JPH05247091A

JPH05247091A - Ｈｔｌｖ抗体に対して免疫反応性をもつ合成ペプチド組成物

Info

Publication number: JPH05247091A
Application number: JP691691A
Authority: JP
Inventors: Chang Yi Wang; チャン・イ・ワン
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1990-01-24
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1993-09-24
Also published as: FI910245A0; CA2034611C; EP0439077B1; FI910245A; EP0439077A3; CA2034611A1; DE69132200D1; EP0439077A2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】化学合成したペプチド組成物を用いるＨＴＬ
Ｖ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−II反応性抗体の検出法及び
ＡＬＴ（成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）症状の診断法。【構成】次の配列 APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS-X（IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAIVSSPCH-X（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA-X（VI）（Ｘは−ＯＨまたは−ＮＨ_２）より成る群から選ばれる
ペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨ
ＴＬＶ−II抗体に対する免疫反応性が保持される条件で
アミノ酸が付加、欠失、または置換される）；または上
記ペプチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重
合体から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−
II抗体に対して特異的免疫反応性を有するペプチド組成
物。さらに化学合成したＨＴＬＶペプチド組成物を化学
合成したＨＩＶ（１と２）ペプチド組成物と共用する、
ＡＬＴ、ＨＴＬＶ−Ｉ及び／又はＨＴＬＶ−IIへの感
染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の同時検出・診
断法、ＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染との判別法
を提供する。検出方法には酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）等を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＨＴＬＶ−Ｉおよび／ま
たはＨＴＬＶ−II抗体に対して特異的免疫反応性を有す
るペプチド組成物に関する。

【０００２】ヒトＴ細胞白血病ウイルスはある種の成人
リンパ様悪性疾患、特に成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫
（ＡＴＬ）およびヘアリー・Ｔ細胞白血病（ＨＴＬ）に
関連している（１−３、２４および２５）。２つのサブ
グループ、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIが確認され
ている。今日に至るまで、この研究のほとんどは日本で
ＡＴＬ患者に広まっているＨＴＬＶ−Ｉに集中してい
る。しかしながら、最近の研究により、ＨＴＬＶ−IIが
米国の主要都市で静脈内薬物常用者の間により多く広ま
っていることが分かった（２７、２８）。ＨＴＬＶ蛋白
と反応する抗体はＡＴＬ患者の血清中に見いだされた。
これらのＨＴＬＶ抗体はこのウイルスのｇａｇコア抗原
とエンベロープ蛋白の両方を認識する（４、５、２
７）。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（Ａ
ＲＣ）の原因となるレトロウイルスである。ＨＩＶ蛋白
と反応する抗体はＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者の血清中に
見いだされた。これらのＨＩＶ抗体はＨＩＶウイルスの
ｇａｇコア抗原とエンベロープ蛋白の両方を認識する。
米国では、ＡＩＤＳがＡＴＬよりもかなり多く広まって
おり、ＨＩＶに対して血清陽性を示すヒトの一部はＨＴ
ＬＶに対しても血清陽性である。

【０００３】本発明は、合成ペプチド組成物を使用して
体液中のＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−IIに対
する抗体を検出するための非常に感度のよい方法に関す
る。本発明はさらに、合成ペプチド組成物を使用して体
液中のＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−IIおよびＨＩＶに対す
る抗体を同時に検出するための高感度方法に関する。１
つのペプチド組成物は、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−
IIｅｎｖ蛋白の外側（細胞外）部分（ｇｐ４６と呼ばれ
る）のセグメントに対応するアミノ酸配列を有するペプ
チドを含み、さらにＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−IIｅｎｖ
蛋白のトランスメンブラン部分（ｇｐ２１と呼ばれる）
のセグメントに対応するアミノ酸配列を有するペプチド
を含む。これらの配列はＡＴＬまたはＨＴＬ患者の血清
中の抗体と高度に免疫反応性であることが判明した。ま
た、この種のペプチド組成物は、健康な哺乳類（ヒトを
含む）におけるＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II感染症に対
して防御を賦与する、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗体
の生産を刺激することによってＡＴＬまたはＨＴＬＶ−
II感染症を予防するためのワクチンの製造に有用であ
る。さらに、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−IIエンベロープ
蛋白の部分に対応するアミノ酸配列をもつペプチドを含
むペプチド組成物は、ＨＩＶエンベロープ・コア蛋白の
部分に対応するアミノ酸配列をもつペプチドを含むペプ
チド組成物と共に使用して、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−
IIおよびＨＩＶに対する抗体を同時に検出することがで
きる。

【０００４】より詳細には、本発明は、指定した配列で
約３４、４０、３８、２０、２４および１６個のアミノ
酸またはそれらの類縁体を含む化学合成ペプチド；その
類縁体、セグメント、混合物、複合体および重合体より
成る群から選ばれるペプチドを含む、ＨＴＬＶ−Ｉおよ
び／またはＨＴＬＶ−II抗体の検出に有用なペプチド組
成物に関する。本発明はさらに、指定した配列で約２
１、１９、１１および１６個のアミノ酸を含む化学合成
ペプチド；その類縁体、セグメント、混合物、複合体お
よび重合体より成る群から選ばれるペプチドを含むＨＩ
Ｖペプチド組成物と共にＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨ
ＴＬＶ−IIペプチド組成物を使用して、ヒト体液中のＨ
ＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−IIおよびＨＩＶに対する抗体を
同時に検出することに関する。また、本発明はＨＴＬＶ
感染症、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−II感染症、の診
断方法を提供する。

【０００５】検出方法には酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）、ニトロセルロースペーパー上でのマルチ−ド
ット、マルチ−ラインまたはマルチ−スクエアブロッテ
ィング、および固相抗原としてペプチドを使用する間接
赤血球凝集反応アッセイが含まれる。好適な検出方法は
ＥＬＩＳＡである。

【０００６】

【従来の技術】ヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルス
（ＨＴＬＶ）は、Ｔ細胞リンパ腫および皮膚疾患を有す
る患者から初めて分離された関連レトロウイルスの１属
である。この属の特定サブグループであるＩ型（ＨＴＬ
Ｖ−Ｉとして知られている）は、日本（６−９）、カリ
ブ海諸島（１０、１１）および米国南西部（１２）の地
域に発生する成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫（ＡＴＬ）と
呼ばれる疾患と臨床的・疫学的特徴を共有する悪性疾患
の病原体と同定された。ＨＴＬＶ−IIについては既知風
土病の地方が存在せず、またＨＴＬＶ−IIと特定疾患と
の既知因果関係も存在しない。静脈内薬物常用者に感染
したＨＴＬＶ−IIウイルスの起源は分かっていない。Ｈ
ＴＬＶ−IIに関する広範な血清罹患率の研究は行われて
いない。

【０００７】ＨＴＬＶ−IIはＨＴＬＶ−Ｉと構造的に極
めて類似している。２つのウイルスは約５０％の配列相
同を共有する（２９）。ＨＴＬＶ−IIはヘアリー・細胞
性白血病の患者から分離されたが、因果関係は分からな
かった。ＨＴＬＶ−IIのｅｎｖ蛋白のアミノ酸配列は、
アミノ酸残基の６９％がＨＴＬＶ−Ｉと同一であり、さ
らに追加の１４％のアミノ酸が保存的置換を示す（３
０、３１）。Ｘおよびｐｏｌ遺伝子はｅｎｖ遺伝子より
も一層高度に保存されている（３２）。

【０００８】ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−II間の高度な相
同性のために、全ウイルスリゼイトまたは組換え蛋白に
基づいたＨＴＬＶ−ＩについてのＥＬＩＳＡによる標準
試験アッセイはＨＴＬＶ−IIとも交差反応する。米国特
許第４８３３０７１号に開示されたペプチドもＨＴＬＶ
−IIと交差反応性である。ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−II
のｅｎｖ蛋白を識別するのに効果的な血清学的アッセイ
は存在しないが、２つのウイルス間の抗原的差異は水疱
性口内炎ウイルス偽型の中和により検出された（５）。
ＨＴＬＶ−Ｉ酵素イムノアッセイにおいて反応性のサン
プル中にＨＴＬＶに対する抗体が存在することを確かめ
るために、２つの補足的方法が使用された。ＨＴＬＶ−
Ｉについてのウェスターンブロット法は、コア蛋白では
ｐ１５、ｐ１９、ｐ２４、ｐ２８、ｐ３２、ｐ３６およ
びｐ５５に、そしてエンベロープ蛋白ではｇｐ４５とｇ
ｐ６１にバンドを与える（３２）。ＨＴＬＶ−Ｉについ
てのラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は、ｅｎｖ
蛋白ではｇｐ４５とｇｐ６１に、コア蛋白ではｐ２４と
ｐ５５に、そしてＸ領域ではｐ４０ｘにバンドを与える
（３１）。しかしながら、どちらの試験も２つのウイル
スを識別しない。

