CN109071558B - 取代的三环杂环化合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了通式I的取代的三环杂环化合物或其立体异构体、互变异构体、N‑氧化物、水合物、溶剂合物、代谢物、药学上可接受的盐、酯或前药，包含上述结构的药物组合物和它们的用途。取代的三环杂环化合物和包含本文公开的化合物的药物组合物可用于治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症。此外，这种化合物和包含本文公开的化合物的药物组合物还可用于预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年6月15日向国家知识产权局提交的申请号为PCT/CN2016/085811的国际专利申请的优先权和权益，通过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
本发明属于制药技术领域，更具体地涉及化合物、包括其的组合物和二者用于治疗由癌症和神经退行性疾病引起的病症的用途。特别地，本文提供了能够抑制一种以上的激酶，特别是LRRK，更特别是LRRK2的取代的三环杂环化合物。
背景技术
帕金森病(PD)是第二常见的神经退行性疾病，影响1-2％的老年人群[1]。全基因组关联分析(GWAS)在非家族性PD的24个位点具有28种相关的遗传风险变异[2]。其中，发现LRRK2(Park8)中的突变也是以遗传形式，确定了在家族性和非家族性PD中驱动发病机制的共享分子途径，并且包括最常见的疾病原因[3,4]。PD致病性LRRK2突变图主要与激酶(G2019S，I2020T)和ROC-COR结构域(R1441C/G/H，Y1699C)有关，表示这些酶促活性对发病机制至关重要[5]。致病性突变的频率在整体2％左右是罕见的[6,7]，然而在某些种族人群的高达40％的患者中发现了这种最常见突变G2019S，其将该激酶激活2至3倍[8-13]。除了致病性突变外，LRRK2中常见的遗传变异性是散发性PD的危险因素[14-16]。
2004年，LRRK2被确定为负责与PARK8基因座相关的对PD遗传的基因[17,18]，并发现其由51个外显子组成，产生较大的(268kDa)蛋白质。随后，确定了LRRK2一级结构中的许多变体，包括还出现在散发性PD中的与家族性PD分离的显性突变，以及增加散发性PD发展的终生风险的LRRK2基因座处的多态性[20-22]。
LRRK2是其核心包含两种酶促功能的多结构域蛋白。由以称为Roc结构域的C-末端(COR)终止的间隔结构域的复合蛋白(ROC)的Ras组成的GTP酶结构域紧接着属于丝氨酸/苏氨酸激酶的激酶结构域。这种酶促核心被在LRRK2N末端的包含犰狳蛋白、锚蛋白和富含亮氨酸重复(LRR)结构域的蛋白质-蛋白质相互作用结构域所包围[23]。LRRK2C末端含有WD40结构域，这被认为是蛋白质折叠所必需的，从而控制LRRK2功能和激酶活性[24]。有趣的是，迄今为止描述的主要的致病性突变发生在LRRK2的酶促核心内，表明LRRK2活性的修饰极大地影响了PD的发病和进展。
迄今为止，近40种单氨基酸取代突变与常染色体显性PD有关[25,26]。占欧洲家族性PD约6％以及占散发性PD病例3％的LRRK2最常见的突变形式包括Gly2019对Ser残基的氨基酸取代。Gly2019位于保守的DYG-Mg2+-结合基序内，在激酶结构域的子结构域-VII中[25]。最近的报道表明，这种突变增强了LRRK2的自磷酸化，以及其将髓磷脂碱性蛋白磷酸化2-3倍的能力[8,12,27]。当在细胞系和原代神经元培养物中过表达G2019S-LRRK2时，观察到在氧化应激不存在和存在下的细胞毒性，以及包涵体的形成[27,28]。这些结果以及LRRK2激酶活性的遗传灭活显示出对这种毒性表型的保护作用的事实，表明LRRK2激酶活性的改变潜在地参与LRRK2-PD的神经毒性和致病机制。
已经发现衍生自LRRK2G2019S帕金森病患者的诱导多能干细胞(iPSC)表现出神经突增生和对鱼藤酮敏感性增加的缺陷，其可以通过遗传校正G2019S突变或用具有LRRK2激酶活性的小分子抑制剂治疗细胞加以改善[29]。与iPSC中的LRRK2G2019S突变相关的增加的线粒体损伤也由G2019S突变的遗传校正阻断[30]。
另外的证据将LRRK2功能和功能障碍与自噬溶酶体途径关联[31]。LRRK2蛋白质导致伴侣介导的自噬中的缺陷，其对细胞降解α-突触核蛋白的能力产生负面影响[32]。在其它细胞模型中，选择性LRRK2抑制剂已被证明可以刺激巨噬细胞吞噬[33]。这些数据表明，具有LRRK2激酶活性的小分子抑制剂可以有效治疗以由异常自噬/溶酶体降解途径引起的细胞蛋白水解缺陷为特征的疾病，包括与GBA突变相关的帕金森病[34]、其它α-突触核蛋白病、tau蛋白病、阿尔茨海默病[35]和其它神经退行性疾病[36]和戈谢病[37]等形式。此外，与正常受试者的成纤维细胞相比，在C型Niemann-Pick(NPC)病患者的成纤维细胞中也观察到LRRK2mRNA的水平显着升高，这表明异常的LRRK2功能可能在溶酶体疾病中起作用[38]。这一观察结果表明LRRK2抑制剂可能有效治疗NPC。
还报道了与PD相关的G2019S突变体形式的LRRK2增强微管蛋白相关性Tau的磷酸化[39]，并且已经提出了其中LRRK2作用于Tau和α-突触核蛋白的致病作用上游的疾病模型[40]。为了支持这点，转基因小鼠模型中LRRK2表达与增加的不溶性Tau聚集和增加的Tau磷酸化有关[41]。据报道，PD致病性突变体蛋白LRRK2R1441G的过度表达导致转基因小鼠模型中帕金森病的症状和Tau过度磷酸化[42]。因此，这些数据表明，具有激酶催化活性的LRRK2抑制剂可用于治疗特征为Tau过度磷酸化的tau蛋白病，例如嗜银颗粒痴呆、皮克病、皮质基底核退化症、进行性核上性麻痹以及与染色体17相关的遗传性额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)[43]。此外，LRRK2抑制剂可以具有治疗特征为多巴胺水平降低的其它疾病的效用，例如与药物成瘾相关的脱瘾症状/复发[44]。
发明内容
在一方面，本文提供的是通式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂合物、代谢物、药学上可接受的盐、酯或前药：
其中：
V是CH或N；
W是N或O；
R1是不存在的、H、C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10杂环烷基、C6-14芳基、C1-10杂芳基、C1-5烷基-C1-10杂芳基、或C1-5烷基-C6-14芳基，其中所述的C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10杂环烷基、C6-14芳基、C1-10杂芳基、C1-5烷基-C1-10杂芳基和C1-5烷基-C6-14芳基各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7环烷基和C2-7杂环烷基中的一个以上的取代基取代；
X1是键、CO或-(CH2)n-；
Y是-(CH2)n-、-(CR2R3)-、C6-14芳基或C1-10杂芳基，任选地R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成C3-C10碳环或3至10元杂环，其中所述-(CH2)n-、-(CR2R3)-、C6-14芳基、C1-10杂芳基、C3-C10碳环和3至10元杂环各自独立地且任选地被选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、和C1-6卤代烷基中的一个以上的取代基取代；
Z是键、NR2、-(CH2)n-或-(CR2R3)-，其中所述NR2、-(CH2)n-和-(CR2R3)-各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、和C1-6卤代烷基中的一个以上的取代基取代；
n是0、1、2、3、4或5；
R2和R3独立地选自-H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、C6-14芳基或C1-10杂芳基，其中所述C1-6烷基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、C6-14芳基和C1-10杂芳基各自任选地且独立地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、和-CO2H中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，R1是H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C3-8杂芳基、C1-3烷基-C1-7杂芳基、或C1-3烷基-C6-10芳基，其中所述C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C3-8杂芳基、C1-3烷基-C1-7杂芳基、和C1-3烷基-C6-10芳基各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7环烷基、和C3-7杂环烷基中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，X1是CO、-CH2-、-(CH2)2-、或-(CH2)3-。
在一些实施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-、C6-10芳基或C3-8杂芳基，任选地R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成C3-C8碳环或3至8元杂环，其中所述-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-、C6-10芳基、C3-8杂芳基、C3-C8碳环和3至8元杂环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、和C1-6卤代烷基中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-，
其中Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地是C或N，并且Q1、Q2、Q3和Q4各自任选地被选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基和C1-6卤代烷基中的一种以上的取代基取代，
其中Q5、Q6和Q7各自独立地是C、N、O或S，并且Q5、Q6和Q7各自任选地被选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基或C1-6卤代烷基中的一种以上的取代基取代。
在一些实施方式中，Z是键、NR2、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-或-(CR2R3)-，其中所述NR2、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-和-(CR2R3)-各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、和C1-6卤代烷基中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，R2和R3独立地选自-H、C1-3-烷基、C3-5环烷基、C3-5杂环烷基、C6-8芳基或C3-8杂芳基，其中所述C1-3烷基、C3-5环烷基、C3-5杂环烷基、C6-8芳基和C3-8杂芳基各自任选地且独立地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、和-CO2H中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，R1选自以下基团：
在一些实施方式中，R1优选地选自以下基团：
在一些实施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-、苯环、5至6元杂芳环、C6-10芳基或C3-8杂芳基，任选地R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成C3-C6碳环或3至6元杂环，其中所述苯环、5至6元杂芳环、C6-10芳基、C3-8杂芳基、C3-C6碳环和3至6元杂环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、甲基、乙基、正丙基、异丙基、-CF3、和C1-3卤代烷基中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，Y选自以下基团：
在一些实施方式中，Y优选地选自以下基团：
在一些实施方式中，本文提供了具有以下结构之一的化合物，或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂合物、代谢物、药学上可接受的盐、酯或前药：
在一些实施方式中，本文提供了优选地具有以下结构之一的化合物，或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂合物、代谢物、药学上可接受的盐、酯或前药：
在另一方面，本文提供了包含本文公开的化合物的药物组合物。
在一些实施方式中，本文公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂、辅料或其组合。
在一些实施方式中，本文公开的药物组合物还包含第二治疗剂。
在另一方面，本文提供了本文公开的化合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症。
在一些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本文提供了治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文公开的化合物或药物组合物。
在一些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本文提供了用于在治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症中使用的的本文公开的化合物或药物组合物。
在一些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本文提供了本文公开的化合物或药物组合物在制备药物中的用途，该药物用于预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文公开的化合物或药物组合物。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了用于在预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症中使用的的本文公开的化合物或药物组合物。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了本文公开的化合物或药物组合物在试验中的用途，该试验用于鉴定能够抑制激酶的其它候选化合物。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了通式II的化合物，或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂合物、代谢物、药学上可接受的盐、酯或前药：
其中V为CH或N；
W是N或O；
R1是不存在的、H、C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10杂环烷基、C6-14芳基、C1-10杂芳基、C1-5烷基-C1-10-杂芳基、或C1-5-烷基-C6-14-芳基，其中所述C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10杂环烷基、C6-14芳基、C1-10杂芳基、C1-5烷基-C1-10-杂芳基和C1-5-烷基-C6-14-芳基各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、酰胺类、磺胺类和砜类中的一个以上的取代基取代；
X1是键、CO、或-(CH2)n-；
Y是-(CH2)n-；
Z是键、N、或-(CH2)n-；
R4各自独立地是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、或C1-6卤代烷基，任选地两个R4与它们所连接的Y一起形成C3-C10碳环或3至10元杂环，其中所述C3-C10碳环和3至10元杂环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、和C1-6卤代烷基中的一种以上的取代基取代；
R5是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C1-6卤代烷基，任选地R4和R5与它们所连接的Y-Z一起形成苯环、C3-C10碳环、3至10元杂环或5至10元杂芳环，其中所述苯环、C3-C10碳环、3至10元杂环和5至10元杂芳环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、和C1-6卤代烷基中的一种以上的取代基取代；
k是0、1、2、3或4；
n是0、1、2、3、4或5；
在一些实施方式中，R1是H、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C1-8杂芳基、C1-3烷基-C1-8-杂芳基、或C1-3-烷基-C6-10-芳基，其中所述C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C1-8杂芳基、C1-3烷基-C1-8-杂芳基、和C1-3-烷基-C6-10-芳基各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7环烷基、和C3-7杂环烷基中的一种以上的取代基取代。
在一些实施方式中，X1是CO、-CH2-、-(CH2)2-、或-(CH2)3-。
在一些实施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、或-(CH2)3-。
在一些实施方式中，Z是键、N、-CH2-、-(CH2)2-、或-(CH2)3-。
在一些实施方式中，R4各自独立地是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-3烷基、或C1-3卤代烷基，任选地两个连接至Y的R4与Y一起形成C3-C7碳环或3至7元杂环，其中所述C3-C7碳环和3至7元杂环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、和C1-6卤代烷基中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，R5是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-3烷基、或C1-6卤代烷基，任选地R4和R5与它们所连接的Y-Z一起形成苯环、C3-C7碳环、3至7元杂环或5至7元杂芳环，其中所述苯环、C3-C7碳环、3至7元杂环和5至7元杂芳环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C1-6卤代烷基中的一个以上的取代基取代。
在一些实施方式中，R1选自以下基团：
