. If necessary, a solubilizing agent, buffer, pH adjuster, isotonic agent, painless Agents, preservatives, stabilizers and the like can be added. It can also be made into a freeze-dried preparation for business preparation.
  • the dosage form for oral administration is a solid or liquid dosage form, specifically tablets, coated tablets, pills, fine granules, granules, powders, capsules, syrups, emulsions, suspensions. Agents, injections, troches and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further contain other therapeutically effective drugs, and if necessary, blood flow promoters, bactericides, anti-inflammatory agents, cell activators, vitamins Ingredients such as amino acids, humectants and keratolytic agents can also be added.
  • the ratio of the active ingredient to the carrier at this time can be varied between 1 to 90% by weight.
  • the dose of the antibody according to the present invention is determined according to pharmacology such as administration route, type of disease, degree of symptom, age, sex, body weight, severity of disease, pharmacokinetics and toxicological characteristics of the patient. Forces that can be determined by a clinician based on various factors, such as clinical findings, the availability of drug delivery systems, and the power to be administered as part of other drug combinations.
  • Per oral administration 1 to 5000 mgZ ⁇ , preferably 10 to 2000 mgZ days, more preferably 50 to 2000 mgZ days, and 1 to 5000 mgZ days, preferably 5 to 2000 mg / ⁇ , more preferably 50 for injection administration.
  • ⁇ 2000 mg / ⁇ can be administered in one or several divided doses. When administered to children, the dose may be less than that administered to adults.
  • the actual administration method used may vary greatly depending on the judgment of the clinician, and may deviate from the above-mentioned dose range.
  • a screening method for a substance that inhibits the adhesion between TARM protein and T cell is provided.
  • TARM protein is expressed on rod cells and is involved in the immune response interaction between rod cells and T cells.
  • the binding stimulation to TARM protein induces the production of IL-6, which causes autoimmune diseases. Therefore, the screening method of the first aspect according to the present invention can be used for screening a substance that inhibits the adhesion between TARM protein and T cell, and is preferably used for the treatment of autoimmune disease, more preferably rheumatoid arthritis. It can be used for screening of useful substances.
  • step (c) The method may further comprise a step of comparing the binding activity in the presence of the test substance with the binding activity in the absence of the test substance! /.
  • step (c) when the binding activity in the presence of the test substance is lower than the binding activity in the absence of the test substance, preferably 50% or less, the test substance Can be determined to inhibit the binding of the protein according to the present invention to T cells.
  • step (a) is not particularly limited as long as TARM protein and T cell are in direct contact with each other.
  • TARM protein is immobilized on a solid phase. This can be carried out by adding labeled T cells to the plate or adding labeled TARM protein to the plate containing T cells.
  • the T cells are preferably activated T cells, more preferably activated Th2 cells.
  • the binding activity can be measured according to a known method. For example, adding labeled T cells to a TARM protein-immobilized plate, culturing for a certain period of time, removing unadhered cells by washing, etc., and measuring the adhered cells to measure the binding activity. Can do.
  • Examples of the label include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances (including fluorescent proteins), luminescent substances, and the like.
  • the radioisotope for example, [], [ 14 C], [ 125 I], [ 35 S] and the like can be used.
  • the enzyme for example,
  • the fluorescent substance for example, fluorescein isothiocyanate, BODIPY, Calcein-AM (manufactured by Dojin) or the like, and as the fluorescent protein, for example, GFP or the like can be used.
  • These enzymes and fluorescent proteins can be expressed by introducing genes into cells.
  • the luminescent substance for example, luciferin, lucigenin, or the like can be used.
  • a biotin-avidin system can be used to bind the ligand and the labeling substance.
  • the T cells added without adhering to the T cells and adhering to the T cells are antibodies specific for T cells, such as anti-CD3 antibodies, or antibodies specific for helper T cells, such as anti-CD4. It can also be detected by an antibody.
  • the binding activity was measured in advance for the added cells, and the binding activity was measured against the added cells. It can be expressed as the percentage of cells that adhere.
  • a screening method for a substance that inhibits the activity of rod cells is provided.
  • the rod-like cells can be activated by the binding-stimulated TARM protein (Examples 3 and 4). Therefore, using a rod-like cell line stimulated by crosslinking with a TARM antibody, a substance that inhibits the rod-like cell activity can be screened.
  • the screening method for a substance that inhibits the activation of rod cells according to the present invention can be preferably used for screening a substance useful for the treatment of autoimmune disease, more preferably rheumatoid arthritis.
  • the TARM protein expressed on the rod-shaped cells is subjected to cross-linking stimulation, the rod-shaped cells are activated. At this time, the TARM protein forms a complex with the FcR ⁇ chain known as a signal transduction molecule. At the same time, it induces the production of IL-6, which causes autoimmune diseases, and MCP-1, a chemotactic factor for monocytes. Therefore, in the step ( e ) of the screening method according to the second aspect of the present invention, the degree of activity of the rod cells is measured using the production amount of IL-6 and Z or MCP-1 in the rod cells as an index. Alternatively, the degree of activity of rod cells can be measured using the expression level of FcR ⁇ chain in rod cells as an index.
  • step (f-1) IL 6 and Z or MCP-1 production in the presence of the test substance and IL-6 and Z or MCP 1 in the absence of the test substance
  • the method further includes a step of comparing the production amount.
  • step (f 1) the amount of IL-6 and Z or MCP-1 produced in the presence of the test substance is less than the amount of IL-6 and Z or MCP-1 produced in the absence of the test substance.
  • the test substance inhibits the activation of rod-shaped cells when it is preferably 50% or less.
  • the step (e) may further include (f 2) a step of comparing the expression level of the FcR y chain in the presence of the test substance with the expression level of the FcR ⁇ chain in the absence of the test substance! /.
  • step (f2) when the expression level of FcR ⁇ chain in the presence of the test substance is lower than the expression level of FcR ⁇ chain in the absence of the test substance, it is preferably 50% or less In some cases, it can be determined that the test substance inhibits the activity of rod-shaped cells.
  • step (d) is not particularly limited as long as it is an embodiment in which TARM protein power on the rod-shaped cell is cross-stimulated by the antibody according to the present invention.
  • the antibody according to the present invention It can be performed by culturing rod cells in a medium containing
  • step (e) protein production and expression can be measured according to known methods, but commercially available kits can also be used.
  • a screening method for a substance that inhibits complex formation between a TARM protein and an FcR ⁇ chain there is provided a screening method for a substance that inhibits complex formation between a TARM protein and an FcR ⁇ chain.
  • TARM protein is expressed on rod cells and forms a complex with FcR ⁇ chain, which is well known as a signal transduction molecule. It has also been suggested that FcR ⁇ chain increases its expression on the cell surface by forming a complex with TARM protein. Therefore, the screening method according to the present invention can be used for screening a substance that inhibits the complex formation between TARM protein and FcR ⁇ chain, and is preferably useful for the treatment of autoimmune diseases, more preferably rheumatoid arthritis. It can be used for screening of substances.
  • step (i) the expression level of FcR y chain in the presence of the test substance is compared with the expression level of FcR y chain in the absence of the test substance. It may further include a step of performing.
  • step (i) when the expression level of the FcR ⁇ chain in the presence of the test substance is lower than the expression level of the FcR ⁇ chain in the absence of the test substance, it is preferably 50% or less. Furthermore, it can be determined that the test substance inhibits complex formation between the protein according to the present invention and the FcR ⁇ chain.
  • "contacting" is not particularly limited as long as the TARM protein and the rod-shaped cells expressing the FcR y chain are in direct contact with the antibody of the present invention. For example, it can be performed by culturing rod-shaped cells in a medium containing the antibody according to the present invention.
  • step (h) the expression level can be measured using, for example, flow cytometry, which can be performed according to a known method.
  • test substance includes synthetic low molecular weight compounds, proteins, synthetic peptides, purified or partially purified polypeptides, antibodies, bacterial release substances (including bacterial metabolites), nucleic acids (antisense, Ribozyme, RNAi, etc.) are preferable, and preferred are compounds or salts thereof or solvates thereof (for example, hydrates), but are not limited thereto.
  • the “test substance” may be a new substance or a known substance.
  • TARM protein may be simply referred to as “TARM”
  • TA RM-L protein may be simply referred to as “TARM-L”.
  • mTARM a TARM protein derived from a mouse
  • hTARM a TARM protein derived from a human
  • Example 1 Isolation and expression analysis of mouse TARM gene
  • CD4 T cells isolated from mouse spleen were separated into Thl or Th2 by in vitro culture, and cDNA fragments used for drivers or testers were prepared from each, and the highly sensitive subtraction (N-RDA) method was performed.
  • N-RDA highly sensitive subtraction
  • PCR primers were designed as follows, and the expression of the mTARM gene in each mouse organ was examined.
  • mTARM F1 GTGACTTTGCAGTGCCAGAA (SEQ ID NO: 17)
  • mTARM Rl TGCACAGGAGTTGAGTGTCC (SEQ ID NO: 18)
  • PCR consists of the following reaction mixture (QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) 12.51, uracil DNA glycosylase (Invitrogen) 0.25 1, 100 M mTARM F primer 0.125 1, ⁇ M mT It was carried out with ARM R primer 0.125 1, vertical cDNA (10-fold dilution) 2.5 1 and distilled water 7. 25 1). PCR was performed at 94 ° C for 10 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds and 60 ° C for 1 minute. As a result, mTARM was expressed in the kidney.
  • cDNA double-stranded cDNA was synthesized from total RNA of mouse kidney using cDNA synthesis kit (manufactured by TAKARA), and purified using Qiaquick PCR purification kit (manufactured by QIAGEN).
  • an ad29 adapter (ad29S: acatcactccgt (SEQ ID NO: 19) and ad29A: acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct (third column 3 ⁇ 4 ⁇ No .: 20) was added to form a RACE cage.
  • PCR4 AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO: 21)
  • mTARM—RACE— 3, -4 GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO: 23)
  • PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 1 minute, 72 ° C for 5 minutes, and finally 72 ° C for 5 minutes. did.
  • 2 PCR was performed using the following reaction solution composition (lO X ExTaq buffer 51, 2.5 mM dN TP 4 ⁇ , ExTaq 0.25 1, 100 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ primer (5, PCR1) 0.5 1, 100 ⁇ Gene specific primer 0.5 ⁇ 1, 1 st PCR product (100-fold dilution) 1 1, distilled water 38. 75 1).
  • PCR1 GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG (SEQ ID NO: 24)
  • PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 25 cycles of reaction at 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 5 minutes, and finally the reaction at 72 ° C for 5 minutes. did.
  • the amplified cDNA fragment was cloned into pCR2.1 (Invitrogen), and the base sequence was determined using ABI3100 sequence analyzer (AppliedBiosystems).
  • PCR was carried out using the following reaction solution composition (10 XE xTaq knocker 51, 2.5 mM dNTP 41, ExTaq 0.25 ⁇ 1, 100 ⁇ 5, primer 0.51, 100 ⁇ 3, primer 0.5 1, cDNA (25-fold dilution) 1 ⁇ ⁇ , distilled water 38.75 ⁇ 1).
  • mTARM 3 'UTR-2 TTCAGTTATTTTACCAGGGTTTA (SEQ ID NO: 29) PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of reaction at 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 5 minutes, and finally the reaction at 72 ° C for 5 minutes. did.
  • Six types of splicing isoforms can be identified with two types of primer sets. As a result, amplification products were obtained in 5 out of 6 combinations of splicing isoforms.
  • the base sequence was determined using the ABI3100 sequence analyzer. It was determined.
  • mTARM_qF2 TCTGTGATAGACAACCATCT (SEQ ID NO: 30)
  • mTARM_qR2 GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO: 31)
  • mTARM— qF4 ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA (SEQ ID NO: 32)
  • mTARM_qR3 TCATTTTTCTCCTGGGGCAC (SEQ ID NO: 33)
  • RNA V ⁇ prepared from mouse organs using RNeasy mini kit (QIAGEN) was synthesized using RNA PCR kit (TAKARA) from purchased total RNA (Promega) Real-time PCR was performed on ABI7700 using the single-stranded cDNA as a cage.
  • PCR consists of the following reaction mixture (QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) 12.51, uracil DNA glycosylase (Invitrogen) 0.25 ⁇ 1, 100 F primer 0.125 1, 100 / z MR primer 0.125 1, vertical cDNA (10-fold dilution) 2.51, distilled water 7.25 ⁇ 1).
  • PCR was performed at 94 ° C for 10 minutes, and then a reaction was performed at 94 ° C for 30 seconds and at 60 ° C for 1 minute in 35 cycles.
  • the mTARM gene expression vector was prepared as follows.
  • mTARM F2 cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT (SEQ ID NO: 36)
  • mTARM R2 gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG (SEQ ID NO: 37)
  • RNA PCR kit manufactured by TAKARA
  • TAKARA RNA PCR kit
  • PCR consists of the following reaction mixture (10 X buffer 51, 2.5 mM dNTP 41, Pyrobest polymerase (manufactured by TAKARA) 0.5 1, 100 ⁇ primer 0.5 1 each, cDNA 1 1, DMSO 2 5 1, performed with distilled water 36 ⁇ 1).
  • PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 5 minutes, and finally the reaction at 72 ° C for 2 minutes. .
  • the amplified cDNA was cloned into pBlueScriptll SK (+) (Stratagene), and the base sequence was confirmed using an ABI3100 sequence analyzer.
  • the obtained cDNA fragment was inserted into an expression vector pMXII IRES EG FP (Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058) to prepare an mTARM gene expression vector.
  • pMXII IRES EG FP Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058
  • Transfusion solution is expressed in 600 ml of OPTI-MEM (GI BCO BRL) and 24 ⁇ 1 of TransIT LT1 (TaKaRa) mixed in a 5 ml tube and allowed to stand for 5 minutes at room temperature.
  • the vector 9ug and the packaging vector pCL—Eco (Imgenex) 9ug were added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 48 hours, the culture supernatant was collected and filtered through 0.45 um to obtain a recombinant virus solution.
  • This recombinant virus was infected with the B300.19 cell line (EMBO J. (1984) 3: 1209-121 9) as follows to prepare mTARM gene-expressing cells.
  • B300 Six 1 ⁇ 10 6 cells of 19 cells were added to a 15 ml tube, centrifuged at 1200 rpm at 25 ° C. for 5 minutes, and the culture supernatant was removed by aspiration.
  • Prepare cells by mixing 2 ml of recombinant virus solution with 2 ⁇ 1 of polybrene (lOmgZml) and 55 ⁇ ⁇ 2-mercaptoethanol 2 1, and centrifuge at 2500 rpm at 30 ° C for 2 hours to infect the cells. went.
  • the recombinant virus solution was removed, and the medium (RPMI-1640 / 10% FBS / 55uM 2-mercaptoethanol) was added and cultured.
  • the medium RPMI-1640 / 10% FBS / 55uM 2-mercaptoethanol
  • Neo vector was constructed as follows
  • Amplification was performed by PCR using 5 'primer with Hindlll and 3' primer with Xhol.
  • the obtained cDNA fragment was digested with Hindlll and Xhol and then inserted into PCDNA3.1 (+) — Neo vector from which the Sail site was deleted.
  • the extracellular region of mTARM consists of mTARM full-length cDNA in a saddle shape, with Sail attached, 5, primer (mTARM F2: (SEQ ID NO: 36)) and Notl attached, 3, primer.
  • mTARM-R3 cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat (Self column number: 38) was used for PCR amplification.
  • PCR consists of the following reaction mixture (10 X buffer 51, 2.5 mM dNTP 41, Pyrobest polymerase (manufactured by TAKARA) 0.5 1, 100 ⁇ primer 0.5 1 each, cDNA 1 1, DMSO 2 5 1, performed with distilled water 36 ⁇ 1). PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 5 minutes, and finally the reaction at 72 ° C for 2 minutes. . The amplified cDNA was cloned into pBlueScriptll SK (+) (Stratagene), and the base sequence was confirmed using an ABI3100 sequence analyzer. The obtained cDNA fragment was digested with Sail and Notl and then inserted into the pc DNA3.1 (+) -SEAP (His) —Neo vector to express mTARM—AP.
  • a vector was prepared.
  • AP chimeric protein The expression of the secreted chimeric protein (hereinafter referred to as AP chimeric protein)
  • the obtained AP chimeric protein expression vector was introduced into the 293 / EBNA-1 cell line using TransIT LT1 (TAKARA) and cultured for 4 to 5 days.
  • TAKARA TransIT LT1
  • Hepes pH 7.4
  • the concentration of the AP chimeric protein was calculated by measuring alkaline phosphatase activity using Aurora AP chemiluminescent repeater gene assay (ICN).
  • mTARM-AP chimeric protein was purified for use as an antigen for immunization.
  • the culture supernatant containing the mTARM—AP chimera protein is loaded onto a 1 ml HiTrap chelating HP column (Amersham Biosciences), washed with 10 mM imidazole solution, and then washed with 500 mM imidazole solution. Eluted from the column.
  • mTARM-AP Kime The concentration of rattan was calculated by enzyme activity measurement using Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay (ICN) and protein quantification using Protein Assay kit II (BIO-RAD).
  • the obtained mTARM-AP chimeric protein was mixed with TiterMax to immunize WKY rats (obtained from Japan SLC). Lymphocytes were isolated from the immunized rat, mixed so that the ratio of P3 myeloma cells (ATCC) to lymphocytes was 1: 5, and cell fusion was performed using a PEG1500 solution (Boehringer). Hybridomas were selected with HAT medium (Invitrogen), and the culture supernatant of the obtained hybridomas was screened by sandwich ELISA using mTARM-Fc chimeric protein. Cloning was performed from the positive humor, and three types of clones (# 6, # 21, # 37) were obtained.
  • mTARM- IRES- B300.19 cells transfected with EGFP were reacted with the prepared anti-mTARM antibody and analyzed by FACS.
  • the prepared antibody reacted only with B300.19 cells expressing EGFP (Fig. 4B), the specificity of the anti-mTARM antibody was confirmed.
  • Hybridomas producing the obtained anti-mTARM monoclonal antibodies # 6, # 21, and # 37 were inoculated into the peritoneal cavity of nude mice to obtain ascites, and the antibody was purified using a Protein G column.
  • the hybridoma producing the anti-mTARM monoclonal antibody # 6 was deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under FERM B P-10376.
  • mTARM protein Using the obtained monoclonal antibody (mAb), the expression of mTARM protein on the surface of cultured bone marrow-derived cells was examined.
  • Bone marrow-derived immature rod cells are suspended in FACS buffer (PBSZl% FB S / l mM EDTA) containing 5% mouse serum and reacted with antibody # 6 or antibody # 21 (10 / ⁇ 8 ⁇ 1) Then, it was reacted with a rabbit-labeled donkey anti-rat IgG secondary antibody (Jackson) and measured using a FACSCalibur (Becton Dickinson). As a result, both antibody # 6 and antibody # 21 showed a stronger positive reaction than the negative control rat IgG.
  • FACS buffer PBSZl% FB S / l mM EDTA
  • antibody # 6 was fluorescently labeled using an Alexa 647 monoclonal antibody labeling kit (Molecular Probe).
  • FACS buffer PBSZl% FBS / lmM EDTA
  • FcR blocking solution BD Pharmingen
  • mTARM protein is expressed in immature and mature rod cells
  • mTARM protein expression is increased in mature bone marrow rod cells compared to immature rod cells
  • activation marker It was revealed that mTARM protein expression was strong in cells expressing CD40 (Fig. 5).