【０００９】最近、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIを識別
するためにＰＣＲが使用された。ＰＣＲ法は明確な結果
をもたらす（２８）。しかしながら、その鋭敏な感度ゆ
えに、この方法は誤った陽性の結果を出しがちである。
その上、この試験は非常に時間がかかり、しかも多くの
費用を要する。

【００１０】現在のところ、ＨＴＬＶ−Ｉの伝播機構は
未知であるが、分子および疫学的分析によりＨＴＬＶの
水平伝播が明らかに関係していると分かった（１３、１
４）。ＡＴＬを風土病とする地域でのＨＴＬＶ−Ｉ血清
陽性は全住民において上昇しており、さらに患者の近親
者および輸血を受けた者の間で上昇している（１５、１
６）。ＨＴＬＶ−II血清陽性は米国の主要都市の静脈内
薬物常用者において確認されている(27 、28) 。

【００１１】このことは、血液サンプルが血液銀行に入
る前にそれをスクリーニングするために、そしてＨＴＬ
Ｖ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II感染者に由来する献
血を分離して輸血を受けなければならない患者（例え
ば、血友病者および手術患者）の間にウイルスが広がる
のを避けるために、安全で、信頼できる、感度の高い試
験法が早急に必要とされていることを意味する。

【００１２】ＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染を識
別するための迅速で、安価な試験法も早急に望まれてい
る。１９８８年以来、ＨＴＬＶ−Ｉについての全ドナー
の強制的スクリーニングが実施されており、ＨＩＶだけ
でなくＨＴＬＶ−Ｉに対しても反応性のドナーにはそれ
らの結果を通知しなければならない。ＨＴＬＶ−ＩとＨ
ＴＬＶ−IIのどちらのウイルスが血清陽性の原因になっ
ているかが不確かであると、ＡＴＬまたはＨＴＬＶ−Ｉ
の神経学的合併症にかかる危険性について正確にドナー
に助言することが非常に難しくなる。また、ＨＴＬＶ−
ＩとＨＴＬＶ−IIとを区別する方法は、ＨＴＬＶ−IIの
風土病地域を定めるための血清罹患率研究および両ウイ
ルスの病原性研究にとっても重要である（３３）。

【００１３】ＨＴＬＶ−Ｉウイルスの完全なヌクレオチ
ド配列は１９８３年に報告された（１７）。この報告は
ＨＴＬＶ−Ｉウイルスの構造をＤＮＡレベルと推定され
た蛋白レベルの両方で明らかにし、ＨＴＬＶ−Ｉウイル
スに存在しうる異なるエピトープの血清学的研究を可能
にした。ＨＴＬＶ−IIウイルスのヌクレオチド配列は１
９８４、１９８５および１９８６年に報告された（３
０、３１、３２）。

【００１４】１９８３年のＳｅｉｋｉｅｔａｌの報
告と同時に、国立がん研究所のＣａｒｌＳａｘｉｎｇ
ｅｒ博士は、アフリカの人々のＨＴＬＶ−Ｉ抗体を検出
する酵素イムノアッセイの開発において、単離したＨＴ
ＬＶ−Ｉウイルスの固相免疫吸着剤としての使用を報告
した（１８）。

【００１５】さらに、Ｓａｍｕｅｌｅｔａｌ．（１
９）は、ＡＴＬ患者由来の血清中の抗体と免疫学的に反
応するＨＴＬＶ−ＩＤＮＡコード化糖蛋白を同定する
ために、Ｅ．ｃｏｌｉ内のクローニング・発現ベクター
が使用されたと報告した。エンベロープ蛋白をコードす
るＨＴＬＶ−ＩＤＮＡは切断した断片となし、発現ベ
クターに挿入した。この発現ベクターは形質転換により
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に導入した。ｐＫＳ４００と呼ばれる
１つのクローンがエンベロープ蛋白産物を生産し、この
蛋白は１群２８の血清をスクリーニングするための免疫
吸着剤として適していることが判明した。細菌が合成し
たＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ蛋白配列を認識する抗体
は、破壊ヴィリオンを抗原として用いたＥＬＩＳＡアッ
セイで調べたときＨＴＬＶ抗体を含んでいた、すべての
血清中に存在していた（１８）。

【００１６】Ｓｌａｍｏｎｅｔａｌ．の出願番号Ｐ
ＣＴ／ＵＳ８５／０１８０３（１９８６年３月２７日に
公開番号ＷＯ８６／０１８３４として発表された）は、
ＨＴＬＶ−ＩのＸ領域（このウイルスのｅｎｖと３′Ｌ
ＴＲの間にある高度に保存された領域）の発現産物とし
てＨＴＬＶ−Ｉの免疫原部位と関係したポリペプチドを
開示した。分子量３７〜４０ｋｄのこれらの蛋白はクロ
ーン化して、Ｅ．ｃｏｌｉにより融合蛋白として発現さ
せた。得られた産物は精製し、血清をスクリーニングす
るための液相免疫沈降試験において使用した。これらの
結果は約７７〜８７％の正確さを示した（２０）。上記
の方法はすべて、免疫反応性を検出する際に使用した抗
原のために、ＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染を識
別することができなかった。

【００１７】蛋白の表面にある抗原または免疫原部位を
マッピングするために、あるいは可能なワクチンとし
て、合成ペプチドが次第に使用されるようになった。以
前に、本発明者と共同研究者は、ＨＩＶ（以前にはＨＴ
ＬＶ−III と呼ばれた）のエンベロープ蛋白上の高度に
抗原性のエピトープを同定するために、そしてＨＩＶ抗
体を検出する高感度の特異的イムノアッセイを開発する
ために、この手法を用いた（２１）。１９８８年４月５
日付けの米国特許第４７３５８９６号および１９８９年
１１月７日付けの米国特許第４８７９２１２号も参照さ
れたい；これらの特許の開示内容は参照によりここに引
用するものとする（２２、２３）。本発明では、ＨＴＬ
Ｖ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIの高度に抗原性のエピトープ
を選択・同定するために、類似の手法が使用される。エ
ピトープ分析のためのエンベロープ蛋白の領域を選択す
る際に、いくつかの戦略が用いられた。第一に、ＨＴＬ
Ｖ−ＩとＨＴＬＶ−IIとの間でアミノ酸配列の比較的高
い保存を示す領域が検索された。第二に、ＨＴＬＶエン
ベロープ蛋白のトランスメンブラン部分（第１図参
照）、ｇａ２１の全領域をカバーする多重複線状ペプチ
ドが合成され、特性決定された。第三に、ＨＴＬＶエン
ベロープ蛋白の外側部分（第１図参照）、ｇｐ４６の全
領域をカバーする多重複線状ペプチドが合成され、特性
決定された。以下の配列をもつトランスメンブラン部分
からの３種のペプチド（第２図参照）およびそれらの混
合物は、ＡＴＬ患者由来の血清と高度に免疫反応性であ
ることが分かった：

【００１８】

【００１９】また、次の配列をもつ外側部分からの３種
のペプチドおよびそれらの混合物も、ＡＴＬ患者由来の
血清と高度に免疫反応性であることが判明した（第３図
参照）：

【００２０】

【００２１】ここで：Ａ＝Ａｌａ＝アラニンＧ＝Ｇｌｙ＝グリ
シンＲ＝Ａｒｇ＝アルギニンＩ＝Ｉｌｅ＝イソ
ロイシンＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェ
ニルアラニンＮ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＳ＝Ｓｅｒ＝セリ
ンＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＷ＝Ｔｒｐ＝トリ
プトファンＥ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロ
シンＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＶ＝Ｖａｌ＝バリ
ンＫ＝Ｌｙｓ＝リシンＣ＝Ｃｙｓ＝シス
テインＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジンＰ＝Ｐｒｏ＝プロ
リンＴ＝Ｔｈｒ＝トレオニンＨＴＬＶ−ＩのペプチドIVに対応し、ＨＴＬＶ−IIの同
一領域に存在する類似ペプチドの例は次の配列を含む：

【００２２】

【００２３】ペプチドＩ、IIおよびIII は米国特許第４
８３３０７１号として発行された親出願に開示されてい
る。

【００２４】化学合成ペプチドを土台としてＨＴＬＶ−
Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II抗体のアッセイは、破壊
した全ウイルスまたは細菌が生産した免疫吸着剤を用い
るアッセイと比べていくつかの利点を示す。これらのペ
プチドは自動固相合成法を使ってグラム量で簡単に合成
することができ、こうして再生産可能な同一抗原が一貫
した収量で得られる。生物学的系からの抗原の分離はこ
のような再生産を妨げる。より重要なこととして、非Ｈ
ＴＬＶ−Ｉまたは非ＨＴＬＶ−II感染者に見られる非特
異的反応は、アッセイに使用した調製物の異成分による
と思われる。これは特に免疫吸着剤として全ウイルスま
たはＥ．ｃｏｌｉ誘導組換え産物を用いたアッセイの場
合に当てはまる。これらの方法では、宿主細胞の内因性
細菌蛋白または主要組織適合抗原がしばしば目的の抗原
ウイルスまたは蛋白と一緒に精製される。これらの汚染
抗原に対する抗体は往々にして正常な人々にも見られる
ので、一般に行われている抗原分離法では偽陽性結果を
排除することができない。従って、本発明のアッセイ
は、他の方法が直面する偽陽性反応を明らかに排除する
と同時に、実質的に増大したシグナル対ノイズ比によっ
て真に陽性の血清に対して高い感度を示す。この増大し
たシグナル対ノイズ比は免疫吸着剤の純度から生じると
思われる。また、本発明アッセイは、ペプチドIVおよび
そのＨＴＬＶ−II類似体（ペプチドＸ）がＨＴＬＶ−Ｉ
またはＨＴＬＶ−II感染血清を識別するのに有用である
という点で高度に特異的である。換言すると、ペプチド
IVはＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を優先的に検出してＨＴ
ＬＶ−II抗体を検出せず、この逆も言える。

【００２５】さらに、今日まで、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨ
ＴＬＶ−II感染症に対して防御を賦与する生ワクチンま
たは方法がまったく報告されていない。不活化ウイルス
の利用は病気にかかる恐れを誘発し、その許容性および
使用を妨げる。

【００２６】

【発明が解決しようとする課題】それ故に、本発明の目
的は、テスト試薬としてウイルスまたはそのリゼインの
使用を必要としない検出・診断方法を開発することであ
る。

【００２７】別の目的は、感度と精度の高いテスト方法
を開発することである。

【００２８】他の目的は、化学的手段によりテスト試薬
を製造することである。合成試薬はその後体液中のＨＴ
ＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II抗体の存在を検出
しかつＡＴＬを診断するために使用され、これによりウ
イルスまたはそのセグメントにさらされる危険およびウ
イルスの不必要な増殖を回避することができる。

【００２９】また、本発明の目的は、ＨＴＬＶ−Ｉおよ
びＨＴＬＶ−II感染症を識別できるテスト試薬および方
法を提供することであり、これによりＨＴＬＶ−IIウイ
ルスが原因で起こる病気、ＨＴＬＶ−II感染症の病因を
研究することが可能になり、さらにＨＩＶとＨＴＬＶ−
IIの両方に感染した患者におけるＨＩＶ感染症の発生に
対するその影響を研究することが可能となる。

【００３０】他の目的は、健康な哺乳類（ヒトを含む）
に注入したとき、ＨＴＬＶ−Ｉ抗体の生産を刺激してＨ
ＴＬＶ−Ｉ感染症に対して防御を賦与するワクチンを開
発することである。

【００３１】別の目的は、ＨＴＬＶ−Ｉに対するモノク
ローナルおよびポリクローナル抗体を開発するために、
哺乳類に使用することのできる非ウイルス免疫原を提供
することである。

【００３２】他の目的は、ＨＴＬＶ（ＩおよびII）抗体
とＨＩＶ抗体を同時に検出するための診断方法を開発す
ることである。

【００３３】文献１．Ｂ．Ｊ．Ｐｏｉｅｓｚ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏ
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ｆｆｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１８：５７１
（１９８２）．２６．Ｊ．Ｄ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｔａｌ．，
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１５：３７２（１９８
６）．２７．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，Ｓ．Ｈ．Ｗｅ
ｉｓｓ，Ｊ．Ｈ．Ｇｉｒｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ａ
ｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２５５：３１３３（１９８
６）．２８．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｐ．Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｖ．Ｓ．Ｓｈ
ｏｒｔｙｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４
７１（１９８９）．２９．Ｒ．Ｃ．Ｇａｌｌｏ，Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕ
ｍｏｒＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３：２６５（１
９８６）．３０．Ｋ．Ｓｈｉｍｏｔｏｌｉｎｏ，Ｙ．Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ，８２，３１
０１−３１０５（Ｍａｙ１９８５）．３１．Ｊ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，Ｒ．Ｐａｔａｒｃａ，
Ｄ．Ｐｅｒｋｉｎｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
２５：４２１（１９８４）．３２．Ｇ．Ｍ．Ｓｈａｗ，Ｍ．Ａ．Ｇｏｎｄａ，Ｇ．
Ｈ．Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵ
ＳＡ，８１：４５４４（１９８４）．３３．Ｓ．Ｇ．Ｓａｎｄｌｅｒ，Ｃ．Ｆａｎｇ，ｉｎ
Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−Ｔｒａｎｓｆｍｉｔｔｅｄ
ＶｉｒａｌＤｉｓｅａｓｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖ
Ａ：ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｎ．ｏｆＢｌｏｏｄ
Ｂａｎｋｅｒｓ，ｐ．１９（１９８７）．

【００３４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、４種の
ペプチド（それぞれ特定の配列をもつ）が固相ペプチド
合成法により製造された。これらのペプチドは、血清お
よび体液中のＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗体の高感度
・精度検出法に、あるいはＡＴＬの診断に、有用である
ことが見いだされた。高い免疫反応性のために、これら
のペプチドはＢａｌｂ／ｃマウスのような健康な哺乳類
によるＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗体の生産を刺激す
るのに有用であることが期待される。

【００３５】本発明によれば、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ
−II抗体の検出およびＡＴＬの診断に有用なペプチド組
成物は、次のペプチド：

【００３６】

【００３７】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂であ
る）より成る群から選ばれるペプチド、その類縁体、セ
グメント、混合物、複合体または重合体を含有する；た
だしＡ＝Ａｌａ＝アラニンＧ＝Ｇｌｙ＝グリ
シンＲ＝Ａｒｇ＝アルギニンＩ＝Ｉｌｅ＝イソ
ロイシンＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェ
ニルアラニンＮ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＳ＝Ｓｅｒ＝セリ
ンＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＷ＝Ｔｒｐ＝トリ
プトファンＥ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロ
シンＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＶ＝Ｖａｌ＝バリ
ンＫ＝Ｌｙｓ＝リシンＣ＝Ｃｙｓ＝シス
テインＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジンＰ＝Ｐｒｏ＝プロ
リンＴ＝Ｔｈｒ＝トレオニン体液中のＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗体を検出しかつ
ＡＴＬを診断するための感度・精度の高い方法は、次の
段階から成っている：Ａ．次のアミノ酸配列：

【００３８】

【００３９】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂であ
る）を有する群から選ばれるペプチド、その類縁体、セ
グメント、混合物、複合体または重合体を含有するペプ
チド組成物を調製する段階；およびＢ．イムノアッセイ
法において抗原として約ｐＨ７〜１０の緩衝液中の約
０．０１μｇ〜約２０μｇ／テストのペプチド組成物を
使用する段階。

【００４０】さらに、本発明によれば、ペプチドそれら
自体、または蛋白や高分子キャリアーに結合されたペプ
チド、またはシステイン酸化誘導ジスルフィド架橋によ
りホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ
重合されたペプチド、またはホモまたはヘテロ官能性多
価架橋剤の使用によりホモまたはヘテロダイマーもしく
は高級オリゴマーに重合されたペプチド、あるいは多価
リシン樹脂上で直接合成されたペプチドを使用して、健
康な哺乳類（ヒトを含む）によるＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬ
Ｖ−II抗体の生産を刺激することができる。この方法
は、ヒト血清アルブミンのようなキャリアーに結合され
た、または重合体としての、有効量のこれら６種のペプ
チドの混合物を含むペプチド組成物を、腹腔内または皮
下注射により健康な哺乳類の体内に導入することから成
っている。

【００４１】ペプチドＩ〜VIの類縁体はＨＴＬＶ−IIに
も存在する。第１図を参照されたい。この種の配列は次
のものである：

【００４２】

【００４３】（ＨＴＬＶ−Ｉと相違する残基には下線が
引いてある。）ペプチドVII 〜XII は体液中のＨＴＬＶ
−II抗体を検出するのに有用である。これらの配列を再
検討すると、ペプチドIXはペプチドIII と同一であり；
ペプチドVII およびVIIIは１個のアミノ酸を除いてペプ
チドＩおよびIIと同一である；が、ペプチドＸ、XIおよ
びXII は対応するＨＴＬＶ−IIアミノ酸配列に従ってア
ミノ酸が置換されている部位を多数含み、ペプチドIV、
ＶおよびVIとかなり相違することが分かる。