在一些实施方式中，R5是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-3烷基、或C1-3卤代烷基，任选地R4和R5与它们所连接的Y-Z一起形成苯环或吡唑环，其中所述苯环和吡唑环各自独立地且任选地被选自F、Cl、Br、-CN、-OH、-CO2H、和-CF3中的一个以上的取代基取代。
在另一方面，本文提供了包含本文公开的通式II化合物的药物组合物。
在一些实施方式中，本文公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂、辅料或其组合。
在一些实施方式中，本文公开的药物组合物还包含第二治疗剂。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症。
在一些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本文提供了治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的疾病的方法，包括向受试者给予治疗有效量的通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物。
在一些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物，其用于在治疗由癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症中使用。
在一些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物在制备药物中的用途，该药物用于预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物，其用于在预防或治疗由任何异常激酶活性引起的、与之相关或伴随的病症中使用。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文公开的通式II化合物的药物组合物在试验中的用途，该试验用于鉴定能够抑制激酶的另外候选化合物。
在一些实施方式中，激酶是LRRK。
在一些实施方式中，激酶是LRRK2。
具体实施方式
定义和常规术语
本发明中引用的所有参考文献通过引用将其整体并入本文，并且在引入的参考文献和本发明之间存在不一致的情况下，将以本公开为准。此外，本文使用的所有术语和短语具有本领域技术人员已知的一般含义。即使如此，仍然需要对本发明的术语和短语进行更详细的说明。在提及的术语和短语与熟知的意义之间存在不一致的情况下，以本公开为准。不管所讨论的术语是单独地还是以组合出现，本说明书中使用的常规术语的以下定义均适用。
如在本文中使用的语法冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”旨在包括“至少一个”或“一个以上”，除非在本中另有说明或与上下文明显矛盾。因此，本文所使用的冠词是指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。作为示例，“组分”是指一个以上的组分，并且因此可能考虑多于一个的组分，并且可以在所描述的实施方式的实现中采用或使用。
如在本文中所述的，本文公开的化合物可以任选地被一个以上的取代基取代，如通常在以下举例说明的，或由本发明的特定类别、亚类和种类举例说明的。
术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
术语“烷基”是指1至10个碳原子的饱和直链或支链单价烃基。除非另有说明，烷基基团含有1-10个碳原子。在一些实施方式中，烷基基团含有1-8个碳原子；在其它实施方式中，烷基基团含有1-6个碳原子；在又一其它实施方式中，烷基基团含有1-4个碳原子；在再一其它实施方式中，烷基基团含有1-3个碳原子。烷基基团任选地被一个以上的本文所描述的取代基取代。
烷基基团的一些非限制性实例包括甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))等。
术语“环烷基”是指具有3至10个碳原子的单价或多价饱和环，如单环、双环或三环系统。并且其中双环或三环系统可以包括稠环、桥环和螺环。在一些实施方式中，环烷基基团含有3至8个碳原子。在其它实施方式中，环烷基基团含有3至6个碳原子。环烷基(cycloalkyl radical)任选被一个以上的本文所描述的取代基取代。
术语“芳基”是指具有总共6至12个环成员，优选6至10个环成员，且更优选6个环成员的单价或多价单环、双环或三环碳环系统，并且其中该系统中的至少一个环是芳香族的。芳基基团通常但不一定通过芳基基团的芳香族环与母体分子结合。术语“芳基”和“芳香环”在本文中可以互换使用。芳基基团的实例可以包括苯基、萘基、蒽等。芳基(aryl radical)任选被一个以上的本文所描述的取代基取代。
术语“杂芳基”是指具有总共5至10个环成员的单价或多价单环、双环或三环系统，并且其中系统中的至少一个环是芳香族的，并且至少一个环含有一个以上的杂原子。杂芳基基团通常但不一定通过杂芳基基团的芳香环与母体分子结合。术语“杂芳基”和“杂芳香环”或“杂芳香化合物”在本文中可以互换使用。杂芳基基团任选被一个以上的本文公开的取代基取代。在一些实施方式中，5至10元杂芳基基团含有1、2、3或4个独立地选自O、S和N的杂原子；在一些其它实施方式中，5至6元杂芳基是单环系统并且含有1、2、3或4个独立地选自O、S和N的杂原子。
杂芳基环的一些非限制性实例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、四唑基等及其苯并衍生物，如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基等；或吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基等及其苯并衍生物，如喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基等。
“杂环烷基”是指含有一个以上的选自氮、氧和硫的杂原子的环状脂肪族基团，在环中其任选地被一个以上的-(CO)-基团中断和/或在环中任选地含有一个以上的双键。可替换地，杂环烷基基团是C4-7-杂环烷基、更优选C4-6-杂环烷基。优选的杂环烷基基团包括但不限于哌嗪基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基和四氢吡喃基。
本发明化合物的描述
治疗应用
本发明的另一方面涉及上述化合物用于在医药中使用。
本发明的另一方面涉及上述化合物用于在治疗癌症或神经退行性疾病中使用。
另一方面涉及如上述化合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗或预防神经退行性疾病。优选地，神经退行性疾病是帕金森病。
另一方面涉及上述化合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗或预防增殖性疾病，例如癌症。
优选地，以足以抑制一种以上的激酶、优选LRRK、甚至更优选LRRK2的量给予该化合物。
又一其它方面涉及本发明化合物在制备药物中的用途，该药物用于预防或治疗由针对于生物靶标的任何异常活性引起的、与之相关或伴随的病症，其中该靶标是激酶，更优选LRRK，甚至更优选LRRK2。
优选地，该病症是帕金森病。
本发明的另一方面涉及治疗蛋白激酶相关疾病或病症的方法。根据本发明该方面的方法是通过将治疗有效量的如上所述的本发明化合物本身，或更优选作为与例如如下文详述的药学上可接受的载体混合的部分药物组合物给予至需要其的受试者而实现的。
本发明的又另一方面涉及治疗患有通过抑制蛋白激酶而减轻的疾病状态的哺乳动物的方法，其中该方法包括向哺乳动物给予治疗有效量的本发明化合物。
优选地，疾病状态是通过抑制蛋白激酶LRRK，更优选LRRK2来减轻的。
优选地，哺乳动物是人类。
术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或由他们从已知的方式、手段、技术和程序易于开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所使用的术语“给药”是指将本发明化合物与蛋白激酶组合在一起的方法，以这种方式使得化合物可以影响蛋白激酶的酶活性，通过直接地，即通过与蛋白激酶本身相互作用或者间接地，即通过与在其上蛋白激酶的催化活性是依赖性的其它分子相互作用。如本文所使用的，可以在体外(即在试管中)，或体内(即在活体的细胞或组织中)完成给药。
在本文中，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病或病症的进展，基本上改善疾病或病症的临床症状或基本上预防疾病或病症的临床症状出现。
在本文中，术语“预防”是指起初阻止生物体获得病症或疾病的方法。
术语“治疗有效量”是指所给予量的化合物将在一定程度上缓解被治疗的疾病或病症的一种以上的症状。
对于本发明中使用的任何化合物，治疗有效量(本文中也称为治疗有效剂量)可以最初地由细胞培养测定来进行估计。例如，可以配制剂量以在动物模型中实现包括细胞培养中测定的IC50或IC100的循环浓度范围。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。也可以从体内数据估计初始剂量。使用这些初步指导，本领域普通技术人员可以确定人类的有效剂量。
此外，可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定本文所述化合物的毒性和治疗功效，例如通过测定LD50和ED50。毒性和治疗有效之间的剂量比是治疗指标，并且可以表示为LD50和ED50之间的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。由这些细胞培养物测定和动物研究所获得的数据可用于配制在人体中使用而无毒性的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括具有很少或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和采用的给药途径。鉴于患者状况，个体医师可以选择确切的制剂、给药途径和剂量。(参见，例如，Fingl等人，1975，In：The Pharmacological Basisof Therapeutics，第1章，第1页)。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的活性化合物的血浆水平。用于口服给药的常规患者剂量的范围为约1-2000mg/kg/天，通常为约2-1000mg/kg/天，优选为约5-700mg/kg/天且最优选为约10-500mg/kg/天。优选地，通过每天给予多个剂量来实现治疗有效的血清水平。在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过多的实验。
如本文所使用的，“激酶相关的疾病或病症”是指以本文定义的不适当激酶活性或激酶的过度活性为特征的疾病或病症。不适当活性是指(i)通常不表达所述激酶的细胞中的激酶表达；(ii)增加的激酶表达，导致不希望的细胞增殖、分化和/或生长；或(iii)降低的激酶表达，导致细胞增殖、分化和/或生长不期望的减少。激酶的过度活性是指编码特定激酶的基因的扩增或一定激酶活性水平的产生，其可以与细胞增殖、分化和/或生长紊乱相关(即，随着激酶水平增加，一个以上的细胞紊乱的症状的严重程度增加)。过度活性也可以是由于突变而导致的与配体无关或组成型激活的结果，该突变如负责配体结合的激酶的片段缺失。
本文所述的化合物可用于预防的优选疾病或病症包括癌症和神经退行性疾病，如帕金森病。
因此，本发明还提供了本文定义的化合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗期望以抑制LRRK2的疾病。这些疾病包括帕金森病。
药物组合物
对于根据本发明的用途，本文所述的化合物或其生理上可接受的盐、酯或其它生理功能衍生物可以作为药物制剂呈现，该药物制剂包含化合物或其生理上可接受的盐、酯或其它生理功能衍生物，以及一种以上的药学上可接受的载体，以及任选的其它治疗和/或预防成分。载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是可接受的并且对其接受者无害。药物组合物可用于人和兽医中的人或动物用途。
用于本文描述的各种不同形式的药物组合物的合适辅料的实例可以在“Handbookof Pharmaceutical Excipients，第2版，(1994)，由A Wade和PJ Weller编辑”中找到。
用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是熟知的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑1985)中进行了描述。
合适载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
药物载体、辅料或稀释剂的选择可以根据预期给药途径和标准药学实践来进行选择。药物组合物可以包含或额外包含作为载体、辅料或稀释剂的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、缓冲剂、调味剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等，以及为了使得制剂与意图的接受者的血液等渗所包含的物质。
合适粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖、无水乳糖、游离乳糖、β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成胶(如阿拉伯胶、黄芪胶)或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
合适润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
药物制剂包括适合于口服、局部(包括皮肤、口腔和舌下)、直肠或肠胃外(包括皮下、皮内、肌内和静脉内)、鼻内和肺部给药(例如，通过吸入)的那些。制剂可以在适当的情况下以离散剂量单位方便地呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。所有方法包括让活性化合物与液体载体或细碎固体载体或两者联合的步骤，然后如果需要的话，将产物成形为所需制剂。
其中载体是固体的适用于口服给药的药物制剂最优选地以单位剂量制剂形式，如各自含有预定量的活性化合物的丸剂、胶囊或片剂。可以通过压制或模制，任选地与一种以上的辅助成分一起制备片剂。可以通过在合适的机器中压制处于自由流动形式(诸如粉末或颗粒)的活性化合物，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑物质、表面活性剂或分散剂混合来制备压制片剂。可以通过模制活性化合物和惰性液体稀释剂来制备模制的片剂。可以任选地将片剂包衣，如果不进行包衣的话，可以任选地打印符号。可以通过将活性化合物单独地或与一种以上的辅助成分混合填充到胶囊壳中，然后以常规方式进行密封来制备胶囊。扁囊剂类似于胶囊，其中将活性化合物与任何辅助成分一起密封在米纸膜中。也可以将活性化合物配制成可分散的颗粒，例如可以在给药前将其悬浮于水中，或洒在食物上。可以将颗粒包装在例如小袋中。其中载体是液体的适合于口服给药的制剂，可以作为以水性或非水性液体方式的溶液或悬浮液，或作为水包油液体乳剂呈现。
用于口服给药的制剂包括控释剂型，例如片剂，其中将活性化合物配制于合适的控释基质中，或将其包衣有合适的释控膜。这类制剂可以特别方便地用于预防性使用。
适用于直肠给药的药物制剂(其中载体是固体)最优选地以单位剂量栓剂形式呈现。合适的载体包括可可脂和本领域通常使用的其它材料。可以通过将活性化合物与软化或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和成型来方便地形成栓剂。适用于肠胃外给药的药物制剂包括在水性或油性溶剂中的活性化合物的无菌溶液或悬浮液。
可注射的制剂可适用于弹丸注射(bolus injection)或连续注射。这种制剂方便地存在于单位剂量或多剂量容器中，在引入制剂后将容器密封直到使用需要。可替换地，活性化合物可以是粉末形式，在使用前由合适的溶剂，如无菌的无热原水形成。
也可以将活性化合物配制成长效持久制剂，其可以通过肌内注射或通过植入，例如皮下或肌肉内给药。持久制剂可以包括例如合适的聚合物或疏水性材料或离子交换树脂。这种长效制剂对于预防性使用特别方便。
呈现了适合于通过口腔进行肺部给药的制剂，使得将含有活性化合物并期望具有0.5至7微米范围内的直径的颗粒在接受者的支气管树中递送。
作为一种可能性，这种制剂是以细粉碎粉末的形式，其可以方便地存在于适合于例如明胶的可刺穿的胶囊中，用于吸入装置，或者可替换地作为包含活性化合物、合适的液体或气体推进剂和任选的其它成分如表面活性剂和/或固体稀释剂的自推进制剂。合适的液体推进剂包括丙烷和氯氟烃，且合适的气体推进剂包括二氧化碳。还可以采用其中活性化合物以溶液或悬浮液的液滴的形式进行分配的自推进制剂。
这类自推进制剂类似于本领域已知的那些自推进制剂，并且可以通过已建立的方法制备。适当地，它们呈现在容器中，该容器提供有具有所需喷雾特性的手动操作或自动功能的阀；有利地，在每次操作该阀时，其具有递送固定体积，例如25至100微升的计量式。
作为另外的可能性，活性化合物可以是用于在雾化器或喷雾器中使用的溶液或悬浮液的形式，由此采用加速气流或超声波搅拌以产生用于吸入的细小液滴雾。
适用于鼻内给药的制剂包括通常类似于上述用于肺部给药的制剂。当将制剂分配时，这类制剂应期望地具有在10至200微米范围内的粒径以使得能够保持在鼻腔中；这可以通过适当地使用合适粒度的粉末或选择适当的阀而实现。其它合适的制剂包括粒径在20-500微米范围内的粗粉末，用于通过从靠近鼻子的容器通过鼻通道而快速吸入来给药，以及包含0.2至5％w/v的水性或油性溶液或悬浮液中的活性化合物的滴鼻液。
药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于0.1M且优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的饱和食盐水。另外，这些药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括饱和食盐水和缓冲介质。肠胃外溶剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液(lactated Ringer's)或固定油。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
可以提供适合于局部制剂的制剂，例如凝胶、乳膏剂或软膏剂。这类制剂可以例如应用于伤口或溃疡，将其直接地涂在伤口或溃疡表面，或使其携带在可应用于待被治疗区域上方的合适支撑物，如绷带、纱布、网丝等上。
还可以提供液体或粉末制剂，可以将其直接喷洒或喷撒到待治疗部位，例如，伤口或溃疡上。可替换地，可以将如绷带、纱布、网丝等的载体喷洒或喷撒有制剂，然后应用于待被治疗的部位。
根据本发明的另一方面，提供了用于制备如上所述的药物或兽医组合物的方法，该方法包括使活性化合物与载体联合，例如通过混合。
通常，通过将活性剂与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀且紧密地联合，然后如果需要的话，将产品成型来制备制剂。本发明涉及用于制备药物组合物的方法，包括使式(I)的化合物与药学上或兽医学上可接受的载体或溶剂结合或联合。
盐/酯
