CN101316930A - T细胞粘附分子及其抗体 - Google Patents

T细胞粘附分子及其抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN101316930A
CN101316930A CNA2006800446143A CN200680044614A CN101316930A CN 101316930 A CN101316930 A CN 101316930A CN A2006800446143 A CNA2006800446143 A CN A2006800446143A CN 200680044614 A CN200680044614 A CN 200680044614A CN 101316930 A CN101316930 A CN 101316930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
aminoacid sequence
protein
sequence shown
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800446143A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101316930B (zh
Inventor
小笠原秀晃
水野惠子
有田贵久
西村美由希
今井俊夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai R&D Management Co Ltd
Original Assignee
Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Management Co Ltd filed Critical Eisai R&D Management Co Ltd
Publication of CN101316930A publication Critical patent/CN101316930A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101316930B publication Critical patent/CN101316930B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供在树状细胞上表达的T细胞粘附分子。根据本发明，提供含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质。

Description

T细胞粘附分子及其抗体
发明领域
本发明涉及在来自骨髓的树状细胞上表达的T细胞粘附分子及其基因、以及在T细胞上表达的、该粘附分子(受体)的配体及其基因。本发明还涉及该粘附分子或该配体的抗体及其用途。本发明进一步涉及利用该粘附分子的筛选方法。
背景技术
近年来，有人报道：在T细胞上表达的作为树状细胞活化因子而被克隆的分子是控制破骨细胞分化的重要的细胞因子(Yasuda，H.，等人.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：3597～3602)，以此为代表，明确了免疫系统与骨代谢的密切关系。
有关通过免疫系统控制分子来控制骨代谢的研究得到迅速进展，对于与破骨细胞分化控制相关的信号传递也进一步得到了解。
例如，作为与破骨细胞分化相关的分子，已知有Oscar(破骨细胞相关受体)。目前已报到：Oscar是类免疫球蛋白受体，与FcRγ链缔合，经由FcRγ链的ITAM基序向磷脂酶Cγ传递信号(Kim，N.，等.(2002)JExp Med 195：201～209)。
作为在树状细胞上表达、与T细胞粘附、以致参与与T细胞和树状细胞之间的免疫应答有关的相互作用的分子，已报导有CD80-CD28、CD40-CD40L、ICAM1-LFA1等各种的相互作用。
发明概要
本发明人等通过扣除法，对于在来自骨髓的树状细胞上特异性表达的基因进行了鉴定。本发明人等还发现：该基因所编码的蛋白质与IgE受体的FcRγ链结合；通过LPS刺激，该蛋白质的表达增强；通过对该蛋白质的抗体交联刺激，树状细胞被活化；该蛋白质具有与T细胞粘附的功能；该蛋白质的抗体对于类风湿关节疾病模型-胶原诱导关节炎模型具有治疗效果。本发明人等进一步对于在T细胞上表达的、该蛋白质的配体基因进行了鉴定。本发明基于上述认识而完成。
本发明提供膜蛋白或分泌蛋白(以下称为本发明的第一方案的新型蛋白质)，该膜蛋白或分泌蛋白含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，或者具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列。
本发明提供选自下述(i)、(ii)、(iii)和(iv)的膜蛋白或分泌蛋白(以下称为本发明的第二方案的新型蛋白质)：
(i)含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(ii)含有在SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(iii)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码、且与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(iv)含有与SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
本发明提供编码本发明的第一方案和第二方案的新型蛋白质的多核苷酸。
本发明还提供选自下述(v)、(vi)、(vii)和(viii)的多核苷酸：
(v)含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸；
(vi)在含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸中，有1或多个核苷酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个核苷酸，且编码与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸；
(vii)在严谨条件下与含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸杂交，且编码与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸；和
(viii)与含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸具有90％以上的同一性，且编码与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸。
本发明又提供选自下述(ix)、(x)、(xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白(以下称为TARM(骨髓细胞上的T细胞相互作用活化受体，Tcell-interacting Activating Receptor on Myeloid cells)蛋白)的抗体及其功能性片段(以下称为本发明的第一方案的抗体)。
(ix)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(x)含有在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列中，有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii)含有与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
本发明又提供选自下述(xiii)、(xiv)、(xv)和(xvi)、作为本发明的新型蛋白质的配体的新型配体蛋白(以下称为本发明的新型配体蛋白，或者称为TARM-L(TARM配体)蛋白)：
(xiii)含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质；
(xiv)含有在SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列中，有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质；
(xv)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码，且与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和
(xvi)含有与SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
本发明还提供编码本发明的新型配体蛋白的多核苷酸。
本发明又提供选自下述(xvii)、(xviii)、(xix)和(xx)的多核苷酸：
(xvii)含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸；
(xviii)在含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸中，有1或多个核苷酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个核苷酸，且编码与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸；
(xix)在严谨条件下与含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸杂交，且编码与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸；和
(xx)与含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸具有70％以上的同一性，且编码与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸。
本发明提供本发明的新型配体蛋白的抗体及其功能性片段(以下称为本发明的第二方案的抗体)。
本发明又提供自身免疫疾病治疗药和T细胞粘附抑制剂，该自身免疫疾病治疗药和T细胞粘附抑制剂含有本发明的第一方案和第二方案的抗体(以下将它们统称为“本发明的抗体”)或它们的功能性片段作为有效成分。
本发明提供以下所示的筛选方法。
根据本发明的第一方案的筛选方法，提供抑制TARM蛋白与T细胞粘附的物质或其盐或者它们的溶剂合物的筛选方法，该筛选方法包含下述步骤：
(a)在被检物质的存在下或非存在下，使TARM蛋白与T细胞接触的步骤；和
(b)测定TARM蛋白与T细胞的粘附活性的步骤。
根据本发明的第二方案的筛选方法，还提供抑制树状细胞活化的物质或其盐或者它们的溶剂合物的筛选方法，该筛选方法包含以下步骤：
(d)在被检物质的存在下或非存在下，使本发明的抗体或其功能性片段与树状细胞接触的步骤；和
(e)测定上述树状细胞的活化程度的步骤。
根据本发明的第三方案的筛选方法，提供抑制TARM蛋白与FcRγ链形成复合物的物质或其盐或者它们的溶剂合物的筛选方法，该筛选方法包含下述步骤：
(g)在被检物质的存在下或非存在下，使本发明的抗体或其功能性片段与树状细胞接触的步骤；和
(h)测定上述树状细胞中FcRγ链的表达量的步骤。
附图简述
图1是表示小鼠TARM基因(m1～4和s1)的氨基酸序列的图。下划线表示免疫球蛋白(IG)环结构部分，粗字体表示跨膜部分。
图2是表示使用引物对1、通过实时PCR对小鼠组织中TARM的mRNA表达进行分析的结果图。
图3是表示使用引物对1、通过实时PCR对各种细胞中TARM的mRNA表达进行分析的结果图。
图4A是表示在抗TARM蛋白抗体的制备中所使用的胞外域的结构和氨基酸编号的图。B是表示对该抗体与TARM蛋白的特异性进行研究的结果图。
图5是表示对来自骨髓的树状细胞中的小鼠蛋白的表达进行分析的结果图。
图6是表示对来自正常小鼠的免疫组织细胞中的小鼠蛋白的表达进行分析的结果图。
图7是表示对在c-kit阳性腹腔肥大细胞中的小鼠蛋白的表达进行分析的结果图。
图8是表示对LPS炎症刺激导致的来自小鼠淋巴结的细胞中的小鼠TARM蛋白的表达进行分析的结果图。箭头表示小鼠TARM蛋白的表达。
图9A是表示抗TARM蛋白抗体刺激诱导由成熟骨髓树状细胞生成IL-6的图。B是表示抗TARM蛋白抗体刺激诱导由未成熟骨髓树状细胞生成MCP-1的图。
图10是表示伴随小鼠TARM蛋白在细胞表面上的表达增加，FcRγ链也增加的图。
图11是表示通过免疫沉淀法对小鼠TARM蛋白与FcRγ链形成复合物进行分析的结果图。
图12是表示对与小鼠TARM蛋白结合的分子在活化T细胞中的表达进行分析的结果图。
图13是表示活化T细胞与小鼠TARM蛋白的粘附能力的图。
图14是表示抗小鼠TARM蛋白抗体抑制Th2细胞与小鼠TARM蛋白粘附的图。
图15是表示给予抗小鼠TARM蛋白抗体的胶原诱导关节炎模型的外观观察和体重随时间变化的图。
图16是表示给予抗小鼠TARM蛋白抗体对于胶原诱导关节炎模型血浆中的血清淀粉状蛋白A浓度的效果的图。
图17是表示给予抗小鼠TARM蛋白抗体对于胶原诱导关节炎模型血浆中的抗胶原抗体效价的效果的图。
图18是表示通过实时PCR对人组织中的TARM蛋白的mRNA表达进行分析的结果图。
图19是表示来自人的TARM蛋白的氨基酸序列图。下划线表示免疫球蛋白(Ig)环结构部分，粗字体表示跨膜部分。框起的部分表示在hTARM和LOC441864之间不同的序列。
图20是表示活化T细胞与人TARM蛋白的粘附能力、以及抗人TARM蛋白抗体抑制T细胞与人TARM蛋白粘附的图。
图21A是表示对与小鼠TARM蛋白结合的分子在小鼠细胞株中的表达进行分析的结果图。B是通过实时PCR对于小鼠细胞株中作为mTARM-L侯选分子的ENSMUSG00000035095的mRNA表达进行分析的结果图。
图22A是表示小鼠TARM-AP嵌合蛋白与表达mTARM-L的B300.19细胞的特异性结合的图。B是表示表达mTARM-L的B300.19细胞与小鼠TARM-AP嵌合蛋白特异性细胞粘附的图。
图23是表示对人和小鼠TARM-L蛋白同源性进行分析的结果图。
图24是表示对人TARM蛋白和小鼠TARM蛋白(m3)的同源性进行分析的结果图。
发明的具体说明
以下，详细说明本发明。以下的记述是用于说明本发明的列举，并不将本发明限定于所记述的实施方案中。本说明书中使用的所有的技术术语、科学术语和专业术语与本发明所属技术领域的通常的技术人员所常规理解的具有相同的含义，其目的只是用于说明特定的方案使用，并不用于限定。本发明只要不脱离其宗旨，可以以各种形式实施。本说明书中引用的所有先行技术文献和公开公报、专利公报等专利文献均作为参照引入本说明书中，可用于本发明的实施。
[新型蛋白质和多核苷酸]
本发明中鉴定的、在来自骨髓的树状细胞上特异性表达的基因中，来自小鼠的基因中存在5种同种型。来自小鼠的基因的同种型有：膜结合型蛋白(膜蛋白)的基因有m1、m2、m3和m4，分泌型蛋白(分泌蛋白)的基因有s1，各同种型的核苷酸序列和氨基酸序列与下述SEQ IDNO.对应。
m1：SEQ ID NO.11和12
m2：SEQ ID NO.1和2
m3：SEQ ID NO.3和4
m4：SEQ ID NO.5和6
s1：SEQ ID NO.7和8
本发明中鉴定的、在来自骨髓的树状细胞上特异性表达的基因中，来自人类的基因有一种膜蛋白的基因。该基因的核苷酸序列和由其所编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.9和10。
本发明中鉴定的基因的核苷酸序列编码信号肽，因此，由该基因所编码的蛋白质形成膜蛋白或分泌蛋白。本发明的膜蛋白通过改变其C末端(例如通过除去跨膜部分)，可以制成分泌蛋白。本发明的分泌蛋白通过改变其C末端(例如通过附加跨膜部分)，可以制成膜蛋白。
本说明书中，“在氨基酸序列中，有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加”和“在多核苷酸中，有1或多个核苷酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个核苷酸”是指通过位点定向诱变法等周知的技术，或者由于可天然产生的程度的多个氨基酸或者核苷酸的置换等进行变异。氨基酸和核苷酸的变异个数例如为1～30个，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，特别优选1～2个。
变异氨基酸序列可以优选该氨基酸序列为具有1或多个(优选1或数个、或者1、2、3或4个)保守性置换的氨基酸序列。
变异核苷酸序列可以优选为该核苷酸序列具有1或多个(例如1个～数个、或者1、2、3或4个)对于含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质的功能没有影响的变异。
本说明书中，“保守性置换”是指实质上不改变蛋白质的功能，将1或多个氨基酸残基用其它的化学性类似的氨基酸残基置换。例如有：将某种疏水性残基用其它的疏水性残基置换的情况、用与某种极性残基具有相同电荷的其它极性残基置换的情况等。可进行上述置换的功能性类似的氨基酸，其每种氨基酸都是该技术领域中所公知的。具体列举如下：非极性(疏水性)氨基酸有：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸有：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。具有正电荷(碱性)的氨基酸有：精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。具有负电荷的(酸性)氨基酸有：天冬氨酸、谷氨酸等。
本说明书中，“杂交”是指在严谨条件下与靶多核苷酸进行杂交。具体来说，有通过FASTA、BLAST、Smith-Waterman [Meth.Enzym.，164，765(1988)]等同源性检索软件，使用缺省(初始设定)的参数计算时，与靶核苷酸序列至少具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更进一步优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同源性的多核苷酸。另外，“严谨的条件下”可按照在本领域技术人员通常可使用的杂交缓冲液中、在温度40℃～70℃、优选60℃～65℃等下进行反应，在盐浓度15～300mmol/L、优选15～60mmol/L等的清洗液中清洗的方法进行。温度、盐浓度可根据所使用的探针的长度适当调节。并且，对杂交所得产物进行清洗时的条件可在0.2或2×SSC、0.1％SDS、温度20～68℃下进行。是严谨(高严谨)条件还是温和条件(低严谨)，这可以通过清洗时的盐浓度或温度设置其差异。通过盐浓度设定杂交的差异时，以0.2×SSC、0.1％SDS作为严谨洗涤缓冲液(高严谨洗涤缓冲液)、以2×SSC、0.1％SDS作为温和洗涤缓冲液(低严谨洗涤缓冲液)进行。通过温度设定杂交差异时，严谨可以是在68℃下、中等程度(中等严谨)可以是在42℃下、温和可以是在室温(20～25℃)下、均以0.2×SSC、0.1％SDS进行。
通常，实施预杂交时，可以在与杂交相同的条件下实施，但预杂交和预备洗涤并不限于在相同条件下进行。
杂交可按照公知方法进行。使用市售的文库时，可按照所附的使用说明书记载的方法进行。
本说明书中，对于氨基酸序列和核苷酸序列的“同一性”(也称为同源性)是对于要进行比较的序列间，在构成各序列的氨基酸残基或核苷酸残基的一致程度的含义中使用。此时考虑了缺口的存在和氨基酸的性质(Wilbur，Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：726～730(1983))。同源性的计算可使用市售的软件BLAST(Altschul：J.Mol.Biol.215：403～410(1990))、FASTA(Peasron：Methods in Enzymology 183：63～69(1990))、Smith-Waterman[Meth.Enzym.，164，765(1988)]等同源性检索软件。
“同一性”的数值只要是均为使用本领域技术人员所公知的同源性检索程序计算的数值即可，例如，可在美国生物技术信息中心(NCBI)的同源性算法BLAST(基本局部对比检索工具(Basic local alignmentsearch tool))http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST中，使用缺省(初始设定)的参数计算。
在本发明的第二方案的新型蛋白质中，与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列可以是具有优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上同一性的氨基酸序列。
编码本发明的第二方案的新型蛋白质的多核苷酸中，与SEQ IDNO.9所示核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列可以是具有优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上同一性的核苷酸序列。
本发明的第一方案的抗体中，与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列可以是具有优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更进一步优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上同一性的氨基酸序列。
本发明中，只要给出SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，则编码该序列的核苷酸序列容易确定，可以选择编码SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的各种核苷酸序列。
因此，编码含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸是指：除SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11所示DNA序列的一部分或全部之外，还具有编码同一氨基酸的DNA序列、存在简并关系的密码子作为DNA序列的序列。本发明中进一步包含与它们相对应的RNA序列。
编码含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的优选例子有：含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的多核苷酸。
本说明书中，与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质是否具有同等功能，这可通过评价与含有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质的表达相关的生物体现象或功能来确定，例如，可通过基因重组技术使蛋白质表达，评价是否可发挥树状细胞的活化受体功能，由此确定。含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质与T细胞相互作用，具有活化树状细胞的功能，因此评价时可以以下述功能作为指标：
-与T细胞的粘附功能(实施例5、6、10和11)、
-通过抗体交联刺激活化树状细胞的功能(实施例3)、
-与FcRγ链形成复合物的功能(实施例4)、或者
-上述功能的一部分或全部的组合。
[新型配体蛋白和多核苷酸]
在本发明中鉴定的、作为TARM蛋白的配体在活化T细胞上特异性表达的基因中，来自小鼠的基因有一种膜蛋白的基因。该基因的核苷酸序列和由其所编码的蛋白质的氨基酸序列记载于SEQ ID NO.13和14。作为TARM蛋白的配体在活化的T细胞上特异性表达的基因中，来自人的基因有一种膜蛋白的基因。该基因的核苷酸序列和其所编码的蛋白质的氨基酸序列记载于SEQ ID NO.15和16。
本发明的新型配体蛋白中，与SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列可以是具有优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更进一步优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上同一性的氨基酸序列。
编码本发明的新型配体蛋白的多核苷酸中，与SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列具有70％同一性的核苷酸序列可以是具有优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更进一步优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上同一性的核苷酸序列。
本发明中，如果给出SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，则编码该序列的核苷酸序列容易确定，可以选择编码SEQ IDNO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的各种核苷酸序列。
因此，编码含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸是指：除SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示DNA序列的一部分或全部之外，还具有编码同一氨基酸的DNA序列、存在简并关系的密码子作为DNA序列的序列。本发明中进一步包含与它们相对应的RNA序列。
编码含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的优选例子有：含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸。
本说明书中，是否与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能，这可通过评价与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质的表达相关的生物体现象或功能来确定，例如，可通过基因重组技术使该蛋白质表达，通过评价其是否在T细胞上作为配体对树状细胞的活化受体发挥功能，由此来确定。含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质与TARM蛋白结合，因此在评价时，例如可以以与TARM蛋白结合的功能(实施例12)作为指标。
本发明的新型配体蛋白是单跨膜蛋白，按照以N末端一侧为细胞外的方向在细胞表面表达。因此，利用该蛋白质可以制备该蛋白质的抗体。
本发明提供含有下述多肽的蛋白质：该多肽含有SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的第1～第159号、或者SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的第1～第158号氨基酸序列的至少6个氨基酸残基或全部。该蛋白质含有相当于TARM-L蛋白的氨基酸序列的胞外域的部分，因此可作为用于制备该蛋白质的抗体的抗原使用。
本发明还提供本发明的新型配体蛋白在制备本发明的新型配体蛋白的抗体中的应用。
[抗体]
