TWI659955B - 取代的三環雜環化合物及其用途 - Google Patents

取代的三環雜環化合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI659955B
TWI659955B TW106119751A TW106119751A TWI659955B TW I659955 B TWI659955 B TW I659955B TW 106119751 A TW106119751 A TW 106119751A TW 106119751 A TW106119751 A TW 106119751A TW I659955 B TWI659955 B TW I659955B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
alkyl
assay
compound
heteroaryl
orthophosphoric acid
Prior art date
Application number
TW106119751A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201800411A (zh
Inventor
岩 夏
愛德華‧賈爾斯 麥卡弗
宋陽
徐元元
朱琳
褚純雋
吳玲
劉淼
賈斯丁‧史蒂文 布萊恩斯
Original Assignee
大陸商蘇州亞寶藥物研發有限公司
英商生命弧公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商蘇州亞寶藥物研發有限公司, 英商生命弧公司 filed Critical 大陸商蘇州亞寶藥物研發有限公司
Publication of TW201800411A publication Critical patent/TW201800411A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI659955B publication Critical patent/TWI659955B/zh

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

提供了通式I的取代的三環雜環化合物或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、溶劑合物、代謝物、藥學上可接受的鹽、酯或前藥，包含上述結構的藥物組合物和它們的用途。取代的三環雜環化合物和包含本文揭露的化合物的藥物組合物可用於治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症。此外，這種化合物和包含本文揭露的化合物的藥物組合物還可用於預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症。

Description

取代的三環雜環化合物及其用途
相關申請的交叉引用
本申請要求於2016年6月15日向國家智慧財產權局提交的申請號為PCT/CN2016/085811的國際專利申請的優先權和權益，通過引用將其全部內容併入本文。
本發明屬於製藥技術領域，更具體地涉及化合物、包括其組合物和二者用於治療由癌症和神經退行性疾病引起的病症的用途。特別地，本文提供了能夠抑制一種以上的激酶，特別是LRRK，更特別是LRRK2的取代的三環雜環化合物。
抗帕金森氏病(PD)是第二常見的神經退行性疾病，影響1-2%的老年人群[1]。全基因組關聯分析(GWAS)，非家族性PD的24個位點具有28種PD相關的遺傳風險變異[2]。其中，發現LRRK2(Park8)中的突變也具有遺傳形式，此確定了其成為家族性和非家族性PD驅動發病機制中的共通分子途徑，進而LRRK2突變成為最常見的病因[3,4]。PD致病性LRRK2突變圖中主要為激酶(G2019S，I2020T)和ROC-COR結構域(R1441C/G/H，Y1699C)相關的突 變，提示這些酶活性變化對發病機制至關重要[5]。這些致病性突變的概率在所有PD患者中屬於比較少見的，約占2%左右[6,7]，然而在某些種族人群中，發現有高達40%的患者攜帶突變G2019S，使其成為LRRK2中最常見突變，該突變可以使LRRK2激酶活性提升至原來的2至3倍[8-13]。除了致病性突變外，普通的LRRK2變異也是散發性PD(即，非家族性PD)的危險因素[14-16]。
2004年，Lrrk2被確定為Park8基因座相關遺傳致病PD的重要因素[17,18]，Lrrk2由51個外顯子組成，編碼產生較大的(268kDa)蛋白質。隨後，確定了Lrrk2一級結構中的許多變體，其中有同樣出現在散發性PD中的區分家族性PD的顯性突變，以及增加散發性PD病程發展的終生風險的LRRK2基因座的多態性[20-22]。
LRRK2是一種核心包含兩種酶功能的多結構域蛋白。GTP酶位於Roc(Ras樣結構域)，其末端連接間隔域COR(即Roc的C-末端)，隨即連絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。核心酶功能周圍包圍著處於LRRK2 N-端的由錨蛋白(ANK)、和富含亮氨酸重複(LRR)結構域組成的發揮蛋白質-蛋白質相互作用的結構域[23]。LRRK2 C末端含有WD40結構域，這被認為是蛋白質折疊所必需的，從而控制LRRK2功能和激酶活性[24]。有趣的是，迄今為止描述的主要的致病性突變多發生在LRRK2的酶核心內，表明LRRK2活性的改變極大地影響了PD的發病和進展。
迄今為止，有近40種單一氨基酸取代突變與常染色體顯性PD有關[25,26]。占歐洲家族性PD約6%以及占散發性PD病例3%的LRRK2最常見的突變為Gly2019對Ser殘基的氨基酸取代。Gly2019位於保守的DYG-Mg2+-結合基序內，在激酶結構域的子結構域-VII中[25]。最近的報導表明，這種突變增強 了LRRK2的自磷酸化，以及其將髓鞘鹼性蛋白磷酸化的能力(提升了2~3倍)[8,12,27]。當在細胞系和原代神經元中過表達G2019S-LRRK2時，觀察到在氧化應激不存在和存在下，該突變均表現出細胞毒性，並促進包涵體的形成[27,28]。 上述結果以及LRRK2激酶活性基因失活顯示出的對這種毒性表型的保護作用的事實，表明LRRK2激酶活性的改變潛在地參與LRRK2-PD的神經毒性和致病機制。
已經發現衍生自LRRK2 G2019S帕金森氏病患者的誘導多功能幹細胞(iPSCs)表現出神經突生長的缺陷和對魚藤酮敏感性的增加，其可以通過基因校正G2019S突變或用具有LRRK2激酶活性的小分子抑制劑治療細胞加以改善[29]。LRRK2 G2019S突變誘導的iPSCs相關線粒體損傷的增加也由G2019S突變的基因校正而阻斷了[30]。
另外的證據將LRRK2功能障礙與自噬溶酶體途徑關聯[31]。LRRK2蛋白質導致伴侶介導型自噬出现缺陷，對細胞降解α-突觸核蛋白的能力產生負面影響[32]。在其它細胞模型中，選擇性LRRK2抑制劑已被證明可以刺激巨噬細胞吞噬[33]。這些資料表明，具有LRRK2激酶活性的小分子抑制劑可以有效治療以由異常自噬/溶酶體降解途徑引起的細胞蛋白水解缺陷為特徵的疾病，包括與GBA突變相關的帕金森氏病[34]、其它α-突觸核蛋白病、tau蛋白病、阿爾茨海默病[35]和其它神經退行性疾病[36]和戈謝病[37]等形式。此外，與正常受試者的成纖維細胞相比，在C型Niemann-Pick(NPC)病患者的成纖維細胞中也觀察到了LRRK2 mRNA水準的顯著升高，這表明LRRK2功能異常可能在溶酶體疾病中起作用[38]。這一觀察結果表明LRRK2抑制劑可能有效治療NPC。
還報導了PD相關G2019S突變體形式的LRRK2可以增強微管蛋白相關Tau蛋白的磷酸化[39]，並且已經提出了其中LRRK2處於Tau和α-突觸核蛋白致病作用的上游的疾病模型[40]。為了支援這點，在轉基因小鼠模型中發現不溶性Tau蛋白聚集的增加和Tau蛋白磷酸化的升高與LRRK2的的表達有關[41]。據報導，PD致病性R1441 G突變LRRK2蛋白的過度表達誘發轉基因小鼠模型出現PD症狀和Tau蛋白的過度磷酸化[42]。因此，這些資料表明，具有激酶催化活性的LRRK2抑制劑可用於治療特徵為Tau過度磷酸化的tau蛋白病，例如嗜銀顆粒癡呆、皮克病、皮質基底核退化症、進行性核上性麻痹以及與染色體17相關的遺傳性額顳葉癡呆和帕金森氏綜合徵(FTDP-17)[43]。此外，LRRK2抑制劑可以具有治療特徵為多巴胺水準降低的其它疾病的效用，例如與藥物成癮相關的脫癮症狀/復發[44]。
在一方面，本文提供的是通式I的化合物或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、溶劑合物、代謝物、藥學上可接受的鹽、酯或前藥： 其中：V是CH或N；W是N或O； R1是不存在的、H、C1-10烷基、C3-10環烷基、C2-10雜環烷基、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C1-5烷基-C1-10雜芳基，或C1-5烷基-C6-14芳基，其中所述的C1-10烷基、C3-10環烷基、C2-10雜環烷基、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C1-5烷基-C1-10雜芳基和C1-5烷基-C6-14芳基各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7環烷基和C2-7雜環烷基中的一個以上的取代基取代；X1是鍵、CO或-(CH2)n-；Y是-(CH2)n-、-(CR2R3)-、C6-14芳基或C1-10雜芳基，任選地R2和R3與它們所連接的碳原子一起形成C3-C10碳環或3至10元雜環，其中該-(CH2)n-、-(CR2R3)-、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C3-C10碳環和3至10元雜環各自獨立地且任選地被選自C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代；Z是鍵、NR2、-(CH2)n-或-(CR2R3)-，其中該NR2、-(CH2)n-和-(CR2R3)-各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代；n是0、1、2、3、4或5；R2和R3獨立地選自-H、C1-6烷基、C3-7環烷基、C2-7雜環烷基、C6-14芳基或C1-10雜芳基，其中該C1-6烷基、C3-7環烷基、C2-7雜環烷基、C6-14芳基和C1-10雜芳基各自任選地且獨立地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH，和-CO2H中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，R1是H、C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C1-3烷基-C1-7雜芳基或C1-3烷基-C6-10芳基，其中該C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C1-3烷基-C1-7雜芳基，和C1-3烷基-C6-10芳基各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、 -N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7環烷基，和C3-7雜環烷基中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，X1是CO、-CH2-、-(CH2)2-，或-(CH2)3-。
在一些實施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-、C6-10芳基或C3-8雜芳基，任選地R2和R3與它們所連接的碳原子一起形成C3-C8碳環或3至8元雜環，其中該-CH2-、-(CH2)2-，或-(CH2)3-、-(CR2R3)-、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C3-C8碳環和3至8元雜環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-， 其中Q1、Q2、Q3和Q4各自獨立地是C或N，並且Q1、Q2、Q3和Q4各自任選地被選自C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基和C1-6鹵代烷基中的一種以上的取代基取代， 其中Q5、Q6和Q7各自獨立地是C、N、O或S，並且Q5、Q6和Q7各自任選地被選自C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基或C1-6鹵代烷基中的一種以上的取代基取代。
在一些實施方式中，Z是鍵、NR2、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-或-(CR2R3)-，其中該NR2、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-和-(CR2R3)-各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，R2和R3獨立地選自-H、C1-3-烷基、C3-5環烷基、C3-5雜環烷基、C6-8芳基或C3-8雜芳基，其中該C1-3烷基、C3-5環烷基、C3-5雜環烷基、C6-8芳基和C3-8雜芳基各自任選地且獨立地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH，和-CO2H中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，R1選自以下基團：
在一些實施方式中，R1較佳地選自以下基團：
在一些實施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CR2R3)-、苯環、5至6元雜芳環、C6-10芳基或C3-8雜芳基，任選地R2和R3與它們所連接的碳原子一起形成C3-C6碳環或3至6元雜環，其中該苯環、5至6元雜芳環、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C3-C6碳環和3至6元雜環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、甲基、乙基、正丙基、異丙基、-CF3，和C1-3鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，Y選自以下基團：
在一些實施方式中，Y較佳地選自以下基團：
在一些實施方式中，本文提供了具有以下結構之一的化合物，或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、溶劑合物、代謝物、藥學上可接受的鹽、酯或前藥：
在一些實施方式中，本文提供了較佳地具有以下結構之一的化合物， 或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、溶劑合物、代謝物、藥學上可接受的鹽、酯或前藥：
在另一方面，本文提供了包含本文揭露的化合物的藥物組合物。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組合物還包含藥學上可接受的載體、稀釋劑、輔料或其組合。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組合物還包含第二治療劑。
在另一方面，本文提供了本文揭露的化合物或藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症。
在一些實施方式中，神經退行性疾病是帕金森氏病。
在另一方面，本文提供了治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症的方法，包括給予受試者治療有效量的本文揭露的化合物或藥物組合物。
在一些實施方式中，神經退行性疾病是帕金森氏病。
在另一方面，本文提供了用於在治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症中使用的的本文揭露的化合物或藥物組合物。
在一些實施方式中，神經退行性疾病是帕金森氏病。
在另一方面，本文提供了本文揭露的化合物或藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症的方法，包括給予受試者治療有效量的本文揭露的化合物或藥物組合物。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了用於在預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症中使用的的本文揭露的化合物或藥物組合物。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了本文揭露的化合物或藥物組合物在試驗中的用途，該試驗用於鑒定能夠抑制激酶的其它候選化合物。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了通式II的化合物，或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、溶劑合物、代謝物、藥學上可接受的鹽、酯或前藥： 其中V為CH或N；W是N或O；R1是不存在的、H、C1-10烷基、C3-10環烷基、C2-10雜環烷基、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C1-5烷基-C1-10-雜芳基，或C1-5-烷基-C6-14-芳基，其中該C1-10烷基、C3-10環烷基、C2-10雜環烷基、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C1-5烷基-C1-10-雜芳基和C1-5-烷基-C6-14-芳基各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7環烷基、C2-7雜環烷基、醯胺類、磺胺類和碸類中的一個以上的取代基取代； X1是鍵、CO，或-(CH2)n-；Y是-(CH2)n-；Z是鍵、N，或-(CH2)n-；R4各自獨立地是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，或C1-6鹵代烷基，任選地兩個R4與它們所連接的Y一起形成C3-C10碳環或3至10元雜環，其中該C3-C10碳環和3至10元雜環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一種以上的取代基取代；R5是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基，任選地R4和R5與它們所連接的Y-Z一起形成苯環、C3-C10碳環、3至10元雜環或5至10元雜芳環，其中該苯環、C3-C10碳環、3至10元雜環和5至10元雜芳環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一種以上的取代基取代；k是0、1、2、3或4；n是0、1、2、3、4或5；在一些實施方式中，R1是H、C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、C6-10芳基、C1-8雜芳基、C1-3烷基-C1-8-雜芳基，或C1-3-烷基-C6-10-芳基，其中該C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、C6-10芳基、C1-8雜芳基、C1-3烷基-C1-8-雜芳基，和C1-3-烷基-C6-10-芳基各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7環烷基，和C3-7雜環烷基中的一種以上的取代基取代。
在一些實施方式中，X1是CO、-CH2-、-(CH2)2-或-(CH2)3-。
在一些實施方式中，Y是-CH2-、-(CH2)2-或-(CH2)3-。
在一些實施方式中，Z是鍵、N、-CH2-、-(CH2)2-或-(CH2)3-。
