JP2011251969A

JP2011251969A - 抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体

Info

Publication number: JP2011251969A
Application number: JP2011144055A
Authority: JP
Inventors: Kiichiro Kobori; 樹一郎小堀; Takuji Matsumoto; 拓二松本; Kazunori Saito; 和典齋藤
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2011-12-15

Abstract

【課題】ヒトＨＬに特に結合特異性を有する抗ヒトＨＬ抗体、及び当該抗体を用いて血中ＨＬを簡単かつ高感度に測定する方法の提供。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列を有するペプチド１もしくは、別の特定な配列からなるアミノ酸配列を有するペプチド８、又は上記のアミノ酸のうち１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いる、特定な配列からなるアミノ酸配列を認識する抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、家族性ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ欠損症、肝疾患・低栄養状態、動脈硬化症等の診断薬として有用な高い抗原認識特異性を有する抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体及びこれを用いた試薬に関する。

ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ(Hepatic triglyceride lipase,HL)はHepatocyteで合成される６５ｋＤａの糖蛋白質である。リポ蛋白リパーゼ(Lipoproteinlipase, LPL)と同様に、ＨＬはトリグリセリドの水解を触媒し、トリグリセリドリッチなカイロミクロンや超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）からコレステロールリッチレムナント粒子への転換を起こす。各リパーゼはヘパリン結合蛋白質でヒトや実験動物のポストヘパリン血漿（ＰＨＰ）中に見出される。初期の研究ではレムナントクリアランスでのＨＬの役割が確立されていた。ラットやサルへの抗ＨＬＩｇＧの注入によるＨＬ活性阻害により、放射活性標識したレムナント粒子の肝臓取込みが損なわれ、血漿ＶＬＤＬやＬＤＬ画分の蓄積が起こる。ヒトでは家族性ＨＬ欠損症が存在するとコレステロールやトリグリセリドを含むレムナント様粒子の血漿レベルが上がり、早発の動脈硬化性疾患を呈する。トランスジェニックのマウスやウサギでのヒトＨＬの発現は総血漿コレステロールの低下を呈する。高脂肪食負荷のＨＬノックアウトマウスでは、ＨＬの発現により異常脂質プロファイルの矯正が起こり、大動脈コレステロールが明らかに減少する。これらの結果はＨＬの抗動脈硬化的役割を支持している。また、ＨＬは肝で合成される半減期の短い糖蛋白質であることから、肝機能や栄養状態を反映する極めて臓器特異性の高い診断マーカーとしても注目されている。

健常人及び上記各種疾患に罹患している患者の体液中のＨＬを定量する方法として、主に原理の異なる２種類の方法（活性量及び蛋白量）が行なわれている。ＨＬは肝内皮細胞表面に係留している酵素であることから、ヘパリンを静注して血中に遊離の状態で取り出すことが行われている。このヘパリン投与後の血漿をポストヘパリン血漿（ＰＨＰ）と呼んでいる。現在、ＰＨＰ中にはトリグリセリドを分解する２種類のリパーゼが存在することが知られており、ＨＬと肝外組織の毛細血管内皮細胞表面に糖鎖を介して係留しているリポ蛋白リパーゼ（Lipoprotein lipase,LPL）である。ＨＬを精密に測定するためには、ＨＬとＬＰＬを分別定量することが必要である。ＨＬを活性量で定量する方法としては、一般的には２種の酵素（ＨＬとＬＰＬ）の一方を何らかの方法により不活性化後、残存するもう一方の酵素を至適条件下で測定する方法がある。代表的な方法としては、（１）１ＭのNaClでＬＰＬを不活性化後、ＰＨＰ中の残存するＨＬ活性を測定する方法、（２）ヘパリンセファロースカラムを用いＨＬとＬＰＬをNaClの濃度により分別溶出後、それぞれの酵素活性を測定する方法などがある。しかし、（１）の方法は、NaClの選択中和後、NaClが残存する活性酵素に悪い影響を与え、活性を部分的に不活性化させてしまい、（２）のカラム法は、時間がかかり、回収率に問題があることが知られている。

ＨＬを蛋白量で測定する方法に関しては、非特許文献１がモノクローナル抗体を用いた定量方法を報告している。しかし、原料ロット間差が知られている細胞壁由来の不溶性担体を使用し、遠心分離が必要であるなど操作が煩雑である。また、このモノクローナル抗体の抗原認識部位は知られておらず、抗原測定などに用途が限定される。

池田康行ら、メディカルイムノロジー（Medical Immunology）、第１８巻、第４号、６４３頁、１９８９年

従って本発明の目的は、ヒトＨＬに特に結合特異性を有する抗ヒトＨＬ抗体、及び当該抗体を用いて血中ＨＬを簡単かつ高感度に測定する方法を提供することにある。

かかる実情において本発明者らは、高い結合特異性（抗原認識特異性）を有する抗ＨＬ抗体を得るべく種々検討した結果、配列番号１又は２のいずれか１つの配列部分がヒトＨＬの免疫応答優位部位であり、これらの配列に極めて高い結合特異性（抗原認識特異性）を有する抗ヒトＨＬ抗体を得ることに成功し、更に当該抗体を用いたイムノアッセイによれば、ヒトＨＬを簡便かつ高感度に測定できること、また、当該抗体はＨＬの測定のみならず、ヒトＨＬの分離・精製や、本配列部分又は、本配列以外の配列に異常がある遺伝子異常症の検出にも極めて有用であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列番号１もしくは２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸のうち１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列を認識する抗ヒトＨＬ抗体又はそのフラグメントを提供するものである。
また、本発明は上記の抗ヒトＨＬモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。また、本発明は上記の抗ヒトＨＬ抗体、そのフラグメント又はそれらの標識体を含有するヒトＨＬ測定試薬を提供するものである。
また、本発明は、ヒト血液由来検体に上記の抗ヒトＨＬ抗体、そのフラグメント又はそれらの標識体を反応させることを特徴する該検体中のヒトＨＬ測定法を提供するものである。
更に本発明は、上記の抗ヒトＨＬ抗体又はそのフラグメントを不溶性担体に固定化してなる固定化抗ヒトＨＬ抗体又は固定化フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりヒトＨＬを分離又は精製する方法を提供するものである。

本発明の抗ヒトＨＬ抗体は、ヒトＨＬに対する特異性が高く、ＬＰＬに反応しないので、ヒトＨＬ測定用抗体として有用である。従って、本発明抗体を用いれば簡便かつ高感度でヒトＨＬを測定することができ、動脈硬化症及び肝機能診断に有利である。

ヒトＨＬの免疫応答優位部位を特定した結果を示す図である。ヘパリンセファロース４Ｂクロマトグラフィーにより分画したフラクションを固相化した酵素免疫測定法を用い、ＨＴＧＬとＬＰＬの分別状態を検定した結果を示す図である。モノクローナル抗体３Ａ２を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるヒトＨＬのクロマトグラムを示す図である。モノクローナル抗体３Ａ２を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたヒトＨＬの精製度を示す電気泳動図である。本発明によって確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＨＬの定量法の検量線を示す図である。本発明によって確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＨＬの定量法の正確性を示す図である。本発明によって確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＨＬの定量法の特異性を示す図である。

本発明の抗ヒトＨＬ抗体は、ヒトＨＬに対して反応性を有し、かつ抗原認識部位が配列番号１もしくは２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸のうち１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列を認識するものである。ここにおけるアミノ酸の変異の数及び部位は、特に限定されない。「１〜数個」とは、常用される技術、例えば部位特異的変異誘発法により生じさせることができる個数を意味し、具体的には１〜１０個程度を意味するが、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜３個である。

本発明の抗ヒトＨＬ抗体は、ヒトＨＬに対して反応性を有し、かつヒトＬＰＬと反応しないのが好ましい。

本発明抗ヒトＨＬ抗体にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも含まれるが、モノクローナル抗体が好ましい。特に好ましい例としては、ＦＥＲＭＰ−１８１８１として寄託されたハイブリドーマ３Ａ２により産生され、配列番号１を認識するモノクローナル抗体３Ａ２が挙げられる。

本発明抗体が、認識する配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列は、ヒトＨＬにおける免疫応答優位部位である。このようなヒトＨＬの免疫応答優位部位に対する抗体は例えば次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）により製造できる。

（ａ）免疫抗原の調製・選択蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の一次構造を利用して、組換え蛋白質を発現させ、抗原として調製する工程（ａ−１）及び蛋白質の基本的な性質を利用し、親水性領域及び一次構造に動物種間が明確な合成ペプチドの配列を選択して合成する工程（ａ−２）である。ペプチドを選択する方法としては、ホップとウッド法（Hopp & Woods法、プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第７８巻、第３８２４〜３８２８頁、１９８１年）、Perker antigenicity法、Protrusion index antigenicity法及びWellingantigenicity法などを使用することが出来る。合成するペプチドの種類は、好ましくは５〜１０個以上、更に好ましくは５〜１０個である。

（ｂ）蛋白質の免疫応答優位部位の特定（ア）（ａ−１）で発現させた蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を（ａ−２）で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位を特定する工程。
（イ）（ａ−１）で発現させた蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞培養上清を、（ａ−２）で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応せしめ、ハイブリドーマ細胞群中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程。
（ウ）（ａ−２）で合成したペプチドを担体蛋白質と結合させ、各々のペプチドと担体蛋白質の結合物を等量ずつ混合した抗原、又は、各々のペプチドを等量ずつ混合して担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を（ａ−２）で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程。
（エ）（ａ−２）で合成したペプチドを担体蛋白質と結合させ、各々のペプチドと担体蛋白質の結合物を等量ずつ混合した抗原、又は、各々のペプチドを等量ずつ混合して担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞培養上清を、（ａ−２）で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応せしめ、ハイブリドーマ細胞群中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程。

上記工程（ア）及び（イ）により、選択的に高い結合特異性（抗原認識特異性）を有する抗体を製造することが容易になり、更にハイブリドーマ細胞樹立後に抗体の特異性を評価する複数の工程（ウェスタンブロティング法、高原を固相化した酵素免疫測定法、免疫沈降法、高価なペプセット（PepSet^TM、倉敷紡績（株）社製）など）を大幅に省略化できる。また各々５〜１０個のペプチドをそれぞれ哺乳動物に免疫する煩雑さを解消し、省力化と経費削減を達成できる。上記工程（ウ）及び（エ）により、各々５〜１０個のペプチドをそれぞれ哺乳動物に免疫する煩雑さを解消し、省力化と経費削減達成ができる。

（ｃ）蛋白質中の免疫応答優位部位に対する抗体の製造上記（イ）及び（ウ）の工程で得られたハイブリドーマ細胞から、蛋白質中の免疫応答優位部位を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択して、組換え蛋白質と免疫応答優位部位に対応するペプチドの２種類の抗原をそれぞれ固相化した担体に反応させ、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性（抗原認識特異性）を有するハイブリドーマ細胞を製造することも出来るが、下記の（オ）、（カ）及び（キ）の工程によりモノクローナル抗体を製造するのが好ましい。

（オ）生体試料より単離した蛋白質抗原又は、（ａ−１）で発現させた当該蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞から、免疫抗原と免疫応答優位部位に対応するペプチド群をそれぞれ固相化した担体に反応せしめ、免疫応答優位部位を認識し、免疫抗原に対して高い結合特異性（抗原認識特異性）を有するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を製造する工程。

（カ）（ｂ）で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞から組換え蛋白質と免疫応答優位部位に対応するペプチドの２種類の抗原をそれぞれ固相化した担体に反応させ、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を製造する工程。

（キ）（ｂ）で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有する抗血清及びポリクローナル抗体を製造する工程及び、抗血清を免疫応答優位部位に対応するペプチドを固相化した担体に反応させたのち、常法に従い担体を単離後、担体より抗体画分を分画して、高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するポリクローナル抗体群を濃縮する工程。

抗原として用いられるヒトＨＬとしては、配列番号３記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ヒトＨＬ蛋白質中の特定のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えばヒトＨＬの配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドや、ヒトＨＬの配列番号２で示されるアミノ酸配列又は配列番号２記載のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。上記組換えＨＬ（配列番号３）、配列番号１の配列及び配列番号２の配列で示される配列を含むペプチド類は、常法により化学合成又は遺伝子発現させることにより得られる。ペプチドの合成法としては、「実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック」（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜７４頁、１９９２年）等に記載されているような一般的な方法に従って合成できる。例えばｔ−ＢＯＣ（tert-butyloxylcarbony 1)法、Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbony 1)法あるいはＭＡＰ(Multiple Antigen Peptide)法を使用することができる。遺伝子発現による方法としては、アミノ酸配列を各々発現可能なように配列した遺伝子を発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。宿主細胞としては、原核細胞（例えば大腸菌）及び真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）のいずれをも使用することができる。担体との結合を効果的にするためには、配列番号１又は２のいずれかで示されるペプチドのＮ又はＣ末端にシステイン、リジン、アルギニン等のアミノ酸を付与することもできる。Ｎ又はＣ末端にシステインを付与した場合、システインのアミノ基あるいはカルボキシ基はフリーにし、反対側の末端はブロックする。また、アミノ末端をフリーにして合成し、カルボキシ末端をアミドにし、担体との結合にビスイミドエステルを用いてもよい。ペプチドの担体としては、アルブミン、グロブリン等の哺乳動物由来蛋白質、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質、不活性化した結核菌等の微生物、ポリリジン、ポリアスパラギン等のポリアミノ酸、多糖類などが使用できる。

ヒトＨＬをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３記載のアミノ酸配列からなるヒトＨＬをコードするＤＮＡ（配列番号４）を利用できる。配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡは、常法に従って化学合成することができ、またヒト肝臓から常法に従って抽出したｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号４記載の塩基配列にしたがって設計したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅することもできる。更に、ヒトＨＬをコードするＤＮＡは、常法に従って作製したヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから、配列番号４記載の塩基配列に従って設計したプローブを用いて得ることもできる。ヒトＨＬをコードするＤＮＡからのヒトＨＬの調製は、例えば、ヒトＨＬをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、該ベクターより適当な宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養物を精製することにより行うことができる。

本発明のモノクローナル抗体は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されているようなモノクローナル抗体の一般的な製造方法に従って、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。かかるハイブリドーマは、抗原を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。

具体的には、精製ヒトＨＬを抗原として、又は当該ヒトＨＬのアミノ酸配列の一部である配列番号１又は２のいずれかの配列からなるペプチド、もしくはこれと担体との結合物を抗原として該抗原を哺乳動物（ヒト抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたヒト抗体産生マウスのようなトランスジェニック動物も含む）、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ、更に具体的にはマウス、ラットあるいはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行なって、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。

ハイブリドーマの創製は、例えばケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って行なうことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒトに由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを細胞融合することにより調製される。例えばマウス由来のミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ，Ｓｐ２）ＰＡ１、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等を使用することができる。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中培養上清の哺乳動物の免疫感作で用いた抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。ここでは、前述の（ｃ）の（オ）及び（カ）の工程により効率的にヒトＨＬに対する抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。

目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする方法は、通常の方法に従えば良く、特に限定されない。ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行なうことができる。

ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の生産は、ハイブリドーマをインビトロ又はインビボで培養し、得られた培養上清又は哺乳動物の腹水から単離することにより行なうことかできる。インビトロの培養では、モノクローナル抗体を産生させるために用いられる既知の栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調整されるあらゆる栄養培地を用いて実施することができる。基本培地としては、例えば、Ｈａｍ'Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／又は種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。インビボの培養では、マウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等、好ましくはマウス、もしくはラット、より好ましくはマウスの腹水等で実施することができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈殿法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ、ＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供すること等により行なうことができる。

本発明のポリクローナル抗体は、前記モノクローナル抗体の調製で挙げたのと同様の文献に記載されているような一般的な方法に従って、調製することができる。すなわち、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマあるいはウシ等の哺乳動物やニワトリなどの鳥類、好ましくはラット、モルモット、ウサギあるいはヤギに、配列番号１又は２のいずれかのペプチド、もしくはそれらの混合物又はその担体との結合物を、モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫して、これにより製造されるヒトＨＬに反応性を有する抗体を含む血清、乳あるいは卵を、上記モノクローナル抗体の場合と同様にして単離、精製することにより調製することができる。

精製蛋白質を用いるポリクローナル抗体の生産方法は、良く知られた方法であるが、抗原にごくわずかにでも抗原性を有する夾雑物があれば、それらに対する抗体も共に生産されてしまうことが問題となっている。また、精製蛋白質をヒト生体試料から得ようとする場合は、倫理的な問題、原材料中の感染性物質による作業者の健康への問題、製造物のロット間差の問題など、多くの問題がある。これに対し本発明の配列番号１又は２の配列のペプチドを利用する方法は、原料に由来する問題がなく、製造ロット間差についてもほとんど無視することができ、更に、配列番号１又は２の配列が、蛋白質発現やペプチド合成設備を有する施設であれば容易に入手することができるなど、生体試料由来の精製蛋白質を用いる方法に比べ、数多くのメリットがあり、極めて有用である。また、配列番号１又は２は、選択的に蛋白質の免疫応答優位部位に対する高い結合特異性(抗原認識特異性)抗体を製造する様に設計されており、免疫抗原としての優位性は極めて高い。以上のようにして得られた本発明の抗ヒトＨＬ抗体は、蛋白分解酵素であるペプシン、パパイン等で処理する等の常法により、抗体フラグメント、すなわちＦａｂ'又はＦ（ａｂ'）₂とすることができ、本発明の測定法や精製法においては、本発明の抗ヒトＨＬ抗体のみならず、このような抗体フラグメントを使用することもできる。

上記本発明の抗ヒトＨＬ抗体、そのフラグメント又はそれらの標識体を用いれば、簡便かつ高感度にヒト血液由来検体中のＨＬを検出又は定量することが可能となる。ヒト血液由来検体としては、特に限定されないが、例えば、血漿、血清等が挙げられる。

検体を測定するためには、上記で得られた抗体を用いて免疫学的測定方法を実施すればよい。測定方法としては、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテツクス免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フロロイムノアッセイ、イムノクロマトアッセイ、光学免疫測定法などを利用することができる。本発明の測定系としては、得られたヒトＨＬに対する抗体を用い放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫比濁法、免疫沈降法、イムノクロマト法などの公知の免疫測定方法を構築することにより、ヒトＨＬを測定することができる。標識として酵素を使うことは有利であり、酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどが好適である。また、標識に金コロイド、ラテックスやカーボン粒子のような目視で判別できるものを用いても有利である。

免疫測定法の一つの例として、いわゆる競合免疫測定法がある。例えば、検体に放射性同位体等で標識したヒトＨＬを一定量混合し、更に抗ヒトＨＬ抗体を混合し検体中のヒトＨＬ及び標識ヒトＨＬを反応させる。検体中のヒトＨＬは、標識ヒトＨＬと競合して抗ヒトＨＬ抗体と反応するため、検体中にヒトＨＬが存在する分、標識ヒトＨＬとの反応が減少する。反応後、抗ヒトＨＬ抗体をあらかじめ固相担体に結合させておくか、抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡと抗ヒトＨＬ抗体を反応させることにより、結合、非標識ヒトＨＬを分離する。一般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素等を検出することによりヒトＨＬを測定することが可能となる。

免疫測定法のもう一つの例として、いわゆるサンドイッチ系がある。例えば、抗ヒトＨＬ抗体をマイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用いられる担体に結合させ、これを検体と接触させる事により、検体中のヒトＨＬを担体上にある抗ヒトＨＬ抗体と反応させる。一般に用いられている方法により結合していない分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗ヒトＨＬ抗体と接触させ、担体上にある抗ヒトＨＬ抗体と結合したヒトＨＬと反応させる。一般に用いられている方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等を検出することによりヒトＨＬを測定することが可能となる。また、金コロイド、ラテックスやカーボン粒子のような視覚的に判定可能な物質を前述の抗体の一方に標識をして、上述のサンドイッチ系又は競合法に応用し、判定することも可能である。この測定系に用いる抗ヒトＨＬ抗体、標識抗ヒトＨＬ抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はその組み合わせのいずれを用いることも可能である。

ここで肝要なことは、担体に結合する抗体とヒトＨＬとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み合わることであり、このような抗体の組み合わせは、前述の系の組み立て、その系に適用してみることにより選択することができる。

凝集検定も有利な実施形態であり、前述の抗体の一方で被覆された粒子と、他の抗体で被覆された粒子を作製する。検出すべき物質への粒子の結合により、凝集が起こり、これは濁りの変化を判定あるいは検出することができる。また、代表的なヒトＨＬ蛋白質濃度を測定できる免疫測定法であるサンドイッチＥＬＩＳＡ法の場合、本発明のモノクローナル抗体３Ａ２をプラスチックプレートに固定化し、２次抗体に本発明のポリクローナル抗体、３次抗体にペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を用いるのが好ましい。

本発明の抗ヒトＨＬ抗体又はフラグメントを不溶性担体に固定化してなる固定化抗ヒトＨＬ抗体又は固定化フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、試料中に含まれるヒトＨＬを分離又は精製することができる。

このようなヒトＨＬを分離又は精製に用いられる不溶性担体としては、（１）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラスチックやガラスに代表されるような水不溶性物質からなるプレート、試験管、もしくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、あるいはメンブレン等のほか、（２）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、多孔性シリカ系担体等を用いることができる。

このようなアフィニティークロマトグラフィーとしては、例えば（ａ）不溶性担体として上記（１）のフィルター、メンブレン等を用い、これに本発明の抗ヒトＨＬ抗体又はその抗体フラグメントを固定化した後、この不溶性担体と試料を接触させることにより試料中に含まれるヒトＨＬを分離する方法、（ｂ）不溶性担体として上記（２）のようなセルロース系担体等を用い、これに本発明の抗ヒトＨＬ抗体又はその抗体フラグメントを常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、この不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血漿、血清等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）を通じて溶出させることにより、試料中に含まれるヒトＨＬを分離又は精製する方法が挙げられる。

上記（ｂ）のアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体（２）の具体例としては、本発明の抗ヒトＨＬ抗体又はその抗体フラグメントを固定できるものであれば、特に限定されないが、例えば、市販品であるアマシャムファルマシアバイオテク(amersham pharmacia biotech)社製のSepharose 2B、Sepharose 4B、Sepharose 6B、CNBr-Activated 4B、AH-Sepharose 4B、CH-Sepharose4B、Activated CH-Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、Activated thiol-Sepharose 4B、Sephadex、CM-Sephadex、ECH-Sepharose 4B、EAH-Sepharose 4B、NHS-activated SepharoseあるいはThiopropyl Sepharose 6B等、バイオラッド(Bio-Rad)社製のBio-Gel A、Cellex、Cellex AE、Cellex-CM、Cellex PAB、Bio-Gel P、Hydrazide Bio-Gel P、Aminoethyl Bio-Gel P、Bio-Gel CM、Affi-Gel 10、Affi-Gel 15、Affi-Prep 10、Affi-Gel Hz、Affi-Prep Hz、Affi-Gel 102、CMBio-Gel A、Affi-Gel heparin、Affi-Gel 501あるいはAffi-Gel 601等、和光純薬工業社製のクロマゲルA、クロマゲルP、エンザフィックスP-HZ、エンザフィックスP-SHあるいはエンザフィックスP-AB等、セルバ(Serva)社製のAE-Cellurose、CM-CelluroseあるいはPAB Cellurose等を挙げることができる。

次に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１（組換えヒトＨＬ蛋白質の製造）
（１）ヒトＨＬをコードするｃＤＮＡの調製
市販ヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（宝酒造（株）社製）を鋳型として、特異的プライマー〔センスプライマー：5^'−GGAATTCGGACAAAGCCTGAAACCAG-3'（配列番号５）、アンチセンスプライマー：5'-GTTTCGCTTTCTAGTCTACTCCTAGGC-3'（配列番号６）〕を用いて、下記の条件でＰＣＲを行い、ヒトＨＬのｃＤＮＡをクローニングした。すなわち、特異的プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を、下記の条件で制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの２種により切断後、常法により、アガロース電気泳動により分離し、約１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルごと切り出した後、Geneclean II(BIO 101社製)で抽出し、目的とするｃＤＮＡ断片を得た。

＜ＰＣＲ試薬条件＞Takara Ex Taq^TM(5units/μl) 0.25〜0.5μl10X Ex Taq^TM Buffer 10μldNTP Mixture（各2.5mM） 8μlTemplate(cDNAライブラリー) 1μlPrimer（配列番号５） 0.2〜1.0μlPrimer（配列番号６） 0.2〜1.0μl滅菌蒸留水最終液量100μlへ

＜ＰＣＲ温度反応条件＞95℃、5.0分以下の３ステップを37回繰り返した。
95℃、0.5分65℃、1.0分72℃、2.0分

＜制限酵素反応条件＞得られた各ＰＣＲ産物１０μl当り、制限酵素バッファー（50mM NaCl, 100mMTirs-HCl, 10mM MgCl₂,0.025％ Triton X-100, pH7.5）を１μl及び制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ(BioLabs社製)を２μl添加して、３７℃で一晩反応させ消化させた。

このようにして得られた、約１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ LigationKit（宝酒造（株）社製）を用いて、上記条件により、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの２種により切断したｐＭＡＬ−ｐ２ベクター（BioLabs社製）に挿入した。次いで、このｐＭＡＬ−ｐ２_ＨＬベクターを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（Invitrogen社製）に導入した。更に、この大腸菌より、プラスミドＤＮＡを抽出し、プラスミドＤＮＡのシーケンスを行い、約１．４Ｋｂｐの目的とするｃＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。このようにして得られた、約１．４ＫｂｐのＰＣＲ産物は、目的とするヒトＨＬをコードするｃＤＮＡであることが確認された。

（２）組換えヒトＨＬ蛋白質の調製
上記で得られたヒトＨＬのｃＤＮＡをマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）の下流に組み込み、ＭＢＰとＨＬの結合蛋白質として発現するように構築されたプラスミド（ｐＭＡＬ−ｐ２_ＨＬベクター）を形質転換した大腸菌を１００μg／mLのAmpicillinを含むＬＢ培地５mLに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液を１００μg／mLのアンピシリン及び０．３mMのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地１００mLに植菌し、３７℃で２時間振盪培養した。培養液を遠心（４，０００×ｇ，１０min）で集菌し、菌体を２００mMのNaCl及び１mMのＥＤＴＡを含む２０mMのトリス緩衝液（pH７．４）（以下、緩衝液（Ａ）と呼ぶ。）で懸濁、遠心（４，０００×ｇ，１０min）し、菌体を洗浄した。菌体を緩衝液（Ａ）の１００mLで懸濁後、超音波処理して菌体を破砕させた。これを遠心（９，０００×ｇ，１０min）し、上清を回収して粗酵素液とした。得られた粗精製酵素をガラスカラム管に充填し緩衝液（Ａ）で平衡化したアミロースレジン（BioLabs社製）に添加した。吸着し酵素を緩衝液（Ａ）で十分洗浄後、１０mMのmaltoseを含む緩衝液（Ａ）で溶出させた。溶出パターンを波長２８０nmの吸光度により観察し、精製組換えヒトＨＬとＭＢＰの結合蛋白質画分を得た。

実施例２（抗ヒトＨＬモノクローナル抗体の調製）
（ａ）免疫抗原の選択・調製
一般的に蛋白質の構造として外部に露出している部位と考えられるアミノ酸配列中の親水性の高い部位を免疫抗原又はハイブリドーマ細胞のスクリーニングに用いるためヒトＨＬの蛋白構造解析を行なった。塩基配列・アミノ酸配列の解析は専用ソフトDNASIS-Macv.3.6（日立ソフトウェア社製）を使用した。抗原認識部位として提示されやすい親水性領域推定法として、ホップとウッド法（Hopp &Woods）法、プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７８巻、第３８２４〜第３８２８頁、１９８１年）を参考にした。また、ある動物種に異種の抗原を免疫した際、抗原として提示されるアミノ酸配列としては、抗原のアミノ酸に動物の種差が明瞭に認められる領域を免疫することが重要であることを考え、ホモロジー検索を行い、より種差のある配列を選択した。ヒトＨＬのアミノ酸配列からハイドロホビシティ(Hydrophobicity)を計算した。全体としては疎水性が強いが、Ｎ末端、中央部及びＣ末端に親水性の領域がある。遺伝子配列が決定されている動物のＨＬアミノ酸配列間のホモロジー検索結果(Multiple alignment)、全体的にＨＬアミノ酸配列は動物種差がほとんど無く、Ｎ末端とＣ末端に若干の種差が認められるのみであった。上記疎水性部位の推定及び由来動物の異なるＨＬのアミノ酸配列のホモロジー評価、更に個々のアミノ酸の構造特性、担体との結合性を総合的に判断して、抗原として使用する、あるいは抗体を製造するハイブリドーマの選択に使用する配列を決定した。

上記観点より、本実施例で合成し用いたペプチドは、配列番号３で示されるヒトＨＬのアミノ酸配列中、２４〜４３番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１；以下「ペプチド１」という）、４５〜６３番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド２」という）、２５５〜２７５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド３」という）、３３０〜３３８番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド４」という）、３６７〜３８５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド５」という）、４２８〜４４６番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド６」という）、４６７〜４７６番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド７」という）、４９０〜４９９番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２；以下「ペプチド８」という）とした。これらのペプチド合成は、tBOC(tert-butyloxylcarbonyl)法、Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)法等により行なった。

合成ペプチドと担体蛋白の結合法には、担体蛋白としてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いた。１０mgの担体用のＫＬＨ（PIERCE社製）を蒸留水の１mLに溶解させ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（PIERCE社製）の２mgを、１mLの蒸留水に溶解し、その１００μlとＫＬＨ溶液２００μlを混合し、室温で１時間攪拌した。０．１Ｍのリン酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシアバイオテック社製）に添加した。０．１Ｍのリン酸緩衝液（pH７．４）で溶出させ、溶出パターンを波長２８０nmでの吸光度で測定した。該溶出パターンに従いマレイミド活性化ＫＬＨを回収後、合成ペプチド（４mg／mL蒸留水）の０．５mLを加え、室温で２時間攪拌し、１００倍容のＰＢＳで透析し、免疫抗原あるいは酵素免疫測定法に供した。

（ｂ）蛋白質の免疫応答優位部位の特定
（ｂ−１）（ａ）で発現させた蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を（ａ）で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程は以下の通りに実施した。

組換えヒトＨＬを用いた場合、免疫方法は８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、精製組換えヒトＨＬを適当なアジュバンド「例えば、フロインドアジュバンドあるいは、リビアジュバンドシステム(Ribi Ajuvant System、RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH社製)と共に注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から１４日目、２８日目、４２日目に精製組換えヒトＨＬを皮下あるいは腹腔内に注射することにより追加免疫し、最終投与２週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。合成ペプチドと担体蛋白の結合物を用いた場合、０．３mgの結合物とフロインドの完全アジュバンド(Freud's Complete adjuvant、Sigma社製)を等量混合し、ウサギ四肢及び背中の皮膚数十ヶ所に注射して免疫した。２ヵ月〜３ヵ月の間に５〜６回同様に投与した。最終投与２週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。下記に示した論理的・戦略的に選択後合成した合成ペプチドを固相化した酵素免疫測定法を用い、マウス血清中の抗体群の検定を実施した。

（ｂ−２）（ａ）で合成したペプチドを担体蛋白質と結合させ、各々のペプチドと担体蛋白質の結合物を等量ずつ混合した抗原、又は、各々のペプチドを等量ずつ混合して担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を（ａ）で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程は以下の通りに実施した。

合成ペプチドと担体の結合物に付いては、各々の合成ペプチドを担体と結合させ、担体との結合物としたのち、（１）ペプチド２、４〜８の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原と、（２）ペプチド１及び２の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原の２種類を用い、各々のペプチドをウサギに免疫する煩雑さを解消し、省力化を達成した。得られた抗血清に付いては、下記に示した合成ペプチドを固相化した酵素免疫測定法を用い、マウス血清中の抗体群の検定を実施した。