本发明的化合物可以呈现为盐或酯，特别是药学上和兽医学上可接受的盐或酯。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括其合适的酸加成盐或碱盐。关于合适的药物盐的综述可以在Berge等人，J Pharm Sci，66,199(1977)中找到。例如用强无机酸，如矿物酸，例如氢卤酸(如盐酸、氢溴酸和氢碘酸)、硫酸、磷酸硫酸盐、硫酸氢盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐和磺酸；用强有机羧酸，如未取代或取代的(例如，通过卤素)1至4个碳原子的链烷羧酸，如乙酸；用饱和或不饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；用羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；用氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；用苯甲酸；或用有机磺酸，如未取代或取代的(例如，通过卤素)(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲烷-或对甲苯磺酸，来形成盐。不是药学上或兽医学上可接受的盐可能仍然是有价值的中间体。
优选的盐包括，例如乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、二葡糖酸盐、环戊酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、草酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、烟酸盐、棕榈酸酯、果胶酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、pivolate、樟脑酸盐、十一酸盐和琥珀酸盐，有机磺酸如甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、对氯苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；和无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硫酸氢、半硫酸、硫氰酸、过硫酸、磷酸和磺酸。
根据被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，如未取代或取代的(例如，通过卤素)1至12个碳原子的链烷羧酸，如乙酸；用饱和或不饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；用羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；用氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；用苯甲酸；或用有机磺酸，如未取代或取代的(例如，通过卤素)(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲烷-或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括可以是未取代或取代的(例如，通过卤素)1-12个碳原子的烷醇。
对映异构体/互变异构体
在先前讨论的本发明的所有方面中，在适当的情况下，本发明包括本发明化合物的所有对映异构体、非对映异构体和互变异构体。本领域技术人员应识别具有光学性质(一个以上的手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可以通过本领域已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
对映异构体以其手性中心的绝对构型为特征，并由Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-排序规则进行描述。这些惯例在本领域中是熟知的(例如，参见“Advanced OrganicChemistry”，第3版，March，J.，John Wiley和Sons，New York，1985)。
含有手性中心的本发明化合物可以用作为外消旋混合物、富含对映异构体的混合物，或者可以使用熟知的技术分离外消旋混合物，并且可以单独地使用单个对映异构体。
立体异构体和几何异构体
一些本发明的化合物可以作为立体异构体和/或几何异构体存在-例如，它们可以具有一个以上的不对称和/或几何中心，因此可以以两种以上的立体异构和/或几何形式存在。本发明考虑了使用所有的这些抑制剂的单个立体异构体和几何异构体及其混合物。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保持适当的功能活性(尽管不一定以相同程度)。
本发明还包括药剂或其药学上可接受的盐的所有合适的同位素变体。将本发明的药剂或其药学上可接受的盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子数但原子质量与通常在自然界中发现的原子的原子质量不同的原子取代的一种。可以并入该药剂及其药学上可接受的盐的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如分别地2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。药剂和药学上可接受的盐的某些同位素变体，例如其中并入如3H或14C的放射性同位素的那些同位素变体，可用于药物和/或底物组织分布研究。氚标记的，即3H，和碳-14，即14C同位素，由于其易于制备和可检测性是特别优选的。此外，用同位素如氘(即2H)取代可以提供由更大的代谢稳定性，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求产生的某些治疗优势，因此在某些情况下可能是优选的。例如，本发明包括其中任一氢原子被氘原子代替的通式(I)的化合物。通常可以使用合适试剂的适当同位素变体由常规方法制备本发明的药剂和本发明的其药学上可接受的盐的同位素变体。
前药
本发明还包括以前药形式的本发明化合物，即在体内释放根据通式(I)的活性母体药物的共价键合的化合物。这样的前药通常是其中一个以上的适当基团已被修饰，使得在给药至人或哺乳动物受试者后该修饰可能被逆转的本发明化合物。通常通过这类受试者中天然存在的酶来进行该逆转，尽管可能将第二药剂与这种前药一起给药以便在体内进行反转。这类修饰的实例包括酯(例如，上述的任何一种)，其中可以由酯酶等进行这种逆转。其它的这类系统对于本领域技术人员来说是熟知的。
溶剂化物
本发明还包括本发明化合物的溶剂化物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。
多晶型
本发明还涉及以本发明化合物的各种结晶形式、多晶形式和水合形式的本发明化合物。在制药工业中已经确定了，可以通过稍微改变在这类化合物的合成制备中使用的溶剂的纯化和/或分离的方法而以任何这些形式分离化学化合物。
给药
本发明的药物组合物可适用于直肠、鼻内、支气管内、局部(包括口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内和皮内)、腹膜内或鞘内给药。优选地，制剂是口服给药的制剂。制剂可以方便地以单位剂型，即以包含单位剂量或者单位剂量的多个单位或子单位的离散部分的形式呈现。作为实例，制剂可以是以片剂和缓释胶囊的形式，并且可以通过药学领域熟知的任何方法进行制备。
本发明的用于口服给药的制剂可以呈现为：离散单位，如各自含有预定量的活性剂的胶囊、凝胶剂、滴剂、扁囊剂、丸剂或片剂；作为粉末或颗粒；作为水性液体或非水性液体中的活性剂的溶液、乳液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂；或作为弹丸注射等。优选地，每剂量的这些组合物含有1至250mg且更优选10-100mg的活性成分。
对于用于口服给药的组合物(例如，片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括溶剂，如常用辅料，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填料和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其它金属硬脂酸酯、甘油硬脂酸、硬脂酸、硅酮流体、滑石蜡、油和胶体二氧化硅。调味剂如薄荷、冬青油、樱桃香料等也可以使用。可能需要添加着色剂以使剂型容易被识别。片剂也可以通过本领域熟知的方法进行包衣。
可以通过压制或模制，任选地与一种以上的辅助成分一起制成片剂。可以通过在合适的机器中压制处于自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性剂，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑物质、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合来制备压制片剂。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备模制片剂。可以将片剂任选地包衣或刻痕，并且可以进行配制从而提供活性剂的缓慢的或受控的释放。
适用于口服给药的其它制剂包括包含调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的活性剂的锭剂；包含惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶中的活性剂的软锭剂；和包含合适液体载体中的活性剂的漱口水。
其它给药形式包括可以进行静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌肉内注射并由无菌或可灭菌溶液制备的溶液或乳剂。可注射形式通常每剂含有10-1000mg，优选10-250mg之间的活性成分。
本发明的药物组合物还可以是以肛门塞药、阴道栓剂、悬浮液、乳剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液或撒布剂的形式。
透皮给药的另一种方法是使用皮肤贴剂。例如，可以将活性成分掺入由聚乙二醇或液体石蜡的水性乳液组成的乳膏剂中。活性成分还可以以1至10重量％的浓度掺入由白蜡或白色软石蜡以及可能需要的稳定剂和防腐剂组成的软膏剂中。
剂量
本领域普通技术人员可以容易地确定本发明组合物之一的给予至受试者的合适剂量，而无需过多的实验。通常，医师将确定最适合个体患者的实际剂量，并且该剂量将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、常规健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速率、药物组合、特定病情的严重程度以及接受治疗的个体。本文公开的剂量是平均病况的示例。当然，可以有个别情况，这种情况中的更高或更低剂量范围是有价值的，并且这种剂量范围在本发明的范围内。
根据本发明，可以给予有效量的通式(I)化合物以抑制与特定病情或疾病有关的激酶。当然，根据化合物的给药类型，将进一步改变剂量。例如，优选将通式(I)的化合物肠胃外给药，以达到急性治疗的“有效量”。尽管肌内弹丸注射也是有用的，但是静脉输注5％葡萄糖水溶液或生理饱和食盐水中的化合物或具有合适辅料的类似制剂是最有效的。通常，肠胃外剂量为约0.01至约100mg/kg；优选在0.1至20mg/kg之间，以这种方式维持血浆中药物浓度在有效抑制激酶的浓度。可以以一水平每天给予化合物一至四次，达到约0.4至约400mg/kg/天的总日剂量。本领域普通技术人员通过将药剂的血液水平与具有治疗效果的所需浓度相比，容易确定治疗有效的本发明化合物的精确量，以及将该化合物最佳给药的途径。
也可以向患者口服给予本发明化合物，以药物浓度能够足以实现治疗一种以上的本文公开的治疗适应症的方式。通常，以与患者病情一致的方式，以约0.1至约50mg/kg之间的口服剂量给予含有该化合物的药物组合物。口服剂量优选为约0.5至约20mg/kg。
当根据本发明给予本发明化合物时，预期不会产生不可接受的毒理作用。可以以多种生物测定法之一测试可以具有良好生物利用度的本发明化合物，以确定具有给定药理作用所需的化合物的浓度。
组合
在一个特别优选的实施方式中，将一种以上的本发明化合物与一种以上的其它活性剂(例如，市场上可获得的现有药物)组合给药。在这种情况下，可以将本发化合物与一种以上的其它活性剂连续、同时或序贯给药。
通常，药物在组合使用时更有效。特别地，组合治疗是期望的，以便避免主要毒性、作用机制和抗药性机制的重叠。此外，还期望以最大耐受剂量和这种剂量之间的最小时间间隔给予大多数药物。组合化疗药物的主要优点是其可以通过生物化学相互作用促进附加的或可能的协同作用，并且还可能减少出现抗药性。
可以通过研究测试化合物与已知或猜测为在治疗特定病症中有价值的药剂的抑制活性来提出有益的组合。该方法也可用于确定这种药剂的给药顺序，即在递送化合物之前、与之同时或之后。这种给药方式可以是本文所鉴定的所有活性剂的特征。
试验
本发明的另一方面涉及如上所述的化合物在试验中的用途，这种试验用于鉴定能够抑制一种以上的激酶、更优选LRRK、甚至更优选LRRK2的其它候选化合物。
优选地，该试验是竞争性结合试验。
更优选地，竞争性结合试验包括让本发明化合物与激酶、优选LRRK、更优选LRRK2和候选化合物接触，并检测根据本发明的化合物与激酶之间的相互作用的任何变化。
优选地，通过本发明化合物的常规SAR修饰产生候选化合物。
如本文所使用的，术语“常规SAR修饰”是指通过化学衍生化来改变给定化合物的本领域已知的标准方法。
因此，在一个方面，所鉴定的化合物可以作为模型(例如，模板)，用于开发其它化合物。在这种测试中使用的化合物可以游离于溶液中、固定在固体载体上、承载在细胞表面或位于细胞内。可以测量化合物和待测试药剂之间的活性消除或结合复合物的形成。
本发明的试验可以是筛选，因而测试了大量药剂。在一方面，本发明的测定方法是高通量筛选。
本发明还考虑了使用竞争性药物筛选试验，其中能够结合化合物的中和抗体与用于结合化合物的测试化合物特异性竞争。
提供了用于筛选的另一技术，用于对物质具有合适结合亲和力的试剂进行高通量筛选(HTS)，并且该技术基于WO 84/03564中详细描述的方法。
预期本发明的测定方法，将适合于对测试化合物进行小规模筛选和大规模筛选以及适合于定量试验。
优选地，竞争性结合试验包括在激酶的已知底物存在下，让本发明化合物与所述激酶接触，并检测所述激酶和所述已知底物之间相互作用的任何变化。
本发明的另一方面提供了检测配体与激酶结合的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在激酶的已知底物存在下，让配体与所述激酶接触；
(ii)检测所述激酶和所述已知底物之间的相互作用的任何变化；
并且其中所述配体是本发明化合物。
本发明的一个方面涉及一种方法，包括以下步骤：
(a)进行上述测定方法；
(b)鉴定能够与配体结合结构域结合的一种以上的配体；和
(c)制备一定量的所述一种以上的配体。
本发明的另一方面提供了一种方法，包括以下步骤：
(a)进行上述测定方法；
(b)鉴定能够与配体结合结构域结合的一种以上的配体；和
(c)制备包含所述一种以上的配体的药物组合物。
本发明的另一方面提供了一种方法，包括以下步骤：
(a)进行上述测定方法；
(b)鉴定能够与配体结合结构域结合的一种以上的配体；
(c)修饰能够与配体结合结构域结合的所述一种以上的配体；
(d)进行这种上述测定方法；
(e)任选地制备包含所述一种以上的配体的药物组合物。
本发明还涉及通过上述方法鉴定的配体。
本发明的另一方面涉及包含通过上述方法鉴定的配体的药物组合物。
本发明的另一方面涉及通过上述方法鉴定的配体在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于治疗一种以上的病症。
上述方法可用于筛选可用作一种以上的激酶的抑制剂的配体。
通式(I)的化合物既可有用地作为实验室工具又可有用地作为治疗剂。在实验室中，本发明的某些化合物可用于建立通常被称为“靶标验证”的方法，在疾病状态的确定或进展期间，已知或新发现的激酶是否导致关键性的或至少重要的生物化学功能产生。
常规的合成方法
通过以下实施例描述本发明。但是应当理解，本发明不限于这些实施方式，这些实施例仅用于提出实施本发明的方法。
在整个说明书中使用以下缩写：
AcOH 乙酸
AlCl3 氯化铝
BH3 硼烷
Bn 苄基
BuOH 正丁醇
CuI 碘化亚铜
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DIEA,DIPEA N,N-二异丙基乙胺
EA 乙酸乙酯
EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
EtOH 乙醇
EtOAc 乙酸乙酯
Et3N 三乙胺
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBT 羟基苯并三唑
I2 碘
IPA 异丙醇
KOAc 醋酸钾
KOH 氢氧化钾
K3PO4 磷酸钾
LiAlH4 氢化铝锂
LiCl 氯化锂
LCMS 高效液相色谱-质谱联用
MeOH 甲醇
MeCN 乙腈
MeI 碘甲烷
MsCl 甲磺酰氯
Na2CO3 碳酸钠
NaHCO3 碳酸氢钠
Na2S2O3 硫代硫酸钠
NaOH 氢氧化钠
NaBH4 硼氢化钠
(n-Bu)4NI 四丁基碘化铵
n-BuLi 正丁基锂
NH3 氨
NH4Cl 氯化铵
NIS N-碘代琥珀酰亚胺
NMR 核磁共振
prep-HPLC 制备高效液相色谱
prep-TLC 制备薄层色谱
PMB 对甲氧基苄基
PMBCl 对甲氧基苄基氯
PPh3 三苯基膦
Pd(dppf)Cl2 1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)钯(0)
Pd(OAc)2 乙酸钯(II)
PE 石油醚
rt 室温
Sphos 2-二环己基膦基-2',6'-二甲氧基联苯
t-BuOK 叔丁醇钾
t-BuONa 叔丁醇钠
TEA 三乙胺
TLC 薄层色谱法
THF 四氢呋喃
TFA 三氟乙酸
Trt 三苯甲基
UV 紫外线
方案1：
步骤1步骤1描述了将式A转化为式B，其中X是卤素，优选溴或碘，并且LG是离去基团，如琥珀酰亚胺。
反应是在合适的溶剂中在合适的卤化剂，如碘或N-溴代琥珀酰亚胺的存在下进行的，任选地在碱，如氢氧化钾的存在下进行的。
典型条件(X＝I)，1,4-二氧六环中1当量的式A、2当量的I2、3.7当量的KOH，在75℃下持续4小时。
步骤2
步骤2描述了将式B转化成式C，其中PG定义为保护基团，包括但不限于叔丁氧基羰基-；苄氧基羰基-；苄基-；4-甲氧基苄基-；2,4-二甲氧基苄基-或三苯甲基-；LG定义为离去基团，如卤素或碳酸叔丁酯。
该反应包括用保护基团封端吡唑NH。本领域技术人员将会理解，许多保护基团可用于此目的(参见Greene，Theodora W.和Wuts，Peter G.M.Greene’s Protective Groupsin Organic Synthesis.第4版(2006))。技术人员还将理解，可以在N1或N2处引入保护基团，并且该比例可以根据PG的性质或展开的精确反应条件而改变。反应条件取决于保护基团的性质。
典型条件(PG＝4-甲氧基苄基)：在室温下将DMF中的1当量的4-甲氧基苄基氯；1当量的式B，2当量的氢氧化钾搅拌过夜。
步骤3
步骤3描述了将式C转化成式D，其中X是卤素，基团R1可以任选地含有官能团，可以使用本领域技术人员已知的标准条件在合成方法的后续阶段操作该官能团。
该反应包括让式C中的氯基与合适溶剂中的氨基基团进行亲核取代，任选地在质子酸(Bronsted acid)的存在下。该反应通常需要加热，用热的方法或使用微波照射进行加热。
典型条件：将正丁醇中的2.5当量的胺、1当量的式C在密封的反应器中加热至180℃持续5小时。
步骤4
步骤4涉及将式D转化为式E。X是卤素，且优选碘。该反应涉及在合适的过渡金属催化剂和合适的碱(优选三乙胺)以及任选的额外添加剂(如四丁基碘化铵)的存在下，取代的乙烯基酯与式D的交叉偶联。本领域技术人员通常将这种类型的转化称为“Heck反应”。