在一些實施方式中，R4各自獨立地是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-3烷基或C1-3鹵代烷基，任選地兩個連接至Y的R4與Y一起形成C3-C7碳環或3至7元雜環，其中該C3-C7碳環和3至7元雜環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，R5是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-3烷基或C1-6鹵代烷基，任選地R4和R5與它們所連接的Y-Z一起形成苯環、C3-C7碳環、3至7元雜環或5至7元雜芳環，其中該苯環、C3-C7碳環、3至7元雜環和5至7元雜芳環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
在一些實施方式中，R1選自以下基團：
在一些實施方式中，R5是不存在的、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-3烷基或C1-3鹵代烷基，任選地R4和R5與它們所連接的Y-Z一起形成苯環或吡唑環，其中該苯環和吡唑環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、-CN、-OH、-CO2H，和-CF3中的一個以上的取代基取代。
在另一方面，本文提供了包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組合物還包含藥學上可接受的載體、稀釋劑、輔料或其組合。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組合物還包含第二治療劑。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症。
在一些實施方式中，神經退行性疾病是帕金森氏病。
在另一方面，本文提供了治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的疾病的方法，包括向受試者給予治療有效量的通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物。
在一些實施方式中，神經退行性疾病是帕金森氏病。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物，其用於在治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症中使用。
在一些實施方式中，神經退行性疾病是帕金森氏病。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症的方法，包括向受試者給予治療有效量的通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物，其用於在預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症中使用。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
在另一方面，本文提供了通式II化合物或包含本文揭露的通式II化合物的藥物組合物在試驗中的用途，該試驗用於鑒定能夠抑制激酶的另外候選化合物。
在一些實施方式中，激酶是LRRK。
在一些實施方式中，激酶是LRRK2。
定義和常規術語
本發明中引用的所有參考文獻通過引用將其整體併入本文，並且在引入的參考文獻和本發明之間存在不一致的情況下，將以本揭露為準。此外，本文使用的所有術語和短語具有本領域技術人員已知的一般含義。即使如此，仍然需要對本發明的術語和短語進行更詳細的說明。在提及的術語和短語與熟知的意 義之間存在不一致的情況下，以本揭露為準。不管所討論的術語是單獨地還是以組合出現，本說明書中使用的常規術語的以下定義均適用。
如在本文中使用的語法冠詞“一個(a)”、“一種(an)”和“該(the)”旨在包括“至少一個”或“一個以上”，除非在本中另有說明或與上下文明顯矛盾。 因此，本文所使用的冠詞是指一個或多於一個(即，至少一個)的該冠詞的語法物件。作為示例，“組分”是指一個以上的組分，並且因此可能考慮多於一個的組分，並且可以在所描述的實施方式的實現中採用或使用。
如在本文中所述的，本文揭露的化合物可以任選地被一個以上的取代基取代，如通常在以下舉例說明的，或由本發明的特定類別、亞類和種類舉例說明的。
術語“鹵素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
術語“烷基”是指1至10個碳原子的飽和直鏈或支鏈單價烴基。除非另有說明，烷基基團含有1-10個碳原子。在一些實施方式中，烷基基團含有1-8個碳原子；在其它實施方式中，烷基基團含有1-6個碳原子；在又一其它實施方式中，烷基基團含有1-4個碳原子；在再一其它實施方式中，烷基基團含有1-3個碳原子。烷基基團任選地被一個以上的本文所描述的取代基取代。
烷基基團的一些非限制性實例包括甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、異丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、異丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、正己基 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))等。
術語“環烷基”是指具有3至10個碳原子的單價或多價飽和環，如單環、雙環或三環系統。並且其中雙環或三環系統可以包括稠環、橋環和螺環。在一些實施方式中，環烷基基團含有3至8個碳原子。在其它實施方式中，環烷基基團含有3至6個碳原子。環烷基(cycloalkyl radical)任選被一個以上的本文所描述的取代基取代。
術語“芳基”是指具有總共6至12個環成員，較佳6至10個環成員，且更佳6個環成員的單價或多價單環、雙環或三環碳環系統，並且其中該系統中的至少一個環是芳香族的。芳基基團通常但不一定通過芳基基團的芳香族環與母體分子結合。術語“芳基”和“芳香環”在本文中可以互換使用。芳基基團的實例可以包括苯基、萘基、蒽等。芳基(aryl radical)任選被一個以上的本文所描述的取代基取代。
術語“雜芳基”是指具有總共5至10個環成員的單價或多價單環、雙環或三環系統，並且其中系統中的至少一個環是芳香族的，並且至少一個環含有一個以上的雜原子。雜芳基基團通常但不一定通過雜芳基基團的芳香環與母體分子結合。術語“雜芳基”和“雜芳香環”或“雜芳香化合物”在本文中可以互換使用。雜芳基基團任選被一個以上的本文揭露的取代基取代。在一些實施方式中，5至10元雜芳基基團含有1、2、3或4個獨立地選自O、S和N的雜原子；在一些其它實施方式中，5至6元雜芳基是單環系統並且含有1、2、3或4個獨立地選自O、S和N的雜原子。
雜芳基環的一些非限制性實例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、四唑基等及其苯並衍生物，如苯並呋喃基、苯並噻吩基、苯並咪唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基等；或吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、三嗪基等及其苯並衍生物，如喹啉基、異喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基等。
“雜環烷基”是指含有一個以上的選自氮、氧和硫的雜原子的環狀脂肪族基團，在環中其任選地被一個以上的-(CO)-基團中斷和/或在環中任選地含有一個以上的雙鍵。可替換地，雜環烷基基團是C4-7-雜環烷基、更佳C4-6-雜環烷基。較佳的雜環烷基基團包括但不限於呱嗪基、呱啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、吡咯烷基、四氫呋喃基和四氫吡喃基。
本發明化合物的描述
治療應用
本發明的另一方面涉及上述化合物用於在醫藥中使用。
本發明的另一方面涉及上述化合物用於在治療癌症或神經退行性疾病中使用。
另一方面涉及如上述化合物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防神經退行性疾病。較佳地，神經退行性疾病是帕金森氏病。
另一方面涉及上述化合物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防增殖性疾病，例如癌症。
較佳地，以足以抑制一種以上的激酶、較佳LRRK、甚至更佳LRRK2的量給予該化合物。
又一其它方面涉及本發明化合物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由針對於生物靶標的任何異常活性引起的、與之相關或伴隨的病症，其中該靶標是激酶，更佳LRRK，甚至更佳LRRK2。
較佳地，該病症是帕金森氏病。
本發明的另一方面涉及治療蛋白激酶相關疾病或病症的方法。根據本發明該方面的方法是通過將治療有效量的如上所述的本發明化合物本身，或更佳作為與例如如下文詳述的藥學上可接受的載體混合的部分藥物組合物給予至需要其的受試者而實現的。
本發明的又另一方面涉及治療患有通過抑制蛋白激酶而減輕的疾病狀態的哺乳動物的方法，其中該方法包括向哺乳動物給予治療有效量的本發明化合物。
較佳地，疾病狀態是通過抑制蛋白激酶LRRK，更佳LRRK2來減輕的。
較佳地，哺乳動物是人類。
術語“方法”是指用於完成給定任務的方式、手段、技術和程式，包括但不限於化學、藥理學、生物學、生物化學和醫學領域的從業者已知的或由他們從已知的方式、手段、技術和程式易於開發的那些方式、手段、技術和程式。
如本文所使用的術語“給藥”是指將本發明化合物與蛋白激酶組合在一起的方法，以這種方式使得化合物可以影響蛋白激酶的酶活性，通過直接地，即通過與蛋白激酶本身相互作用或者間接地，即通過與在其上蛋白激酶的催化 活性是依賴性的其它分子相互作用。如本文所使用的，可以在體外(即在試管中)，或體內(即在活體的細胞或組織中)完成給藥。
在本文中，術語“治療”包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉疾病或病症的進展，基本上改善疾病或病症的臨床症狀或基本上預防疾病或病症的臨床症狀出現。
在本文中，術語“預防”是指起初阻止生物體獲得病症或疾病的方法。
術語“治療有效量”是指所給予量的化合物將在一定程度上緩解被治療的疾病或病症的一種以上的症狀。
對於本發明中使用的任何化合物，治療有效量(本文中也稱為治療有效劑量)可以最初地由細胞培養測定來進行估計。例如，可以配製劑量以在動物模型中實現包括細胞培養中測定的IC50或IC100的迴圈濃度範圍。這些資訊可用於更精確地確定人體中的有用劑量。也可以從體內資料估計初始劑量。 使用這些初步指導，本領域普通技術人員可以確定人類的有效劑量。
此外，可以通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥物程式來確定本文該化合物的毒性和治療功效，例如通過測定LD50和ED50。毒性和治療有效之間的劑量比是治療指標，並且可以表示為LD50和ED50之間的比率。表現出高治療指數的化合物是較佳的。由這些細胞培養物測定和動物研究所獲得的資料可用於配製在人體中使用而無毒性的劑量範圍。這些化合物的劑量較佳在包括具有很少或無毒性的ED50的迴圈濃度的範圍內。劑量可以在該範圍內變化，這取決於所用的劑型和採用的給藥途徑。鑒於患者狀況，個體醫師可以選擇確切 的製劑、給藥途徑和劑量。(參見，例如，Fingl等人，1975，In：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁)。
可以單獨調整劑量和間隔以提供足以維持治療效果的活性化合物的血漿水準。用於口服給藥的常規患者劑量的範圍為約1-2000mg/kg/天，通常為約2-1000mg/kg/天，較佳為約5-700mg/kg/天且最佳為約10-500mg/kg/天。 較佳地，通過每天給予多個劑量來實現治療有效的血清水準。在局部給藥或選擇性攝取的情況下，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。本領域技術人員將能夠優化治療有效的局部劑量而無需過多的實驗。
如本文所使用的，“激酶相關的疾病或病症”是指以本文定義的不適當激酶活性或激酶的過度活性為特徵的疾病或病症。不適當活性是指(i)通常不表達該激酶的細胞中的激酶表達；(ii)增加的激酶表達，導致不希望的細胞增殖、分化和/或生長；或(iii)降低的激酶表達，導致細胞增殖、分化和/或生長不期望的減少。激酶的過度活性是指編碼特定激酶的基因的擴增或一定激酶活性水準的產生，其可以與細胞增殖、分化和/或生長紊亂相關(即，隨著激酶水準增加，一個以上的細胞紊亂的症狀的嚴重程度增加)。過度活性也可以是由於突變而導致的與配體無關或組成型啟動的結果，該突變如負責配體結合的激酶的片段缺失。
本文所述的化合物可用於預防的較佳疾病或病症包括癌症和神經退行性疾病，如帕金森氏病。
因此，本發明還提供了本文定義的化合物用於製備藥物的用途，該藥物用於治療期望以抑制LRRK2的疾病。這些疾病包括帕金森氏病。
藥物組合物
對於根據本發明的用途，本文所述的化合物或其生理上可接受的鹽、酯或其它生理功能衍生物可以作為藥物製劑呈現，該藥物製劑包含化合物或其生理上可接受的鹽、酯或其它生理功能衍生物，以及一種以上的藥學上可接受的載體，以及任選的其它治療和/或預防成分。載體在與製劑的其它成分相容的意義上必須是可接受的並且對其接受者無害。藥物組合物可用於人和獸醫中的人或動物用途。
用於本文描述的各種不同形式的藥物組合物的合適輔料的實例可以在“Handbook of Pharmaceutical Excipients，第2版，(1994)，由A Wade和PJ Weller編輯”中找到。
用於治療用途的可接受的載體或稀釋劑在製藥領域是熟知的，並且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編輯1985)中進行了描述。
合適載體的實例包括乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇、山梨糖醇等。合適稀釋劑的實例包括乙醇、甘油和水。
藥物載體、輔料或稀釋劑的選擇可以根據預期給藥途徑和標準藥學實踐來進行選擇。藥物組合物可以包含或額外包含作為載體、輔料或稀釋劑的任何合適的黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑、緩衝劑、調味劑、表面活性劑、增稠劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等，以及為了使得製劑與意圖的接受者的血液等滲所包含的物質。
合適黏合劑的實例包括澱粉、明膠、天然糖(如葡萄糖、無水乳糖、游離乳糖、β-乳糖)、玉米甜味劑、天然和合成膠(如阿拉伯膠、黃芪膠)或海藻酸鈉、羧甲基纖維素和聚乙二醇。
合適潤滑劑的實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。
可以在藥物組合物中提供防腐劑、穩定劑、染料甚至調味劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
藥物製劑包括適合於口服、局部(包括皮膚、口腔和舌下)、直腸或腸胃外(包括皮下、皮內、肌內和靜脈內)、鼻內和肺部給藥(例如，通過吸入)的那些。製劑可以在適當的情況下以離散劑量單位方便地呈現，並且可以通過藥學領域眾所周知的任何方法進行製備。所有方法包括讓活性化合物與液體載體或細碎固體載體或兩者聯合的步驟，然後如果需要的話，將產物成形為所需製劑。
其中載體是固體的適用於口服給藥的藥物製劑最佳地以單位劑量製劑形式，如各自含有預定量的活性化合物的丸劑、膠囊或片劑。可以通過壓製或模製，任選地與一種以上的輔助成分一起製備片劑。可以通過在合適的機器中壓製處於自由流動形式(諸如粉末或顆粒)的活性化合物，任選地與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑物質、表面活性劑或分散劑混合來製備壓製片劑。可以通過模製活性化合物和惰性液體稀釋劑來製備模製的片劑。可以任選地將片劑包衣，如果不進行包衣的話，可以任選地列印符號。可以通過將活性化合物單獨地或與一種以上的輔助成分混合填充到膠囊殼中，然後以常規方式進行密封來製備膠囊。扁囊劑類似於膠囊，其中將活性化合物與任何輔助成分一起密封在米紙膜中。也可以將活性化合物配製成可分散的顆粒，例如可以在給藥前將其懸浮於水中，或灑在食物上。可以將顆粒包裝在例如小袋中。其中 載體是液體的適合於口服給藥的製劑，可以作為以水性或非水性液體方式的溶液或懸浮液，或作為水包油液體乳劑呈現。
用於口服給藥的製劑包括控釋劑型，例如片劑，其中將活性化合物配製於合適的控釋基質中，或將其包衣有合適的釋控膜。這類製劑可以特別方便地用於預防性使用。
適用於直腸給藥的藥物製劑(其中載體是固體)最佳地以單位劑量栓劑形式呈現。合適的載體包括可可脂和本領域通常使用的其它材料。可以通過將活性化合物與軟化或熔化的載體混合，然後在模具中冷卻和成型來方便地形成栓劑。適用於腸胃外給藥的藥物製劑包括在水性或油性溶劑中的活性化合物的無菌溶液或懸浮液。
可注射的製劑可適用於彈丸注射(bolus injection)或連續注射。這種製劑方便地存在於單位劑量或多劑量容器中，在引入製劑後將容器密封直到使用需要。可替換地，活性化合物可以是粉末形式，在使用前由合適的溶劑，如無菌的無熱原水形成。
也可以將活性化合物配製成長效持久製劑，其可以通過肌內注射或通過植入，例如皮下或肌肉內給藥。持久製劑可以包括例如合適的聚合物或疏水性材料或離子交換樹脂。這種長效製劑對於預防性使用特別方便。
呈現了適合於通過口腔進行肺部給藥的製劑，使得將含有活性化合物並期望具有0.5至7微米範圍內的直徑的顆粒在接受者的支氣管樹中遞送。
作為一種可能性，這種製劑是以細粉碎粉末的形式，其可以方便地存在於適合於例如明膠的可刺穿的膠囊中，用於吸入裝置，或者可替換地作為包含活性化合物、合適的液體或氣體推進劑和任選的其它成分如表面活性劑 和/或固體稀釋劑的自推進製劑。合適的液體推進劑包括丙烷和氯氟烴，且合適的氣體推進劑包括二氧化碳。還可以採用其中活性化合物以溶液或懸浮液的液滴的形式進行分配的自推進製劑。
這類自推進製劑類似於本領域已知的那些自推進製劑，並且可以通過已建立的方法製備。適當地，它們呈現在容器中，該容器提供有具有所需噴霧特性的手動操作或自動功能的閥；有利地，在每次操作該閥時，其具有遞送固定體積，例如25至100微升的計量式。
作為另外的可能性，活性化合物可以是用於在霧化器或噴霧器中使用的溶液或懸浮液的形式，由此採用加速氣流或超音波攪拌以產生用於吸入的細小液滴霧。
適用於鼻內給藥的製劑包括通常類似於上述用於肺部給藥的製劑。 當將製劑分配時，這類製劑應期望地具有在10至200微米範圍內的粒徑以使得能夠保持在鼻腔中；這可以通過適當地使用合適細微性的粉末或選擇適當的閥而實現。其它合適的製劑包括粒徑在20-500微米範圍內的粗粉末，用於通過從靠近鼻子的容器通過鼻通道而快速吸入來給藥，以及包含0.2至5%w/v的水性或油性溶液或懸浮液中的活性化合物的滴鼻液。
藥學上可接受的載體是本領域技術人員熟知的，包括但不限於0.1M且較佳0.05M的磷酸鹽緩衝液或0.8%的鹽水。另外，這些藥學上可接受的載體可以是水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射的有機酯(如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝媒介。腸胃外溶劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液 (lactated Ringer's)或固定油。還可以存在防腐劑和其它添加劑，例如，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
可以提供適合於局部製劑的製劑，例如凝膠、乳膏劑或軟膏劑。這類製劑可以例如應用於傷口或潰瘍，將其直接地塗在傷口或潰瘍表面，或使其攜帶在可應用於待被治療區域上方的合適支撐物，如繃帶、紗布、網絲等上。
還可以提供液體或粉末製劑，可以將其直接噴灑或噴撒到待治療部位，例如，傷口或潰瘍上。可替換地，可以將如繃帶、紗布、網絲等的載體噴灑或噴撒有製劑，然後應用於待被治療的部位。
根據本發明的另一方面，提供了用於製備如上所述的藥物或獸醫組合物的方法，該方法包括使活性化合物與載體聯合，例如通過混合。