ペプチド１〜８を１mg／mLの濃度で高純度の蒸留水に溶解させた。１５０mMのNaClを含む２０mMリン酸緩衝液（pH７．４：以下ＰＢＳという）に溶解ペプチド各々を１０μg／mLの濃度で調製後、９６穴ＥＩＡプレートに５０μl／穴ずつ分注し、室温で２時間放置し抗原をプレートに固相化した。０．０５％のTween ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳという）で２回洗浄後、ブロッキング試薬（ブロックエース、大日本製薬社製）を３５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置し底面上の蛋白結合残基をブロックした。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、第１次抗体として、Ｔ−ＰＢＳに上記で調製したマウス血清及びウサギ血清の各々を１００倍に希釈後、５０μｌ／穴ずつ分注し室温で２時間放置する。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、第２抗体として、ヤギの抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物及び抗ウサギイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物（TAGO社製）の５００００倍希釈液を５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミンヂアミン２塩酸塩の６０mgをクエン酸・リン酸緩衝液（pH５．２）の２０mLに溶かした溶液に、３０％の過酸化水素の２０μlを加えた溶液）を５０μl／穴ずつ分注し発色後、１．５Ｎの硫酸溶液を５０μl／穴ずつ分注し反応を停止させる。プレートリーダーにて吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmで測定する。組換えヒトＨＬをマウスに免疫して得られた血清を抗血清（ａ）、ペプチド２、４〜８の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原をウサギに免疫して得られた血清を抗血清（ｂ）、ペプチド１及び２の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原をウサギに免疫して得られた血清を抗血清（ｃ）とした。この結果を表１及び図１に示す。

組換えヒトＨＬをマウスに免疫して得られた血清を抗血清（ａ）中では、ペプチド１に対する抗体群が優位に多く、ペプチド１が、ヒトＨＬのアミノ酸配列中で免疫応答優位部位であった。ペプチド２、４〜８の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原ウサギに免疫して得られた血清を抗血清（ｂ）中では、ペプチド８に対する抗体群が優位に多く、ペプチド８が、ヒトＨＬのアミノ酸配列中で免疫応答優位部位であることが、明らかとなった。ペプチド１及び２の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原をウサギに免疫して得られた血清を抗血清（ｃ）中では、ペプチド２よりペプチド１に対する抗体群が優位に多く、ペプチド１が、ヒトＨＬのアミノ酸配列中で免疫応答優位部位であった。

以上の結果から、抗ヒトＨＬモノクローナル抗体を製造する場合、ペプチド１又は８を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造できることが明らかとなった。同様に、抗ヒトＨＬポリクローナル抗体を製造する場合、ペプチド１又は８を哺乳動物に免疫することにより抗血清を取得し、製造できることが明らかとなった。また、ペプチド１に対する抗ＨＬ抗体を取得する場合、哺乳動物としてマウス又はウサギが好適であり、ペプチド８に対する抗ＨＬ抗体を取得する場合、哺乳動物としてウサギが好適であることが明らかとなった。

（ｃ）蛋白質中の免疫応答優位部位に対する抗体の製造
（ｃ−１）（ｂ）で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞から組換え蛋白質と免疫応答優位部位に対応するペプチドの２種類の抗原をそれぞれ固相化した担体に反応させ、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性（抗原認識特異性）を有するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を製造する工程は以下の通りに実施した。

免疫方法は、８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、ペプチド１の担体との結合物を適当なアジュバンド（例えば、フロインドアジュバンドあるいは、リビアジュバンドシステム(RIBI Ajuvant System、RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH社製)と共に注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から１４日目、２８日目、４２日目にペプチド１の担体との結合物を皮下あるいは腹腔内に注射することにより追加免疫し、更に下記に述べるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ調製の前々日及び前日にも同様にして採集免疫し、マウスから脾細胞を調製して細胞融合に用いた。

８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕ１を正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０に１．５mMのグルタミン及び１３％の牛胎児血清を加えた培地）に培養（３７℃、ＣＯ₂、５％通気）し、４日後に２×１０⁷以上の細胞を得た。

ＲＰＭＩ−１６４０（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス脾細胞１×１０⁸個とマウス骨髄腫細胞２×１０⁷個と混合し、１５００rpmで５分間遠心分離にかけた。沈殿として得られた脾細胞とＰ３−Ｕ１の混合した細胞群をほぐした後、攪拌しながら５０％のポリエチレングリコール及び、１０％のＤＭＳＯ混合溶液の１mLを加え、２分後にＲＰＭＩ−１６４０を徐々に加え、全容量が５０mLとなるようにした。１０００rpmで５分間遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、ＨＡＴ培地（上記正常培地にヒポキサンチン１０^-4Ｍ、チミジン１．５×１０^-5Ｍ、及びアミノプテリン４×１０^-7Ｍを加えた培地）の３０mLを加え、５mL容メスピペットでゆるやかに細胞を懸濁し、５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で２時間培養した。１５００rpmで５分間遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、ＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレートに２００μl／穴ずつ分注し、５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で１０〜１４日間培養した。

抗ヒトＨＬモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、抗原を固相化した酵素免疫測定法を用いて行なった。実施例１で調製した組換えヒトＨＬ及びペプチド１をＰＢＳに１μg／mLの濃度で調製後、９６穴ＥＩＡプレートに５０μl／穴ずつ分注し、室温で２時間放置し抗原をプレートに固相化した。Ｔ−ＰＢＳを３５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳを５０μL／穴ずつ分注し、第１次抗体として、クリーンベンチ内でハイブリドーマ培養上清を９６穴ＥＩＡプレートに１００μl／穴ずつ移し、４℃で一晩又は室温で２時間放置した。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、第２抗体として、ヤギの抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物（TAGO社製）の５０００倍希釈液を５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩の６０mgをクエン酸・リン酸緩衝液（pH５．２）の２０mLに溶かした溶液に、３０％の過酸化水素の２０μlを加えた溶液）を５０μl／穴ずつ分注し発色後、１．５Ｎの硫酸溶液を５０μl／穴ずつ分注し反応を停止させる。プレートリーダーにて吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmで測定した。

抗ＨＬモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが認められた穴について、限界希釈法によりクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体産生の認められたものを、抗ＨＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。樹立されたハイブリドーマ３Ａ２を２００１年１月２４日付けにて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８１８１として寄託した。

（ｃ−２）モノクローナル抗体の大量調製プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンの０．５mL／匹を腹腔内投与し、１〜２週間飼育する。）した１０週令マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に上記のハイブリドーマ株各１×１０⁶個細胞／匹を腹腔内注射した。１０〜２１日後にハイブリドーマ株は腹水癌化し、腹腔内に腹水があるマウスから、腹水（４〜１０mL／匹）を採取し、遠心分離して固形分を除去した。上清を５０％硫安塩析後、ＰＢＳで一晩透析し、これを粗精製モノクローナル抗体とした。

（ｃ−３）（ｂ）で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性（抗原認識特異性）を有する抗血清及びポリクローナル抗体を製造する工程及び、抗血清を免疫応答優位部位に対応するペプチドを固相化した担体に反応させたのち、常法に従い担体を単離後、担体より抗体画分を分画して、高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するポリクローナル抗体群を濃縮する工程は以下の通りに実施した。

上記（ａ）で調製したペプチド１又は８と担体（ＫＬＨ）の結合物の０．１〜０．３mgとフロインドの完全アジュバンド（Freud's Complete adjuvant、Sigma社製）を等量混合し、ウサギ四肢及び背中の皮膚数十ヶ所に注射して免疫した。２ヶ月〜３ヶ月の間に５〜６回同様に投与した。最終投与２週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。血清を５０％硫安塩析後、ＰＢＳで一晩透析し、これを粗精製ポリクローナル抗体とした。

（ｃ−４）（抗ヒトＨＬ抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の精製）
上記で取得したモノクローナル抗体３Ａ２の粗精製モノクローナル抗体及び、粗精製ポリクローナル抗体に、ＭＡＰＳ II結合バッファー（バイオラッド社製）を等量加え、０．４５μmのフィルター（ミリポア社製）で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液をHiTrap Protein Aアフィニティーカラム（ファルマシアバイオテック社製）にて添加した。ＭＡＰＳ II結合バッファーで洗浄後、ＭＡＰＳ II溶出バッファー（バイオラッド社製）で溶出させた（３mL／チューブ，約１０本）。溶出パターンを波長２８０nmでの吸光度で測定し、溶出パターンに従い、抗体を含む分画を回収した。

（アイソタイプの決定）
マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット（ＺＹＭＥＤ社製）を用い、キット添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、モノクローナル抗体３Ａ２のアイソタイプを決定した。３Ａ２はＩｇＧ_2a，κであることが確認された。

実施例３（アフィニティークロマトグラフィーによるヒトＨＬの精製）
ヒトＰＨＰから実施例２で調製した精製モノクローナル抗体３Ａ２を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、高純度のヒトＨＬを精製した。
（１）固相化モノクローナル抗体（カラム充填用吸着体）の調製ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（CNBr-activated Sepharose 4B、ファルマシアバイオテック社製）を用い、添付のプロトコールに従って操作を行なった。ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを１mMの塩酸で２０分間膨潤させ、Ｇ３グレードの細孔のグラスフィルター付きブフナーロート上で同１mMの塩酸で洗浄する。ゲルを０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム（pH８．３）の緩衝液（以下、結合バッファーという。）に懸濁し、結合バッファーに対し一晩透析した抗体を添加し、室温で２時間混合し抗体とゲルを結合させる。１１０００rpmで５分間遠心分離し上清を除去し、０．１Ｍのトリス緩衝液（pH８．０）に懸濁後、室温で２時間放置する。グラスフィルターにより濾過後、グラスフィルター上で結合バッファー及び０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの酢酸緩衝液（pH４．０）で交互に洗浄する。最後に適当量のＰＢＳに懸濁しカラムに充填させる。

（２）ヘパリンセファロース４Ｂクロマトグラフィーによる精製複数の健常人から採血したヘパリン負荷後の末梢血を、常法に従い遠心分離により血球系細胞を除去し、ヒト血漿ＰＨＰを得、使用時まで−８０℃で保存した。−８０℃保存ヒト血漿２００mLを３７℃恒温槽で溶解し、不溶物を除くために遠心（５０００×ｇ，３０min，４℃）した。このＰＨＰをガラスカラム管（２×４０cm、バイオラッド社製）に充填し、０．３ＭのNaCl及び１０％のGlycerolを含む５mMのリン酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したHeparin-Sepharose 4Bに添加した。０．３ＭのNaCl及び１０％のGlycerolを含む５mMのリン酸緩衝液（pH７．４）で洗浄後、０．３〜１．５ＭのNaCl、１０％のGlycerolを含む５mMのリン酸緩衝液（pH７．４）で濃度勾配溶出させた（８mL／チューブ，６５本）。溶出パターンを波長２８０nmでの吸光度と下記に示した分画したフラクションを固相化した酵素免疫測定法を用い、ＨＴＧＬとＬＰＬの分別状態を検定した。

各々の分画したフラクションを、９６穴ＥＩＡプレートに５０μl／穴ずつ分注し、室温で２時間放置し抗原プレートに固相化した。Ｔ−ＰＢＳを３５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳを５０μｌ／穴ずつ分注し、第１次抗体として、実施例３で調製した精製抗ヒトＨＬモノクローナル抗体３Ａ２及び、精製した抗ＬＰＬモノクローナル抗体（特開平０５−２２３８２２記載のモノクローナル抗体が適当である。）を１０μg／mLの濃度に希釈後、５０μl／穴ずつ分注し、室温で２時間放置した。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、第２抗体として、ヤギの抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物（TAGO社製）の５０００倍希釈液を５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。Ｔ−ＰＢＳにより２回洗浄後、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩の６０mgをクエン酸・リン酸緩衝液（pH５．２）の２０mLに溶かした溶液に、３０％の過酸化水素の２０μlを加えた溶液）を５０μl／穴ずつ分注し発色後、１．５Ｎの硫酸溶液を５０μl／穴ずつ分注し反応を停止させる。プレートリーダーにて吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmで測定した。

結果を図２に示す。実施例２で調製した精製抗ヒトＨＬモノクローナル抗体３Ａ２により検出されたＨＬ蛋白質は、約０．８ＭのNaCl濃度で溶出されており、チャン（Chao-Fu Cheng）ら（ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、第２６０巻、第１９号、第１０７２０−１０７２７頁、１９８５）の文献の結果と一致しており、本発明の抗ヒトＨＬモノクローナル抗体３Ａ２が、特異的にヒトＨＬを認識していることを示している。また、本発明の抗ヒトＨＬモノクローナル抗体３Ａ２は、抗ＬＰＬモノクローナル抗体で検出される約１．５ＭのNaCl濃度で溶出されるＬＰＬには、交差反応性を示さず、〔１〕ヒトＨＬに対して抗原抗体反応が認められる。〔２〕少なくともヒトリポ蛋白リパーゼに対しては、抗原抗体反応が認められない、ことが証明された。

（３）アフィニティークロマトグラフィーによる精製上記（２）で調製したＨＬを含む溶液をＰＢＳに対して一晩透析後、（１）で調製したアフィニティーカラムに加えた。カラムをＰＢＳで洗浄し、３ＭのNaSCNを含むＰＢＳで溶出させ、溶出画分のパターンを、波長２８０nmでの吸光度により測定した。結果を図３に示す。該溶出パターンに従い、ヒトＨＬを含む画分を集め、ＰＢＳで透析し、極めて高純度の精製ヒトＨＬを調整した。

常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により解析した。結果を図４に示す。泳動・スポット画像解析ソフトDensitograph Ver.4.03C（アトー（株）社製）を用い分子量と純度を評価した結果、分子量約６５，０００の一種からなり、極めて高い純度であることが確認された。

実施例４サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＨＬの定量法の確立
（１）固相化抗体の作製ＰＢＳに精製モノクローナル抗体３Ａ２又は、精製ポリクローナル抗体を１０μg／mLに希釈し、９６穴ＥＩＡプレートに５０μl／穴ずつ分注し、室温で２時間放置し抗体をプレートに固相化した。Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄後、１％のＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳを３５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。内容物を除去後、１％のＢＳＡ及び１０％のシュークロースを含むＴ−ＰＢＳを３５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置後、内容物を除去して自然乾燥させた。

（２）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識５mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）にペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）を１０mg／mLの濃度で溶解した溶液に、メタ過ヨウ酸ナトリウムを蒸留水で１０００mg／mLの濃度で溶解した溶液を、ＨＲＰ：メタ過ヨウ酸ナトリウム＝１mg：０．４３mgの比で加え、暗所、室温で３０分間反応させた。次いで反応液を５mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５（１．５×３０cm、ファルマシアバイオテック社製）のカラムに添加して、活性化ＨＲＰ画分を回収した。次に精製モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．３）で一晩透析した溶液に、活性化ＨＲＰ画分を重量比１：１で混合し、暗所、室温で１時間反応させた。反応後、テトラヒドロホウ酸ナトリウムを蒸留水で２mg／mLの濃度で溶解した溶液を、反応液５００μlに対して１０μlで混合し、暗所、室温で１５分間反応させた。反応後、等量の飽和硫安を加え、氷上で１時間放置した。１２，０００rpmで１０分間遠心分離後、上清を除去してＨＲＰ標識抗体を回収し、ＰＢＳに懸濁した。波長２８０nmでの吸光度を測定し、吸光度を用い以下の試験を行った。

（３）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量系（２抗体法）
（１）で作製した固相化抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（以下、固相化マイクロプレートという）を用いる。固相化マイクロプレートの各ウェルに０．２％のＢＳＡ及び０．０５％のTriton X-100を含むＰＢＳ（以下、ＢＴ−ＰＢＳという）で希釈した測定試料（ヘパリン負荷前血漿、ＰＨＰ、精製ＨＬ）を５０μl／穴ずつ加え、室温で２時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、ＢＴ−ＰＢＳＢで希釈した（２）で作製したＨＲＰ標識モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体溶液を５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩の６０mgをクエン酸・リン酸緩衝液（pH５．２）の２０mLに溶かした溶液に、３０％の過酸化水素の２０μlを加えた溶液を５０μl／穴ずつ分注し発色後、１．５Ｎの硫酸溶液を５０μｌ／穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmで測定した。

（４）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量系（３抗体法）
（１）で作製した固相化抗体、モノクローナル抗体３Ａ２（以下、固相化マイクロプレート）を用いる。固相化マイクロプレートの各ウェルにＢＴ−ＰＢＳで希釈した測定試料（ヘパリン負荷前血漿、ＰＨＰ、精製ＨＬ）を５０μｌ／穴ずつ加え、室温で２時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、第２抗体としてＢＴ−ＰＢＳでポリクローナル抗体を１０μg／mLに希釈した溶液を５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、第３抗体として、ヤギの抗ウサギイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物（TAGO社製）の５０００倍希釈液を５０μl／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩の６０mgをクエン酸・リン酸緩衝液（pH５．２）の２０mLに溶かした溶液にね３０％の過酸化水素の２０μlを加えた溶液を５０μl／穴ずつ分注し発色後、１．５Ｎの硫酸溶液を５０μl／穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmで測定した。又は、ＴＭＢ基質（PIERCE社製）を５０μl／穴ずつ分注し発色後、２．０Ｎの硫酸溶液を５０μl／穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を４５０nmで測定した。被検体中のＨＬ濃度は、各々精製ＨＬ及び標準ＰＨＰを標準物質として作成した検量線から求めた。

（５）検量線作製（精製ＨＬ）
実施例３で調製した精製ＨＬを標準物質として、（４）で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検量線を作製した。結果を図５に示す。１０〜１０００ng／mLの濃度範囲で良好な検量線が得られた（ｙ＝０．３１５Ln（ｘ）−０．５２７５、相関係数：Ｒ²＝０．９９６３）。この検量線から被検体中のＨＬ濃度を計算した。

（６）測定系の正確性確認（５）で作成した検量線から、同時に測定したＰＨＰを４０倍、８０倍及び１６０倍して測定後、各点のＨＬ濃度を計算して、希釈直線性から測定系の正確性を確認した。結果を図６に示す。４０〜１６０倍まで良好な希釈直線性を示した（ｙ＝８９４．４１ｘ−０．９６８４、相関係数：Ｒ²＝０．９８５７）。

（７）サンドイッチＥＬＩＳＡ系の特異性検討特異性を検討するため、ヘパリン負荷前血漿及びヘパリン負荷後血漿（ＰＨＰ）を４０倍、８０倍及び１６０倍して測定後、各点のＨＬ濃度を計算して、特異性を確認した。結果を図７に示す。ヘパリン負荷後血漿（ＰＨＰ）は、４０〜１６０倍まで良好な希釈直線性（ｙ＝５５１．９４ｘ＋２．２６９２、相関係数：Ｒ²＝０．９８１６）を示し、ヘパリンを静注して肝内皮細胞表面に係留しているＨＬを血中に遊離の状態で取り出し、特異的に測定していることが明らかとなった。一方、ヘパリン負荷前血漿は、ＨＬが肝内皮細胞表面に係留した状態であり、血中に遊離で存在するＨＬはほとんどないが、微量のＨＬ（ｙ＝２４．８７８ｘ＋５．３７５６、相関関数：Ｒ²＝０．９３２２）を測定できた。

Claims

配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド８、又は配列番号１もしくは２で示されるアミノ酸のうち１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いる、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を認識する抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体又はそのフラグメントの製造方法。
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド８、又は配列番号１もしくは２で示されるアミノ酸のうち１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するペプチドを免疫感作して取得された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマからペプチド１又は８に対して特異的親和性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで該ハイブリドーマを培養する工程を含む、請求項１記載の抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体又はそのフラグメントの製造方法。
免疫原が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド１であって、ハイブリドーマ３Ａ２（ＦＥＲＭＰ−１８１８１）を培養する工程を含む、請求項１記載の抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体又はそのフラグメントの製造方法。