  • CD3 positive T cells CD3 positive T cells, DX 5 positive NK cells, CD1 lb positive myeloid cells, CDl lc positive rod cells, and peripheral blood (P BL) in the spleen (SP)
  • P BL peripheral blood
  • mTARM protein was strong in any of B220-positive B cells, F4Z80-positive monocyte Z macrophages, SSC high / Grl-positive neutrophils, and SSC highZF4Z80-positive eosinophils (Fig. 6).
  • mTARM protein is expressed on peritoneal CD3-positive T cells, DX5-positive NK cells, CDllc-positive rod cells, B220-positive B cells, F4Z80-positive monocytes, Z macrophages, and SS C highZGrl-positive neutrophils.
  • a result of further analysis it was found that the mTARM protein was expressed in ckit-positive mast cells, since expression was observed in some CDl lb-positive myeloid cells. (Fig. 7).
  • mTARM protein is expressed in cultured rod cells Since expression is not observed in mouse immunity and terminal tissue rod cells, expression may be induced in vivo by inflammatory stimuli. It was. Therefore, 100 / zg LPS was intraperitoneally administered to C57BL / 6 male mice, and after 14 to 18 hours, cells were collected for mesenteric lymph node strength, and expression of mTAR M protein was analyzed.
  • mTARM protein is not expressed on the cell surface of normal rod cells in vivo, but is selectively expressed on rod cells, especially myeloid rod cells, during inflammation. Clearly, mTARM protein was suggested to function in rod cells during inflammation.
  • Bone marrow-derived immature rod cells or mature rod cells are divided into 350 cells with 1 X 10 8 cells. Suspend in S buffer (PBSZl% FBS / 2mM EDTA), add 50 ⁇ l of FcR blocking solution (Milt enyi) and react at 4 ° C for 10 minutes, then CD 11c microbeads (Miltenyi) 100 1 was added and reacted at 4 ° C for 30 minutes, and then CDllc positive cells were separated and purified using Auto MACS (Miltenyi) and adjusted.
  • anti-mTARM antibody induces IL-6 production of bone marrow-derived mature rod-like cells to the same extent as anti-CD40 antibody, and has an additive effect with anti-CD40 antibody.
  • Figure 9A immature rod cells tended to induce IL-6 production.
  • anti-mTARM antibody induced the production of MCP-1 from immature bone marrow rod cells, but no induction was observed with anti-CD40 antibody (FIG. 9B). Induction of MCP-1 production by anti-mTARM antibodies was not observed in mature bone marrow rod cells.
  • the ability to analyze IL-12, TNF ⁇ , IL-1 j8, IL-10, and KC production induction was not observed in mature bone marrow rod cells. It wasn't.
  • mTARM functions as an active receptor for rod cells, we tried to elucidate the signal transduction molecule.
  • mTARM is similar to Oscar, which is involved in osteoclast differentiation, and the transmembrane site is similar.
  • Oscar is known to form a complex with the FcR ⁇ chain, a signal transduction molecule that is well known as an IgE receptor, and this association is between the basic amino acids of the Oscar transmembrane domain and the FcR y chain. It is thought that the interaction of acidic amino acids is involved.
  • mTARM also has a basic amino acid in the transmembrane region.
  • Fc Similar to the R chain, DAP10 and DAP12 are known as active signaling molecules having acidic amino acids in the transmembrane region. Therefore, we examined whether FcR y chain, DAP10, or DAP12 could form a complex with mTARM.
  • the FcR y chain, DAP10, and DAP12 expression vectors are the following primers designed on the basis of GenBank TM NM-010185, AF072846, NM 011662
  • FcR ⁇ F cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT (SEQ ID NO: 39)
  • FcR ⁇ R gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT (SEQ ID NO: 40)
  • DAP 10 F: cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC (SEQ ID NO: 41)
  • a recombinant retrovirus was prepared in the same manner as the preparation of mTARM-expressing cells, infected with mTARM-expressing B300.19 cells, and cultured in the presence of puromycin to select infected cells.
  • the resulting B300.19 forced expression cells were suspended in FACS buffer (PBS / 1% FBS / lmM EDTA) and reacted with antibody # 6 and mouse anti-Flag antibody (Sigma) at a final concentration of gZml.
  • B300 19 Forced expression of cell lysate containing 1% digtonin (1% digtonin / 5 Solubilized with OmM Tris-HCl (pH 7.5) / 150 mM NaCl / 5 mM NaF / ImM orthovanadate / Complete TM (Roche)) and immunoprecipitated with anti-Flag antibody! Immunoblotting was performed with anti-mTARM antibody # 6.
  • bone marrow-derived mature rods were solubilized in a cell lysate containing 1% digtonin, and negative control rat IgG, anti-mTARM antibody # 21, anti-CD54 antibody and anti-Fc R y chain were used. Immunoprecipitation was performed with an antibody, and immunoblotting was performed with an anti-FcR y chain antibody.
  • Spider cells are known to interact with T cells as antigen-presenting cells. Therefore, a molecule that binds to mTARM was expressed on T cells, and the activity of rod cells was thought to be controlled via this molecule. Therefore, we examined whether mTARM-binding molecules exist on T cells.
  • the CD4 positive cells purified by MACS are suspended in a medium (RPMI1640 / 10% FBS / lmM sodium pyruvate Z55uM 2-mercaptoethanol) so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and anti-CD3 antibody (manufactured by eBiosdence) is added.
  • a medium RPMI1640 / 10% FBS / lmM sodium pyruvate Z55uM 2-mercaptoethanol
  • mice IL-2 (20ngZml) (Genzyme) and mouse IL-12 (lOngZml) were added under Thl conditions, and mouse IL-2 (20ngZml) and mouse IL-4 (1 under Th2 conditions). 5 ng Zml was cultured. It was confirmed that Thl cells were separated by IFN-y production and Th2 cells were separated by IL-4 production.
  • mTARM-binding molecules are not expressed on resting CD4 + T cells, but expression is induced on active CD4 + T cells (Fig. 12). ). The mTARM binding molecule was already expressed 2 days after stimulation and maintained after 8 days! After 8 days, when mTARM-binding molecules were expressed in both Thl and Th2, the expression in Th2 cells was stronger than that in Thl cells, and a tendency was observed (Fig. 12).
  • Activated T cells after 6 to 9 days after stimulation are suspended in cell adhesion buffer (RPMI1640Z0.5% BSA / 20 mM HEPES (pH 7.4)) and fluorescently labeled with Calcein-AM (manufactured by Dojin) 5 IX 10 per well was added and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • remove non-adherent cells by washing, add cell lysate (10 mM Tris—HCl (pH 8.0) / 1% TritonX — 100), and then use Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer). Then, measurement was performed at an excitation wavelength of 485 nm and a detection wavelength of 535 nm, and adherent cells were quantified. The degree of cell adhesion was expressed as a percentage of the adhered cells to the added cells.
  • mTARM functions as an adhesion molecule for activated T cells (Fig. 13). Both Thl cells and Th2 cells showed adhesion activity to mTARM, but the adhesion activity of Th2 cells to mTARM was higher than that of Thl cells.
  • Example 7 The therapeutic effect of the pile TARM pile body in the collagen-induced bonsai flame model
  • Collagen-Induced Arthritis (CIA) model is related to autoimmunity. It is a disease model of rheumatoid arthritis, and CD4 positive T cells and antibodies that react with type II collagen are detected, and it is considered that both cause arthritis in cooperation. In the CIA model, it is said that MHC class II is restricted. TARM is an activation molecule expressed in rod cells and induces cell adhesion of activated rod cells via TARM binding molecules. Therefore, by inhibiting the interaction between rod cells and activated rod cells with anti-TARM antibodies, it was possible to suppress the immune response involving rod cells and activated T cells. Therefore, we examined the therapeutic effects of anti-TARM antibodies in the CIA model.
  • Emulsion was prepared by mixing an equal volume of 3% type II collagen solution from collagenous joints (manufactured by a collagen technology training company) and complete Freund's adjuvant (manufactured by Difco). 100 1 (150 ⁇ gZ) per animal was obtained from Charles River Co., Ltd., and immunized in the buttocks skin on day 21 (primary immunization) and day 0 (boost immunization). Anti-mTARM antibody # 6 was administered to the tail vein twice a week at 500 gZl from the booster immunization. From the third day after booster immunization, body weight measurement and appearance evaluation were performed, and the animals were sacrificed on the 13th day. Appearance findings were scored and evaluated as follows. 0: Non-onset, 1: Erythema and mild swelling at the ankle or ankle joint, 2: Mild from erythema and ankle to ankle! 4: Erythema and severe swelling of the entire ankle, foot, and fingers.
  • SAA serum amyloid A
  • the concentration of SAA in plasma was measured by diluting plasma 8000 times and using an ELISA kit (Biosource).
  • the primer is designed based on the sequence of the region encoding the TARM protein and the full-length sequence is designed.
  • cDNA was isolated o
  • hTARM F1 TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO: 45)
  • hTARM R1 TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO: 46)
  • RNA PCR kit (TAKARA) from total RNA of human organs (Clontech) Real-time PCR was performed with ABI7700 using the single-stranded cDNA synthesized in this way as a saddle.
  • PCR consists of the following reaction mixture (QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAG EN) 12.5 ⁇ 1, Uracil DNA Glycosylase (Invitrogen) 0.25 1, 10 O ⁇ MF primer 0.125 1, ⁇ ⁇ R primer 0.125 1, vertical cD NA (10-fold dilution) 2.5 1, distilled water 7. 25 1). PCR was performed at 94 ° C for 10 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds and 60 ° C for 1 minute.
  • double-stranded cDNA was synthesized from total bone marrow RNA using a cDNA synthesis kit (TAKARAs), and cDNA was purified using a Qiaquick PCR purification kit (Qiagen).
  • an ad29 adapter was added to make a RACE saddle.
  • 1 st PCR consists of the following reaction composition (lO X ExTaq buffer 5 1, 2.5 mM dNTP 41, ExTaq 0.25 1, 100 M primer (5, PCR4) 0.5 1, 100 M Gene specific primer 0 5 1, cDNA with ad29 adapter added (25-fold dilution) 1 ⁇ 1, distilled water 38.7 5 1).
  • PCR4 AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO: 21)
  • PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 1 minute, 72 ° C for 5 minutes, and finally 72 ° C for 5 minutes. did.
  • h29B140 Fl TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO: 49) or h29B140 R1: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO: 50)
  • the amplified cDNA fragment is pCR2
  • h29B140_SalI-Kozac_F cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTT
  • h29B140 Notl—R: cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC (SEQ ID NO: 52)
  • PCR was performed using single-stranded cDNA synthesized from bone marrow total RNA using RNA PCR kit (manufactured by TAKARA) as a saddle.
  • PCR consists of the following reaction composition (10 X buffer 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP 41, Pyrobest polymerase (manufactured by TAKARA) 0.5 ⁇ 1, 100 ⁇ primer 0.5 1 each, cDNA 1 1, DMSO 2.5 1 and distilled water 36 ⁇ 1).
  • PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 5 minutes, and finally the reaction at 72 ° C for 2 minutes. .
  • the amplified cDNA was cloned into pBlueScriptll SK (+) (Stratagene), and the nucleotide sequence was determined using an ABI3100 sequence analyzer.
  • the base sequence of the obtained hTARM cDNA was in agreement with the sequence determined by RACE (SEQ ID NO: 9).
  • SEQ ID NO: 10 the amino acid sequence encoded by hTARM cDNA, a signal sequence necessary for functioning as a cell membrane protein was present at the N-terminus.
  • hTARC and XM 497642 amino acid encoding In the sequence (LOC441864) the N-terminus and C-terminus were different. Therefore, it was clarified that the estimated cDNA sequence XM-497642 does not actually exist and the hTARM cDNA is an actual gene encoding the cell membrane protein hTARM (FIG. 19).
  • the human TARM gene expression vector was prepared by inserting the hTARM cDNA obtained in Example 8 into the expression vector pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058).
  • a recombinant retrovirus was produced as follows.
  • 293 / EBNA-1 cell line (manufactured by Invitrogen) 3xl0 6 cells were suspended in a medium (D-MEMZlO% FB S), seeded in a 10 cm dish, and cultured in a CO incubator for 24 hours. Next day
  • Transfusion solution is expressed in 600 ml of OPTI-MEM (GIB CO BRL) and 24 ⁇ 1 of TransIT LTl (TaKaRa) in a 5 ml tube and left to stand for 5 minutes at room temperature.
  • a vector 9 ⁇ g and a packaging vector pCL-Eco (manufactured by Imgenex) 9 ⁇ g were added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 48 hours, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 m filter to obtain a recombinant virus solution.
  • the B300.19 cell line was infected with this recombinant virus as follows to prepare hTARM gene-expressing cells.
  • Six B300.19 cells lxlO were added to a 15 ml tube, centrifuged at 1200 rpm at 25 ° C. for 5 minutes, and the culture supernatant was removed by aspiration.
  • 2 ml of the recombinant virus solution was mixed with polybrene (lOmgZml) 2 55 ⁇ 2-mercaptoethanol 21 and mixed, followed by centrifugation at 2500 rpm at 30 ° C for 2 hours for infection.
  • HTARM-expressing cells were obtained by separating EGFP-positive cells by cell sorting.
  • hTARM The extracellular region of hTARM is a hTARM full-length cDNA in a vertical shape with Sail attached 5 ' Primer (h29B140—Sail— Kozac— F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAG CTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO: 51)) and Notl attached 3.
  • PCR consists of the following reaction mixture (10 X buffer 51, 2.5 mM dNTP 41, Pyrobest polymerase (manufactured by TAKARA) 0.5 1, 100 ⁇ primer 0.5 1 each, cDNA 1 1, DMSO 2 5 1 and distilled water 36 ⁇ 1). PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 5 minutes, and finally 72 ° C for 2 minutes. . The amplified cDNA was cloned into pBlueScriptll SK (+) (Stratagene) and the nucleotide sequence was confirmed using an ABI3100 sequence analyzer. After digesting the obtained cDNA fragment with Sail and Notl, the pcDNA3.1 (+) — SEAP (His) —Neo vector described in Example 2 was used.
  • AP chimeric protein secreted chimeric protein
  • the obtained AP chimeric protein expression vector was introduced into 293 / EBNA-1 cell line using TransIT LT1 (manufactured by TAKARA), and cultured for 4 days for 5 days.
  • AP chimera protein secreted into the culture supernatant is collected by centrifugation, filtered through a 0.22 m filter, and then Hepes (pH 7.4) and sodium azide, respectively.
  • the final concentration was 20 mM and was stored at 4 ° C. so as to be 0.02%.
  • the concentration of the AP chimeric protein was calculated by measuring the alkaline phosphatase activity using Aurora AP chemiluminesce reporter gene assay (ICN).
  • hTARM-AP chimeric protein was purified for use as an antigen for immunization.
  • hTARM Culture supernatant containing AP chimeric protein was added to an lml HiTrap chelating HP column (Amersham Bioscien After washing with 10 mM imidazole solution, the hTARM-AP chimeric protein was eluted from the column with 500 mM imidazole solution. The degree of hTARM-AP chime phenoprotein is measured by enzyme activity measurement using Aurora AP cnemilumme scent reporter gene assay (ICN) and protein quantification using Protein Assay kit II (BIO-RAD). Calculated.
  • CD4 positive cells purified by MACS were treated with PE-labeled mouse anti-human CD25 antibody (Miltenyi) and FITC-labeled mouse anti-human CD4 antibody (Miltenyi) each at 1 ° C and reacted at 4 ° C for 20 minutes.
  • CD4 positive CD25 negative T cells were obtained using FACS Aria (BD Biosciences).
  • CD4 positive CD25 negative T cells were activated using T Cell Activation / Expansion Kit human (Miltenyi). From day 3 after stimulation, human IL-2 (2 ng / ml) was added, and after activation, CD4 positive T cells on the 6th and 8th days after stimulation, hTARM-AP chimeric protein was activated against activated T cells. Functions as an adhesion molecule We examined whether it was possible.
  • Activated T cells were suspended in a cell adhesion buffer (RPMI1640Z0.5% BSA / 20 mM HEPES / 55 nM 2ME (pH 7.4)) and fluorescently labeled with Calcein-AM (manufactured by Dojin). Four 5xl0 per well were added and reacted at 37 ° C for 1 hour. Remove non-adherent cells by washing, add cell lysate (10 mM Tris—HCl (pH 8.0) / 1% TritonX—100), and then use Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer). Then, measurement was performed at an excitation wavelength of 485 nm and a detection wavelength of 535 nm, and adherent cells were quantified. The degree of cell adhesion was expressed as a percentage of the adhered cells to the added cells.
  • hTARM functions as an adhesion molecule for activated human T cells (Fig. 20).
  • anti-hTARM antibody # 11, # 18, # 19, # 22, # 26, # 40 in each well
  • 10 gZml was added and pretreated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, activated T cells labeled with fluorescence were added, and cell adhesion activity in the presence of each antibody was examined.
  • Anti-IgG2a antibodies were used as controls for # 11, # 19, # 26, and # 40, and anti-IgG2b antibodies were used for # 18 and # 22.
  • mTARM-L mTARM Ligand
  • mTARM-binding molecules Since mTARM-binding molecules exist on activated T cells (Example 5), mTARM-binding molecules are also present in mouse immune cell-derived cell lines (L5178Y—R cell line, BW5147 cell line, Raw264.7 cell line). The presence or absence of force was examined using the method described in Example 5.
  • ENSMUSG00000035095 A530065I17Rik, NM_176953 (primer # 2558: CAGCTGGCAAGAGGAACAGT (SEQ ID NO: 54), # 2559: using GAGCATCGGCACTTATCTCC (SEQ ID NO: 55)) is an mTAR M-AP chimeric protein cell A pattern correlating with the activity of binding to the protein was shown (FIG. 22B). However, the amino acid sequence encoded by ENSMUSG00000035095 did not have a transmembrane region, and was thought to function as a cell membrane protein.
  • This amino acid sequence is a putative sequence, and it was thought that the estimation of the cDNA sequence of the genome sequencing ability was wrong. Therefore, first, identification of a human homologous gene product was attempted, and a database search was performed using the amino acid sequence encoded by ENSMUS G00000035095. As a result, the human amino acid sequence LOC196264 having high homology with the amino acid sequence encoded by ENSMUSG00000035095 was found. This amino acid sequence exhibited a cell membrane protein containing one immunoglobulin loop structural region. Therefore, LOC196264 was considered to be the full-length human amino acid sequence of the T ARM-L candidate. Next, a tblastn search of the database was performed using the amino acid sequence of LOC196264.
  • mouse B A region encoding a sequence homologous to the amino acid sequence of LOC 196264 was found in the genomic base sequence of AC clone AC 122305. Based on this sequence, the cDNA sequence and amino acid sequence of mouse TARM-L candidate are deduced and primer number: 56)
  • cDNA encoding the full-length protein was isolated.
  • Thl day2 total RNA was used, and cDNA was amplified by the method described in Example 1. Insert the amplified cDNA into the expression vector pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058) to create an mTARM-L candidate gene expression vector and use the ABI3100 sequence analyzer. The base sequence was determined (SEQ ID NO: 13).