本发明的抗体可特异性识别TARM蛋白或TARM-L蛋白。因此，用于获得本发明的抗体的TARM蛋白或TARM-L蛋白只要具有TARM或TARM-L抗原性即可，包含在TARM蛋白或TARM-L蛋白的氨基酸序列中具有1或多个氨基酸残基缺失、插入、置换或附加所得的氨基酸序列的蛋白质。上述蛋白质与原有蛋白质同样，可保持生物学活性，这是公知的(Mark等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662～6；Zoller和Smith(1982)Nucleic Acids Res.10：6487～500；Wang等人.(1984)Science 224：1431～3；Dalbadie-McFarland等人.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6409～13)。在某种蛋白质中，在保持原有蛋白质的抗原性的状态下进行1或多个氨基酸缺失、插入、置换或附加的方法是公知的。例如，可通过位点定向诱变法制备编码变异蛋白质的多核苷酸，使其适当表达获得(Molecular Cloning(分子克隆)，ALaboratory Manual 2nd de(实验指南第二版)，Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社出版)(1989)；Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实验指南)，John Wiley&Sons，(1987～1997)，Section8.1～8.5；Hashimoto-Hoto等人.(1995)Gene 152：271～5；Kinkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488～92；Kramer和Fritz(1987)Method.Enzymol154：350～67；Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763～6)。
本发明的抗体也包含TARM蛋白或TARM-L蛋白的一部分的特异性抗体。
即，用于获得本发明抗体的TARM蛋白或TARM-L蛋白中，除具有TARM蛋白或TARM-L蛋白全长氨基酸序列的多肽之外，也包含与TARM蛋白或TARM-L蛋白的至少6个氨基酸残基以上(例如6、8、10、12或15个氨基酸残基以上)具有同一序列的多肽片段。本说明书中，TARM蛋白或TARM-L蛋白的多肽片段只要具有TARM蛋白或TARM-L蛋白的抗原性即可，可以是任何片段。
优选的片段有：TARM蛋白或TARM-L蛋白的氨基末端、羧基末端等多肽片段。多肽的抗原决定部位可通过对蛋白质的氨基酸序列上的疏水性/亲水性进行分析的方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105～22)、分析二级结构的方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47：251～76)推定，并且可通过计算机程序(Ann.Biochem.151：540～6(1985))或者合成短肽、确认其抗原性的PEPSCAN法(日本特表昭60-500684号公报)等方法确认。
本发明的抗体优选是对TARM蛋白或TARM-L蛋白的功能产生影响的抗体。对TARM蛋白的功能产生影响是指：例如通过本发明的第一方案的抗体对TARM蛋白的交联刺激，活化树状细胞(实施例3)；该抗体与TARM蛋白结合，由此抑制TARM蛋白与T细胞的粘附(实施例6和实施例11)；和通过该抗体与TARM蛋白结合，抑制TARM蛋白与FcRγ链形成复合物(实施例4)。对于TARM-L蛋白质的功能产生影响是指：例如通过本发明的第二方案的抗体与TARM-L蛋白结合，抑制TARM-L蛋白与TARM蛋白的结合。
本发明的抗体包含以TARM蛋白或TARM-L蛋白作为抗原，使该抗原对小鼠等哺乳动物免疫而得到的单克隆抗体；使用基因重组技术制备的嵌合抗体和人源化抗体；以及使用生成人抗体的转基因动物等制备的人抗体。以本发明的抗体作为药物给予人时，从副作用的角度考虑优选人抗体。
“人抗体”是指所有的区域均来自人的抗体。人抗体可将人抗体基因导入小鼠制备。例如可参照Nature Genetics，7卷，13～21页，1994、Nature Genetics，15卷，146～156页，1997、日本特表平4-504365号公报、日本特表平7-509137号公报、WO94/25585号公报、Nature，368卷，856～859页，1994、和日本特表平6-500233号公报的方法制备。还可以使用噬菌体展示法制备。例如可参照Marks，J.D.等人：J.Mol.Biol.，222卷，581～597页，1991的方法制备。
“人源化抗体”是指只将小鼠抗体的抗原结合部位(CDR；互补决定区)的基因序列移植到人抗体基因中(CDR移植)的抗体。例如可参照日本特表平4-506458号公报和日本特开昭62-296890号公报的方法制备。
“嵌合抗体”是指将小鼠抗体的可变区与人抗体的恒定区连接得到的抗体。具体来说，是将抗原对小鼠免疫，从该小鼠单克隆抗体的基因中切取与抗原结合的抗体可变区(V区)，与来自人骨髓的抗体恒定区(C区)基因结合制备。例如可参照日本特公平3-73280号公报的方法制备。
本发明的单克隆抗体可以采用本领域技术人员所公知的方法获得(例如“Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实验指南)”(John Wiley&Sons，(1987))、Antibodies(抗体)：A laboratoryManual(实验指南)，Ed.Harlow和David Lane，Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)(1988))。
免疫抗原可以使用TARM蛋白或TARM-L蛋白的片段。或者可使用基于上述氨基酸序列合成的片段。抗原可以以与载体蛋白的复合物的形式使用。抗原与载体蛋白复合物的制备中可以使用各种缩合剂，可使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯等。载体蛋白质可以是牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白等常用的载体蛋白，通常采用以1～5倍量的比例偶联的方法。
被免疫的动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等，接种方法有皮下、肌肉或腹腔内给予。给予时可以与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合给予，给予通常是每隔2～5周进行一次。
由被免疫的动物的脾脏或淋巴结得到的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，以杂交瘤的形式分离。骨髓瘤细胞可使用来自小鼠、大鼠、人等的骨髓瘤细胞，优选来自与抗体生成细胞同种，也可以是不同种。
细胞融合的操作方法可按照已知的方法，例如Nature，256，495，1975来实施。
融合促进剂有聚乙二醇或仙台病毒等，通常可使用20～50％左右浓度的聚乙二醇(平均分子量1000～4000)，在20～40℃、优选30～37℃的温度下，在抗体生成细胞数与骨髓瘤细胞数的比通常为1∶1～10∶1左右反应约1～10分钟左右，由此实施细胞融合。
生成抗体的杂交瘤的筛选可以采用各种免疫化学方法。例如有：使用涂布TARM蛋白或TARM-L蛋白的微量板的ELISA法、使用涂布抗免疫球蛋白抗体的微量板的EIA法、对含有TARM蛋白的样本进行电泳然后使用硝化纤维素转印膜的免疫印记法等。
生成抗体的杂交瘤的筛选可以通过确认该抗体是否对TARM蛋白或TARM-L蛋白的功能产生影响进行筛选，由此代替上述免疫化学方法。通过本发明的第一方案的抗体对TARM蛋白的功能的影响、例如通过本发明的第一方案的抗体对TARM蛋白的交联刺激是否活化了树状细胞(实施例3)；该抗体与TARM蛋白的结合是否可抑制TARM蛋白与T细胞的粘附功能(实施例6和实施例11)；或者该抗体与TARM蛋白的结合是否抑制了TARM蛋白与FcRγ链形成复合物(实施例4)，可以筛选生成抗体的杂交瘤。通过本发明的第二方案的抗体对TARM-L蛋白的功能的影响、例如通过本发明的抗体的第二方案与TARM-L蛋白的结合是否可抑制TARM蛋白和TARM-L蛋白的结合功能，由此可筛选生成抗体的杂交瘤。通过该筛选方法，可以选择本发明的抗体的优选方案-对TARM蛋白或TARM-L蛋白的功能产生影响的抗体。另外，该筛选可以在通过是否生成与TARM蛋白或TARM-L蛋白结合的抗体进行选择的上述免疫化学方法筛选之后进行，以二次筛选的形式进行。
进一步通过例如极限稀释法由上述孔进行克隆，获得克隆。杂交瘤的筛选、培养通常是添加HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)，在含有10～20％胎牛血清的动物细胞用培养基(例如RPMI1640)中进行。这样得到的克隆移植到预先给予了降植烷的SCID小鼠的腹腔内，10～14天后采集高浓度含有单克隆抗体的腹水，可得到纯化抗体的原料。还可以培养该克隆，将该培养物作为纯化抗体的原料。
单克隆抗体的纯化可以采用作为免疫球蛋白的纯化方法而已知的方法，例如可通过硫酸铵分级分离法、PEG分级分离法、乙醇分级分离法、阴离子交换体的利用、蛋白A柱、蛋白G柱y、以及使用TARM蛋白的亲和柱层析等的方法容易地实现。
本发明的“功能性片段”是指抗体的一部分(部分片段)，可特异性识别本发明的蛋白质的片段。具体有：Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链抗体(scFv)和它们的聚合物等。
本发明的第一方案的抗体的优选例子有：本发明的第一方案的新型蛋白质的抗体及其功能性片段。
本发明的第一方案的抗体的优选例子进一步有下述蛋白质的抗体。
(ix’)含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(x’)含有在SEQ ID NO.12所示氨基酸序列中有1或多个氨基酸插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi’)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码、且与含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii’)含有与SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列、且与含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
本发明的第一方案的抗体的更优选例子有：含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列或具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
具体例子有：保藏的FERM BP-10376杂交瘤所生产的单克隆抗体。
因此，本发明提供在2005年7月15日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所生物寄托中心(
Figure A20068004461400271
305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-10376的杂交瘤(@TARM#6.11)。
本发明的第一方案的抗体的更优选例子还有：含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列或者具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
本发明的第二方案的抗体的优选例子有：含有SEQ ID NO.14所示氨基酸序列或具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
本发明的第二方案的抗体的优选例子还有：含有SEQ ID NO.16所示氨基酸序列或具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
本发明的第二方案的抗体的更优选例子有：识别TARM-L蛋白质在胞外表达的多肽部分的抗体或其功能性片段。上述抗体例如有：含有由SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的第1～第159号、SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的第1～第158号氨基酸序列的至少6个氨基酸残基或全部形成的多肽的蛋白质的抗体或其功能性片段。
[抗体的用途和药物组合物]
自身免疫疾病
参与免疫应答的淋巴结-T细胞通过与树状细胞的协同作用而担负各种免疫应答，其中所述树状细胞作为对T细胞具有抗原呈递功能的细胞而已知(Kroczek，RA.，等人.(2004)Current Opinion inImmunology(免疫学新观点)16：321～327)。如后述实施例所示，通过炎症刺激，TARM蛋白在树状细胞上的表达增强(实施例2)；经由TARM蛋白，树状细胞与T细胞粘附(实施例5和实施例10)。还可确认，树状细胞被经结合刺激的TARM蛋白活化，诱导IL-6的生成(实施例3)。有人报道，IL-6的过量生产与自身免疫疾病有关(Ishihara，K.，等人.(2002)Cytokine&Growth Factor Reviews 13：357～368)。并且，通过TARM蛋白的抗体，T细胞与树状细胞的粘附得到显著抑制(实施例6和实施例11)。
在后述实施例中，在胶原诱导关节炎模型中，可以确认本发明的抗体实际上具有治疗效果(实施例7)。胶原诱导关节炎模型是自身免疫疾病之一的类风湿性关节炎的模型。
因此，本发明的第一方案的抗体对于自身免疫疾病的治疗有效。
自身免疫疾病例如有类风湿性关节炎。
同样，可以认为通过TARM-L蛋白的抗体，T细胞与树状细胞的粘附得到抑制。因此，本发明的第二方案的抗体对于自身免疫疾病的治疗有效。
本发明还提供本发明的抗体在自身免疫疾病治疗药的制备中的应用。
本发明又提供自身免疫疾病的治疗方法，该方法包含将治疗上有效量的本发明的抗体给予包括人的哺乳动物的步骤。
T细胞粘附抑制剂
如后述实施例中所示，通过TARM蛋白的抗体，T细胞与树状细胞的粘附得到显著抑制(实施例6和实施例11)。因此，本发明的第一方案的抗体可用作T细胞粘附抑制剂。
同样可以认为，通过TARM-L蛋白的抗体，T细胞与树状细胞的粘附得到抑制。因此，本发明的第二方案的抗体可用作T细胞粘附抑制剂。
本说明书中，“T细胞粘附”是指树状细胞与T细胞的粘附，即，在树状细胞上表达的TARM蛋白与在T细胞上表达的TARM-L蛋白的结合。使用本发明的T细胞粘附抑制剂，通过抑制在树状细胞上表达的TARM蛋白与在T细胞上表达的TARM-L蛋白的结合，可以抑制由于树状细胞与T细胞的相互作用而产生的免疫应答、例如树状细胞和T细胞的活化、增殖、分化、细胞因子/趋化因子的生成。
药物组合物
对本发明的抗体的给予形式没有特别限定，可以通过口服给予、非口服给予(例如静脉注射、肌肉注射、皮下给予、直肠给予、透皮给予、局部给予)的任意给予途径给予包括人在内的哺乳类，优选非口服给予，特别是静脉注射。
口服给予和非口服给予的剂型及其制备方法是本领域技术人员所周知的，通过将本发明的抗体与药学上可接受的载体等混合等，可按照常规方法进行。
药学上可接受的载体例如可使用在制剂领域中常用且不与本发明的抗体反应的物质。药学上可接受的载体例如可使用通常所使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂或根据需要使用稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、增量剂、湿润剂、表面活性剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、助溶剂、止痛剂等，可以配合通常作为药物制剂原料使用的成分，按照常规方法制成制剂。
非口服给予的剂型有：注射用制剂(例如输液注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂)、外用剂(例如软膏剂、泥敷剂、洗剂)、栓剂、吸入剂、滴眼剂、眼软膏剂、滴鼻剂、滴耳剂、脂质体剂等。
例如，注射用制剂通常可以将本发明的抗体溶解于注射用蒸馏水中制备，也可以根据需要添加助溶剂、缓冲剂、pH调节剂、等渗剂、止痛剂、保存剂、稳定剂等。还可以制成在用时调制的冻干制剂。
用于口服给予的剂型有固体或液体的剂型，例如有片剂、包衣片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳液剂、混悬剂、注射剂、锭剂等。
本发明的药物组合物可进一步含有治疗上有效的其它药物，还可根据需要配合血液循环改善剂、灭菌剂、消炎剂、细胞活化剂、维生素类、氨基酸、保湿剂、角质溶解剂等成分。此时，有效成分与载体的比例可在1～90％重量之间变动。
本发明的抗体的给予量例如可以根据给予途径、疾病的种类、症状的程度、患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度、药物动力学和毒物学特征等药理学知识、是否利用了药物输送系统、以及是否作为与其它药物组合的一部分给予等各种因素由临床医生确定，通常成人(体重60公斤)口服给予时为1～5000mg/天，优选10～2000mg/天，进一步优选50～2000mg/天；注射给予时为1～5000mg/天，优选5～2000mg/天，进一步优选50～2000mg/天，可以分一次或多次给予。给予幼儿时，用量可以比给予成人的量少。实际使用的给予方法根据临床医生的判断而有很大变化，可以脱离上述给予范围。
[筛选方法]
抑制TARM蛋白与T细胞粘附的物质的筛选方法
本发明的第一方案的筛选方法提供抑制TARM蛋白与T细胞粘附的物质的筛选方法。
TARM蛋白在树状细胞上表达，参与与树状细胞和T细胞之间免疫应答有关的相互作用。另外，通过对TARM蛋白增加结合刺激，可诱导作为自身免疫疾病原因的IL-6的生成。因此，本发明的第一方案的筛选方法可用于抑制TARM蛋白和T细胞粘附的物质的筛选，可用于优选自身免疫疾病、更优选类风湿性关节炎的治疗中有用的物质的筛选。
本发明的第一方案的筛选方法中，在步骤(b)之后可以进一步含有(c)对在被检物质存在下的结合活性与被检物质非存在下的结合活性进行比较的步骤。
步骤(c)中，被检物质存在下的结合活性低于被检物质非存在下的结合活性时、优选为50％以下时，可以判定该被检物质抑制本发明的蛋白质与T细胞的结合。
步骤(a)中，“使其接触”只要是TARM蛋白与T细胞直接接触的方案即可，没有特别限定，例如可通过在固定有TARM蛋白的板上添加标记的T细胞的方法，或者在含有T细胞的板上添加标记的TARM蛋白的方法实施。
T细胞优选为活化T细胞，更优选为活化Th2细胞。
步骤(b)中，结合活性的测定可通过公知的方法进行。例如，在固定有TARM蛋白的板上添加标记的T细胞，培养一定时间后，通过洗涤等除去未粘附的细胞，对粘附的细胞进行测定，由此可测定结合活性。
上述标记例如可使用放射性同位素、酶、荧光物质(包含荧光蛋白)、发光物质等。放射性同位素例如可使用[3H]、[14C]、[125I]、[35S]等。上述酶例如可使用β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶等。荧光物质例如可使用荧光素异硫氰酸酯、BODIPY、钙黄绿素-AM(同仁社制备)等，荧光蛋白例如可使用GFP等。这些酶和荧光蛋白可以将基因导入到细胞中使其表达。发光物质例如可使用萤光素、光泽精等。根据情况，为了使上述配体与标记物质结合，可以使用生物素-抗生物素蛋白的体系。
还可以不标记T细胞即进行添加，通过T细胞特异性抗体、例如抗CD3抗体，或者辅助T细胞特异性抗体、例如抗CD4抗体来检测粘附的T细胞。
结合活性可以预先对添加的细胞进行测定，以粘附的细胞相对于添加的细胞的比例表示。
抑制树状细胞活化的物质的筛选方法
本发明的第二方案的筛选方法提供抑制树状细胞活化的物质的筛选方法。
经结合刺激的TARM蛋白可以活化树状细胞(实施例3和4)。因此，使用用TARM抗体进行交联刺激的树状细胞体系，可以筛选抑制树状细胞活化的物质。
如上所述，有证据显示：树状细胞的活化引起自身免疫疾病。因此，抑制本发明的树状细胞活化的物质的筛选方法可用于优选自身免疫疾病、更优选类风湿性关节炎治疗中有用的物质的筛选。
对在树状细胞上表达的TARM蛋白给予交联刺激，则树状细胞被活化，但此时TARM蛋白与作为信号传递分子已知的FcRγ链形成复合物，同时也会诱导作为自身免疫疾病病因的IL-6或单核细胞的趋化性因子MCP-1的生成。因此，在本发明的第二方案的筛选方法的步骤(e)中，可以以树状细胞中的IL-6和/或MCP-1的生成量作为指标测定树状细胞的活化程度，或者以树状细胞中FcRγ链的表达量作为指标测定树状细胞的活化程度。
本发明的第二方案的筛选方法中，在以树状细胞中的IL-6和/或MCP-1的生成量为指标测定树状细胞的活化程度时，可以在步骤(e)之后进一步含有(f-1)将被检物质存在下的IL-6和/或MCP-1的生成量与被检物质非存在下的IL-6和/或MCP-1生成量进行比较的步骤。在步骤(f-1)中，如果被检物质存在下的IL-6和/或MCP-1的生成量低于被检物质非存在下的IL-6和/或MCP-1的生成量、优选为50％以下时，可以判定该被检物质抑制树状细胞的活化。
本发明的第二方案的筛选方法中，在以树状细胞中FcRγ链的表达量为指标测定树状细胞的活化程度时，可以在步骤(e)之后进一步含有(f-2)将被检物质存在下的FcRγ链的表达量与被检物质非存在下的FcRγ链的表达量进行比较的步骤。
步骤(f-2)中，如果被检物质存在下的FcRγ链的表达量低于被检物质非存在下的FcRγ链的表达量、优选为50％以下时，可以判定该被检物质抑制树状细胞的活化。
步骤(d)中，“使其接触”只要是树状细胞上的TARM蛋白通过本发明的抗体进行交联刺激的方案即可，没有特别限定，例如可通过在含有本发明抗体的培养基中培养树状细胞来进行。
步骤(e)中，蛋白质的生成量或表达量的测定可按照公知的方法进行，也可以使用市售的试剂盒。
抑制TARM蛋白与FcRγ链形成复合物的物质的筛选方法。
本发明的第三方案的筛选方法提供抑制TARM蛋白与FcRγ链形成复合物的物质的筛选方法。
TARM蛋白在树状细胞上表达，与作为信号传递分子而已知的FcRγ链形成复合物。另外，FcRγ链通过与TARM蛋白形成复合物，显示在细胞表面上的表达增加。因此，本发明的筛选方法可以用于抑制TARM蛋白与FcRγ链形成复合物的物质的筛选，可用于优选自身免疫疾病、更优选类风湿性关节炎的治疗中有用的物质的筛选。
本发明的筛选方法中，在步骤(h)之后可以进一步含有(i)将被检物质存在下的FcRγ链的表达量与被检物质非存在下的FcRγ链的表达量进行比较的步骤。
步骤(i)中，如果被检物质存在下的FcRγ链的表达量低于被检物质非存在下的FcRγ链的表达量、优选为50％以下时，可以判定该被检物质抑制本发明的蛋白质与FcRγ链形成复合物。
步骤(g)中，“使其接触”只要是表达TARM蛋白和FcRγ链的树状细胞与本发明的抗体直接接触的方案即可，没有特别限定，例如可通过在含有本发明抗体的培养基中培养树状细胞来进行。
步骤(h)中，表达量的测定可通过公知的方法进行，例如可使用流式细胞仪测定。
本说明书中，“被检物质”有：合成低分子化合物、蛋白质、合成肽、纯化或部分纯化的多肽、抗体、细菌释放物质(包括细菌代谢产物)、核酸(反义、核酶、RNAi等)等，优选化合物或其盐或者它们的溶剂合物(例如水合物)，但并不限于此。“被检物质”可以是新型物质，也可以是公知的物质。
实施例
以下通过实施例详细说明本发明，但下述实施例并不限定本发明的范围。实施例中，“TARM蛋白”可简称为“TARM”，“TARM-L蛋白”可简称为“TARM-L”。另外，来自小鼠的TARM蛋白可简称为“mTARM”，来自人的TARM蛋白可简称为“hTARM”。
[实施例1]小鼠TARM基因的分离和表达分析
(1)mTARM基因的分离
将由小鼠脾脏分离的CD4T细胞通过体外培养分化成Th1或Th2，分别由Th1或Th2制备用于驱动(driver)和测试(tester)的cDNA片段，使用在进行高灵敏度扣除(N-RDA)法的过程中得到的cDNA片段的序列进行Blast检索。结果得到了编码功能未知的膜蛋白的基因(GenbankTM检索号NM_177363)。
以GenBankTM的序列(NM_177363)的序列为基础，如下设计PCR用引物，研究小鼠各器官中mTARM基因的表达。
mTARM F1：GTGACTTTGCAGTGCCAGAA(SEQ ID NO.17)
mTARM R1：TGCACAGGAGTTGAGTGTCC(SEQ ID NO.18)
使用RNA PCR试剂盒(TAKARA公司制备)，由各器官的总RNA(Promega公司制备)合成单链cDNA，以此作为模板，通过ABI7700(Applied Biosystems公司制备)进行实时PCR。PCR在以下的反应液组成(12.5μl QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN公司制备)、0.25μl尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen公司制备)、0.125μl 100μMmTARM F引物、0.125μl 100μM mTARM R引物、2.5μl模板cDNA(稀释10倍)、7.25μl蒸馏水)中进行。PCR是在94℃下处理10分钟，然后将94℃30秒、60℃1分钟的反应进行35个循环。结果，mTARM在肾脏中表达。
使用肾脏的总RNA，进行5’-RACE(cDNA末端快速扩增)和3’-RACE，尝试确定mTARM的全长基因序列。
首先，使用cDNA合成试剂盒(TAKARA公司制备)，由小鼠肾脏的总RNA合成双链cDNA，使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司制备)纯化cDNA。接着附加ad29接头(使ad29S：acatcactccgt(SEQ IDNO.19)和ad29A：acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct(SEQ ID NO.20)退火所得)，作为RACE的模板。
1st PCR是在以下的反应液组成(5μl 10×ExTaq缓冲液、4μl 2.5mMdNTP、0.25μl ExTaq、0.5μl 100μM引物(5’PCR4)、0.5μl 100μM基因特异性引物、1μl附加有ad29接头的cDNA(稀释25倍)、38.75μl蒸馏水)进行。
引物使用下述序列。
5′PCR4：AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG(SEQ ID NO.21)
mTARM_RACE_5′_4：CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT(SEQ IDNO.22)，或
mTARM_RACE_3′_4：GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC(SEQ IDNO.23)
PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃1分钟、72℃5分钟的反应进行30个循环，最后在72℃下反应5分钟。
2nd PCR是在以下的反应液组成(5μl 10×ExTaq缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、0.25μl ExTaq、0.5μl 100μM引物(5’PCR1)、0.5μl 100μM基因特异性引物、1μl 1st PCR产物(稀释100倍)、38.75μl蒸馏水)中进行。
引物使用下述序列。
5′PCR1：GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG(SEQ ID NO.24)
mTARM_RACE_5′_3：TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT(SEQ IDNO.25)，或
mTARM_RACE_3′_3：CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCTTTC(SEQ ID NO.26)
PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行25个循环，最后在72℃下反应5分钟。将扩增的cDNA片段克隆到pCR2.1(Invitrogen公司制备)后，使用ABI3100测序仪(Applied Biosystems公司制备)确定核苷酸序列。
结果，5’RACE中得到2种、3’RAGE中得到3种cDNA，明确了剪接同种型的存在。
使用RACE所得的核苷酸序列信息，进行扩增各剪接同种型的引物的设计。使用cDNA合成试剂盒(TAKARA公司制备)，由小鼠骨髓的总RNA合成双链cDNA，使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司制备)纯化cDNA。PCR在以下的反应液组成(5μl 10×ExTaq缓冲液、4μl2.5mM dNTP、0.25μl ExTaq、0.5μl 100μM 5’引物、0.5μl 100μM 3’引物、1μl cDNA(稀释25倍)、38.75μl蒸馏水)中进行。
引物使用下述序列。
mTARM_5′UTR：GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC(SEQ ID NO.27)
mTARM_3′UTR-1：GTCCAGATATGTCCAGGCCTCTG(SEQ ID NO.28)，或
mTARM_3′UTR-2：TTCAGTTATTTTACCAGGGTTTA(SEQ ID NO.29)
PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行35个循环，最后在72℃下反应5分钟。通过两种引物对可以确认6种剪接同种型。结果，在6种剪接同种型的组合中，5种可得到扩增产物，因此，将扩增的cDNA片段克隆到pCR2.1(Invitrogen公司制备)上，然后使用ABI3100测序仪确定核苷酸序列。
结果了解到，存在编码4种膜结合型TARM基因(m1、m2、m3、m4)和一种分泌型TARM基因(s1)的剪接同种型(图1)。
(2)mTARM基因的表达分析
对mTARM基因在小鼠正常组织中的表达进行分析。如上所述，由于存在剪接同种型，因此设计了3组引物对。
对1(设计为特异性扩增m1、m2同种型)
mTARM_qF2：TCTGTGATAGACAACCATCT(SEQ ID NO.30)
mTARM_qR2：GTCATTGTACCCGGGGTCTT(SEQ ID NO.31)
对2(设计为特异性扩增m3、m4同种型)
mTARM_qF4：ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA(SEQ ID NO.32)
mTARM_qR3：TCATTTTTCTCCTGGGGCAC(SEQ ID NO.33)
对3(设计为特异性扩增s1同种型)
mTARM_qF3：GATCTCTGTGATAGATGCAAG(SEQ ID NO.34)
mTARM_qR2：GTCATTGTACCCGGGGTCTT(SEQ ID NO.35)
使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN公司制备)，由小鼠器官制备总RNA，或者使用RNA PCR试剂盒(TAKARA公司制备)，由购入的各器官的总RNA(Promega公司制备)合成单链cDNA，以此作为模板，通过ABI7700进行实时PCR。PCR在以下反应液组成(12.5μl QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN公司制备)、0.25μl尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen公司制备)、0.125μl 100μM F引物、0.125μl 100μμM R引物、2.5μl模板cDNA(稀释10倍)、7.25μl蒸馏水)中进行。
PCR在94℃下处理10分钟，然后将94℃30秒、60℃1分钟的反应进行35个循环。
结果表明，mTARM在骨髓中强烈表达(图2)。
接着，进行mTARM在各种细胞中的表达分析。
使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN公司制备)，由从小鼠脾脏分离纯化的细胞、体外培养的细胞和各种细胞株中制备总RNA，使用RNAPCR试剂盒(TAKARA公司制备)，合成单链cDNA，以此作为模板，通过ABI7700，与小鼠正常组织中的表达分析同样地进行实时PCR。
结果表明，mTARM在来自骨髓的树状细胞中强烈表达(图3)。
[实施例2]小鼠TARM抗体的制备和表达分析
(1)表达mTARM基因的细胞的制备
mTARM基因表达载体的制备如下进行。
引物基于同种型m1的核苷酸序列设计。
mTARM F2：cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT(SEQ ID NO.36)
mTARM R2：gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG(SEQ ID NO.37)
使用RNA PCR试剂盒(TAKARA公司制备)，由骨髓的总RNA合成单链cDNA，用作模板。PCR在以下反应液组成(5μl 10×缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、0.5μl Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制备)、各0.5μl 100μM引物、1μl cDNA、2.5μl DMSO、36μl蒸馏水)中进行。PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行35个循环，最后在72℃下反应2分钟。将扩增的cDNA克隆到pBlueScriptII SK(+)(Stratagene公司制备)中，用ABI3100测序仪确认核苷酸序列。将所得cDNA片段插入到表达载体pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000)19(27)：3050～3058)中，制备mTARM基因表达载体。
重组反转录病毒的制备如下进行。
将3×106个293/EBNA-1细胞株(Invitrogen公司制备)悬浮于培养基(D-MEM/10％FBS)中，接种于10cm的培养皿中，在CO2培养箱中培养24小时。第二天更换培养基，加入如下制备的转染溶液，进行转染。转染溶液是在5ml的管中加入600μl OPTI-MEM(GIBCO BRL公司制备)和24μl TransIT LT1(TaKaRa公司制备)，混合，在室温下静置5分钟，然后加入9μg表达载体和9μg包装载体pCL-Eco(Imgenex公司制备)，在室温下静置5分钟。48小时后回收培养上清，进行0.45μm的滤器过滤，得到重组病毒液。
将该重组病毒如下感染B300.19细胞株(EMBO J.(1984)3：1209～1219)，制备mTARM基因表达细胞。将1×106个B300.19细胞加入到15ml的管中，在1200rpm、25℃下离心5分钟，然后吸引除去培养上清。向2ml重组病毒液中加入2μl polybrene(10mg/ml)和2μl 55μM 2-巯基乙醇，混合，将所得溶液加入到细胞中，在2500rpm、30℃下离心2小时，进行感染，感染后除去重组病毒液，加入培养基(RPMI-1640/10％FBS/55μM 2-巯基乙醇)，进行培养。将EGFP阳性细胞通过细胞分选仪分离，获得mTARM表达细胞。
(2)mTARM的胞外域和SEAP以及Fc嵌合蛋白的制备
首先，如下制备pcDNA3.1(+)-SEAP(His)10-Neo载体。
pcDNA3.1(+)-Neo载体(Invitrogen公司制备)的内源性SalI位点是用SalI消化，然后使进行平滑化，由此使其缺损。SEAP(His)10的cDNA片段是以pDREF-SEAP His6-Hyg(J.Biol.Chem.，1996，271，21514～21521)为模板，使用附加有HindIII的5’引物和附加有XhoI的3’引物，通过PCR进行扩增。将所得cDNA片段用HindIII和XhoI消化，然后插入到使SalI位点缺损的pcDNA3.1(+)-Neo载体中。
接着，mTARM的胞外域是以mTARM全长cDNA为模板，使用附加有SalI的5’引物(mTARM_F2：(SEQ ID NO.36))和附加有NotI的3’引物(mTARM_R3：cgcggcggccgcattatccacagtgtgtagccttctgtcat(SEQ IDNO.38))，通过PCR进行扩增。PCR在以下的反应液组成(5μl 10×缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、0.5μl Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制备)、各0.5μl 100μM引物、1μl cDNA、2.5μl DMSO、36μl蒸馏水)中进行。PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行35个循环，最后在72℃下反应2分钟。将扩增的cDNA克隆到pBlueScriptII SK(+)(Stratagene公司制备)上，使用ABI3100测序仪确认核苷酸序列。将所得cDNA片段用SalI和NotI进行消化，然后插入到上述pcDNA3.1(+)-SEAP(His)10-Neo载体中，制备mTARM-AP表达载体。
由此，mTARM的胞外域与分泌型人胎盘性碱性磷酸酶通过3个氨基酸接头(Ala-Ala-Ala)结合，并且可表达C末端有10个组胺酸标志物(His)10的分泌嵌合蛋白(以下称为AP嵌合蛋白)。所得AP嵌合蛋白表达载体是使用TransIT LT1(TAKARA公司制备)，导入到293/EBNA-1细胞株中，培养4～5天。分泌到培养上清中的AP嵌合蛋白通过离心回收培养上清，用0.22μm的滤器过滤，然后分别加入Hepes(pH 7.4)和叠氮化钠，终浓度为20mM、0.02％，在4℃下保存。AP嵌合蛋白的浓度是使用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN公司制备)测定碱性磷酸酶活性计算。
(3)mTARM单克隆抗体的制备
为了用作免疫的抗原，首先进行mTARM-AP嵌合蛋白的纯化。
纯化是利用存在于AP嵌合蛋白C末端的组胺酸标志物，使用HisTrap试剂盒(Amersham Biosciences公司制备)进行。将含有mTARM-AP嵌合蛋白质的培养上清添加到1ml的HiTrap chelating HP柱(AmershamBiosciences公司制备)中，通过10mM咪唑溶液进行洗涤，然后用500mM咪唑溶液由柱中洗脱mTARM-AP嵌合蛋白。mTARM-AP嵌合蛋白的浓度通过使用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN公司制备)的酶活性测定和使用蛋白质测试试剂盒II(BIO-RAD公司制备)的蛋白质定量计算。
所得mTARM-AP嵌合蛋白与TiterMax混合，免疫WKY大鼠(购自日本SLC公司)。由被免疫的大鼠中分离淋巴细胞，将P3骨髓瘤细胞(ATCC)和淋巴细胞按照比例1∶5混合，使用PEG1500溶液(Boehringer公司制备)进行细胞融合。通过HAT培养基(Invitrogen公司制备)选择杂交瘤，所得杂交瘤的培养上清通过使用mTARM-Fc嵌合蛋白的夹层ELISA进行筛选。由阳性孔进行克隆，得到3种克隆(#6、#21、#37)。使制备的抗mTARM抗体与导入了mTARM-IRES-EGFP的B300.19细胞反应，通过FACS进行分析，结果，制备的抗体只与表达EGFP的B300.19细胞反应(图4B)，可以确认抗mTARM抗体的特异性。
将生产所得抗mTARM单克隆抗体#6、#21、#37的杂交瘤接种于裸鼠的腹腔，得到腹水，使用蛋白G柱纯化抗体。生产抗mTARM单克隆抗体#6的杂交瘤以FERM BP-10376保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。
(4)来自骨髓的培养树状细胞中TARM蛋白的表达
使用所得单克隆抗体(mAb)，研究mTARM蛋白在来自骨髓的培养树状细胞表面上的表达。
来自骨髓的培养树状细胞按以下方法制备。将C57BL/6雄性小鼠(购自日本SLC公司)的骨髓细胞悬浮于含有小鼠GM-CSF(20ng/ml)(R&D系统公司制备)的培养基(RPMI1640/10％FBS/1mM丙酮酸钠/55μM 2-巯基乙醇)中，使其浓度为2×106个/10ml，接种于未处理的10cm培养皿中进行培养。3天后，加入10ml含有小鼠GM-CSF(20ng/ml)的培养基，继续培养。并且，在3天后回收10ml培养液，离心，然后将细胞块用10ml含有新鲜的小鼠GM-CSF(20ng/ml)的培养基悬浮，返回到原来的未处理的10cm培养皿中，培养2天。上述所得的未成熟树状细胞悬浮于含有LPS(100ng/ml)(Sigma公司制备)的培养基中，使其浓度为1×107个/10ml，细胞培养处理完毕后接种于10cm的培养皿中培养1天，获得成熟树状细胞。
将来自骨髓的未成熟树状细胞悬浮于含有5％小鼠血清的FACS缓冲液(PBS/1％FBS/1mM EDTA)中，与抗体#6或抗体#21(10μg/ml)反应，然后与PE标记驴抗大鼠IgG二次抗体(Jackson公司制备)反应，使用FACSCalibur(Becton Dickinson公司制备)测定。结果，抗体#6、抗体#21与阴性对照的大鼠IgG相比，均可见强的阳性反应。
因此，为了对mTARM表达细胞进行详细分析，使用Alexa 647单克隆抗体标记试剂盒(Molecular Probe公司制备)对抗体#6进行荧光标记。接着，将未成熟的树状细胞或经LPS刺激得到的成熟树状细胞悬浮于含有5％小鼠血清、5％大鼠血清的FACS缓冲液(PBS/1％FBS/1mM EDTA)中，加入FcR封闭溶液(BD Pharmingen公司制备)，在冰上反应10分钟，然后使荧光标记抗mTARM抗体和抗CD11c树状细胞标记抗体以及抗CD40活化标记抗体在冰上反应30分钟，使用FACSCalibur测定。
结果了解到，mTARM蛋白在未成熟和成熟树状细胞中表达；在成熟骨髓树状细胞中与在未成熟树状细胞中相比，mTARM蛋白的表达增强；表达活化标志CD40的细胞中，mTARM蛋白的表达强(图5)。
(5)正常小鼠中TARM蛋白的表达
在来自骨髓的树状细胞中可见mTARM的表达，由此对mTARM蛋白在正常小鼠免疫组织中的表达进行分析。
从C57BL/6雄性小鼠的骨髓、末梢血、脾脏、肠道淋巴结、淋巴集结中制备细胞，悬浮于含有5％小鼠血清、5％大鼠血清的FACS缓冲液(PBS/1％FBS/1mM EDTA)中，加入FcR封闭溶液，在冰上反应10分钟。接着将荧光标记抗mTARM抗体和各种荧光标记细胞系列标记抗体在冰上反应30分钟，然后使用FACSCalibur测定。
结果，在正常小鼠的免疫组织中，在脾脏(SP)中的CD3阳性T细胞、DX5阳性NK细胞、CD11b阳性骨髓系细胞、CD11c阳性树状细胞或末梢血(PBL)中的B220阳性B细胞、F4/80阳性单核细胞/巨噬细胞、高SSC/Grl阳性嗜中性粒细胞、高SSC/F4/80阳性嗜酸性粒细胞中均未见mTARM蛋白的表达(图6)。
因此，使用由腹腔制备的细胞，对正常小鼠末梢组织中的表达进行分析。
结果，mTARM蛋白在腹腔的CD3阳性T细胞、DX5阳性NK细胞、CD11c阳性树状细胞，B220阳性B细胞、F4/80阳性单核细胞/巨噬细胞、高SSC/Grl阳性嗜中性粒细胞中未见表达，但在CD11b阳性骨髓系细胞的一部分中可见表达，对其进行进一步的分析，结果可知，mTARM蛋白在c-kit阳性肥大细胞中表达(图7)。
(6)通过LPS炎症刺激的树状细胞中TARM蛋白的表达
mTARM蛋白在培养树状细胞中表达，但在小鼠免疫和末梢组织的树状细胞中未见表达，因此可以认为是在体内通过炎症刺激诱导表达。因此，将100μg LPS腹腔内给予C57BL/6雄性小鼠，在14小时～18小时后从肠系膜淋巴结中回收细胞，分析mTARM蛋白的表达。
结果，通过LPS炎症刺激，可见mTARM蛋白在转移到肠系膜淋巴结中的CD11c阳性/CD11b+阳性骨髓系树状细胞中表达(图8)。因此，mTARM蛋白在体内的正常时的树状细胞中不在细胞表面上表达，但是在炎症时，在树状细胞、尤其是骨髓系树状细胞中选择性地表达。由此显示，mTARM蛋白在炎症时通过树状细胞发挥功能。
[实施例3]抗TARM抗体对来自骨髓的培养树状细胞的活化
mTARM在树状细胞中选择性地表达，由此对mTARM交联刺激对树状细胞的活化进行研究。
将1×108个来自骨髓的未成熟树状细胞或成熟树状细胞悬浮于350μl的MACS缓冲液(PBS/1％FBS/2mM EDTA)中，加入50μl FcR封闭溶液(Miltenyi公司制备)，在4℃下反应10分钟，然后加入100μl CD11c微珠(Miltenyi公司制备)，在4℃下反应30分钟，然后使用Auto MACS(Miltenyi公司制备)，分离纯化CD11c阳性细胞。在37℃下、将F(ab)’2抗大鼠IgG抗体(10μg/ml)(Jackson公司制备)在96孔板上固定2小时，用PBS清洗，然后在37℃下将抗mTARM抗体#6、#21或阴性对照的大鼠IgG(10μg/ml)固定1小时。将板用PBS清洗，然后将纯化的CD11c阳性树状细胞在培养基或含有终浓度为2μg/ml的抗CD40活化抗体(DBPharmingen公司制备)的培养基中培养。在24小时或48小时后回收培养上清，使用DuoSet ELISA Development试剂盒(R&D公司制备)进行细胞因子的检测。
结果，抗mTARM抗体与抗CD40抗体同等程度地诱导由来自骨髓的成熟树状细胞生成IL-6，并且与抗CD40抗体具有协同效果(图9A)。同样，在未成熟树状细胞中也可见诱导IL-6的生成的倾向。并且，抗mTARM抗体诱导未成熟骨髓树状细胞生成MCP-1，但在抗CD40抗体中未见诱导(图9B)。抗mTARM抗体对MCP-1生成的诱导在成熟骨髓树状细胞中未见。除此之外，也对IL-12、TNFα、IL-1β、IL-10、KC的生成诱导进行了分析，但抗mTARM抗体对于未成熟树状细胞和成熟树状细胞均未见显著的影响。
由以上结果表明，树状细胞上的mTARM与特定的细胞因子或趋化因子(例如IL-6或MCP-1)的生成有关。
[实施例4]TARM与FcRγ链的复合物形成
已了解到，mTARM可发挥树状细胞活化受体的功能，因此，尝试了解信号传递分子。mTARM与参与破骨细胞分化的Oscar的跨膜部位相似。已知Oscar与作为IgE受体而周知的信号传递分子FcRγ链形成复合物，可以认为该缔合与Oscar的跨膜区的碱性氨基酸和FcRγ链的酸性氨基酸的相互作用有关。mTARM在跨膜区也具有碱性氨基酸。另一方面，作为与FcRγ链同样地在跨膜区具有酸性氨基酸的活化信号传递分子已知有DAP10、DAP12。因此，对FcRγ链、DAP10或DAP12是否与mTARM形成复合物进行研究。
FcRγ链、DAP10、DAP12的表达载体如下制备：分别使用根据GenBankTM的NM_010185、AF072846、NM_011662所示的核苷酸序列设计的下述引物进行扩增，
FcRγF：cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT(SEQ ID NO.39)
FcRγR：gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT(SEQ ID NO.40)
DAP10F：cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC(SEQ ID NO.41)
DAP10R：gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT(SEQ ID NO.42)
DAP12F：cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT(SEQ ID NO.43)
DAP12R：gcgggcggccgcTCATCTGTAATATTGCCTCTGTGT(SEQ ID NO.44)
将所得cDNA片段插入设计成以Flag标志序列附加在N末端的形式在细胞表面上表达的表达载体pMIXII IRES-Puro。按照与mTARM表达细胞的制备同样的方法制备重组反转录病毒，感染表达mTARM的B300.19细胞，在嘌呤霉素存在下进行培养，选择感染细胞。将所得的B300.19强制表达细胞悬浮于FACS缓冲液(PBS/1％FBS/1mM EDTA)中，与终浓度10μg/ml的抗体#6和小鼠抗Flag抗体(Sigma公司制备)反应，然后与PE标记驴抗大鼠IgG二次抗体(Jackson公司制备)和Cy5标记驴抗小鼠IgG二次抗体(Jackson公司制备)反应，使用FACSCalibur(Becton Dickinson公司制备)测定。
结果，在同时表达mTARM和FcRγ链时，FcRγ链在细胞表面上的表达伴随着mTARM在细胞表面上的表达量而增加。DAP10和DAP12在细胞表面上的表达与mTARM的表达量无关。因此，FcRγ链通过与mTARM链形成复合物，显示在细胞表面的表达增加(图10)。
接着，对mTARM的结合蛋白进行生物化学分析。
将B300.19强制表达细胞用含有1％digtonin的细胞溶解液(1％digtonin/50mM Tris-HCl(pH 7.5)/150mM NaCl/5mM NaF/1mM原钒酸盐/CompleteTM(Roche公司制备))溶解，通过抗Flag抗体进行免疫沉降，通过抗mTARM抗体#6进行免疫印记分析。
结果，mTARM与FcRγ链一起发生免疫沉淀，而DAP10和DAP12与mTARM并不一起免疫沉淀(图11A)。在抗Flag抗体中，FcRγ链、DAP10、DAP12分别免疫沉淀，这可通过抗Flag抗体的免疫印记分析确认。在B300.19强制表达细胞中的mTARM和附加有Flag标志的FcRγ链、DAP10和DAP12的表达通过将细胞溶解液进行抗mTARM抗体#6或抗Flag抗体的免疫印记来确认。因此可以了解到，在B300.19强制表达细胞中，FcRγ链与mTARM形成复合物。
并且，将来自骨髓的成熟树状细胞用含有1％digtonin的细胞溶解液溶解，通过阴性对照的大鼠IgG、抗mTARM抗体#21、抗CD54抗体和抗FcRγ链抗体进行免疫沉淀，通过抗FcRγ链抗体进行免疫印记。
结果，FcRγ链与mTARM一起免疫沉淀，其它的细胞膜蛋白的CD54并不与FcRγ链一起免疫沉淀(图11B)。因此，可以了解到，在成熟树状细胞中，FcRγ链与mTARM也形成复合物。
由这些结果显示，mTARM的交联刺激对树状细胞的活化是经由来自FcRγ链的信号传递进行。
[实施例5]活化的淋巴细胞与固定的TARM的粘附
(1)mTARM结合分子在活化T细胞上的表达
已知树状细胞作为抗原呈递细胞与T细胞相互作用。因此，与mTARM结合的分子在T细胞上表达，经由该分子控制树状细胞的活化。因此，对于mTARM结合分子是否存在于T细胞上进行研究。
将4×107个C57BL/6雄性小鼠的脾脏细胞悬浮于70μl MACS缓冲液(PBS/1％FBS/2mM EDTA)中，加入10μl FcR封闭溶液，在4℃下反应10分钟，再加入100μl CD4微珠(Miltenyi公司制备)，在4℃下反应15分钟，然后使用Auto MACS，得到休止期CD4阳性T细胞。用MACS纯化的CD4阳性细胞悬浮于培养基(RPMI1640/10％FBS/1mM丙酮酸钠/55μM 2-巯基乙醇)中，加入到以1μg/ml抗CD3抗体(eBioscience公司制备)溶液在37℃下固定了2小时的板中，在2μg/ml抗CD28抗体(Pharmingen公司制备)存在下进行刺激。在分化为Th1时，在10ng/ml小鼠IL-12(Peprotech公司制备)和10μg/ml抗小鼠IL-4抗体(MP4-25D2，Pharmingen公司制备)存在下进行抗CD3抗体刺激；分化为Th2时，在15ng/ml小鼠IL-4(Genzyme公司制备)和15μg/ml抗小鼠IL-12抗体(24910.1，Pharmingen公司制备)存在下进行抗CD3抗体刺激。刺激2天后，在Th1条件下加入20ng/ml小鼠IL-2(Genzyme公司制备)和10ng/ml小鼠IL-12，在Th2条件下加入20ng/ml小鼠IL-2和15ng/ml小鼠IL-4进行培养。可以确认，Th1细胞通过IFN-γ的生成、Th2细胞通过IL-4的生成而分别分化。
用MACS纯化后的休止期CD4阳性T细胞和CD3刺激后2天和8天后的活化CD4阳性T细胞，研究mTARM-AP嵌合蛋白质在细胞表面上的结合活性。细胞悬浮于FACS缓冲液(PBS/1％FBS)中，与终浓度为30μg/ml的mTARM-AP嵌合蛋白或作为阴性对照的AP蛋白在冰上反应30分钟，加入兔抗PLAP抗体(稀释6000倍)(COSMO BIO公司制备)，在冰上反应30分钟，然后再加入PE标记驴抗兔IgG(H+L)抗体(稀释50倍)(Jackson公司制备)，在冰上反应30分钟。mTARM-AP嵌合蛋白的结合使用FACSCalibur测定。
结果，mTARM结合分子在休止期的CD4阳性T细胞中不表达，但在活化CD4阳性T细胞中被诱导表达(图12)。mTARM结合分子在刺激2天后已经表达，即使在8天后仍可维持表达。在Th1、Th2的任何分化条件下都可见mTARM结合分子的表达，但在8天后，在Th2细胞中的表达与在Th1细胞中比较更强(图12)。
(2)活化T细胞与mTARM重组蛋白的粘附
接着，对mTARM是否可发挥活化T细胞的粘附分子的功能进行研究。
首先，在96孔ELISA板(Nunc公司制备)上各加入50μl抗碱性磷酸酶抗体(10μg/ml)(Seradyn公司制备)，在37℃下静置30分钟，进行固定。用PBS清洗，然后通过Block Ace(大日本制药公司制备)封闭非特异性结合部位。将10nM AP嵌合蛋白加入到各孔中，在室温下静置30分钟，进行固定。刺激6～9天后的活化T细胞悬浮于细胞粘附缓冲液(RPMI1640/0.5％BSA/20mM HEPES(pH 7.4))中，通过钙黄绿素-AM(同仁社制备)进行荧光标记，然后每孔中分别加入1×105个细胞，在37℃下反应1小时。清洗未粘附的细胞并除去，加入细胞溶解液(10mMTris-HCl(pH 8.0)/1％Triton X-100)，然后使用Wallac ARVO SX 1420MULTILABEL COUNTER(Perkin Elmer公司制备)，以激发波长485nm、检测波长535nm进行测定，对粘附细胞进行定量。细胞粘附的程度以粘附细胞相对于所添加的细胞的比例、以百分数表示。
结果表明，mTARM发挥活化T细胞的粘附分子的功能(图13)。Th1细胞、Th2细胞均显示与mTARM的粘附活性，但Th2细胞与mTARM的粘附活性与Th1细胞相比，可见高的倾向。
[实施例6]抗TARM抗体抑制细胞粘附的活性
对经由mTARM的与Th2细胞的细胞粘附有关的抗TARM抗体的效果进行研究。
向Th2细胞中加入10μg/ml抗mTARM抗体，在室温下进行10分钟的前处理，然后将其加入到固定有mTARM-AP嵌合蛋白的板中，在抗体的存在下研究细胞粘附活性。
结果，Th2细胞与mTARM-AP嵌合蛋白的粘附在抗mTARM抗体#6、#21、#37中均受到显著抑制(图14)。
[实施例7]胶原诱导关节炎模型中抗TARM抗体的治疗效果
胶原诱导关节炎模型(CIA)是自身免疫性类风湿性关节炎的疾病模型，可检测出与II型胶原反应的CD4阳性T细胞和抗体，因此可以认为两者协同引发关节炎。另外，在CIA模型中，可认为受MHC II型限制。TARM是在树状细胞中表达的活化分子，经由TARM结合分子诱导活化T细胞的细胞粘附。因此，通过抗TARM抗体抑制树状细胞和活化T细胞的相互作用，可能抑制与树状细胞或活化T细胞有关的免疫应答。因此，对CIA模型中的抗TARM抗体的治疗效果进行了研究。
将来自牛关节的II型胶原3％溶液(胶原技术研修会社制备)和完全弗氏佐剂(Difco公司制备)等量混合，制备乳液，对5周龄的DBA/1J小鼠(购自Charles River公司)每只以100μl(150μg/只)、在第-21天(初次免疫)和第0天(追加免疫)、在臀部皮内免疫。抗mTARM抗体#6是由追加免疫起以500μg/1次、每周2次尾静脉给予。追加免疫第3天开始进行体重测定和外观评价，第13天杀死。外观观察可如下进行评分评价。0：未发病，1：红斑以及跗骨或踝的关节轻度肿胀，2：红斑以及由踝到跗骨的关节轻度肿胀，3：红斑以及由踝至跖骨的关节中度肿胀，4：红斑以及踝、足、脚趾全体重度肿胀。
结果，通过给予抗mTARM抗体，肉眼所见中可见明显的症状减轻和抑制体重减轻(图15)。
由杀死的小鼠下腔静脉进行肝素采血，测定血浆中中血清淀粉状蛋白A(SAA)浓度和对胶原的抗体滴度。SAA是通过由炎症刺激产生的细胞因子的作用，在肝细胞中生成的血浆蛋白，血浆中的SAA浓度是炎症的指标。对胶原的抗体滴度是抗原特异性免疫应答的指标。
血浆中SAA的浓度是将血浆稀释8000倍，使用ELISA试剂盒(BioSource公司制备)测定。
血浆中对胶原的抗体滴度测定如下进行。