通常，通過將活性劑與液體載體或細分散的固體載體或兩者均勻且緊密地聯合，然後如果需要的話，將產品成型來製備製劑。本發明涉及用於製備藥物組合物的方法，包括使式(I)的化合物與藥學上或獸醫學上可接受的載體或溶劑結合或聯合。
鹽/酯
本發明的化合物可以呈現為鹽或酯，特別是藥學上和獸醫學上可接受的鹽或酯。
本發明化合物的藥學上可接受的鹽包括其合適的酸加成鹽或堿鹽。 關於合適的藥物鹽的綜述可以在Berge等人，J Pharm Sci，66,199(1977)中找到。例如用強無機酸，如礦物酸，例如氫鹵酸(如鹽酸、氫溴酸和氫碘酸)、硫酸、磷酸硫酸鹽、硫酸氫鹽、半硫酸鹽、硫氰酸鹽、過硫酸鹽和磺酸；用強有機羧酸，如未取代或取代的(例如，通過鹵素)1至4個碳原子的鏈烷羧酸， 如乙酸；用飽和或不飽和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；用羥基羧酸，例如抗壞血酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；用氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；用苯甲酸；或用有機磺酸，如未取代或取代的(例如，通過鹵素)(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲烷-或對甲苯磺酸，來形成鹽。不是藥學上或獸醫學上可接受的鹽可能仍然是有價值的中間體。
較佳的鹽包括，例如乙酸鹽、三氟乙酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、泛酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、丁酸鹽、二葡糖酸鹽、環戊酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、草酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、煙酸鹽、棕櫚酸酯、果膠酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、酒石酸鹽、乳糖酸鹽、pivolate、樟腦酸鹽、十一酸鹽和琥珀酸鹽，有機磺酸如甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、苯磺酸鹽、對氯苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽；和無機酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硫酸氫、半硫酸、硫氰酸、過硫酸、磷酸和磺酸。
根據被酯化的官能團，使用有機酸或醇/氫氧化物形成酯。有機酸包括羧酸，如未取代或取代的(例如，通過鹵素)1至12個碳原子的鏈烷羧酸，如乙酸；用飽和或不飽和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；用羥基羧酸，例如抗壞血酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；用氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；用苯甲酸；或用有機磺酸，如未取代或取代的(例如，通過鹵素)(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲烷-或對甲苯磺酸。合適的氫氧化物包括無機氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧 化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括可以是未取代或取代的(例如，通過鹵素)1-12個碳原子的烷醇。
對映異構體/互變異構體
在先前討論的本發明的所有方面中，在適當的情況下，本發明包括本發明化合物的所有對映異構體、非對映異構體和互變異構體。本領域技術人員應識別具有光學性質(一個以上的手性碳原子)或互變異構特徵的化合物。可以通過本領域已知的方法分離/製備相應的對映異構體和/或互變異構體。
對映異構體以其手性中心的絕對構型為特徵，並由Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-排序規則進行描述。這些慣例在本領域中是熟知的(例如，參見“Advanced Organic Chemistry”，第3版，March，J.，John Wiley和Sons，New York，1985)。
含有手性中心的本發明化合物可以用作為外消旋混合物、富含對映異構體的混合物，或者可以使用熟知的技術分離外消旋混合物，並且可以單獨地使用單個對映異構體。
立體異構體和幾何異構體
一些本發明的化合物可以作為立體異構體和/或幾何異構體存在-例如，它們可以具有一個以上的不對稱和/或幾何中心，因此可以以兩種以上的立體異構和/或幾何形式存在。本發明考慮了使用所有的這些抑制劑的單個立體異構體和幾何異構體及其混合物。權利要求中使用的術語包括這些形式，隻要該形式保持適當的功能活性(儘管不一定以相同程度)。
本發明還包括藥劑或其藥學上可接受的鹽的所有合適的同位素變體。將本發明的藥劑或其藥學上可接受的鹽的同位素變體定義為其中至少一個 原子被具有相同原子數但原子品質與通常在自然界中發現的原子的原子品質不同的原子取代的一種。可以併入該藥劑及其藥學上可接受的鹽的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如分別地2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。藥劑和藥學上可接受的鹽的某些同位素變體，例如其中併入如3H或14C的放射性同位素的那些同位素變體，可用於藥物和/或底物組織分佈研究。氚標記的，即3H，和碳-14，即14C同位素，由於其易於製備和可檢測性是特別佳的。此外，用同位素如氘(即2H)取代可以提供由更大的代謝穩定性，例如增加的體內半衰期或降低的劑量需求產生的某些治療優勢，因此在某些情況下可能是較佳的。例如，本發明包括其中任一氫原子被氘原子代替的通式(I)的化合物。通常可以使用合適試劑的適當同位素變體由常規方法製備本發明的藥劑和本發明的其藥學上可接受的鹽的同位素變體。
前藥
本發明還包括以前藥形式的本發明化合物，即在體內釋放根據通式(1)的活性母體藥物的共價鍵合的化合物。這樣的前藥通常是其中一個以上的適當基團已被修飾，使得在給藥至人或哺乳動物受試者後該修飾可能被逆轉的本發明化合物。通常通過這類受試者中天然存在的酶來進行該逆轉，儘管可能將第二藥劑與這種前藥一起給藥以便在體內進行反轉。這類修飾的實例包括酯(例如，上述的任何一種)，其中可以由酯酶等進行這種逆轉。其它的這類系統對於本領域技術人員來說是熟知的。
溶劑化物
本發明還包括本發明化合物的溶劑化物形式。權利要求中使用的術語包括這些形式。
多晶型
本發明還涉及以本發明化合物的各種結晶形式、多晶形式和水合形式的本發明化合物。在製藥工業中已經確定了，可以通過稍微改變在這類化合物的合成製備中使用的溶劑的純化和/或分離的方法而以任何這些形式分離化學化合物。
給藥
本發明的藥物組合物可適用於直腸、鼻內、支氣管內、局部(包括口腔和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內、動脈內和皮內)、腹膜內或鞘內給藥。較佳地，製劑是口服給藥的製劑。製劑可以方便地以單位劑型，即以包含單位劑量或者單位劑量的多個單位或子單位的離散部分的形式呈現。作為實例，製劑可以是以片劑和緩釋膠囊的形式，並且可以通過藥學領域熟知的任何方法進行製備。
本發明的用於口服給藥的製劑可以呈現為：離散單位，如各自含有預定量的活性劑的膠囊、凝膠劑、滴劑、扁囊劑、丸劑或片劑；作為粉末或顆粒；作為水性液體或非水性液體中的活性劑的溶液、乳液或懸浮液；或作為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑；或作為彈丸注射等。較佳地，每劑量的這些組合物含有1至250mg且更佳10-100mg的活性成分。
對於用於口服給藥的組合物(例如，片劑和膠囊)，術語“可接受的載體”包括溶劑，如常用輔料，例如黏合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃芪膠、聚乙烯吡咯烷酮(聚維酮)、甲基纖維素、乙基纖維素、羧 甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、蔗糖和澱粉；填料和載體，例如玉米澱粉、明膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸二鈣、氯化鈉和海藻酸；和潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸鈉和其它金屬硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、硬脂酸、矽酮流體、滑石蠟、油和膠體二氧化矽。調味劑如薄荷、冬青油、櫻桃香料等也可以使用。可能需要添加著色劑以使劑型容易被識別。片劑也可以通過本領域熟知的方法進行包衣。
可以通過壓製或模製，任選地與一種以上的輔助成分一起製成片劑。可以通過在合適的機器中壓製處於自由流動形式(如粉末或顆粒)的活性劑，任選地與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑物質、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合來製備壓製片劑。可以通過在合適的機器中模製用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末化合物的混合物來製備模製片劑。可以將片劑任選地包衣或刻痕，並且可以進行配製從而提供活性劑的緩慢的或受控的釋放。
適用於口服給藥的其它製劑包括包含調味基質，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中的活性劑的錠劑；包含惰性基質如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠中的活性劑的軟錠劑；和包含合適液體載體中的活性劑的漱口水。
其它給藥形式包括可以進行靜脈內、動脈內、鞘內、皮下、皮內、腹膜內或肌肉內注射並由無菌或可滅菌溶液製備的溶液或乳劑。可注射形式通常每劑含有10-1000mg，較佳10-250mg之間的活性成分。
本發明的藥物組合物還可以是以肛門塞藥、陰道栓劑、懸浮液、乳劑、洗劑、軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑、噴霧劑、溶液或撒布劑的形式。
透皮給藥的另一種方法是使用皮膚貼劑。例如，可以將活性成分摻入由聚乙二醇或液體石蠟的水性乳液組成的乳膏劑中。活性成分還可以以1 至10重量%的濃度摻入由白蠟或白色軟石蠟基質以及可能需要的穩定劑和防腐劑組成的軟膏劑中。
劑量
本領域普通技術人員可以容易地確定本發明組合物之一的給予至受試者的合適劑量，而無需過多的實驗。通常，醫師將確定最適合個體患者的實際劑量，並且該劑量將取決於多種因素，包括所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時間、年齡、體重、常規健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄速率、藥物組合、特定病情的嚴重程度以及接受治療的個體。本文揭露的劑量是平均病況的示例。當然，可以有個別情況，這種情況中的更高或更低劑量範圍是有價值的，並且這種劑量範圍在本發明的範圍內。
根據本發明，可以給予有效量的通式(I)化合物以抑制與特定病情或疾病有關的激酶。當然，根據化合物的給藥類型，將進一步改變劑量。例如，較佳將通式(I)的化合物腸胃外給藥，以達到急性治療的“有效量”。儘管肌內彈丸注射也是有用的，但是靜脈輸注5%葡萄糖水溶液或生理鹽水中的化合物或具有合適輔料的類似製劑是最有效的。通常，腸胃外劑量為約0.01至約100mg/kg；較佳在0.1至20mg/kg之間，以這種方式維持血漿中藥物濃度在有效抑制激酶的濃度。可以以一水準每天給予化合物一至四次，達到約0.4至約400mg/kg/天的總日劑量。本領域普通技術人員通過將藥劑的血液水準與具有治療效果的所需濃度相比，容易確定治療有效的本發明化合物的精確量，以及將該化合物最佳給藥的途徑。
也可以向患者口服給予本發明化合物，以藥物濃度能夠足以實現治療一種以上的本文揭露的治療適應症的方式。通常，以與患者病情一致的方 式，以約0.1至約50mg/kg之間的口服劑量給予含有該化合物的藥物組合物。口服劑量較佳為約0.5至約20mg/kg。
當根據本發明給予本發明化合物時，預期不會產生不可接受的毒理作用。可以以多種生物測定法之一測試可以具有良好生物利用度的本發明化合物，以確定具有給定藥理作用所需的化合物的濃度。
組合
在一個特別佳的實施方式中，將一種以上的本發明化合物與一種以上的其它活性劑(例如，市場上可獲得的現有藥物)組合給藥。在這種情況下，可以將本發化合物與一種以上的其它活性劑連續、同時或序貫給藥。
通常，藥物在組合使用時更有效。特別地，組合治療是期望的，以便避免主要毒性、作用機制和抗藥性機制的重疊。此外，還期望以最大耐受劑量和這種劑量之間的最小時間間隔給予大多數藥物。組合化療藥物的主要優點是其可以通過生物化學相互作用促進附加的或可能的協同作用，並且還可能減少出現抗藥性。
可以通過研究測試化合物與已知或猜測為在治療特定病症中有價值的藥劑的抑制活性來提出有益的組合。該方法也可用於確定這種藥劑的給藥順序，即在遞送化合物之前、與之同時或之後。這種給藥方式可以是本文所鑒定的所有活性劑的特徵。
試驗
本發明的另一方面涉及如上所述的化合物在試驗中的用途，這種試驗用於鑒定能夠抑制一種以上的激酶、更佳LRRK、甚至更佳LRRK2的其它候選化合物。
較佳地，該試驗是競爭性結合試驗。
更佳地，競爭性結合試驗包括讓本發明化合物與激酶、較佳LRRK、更佳LRRK2和候選化合物接觸，並檢測根據本發明的化合物與激酶之間的相互作用的任何變化。
較佳地，通過本發明化合物的常規SAR修飾產生候選化合物。
如本文所使用的，術語“常規SAR修飾”是指通過化學衍生化來改變給定化合物的本領域已知的標準方法。
因此，在一個方面，所鑒定的化合物可以作為模型(例如，範本)，用於開發其它化合物。在這種測試中使用的化合物可以游離於溶液中、固定在固體載體上、承載在細胞表面或位於細胞內。可以測量化合物和待測試藥劑之間的活性消除或結合複合物的形成。
本發明的試驗可以是篩選，因而測試了大量藥劑。在一方面，本發明的測定方法是高通量篩選。
本發明還考慮了使用競爭性藥物篩選試驗，其中能夠結合化合物的中和抗體與用於結合化合物的測試化合物特異性競爭。
提供了用於篩選的另一技術，用於對物質具有合適結合親和力的試劑進行高通量篩選(HTS)，並且該技術基於WO 84/03564中詳細描述的方法。
預期本發明的測定方法，將適合於對測試化合物進行小規模篩選和大規模篩選以及適合於定量試驗。
較佳地，競爭性結合試驗包括在激酶的已知底物存在下，讓本發明化合物與該激酶接觸，並檢測該激酶和該已知底物之間相互作用的任何變化。
本發明的另一方面提供了檢測配體與激酶結合的方法，該方法包括以下步驟：(i)在激酶的已知底物存在下，讓配體與該激酶接觸；(ii)檢測該激酶和該已知底物之間的相互作用的任何變化；並且其中該配體是本發明化合物。
本發明的一個方面涉及一種方法，包括以下步驟：(a)進行上述測定方法；(b)鑒定能夠與配體結合結構域結合的一種以上的配體；和(c)製備一定量的該一種以上的配體。
本發明的另一方面提供了一種方法，包括以下步驟：(a)進行上述測定方法；(b)鑒定能夠與配體結合結構域結合的一種以上的配體；和(c)製備包含該一種以上的配體的藥物組合物。
本發明的另一方面提供了一種方法，包括以下步驟：(a)進行上述測定方法；(b)鑒定能夠與配體結合結構域結合的一種以上的配體；(c)修飾能夠與配體結合結構域結合的該一種以上的配體；(d)進行這種上述測定方法；(e)任選地製備包含該一種以上的配體的藥物組合物。
本發明還涉及通過上述方法鑒定的配體。
本發明的另一方面涉及包含通過上述方法鑒定的配體的藥物組合物。
本發明的另一方面涉及通過上述方法鑒定的配體在製備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用於治療一種以上的病症。
上述方法可用於篩選可用作一種以上的激酶的抑制劑的配體。
通式(I)的化合物既可有用地作為實驗室工具又可有用地作為治療劑。在實驗室中，本發明的某些化合物可用於建立通常被稱為“靶標驗證”的方法，在疾病狀態的確定或進展期間，已知或新發現的激酶是否導致關鍵性的或至少重要的生物化學功能產生。
常規的合成方法
通過以下實施例描述本發明。但是應當理解，本發明不限於這些實施方式，這些實施例僅用於提出實施本發明的方法。
在整個說明書中使用以下縮寫：AcOH 乙酸
AlCl3 氯化鋁
BH3 硼烷
Bn 苄基
BuOH 正丁醇
CuI 碘化亞銅
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲基亞碸
DIEA,DIPEA N,N-二異丙基乙胺
EA 乙酸乙酯
EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽
EtOH 乙醇
EtOAc 乙酸乙酯
Et3N 三乙胺
HATU 2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBT 羥基苯並三唑
I2 碘
IPA 異丙醇
KOAc 醋酸鉀
KOH 氫氧化鉀
K3PO4 磷酸鉀
LiAlH4 氫化鋁鋰
LiCl 氯化鋰
LCMS 高效液相色譜-質譜聯用
MeOH 甲醇
MeCN 乙腈
MeI 碘甲烷
MsCl 甲磺醯氯
Na2CO3 碳酸鈉
NaHCO3 碳酸氫鈉
Na2S2O3 硫代硫酸鈉
NaOH 氫氧化鈉
NaBH4 硼氫化鈉
(n-Bu)4NI 四丁基碘化銨
n-BuLi 正丁基鋰
NH3 氨
NH4Cl 氯化銨
NIS N-碘代琥珀醯亞胺
NMR 核磁共振
prep-HPLC 製備高效液相色譜
prep-TLC 製備薄層色譜
PMB 對甲氧基苄基
PMBCl 對甲氧基苄基氯
PPh3 三苯基膦
Pd(dppf)Cl2 1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II)
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)鈀(0)
Pd(OAc)2 乙酸鈀(II)
PE 石油醚
rt 室溫
Sphos 2-二環己基膦基-2',6'-二甲氧基聯苯
t-BuOK 叔丁醇鉀
t-BuONa 叔丁醇鈉
TEA 三乙胺
THF 四氫呋喃
TFA 三氟乙酸
Trt 三苯甲基
UV 紫外線
步驟1
步驟1描述了將式A轉化為式B，其中X是鹵素，較佳溴或碘，並且LG是離去基團，如琥珀醯亞胺。
反應是在合適的溶劑中在合適的鹵化劑，如碘或N-溴代琥珀醯亞胺的存在下進行的，任選地在堿，如氫氧化鉀的存在下進行的。
典型條件(X=I)，1,4-二氧六環中1當量的式A、2當量的I2、3.7當量的KOH，在75℃下持續4小時。
步驟2
步驟2描述了將式B轉化成式C，其中PG定義為保護基團，包括但不限於叔丁氧基羰基-；苄氧基羰基-；苄基-；4-甲氧基苄基-；2,4-二甲氧基苄基-或三苯甲基-；LG定義為離去基團，如鹵素或碳酸叔丁酯。
該反應包括用保護基團封端吡唑NH。本領域技術人員將會理解，許多保護基團可用於此目的(參見Greene，Theodora W.和Wuts，Peter G.M.Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis.第4版(2006))。技術人員還將理解，可以在N1或N2處引入保護基團，並且該比例可以根據PG的性質或展開的精確反應條件而改變。反應條件取決於保護基團的性質。
典型條件(PG=4-甲氧基苄基)：在室溫下將DMF中的1當量的4-甲氧基苄基氯；1當量的式B，2當量的氫氧化鉀攪拌過夜。
步驟3
步驟3描述了將式C轉化成式D，其中X是鹵素，基團R1可以任選地含有官能團，可以使用本領域技術人員已知的標準條件在合成方法的後續階段操作該官能團。
該反應包括讓式C中的氯基與合適溶劑中的氨基基團進行親核取代，任選地在質子酸(Bronsted acid)的存在下。該反應通常需要加熱，用熱的方法或使用微波照射進行加熱。
典型條件：將正丁醇中的2.5當量的胺、1當量的式C在密封的反應器中加熱至180℃持續5小時。
步驟4
步驟4涉及將式D轉化為式E。X是鹵素，且較佳碘。該反應涉及在合適的過渡金屬催化劑和合適的堿(較佳三乙胺)以及任選的額外添加劑(如四丁基碘化銨)的存在下，取代的乙烯基酯與式D的交叉偶聯。本領域技術人員通常將這種類型的轉化稱為“Heck反應”。
典型條件：DMF中的1當量的式D、10當量的乙烯基酯、2當量的四丁基碘化銨、0.2當量的Pd(dppf)Cl2；DMF：水：三乙胺(6.25：1：1)，加熱至70℃過夜。
步驟5
步驟5涉及將式E轉化為式F。該反應包括在合適的溶劑中，在合適的過渡金屬催化劑存在下，用氫源將雙鍵氫化為相應的飽和化合物。添加質子酸(如HCl或乙酸)以促進該反應可能是必需或期望的。本領域技術人員將理解，可以使用許多不同的金屬催化劑用於這種類型的反應，並且在壓力下進行這些反應可能是必需或期望的。
典型條件：在氫氣氣氛下，用碳載鈀處理式E。
步驟6
步驟6涉及將式F轉化為式G。該反應包括在合適的溶劑中，在合適的堿，如氫氧化鈉的存在下，將酯水解成相應的羧酸。
典型條件：在甲醇中用氫氧化鈉水溶液處理式F。
步驟7
步驟7涉及將式G轉化為式H。該反應包括在醯胺鍵形成反應條件下分子內環化而形成內醯胺。本領域技術人員將理解，對於這種類型的反應可以使用許多不同的醯胺鍵形成反應條件。
典型條件：在二氯甲烷中，在三乙胺存在下用HATU處理式G。
步驟8
步驟8涉及將式H轉化成通式I。反應涉及從吡唑中除去保護基團，並且精確的條件將根據保護基的性質而變化(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，第4版.(2006)。
典型條件(PG為4-甲氧基苄基)：在70℃下用三氟乙酸處理式H過夜。
步驟9
步驟9涉及將式H轉化為式J。該反應包括用還原劑如硼烷將醯胺還原成相應的胺。本領域技術人員將理解，許多不同的還原劑可用於這種類型的反應。
步驟10
步驟10涉及將式J轉化為式K。反應包括從吡唑除去保護基團，並且精確的條件將取決於保護基團的性質(Greene,Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis.第4版.(2006)。
典型條件(PG為4-甲氧基苄基)：在70℃下用三氟乙酸處理式J過夜。
步驟11
步驟11描述了將式D轉化成式L，其中X和PG如前定義。該反應涉及在合適的溶劑中在過渡金屬催化劑的存在下，式D中的鹵化物與芳基或雜芳基硼酸或酯的交叉偶聯。反應通常在用熱的方式或微波加熱所提升的溫度下進行。通常向反應混合物中加入無機堿(如碳酸鈉)。對於本領域技術人員來說，這種類型的轉化已知為“Suzuki偶聯”。
典型條件：1,4-二氧六環中的1當量的式D、0.09當量的Pd(dppf)2Cl2、1.5當量的硼酸(或硼酸酯)、3.5當量的2M碳酸鈉水溶液在90℃下持續18小時。
步驟12
步驟12涉及將式L轉化為式M。該反應包括在合適的溶劑中，在合適的堿，如氫氧化鈉的存在下，用水將酯水解成相應的羧酸。
典型條件：在甲醇中，用氫氧化鈉水溶液處理式L。
步驟13
步驟13涉及將式M轉化為式N。該反應涉及在醯胺鍵形成反應條件下分子內環化以形成內醯胺。本領域技術人員將理解，對於這種類型的反應可以使用許多不同的醯胺鍵形成反應條件。
典型條件：在二氯甲烷中，在三乙胺存在下用HATU處理式M。
步驟14
步驟14涉及將式N轉化為式O。該反應涉及從吡唑除去保護基團，並且精確的條件將根據保護基的性質而變化(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，第4版(2006)。
典型條件(PG為4-甲氧基苄基)：在70℃下，用三氯乙酸處理式N過夜。
步驟15
步驟15涉及將式N轉化為式P。該反應包括用還原劑如硼烷將醯胺還原成相應的胺。本領域技術人員將理解，許多不同的還原劑可用於這種類型的反應。
步驟16
步驟16涉及將式P轉化為式Q。該反應包括從吡唑除去保護基團，並且精確的條件將取決於保護基團的性質(Greene，Theodora W.和Wuts,Peter G.M.Greene's Protective Groups in Organic Synthesis.第4版.(2006)。
典型條件(PG為4-甲氧基苄基)：在70℃下，用三氟乙酸處理式P過夜。
通過以下非限制性實施例進一步描述本發明。
實施例
合成化合物的常規程式
色譜法
使用由Agela Technologies製造的設備進行高壓液相色譜法，並通過多波長UV檢測器進行監測。用於分離過程的典型流動相是PE/EA、DCM/MeOH或水/MeCN。本領域技術人員將理解，改變每種具體化合物的條件可能是必須的或希望的，例如通過在開始或結束時改變溶劑組成，改變溶劑或緩衝液，改變執行時間，改變流動速率和/或色譜柱。
分析方法
在室溫下在該溶劑中，使用Bruker AV 400光譜儀進行1H核磁共振(NMR)光譜，除非另有說明。在所有情況下，NMR資料與所提出的結構一致。使用用於指定主峰的常規縮寫，以份每百萬計給出特有的化學位移(δ)：例如，s，單峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，雙二重峰；br，寬。 使用Agilent 1290 Infinity/6460 triple Quad LCMS記錄質譜。當使用薄層色譜(TLC)時，它是指矽膠TLC。
製備化合物
在沒有描述製備起始原料的情況下，這些起始原料是可以通過商業管道購買的，文獻中已知的，或者由本領域技術人員使用標準程式易於可獲得的。在說明通過類似於先前的實施例或中間體而製備化合物的情況下，本領域技術人員將理解，可以改變每個特定反應的反應時間、試劑的當量數和溫度，並且採用不同的後處理或純化技術可能是必須的或期望的。
實施例1
步驟1
合成4-氯-3-碘-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶(中間體1)：
在室溫下，將碘(19g，76mmol)加入至4-氯-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶(5.8g，38mmol，根據WO 2010106333A1和WO 2012038743A1合成)和KOH(8g， 142mmol)在1,4-二氧六環(100mL)中的混合物中。將反應混合物在75℃下攪拌4小時，然後冷卻至室溫。將溶液用飽和Na2S2O3(水溶液)稀釋，過濾所得沉澱物並進行乾燥，得到黃色固體(4.1g)。將濾液靜置3天，過濾所得沉澱物，產生另外3.55g產物。合併產率(7.65g，72%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 7.65(d,J=6.0Hz,1H),8.13(d,J=6.0Hz,1H),14.22(s,1H).m/z(ESI)+：280[M+H]+
步驟2
合成1-(4-甲氧基苄基)-4-氯-3-碘-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶(中間體2)：
在室溫下，將4-甲氧基苄基氯(0.5mL，3.6mmol)加入至中間體1(1g，3.6mmol)和KOH(0.3g，5.4mmol)在DMF(10mL)中的混合物中。將所得混合物在室溫下攪拌2.5小時，然後減壓濃縮，殘餘物溶解於EtOAc中並用水洗滌，將有機相乾燥並減壓濃縮。用快速色譜純化殘餘物，以0至30%EtOAc/PE梯度洗脫，得到N1：N2位置異構的混合物固體(N1：N2=9：1，1.3g，93%)。主要的N1異構體：1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 3.70(s,3H),5.57(s,2H),6.87(d,J=8.8Hz,2H),7.22(d,J=8.4Hz,2H),7.80(d,J=4.8Hz,1H),8.17(d,J=4.4Hz,1H).m/z(ESI)+：400[M+H]+.
步驟3
合成1-(4-甲氧基苄基)-3-碘-N-甲基-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-4-胺(中間體3)：
將甲胺(6mL，40%水溶液)加入至中間體2(1.0g，2.50mmol)在n-BuOH(6mL)中的溶液中。將混合物在密封反應釜中加熱至170℃攪拌反應5小時，然後減壓濃縮，用快速色譜純化殘餘物，0~50%EtOAc/DCM洗脫，得到白色固體(0.84g，85%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 1.71(m,2H),2.24(m,4H),4.43(s,2H),4.94(m,1H),6.80(d,J=6.0Hz,1H),7.41(m,2H),7.59(d,J=6.8Hz,1H),7.78(d,J=6.0Hz，1H),7.98(d,J=7.2Hz,1H),13.28(s,1H)；m/z(ESI)+：395[M+H]+.
步驟4
合成(E)-3-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)丙烯酸甲酯(中間體4)：
在室溫下，氬氣保護，將丙烯酸甲酯(1.30g，15.08mmol)和Pd(dppf)Cl2(220mg，0.3mmol)加入至中間體3(595mg，1.51mmol)和四丁基碘化銨(1.11g，3.02mmol)在DMF/水/三乙胺(26mL/2.8mL/2.8mL)中的混合物中，將所得混合物在密封反應釜中70℃下加熱過夜，然後減壓濃縮，將粗殘餘物溶解於EtOAc中，用飽和食鹽水洗滌，Na2SO4乾燥有機相，過濾，減壓濃縮，快速色譜純化，0至60%乙酸乙酯/石油醚梯度洗脫，得到棕色膠狀固體(80%)。 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 2.93(d,J=4.4Hz,3H),3.69(s,3H),3.75(s,3H),5.49(s,2H),6.72(m,2H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),6.92(d,J=6.0Hz,1H),7.22 (d,J=8.0HZ,2H),7.83(d,J=6.0Hz,1H),8.11(d,J=17.6Hz,1H)；m/z(ESI)+：353[M+H]+.
步驟5
合成3-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)丙酸甲酯(中間體5)：
將10%Pd/C(0.1g)和乙酸(2mL)加入至中間體4(317mg，0.90mmol)在乙酸乙酯(10ml)和甲醇(10mL)中的溶液中。將所得混合物在H2氣氛下在室溫下攪拌過夜，然後通過矽藻土過濾。用EtOAc洗滌濾餅兩次合併濾液減壓濃縮，得到白色固體(90%)。殘餘物不經進一步純化而用於下一步反應。 m/z(ESI)+：355[M+H]+。
步驟6
合成3-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-丙酸(中間體6)：
在室溫下，將NaOH(160mg，4.0mmol)加入至中間體5(283mg，0.80mmol)在甲醇(15mL)和水(3mL)中的溶液中。將所得混合物在40℃下攪拌4小時，然後用乙酸調節至pH=4，減壓濃縮後，用快速色譜純化殘餘物，用0至30%甲醇/DCM梯度洗脫，得到黃色固體(68%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6) δ ppm：2.68(d,J=7.2Hz,2H),2.91(d,J=4.4Hz,3H),3.21(t,J=7.2Hz,2H),3.70(d,J=6.0Hz,3H),5.33(d,J=8.4Hz,2H),6.33(d,J=6.8Hz,1H),6.74(d,J=10.4Hz,1H),6.86(d,J=10.0Hz,2H),7.13(d,J=8.4Hz,2H),7.72(d,J=10.0Hz,1H),12.20(br s,1H)；m/z(ESI)+：341[M+H]+.
步驟7
合成6-甲基-2-(4-甲氧基苄基)-2,6,8,9-四氫-7H-1,2,5,6-四氮雜苯並[cd]薁-7-酮(中間體7)：
在氬氣保護下，將HOBt(2.06g，15.21mmol)和DIPEA(1.97g，15.21mmol)加入至中間體6(4.31g，12.67mmol)在無水THF(250mL)的溶液中。將混合物冷卻至0℃，然後加入EDCI(2.92g，15.21mmol)。在0℃下攪拌0.5小時後，將反應混合物緩慢自然升溫至室溫並攪拌過夜，然後用水(100mL)淬滅。減壓濃縮除去大部分THF，殘餘物在EtOAc和水之間分液。用飽和食鹽水(100mL)洗滌有機層，Na2SO4乾燥後減壓濃縮。用快速色譜純化殘餘物(EtOAc/PE梯度洗脫)，得到白色固體(75%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm：2.94(m,2H),3.12(m,2H),3.52(s,3H),3.70(s,3H),5.50(s,2H),6.87(d,J=8.8Hz,2H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),7.43(d,J=6.0Hz,1H)，8.16(d,J=6.0Hz,1H)；m/z(ESI)+：323[M+H]+
步驟8
合成6-甲基-2,6,8,9-四氫-7H-1,2,5,6-四氮雜苯並[cd]薁-7-酮(實施例1)：
將中間體7溶於TFA(150mg，5mL)，在密封反應釜中90℃下攪拌過夜。 冷卻至室溫後，減壓濃縮混合物，殘餘物溶於DCM/MeOH的混合溶劑(1：1，v/v，10mL)中，用K2CO3中和，過濾，洗滌並減壓濃縮。隨後用快速色譜純化殘餘物，用0至30%甲醇/DCM梯度洗脫，然後用反相C-18柱純化，用5至60%MeCN/水梯度洗脫，得到為白色固體的產物(75%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 2.94(s,2H),3.13(s,2H),3.49(s,3H),7.18(s,1H),8.14(s,1H),13.30(br s,1H)；m/z(ESI)+：203[M+H]+.
實施例2-14
在步驟3中用合適的胺代替甲胺，類似於實施例1地製備實施例2-14。
實施例15
在步驟4中用甲基丙烯酸甲酯代替丙烯酸甲酯，類似於實施例14地製備實施例15。
實施例16
合成6-甲基-6,7,8,9-四氫-2H-1,2,5,6-四氮雜苯並[cd]薁(實施例16)：
在0℃下，將BH3(1M，於5mL的THF中)加入至實施例1中的中間體7(328mg，於10mL無水THF中，1.02mmol)的溶液中。氬氣保護條件下室溫攪拌16小時後，加入甲醇(10mL)淬滅反應混合物，然後減壓濃縮。將粗中間產物8溶解於TFA(5mL)中，並在密封反應釜中90℃下攪拌過夜。冷卻 至室溫後，將混合物減壓濃縮並溶解於DCM/MeOH(1：1，v/v，10mL)中，用K2CO3中和，過濾並減壓濃縮。隨後用快速色譜純化殘餘物，用0至30%甲醇/DCM梯度洗脫，然後用反相C-18柱純化，用5至60%MeCN/水梯度洗脫，得到黃色固體(兩步產率15%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 2.05(m,2H),2.98(m,2H),3.33(s,3H),3.66(m,2H),6.74(d,J=6.0Hz,1H),7.70(d,J=6.0Hz,1H),13.07(br s,1H)；m/z(ESI)+：189[M+H]+.
實施例17-29
類似於實施例16地製備實施例17-29，如下所示，用合適的中間體代替中間體7，該中間體是在步驟3(實施例1)中用適當的胺代替甲胺製備的。
實施例30
類似於實施例16地製備實施例30，如下所示，用適當的中間體代替中間體7，而該中間體是通過在步驟3(實施例1)中用適當的胺代替甲胺，並在步驟4(實施例1)中用甲基丙烯酸甲酯代替丙烯酸甲酯而製備的。
實施例31
步驟1
合成2-(4-(甲基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)苯甲酸甲酯(中間體9)：
用氬氣將中間體3(1.8g，4.56mmol)、(2-(甲氧基羰基)苯基)硼酸(1.23g，6.85mmol)和K3PO4(1.94g，9.13mmol)在甲苯(50mL)中的混合物進行去氧處理，然後加入Pd(OAc)2(103mg，0.46mmol)。將混合物轉移至密封反應釜中並加熱至95℃持續反應16小時。濃縮後，殘餘物在EtOAc(300mL)和水(150mL)之間進行分液。用水(100mL×2)洗滌有機層，用無水Na2SO4乾燥，過濾並減壓濃縮。用快速色譜純化殘餘物，用0至65%EtOAe/PE梯度洗脫，得 到淺黃色泡狀固體(1.44g，78%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 2.80(d,J=8.8Hz,3H),3.44(s,3H),3.70(s,3H),5.11(m,1H),5.46(s,2H),6.90(m,3H),7.18(d,J=8.8Hz,2H),7.55(d,J=7.6Hz,1H),7.62(t,J=7.6Hz,1H),7.71(t,J=7.6Hz,1H),7.81(d,J=6.0Hz,1H),7.88(d,J=7.6Hz,1H)；m/z(ESI)+：403[M+H]+.
步驟2
合成2-(4-(乙基氨基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)苯甲酸(中間體10)：
在室溫下，將NaOH(700mg，17.78mmol)加入至中間體9(1.44g，3.55mmol)在甲醇(20mL)和水(5mL)中的溶液中。將所得混合物在45℃下攪拌4小時，並用乙酸將混合物的pH值調節至4。減壓濃縮後，用快速色譜純化殘餘物，用0至30%甲醇/DCM梯度洗脫，得到白色固體(1.3g，93%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 3.00(d,J=4.8Hz,3H),3.71(s,3H),5.62(s,2H),6.89(d,J=8.4Hz,2H),7.22(d,J=8.4Hz,3H),7.38(d,J=7.2Hz,1H),7.48(d,J=7.2Hz,1H),7.69(m,3H),8.02(d,J=6.8Hz,1H),13.20(br s,1H)；m/z(ESI)+：389[M+H]+.
步驟3
合成11-(4-甲氧基苄基)-4-甲基-4,11-二氫-5H-3,4,10,11-四氮雜二苯並[cd,h]薁-5-酮(中間體11)：
在氬氣保護下，將Et3N(1.02g，10.05mmol)加入至中間體10(1.3g，3.34mmol)和HATU(1.9g，5.02mmol)在無水DCM(40mL)中的混合物中。 在室溫下攪拌16小時後，將反應混合物減壓濃縮，並且用快速色譜純化殘餘物，用0至30%EtOAc/PE梯度洗脫，得到白色固體(1.11g，90%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 3.64(s,3H),3.70(s,3H),5.61(s,2H),6.89(d,J=8.4Hz,2H),7.29(d,J=8.4Hz,2H),7.39(d,J=6.0Hz,1H),7.51(t,J=7.6Hz,1H),7.67(t,J=7.4Hz,1H),8.10(d,J=6.0Hz,1H),8.31(m,2H)；m/z(ESI)+：371[M+H]+.
步驟4
合成4-甲基-4,11-二氫-5H-3,4,10,11-四氮雜二苯並[cd,h]薁-5-酮(實施例31)：
將中間體11(50mg，0.135mmol)在TFA(3mL)中的溶液加熱至90℃持續反應6小時，然後減壓濃縮，並用快速色譜純化，用0至30%甲醇/DCM梯度洗脫，得到白色固體(45%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 3.66(s,3H),7.16(d,J=6.0Hz,1H),7.52(t,J=5.6Hz,1H),7.69(t,J=5.2Hz,1H),8.08(d,J=6.4Hz,1H),8.35(m,2H),13.73(s,1H).m/z(ESI)+：251[M+H]+.