典型条件：DMF中的1当量的式D、10当量的乙烯基酯、2当量的四丁基碘化铵、0.2当量的Pd(dppf)Cl2；DMF：水：三乙胺(6.25:1:1)，加热至70℃过夜。
步骤5
步骤5涉及将式E转化为式F。该反应包括在合适的溶剂中，在合适的过渡金属催化剂存在下，用氢源将双键氢化为相应的饱和化合物。添加质子酸(如HCl或乙酸)以促进该反应可能是必需或期望的。本领域技术人员将理解，可以使用许多不同的金属催化剂用于这种类型的反应，并且在压力下进行这些反应可能是必需或期望的。
典型条件：在氢气气氛下，用碳载钯处理式E。
步骤6
步骤6涉及将式F转化为式G。该反应包括在合适的溶剂中，在合适的碱，如氢氧化钠的存在下，将酯水解成相应的羧酸。
典型条件：在甲醇中用氢氧化钠水溶液处理式F。
步骤7
步骤7涉及将式G转化为式H。该反应包括在酰胺键形成反应条件下分子内环化而形成内酰胺。本领域技术人员将理解，对于这种类型的反应可以使用许多不同的酰胺键形成反应条件。
典型条件：在二氯甲烷中，在三乙胺存在下用HATU处理式G。
步骤8
步骤8涉及将式H转化成通式I。反应涉及从吡唑中除去保护基团，并且精确的条件将根据保护基的性质而变化(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis，第4版.(2006)。
典型条件(PG为4-甲氧基苄基)：在70℃下用三氟乙酸处理式H过夜。
步骤9
步骤9涉及将式H转化为式J。该反应包括用还原剂如硼烷将酰胺还原成相应的胺。本领域技术人员将理解，许多不同的还原剂可用于这种类型的反应。
步骤10
步骤10涉及将式J转化为式K。反应包括从吡唑除去保护基团，并且精确的条件将取决于保护基团的性质(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene’s ProtectiveGroups in Organic Synthesis.第4版.(2006)。
典型条件(PG为4-甲氧基苄基)：在70℃下用三氟乙酸处理式J过夜。
方案2：
步骤11
步骤11描述了将式D转化成式L，其中X和PG如前定义。该反应涉及在合适的溶剂中在过渡金属催化剂的存在下，式D中的卤化物与芳基或杂芳基硼酸或酯的交叉偶联。反应通常在用热的方式或微波加热所提升的温度下进行。通常向反应混合物中加入无机碱(如碳酸钠)。对于本领域技术人员来说，这种类型的转化已知为“Suzuki偶联”。
典型条件：1,4-二氧六环中的1当量的式D、0.09当量的Pd(dppf)2Cl2、1.5当量的硼酸(或硼酸酯)、3.5当量的2M碳酸钠水溶液在90℃下持续18小时。
步骤12
步骤12涉及将式L转化为式M。该反应包括在合适的溶剂中，在合适的碱，如氢氧化钠的存在下，用水将酯水解成相应的羧酸。
典型条件：在甲醇中，用氢氧化钠水溶液处理式L。
步骤13
步骤13涉及将式M转化为式N。该反应涉及在酰胺键形成反应条件下分子内环化以形成内酰胺。本领域技术人员将理解，对于这种类型的反应可以使用许多不同的酰胺键形成反应条件。
典型条件：在二氯甲烷中，在三乙胺存在下用HATU处理式M。
步骤14
步骤14涉及将式N转化为式O。该反应涉及从吡唑除去保护基团，并且精确的条件将根据保护基的性质而变化(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis，第4版(2006)。
典型条件(PG为4-甲氧基苄基)：在70℃下，用三氯乙酸处理式N过夜。
步骤15
步骤15涉及将式N转化为式P。该反应包括用还原剂如硼烷将酰胺还原成相应的胺。本领域技术人员将理解，许多不同的还原剂可用于这种类型的反应。
步骤16
步骤16涉及将式P转化为式Q。该反应包括从吡唑除去保护基团，并且精确的条件将取决于保护基团的性质(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene's ProtectiveGroups in Organic Synthesis.第4版.(2006)。
典型条件(PG为4-甲氧基苄基)：在70℃下,用三氟乙酸处理式P过夜。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
合成化合物的常规程序
色谱法
使用由Agela Technologies制造的设备进行高压液相色谱法，并通过多波长UV检测器进行监测。用于分离过程的典型流动相是PE/EA、DCM/MeOH或水/MeCN。本领域技术人员将理解，改变每种具体化合物的条件可能是必须的或希望的，例如通过在开始或结束时改变溶剂组成，改变溶剂或缓冲液，改变运行时间，改变流动速率和/或色谱柱。
分析方法
在室温下在所述溶剂中，使用Bruker AV 400光谱仪进行1H核磁共振(NMR)光谱，除非另有说明。在所有情况下，NMR数据与所提出的结构一致。使用用于指定主峰的常规缩写，以份每百万计给出特有的化学位移(δ)：例如，s，单峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，双二重峰；br，宽。使用Agilent 1290Infinity/6460triple Quad LCMS记录质谱。当使用薄层色谱(TLC)时，它是指硅胶TLC。
制备化合物
在没有描述制备起始原料的情况下，这些起始原料是可以通过商业渠道购买的，文献中已知的，或者由本领域技术人员使用标准程序易于可获得的。在说明通过类似于先前的实施例或中间体而制备化合物的情况下，本领域技术人员将理解，可以改变每个特定反应的反应时间、试剂的当量数和温度，并且采用不同的后处理或纯化技术可能是必须的或期望的。
实施例1
步骤1
合成4-氯-3-碘-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(中间体1)：
在室温下，将碘(19g，76mmol)加入至4-氯-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(5.8g，38mmol，根据WO 2010106333A1和WO 2012038743A1合成)和KOH(8g，142mmol)在1,4-二氧六环(100mL)中的混合物中。将反应混合物在75℃下搅拌4小时，然后冷却至室温。将溶液用饱和Na2S2O3(水溶液)稀释，过滤所得沉淀物并进行干燥，得到黄色固体(4.1g)。将滤液静置3天，过滤所得沉淀物，产生另外3.55g产物。合并产率(7.65g，72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm7.65(d,J＝6.0Hz,1H),8.13(d,J＝6.0Hz,1H),14.22(s,1H).m/z(ESI)+:280[M+H]+
步骤2
合成1-(4-甲氧基苄基)-4-氯-3-碘-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(中间体2)：
在室温下，将4-甲氧基苄基氯(0.5mL，3.6mmol)加入至中间体1(1g，3.6mmol)和KOH(0.3g，5.4mmol)在DMF(10mL)中的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌2.5小时，然后减压浓缩，残余物溶解于EtOAc中并用水洗涤，将有机相干燥并减压浓缩。用快速色谱纯化残余物，以0至30％EtOAc/PE梯度洗脱，得到N1:N2位置异构的混合物固体(N1:N2＝9:1，1.3g，93％)。主要的N1异构体：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.70(s,3H),5.57(s,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,2H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),7.80(d,J＝4.8Hz,1H),8.17(d,J＝4.4Hz,1H).m/z(ESI)+:400[M+H]+.
步骤3
合成1-(4-甲氧基苄基)-3-碘-N-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-胺(中间体3)：
将甲胺(6mL，40％水溶液)加入至中间体2(1.0g，2.50mmol)在n-BuOH(6mL)中的溶液中。将混合物在密封反应釜中加热至170℃搅拌反应5小时，然后减压浓缩，用快速色谱纯化残余物，0～50％EtOAc/DCM洗脱，得到白色固体(0.84g，85％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.71(m,2H),2.24(m,4H),4.43(s,2H),4.94(m,1H),6.80(d,J＝6.0Hz,1H),7.41(m,2H),7.59(d,J＝6.8Hz,1H),7.78(d,J＝6.0Hz,1H),7.98(d,J＝7.2Hz,1H),13.28(s,1H)；m/z(ESI)+:395[M+H]+.
步骤4
合成(E)-3-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)丙烯酸甲酯(中间体4)：
在室温下，氩气保护，将丙烯酸甲酯(1.30g，15.08mmol)和Pd(dppf)Cl2(220mg，0.3mmol)加入至中间体3(595mg，1.51mmol)和四丁基碘化铵(1.11g，3.02mmol)在DMF/水/三乙胺(26mL/2.8mL/2.8mL)中的混合物中，将所得混合物在密封反应釜中70℃下加热过夜，然后减压浓缩，将粗残余物溶解于EtOAc中，用饱和食盐水洗涤，Na2SO4干燥有机相，过滤，减压浓缩，快速色谱纯化，0至60％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得到棕色胶状固体(80％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.93(d,J＝4.4Hz,3H),3.69(s,3H),3.75(s,3H),5.49(s,2H),6.72(m,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),6.92(d,J＝6.0Hz,1H),7.22(d,J＝8.0HZ,2H),7.83(d,J＝6.0Hz,1H),8.11(d,J＝17.6Hz,1H)；m/z(ESI)+:353[M+H]+.
步骤5
合成3-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)丙酸甲酯(中间体5)：
将10％Pd/C(0.1g)和乙酸(2mL)加入至中间体4(317mg，0.90mmol)在乙酸乙酯(10ml)和甲醇(10mL)中的溶液中。将所得混合物在H2气氛下在室温下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤。用EtOAc洗涤滤饼两次合并滤液减压浓缩，得到白色固体(90％)。残余物不经进一步纯化而用于下一步反应。m/z(ESI)+:355[M+H]+。
步骤6
合成3-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-丙酸(中间体6)：
在室温下，将NaOH(160mg，4.0mmol)加入至中间体5(283mg，0.80mmol)在甲醇(15mL)和水(3mL)中的溶液中。将所得混合物在40℃下搅拌4小时，然后用乙酸调节至pH＝4，减压浓缩后，用快速色谱纯化残余物，用0至30％甲醇/DCM梯度洗脱，得到黄色固体(68％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:2.68(d,J＝7.2Hz,2H),2.91(d,J＝4.4Hz,3H),3.21(t,J＝7.2Hz,2H),3.70(d,J＝6.0Hz,3H),5.33(d,J＝8.4Hz,2H),6.33(d,J＝6.8Hz,1H),6.74(d,J＝10.4Hz,1H),6.86(d,J＝10.0Hz,2H),7.13(d,J＝8.4Hz,2H),7.72(d,J＝10.0Hz,1H),12.20(br s,1H)；m/z(ESI)+:341[M+H]+.
步骤7
合成6-甲基-2-(4-甲氧基苄基)-2,6,8,9-四氢-7H-1,2,5,6-四氮杂苯并[cd]薁-7-酮(中间体7)：
在氩气保护下，将HOBt(2.06g，15.21mmol)和DIPEA(1.97g，15.21mmol)加入至中间体6(4.31g，12.67mmol)在无水THF(250mL)的溶液中。将混合物冷却至0℃，然后加入EDCI(2.92g，15.21mmol)。在0℃下搅拌0.5小时后，将反应混合物缓慢自然升温至室温并搅拌过夜，然后用水(100mL)淬灭。减压浓缩除去大部分THF，残余物在EtOAc和水之间分液。用饱和食盐水(100mL)洗涤有机层，Na2SO4干燥后减压浓缩。用快速色谱纯化残余物(EtOAc/PE梯度洗脱)，得到白色固体(75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:2.94(m,2H),3.12(m,2H),3.52(s,3H),3.70(s,3H),5.50(s,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),7.43(d,J＝6.0Hz,1H),8.16(d,J＝6.0Hz,1H)；m/z(ESI)+:323[M+H]+
步骤8
合成6-甲基-2,6,8,9-四氢-7H-1,2,5,6-四氮杂苯并[cd]薁-7-酮(实施例1)：
将中间体7溶于TFA(150mg，5mL)，在密封反应釜中90℃下搅拌过夜。冷却至室温后，减压浓缩混合物，残余物溶于DCM/MeOH的混合溶剂(1:1，v/v，10mL)中，用K2CO3中和，过滤，洗涤并减压浓缩。随后用快速色谱纯化残余物，用0至30％甲醇/DCM梯度洗脱，然后用反相C-18柱纯化，用5至60％MeCN/水梯度洗脱，得到为白色固体的产物(75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.94(s,2H),3.13(s,2H),3.49(s,3H),7.18(s,1H),8.14(s,1H),13.30(br s,1H)；m/z(ESI)+:203[M+H]+.
实施例2-14
在步骤3中用合适的胺代替甲胺，类似于实施例1地制备实施例2-14。
实施例15
在步骤4中用甲基丙烯酸甲酯代替丙烯酸甲酯，类似于实施例14地制备实施例15。
实施例16
合成6-甲基-6,7,8,9-四氢-2H-1,2,5,6-四氮杂苯并[cd]薁(实施例16)：
在0℃下，将BH3(1M，于5mL的THF中)加入至实施例1中的中间体7(328mg，于10mL无水THF中，1.02mmol)的溶液中。氩气保护条件下室温搅拌16小时后，加入甲醇(10mL)淬灭反应混合物，然后减压浓缩。将粗中间产物8溶解于TFA(5mL)中，并在密封反应釜中90℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物减压浓缩并溶解于DCM/MeOH(1:1，v/v，10mL)中，用K2CO3中和，过滤并减压浓缩。随后用快速色谱纯化残余物，用0至30％甲醇/DCM梯度洗脱，然后用反相C-18柱纯化，用5至60％MeCN/水梯度洗脱，得到黄色固体(两步产率15％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.05(m,2H),2.98(m,2H),3.33(s,3H),3.66(m,2H),6.74(d,J＝6.0Hz,1H),7.70(d,J＝6.0Hz,1H),13.07(br s,1H)；m/z(ESI)+:189[M+H]+.
实施例17-29
类似于实施例16地制备实施例17-29，如下所示，用合适的中间体代替中间体7，该中间体是在步骤3(实施例1)中用适当的胺代替甲胺制备的。
实施例30
类似于实施例16地制备实施例30，如下所示，用适当的中间体代替中间体7，而该中间体是通过在步骤3(实施例1)中用适当的胺代替甲胺，并在步骤4(实施例1)中用甲基丙烯酸甲酯代替丙烯酸甲酯而制备的。
实施例31
步骤1
合成2-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)苯甲酸甲酯(中间体9)：
用氩气将中间体3(1.8g，4.56mmol)、(2-(甲氧基羰基)苯基)硼酸(1.23g，6.85mmol)和K3PO4(1.94g，9.13mmol)在甲苯(50mL)中的混合物进行脱氧处理，然后加入Pd(OAc)2(103mg，0.46mmol)。将混合物转移至密封反应釜中并加热至95℃持续反应16小时。浓缩后，残余物在EtOAc(300mL)和水(150mL)之间进行分液。用水(100mL×2)洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速色谱纯化残余物，用0至65％EtOAc/PE梯度洗脱，得到浅黄色泡状固体(1.44g，78％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.80(d,J＝8.8Hz,3H),3.44(s,3H),3.70(s,3H),5.11(m,1H),5.46(s,2H),6.90(m,3H),7.18(d,J＝8.8Hz,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(t,J＝7.6Hz,1H),7.71(t,J＝7.6Hz,1H),7.81(d,J＝6.0Hz,1H),7.88(d,J＝7.6Hz,1H)；m/z(ESI)+:403[M+H]+.
步骤2
合成2-(4-(乙基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)苯甲酸(中间体10)：
在室温下，将NaOH(700mg，17.78mmol)加入至中间体9(1.44g，3.55mmol)在甲醇(20mL)和水(5mL)中的溶液中。将所得混合物在45℃下搅拌4小时，并用乙酸将混合物的pH值调节至4。减压浓缩后，用快速色谱纯化残余物，用0至30％甲醇/DCM梯度洗脱，得到白色固体(1.3g，93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.00(d,J＝4.8Hz,3H),3.71(s,3H),5.62(s,2H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H),7.22(d,J＝8.4Hz,3H),7.38(d,J＝7.2Hz,1H),7.48(d,J＝7.2Hz,1H),7.69(m,3H),8.02(d,J＝6.8Hz,1H),13.20(br s,1H)；m/z(ESI)+:389[M+H]+.
步骤3
合成11-(4-甲氧基苄基)-4-甲基-4,11-二氢-5H-3,4,10,11-四氮杂二苯并[cd,h]薁-5-酮(中间体11)：
在氩气保护下，将Et3N(1.02g，10.05mmol)加入至中间体10(1.3g，3.34mmol)和HATU(1.9g，5.02mmol)在无水DCM(40mL)中的混合物中。在室温下搅拌16小时后，将反应混合物减压浓缩，并且用快速色谱纯化残余物，用0至30％EtOAc/PE梯度洗脱，得到白色固体(1.11g，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.64(s,3H),3.70(s,3H),5.61(s,2H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝6.0Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.67(t,J＝7.4Hz,1H),8.10(d,J＝6.0Hz,1H),8.31(m,2H)；m/z(ESI)+:371[M+H]+.