【００４４】ペプチドIVおよびＸはそれぞれＨＴＬＶ−
ＩおよびＨＴＬＶ−IIに特有であることが判明した。す
なわち、ペプチドIVはＨＴＬＶ−IIに対する抗体と反応
性でなく、そしてペプチドＸはＨＴＬＶ−Ｉに対する抗
体と反応性でない。このために、ペプチドIVおよびＸは
ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIの血清陽性を識別するため
に使用される。

【００４５】さらに、本発明によれば、ペプチドIV〜XI
I の混合物は体液中のＨＴＬＶ−Ｉ／IIの存在を検出す
るために使用することができる。また、ＨＴＬＶ−Ｉ／
ＨＴＬＶ−IIに対する抗体の検出に有用なペプチド組成
物は、ＨＴＬＶ−Ｉ／IIとＨＩＶ−１／２の両方による
感染を同時に検出するために、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ
−２に対する抗体の検出に有用なペプチド組成物と共に
使用される。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体
の検出に有用なペプチド組成物は、特定配列（ＨＩＶ−
２の配列はペプチドVII およびペプチドVIIIの類縁体で
ある）の以下のアミノ酸またはそれらの類縁体の化学合
成ペプチド：

【００４６】

【００４７】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂であ
る）、その類縁体、セグメント、混合物、または重合体
を含有する；ただしＡ＝Ａｌａ＝アラニンＧ＝Ｇｌｙ＝グリ
シンＲ＝Ａｒｇ＝アルギニンＩ＝Ｉｌｅ＝イソ
ロイシンＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェ
ニルアラニンＮ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＳ＝Ｓｅｒ＝セリ
ンＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＷ＝Ｔｒｐ＝トリ
プトファンＥ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロ
シンＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＶ＝Ｖａｌ＝バリ
ンＫ＝Ｌｙｓ＝リシンＣ＝Ｃｙｓ＝シス
テインＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジンＰ＝Ｐｒｏ＝プロ
リンＴ＝Ｔｈｒ＝トレオニンＭ＝Ｍｅｔ＝メチオニン下線を引いたアミノ酸は種々の単離物の間で共有される
残基を表す。ＨＩＶ−２のペプチドXVI では、ヌクレオ
チド配列から推定される対応ＨＩＶ−２エンベロープ蛋
白アミノ酸配列において置換が行われた。

【００４８】本発明によれば、体液中のＨＴＬＶ−Ｉま
たはＨＴＬＶ−II抗体の検出、ＡＴＬの診断、およびＨ
ＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIに対する抗体の生産を刺
激することによる健康な哺乳類のワクチン接種のため
に、６種のペプチドが化学的に合成された。これらのペ
プチドは次の配列を有する：

【００４９】

【００５０】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂であ
る）。

【００５１】これらのペプチドは類縁体またはセグメン
ト、すなわち、上記配列の末端アミノ酸（例えば、−Ｇ
ｌｙ−、−Ｇｌｎ−、−Ａｓｎ−、および−Ｃｙｓ−）
に１以上のアミノ酸が付加された、あるいは末端からア
ミノ酸が除去された、より長いまたはより短いペプチド
鎖、でありうる。例えば、ペプチドＸはペプチドIVの類
縁体である。

【００５２】また、これらのペプチドは複合体であって
もよく、すなわち、それらはウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなキャ
リアー蛋白に結合させることができる。さらに、これら
のペプチドは重合体であってもよく、すなわち、それら
は分枝オクタマーリシン樹脂のような高分子樹脂上で合
成することができる。ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗体
により認識されるペプチドの免疫反応性が保持される限
り、合成ペプチドの類縁体は上記配列のアミノ酸の置
換、挿入および／または欠失を含みうることが期待され
る。

【００５３】さらに、異なる単離物間の株による変異を
適応させるために、保存的置換についての調節および非
保存的置換を伴うもの間の選択が上記の特定配列におい
て行われる。例えば、ＨＴＬＶ−II株に存在するペプチ
ドＸ〜XII も使用することができる。

【００５４】体液中のＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−II
に対する抗体の検出およびＡＴＬの診断のためのテスト
試薬として有用なポリペプチドのアミノ酸配列は、ｇｐ
２１と呼ばれるＨＴＬＶウイルスのアミノ酸配列の部分
セグメント、およびｇｐ４６と呼ばれるＨＴＬＶウイル
スのアミノ酸配列の部分セグメント（両方ともＨＴＬＶ
−ＩまたはＨＴＬＶ−IIウイルスのエンベロープ蛋白を
規定するｇｐ６１の一部である）に対応するように選ば
れる。

【００５５】抗体ＨＴＬＶ−Ｉを検出するための固相免
疫吸着剤として有用なペプチドは、側鎖保護ｔ−Ｂｏｃ
−アミノ酸を用いる“古典的”なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
固相ペプチド合成法により、以下のアミノ酸配列に一致
するように合成した：

【００５６】

【００５７】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂であ
る）。

【００５８】これらのペプチドの他の類縁体は、所望の
ｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸を付加、置換または欠失してアミ
ノ酸配列を変えることにより製造することができる。

【００５９】例えば、次の配列を有する類縁体ペプチド
VII 〜XII も製造することができる：

【００６０】

【００６１】樹脂上での目的の保護ペプチドの合成が完
了した後、ペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸で処理し
て、樹脂からペプチドを切断する。ベンジル誘導保護基
で合成の間中保護されるアミノ酸の官能基も同時にペプ
チドから切断される。その後、遊離ペプチドは高性能液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製して、アミノ
酸分析により生化学的に特性決定される。

【００６２】上記方法により合成されたペプチドはＨＴ
ＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−IIに対する抗体と高
度に反応性であり、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬ
Ｖ−II抗体を検出するための高感度の特異的免疫吸着剤
として使用することができる。

【００６３】第３図は、ＥＬＩＳＡ法（ウェルプレート
はそれぞれ１．０μｇのペプチドIV、ＶおよびVIで被覆
する）を使ってＡＴＬ患者由来の血清から得られたデー
タを示す。表Ｉは、ウェルプレートを重量比１：０．２
５：１：１（II：IV：Ｖ：VI）のペプチドII、IV、Ｖお
よびVIの混合物で被覆したＥＬＩＳＡ法を使って、ＡＴ
Ｌ患者由来の血清から得られたデータを示す。表IIは、
赤血球（ＲＢＣ）をペプチドVI−ＢＳＡ複合体で被覆し
た凝集法を利用して、ＡＴＬ患者由来の血清から得られ
たデータを示す。表III およびIVは、ペプチドIVおよび
ペプチドＸと関連した唯一の特異的免疫反応性、並びに
ＨＴＬＶ−Ｉ感染者とＨＴＬＶ−II感染者を識別する際
のそれらの有用性を示す。

【００６４】ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II
抗体との免疫反応における本発明ペプチド組成物の高感
度および特異性に基づいて、これらのペプチド組成物は
ＡＴＬおよび／またはＨＴＬＶ−II感染症のためのワク
チンとして、あるいは哺乳類（ヒトを含む）にＨＴＬＶ
−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−IIに対するモノクローナ
ルおよびポリクローナル抗体を発生させるための免疫原
として有用であると考えられる。また、ペプチド組成物
は、蛋白に結合されたまたは高分子キャリアー樹脂
（例．オクタマーリシン樹脂）上で合成されたもの、ま
たはシステイン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモま
たはヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合され
たもの、あるいはホモまたはヘテロ官能性多価架橋剤の
使用によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリ
ゴマーに重合されたものも、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／また
はＨＴＬＶ−II抗体の生産を刺激しかつ健康な哺乳類に
ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II感染症に対す
る防御を賦与するために、正常個体に導入することがで
きる。本発明のペプチド組成物はウイルスから生化学的
に誘導されるものではないので、予防接種を受けようと
する正常個体がこの病気にさらされる危険はない。

【００６５】本発明ペプチドを使用することの利点は数
多く存在する。

【００６６】本発明ペプチドは化学的に合成される。こ
のことは、テスト試薬やワクチンの製造過程でＨＴＬＶ
−ＩまたはＨＴＬＶ−IIウイルスと接触しないことを意
味する。ワクチン製造中または予防接種時に、ワクチン
製造者や医師はＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIウイル
スにさらされる危険がない。さらに、ＨＴＬＶ−Ｉまた
はＨＴＬＶ−II抗体を検出するテスト（この場合、テス
ト試薬を血清または体液のサンプルにさらす）の最終段
階まで、実験室の研究者がＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ
−IIウイルスにさらされる危険はない。

【００６７】本発明方法によって回避される別の問題
は、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIウイルスリゼイト
調製物と一緒に精製された宿主細胞からの抗原物質、あ
るいは発現されたウイルス断片と一緒に精製されたＥ．
ｃｏｌｉ誘導蛋白の存在により生ずる偽陽性結果の可能
性である。正常個体のうちの何人かは、宿主細胞由来の
抗原物質と交差反応するＥ．ｃｏｌまたはヒト白血球抗
原（例．ＨＬＡ）に対する抗体をもっている。これらの
正常個体からの血清サンプルはＥＬＩＳＡまたはＩＲＭ
Ａテストにおいて陽性の応答を示すかもしれない。

【００６８】さらに、適当なアミノ酸類似体の置換によ
り、上記の特定アミノ酸配列に基づいた種々のペプチド
類縁体が合成され、これらのペプチドはより低いバック
グラウンド読み取り、あるいはＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴ
ＬＶ−II抗体スクリーニングアッセイに有用な固相への
良好な吸着能を示す特性をもつことが期待される。

【００６９】さらに、本発明のペプチド組成物は合成的
に製造されるので、品質をコントロールすることがで
き、その結果、テスト結果の再現性が保証される。ま
た、各テスト法に必要なペプチドの量はごくわずかであ
り、しかもペプチドの製造経費は比較的少ないので、Ｈ
ＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−II抗体について体液をスク
リーニングするコスト、ＡＴＬおよび／またはＨＴＬＶ
−II感染症の診断コスト、およびワクチンの製造コスト
が比較的低い。

【００７０】本発明により製造されたペプチドは、酵素
免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットア
ッセイ、凝集アッセイ、ラジオイムノラジオメトリック
アッセイ（ＩＲＭＡ）、または他の公知イムノアッセイ
においてテスト試薬として用いることにより、ＨＴＬＶ
−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II感染を検出しかつＡＴ
Ｌを診断するために使用される。好適な方法はＥＬＩＳ
Ａである。ＥＬＩＳＡ法は実施例１および２に、ＩＲＭ
Ａ法は実施例５に、そして凝集アッセイは実施例３およ
び６に示してある。

【００７１】以下の方法において、プレートまたはビー
ズへのペプチドの結合を容易にするために、被覆緩衝液
中に０．２５重量％のグルタルアルデヒドが加えられる
ことに注意すべきである。さらに、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が
第二抗体トレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗ヒトＩｇＧの代わりに用いられる。

【００７２】これらの方法で用いるゼラチンはウシ皮膚
ゼラチン、ブタ皮膚ゼラチン、魚ゼラチンまたは既知の
入手可能なゼラチン蛋白であり、アルブミン蛋白と置き
換えることができる。

【００７３】実施例１０には、ペプチドIVがＨＴＬＶ−
Ｉ抗体と優先的に反応し、ＨＴＬＶ−II抗体と反応せ
ず、従ってＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染を区別
するために使用しうることが示してある。

【００７４】同様に、実施例１１には、ＨＴＬＶ−II
（ＨＴＬＶ−Ｉの変異型）のアミノ酸配列から誘導され
た類縁体ペプチドであるペプチドＸがＨＴＬＶ−II抗体
とのみ反応し、ＨＴＬＶ−II感染を特異的に検出するた
めに使用できることが示してある。

【００７５】

【実施例】実施例１酵素免疫吸着アッセイによるＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−
II抗体の検出９６−ウェルプレートのウェルに、上記のように製造し
た３種のペプチドIV、Ｖ、VIを１００μｌの１０ｍＭ
ＮａＨＣＯ₃緩衝液ｐＨ９．５中の各々１．０μｇ／ウ
ェルのペプチドで４℃にて一晩（または室温で３時間）
被覆した。ウェルはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で３回洗
い、その後ＰＢＳ中の３重量％ゼラチン２５０μｌと３
７℃で１時間インキュベートして、非特異的蛋白結合部
位を遮断し、続いて０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳで３回以上洗った。テスト血清（患者または正
常個体から採取した血液）は２０容量％正常ヤギ血清、
１重量％ゼラチンおよび０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳを用いて１：２０（容量：容量）の希釈率
で希釈した。各ウェルに２００μｌの希釈血清を加え、
３７℃で１時間反応させた。その後、ウェル０．０５容
量％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗い、未結合抗
体を除いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒ
トＩｇＧを第二抗体トレーサーとして使用して、陽性ウ
ェルに形成されたＨＴＬＶ−Ｉ抗体−抗原複合体と結合
させた。１容量％正常ヤギ血清および０．０５容量％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：３０００に希釈した１
００μｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを各
ウェルに加えて、３７℃でさらに１５分間インキュベー
トした。

【００７６】ウェルは０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０含
有ＰＢＳで５回洗って未結合抗体を除き、クエン酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ５．０中に０．０４重量％オルトフェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ）および０．０１２容量％過酸
化水素を含む基質混合物１００μｌと反応させた。この
基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキシダーゼ
標識を検出するために使用された。反応は１００μｌの
１．０ＭＨ₂ＳＯ₄を加えて停止させ、ＥＬＩＳＡリ
ーダーを使って４９２ｎｍ（すなわちＡ₄₉₂）で吸光度
を測定した。アッセイは正常個体またはＨＴＬＶ−Ｉ感
染症に無関係の病気をもつ患者からの血清サンプルの希
釈物（１：２０）を陰性対照として用いて２通り行っ
た。Ａ₄₉₂＝０．１２（正常血清対照の平均Ａ₄₉₂値の
約３倍）の閾値より大きい吸光度読み取りを陽性として
採用した。これらの結果を第３図に示す。

【００７７】実施例２酵素免疫吸着アッセイによるＨＴＬＶの抗体の検出９６−ウェルプレートのウェルに、II：IV：Ｖ：VI＝
１：０．２５：１：１の重量比の上記のように製造した
４種のペプチドの混合物を１００μｌの１０ｍＭＮａＨ
ＣＯ₃緩衝液ｐＨ９．５中の３．２５μｇ／ウェルの混
合物で４℃にて一晩（または室温で３時間もしくは３７
℃で１時間）被覆した。ウェルはリン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で３回洗い、その後ＰＢＳ中の３重量％ゼラチン２
５０μｌと３７℃で１時間インキュベートして、非特異
的蛋白結合部位を遮断し、続いて０．０５容量％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで３回以上洗った。テスト血清
（ヒト患者または正常個体から採取した血液）は２０容
量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび０．０５容
量％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて１：２０
（容量：容量）の希釈率で希釈した。各ウェルに２００
μｌの希釈血清を加え、３７℃で１時間反応させた。そ
の後、ウェル０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
で３回洗い、未結合抗体を除いた。西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを第二抗体トレーサーと
して使用して、陽性ウェルに形成されたＨＴＬＶ抗体−
抗原複合体と結合させた。１容量％正常ヤギ血清および
０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：３０
００に希釈した１００μｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗ヒトＩｇＧを各ウェルに加えて、３７℃でさらに１５
分間インキュベートした。

【００７８】ウェルは０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０含
有ＰＢＳで５回洗って未結合抗体を除き、クエン酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ５．０中に０．０４重量％オルトフェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ）および０．０１２容量％過酸
化水素を含む基質混合物１００μｌと反応させた。この
基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキシダーゼ
標識を検出するために使用された。反応は１００μｌの
１．０ＭＨ₂ＳＯ₄を加えて停止させ、ＥＬＩＳＡリ
ーダーを使って４９２ｎｍで吸光度（すなわちＡ₄₉₂）
を測定した。アッセイは正常個体またはＨＴＬＶ感染症
に無関係の病気をもつ患者からの血清サンプルの希釈物
（１：２０）を陰性対照として用いて２通り行った。Ａ
₄₉₂＝正常対照のＡ₄₉₂＋０．１（反応性対照のＡ₄₉₂
値）の閾値より大きい吸光度読み取りを陽性として採用
した。これらの結果を表Ｉおよび第４図に示す。

【００７９】表Ｉ固相免疫吸着剤として４種のペプチドの混合物を用いるＥＬＩＳＡ＊によるＨＴＬＶ抗体の検出患者陽性数／試験数＊陽性％１．ＡＴＬ患者（ロット５）（ＨＴＬＶウェスターンブロット陽性）９４／９４１００２．ＡＴＬ患者（ロット５）（ＨＴＬＶウェスターンブロット陰性）０／６０３．ＡＩＤＳ／ＡＲＣ患者またはＨＩＶに感染したことが知られた患者１０／１６１６４．正常個体０／２０００＊アッセイは緩衝液で１：２０（ｖ／ｖ）に希釈した血
清を用いて行った。

【００８０】注：ＡＴＬ患者由来の血清は親切にも日本
赤十字社から提供され、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、一次免疫不
全症、白血病／リンパ腫の患者からの血清はカリフォル
ニア大学のＳ．Ｇｕｐｔａ博士、コロンビア大学のＤ．
Ｍ．Ｋｎｏｗｌｅｓ博士、およびロングアイランドユダ
ヤ人病院のＦ．Ｄ．Ｓｉｅｇａｌ博士により親切にも提
供された。

【００８１】表Ｉの結果は、血清サンプルを用いた本発
明によるＥＬＩＳＡテスト法が非常に正確で、高度に特
異的であることを示している。正常個体からの血清には
免疫反応が全く見られなかった。

【００８２】血液銀行からウイルスに汚染された血液を
除くスクリーニングテストにおいて、所望により、陽性
反応を規定する基準をより厳重にすることができる点に
留意されたい。

【００８３】実施例３凝集アッセイによるＨＴＬＶ抗体の検出Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法により合成された本発明の
ＨＴＬＶペプチドは、本質的にＦｕ−ＴｏｎｇＬｉｕ
ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：６９
０−６９７（１９７９）に記載されるように、ｍ−マレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＭＢＳ）で誘導体化したウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）に結合させた。０．０１３ｍｌのＭＢＳ溶液（ジ
メチルホルムアミド中０．０２５ｍｇ／ｍｌ）を室温で
０．３２ｍｌのＢＳＡ溶液（０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０中１００ｍｇ／ｍｌ）加えた。ＢＳＡ溶液に加
えるＭＢＳの量は、研究する特定の複合体について決定
されたＢＳＡ対ＭＢＳの最適モル比により変化しうる。
この混合物は室温で１時間撹拌し、その後遠心して沈澱
アルブミンを除いた。次に、澄明混合物をセファデック
スＧ−２５のゲル濾過にかけ、２８０ｎｍでのそれらの
吸光度により検出した蛋白含有画分をプールし、必要に
なるまで−７０℃で凍結保存した。

【００８４】ペプチドはＨ₂Ｏ中に１０ｍｇ／ｍｌで溶
解した。予め定められた量の各ペプチド溶液は活性化Ｂ
ＳＡ−ＭＢＳ溶液に滴下し、室温で３時間撹拌した。最
終ペプチド−ＢＳＡ複合体はゲル濾過または十分な透析
により遊離ペプチドから分離した。ペプチド対ＢＳＡの
比は慣用方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定し
た。

【００８５】一例として、ペプチドVI−ＢＳＡ複合体は
その後二重アルデヒド固定化ヒトＯ赤血球にｐＨ４．０
で吸着させた。次に、ペプチド−複合体被覆赤血球はＮ
ａＢＨ₄で処理して非特異的蛋白結合を妨げた。その
後、ペプチド−複合体被覆赤血球をＰＢＳで洗い、５％
正常ヒト血清−ＰＢＳ溶液とインキュベートした。これ
らの処理細胞はその後血清および血漿サンプル中のＨＴ
ＬＶ抗体を検出するための凝集アッセイにおいて使用し
た。

【００８６】成人Ｔ細胞白血病患者由来の全部で１００
の血清は、（１）固相としてＨＴＬＶ−Ｉウイルスリゼ
イトを用いる酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）［ＤｕＰｏ
ｎｔ社のＨＴＬＶ−ＩＥＬＩＳＡ］；（２）ウェスタ
ーンブロット（ＷＢ）分析；（３）固相としてペプチド
VI−ＢＳＡ複合体を用いる上記のＨＴＬＶ凝集アッセイ
によりＨＴＬＶ抗体について試験した。これらの結果を
表IIに示す。

【００８７】表II 結果ＷＢ試験数ＥＩＡＨＴＬＶ凝集アッセイ＋７７＋７７陽性＋未確定２＋２陰性＊ − ２１ − ２１陰性＊ＨＴＬＶ凝集アッセイで陰性の結果が出た２つのサン
プルは、ＨＴＬＶのｐ１９コア蛋白に対する抗体のみを
もつことが判明した。

【００８８】実施例４７種の化学合成ペプチドの混合物を用いる酵素イムノア
ッセイによるＨＴＬＶ抗体とＨＩＶ（１および２）抗体
の同時検出実施例１の方法に従って、本発明の７種の化学合成ペプ
チドを含む溶液を使用して、９６ウェルプレートのウェ
ルに被覆した。３種のペプチドはＨＴＬＶ−Ｉペプチド
属［II、IVおよびVI］から；３種はＨＴＬＶ−Ｉペプチ
ド属［XIII、XIV およびXV］から；そして１種はＨＩＶ
−２ペプチド属［XVI ］からそれぞれ誘導された。ペプ
チドII：IV：VI：XIII：XIV ：XV：XVI は合計濃度２
１．２μｇ／ｍｌにおいて２：０．２：２：１０：１：
１：５の比で存在していた。ＨＩＶ−１陽性ドナー（１
５５サンプル）；ＨＩＶ−２陽性ドナー（１０サンプ
ル）；ウェスターンブロットでＨＴＬＶ陽性ドナー（９
２サンプル）；ウェスターンブロットでＨＴＬＶ陰性ド
ナー（４サンプル）；自己免疫病患者（ＡＩ、３６サン
プル）；および無作為に抽出した供血者（ＲＢＳ、４７
４サンプル）；からの全部で７７１のサンプルがそれら
のレトロウイルス免疫反応性についてペプチド被覆プレ
ート上で試験された。

【００８９】これらのサンプルに関する合成ペプチドに
基づいたレトロウイルスコンボＥＩＡ（ＨＴＬＶおよび
ＨＩＶ−１／２）の性能は第５図に示してある。明らか
に、これらの結果はＨＴＬＶペプチドとＨＩＶペプチド
との併用がレトロウイルス感染症の検出に有用であるこ
とを示している。

【００９０】実施例５イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）によるＨ
ＴＬＶ抗体の検出９６−ウェル軟質ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プレートの
ウェルに、上記のように製造した３種のペプチドの混合
物（１：１：１）を１００μｌの１０ｍＭＮａＨＣＯ
₃緩衝液ｐＨ９．５中１．５μｇ／ウェルで４℃にて一
晩（または室温で３時間）被覆する。ウェルはリン酸緩
衝溶液（ＰＢＳ）で３回洗い、その後ＰＢＳ中の３重量
％ゼラチン２５０μｌと３７℃で１時間インキュベート
して、非特異的蛋白結合部位を遮断し、続いて０．０５
容量％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回以上洗浄
する。テスト血清（ヒト患者または正常個体から採取し
た血液）は２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチン
および０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用
いて１：２０および１：２００（容量：容量）の希釈率
でそれぞれ希釈する。各ウェルに２００μｌの希釈血清
を加え、３７℃で１時間反応させる。その後、ウェルを
０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗い、
未結合抗体を除去する。Ｉ−１２５標識アフィニティー
精製ヤギ抗ヒトＩｇＧを第二抗体トレーサーとして使用
して、陽性ウェルに形成された抗体−抗原複合体と結合
させる。１容量％正常ヤギ血清および０．０５容量％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の５０，０００〜２００，
０００ｃｐｍのＩ−１２５標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１００
μｌを各ウェルに加えて、３７℃でさらに１時間インキ
ュベートする。

【００９１】ウェルは０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ２０含
有ＰＢＳで５回洗って未結合第二抗体を除き、乾かす。
ウェルを切り取り、ガンマ−シンチレーションカウンタ
ーで計数する。アッセイは１：２０希釈物（容量：容
量）を用いて２通り実施する。陰性対照として正常血清
サンプルも同時に試験する。正常血清サンプルの平均読
み取り＋４ＳＤ（標準偏差）より大きいｃｐｍ読み取り
を陽性として採用する。実施例６固相免疫吸着剤としてペプチド混合物を被覆したゼラチ
ン粒子、異なる動物種の赤血球、またはラテックスビー
ズを用いる凝集アッセイによるＨＴＬＶ抗体の検出１ｍｌの完全洗浄赤血球、ゼラチン粒子、またはポリス
チレンラテックスビーズに５μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ
の範囲の濃度でペプチド混合物を被覆する。その後、ペ
プチド混合物被覆細胞、粒子またはビーズは９６−ウェ
ルＵ形マイクロプレートのウェル中もしくはスライド上
で段階的希釈血清サンプルとインキュベートする。室温
で約１時間放置後、ウェルの底またはスライド上の沈降
凝集パターンを読み取り、陽性反応を示す最大希釈率を
記録する。