首先，在96孔ELISA板(Nunc公司制备)中分别加入50μl 5μg/ml来自牛关节的II型胶原溶液，在4℃下静置过夜，进行固定。用T-PBS(0.02％吐温20/PBS)清洗，然后用1％BSA/PBS封闭非特异性结合部位。用T-PBS清洗3次，然后向各孔中各加入50μl用T-PBS稀释10万倍的血浆，在室温下静置2小时。用T-PBS清洗3次，然后将生物素化抗小鼠IgG1(BD公司制备)、生物素化抗小鼠IgG2a(BD公司制备)用T-PBS稀释1000倍，向各孔中各加入50μl，在室温下静置2小时。用T-PBS清洗3次，然后将HRP标记链霉抗生物素(Pierce公司制备)用T-PBS稀释5000倍，向各孔中各加入50μl，在室温下静置30分钟。然后使用显色底物进行显色。
结果，血浆中的SAA浓度由于给予抗mTARM抗体而减少(图16)。血浆中抗胶原抗体滴度未见由于给予抗mTARM抗体而变化(图17)。
[实施例8]人TARM全长基因序列的确定
为了鉴定人TARM基因，使用小鼠TARM基因序列进行BLAST检索。结果发现了与小鼠TARM cDNA序列的同源性高的序列Genbank检索号：XM_497642。但是，在XM 497642所编码的氨基酸序列(LOC441864)中不存在信号序列，无法认定其可发挥细胞膜蛋白质的功能。XM_497642是推定的序列，由基因组序列推定cDNA序列可能出现错误。因此，尝试确定人TARM的全长基因序列。鉴定TARM的表达组织，进行5’-、3’-RACE，推定TARM cDNA的全长序列，然后以编码TARM蛋白的区域的序列为基础设计引物，进行全长cDNA的分离。
(1)人TARM基因的表达分析。
首先，进行hTARM在人组织中的表达分析。以GenBank检索号：XM_497642的序列为基础设计引物。
hTARM F1：TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC(SEQ ID NO.45)
hTARM R1：TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT(SEQ ID NO.46)
使用RNA PCR试剂盒(TAKARA公司制备)，由人各器官的总RNA(Clontech公司制备)合成单链cDNA，以此为模板，通过ABI7700进行实时PCR。PCR在以下的反应液组成(12.5μl QuantiTect SYBR GreenPCR Master Mix(QIAGEN公司制备)、0.25μl尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen公司制备)、0.125μl 100μM F引物、0.125μl 100μM R引物、2.5μl模板cDNA(稀释10倍)、7.25μl蒸馏水)中进行。PCR是在94℃下处理10分钟，然后将94℃30秒、60℃1分钟的反应进行35个循环。
结果可知，hTARM基因也与mTARM基因同样，在骨髓中强烈表达(图18)。
(2)人TARM基因的分离
hTARM基因可见在骨髓中表达，因此，使用骨髓的总RNA，尝试通过5’-RACE和3’-RACE确定hTARM的全长基因序列。
首先，使用cDNA合成试剂盒(TAKARA公司制备)，由骨髓的总RNA合成双链cDNA，使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen公司制备)纯化cDNA。接着，附加ad29接头，制作RACE的模板。1st PCR在以下的反应液组成(5μl 10×ExTaq缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、0.25μlExTaq、0.5μl 100μM引物(5’PCR4)、0.5μl 100μM基因特异性引物、1μl附加有ad29接头的cDNA(稀释25倍)、38.75μl蒸馏水)中进行。
引物使用如下：
5′PCR4：AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG(SFQ ID NO.21)
hTARM_RACE_5′_4：CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT(SEQ IDNO.47)，或
hTARM_RACE_3′_4：GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC(SEQ IDNO.48)
PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃1分钟、72℃5分钟的反应进行30个循环，最后在72℃下反应5分钟。
2nd PCR在以下的反应液组成(5μl 10×ExTaq缓冲液、4μl 2.5mMdNTP、0.25μl ExTaq、0.5μl 100μM引物(5’PCR1)、0.5μl 100μM基因特异性引物、1μl 1st PCR产物(稀释100倍)、38.75μl蒸馏水)中进行。
引物使用以下的序列。
5′PCR1：(SEQ ID NO.24)，
h29B140F1：TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC(SEQ ID NO.49)，或
h29B140R1：TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT(SEQ ID NO.50)
PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行25个循环，最后在72℃下反应5分钟。将扩增的cDNA片段克隆到pCR2.1(Invitrogen公司制备)，然后使用ABI3100测序仪确定核苷酸序列。
结果，得到了与XM_497642的序列完全不同的5’和3’的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)。
使用由RACE得到的核苷酸序列信息设计的引物，
h29B140_Sall-Kozac_F：
cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC(SEQ ID NO.51)
h29B140_NotI-R：
cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC(SEQ ID NO.52)
和使用RNA PCR试剂盒(TAKARA公司制备)，由骨髓的总RNA合成单链cDNA，以此为模板，进行PCR。PCR在以下的反应液组成(5μl 10×缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、0.5μl Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制备)、各0.5μl 100μM引物、1μl cDNA、2.5μl DMSO、36μl蒸馏水)中进行。PCR是在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行35个循环，最后在72℃下反应2分钟。将扩增的cDNA克隆到pBlueScriptII SK(+)(Stratagene公司制备)中，使用ABI3100测序仪确定核苷酸序列。所得hTARM cDNA的核苷酸序列与通过RACE确定的序列一致(SEQ ID NO.9)。hTARM cDNA所编码的氨基酸序列(SEQID NO.10)中，在N末端存在为了发挥细胞膜蛋白的功能而必须的信号序列。hTARC和XM 497642所编码的氨基酸序列(LOC441864)中，N末端与C末端不同。因此，由基因组序列的推定cDNA序列XM_497642实际上并不存在，是hTARM cDNA编码细胞膜蛋白hTARM的实际存在的基因(图19)。
[实施例9]人TARM抗体的制备
(1)人TARM基因表达细胞的制备
人TARM基因表达载体是将实施例8所得的hTARM cDNA插入到表达载体pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000)19(27)：3050～3058)中制备。
重组反转录病毒的制备如下进行。
将3×106个293/EBNA-1细胞株(Invitrogen公司制备)悬浮于培养基(D-MEM/10％FBS)中，接种于10cm培养皿中，在CO2培养箱中培养24小时。第二天更换培养基，加入以下制备的转染溶液，进行转染。转染溶液是在5ml的管中加入600μl OPTI-MEM(GIBCO BRL公司制备)和24μl TransIT LT1(TaKaRa公司制备)，混合，在室温下静置5分钟，然后加入9μg表达载体和9μg作为包装载体的pCL-Eco(Imgenex公司制备)，在室温下静置5分钟。48小时后回收培养上清，进行0.45μm的滤器过滤，得到重组病毒液。
将该重组病毒如下感染B300.19细胞株，制备hTARM基因表达细胞。将1×106个B300.19细胞加入到15ml的管中，以1200rpm、25℃下离心5分钟，然后吸引除去培养上清。在2ml重组病毒液中加入2μlpolybrene(10mg/ml)和2μl 55μM 2-巯基乙醇，制成混合溶液，将该混合溶液加入到细胞中，在2500rpm、30℃下离心2小时，进行感染。感染后除去重组病毒液，加入培养基(RPMI-1640/10％FBS/55μM 2-巯基乙醇)，进行培养。通过细胞分选仪分离EGFP阳性细胞，得到hTARM表达细胞。
(2)hTARM的胞外域和SEAP以及Fc嵌合蛋白的制备
hTARM的胞外域是以hTARM总长cDNA为模板，使用附加有SalI的5’引物(h29B140_SalI-Kozac_F：cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC(SEQ ID NO.51))和附加有NotI的3’引物(h29B140_NotI_SEAP_R：gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTCGATGT(SEQ ID NO.53))通过PCR进行扩增。PCR在以下的反应液组成(5μl 10×缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、0.5μl Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制备)、各0.5μl 100μM引物、1μl cDNA、2.5μl DMSO、36μl蒸馏水)中进行。PCR在94℃下处理5分钟，然后将94℃30秒、65℃30秒、72℃5分钟的反应进行35个循环，最后在72℃下反应2分钟。将扩增的cDNA克隆到pBlueScriptII SK(+)(Stratagene公司制备)中，使用ABI3100测序仪确认核苷酸序列。将所得cDNA片段用SalI和NotI消化，然后插入到实施例2记载的pcDNA3.1(+)-SEAP(His)10-Neo载体中，制备hTARM-AP表达载体。
由此，hTARM的胞外域与分泌型人胎盘性碱性磷酸酶通过3个氨基酸接头(Ala-Ala-Ala)结合，并可表达在C末端有10个组胺酸标志物(His)10的分泌嵌合蛋白(以下称为AP嵌合蛋白)。所得的AP嵌合蛋白表达载体是使用TransIT LT1(TAKARA公司制备)，导入293/EBNA-1细胞株，培养4～5天。分泌到培养上清中的AP嵌合蛋白通过离心回收培养上清，用0.22μm的滤器过滤，然后分别加入Hepes(pH 7.4)和叠氮化钠，使终浓度为20mM、0.02％，在4℃下保存。AP嵌合蛋白的浓度是使用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN公司制备)测定并计算碱性磷酸酶活性。
(3)hTARM的单克隆抗体的制备
为了制备作为免疫用的抗原，首先进行hTARM-AP嵌合蛋白的纯化。
纯化是利用存在于AP嵌合蛋白C末端的组氨酸标志，使用HisTrap试剂盒(Amersham Biosciences公司制备)进行。将含有hTARM-AP嵌合蛋白的培养上清添加到1ml的HiTrap chelating HP柱(AmershamBiosciences公司制备)中，用10mM咪唑溶液洗涤，然后用500mM咪唑溶液从柱中洗脱hTARM-AP嵌合蛋白。hTARM-AP嵌合蛋白的浓度是通过使用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN公司制备)的酶活性测定和使用蛋白质测定试剂盒II(BIO-RAD公司制备)的蛋白质定量来计算。
接着，委托Kohjin Bio株式会社，以所得hTARM-AP嵌合蛋白作为抗原，对Balb/c小鼠进行免疫。由免疫的小鼠中分离淋巴细胞，将P3U1骨髓瘤细胞与淋巴细胞混合，通过PEG法进行细胞融合。使用所得杂交瘤的培养上清、通过使用hTARM-Fc嵌合蛋白的ELISA进行筛选。由阳性孔进行克隆，得到6种克隆(#11、#18、#19、#22、#26、#40)。通过FACS进行特异性研究，结果，各克隆均只与表达hTARM的B300.19细胞反应，不与母株B300.19细胞反应。将生产所得抗hTARM单克隆抗体#11、#18、#19、#22、#26、#40的杂交瘤接种于裸鼠的腹腔内，得到腹水，使用蛋白A柱纯化抗体。
[实施例10]活化人T细胞与hTARM重组蛋白的粘附
肝素采集人末梢血，加入等量的Ficoll-Paque PLUS(AmershamBiosciences)，通过400xg、30分钟的比重离心法分离单核细胞。悬浮于MACS缓冲液(PBS/1％FBS/2mM EDTA)中，以5μl/1×107个加入FcR封闭溶液(Miltenyi公司制备)，在4℃下反应15分钟。使用人CD25+CD4+Treg分离试剂盒(Miltenyi公司制备)和Auto MACS，获得休止期的CD4阳性T细胞。由MACS纯化的CD4阳性细胞是将PE标记小鼠抗人CD25抗体(Miltenyi公司制备)和FITC标记小鼠抗人CD4抗体(Miltenyi公司制备)分别加入溶液的1/11容量，在4℃下反应20分钟，使用FACS Aria(BD Biosciences)获得CD4阳性CD25阴性T细胞。CD4阳性CD25阴性T细胞使用T细胞活化/扩展试剂盒人类(Miltenyi公司制备)进行活化。由刺激后的第3天开始加入人IL-2(2ng/ml)，使用刺激后第6天和第8天的活化CD4阳性T细胞，研究hTARM-AP嵌合蛋白是否发挥活化T细胞的粘附分子的功能。
首先，在96孔ELISA板(Nunc公司制备)中各加入50μl抗碱性磷酸酶抗体(10μg/ml)(Seradyn公司制备)，在37℃下静置30分钟，进行固定。用PBS清洗，然后用Block Ace(大日本制药公司制备)封闭非特异性结合部位。向各孔中加入AP嵌合蛋白(1nM)，在室温下静置30分钟，进行固定。活化T细胞悬浮于细胞粘附缓冲液(RPMI1640/0.5％BSA/20mM HEPES/55nM 2ME(pH 7.4))中，通过钙黄绿素-AM(同仁社制备)进行荧光标记，然后每孔中分别加入5×104个细胞，在37℃下反应1小时。洗涤并除去非粘附细胞，加入细胞溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)/1％TritonX-100)，然后使用Wallac ARVO SX 1420 MULTILABELCOUNTER(Perkin Elmer公司制备)，用485nm激发波长、535nm检测波长测定，对粘附细胞进行定量。细胞粘附的程度用粘附细胞相对于添加的细胞的比例、以百分数表示。
结果可知，hTARM对活化人T细胞发挥粘附分子的功能(图20)。
[实施例11]抗TARM抗体的抑制细胞粘附的活性
对于抗TARM抗体对经由hTARM的活化人T细胞的细胞粘附的效果进行研究。
向各孔中加入AP嵌合蛋白，在室温下静置30分钟，进行固定，然后向各孔中加入10μg/ml抗hTARM抗体(#11、#18、#19、#22、#26、#40)，在室温下前处理30分钟。然后加入荧光标记的活化T细胞，在各抗体存在下研究细胞粘附活性。对于#11、#19、#26、#40，使用抗IgG2a抗体作为对照，对于#18、#22，使用抗IgG2b抗体作为对照。
结果，活化T细胞与hTARM-AP嵌合蛋白的粘附在抗hTARM抗体#18、#19、#22、#26中受到显著抑制，在#11、#40中受到部分抑制(图20)。
[实施例12]mTARM的新型配体mTARM-L的鉴定
(1)mTARM-L(mTARM配体)侯选分子的选择
在活化T细胞上存在mTARM结合分子(实施例5)，因此，采用实施例5的方法对于来自小鼠免疫细胞的细胞株(L5178Y-R细胞株、BW5147细胞株、Raw264.7细胞株)是否存在mTARM结合分子进行研究。
结果，mTARM结合分子在L5178Y-R细胞株中强烈表达，但在BW5147细胞株和Raw264.7细胞株中几乎不表达(图21A)。
接着，假定mTARM的未知的配体属于免疫球蛋白超级家族(IgSF)，检索小鼠系综数据库，着眼于47个IgSF侯选，通过实时PCR研究免疫细胞中的表达。总RNA是使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，由L5178Y-R细胞、BW5147细胞、Raw264.7细胞中分离。实时PCR是在SYBR-green存在下、使用ABI7700测序系统(PEApplied-Biosystems)进行。
结果，ENSMUSG00000035095(A530065I17Rik，NM_176953)的mRNA表达(使用引物#2558：CAGCTGGCAAGAGGAACAGT(SEQID NO.54)，#2559：GAGCATCGGCACTTATCTCC(SEQ ID NO.55))显示参与了mTARM-AP嵌合蛋白与细胞的结合活性(图22B)。但是，ENSMUSG00000035095所编码的氨基酸序列中不存在跨膜区，无法认定其发挥细胞膜蛋白的功能。该氨基酸序列是推定的序列，由基因组序列推定cDNA序列的推定可能有错误。因此，首先尝试人同源基因产物的鉴定，使用ENSMUSG00000035095所编码的氨基酸序列进行数据库检索。结果发现了与ENSMUSG00000035095所编码的氨基酸序列同源性高的人氨基酸序列LOC196264。该氨基酸序列呈现含有一个免疫球蛋白环结构区的细胞膜蛋白质。因此，可以认为LC196264是TARM-L侯选的全长人氨基酸序列。接着，使用LOC196264的氨基酸序列进行数据库的tblastn检索。结果，在小鼠BAC克隆AC122305的基因组核苷酸序列中发现了编码与LOC196264的氨基酸序列具有同源性的序列的区域。由该序列推定小鼠TARM-L侯选的cDNA序列和氨基酸序列，设计引物，进行编码全长蛋白质的cDNA的分离。
#2693：CGCGTCGACGCCACCATGCAGCTGGCAAGAGGAACAGTA(SEQ ID NO.56)
#2694：GCGGGCGGCCGCTCAGTACGCCTCTTCTTCGTAGTC(SEQID NO.57)
模板使用Th1 day2的总RNA，按照实施例1的方法扩增cDNA。将扩增的cDNA插入到表达载体pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000)19(27)：3050～3058)中，制备mTARM-L侯选基因表达载体，使用ABI3100测序仪确定核苷酸序列(SEQ ID NO.13)。
(2)mTARM-L的鉴定
接着，为了研究mTARM-L侯选是否为TARM的未知配体，按照实施例2的方法制备该分子的表达细胞。按照实施例5的方法测定mTARM-AP嵌合蛋白与mTARM-L侯选表达细胞的细胞表面上的结合活性，以及mTARM-L侯选表达细胞与固定的mTARM的粘附活性。
结果可知，mTARM-AP与EGFP阳性的表达mTARM-L的B300.19细胞特异性结合，但不与EGFP阳性、导入了对照载体的B300.19细胞结合(图22A)。阴性对照的AP不与EGFP阳性、表达mTARM的B300.19细胞结合(图22A)。
并且，研究了表达mTARM-L的B300.19细胞与AP和mTARM-AP嵌合蛋白的粘附活性，细胞只与mTARM-AP嵌合蛋白粘附(图22B)。
由以上结果可知，mTARM-L侯选分子实际上是新型的TARM的配体，将该配体命名为mTARM-L(TARM配体)。
hTARM-L可以以编码LOC196264的氨基酸序列的NM_198275的核苷酸序列为基础设计引物，进行编码全长蛋白质的cDNA的分离。
#2721：CGCGTCGACGCCACCATGCAGCAGAGAGGAGCAGCTGGA(SEQ ID NO.58)
#2722：GCGGGCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA(SEQID NO.59)
模板使用骨髓的总RNA，按照实施例1的方法扩增cDNA。将扩增的cDNA插入到表达载体pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000)19(27)：3050～3058)中，制备TARM-L基因表达载体，使用ABI3100测序仪确定核苷酸序列(SEQ ID NO.15)。
人和小鼠TARM-L通过ClustalW进行的同源性分析结果如图23所示。hTARM-L是235个氨基酸，mTARM-L是237个氨基酸，同源性为86％。而与hTARM(271个氨基酸)同源性最高的mTARM m3(293个氨基酸)的同源性为50％(图24)。
序列表
<110>卫材R&D管理有限公司
<120>T细胞粘附分子及其抗体
<130>162119PX
<160>59
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>889
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(49)..(879)
<223>
<400>1
gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct    57
                                                     Met Ile Ser
                                                     1
agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg tct cct ccc aag ccc agc ctc    105
Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu
    5                   10                  15
agt gcc tgg ccc agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg    153
Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met
20                  25                  30                  35
caa tgt aag agc ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa    201
Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu
                40                  45                  50
ggt ttc gct ttg aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg    249
Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr
            55                  60                  65
gct gat ttt cat ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac    297
Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr
        70                  75                  80
acc tgt gaa tac tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc    345
Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro
    85                  90                  95
agc aat gcc ctt ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc    393
Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser
100                 105                 110                 115
ttt caa gcc cac cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act    441
Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr
                120                 125                 130
ttg cag tgc cag aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg    489
Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala
            135                 140                 145
tta ctg aag gtg gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca    537
Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr
        150                 155                 160
gga atg gta tca gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg    585
Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser
    165                 170                 175
ggg gaa tac agc tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc    633
Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala
180                 185                 190                 195
tca ggg ccc agc aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg    681
Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu
                200                 205                 210
cct caa gat ctt gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc    729
Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr
            215                 220                 225
tca ccc aag acc ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat    777
Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn
        230                 235                 240
ctc atc cgg gtc ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc    825
Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly
    245                 250                 255
ttc ctg gtt gaa gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc    873
Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro
260                 265                 270                 275
tgg taa aataactgaa                                                 889
Trp
<210>2
<211>276
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>2
Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His
            20                  25                  30
Val Thr Met Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu
        35                  40                  45
Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr
    50                  55                  60
Glu Glu Thr Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly
65                  70                  75                  80
Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro
                85                  90                  95
Ser His Pro Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro
            100                 105                 110
Gln Pro Ser Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser
        115                 120                 125
Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val
    130                 135                 140
Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg
145                 150                 155                 160
Ser Ser Thr Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala
                165                 170                 175
Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro
            180                 185                 190
Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp
        195                 200                 205
Asn His Leu Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu
    210                 215                 220
Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Val Asp Asn Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile
                245                 250                 255
Val Gly Gly Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro
            260                 265                 270
Asn Lys Pro Trp
        275
<210>3
<211>1054
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(49)..(930)
<223>
<400>3
gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct    57
                                                     Met Ile Ser
                                                     1
agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg ctg tgt gtt ggg caa aca gac    105
Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly Gln Thr Asp
    5                   10                  15
att cct gaa aat ggg tct cct ccc aag ccc agc ctc agt gcc tgg ccc    153
Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro
20                  25                  30                  35
agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg caa tgt aag agc    201
Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln Cys Lys Ser
                40                  45                  50
ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa ggt ttc gct ttg    249
Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu
            55                  60                  65
aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg gct gat ttt cat    297
Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Phe His
        70                  75                  80
ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac acc tgt gaa tac    345
Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr
    85                  90                  95
tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc agc aat gcc ctt    393
Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser Asn Ala Leu
100                 105                 110                 115
ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc ttt caa gcc cac    441
Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe Gln Ala His
                120                 125                 130
cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act ttg cag tgc cag    489
His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln
            135                 140                 145
aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg tta ctg aag gtg    537
Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val
        150                 155                 160
gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca gga atg gta tca    585
Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser
    165                 170                 175
gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg ggg gaa tac agc    633
Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser
180                 185                 190                 195
tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc tca ggg ccc agc    681
Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser
                200                 205                 210
aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg cct caa gat ctt    729
Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro Gln Asp Leu
            215                 220                 225
gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc tca ccc aag acc    777
Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr
        230                 235                 240
ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat ctc atc cgg gtc    825
Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu Ile Arg Val
    245                 250                 255
ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc ttc ctg gtt gaa    873
Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe Leu Val Glu
260                 265                 270                 275
gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc tgt gcc cca gga    921
Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Cys Ala Pro Gly
                280                 285                 290
gaa aaa tga atcttcggac caaactatct ctgtgaattt atgtgaaatt            970
Glu Lys
gatgcagcac tttgggaatc atccagagac aggctgcctc atcctgactc ttcacacaga  1030
acagaggcct ggacatatct ggac                                         1054
<210>4
<211>293
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>4
Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Thr Asp Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln
        35                  40                  45
Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr
                85                  90                  95
Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser
            100                 105                 110
Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe
        115                 120                 125
Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu
    130                 135                 140
Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu
145                 150                 155                 160
Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly
                165                 170                 175
Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly
            180                 185                 190
Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser
        195                 200                 205
Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro
    210                 215                 220
Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser
225                 230                 235                 240
Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu
                245                 250                 255
Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe
            260                 265                 270
Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Cys
        275                 280                 285
Ala Pro Gly Glu Lys
290
<210>5
<211>1018
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(49)..(894)
<223>
<400>5
gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct    57
                                                     Met Ile Ser
                                                     1
agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg tct cct ccc aag ccc agc ctc    105
Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu
    5                   10                  15
agt gcc tgg ccc agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg    153
Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met
20                  25                  30                  35
caa tgt aag agc ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa    201
Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu
                40                  45                  50
ggt ttc gct ttg aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg    249
Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr
            55                  60                  65
gct gat ttt cat ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac    297
Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr
        70                  75                  80
acc tgt gaa tac tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc    345
Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro
    85                  90                  95
agc aat gcc ctt ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc    393
Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser
100                 105                 110                 115
ttt caa gcc cac cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act    441
Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr
                120                 125                 130
ttg cag tgc cag aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg    489
Leu Gln Cys Gln Lys Ala GlySer Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala
            135                 140                 145
tta ctg aag gtg gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca    537
Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr
        150                 155                 160
gga atg gta tca gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg    585
Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser
    165                 170                 175
ggg gaa tac agc tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc    633
Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala
180                 185                 190                 195
tca ggg ccc agc aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg    681
Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu
                200                 205                 210
cct caa gat ctt gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc    729
Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr
            215                 220                 225
tca ccc aag acc ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat    777
Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn
        230                 235                 240
ctc atc cgg gtc ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc    825
Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly
    245                 250                 255
ttc ctg gtt gaa gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc    873
Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro
260                 265                 270                 275
tgt gcc cca gga gaa aaa tga atcttcggac caaactatct ctgtgaattt         924
Cys Ala Pro Gly Glu Lys
                280
atgtgaaatt gatgcagcac tttgggaatc atccagagac aggctgcctc atcctgactc    984
ttcacacaga acagaggcct ggacatatct ggac                                1018
<210>6
<211>281
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>6
Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His
            20                  25                  30
Val Thr Met Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu
        35                  40                  45
Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr
    50                  55                  60
Glu Glu Thr Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly
65                  70                  75                  80
Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro
                85                  90                  95