步骤4
合成4-甲基-4,11-二氢-5H-3,4,10,11-四氮杂二苯并[cd,h]薁-5-酮(实施例31)：
将中间体11(50mg，0.135mmol)在TFA(3mL)中的溶液加热至90℃持续反应6小时，然后减压浓缩，并用快速色谱纯化，用0至30％甲醇/DCM梯度洗脱，得到白色固体(45％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.66(s,3H),7.16(d,J＝6.0Hz,1H),7.52(t,J＝5.6Hz,1H),7.69(t,J＝5.2Hz,1H),8.08(d,J＝6.4Hz,1H),8.35(m,2H),13.73(s,1H).m/z(ESI)+:251[M+H]+.
实施例32-44
类似于实施例31地制备实施例32-44，如下所示，用合适的中间体代替中间体3，而该中间体是在步骤3(实施例1)中用适当的胺代替甲胺而制备的。
实施例45
合成4-甲基-5,11-二氢-4H-3,4,10,11-四氮杂二苯并[cd,h]薁(实施例45)：
0℃，在氩气保护下，将BH3(1.6M，在THF中，4mL)加入至实施例31中的中间体11(260mg，0.70mmol)的无水THF(15mL)的溶液中。将混合物在室温下搅拌3小时，然后通过加入甲醇(6mL)淬灭并减压浓缩。将粗产物12溶解于TFA(5mL)中，并在密封反应釜中在90℃下搅拌过夜。冷却至室温后，减压浓缩混合物，并将残余物溶解于DCM/MeOH(1:1，v/v，10mL)中，用K2CO3中和，过滤并浓缩。用快速色谱纯化残余物，用0至35％甲醇/DCM梯度洗脱，然后用反相C-18柱纯化，用5至70％MeCN/水梯度洗脱，得到灰白色固体(两步产率36％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.33(s,3H),4.86(s,2H),7.06(s,1H),7.50(m,2H),7.62(d,J＝6.8Hz,1H),7.73(d,J＝6.4Hz,1H),8.02(d,J＝7.2Hz,1H),12.68(br s,1H)；m/z(ESI)+:237[M+H]+.
实施例46-58
据下述方案，类似于实施例45地制备实施例46-58。
实施例59,60
按照以下方案，类似于实施例44地制备实施例59,60，在步骤1(实施例31)中用适当的苯基硼酸代替2-(甲氧基羰基)苯基硼酸，且在步骤3(实施例1)中用四氢-2H-吡喃-4-胺代替甲胺。
实施例61,62
根据下述方案，类似于实施例58的制备实施例61,62，用合适的中间体代替中间体11(实施例45)，该中间体通过在步骤1(实施例31)中用适当的苯基硼酸代替2-(甲氧基羰基)苯基硼酸，并在步骤3(实施例1)中用四氢-2H-吡喃-4-胺代替甲胺。
实施例65
步骤1
合成4-碘-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中间体16)：
将4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(8.0g，30.0mmol)，K2CO3(12.42g，90.0mmol)和TrtCl(10.06g，36.0mmol)在MeCN(200mL)中的混合物加热至90℃持续反应15小时。冷却至室温后，过滤，并用乙酸乙酯(100mL)洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩，并用快速色谱纯化残余物，用0至15％EtOAc/PE梯度洗脱，得到白色晶状固体(10.0g，67％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.28(t,J＝7.2Hz,3H),4.27(m,J＝7.2Hz,2H),7.02(m,6H),7.29–7.50(m,9H),7.56(s,1H)。
步骤2
合成4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中间体17)：
在氩气保护下，将中间体16(2.1g，4.13mmol)和2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(2.31g，12.40mmol)的无水THF(20mL)溶液冷却至-75℃，然后逐滴地滴加n-BuLi(7.75mL，12.40mmol，正己烷溶液，1.6M)，滴加过程维持反应温度在-70℃以下，滴加完毕后在-75℃下搅拌1小时，加入水淬灭反应混合物，然后混合物在水和EtOAc中分液。分别用饱和NH4Cl水溶液(100mL)、水(100mL)和饱和食盐水(100mL)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并减压浓缩。用快速色谱纯化残余物，用0至30％EtOAc/PE梯度洗脱，得到白色固体(0.5g，24％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:1.23(s,12H),1.28(t,J＝5.2Hz,3H),4.24(q,J＝5.2Hz,2H),7.04(m,6H),7.39(m,9H),7.47(s,1H).
步骤3
合成4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中间体18)：
在氩气保护下，将中间体3a(3.25g，7.0mmol，通过在步骤3中用四氢-2H-吡喃-4-胺代替甲胺，类似于实施例1中的中间体3进行制备)和中间体17(3.92g，7.7mmol)、Cs2CO3(6.85g，21mmol)、Pd(dppf)Cl2的无水DMF(20mL)溶液密封在反应釜中。将混合物在90℃下搅拌16小时并冷却至室温，并将200mL饱和NH4Cl溶液加入到反应混合物中。用乙酸乙酯萃取(3×150mL)后，用150mL饱和NH4Cl溶液洗涤合并的有机层，Na2SO4干燥后减压浓缩。用快速色谱纯化残余物，用0％至80％EtOAc/PE梯度洗脱，得到白色固体(3.0g，60％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.67(t,J＝6.8Hz,3H),1.15(m,2H),1.80(m,2H),3.40(m,2H),3.72(m,5H),3.95(m,2H),4.06(m,1H),4.72(d,J＝7.6Hz,2H),5.46(s,2H),6.86(m,3H),7.16(m,8H),7.42(m,10H),7.75(m,2H).m/z(ESI)+:719[M+H]+.
步骤4
合成4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸(中间体19)：
在50℃下，将中间体18(3.0g，4.34mmol)和NaOH(0.87g，21.71mmol)在THF/H2O(1:1，v/v，16mL)中的混合物搅拌60小时并冷却至室温。减压除去混合物中的THF，用HCl(1N)将混合物的pH值调至3。用DCM(100mL×3)萃取混合物，并合并有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到粗产物(2.5g)，将该粗产物无需纯化直接地用于下一步反应。m/z(ESI)+:691[M+H]+。
步骤5
合成5-(4-甲氧基苄基)-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-2-三苯甲基-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁-10(2H)-酮(中间体20)：
在室温下，将中间体19(2.5g，3.26mmol)、HATU(2.06g，5.43mmol)和TEA在CH2Cl2(50mL)中的混合物搅拌16小时，然后将混合物减压浓缩，并用快速色谱纯化残余物，用0％至80％EtOAc/PE梯度洗脱，得到白色固体(3.0g，60％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.60(d,J＝10.4Hz,2H),2.80(m,2H),3.40(m,2H),3.69(s,3H),3.97(m,2H),5.51(s,2H),5.67(m,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(m,8H),7.41(m,10H),7.75(s,1H),8.15(d,J＝6.0Hz,1H).m/z(ESI)+:673[M+H]+.
步骤6
合成9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁-10(2H)-酮(实施例65)：
将中间体20(50mg，0.080mmol)、TFA(3mL)的混合物在密封反应器中90℃下搅拌16小时。混合物减压浓缩，且使用配备反相C-18柱的快速色谱纯化残余物，用5％至60％乙腈/水梯度洗脱，得到白色固体(12mg，60％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.62(m,2H),2.84(m,2H),3.76(m,2H),3.98(m,2H),5.81(m,1H),7.15(d,J＝5.6Hz,1H),8.05(s,1H),8.09(d,J＝5.6Hz,1H),13.41(s,1H),14.01(s,1H).m/z(ESI)+:311[M+H]+.。
实施例66和67
步骤1
合成5-(4-甲氧基苄基)-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-2-三苯甲基-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁-10(2H)-酮(中间体21)：
在室温下，将在实施例65中的中间体20(1.0g，1.49mmol)的CH2Cl2/TFA(22mL，10:1，v/v)溶液搅拌3小时。将反应混合物用50mL饱和Na2CO3溶液淬灭，并将混合物中的CH2Cl2减压除去。通过过滤收集混合物中的固体，滤饼用水(20mL×3)洗涤，得到白色固体(0.42g，66％)，该白色固体无需进一步纯化直接应用于下一步反应。m/z(ESI)+:431[M+H]+.
步骤2
合成5-(4-甲氧基苄基)-2-甲基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁-10(2H)-酮(中间体22)和5-(4-甲氧基苄基)-1-甲基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁-10(1H)-酮(中间体23)：
在室温下，在密封反应釜中，将CH3I(145mg，1.02mmol)加入至中间体21(220mg，0.51mmol)和Cs2CO3(333mg，1.02mmol)在无水DMF(5mL)中的混合物中。在60℃下搅拌5小时后，将混合物冷却至室温，并倒入至20mL饱和的NH4Cl水溶液中，然后用EA(30mL×3)萃取。用饱和食盐水(20mL×3)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得中间体22和23的混合物的粗产物(200mg，白色固体)，无需进一步纯化直接地用于下一步反应。m/z(ESI)+:445[M+H]+。
步骤3
合成2-甲基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁-10(2H)-酮(实施例66)和1-甲基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯[h]薁-10(1H)-酮(实施例67)：
在90℃下，将密封反应釜中的中间体22和23(200mg，0.45mmol)和TFA(5mL)的混合物搅拌16小时。减压浓缩混合物，并使用配备反相C-18柱的快速色谱纯化残余物，用5％至50％乙腈/水梯度洗脱，得到20mg的终产物66和42mg的终产物67。
化合物66:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.63(m,2H),2.80(m,2H),3.46(m,2H),3.94(m,2H),4.13(s,3H),5.71(m,1H),7.10(d,J＝5.6Hz,1H),7.97(s,1H),8.06(d,J＝5.6Hz,1H),13.41(s,1H).m/z(ESI)+:325[M+H]+。
化合物67:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.61(m,2H),2.80(m,2H),3.45(m,2H),3.95(m,5H),5.63(m,1H),7.11(d,J＝5.6Hz,1H),8.07(d,J＝5.6Hz,1H),8.35(s,1H),13.37(s,1H).m/z(ESI)+:325[M+H]+。
实施例68
合成吡唑硼酯：
步骤1
合成4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(25)
在室温下，将NIS(22.5g，100mmol)加入至1H-吡唑-3-羧酸乙酯(10.0g，71.4mmol)的DCM(30mL)溶液中。将混合物搅拌24小时。然后用H2O(50mL)淬灭反应物，并用EtOAc(60mL×3)萃取混合物。用饱和食盐水(50mL×3)洗涤合并的有机相，通过Na2SO4进行干燥。过滤后，减压浓缩滤液。通过色谱(PE：EtOAc＝1:5，v/v)纯化残余物，得到产物4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(15.5g，82％)。m/z(ESI)+:267[M+H]+。
步骤2
合成4-碘-1-异丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(26)和4-碘-1-异丙基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(27)
将2-碘丙烷(12.9g，75.9mmol)和K2CO3(16.0g，116mmol)加入至4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(15.53g，58.4mmol)的DMF(150mL)溶液中。将混合物加热至60℃持续反应3小时。然后用水(300mL)淬灭反应，用EtOAc(200mL×3)萃取混合物。用饱和食盐水(200mL×3)洗涤合并的有机相并通过Na2SO4进行干燥。过滤后，减压浓缩有机相。通过正相柱层析(PE:EtOAc＝10:1，v/v)纯化残余物，得到4-碘-1-异丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(中间体26)(9.4g，52％)，m/z(ESI)+:309[M+H]+，且利用PE:EtOAc＝8:1(v/v)洗脱，得到4-碘-1-异丙基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中间体27)(6.1g，33％)。m/z(ESI)+:309[M+H]+。
步骤3
合成1-异丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(28)
将4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-联(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(3.56g，14.0mmol)、KOAc(2.7g，27.5mmol)和Pd(dppf)2Cl2(300mg)加入至4-碘-1-异丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(2.14g，6.95mmol)的DMSO(20mL)溶液中。将混合物加热至100℃持续2小时。然后用H2O(40mL)淬灭反应并用EtOAc(40mL×3)萃取混合物。然后用饱和食盐水(40mL×3)洗涤合并的有机相，通过Na2SO4进行干燥。过滤后，减压浓缩滤液。通过快速柱层析色谱(PE:EtOAc＝10:1，v/v)纯化残余物，得到产物1-异丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(1.0g，93％)。m/z(ESI)+:309[M+H]+。
步骤4
合成1-异丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(29)
将4-碘-1-异丙基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(4.5g，14.6mmol)和2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(8.15g，43.8mmol)的无水THF(50mL)溶液冷却至-75℃，然后逐滴地滴加n-BuLi(17.5mL，正己烷溶液，1.6N，43.8mmol)，将混合物在-75℃下搅拌2小时，随后加入200mL饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取混合物，并用50mL饱和食盐水洗涤合并的有机层，进行干燥(Na2SO4)并减压浓缩。用快速色谱纯化残余物(黄色油状物)，用0至40％EtOAc/PE梯度洗脱，得到淡黄色油状物(2.0g，44％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.20-1.50(m,21H),4.25(q,J＝7.2Hz,2H),4.51-4.65(m,1H),8.18(s,1H)；m/z(ESI)+:309[M+H]+。
可以类似于28和29在步骤2中使用碘甲烷或碘乙烷制备下面的吡唑硼酯：
合成实施例68：
步骤1
合成3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-胺(30)
在130℃下，将在50mL圆底烧瓶中的4-氯-3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(3.0g，7.5mmol)、1-甲基哌啶-4-胺(2.57g，22.5mmol)和DIEA(3.87g，30mmol)的混合物搅拌过夜。随后减压浓缩反应物，并用正相柱层析纯化残余物，用DCM/MeOH梯度洗脱，得到棕色固体3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-胺(2.7g，75％)。m/z(ESI)+:478[M+H]+。
步骤2
合成1-异丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(31)
在N2保护下，将3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-胺(464mg，0.97mmol)、1-异丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(300mg，0.97mmol)，Pd(dppf)Cl2(80mg，0.097mmol)和2NNa2CO3(1mL，2mmol)的1,4-二氧六环(20mL)溶液加热至90℃并搅拌过夜。随后用EtOAc(100mL)稀释混合物，用水(30mL×2)、饱和食盐水(30mL)洗涤并通过Na2SO4进行干燥。过滤有机相并浓缩滤液，得到残余物，将该残余物通过硅胶色谱纯化，用DCM/MeOH＝10/1(v/v)洗脱，得到黄色油状物1-异丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(300mg，58％)。m/z(ESI)+:532[M+H]+。
步骤3
合成(1-异丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(32)
在0℃下，将LiAlH4(182mg，4.79mmol)分批加入至1-异丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(510mg，0.96mmol)的无水THF(20mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌1小时。随后用水(5mL)和EtOAc(100mL)淬灭反应。过滤悬浮液，分离有机相并用饱和食盐水(15mL)洗涤，随后通过Na2SO4进行干燥。过滤有机相，并减压浓缩滤液。通过硅胶色谱，以DCM/MeOH＝6/1(v/v)洗脱来纯化残余物，得到白色固体(1-异丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(300mg，64％)。m/z(ESI)+:490[M+H]+。
步骤4
合成1-异丙基-5-(4-甲氧基苄基)-9-(1-甲基哌啶-4-基)-1,5,9,10-四氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁(33)
在0℃在N2下，将甲磺酰氯(144mg，1.22mmol)逐滴地加入至(1-异丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(300mg，0.61mmol)和Et3N(185mg，1.84mmol)的THF(50mL)溶液中。随后将反应在室温下搅拌0.5小时，TLC显示起始原料消失，随后加入t-BuOK(206mg，1.84mmol)。将反应在N2保护下加热至60℃搅拌1小时，随后用水(10mL)淬灭反应并用EtOAc(100mL)萃取，用饱和食盐水(30mL)洗涤有机相，通过Na2SO4进行干燥。过滤有机相并浓缩滤液，得到残余物，通过以DCM/MeOH＝6/1(v/v)洗脱的硅胶色谱纯化该残余物，得到无色油状物1-异丙基-5-(4-甲氧基苄基)-9-(1-甲基哌啶-4-基)-1,5,9,10-四氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁(200mg，69％)。m/z(ESI)+:472[M+H]+。
步骤5
合成1-异丙基-9-(1-甲基哌啶-4-基)-1,5,9,10-四氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁(实施例68)
在70℃下，将1-异丙基-5-(4-甲氧基苄基)-9-(1-甲基哌啶-4-基)-1,5,9,10-四氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁(200mg，0.42mmol)在TFA(5mL)中的混合物搅拌过夜，减压浓缩，通过制备型HPLC纯化所得残余物，合并所收集的洗脱液，用饱和的NaHCO3水溶液调节至pH＝8，并用EtOAc(10mL×3)萃取，通过Na2SO4干燥有机相并进行过滤，减压浓缩滤液，得到白色固体1-异丙基-9-(1-甲基哌啶-4-基)-1,5,9,10-四氢-1,2,4,5,8,9-六氮杂苯并[cd]环戊二烯并[h]薁(110mg，74％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.44(d,J＝6.0Hz,6H),1.63-1.71(m,2H),1.91-2.12(m,4H),2.22-2.32(m,3H),2.92(s,2H),4.47(s,2H),4.62(m,1H),4.93-4.96(m,1H),6.7，9(d,J＝6.0Hz,1H),7.78-7.81(m,2H),12.95(br s,1H)；m/z(ESI)+:352[M+H]+。
实施例69-88
类似于实施例68，在步骤1中使用合适的胺以及在步骤2中使用适当的吡唑硼酯而制备实施例69-88。对于实施例69和76，合适的吡唑硼酯是实施例65步骤2中的中间体17。
实施例89
步骤1
合成4-碘-6-(三氟甲基)烟酸(34)
在3000mL的3颈圆底烧瓶中，氮气保护，将2,2,6,6-四甲基哌啶(34.5g，141mmol)的无水THF(600mL)溶液降温-78℃，维持-78℃，将n-BuLi(98mL，2.4M己烷溶液)加入并搅拌反应0.5小时，后将6-三氟甲基烟酸(15g，78mmol)的无水THF(50mL)溶液逐滴地加入，并在-78℃下将混合物搅拌2.5小时。随后缓慢加入I2(29.3g，117mmol)的无水THF(50mL)溶液，并同样在-78℃下搅拌反应1小时。随后将100mL饱和NH4Cl水溶液加入淬灭反应，通过1N HCl将反应液的pH值调节至4～5，随后用DCM(400mL×3)萃取混合物，Na2SO4进行干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，通过在正相硅胶柱纯化(PE/EA/AcOH，1:10:0.01，v/v/v)，得到黄色固体化合物34(10g，40％)。m/z(ESI)-:316[M-H]-。
步骤2
合成4-碘-6-(三氟甲基)烟酸甲酯(35)
在室温下，将中间体34(10g，31mmol)，K2CO3(8.7g，63mmol)和MeI(5.37g，37.9mmol)在DMF(25mL)中的混合物搅拌过夜。随后向反应混合物中加入H2O(300mL)。过滤混合物并用水(20mL)洗涤滤饼，在空气中干燥，得到黄色固体化合物35(10g，粗品)。m/z(ESI)+:332[M+H]+。
步骤3
合成4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-6-(三氟甲基)烟酸甲酯(36)
在N2保护下，将中间体35(10.0g，30.0mmol)、双(频哪醇合)二硼(11.5g，45.3mmol)、KOAc(5.9g，60.4mmol)和Pd(dppf)2Cl2(3.31g，4.53mmol)混合于1,4-二氧六环(100mL)中，升温至95℃并维持该温度持续搅拌18小时。后降温浓缩，残余物在于EtOAc(300mL)和水(80mL)之间分液。用水(200mL×2)洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过正相硅胶柱层析(PE/EA，v/v，20:1至10:1梯度)纯化残余物，得到黄色固体的产物(2.2g)。m/z(ESI)+:250[M+H]+。
步骤4
合成4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-6-(三氟甲基)烟酸(37)
用N2将化合物3a(1.23g，2.66mmol)、中间体36(2.2g，6.6mmol)和K2CO3(733mg，5.32mmol)的1,4-二氧六环/H2O(4:1，v/v，20mL)溶液脱气。随后，向上述溶液中加入PPh3(175mg，0.67mmol)和Pd(PPh3)4(185mg)。在氮气保护下，将混合物在100℃下搅拌18小时。减压浓缩反应混合物，得到残余物，通过正相硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH，v/v，5:1至2:1梯度洗脱)，得到化合物37，为黄色固体(1.0g，69％)。m/z(ESI)+:528[M+H]+。
步骤5
合成(4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲醇(38)
在0℃下，将中间体37(1g，1.9mmol)，AlCl3(234mg，1.9mmol)和LiAlH4(261mg，7.86mmol)在无水THF(40mL)中的混合物搅拌1小时。依次地将H2O(0.26mL)、15％NaOH(水溶液，0.26mL)和H2O(0.8mL)加入至混合物中。过滤混合物并减压浓缩滤液，正相硅胶柱层析纯化残余物(PE/EA，v/v，5:1至2:1梯度洗脱)，得到为黄色油状物的产物(240mg，24.6％)。m/z(ESI)+:514[M+H]+。
步骤6
合成11-(4-甲氧基苄基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-8-(三氟甲基)-5,11-二氢-4H-3,4,7,10,11-五氮杂二苯并[cd,h]薁(39)
在0℃，将MsCl(112mg，0.97mmol)逐滴地加入至中间体38(250mg，0.49mmol)和TEA(198mg，1.95mmol)的无水THF(20mL)溶液中。在0℃下搅拌0.5小时后，加入t-BuOK(219mg，1.95mmol)。随后在55℃下搅拌反应1.5小时，减压浓缩，得到残余物，正相硅胶柱层析纯化残余物(PE/EA，1:1，v/v)，得到为黄色固体的化合物39(230mg，95％)。m/z(ESI)+:496[M+H]+。
步骤7
合成4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-8-(三氟甲基)-5,11-二氢-4H-3,4,7,10,11-五氮杂二苯并[cd,h]薁(实施例89)
化合物39(230mg，0.46mmol)在微波反应管中溶于TFA(3mL)，后微波辅助加热至105℃反应搅拌1小时，后减压浓缩，残余物通过制备型HPLC纯化，得到白色固体(55mg，33.1％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.76(d,J＝10.6Hz,2H),2.18(dt,J＝11.5,7.7Hz,2H),3.47(t,J＝11.4Hz,2H),4.04(dd,J＝11.1,3.6Hz,2H),4.41(t,J＝10.2Hz,1H),4.89(s,2H),7.24(d,J＝6.8Hz,1H),7.86(d,J＝6.9Hz,1H),8.27(s,1H),9.19(s,1H),14.70(s,1H)；19F-NMR(376MHz,DMSO-d6)δppm-66.72,-74.41；m/z(ESI)+:376[M+H]+。
实施例90-92
在步骤1中使用合适的吡啶，类似于实施例89地制备实施例90-92。
实施例93
步骤1
合成2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)乙醇(40)
在100℃下，将3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-胺(1.5g，3.23mmol)、2-(甲基氨基)乙醇(1.98g，32.3mmol)、碘化亚铜(123mg，0.65mmol)、L-脯氨酸(150mg，1.3mmol)和t-BuOK(621mg，6.46mmol)在DMSO(15mL)中的混合物搅拌过夜。随后用EtOAc(100mL)稀释混合物，用水(30mL×2)、饱和食盐水(30mL×1)洗涤，通过Na2SO4进行干燥，过滤混合物并浓缩滤液，残余物通过正相硅胶柱层析纯化，以PE/EtOAc＝2/1(v/v)洗脱，得到无色油状物2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)乙醇(760mg，57％)。m/z(ESI)+:412[M+H]+。
步骤2
合成2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)甲磺酸乙酯(41)
在0℃下N2保护，将甲磺酰氯(429mg，3.7mmol)逐滴地加入至2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)乙醇(760mg，1.85mmol)和Et3N(560mg，5.55mmol)的THF(76mL)溶液中，随后在室温下将混合物搅拌0.5小时。用水(10mL)淬灭反应并用EtOAc(20mL×2)萃取，用饱和食盐水(20mL×1)洗涤合并的有机相，并通过Na2SO4进行干燥，过滤有机相并浓缩滤液，残余物通过正相硅胶柱层析纯化，PE/EtOAc＝3:1(v/v)洗脱，得到无色油状物2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)甲磺酸乙酯(489mg，54％)。m/z(ESI)+:490[M+H]+。
步骤3