實施例32-44
類似於實施例31地製備實施例32-44，如下所示，用合適的中間體代替中間體3，而該中間體是在步驟3(實施例1)中用適當的胺代替甲胺而製備的。
實施例45
合成4-甲基-5,11-二氫-4H-3,4,10,11-四氮雜二苯並[cd,h]薁(實施例45)：
0℃，在氬氣保護下，將BH3(1.6M，在THF中，4mL)加入至實施例31中的中間體11(260mg，0.70mmol)的無水THF(15mL)的溶液中。將混合物在室溫下攪拌3小時，然後通過加入甲醇(6mL)淬滅並減壓濃縮。將粗產物12溶解於TFA(5mL)中，並在密封反應釜中在90℃下攪拌過夜。冷卻至室溫後，減壓濃縮混合物，並將殘餘物溶解於DCM/MeOH(1：1，v/v，10mL)中，用K2CO3中和，過濾並濃縮。用快速色譜純化殘餘物，用0至35%甲醇/DCM梯度洗脫，然後用反相C-18柱純化，用5至70%MeCN/水梯度洗脫，得到灰白 色固體(兩步產率36%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 3.33(s,3H),4.86(s,2H),7.06(s,1H),7.50(m,2H),7.62(d,J=6.8Hz,1H),7.73(d,J=6.4Hz,1H),8.02(d,J=7.2Hz,1H),12.68(br s,1H)；m/z(ESI)+：237[M+H]+.
實施例46-58
據下述方案，類似於實施例45地製備實施例46-58。
實施例59,60
按照以下方案，類似於實施例44地製備實施例59,60，在步驟1(實施例31)中用適當的苯基硼酸代替2-(甲氧基羰基)苯基硼酸，且在步驟3(實施例1)中用四氫-2H-吡喃-4-胺代替甲胺。
實施例61,62
根據下述方案，類似於實施例58的製備實施例61,62，用合適的中間體代替中間體11(實施例45)，該中間體通過在步驟1(實施例31)中用適當的苯基硼酸代替2-(甲氧基羰基)苯基硼酸，並在步驟3(實施例1)中用四氫-2H-吡喃-4-胺代替甲胺。
實施例65
步驟1
合成4-碘-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中間體16)：
將4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(8.0g，30.0mmol)，K2CO3(12.42g，90.0mmol)和TrtCl(10.06g，36.0mmol)在MeCN(200mL)中的混合物加熱至90℃持續反應15小時。冷卻至室溫後，過濾，並用乙酸乙酯(100mL)洗滌濾餅，合併濾液減壓濃縮，並用快速色譜純化殘餘物，用0至15%EtOAc/PE梯度洗脫，得到白色晶狀固體(10.0g，67%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 1.28(t, J=7.2Hz,3H),4.27(m,J=7.2Hz,2H),7.02(m,6H),7.29-7.50(m,9 H),7.56(s,1H)。
步驟2
合成4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中間體17)：
在氬氣保護下，將中間體16(2.1g，4.13mmol)和2-異丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷(2.31g，12.40mmol)的無水THF(20mL)溶液冷卻至-75℃，然後逐滴地滴加n-BuLi(7.75mL，12.40mmol，正己烷溶液，1.6M)，滴加過程維持反應溫度在-70℃以下，滴加完畢後在-75℃下攪拌1小時，加入水淬滅反應混合物，然後混合物在水和EtOAc中分液。分別用飽和NH4Cl水溶液(100mL)、水(100mL)和飽和食鹽水(100mL)洗滌有機層，乾燥(Na2SO4)並減壓濃縮。用快速色譜純化殘餘物，用0至30%EtOAc/PE梯度洗脫，得到白色固體(0.5g，24%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm：1.23(s,12H),1.28(t,J=5.2Hz,3H),4.24(q,J=5.2Hz,2H),7.04(m,6H),7.39(m,9H),7.47(s,1H).
步驟3
合成4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-(四氫-2H-吡喃-4-基氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中間體18)：
在氬氣保護下，將中間體3a(3.25g，7.0mmol，通過在步驟3中用四氫-2H-吡喃-4-胺代替甲胺，類似於實施例1中的中間體3進行製備)和中間體17(3.92g，7.7mmol)、Cs2CO3(6.85g，21mmol)、Pd(dppf)Cl2的無水DMF(20mL)溶液密封在反應釜中。將混合物在90℃下攪拌16小時並冷卻至室溫，並將200mL飽和NH4Cl溶液加入到反應混合物中。用乙酸乙酯萃取(3×150mL)後，用150mL飽和NH4Cl溶液洗滌合併的有機層，Na2SO4乾燥後減壓濃縮。用快速色譜純化殘餘物，用0%至80%EtOAc/PE梯度洗脫，得到白色固體(3.0g，60%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 0.67(t,J=6.8Hz,3H),1.15(m,2H),1.80(m,2H),3.40(m,2H),3.72(m,5H),3.95(m,2H),4.06(m,1H),4.72(d,J=7.6Hz,2H),5.46(s,2H),6.86(m,3H),7.16(m,8H),7.42(m,10H),7.75(m,2H).m/z(ESI)+：719[M+H]+.
步驟4
合成4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-(四氫-2H-吡喃-4-基氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1-三苯甲基-1H-吡唑-3-羧酸(中間體19)：
在50℃下，將中間體18(3.0g，4.34mmol)和NaOH(0.87g，21.71mmol)在THF/H2O(1：1，v/v，16mL)中的混合物攪拌60小時並冷卻至室溫。減壓除去混合物中的THF，用HCl(1N)將混合物的pH值調至3。用DCM(100mL×3)萃取混合物，併合並有機層，乾燥(Na2SO4)並濃縮，得到粗產物(2.5g)，將該粗產物無需純化直接地用於下一步反應。m/z(ESI)+：691[M+H]+。
步驟5
合成5-(4-甲氧基苄基)-9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-2-三苯甲基-5,9-二氫-1，2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁-10(2H)-酮(中間體20)；
在室溫下，將中間體19(2.5g，3.26mmol)、HATU(2.06g，5.43mmol)和TEA在CH2Cl2(50mL)中的混合物攪拌16小時，然後將混合物減壓濃縮，並用快速色譜純化殘餘物，用0%至80%EtOAc/PE梯度洗脫，得到白色固體(3.0g，60%)。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ ppm 1.60(d,J=10.4Hz,2H),2.80(m,2H),3.40(m,2H),3.69(s,3H),3.97(m,2H),5.51(s,2H),5.67(m,1H),6.86(d,J=8.8Hz,2H),7.18(m,8H),7.41(m,10H),7.75(s,1H),8.15(d,J=6.0 Hz,1H).m/z(ESI)+：673[M+H]+.
步驟6
合成9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁-10(2H)-酮(實施例65)：
將中間體20(50mg，0.080mmol)、TFA(3mL)的混合物在密封反應器中90℃下攪拌16小時。混合物減壓濃縮，且使用配備反相C-18柱的快速色譜純化殘餘物，用5%至60%乙腈/水梯度洗脫，得到白色固體(12mg，60%)。 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 1.62(m,2H),2.84(m,2H),3.76(m,2H),3.98(m,2H),5.81(m,1H),7.15(d,J=5.6Hz,1H),8.05(s,1H),8.09(d,J=5.6Hz,1H),13.41(s,1H),14.01(s,1H).m/z(ESI)+：311[M+H]+.。
實施例66和67
步驟1
合成5-(4-甲氧基苄基)-9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-2-三苯甲基-5,9-二氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁-10(2H)-酮(中間體21)：
在室溫下，將在實施例65中的中間體20(1.0g，1.49mmol)的CH2Cl2/TFA(22mL，10：1，v/v)溶液攪拌3小時。將反應混合物用50mL飽和Na2CO3溶液淬滅，並將混合物中的CH2Cl2減壓除去。通過過濾收集混合物中的固體，濾餅用水(20mL×3)洗滌，得到白色固體(0.42g，66%)，該白色固體無需進一步純化直接應用於下一步反應。m/z(ESI)+：431[M+H]+.
步驟2
合成5-(4-甲氧基苄基)-2-甲基-9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁-10(2H)-酮(中間體22)和5-(4-甲氧基苄基)-1-甲基-9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁-10(1H)-酮(中間體23)：
在室溫下，在密封反應釜中，將CH3I(145mg，1.02mmol)加入至中間體21(220mg，0.51mmol)和Cs2CO3(333mg，1.02mmol)在無水DMF(5mL)中的混合物中。在60℃下攪拌5小時後，將混合物冷卻至室溫，並倒入至20mL飽和的NH4Cl水溶液中，然後用EA(30mL×3)萃取。用飽和食鹽水(20mL×3)洗滌合併的有機層，用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮，得中間體22和23的混合 物的粗產物(200mg，白色固體)，無需進一步純化直接地用於下一步反應。 m/z(ESI)+：445[M+H]+。
步驟3
合成2-甲基-9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁-10(2H)-酮(實施例66)和1-甲基-9-(四氫-2H-吡喃-4-基)-5,9-二氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯[h]薁-10(1H)-酮(實施例67)：
在90℃下，將密封反應釜中的中間體22和23(200mg，0.45mmol)和TFA(5mL)的混合物攪拌16小時。減壓濃縮混合物，並使用配備反相C-18柱的快速色譜純化殘餘物，用5%至50%乙腈/水梯度洗脫，得到20mg的終產物66和42mg的終產物67。
化合物66：1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 1.63(m,2H),2.80(m,2H),3.46(m,2H),3.94(m,2H),4.13(s,3H),5.71(m,1H),7.10(d,J=5.6Hz,1H),7.97(s,1H),8.06(d,J=5.6Hz,1H),13.41(s,1H).m/z(ESI)+：325[M+H]+。
化合物67：1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ ppm 1.61(m,2H),2.80(m,2H),3.45(m,2H),3.95(m,5H),5.63(m,1H),7.11(d,J=5.6Hz,1H),8.07(d,J=5.6Hz,1H),8.35(s,1H),13.37(s,1H).m/z(ESI)+：325[M+H]+。
實施例68
合成吡唑硼酯：
步驟1
合成4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(25)
在室溫下，將NIS(22.5g，100mmol)加入至1H-吡唑-3-羧酸乙酯(10.0g，71.4mmol)的DCM(30mL)溶液中。將混合物攪拌24小時。然後用H2O(50mL)淬滅反應物，並用EtOAc(60mL×3)萃取混合物。用飽和食鹽水(50mL×3)洗滌合併的有機相，通過Na2SO4進行乾燥。過濾後，減壓濃縮濾液。通過色譜(PE：EtOAc=1：5，v/v)純化殘餘物，得到產物4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(15.5g，82%)。m/z(ESI)+：267[M+H]+。
步驟2
合成4-碘-1-異丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(26)和4-碘-1-異丙基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(27)
將2-碘丙烷(12.9g，75.9mmol)和K2CO3(16.0g，116mmol)加入至4-碘-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(15.53g，58.4mmol)的DMF(150mL)溶液中。將混合物加熱至60℃持續反應3小時。然後用水(300mL)淬滅反應，用EtOAc(200mL×3)萃取混合物。用飽和食鹽水(200mL×3)洗滌合併的有機相並通 過Na2SO4進行乾燥。過濾後，減壓濃縮有機相。通過正相柱層析(PE：EtOAc=10：1，v/v)純化殘餘物，得到4-碘-1-異丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(中間體26)(9.4g，52%)，m/z(ESI)+：309[M+H]+，且利用PE：EtOAc=8：1(v/v)洗脫，得到4-碘-1-異丙基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(中間體27)(6.1g，33%)。m/z(ESI)+：309[M+H]+。
步驟3
合成1-異丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(28)
將4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-聯(1,3,2-二氧雜環戊硼烷)(3.56g，14.0mmol)、KOAc(2.7g，27.5mmol)和Pd(dppf)2Cl2(300mg)加入至4-碘-1-異丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(2.14g，6.95mmol)的DMSO(20mL)溶液中。 將混合物加熱至100℃持續2小時。然後用H2O(40mL)淬滅反應並用EtOAc(40mL×3)萃取混合物。然後用飽和食鹽水(40mL×3)洗滌合併的有機相，通過Na2SO4進行乾燥。過濾後，減壓濃縮濾液。通過快速柱層析色譜(PE：EtOAc=10：1，v/v)純化殘餘物，得到產物1-異丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(1.0g，93%)。m/z(ESI)+：309[M+H]+。
步驟4
合成1-異丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(29)
將4-碘-1-異丙基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(4.5g，14.6mmol)和2-異丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷(8.15g，43.8mmol)的無水THF(50mL) 溶液冷卻至-75℃，然後逐滴地滴加n-BuLi(17.5mL，正己烷溶液，1.6N，43.8mmol)，將混合物在-75℃下攪拌2小時，隨後加入200mL飽和NH4Cl水溶液淬滅反應，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取混合物，並用50mL飽和食鹽水洗滌合併的有機層，進行乾燥(Na2SO4)並減壓濃縮。用快速色譜純化殘餘物(黃色油狀物)，用0至40%EtOAc/PE梯度洗脫，得到淡黃色油狀物(2.0g，44%)。 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ ppm 1.20-1.50(m,21H),4.25(q,J=7.2Hz,2H),4.51-4.65(m,1 H),8.18(s,1 H)；m/z(ESI)+：309[M+H]+。
可以類似於28和29在步驟2中使用碘甲烷或碘乙烷製備下面的吡唑硼酯：
合成實施例68：
步驟1
合成3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(1-甲基呱啶-4-基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-4-胺(30)
在130℃下，將在50mL圓底燒瓶中的4-氯-3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶(3.0g，7.5mmol)、1-甲基呱啶-4-胺(2.57g，22.5mmol)和DIEA(3.87g，30mmol)的混合物攪拌過夜。隨後減壓濃縮反應物，並用正相柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH梯度洗脫，得到棕色固體3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(1-甲基呱啶-4-基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-4-胺(2.7g，75%)。m/z(ESI)+：478[M+H]+。
步驟2
合成1-異丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基呱啶-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(31)
在N2保護下，將3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(1-甲基呱啶-4-基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-4-胺(464mg，0.97mmol)、1-異丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(300mg，0.97mmol)，Pd(dppf)Cl2(80mg，0.097mmol)和2N Na2CO3(1mL，2mmol)的1,4-二氧六環(20mL)溶液加熱至90℃並攪拌過夜。隨後用EtOAc(100mL)稀釋混合物，用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL)洗滌並通過Na2SO4進行乾燥。過濾有機相並濃縮濾液，得到殘餘物，將該殘餘物通過矽膠色譜純化，用DCM/MeOH=10/1(v/v)洗脫，得到黃色油狀物1-異丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基呱啶-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(300mg，58%)。m/z(ESI)+：532[M+H]+。
步驟3
合成(1-異丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基呱啶-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(32)
在0℃下，將LiAlH4(182mg，4.79mmol)分批加入至1-異丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基呱啶-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-羧酸乙酯(510mg，0.96mmol)的無水THF(20mL)溶液中。將混合物在室溫下攪拌1小時。隨後用水(5mL)和EtOAc(100mL)淬滅反應。過濾懸浮液，分離有機相並用飽和食鹽水(15mL)洗滌，隨後通過Na2SO4進行乾燥。 過濾有機相，並減壓濃縮濾液。通過矽膠色譜，以DCM/MeOH=6/1(v/v)洗脫來純化殘餘物，得到白色固體(1-異丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基呱啶-4- 基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(300mg，64%)。m/z(ESI)+：490[M+H]+。
步驟4
合成1-異丙基-5-(4-甲氧基苄基)-9-(1-甲基呱啶-4-基)-1,5,9,10-四氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁(33)
在0℃在N2下，將甲磺醯氯(144mg，1.22mmol)逐滴地加入至(1-異丙基-4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((1-甲基呱啶-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(300mg，0.61mmol)和Et3N(185mg，1.84mmol)的THF(50mL)溶液中。隨後將反應在室溫下攪拌0.5小時，TLC顯示起始原料消失，隨後加入t-BuOK(206mg，1.84mmol)。將反應在N2保護下加熱至60℃攪拌1小時，隨後用水(10mL)淬滅反應並用EtOAc(100mL)萃取，用飽和食鹽水(30mL)洗滌有機相，通過Na2SO4進行乾燥。過濾有機相並濃縮濾液，得到殘餘物，通過以DCM/MeOH=6/1(v/v)洗脫的矽膠色譜純化該殘餘物，得到無色油狀物1-異丙基-5-(4-甲氧基苄基)-9-(1-甲基呱啶-4-基)-1,5,9,10-四氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁(200mg，69%)。m/z(ESI)+：472[M+H]+。
步驟5
合成1-異丙基-9-(1-甲基呱啶-4-基)-1,5,9,10-四氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁(實施例68)
在70℃下，將1-異丙基-5-(4-甲氧基苄基)-9-(1-甲基呱啶-4-基)-1,5,9,10-四氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁(200mg，0.42mmol)在TFA(5mL)中的混合物攪拌過夜，減壓濃縮，通過製備型HPLC純化所得殘餘物，合 併所收集的洗脫液，用飽和的NaHCO3水溶液調節至pH=8，並用EtOAc(10mL×3)萃取，通過Na2SO4乾燥有機相並進行過濾，減壓濃縮濾液，得到白色固體1-異丙基-9-(1-甲基呱啶-4-基)-1,5,9,10-四氫-1,2,4,5,8,9-六氮雜苯並[cd]環戊二烯並[h]薁(110mg，74%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 1.44(d,J=6.0Hz,6H),1.63-1.71(m,2H),1.91-2.12(m,4H),2.22-2.32(m,3H),2.92(s,2H),4.47(s,2H),4.62(m,1H),4.93-4.96(m,1H),6.7，9(d,J=6.0Hz,1H),7.78-7.81(m,2H),12.95(br s,1H)；m/z(ESI)+：352[M+H]+。
實施例69-88
類似於實施例68，在步驟1中使用合適的胺以及在步驟2中使用適當的吡唑硼酯而製備實施例69-88。對於實施例69和76，合適的吡唑硼酯是實施例65步驟2中的中間體17。
實施例89
步驟1
合成4-碘-6-(三氟甲基)煙酸(34)
在3000mL的3頸圓底燒瓶中，氮氣保護，將2,2,6,6-四甲基呱啶(34.5g，141mmol)的無水THF(600mL)溶液降溫-78℃，維持-78℃，將n-BuLi(98mL，2.4M己烷溶液)加入並攪拌反應0.5小時，後將6-三氟甲基煙酸(15g，78mmol)的無水THF(50mL)溶液逐滴地加入，並在-78℃下將混合物攪拌2.5小時。隨後緩慢加入I2(29.3g，117mmol)的無水THF(50mL)溶液，並同樣在-78℃下攪拌反應1小時。隨後將100mL飽和NH4Cl水溶液加入淬滅反應，通過1N HCl將反應液的pH值調節至4~5，隨後用DCM(400mL×3)萃取混合物，Na2SO4進行乾燥，過濾並減壓濃縮，得到殘餘物，通過在正相矽膠柱純化(PE/EA/AcOH，1：10：0.01，v/v/v)，得到黃色固體化合物34(10g，40%)。m/z(ESI)-：316[M-H]-。
步驟2
合成4-碘-6-(三氟甲基)煙酸甲酯(35)
在室溫下，將煙酸衍生物34(10g，31mmol)，K2CO3(8.7g，63mmol)和MeI(5.37g，37.9mmol)在DMF(25mL)中的混合物攪拌過夜。隨後向反應混合物中加入H2O(300mL)。過濾混合物並用水(20mL)洗滌濾餅，在空氣中乾燥，得到黃色固體化合物35(10g，粗品)。m/z(ESI)+：332[M+H]+。
步驟3
合成4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)-6-(三氟甲基)煙酸甲酯(36)
在N2保護下，將碘化物35(10.0g，30.0mmol)、雙(頻哪醇合)二硼(11.5g，45.3mmol)、KOAc(5.9g，60.4mmol)和Pd(dppf)2Cl2(3.31g，4.53mmol)混合於1,4-二氧六環(100mL)中，升溫至95℃並維持該溫度持續攪拌18小時。 後降溫濃縮，殘餘物在於EtOAc(300mL)和水(80mL)之間分液。用水(200 mL×2)洗滌有機層，用無水Na2SO4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過正相矽膠柱層析(PE/EA，v/v，20：1至10：1梯度)純化殘餘物，得到黃色固體的產物(2.2g)。 m/z(ESI)+：250[M+H]+。
步驟4
合成4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-6-(三氟甲基)煙酸(37)
用N2將化合物3a(1.23g，2.66mmol)、化合物36(2.2g，6.6mmol)和K2CO3(733mg，5.32mmol)的1,4-二氧六環/H2O(4：1，v/v，20mL)溶液脫氣。隨後，向上述溶液中加入PPh3(175mg，0.67mmol)和Pd(PPh3)4(185mg)。 在氮氣保護下，將混合物在100℃下攪拌18小時。減壓濃縮反應混合物，得到殘餘物，通過正相矽膠柱層析純化(DCM/MeOH，v/v，5：1至2：1梯度洗脫)，得到化合物37，為黃色固體(1.0g，69%)。m/z(ESI)+：528[M+H]+。
步驟5
合成(4-(1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲醇(38)
在0℃下，將中間體37(1g，1.9mmol)，AlCl3(234mg，1.9mmol)和LiAlH4(261mg，7.86mmol)在無水THF(40mL)中的混合物攪拌1小時。 依次地將H2O(0.26mL)、15%NaOH(水溶液，0.26mL)和H2O(0.8mL)加入至混合物中。過濾混合物並減壓濃縮濾液，正相矽膠柱層析純化殘餘物(PE/EA，v/v，5：1至2：1梯度洗脫)，得到為黃色油狀物的產物(240mg，24.6%)。 m/z(ESI)+：514[M+H]+。
步驟6
合成11-(4-甲氧基苄基)-4-(四氫-2H-吡喃-4-基)-8-(三氟甲基)-5,11-二氫-4H-3,4,7,10,11-五氮雜二苯並[cd,h]薁(39)
在0℃，將MsCl(112mg，0.97mmol)逐滴地加入至中間體38(250mg，0.49mmol)和TEA(198mg，1.95mmol)的無水THF(20mL)溶液中。在0℃下攪拌0.5小時後，加入t-BuOK(219mg，1.95mmol)。隨後在55℃下攪拌反應1.5小時，減壓濃縮，得到殘餘物，正相矽膠柱層析純化殘餘物(PE/EA，1：1，v/v)，得到為黃色固體的化合物39(230mg，95%)。m/z(ESI)+：496[M+H]+。
步驟7
合成4-(四氫-2H-吡喃-4-基)-8-(三氟甲基)-5,11-二氫-4H-3,4,7,10,11-五氮雜二苯並[cd,h]薁(實施例89)
化合物39(230mg，0.46mmol)在微波反應管中溶於TFA(3mL)，後微波輔助加熱至105℃反應攪拌1小時，後減壓濃縮，殘餘物通過製備型HPLC純化，得到白色固體(55mg，33.1%)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ ppm 1.76(d,J=10.6Hz,2H),2.18(dt,J=11.5,7.7Hz,2H),3.47(t,J=11.4Hz,2H),4.04(dd,J=11.1,3.6Hz,2H),4.41(t,J=10.2Hz,1H),4.89(s,2H),7.24(d,J=6.8Hz,1H),7.86(d,J=6.9Hz,1H),8.27(s,1H),9.19(s,1H),14.70(s,1H)；19F-NMR(376MHz,DMSO-d 6 )δ ppm -66.72,-74.41；m/z(ESI)+：376[M+H]+.。
實施例90-92
在步驟1中使用合適的吡啶，類似於實施例89地製備實施例90-92。
實施例93
步驟1
合成2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)乙醇(40)
在100℃下，將3-碘-1-(4-甲氧基苄基)-N-(四氫-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-4-胺(1.5g，3.23mmol)、2-(甲基氨基)乙醇(1.98g，32.3mmol)、 碘化亞銅(123mg，0.65mmol)、L-脯氨酸(150mg，1.3mmol)和t-BuONa(621mg，6.46mmol)在DMSO(15mL)中的混合物攪拌過夜。隨後用EtOAc(100mL)稀釋混合物，用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL×1)洗滌，通過Na2SO4進行乾燥，過濾混合物並濃縮濾液，殘餘物通過正相矽膠柱層析純化，以PE/EtOAc=2/1(v/v)洗脫，得到無色油狀物2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)乙醇(760mg，57%)。 m/z(ESI)+：412[M+H]+。
步驟2
合成2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)甲磺酸乙酯(41)
在0℃下N2保護，將甲磺醯氯(429mg，3.7mmol)逐滴地加入至2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)乙醇(760mg，1.85mmol)和Et3N(560mg，5.55mmol)的THF(76mL)溶液中，隨後在室溫下將混合物攪拌0.5小時。用水(10mL)淬滅反應並用EtOAc(20mL×2)萃取，用飽和食鹽水(20mL×1)洗滌合併的有機相，並通過Na2SO4進行乾燥，過濾有機相並濃縮濾液，殘餘物通過正相矽膠柱層析純化，PE/EtOAc=3：1(v/v)洗脫，得到無色油狀物2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)甲磺酸乙酯(489mg，54%)。m/z(ESI)+：490[M+H]+。
步驟3
合成2-(4-甲氧基苄基)-9-甲基-6-(四氫-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氫-2H-1,2,5,6,9-五氮雜苯並[cd]薁(42)
將t-BuOK(312mg，2.79mmol)加入至2-((1-(4-甲氧基苄基)-4-((四氫-2H-吡喃-4-基)氨基)-1H-吡唑並[4,3-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)甲磺酸乙酯(455mg，0.93mmol)的無水THF(50mL)溶液中。在N2下，將反應物加熱至60℃反應1小時。隨後用水(10mL)淬滅反應並用EtOAc(100mL)萃取，用飽和食鹽水(30mL)洗滌有機相，並且通過Na2SO4進行乾燥，過濾有機相，減壓濃縮濾液，殘餘物通過正相矽膠柱層析純化，PE/EtOAc=1/1(v/v)洗脫，得到油狀物2-(4-甲氧基苄基)-9-甲基-6-(四氫-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氫-2H-1,2,5,6,9-五氮雜苯並[cd]薁(167mg，46%)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 1.57-1.66(m,2H),1.79(m,2H),3.06(s,3H),3.37(m,2H),3.60(m,4H),3.77(s,3H),4.04(m,2H),5.24(m,3H),6.37(d,J=6.0Hz,1H),6.82(d,J=8.0Hz,2H),7.16(d,J=8.0Hz,2H),7.78(d,J=6.0Hz,1H)；m/z(ESI)+：394[M+H]+。
步驟4
合成9-甲基-6-(四氫-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氫-2H-1,2,5,6,9-五氮雜苯並[cd]薁(實施例93)
在N2下，將2-(4-甲氧基苄基)-9-甲基-6-(四氫-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氫-2H-1,2,5,6,9-五氮雜苯並[cd]薁(150mg，0.38mmol)的TFA(7.5mL)溶液加熱至70℃反應8小時，後減壓濃縮除去TFA，將殘餘物溶解於EtOAc(150mL)中，用NaHCO3水溶液(20mL×2)、飽和食鹽水(20mL×1)洗滌，通過Na2SO4進行乾燥，過濾後濃縮濾液，殘餘物通過製備TLC(DCM/MeOH=11/1，v/v)純化，得到白色固體9-甲基-6-(四氫-2H-吡喃-4-基)-6,7,8,9-四氫-2H-1,2,5,6,9-五氮雜苯並[cd]薁(75mg，72%)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ ppm 1.71(m,2H),1.87(m,2H),3.02(s,3H),3.44(m,4H),3.78(m,2H),3.98(m,2H),4.33(m,1H), 6.84(s,1H),7.55(s,1H),12.35(br s,1H),12.98(br s,1H)；19F-NMR(376MHz,DMSO-d 6 )δ ppm -74.41；m/z(ESI)+：274[M+H]+。
實施例94
在步驟1中使用2-(乙基氨基)乙醇代替2-(甲基氨基)乙醇，類似於實施例93地製備實施例94。
使用以下方法，測定實施例的LRRK2抑制和對其它激酶如JAK2的選擇性。
材料和方法
材料
在AdaptaTM激酶測定法(LRRK2_IC50測定)中：激酶反應緩衝液含有5×激酶緩衝液S(Life Technologies，PV5213)和2mM DTT(Life Technologies，P2325)。激酶LRRK2 G2019S蛋白(PV4881)和ERM(LRRKtide，PV5093)源自Life Technologies。AdaptaTM通用激酶測定試劑盒(Life Technologies，PV5099)包含以下組分：AdaptaTMEu-抗-ADP抗體(PV5097；4μg)；10μM AlexaFluor®647 ADP示蹤劑(PV5098；200pmol)；TR-FRET稀釋緩衝液(PV3574；100ml)；激酶淬滅緩衝液(P2825；1ml)；10mM ATP(PV3227；500μl)；和10mM ADP (PV5096；500μl)。LRRK2-IN-1(1234480-84-2，HY-10875)源自MedChem Express。
在LANCE®激酶測定法(JAK2_IC50選擇性測定)中：JAK2(Invitrogen，目錄號PV4288)，ATP(Sigma，目錄號A7699-1 g)，DMSO(Sigma，目錄號D2650)，DTT(Sigma，目錄號43815)，LANCE Ultra ULightTM-JAK-1肽(Perkin Elmer，目錄號TRF0121)，LANCE Eu-W1024磷酸化酪氨酸抗體(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0069)，LANCETM檢測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100)，Tofacitinib(PharmaBlock Sciences(Nanjing)，Inc，目錄號PBN2011586-01)；設備：Envision(Perkin Elmer)，Bravo(Agilent)；消耗品：384孔中間板(Greiner，目錄號781280)，384孔測定板(Perkin Elmer，目錄號6007299)，
在果蠅模型中：抗LRRK2(phospho S935)抗體[UDD2 10(12)](ab133450)源自Abcam。ddc-GAL4源自蘇州大學醫學系。
Adapta TM 激酶試驗方法
Adapta®通用激酶測定法是一種用於檢測ADP的均勻的基於螢光的免疫測定法。與ATP消耗測定法相反，Adapta®測定法對ADP形成非常敏感，大多數信號能夠在初始10-20%的ATP轉化為ADP時改變發生。這使得Adapta®通用激酶測定法非常適合用於低活性激酶。
在室溫(~21℃)下進行所有測定，並且在所用條件下該測定與時間和酶濃度呈線性關係。由5×激酶緩衝液S儲存液(以上列出的)製備1×激酶反應緩衝液溶液，通過向8ml H2O中加入2ml 5×儲存液來製備10ml的1×激酶反應緩衝液。將20μl的1M DTT加入至此1×激酶反應緩衝液中。
在低容量384孔板中以10μl體積進行激酶反應。通常，使用Greiner板(目錄# 3674 #，低容量，白壁，784075)。未經測試的其它未經處理的測定板也可能是合適的。這種測定中的底物濃度為100μM，且1×激酶反應緩衝液由50mM Tris-HCl pH8.5、10mM MgCl2、1mM EGTA、0.01%Brij-35和2mM DTT，以及任何其它的可能是特定激酶所必需的添加劑。允許激酶反應在室溫下進行1小時，隨後添加5μl的TR-FRET稀釋緩衝液中的激酶淬滅緩衝液(EDTA；30mM)、Eu標記的抗體(6nM)和示蹤劑(18.9nM)的製劑。測定孔中的抗體的最終濃度為2nM，示蹤劑為6.3nM且EDTA為10mM。允許板在室溫下平衡至少30分鐘，隨後在配置用於AdapttaTM TR-FRET的平板讀取儀上讀取。
使用BMG LABTECH PHERAstar平板讀取儀，使用用於AdaptaTM的適當濾波器和儀器設置產生本文檔中提供的資料。在孔中以1%DMSO(最終)篩選測試化合物。對於8點滴定，從起始濃度進行5次連續稀釋。
LANCE ® 激酶選擇性試驗方法
該測定法涉及兩個步驟，酶促步驟和用HTRF試劑進行的檢測步驟。步驟1：在酶促步驟期間，將底物生物素與感興趣的激酶一起孵育。加入ATP，開始反應。步驟2：檢測試劑捕獲磷酸化底物，所得TR-FRET與磷酸化水準成比例。
化合物製備：將測試化合物溶解於30mM DMSO溶液中，並在室溫下將此溶液放入氮氣罩中長期儲存；以3倍係數，總共11種濃度，稀釋DMSO中的30mM化合物；吸出1μl化合物，隨後用激酶緩衝液將該化合物稀釋25倍。 混合均勻，室溫下平衡30分鐘。
激酶反應：通過Agilent Bravo，將2.5μl激酶緩衝液(4x)中的化合物轉移到測定板中。旋轉板；通過使用Eppendorf電子多通道移液器，將5μl酶混合物轉移到測定板中。旋轉板；在室溫(23℃)下孵育測定板20分鐘；通過使用Multidrop，將2.5μl的含有ATP的激酶緩衝液加入至測定板中。旋轉並密封板；在室溫(23℃)下孵育測定板90分鐘。
停止反應：使用Eppendorf電子多通道移液器，將10μl檢測試劑(2nM LANCE Eu-W1024磷酸化酪氨酸抗體)轉移至測定板中。旋轉並密封板；在室溫(23℃)下孵育測定板60分鐘。
檢測和讀取：激發波長為340nm，初次發射波長為615nm，二次發射波長為665nm(分別用於Cryptate和Ulight)。用EnVision讀板，得到兩個波長的讀數；計算665nm/615nm的比率。
使用XLfit(IDBS Inc.)軟體，獲得IC50估計值。
果蠅模型篩選方法
果蠅模型用於在體內評價實例。由Andrea Brand和Norbert Perrimon於1993年開發的GAL4/UAS系統[45]用於產生表達多巴胺(DA)神經元中的LRRK2-G2019S的轉基因果蠅。該系統有兩個部分：編碼酵母轉錄啟動蛋白GAL4的GAL4基因和GAL4特異性結合啟動基因轉錄的增強子UAS(上游啟動序列)。該系統利用了與UAS特異性結合的酵母GAL4轉錄因數。將UAS-野生型-LRRK2和UAS-G2019S-LRRK2轉基因與多巴脫羧酶(ddc)-GAL4驅動子[46]組合，以在DA神經元中表達LRRK2-G2019S。10μM的GW5074用作陽性對照。陰性對照組為DMSO對照(所有化合物以1：1000稀釋溶解於DMSO 中)。在12小時光照12小時黑暗迴圈中將果蠅保持在25℃。GW5074用作為陽性對照[47]。
存活率
收集二十隻最新封閉的雌性果蠅，並將其放入食物小瓶中。每隔一天將果蠅轉移到新鮮的食物小瓶中，此時記錄死亡。
基於果蠅的生存曲線，50%存活時間參數表示存活一半果蠅的時間，並且將此參數用於比較不同組之間的存活率。基於每組的4個獨立實驗，計算平均50%存活時間和標準誤差。通過GraphPad PRISM® 6.0軟體分析資料。
攀爬試驗(Climbing Assay)
負趨地性測定用於分析果蠅的運動能力。讓每小瓶的二十隻果蠅(每組四隻小瓶)每週進行一次攀爬試驗。
將待測試的果蠅轉移至垂直塑膠管(15cm高，1.5cm的直徑)中。 在室溫下靜置30分鐘後，將果蠅輕輕敲打至管底，計數10秒內可以爬至或高於測試線的果蠅數目，並且計算百分比。
基於每個小瓶的三次獨立實驗分析攀爬能力，並通過GraphPad PRISM® 6.0軟體分析資料。
在第6周進行的激酶試驗
在冰上將成體果蠅頭均質化，在具有ATP和DTT的激酶反應緩衝液中進行腦裂解物的激酶反應。
隨後，通過12%SDS-PAGE凝膠，使裂解物進行電泳，並轉移到PVDF膜(Millipore)。在室溫下，在具有5%脫脂乳的TBST中封閉該膜1小 時，隨後在4℃下在抗LRRK2 pSer935抗體(Abcam，ab133450)和抗Flag抗體中孵育過夜。
用HRP綴合的二抗和ECL檢測試劑檢測蛋白質。通過Image J軟體分析免疫印跡的光密度，並計算磷酸化LRRK2蛋白相比於Flag蛋白的比率，並通過GraphPad PRISM® 6.0軟體分析資料。
激酶選擇性試驗方法
1. MKK1試驗
這是一種兩步測定法，其中在25.5μl的含有25mM Tris、0.1mM EGTA、0.01%Brij35、10mM乙酸鎂和0.005mM ATP中，無活性的MAPK(0.06mg/ml)被MKK1(稀釋於25mM Tris、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.01%Brij35、1mg/ml BSA中)啟動。在室溫下孵育30分鐘後，從第一次反應移液5μl至20μl的含有(終濃度)25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.66mg/ml髓鞘鹼性蛋白(MBP)、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的第二反應混合物中，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集至P81 Unifilter板上。
2. MAPK2/ERK2試驗
在25.5μl終體積的25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，測定針對於MBP的MAPK/ERK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分 鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集至P81 Unifilter板中。
3. JNK1a1/SAPK1c試驗
在25.5μl終體積的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，測定針對於ATF2(啟動轉錄因數)的JNK1a1/SAPK1c(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
4. SAPK 2a/p38試驗
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的SAPK 2a/p38(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
5. SAPK 2b/p38ß2試驗
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的SAPK 2b/p38ß2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵 育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
6. SAPK 3/p38 g試驗
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的SAPK 3/p38 g(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
7. SAPK 4/p38 試驗
在含有25mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的SAPK 4/p38d(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
8. MAPKAP-K1a試驗
在含有50mM Na-b-甘油磷酸鹽pH 7.5、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKLNRTLSVA的MAPKAP-K1a(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1% b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育40分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
9. MAPKAP-K2試驗
在含有50mM Na-b-甘油磷酸鹽pH 7.5、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKLNRTLSVA的MAPKAP-K2(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1% b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
10. MSK1試驗
在含有8mM MOPS pH7.0、0.2mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於經修飾的Crosstide肽GRPRTSSFAEGKK的MSK1(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、0.1% b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
11. PRAK試驗
在含有50mM b-甘油磷酸鈉pH 7.5、0.1mM EGTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKLRRTLSVA的PRAK(5-20mU，稀釋於50mM b-甘油磷酸鈉pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% b-巰基乙醇、1mg/ml BSA)，並在室溫下孵育30 分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
12. PKA試驗
在含有8mM MOPS pH 7.5、0.2mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於肯普肽(LRRASLG)的PKA(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、0.1% b-巰基乙醇、1mg/ml BSA)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
13. PKCa試驗
在磷脂醯絲氨酸(PtdSerine)和DAG(0.1mg/ml和10μg/ml)以及0.1mM CaCl2存在下，測定針對於組蛋白H1的PKCa(5-20mU，稀釋於20mM Hepes pH 7.4,0.03%Triton X-100中)。該測定在25.5μl終體積中進行，該體積含有20mM Hepes pH 7.4、0.03%Triton X-100、0.1mg/ml組蛋白H1、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)，並在室溫下孵育30分鐘。 通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板中。
製備PtdSer/DAG：-在MeOH/氯仿(1：2)中的PtdSer原料=10mg/ml。乾燥所需量。重懸於適當體積的10mM Hepes pH 7.4中。渦旋並短暫地超音波。(2×10-15秒，間隔10-15秒)。在MeOH/氯仿(1：2)中的DAG原料=10mg/ml。乾燥所需量。添加經超音波的PtdSer溶液。進行渦旋和超音波。
14. PDK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%%b-巰基乙醇、100μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於PDKtide(KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQ-EMFRDFDYIADWC)的PDK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.05%%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
15. △PH-PKBa-S473D試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於經修飾的Crosstide肽GRPRTSSFAEGKK的△PH-PKB.a-S473D(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
16. SGK試驗
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於經修飾的Crosstide肽GRPRTSSFAEGKK的SGK(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
17. S6K1/P70 S6K試驗
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、0.1mM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKRNRTLTV)的S6K1/P70 S6K(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
18. GSK3b試驗
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、20μM磷酸化GS2肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於磷酸化GS2肽(YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(PO4)EDEEE)的GSK3b(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
19. ROCK-II(ROKa)試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、30μM Long S6底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於Long S6底物肽(KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK)的ROCK-II(ROKa)(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
20. AMPK試驗
在含有50mM Hepes pH 7.5、1mM DTT、0.02% Brij35、0.4mM SAMS肽、0.196mM AMP、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於SAMS底物肽(HMRSAMSGLHLVKRR)的AMPK(5-20mU，稀釋於50mM Hepes pH 7.5、1mM DTT、0.02% Brij35中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
21. CHK1試驗
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、200μM CHKtide、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於CHKtide底物肽(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR)的CHK1(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.1%b-巰基乙醇、0.01% Brij-35、5%甘油、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
22. CK2試驗
在含有20mM Hepes pH 7.5、0.15M NaCl、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.1% Triton-X 100、CKII肽(0.165mM)、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於CKII肽(RRRDDDSDDD)的CK2(5-20mU，稀釋於20mM Hepes pH 7.5、0.15M NaCl、0.1mM EGTA、0.1% Triton X-100、5mM DTT、50%甘油中)，並在室溫下孵 育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
23. PBK試驗
在含有50mM Tris pH 8.6、50mMb-甘油磷酸鈉、0.04mM CaCl2、磷酸化b肽(0.196mM)、10mM乙酸鎂、0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於磷酸化b肽(KRKQISVRGL)的PBK(5-20mU，稀釋於50mMb-甘油磷酸鈉pH 7.0、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育15分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
24. LCK試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3Vo4、Cdc2肽(0.25mM)、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於Cdc2肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的LCK(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育15分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
25. CSK試驗
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、Cdc2肽(0.25mM)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於Cdc2肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的CSK(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1%b-巰基乙醇、 1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
26. CDK2/週期蛋白A試驗
在含有50mM Hepes pH7.5、1mM DTT、0.02% Brij35、100mM NaCl、組蛋白H1(1mg/ml)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於組蛋白H1的CDK2/週期蛋白A(5-20mU，稀釋於50mM Hepes pH 7.5、1mM DTT、0.02% Brij35、100mM NaCl中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
27. DYRK 1A試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、350μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於Woodtide的DYRK 1A(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
28. CK1試驗
在含有20mM Hepes pH 7.5、0.15M NaCl、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.1% Triton-X 100、CKI肽(0.5mM)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於CKI肽(RRKDLHDDEEDEAMSITA)的CK1(5-20mU，稀釋於20mM Hepes pH7.5、0.15M NaCl、0.1mM EGTA、0.1% Triton X-100、5mM DTT、50%甘油中)， 並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
29. NEK6試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.01% Brij、0.1%b-巰基乙醇、NEK6肽(0.3mM)、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於NEK6肽(FLAKSFGSPNRAYKK)的NEK6(5-20mU，稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
30. NEK2a試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.01% Brij、0.1%b-巰基乙醇、300μM NEK2a肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於NEK2a肽(RFRRSRRMI)的5-20mU的NEK2a(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
31. MAPKAP-K1b/RSK2試驗
在含有50mM b-甘油磷酸鈉(pH 7.5)、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKLNRTLSVA)的MAPKAP-K1b(5-20mU， 稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
32. IKKb試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(LDDRHDSGLDSMKDEEY)的5-20mU的IKKb(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
33. smMLCK試驗
在含有50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA、5mM CaCl2、10μM鈣調素、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKRPQRATSNVFA)的5-20mU的smMLCK(稀釋於50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
34. PRK2試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、30μM Long S6肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole) 的25.5μl終體積中，測定針對於Long S6肽(KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK)的5-20mU的PRK2(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
35. MNK2α試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.5mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(eIF4E)的5-20mU的MNK2(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
36. CAMK-1試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM鈣調素、0.1%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(YLRRRLSDSNF)的5-20mU的CAMK-1(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
37. PIM2試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM鈣調素、0.1%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RSRHSSYPAGT)的5-20mU的PIM2(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
38. NEK7試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.01% Brij、0.1%b-巰基乙醇、底物肽(0.3mM)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(FLAKSFGSPNRAYKK)的NEK7(5-20mU，稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，且用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
39. JNK3a1試驗
在25.5μl終體積的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% b-巰基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，測定針對於ATF2(啟動轉錄因數)的JNK3 a1(5-20mU，稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
40. MAPKAP-K3試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKLNRTLSVA)的5-20mU的MAPKAP-K3(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
41. ERK8試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的5-20mU的ERK8(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
42. MNK1試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.5mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(eIF4E)的5-20mU的MNK1(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
43. SRPK1試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RSRSRSRSRSRSRSR)的5-20mU的SRPK1(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
44. △PH-PKBβ(S474D)試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於經修飾的Crosstide肽(GRPRTSSFAEGKK)的△PH-PKB β-S474D(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
45. Aurora B試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG)的Aurora B(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
46. CHK2試驗
在含有8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、200μM CHKtide、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於CHKtide底物肽(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR)的CHK2(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.1%b-巰基乙醇、0.01% Brij-35、5%甘油、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
47. Src試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的Src(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
48. EF2K試驗
在含有50mM Hepes pH 6.6、0.2mM CaCl2、0.3μM鈣調素、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RKKFGESKTKTKEFL)的EF2K(5-20mU，稀釋於50mM Hepes pH 6.6、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
49. MARK3試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於CHKtide底物(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR)的MARK3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
50. MST2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的MST2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、100μM釩酸鹽中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
51. PKD1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKLNRTLSVA)的PKD1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。 通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
52. PLK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、10μM釩酸鹽、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(ISDELMDATFADQEAKKK)的PLK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA、100μM釩酸鹽中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
53. DYRK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、350μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於Woodtide(KKISGRLSPIMTEQ)的DYRK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
54. JNK2試驗
在25.5μl終體積的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% b-巰基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)中，測定針對於ATF2(啟動轉錄因數)的JNK2 1(5-20mU，稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
55. DYRK3試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、350μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於Woodtide(KKISGRLSPIMTEQ)的DYRK3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH7.5、0.1mM EGTA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
56. HIPK2試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的5-20mU的HIPK2(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
57. HIPK3試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的5-20mU的HIPK3(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
58. PAK4試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RRRLSFAEPG)的PAK4(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
59. PAK5(PAK7)試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RRRLSFAEPG)的PAK5(PAK7)(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
60. PAK6試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RRRLSFAEPG)的PAK6(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
61. CAMKKa試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM鈣調素、0.1%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(AKPKGNKDYHLQTCCGSLAYRRR)的5-20mU的CAMKKa(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
62. CAMKKb試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.5mM CaCl2、0.3μM鈣調素、0.1%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(DGEFLRTSCGSPNYAARRR)的5-20mU的CAMKKb(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
63. PIM1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RSRHSSYPAGT)的PIM1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
64. PIM3試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RSRHSSYPAGT)的PIM3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
65. PLK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、10μM釩酸鹽、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(ISDELMDATFADQEAKKK)的PLK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA、100μM釩酸鹽中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
66. BRSK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKLNRTLSFAEPG)的BRSK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
67. MELK試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、200μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKLNRTLSFAEPG)的MELK(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
68. PKCζ試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、10μM釩酸鹽、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(ERMRPRKRQGSVRRRV)的PKCζ(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA、100μM釩酸鹽中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
69. Aurora C試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.05%b-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG)的Aurora C(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
70. ERK1試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.1%b-巰基乙醇、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的5-20mU的ERK1(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1%b-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
71. FGF-R1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的FGF-R1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
72. IRR試驗
在含有50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的5-20mU的IRR(稀釋於50mM Hepes(pH 7.5)、0.1mM EGTA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
73. EPH-A2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-A2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、 1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
74. MST4試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的5-20mU的MST4(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
75. SYK試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的SYK(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
76. YES1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的YES1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
77. IGF-1R試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKKSPGEYVNIEFG)的IGF-1R(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
78. VEG-FR試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKKSPGEYVNIEFG)的VEG-FR(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
79. BTK試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KVEKIGEGTYGVVYK)的BTK(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
80. IR-HIS試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKSRGDYMTMQIG)的IR-HIS(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
81. EPH-B3試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-B3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
82. TBK1(DU12569)試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、300μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE)的TBK1(DU12569)(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
83. IKKepsilon(DU14231)試驗
在含有50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-g-ATP](500-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積 中，測定針對於MBP的5-20mU的IKKepsilon(DU14231)(稀釋於50mM Tris(pH 7.5)、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定。使用50mM正磷酸的洗滌緩衝液將測定液收集到P81 Unifilter板上。
84. GCK試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的GCK(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
85. IRAK4試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的IRAK4(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
86. NUAK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM ALNRTSSDSALHRRR、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於ALNRTSSDSALHRRR的NUAK1 (5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
87. MLK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的MLK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Uifilter板上。
88. MINK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的MINK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
89. MLK3試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的MLK3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl 的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
90. LKB1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.2mM LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR的LKB1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。 通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
91. HER4試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml聚Glut Tyr、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於聚Glut Tyr的HER4(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
92. TTK試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM RSRSRSRSRSRSRSR、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於RSRSRSRSRSRSRSR的TTK(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)， 並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
93. RIPK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的RIPK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
94. Aurora A試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於LRRLSLGLRRLSLGLRRLSLGLRRLSLG的Aurora A(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
95. PAK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM RRRLSFAEPG、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於RRRLSFAEPG的PAK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過 加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
96. BRSK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKLNRTLSFAEPG、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKLNRTLSFAEPG的BRSK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
97. HIPK3試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的HIPK3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
98. HIPK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的HIPK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl 的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
99. JNK3α1試驗
在25.5μl終體積的50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、ATF2(3μM)、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](500-1000cpm/pmole)中，測定針對於ATF2(啟動轉錄因數)的JNK3(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA、0.1% β-巰基乙醇中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
100. MAPKAP-K3試驗
在含有50mM β-甘油磷酸鈉pH 7.5、0.5mM EDTA、30μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKLNRTLSVA的MAPKAP-K3(5-20mU，稀釋於20mM MOPS pH 7.5、1mM EDTA、0.01% Brij35、5%甘油、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
101. MARK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的MARK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30 分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
102. MARK4試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的MARK4(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
103. EPH-B4試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-B4(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
104. JAK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.05% β-巰基乙醇、100μM底物肽、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於PDKtide(KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQ-EMFRDFDYIADWC)的JAK2(5-20mU， 稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.05% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
105. EPH-A4試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-A4(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
106. TAK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、300μM底物肽、10mM乙酸鎂、0.5mM MnCl和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RLGRDKYKTLRQIRQ)的TAK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
107. TrkA試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的TrkA(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、10mM MnCl、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過 加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
108. MEKK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.33mg/ml MBP、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於MBP的MEKK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
109. MARK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的MARK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
110. CLK2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.3mM肽、10mM DTT、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(RNRYRDVSPFDHSR)的CLK2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl 的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
111. DAPK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.3mM肽、10mM DTT、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(KKLNRTLSFAEPG)的DAPK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
112. EPH-B2試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、1mg/ml底物肽、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於底物肽(聚Glut Tyr)的EPH-B2(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、1mg/ml BSA中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
113. TSSK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR、10mM乙酸鎂和0.02mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR的TSSK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA、10mM DTT中)，並在 室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
114. TESK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.2mg/ml肌動蛋白素2、10mM乙酸鎂和0.05mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於肌動蛋白素2的TESK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA、10MM DTT中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
115. TTBK1試驗
在含有50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.3mM RRKDLHDDEEDEAMSITA、10mM乙酸鎂和0.005mM[33P-γ-ATP](50-1000cpm/pmole)的25.5μl終體積中，測定針對於RRKDLHDDEEDEAMSITA的TTBK1(5-20mU，稀釋於50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1% β-巰基乙醇、1mg/ml BSA、10mM DTT中)，並在室溫下孵育30分鐘。通過加入5μl的0.5M(3%)正磷酸來停止測定，隨後用50mM正磷酸的洗滌緩衝液收集到P81 Unifilter板上。
LRRK2效力
下表示出了以本發明實施例抑制LRRK2 G2019S的IC50值。
JAK2選擇性
下表示出了本發明實施例的JAK2 IC50值。
果蠅模型的效力
存活率
下表示出了本發明實施例的存活率。
*P<0.05，與DMSO陰性對照相比。
攀爬試驗
下表示出了本發明實施例的攀爬測定。
在第6周進行的激酶試驗
下表示出了本發明實施例的激酶測定結果。
激酶選擇性數據
代表性化合物的激酶選擇性資料如下表所示。以1μM抑制劑濃度下的每種特異性激酶的抑制百分比表示值。
在不脫離本發明的範圍和精神下，本發明描述方面的各種修改和變體對於本領域技術人員將是顯而易見的。雖然已經結合具體的較佳實施方式描述了本發明，但是應當理解，所要求保護的本發明不應被不適當地限於這些具體實施方式。實際上，實施本發明的所描述的模式的各種修改，這種修改對於相關領域的技術人員是顯而易見的，意圖在所附權利要求的範圍內。
參考文獻
1. Lees AJ, Hardy J, Revesz T (2009) Parkinson's disease. Lancet 373: 2055-2066.
2. Nalls MA, Pankratz N, Lill CM, Do CB, Hernandez DG,等人(2014) Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk loci for Parkinson's disease. Nat Genet 46: 989-993.
3. Simon-Sanchez J, Schulte C, Bras JM, Sharma M, Gibbs JR,等人(2009) Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat Genet 41: 1308-1312.
4. Satake W, Nakabayashi Y, Mizuta I, Hirota Y, Ito C,等人(2009) Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat Genet 41: 1303-1307.
5. Rudenko IN, Cookson MR (2014) Heterogeneity of leucine-rich repeat kinase 2 mutations: genetics, mechanisms and therapeutic implications. Neurotherapeutics 11: 738-750.
6. Fonzo A, Wu-Chou Y-H, Lu C-S, Doeselaar M, Simons EJ, 等人(2006) A common missense variant in the LRRK2 gene, Gly2385Arg, associated with Parkinson’s disease risk in Taiwan. Neurogenetics 7: 133-138.
7. Farrer MJ, Stone JT, Lin CH, Dachsel JC, Hulihan MM,等人(2007) Lrrk2 G2385R is an ancestral risk factor for Parkinson's disease in Asia. Parkinsonism Relat Disord 13: 89-92.
8. West AB, Moore DJ, Biskup S, Bugayenko A, Smith WW,等人(2005) From The Cover: Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences 102: 16842-16847.
9. Khan NL, Jain S, Lynch JM, Pavese N, Abou-Sleiman P,等人(2005) Mutations in the gene LRRK2 encoding dardarin (PARK8) cause familial Parkinson's disease: clinical, pathological, olfactory and functional imaging and genetic data. Brain.
10. Kachergus J, Mata IF, Hulihan M, Taylor JP, Lincoln S,等人(2005) Identification of a Novel LRRK2 Mutation Linked to Autosomal Dominant Parkinsonism: Evidence of a Common Founder across European Populations. The American Journal of Human Genetics 76: 672-680.
11. Ozelius LJ, Senthil G, Saunders-Pullman R, Ohmann E, Deligtisch A,等人(2006) LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson's Disease in Ashkenazi Jews. New England Journal of Medicine 354: 424-425.
12. Jaleel M, Nichols RJ, Deak M, Campbell David G, Gillardon F,等人(2007) LRRK2 phosphorylates moesin at threonine-558: characterization of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochemical Journal 405: 307-317.
13. Ishihara L, Gibson RA, Warren L, Amouri R, Lyons K,等人(2007) Screening for Lrrk2 G2019S and clinical comparison of Tunisian and North American Caucasian Parkinson's disease families. Movement Disorders 22: 55-61.
14. Tan, E. K. (2006) Identification of a common genetic risk variant(LRRK2 Gly2385Arg) in Parkinson's disease. Ann Acad Med Singapore. 35: 840-842.
15. Ross OA, Wu Y-R, Lee M-C, Funayama M, Chen M-L,等人(2008) Analysis of Lrrk2 R1628P as a risk factor for Parkinson's disease. Annals of Neurology 64: 88-92.
16. Ross OA, Soto-Ortolaza AI, Heckman MG, Aasly JO, Abahuni N,等人(2011) Association of LRRK2 exonic variants with susceptibility to Parkinson's disease: a case-control study. The Lancet Neurology 10: 898-908.
17. Paisán-Ruíz C, Jain S, Evans EW, Gillks WP, Simón J,等人(2004) Cloning of the Gene Containing Mutations that Cause PARK8-Linked Parkinson's Disease. Neuron 44: 595-600.
18. Zimprich A, Biskup S, Leitner P, Lichtner P, Farrer M,等人(2004) Mutations in LRRK2 Cause Autosomal-Dominant Parkinsonism with Pleomorphic Pathology. Neuron 44: 601-607.
19. Agalliu I, San Luciano M, Mirelman A,等人(2015) Higher frequency of certain cancers in lrrk2 g2019s mutation carriers with parkinson disease: A pooled analysis. JAMA Neurology 72: 58-65.
20. Singleton AB, Farrer MJ, Bonifati V (2013) The genetics of Parkinson's disease: Progress and therapeutic implications. Movement Disorders 28: 14-23.
21. Jostins L, Ripke S, Weersma RK, Duerr RH, McGovern DP,等人(2012) Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature 491: 119-124.
22. Marcinek P, Jha AN, Shinde V, Sundaramoorthy A, Rajkumar R,等人(2013) LRRK2 and RIPK2 Variants in the NOD 2-Mediated Signaling Pathway Are Associated with Susceptibility to Mycobacterium leprae in Indian Populations. Plos One 8: e73103.
23. Marín I (2006) The Parkinson Disease Gene LRRK2: Evolutionary and Structural Insights. Molecular Biology and Evolution 23: 2423-2433.
24. Rudenko IN, Kaganovich A, Hauser DN, Beylina A, Chia R,等人(2012) The G2385R variant of leucine-rich repeat kinase 2 associated with Parkinson's disease is a partial loss-of-function mutation. Biochemical Journal 446: 99-111.
25. Mata IF, Wedemeyer WJ, Farrer MJ, Taylor JP, Gallo KA (2006) LRRK2 in Parkinson's disease: protein domains and functional insights. Trends in Neurosciences 29: 286-293.
26. Taylor JP, Mata IF, Farrer MJ (2006) LRRK2: a common pathway for parkinsonism, pathogenesis and prevention？ Trends in Molecular Medicine 12: 76-82.
27. Greggio E, Jain S, Kingsbury A, Bandopadhyay R, Lewis P,等人(2006) Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiology of Disease 23: 329-341.
28. Heo HY, Park J-M, Kim C-H, Han BS, Kim K-S,等人(2010) LRRK2 enhances oxidative stress-induced neurotoxicity via its kinase activity. Experimental Cell Research 316: 649-656.
29. Reinhardt P, Scbmid B, Burbulla Lena F, Schöndorf David C, Wagner L,等人(2013) Genetic Correction of a LRRK2 Mutation in Human iPSCs Links Parkinsonian Neurodegeneration to ERK-Dependent Changes in Gene Expression. Cell Stem Cell 12: 354-367.
30. Sanders LH, Laganière J, Cooper O, Mak SK, Vu BJ,等人(2014) LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: Reversal by gene correction. Neurobiology of Disease 62: 381-386.
31. Manzoni C, Lewis PA (2013) Dysfunction of the autophagy/lysosomal degradation pathway is a shared feature of the genetic synucleinopathies: The FASEB Journal 27: 3424-3429.
32. Orenstein SJ, Kuo S-H, Tasset I, Arias E, Koga H,等人(2013) Interplay of LRRK2 with chaperone-mediated autophagy. Nat Neurosci 16: 394-406.
33. Manzoni C, Mamais A, Dihanich S, Abeti R, Soutar MPM,等人(2013) Inhibition of LRRK2 kinase activity stimulates macroautophagy. Biochimica et Biophysica Act a(BBA)-Molecular Cell Research 1833: 2900-2910.
34. Swan M, Saunders-Pullman R (2013) The Association Between ß-Glucocerebrosidase Mutations and Parkinsonism. Current Neurology and Neuroscience Reports 13: 1-10.
35. LiL, Zhang X, Le W (2010) Autophagy Dysfunction in Alzheimer’s Disease. Neurodegenerative Diseases 7: 265-271.
36. Nixon RA (2013) The role of autophagy in neurodegenerative disease. Nat Med 19: 983-997.
37. Westbroek W, Gustafson AM, Sidransky E (2011) Exploring the link between glucocerebrosidase mutations and parkinsonism. Trends in Molecular Medicine 17: 485-493.
38. Reddy JV, Ganley IG, Pfeffer SR (2006) Clues to Neuro-Degeneration in Niemann-Pick Type C Disease from Global Gene Expression Profiling. Plos One 1: e19.-supporting information Dataset S1
39. Kawakami F, Yabata T, Ohta E, Maekawa T, Shimada N,等人(2012) LRRK2 Phosphorylates Tubulin-Associated Tau but Not the Free Molecule: LRRK2-Mediated Regulation of the Tau-Tubulin Association and Neurite Outgrowth. Plos One 7: e30834.
40. Taymans J-M, Cookson MR (2010) Mechanisms in dominant parkinsonism: The toxic triangle of LRRK2, α-synuclein, and tau. BioEssays 32: 227-235.
41. Bailey RM, Covy JP, Melrose HL, Rousseau L, Watkinson R,等人(2013) LRRK2 phosphorylates novel tau epitopes and promotes tauopathy. Acta Neuropathologica 126: 809-827.
42. Li Y, Liu W, Oo TF, Wang L, Tang Y,等人(2009) Mutant LRRK2R1441 g BAC transgenic mice recapitulate cardinal features of Parkinson's disease. Nat Neurosci 12: 826-828.
43. Goedert M, Jakes R (2005) Mutations causing neurodegenerative tauopathies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease 1739: 240-250.
44. Rothman RB, Blough BE, Baumann MH (2008) Dopamine/serotonin releasers as medications for stimulant addictions. In: Giuseppe Di Giovann VDM, Ennio E, editors. Progress in Brain Research: Elsevier. pp. 385-406.
45. Brand AH, Perrimon N (1993) Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development 118: 401-415.
46. Liu Z, Wang X, Yu Y, Li X, Wang T,等人(2008) A Drosophila model for LRRK2-linked parkinsonism. Proceedings of the National Academy of Sciences 105: 2693-2698.
47. Liu Z, Hamamichi S, Dae Lee B, Yang D, Ray A,等人(2011)Inhibitors of LRRK2 kinase attenuate neurodegeneration and Parkinson-like phenotypes in Caenorhabditis elegans and Drosophila Parkinson's disease models. Human Molecular Genetics 20: 3933-3942.

Claims (22)

  1. 一種通式I的化合物或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、藥學上可接受的鹽或酯：其中：V是CH或N；W是N或O；R1是不存在的、H、C1-10烷基、C3-10環烷基、C2-10雜環烷基、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C1-5烷基-C1-10雜芳基，或C1-5烷基-C6-14芳基，其中所述的C1-10烷基、C3-10環烷基、C2-10雜環烷基、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C1-5烷基-C1-10雜芳基和C1-5烷基-C6-14芳基各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7環烷基和C2-7雜環烷基中的一個以上的取代基取代；X1是CO或-CH2-；Y是-CH2-、-(CR2R3)-、C6-14芳基或C1-10雜芳基，任選地R2和R3與它們所連接的碳原子一起形成C3-C10碳環或3至10元雜環，其中該-CH2-、-(CR2R3)-、C6-14芳基、C1-10雜芳基、C3-C10碳環和3至10元雜環各自獨立地且任選地被選自C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代；Z是鍵、NR2、-CH2-或-(CR2R3)-，其中該NR2、-CH2-和-(CR2R3)-各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代；R2和R3獨立地選自-H、C1-6-烷基、C3-7-環烷基、C2-7-雜環烷基、C6-14芳基或C1-10-雜芳基，其中該C1-6-烷基、C3-7-環烷基、C2-7-雜環烷基、C6-14芳基和C1-10-雜芳基各自任選地且獨立地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH，和-CO2H中的一個以上的取代基取代。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R1是H、C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C1-3烷基-C1-7雜芳基，或C1-3烷基-C6-10芳基，其中該C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C1-3烷基-C1-7雜芳基，和C1-3烷基-C6-10-芳基各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基、C3-7環烷基，和C3-7雜環烷基中的一個以上的取代基取代。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中Y是-CH2-、-(CR2R3)-、C6-10芳基或C3-8雜芳基，任選地R2和R3與它們所連接的碳原子一起形成C3-C8碳環或3至8元雜環，其中該-CH2-、-(CR2R3)-、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C3-C8碳環和3至8元雜環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、C1-6烷基，和C1-6鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之化合物，其中Y是-CH2-、-(CR2R3)-，其中Q1、Q2、Q3和Q4各自獨立地是C或N，並且Q1、Q2、Q3和Q4各自任選地被選自C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH和C1-6鹵代烷基中的一種以上的取代基取代，其中Q5、Q6和Q7各自獨立地是C、N、O或S，並且Q5、Q6和Q7各自任選地被選自C1-6烷基、C3-7環烷基、C3-7雜環烷基、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH和C1-6鹵代烷基中的一種以上的取代基取代。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R2和R3獨立地選自-H、C1-3烷基、C3-5環烷基、C3-5雜環烷基、C6-8芳基或C3-8雜芳基，其中該C1-3烷基、C3-5環烷基、C3-5雜環烷基、C6-8芳基和C3-8雜芳基各自任選地且獨立地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH，和-CO2H中的一個以上的取代基取代。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R1選自以下基團：
  7. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R1進一步地選自以下基團：
  8. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中Y是-CH2-、-(CR2R3)-、苯環、5至6元雜芳環、C6-10芳基或C3-8雜芳基，任選地R2和R3與它們所連接的碳原子一起形成C3-C6碳環或3至6元雜環，其中該苯環、5至6元雜芳環、C6-10芳基、C3-8雜芳基、C3-C6碳環和3至6元雜環各自獨立地且任選地被選自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-N3、-NH2、-OH、甲基、乙基、正丙基、異丙基、-CF3，和C1-3鹵代烷基中的一個以上的取代基取代。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中Y選自以下基團：
  10. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中Y進一步地選自以下基團：
  11. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構之一或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、藥學上可接受的鹽或酯：
  12. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物進一步地具有以下結構之一或其立體異構體、互變異構體、N-氧化物、水合物、藥學上可接受的鹽或酯：
  13. 一種包含如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之化合物的藥物組合物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之藥物組合物，進一步地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑、輔料或其組合。
  15. 一種如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之化合物或如申請專利範圍第13項或第14項所述之藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療由癌症和神經退行性疾病中的至少一種引起的病症。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之用途，其中該神經退行性疾病是帕金森氏病。
  17. 一種如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之化合物或如申請專利範圍第13項或第14項所述之藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由任何異常激酶活性引起的、與之相關或伴隨的病症。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中該激酶是LRRK。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的用途，其中該激酶是LRRK2。
  20. 一種如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之化合物或如申請專利範圍第13項或第14項所述之藥物組合物在試驗中的用途，該試驗用於鑒定能夠抑制激酶的另外候選化合物。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之用途，其中該激酶是LRRK。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該激酶是LRRK2。
TW106119751A 2016-06-15 2017-06-14 取代的三環雜環化合物及其用途 TWI659955B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
??PCT/CN2016/085811 2016-06-15
CNPCT/CN2016/085811 2016-06-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201800411A TW201800411A (zh) 2018-01-01
TWI659955B true TWI659955B (zh) 2019-05-21

Family

ID=61725384

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106119751A TWI659955B (zh) 2016-06-15 2017-06-14 取代的三環雜環化合物及其用途

Country Status (1)

Country Link
TW (1) TWI659955B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003072550A1 (fr) * 2002-02-28 2003-09-04 Eisai Co., Ltd. Nouveaux composes indazole a anneaux fusionnes
WO2013164323A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyrazole aminopyrimidine derivatives as lrrk2 modulators for use in the treatment of parkinson's disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003072550A1 (fr) * 2002-02-28 2003-09-04 Eisai Co., Ltd. Nouveaux composes indazole a anneaux fusionnes
WO2013164323A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyrazole aminopyrimidine derivatives as lrrk2 modulators for use in the treatment of parkinson's disease

Also Published As

Publication number Publication date
TW201800411A (zh) 2018-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3035800B1 (en) Compounds inhibiting leucine-rich repeat kinase enzyme activity
EP2408772B1 (en) Compounds
US10954240B2 (en) Compounds inhibiting leucine-rich repeat kinase enzyme activity
CA2803156C (en) Fused heterocyclic compounds as phosphodiesterases (pdes) inhibitors
CA2673368C (en) 3-benzofuranyl-4-indolyl maleimides as potent gsk3 inhibitors for neurogenerative disorders
TWI501965B (zh) 作為ｐｄｅ１０ａ酵素抑制劑之新穎苯基咪唑衍生物
EP1539759B1 (en) Novel imidazopyridines and their use
KR101803984B1 (ko) Ｐｄｅ１０ａ 효소 저해제로서의 헤테로방향족 페닐이미다졸 유도체
CA2783727C (en) 2-arylimidazole derivatives as pde10a enzyme inhibitors
CA2770087C (en) Imidazopyridine or imidazopyrimidine derivatives as phosphodiesterase 1oa inhibitors
CA2783728C (en) Heteroaromatic aryl triazole derivatives as pde10a enzyme inhibitors
EP2601192B1 (en) Fused heterocyclic compounds
CN103153994A (zh) 双环杂芳基激酶抑制剂及使用方法
EP2298731A1 (en) Amide compound
JP2010518153A (ja) ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン化合物、該ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン化合物を合成するために用いられるアザインドール化合物、それらの製造方法、及びそれらの使用
KR20150128768A (ko) 시르투인 조절제로서의 티에노[3,2-d]피리미딘-6-카르복스아미드 및 유사체
EP3672958B1 (en) Annulated glycosidase inhibitors
CN109071558B (zh) 取代的三环杂环化合物及其用途
CN110958882B (zh) 作为糖原合酶激酶3(gsk3)抑制剂的三环化合物及其用途
TWI659955B (zh) 取代的三環雜環化合物及其用途
WO2015163431A1 (ja) 片頭痛治療剤
WO2012124782A1 (ja) 縮合複素環化合物
US20230099293A1 (en) Oga inhibitor compounds
WO2023122298A1 (en) Protein stabilizing compounds containing usp28 and/or usp25 targeting ligands
WO2020150423A1 (en) Methods for the treatment of neurological disorders