【００９２】これは血清または体液などのサンプル中の
ＨＴＬＶ抗体の定性・定量分析に利用しうる１段階アッ
セイである。

【００９３】実施例７凝集アッセイを用いてＨＴＬＶ抗体を検出するための第
三のテストキットは、多重マイクロウェルプレートを含
む区画容器、および（１）ペプチド混合物を被覆した赤
血球、ゼラチン粒子またはラテックスポリスレンビーズ
のびん；（２）正常ヒト血清（陰性対照として）；
（３）ＮＰ４０処理および熱不活性化ＨＴＬＶ−Ｉ陽性
血清（陽性対照として）；および（４）サンプル希釈
後；を含む凝集アッセイ用の他の補助物質から成ってい
る。凝集アッセイは実施例３に記載の方法に従って行わ
れる。

【００９４】実施例８ＨＴＬＶ抗体を検出するための診断テストキットを作製
することができる。このテストキットは、使用前に１０
０μｌの１０ｍＭＮａＨＣＯ₃緩衝液ｐＨ９．５中の
本発明ペプチドまたはペプチド混合物を被覆した多重９
６−ウェルプレートを含む区画容器を含んでいる。キッ
トはさらに別の密閉容器に収容した酵素検出用の物質、
すなわち１）正常ヒト血清（陰性対照として）；２）Ｎ
Ｐ４０処理および熱不活性化ＨＴＬＶ−Ｉ陽性血清（陽
性対照として）；３）サンプル希釈剤；４）ペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ；および５）例えばリン酸
クエン酸塩緩衝液中のオルトフェニルレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）および過酸化水素から成る発色指示薬を含んでい
る。このアッセイは実施例１に記載の方法に従って行わ
れる。

【００９５】このテストキットでは、本発明ペプチドま
たはペプチド混合物を前以て被覆した９６−ウェルプレ
ートの代わりに、固相免疫吸着剤として本発明ペプチド
を被覆したポリスチレンビーズ、コントロールドポアサ
イズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｓｉｚｅ）ガラ
スビーズ、またはニトロセルロースペーパー帯片を使用
することができる。

【００９６】実施例９イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）により抗
体を検出するための第二のテストキットは、１００μｌ
の１０ｍＭＮａＨＣＯ₃緩衝液ｐＨ９．５中の本発明
ペプチドまたはペプチド混合物を被覆した多重９６−ウ
ェル軟質ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プレートを含む区画
容器、および１）正常ヒト血清（陰性対照として）；
２）ＮＰ４０処理および熱不活性化ＨＴＬＶ−Ｉ陽性血
清（陽性対照として）；３）サンプル希釈剤；および
４）Ｉ−１２５標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ；を含むラジオイ
ムノアッセイ用の物質から成っている。このアッセイは
実施例５に記載の方法に従って行われる。

【００９７】このテストキットでは、本発明ペプチドを
前以て被覆した９６−ウェルＰＶＣプレートの代わり
に、固相免疫吸着剤として本発明ペプチドを被覆したポ
リスチレンビーズを使用することができる。

【００９８】実施例１０合成ペプチドを用いる酵素イムノアッセイによるＨＴＬ
Ｖ−Ｉ抗体（ＨＴＬＶ− II抗体ではない）の特異的検出ＨＴＬＶ−Ｉに対応する配列：

【００９９】

【０１００】を有する５μｇ／ｍｌの本発明合成ＨＴＬ
Ｖ−ＩペプチドIVを含む溶液を、実施例１に従って９６
−ウェルプレートのウェルに被覆した。ＨＴＬＶリゼイ
トに基づいたテストで反復反応性を示すことが知られた
個体または供血者からの全部で１２０のサンプルが、そ
れらの免疫反応性についてペプチド被覆プレートで試験
された。１２０のサンプルのうち、７３はＨＴＬＶ−Ｉ
またはＨＴＬＶ−II特異的ＤＮＡプローブを用いるポリ
メラーゼチェイン反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉ
ｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によっても試験され
た。これらのうち、４３はＰＣＲでＨＴＬＶ−Ｉについ
て陽性であり、そして３０はＰＣＲでＨＴＬＶ−IIにつ
いて陽性であった。ウェスターンブロット（ＷＢ）やラ
ジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）のような補足的テ
ストも１２０全部のサンプルについて実施した。利用で
きるＰＣＲ結果をもたないサンプルの場合は、ＷＢおよ
びＲＩＰＡ結果を潜在的ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−
II陽性とみなした。従って、１２０のサンプルは次のカ
テゴリーから成っていた；すなわち、ＰＣＲでＨＴＬＶ
−Ｉ陽性（４３サンプル）；ウェスターンブロットおよ
びＲＩＰＡで潜在的ＨＴＬＶ−Ｉ陽性（１２サンプ
ル）；ＰＣＲでＨＴＬＶ−II陽性（３０サンプル）；ウ
ェスターンブロットおよびＲＩＰＡで潜在的ＨＴＬＶ−
II陽性（２６サンプル）；およびウイルスリゼイトＥＬ
ＩＳＡでＨＴＬＶに対して反復反応性であくが、ウェス
ターンブロットおよびＲＩＰＡで陰性（ＲＲ（ＷＢＮ
ＥＧ）、９サンプル）。

【０１０１】この合成ペプチドに基づいたＥＩＡの性能
（ＨＴＬＶ−Ｉ特異性）は表III に示してある。表III
の結果は、この方法がＨＴＬＶ−Ｉに対して高感受性で
特異的であり、ＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染を
区別するために使用できることを示している。一方、全
ウイルスリゼイトＥＩＡは、１２０全部のサンプルに対
して陽性の結果を与えるので、２つのウイルス感染症を
識別できない。

【０１０２】表III ペプチドIVによるテスト患者（括弧内のアッセイにより確認）陽性数／試験数陽性％１．ＨＴＬＶ−Ｉ（ＰＣＲ）４１／４３９５．３２．ＨＴＬＶ−Ｉ（ＷＢ／ＲＩＰＡ）１２／１２１００３．ＨＴＬＶ−II（ＰＣＲ）４／３０１３．３４．ＨＴＬＶ−II（ＷＢ／ＲＩＰＡ）１／２６３．８５．ＲＲ（ＷＢＮＥＧ）０／９０ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−II陽性であることがＰＣ
Ｒ、ＲＩＰＡまたはＷＢにより確認された個体および供
血者からの血清は、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎ
ｃ．から、および米国赤十字社（ＡＲＣ）のＣｈａｎｇ
Ｆａｎｇ博士より親切にも提供された。

【０１０３】実施例１１合成ペプチドを用いる酵素イムノアッセイによるＨＴＬ
Ｖ−II抗体（ＨＴＬＶ−Ｉ抗体ではない）の特異的検出第２図のＨＴＬＶ−IIに対応する配列、すなわち

【０１０４】

【０１０５】のアミノ酸配列を有する、ＨＴＬＶ−IIペ
プチドＸと呼ばれる、本発明のＨＴＬＶ−ＩペプチドIV
の合成ペプチド類縁体を含む溶液は、実施例１の方法に
従って５μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートのウェ
ルを被覆するために使用した。実施例１０と同じ１２０
のサンプルが試験された。

【０１０６】この合成ペプチドに基づいたＥＩＡの性能
（ＨＴＬＶ−II特異性）は表IVに示してある。表IVの結
果は、この方法がＨＴＬＶ−IIに対して高感受性で特異
的であり、ＨＴＬＶ−II抗体とＨＴＬＶ−Ｉ抗体を区別
するために使用できることを示している。一方、全ウイ
ルスリゼイトＥＩＡは、１２０全部のサンプルに対して
陽性の結果を与えるので、２つのウイルス感染症を識別
できない。

【０１０７】表IV ペプチドＸによるテスト患者（括弧内のアッセイにより確認）陽性数／試験数陽性％１．ＨＴＬＶ−II（ＰＣＲ）２８／３０９３．３２．ＨＴＬＶ−II（ＷＢ／ＲＩＰＡ）２４／２６９２．３３．ＨＴＬＶ−Ｉ（ＰＣＲ）０／４３０４．ＨＴＬＶ−Ｉ（ＷＢ／ＲＩＰＡ）０／１２０５．ＲＲ（ＷＢＮＥＧ）０／９０上記の実施例は本発明を例示するものであって、その範
囲を制限するものではないことを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIエンベロープ
蛋白のアミノ酸配列の比較を示す。

【図２】本明細書中で開示した化学合成ペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。

【図３】ＡＴＬ患者由来の血清とここに開示したペプチ
ドとの免疫反応性を示すヒストグラムである。

【図４】ＨＩＶ感染患者、ＡＴＬ患者、および無作為に
抽出した供血者由来の血清とここに開示したペプチドと
の免疫反応性を示すヒストグラムである。

【図５】ここに開示した７種の化学合成ペプチドの混合
物を使用する酵素イムノアッセイによるＨＴＬＶ−Ｉお
よびＨＩＶ（１および２）に対する抗体の同時検出を示
すヒストグラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 8413−4ＣＣ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の配列：（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）より成る群
から選ばれるペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉおよ
び／またはＨＴＬＶ−II抗体に対する免疫反応性が実質
的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠
失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換され
る）；または上記ペプチドのセグメント、混合物、複合
体、もしくは重合体から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／ま
たはＨＴＬＶ−II抗体に対して特異的免疫反応性を有す
るペプチド組成物。
【請求項２】ペプチドIV、ＶおよびVIの混合物から成
る、請求項１記載のペプチド組成物。
【請求項３】次のアミノ酸配列：を有するペプチドIIまたはその類縁体をさらに含む、請
求項２記載のペプチド組成物。
【請求項４】次のアミノ酸配列：を有するペプチドIV、ＶおよびVIの類縁体を含む、請求
項１記載のペプチド組成物。
【請求項５】ペプチドIV、ＶおよびVIと、次の配列：を有するペプチドＩ、IIおよびIII 、またはその類縁
体、との混合物から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／または
ＨＴＬＶ−II抗体に対して特異的免疫反応性を有するペ
プチド組成物。
【請求項６】（Ａ）固体支持体に、次のアミノ酸配
列：（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）より成る群
から選ばれるペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉおよ
び／またはＨＴＬＶ−II抗体に対する免疫反応性が実質
的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠
失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換され
る）；またはそのセグメント、混合物、複合体、もしく
は重合体を含む有効量のペプチド組成物を抗原として被
覆し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加え（その場合、
テスト検体中のＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−
II抗体がペプチド組成物とペプチド−抗体複合体を形成
する）；（Ｃ）この混合物をインキュベートし；そして（Ｄ）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する；ことか
ら成るＨＴＬＶ−Ｉ抗体を検出してＡＴＬ疾患を診断す
るためのイムノアッセイ法。
【請求項７】固体支持体は有効量のペプチドIV、Ｖお
よびVIの混合物で被覆される、請求項６記載のイムノア
ッセイ法。
【請求項８】固体支持体は有効量のペプチドII、IV、
ＶおよびVIの混合物で被覆される、ただしペプチドIIま
たはその類縁体はアミノ酸配列：を有する、請求項６記載のイムノアッセイ法。
【請求項９】段階Ｄは酵素で標識した既知の第二抗体
およびこの酵素と反応して着色生成物を形成する基質を
導入することを含む、請求項６記載のイムノアッセイ
法。
【請求項１０】各テストにおいて、ペプチド組成物は
有効量のII：IV：Ｖ：VIの混合物である、請求項９記載
の方法。
【請求項１１】段階Ｄは酵素で標識した既知の第二抗
体およびこの酵素と反応して着色生成物を形成する基質
を導入することを含む、請求項８記載のイムノアッセイ
法。
【請求項１２】段階Ｄは放射性元素で標識した既知の
第二抗体を導入することを含む、請求項６記載のイムノ
アッセイ法。
【請求項１３】ペプチド−抗体複合体は凝集パターン
として検出可能である、請求項６記載のイムノアッセイ
法。
【請求項１４】ペプチド−抗体複合体は凝集パターン
として検出可能である、請求項８記載のイムノアッセイ
法。
【請求項１５】固体支持体はマルチドット、マルチ−
ライン、またはマルチ−スクエア配列にペプチド組成物
で被覆された帯片である、請求項６記載のイムノアッセ
イ法。
【請求項１６】固体支持体はマルチドット、マルチ−
ライン、またはマルチ−スクエア配列にペプチド組成物
で被覆された帯片である、請求項８記載のイムノアッセ
イ法。
【請求項１７】（ａ）固体支持体；（ｂ）固体支持体に被覆された、請求項１記載のペプチ
ド組成物から成る免疫吸着剤；（ｃ）陰性対照としての正常血清のサンプル；（ｄ）陽性対照としてのＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗
体を含む血清のサンプル；および（ｅ）血清サンプルを希釈するための緩衝剤；から成
る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II抗体を検
出してＡＴＬ、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−II感染症
を診断するためのテストキット。
【請求項１８】（ａ）固体支持体；（ｂ）固体支持体に被覆された、請求項４記載のペプチ
ド組成物から成る免疫吸着剤；（ｃ）陰性対照としての正常血清のサンプル；（ｄ）陽性対照としてのＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗
体を含む血清のサンプル；および（ｅ）血清サンプルを希釈するための緩衝剤；から成
る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−II抗体を検
出してＡＴＬ、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−II感染症
を診断するためのテストキット。
【請求項１９】次の配列：（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）より成る群
から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体
（ＨＴＬＶ−Ｉ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持
されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失される
か、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；または
上記ペプチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは
重合体；および次の配列（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）より成る群
から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体
（ＨＩＶ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持される
という条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あ
るいは配列中のアミノ酸が置換される）；または上記ペ
プチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合
体；から成る、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIおよび
ＨＩＶの抗体に対して特異的免疫反応性を有するペプチ
ド組成物。
【請求項２０】ペプチドIV、Ｖ、VI、XII 、XIV 、XV
およびXVI の混合物から成る、請求項１９記載のペプチ
ド組成物。
【請求項２１】ペプチドIV、Ｖ、VI、XII 、XIV 、XV
およびXVI の混合物とペプチドIIから成る、請求項１９
記載のペプチド組成物。
【請求項２２】 II：IV：VI：XIII：XIV ：XV：XVI は
２：０２：２：１０：１：１．５の重量比である、請求
項２１記載のペプチド組成物。
【請求項２３】（Ａ）固体支持体に、次のアミノ酸配
列：（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）より成る群
から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体
（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−II抗体に対する免疫反応性
が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加ま
たは欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換さ
れる）；またはそのセグメント、混合物、複合体、もし
くは重合体；および次のアミノ酸配列：（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）より成る群
から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体
（ＨＩＶ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持される
という条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あ
るいは配列中のアミノ酸が置換される）；または上記ペ
プチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合
体；を含む有効量のペプチド組成物を抗原として被覆
し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加える（その場
合、テスト検体中のＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬ
Ｖ−IIおよびＨＩＶ抗体がペプチド組成物とペプチド−
抗体複合体を形成する）；ことから成るＨＴＬＶ−Ｉお
よび／またはＨＴＬＶ−IIおよびＨＩＶの抗体を同時に
検出するためのイムノアッセイ法。
【請求項２４】固体支持体はペプチドIVまたはＸ、V
I、XIII、XIV 、XVおよびXVI の混合物とペプチドIIで
被覆される、請求項２３記載のイムノアッセイ法。
【請求項２５】 II：IV／Ｘ：VI：XIII：XIV ：XV：XV
I は２：０２：２：１０：１：１．５の重量比である、
請求項２４記載のイムノアッセイ法。
【請求項２６】（Ａ）固体支持体に、次のアミノ酸配
列：（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ₂である）を有する有
効量のペプチド組成物またはその類縁体を被覆し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加え（その場合、
テスト検体中のＨＴＬＶ−Ｉ抗体がペプチド組成物とペ
プチド−抗体複合体を形成する）；（Ｃ）この混合物をインキュベートし；そして（Ｄ）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する；ことに
よって体液中のＨＴＬＶ−Ｉ抗体の存在とＨＴＬＶ−II
抗体の存在を識別するためのイムノアッセイ法。
【請求項２７】有効量は約０．０１〜２０μｇであ
る、請求項２６記載のイムノアッセイ法。
【請求項２８】次のアミノ酸配列：を有する、体液中のＨＴＬＶ−II抗体を検出してＨＴＬ
Ｖ−II感染症を診断するためのペプチド組成物。
【請求項２９】（Ａ）固体支持体に、有効量の請求項
２８記載のアミノ酸配列を有するペプチド組成物を被覆
し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加え（その場合、
テスト検体中のＨＴＬＶ−II抗体がペプチド組成物とペ
プチド−抗体複合体を形成する）；（Ｃ）この混合物をインキュベートし；そして（Ｄ）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する；ことに
よって体液中のＨＴＬＶ−II抗体の存在とＨＴＬＶ−Ｉ
抗体の存在を識別するためのイムノアッセイ法。
【請求項３０】有効量は約０．０１〜２０μｇであ
る、請求項２９記載のイムノアッセイ法。