合成2-(4-甲氧基苄基)-9-甲基-6-(四氢-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氢-2H-1,2,5,6,9-五氮杂苯并[cd]薁(42)
将t-BuOK(312mg，2.79mmol)加入至2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)甲磺酸乙酯(455mg，0.93mmol)的无水THF(50mL)溶液中。在N2下，将反应物加热至60℃反应1小时。随后用水(10mL)淬灭反应并用EtOAc(100mL)萃取，用饱和食盐水(30mL)洗涤有机相，并且通过Na2SO4进行干燥，过滤有机相，减压浓缩滤液，残余物通过正相硅胶柱层析纯化，PE/EtOAc＝1/1(v/v)洗脱，得到油状物2-(4-甲氧基苄基)-9-甲基-6-(四氢-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氢-2H-1,2,5,6,9-五氮杂苯并[cd]薁(167mg，46％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.57-1.66(m,2H),1.79(m,2H),3.06(s,3H),3.37(m,2H),3.60(m,4H),3.77(s,3H),4.04(m,2H),5.24(m,3H),6.37(d,J＝6.0Hz,1H),6.82(d,J＝8.0Hz,2H),7.16(d,J＝8.0Hz,2H),7.78(d,J＝6.0Hz,1H)；m/z(ESI)+:394[M+H]+。
步骤4
合成9-甲基-6-(四氢-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氢-2H-1,2,5,6,9-五氮杂苯并[cd]薁(实施例93)
在N2下，将2-(4-甲氧基苄基)-9-甲基-6-(四氢-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氢-2H-1,2,5,6,9-五氮杂苯并[cd]薁(150mg，0.38mmol)的TFA(7.5mL)溶液加热至70℃反应8小时，后减压浓缩除去TFA，将残余物溶解于EtOAc(150mL)中，用NaHCO3水溶液(20mL×2)、饱和食盐水(20mL×1)洗涤，通过Na2SO4进行干燥，过滤后浓缩滤液，残余物通过制备TLC(DCM/MeOH＝11/1，v/v)纯化，得到白色固体9-甲基-6-(四氢-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氢-2H-1,2,5,6,9-五氮杂苯并[cd]薁(75mg，72％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.71(m,2H),1.87(m,2H),3.02(s,3H),3.44(m,4H),3.78(m,2H),3.98(m,2H),4.33(m,1H),6.84(s,1H),7.55(s,1H),12.35(br s,1H),12.98(br s,1H)；19F-NMR(376MHz,DMSO-d6)δppm-74.41；m/z(ESI)+:274[M+H]+。
实施例94
在步骤1中使用2-(乙基氨基)乙醇代替2-(甲基氨基)乙醇，类似于实施例93地制备实施例94。
使用以下方法，测定实施例的LRRK2抑制和对其它激酶如JAK2的选择性。
材料和方法
材料
在AdaptaTM激酶测定法(LRRK2_IC50测定)中：激酶反应缓冲液含有5×激酶缓冲液S(Life Technologies，PV5213)和2mM DTT(Life Technologies，P2325)。激酶LRRK2G2019S蛋白(PV4881)和ERM(LRRKtide，PV5093)源自Life Technologies。AdaptaTM通用激酶测定试剂盒(Life Technologies，PV5099)包含以下组分：AdaptaTMEu-抗-ADP抗体(PV5097；4μg)；10μM 
647ADP示踪剂(PV5098；200pmol)；TR-FRET稀释缓冲液(PV3574；100ml)；激酶淬灭缓冲液(P2825；1ml)；10mM ATP(PV3227；500μl)；和10mM ADP(PV5096；500μl)。LRRK2-IN-1(1234480-84-2，HY-10875)源自MedChem Express。
在
激酶测定法(JAK2_IC50选择性测定)中：JAK2(Invitrogen，目录号PV4288)，ATP(Sigma，目录号A7699-1g)，DMSO(Sigma，目录号D2650)，DTT(Sigma，目录号43815)，LANCE Ultra ULightTM-JAK-1肽(Perkin Elmer，目录号TRF0121)，LANCE Eu-W1024抗磷酸酪氨酸(PT66)(Perkin Elmer，目录号AD0069)，LANCETM检测缓冲液(Perkin Elmer，目录号CR97-100)，Tofacitinib(PharmaBlock Sciences(Nanjing)，Inc,目录号PBN2011586-01)；设备：Envision(Perkin Elmer)，Bravo(Agilent)；消耗品：384孔中间板(Greiner，目录号781280)，384孔测定板(Perkin Elmer，目录号6007299)，
在果蝇模型中：抗LRRK2(phospho S935)抗体[UDD2 10(12)](ab133450)源自Abcam。ddc-GAL4源自苏州大学医学系。
AdaptaTM激酶试验方法
在室温(～21℃)下进行所有测定，并且在所用条件下该测定与时间和酶浓度呈线性关系。由5×激酶缓冲液S储存液(以上列出的)制备1×激酶反应缓冲液溶液，通过向8mlH2O中加入2ml 5×储存液来制备10ml的1×激酶反应缓冲液。将20μl的1M DTT加入至此1×激酶反应缓冲液中。
在低容量384孔板中以10μl体积进行激酶反应。通常，使用Greiner板(目录#3674#，低容量，白壁，784075)。未经测试的其它未经处理的测定板也可能是合适的。这种测定中的底物浓度为100μM，且1×激酶反应缓冲液由50mM Tris-HCl pH8.5、10mM MgCl2、1mMEGTA、0.01％Brij-35和2mM DTT，以及任何其它的可能是特定激酶所必需的添加剂。允许激酶反应在室温下进行1小时，随后添加5μl的TR-FRET稀释缓冲液中的激酶淬灭缓冲液(EDTA；30mM)、Eu标记的抗体(6nM)和示踪剂(18.9nM)的制剂。测定孔中的抗体的最终浓度为2nM，示踪剂为6.3nM且EDTA为10mM。允许板在室温下平衡至少30分钟，随后在配置用于AdaptaTM TR-FRET的平板读取仪上读取。
使用BMG LABTECH PHERAstar平板读取仪，使用用于AdaptaTM的适当滤波器和仪器设置产生本文档中提供的数据。在孔中以1％DMSO(最终)筛选测试化合物。对于8点滴定，从起始浓度进行5次连续稀释。
该测定法涉及两个步骤，酶促步骤和用HTRF试剂进行的检测步骤。步骤1：在酶促步骤期间，将底物生物素与感兴趣的激酶一起孵育。加入ATP，开始反应。步骤2：检测试剂捕获磷酸化底物，所得TR-FRET与磷酸化水平成比例。
化合物制备：将测试化合物溶解于30mM DMSO溶液中，并在室温下将此溶液放入氮气罩中长期储存；以3倍系数，总共11种浓度，稀释DMSO中的30mM化合物；吸出1μl化合物，随后用激酶缓冲液将该化合物稀释25倍。混合均匀，室温下平衡30分钟。
激酶反应：通过Agilent Bravo，将2.5μl激酶缓冲液(4x)中的化合物转移到测定板中。旋转板；通过使用Eppendorf电子多通道移液器，将5μl酶混合物转移到测定板中。旋转板；在室温(23℃)下孵育测定板20分钟；通过使用Multidrop，将2.5μl的含有ATP的激酶缓冲液加入至测定板中。旋转并密封板；在室温(23℃)下孵育测定板90分钟。
停止反应：使用Eppendorf电子多通道移液器，将10μl检测试剂(2nM LANCE Eu-W1024抗磷酸酪氨酸)转移至测定板中。旋转并密封板；在室温(23℃)下孵育测定板60分钟。
检测和读取：激发波长为340nm，初次发射波长为615nm，二次发射波长为665nm(分别用于Cryptate和Ulight)。用EnVision读板，得到两个波长的读数；计算665nm/615nm的比率。
使用XLfit(IDBS Inc.)软件，获得IC50估计值。
果蝇模型筛选方法
果蝇模型用于在体内评价实例。由Andrea Brand和Norbert Perrimon于1993年开发的GAL4/UAS系统[45]用于产生表达多巴胺(DA)神经元中的LRRK2-G2019S的转基因果蝇。该系统有两个部分：编码酵母转录激活蛋白GAL4的GAL4基因和GAL4特异性结合激活基因转录的增强子UAS(上游激活序列)。该系统利用了与UAS特异性结合的酵母GAL4转录因子。将UAS-野生型-LRRK2和UAS-G2019S-LRRK2转基因与多巴脱羧酶(ddc)-GAL4驱动子[46]组合，以表达DA神经元中的LRRK2-G2019S。10μM的GW5074用于阳性对照。阴性对照组为DMSO对照(所有化合物以1:1000稀释溶解于DMSO中)。在12小时光照12小时黑暗循环中将果蝇保持在25℃。GW5074用作为阳性对照[47]。
存活率
收集二十只最新封闭的雌性果蝇，并将其放入食物小瓶中。每隔一天将果蝇转移到新鲜的食物小瓶中，此时记录死亡。
基于果蝇的生存曲线，50％存活时间参数表示存活一半果蝇的时间，并且将此参数用于比较不同组之间的存活率。基于每组的4个独立实验，计算平均50％存活时间和标准误差。通过GraphPad 
6.0软件分析数据。
攀爬试验(Climbing Assay)
负趋地性测定用于分析果蝇的运动能力。让每小瓶的二十只果蝇(每组四只小瓶)每周进行一次攀爬试验。
将待测试的果蝇转移至垂直塑料管(15cm高，1.5cm的直径)中。在室温下静置30分钟后，将果蝇轻轻敲打至管底，计数10秒内可以爬至或高于测试线的果蝇数目，并且计算百分比。
基于每个小瓶的三次独立实验分析攀爬能力，并通过GraphPad 
6.0软件分析数据。
在第6周进行的激酶试验
在冰上将成体果蝇头均质化，在具有ATP和DTT的激酶反应缓冲液中进行脑裂解物的激酶反应。
随后，通过12％SDS-PAGE凝胶，使裂解物进行电泳，并转移到PVDF膜(Millipore)。在室温下，在具有5％脱脂乳的TBST中封闭该膜1小时，随后在4℃下在抗LRRK2pSer935抗体(Abcam，ab133450)和抗Flag抗体中孵育过夜。
用HRP缀合的二抗和ECL检测试剂检测蛋白质。通过Image J软件分析免疫印迹的光密度，并计算磷酸化LRRK2蛋白相比于Flag蛋白的比率，并通过GraphPad 
6.0软件分析数据。
激酶选择性试验方法
1.MKK1试验
这是一种两步测定法，其中在25.5μl的含有25mM Tris、0.1mM EGTA、0.01％Brij35、10mM乙酸镁和0.005mM ATP中，无活性的MAPK(0.06mg/ml)被MKK1(稀释于25mMTris、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.01％Brij35、1mg/ml BSA中)激活。在室温下孵育30分钟后，从第一次反应移液5μl至20μl的含有(终浓度)25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.66mg/ml髓鞘碱性蛋白(MBP)、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的第二反应混合物中，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集至P81Unifilter板上。
2.MAPK2/ERK2试验。
在25.5μl终体积的25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，测定针对于MBP的MAPK/ERK2(5–20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集至P81Unifilter板中。
3.JNK1a1/SAPK1c试验。
在25.5μl终体积的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，测定针对于ATF2(激活转录因子)的JNK1a1/SAPK1c(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
4.SAPK 2a/p38试验。
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的SAPK 2a/p38(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1％b-巯基乙醇、1mg/mlBSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
5.SAPK 2b/p38β2试验。
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的SAPK2b/p38β2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1％b-巯基乙醇、1mg/mlBSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
6.SAPK 3/p38g试验。
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的SAPK 3/p38g(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1％b-巯基乙醇、1mg/mlBSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
7.SAPK 
试验。
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的SAPK 4/p38d(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1％b-巯基乙醇、1mg/mlBSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
8.MAPKAP-K1a试验。
在含有50mM Na-b-甘油磷酸盐pH 7.5、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKLNRTLSVA的MAPKAP-K1a(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育40分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
9.MAPKAP-K2试验。
在含有50mM Na-b-甘油磷酸盐pH 7.5、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKLNRTLSVA的MAPKAP-K2(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
10.MSK1试验。
在含有8mM MOPS pH7.0、0.2mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于经修饰的Crosstide肽GRPRTSSFAEGKK的MSK1(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
11.PRAK试验。
在含有50mM b-甘油磷酸钠pH 7.5、0.1mM EGTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKLRRTLSVA的PRAK(5-20mU，稀释于50mM b-甘油磷酸钠pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/mlBSA)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
12.PKA试验。
在含有8mM MOPS pH 7.5、0.2mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于肯普肽(LRRASLG)的PKA(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、0.1％b-巯基乙醇、1mg/mlBSA)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
13.PKCa试验。
在磷脂酰丝氨酸(PtdSerine)和DAG(0.1mg/ml和10μg/ml)以及0.1mM CaCl2存在下，测定针对于组蛋白H1的PKCa(5-20mU，稀释于20mM Hepes pH 7.4，0.03％Triton X-100中)。该测定在25.5μl终体积中进行，该体积含有20mM Hepes pH 7.4、0.03％Triton X-100、0.1mg/ml组蛋白H1、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板中。
制备PtdSer/DAG：-在MeOH/氯仿(1:2)中的PtdSer原料＝10mg/ml。干燥所需量。重悬于适当体积的10mM Hepes pH 7.4中。涡旋并短暂地超声。(2×10-15秒，间隔10-15秒)。在MeOH/氯仿(1:2)中的DAG原料＝10mg/ml。干燥所需量。添加经超声的PtdSer溶液。进行涡旋和超声。
14.PDK1试验。
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％％b-巯基乙醇、100μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于PDKtide(KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQ-EMFRDFDYIADWC)的PDK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.05％％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
15.ΔPH-PKBa-S473D试验。
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于经修饰的Crosstide肽GRPRTSSFAEGKK的ΔPH-PKBa-S473D(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mMEGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
16.SGK试验。
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于经修饰的Crosstide肽GRPRTSSFAEGKK的SGK(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
17.S6K1/P70S6K试验。
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、0.1mM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKRNRTLTV)的S6K1/P70S6K(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
18.GSK3b试验。
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、20μM磷酸化GS2肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于磷酸化GS2肽(YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(PO4)EDEEE)的GSK3b(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH7.5、1mMEDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
19.ROCK-II(ROKa)试验。
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、30μM Long S6底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Long S6底物肽(KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK)的ROCK-II(ROKa)(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
20.AMPK试验。
在含有50mM Hepes pH 7.5、1mM DTT、0.02％Brij35、0.4mM SAMS肽、0.196mMAMP、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于SAMS底物肽(HMRSAMSGLHLVKRR)的AMPK(5-20mU，稀释于50mM Hepes pH 7.5、1mM DTT、0.02％Brij35中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
21.CHK1试验。
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、200μM CHKtide、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于CHKtide底物肽(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR)的CHK1(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.1％b-巯基乙醇、0.01％Brij-35、5％甘油、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
22.CK2试验。
在含有20mM Hepes pH 7.5、0.15M NaCl、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.1％Triton-X100、CKII肽(0.165mM)、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于CKII肽(RRRDDDSDDD)的CK2(5-20mU，稀释于20mM Hepes pH7.5、0.15M NaCl、0.1mM EGTA、0.1％Triton X-100、5mM DTT、50％甘油中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
23.PBK试验。
在含有50mM Tris pH 8.6、50mMb-甘油磷酸钠、0.04mM CaCl2、磷酸化b肽(0.196mM)、10mM乙酸镁、0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于磷酸化b肽(KRKQISVRGL)的PBK(5-20mU，稀释于50mMb-甘油磷酸钠pH7.0、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育15分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
24.LCK试验。
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3Vo4、Cdc2肽(0.25mM)、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Cdc2肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的LCK(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育15分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
25.CSK试验。
在含有8mM MOPS pH7.0、0.2mM EDTA、Cdc2肽(0.25mM)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Cdc2肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的CSK(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
26.CDK2/周期蛋白A试验。
在含有50mM Hepes pH7.5、1mM DTT、0.02％Brij35、100mM NaCl、组蛋白H1(1mg/ml)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于组蛋白H1的CDK2/周期蛋白A(5-20mU，稀释于50mM Hepes pH 7.5、1mM DTT、0.02％Brij35、100mM NaCl中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
27.DYRK 1A试验。
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、350μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Woodtide的DYRK1A(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
28.CK1试验。
在含有20mM Hepes pH 7.5、0.15M NaCl、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.1％Triton-X100、CKI肽(0.5mM)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于CKI肽(RRKDLHDDEEDEAMSITA)的CK1(5-20mU，稀释于20mM HepespH7.5、0.15M NaCl、0.1mM EGTA、0.1％Triton X-100、5mM DTT、50％甘油中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
29.NEK6试验。
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.01％Brij、0.1％b-巯基乙醇、NEK6肽(0.3mM)、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于NEK6肽(FLAKSFGSPNRAYKK)的NEK6(5-20mU，稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mMEGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
30.NEK2a试验。
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.01％Brij、0.1％b-巯基乙醇、300μMNEK2a肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于NEK2a肽(RFRRSRRMI)的5-20mU的NEK2a(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
31.MAPKAP-K1b/RSK2试验。
在含有50mM b-甘油磷酸钠(pH 7.5)、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKLNRTLSVA)的MAPKAP-K1b(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
32.IKKb试验。
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(LDDRHDSGLDSMKDEEY)的5-20mU的IKKb(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/mlBSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
33.smMLCK试验
在含有50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA、5mM CaCl2、10μM钙调素、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKRPQRATSNVFA)的5-20mU的smMLCK(稀释于50mM Hepes(pH7.5)、0.1mM EGTA、1mg/mlBSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
34.PRK2试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、30μM Long S6肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Long S6肽(KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK)的5-20mU的PRK2(稀释于50mM Tris(pH7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
35.MNK2ɑ试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.5mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(eIF4E)的5-20mU的MNK2(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
36.CAMK-1试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM钙调素、0.1％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(YLRRRLSDSNF)的5-20mU的CAMK-1(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
37.PIM2试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM钙调素、0.1％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RSRHSSYPAGT)的5-20mU的PIM2(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