Ser His Pro Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro
            100                 105                 110
Gln Pro Ser Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser
        115                 120                 125
Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val
    130                 135                 140
Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg
145                 150                 155                 160
Ser Ser Thr Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala
                165                 170                 175
Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro
            180                 185                 190
Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp
        195                 200                 205
Asn His Leu Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu
    210                 215                 220
Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Val Asp Asn Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile
                245                 250                 255
Val Gly Gly Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro
            260                 265                 270
Asn Lys Pro Cys Ala Pro Gly Glu Lys
        275                 280
<210>7
<211>932
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(49)..(819)
<223>
<400>7
gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct    57
                                                     Met Ile Ser
                                                     1
agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg ctg tgt gtt ggg caa aca gac    105
Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly Gln Thr Asp
    5                   10                  15
att cct gaa aat ggg tct cct ccc aag ccc agc ctc agt gcc tgg ccc    153
Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro
20                  25                  30                  35
agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg caa tgt aag agc    201
Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln Cys Lys Ser
                40                  45                  50
ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa ggt ttc gct ttg    249
Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu
            55                  60                  65
aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg gct gat ttt cat    297
Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Phe His
        70                  75                  80
ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac acc tgt gaa tac    345
Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr
    85                  90                  95
tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc agc aat gcc ctt    393
Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser Asn Ala Leu
100                 105                 110                 115
ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc ttt caa gcc cac    441
Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe Gln Ala His
                120                 125                 130
cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act ttg cag tgc cag    489
His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln
            135                 140                 145
aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg tta ctg aag gtg    537
Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val
        150                 155                 160
gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca gga atg gta tca    585
Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser
    165                 170                 175
gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg ggg gaa tac agc    633
Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser
180                 185                 190                 195
tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc tca ggg ccc agc    681
Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser
                200                 205                 210
aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gat gca aga caa cca tct gcc tca    729
Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Ala Arg Gln Pro Ser Ala Ser
            215                 220                 225
aga tct tgc tgc ctc gac ttt ccc acc gca act gac agc aac ctc acc    777
Arg Ser Cys Cys Leu Asp Phe Pro Thr Ala Thr Asp Ser Asn Leu Thr
        230                 235                 240
caa gac ccc ggg tac aat gac aga agg cta cac tgt gga taa            819
Gln Asp Pro Gly Tyr Asn Asp Arg Arg Leu His Cys Gly
    245                 250                 255
tctcatccgg gtcggtgtgg ctgctgcaat cctgctaata gtgggagget tcctggttga  879
agcctggcac agtgagcggc tgtctccaaa taaaccctgg taaaataact gaa         932
<210>8
<211>256
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>8
Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Thr Asp Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln
        35                  40                  45
Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr
                85                  90                  95
Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser
            100                 105                 110
Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe
        115                 120                 125
Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu
    130                 135                 140
Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu
145                 150                 155                 160
Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly
                165                 170                 175
Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly
            180                 185                 190
Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser
        195                 200                 205
Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Ala Arg Gln Pro
    210                 215                 220
Ser Ala Ser Arg Ser Cys Cys Leu Asp Phe Pro Thr Ala Thr Asp Ser
225                 230                 235                 240
Asn Leu Thr Gln Asp Pro Gly Tyr Asn Asp Arg Arg Leu His Cys Gly
                245                 250                 255
<210>9
<211>816
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(816)
<223>
<400>9
atg atc cct aag ctg ctt tcc ctc ctc tgt ttc aga ctg tgc gtg ggc    48
Met Ile Pro Lys Leu Leu Ser Leu Leu Cys Phe Arg Leu Cys Val Gly
1               5                   10                  15
caa gga gac aca agg gga gat ggg tca ctg ccc aag ccg tcc ctc agt    96
Gln Gly Asp Thr Arg Gly Asp Gly Ser Leu Pro Lys Pro Ser Leu Ser
            20                  25                  30
gcc tgg ccc agc tcg gtg gtc cct gcc aac agc aat gtg acg ctg cga    144
Ala Trp Pro Ser Ser Val Val Pro Ala Asn Ser Asn Val Thr Leu Arg
        35                  40                  45
tgt tgg act cct gcc aga ggt gtg agc ttt gtt ctc agg aag gga gga    192
Cys Trp Thr Pro Ala Arg Gly Val Ser Phe Val Leu Arg Lys Gly Gly
    50                  55                  60
att att ctg gag tcc ccg aag ccc ctt gat tct aca gag ggc gcg gcc    240
Ile Ile Leu Glu Ser Pro Lys Pro Leu Asp Ser Thr Glu Gly Ala Ala
65                  70                  75                  80
gaa ttt cac ctc aat aat cta aaa gtc aga aat gct gga gag tac acc    288
Glu Phe His Leu Asn Asn Leu Lys Val Arg Asn Ala Gly Glu Tyr Thr
                85                  90                  95
tgt gaa tac tac aga aaa gca tcc ccc cac atc ctt tca cag cgc agt    336
Cys Glu Tyr Tyr Arg Lys Ala Ser Pro His Ile Leu Ser Gln Arg Ser
            100                 105                 110
gac gtc ctt cta ctg ttg gtg aca gga cat tta tct aaa cct ttc ctc    384
Asp Val Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly His Leu Ser Lys Pro Phe Leu
        115                 120                 125
cga acc tac caa agg ggt aca gtg acc gca ggt gga agg gtg act ctg    432
Arg Thr Tyr Gln Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Gly Arg Val Thr Leu
    130                 135                 140
cag tgc cag aag cga gac caa ttg ttt gtg cct atc atg ttc gct cta    480
Gln Cys Gln Lys Arg Asp Gln Leu Phe Val Pro Ile Met Phe Ala Leu
145                 150                 155                 160
ctg aag gca ggg acg cca tca ccc atc cag ctg cag agt cca gcg ggg    528
Leu Lys Ala Gly Thr Pro Ser Pro Ile Gln Leu Gln Ser Pro Ala Gly
                165                 170                 175
aag gag ata gac ttc tct ctg gtg gac gtg aca gcc ggc gat gct ggg    576
Lys Glu Ile Asp Phe Ser Leu Val Asp Val Thr Ala Gly Asp Ala Gly
            180                 185                 190
aac tac agc tgc atg tac tac cag aca aag tct ccc ttc tgg gcc tca    624
Asn Tyr Ser Cys Met Tyr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Trp Ala Ser
        195                 200                 205
gaa ccc agt gat cag ctt gag ata ttg gtg aca gtt ccc cca ggt acc    672
Glu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Ile Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Thr
    210                 215                 220
aca tcg agc aac tac tcc ctg ggt aac ttc gta cga ctg ggt ctg gct    720
Thr Ser Ser Asn Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Arg Leu Gly Leu Ala
225                 230                 235                 240
gcc gta att gtg gtt atc atg gga gct ttc ctg gtg gag gcc tgg tac    768
Ala Val Ile Val Val Ile Met Gly Ala Phe Leu Val Glu Ala Trp Tyr
                245                 250                 255
agc cgg aat gtg tct cca ggt gaa tca gag gcc ttc aaa cca gag tga    816
Ser Arg Asn Val Ser Pro Gly Glu Ser Glu Ala Phe Lys Pro Glu
            260                 265                 270
<210>10
<211>271
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Met Ile Pro Lys Leu Leu Ser Leu Leu Cys Phe Arg Leu Cys Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Gly Asp Thr Arg Gly Asp Gly Ser Leu Pro Lys Pro Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Trp Pro Ser Ser Val Val Pro Ala Asn Ser Asn Val Thr Leu Arg
        35                  40                  45
Cys Trp Thr Pro Ala Arg Gly Val Ser Phe Val Leu Arg Lys Gly Gly
    50                  55                  60
Ile Ile Leu Glu Ser Pro Lys Pro Leu Asp Ser Thr Glu Gly Ala Ala
65                  70                  75                  80
Glu Phe His Leu Asn Asn Leu Lys Val Arg Asn Ala Gly Glu Tyr Thr
                85                  90                  95
Cys Glu Tyr Tyr Arg Lys Ala Ser Pro His Ile Leu Ser Gln Arg Ser
            100                 105                 110
Asp Val Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly His Leu Ser Lys Pro Phe Leu
        115                 120                 125
Arg Thr Tyr Gln Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Gly Arg Val Thr Leu
    130                 135                 140
Gln Cys Gln Lys Arg Asp Gln Leu Phe Val Pro Ile Met Phe Ala Leu
145                 150                 155                 160
Leu Lys Ala Gly Thr Pro Ser Pro Ile Gln Leu Gln Ser Pro Ala Gly
                165                 170                 175
Lys Glu Ile Asp Phe Ser Leu Val Asp Val Thr Ala Gly Asp Ala Gly
            180                 185                 190
Asn Tyr Ser Cys Met Tyr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Trp Ala Ser
        195                 200                 205
Glu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Ile Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Thr
    210                 215                 220
Thr Ser Ser Asn Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Arg Leu Gly Leu Ala
225                 230                 235                 240
Ala Val Ile Val Val Ile Met Gly Ala Phe Leu Val Glu Ala Trp Tyr
                245                 250                 255
Ser Arg Asn Val Ser Pro Gly Glu Ser Glu Ala Phe Lys Pro Glu
            260                 265                 270
<210>11
<211>925
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(49)..(915)
<223>
<400>11
gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct    57
                                                     Met Ile Ser
                                                     1
agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg ctg tgt gtt ggg caa aca gac    105
Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly Gln Thr Asp
    5                   10                  15
att cct gaa aat ggg tct cct ccc aag ccc agc ctc agt gcc tgg ccc    153
Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro
20                  25                  30                  35
agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg caa tgt aag agc    201
Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln Cys Lys Ser
                40                  45                  50
ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa ggt ttc gct ttg    249
Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu
            55                  60                  65
aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg gct gat ttt cat    297
Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Phe His
        70                  75                  80
ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac acc tgt gaa tac    345
Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr
    85                  90                  95
tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc agc aat gcc ctt    393
Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser Asn Ala Leu
100                 105                 110                 115
ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc ttt caa gcc cac    441
Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe Gln Ala His
                120                 125                 130
cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act ttg cag tgc cag    489
His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln
            135                 140                 145
aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg tta ctg aag gtg    537
Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val
        150                 155                 160
gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca gga atg gta tca    585
Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser
    165                 170                 175
gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg ggg gaa tac agc    633
Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser
180                 185                 190                 195
tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc tca ggg ccc agc    681
Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser
                200                 205                 210
aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg cct caa gat ctt    729
Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro Gln Asp Leu
            215                 220                 225
gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc tca ccc aag acc    777
Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr
        230                 235                 240
ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat ctc atc cgg gtc    825
Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu Ile Arg Val
    245                 250                 255
ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc ttc ctg gtt gaa    873
Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe Leu Val Glu
260                 265                 270                 275
gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc tgg taa            915
Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Trp
                280                 285
aataac tgaa                                                        925
<210>12
<211>288
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>12
Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Thr Asp Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln
        35                  40                  45
Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr
                85                  90                  95
Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser
            100                 105                 110
Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe
        115                 120                 125
Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu
    130                 135                 140
Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu
145                 150                 155                 160
Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly
                165                 170                 175
Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly
            180                 185                 190
Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg A1a Ser
        195                 200                 205
Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro
    210                 215                 220
Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser
225                 230                 235                 240
Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu
                245                 250                 255
Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe
            260                 265                 270
Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Trp
        275                 280                 285
<210>13
<211>714
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>13
atgcagctgg caagaggaac agtaggaggc cgtggctgcg ctctctttcc actgctgagc    60
atcctagtcg tccagggtgc gcgtatcgtc ctctccttgg agataagtgc cgatgctcac    120
gtccgaggct atgtgggaga gaagatcaag ttgaaatgca ccttcaagtc atcttcagat    180
gtcactgaca agctgaccat agactggaca taccgccctc ccagcagcag ccgcacagag    240
tctatttttc actatcagtc tttccagtac ccgaccacag cgggcacatt ccgagaccgg    300
atctcctggg ccggaaatgt ctacaaaggg gatgcgtcca tcagtatcag caaccccact    360
ctaaaggaca atgggacgtt cagctgtgct gtgaagaacc ctccagacgt gtaccacaat    420
atccccctaa cagagctcac ggtcacagaa agggggttcg gcaccatgct gtcttctgtg    480
gcccttctct ccatcctcgt cttcgtcccc tcagcagtgg tggtcattct gctgctggtg    540
cgaatgggga ggaaggcaac aggggtgcag aagaggagca ggtctggcta taagaagtct    600
tccattgaag tttccgatga cactgaccag gaggacagca atgactgcat gacgaggctt    660
tgtgtccgct gtgcagagtg tctggattca gactacgaag aagaggcgta ctga          714
<210>14
<211>237
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>14
Met Gln Leu Ala Arg Gly Thr Val Gly Gly Arg Gly Cys Ala Leu Phe
1               5                   10                  15
Pro Leu Leu Ser Ile Leu Val Val Gln Gly Ala Arg Ile Val Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Glu Ile Ser Ala Asp Ala His Val Arg Gly Tyr Val Gly Glu Lys
        35                  40                  45
Ile Lys Leu Lys Cys Thr Phe Lys Ser Ser Ser Asp Val Thr Asp Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Ile Asp Trp Thr Tyr Arg Pro Pro Ser Ser Ser Arg Thr Glu
65                  70                  75                  80
Ser Ile Phe His Tyr Gln Ser Phe Gln Tyr Pro Thr Thr Ala Gly Thr
                85                  90                  95
Phe Arg Asp Arg Ile Ser Trp Ala Gly Asn Val Tyr Lys Gly Asp Ala
            100                 105                 110
Ser Ile Ser Ile Ser Asn Pro Thr Leu Lys Asp Asn Gly Thr Phe Ser
        115                 120                 125
Cys Ala Val Lys Asn Pro Pro Asp Val Tyr His Asn Ile Pro Leu Thr
    130                 135                 140
Glu Leu Thr Val Thr Glu Arg Gly Phe Gly Thr Met Leu Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
Ala Leu Leu Ser Ile Leu Val Phe Val Pro Ser Ala Val Val Val Ile
                165                 170                 175
Leu Leu Leu Val Arg Met Gly Arg Lys Ala Thr Gly Val Gln Lys Arg
            180                 185                 190
Ser Arg Ser Gly Tyr Lys Lys Ser Ser Ile Glu Val Ser Asp Asp Thr
        195                 200                 205
Asp Gln Glu Asp Ser Asn Asp Cys Met Thr Arg Leu Cys Val Arg Cys
    210                 215                 220
Ala Glu Cys Leu Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Glu Ala Tyr
225                 230                 235
<210>15
<211>708
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>15
atgcagcaga gaggagcagc tggaagccgt ggctgcgctc tcttccctct gctgggcgtc    60
ctgttcttcc agggtgttta tatcgtcttt tccttggaga ttcgtgcaga tgcccatgtc    120
cgaggttatg ttggagaaaa gatcaagttg aaatgcactt tcaagtcaac ttcagatgtc    180
actgacaagc ttactataga ctggacatat cgccctccca gcagcagcca cacagtatca    240
atatttcatt atcagtcttt ccagtaccca accacagcag gcacatttcg ggatcggatt    300
tcctgggttg gaaatgtata caaaggggat gcatctataa gtataagcaa ccctaccata    360
aaggacaatg ggacattcag ctgtgctgtg aagaatcccc cagatgtgca ccataatatt    420
cccatgacag agctaacagt cacagaaagg ggttttggca ccatgctttc ctctgtggcc    480
cttctttcca tccttgtctt tgtgccctca gccgtggtgg ttgctctgct gctggtgaga    540
atggggagga aggctgctgg gctgaagaag aggagcaggt ctggctataa gaagtcatct    600
attgaggttt ccgatgacac tgatcaggag gaggaagagg cgtgtatggc gaggctttgt    660
gtccgttgcg ctgagtgcct ggattcagac tatgaagaga catattga                 708
<210>16
<211>235
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Met Gln Gln Arg Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly Cys Ala Leu Phe Pro
1               5                   10                  15
Leu Leu Gly Val Leu Phe Phe Gln Gly Val Tyr Ile Val Phe Ser Leu
            20                  25                  30
Glu Ile Arg Ala Asp Ala His Val Arg Gly Tyr Val Gly Glu Lys Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Lys Cys Thr Phe Lys Ser Thr Ser Asp Val Thr Asp Lys Leu
    50                  55                  60
Thr Ile Asp Trp Thr Tyr Arg Pro Pro Ser Ser Ser His Thr Val Ser
65                  70                  75                  80
Ile Phe His Tyr Gln Ser Phe Gln Tyr Pro Thr Thr Ala Gly Thr Phe
                85                  90                  95
Arg Asp Arg Ile Ser Trp Val Gly Asn Val Tyr Lys Gly Asp Ala Ser
            100                 105                 110
Ile Ser Ile Ser Asn Pro Thr Ile Lys Asp Asn Gly Thr Phe Ser Cys
        115                 120                 125
Ala Val Lys Asn Pro Pro Asp Val His His Asn Ile Pro Met Thr Glu
    130                 135                 140
Leu Thr Val Thr Glu Arg Gly Phe Gly Thr Met Leu Ser Ser Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Leu Ser Ile Leu Val Phe Val Pro Ser Ala Val Val Val Ala Leu
                165                 170                 175
Leu Leu Val Arg Met Gly Arg Lys Ala Ala Gly Leu Lys Lys Arg Ser
            180                 185                 190
Arg Ser Gly Tyr Lys Lys Ser Ser Ile Glu Val Ser Asp Asp Thr Asp
        195                 200                 205
Gln Glu Glu Glu Glu Ala Cys Met Ala Arg Leu Cys Val Arg Cys Ala
    210                 215                 220
Glu Cys Leu Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Thr Tyr
225                 230                 235
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
gtgactttgc agtgccagaa    20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
tgcacaggag ttgagtgtcc                                     20
<210>19
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
acatcactcc gt                                             12
<210>20
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
acggagtgat gtccgtcgac gtatctctgc gttgatactt cagcgtagct    50
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
agctacgctg aagtatcaac gcagag                              26
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
cttctggcac tgcagagtca ccct          24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggagagtaca cctgtgaata ctac          24
<210>24
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
gtatcaacgc agagatacgt cgacgg        26
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
tccacctgcg gtcactgtac ccct          24
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
ctacagaaaa gcatcccccc acatcctttc    30
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
gctgatagta gacctgctga agac    24
<210>28
<211>23
<212>DNA
    <213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
gtccagatat gtccaggcct ctg     23
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ttcagttatt ttaccagggt tta     23
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
tctgtgatag acaaccatct         20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
gtcattgtac ccggggtctt           20
<210>32
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
atgacagaag gctacactgt ggataa    26
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
tcatttttct cctggggcac           20
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
gatctctgtg atagatgcaa g         21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
gtcattgtac ccggggtctt                         20
<210>36
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
cgcgtcgacg ccaccatgat ctctaggctc ctttccctt    39
<210>37
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
gcgggcggcc gcttaccagg gtttatttgg agacag       36
<210>38
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
cgcggcggcc gcattatcca cagtgtagcc ttctgtcat    39
<210>39
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
cgcctcgagc tgggagagcc gcagctctgc tat       33
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
gcgggcggcc gcctactggg gtggtttctc atgctt    36
<210>41
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
cgcgtcgacc agacatcggc aggttcctgc tcc       33
<210>42
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
gcgggcggcc gctcagcctc tgccaggcat gttgat     36
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
cgcgtcgact taagtcccgt acaggcccag agt       33
<210>44
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
gcgggcggcc gctcatctgt aatattgcct ctgtgt    36
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
tgtgaatact acagaaaagc atcc                 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
tccacctgcg gtcactgtac ccct                 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
cttctggcac tgcagagtca ccct    24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
ggagagtaca cctgtgaata ctac    24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
tgtgaatact acagaaaagc atcc    24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
tccacctgcg gtcactgtac ccct    24
<210>51
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
cgcgtcgacg ccaccatgat ccctaagctg ctttccctc    39
<210>52
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
cgcgcggccg cctagcgcat gctacccttg gcagc        35
<210>53
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
gcgggcggcc gcacccaggg agtagttgct cgatgt       36
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
cagctggcaa gaggaacagt                         20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
gagcatcggc acttatctcc                         20
<210>56
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
cgcgtcgacg ccaccatgca gctggcaaga ggaacagta    39
<210>57
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
gcgggcggcc gctcagtacg cctcttcttc gtagtc       36
<210>58
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
cgcgtcgacg ccaccatgca gcagagagga gcagctgga    39
<210>59
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
gcgggcggcc gctcaatatg tctcttcata gtctga    36

Claims (31)

1.膜蛋白或分泌蛋白，该膜蛋白或分泌蛋白含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，或者具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
2.膜蛋白或分泌蛋白，该膜蛋白或分泌蛋白选自下述(i)、(ii)、(iii)和(iv)：
(i)含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(ii)含有在SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或者两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(iii)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码、且与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(iv)含有与SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
3.多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求1的膜蛋白或分泌蛋白。
4.权利要求3的多核苷酸，该多核苷酸含有SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
5.多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求2的膜蛋白或分泌蛋白。
6.多核苷酸，该多核苷酸选自下述(v)、(vi)、(vii)和(viii)：
(v)含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸；
(vi)在含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸中有1或多个核苷酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加有1或多个核苷酸，且编码与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸；
(vii)在严谨条件下与含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸杂交，且编码与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸；和
(viii)与含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸具有90％以上的同一性，且编码与含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸。
7.选自下述(ix)、(x)、(xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段：
(ix)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(x)含有在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii)含有与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70％以上的同一性，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
8.权利要求7的抗体或其功能性片段，它是权利要求1或2的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
9.权利要求8的抗体或其功能性片段，它是含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列或者具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
10.权利要求7的抗体或其功能性片段，它是选自下述(ix’)、(x’)、(xi’)和(xii’)的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段：(ix’)含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；(x’)含有在SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi’)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码、且与含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii’)含有与SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列、且与含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
11.权利要求10的抗体或其功能性片段，它是含有SEQ ID NO.12所示氨基酸序列或者具有1或多个保守性置换的SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗体或其功能性片段。
12.权利要求11的抗体或其功能性片段，它由以保藏号FERMBP-10376委托保藏的杂交瘤生成。
13.杂交瘤，该杂交瘤以保藏号FERM BP-10376委托保藏。
14.蛋白质，该蛋白质选自下述(xiii)、(xiv)、(xv)和(xvi)：
(xiii)含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质；
(xiv)含有在SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质；
(xv)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码，且与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和
(xvi)含有与SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
15.多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求14的蛋白质。
16.多核苷酸，该多核苷酸选自下述(xvii)、(xviii)、(xix)和(xx)：
(xvii)含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸；
(xviii)在含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸中有1或多个核苷酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个核苷酸，且编码与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸；
(xix)由在严谨条件下与含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸杂交，且编码与含有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸；和
(xx)与含有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的多核苷酸具有70％以上的同一性，且编码与含有SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.16所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸。
17.权利要求14的蛋白质的抗体或其功能性片段。
18.自身免疫疾病治疗药，该自身免疫疾病治疗药含有权利要求7～12和17中任一项的抗体或其功能性片段作为有效成分。
19.权利要求18的自身免疫疾病治疗药，该药物用于类风湿性关节炎的治疗。
20.T细胞粘附抑制剂，该T细胞粘附抑制剂含有权利要求7～12和17中任一项的抗体或其功能性片段作为有效成分。
21.抑制TARM蛋白与T细胞粘附的物质或其盐或者它们的溶剂合物的筛选方法，该筛选方法包含下述步骤：
(a)在被检物质的存在下或非存在下，使TARM蛋白与T细胞接触的步骤；和
(b)测定上述TARM蛋白与T细胞的粘附活性的步骤；
上述TARM蛋白是选自下述(ix)、(x)、(xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白：
(ix)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(x)含有在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii)含有与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
22.权利要求21的筛选方法，该筛选方法是在步骤(b)之后进一步含有(c)将被检物质存在下的结合活性与被检物质非存在下的结合活性进行比较的步骤。
23.权利要求21或22的筛选方法，其中，T细胞是活化T细胞。
24.权利要求21～23中任一项的筛选方法，其中，活化T细胞是活化Th2细胞。
25.抑制树状细胞活化的物质或其盐或者它们的溶剂合物的筛选方法，该筛选方法包含以下步骤：
(d)在被检物质的存在下或非存在下，使权利要求7～12中任一项的抗体或其功能性片段与树状细胞接触的步骤；和
(e)测定上述树状细胞的活化程度的步骤。
26.权利要求25的筛选方法，其中，步骤(e)中，以树状细胞中的IL-6和/或MCP-1的生成量作为指标测定树状细胞的活化程度。
27.权利要求26的筛选方法，该筛选方法是在步骤(e)之后进一步含有(f-1)将被检物质存在下的IL-6和/或MCP-1的生成量与被检物质非存在下的IL-6和/或MCP-1生成量进行比较的步骤。
28.权利要求25的筛选方法，其中，步骤(e)中，以树状细胞中的FcRγ链的表达量作为指标测定树状细胞的活化程度。
29.权利要求28的筛选方法，该筛选方法是在步骤(e)之后进一步含有(f-2)将被检物质存在下的FcRγ链的表达量与被检物质非存在下的FcRγ链的表达量进行比较的步骤。
30.抑制TARM蛋白与FcRγ链形成复合物的物质或者其盐或它们的溶剂合物的筛选方法，该筛选方法包含下述步骤：
(g)在被检物质的存在下或非存在下，使权利要求7～12中任一项的抗体或其功能性片段与树状细胞接触的步骤；和
(h)测定上述树状细胞中FcRγ链的表达量的步骤；
上述TARM蛋白是选自下述(ix)、(x)、(xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白：
(ix)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(x)含有在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列中有1或多个氨基酸的插入、置换或缺失，或者向其一方或两末端附加1或多个氨基酸所得的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi)由在严谨条件下与编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii)含有与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列，且与含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白质具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
31.权利要求30的筛选方法，该筛选方法是在步骤(h)之后进一步含有(i)将被检物质存在下的FcRγ链的表达量与被检物质非存在下的FcRγ链的表达量进行比较的步骤。
CN2006800446143A 2005-09-29 2006-09-29 T细胞粘附分子及其抗体 Expired - Fee Related CN101316930B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005285194 2005-09-29
JP285194/2005 2005-09-29
PCT/JP2006/319576 WO2007037430A1 (ja) 2005-09-29 2006-09-29 Ｔ細胞接着分子およびそれに対する抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101316930A true CN101316930A (zh) 2008-12-03
CN101316930B CN101316930B (zh) 2013-06-19

Family

ID=37899850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800446143A Expired - Fee Related CN101316930B (zh) 2005-09-29 2006-09-29 T细胞粘附分子及其抗体

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20090181025A1 (zh)
EP (1) EP1939288B1 (zh)
JP (1) JP5106111B2 (zh)
KR (1) KR101026016B1 (zh)
CN (1) CN101316930B (zh)
AU (1) AU2006295717B2 (zh)
BR (1) BRPI0616438A2 (zh)
CA (1) CA2624135C (zh)
DK (1) DK1939288T3 (zh)
ES (1) ES2400520T3 (zh)
HK (1) HK1119448A1 (zh)
IL (2) IL190488A (zh)
MY (1) MY150639A (zh)
NO (1) NO20081503L (zh)
NZ (1) NZ567043A (zh)
RU (1) RU2396275C2 (zh)
WO (1) WO2007037430A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010123119A1 (ja) * 2009-04-23 2010-10-28 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 炎症性腸疾患治療剤およびそのスクリーニング方法
AR104833A1 (es) * 2015-07-01 2017-08-16 Syngenta Participations Ag Composiciones y métodos para controlar plagas de plantas
JP7280586B2 (ja) * 2018-10-15 2023-05-24 学校法人東京理科大学 樹状細胞の成熟抑制剤及び成熟抑制方法、並びに医薬組成物

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPH0373280A (ja) 1989-03-20 1991-03-28 Kunii Nakada タガネ及びその装着用ホルダー
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
AU5744200A (en) 1999-06-17 2001-01-09 Incyte Genomics, Inc. Human transport proteins
JP3988821B2 (ja) * 1999-08-31 2007-10-10 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患を治療するための組成物及び方法
WO2001055335A2 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to leukocyte immunoglobulin receptor-like (lir-like) polypeptides and polynucleotides
JP2004524001A (ja) * 2000-01-25 2004-08-12 ハイセック，インコーポレーテッド 白血球免疫グロブリン受容体（ｌｉｒ様）ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する方法と材料
US20030187201A1 (en) * 2000-09-15 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080068039A (ko) 2008-07-22
DK1939288T3 (da) 2013-03-11
NO20081503L (no) 2008-06-30
NZ567043A (en) 2012-08-31
AU2006295717B2 (en) 2012-01-19
ES2400520T3 (es) 2013-04-10
AU2006295717A1 (en) 2007-04-05
CA2624135C (en) 2015-06-30
CN101316930B (zh) 2013-06-19
EP1939288A1 (en) 2008-07-02
RU2008116833A (ru) 2009-11-10
IL190488A0 (en) 2008-11-03
US20090181025A1 (en) 2009-07-16
KR101026016B1 (ko) 2011-03-30
JPWO2007037430A1 (ja) 2009-04-16
WO2007037430A1 (ja) 2007-04-05
IL190488A (en) 2016-09-29
EP1939288B1 (en) 2012-12-19
BRPI0616438A2 (pt) 2012-12-25
EP1939288A4 (en) 2010-05-26
RU2396275C2 (ru) 2010-08-10
MY150639A (en) 2014-02-14
JP5106111B2 (ja) 2012-12-26
CA2624135A1 (en) 2007-04-05
HK1119448A1 (en) 2009-03-06
IL211031A0 (en) 2011-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11214616B2 (en) Anti-TIGIT antibodies and their use as therapeutics and diagnostics
Diefenbach et al. Ligands for the murine NKG2D receptor: expression by tumor cells and activation of NK cells and macrophages
Gunter et al. Thy-1-mediated T-cell activation requires co-expression of CD3/Ti complex
Daniels et al. Murine cytomegalovirus is regulated by a discrete subset of natural killer cells reactive with monoclonal antibody to Ly49H
CN108472346A (zh) 含有traf诱导结构域的嵌合受体及相关组合物和方法
Ohteki et al. Predominant appearance of γ/δ T lymphocytes in the liver of mice after birth
CN109562126A (zh) 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
CN109997041A (zh) 人白细胞抗原限制的γδT细胞受体及其使用方法
CN107106670A (zh) 用于修饰的t细胞的方法和组合物
CN102292352A (zh) Tcr复合物免疫治疗剂
CN101970493A (zh) 单克隆抗体及其方法
CN1984672A (zh) Nkg2d的调节
CN109790213A (zh) 用于鉴定lilrb阻断抗体的方法
JP2021090454A (ja) 抗原結合分子及びその使用方法
Elhabazi et al. Structure and function of the immune semaphorin CD100/SEMA4D
CN101316930B (zh) T细胞粘附分子及其抗体
US20080248025A1 (en) Gamma Delta T Cells and Methods of Treatment of Interleukin-17 Related Conditions
Furuya et al. Interleukin‐23 Regulates Inflammatory Osteoclastogenesis via Activation of CLEC5A (+) Osteoclast Precursors
CN107847516A (zh) 用ctla‑4拮抗剂增强免疫应答的方法
US20220057381A1 (en) Cell-based assay for determining the in vitro tumor killing activity of chimeric antigen expressing immune cells
CN110386973A (zh) 具有多种功能的蛋白多肽及其医药用途
JP2017141172A (ja) 抗イヌｃｄ７０モノクローナル抗体
CN100509848C (zh) 抗人ox40l单克隆抗体制备及应用
US20230242666A1 (en) Methods and Compositions for the Reduction of Chimeric Antigen Receptor Tonic Signaling
CN100369933C (zh) 抗人gl50单克隆抗体的制备及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130619

Termination date: 20170929

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee