JPS60500684A - 抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法 本発明はタンパク質中におけるアミノ酸連鎖の抗原活性の検出または決定方法に 関する。

本明細書を通して用いられる”抗原活性”とは抗体と特異的に結合するアミノ酸 連鎖を意味するものであり、抗体の製造を引き出し、または刺激するアミノ酸連 鎖（この後者の連鎖は、また“免疫原”と呼ばれる）を含める。

すでに良く知られているように、抗原は通常、ヒトや動物にとってなじみが少な く、ヒトまたは動物による抗体の形成を引き出すことができる、タンパク質のよ うな巨大分子であシ、抗体は、この巨大分子の存在に応答してヒトまた（は動物 によって合成されたタンパク質である。

抗体はその合成を引き出した巨大分子、すなわち抗原に特異な親和性を有し、こ の抗体の特異性は、通常抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ ｎｔ　）　と呼ばれている巨大分子上の一つ以上の特別の位置まだはアミノ酸連 鎖にもとづいている。

本発明の第１の目的は、選択されたタンパク質、たとえば鵞口揄または肝炎のよ うな特定の臨床上の疾患から保護する抗体をもたらすことができる抗原の抗原決 定基を構成するアミノ酸連鎖を検出または決定することにある。

本発明によれば、タンパク質またはタンパク質の部分の既知のアミノ酸連鎖内の 抗原活性なアミノ酸連鎖の検出方法または決定方法が提供される。

この方法は下記のステップから成る。

１　複数のペプチドを合成する。これらペプチドは、各々が既知のアミノ酸連鎖 内の連鎖に相当する、複数のアミノ酸の連鎖から成り、かつこのペプチドは重複 したアミノ酸連鎖を有する。

２　これらペプチドを各々、タンパク質またはタンパク質の一部分に対する抗体 と接触させる。

３、　これらペプチドの各々と、前記抗体との間に、前記ペプチドが抗原活性を 有するか否かを示す抗原−杭体反内があるか否かを検出、または決定する。

上述のように、この方法に従って合成されたペプチドは重複したアミノ酸連鎖を 有しており、すなわち少なくとも一つのアミノ酸が他のペプチドの連鎖の一末端 から除かれ、かつ少なくとも一つのアミノ酸がその連鎖の他の一末端に加えられ 、残シのアミノ酸は両方の連鎖に共通な状態で一つのペプチドが他のペプチドと つながっている。

かかる重複した連鎖内のアミノ酸は、各々の配列が上述したようにタンパク質ま たはタンパク質の部分の既知のアミノ酸連鎖内の連鎖に相当するように、もちろ ん選択される。

本発明の方法は、与えられた抗体が特定の抗原活性を有するアミノ酸の連鎖を明 確に識別するという概念、およびこの結果として、あらゆる可能な結合の中から 特定の抗原決定基のアミノ酸連鎖を確認する抗体の高度の特異性を利用して特定 の抗原決定基が確認されるという概念にもとづくものである。

免疫原タンパク質の活性抗原または抗原決定基を表わすアミノ酸の連鎖の確認を 目標とした多くの刊行物が出されている。

しかしながら、最近の利用できる方法によっても、タンパク質分子内の活性なア ミノ酸連鎖の確認は、長く、そして動きがとれなくなるような工程である。

本発明（寸、上述したように重複し汽連鎖を有するペプチドを用いるスクリーニ ング法によって、抗原として活性であるアミノ酸の連鎖を検出する方法である。

抗原決定基は一般的に約六つのアミノ酸の連鎖の長さから成ると信じられており 、従って本発明の第１の工程に従って製造されるアミノ酸の連鎖は、好ましくは 六つのアミノ酸の連鎖である。

しかしながら、本発明の方法によれば、五つのアミノ酸の長さの連鎖は、後述す るスクリーニング操作において容易に検出できる反応を与えることが著るしく少 ないようには思われるが、本発明は六つのアミノ酸の連鎖に限定されないことを 理解すべきである。

九つ、またはそれ以上のアミノ酸の長さの連鎖は、おそらく不必要に長く、従っ てかかる連鎖は現時点では好ましくない。しかしながら、これらの連鎖も本発明 の広範な範囲内に含まれるものである。

本発明の実施にあたっては、目的とする抗原決定基を有すると信じられるタンパ ク質またはタンバク質部分のアミノ酸連鎖が予め決定される。

多数のタンパク質のアミノ酸配列はすでに知られておシ、また、たとえば組換え （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　）　ＤＮＡ技術のような最近の方法は、アミノ酸連 鎖が未だ知られていないタンパク質の連鎖を迅速に解明する方法として有用であ る。

本発明の重要性は、タンパク質の抗原決定基を著るしい容易さで、短かいアミノ 酸連鎖として確認できることにある。更に重要なあらゆる連続した抗原決定基を 確認できる。

この情報は、ヒトおよび動物の臨床疾患の診断に用いられる、必要な選択性を有 する薬剤の設計に、はかり知れないくらい有益である。

捷だ、特定の病原体と関連した抗原決定基の知識も、通常のワクチンのような多 くの有害な副作用がなく、疾患に対する保護に有用なペプチドワクチンの製造に 必須である。

本発明は、また、体の受容体に対する特殊な治療薬の設計にも用いることができ る。

タンパク質またはタンパク質の部分内の抗原決定基の決定における上記方法の使 用の一例は下記のようである。

１　始めに、たとえば刊行物データから得られた、タンパク質またはタンパク質 の部分の既知のアミノ酸連鎖について、第１の六つのアミノ酸（この例における 、すべての合成されたペプチドは六つのアミノ酸の長であると仮定すψ）の順序 を、アミン末端から、またはカルボキシ末端から出発して選び、これを“配列１ ′とする。

次いで第２番目のアミノ酸から出発し、第７番目のアミノ酸を含むまでの六つの アミノ酸連鎖のセントラ”配列２”とする。

この−末端から一つのアミノ酸を落とし、既知の連鎖の他端に一つのアミノ酸を 加えるドロッピング（ｄｒｏｐｐｉｎｇ　）操作を続けることによって、タンパ ク質またはタンパク質の部分内に含まれる、すべてのへキサペプチドに必要なア ミノ酸連鎖が得られる。

かかる連鎖の全数は、タンパク質またはタンパク質の部分を形成するアミノ酸の 実際の数よりも５少ない。

２　上記のようにして決定された各連鎖を、次いで合成した。

好適な合成方法には、通常下記のように呼ばれている、ペプチド合成に良く知ら れている方法が含まれる。

（ａｌ　溶液相法；または （ｂｌ　固相法；たとえばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）技術：マ ルグリン、１．（Ｍａｒｇｌｉｎ、　Ａ、）およびメリフィールド、アール、ビ 、　（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　）、７　＝　ニア　ル・レビュー・ オプ・バイオケミストリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｄ。

Ｂｉｃｏｃｈｅｍ、　）　３９　、８４１〜８６６　（１９７０）。

しかしながら、好ましくはアミノ酸連鎖の合成は、固相担体としてポリエチレン またはポリプロピレンのような重合物質を使用し、この担体上に、少なくとも一 つの官能基を含むビニルモノマーをグラフト重合させて、担体上に重合鎖を生せ しめる固相法によって行なわれる。

これら重合鎖の官能基は、次いで反応して第１級葦たは第２級アミン基を生成し 、どれらアミノ基は次いでアミノ酸残基と適当な程度に連続的に反応して、目的 とする合成ペプチドが形成される。

担体は好ましくは、約４ｍ１１Ｌの径と約５Ｑｍｍの長さを有する固体重合物棒 の形状である。

かかる棒の多数が、その寸法が酵素連鎖免疫溶媒検定（ｅｕｚｙｍｅ　−１ｉｎ ｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ　（Ｅ　ＬＩ　Ｓ　Ａ　）　） に用いた標準板の寸法に対応する１２×８格子の適切なホルダーに保持される。

３、　各ペプチドの合成のための操作の選択冗応じて、合成操作完了時にペプチ ドが既に適切な担体に結合しているか、または適切な固体担体に検定段階の調整 時において結合している。

４、　合成されたペプチドを担持する担体ば、ミクロ滴定板（ｍ１ｃｒｏｔｉｔ ｒｅ　ｐｌａｔｅ　）または類似装置の空間（ｗｅｌｌ　）Ｋ移され、次いで各 既知の連鎖は各空間（ｗｅｌ目内において抗原−抗体反応の存否を検出する通常 の方法を用いて、既知の抗体に対してスクリーニングされる。

これらの方法の例には、酵素が連鎖した免疫溶媒検定（ＥＬＩＳＡ）および放射 線免疫検定（ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ。

ＲＩＡ）が含まれる。

好適な抗体は、商業的に入手可能な抗血清として購入されるか、またけ良く知ら れ−ている方法（Ｆ従って、適切な宿主動物で製造される。

好捷しくに、上述した六つの長さのアミノ酸連鎖の合成の組織化を目的として、 電算機にもとづく管理プログラムが用いられる。

コレハ各ミクロ滴定板における各位置について、最終ペプチドの本質を記録する のに用いられ、更に両立する反応条件にもとづき、同時に起りうる合成の順序を 決定するのに役立つ。

最後に、かかる電算機管理プログラムは、抗体スクリーニングの段階における最 終評価のために畳かれたプログラムと共に使用することもできる。

実施例において、より詳細に述べるように、上記段階において概述した方法は、 鵞口癒ビールス（ＦＭＤＶ）タンパク質ＶＰＩの、抗原として活性なアミノ酸連 鎖を確認するのに用いられた。

もちろん、本発明は連鎖が知られている他のタンパク質と同様に、ヘパティティ ス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）　Ｂビールス表面抗原（５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇ ｅｎ　）のような、他のビールス。

タンパク質の抗原決定基の決定にも同様に適用できる。

良く知られた間接的なＥＬＩＳＡ技術は、アミノ酸連鎖と与えられた抗体との間 の抗原−抗体反応の有無の最終的検出または決定に好ましくは用いられる。

この検定の使用は、たとえば抗ヒトＩｇＧ、抗つシＩｇＧ等のような、最終試験 に用いられる杭体種に対する抗血清の製造を必要とする。

かかる製造は、次いで西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　）ベルオキシダー ゼのような酵素と組合わされ、最終試験のために必要な試験薬が提供される。

間接ＦＬＩＳＡ検定の実施は、この分野において良く知られた技術によって行な われる。

上述したタイプのスクリーニング試験によって本発明の方法が実施されたとき、 特定の抗体について得られた結果は、下記範ちゅう中のいづれか一つに属する。

ｆａ）　製造したアミノ酸連鎖のいづれについても陽性の反応がない、すなわち 完全に陰性の場合。

（ｂ）　単一のアミノ酸連鎖のみが反応する場合。

この結果は理想的な場合である。

（Ｃ）　多数のアミノ酸連鎖が反応する場合。

この観察された結果については、下記二つの理由中の一つが期待される。

一つの理由は、混合抗体群を含む抗血清との反応であり、各抗体は異なる抗原の 部位で反応する。

他の理由は、免疫原部位が重複するアミノ酸連鎖との反応である。

第一の理由の場合、より有用な抗原活性なアミノ酸連鎖を決定するだめの試験を 更に必要とする。

もちろん、一旦、与えられた抗体との反応において、抗原活性なアミノ酸連鎖が 検出または決定されたときに、この情報は種々の診断に、およびワクチンの製造 に利用することができる。

事実、特定の臨床疾患薬に対応する、抗原活性アミノ酸連鎖が決定されたときに は、このことから、この疾患に対する保護を与え、目的とする抗体反応を引き出 す、一種またはそれ以上の合成的に得られた一種捷たはそれ以上の適切なアミノ 酸連鎖から成るワクチンの製造を導くことができる。

本発明のより詳細な特徴を下記実施例において例としてのみ説明する。

実施例１ クルン、ノイ、　（）（ｕｒｔｚ、　Ｃ，’）らによって翻訳されたヌクレイツ ク・アンンド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）９ 　、１９１９−１９３１　（１９８１）に従ッテ、ＶＰＩ（ＦＭＤＶ、タイプＯ ，）の２１３−アミノ酸連鎖をすべて可能な−・キサペプチド単位に細別し、各 ヘキサペプチド単位をポリエチレン担体上で、同一配向で、かつ第１図に示した ように二つの長さのアミノ酸をスペーサとして、合成した。

６容積チのアクリル酸水溶液に浸漬したポリエチレン棒にＩＭｒａｄの照射量で γ−線を照射した。〔ミュラ−−ノユルテ、ティ、　（Ｍｕｌ　Ｉｅｒ　−５ｃ ｈｕｌｔｅ　、　ｌ）、　）　、ホル、＜ター、！７，１イ、　（Ｈｏｒｓｔｅ ｒ、　Ｆ、　Ａ、　’）＋　ポリマー−ヒ゛ユルテ：／　（ｐｏｌｙｍｅｒ　１ ３ｕｌｌｅｔｉｎ）　７　、７７〜８］　（１９８２）を参照〕。

固相ペプチド化学の通常の方法を用いて〔エリクノン、ビイ、ダブリュ、　（Ｅ ｒ１ｃｋｓｏｎ　、　Ｂ、　Ｗ、　）　＋　メリフィールド。

アール、ビイ、　（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、）、“ザ・プロテインズ （’ｐｌ〕ｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）−第２巻、第２５５〜２５７頁、アカテミ ノク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）　、＝　−Ｌ−ヨーク（Ｎｅ ｗＹｏｒｋ　）　＜　１９７３　）を参照〕、Ｎｏ　ｔ−ブチルオキ７カルボニ ルーＬ　−ＩＪレジンメチルエステルを側鎖のＮ−アミン基を介してポリエチレ ン・ポリアクリル酸（ＰＰＡ、）　に結合させた。

次いで引続きペプチド状スペ〜すを完成させるため［ＢＯＣ−アラニンを結合さ せた。

担体のアＳ）置換を、Ｎ　Ｈ２−リジン（ＯＭｅ）　−ＰＰＡをＣＩ４でラベル された酪酸と反応させることによって決定し、８〜ＩＯｎモル／棒であることを 見出した。

合成すべき連鎖に指示されるようにして、通常の固相ペプチド合成に従い連続し てアミノ酸を添加した。

最終の結合反応が終了し、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基の除去 の後に、末端のアミノ基をジジノチルホルムア４ド（ＤＭＦ）／ト１１エテルア ミン混合物中の無水酢酸でアセチル化した。

すべての、シンクロへキソル力ルポジイミドを仲介とするカップリング反応をＮ −ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下にＤＭＦ中で行なった。

下記の側鎖保護基を用いた。

ス■／オニ／ｌセリン、アヌバルチン酸、グルタミン酸およびチロ７ンについて はＯ−ベンジル；リジ／についてはカルボベンツ゛オギン、アルギニンについて はトシル（ｔｏｓｙｌ　）　；　／スティンについては４−メチルベンジル２お よびヒスチジ／については１−ベンジルオキ７カルポニルアミドー２．２．２− 　トリフルオル酢酸中。

側鎖保護基の除去は、室温下で９０分、トリフルオル酢酸中てボロン［・リス（ トリフルオルアセテート）で処理することにより行なった〔プレス、ジエイ、（ Ｐｌｅｓｓ。

Ｊ、）、バウア、ダブリュ、　（Ｂａｕｅｒ　、　Ｗ、　）、アンゲヴアンテ・ ヘミイ（ｌｎｇｅｗａｎｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　）　８５　、１４２　（１９７３ ）参照〕。

ＨＣＩ／プロピオン酸中で加水分解の後に、コントロールとして合成中に含まれ た連鎖の分析から、各段階においてカンプリングが起ったことを確認した。

ＥＬＩＳＡによる試験の前に、棒とカンプリングしたペプチドをリン酸塩をパン ファーとする塩水（ＰＢＳ）で数回、洗浄した。

Ｂ、ヘキサペプチドの試験 Ａ５の記述により製造したヘキサペプチドについての抗原プロファイル（ｐｒｏ ｆｉｌｅ　）を、Ｎ−末端アミノ酸ヘフチドのＶＰＩ連鎖内の位置を与える数値 上に、得られたＥＬＩＳ、Ａ消滅に比例する垂直線として第２図に示した。

第２図に示されるような、相異なるプロファイルを得るために用いた抗血清は下 記のようである。

（ａｌおよび（ｂｌ　二つの異なる抗熱傷（ａｎｔｉ−ｉｎｔａｃｔ　）ビール ス粒子、タイプＯし くＣ１精製完全ビールスにより吸収の後に（ｂ）に用いた抗熱傷ビールス粒子、 タイプ０１゜ （ｄｉ　抗ビールス静サブユニット（５ｕｂｕｎｉｔ　）　、タイプ０１；（ｅ ）　抗ＶＰＩ、タイプ０１および ＋ｆ＋　抗熱傷ビールス粒子、タイプＣ０゜棒とカンプリングしたペプチド（Ｒ ＣＰ）の夫々にって上述した各々の定義された抗血清の活性を試験するために、 酵素と結合した免疫溶媒検定を用いた。

ＲＣＰＳけ、抗体の非特定の吸収をブロフクするために、３７°Ｃで１時間、１ ０％の馬血清、１０チオバルブミンおよびＰＢＳ中の１チトウイーン（’ｌ’ｗ ｅｅｎ　）　−８０で予め破覆した。

培養前（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｌ混合物で１／／ｉｏに希釈された抗血 清中で４°Ｃで一夜、培養した後に、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ　）　 −８０／Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄した。

３７℃で１時間、培養前混合物で／ｓｏ、ｏｏｏに希釈された西洋ワサビペルオ キシダーゼとカンプリングした適適な杭先ＪｇＧ免疫グロブリンと反応の後に、 過剰の接合を除去するためＫＰＢＳ／）ウィーン（Ｔｗｅｅｎ　）で再び繰シ返 し洗浄した。

抗体の存在は、現像液（オルソフェニレンジアミン４０ｍ９．過酸化水素２０ｍ １をリン酸塩バッファー１００ｍＪに溶解した液、ｐＨ５，０）と４５分の反応 によって検出し、発現した色を４２０　ｎｍにおいてタイターチク・マルチスキ ャ７　（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　）で読んだ。

試験の後に、ペプチドを０．１％の２−メルカプトエタノールおよび０１％の硫 酸ドデシル・ナトＩＪウムを含む８Ｍ尿素溶液で３回洗浄し、結合したすべ゛て の微量の抗体を除去するために数回、ＰＢＳで洗浄した。

ＲＣＰｓは異なる抗血清の試験に更に使用することができる。

抗熱傷ビールス粒子血清は、兎を不活性化され、精製されたビールスの５０！ｉ ｇで７０インの完全７ジユバントにおいて免疫化することによって製造される。

兎は一回、注射の後、３〜４週間出血した。

抗ビールス、サブユニット（５ｕｂｕｎｉｔ　）血清（兎）は、酸で破壊された 精製ビールスの１０μｇで３〜４週間の間隔を置いて３回、最初はフロイントの 完全アジュバント、次いで以後はフロイントの不完全アジュバントで、免疫化す ることによって製造された。

ポリペプチドｖＰ１は、尿素で破壊され、精製されたビールスから得られたタン パク質の混合物から、等電中心法い５ｏ−ｅｌｅｃｔｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ） によって分離した〔バルテリング、ニス、ジエイ、　（Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、　 Ｓ、　Ｊ、　）、ワグナール、エフ、　（Ｗａｇｅｎａａｒ、　Ｆ、　＞、ギー ルケンス、エイ、エル。

ジエイ、　（Ｇｉｅｌｋｅｎｓ、　Ａ、　Ｌ、　Ｊ、　Ｌ　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖ ｉｒｏｌ、　６２３５７〜３６１　（１９８２）参照〕。

８Ｍ尿素でゲルから溶出し、ＰＢＳに対して透析の後に、抗血清を１２８につい て上述したようにして生成させた。

スキャン（Ｃ）に対する抗血清は、精製ビールス（１５００μｇの完全ビールス を７２時間、４°Ｃでｌ　ｍｌの血清で培養させた）ので吸収の後に、スキャン （ｂｌに用いたものであり、すべてのビールスに結合した抗体を遠心分離により 除去した。

Ｃ２抗原ペプチドに結合したビールス粒子の確認上記試験をした四つの抗熱傷ビ ールス粒子血清の中で、スキャン（ａｌおよび＋ｂ＋は見出された活性パターン において頂点を示した。

同一の抗原製造に対する応答における大きな定量的相違が以前に報告されている 。しかしながら、これらのスキャンは血清間の抗体組成において可能な変異性を 強調している。

スキャン（ａｌ　、　（ｂｌおよび（Ｃ１の試験から、ペプチド番号１４６およ び１４７に活性な抗体が全抗無傷ビールス血清中に存在するが、精製ビールスで 吸収後には存在しない。

これらと同一の抗体はスキャンｆｄ）の抗熱傷血清中には観察さｈず、スキャン （ｅ）の抗−ＶＰＩ血清中にはわずかに存在するのみであった。

抗ＶＰＩ血清に、いくらかの活性が見出されたことは、分離されたタンパク質が 、弱いながらも免疫活性を示すと考えられる〔クライト、ティ、シイ、　（Ｋｌ ｅｉｄ、　Ｄ−Ｊ、）ら、ザイアンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２１４　、１１２ ５〜１１２９　（１９８１）参照〕。

しかしながら、他の抗ＶＰＩ血清も試験され、位置番号１４８に強い活性を持っ ているが、位置番号１４６および１４７には活性を示さなかったことに注目すべ きである。

６ スキャン＋ｂ＋とスキャンＦＣ＋の重複（非吸収に対する吸収）は、ペプチド番 号１４６および１４７の活性の情夫に加えてペプチド番号５，６および２０６の 活性低下も発生していることを示している。

これらの中で、番号５および６の活性は試験された全ての抗熱傷ビールス血清中 に見出されておらず、一方、番号２０６の活性は常に存在した。

これらの結果から、活性であることが見出された配列の中で、番号１４６および １４７における両者は下記へキサペプチドであり、他の観察と一致して、番号２ ０６における位置よシもよシ少ない分布で、主要な位置を構成すると結論される 。

Ｇｌｙ−ＡＳＪ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　（Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ −Ｌ　）およびＡＳＩ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ　−Ｉ、ｅｕ−Ａｈａ　（Ｄ −Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｌ　−Ａ） しかしながら番号１４６．１４７の位置については、下記二つの可能性を区分す ることができない。

一つの可能性：活性要素が五つのアミノ酸の長さ、すなわち、二つのＡＳＩ）− Ｉ、ｅｕ−Ｑｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　（Ｄ−Ｌ−Ｑ　−Ｖ−Ｌ）Ｋ共通な配列。

他の可能性：活性要素が七つのアミノ酸の長さ、すなわち、二つのへキサペプチ ドＧｌｙ　−Ａｓｐ　−Ｉ、ｅｕ　−Ｇｌｎ　−Ｖａｌ　−Ｉ、ｅｕ−Ａｌａ　 （Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−Ａ）の組合せ。

Ａ、ヘキサペプチドの製造 オフィス・アンチルナショナル・デ・エビシーティクス（０ｆｆｉｃｅ　′１ｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅｓ　Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｓ　）のバクラフ。

エッチ、　ｘ　＃、　（Ｂａｃｈｒａｃｈ、　Ｈ，Ｌ、　）らによッテ与えられ たＶＰＩ　（ＦＭＤＶタイフＡＩ。またはＡ６．　）　ノ２１２７　：’　／酸 連鎖を２０７へキサペプチドに細分した。

これらへキサペプチドを、アルギニンの側鎖をｐ−メトキシベンゼンスルホニル 基で保護した以外は上記実施例と同様にして合成した。

Ｂ、ヘキサペプチドの試験 ヘキサペプチドの抗原プロファイルを第３図に示した。

この輪郭の製造に用いた抗血清は下記のとおりである。

伸）抗熱傷ビールス粒子、タイプＡ１゜（ｂｌ　精製された完全ＦＭＤＶタイプ ＡＩＯで吸収の後に（ａｌに用いた抗熱傷ビールス粒子 ヘキサペプチドの試験および血清の製造は実施例１の記載と本質的に同一である 。

Ｃ６活性要素に結合したビールス粒子の確認実施例１において用いられたものと 同一との理由から、下記へキサペプチドがＦＭＤＶＯ八−タイプの抗原決定基の 主要な位置を占めると結論することができる。

Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ−８ｅｒ−１１ｅ　（Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−８ −Ｉ　）およびＡＳＩ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−１１ｅ　−Ａｌａ実施例１ に記述したＦＭＤビールス、タイプ０１の場合のように、これら二つの配置を区 分することはできず、従って、活性連鎖は五つのアミノ酸の長さ、すなわちＡｓ ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−１１ｅ　（Ｄ−Ｌ−Ｇ−８−Ｉ　）または七つの アミノ酸の長さ、すなわちＧｌｙ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ−８ｅｒ−１ １ｅ　−Ａｌａ　（Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−８−Ｉ−Ａ）であることが可能であると結 論される。

実施例３ ジャーナル、オブ・バイｏｏシイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 ）４６．３１１〜３１６　（１９８３）においてロバートンン、エンチ。

エル、（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　、　Ｈ，Ｌ、　）らによって与えられた、ｖｐｌ （ＦＭＤＶタイプＣ，）ノ２１０アミ／酸連鎖を２０５へキサペプチドに細別し た。

これらへキサペプチドを上記実施例２に記載したように合成した。

Ｂ、ヘキサペプチドの試験 ヘキサペプチドの抗原プロファイルを第４図に示した。

プロファイルの作成に用いた抗血清は下記のとおりである。

ｆａｔ　抗熱傷ビールス粒子タイプＣ３（ｂ）　精製した完全ＦＭＤＶタイプＣ １で吸収した後に（ａｌ区　区　区 国際調査報告 Ｃ１ｔｅｄ　ｉｎ　５ｅａｒｃｈ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｍｅｍｂｅｒ ｓｅｐｏｒｔ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　タンパク質またはタンパク質部分の既知のアミン酸連鎖内の抗原活性アミノ 酸連鎖を検出または決定する方法であり、該方法は下記段階から成る。 １、　各々のペプチドが既知のアミノ酸連鎖内の連鎖に相当する複数のアミノ酸 の連鎖から成り、該ペプチドが重複するアミノ酸連鎖を有する、複数のペプチド を合成し、 ２　前記ペプチドの各々をタンパク質またはタンバク質部分に対する抗体と接触 させ、 ３　前記ペプチドが抗原活性を有するか否かを示す、前記各ペプチドと前記抗体 との間の抗原−抗体反応の有無を検出または決定する。 ２　前記複数のペプチドが一つのアミノ基で重複している特許請求の範囲第１項 記載の抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法。 ３、　前記複数のペプチドの各々が五つ〜九つのアミン酸の連鎖である特許請求 の範囲第１項捷たけ第２項記載の抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法。 ４、　前記複数のペプチドの各々が、六つのアミノ酸の連鎖である特許請求の範 囲第３項記載の抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法。 ５　前記複数のペプチドの各々が固相担体上で合成され、該固相担体と結合して 保持される各々のベプチ１ ドについて前記方法の以後の段階が行なわれる特許請求の範囲第１項記載の抗原 活性アミノ酸連鎖の決定方法。 ６、　前記固相担体が固体重合物のピン捷たは棒の形状である特許請求の範囲第 ５項記載の抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法。 ７、　前記固相担体が、ポリエチレンおよびポリプロピレンから成る群から選ば れた重合体物質であり、この重合体物質にグラフト重合されて、担体上に重合体 側鎖を生ぜしめる、少なくとも一つの官能基を含むビニルモノマーを有する特許 請求の範囲第５項または第６項記載の抗原活性アミノ酸連鎖の決定方法。