  • mTARM-L candidate is an unknown ligand for TARM
  • cells expressing this molecule were prepared by the method described in Example 2.
  • the binding activity of mTARM-AP chimeric protein on the cell surface of mTARM-L candidate expression cells and the adhesion activity of mTARM-L candidate expression cells to solid-phased mTARM were measured by the method described in Example 5.
  • mTARM-AP did not bind to B300.19 cells transfected with an EGFP-positive control vector ( Figure 22A), which specifically binds to EGFP-positive mTARM-L-expressing B300.19 cells. ).
  • Negative control AP did not bind to EGFP positive mTARM L expressing B300.19 cells (FIG. 22A).
  • hTARM— L is the base of NM 198275 encoding the amino acid sequence of LOC196264 Primer based on sequence number: 58)
  • cDNA encoding the full-length protein was isolated. Bone marrow total RNA was used as a template, and cDNA was amplified by the method described in Example 1. Insert the amplified cDNA into the expression vector pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058) to create a TARM-L gene expression vector and use the ABI3100 sequence analyzer. The nucleotide sequence was determined (SEQ ID NO: 15).
  • FIG. 23 shows the results of homology analysis of human and mouse TARM-L using ClustalW.
  • hTARM-L was 235 amino acids
  • mTARM-L was 237 amino acids
  • the homology was 86%.
  • the homology of mTARM m3 (293 amino acid), which has the highest homology with hTARM (271 amino acids) was 50% (Fig. 24).

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Abstract

　本発明は、樹状細胞上に発現するＴ細胞接着分子の提供を目的とする。本発明によれば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質が提供される。

Description

T細胞接着分子およびそれに対する抗体
発明の分野
[0001] 本発明は、骨髄由来の榭状細胞上に発現する Τ細胞接着分子およびその遺伝子 、並びに Τ細胞上に発現する、該接着分子 (受容体）に対するリガンドおよびその遺 伝子に関する。本発明はまた、該接着分子または該リガンドに対する抗体およびそ の用途に関する。本発明はさらに、該接着分子を利用したスクリーニング方法に関す る。
背景技術
[0002] 近年、 Τ細胞上に発現する榭状細胞活性化因子としてクローユングされていた分子 力 破骨細胞の分ィ匕を制御する中心的なサイト力インであることが報告されたことをは じめ（Yasuda,H.， et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:3597-3602)、免疫系と骨代 謝が密接に関係していることが明らかになつてきた。
[0003] 免疫系制御分子による骨代謝の制御に関する研究は急速に進み、破骨細胞分ィ匕 の制御に関わるシグナル伝達にっ ヽても解明が進んできて 、る。
[0004] 例えば、破骨細胞の分化に関与する分子として、 Oscar (Osteoclast- associated re ceptor)が知られている。 Oscarは免疫グロブリン様受容体であり、 FcR y鎖と会合し
、 FcR y鎖の ITAMモチーフを介してホスホリパーゼ にシグナルを伝達すること がこれまでに報告されている（Kim,N.， et al.(2002)J Exp Med 195:201-209)。
[0005] また、榭状細胞上に発現し、 T細胞と接着して、 T細胞と榭状細胞との間の免疫応 答に関する相互作用に関与する分子としては、 CD80— CD28、 CD40— CD40L、
ICAM1— LFA1など様々な相互作用が報告されて 、る。
発明の概要
[0006] 本発明者らは今般、サブトラクシヨン法により骨髄由来の榭状細胞上に特異的に発 現する遺伝子を同定した。本発明者らはまた、該遺伝子にコードされるタンパク質が I gE受容体である FcR y鎖と結合すること、 LPS刺激により該タンパク質の発現が増 強されること、該タンパク質への抗体架橋刺激により榭状細胞が活性化すること、該 タンパク質が T細胞への接着機能を有すること、該タンパク質に対する抗体が関節リ ゥマチの疾患モデルであるコラーゲン誘導関節炎モデルに対して治療効果を有する ことを見出した。本発明者らはさらに、 τ細胞上に発現する、該タンパク質に対するリ ガンドの遺伝子を同定した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
[0007] 本発明によれば、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6または配列番号： 8で表 されるアミノ酸配列、あるいは 1または複数個の保存的置換を有する配列番号： 2、配 列番号： 4、配列番号： 6または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タ ンパク質または分泌タンパク質 (以下、本発明による第一の態様の新規タンパク質と いう）が提供される。
[0008] 本発明によれば、以下の (i)、 (ii)、 (iii)、および (iv)力も選択される、膜タンパク質 または分泌タンパク質 (以下、本発明による第二の態様の新規タンパク質という）が提 供される：
(i)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパ ク質；
(ii)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入 、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされたアミノ酸配列 を含んでなり、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の 機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
(iii)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または 分泌タンパク質;および
(iv)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と 90%以上の同一性を有するアミノ酸配 列を含んでなり、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等 の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
[0009] 本発明によれば、本発明による第一の態様および第二の態様の新規タンパク質を コードするポリヌクレオチドが提供される。
[0010] 本発明によればまた、以下の (V)、 (vi)、 (vii)、および (viii)力も選択される、ポリヌ クレオチドが提供される：
(V)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
(vi)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドにお 、て、 1また は複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端 への 1または複数個のヌクレオチドの付加がなされ、かつ配列番号： 10で表されるァ ミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク 質をコードするポリヌクレオチド；
(vii)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとストリンジェント な条件でハイブリダィズし、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列力 なるタンパ ク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレ ォチド；および
(viii)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと 90%以上の同 一性を有し、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の 機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[0011] 本発明によれば、以下の ）、（x)、（xi)、および (xii)から選択される膜タンパク質 または分泌タンパク質（以下、 TARM (T cell-interacting Activating Receptor on My eloid cells)タンパク質と呼ぶことがある）に対する抗体およびその機能的断片（以下、 本発明による第一の態様の抗体と!/、う)が提供される。
[0012] (ix)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク 質；
(X)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または配 列番号： 12で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、置換 または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸の付加が なされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、 配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
(xi)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2、配列 番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表される アミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タン パク質;および
(xii)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
[0013] 本発明によれば、以下の (xiii)、 (xiv)、（xv)、および (xvi)力 選択される、本発 明による新規タンパク質のリガンドとなる新規リガンドタンパク質 (以下、本発明による 新規リガンドタンパク質、または TARM— L (TARM ligand)タンパク質と呼ぶこと 力 Sある）が提供される：
(xiii)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパ ク質；
(xiv)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列において、 1または 複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付 加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(xv)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ 、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と 同等の機能を有するタンパク質；および
(xvi)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一 性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表さ れるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
[0014] 本発明によれば、本発明による新規リガンドタンパク質をコードするポリヌクレオチド が提供される。
[0015] 本発明によればまた、以下の（xvii)、 (xviii)、 (xix)、および (xx)力も選択される、 ポリヌクレオチドが提供される：
(xvii)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレ ォチド；
(xviii)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌク レオチドにおいて、 1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいは その一方または両末端への 1または複数個のヌクレオチドの付カ卩がなされ、かつ配列 番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機 能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(xix)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレ ォチドとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ配列番号： 14または配列番号 : 16で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド；および
(xx)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレ ォチドと 70%以上の同一性を有し、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表され るアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌ クレオチド。
[0016] 本発明によれば、本発明による新規リガンドタンパク質に対する抗体およびその機 能的断片 (以下、本発明による第二の態様の抗体と!/ヽぅ）が提供される。
[0017] 本発明によれば、本発明による第一の態様および第二の態様の抗体 (以下、これら を併せて、「本発明による抗体」と呼ぶことがある)またはそれらの機能的断片を有効 成分として含んでなる、自己免疫疾患治療剤および T細胞接着阻害剤が提供される
[0018] 本発明によれば、以下に示すスクリーニング方法が提供される。
本発明による第一の態様のスクリーニング方法によれば、下記工程：
(a)被験物質の存在下および非存在下にお!/、て、 TARMタンパク質と T細胞とを接 触させる工程;および (b) TARMタンパク質と T細胞との接着活性を測定する工程
を含んでなる、 TARMタンパク質と Τ細胞との接着を阻害する物質もしくはその塩ま たはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法が提供される。
[0019] 本発明による第二の態様のスクリーニング方法によればまた、下記工程：
(d)被験物質の存在下および非存在下にお!/、て、本発明による抗体またはその機能 的断片と榭状細胞とを接触させる工程;および
(e)前記榭状細胞の活性化の程度を測定する工程
を含んでなる、榭状細胞の活性ィ匕を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶 媒和物のスクリーニング方法が提供される。
[0020] 本発明による第三の態様のスクリーニング方法によればまた、下記工程：
(g)被験物質の存在下および非存在下にお 、て、本発明による抗体またはその機能 的断片と榭状細胞とを接触させる工程;および
(h)前記榭状細胞における FcR γ鎖の発現量を測定する工程
を含んでなる、 TARMタンパク質と FcR γ鎖との複合体形成を阻害する物質もしくは その塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]マウス TARM遺伝子（ml〜4および si)のアミノ酸配列を示した図である。下線 はィムノグロブリン (IG)ループ構造部分を表し、太字は膜貫通部分を表す。
[図 2]マウス組織における TARMの mRNA発現を、プライマーセット 1を用いてリアル タイム PCRにより解析した結果を示した図である。
[図 3]各種細胞における TARMの mRNA発現を、プライマーセット 1を用いてリアル タイム PCRにより解析した結果を示した図である。
[図 4]Aは、抗 TARMタンパク質抗体の作製に用いられる細胞外領域の構造および アミノ酸番号を示した図である。 Bは、該抗体の TARMタンパク質に対する特異性に っ 、て検討した結果を示した図である。
[図 5]骨髄由来榭状細胞におけるマウスタンパク質の発現について解析した結果を 示した図である。
[図 6]正常マウスの免疫組織由来細胞におけるマウスタンパク質の発現について解 祈した結果を示した図である。
圆 7]c— kit陽性腹腔肥満細胞におけるマウスタンパク質の発現について解析した 結果を示した図である。
[図 8]LPS炎症刺激によるマウスリンパ節由来細胞におけるマウス TARMタンパク質 の発現について解析した結果を示した図である。矢印はマウス TARMタンパク質の 発現を示す。
[図 9]Aは、抗 TARMタンパク質抗体刺激による、成熟骨髄榭状細胞からの IL— 6の 産生の誘導について示した図である。 Bは、抗 TARMタンパク質抗体刺激による、未 熟骨髄榭状細胞からの MCP— 1の産生の誘導について示した図である。
[図 10]マウス TARMタンパク質の細胞表面上への発現の増加に伴う FcR γ鎖の増 加につ 、て示した図である。
[図 11]マウス TARMタンパク質と FcR γ鎖の複合体形成を免疫沈降法により解析し た結果を示した図である。
[図 12]活性化 Τ細胞におけるマウス TARMタンパク質に結合する分子の発現解析し た結果を示した図である。
[図 13]活性化 T細胞のマウス TARMタンパク質に対する接着能について示した図で ある。
[図 14]抗マウス TARMタンパク質抗体による Th2細胞のマウス TARMタンパク質へ の接着の阻害を示した図である。
[図 15]抗マウス TARMタンパク質抗体を投与されたコラーゲン誘導関節炎モデルに おける外見的所見および体重の経時的変化を示した図である。
[図 16]コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中の血清アミロイド A濃度に対する抗マウ ス TARMタンパク質抗体投与の効果を示した図である。
圆 17]コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中の抗コラーゲン抗体価に対する抗マウ ス TARMタンパク質抗体の投与の効果を示した図である。
[図 18]ヒト組織における TARMタンパク質の mRNA発現を、リアルタイム PCRにより 解析した結果を示した図である。
[図 19]ヒト由来の TARMタンパク質のアミノ酸配列を示した図である。下線はィムノグ ロブリン (Ig)ループ構造部分を表し、太字は膜貫通部分を表す。また、囲み部分は、 hTARMと LOC441864の間で相違する配列を表す。
[図 20]活性化 T細胞のヒト TARMタンパク質に対する接着能、および抗ヒト TARMタ ンパク質抗体による T細胞のヒト TARMタンパク質への接着の阻害を示した図である [図 21]Aは、マウス細胞株におけるマウス TARMタンパク質に結合する分子の発現 を解析した結果を示した図である。 Bは、マウス細胞株における mTARM— L候補分 子である ENSMUSG00000035095の mRNA発現を、リアルタイム PCRにより解 祈した結果を示した図である。
[図 22]Aは、マウス TARM— APキメラタンパク質の、 mTARM— L発現 B300. 19 細胞への特異的な結合を示した図である。 Bは、 mTARM— L発現 B300. 19細胞 の、マウス TARM— APキメラタンパク質への特異的な細胞接着を示した図である。
[図 23]ヒトおよびマウス TARM— Lタンパク質の相同性を解析した結果を示した図で ある。
[図 24]ヒト TARMタンパク質およびマウス TARMタンパク質（m3)の相同性を解析し た結果を示した図である。
発明の具体的な説明
[0022] 以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示で あり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使 用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術 分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態 様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発 明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細 書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特 許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いること ができる。
[0023] if規タンパク質およびポリヌクレオチド]
本発明において同定した骨髄由来の榭状細胞上に特異的に発現する遺伝子のう ちマウス由来の遺伝子には 5種のアイソフォームが存在する。マウス由来の遺伝子の ァイソフォームとしては、膜結合型タンパク質 (膜タンパク質)の遺伝子として ml、 m2 、 m3、および m4が、分泌型タンパク質 (分泌タンパク質）の遺伝子として siが、それ ぞれ挙げられる。それぞれのァイソフォームの塩基配列およびアミノ酸配列は下記の 配列番号と対応する。
ml：配列番号： 11および 12
m2 :配列番号： 1および 2
m3 :配列番号： 3および 4
m4 :配列番号： 5および 6
si :配列番号： 7および 8
[0024] 本発明において同定した骨髄由来の榭状細胞上に特異的に発現する遺伝子のう ちヒト由来の遺伝子としては、 1種類の膜タンパク質の遺伝子が挙げられる。この遺伝 子の塩基配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号： 9および 10に記載される。
[0025] 本発明にお 、て同定した遺伝子の塩基配列はシグナルペプチドをコードするため 、該遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質または分泌タンパク質を形成 する。本発明による膜タンパク質は、その C末端を改変することにより（例えば、膜貫 通部分を削除することにより）、分泌タンパク質とすることができる。本発明による分泌 タンパク質は、その C末端を改変することにより（例えば、膜貫通部分を付加すること により）、膜タンパク質とすることができる。
[0026] 本願明細書において、「アミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、 置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付カ卩がなされた」および「ポリ ヌクレオチドにおいて、 1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、ある いはその一方または両末端への 1または複数個のヌクレオチドの付カ卩がなされた」と は、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ 得る程度の複数個の数のアミノ酸あるいはヌクレオチドの置換等により改変がなされ たことを意味する。アミノ酸およびヌクレオチドの改変の個数は、例えば 1〜30個、好 ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜2個であることができる。 [0027] 改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、 1または複数個（好ましくは 1 または数個あるいは 1、 2、 3、または 4個）の保存的置換を有するアミノ酸配列である ことができる。
[0028] 改変塩基配列は、好ましくは、その塩基配列が、 1個または複数個（例えば、 1個な いし数個あるいは 1、 2、 3、または 4個）の、配列番号： 10で表されるアミノ酸配列から なるタンパク質の機能に影響を与えない変異を有する塩基配列であることができる。
[0029] 本願明細書にぉ 、て「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しな 、 ように、 1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換 えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場 合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙 げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に 当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸とし ては、ァラニン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フエニノレアラ ニン、メチォニンなどが挙げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、ス レオニン、チロシン、グルタミン、ァスパラギン、システィンなどが挙げられる。陽電荷 をもつ（塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。 また、負電荷をもつ（酸性)アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げ られる。
[0030] 本願明細書にお!、て「ハイブリダィズする」とは、ストリンジ ントな条件下で標的ポリ ヌクレオチドにハイブリダィズすることを意味する。具体的には、 FASTA、 BLAST, Smith- Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトゥェ ァにより、デフォルト (初期設定)のノ ラメーターを用いて計算したときに、標的ヌクレ ォチド配列と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さ らに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、 そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また 、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダィゼーシヨン緩 衝液中で、温度が 40°C〜70°C、好ましくは 60°C〜65°Cなどで反応を行い、塩濃度 力 Sl5〜300mmolZL、好ましくは 15〜60mmolZLなどの洗浄液中で洗浄する方 法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適 宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダィズしたものを洗浄するときの条件は
、0. 2または 2 X SSC、0. 1%SDS、温度 20— 68°Cで行うこと力 Sできる。ストリンジェ ント（high stringency)な条件にするかマイルド（low stringency)な条件にするかは、洗 浄時の塩濃度または温度で差を設けることができる。塩濃度でハイブリダィズの差を 設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー（high stringency wash buffer)として 0 . 2 X SSC、 0. 1%SDS、マイルド洗浄バッファー（low stringency wash buffer)として 2 X SSC、 0. 1%SDSで行うことができる。また、温度でハイブリダィズの差を設ける 場合には、ストリンジヱントの場合は 68°C、中等度（moderate stringency)の場合は 4 2°C、マイルドの場合は室温（20— 25°C)でいずれの場合も 0. 2 X SSC、0. 1 %SD Sで行えばよい。
[0031] 通常、プレハイブリダィズを実施する場合にはハイブリダィズと同じ条件で実施する 力 ハイブリダィズとプレ（予備)洗浄は同じ条件で行うとは限らない。
[0032] ノ、イブリダィゼーシヨンは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライ ブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる
[0033] 本願明細書にぉ 、て、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列にっ 、て「同一性」（相 同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミ ノ酸残基あるいはヌクレオチド残基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギヤ ップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7 26-730 (1983))。相同性の計算には、市販のソフトである BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、 FASTA(Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69 ( 1990))、 Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)等の相同性検索ソフトゥェ ァを用いることができる
「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出 される数値であればよぐ例えば全米バイオテクノロジー情報センター (NCBI)の相 ノレコリスム BLAST (Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.ni h.gov/BLAST/にお 、てデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算 出することができる。
[0034] 本発明による第二の態様の新規タンパク質において、配列番号： 10で表されるアミ ノ酸配列と 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、 95%以上、特に 好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有するアミノ酸配列 であることができる。
[0035] 本発明による第二の態様の新規タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、 配列番号： 9で表される塩基配列と 90%以上の同一性を有する塩基配列は、好まし くは、 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一 性を有する塩基配列であることができる。
[0036] 本発明による第一の態様の抗体において、配列番号 : 2、配列番号 :4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70% 以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、 80%以上、より好ましくは 85% 以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98 %以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることが できる。
[0037] 本発明にお 、て、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番 号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコード するヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配 列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードする 種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
[0038] 従って、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、ま たは配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチドとは、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9 、または配列番号： 11で表される DNA配列の一部または全部に加え、同一のァミノ 酸をコードする DNA配列であって縮重関係にあるコドンを DNA配列として有する配 列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応する RNA配列も 含まれる。
[0039] 配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または配列 番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド の好ましい例としては、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列 番号： 9、または配列番号： 11で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙 げられる。
[0040] 本明細書にぉ 、て、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列 番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機 能を有するかどうかは配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列 番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関 連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができ、例えば、その タンパク質を遺伝子組み換え技術により発現させ、榭状細胞の活性化受容体として 機能するかどうかを評価することにより決定することができる。配列番号: 2、配列番号 :4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質は T細胞と相互作用し、榭状細胞を活性化する機能を有 することから、評価に当たっては下記機能を指標とすることができる：
T細胞に対する接着機能（実施例 5、 6、 10および 11)、
抗体架橋刺激による榭状細胞活性化機能 (実施例 3)、
FcR γ鎖との複合体形成機能 (実施例 4)、または
上記機能の一部またはすベての組み合わせ。
[0041] 規リガンドタンパク質およびポリヌクレオチド]
本発明にお ヽて同定した、 TARMタンパク質のリガンドとして活性化 Τ細胞上に特 異的に発現する遺伝子のうちマウス由来の遺伝子としては、 1種類の膜タンパク質の 遺伝子が挙げられる。この遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるタンパク 質のアミノ酸配列は、配列番号： 13および 14に記載される。また、 TARMタンパク質 のリガンドとして活性化 Τ細胞上に特異的に発現する遺伝子のうちヒト由来の遺伝子 としては、 1種類の膜タンパク質の遺伝子が挙げられる。この遺伝子の塩基配列およ びそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号： 15および 16に記 載される。
[0042] 本発明による新規リガンドタンパク質において、配列番号： 14または配列番号： 16 で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、 8 0%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有 するアミノ酸配列であることができる。
本発明による新規リガンドタンパク質をコードするポリヌクレオチドにお 、て、配列番 号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列と 70%以上の同一性を有する塩基 配列は、好ましくは、 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上 、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99 %以上の同一性を有する塩基配列であることができる。
[0043] 本発明において、配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列が与え られれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号： 14または配 列番号： 16で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択するこ とがでさる。
[0044] 従って、配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含んでなるタ ンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号： 13または配列番号： 15で表さ れる DNA配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードする DNA配列であ つて縮重関係にあるコドンを DNA配列として有する配列をも意味するものとする。本 発明においてはさらに、これらに対応する RNA配列も含まれる。
[0045] 配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質 をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号： 13または配列番号： 1 5で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
[0046] 本願明細書において、配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号： 14または配列番号： 16 で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能 を評価することにより決定することができ、例えば、そのタンパク質を遺伝子組み換え 技術により発現させ、榭状細胞の活性ィヒ受容体の T細胞上のリガンドとして機能する 力どうかを評価することにより決定することができる。配列番号： 14または配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質は TARMタンパク質と結合することから 、評価に当たっては、例えば、 TARMタンパク質に対する結合機能（実施例 12)を指 標とすることができる。
本発明による新規リガンドタンパク質は、 1回膜貫通タンパク質であり、 N末端側を 細胞外とする向きで細胞表面に発現している。従って、該タンパク質を利用して、該 タンパク質に対する抗体を作製することができる。
本発明によれば、配列番号： 14で表されるアミノ酸配列の 1番目〜159番目、また は配列番号： 16で表されるアミノ酸配列の 1番目〜158番目のアミノ酸配列の少なく とも 6アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質が提供さ れる。該タンパク質は、 TARM— Lタンパク質のアミノ酸配列の細胞外領域に相当す る部分を含んでなることから、該タンパク質に対する抗体を作製するための抗原とし て用いることができる。
本発明によれば、本発明による新規リガンドタンパク質に対する抗体を作製するた めの、本発明による新規リガンドタンパク質の使用が提供される。
[抗体]
本発明による抗体は、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質を特異的に 認識することができる。従って、本発明による抗体を得るための TARMタンパク質ま たは TARM— Lタンパク質は、 TARMまたは TARM— Lの抗原性を有して!/、ればよ ぐ TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは 複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタ ンパク質が包含される。このようなタンパク質が元のタンパク質と同じ生物学的活性が 維持されることは公知である (Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-6;Z oiler and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487— 500;Wang et al.(1984)Science 224 : 1431— 3;Dalbadie— McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409—13)。ある タンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、 1若しくは複数個 のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特 異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現 させて得ることができる (Molecular Cloning.A Laboratory Manual 2 ed.,Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (198 7- 1997),Section8.1- 8.5;Hashimoto- Goto et al.(1995)Gene 152:271- 5;Kinkel(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488- 92;Kramer and Fritz(1987)Method.Enzymol 154:35 0-67;Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763-6)o
[0048] 本発明による抗体には、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質の一部に 対して特異的な抗体も含まれる。
[0049] 即ち、本発明の抗体を得るための TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質 には、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質の全長アミノ酸配列を有するポ リペプチドに加えて、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質の少なくとも 6ァ ミノ酸残基以上 (例えば、 6、 8、 10、 12または 15アミノ酸残基以上）と同一の配列を 有するポリペプチド断片も含まれる。本明細書における TARMタンパク質または TA RM— Lタンパク質のポリペプチド断片は、 TARMタンパク質または TARM— Lタン ノ ク質の抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。
[0050] 好ましい断片としては、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質のアミノ末 端、カルボキシル末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。ポリペプチドの抗 原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎水性 Z親水性を解析する方法 (Kyt e-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157:105-22)、二次構造を解析する方法 (Chou-Fasman( 1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251- 76)により推定し、さらにコンピュータープログラム (An al.Biochem. 151:540-6(1985》または短!、ペプチドを合成しその抗原性を確認する P EPSCAN法 (特表昭 60— 500684号公報）等の手法により確認することができる。
[0051] 本発明による抗体は、好ましくは TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質の 機能に影響を与える抗体である。 TARMタンパク質の機能に影響を与えるとは、例 えば、本発明による第一の態様の抗体による TARMタンパク質の架橋刺激により、 榭状細胞を活性化すること (実施例 3)、該抗体が TARMタンパク質と結合することに より、 TARMタンパク質と T細胞との接着を阻害すること（実施例 6および実施例 11) 、および該抗体が TARMタンパク質と結合することにより、 TARMタンパク質と FcR y鎖との複合体形成を阻害すること (実施例 4)である。 TARM— Lタンパク質の機能 に影響を与えるとは、例えば、本発明による第二の態様の抗体が TARM— Lタンパ ク質と結合することにより、 TARM— Lタンパク質と TARMタンパク質との結合を阻害 することである。
[0052] 本発明による抗体には、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質を抗原とし て、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるモノクローナル抗体、遺伝子組 換え技術を用いて製造されキメラ抗体およびヒト型抗体、並びにヒト抗体産生トランス ジヱニック動物等を用いて製造されるヒト抗体が含まれる。本発明による抗体を医薬と してヒトに投与する場合は、副作用の観点から、ヒト抗体が望ましい。
[0053] 「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子 をマウスに導入して作製することができる。例えば、 Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994 ; Nature Genetics, Vol.15, p.146- 156, 1997 ;特表平 4 504365号公報；特表 平 7— 509137号公報； W094Z25585号公報； Nature, Vol.368, p.856- 859, 1994 ；および特表平 6— 500233号公報に記載の方法を参照して作製することができる。 また、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。例えば、 Marks, J. D. et al: J. Mol. Biol, Vol.222, p.581-597, 1991に記載の方法を参照して作製することが できる。
[0054] 「ヒト型抗体」は、マウス抗体の抗原結合部位 (CDR；相補性決定領域)の遺伝子配 列だけをヒト抗体遺伝子に移植 (CDRグラフティング）した抗体である。例えば、特表 平 4 506458号公報および特開昭 62— 296890号公報等に記載の方法を参照し て作製することができる。
[0055] 「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を連結した抗体であ る。具体的には、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子か ら抗原と結合する抗体可変部 (V領域)を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常部 (C領 域)遺伝子と結合して作製することができる。例えば、特公平 3— 73280号公報に記 載の方法を参照して作製することができる。
[0056] 本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知方法を用いて得ることができる（ ί列えば、『Current Protocols in Molecular BiologyJQohn Wiley & Sons(1987))、 Antib odies:A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Labora tory(1988)) 0
[0057] 免疫抗原としては、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質のフラグメントを 用いることができる。あるいは、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることが できる。抗原はキャリア蛋白質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク 質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができる力 ダルタルアルデヒド、 カルポジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清 アルブミン、サイログロブリン、へモシァニン等の常用されているものでよぐ通常 1〜
5倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
[0058] 免疫される動物としてはマウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ハムスターなどが挙げら れ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完 全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよぐ投 与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ行われる。
[0059] 免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節力 得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞 と細胞融合させ、ハイプリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、 ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ま 、 力 異種間においても可能な場合もある。
[0060] 細胞融合の操作は既知の方法、例えば、 Nature, 256,495, 1975に従って実施でき る。
[0061] 融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウィルスなどが挙げられ、通 常には、 20〜50%程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量 1000〜4000 )を用いて 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cの温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細 胞数の比は通常 1： 1〜10： 1程度、約 1〜10分間程度反応させることにより細胞融合 を実施することができる。
[0062] 抗体産生ノ、イブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる 。例えば、 TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質をコートしたマイクロプレー トを用いる ELISA法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いる EI A法、 TARMタンパク質を含むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用 V、るィムノブロット法などが挙げられる。
[0063] 抗体産生ノ、イブリドーマのスクリーニングには、また、上記免疫化学的方法に代え て、該抗体が TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質の機能に影響を与える か否かによりスクリーニングすることができる。本発明による第一の態様の抗体が TA RMタンパク質の機能に与える影響、例えば、本発明による第一の態様の抗体による TARMタンパク質の架橋刺激により、榭状細胞が活性化されるか否か (実施例 3)、 該抗体と TARMタンパク質との結合により、 TARMタンパク質と T細胞との接着機能 を阻害できるカゝ否カゝ (実施例 6および実施例 11)、あるいは該抗体と TARMタンパク 質との結合により、 TARMタンパク質と FcR y鎖との複合体形成を阻害する力否か（ 実施例 4)により、抗体産生ハイプリドーマをスクリーニングすることができる。本発明 による第二の態様の抗体が TARM— Lタンパク質の機能に与える影響、例えば、本 発明による抗体の第二の態様と TARM— Lタンパク質との結合により、 TARMタン ノ ク質と TARM— Lタンパク質との結合機能を阻害できるか否かにより、抗体産生ハ イブリドーマをスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法により、本発明 の抗体の好ましい様態である TARMタンパク質または TARM— Lタンパク質の機能 に影響を与える抗体を選択することができる。またこのスクリーニングは、 TARMタン ノ ク質または TARM— Lタンパク質と結合する抗体を産生する力否かにより選択する 上記免疫化学的方法スクリーニングに次いで行う、 2次スクリーニングとして行っても 良い。
[0064] このようなゥエルから更に、例えば限界希釈法によってクローユングを行い、クロー ンを得ることができる。ハイプリドーマの選別、育種は、通常、 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、チミジン）を添加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地 (例、 RPMI1640)で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタ ンを投与した SCIDマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14日後にモノクローナル抗体を 高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを 培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
[0065] モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いれば よぐたとえば、硫安分画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利 用、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラム y、さらに TARMタンパク質を用いるァフィ 二ティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。
[0066] 本発明による「機能的断片」とは、抗体の一部分 (部分断片)であって、本発明のタ ンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、 Fab, Fab'、 F (ab' ) 、
2 可変領域断片 (Fv)、ジスルフイド結合 Fv、一本鎖抗体 (scFv)、およびこれらの重合 体等が挙げられる。
[0067] 本発明による第一の態様の抗体の好ま U、例としては、本発明による第一の態様 の新規タンパク質に対する抗体およびその機能的断片が挙げられる。
[0068] 本発明による第一の態様の抗体の好ま U、例としてはまた、本発明による第二の態 様の新規タンパク質に対する抗体およびその機能的断片が挙げられる。
[0069] 本発明による第一の態様の抗体の好ましい例としては更に、下記タンパク質に対す る抗体が挙げられる。
(ix' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タン パク質；
(χ' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿 入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸 の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 12で表されるアミノ酸配 列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質； (χί' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 12 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または 分泌タンパク質;および
(χϋ' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配 列を含んでなり、かつ配列番号： 12で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等 の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
[0070] 本発明による第一の態様の抗体のより好ましい例としては、配列番号： 12で表され るアミノ酸配列もしくは 1または複数個の保存的置換を有する配列番号： 12で表され るアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体または その機能的断片が挙げられる。
[0071] 具体例としては、 FERM BP— 10376のもと受託されたハイブリドーマが産生する モノクローナル抗体が挙げられる。 [0072] 従って、本発明によれば、 2005年 7月 15日付で独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター (〒 305— 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 )に FERM BP— 10376のもと寄託されたハイブリドーマ（@TARM # 6. 11)が提 供される。
[0073] 本発明による第一の態様の抗体のより好ましい例としてはまた、配列番号： 10で表 されるアミノ酸配列もしくは 1または複数個の保存的置換を有する配列番号： 10で表 されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体ま たはその機能的断片が挙げられる。
[0074] 本発明による第二の態様の抗体の好ましい例としては、配列番号： 14で表されるァ ミノ酸配列もしくは 1または複数個の保存的置換を有する配列番号： 14で表されるァ ミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその 機能的断片が挙げられる。
[0075] 本発明による第二の態様の抗体の好ましい例としてはまた、配列番号： 16で表され るアミノ酸配列もしくは 1または複数個の保存的置換を有する配列番号： 16で表され るアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体または その機能的断片が挙げられる。
本発明による第二の態様の抗体のより好ましい例としては、 TARM—Lタンパク質 の細胞外に発現しているポリペプチド部分を認識する抗体またはその機能的断片が 挙げられる。このような抗体としては、例えば、配列番号： 14で表されるアミノ酸配列 の 1番目〜159番目、配列番号： 16で表されるアミノ酸配列の 1番目〜158番目のァ ミノ酸配列の少なくとも 6アミノ酸残基または全部力 なるポリペプチドを含んでなるタ ンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
[0076] [抗体の用途および医薬組成物] 免疫応答に関与するリンパ球である τ細胞は、 τ細胞に対する抗原提示機能を有 する細胞として知られて!ヽる榭状細胞との協働作用により様々な免疫応答を担って いる（Kroczek,RA.， et al.(2004)Current Opinion in Immunology 16:321—327)。後記 実施例により示されるように、炎症刺激により榭状細胞上の TARMタンパク質の発現 が増強され (実施例 2)、 TARMタンパク質を介して、榭状細胞と T細胞とが接着する ことが明らカゝとなった（実施例 5および実施例 10)。また、結合刺激された TARMタン ノ^質により榭状細胞が活性ィ匕し、 IL— 6の産生が誘導されることが確認された (実 施例 3)。 IL 6の過剰産生は自己免疫疾患と関連していることが報告されている（Is hihara.K., et al.(2002) Cytokine&Growth Factor Reviews 13:357—368)。更に、 TAR Mタンパク質に対する抗体により、 T細胞と榭状細胞との接着が顕著に抑制された（ 実施例 6および実施例 11)。
[0077] また、後記実施例では、コラーゲン誘導関節炎モデルにぉ 、て、本発明による抗体 が実際に治療効果を有することが確認された (実施例 7)。コラーゲン誘導関節炎モ デルは、自己免疫疾患の一つである関節リウマチのモデルである。
[0078] 従って、本発明による第一の態様の抗体は、 自己免疫疾患の治療に有用である。
[0079] 自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチが挙げられる。
[0080] 同様に、 TARM— Lタンパク質に対する抗体により、 T細胞と榭状細胞との接着が 抑制されると考えられる。従って、本発明による第二の態様の抗体は、自己免疫疾患 の治療に有用である。
[0081] 本発明によれば、自己免疫疾患治療剤の製造のための、本発明による抗体の使用 が提供される。
[0082] 本発明によれば、治療上の有効量の本発明による抗体を、ヒトを含む哺乳類に投 与する工程を含んでなる、自己免疫疾患の治療方法が提供される。
[0083] T細胞接着阳.害剤
後記実施例において示されるように、 TARMタンパク質に対する抗体により、 T細 胞と榭状細胞との接着が顕著に抑制された (実施例 6および実施例 11)。従って、本 発明による第一の態様の抗体は、 T細胞接着阻害剤として用いることができる。
[0084] 同様に、 TARM— Lタンパク質に対する抗体により、 T細胞と榭状細胞との接着が 抑制されると考えられる。従って、本発明による第二の態様の抗体は、 T細胞接着阻 害剤として用いることができる。
[0085] 本願明細書にぉ ヽて、「T細胞接着」とは、榭状細胞と Τ細胞との接着、すなわち榭 状細胞上に発現した TARMタンパク質と Τ細胞上に発現した TARM— Lタンパク質 との結合を意味する。本発明の τ細胞接着阻害剤を用いて、榭状細胞上に発現した TARMタンパク質と T細胞上に発現した TARM— Lタンパク質との結合を阻害する ことにより、榭状細胞と T細胞の相互作用によって生じる免疫応答、例えば、榭状細 胞および T細胞の活性化、増殖、分化、サイト力イン'ケモカイン産生を抑制すること ができる。
[0086] 医薬組成物
本発明による抗体の投与形態は、特に制限されず、経口投与、非経口投与 (例え ば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与)のいずれかの 投与経路でヒトを含むほ乳類に投与することができるが、非経口投与、特に静脈注射 、が好ましい。
[0087] 経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知で あり、本発明による抗体を、薬学的に許容される坦体などと混合等することにより、常 法に従って製造することができる。
[0088] 薬学上許容される担体としては、例えば、製剤分野において常用され、かつ本発明 による抗体と反応しない物質が用いられる。薬学上許容される担体には、例えば、通 常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により 安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、 pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増 量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤 等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して 常法により製剤化することが可能である。
[0089] 非経口投与のための剤型は、注射用製剤 (例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋 肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤 (例えば、軟膏剤、パップ剤、ローショ ン剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リボソーム剤等が挙げられ る。
[0090] 例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体を注射用蒸留水に溶解して調製 するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、 pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存 剤、安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とするこ とちでさる。 [0091] 経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、 丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、トロ ーチ剤などが挙げられる。
[0092] 本発明による医薬組成物は、治療上有効な他の薬剤を更に含有していてもよぐま た、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、 保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。このときの有効成分の担体に 対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。
[0093] 本発明による抗体の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患 者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴などの薬理 学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与 される力、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる力 通常、成 人（体重 60kg)あたり、経口投与では l〜5000mgZ曰、好ましくは 10〜2000mgZ 日、さらに好ましくは 50〜2000mgZ日を、注射投与では l〜5000mgZ日、好まし くは 5〜2000mg/曰、さらに好ましくは 50〜2000mg/曰を、 1回または数回に分 けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よ りも少ない可能性がある。実際に用いられる投与法は、臨床医師の判断により大幅に 変動することもあり、上記の投与範囲力も逸脱することがある。
[0094] [スクリーニング方法]
TARMタンパク皙 T細胞 の接羞 阳害する物皙のスクリーユング 法
本発明による第一の態様のスクリーニング方法によれば、 TARMタンパク質と T細 胞との接着を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
[0095] TARMタンパク質は榭状細胞上に発現し、榭状細胞と T細胞との間の免疫応答に 関する相互作用に関与している。また、 TARMタンパク質へ結合刺激が加わることに より、自己免疫疾患の原因ともなる IL— 6の産生が誘導される。従って、本発明による 第一の態様のスクリーニング方法は、 TARMタンパク質と T細胞との接着を阻害する 物質のスクリーニングに用いることができ、好ましくは、自己免疫疾患、より好ましくは 、関節リウマチの治療に有用な物質のスクリーニングに用いることができる。
[0096] 本発明による第一の態様のスクリーニング法においては、工程 (b)の後に、（c)被 験物質の存在下における結合活性と被験物質の非存在下における結合活性とを比 較する工程を更に含んで 、てもよ!/、。
[0097] 工程 (c)にお 、ては、被験物質の存在下における結合活性が被験物質の非存在 下における結合活性を下回る場合に、好ましくは 50%以下である場合に、該被験物 質が本発明によるタンパク質と T細胞との結合を阻害すると判定することができる。
[0098] 工程 (a)にお 、て、「接触させる」とは、 TARMタンパク質と T細胞とが直接接触す る態様であれば特に限定されるものではなぐ例えば、 TARMタンパク質を固相化し たプレートに標識した T細胞を添加する方法、あるいは T細胞を含むプレートに標識 した TARMタンパク質を添加する方法により実施できる。
[0099] T細胞は、好ましくは、活性化 T細胞、より好ましくは、活性化 Th2細胞である。
[0100] 工程 (b)にお 、て、結合活性の測定は、公知の方法に従って行うことができる。例 えば、 TARMタンパク質を固相化したプレートに標識した T細胞を添加し、一定時間 培養後、洗浄等により接着していない細胞を取り除き、接着した細胞について測定 することにより結合活性を測定することができる。
[0101] 前記標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質 (蛍光タンパク質を 含む)、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [14C] 、 [125I]、 [35S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば、 |8—ガラクトシ ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いること ができる。蛍光物質としては、例えば、フルォレセイソチオシァネート、 BODIPY、 Ca lcein— AM (同仁社製)等、また、蛍光タンパク質としては、例えば、 GFP等を用いる ことができる。これら酵素および蛍光タンパク質は、細胞に遺伝子を導入して発現さ せることも可能である。発光物質としては、例えば、ルシフェリン、ルシゲニン等を用い ることができる。場合によっては、前記リガンドと標識物質を結合させるためにビォチ ンーアビジンの系を用いることもできる。
[0102] また、 T細胞を標識しな 、で添加し、接着した T細胞を T細胞に特異的な抗体、例 えば、抗 CD3抗体、あるいはヘルパー T細胞に特異的な抗体、例えば、抗 CD4抗体 により検出することもできる。
[0103] 結合活性は、添カ卩した細胞についてあら力じめ測定しておいて、添加した細胞に対 する接着した細胞の割合で表すことができる。
[0104] 撒状細胞の活件化を阳.害する物皙のスクリーニング方法
本発明による第二の態様のスクリーニング方法によれば、榭状細胞の活性ィ匕を阻 害する物質のスクリーニング方法が提供される。
[0105] 結合刺激された TARMタンパク質により榭状細胞を活性ィ匕することができる（実施 例 3および 4)。従って、 TARM抗体により架橋刺激された榭状細胞系を用いて、榭 状細胞の活性ィ匕を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
[0106] 前述したように、榭状細胞の活性ィ匕により自己免疫疾患が引き起こされることが示さ れた。従って、本発明による榭状細胞の活性化を阻害する物質のスクリーニング法は 、好ましくは、 自己免疫疾患、より好ましくは、関節リウマチの治療に有用な物質のス クリーニングに用いることができる。
[0107] 榭状細胞上に発現した TARMタンパク質に架橋刺激を与えると榭状細胞が活性 化するが、その際に、 TARMタンパク質はシグナル伝達分子として知られている FcR γ鎖と複合体を形成するとともに、自己免疫疾患の原因ともなる IL 6や、単球の走 化性因子である MCP— 1の産生が誘導される。従って、本発明による第二の態様の スクリーニング方法の工程 (e)においては、榭状細胞の活性ィ匕の程度を、榭状細胞 における IL— 6および Zまたは MCP—1の産生量を指標にして測定することができ、 あるいは榭状細胞の活性ィ匕の程度を、榭状細胞における FcR γ鎖の発現量を指標 にして測定することができる。
[0108] 本発明による第二の態様のスクリーニング法において、榭状細胞の活性ィ匕の程度 を、榭状細胞における IL 6および Ζまたは MCP— 1の産生量を指標にして測定す る場合には、工程 (e)の後に、（f— 1)被験物質の存在下における IL 6および Zま たは MCP—1の産生量と被験物質の非存在下における IL— 6および Zまたは MCP 1の産生量とを比較する工程を更に含んで 、てもよ 、。 工程 (f 1)にお 、ては、 被験物質の存在下における IL 6および Zまたは MCP— 1の産生量が被験物質の 非存在下における IL— 6および Zまたは MCP— 1の産生量を下回る場合に、好まし くは 50%以下である場合に、該被験物質が榭状細胞の活性化を阻害すると判定す ることがでさる。 [0109] 本発明による第二の態様のスクリーニング法においては、また、榭状細胞の活性化 の程度を、榭状細胞における FcR y鎖の発現量を指標にして測定する場合には、ェ 程 (e)の後に、（f 2)被験物質の存在下における FcR y鎖の発現量と被験物質の 非存在下における FcR γ鎖の発現量とを比較する工程を更に含んで 、てもよ!/、。
[0110] 工程 (f 2)においては、被験物質の存在下における FcR γ鎖の発現量が被験物 質の非存在下における FcR γ鎖の発現量を下回る場合に、好ましくは 50%以下で ある場合に、該被験物質が榭状細胞の活性ィ匕を阻害すると判定することができる。
[0111] 工程 (d)において、「接触させる」とは、榭状細胞上の TARMタンパク質力 本発明 による抗体により架橋刺激される態様であれば特に限定されるものではなぐ例えば 、本発明による抗体を含む培地で榭状細胞を培養することにより行うことができる。
[0112] 工程 (e)にお 、て、タンパク質の産生量や発現量の測定は、公知の方法に従って 行うことができるが、市販のキットを使用することもできる。
[0113] T ARMタンパク皙 FcR v鎖 の^!合体形成 阳.害する物皙のスクリーユング 法
本発明による第三の態様のスクリーニング方法によれば、 TARMタンパク質と FcR γ鎖との複合体形成を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
[0114] TARMタンパク質は榭状細胞上に発現し、シグナル伝達分子としてよく知られてい る FcR γ鎖と複合体を形成する。また、 FcR γ鎖は、 TARMタンパク質と複合体を形 成することによって細胞表面への発現が増加することが示唆されている。従って、本 発明によるスクリーニング方法は、 TARMタンパク質と FcR γ鎖との複合体形成を阻 害する物質のスクリーニングに用いることができ、好ましくは、自己免疫疾患、より好ま しくは関節リウマチの治療に有用な物質のスクリーニングに用いることができる。
[0115] 本発明によるスクリーニング法においては、工程 (h)の後に、（i)被験物質の存在下 における FcR y鎖の発現量と被験物質の非存在下における FcR y鎖の発現量とを 比較する工程を更に含んで 、てもよ 、。
[0116] 工程 (i)においては、被験物質の存在下における FcR γ鎖の発現量が被験物質の 非存在下における FcR γ鎖の発現量を下回る場合に、好ましくは 50%以下である場 合に、該被験物質が本発明によるタンパク質と FcR γ鎖との複合体形成を阻害する と判定することができる。 [0117] 工程 (g)において、「接触させる」とは、 TARMタンパク質と FcR y鎖を発現させた 榭状細胞と本発明の抗体とが直接接触する態様であれば特に限定されるものではな ぐ例えば、本発明による抗体を含む培地で榭状細胞を培養することにより行うことが できる。
[0118] 工程 (h)において、発現量の測定は、公知の方法に従って行うことができる力 例 えば、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。
[0119] 本願明細書において、「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成 ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質 (細菌代謝産物を 含む）、核酸 (アンチセンス、リボザィム、 RNAi等)等が挙げられ、好ましくは、化合物 もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定さ れるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であって ちょい。
実施例
[0120] 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明の範囲を限 定するものではない。なお、実施例では「TARMタンパク質」を単に「TARM」、「TA RM— Lタンパク質」を単に「TARM— L」ということがある。また、マウス由来の TAR Mタンパク質を単に「mTARM」、ヒト由来の TARMタンパク質を単に「hTARM」と いうことがある。
[0121] 「実施例 1Ί マウス TARM遣伝子の単離および発現解析
(1) mTARM遺伝子の単離
マウス脾臓より分離した CD4 T細胞を in vitro cultureにより Thlあるいは Th2 に分ィ匕させ、それぞれからドライバーあるいはテスターに用いる cDNA断片を作製し 、高感度サブトラクシヨン (N—RDA)法を行う過程で得られた cDNA断片の配列を 用いて Blast検索を行った。その結果、機能未知の細胞膜タンパク質をコードする遺 伝子（Genbank™ accession No. NM— 177363)力得られた。
[0122] GenBank™の配列（NM— 177363)の配列をもとに、 PCR用プライマーを下記の ように設計し、マウスの各臓器における mTARM遺伝子の発現を検討した。
mTARM F1： GTGACTTTGCAGTGCCAGAA (配列番号： 17) mTARM Rl： TGCACAGGAGTTGAGTGTCC (配列番号： 18)
[0123] 各臓器の全 RNA (Promega社製）から RNA PCR kit (TAKARA社製）を用いて合 成した 1本鎖 cDNAを铸型として、 ABI7700 (AppliedBiosystems社製）でリアルタイ ム PCRを行った。 PCRは以下の反応液組成（QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN社製） 12. 5 1、ゥラシル DNAグリコシラーゼ（Invitrogen 社製） 0. 25 1、 100 M mTARM F プライマー 0. 125 1、 ΙΟΟ M mT ARM R プライマー 0. 125 1、铸型 cDNA (10倍希釈） 2. 5 1、蒸留水 7. 25 1)で行った。 PCRは、 94°Cで 10分間処理した後、 94°Cで 30秒、 60°Cで 1分の 反応を 35サイクルで行った。その結果、 mTARMは腎臓で発現していた。
[0124] そこで、腎臓の全 RNAを用いて 5，—RACE (Rapid Amplification of cDNA
Ends)および 3 '— RACEを行い、 mTARMの全長遺伝子配列の決定を試みた。
[0125] まず、マウス腎臓の全 RNAから cDNA synthesis kit (TAKARA社製）を用いて 二本鎖 cDNAを合成し、 Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN社製）を用 V、て cDNAを精製した。つぎに ad29アダプター（ad29S： acatcactccgt (配列番号： 1 9)と ad29A： acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct (目 3列 ¾·号： 20)を ァ-リーングさせたもの）を付加し、 RACEの铸型とした。
[0126] 1st PCRは、以下の反応液糸且成 (lO X ExTaq バッファー 5 1、 2. 5mM dN TP 4 μ Ι, ExTaq 0. 25 ^ 1, 100 プライマー （5，PCR4) 0. 5 1、 100 Gene specific primer 0. 5 1、 ad29アダプター付加 cDNA (25倍希釈） Ι μ Ι,蒸留水 38. 75 μ 1)で行った。
プライマーは、下記の配列を使用した。
5， PCR4： AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (配列番号：21)
mTARM— RACE— 5 '—4： CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (配列番号： 22 )、あるいは
mTARM— RACE— 3，—4： GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (配列番号： 23 )
PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 1分、 72°Cで 5分の反応 を 30サイクル行 ヽ、最後に 72°Cで 5分間反応した。 [0127] 2 PCRは、以下の反応液組成（lO X ExTaq バッファー 5 1、 2. 5mM dN TP 4 μ Ι, ExTaq 0. 25 1、 100 Μ プライマー （5，PCR1) 0. 5 1、 100 Μ Gene specific primer 0. 5 ^ 1, 1st PCR 産物（100倍希釈） 1 1、蒸留 水 38. 75 1)で行った。
プライマーは、下記の配列を使用した。
5， PCR1： GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG (配列番号： 24)
mTARM— RACE— 5 '—3： TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (配列番号： 25 )、あるいは
mTARM— RACE— 3，—3： CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCTTTC (配 列番号： 26)
PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5分の反 応を 25サイクル行い、最後に 72°Cで 5分間反応した。増幅した cDNA断片を pCR2 . 1 (Invitrogen社製）にクローユングした後、 ABI3100シーケンスアナライザー（App liedBiosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。
[0128] その結果、 5， RACEでは 2種類、 3， RACEでは 3種類の cDNAが得られ、スプライ シングァイソフォームの存在が明らかとなつた。
[0129] RACEで得られた塩基配列情報を用いて、各スプライシングァイソフォームを増幅 するプライマーの設計を行った。マウス骨髄の全 RNAから cDNA synthesis kit ( TAKARA社製）を用いて二本鎖 cDNAを合成し、 Qiaquick PCR purification k it (QIAGEN社製）を用いて cDNAを精製した。 PCRは、以下の反応液組成（10 X E xTaq ノ ッファー 5 1、 2. 5mM dNTP 4 1、 ExTaq 0. 25 μ 1、 100 μ Μ 5 ，プライマー 0. 5 1、 100 Μ 3，プライマー 0. 5 1、 cDNA (25倍希釈） 1 μ \ 、蒸留水 38. 75 μ 1)で行った。
プライマーは、下記の配列を使用した。
mTARM— 5 ' UTR: GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC (配列番号： 27) mTARM— 3， UTR— 1: GTCCAGATATGTCCAGGCCTCTG (配列番号： 28)、あ るいは
mTARM 3 ' UTR - 2: TTCAGTTATTTTACCAGGGTTTA (配列番号： 29) PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5分の反 応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 5分間反応した。 2種類のプライマーセットで 6種 類のスプライシングァイソフォームを確認することができる。結果、スプライシングアイ ソフォーム 6種類の組合せのうち 5種類で増幅産物が得られたので、増幅した cDNA 断片を pCR2. 1 (Invitrogen社製）にクローユングした後、 ABI3100シーケンスアナラ ィザーを用いて塩基配列を決定した。
[0130] その結果、 4種類の膜結合型 TARM遺伝子（ml、 m2、 m3、 m4)と 1種類の分泌 型 TARM遺伝子（si)をコードするスプライシングァイソフォームの存在が明ら力とな つた (図 1)。
[0131] (2) mTARM遺伝子の発現解析
mTARM遺伝子のマウス正常組織での発現解析を行った。上記のようにスプライ シングァイソフォームが存在して 、るので、 3つのプライマーセットを設計した。
セット 1 (ml、 m2ァイソフォームを特異的に増幅するように設計）
mTARM_qF2： TCTGTGATAGACAACCATCT (配列番号： 30)
mTARM_qR2： GTCATTGTACCCGGGGTCTT (配列番号：31)
セット 2 (m3、m4ァイソフォームを特異的に増幅するように設計）
mTARM— qF4： ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA (配列番号： 32) mTARM_qR3： TCATTTTTCTCCTGGGGCAC (配列番号： 33)
セット 3 (siァイソフォームを特異的に増幅するように設計）
mTARM— qF3： GATCTCTGTGATAGATGCAAG (配列番号： 34)
mTARM_qR2： GTCATTGTACCCGGGGTCTT (配列番号： 35)
[0132] マウス臓器から RNeasy mini kit (QIAGEN社製）を用いて調製した全 RNAある Vヽは購入した各臓器の全 RNA (Promega社製）から RNA PCR kit (TAKARA社製 )を用いて合成した 1本鎖 cDNAを铸型として、 ABI7700でリアルタイム PCRを行つ た。 PCRは以下の反応液組成（QuantiTect SYBR Green PCR Master Mi x (QIAGEN社製） 12. 5 1、ゥラシル DNAグリコシラーゼ（Invitrogen社製） 0. 25 ^ 1, 100 F プライマー 0. 125 1、 100 /z M R プライマー 0. 125 1、 铸型 cDNA (10倍希釈） 2. 5 1、蒸留水 7. 25 μ 1)で行った。 [0133] PCRは、 94°Cで 10分間処理した後、 94°Cで 30秒、 60°Cで 1分の反応を 35サイク ルで行った。
[0134] その結果、 mTARMは骨髄で強く発現していることが明ら力となった（図 2)。
[0135] つぎに、 mTARMの各種細胞における発現解析を行った。
[0136] マウス脾臓力も分離精製した細胞、イン'ビトロで培養した細胞および各種細胞株 から RNeasy mini kit (QIAGEN社製）を用いて全 RNAを調製し、 RNA PCR ki t (TAKARA社製）を用いて 1本鎖 cDNAを合成して铸型とし、 ABI7700でリアルタイ ム PCRをマウス正常組織での発現解析と同様に行った。
[0137] その結果、 mTARMは骨髄由来榭状細胞で強く発現していることが明ら力となった
(図 3)。
[0138] 「 施例 2Ί マウス TARMに針する杭体の作 解析
(1) mTARM遺伝子発現細胞の作製
mTARM遺伝子発現ベクターの作製は、以下のように行った。
プライマーは、ァイソフォーム mlの塩基配列をもとに設計した。
mTARM F2： cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT (配列番号： 36)
mTARM R2： gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG (配列番号： 37 )
[0139] 骨髄の全 RNAから RNA PCR kit (TAKARA社製）を用いて 1本鎖 cDNAを合成 して铸型に用いた。 PCRは、以下の反応液組成（10 Xバッファー 5 1、 2. 5mM dNTP 4 1、 Pyrobest polymerase (TAKARA社製） 0. 5 1、 100 Μプライ マー 各 0. 5 1、 cDNA 1 1、 DMSO 2. 5 1、蒸留水 36 μ 1)で行った。 PCR は、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5分の反応を 35 サイクル行い、最後に 72°Cで 2分間反応した。増幅した cDNAを pBlueScriptll S K ( + ) (Stratagene社製）にクローユングして、 ABI3100シーケンスアナライザーを用 いて塩基配列を確認した。得られた cDNA断片を発現ベクター pMXII IRES EG FP (Oncogene(2000)19(27):3050-3058)に挿入して、 mTARM遺伝子発現ベクター を作製した。 [0140] 組換えレトロウイルスの作製は以下のように行った。
[0141] 293/EBNA- 1細胞株（Invitrogen社製） 3 X 106個を培地（D—MEM/10%F BS)に懸濁して 10cmディッシュに播き、 COインキュベーターで 24時間培養した。
2
翌日、培地を交換し、以下のように調製したトランスフエクシヨン溶液を加えてトランス フエクシヨンを行った。トランスフエクシヨン溶液は、 5mlチューブに OPTI— MEM (GI BCO BRL社製）を 600 μ 1と TransIT LT1 (TaKaRa社製） 24 μ 1をカ卩えて混合して 室温 5分静置した後、発現ベクター 9ugとパッケージングベクターである pCL—Eco (Imgenex社製） 9ugを加えて室温 5分静置して調製した。 48時間後に、培養上清を 回収して 0. 45umのフィルターろ過を行い、組換えウィルス液を得た。
[0142] この組換えウィルスを以下のように B300. 19細胞株（EMBO J. (1984) 3: 1209-121 9)に感染させ、 mTARM遺伝子発現細胞を作製した。 B300. 19細胞 1 X 106個を 15mlチューブに加え、 1200rpm、 25°Cで 5分間遠心後、培養上清を吸引除去した 。細胞に、組換えウィルス液 2mlに polybrene (lOmgZml) 2 μ 1と 55 ^ Μ 2— メルカプトエタノール 2 1をカ卩えて混合した溶液をカ卩え、 2500rpm、 30°Cで 2時間 遠心して感染を行った。感染後に組換えウィルス液を除去し、培地 (RPMI— 1640 /10%FBS/55uM 2—メルカプトエタノール）をカ卩えて培養を行った。 EGFP陽 性細胞をセルソーティングにより分離することで mTARM発現細胞を得た。
[0143] (2) mTARMの細胞外領域と SEAPおよび Fcキメラタンパク質の作製
まず、 pcDNA3. 1 (+ ) -SEAP (His) — Neoベクターを、以下のように作製した
10
[0144] pCDNA3. 1 (+ )— Neoベクター（Invitrogen社製）の内在性の Sailサイトは、 Sail で消化した後、平滑ィ匕を行うことにより欠損させた。 SEAP (His) の cDNA断片は、
10
pDREF-SEAP His— Hyg (J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514— 21521)を铸型と
6
して、 Hindlllを付カ卩した 5 'プライマーと Xholを付カ卩した 3 'プライマーを用いて PCR で増幅した。得られた cDNA断片を Hindlllと Xholで消化した後、 Sailサイトを欠損 させた PCDNA3. 1 (+ )—Neoベクターに挿入した。
[0145] 次に、 mTARMの細胞外領域は、 mTARM全長 cDNAを铸型として、 Sailを付カロ した 5，プライマー（mTARM F2： (配列番号： 36) )と Notlを付カ卩した 3，プライマー (mTARM― R3： cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat (酉己列番号： 38) )を用い て PCRで増幅した。 PCRは、以下の反応液組成（10 Xバッファー 5 1、 2. 5mM dNTP 4 1、 Pyrobest polymerase (TAKARA社製） 0. 5 1、 100 Μプライ マー 各 0. 5 1、 cDNA 1 1、 DMSO 2. 5 1、蒸留水 36 μ 1)で行った。 PCR は、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5分の反応を 35 サイクル行い、最後に 72°Cで 2分間反応した。増幅した cDNAを pBlueScriptll S K ( + ) (Stratagene社製）にクローユングして、 ABI3100シーケンスアナライザーを用 いて塩基配列を確認した。得られた cDNA断片を Sailと Notlで消化した後、上記 pc DNA3. 1 (+ ) -SEAP (His) —Neoベクターに挿入して、 mTARM— AP発現
10
ベクターを作製した。
[0146] これにより、 mTARMの細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性アルカリフォスファターゼが 3個のアミノ酸リンカ一（Ala - Ala - Ala)で結合され、さらに C末端に 10個のヒスチ ジンタグ (His) のつ 、た分泌キメラタンパク質（以下 APキメラタンパク質）の発現が
10
可能となる。得られた APキメラタンパク質発現ベクターは、 TransIT LT1 (TAKARA 社製)を用いて 293/EBNA— 1細胞株へ導入し、 4から 5日間培養を行った。培養 上清中に分泌された APキメラタンパク質は、遠心分離により培養上清を回収し、 0. 22 μ mのフィルターでろ過した後、 Hepes (pH 7. 4)とアジ化ナトリウムをそれぞれ 最終濃度が 20mM、 0. 02%となるように加えて 4°Cで保存した。 APキメラタンパク質 の濃度は、アルカリフォスファターゼ活性を Aurora AP chemiluminescent rep orter gene assay (ICN社製）を用いて測定して算出した。
[0147] (3) mTARMに対するモノクローナル抗体の作製
免疫用の抗原として用いるために、まず、 mTARM— APキメラタンパク質の精製を 行った。
[0148] 精製は、 APキメラタンパク質の C末端に存在するヒスチジンタグを利用して、 His
Trap Kit (Amersham Biosciences社製）を用いて行った。 mTARM— APキメラタン ノ ク質を含む培養上清を lmlの HiTrap chelating HPカラム（Amersham Bioscien ces社製）に添カロし、 10mM イミダゾール溶液で洗浄した後、 500mM イミダゾー ル溶液で mTARM— APキメラタンパク質をカラムから溶出した。 mTARM - APキメ ラタンノ ク質の濃度は、 Aurora AP chemilumine sc ent reporter gene assa y (ICN社製）を用いた酵素活性測定と Protein Assay kit II (BIO- RAD社製）を 用いたタンパク定量により算出した。
[0149] 得られた mTARM—APキメラタンパク質は、 TiterMaxと混合して WKYラット（日 本 SLC社より入手）に免疫した。免疫したラットからリンパ球を単離して、 P3ミエローマ 細胞 (ATCC)とリンパ球の比率が 1 : 5となるように混合し、 PEG1500溶液（ベーリン ガー社製)を用いて細胞融合を行った。 HAT培地 (Invitrogen社製)でハイブリドーマ を選択し、得られたノヽイブリドーマの培養上清は、 mTARM— Fcキメラタンパク質を 用いたサンドイッチ ELISAによるスクリーニングを行った。陽'性ウエノレからクローニン グを行い、 3種類のクローン（# 6、 # 21、 # 37)を得た。 mTARM— IRES— EGFP を導入した B300. 19細胞に、作製した抗 mTARM抗体を反応させて F ACSにより 解析した結果、作製した抗体は EGFPを発現している B300. 19細胞のみに反応し（ 図 4B)、抗 mTARM抗体の特異性が確認された。
[0150] 得られた抗 mTARMモノクローナル抗体 # 6、 # 21、 # 37を産生するハイブリドー マをヌードマウスの腹腔に接種し腹水を得て、 Protein Gカラムを用いて抗体を精 製した。抗 mTARMモノクローナル抗体 # 6を産生するハイブリドーマは、 FERM B P— 10376のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託 された。
[0151] (4)骨髄由来の培養榭状細胞における TARMタンパク質の発現
得られたモノクローナル抗体 (mAb)を用いて mTARMタンパク質の骨髄由来の培 養榭状細胞表面上への発現を検討した。
[0152] 骨髄由来の培養榭状細胞は、下記の方法で作製した。 C57BLZ6雄マウス（日本 SLC社より入手）の骨髄細胞を 2 X 106個 ZlOmlになるように、マウス GM— CSF (2 OngZml) (R&D system社製）を含む培地（RPMI1640Z10% FBS/lmM ピ ルビン酸ナトリウム Z55 μ Μ 2—メルカプトエタノール）に懸濁し、無処理 10cmディ ッシュに播いて培養した。 3日後に、マウス GM— CSF (20ng/ml)を含む培地 10m 1をカロえて培養を継続した。さらに 3日後、培養液 10mlを回収して遠心した後、細胞 塊を新鮮なマウス GM— CSF (20ng/ml)を含む培地 10mlで懸濁して、元の無処 理 10cmディッシュに戻して 2日間培養した。このようにして得られた未熟榭状細胞は 、 LPS (lOOng/ml) (Sigma社製）を含む培地に 1 X 107個/ 10mlになるように懸濁 し、細胞培養処理済 10cmディッシュに播いて 1日間培養して、成熟榭状細胞を得た
[0153] 骨髄由来の未熟榭状細胞を 5%マウス血清を含む FACS緩衝液 (PBSZl% FB S/l mM EDTA)に懸濁し、抗体 # 6あるいは抗体 # 21 (10 /ζ 8Ζπι1)と反応さ せた後、 ΡΕ標識ロバ抗ラット IgG二次抗体 (Jackson社製）と反応させ、 FACSCalibu r (Becton Dickinson社製）を用いて測定した。その結果、抗体 # 6、抗体 # 21ともに 陰性コントロールのラット IgGに比べて強い陽性反応が認められた。
[0154] そこで、詳細に mTARM発現細胞を解析するために、抗体 # 6を Alexa 647モノク ローナル抗体標識キット (Molecular Probe社製)を用いて蛍光標識を行った。次に、 未熟榭状細胞あるいは LPS刺激で得た成熟榭状細胞を 5%マウス血清、 5%ラット血 清を含む FACS緩衝液（PBSZl% FBS/lmM EDTA)に懸濁し、 FcRブロッ キング溶液 (BD Pharmingen社製)を加えて氷上で 10分反応させた後、蛍光標識抗 mTARM抗体と抗 CD 11 c榭状細胞マーカー抗体および抗 CD40活性化マーカー 抗体と氷上で 30分反応させ、 FACSCaliburを用いて測定した。
[0155] その結果、 mTARMタンパク質は未熟および成熟榭状細胞で発現して ヽること、成 熟骨髄榭状細胞では未熟榭状細胞に比べて mTARMタンパク質の発現が増強され ること、活性化マーカー CD40が発現する細胞で mTARMタンパク質の発現が強 ヽ ことが明らかとなった（図 5)。
[0156] (5)正常マウスにおける TARMタンパク質の発現
骨髄由来榭状細胞での mTARMの発現が認められたことから、正常マウスの免疫 組織での mTARMタンパク質の発現を解析した。
[0157] C57BLZ6雄マウスの骨髄、末梢血、脾臓、腸管リンパ節、パイエル板力 細胞調 整し、 5%マウス血清、 5%ラット血清を含む FACS緩衝液（PBSZl% FBS/lm M EDTA)に懸濁し、 FcRブロッキング溶液をカ卩えて氷上で 10分反応させた。次に 、蛍光標識抗 mTARM抗体と種々の蛍光標識細胞系列マーカー抗体と氷上で 30 分反応させた後、 FACSCaliburを用いて測定した。 [0158] その結果、正常マウスの免疫組織では、脾臓 (SP)における CD3陽性 T細胞、 DX 5陽性 NK細胞、 CD1 lb陽性骨髄系細胞、 CDl lc陽性榭状細胞、また、末梢血 (P BL)における B220陽性 B細胞、 F4Z80陽性単球 Zマクロファージ、 SSC high/ Grl陽性好中球、 SSC highZF4Z80陽性好酸球のいずれにおいても mTARM タンパク質の発現は認められな力つた（図 6)。
[0159] そこで、正常マウス末梢組織での発現を、腹腔から調製した細胞を用いて解析した
[0160] その結果、 mTARMタンパク質は、腹腔の CD3陽性 T細胞、 DX5陽性 NK細胞、 CDl lc陽性榭状細胞、 B220陽性 B細胞、 F4Z80陽性単球 Zマクロファージ、 SS C highZGrl陽性好中球では発現が認められな力つた力 CDl lb陽性骨髄系細 胞の一部で発現が認められたため、さらに解析を進めた結果、 c kit陽性肥満細胞 で mTARMタンパク質が発現していることが明ら力となった（図 7)。
[0161] (6) LPS炎症刺激による榭状細胞での TARMタンパク質の発現誘導
mTARMタンパク質は、培養榭状細胞では発現している力 マウス免疫および末 梢組織の榭状細胞では発現が見られないことから、イン'ビボでは炎症刺激により発 現が誘導されることが考えられた。そこで、 C57BL/6雄マウスに 100 /z gの LPSを 腹腔内投与し、 14時間〜 18時間後に腸間膜リンパ節力も細胞を回収して、 mTAR Mタンパク質の発現を解析した。
[0162] その結果、 LPS炎症刺激により腸間膜リンパ節に移動した CDl lc陽性 ZCD1 lb
+陽性の骨髄系榭状細胞で mTARMタンパク質の発現が認められた（図 8)。したが つて、 mTARMタンパク質は、イン ·ビボにおける正常時の榭状細胞では細胞表面 上に発現していないが、炎症時には榭状細胞とりわけ骨髄系榭状細胞に選択的に 発現していることが明ら力となり、 mTARMタンパク質は炎症時に榭状細胞で機能し ていることが示唆された。
[0163] 「実施例 3Ί 杭 TARM杭体による骨髄由 の焙着榭状細胞の活件化
mTARMは、榭状細胞で選択的に発現していることから、 mTARMの架橋刺激に よる榭状細胞の活性ィ匕につ!、て検討した。
[0164] 骨髄由来の未熟榭状細胞あるいは成熟榭状細胞は、 1 X 108個を 350 1の MAC S緩衝液（PBSZl% FBS/2mM EDTA)に懸濁し、 FcRブロッキング溶液（Milt enyi社製）を 50 μ 1加えて 4°Cで 10分反応させた後、 CD 11cマイクロビーズ (Miltenyi 社製）を 100 1加えて 4°Cで 30分反応させた後、 Auto MACS (Miltenyi社製）を用 いて CDl lc陽性細胞を分離精製して調整した。 96穴プレートに F (ab) ' 2抗ラッ Hg G抗体（10 /z gZml) (Jackson社製）を 37°Cで 2時間固相化し、 PBSで洗浄した後に 抗 mTARM抗体 # 6、 # 21もしくは陰性コントロールのラット IgG (10 μ g/ml)を 37 °Cで 1時間固相化させた。プレートを PBSで洗浄後、精製した CDl lc陽性榭状細胞 を培地あるいは最終濃度 2 μ gZmlの抗 CD40活性化抗体 (BD Pharmingen社製） を含む培地で培養した。 24時間もしくは 48時間後に培養上清を回収し、 DuoSet ELISA Development kit (R&D社製）を用いてサイト力インの検出を行った。
[0165] その結果、抗 mTARM抗体は、骨髄由来の成熟榭状細胞力 の IL 6の産生を 抗 CD40抗体と同程度に誘導し、さらに抗 CD40抗体との相加効果があることが明ら 力となった（図 9A)。同様に、未熟榭状細胞でも IL— 6の産生を誘導する傾向が認め られた。さらに、未熟骨髄榭状細胞からの MCP— 1の産生を抗 mTARM抗体が誘 導したが、抗 CD40抗体では誘導が認められなかった（図 9B)。抗 mTARM抗体に よる MCP— 1の産生誘導は、成熟骨髄榭状細胞では認められな力つた。その他、 IL — 12、 TNF α、 IL— 1 j8、 IL— 10、 KCの産生誘導も解析した力 抗 mTARM抗体 では、未熟榭状細胞と成熟榭状細胞のいずれにおいても顕著な影響は認められな かった。
[0166] 以上の結果から、榭状細胞上の mTARMは、特定のサイトカインゃケモカイン (例 えば、 IL—6 MCP—1)の産生に関与していることが明らかとなった。
[0167] 「実施例 4Ί TARMと FcR y鎖との複合体形成
mTARMが榭状細胞の活性ィ匕受容体として機能することが明ら力となったので、シ グナル伝達分子の解明を試みた。 mTARMは破骨細胞の分ィ匕に関与する Oscarと 細胞膜貫通部位が似て 、る。 Oscarは IgE受容体としてよく知られて ヽるシグナル伝 達分子 FcR γ鎖と複合体を形成することが知られており、この会合は Oscarの細胞 膜貫通領域の塩基性アミノ酸と FcR y鎖の酸性アミノ酸の相互作用が関与すると考 えられている。 mTARMも細胞膜貫通領域に塩基性アミノ酸を有している。一方、 Fc R Ύ鎖と同様に細胞膜貫通領域に酸性アミノ酸を有する活性ィ匕シグナル伝達分子と して DAP10、 DAP12が知られている。そこで、 FcR y鎖、 DAP10、あるいは DAP 12が mTARMと複合体を形成するカゝ否かを検討した。
[0168] FcR y鎖、 DAP10、 DAP12の発現ベクターは、それぞれ、 GenBank™の NM— 010185、 AF072846, NM一 011662に記載の塩基酉己歹 IJをもとに設計した下記の プライマー
FcR γ F： cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT (配列番号： 39) FcR γ R： gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT (配列番号： 40) DAP 10 F： cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC (配列番号： 41) DAP 10 R： gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT (配列番号： 42) DAP 12 F: cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT (配列番号： 43) DAP 12 R: gcgggcggccgcTCATCTGTAATATTGCCTCTGTGT (配列番号： 44) を用いて増幅した cDNA断片を、 Flagタグ配列が N末端に付加された型で細胞表面 上に発現するように設計された発現ベクター pMXII IRES— Puroに挿入して作製 した。そして、 mTARMの発現細胞の作製と同様の方法で組換えレトロウイルスを作 製し、 mTARM発現 B300. 19細胞に感染させ、ピューロマイシン存在下で培養す ることで感染細胞を選択した。得られた B300. 19強制発現細胞を FACS緩衝液 (P BS/1% FBS/lmM EDTA)に懸濁し、最終濃度 gZmlの抗体 # 6およ びマウス抗 Flag抗体 (Sigma社製）と反応させた後、 PE標識ロバ抗ラット IgG二次抗 体 (Jackson社製)および Cy5標識ロバ抗マウス IgG二次抗体 (Jackson社製）と反応さ せ、 FACSCalibur (Becton Dickinson社製）を用いて測定した。
[0169] その結果、 mTARMと FcR γ鎖を同時に発現させた場合に、 FcR γ鎖の細胞表面 上への発現が mTARMの細胞表面上への発現量に伴って増加することが明らかと なった。 DAP10および DAP12の細胞表面上への発現は mTARMの発現量に依 存していなカゝつた。したがって、 FcR γ鎖は mTARMと複合体を形成することで細胞 表面への発現が増加することが示唆された（図 10)。
[0170] 次に、生化学的に mTARMの結合タンパク質を解析した。
[0171] B300. 19強制発現細胞を 1% digtoninを含む細胞溶解液（1% digtonin/5 OmM Tris-HCl (pH 7. 5) /150mM NaCl/5mM NaF/ ImM ortho vanadate/Complete™ (Roche社製） )で可溶化して、抗 Flag抗体で免疫沈降を 行！、、抗 mTARM抗体 # 6でィムノブロットを行った。
[0172] その結果、 FcR y鎖と共に mTARMが免疫沈降されており、 DAP10および DAP 12と mTARMは共に免疫沈降されなかった（図 11A)。抗 Flag抗体で FcR γ鎖、 D AP10、 DAP12がそれぞれ免疫沈降されていることは、抗 Flag抗体によるィムノブ口 ットで確認した。また、 B300. 19強制発現細胞での mTARMと Flagタグを付カ卩した FcR y鎖、 DAP10および DAP12の発現は、細胞溶解液を抗 mTARM抗体 # 6あ るいは抗 Flag抗体によるィムノブロットで確認している。したがって、 B300. 19強制 発現細胞において、 FcR γ鎖と mTARMが複合体を形成していることが明ら力とな つた o
[0173] さらに、骨髄由来の成熟榭状細胞を 1% digtoninを含む細胞溶解液で可溶ィ匕し て、陰性コントロールのラット IgG、抗 mTARM抗体 # 21、抗 CD54抗体および抗 Fc R y鎖抗体で免疫沈降を行 ヽ、抗 FcR y鎖抗体でィムノブロットを行った。
[0174] その結果、 mTARMと共に FcR γ鎖が免疫沈降されており、別の細胞膜タンパク 質の CD54と FcR y鎖は共に免疫沈降されな力つた（図 11Β)。したがって、成熟榭 状細胞においても、 FcR γ鎖と mTARMが複合体を形成していることが明ら力となつ た。
[0175] これらの結果より、 mTARMの架橋刺激による榭状細胞の活性ィ匕は、 FcR γ鎖か らのシグナル伝達を介して 、ることが示唆された。
[0176] 「実施例 5Ί 岡相化した TARMに針する活件化リンパ球の接着
(1)活性化 Τ細胞上での mTARM結合分子の発現
榭状細胞は、抗原提示細胞として T細胞と相互作用することが知られている。した がって、 mTARMと結合する分子が T細胞上に発現し、この分子を介して榭状細胞 の活性ィ匕が制御されていると考えられた。そこで、 T細胞上に mTARM結合分子が 存在するか否かにつ!、て検討した。
[0177] C57BL/6雄マウスの脾臓細胞 4 X 107個を 70 μ 1の MACS緩衝液（PBS/ 1%
FBS/2mM EDTA)に懸濁し、 FcRブロッキング溶液（Miltenyi社製）を 10 μ 1加え て 4°Cで 10分間反応させ、さらに CD4マイクロビーズ（Miltenyi社製）を 100 μ 1加えて 4°Cで 15分間反応させた後、 Auto MACSを用いて休止期 CD4陽性 T細胞を得た 。 MACSで精製した CD4陽性細胞は 1 X 106個/ mlになるように培地 (RPMI1640 /10% FBS/lmM ピルビン酸ナトリウム Z55uM 2—メルカプトエタノール）に 懸濁し、抗 CD3抗体 (eBiosdence社製）を 1 μ gZml溶液により 37°Cで 2時間固相化 したプレートに加え、抗 CD28抗体（Pharmingen社製） 2 /z gZml存在下で刺激した。 Thlへ分化させる場合は、マウス IL 12 (10ngZml) (Peprotech社製）と抗マウス I L— 4抗体（10 μ g/ml) (MP4— 25D2 ;Pharmingen社製）存在下で、 Th2へ分化さ せる場合は、マウス IL 4 (15ngZml) (Genzyme社製）と抗マウス IL 12抗体（15 ^ g/ml) (24910. 1 ; ?11 \&¾6 土製)存在下で抗じ03抗体刺激を行った。刺激 力ら 2日後、 Thl条件ではマウス IL— 2 (20ngZml) (Genzyme社製）とマウス IL— 12 (lOngZml)を加え、また Th2条件ではマウス IL—2 (20ngZml)とマウス IL— 4 (1 5ngZml)をカ卩ぇ培養を行った。 Thl細胞は、 IFN— yの産生により、 Th2細胞は、 I L— 4の産生によりそれぞれ分ィ匕していること確認した。
[0178] MACSで精製した直後の休止期 CD4陽性 T細胞と CD3刺激後 2日および 8日後 の活性ィ匕 CD4陽性 T細胞を用いて、 mTARM— APキメラタンパク質の細胞表面上 への結合活性を検討した。細胞は FACS緩衝液 (PBSZl% FBS)に懸濁し、最終 濃度 30 μ g/mlの mTARM— APキメラタンパク質あるいは陰性コントロールの AP タンパク質と氷上で 30分間反応させ、ゥサギ抗 PLAP抗体 (6000倍希釈）（コスモバ ィォ社)を加え氷上で 30分間反応させた後、さらに PE標識ロバ抗ゥサギ IgG (H+L )抗体（50倍希釈）（Jackson社製）を力卩ぇ氷上で 30分間反応させた。 mTARM— AP キメラタンパク質の結合は、 FACSCaliburを用いて測定した。
[0179] その結果、 mTARM結合分子が、休止期 CD4陽性 T細胞には発現していないが、 活性ィ匕 CD4陽性 T細胞で発現が誘導されることが明らカゝとなった（図 12)。 mTARM 結合分子は、刺激 2日後ではすでに発現しており、 8日後でも発現が維持されて!、た 。 Thl、 Th2いずれの分ィヒ条件でも mTARM結合分子は発現していた力 8日後で は Th2細胞での発現が Thl細胞に比較して強 、傾向が認められた（図 12)。
[0180] (2)活性化 T細胞の mTARM組換えタンパク質への接着 次に mTARMが活性化 T細胞に対する接着分子として機能するカゝ否かを検討した
[0181] まず、 96穴 ELISAプレート（Nunc社製）に抗アルカリフォスファターゼ抗体（10 μ g /ml) (Seradyn社製）を 50 1ずつ加え、 37°Cで 30分間静置して固相化した。 PBS で洗浄した後、ブロックエース (大日本製薬社製)で非特異的結合部位をブロックした 。 APキメラタンパク質（ΙΟηΜ)を各穴に加え、室温で 30分間静置して固相化した。 刺激 6から 9日後の活性化 T細胞は、細胞接着緩衝液 (RPMI1640Z0. 5% BSA /20mM HEPES (pH 7. 4) )に懸濁して、 Calcein—AM (同仁社製）で蛍光 標識した後、 1穴あたり I X 105個ずつ加え、 37° Cで 1時間反応させた。非接着細 胞を洗浄して除き、細胞溶解液（10mM Tris— HCl (pH 8. 0) /1% TritonX — 100)を加えた後、 Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer社製)を用いて、励起波長 485nm、検出波長 535nmで測定し、接着 細胞を定量した。細胞接着の程度は、添加した細胞に対する接着した細胞の割合を パーセントで表した。
[0182] その結果、 mTARMは活性化 T細胞に対する接着分子として機能することが明ら カゝとなった（図 13)。 Thl細胞、 Th2細胞いずれも mTARMに対する接着活性を示 したが、 Th2細胞の mTARMに対する接着活性が Thl細胞に比較して高 ヽ傾向が 認められた。
[0183] 「 施例 6Ί 杭 TARM杭体の細朐榇羞阳.害活件
mTARMを介した Th2細胞の細胞接着に及ぼす抗 TARM抗体の効果を検討した
[0184] Th2細胞に抗 mTARM抗体 10 μ gZmlをカ卩えて室温で 10分間前処理した後、 m TARM— APキメラタンパク質を固相化したプレートにこれをカ卩え、抗体存在下での 細胞接着活性を検討した。
[0185] その結果、 Th2細胞の mTARM— APキメラタンパク質への接着は、抗 mTARM 抗体 # 6、 # 21、 # 37のいずれにおいても顕著に抑制された（図 14)。
[0186] 「実施例 7Ί コラーゲン誘導閣節炎モデルにおける杭 TARM杭体の治療効果
コラーゲン誘導関節炎（Collagen-Induced Arthritis: CIA)モデルは自己免疫性の関 節リウマチの疾患モデルであり、 II型コラーゲンに反応する CD4陽性 T細胞および抗 体が検出されることから、両者が協同して関節炎を惹起すると考えられている。また、 CIAモデルでは、 MHCクラス IIに拘束があると言われている。 TARMは、榭状細胞 に発現する活性化分子であり、また TARMの結合分子を介して活性化 Τ細胞の細 胞接着を誘導する。したがって、抗 TARM抗体により榭状細胞と活性化 Τ細胞の相 互作用を阻害することで、榭状細胞や活性化 T細胞の関与する免疫応答を抑制する 可能性が考えられた。そこで、 CIAモデルにおける抗 TARM抗体の治療効果を検 B、Jした。
[0187] ゥシ関節由来の II型コラーゲン 3%溶液 （コラーゲン技術研修会社製)と完全フロ イントアジュバント（Difco社製）を等量混合してェマルジヨンを作製し、 5週齢の DBA ZUマウス（チャールズリバ一社より入手）に一匹あたり 100 1(150 μ gZ匹）を、 21日目（初回免疫）と 0日目（追加免疫）に臀部皮内に免疫した。抗 mTARM抗体 # 6は、追加免疫時から 500 gZl回で週 2回、尾静脈に投与した。追加免疫から 3日 目より体重測定と外見的評価を行い、 13日目に屠殺した。外見的所見は、以下の様 にスコア化して評価した。 0 :非発症、 1 :紅斑と足根もしくは足首の関節に軽い腫脹、 2：紅斑と足首から足根にかけて軽!、腫脹、 3：紅斑と足首から中足の関節にかけて の中程度の腫脹、 4 :紅斑と足首、足、指全体に重度の腫脹。
[0188] その結果、抗 mTARM抗体投与により、肉眼的所見において明らかな症状の軽減 と、体重減少の抑制が認められた（図 15)。
[0189] また、屠殺したマウスの腹部大静脈よりへノ^ン採血をおこない、血漿中の血清アミ ロイド A (Serum Amyloid A: SAA)濃度とコラーゲンに対する抗体価を測定した 。 SAAは炎症刺激により産生されたサイト力インの作用により、肝細胞で産生される 血漿タンパク質であり、血漿中の SAA濃度は炎症の指標となる。コラーゲンに対する 抗体価は抗原特異的免疫応答の指標となる。
[0190] 血漿中の SAAの濃度は、血漿を 8000倍希釈し、 ELISAキット（バイオソース社製 )を用いて測定した。
[0191] また、血漿中のコラーゲンに対する抗体価の測定は、以下のように行った。
[0192] まず、 96穴 ELISAプレート（Nunc社製）に 5 gZmlのゥシ関節由来の II型コラー ゲン溶液を 50 μ 1ずつ加え、 4°Cでー晚静置して固相化した。 T-PBS (0. 02% T ween20ZPBS)で洗浄後、 1% BSAZPBSで非特異的結合部位をブロックした。 T— PBSで 3回洗浄後、 T—PBSで 10万倍希釈した血漿を 50 1ずつ各穴に加え、 室温で 2時間静置した。 T—PBSで 3回洗浄後、ピオチンィ匕抗マウス IgGl (BD社製） 、ピオチン化抗マウス IgG2a (BD社製）を T—PBSで 1000倍希釈して 50 μ 1ずつ各 穴に加え、室温で 2時間静置した。 T—PBSで 3回洗浄後、 HRP標識ストレプトアビ ジン（Pierce社製）を T—PBSで 5000倍希釈して 50 μ 1ずつ各穴に加え、室温で 30 分間静置した。その後、発色基質を用いて発色させた。
[0193] その結果、血漿中の SAAの濃度が、抗 mTARM抗体の投与により減少していた（ 図 16)。また、血漿中の抗コラーゲン抗体価は、抗 mTARM抗体の投与により変化 が認められなかった（図 17)。
[0194] 「 施例 8Ί ヒト TARM全長遣伝早西 R列の決定
ヒト TARM遺伝子を同定するために、マウス TARM遺伝子配列を用いて BLAST 検索を行った。その結果、マウス TARM cDNA配列と相同性が高い配列 Genban kァクセッション番号: XM— 497642を見出した。しかしながら、 XM— 497642力コ ードするアミノ酸配列（LOC441864)にはシグナルシーケンス配列が存在せず、細 胞膜タンパク質として機能するとは考えられなカゝつた。 XM— 497642は推定上の配 列であり、ゲノム配列力 の cDNA配列推定が間違っていると考えられた。そこで、ヒ ト TARMの完全長遺伝子配列の決定を試みた。 TARMの発現組織を同定し、 5 ' 、 3，—RACEを行って TRAM cDNAの完全長配列を推定した後、 TARMタンパ ク質をコードする領域の配列をもとにプライマーを設計して完全長 cDNAの単離を行 つた o
[0195] (1)ヒト TARM遺伝子の発現解析
まず、 hTARMのヒト組織での発現解析を行った。 GenBankァクセッション番号: X M— 497642の配列をもとにプライマーを設計した。
hTARM F1： TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (配列番号： 45)
hTARM R1： TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (配列番号： 46)
ヒト各臓器の全 RNA(Clontech社製）から RNA PCR kit (TAKARA社製）を用い て合成した 1本鎖 cDNAを铸型として、 ABI7700でリアルタイム PCRを行った。 PCR は以下の反応液組成（QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAG EN社製） 12. 5 ^ 1, Uracil DNA Glycosylase (Invitrogen社製） 0. 25 1、 10 O ^ M F プライマー 0. 125 1、 ΙΟΟ Μ R プライマー 0. 125 1、铸型 cD NA (10倍希釈） 2. 5 1, 蒸留水 7. 25 1)で行った。 PCRは、 94°Cで 10分間 処理した後、 94°Cで 30秒、 60°Cで 1分の反応を 35サイクルで行った。
[0196] その結果、 hTARM遺伝子も mTARM遺伝子と同様に骨髄で強く発現しているこ とが明らかとなった（図 18)。
[0197] (2)ヒト TARM遺伝子の単離
hTARM遺伝子は骨髄において発現がみられたので、骨髄の全 RNAを用いて 5 ' 一 RACEおよび 3， 一 RACEで hTARMの全長遺伝子配列の決定を試みた。
[0198] まず、骨髄の全 RNAから cDNA synthesis kit (TAKARAs社製）を用いて二本鎖 cDNAを合成し、 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen社製）を用いて cDN Aを精製した。次に ad29アダプターを付加し、 RACEの铸型とした。 1st PCRは、 以下の反応液組成（lO X ExTaq buffer 5 1、 2. 5mM dNTP 4 1、 ExTaq 0. 25 1、 100 M プライマー （5，PCR4) 0. 5 1、 100 M Gene specific primer 0. 5 1、 ad29アダプター付加 cDNA (25倍希釈） 1 ^ 1,蒸留水 38. 7 5 1)で行った。
[0199] プライマーは、
5， PCR4： AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (配列番号：21)
hTARM— RACE— 5 '—4： CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (配列番号： 47
)、あるいは
hTARM— RACE— 3，—4： GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (配列番号： 48 )を用いた。
PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 1分、 72°Cで 5分の反応 を 30サイクル行 ヽ、最後に 72°Cで 5分間反応した。
[0200] 2nd PCRは、以下の反応液組成（lO X ExTaq buffer 5 1、 2. 5mM dNTP
4 μ ExTaq 0. 25 1、 100 M プライマー （5，PCR1) 0. 5 1、 100 M Gene specific primer 0. 5 ^ 1, 1st PCR 産物（100倍希釈） 1 1、蒸留水 38. 75 /z l)で行った。
[0201] プライマーは以下の配列を用いた。
5' PCR1 (配列番号： 24)、
h29B140 Fl :TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (配列番号： 49)、あるいは h29B140 R1 :TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (配列番号： 50)
PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5分の反 応を 25サイクル行い、最後に 72°Cで 5分間反応した。増幅した cDNA断片を pCR2
. 1 (Invitrogen社製）にクローユングした後、 ABI3100シーケンスアナライザーを用い て塩基配列を決定した。
[0202] その結果、 XM— 497642に記載の配列と全く異なる 5'および 3'の塩基配列が得 られた (配列番号: 9)。
[0203] RACEで得られた塩基配列情報を用いて設計したプライマー
h29B140_SalI-Kozac_F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTT
CCCTC (配列番号： 51)
h29B140— Notl—R: cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC (配列番 号 : 52)
と、骨髄の全 RNAから RNA PCR kit (TAKARA社製）を用いて合成した 1本鎖 cD NAを铸型として PCRを行った。 PCRは、以下の反応液組成（10 Xバッファー 5 μ 1 、 2. 5mM dNTP 4 1、 Pyrobest polymerase (TAKARA社製） 0. 5 ^ 1, 100 μ Μ プライマー 各 0. 5 1、 cDNA 1 1、 DMSO 2. 5 1、蒸留水 36 μ 1)で 行った。 PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5 分の反応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 2分間反応した。増幅した cDNAを pBlu eScriptll SK ( + ) (Stratagene社製）にクローユングして、 ABI3100シーケンスアナ ライザ一を用 V、て塩基配列を決定した。得られた hTARM cDNAの塩基配列は R ACEで決定した配列と一致して!/、た（配列番号： 9)。 hTARM cDNAがコードする アミノ酸配列（配列番号： 10)は、細胞膜タンパク質として機能するために必要なシグ ナルシーケンスが N末端に存在した。 hTARCと XM 497642力コードするアミノ酸 配列 (LOC441864)では、 N末端と C末端が異なっていた。したがって、ゲノム配列 力 の推定 cDNA配列 XM— 497642は実際には存在せず、 hTARM cDNAが 細胞膜タンパク質 hTARMをコードする実在する遺伝子であることが明らカゝとなった（ 図 19)。
[0204] 「実施例 9Ί ヒト TARMに対する抗体の作製
(1)ヒト TARM遺伝子発現細胞の作製
ヒト TARM遺伝子発現ベクターは、実施例 8で得られた hTARM cDNAを発現べ クタ一 pMXII IRES EGFP (Oncogene(2000)19(27):3050- 3058)に挿入して作製し た。
[0205] 組換えレトロウイルスの作製は以下のように行った。
293/EBNA- 1細胞株（Invitrogen社製） 3xl06個を培地（D—MEMZlO%FB S)に懸濁して 10cmディッシュに播き、 COインキュベーターで 24時間培養した。翌
2
日、培地を交換し、以下のように調製したトランスフエクシヨン溶液を加えてトランスフ ェクシヨンを行った。トランスフエクシヨン溶液は、 5mlチューブに OPTI— MEM (GIB CO BRL社製）を 600 μ 1と TransIT LTl (TaKaRa社製） 24 μ 1を加えて混合して室 温 5分静置した後、発現ベクター 9 μ gとパッケージングベクターである pCL—Eco ( Imgenex社製） 9 μ gを加えて室温 5分静置して調製した。 48時間後に、培養上清を 回収して 0. 45 mのフィルターろ過を行い、組換えウィルス液を得た。
[0206] この組換えウィルスを以下のように B300. 19細胞株に感染させ、 hTARM遺伝子 発現細胞を作製した。 B300. 19細胞 lxlO6個を 15mlチューブに加え、 1200rp m、 25°Cで 5分間遠心後、培養上清を吸引除去した。細胞に、組換えウィルス液 2 mlに polybrene (lOmgZml) 2 55 Μ 2—メルカプトエタノール 2 1をカロ えて混合した溶液を加え、 2500rpm、 30°Cで 2時間遠心して感染を行った。感染後 に組換えウィルス液を除去し、培地（RPMI— 1640ZlO%FBSZ55uM 2—メル カプトエタノール）をカ卩えて培養を行った。 EGFP陽性細胞をセルソーティングにより 分離することで hTARM発現細胞を得た。
[0207] (2) hTARMの細胞外領域と SEAPおよび Fcキメラタンパク質の作製
hTARMの細胞外領域は、 hTARM全長 cDNAを铸型として、 Sailを付カ卩した 5' プライマー（h29B140— Sail— Kozac— F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAG CTGCTTTCCCTC (配列番号： 51) )と Notlを付カ卩した 3，プライマー（h29B140_ Notl— SEAP— R： gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTCGATGT (配列番号 : 53) )を用いて PCRで増幅した。 PCRは、以下の反応液組成（10 Xバッファー 5 1、 2. 5mM dNTP 4 1、 Pyrobest polymerase (TAKARA社製） 0. 5 1、 100 μ Μプライマー 各 0. 5 1、 cDNA 1 1、 DMSO 2. 5 1、蒸留水 36 μ 1) で行った。 PCRは、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 72°Cで 5分の反応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 2分間反応した。増幅した cDNAを pBl ueScriptll SK ( + ) (Stratagene社製）にクローユングして、 ABI3100シーケンスァ ナライザ一を用いて塩基配列を確認した。得られた cDNA断片を Sailと Notlで消化 した後、実施例 2に記載の pcDNA3. 1 (+ )— SEAP (His) — Neoベクターに揷
10
入して、 hTARM—AP発現ベクターを作製した。
[0208] これにより、 hTARMの細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性アルカリフォスファターゼが 3 個のアミノ酸リンカ一（Ala - Ala - Ala)で結合され、さらに C末端に 10個のヒスチジ ンタグ (His) のつ 、た分泌キメラタンパク質（以下、 APキメラタンパク質と 、う）の発
10
現が可能となる。得られた APキメラタンパク質発現ベクターは、 TransIT LT1 (TA KARA社製）を用いて 293/EBNA— 1細胞株へ導入し、 4力も 5日間培養を行った 。培養上清中に分泌された APキメラタンパク質は、遠心分離により培養上清を回収 し、 0. 22 mのフィルターでろ過した後、 Hepes (pH 7. 4)とアジ化ナトリウムをそ れぞれ最終濃度が 20mM、 0. 02%となるようにカ卩えて 4°Cで保存した。 APキメラタ ンパク質の濃度は、アルカリフォスファターゼ活性を Aurora AP chemiluminesce nt reporter gene assay (ICN社製）を用いて測定して算出した。
[0209] (3) hTARMに対するモノクローナル抗体の作製
免疫用の抗原として用いるために、まず、 hTARM— APキメラタンパク質の精製を 行った。
[0210] 精製は、 APキメラタンパク質の C末端に存在するヒスチジンタグを利用して、 His Trap Kit (Amersham Biosciences社製）を用いて行った。 hTARM— APキメラタン ノ ク質を含む培養上清を lmlの HiTrap chelating HPカラム（Amersham Bioscien ces社製）に添カロし、 10mM イミダゾール溶液で洗浄した後、 500mM イミダゾー ル溶液で hTARM— APキメラタンパク質をカラムから溶出した。 hTARM - APキメ フタンノヽク質の 度は、 Aurora AP cnemilumme sc ent reporter gene assa y (ICN社製）を用いた酵素活性測定と Protein Assay kit II (BIO- RAD社製）を 用いたタンパク定量により算出した。
[0211] つぎに、コージンバイオ株式会社に委託して、得られた hTARM— APキメラタンパ クを抗原として BalbZcマウスに免疫した。免疫したマウスからリンパ球を単離して、 P 3U1ミエローマ細胞とリンパ球を混合し、 PEG法にて細胞融合を行った。得られたハ イブリドーマの培養上清を用いて hTARM— Fcキメラタンパク質を用いた ELISAに よるスクリーニングを行った。陽性ゥエルからクローユングを行い、 6種類のクローン（ # 11、 # 18、 # 19、 # 22、 # 26、 # 40)を得た。 FACSにより特異性を検討した結 果、各クローンともに hTARM発現 B300. 19細胞のみに反応し、親株の B300. 19 細胞には反応しなかった。得られた抗 hTARMモノクローナル抗体 # 11、 # 18、 # 19、 # 22、 # 26、 # 40を産生するハイブリドーマをヌードマウスの腹腔に接種し腹 水を得て、 Protein Aカラムを用いて抗体を精製した。
[0212] 施例 ίθΊ 活件化ヒト Τ細胞の hTARM組椽 タンパク皙への榇羞
ヒト末梢血をへパリン採血し、等量の Ficoll—Paque PLUS (Amersham Bioscienc es)を加え、 400xg 30分の比重遠心分離法により単核球を単離した。 MACS緩衝 液（PBSZl% FBS/2mM EDTA)に懸濁し、 FcRブロッキング溶液（Miltenyi社 製）を 5 μ 1/1 X 107個でカ卩え、 4°Cで 15分間反応させた。ヒト CD25 + CD4+ Tre g isolation kit (Miltenyi社製）と Auto MACSを用いて休止期 CD4陽性 T細胞 を得た。 MACSで精製した CD4陽性細胞は、 PE標識マウス抗ヒト CD25抗体 (Milte nyi社製）と FITC標識マウス抗ヒト CD4抗体 (Miltenyi社製)をそれぞれ溶液の lZl 1 容量加え 4°Cで 20分間反応させ、 FACS Aria (BD Biosciences)を用いて CD4陽 性 CD25陰性 T細胞を得た。 CD4陽性 CD25陰性 T細胞は T Cell Activation/ Expansion Kit human (Miltenyi社製）を用いて活性化させた。刺激後 3日目から ヒト IL— 2 (2ng/ml)を加え、刺激後 6日目と 8日目の活性ィ匕 CD4陽性 T細胞を用い て、 hTARM— APキメラタンパク質が活性化 T細胞に対する接着分子として機能す るカゝ否かを検討した。
[0213] まず、 96穴 ELISAプレート（Nunc社製）に抗アルカリフォスファターゼ抗体（10 μ g /ml) (Seradyn社製）を 50 1ずつ加え、 37°Cで 30分間静置して固相化した。 PBS で洗浄した後、ブロックエース (大日本製薬社製)で非特異的結合部位をブロックした 。 APキメラタンパク質（InM)を各穴に加え、室温で 30分間静置して固相化した。活 性化 T細胞は、細胞接着緩衝液 (RPMI1640Z0. 5% BSA/20mM HEPES /55nM 2ME (pH 7. 4) )に懸濁して、 Calcein— AM (同仁社製）で蛍光標識し た後、 1穴あたり 5xl04個ずつ加え、 37° Cで 1時間反応させた。非接着細胞を洗浄 して除き、細胞溶解液（10mM Tris— HCl (pH 8. 0) /1% TritonX— 100)を 加えた後、 Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin El mer社製)を用いて、励起波長 485nm、検出波長 535nmで測定し、接着細胞を定 量した。細胞接着の程度は、添加した細胞に対する接着した細胞の割合をパーセン トで表した。
[0214] その結果、 hTARMは活性化ヒト T細胞に対する接着分子として機能することが明 らかとなつた（図 20)。
[0215] m 杭 τ ARM杭体の細朐榇羞阳.害活件
hTARMを介した活性化ヒト T細胞の細胞接着に及ぼす抗 TARM抗体の効果を検 B、Jした。
[0216] APキメラタンパク質を各穴に加え、室温で 30分間静置して固相化した後、各穴に 抗 hTARM抗体（# 11、 # 18、 # 19、 # 22、 # 26、 # 40) 10 gZmlを加えて室 温で 30分間前処理した。その後蛍光標識した活性化 T細胞を加え、各抗体存在下 での細胞接着活性を検討した。なお、 # 11、 # 19、 # 26、 # 40については抗 IgG2 a抗体を、 # 18、 # 22については抗 IgG2b抗体を対照として用いた。
[0217] その結果、活性化 T細胞の hTARM— APキメラタンパク質への接着は、抗 hTAR M抗体 # 18、 # 19、 # 22、 # 26において顕著に抑制され、 # 11、 # 40において 部分的な抑制がみられた（図 20)。
[0218] [実施例 12] mTARMに対する新規リガンド mTARM— Lの同定
( 1 ) mTARM - L (mTARM Ligand)候ネ ΐ分子の選択 活性化 T細胞上に mTARM結合分子が存在することから（実施例 5)、マウス免疫 細胞由来の細胞株（L5178Y— R細胞株、 BW5147細胞株、 Raw264. 7細胞株） にも mTARM結合分子が存在する力否かについて実施例 5に記載の方法を用いて 検討した。
[0219] その結果、 mTARM結合分子が、 L5178Y— R細胞株で強く発現している力 BW 5147細胞株ぉょひ & 264. 7細胞株ではほとんど発現していないことが明らかと なった（図 21A)。
[0220] 次に、 mTARMに対する未知のリガンドがィムノグロブリンスーパーファミリー（IgS F)に属すると仮定して、 Mouse Ensembleのデータベースを検索して 47個の IgS F候補に着目して、免疫細胞における発現をリアルタイム PCRで調べた。全 RNAは 、 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、 L5178Y—R細胞、 BW 5147細胞、 Raw264. 7細胞から単離した。リアルタイム PCRは、 SYBR— green存 在卜 (？ ABI 7 ( 00 sequence Detect ion System (PE Applied- Biosystems) を用いて行った。
[0221] その結果、 ENSMUSG00000035095 (A530065I17Rik, NM_176953) の mRNA発現（プライマー # 2558： CAGCTGGCAAGAGGAACAGT (配列番号： 54) , # 2559 : GAGCATCGGCACTTATCTCC (配列番号： 55)を使用）が mTAR M—APキメラタンパク質の細胞への結合活性と相関するパターンを示した（図 22B) 。しかしながら、 ENSMUSG00000035095がコードするアミノ酸配列には細胞膜 貫通領域が存在せず、細胞膜タンパク質として機能するとは考えられな力つた。この アミノ酸配列は推定上の配列であり、ゲノム配列力 の cDNA配列の推定が間違つ ていると考えられた。そこで、まず、ヒト相同遺伝子産物の同定を試みて、 ENSMUS G00000035095がコードするアミノ酸配列を用いてデータベース検索を行った。そ の結果、 ENSMUSG00000035095がコードするアミノ酸配列と相同性が高いヒト アミノ酸配列 LOC196264を見出した。このアミノ酸配列は、 1つのィムノグロブリンル ープ構造領域を含む細胞膜タンパク質を呈していた。したがって、 LOC196264が T ARM— L候補の完全長ヒトアミノ酸配列であると考えられた。つぎに LOC196264の アミノ酸配列を用いてデータベースの tblastn検索をおこなった。その結果、マウス B ACクローン AC 122305のゲノム塩基配列に、 LOC 196264のアミノ酸配列に相同 性がある配列をコードする領域を見出した。この配列からマウス TARM— L候補の c DNA配列とアミノ酸配列を推定してプライマー 番号： 56)
# 2694： GCGGGCGGCCGCTCAGTACGCCTCTTCTTCGTAGTC (配列番号： 57)
を設計し、完全長タンパク質をコードする cDNAの単離を行った。テンプレートには、 Thl day2の全 RNAを用い、実施例 1に記載の方法で cDNAを増幅した。増幅し た cDNAを発現ベクター pMXII IRES EGFP (Oncogene(2000)19(27):3050- 3058 )に挿入して、 mTARM— L候補遺伝子発現ベクターを作製して、 ABI3100シーケ ンスアナライザーを用 Vヽて塩基配列を決定した (配列番号：13)。
[0222] (2) mTARM— Lの同定
つぎに、 mTARM— L候補が TARMに対する未知のリガンドであるかどうかを調べ るため、この分子の発現細胞を実施例 2に記載の方法で作製した。 mTARM -AP キメラタンパク質の mTARM— L候補発現細胞の細胞表面上への結合活性と固相 化した mTARMに対する mTARM— L候補発現細胞の接着活性の測定は実施例 5 に記載の方法で行った。
[0223] その結果、mTARM—APは、EGFP陽性のmTARM—L発現B300. 19細胞に 特異的に結合した力 EGFP陽性のコントロールベクターを導入した B300. 19細胞 には結合しなかった（図 22A)。陰性コントロールの APは、 EGFP陽性の mTARM L発現 B300. 19細胞に結合しなかった（図 22A)。
[0224] さらに、 APおよび mTARM— APキメラタンパク質に対する mTARM— L発現 B30 0. 19細胞との接着活性を調べたところ、 mTARM— APキメラタンパク質のみに細 胞が接着した（図 22B)。
[0225] 以上の結果より、 mTARM— L候補分子が実際に新規な TARMに対するリガンド であることが明ら力となり、該リガンドを mTARM— L (TARM Ligand)と命名した。
[0226] hTARM— Lは、 LOC196264のアミノ酸配列をコードする NM 198275の塩基 配列をもとにしてプライマー 番号： 58)
# 2722： GCGGGCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA (配列番号： 59)
を設計し、完全長タンパク質をコードする cDNAの単離を行った。テンプレートには、 骨髄の全 RNAを用い、実施例 1に記載の方法で cDNAを増幅した。増幅した cDN Aを発現ベクター pMXII IRES EGFP (Oncogene(2000)19(27):3050- 3058)に揷 入して、 TARM— L遺伝子発現ベクターを作製して、 ABI3100シーケンスアナライ ザ一を用 、て塩基配列を決定した (配列番号：15)。
ヒトおよびマウス TARM— Lの ClustalWによる相同性解析の結果を図 23に示す。 hTARM— Lは 235アミノ酸、 mTARM— Lは 237アミノ酸であり、相同性は 86%で あった。一方、 hTARM (271アミノ酸）と最も相同性が高い mTARM m3 (293アミ ノ酸）の相同性は 50%であった（図 24)。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列 、あるいは 1または複数個の保存的置換を有する配列番号： 2、配列番号: 4、配列番 号： 6または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分 泌タンパク質。
[2] 以下の (i)、 (ii)、 (iii)、および (iv)力も選択される、膜タンパク質または分泌タンパ ク質：
(i)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパ ク質；
(ii)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入 、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸の 付カ卩がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配 列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
(iii)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または 分泌タンパク質;および
(iv)配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と 90%以上の同一性を有するアミノ酸配 列を含んでなり、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等 の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
[3] 請求項 1に記載の膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[4] 配列番号： 1、配列番号: 3、配列番号： 5または配列番号： 7で表される塩基配列を 含んでなる、請求項 3に記載のポリヌクレオチド。
[5] 請求項 2に記載の膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[6] 以下の (V)、 (vi)、 (vii)、および (viii)力も選択される、ポリヌクレオチド：
(V)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
(vi)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドにお 、て、 1また は複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端 への 1または複数個のヌクレオチドの付加がなされ、かつ配列番号： 10で表されるァ ミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク 質をコードするポリヌクレオチド；
(vii)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとストリンジェント な条件でハイブリダィズし、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列力 なるタンパ ク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレ ォチド；および
(viii)配列番号： 9で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと 90%以上の同 一性を有し、かつ配列番号： 10で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の 機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 以下の )、（x)、（xi)、および (xii)カゝら選択される膜タンパク質または分泌タンパ ク質に対する抗体またはその機能的断片：
(ix)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク 質；
(X)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または配 列番号： 12で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、置換 または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸の付加が なされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、 配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
(xi)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2、配列 番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表される アミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タン パク質;および
(xii)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
[8] 請求項 1または 2に記載の膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体または その機能的断片である、請求項 7に記載の抗体またはその機能的断片。
[9] 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列もしくは 1または複数個の保存的置換を有す る配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパ ク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項 8に記載の抗体またはその 機能的断片。
[10] 以下の (ix' )、（x' )、（xi' )、および (χϋ' )力 選択される膜タンパク質または分泌タ ンパク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項 7に記載の抗体または その機能的断片：
(ix' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タン パク質；
(χ' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿 入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸 の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 12で表されるアミノ酸配 列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質； (χί' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 12 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または 分泌タンパク質;および
(χϋ' )配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配 列を含んでなり、かつ配列番号： 12で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等 の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
[11] 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列もしくは 1または複数個の保存的置換を有す る配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパ ク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項 10に記載の抗体またはそ の機能的断片。
[12] FERM BP— 10376の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される
、請求項 11に記載の抗体またはその機能的断片。
[13] FERM BP— 10376の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマ。
[14] 以下の (xiii)、 (xiv)、（xv)、および (xvi)力も選択されるタンパク質：
(xiii)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパ ク質；
(xiv)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列において、 1または 複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への 1ま たは複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 1 4または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を有 するタンパク質；
(xv)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ 、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と 同等の機能を有するタンパク質；および
(xvi)配列番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一 性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表さ れるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
[15] 請求項 14に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[16] 以下の（xvii)、 (xviii)、 (xix)、および (xx)力も選択される、ポリヌクレオチド：
(xvii)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレ ォチド；
(xviii)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌク レオチドにおいて、 1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいは その一方または両末端への 1または複数個のヌクレオチドの付カ卩がなされ、かつ配列 番号： 14または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機 能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(xix)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレ ォチドとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ配列番号： 14または配列番号 : 16で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド；および
(XX)配列番号： 13または配列番号： 15で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレ ォチドと 70%以上の同一性を有し、かつ配列番号： 14または配列番号： 16で表され るアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌ クレオチド。
[17] 請求項 14に記載のタンパク質に対する抗体またはその機能的断片。
[18] 請求項 7〜12、および 17のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を 有効成分として含んでなる、自己免疫疾患治療剤。
[19] 関節リウマチの治療に用いられる、請求項 18に記載の自己免疫疾患治療剤。
[20] 請求項 7〜12、および 17のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を 有効成分として含んでなる、 T細胞接着阻害剤。
[21] TARMタンパク質と T細胞との接着を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの 溶媒和物のスクリーニング方法であって、下記工程：
(a)被験物質の存在下および非存在下にお!/、て、 TARMタンパク質と T細胞とを接 触させる工程;および
(b)前記 TARMタンパク質と T細胞との結合活性を測定する工程
を含んでなり、前記 TARMタンパク質力 以下の（ix)、（x)、（xi)、および (xii)から 選択される膜タンパク質または分泌タンパク質：
(ix)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク 質；
(X)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または配 列番号： 12で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、置換 または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸の付加が なされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、 配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
(xi)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2、配列 番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表される アミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タン パク質;および
(xii)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有する膜タンパク質または分泌タンパク質
である、スクリーニング方法。
[22] 工程 (b)の後に、 (c)被験物質の存在下における結合活性と被験物質の非存在下 における結合活性とを比較する工程を更に含んでなる、請求項 21に記載のスクリー ユング方法。
[23] T細胞が活性化 T細胞である、請求項 21または 22に記載のスクリーニング方法。
[24] 活性化 T細胞が活性化 Th2細胞である、請求項 21〜23のいずれか一項に記載の スクリーニング方法。
[25] 榭状細胞の活性ィ匕を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリ 一二ング方法であって、下記工程：
(d)被験物質の存在下および非存在下において、請求項 7〜12のいずれか一項に 記載の抗体またはその機能的断片と榭状細胞とを接触させる工程;および
(e)前記榭状細胞の活性化の程度を測定する工程
を含んでなる、スクリーニング方法。
[26] 工程 ）において、榭状細胞の活性ィ匕の程度を、榭状細胞における IL— 6および Zまたは MCP— 1産生量を指標にして測定する、請求項 25に記載のスクリーニング 方法。
[27] 工程 (e)の後に、（f 1)被験物質の存在下における IL 6および Zまたは MCP— 1産生量と、被験物質の非存在下における IL 6および Zまたは MCP— 1産生量と を比較する工程を更に含んでなる、請求項 26に記載のスクリーニング方法。
[28] 工程 (e)にお 、て、榭状細胞の活性ィ匕の程度を、榭状細胞における FcR γ鎖の発 現量を指標にして測定する、請求項 25に記載のスクリーニング方法。
[29] 工程 (e)の後に、（f— 2)被験物質の存在下における FcR y鎖の発現量と被験物 質の非存在下における FcR γ鎖の発現量とを比較する工程を更に含んでなる、請求 項 28に記載のスクリーニング方法。
[30] TARMタンパク質と FcR γ鎖との複合体形成を阻害する物質もしくはその塩または それらの溶媒和物のスクリーニング方法であって、下記工程：
(g)被験物質の存在下および非存在下において、請求項 7〜12のいずれか一項に 記載の抗体またはその機能的断片と榭状細胞とを接触させる工程;および
(h)前記榭状細胞における FcR γ鎖の発現量を測定する工程
を含んでなり、前記 TARMタンパク質力 以下の（ix)、（x)、（xi)、および (xii)から 選択される膜タンパク質または分泌タンパク質：
(ix)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク 質；
(X)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または配 列番号： 12で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、置換 または欠失、あるいはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸の付加が なされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、 配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
(xi)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2、配列 番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表される アミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タン パク質;および
(xii)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含んでなり、かつ配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、配列番号： 10、または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有する膜タンパク質または分泌タンパク質
である、スクリーニング方法。
工程 (h)の後に、（i)被験物質の存在下における発現量と被験物質の非存在下に おける FcR y鎖の発現量とを比較する工程を更に含んでなる、請求項 30に記載のス クリーニング方法。
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