38.NEK7试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.01％Brij、0.1％b-巯基乙醇、底物肽(0.3mM)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(FLAKSFGSPNRAYKK)的NEK7(5-20mU，稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mMEGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，且用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
39.JNK3ɑ1试验
在25.5μl终体积的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，测定针对于ATF2(激活转录因子)的JNK3ɑ1(5-20mU，稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
40.MAPKAP-K3试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKLNRTLSVA)的5-20mU的MAPKAP-K3(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/mlBSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
41.ERK8试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的ERK8(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
42.MNK1试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.5mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(eIF4E)的5-20mU的MNK1(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
43.SRPK1试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RSRSRSRSRSRSRSR)的5-20mU的SRPK1(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/mlBSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
44.ΔPH-PKBβ(S474D)试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于经修饰的Crosstide肽(GRPRTSSFAEGKK)的ΔPH-PKBβ-S474D(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
45.Aurora B试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG)的Aurora B(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mMEGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
46.CHK2试验
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、200μM CHKtide、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于CHKtide底物肽(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR)的CHK2(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.1％b-巯基乙醇、0.01％Brij-35、5％甘油、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
47.Src试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的Src(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
48.EF2K试验
在含有50mM Hepes pH 6.6、0.2mM CaCl2、0.3μM钙调素、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RKKFGESKTKTKEFL)的EF2K(5-20mU，稀释于50mM Hepes pH 6.6、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
49.MARK3试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于CHKtide底物(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR)的MARK3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
50.MST2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的MST2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、100μM钒酸盐中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
51.PKD1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKLNRTLSVA)的PKD1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
52.PLK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、10μM钒酸盐、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(ISDELMDATFADQEAKKK)的PLK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA、100μM钒酸盐中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
53.DYRK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、350μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Woodtide(KKISGRLSPIMTEQ)的DYRK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
54.JNK2试验
在25.5μl终体积的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，测定针对于ATF2(激活转录因子)的JNK2 1(5-20mU，稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
55.DYRK3试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、350μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于Woodtide(KKISGRLSPIMTEQ)的DYRK3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
56.HIPK2试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的HIPK2(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
57.HIPK3试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的HIPK3(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
58.PAK4试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RRRLSFAEPG)的PAK4(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
59.PAK5(PAK7)试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RRRLSFAEPG)的PAK5(PAK7)(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
60.PAK6试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RRRLSFAEPG)的PAK6(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
61.CAMKKa试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM钙调素、0.1％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(AKPKGNKDYHLQTCCGSLAYRRR)的5-20mU的CAMKKa(稀释于50mMTris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
62.CAMKKb试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM钙调素、0.1％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(DGEFLRTSCGSPNYAARRR)的5-20mU的CAMKKb(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
63.PIM1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RSRHSSYPAGT)的PIM1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
64.PIM3试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RSRHSSYPAGT)的PIM3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
65.PLK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、10μM钒酸盐、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(ISDELMDATFADQEAKKK)的PLK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA、100μM钒酸盐中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
66.BRSK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKLNRTLSFAEPG)的BRSK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
67.MELK试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、200μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKLNRTLSFAEPG)的MELK(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
68.PKCζ试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、10μM钒酸盐、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(ERMRPRKRQGSVRRRV)的PKCζ(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA、100μM钒酸盐中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
69.Aurora C试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05％b-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG)的Aurora C(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mMEGTA、0.1％b-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
70.ERK1试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1％b-巯基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的ERK1(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％b-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
71.FGF-R1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的FGF-R1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
72.IRR试验
在含有50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的IRR(稀释于50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
73.EPH-A2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-A2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
74.MST4试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的MST4(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
75.SYK试验
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的SYK(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
76.YES1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的YES1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
77.IGF-1R试验
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKKSPGEYVNIEFG)的IGF-1R(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
78.VEG-FR试验
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKKSPGEYVNIEFG)的VEG-FR(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
79.BTK试验
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的BTK(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
80.IR-HIS试验
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKSRGDYMTMQIG)的IR-HIS(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
81.EPH-B3试验
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-B3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
82.TBK1(DU12569)试验
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE)的TBK1(DU12569)(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
83.IKKepsilon(DU14231)试验
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的5-20mU的IKKepsilon(DU14231)(稀释于50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定。使用50mM正磷酸的洗涤缓冲液将测定液收集到P81Unifilter板上。
84.GCK试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的GCK(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
85.IRAK4试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的IRAK4(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
86.NUAK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM ALNRTSSDSALHRRR、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于ALNRTSSDSALHRRR的NUAK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
87.MLK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的MLK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
88.MINK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的MINK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
89.MLK3试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的MLK3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
90.LKB1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.2mM LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR的LKB1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
91.HER4试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml聚Glut Tyr、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于聚Glut Tyr的HER4(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
92.TTK试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM RSRSRSRSRSRSRSR、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于RSRSRSRSRSRSRSR的TTK(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
93.RIPK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的RIPK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
94.Aurora A试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG的Aurora A(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mMEGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
95.PAK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM RRRLSFAEPG、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于RRRLSFAEPG的PAK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
96.BRSK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKLNRTLSFAEPG、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKLNRTLSFAEPG的BRSK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
97.HIPK3试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的HIPK3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
98.HIPK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的HIPK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
99.JNK3α1试验
在25.5μl终体积的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](500-1000cpm/pmole)中，测定针对于ATF2(激活转录因子)的JNK3(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1％β-巯基乙醇中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
100.MAPKAP-K3试验
在含有50mMβ-甘油磷酸钠pH 7.5、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKLNRTLSVA的MAPKAP-K3(5-20mU，稀释于20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01％Brij35、5％甘油、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
101.MARK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的MARK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
102.MARK4试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的MARK4(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
103.EPH-B4试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚GlutTyr)的EPH-B4(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
104.JAK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.05％β-巯基乙醇、100μM底物肽、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于PDKtide(KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQ-EMFRDFDYIADWC)的JAK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA、0.05％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
105.EPH-A4试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-A4(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
106.TAK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸镁、0.5mM MnCl和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RLGRDKYKTLRQIRQ)的TAK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
107.TrkA试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的TrkA(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
108.MEKK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于MBP的MEKK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
109.MARK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的MARK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
110.CLK2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.3mM肽、10mM DTT、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(RNRYRDVSPFDHSR)的CLK2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
111.DAPK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.3mM肽、10mM DTT、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(KKLNRTLSFAEPG)的DAPK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
112.EPH-B2试验
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-B2(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
113.TSSK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸镁和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的TSSK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA、10mM DTT中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
114.TESK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.2mg/ml肌动蛋白素2、10mM乙酸镁和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于肌动蛋白素2的TESK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA、10MM DTT中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
115.TTBK1试验
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM RRKDLHDDEEDEAMSITA、10mM乙酸镁和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl终体积中，测定针对于RRKDLHDDEEDEAMSITA的TTBK1(5-20mU，稀释于50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％β-巯基乙醇、1mg/ml BSA、10mM DTT中)，并在室温下孵育30分钟。通过加入5μl的0.5M(3％)正磷酸来停止测定，随后用50mM正磷酸的洗涤缓冲液收集到P81Unifilter板上。
LRRK2活性
下表示出了以本发明实施例抑制LRRK2G2019S的IC50值。
表实施例的LRRK2_IC50值
JAK2选择性
下表示出了本发明实施例的JAK2IC50值。
表实施例的JAK2_IC50值
果蝇模型的活性
存活率
下表示出了本发明实施例的存活率。
| 实施例 | 存活率 |
| 29 | * |
| 58 | ** |
**P<0.01，与DMSO阴性对照相比；
*P<0.05，与DMSO阴性对照相比。
攀爬试验
下表示出了本发明实施例的攀爬测定。
**P<0.01，与DMSO阴性对照相比；
*P<0.05，与DMSO阴性对照相比；
在第6周进行的激酶试验
下表示出了本发明实施例的激酶测定结果。
*P<0.05，与DMSO阴性对照相比。
激酶选择性数据
代表性化合物的激酶选择性数据如下表所示。以1μM抑制剂浓度下的每种特异性激酶的抑制百分比表示值。
表代表性化合物的激酶选择性数据
在不脱离本发明的范围和精神下，本发明描述方面的各种修改和变体对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施方式。实际上，实施本发明的所描述的模式的各种修改，这种修改对于相关领域的技术人员是显而易见的，意图在所附权利要求的范围内。
参考文献
1.Lees AJ,Hardy J,Revesz T(2009)Parkinson's disease.Lancet 373:2055-2066.
2.Nalls MA,Pankratz N,Lill CM,Do CB,Hernandez DG,等人(2014)Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new riskloci for Parkinson's disease.Nat Genet 46:989-993.
3.Simon-Sanchez J,Schulte C,Bras JM,Sharma M,Gibbs JR,等人(2009)Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson'sdisease.Nat Genet 41:1308-1312.
4.Satake W,Nakabayashi Y,Mizuta I,Hirota Y,Ito C,等人(2009)Genome-wide association study identifies common variants at four loci as geneticrisk factors for Parkinson's disease.Nat Genet 41:1303-1307.
5.Rudenko IN,Cookson MR(2014)Heterogeneity of leucine-rich repeatkinase 2mutations:genetics,mechanisms and therapeuticimplications.Neurotherapeutics 11:738-750.
6.Fonzo A,Wu-Chou Y-H,Lu C-S,Doeselaar M,Simons EJ,等人(2006)A commonmissense variant in the LRRK2gene,Gly2385Arg,associated with Parkinson’sdisease risk in Taiwan.Neurogenetics 7:133-138.
7.Farrer MJ,Stone JT,Lin CH,Dachsel JC,Hulihan MM,等人(2007)Lrrk2G2385R is an ancestral risk factor for Parkinson's disease inAsia.Parkinsonism Relat Disord 13:89-92.
8.West AB,Moore DJ,Biskup S,Bugayenko A,Smith WW,等人(2005)From TheCover:Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase2augment kinase activity.Proceedings of the National Academy of Sciences 102:16842-16847.
9.Khan NL,Jain S,Lynch JM,Pavese N,Abou-Sleiman P,等人(2005)Mutationsin the gene LRRK2encoding dardarin(PARK8)cause familial Parkinson's disease:clinical,pathological,olfactory and functional imaging and geneticdata.Brain.
10.Kachergus J,Mata IF,Hulihan M,Taylor JP,Lincoln S,等人(2005)Identification of a Novel LRRK2Mutation Linked to Autosomal DominantParkinsonism:Evidence of a Common Founder across European Populations.TheAmerican Journal of Human Genetics 76:672-680.
11.Ozelius LJ,Senthil G,Saunders-Pullman R,Ohmann E,Deligtisch A,等人(2006)LRRK2G2019S as a Cause of Parkinson's Disease in Ashkenazi Jews.NewEngland Journal of Medicine 354:424-425.
12.Jaleel M,Nichols RJ,Deak M,Campbell David G,Gillardon F,等人(2007)LRRK2phosphorylates moesin at threonine-558:characterization of howParkinson's disease mutants affect kinase activity.Biochemical Journal 405:307-317.
13.Ishihara L,Gibson RA,Warren L,Amouri R,Lyons K,等人(2007)Screeningfor Lrrk2G2019S and clinical comparison of Tunisian and North AmericanCaucasian Parkinson's disease families.Movement Disorders 22:55-61.
14.Tan,E.K.(2006)Identification of a common genetic risk variant(LRRK2Gly2385Arg)in Parkinson's disease.Ann Acad Med Singapore.35:840-842.
15.Ross OA,Wu Y-R,Lee M-C,Funayama M,Chen M-L,等人(2008)Analysis ofLrrk2R1628P as a risk factor for Parkinson's disease.Annals of Neurology 64:88-92.
16.Ross OA,Soto-Ortolaza AI,Heckman MG,Aasly JO,Abahuni N,等人(2011)Association of LRRK2exonic variants with susceptibility to Parkinson'sdisease:a case–control study.The Lancet Neurology 10:898-908.
17.Paisán-
C,Jain S,Evans EW,Gilks WP,Simón J,等人(2004)Cloning ofthe Gene Containing Mutations that Cause PARK8-Linked Parkinson'sDisease.Neuron 44:595-600.
18.Zimprich A,Biskup S,Leitner P,Lichtner P,Farrer M,等人(2004)Mutations in LRRK2Cause Autosomal-Dominant Parkinsonism with PleomorphicPathology.Neuron 44:601-607.
19.Agalliu I,San Luciano M,Mirelman A,等人(2015)Higher frequency ofcertain cancers in lrrk2g2019s mutation carriers with parkinson disease:Apooled analysis.JAMA Neurology 72:58-65.
20.Singleton AB,Farrer MJ,Bonifati V(2013)The genetics of Parkinson'sdisease:Progress and therapeutic implications.Movement Disorders 28:14-23.
21.Jostins L,Ripke S,Weersma RK,Duerr RH,McGovern DP,等人(2012)Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatorybowel disease.Nature 491:119-124.
22.Marcinek P,Jha AN,Shinde V,Sundaramoorthy A,Rajkumar R,等人(2013)LRRK2and RIPK2Variants in the NOD 2-Mediated Signaling Pathway Are Associatedwith Susceptibility to Mycobacterium leprae in Indian Populations.Plos One 8:e73103.
23.Marín I(2006)The Parkinson Disease Gene LRRK2:Evolutionary andStructural Insights.Molecular Biology and Evolution 23:2423-2433.
24.Rudenko IN,Kaganovich A,Hauser DN,Beylina A,Chia R,等人(2012)TheG2385R variant of leucine-rich repeat kinase 2associated with Parkinson'sdisease is a partial loss-of-function mutation.Biochemical Journal 446:99-111.
25.Mata IF,Wedemeyer WJ,Farrer MJ,Taylor JP,Gallo KA(2006)LRRK2inParkinson's disease:protein domains and functional insights.Trends inNeurosciences 29:286-293.
26.Taylor JP,Mata IF,Farrer MJ(2006)LRRK2:a common pathway forparkinsonism,pathogenesis and prevention？Trends in Molecular Medicine 12:76-82.
27.Greggio E,Jain S,Kingsbury A,Bandopadhyay R,Lewis P,等人(2006)Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin.Neurobiology of Disease 23:329-341.
28.Heo HY,Park J-M,Kim C-H,Han BS,Kim K-S,等人(2010)LRRK2enhancesoxidative stress-induced neurotoxicity via its kinase activity.ExperimentalCell Research 316:649-656.
29.Reinhardt P,Schmid B,Burbulla Lena F,
David C,Wagner L,等人(2013)Genetic Correction of a LRRK2Mutation in Human iPSCs LinksParkinsonian Neurodegeneration to ERK-Dependent Changes in GeneExpression.Cell Stem Cell 12:354-367.
30.Sanders LH,Laganière J,Cooper O,Mak SK,Vu BJ,等人(2014)LRRK2mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cellsfrom Parkinson's disease patients:Reversal by gene correction.Neurobiology ofDisease 62:381-386.
31.Manzoni C,Lewis PA(2013)Dysfunction of the autophagy/lysosomaldegradation pathway is a shared feature of the genetic synucleinopathies.TheFASEB Journal 27:3424-3429.
32.Orenstein SJ,Kuo S-H,Tasset I,Arias E,Koga H,等人(2013)Interplayof LRRK2with chaperone-mediated autophagy.Nat Neurosci 16:394-406.
33.Manzoni C,Mamais A,Dihanich S,Abeti R,Soutar MPM,等人(2013)Inhibition of LRRK2kinase activity stimulates macroautophagy.Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research 1833:2900-2910.
34.Swan M,Saunders-Pullman R(2013)The Association Betweenβ-Glucocerebrosidase Mutations and Parkinsonism.Current Neurology andNeuroscience Reports 13:1-10.
35.Li L,Zhang X,Le W(2010)Autophagy Dysfunction in Alzheimer’sDisease.Neurodegenerative Diseases 7:265-271.
36.Nixon RA(2013)The role of autophagy in neurodegenerativedisease.Nat Med 19:983-997.
37.Westbroek W,Gustafson AM,Sidransky E(2011)Exploring the linkbetween glucocerebrosidase mutations and parkinsonism.Trends in MolecularMedicine 17:485-493.
38.Reddy JV,Ganley IG,Pfeffer SR(2006)Clues to Neuro-Degeneration inNiemann-Pick Type C Disease from Global Gene Expression Profiling.Plos One 1:e19.-supporting information Dataset S1
39.Kawakami F,Yabata T,Ohta E,Maekawa T,Shimada N,等人(2012)LRRK2Phosphorylates Tubulin-Associated Tau but Not the Free Molecule:LRRK2-Mediated Regulation of the Tau-Tubulin Association and Neurite Outgrowth.PlosOne 7:e30834.
40.Taymans J-M,Cookson MR(2010)Mechanisms in dominant parkinsonism:The toxic triangle of LRRK2,α-synuclein,and tau.BioEssays 32:227-235.
41.Bailey RM,Covy JP,Melrose HL,Rousseau L,Watkinson R,等人(2013)LRRK2phosphorylates novel tau epitopes and promotes tauopathy.ActaNeuropathologica 126:809-827.
42.Li Y,Liu W,Oo TF,Wang L,Tang Y,等人(2009)Mutant LRRK2R1441g BACtransgenic mice recapitulate cardinal features of Parkinson's disease.NatNeurosci 12:826-828.
43.Goedert M,Jakes R(2005)Mutations causing neurodegenerativetauopathies.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease1739:240-250.
44.Rothman RB,Blough BE,Baumann MH(2008)Dopamine/serotonin releasersas medications for stimulant addictions.In:Giuseppe Di Giovann VDM,Ennio E,editors.Progress in Brain Research:Elsevier.pp.385-406.
45.Brand AH,Perrimon N(1993)Targeted gene expression as a means ofaltering cell fates and generating dominant phenotypes.Development 118:401-415.
46.Liu Z,Wang X,Yu Y,Li X,Wang T,等人(2008)A Drosophila model forLRRK2-linked parkinsonism.Proceedings of the National Academy of Sciences105:2693-2698.
47.Liu Z,Hamamichi S,Dae Lee B,Yang D,Ray A,等人(2011)Inhibitors ofLRRK2kinase attenuate neurodegeneration and Parkinson-like phenotypes inCaenorhabditis elegans and Drosophila Parkinson's disease models.HumanMolecular Genetics 20:3933-3942.
Claims (11)
1.一种通式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐：
其中：
V是N；
W是N；
R1选自以下基团：
Y选自以下基团：
X1是-(CH2)n-；
Z是-(CH2)n-；
n是1、2或3。
2.一种化合物，其中所述化合物具有以下结构之一或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐：
3.一种包含根据权利要求1或2所述的化合物的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，进一步地包含药学上可接受的辅料或其组合。
5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，进一步地包含第二治疗剂。
6.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3至5中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗由与LRRK激酶相关的癌症和神经退行性疾病中的至少一种引起的病症。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述神经退行性疾病是帕金森病。
8.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3至5中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗由LRRK激酶活性异常引起的、与之相关或伴随的病症。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述LRRK激酶是LRRK2激酶。
10.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3至5中任一项所述的药物组合物在试验中的用途，所述试验用于鉴定能够抑制LRRK激酶的另外候选化合物。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述LRRK激酶是LRRK2激酶。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN102428084A (zh) * | 2009-03-19 | 2012-04-25 | 医疗技术研究局 | 化合物 |
| CN103261196A (zh) * | 2010-09-22 | 2013-08-21 | 医疗技术研究局 | 作为激酶lrrk2抑制剂的吡唑并吡啶 |
| WO2013139882A1 (en) * | 2012-03-21 | 2013-09-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Pyrazolopyridines for treatment of parkinsons disease |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| synthesis and cytotoxicity of potential anticancer dericatives of pyrazaolo[3,4,5-kl]acridine and indolo[2,3-a]acridine;Xianyong Bu et al.;《Tetrahedron》;20021231;第58卷;第175-181页，第176页Scheme 1 * |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Room A3-212, 218 Xinghu Street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant after: SUZHOU YABAO DRUG RESEARCH & DEVELOPMENT CO., LTD. Applicant after: Aike life Address before: Room 215123, Room A3-212, 218 Xinghu Street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant before: SUZHOU YABAO DRUG RESEARCH & DEVELOPMENT CO., LTD. Applicant before: Department of Science and Technology, National Institutes of Medicine, UK |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1260037 Country of ref document: HK |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: Unit 801, building B7, bio nano Park, No. 218, Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Patentee after: SUZHOU YABAO PHARMACEUTICAL R&D Co.,Ltd. Patentee after: Life AGCO Address before: Room 215123, Room A3-212, 218 Xinghu Street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Patentee before: SUZHOU YABAO PHARMACEUTICAL R&D Co.,Ltd. Patentee before: Life AGCO |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder |