KR101245929B1 - 항체 매개된 골질 재생 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이식가능 의료용 장치를 개선하는데 이용되는 면역 반응성 분자의 분야에 관계한다. 의료용 이식물의 표면 상에 선택된 항체 분자의 고정은 상기 장치의 이식 (implantation) 이후에 상처 치유 과정 (wound healing process)을 향상시키는 시기적절한 방식으로 생체내 성장 인자의 국지화와 농축을 가능하게 한다. 생체내 BMP-2 성장 인자가 부착된 단일클론성 항체에 의해 이식물 장치 상에 포획될 때, BMP-2의 생물학적 활성이 이식물 장치의 근처에서 향상되었다. BMP-2 성장 인자-특이적 항체 분자 또는 이들의 단편은 티타늄 치과 또는 보철 이식물에 고정될 때, 골유착 (osseointegration)을 개선한다.

Description

항체 매개된 골질 재생{ANTIBODY MEDIATED OSSEOUS REGENERATION}
본 발명의 기술분야
본 발명은 이식가능 의료용 장치를 개선하는데 이용되는 면역 반응성 분자의 분야에 관계한다.
본 발명의 배경기술
골 조직은 성체 동물에서, 조골세포 (osteoblastic cell)에 의한 생산 및 파골세포 (osteoclastic cell)에 의한 분해 사이에 신진대사 균형 (metabolic balance) 동안 발달하고 재생한다. 골 재생의 조절은 광범위하게 연구되었고, 그리고 현재 학술 연구와 임상 연구에서 많은 주목을 받고 있다. 성공적인 골 성장은 선천적 이상의 치료, 골에 대한 외상성 손상, 병리학적 골용해성 질환 및 위축 골의 재건과 같은, 인간에서 많은 상이한 의학적 치료에서 요구된다. 특히 주목되는 분야는 병리학적으로 손상된 두개안면골 (craniofacial bone)의 재건 및 치과와 정형외과 수술에서 보철 장치의 이용이다. 이런 장치에는 척주용 골 이식물 (bone implant), 고관절과 무릎과 같은 주요 관절용 대체물 (replacement), 그리고 턱 내로 골유착된 치과 이식물이 포함된다. 또한, 치주염, 골괴사, 관절염 및 골다공증과 같은 다양한 염증성 질환 역시 두개안면골에서 병리학적 골용해 (osteolysis)와 연관된다.
일부 경우에, 골 이식 (bone grafting)은 장골 능선 (iliac crest)과 같은 부위로부터 자가조직 골 (autologous bone)의 수확에 의해 외과 수술을 보충하는데 필요한 골을 제공할 수 있다. 현재, 50만 건 이상의 골 이식 수술이 미국에서 실시되고 있으며, 세계적인 수치는 상기 수치의 2배에 육박할 것으로 추정되고 (Greenwald, et al., 2008), 비용은 2015년까지 31.8억 달러에 이를 것으로 예상된다. 하지만, 자가조직 골 이식은 공여자 부위 이환율, 감염, 신경 손상, 통증 및 상당한 비용과 연관된 단점을 내포하고 있다. 젊은 환자는 공여자 조직 이용도가 제한되고, 반면 늙은 환자는 만성 질환, 예를 들면, 진성 당뇨병, 골다공증, 또는 상처 치유를 약화시키는 비스포스포네이트 약물 (bisphophonate drug)의 섭생 (regimen)으로부터 상처 치유가 불량하다. 신규한 비용-효과적 골 재생 물질의 개발은 골격 재건을 위한 자가조직 골 이식에 대한 요구를 감소시킬 수 있다.
다른 경우에, 골 재생이 바람직하지 않고, 그리고 골 성장을 억제하기 위하여 매개 (mediation)가 요구된다. 비정상적인 또는 이소성 골 형성은 류머티스성 관절염, 두개골조기유합증 (craniosynostosis) 및 진행성 골화성 섬유성 골이형성증 (fribrodysplasia ossificans progressiva)과 같은 질환에서, 그리고 골절 (bone fracture) 또는 골 수술 (bone surgery) 이후에 골극 (bone spur)의 형성에서 심각한 임상적 문제점이다. 이들 경우에, 골의 재생을 저해하는 방법이 요구된다.
골 형성의 과정인 골형성 (osteogenesis)은 광범위하게 연구되었다. 포유동물에서, 골 형성은 2가지 상이한 과정, 연골내 (endochondral) (장골) 및 막내 (intramembraneous) (두개안면골) 과정에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 전-조골세포주, 예를 들면, MC3T3, C2C10, 12 또는 hFOB의 시험관내 분화 및 이들 골 과정 (bone process) 둘 모두에서 생체내 분화는 포유동물에서 발생하는 것으로 알려져 있는 골 과정에 영향을 주는 많은 세포 인자 (cellular factor)를 보유한다, 가령, 연골내 (가령, 장골) 및 막내 (가령, 두개안면골) 과정은 골 형성에 영향을 주는 세포내 인자를 보유한다.
의료용 이식물은 금속, 세라믹, 중합체 또는 이들 물질의 조합을 비롯한 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 이들 물질은 필요에 따라 형태를 취할 수 있기 때문에, 보철 의료용 장치는 골과 관련된 많은 상이한 유형의 수술을 위한 임상적 실시에서 매우 유용하다. 골유착은 골과 성공적으로 합체하기 위하여 의료용 이식물에서 요구되는 상호작용이다. 골의 치유 동안 골형성과 상처 치유의 생리는 복합적이다. 이는 국소 미세환경 (local microenvironment) 내에서 매개자 (mediator)에 대한 특정한 시간적 및 공간적 요구와 함께, 생화학적 캐스케이드 (biochemical cascade)를 수반한다.
의료용 이식물 수술에서, 성공적인 결과를 달성하기 위하여 상처 치유는 의료용 장치의 이식 이후에 신속하게 일어나고 꾸준히 진행되는 것이 바람직하다. 이러한 유형의 수술에서, 환자는 수술 자체의 침해성 (invasiveness)뿐만 아니라 장기적인 생물학적 충격 및 이식된 장치와의 생리학적 상호작용에 의해 영향을 받는다. 이식물 수술의 경우에서처럼 의료용 이식물이 상처 내에 존재할 때, 의료용 이식물은 최적 결과를 위하여 치유의 자연 과정과 통합하는 것이 중요하다.
합성 이식물 또는 골 이식 과정으로 상처 치유의 생리는 특히 복합적이다. 일반적으로, 수술 부위 주변에 세포와 조직에서 지속된 일련의 분자 현상 (molecular event)은 손상된 조직의 점진적인 제거 및 이들 조직의 건강한 조직으로의 개조 (re-modeling)를 유발한다. 이들 과정은 손상된 조직을 둘러싸는 유체와 조직으로부터 복수 인자의 생화학적 반응 및 시기적절한 상호작용의 패턴의 캐스케이드를 수반한다. 상처 부위에서 복수의 생물학적 인자의 타이밍 (timing), 출현 순서, 그리고 농도는 상처 치유 과정의 속도와 결과에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 생물학적 인자에는 성장 인자, 사이토카인, 효소, 호르몬 및 세포외 기질 성분 (extracellular matrix component)이 포함될 수 있다.
이식 수술 이후에 상처 치유 과정을 개선하기 위한 한 가지 접근법은 수술 시점에 상처 부위에 치유 화합물을 적용하는 것이다. 화합물의 일시 주사의 단일 적용은 염증을 감소시키거나, 또는 상처 치유에 관련되는 것으로 알려져 있는 인자를 제공하기 위하여, 수술 동안 이식 부위에 제공되고 있다. 가령, 성장 인자의 단일 일시 주사가 수술 동안 이식물 주변에 배치되었다 (Suhonen U.S. Patent 6,132,214; Descouts U.S. Patent 7,090,496). 최근에, Clancey 등 (U.S. Patent 7,226,587)은 치과와 정형외과 이식물 주변에 외인성 재조합 (r) BMP-2의 적용이 이식물 장치 주변에 골 형성의 체적과 질을 증가시키고 골유착을 향상시킨다고 개시하였다. 또한, 최근에, FDA는 인간 개체에서 이식에 이용되는 콜라겐 막에서 재조합 인간 골 형태형성 단백질 (rhBMP-2)의 사용을 승인하였다.
하지만, 수술 시점에 물질의 적용은 상처 치유 과정에서 단점을 내포하고 있다. 전형적으로, 성장 인자의 단일 일시 주사는 이식물 주변에 배치되고, 그리고 성장 인자의 전달 시점은 제어될 수 있다. 이식 부위에 직접적인 접근이 전형적으로, 수술 동안 일회 적용 (one-time application)에 한정되기 때문에, 이러한 접근법은 치료의 양과 농도의 관점에서 한정되고, 이런 이유로 효과가 제한되고 수술후 시간의 흐름에서 본질적으로 감소한다. 전형적으로, 성장 인자의 단일 일시 주사는 이식물 주변에 배치되고, 그리고 성장 인자의 전달의 시점은 제어될 수 없다. 매개자의 단일 일시 주사의 투여는 상처 치유 과정에서 필요한 시점에 최적 용량이 가용하도록 담보하지 못할 수 있다. 유사하게, 재조합 성장 인자 요법은 1) 생리학적 용량이 전형적으로, 연장된 기간 동안 지속될 수 없고; 2) 재조합 성장 인자가 전형적으로, 그들의 고유 대응물보다 생물활성이 덜하고; 그리고 3) 재조합 성장 인자가 매우 고가일 수 있다는 점을 비롯한 다수의 단점을 내포하고 있다.
의료용 이식물에 대한 상처 치유 과정을 향상시키는 다른 접근법은 의료용 이식물의 표면에 생물분자를 부착함으로써 의료용 장치의 생체적합성 (biocompatibility)을 개선하는 것이다. 의료용 이식물 장치에 생물분자를 부착하는 실례는 공지되어 있다: Subramaniam (U.S. patent 5,861,032)은 생물적합성 코팅을 갖는 의료용 장치를 개시하였는데, 여기서 생물활성제가 산화 (oxidation)에 의해 유기 링커 (organic linker)에 결합된다. Ellingsen (U.S. patent 7,192,445)은 생물분자와 수소화티타늄의 층으로 코팅된 이식물 장치의 용도를 개시하였다. 이들 생물분자는 전기분해 (electrolysis) 동안 형성될 때, 금속 수소화물 층 내로 통합되었다. Clapper 등 (U.S. patent 6,514,734)은 중합성 골격 (polymeric backbone) 내에서 생물활성 기 (bioactive group) 및 잠재성 반응 기 (latent reactive group)를 보유하는 코팅으로서 이용을 위한 폴리-이중-기능성 시약 (poly-bi-functional reagent)을 개시하였다. Clapper 등 (US2003/0181423)은 폴리-이중-기능성 시약에서 골 형태형성 단백질 (BMP) 및 다른 골 성장 인자의 용도를 더욱 개시하였다. Beyer 등 (U.S. Patent 7,572,766)은 BMP의 결합을 위한 분석물 모듈 (analyte module)과 연결된 이식물 모듈 (implant module)을 위한 펩티드를 개시하였다.
본 발명의 요약
의료용 장치의 골 내로의 외과 이식 이후에 골유착 동안, 골 조직은 의료용 이식물과의 정연한 생물학적 합체를 점진적으로 형성한다 (Masuda T, et al., Int J Oral and Maxillofac Implants 1998;13:17-29.). 골유착이 상처 치유 과정의 정상적으로 일부인 다수의 분자와 세포 매개자에 의해 영향을 받긴 하지만, 전환 성장 인자 (TGF)-β 대집단의 구성원이 골유착의 진행을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 수행한다. 이러한 TGF-β 대집단은 공통의 구조적 및 기능적 형태를 공유하고, 그리고 다양한 생물학적 기능을 매개하는 다수의 성장 인자를 포함한다. 이러한 TGF-β 대집단에는 골 형태형성 단백질 (BMP), 액티빈 (activin), 인히빈 (inhibin), 성장과 분화 인자 (GDF), 그리고 신경교-유래 향신경성 인자 (Glial-Derived Neurotrophic factor, GDNF)가 포함된다.
TGF-β BMP 집단 구성원, 특히 BMP-2, BMP-4와 BMP-7은 골형성에서 중요한 성장 인자 매개자인 것으로 간주된다 (DeBiase P and R Capanna, Injury, 2005, Nov: 36 Suppl 3:S43-6; Gautschi et al., ANZ J. Surg. 2007 Aug: 77(8): 626-31). 높은 수준의 서열 동일성 (sequence identity)을 공유하는 적어도 20개의 BMP 구성원이 보고되긴 했지만, BMP-2, BMP-4와 BMP-7은 시험관내 실험에서 조골세포를 자극하여 새로운 골 형성을 유발한다. BMP의 작동약 (agonist)과 길항약 (antagonist) 역시 공지되어 있다. BMP-2 단백질의 단백질 서열이 많은 종에서 공지되어 있다 (참조: GenBank 수탁 번호 AAF21646.1 (Homosapiens); CAA8108.1 (Rattes Norvegius) 및 AAB96785.1 (Oryctolagus cuniculus)).
골 재생을 위한 신규한 치료 양식 (therapeutic modality)은 고형 스캐폴드 (scaffold) 상에 항-BMP-2 항체의 고정을 수반한다. 이는 내생적 BMP-2를 포획하는데 이용된다. 이러한 양식은 항체-매개된-골질 재생 (AMOR)으로 명명된다. AMOR에 참여하기 위하여, 항체 (Ab) 분자는 아래의 특성을 가지고 있어야 한다: 1) 높은 친화성으로 내생적 BMP-2에 결합하는 능력; 2) BMP-2 수용체-결합 도메인으로부터 멀리 떨어진 BMP-2 에피토프에 결합하는 능력, 3) 골전구 세포 상에서 BMP-2 세포 수용체에 결합할 수 있는 Ab-BMP-2 면역 복합체를 형성하는 능력; 4) 세포내 신호를 전달할 수 있는 Ab-BMP-2 면역 복합체를 형성하는 능력; 5) 골원성 분화를 매개하는 Ab-BMP-2 면역 복합체를 형성하는 능력, 그리고 6) 호스트 내에서 해로운 국소 또는 전신 면역학적 반응의 회피.
실험 결과에서, BMP-2에 특이적으로 결합된 단일클론성 항체 (MAb)는 BMP-2가 골원성 세포에 결합할 수 있도록 하고, 그리고 골 재생을 향상시키는 것으로 확인되었다. 세포 상에서 결합된 BMP-2 및 차례로, BMP-2 수용체에 결합된 MAB-BMP-2 복합체를 방해하는 다른 MAb, 그리고 BMP-2에 결합하지만 BMP-2가 그의 수용체에 결합하는 것을 방해하고 골원성 분화를 제한하는 MAb가 확인되었다. 친화성 정제된 다중클론성 토끼 항-인간 BMP-2 역시 BMP-2에 결합할 수 있고 상기 BMP가 표적 세포에 결합할 수 있도록 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 다중클론성 Ab는 다수의 에피토프와 반응하는 항체를 포함할 것으로 생각되고, 이들 에피토프 중에서 일부는 면역 복합체에서 BMP-2가 그의 세포 수용체에 결합하는 것을 차단하고, 반면 다른 에피토프는 이러한 결합을 간섭하지 않는다.
AMOR를 위한 필요조건 중에서 한 가지는 항체가 호스트 내에서 유해한 국소 또는 전신 면역학적 반응을 발생시키지 않아야 한다는 것이다. 쥐와 토끼 두개골 결손부 (calvarial defect)에서 AMOR 이후에 조사된 모든 조직학적 절편 (histological section)에서, 염증성 침윤의 유의미한 증거가 관찰되지 않았다. 게다가, 쥐와 토끼의 검시 조사 (necropsy examination)에서, 병리의 전신 증거 (systemic evidence)가 전혀 관찰되지 않았다.
항체는 골 재생을 매개하는 특성에 대하여 스크리닝 (screening)되고 선별되었다. 항체 클론의 선별된 군 (4B12, 3G7과 C22)은 골형성을 향상시키는 특성을 갖고, 그리고 아이소타입 대조 (isotype control) 및 음성 대조 (negative control) 둘 모두와 비교하여 골 재생에서 유의미한 증가를 나타냈다. 이들 항체는 골 재생을 필요로 하는 질환 또는 수술에서 유용할 것이다. 골 재생을 저해하는 다른 군의 항체 (가령, C13)는 골 재생이 감소되어야 하는 경우에 이용될 수 있다.
선별된 항체는 BMP-2가 상처 치유 동안 골원성 세포의 인근에서 정상적으로 발현될 때 BMP-2를 포획하고, BMP-2를 이식 부위에 국지화시키고, 그리고 상처 치유 과정을 개선하였다. 자연 발생 항원성 인자가 상처 치유 동안 정상적으로 나타날 때, 선별된 항체는 상기 항원성 인자를 이식물의 표면 상에 포획하고, 따라서 선택된 인자의 농도를 증가시키고, 또한 상기 항원성 인자에 대한 이식된 장치의 노출 시간의 길이를 연장시켰다. 특이적 항체의 결합에 의한 의료용 이식물의 표면의 이러한 변형은 고유 성장 인자의 생물학적 이용 효율을 향상시키고 상처 치유를 개선하였다.
선택된 골 형태형성 단백질 (BMP) 항체에 대하여, 다른 구체예에는 다중클론성, 단일클론성 또는 재조합/합성 산출된 면역글로불린, 그리고 항원 결합 기능을 갖는 항체 단편이 포함된다: Fab, F(ab')2, 단일-사슬 가변 영역 항체 단편 (scFv), 미니바디 (minibody), 그리고 상보성 결정 영역 (complementary determining region, CDR)이 이용된다. 항체, 항체 단편 또는 항체의 혼합물이 이용될 수 있다.
이식 부위에서 BMP-2 성장 인자-항체 면역 복합체는 상기 부위에서 골원성 과정, 그리고 궁극적으로, 상기 복합체가 부착된 치과와 정형외과 이식물의 골유착을 향상시켰다. 이식물 주변에 골 밀도는 미세 전산화 단층 촬영 (micro-computed tomorgraphic imaging) 및 조직학적 관찰 (histological observation) 둘 모두에 의한 측정에서, 증가되었다.
이러한 절차는 이식된 의료용 장치 상에서 고유 생물분자의 포획과 농축을 가능하게 한다. 골형성의 정상적인 생리학적 과정에 성장 인자 방출의 커플링 (coupling)은 생체내 성장 인자 생산에 의해 주동된다. 고유 생물분자의 포획과 농축은 그들의 재조합 대응물보다 더욱 시기적절하게 생산되고 더욱 높은 생물활성을 가질 것으로 생각된다.
본 출원은 2009년 1월 20일 제출된 U.S. Provisional Application Serial No. 61/145,963 및 2009년 4월 24일 제출된 U.S Provisional Application Serial No. 61/172,666에 우선권을 주장하고, 이들 양쪽 출원은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 상세한 설명
다양한 이식가능 장치의 생물학적 성능은 고정된 항원-결합 분자를 이용하여 생체내에서 생물분자를 포획함으로써 개선될 수 있다. 이들 장치에는 치과 이식물, 치과 이식물 보철 성분 (가령, 어버트먼트 (abutment)), 정형외과 이식물, 중심정맥관 (central line), 카테터, 이식가능 약물 전달 장치, 그리고 심장박동조율기 (pacemaker)가 포함된다. 변형되는 이런 장치의 물질 구조는 티타늄과 이의 합금, 지르코늄과 이의 합금, 바나듐과 이의 합금, 칼라디움과 이의 합금, 금과 이의 합금, 산화알루미늄, 스테인리스, 그리고 기타 세라믹, 플라스틱, 수지와 금속을 포함할 수 있다.
도 1에서는 항체 매개된 골질 재생 (AMOR)을 위하여 고안되고 조사된 기본 전략을 도시한다. 도 1A에서, 항-BMP-2 항체는 골 조직에 대한 생체내 재생 부위에 삽입되는 스캐폴드 상에 고정된다. 고정된 항체는 미세환경으로부터 내생적 BMP-2를 포획하고, 재생 부위 인근에 BMP-1을 효과적으로 농축시킨다 (도 1B). BMP-2 특이적 항체에 의해 포획된 BMP-2는 골전구 세포 상에서 세포 수용체에 결합하고 골원성 분화를 촉진한다 (도 1C). AMOR에서, 스캐폴드에서 고정된 항체는 스캐폴딩 (scaffolding)의 부위에서, BMP-2 항원을 특이적으로 농축시켰다. 골원성 세포의 세포 표면 상에서 수용체는 BMP-2:항체 면역 복합체에 결합하여 골원성 분화를 위한 세포 신호전달 (cell signaling)을 유도하고, 그리고 스캐폴드를 둘러싸는 영역에서 골 재생의 향상을 가능하게 하였다. 내생적 BMP-2의 포획은 재생 부위에서 BMP-2 인자의 농도와 이용도를 증가시켰다.
다양한 BMP-2 특이적 항체는 BMP-2 단백질 상에서 서로 다른 에피토프에 결합한다. 도 2A-C에서는 다양한 BMP-2 에피토프에 항체 결합의 결과를 도시한다. BMP 수용체 특이적 도메인 ("손목"과 "손가락 마디")에 항체의 결합은 적절한 BMP-수용체 상호작용을 방해할 수 있다 (도 2A). 수용체-특이적 도메인 인근에서 에피토프에 다른 불리한 결합은 입체 장애를 유발할 수 있다 (도 2B). 수용체-특이적 도메인으로부터 격리된, BMP-2 분자 상에 에피토프에 선호되는 항체 결합은 BMP-수용체 상호작용의 간섭을 회피하였다 (도 2C).
다른 전략은 담체 또는 스캐폴드에 항체의 고정이 고정된 항체의 결합 능력에 영향을 줄 수 있다는 것이었다. 이러한 전략은 도 3A-C에 도시된다. 불리한 결합 시나리오는 도 3A와 3B에 도시된다. 이론적으로, 도 3C는 항원의 결합을 위한 고정된 항체의 선호되는 배향일 것이다.
또 다른 전략은 BMP-2 단백질 상에서 다른 에피토프에 결합 접근이 골 재생에 대한 다양한 항체 클론의 효과를 구별하는데 중요할 수 있다는 것이었다.
수용체 결합 도메인 (손목과 손가락 마디)의 장애를 회피할 뿐만 아니라, 항체 결합을 위한 헤파린-결합 도메인 (HBD)의 이용도가 고려되었다 (도 4A-4B). 도 4A에서는 2개의 BRIA 수용체 엑토도메인에 결합된 BMP-2의 이합체 (dimer) 사이에 복합체의 띠 표시에서 3차 구조를 도시한다. 상기 도면을 약간 오른쪽으로 회전시킴으로써, 헤파린-결합 도메인이 도 4B (Kirsch et al., 2000으로부터 개작된 도면)에서 지시된다. 이러한 방식으로, BMP-2 작동약과 길항약과의 상호작용에 영향을 주고 골 재생에 대한 궁극적인 효과를 결정짓는 다른 에피토프가 존재할 수 있다.
도 5A-D에서는 고정된 BMP-2 특이적 항체에 대한 골원성 분화의 시험관내 분석평가를 위하여 고안된 전략을 도시한다. 이러한 접근법은 유세포 분석 및 알칼리성 포스파타아제 분석평가에 이용되었다. 조사되는 항체는 배양 평판에 고정되었다 (도 5A). 이들 평판은 자체로써 골원성 효과를 갖지 않는 일정한 농도의 rhBMP-2 (10 ng/㎖) (도 5B)와 함께 배양되고 세척되었다. 이후, 골원성 세포, 예를 들면, 생쥐 근아세포 세포주 C2C12, 생쥐 조골세포 세포주 MC3T3-E1, 또는 인간 조골세포 세포주 hFOB1.19가 배양 평판에 첨가되었다 (도 5C). 일정한 시간 간격후, 골원성 분화의 양이 유세포 분석법 또는 알칼리성 포스파타아제 반응성에 의해 결정되었다.
하기에 제공된 실시예에서, 단일클론성 항체가 확립된 프로토콜을 이용하여 생산되었다 (참조: Galfre G and Milstein C, 1981, Methods Enzmol., 73 (Pt B): 3-46; Milstein C, 2003, Immunol. Today, Aug 21 (8): 359-64).
본 명세서에 기술된 항체에는 예로써, 공유 부착이 항체가 항-이디오타입 반응 (anti-idiotypic response)을 산출하는 것을 방해하지 못하도록 상기 항체에 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형되는 유도체가 포함된다. 가령, 하지만 제한 없이, 항체 유도체에는 예로써, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 결합 등에 의해 변형된 항체가 포함된다. 다수의 화학적 변형은 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 신진대사 합성 (metabolic synthesis) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다.
BMP-2에 대한 다중클론성 항체는 당분야에 널리 공지된 다양한 절차에 의해 생산될 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 항원에 특이적인 다중클론성 항체를 포함하는 혈청의 생산을 유도하기 위하여, 토끼, 생쥐, 쥐 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 호스트 동물에 투여될 수 있다. 호스트 종류에 따라서 면역학적 반응을 증가시키기 위한 다양한 어쥬번트가 이용될 수 있고, 그리고 여기에는 Freund (완전과 불완전), 무기 겔 (mineral gel), 예를 들면, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예를 들면, 리소레시틴 (lysolecithin), Pluronic polyol, 폴리음이온 (polyanion), 펩티드, CpG 또는 다른 변형된 올리고뉴클레오티드, 유성 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 (dinitrophenol), 그리고 잠재적으로 유용한 인간 어쥬번트, 예를 들면, BCG (bacille Calmette-Guerin)와 코리네박테리움 파붐 (Corynebacterium parvum)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 어쥬번트는 또한, 당분야에 널리 공지되어 있다.
단일클론성 항체는 하이브리도마의 이용, 재조합, 그리고 파지 전시 (phage display) 기술, 또는 이들의 조합을 비롯하여, 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 만들어질 수 있다. 가령, 단일클론성 항체는 당분야에 공지되고 예로써, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., 1981), 이들 참고문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)에서 교시되는 것들을 비롯한 하이브리도마 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "단일클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통하여 생산된 항체에 한정되지 않는다. 용어 "단일클론성 항체"는 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하고, 그리고 이러한 항체가 생산되는 방법을 지칭하지 않는다.
하이브리도마 기술을 이용하여 특이적 항체를 생산하고 스크리닝하는 방법은 일과적이고 당분야에 널리 공지되어 있다. 간단히 말하면, 생쥐는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이런 펩티드를 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 일단 면역 반응이 검출되면, 예로써 항원에 특이적인 항체가 생쥐 혈청 내에서 검출되고, 생쥐 비장이 수확되고, 그리고 비장세포 (splenocyte)가 분리된다. 이들 비장세포는 이후, 널리 공지된 기술에 의해, 임의의 적절한 골수종 세포, 예를 들면, ATCC로부터 입수가능한 세포주 SP20으로부터 세포에 융합된다. 하이브리도마가 선별되고 제한 희석에 의해 클로닝된다. 이들 하이브리도마 클론은 이후, 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대하여, 당분야에 공지된 방법에 의해 분석평가된다. 일반적으로 높은 수준의 항체를 포함하는 복수액 (ascites fluid)은 양성 하이브리도마 클론으로 생쥐를 면역화시킴으로써 산출될 수 있다.
다중클론과 단일클론성 인간 B 세포주 둘 모두를 생산하기 위한 다른 널리 공지된 방법은 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus, EBV)를 이용한 형질전환 (transformation)이다. EBV-형질전환된 B 세포주를 산출하기 위한 프로토콜은 당분야에 널리 공지되어 있다, 예를 들면, 이러한 프로토콜은 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., 1994, John Wiley & Sons, NY의 Chapter 7.22에서 개설된다. 형질전환을 위한 B 세포의 출처는 통상적으로 인간 말초혈이지만, 형질전환을 위한 B 세포는 림프절, 편도선, 비장, 종양 조직, 그리고 감염된 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않은 다른 출처로부터 유래될 수도 있다. 조직은 일반적으로, EBV 형질전환에 앞서 단일 세포 현탁액으로 만들어진다. 부가적으로, B 세포-포함 시료에서 T 세포를 물리적으로 제거하거나 비활성화시키는 단계 (가령, 시클로스포린 A로 처리에 의해)가 수행될 수 있는데, 그 이유는 항-EBV 항체에 혈청검사 양성인 개체로부터 T 세포가 EBV에 의한 B 세포 영속화 (immortalization)를 억제할 수 있기 때문이다. 일반적으로, 인간 B 세포를 포함하는 시료는 EBV가 접종되고, 그리고 3-4주 동안 배양된다. EBV의 전형적인 출처는 B95-8 세포주 (ATCC #VR-1492)의 배양 상층액이다. EBV 형질전환의 물리적 징후는 일반적으로, 3-4주 배양 기간의 종결 시점에 가까워짐에 따라 관찰될 수 있다. 위상차 검경 (phase-contrast microscopy)에 의해, 형질전환된 세포는 크고, 투명하고, 털이 많고, 그리고 조밀한 세포 무리로 집합하는 것으로 나타난다. 초기에, EBV 세포주는 일반적으로 다중클론이다. 하지만, 세포 배양의 연장된 기간 동안, EBV 세포주는 특정 B 세포 클론의 선별적 성장 (selective outgrowth)의 결과로써 단일클론 또는 다중클론이 될 수 있다. 대안으로, 다중클론성 EBV 형질전환된 세포주는 서브클로닝 (가령, 제한 희석 배양에 의해)되거나, 또는 적절한 융합 상대와 융합되고 제한 희석에서 도말되어 단일클론성 B 세포주가 획득될 수 있다. EBV 형질전환된 세포주에 대한 적절한 융합 상대에는 생쥐 골수종 세포주 (가령, SP2/0, X63-Ag8.653), 이종골수종 세포주 (인간 x 생쥐; 가령, SPAM-8, SBC-H20, 그리고 CB-F7), 그리고 인간 세포주 (가령, GM 1500, SKO-007, RPMI 8226, 그리고 KR-4)가 포함된다.
따라서 본 발명은 단일클론성 항체를 생산하는 방법, 그리고 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 항체를 포함하고, 여기서 바람직하게는, 상기 하이브리도마는 본 발명의 항원으로 면역화된 생쥐로부터 분리된 비장세포를 골수종 세포와 융합하고, 이후 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대한 융합체로부터 발생하는 하이브리도마를 스크리닝함으로써 산출된다.
가령, 본 발명의 항체는 또한, 당분야에 공지된 다양한 파지 전시 방법을 이용하여 산출될 수 있다. 파지 전시 방법에서, 기능적 항체 도메인은 그들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면 상에 전시된다. 특히, 이런 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (가령, 인간 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 전시하는데 이용될 수 있다. 목적되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예를 들면, 표지된 항원, 또는 고형 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선별되거나 확인될 수 있다. 이들 방법에 이용되는 파지는 전형적으로, Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인이 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합 방식으로 융합된 파지로부터 발현된 fd와 M13 결합 도메인을 포함하는 섬유성 파지 (filamentous phage)이다. 파지 전시 방법의 실례에는 Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT application No. PCT/GB91/01134; PCT publication WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 그리고 U.S. Pat. No. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743과 5,969,108에서 기술된 것들이 포함된다; 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
상기 참고문헌에서 기술된 바와 같이, 파지 선별 (phage selection)후, 파지로부터 항체 코딩 영역은 분리되고, 인간 항체를 비롯한 완전 항체, 또는 임의의 다른 원하는 BMP-2 결합 단편을 산출하는데 이용되고, 그리고 예로써, 하기에 상세하게 기술된 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 그리고 세균을 비롯한 임의의 원하는 호스트에서 발현될 수 있다. 가령, Fab, Fa와 F2 단편을 재조합 방식으로 생산하는 기술 역시 PCT publication WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 그리고 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (이들 참고문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)에서 기술된 것들과 같은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 활용될 수 있다.
단일-사슬 Fv와 항체를 생산하는데 이용될 수 있는 기술의 실례에는 U.S. Pat. No. 4,946,778과 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 그리고 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에서 기술된 것들이 포함된다. 인간에서 항체의 생체내 이용 및 시험관내 검출 분석평가를 비롯한 일부 용도의 경우에, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 상기 항체의 상이한 부분이 서로 다른 동물 종으로부터 유래되는 분자, 예를 들면, 뮤린 단일클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당분야에 공지되어 있다 (참조: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. No. 5,807,715; 4,816,567; 4,816397, 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다). 인간화 항체는 비-인간 종으로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터 프레임워크 영역을 보유하고 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역 내에서 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변화시키기 위하여, 바람직하게는 개선하기 위하여 CDR 공여자 항체로부터 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 당분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 (modeling), 그리고 특정 위치에서 특별한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (참조: Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 항체는 예로써, CDR-이식 (grafting) (EP 239,400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Pat. No. 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089), 덧붙임 (veneering) 또는 표면치환 (resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 그리고 사슬 뒤섞기 (chain shuffling) (U.S. Pat. No. 5,565,332)를 비롯한 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.
완전 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 이용하여 앞서 기술된 파지 전시 방법을 비롯한 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다 (참조: U.S. Pat. No. 4,444,887과 4,716,111; 그리고 PCT publication WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 그리고 WO 91/10741; 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨).
인간 항체는 또한, 기능적인 내생적 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자도입 생쥐를 이용하여 생산될 수 있다. 가령, 인간 중쇄와 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 생쥐 배아 줄기 세포 내로 무작위로, 또는 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의해 도입될 수 있다. 대안으로, 인간 중쇄와 경쇄 유전자 이외에, 인간 가변 영역, 불변 영역, 그리고 다양성 영역이 생쥐 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 생쥐 중쇄와 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의한 인간 면역글로불린 좌위의 도입으로 별개로 또는 동시에 비-기능적으로 만들어 질 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실 (homozygous deletion)은 내생적 항체 생산을 방해한다. 변형된 배아 줄기 세포는 확장되고, 그리고 키메라 생쥐를 생산하기 위하여 배반포 (blastocyst) 내로 미세주입된다. 키메라 생쥐는 이후, 교배되어 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손이 생산된다. 이들 유전자도입 생쥐는 선택된 항원, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 통상적인 방식으로 면역화된다. 상기 항원에 대한 단일클론성 항체는 전통적인 하이브리도마 기술을 이용하여, 면역화된 유전자도입 생쥐로부터 획득될 수 있다. 유전자도입 생쥐에 의해 품어지는 인간 면역글로불린 도입유전자 (transgene)는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이후 클래스 전환 (class switching) 및 체세포 돌연변이 (somatic mutation)를 겪는다. 따라서 이런 기술을 이용하면, 치료에 유용한 IgG, IgA, IgM와 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개관을 위하여, Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93을 참조한다. 인간 항체와 인간 단일클론성 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이런 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 검토를 위하여, 예로써 PCT publication WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; U.S. Pat. No. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598을 참조하고, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "인도된 선별 (guided selection)"로 지칭되는 기술을 이용하여 산출될 수 있다. 이러한 접근법에서, 선별된 비-인간 단일클론성 항체, 예를 들면, 생쥐 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선별을 인도하는데 이용된다 (Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)).
선택된 결합 항체 분자의 형태에 상관없이, 표적에 상기 항체의 생체내 결합은 바람직하게는, 수용체 결합 또는 다른 활성 효과기를 비롯하여, 표적의 생물학적 활성을 간섭하지 않는 부위에서 발생한다. 따라서 콜라겐 막 담체 또는 의료용 이식물 상에서 획득된 항체-항원 복합체의 분자 표현 (molecular presentation)은 생물분자의 국지적인 농도를 증가시킬 뿐만 아니라 생체내에서 상기 생물분자의 원하는 통상의 자연적인 생물학적 활성을 가능하게 하였고, 이는 이식 수술에 대한 치유 과정을 향상시켰다.
산출된 항체 클론은 표적화된 생물분자와의 반응성에 대하여 생체내에서 조사되었다. 포획된 분자의 생물학적 활성이 접근가능하고 중화되지 않는 지를 결정하기 위한 최초 조사는 변형되고 면역화된 생물분자와의 결합을 포함하였다.
최초 조사는 서양 장기판 형식에서 변하는 농도로, 생물분자의 특정한 항체와의 반응을 포함하였다. 최초 조사에서 면역화 분자에 양성으로 반응하는 것으로 관찰된 각 항체는 선별되고 상기 항원과 반응되어 면역 복합체가 형성되었다. 산출된 면역 복합체는 시험관내 분석평가, 그 이후에 생물학적 활성에 대한 생체내 분석평가에서 조사되었다.
항체의 단편을 획득하기 위하여, 단일클론성 항체는 Fab와 F(ab)'2를 비롯한 항원-결합 단편이 산출되도록 효소적으로 절단되었다. 완전 면역글로불린 분자 또는 그들의 단편은 고유 생물분자를 포획하는 가장 유효한 분자를 선별하기 위한 시험관내와 생체내 분석평가에 이용될 수 있다. 대안으로, 단편의 산출 방법은 재조합 기술을 이용하여 이들 단편을 생산하는 것이었다. 이러한 방식으로, 더욱 작은 단편, 예를 들면, ScFc 또는 CDR이 산출되었다.
의료용 이식물 장치의 표면에 생물분자를 부착하기 위하여, 하기에 더욱 상세하게 논의된 바와 같이, 흡착, 스페이서 분자의 이용, 실란화, 당화 및 공유 결합을 비롯한 다양한 방법이 이용되었다. 이식가능 장치에 항원-결합 분자의 흡착은 항원-결합 분자와 함께 이식가능 장치의 배양에 의해 달성되었다. 각 절차를 위하여, 배양 기간과 조건, 예를 들면, pH, 온도 및 이온 농도가 각각의 항원-결합 분자 및 이식가능 장치에 대하여 최적화되었다.
골 재생에 대한 스캐폴드의 영향에 대하여, 항체의 고정을 위한 다수의 스캐폴드가 조사되었다. 스캐폴드에는 소 아킬레스건 (bovine Achilles tendon)으로부터 유래된 흡수가능 콜라겐 스펀지 (ACS; Collacote, Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ), 이중층 비-가교연결된 돼지 콜라겐 막 (Bio-Gide®, Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Switzerland), 소 단백제거된 암성 골 (bovine deproteinated cancellous bone) (Bio-Gide®, Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Switzerland), β-트리칼슘 포스페이트 (Cerasorb®, RIEMSER Inc, Germany) 및 티타늄 이식물 (Osseospeed®, Astratech, Molndal, Sweden)이 포함되었다. 각각의 스캐폴드 물질로 조직학적 골 재생의 비교는 ACS가 최대 수준의 골 재생과 연관된다는 것을 증명하였다 (데이터 제시되지 않음). 이는 아마도, ACS가 조사된 모든 스캐폴드 중에서 가장 빠른 재흡수율 (resorption rate)을 갖는다는 사실에 기인하였다.
현재, rhBMP-2는 ACS 담체와의 병용이 FDA에 의해 승인되었다. 이런 이유로, 콜라겐 막 (ACS)이 본 연구에서 스캐폴드로서 이용되었다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 항체 매개된 골질 재생 (AMOR)을 위한 전략을 도시한다. (A) 항-BMP-2 항체가 담체 또는 스캐폴드 상에 고정된다; (B) 항체가 이러한 미세환경으로부터 내생적 BMP-2를 포획하고, 골 재생 부위 인근에 BMP-2를 농축시킨다; (C) 특이적 항체에 의해 포획된 BMP-2가 골전구 세포 상에서 그의 세포 수용체에 결합하고, 이들의 골원성 분화를 촉진한다.
도 2에서는 다양한 BMP-2 에피토프에 항체 결합의 결과의 전략을 도시한다. (A) BMP 수용체-특이적 도메인 (손목과 손가락 마디)에 항체 결합은 BMP-수용체 상호작용을 방해하였다; (B) 수용체-특이적 도메인 인근에서 에피토프에 항체 결합은 입체 장애 (steric hindrance)를 발생시켰다; (C) 수용체-특이적 도메인으로부터 멀리 떨어진 에피토프에 항체 결합은 항체 매개된 골질 재생 (AMOR)을 매개할 수 있는데, 그 이유는 상기 결합이 BMP-수용체 상호작용을 간섭하지 않기 때문이다.
도 3에서는 항원-결합 부위의 이용도에 대한, 담체 또는 스캐폴드 상에 고정 이후에 항체 배향 (antibody orientation)의 영향의 전략을 도시한다. (A) 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)의 이용도; 이는 BMP 및 이의 세포 수용체와 동시에 상호작용하기에 잠재적으로 공간적으로 가용하지 않을 수 있다; (B) 결합에 가용한 CDR 없음; 그리고 (C) 항원과의 결합에 가용한 양쪽 CDR.
도 4에서는 BMP-2-BRIA 엑토도메인 복합체의 3차 구조를 도시한다. (A) 막 근위 부 (membrane proximal side)가 바닥에 위치하는 측면도 (side view) 및 (B) 상기 복합체의 2중 축 (twofold axis)을 따라서 평면도 (top view)를 보여주는 띠 표시 (ribbon representation). BMP 단량체는 중간 회색과 짙은 회색이고, 반면 2개의 BRIA 엑토도메인 분자는 밝은 회색이다. "손목"과 "손가락 마디" 에피토프, 그리고 BMP-2의 N-말단에 위치하는 헤파린 결합 도메인 (HBD)이 표시된다 (Kirsch et al., 2000로부터 개작됨).
도 5에서는 (A) 배양 평판에 항-BMP 항체를 고정시키고; (B) 낮은 농도 rhBMP-2 (10 ng/㎖)와 함께 배양하고; (C) C2C12 골전구 세포와 함께 배양하고, 그리고 (D) 알칼리성 포스파타아제 반응 (alkaline phosphatase reaction, ALP)에 의한 세포의 골원성 분화에 대하여 분석평가하기 위한 실험 전략을 도시한다.
도 6에서는 rhBMP-2 면역 복합체 및 C2C12 골원성 세포에 다양한 항-BMP-2 항체 클론의 동시 결합의 결합의 유세포 분석 (flow cytometric analysis)을 도시한다. 아이소타입에 상대적인 MFI 비율은 정합된 아이소타입의 대조 (pAblso), 다중클론성 항체 (pAb), 3G7S 클론, 그리고 생쥐 하이브리도마 (hybridoma) 라이브러리로부터 획득된 다양한 단일클론성 클론 (C3, C6, C7, C9, C13, C15, C18, C20, C21, C22, C24, C26, 그리고 C29)에 대하여 지시된다. p<0.05 (*) 및 p< 0.01 (#)에서 결합의 유의성 (significance)이 지시된다.
도 7에서는 BMP-2와 항체 클론의 존재 (+) 또는 부재 (-)에서 배양된 hFOB 세포주의 알칼리성 포스파타아제 활성을 도시한다. 대조: 항체 없음, BMP-2 없음, 그리고 항체 없이 BMP-2. 항체 클론은 첨가된 BMP-2 (-) 없이 조사되고, 이후 면역 복합체를 형성하는 첨가된 BMP-2 (+)의 존재에서 조사되었다. 조사된 시료: mAb1; pAb2, mAb2와 mAb3. Ab1 (클론 100221, R&D Systems: www.rndsystems.com); pAb (친화성 정제된 염소 항-BMP-2 pAb (R&D Systems; www.rndsystems.com); mAb2 (클론 100230, R&D Systems; www.rndsystems.com) 및 mAb3 (클론 65529, R&D Systems; www.rndsystems.com)이 조사되었다.
도 8에서는 rhBMP-2 및 다양한 항체 면역 복합체의 존재 또는 부재에서 2일 동안 배양된 C2C12 세포주의 알칼리성 포스파타아제 활성을 도시한다.
도 9에서는 수술후 2주 시점에, 쥐 두개골 결손부에서 획득된 골 재생을 도시한다. 4 mm 외과 결손부가 만들어지고, 콜라겐에 고정된 대조 또는 BMP-2 특이적 항체로 채워지고, 그리고 2주간의 치유후 조사되었다. 도 9A: 시료 패널 1-6은 마이크로-CT 스캔의 (i) 결손부의 횡단면 (cross section); (ii) 결손부의 관상면 (coronal section), (iii) 관상면 세부의 전경을 포함한다. 방사성투과 (radiolucency) (어두운 구역)는 빈 공간을 지시한다. 방사성비투과 (radioopacity) (밝은 구역)는 밀집된 조직을 지시한다. 섹션 (iv)에서는 헤마톡실린과 에오신에 의해 염색된 대표적인 영역의 상응하는 조직 구조를 보여준다. 점선은 연결 조직을 지시하고, 실선은 새로운 골을 지시한다. 시료: (A) 대조: 채워지지 않은 결손부 (없음) 및 (B) 콜라겐에 고정된 아이소타입 항체로 채워진 결손부. 실험체: 콜라겐 + BMP-2 결합 단일클론성 항체: (C) 단일클론성 항체 mAb1 (클론 100221; www.rndsystems.com); (D) 다중클론성 항체 pAb (친화성 정제된 염소 항-BMP-2 pAb; R&D Systems; www.rndsystems.com); (E) 단일클론성 항체 mAb2 (클론 100230, R&D Systems; www.rndsystems.com), 그리고 (F) 단일클론성 항체 mAb3 (클론 655529, R&D Systems; www.rndsystems.com)으로 채워진 결손부.
도 10에서는 도 9에서 조사된 각 시료에 대한 각 결손부에서 골 채움 (bone fill)%를 지시하는 조직형태계측법 (histomorphometry)을 도시한다.
도 11A-11M에서는 대조 또는 고정된 실험용 단일클론성 항체 클론으로 처리된 쥐 두개골 결손부 내에서 항체 매개된 골질 재생 (AMOR)을 도시한다. 결손 영역은 수술후 2주, 4주와 6주 시점에 μ-CT 크로스-섹션에 의해, 그리고 6주 시점에 동물의 안락사 이후 조직학적 검사 (헤마톡실린과 에오신; 트리크롬 염색) 및 조직형태계측 (histomorphological measurement)에 의해 조사되었다. 세부 확대는 상자로 표시된 구역과 화살표로 지시된다. 결과는 5회 실험의 전형이었다. 도 11A: 대조 (-) (콜라겐 막 단독) 및 클론 3G7에 대한 μ-CT의 비교; 도 11B: 6주 시점에 대조 (-)의 조직 구조; 도 11C: 클론 3G7의 조직 구조; 도 11D: 대조 (-) 및 클론 4B12에 대한 μ-CT의 비교; 도 11E: 6주 시점에 대조 (-)의 조직 구조; 도 11F: 클론 4B12의 조직 구조; 도 11G: 클론 C13 및 C21에 대한 μ-CT의 비교; 도 11H: 클론 C13의 조직 구조; 도 11I: 클론 C21의 조직 구조; 도 11J: 아이소타입 정합 대조 및 클론 C22에 대한 μ-CT의 비교; 도 11K: 아이소타입 대조의 조직 구조; 그리고 도 11L: 클론 C22의 조직 구조. 비교를 위하여, 도 11M은 한 페이지에 정렬된 도 11A -11L을 도시한다.
도 12에서는 대조 (-) 및 아이소타입 정합된 항체 (iso)에 대하여 2주, 4주와 6주의 3가지 시점에서 획득된 μ-CT 골 밀도의 막대그래프를 도시한다. 도시된 실험체는 다중클론성 항체 클론 (pAB1), 단일클론성 항체 클론 4B12와 3G7S, 그리고 산출된 라이브러리로부터 단일클론성 항체 (C9, C18, C13, C3, C24, C7, C22, C21)이다.
도 13: 도 11과 도 12에서 시료에 대한 수술후 6주 시점에 골상 골 채움 (osteiod bone fill)의 조직형태계측. 골상 골 채움의 비율이 지시된다. 양측 t 검증 (Two-tailed T test)은 클론 4B17 [4B12?]의 경우에 p< 0.05 (*), 그리고 클론 3G7S의 경우에 p < 0.01 (#)에서 유의성을 증명하였다.
도 14에서는 면역자성 비드 (immunomagnetic bead)로부터 용리된 단백질의 웨스턴 블롯 분석 (Western blot analysis)을 도시한다. 레인은 (1) 아이소타입 항체; (2) 단일클론성 항체 클론 4B12; (3) 단일클론성 항체 3G7S; (4) 다중클론성 항체 클론 pAb; (5) 혈액 균질현탁액; (6) 골 균질현탁액; 그리고 (7) 2 ng의 rhBMP-2이다.
도 15A-15B에서는 면역조직화학에 의한 BMP-2 (A-B)와 오스테오칼신 (C-D)의 발현의 in situ 분포를 도시한다. 화살표는 절편의 세부를 지시한다. 절편은 항-BMP-2 다중클론성 항체로 표지되고, 그 이후에 HRP-접합된 이차 항체 결합이 수행되었다. 도 15A에서는 막 단독 (-)과 아이소타입 정합된 항체 (아이소타입)의 대조, 그리고 단일클론성 항체 클론 C13에 대한 BMP-2 분포를 도시한다; 도 15B에서는 단일클론성 항체 클론 C21, C22, 3G7과 4B12를 도시한다.
도 16A-16B에서는 면역조직화학에 의한 오스테오칼신의 in situ 분포를 도시한다. 도 16A에서는 대조 (-)와 아이소타입-정합된 항체 대조 (Iso)에서, 그리고 단일클론성 항체 클론 C13에 대한 오스테오칼신 분포를 도시한다; 도 16B에서는 단일클론성 항체 클론 C21, C22, 3G7과 4B12에서 오스테오칼신 분포를 도시한다.
도 17에서는 BMP-2와 오스테오칼신의 발현의 비교를 위하여 한 페이지에 정렬된 도 15와 도 16을 도시한다.
도 18A-18B에서는 수술후 4주 시점에 토끼 두개골 결손부 내에 항체 매개된 골질 재생 (AMOR)을 도시한다. 도 18A에서는 두개골 결손부 횡단면에 대한 μ-CT 결과를 도시한다; 도 18B에서는 처리된 결손 외과 구역의 관상면의 μ-CT 결과를 도시한다. 도 18A-B 및 도 19에 이용된 항체에는 아이소타입 정합된 항체 (Iso), 단일클론성 항체 클론 C20과 C22가 포함되었다.
도 19에서는 도 18에서 시료에 대한 4주 시점에 헤마톡실린과 에오신 염색 (H & E) 및 트리크롬 (tri) 염색 둘 모두에 대한 조직학적 분석을 도시한다.
도 20에서는 항체 클론 Iso, C20과 C22, 그리고 항-BMP-2 다중클론성 항체 (pAb8), 또는 다양한 항-BMP-2 단일클론성 항체 클론 (C19, 18, C9, C24, C15, C3, 3G7S)을 비롯한, 토끼 두개골 결손부에서 조사된 다른 항체에 대한 도 18과 19에서 시료의 조직형태계측을 도시한다. 아이소타입-정합된-항체에 상대적인 t-검증, p< 0.05 (*)가 지시된다.
도 21A-D에서는 다중클론성 항체 클론 pAb 및 헤파린-흡수된 pAb 항체 (AB-pAb)에 대한 2주 (A-B) 및 4주 (C-D) 시점에 쥐 두개골 결손부의 횡단면의 μ-CT 스캔을 도시한다. 도 21E에서는 콜라겐 대조 (별), pAb (닫힌 정사각형) 및 헤파린-흡수된 pAb 항체 (열린 정사각형)에 대한 재생된 골 체적의 조직형태계측 정량을 도시한다.
도 22A-D에서는 도 21에 도시된 쥐 두개골 결손부가 (A) 콜라겐 단독; (B) 콜라겐 + 아이소타입 대조 항체; (C) 콜라겐 + 항-BMP-2 다중클론성 항체 클론 pAb; 그리고 (D) 헤파린-BMP-2 칼럼에 흡수된 콜라겐 + 항-BMP-2 pAb (AB-pAb)로 채워질 때, 수술후 4주 시점에 획득된 조직학적 비교를 도시한다.
도 23A-F에서는 아이소타입 대조 (A, C, E) 또는 실험용 BMP-2-특이적 항체 클론 (B, D, F)으로 코팅된 Astratech osseospeed 이식물 (3.5 X 8 mm)에 생체내 세포 부착의 주사 전자 검경 (scanning electron microscopy, SEM)을 도시한다. 시료는 토끼 경골 (tibia) 내로 7일간 배치후 수확되었다. 도 23A-B에서는 작은 섬조 (microthread) 부분을 도시한다. 도 23C-D에서는 이식물의 큰 섬조 (macrothread) 부분을 도시하고, 그리고 도 23E-F는 이들 큰 섬조의 높은 확대도(magnification view)이다. 도 A (30x 확대); 도 B (38x 확대); 도 C와 D (40x 확대); 도 E와 F (500x 확대).
도 24A-C에서는 토끼 경골 내로 Astratech osseospeed 이식물 (3.5 x 8 mm)의 14일간 배치후 수확된 BMP-2 특이적 항체 코팅된 이식물 및 아이소타입 대조 항체 코팅된 이식물에 대한 μ-CT 데이터를 도시한다. 도 24A에서는 대조 이식물의 μ-CT 영상의 대표적인 영상을 도시하고, 반면 도 24B에서는 실험용 BMP-2 항체 클론 mAb1 (클론 100221, R&D Systems; www.rndsystems.com)의 μ-CT 영상을 도시한다. 도 24C에서는 도 24A-B에서 도시된 실험용 이식물 및 대조 이식물 주변에 골 밀도의 정량적 치수를 도시한다. 단위는 Houndsfield 단위로 표시된다. t-검정은 대조와 비교하여 실험체에 대하여 p<0.05를 나타냈다.
도 25A-H에서는 면역글로불린 아이소타입-정합된 대조 (A-D) 및 실험용 BMP-2-특이적 항체 (mAb1, 클론 100221) 코팅된 이식물 (E-H)의 조직학적 절편을 도시한다. 이식물은 토끼 경골 내로 배치되고 수술후 18일 시점에 수확되었다.
실시예 1: BMP -2 특이적 항체
단일클론성 항체 클론 3G7S (IgG2a; Abnova, Taipei, Taiwan), 단일클론성 항체 클론 4B12 (IgG2a; Abnova), 그리고 다중클론성 Ab (pAb) (토끼, rhBMP-2, Biovision, Mountain View, CA)를 비롯한 대략 24개의 상업적으로 가용한 항-BMP-2 항체가 조사되었다. 예비 연구에서, mAb1 (클론 100221), mAb2 (클론 100230)와 mAb3 (클론 65529)을 비롯한 3가지 단일클론성 항체 클론이 조사되었다. BMP-2에 특이적인 다중클론성 항체, pAb (친화성 정제된 염소 항-BMP-2 항체) 역시 조사되었다.
부가적으로, 뮤린 단일클론성 항체 (mAb) 라이브러리가 산출되었다. 생물분자 골 형태형성 단백질 (BMP-2)에 특이적인 단일클론성 항체는 표준 절차 (Galfre G and Milstein C, 1981, Methods Enzmol., 73 (Pt B): 3-46; Milstein C, 2003, Immunol. Today, Aug 21 (8): 359-64)에 따라 산출되었다. 생쥐는 적절한 어쥬번트와 함께, BMP-2 (RNV System, Medtronic)의 면역원성 용량 (immunogenic dose)으로 접종되었다. 면역화된 동물의 비장세포로부터 산출된 하이브리도마는 BMP-2에 결합하는 것들에 대하여 스크리닝 (screening)되었다. 수천 개의 산출된 콜로니로부터, 480개의 선별된 콜로니는 BMP-2 결합에 대하여 ELISA에 의해 스크리닝 (screening)되었다; 37개의 클론이 선별되었다. 일부 클론은 발현을 상실하지만, BMP-2의 높은 발현을 갖는 13개의 클론이 확인되었다. 클론은 제조업체의 프로토콜에 따라서, ClonaCell-HY 하이브리도마 클로닝 키트 (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 이용하여 산출되었다. 스크리닝된 클론의 아이소타입검사(isotyping)는 제조업체의 사용설명서에 기술된 바와 같이, 생쥐 MonoAB ID KIT-HRP (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 수행되었다. 이러한 하이브리도마 라이브러리로부터 BMP-2 특이적 항체 클론은 C 접두사, 예를 들면, C3-C29로 표지되고, 그리고 골 재생에 대한 효과에 대하여 조사되었다.
단일클론성 하이브리도마 클론 C22와 C13은 조직 수탁 기관에 기탁되었다.
실시예 2: 배양 접시에 고정된 단일클론성 항체를 이용한 BMP-2의 시험관내 포획
용액으로부터 BMP-2를 포획하는 항-BMP-2 Ab의 능력을 결정하기 위한 시험관내 배양 시스템이 개발되었다. 탄산염/중탄산염 용액 (0.5 mM, pH 9.5)에 희석된 항체 (25 ㎍/㎖)는 실온에서 하룻밤 배양, 그 이후에 PBS로 6회 세척에 의해 24-웰 (well) 배양 접시에서 고정되었다. 재조합 인간 BMP-2 (rhBMP-2, Medtronic, Minneapolis, MN, 100 ng/㎖)는 이후, 4℃에서 1시간 동안 배양되었다. 유리 rhBMP-2는 PBS로 6회 세척에 의해 제거되었다.
예비 조사는 서양 장기판 형식에서 변하는 농도로, BMP-2의 특정한 항체와의 반응을 포함하였다. 최초 조사에서 면역화 분자에 양성으로 반응하는 것으로 관찰된 각 항체는 선별되고 상기 항원과 반응되어 면역 복합체가 형성되었다. 산출된 면역 복합체는 골원성 반응에 대하여 시험관내 분석평가에서 조사되었다.
실시예 3: 유세포 분석에 의한 항체-BMP 면역 복합체의 생물학적 활성의 시험관내 분석평가
BMP-2와 항-BMP-2 항체 사이에 면역 복합체가 골원성 세포의 세포 표면 상에서 BMP-2 수용체에 결합하는 능력을 유지하는 지를 결정하기 위한 시험관내 유세포 분석평가가 개발되었다. 일반적으로, rhBMP-2는 다양한 항-BMP-2 항체와 함께 배양되고, 그리고 이들 면역 복합체는 BMP 수용체를 발현하는 골원성 세포주인 C2C12 세포와 함께 배양되었다. 이후, 피코에리트린 (PE)-접합된 염소 항-생쥐 Ab (Becton Dickinson, San Jose, CA)로 면역형광 표지화 (immunofluorescent labeling)가 수행되었다. 형광 표지화의 강도는 유세포 분석기 (flow cytometer) (FACSCalibur, Becton Dickinson)로 평균 형광 강도 (mean fluorescent intensity, MFI)를 측정함으로써 결정되었다.
골원성 세포주: 조골세포 세포로 발달할 수 있는 잠재력을 갖는 세포주가 이용되었다. 생쥐 근아세포 세포주 C2C12, 생쥐 조골세포 세포주 MC3TC-E1, 그리고 인간 조골세포 세포주 hFOB 1.19의 세포가 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)로부터 획득되었다. C2C12 세포는 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich), 그리고 10% 소 태아 혈청 (FBS, Biocell Laboratories, Rancho Dominguez, CA)으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 배양되었다. MC3T3-E1 세포는 L-글루타민, 리보뉴클레오시드, 그리고 디옥시리보뉴클레오시드 (Cat. No. 12571, Invtrogen, Grand Island, NY)를 포함하고 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich), 그리고 10% FBS (Biocell Laboratories)로 보충된 알파-MEM에서 성장되었다. hFOB 1.19 세포는 2.5 mM L-글루타민 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍ /㎖ 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich), 그리고 10% FBS (Biocell Laboratories)로 보충된, Ham의 F12 배지와 DMEM (Cat. No. D2906, Sigma)의 1:1 혼합물에서 배양되었다. 이들 세포는 공기 중에 5% CO2의 가습된 공기 하에 37℃ (C2C12와 MC3T3-E1) 또는 34℃ (hFOB 1.19)에서, 각 배지에서 배양되었다.
유세포 분석에서, BMP-2 특이적 항체 (실시예 1 참조)는 4℃에서 30분 동안 포화 항체 농도에서 rhBMP-2와 함께 배양되었다. 이후, 면역 복합체는 4℃에서 20분 동안 C2C12 세포와 함께 배양되었다. 결합되지 않은 항체-BMP는 PBS로 세척함으로써 제거되었다. 세포는 피코에리트린 (PE)-접합된 염소 항-생쥐 Ab (Becton Dickinson, San Jose, CA)로 면역형광 표지화에 의해 표지되었다. 형광 표지화의 강도는 유세포 분석기 (flow cytometer) (FACSCalibur, Becton Dickinson)로 평균 형광 강도 (mean fluorescent intensity, MFI)를 측정함으로써 결정되었다.
다양한 BMP-2 특이적 항체의 유세포 분석의 결과는 도 6에 도시된다. 조사된 항체는 단일클론성 항체의 패널 (실시예 1 참조), 그리고 여러 다중클론성 항체를 포함하였다. rhBMP-2와의 포화 결합후, 면역 복합체는 C2C12 세포와 함께 배양되고, 그 이후에, BMP-2: 항체 면역 복합체에 결합하는 세포를 검출하기 위한 형광색소-접합된 염소 항-생쥐 Ab로 면역형광 표지화가 수행되었다. 대조에는 막 담체 단독 (-), 두 번째 항-생쥐 항체의 부재, 그리고 BMP-2에 특이적이지 않은 아이소타입 정합된 IgG 항체 (pAblso)가 포함되었다. 결과는 3회 독립된 실험의 전형이었다. p < 0.05 (* ), 또는 p< 0.01(#)에서 유의성을 결정하기 위하여 양측 t-검증이 이용되었다.
도 6에서 결과는 단지 소수의 항-BMP-2 항체 클론의 C2C12 세포에 면역 복합체의 결합을 증명하였다. 대조와 비교하여, p < 0.05의 유의성 수준 (*)에서 일부 항-BMP-2 항체 (pAb, C15, C18, C21, C22, C24 및 3G7)의 면역 복합체의 유의한 결합이 관찰되었다. 다른 클론, 예를 들면, C3, C6, C9, C13, C20, C26, C29는 결합을 거의 나타내지 않았다. BMP-2에 결합하는 유의미한 능력을 갖지만 BMP 수용체-양성 세포에 이의 결합을 간섭하지 않는 단지 2개의 클론은 p< 0.01 (#)에서 클론 3G7 (IgG2a)과 C22 (IgM)이었다. 흥미롭게도, 친화성 정제된 다중클론성 토끼 항-인간 BMP-2 역시 BMP-2에 결합할 수 있었고 표적 골원성 세포에 BMP 결합을 가능하게 하였다.
이들 결과 (도 6)는 대조와 비교하여, 대부분의 항체 클론은 BMP-수용체 양성 세포에 결합하는 유의미한 능력을 갖지 못한다는 것을 증명하였다. 단지 소수의 단일클론성 항체 클론만 rhBMP-2와 복합될 때, C2C12 세포와의 유의미한 결합 능력을 가졌다. 이들 결과는 일부 단일클론성 항체는 BMP-2에 결합할 수 있고 세포의 BMP-수용체에 BMP-2 결합을 가능하게 하는 반면, 다른 단일클론성 항체는 BMP-2의 그의 수용체에 결합을 방해할 수 있다는 것을 암시하였다. 이는 실험 전략에서 앞서 논의된 바와 같이, 유리한 항체 표현 및 불리한 항체 표현의 모형을 조사하는 필요성을 암시하였다 (도 2 참조). 본 발명에서는 골원성 분화를 매개하는 다양한 항체의 능력을 평가하기 위한 시험관내 분석평가를 고안하였다 (도 7과 8). 하지만, 수행된 가장 유의미한 조사는 임계 크기 두개골 결손부의 시험관내 골 재생이었다 (도 9 내지 13).
실시예 4: BMP-2 면역 복합체에 의한 골원성 분화에 대한 시험관내 분석평가, 알칼리성 포스파타아제 분석평가
용액으로부터 BMP-2를 포획하고 미분화된 골원성 세포의 골원성 분화를 매개하는 항-BMP-2 Ab의 능력을 결정하기 위한 시험관내 세포 배양 시스템이 개발되었다. BMP-2 신호전달 캐스케이드 (signaling cascade)가 단백질의 인산화를 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 포스파타아제 활성의 정량은 BMP-2 골원성 활성과 상관한다. 이러한 방식으로, 시험관내 배양 조건 하에 BMP-2 특이적 항체 면역 복합체와 함께 배양된 세포의 조골세포성 분화가 알칼리성 포스파타아제 활성 분석평가에 의해 결정되었다.
탄산염/중탄산염 용액 (0.5 mM, pH 9.5)에 희석된 항체 (25 ㎍/㎖)는 실온에서 하룻밤 배양, 그 이후에 PBS로 6회 세척에 의해 24-웰 (well) 배양 접시에서 고정되었다. 재조합 인간 BMP-2 (rhBMP-2, Medtronic, Minneapolis, MN, 100 ng/㎖)는 이후, 4℃에서 1시간 동안 배양되었다. 유리 rhBMP-2는 PBS로 6회 세척에 의해 제거되었다. 조골세포로 분화할 수 있는 잠재력을 갖는 세포주 (C2C12, MC3T3 E1 또는 hFOB 세포주)는 이후, 고정된 Ab-BMP-2 면역 복합체를 포함하는 평판에 첨가되었다. 이들 세포는 2일 동안 배양되었다. 배양액 내에서 세포의 조골세포성 분화는 알칼리성 포스파타아제 활성의 측정에 의해 결정되었다. 대조에는 항체 또는 rhBMP-2의 누락, 또는 아이소타입-정합된 항체로 특이적 Ab의 대체가 포함되었다. 양성 대조에는 용해 상태로 200 ng/㎖의 rhBMP-2가 포함되었다. 초기 용량-반응 연구는 배양 평판과 함께 배양될 때 항-BMP-2 항체의 부재에서 10 ng/㎖의 rhBMP-2가 배양 세포의 조골세포성 분화를 유도하지 못한다는 것을 증명하였다 (데이터 제시되지 않음). 이런 이유로, 10 ng/㎖의 rhBMP-2가 이들 연구에서 표준이하-골원성 농도로서 선택되었다.
C2C12 세포는 37℃에서 5% CO2 가습된 배양기에서, 페니실린, 스트렙토마이신, 그리고 10% FBS로 보충된 DMEM에 유지되었다. 세포는 낮은 혈청 조건 하에 분화에 종속되었다. C2C12 세포는 94-웰 평판에서 50 ㎕의 분화 배지 (페니실린, 스트렙토마이신, 그리고 5% FBS를 포함하는 DMEM)에서 3 x 104개 세포/웰로 도말되었다. 4일후, 각 군으로부터 알칼리성 포스파타아제 활성이 조사되었다. 간단히 말하면, 정량적 알칼리성 포스파타아제 분석평가를 위하여, 삼중 웰은 1X PBS에서 2회 세척되고 150 ㎕의 세포 용해 완충액 (cell lysis buffer) (통상적인 염수에서 0.2% Triton X-100)에서 진탕함으로써 RT에서 20분 동안 용해되었다. 부착된 세포는 옐로우 팁 (yellow tip)을 이용하여 벗겨지고 에펜도르프 튜브 (eppendorf tube)로 이전되었다. 세포 현탁액은 4℃에서 10분 동안 2,500 X g (3,726 rpm, CS-15R 원심분리기에서 S4180 회전자, BECKMAN)에서 원심분리되었다. 상층액은 새로운 에펜도르프 튜브로 이전되었다. 알칼리성 포스파타아제 활성은 pNPP-기초된 방법 (Sigma FastTM p-니트로페닐 포스페이트 정제, Sigma-Adrich)을 이용하여 측정되었다. 단백질 농도는 제조업체의 프로토콜에서 기술된 바와 같이, 단백질 분석평가 키트 (Cat. No. 500-0006, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용한 Bradford 방법에 의해 측정되었다. 효소 활성은 전체 세포 단백질에 표준화되었다.
도 7에서는 3가지 BMP-2 특이적 단일클론성 항체 및 1가지 다중클론성 항체 클론에 대한 고정된 면역 복합체의 알칼리성 포스파타아제 활성에 대한 조사 결과를 도시한다. 항체 단독 또는 10 ng/㎖의 rhBMP-2 단독은 hFOB 세포의 유의미한 골원성 분화를 유도하지 못하였다. 평판에 고정되고 BMP-2와 결합될 때, BMP-2에 특이적인 3가지 단일클론성 항체 클론 (mAb1, 클론 100221; mAb2, 클론 100230; mAb3, 클론 65529) 및 1가지 다중클론성 클론 (pAb, 친화성 정제된 염소 항-BMP-2 다중클론성 항체)은 알칼리성 포스파타아제 활성에서 증가에 의해 지시되는 바와 같이, 차후에 부착된 hFOB 세포에서 유의미한 골원성 분화를 유도하였다.
도 8에서는 C2C12 세포주, 그리고 하이브리도마 라이브러리로부터 산출된 다른 BMP-2 특이적 단일클론성 항체 (실시예 1 참조)를 이용하여, 도 7에서 도시된 것과 유사한 연구 결과를 도시한다. 배양 평판은 포화 농도의 항-BMP-2 다중클론성 (pAb) 또는 단일클론성 항체로 코팅되고, 이후 5 mg/㎖에서 BSA로 차단되었다. 이후, 100 ng/㎖의 rhBMP-2가 첨가되고, 그 이후에 유리 BMP-2를 제거하기 위한 광범위한 세척이 수행되었다. C2C12 세포가 첨가되고 2일 동안 배양되었다. 알칼리성 포스파타아제 활성 (ALP)은 앞서 기술된 바와 같이 결정되었다. 결과는 단일클론성 항체 3G7과 C22가 10 ng/㎖의 rhBMP-2 존재에서 골원성 분화를 매개할 수 있다는 것을 확증하였다. 이들 데이터는 시험관내 골원성 분화 분석평가가 AMOR을 매개할 수 있는 항체의 적격성 (suitability)을 스크리닝하기 위한 분석평가로서 이용될 수 있음을 증명하였다.
실시예 5: 생체내 골 재생: 두개골 결손부 모형
골 치유와 재생에 대한 다양한 BMP-2 항체의 효과를 결정하기 위하여, 두개골 결손부 모형 (Cowan et al., 2004)이 쥐 (도 9와 11) 또는 토끼 (도 18, 19) 둘 모두에서 활용되었다. 일반적으로, BMP-2 특이적 항체는 흡수가능 콜라겐 스펀지 (ACS)에서 고정되고, 두개골 결손부 내로 이식되고, 그리고 미세-전산화 단층촬영술, 조직 구조 및 조직형태계측 분석에 의해 골 성장에 대하여 분석평가되었다. 대조에는 채움 없음 (-), 막에 흡수된 아이소타입-정합 항체, 또는 막 단독 (콜라겐)이 포함되었다.
두개골 결손부는 무균 조건에서, 그리고 실라진과 케타민을 위한 이용한 전신 마취 하에, 8주령 쥐의 두개골 (skull)의 돔-유사 부분인 두개관 (calvaria)으로부터 골의 일부의 제거에 의해 발생되었다. 전층 피부 판 (full thickness skin flap)이 들어올려지고, 그리고 왼쪽과 오른쪽 두정골 (parietal bone)이 노출되었다. 두정골 내에 4, 6 또는 8 mm 직경 결손부는 일관성을 위하여 핸드 드릴 천공기 (hand drill trephine burr)를 이용하여 발생되었다. 이러한 절차 동안 일정한 염수 관주 (saline irrigation)가 수행되었다. 두개골 결손부의 발생 이후에, 피부는 봉합되었다. 지정된 시간 간격에서 수술 이후에, 생존 동물은 미세-전산화 단층촬영술 (μ-CT)에 의해 스캐닝되거나, 또는 두개골 결손부 영역 내에서 골 채움의 조직 외관과 정량을 결정하는 차후 조직학적 및 조직형태계측 분석을 위하여 희생되었다.
미세-전산화 단층촬영술. 생존 동물은 수술후 2, 4 또는 6주 시점에 미세-전산화 단층촬영술 (μ-CT)에 의해 스캐닝되었다. 각각의 쥐는 시료 홀더 내에 두개-미축 방향 (cranial-caudal direction)으로 배치되고, 그리고 18.676 ㎛ (Voxel dimension) 1,536 x 1,536 픽셀 매트릭스 (pixel matrcix)의 공간 해상도 (spatial resolution)에서 고해상도 마이크로-CT 시스템 (MicroCAT II, Siemens Medical Solutions Molecular Imaging, Knoxville, TN)을 이용하여 스캐닝되었다. 쥐는 스캐닝 절차 동안 이소플루란으로 전신 마취 하에 유지되었다. 스캐닝 이후, 2D 영상 데이터는 Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) 형식으로 저장되고, 컴퓨터로 이전되고, 그리고 3D 재건과 분석이 수행되었다. 계산을 위한 데이터의 크기를 감소시키기 위하여, 두개관 영역은 수확되고, 그리고 Amira 소프트웨어 (Visage Imaging, San Diego, CA)를 이용하여, 획득된 연속 마이크로단층촬영 부분 영상 (microtomographic slice image)으로부터 관심 체적 (volume of interest, VOI)으로서 저장되었다. 이러한 단계에서, 최초 공간 해상도가 유지되었는데, 그 이유는 데이터가 리샘플링 (resampling)되지 않았기 때문이다. 두개골 결손부 내에서 새로운 골의 체적은 V-Works 4.0 소프트웨어 (Cybermed Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 측정되었다. 골 조직은 전역 임계값 절차 (global thresholding procedure)를 이용하여 분할되었다. 새로운 골은 기부 (base)가 상기 결손부와 동일한 실리더형 디바이더 (cylindrical divider)를 적용함으로써 기존의 골로부터 분리되고, 그리고 체적이 계산되었다.
조직학적 분석: 두개관 표본은 4℃에서 24시간 동안 10% 중성 완충된 포르말린 (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI)으로 고정되었다. 조직은 이후, 4℃에서 2일 동안 탈회 용액 (decalcifying solution) (Richard-Allan Scientific)에서 탈회되었다. 이들 시료는 등급 알코올에서 탈수되고 파라핀에 포매 (embedding)되었다. 5 ㎛ 절편은 형태 평가를 위하여, 헤마톡실린과 에오신 (H&E), 그리고 Masson Trichrome (tri) (Sigma)으로 염색되었다.
조직형태계측: 동물의 두개골 결손부의 새로운 골은 4℃에서 등급 에탄올 (70%, 95%, 100%)에서 탈수되고, 아세톤에서 탈지되고, 그리고 액체 메틸 메타크릴레이트 단량체 (Koldmount™ Cold Mounting Liquid, Mager Scientific)에서 침투되었다. 골 시료는 이후, 메틸 메타크릴레이트 (Koldmount™ Cold Mounting Kit, Mager Scientific)에서 포매되고, 그리고 다이아몬드 칼날 (diamond wafering blade) (Mager Scientific, Dexter, MI)이 달린 저속 절단 톱 (South Bay Technology, Model 650, San Clemente, CA)을 이용하여 절단되었다. TFJ에서 1 내지 2 mm 떨어진 중간 장축 (mid-diaphysis)에서 200 ㎛ 두께 절편이 만들어지고, 손으로 으깨지고, 그리고 축축한 실리콘 카바이드 연마 디스크 (silicon carbide abrasive disc)를 이용하여 50 내지 75 ㎛의 최종 두께로 다듬어졌다. 절편은 Nikon DAPI-FITC를 이용하여 촬영되었다 - 모든 조직형태계측 분석은 표준 ASBMR 방법과 명명법을 이용하여 수행되었다.
실시예 6: 고정된 BMP-2 특이적 항체로 채워진 쥐 두개골 결손부에서 생체내 골 재생: 수술후 2주
생체내에서 AMOR을 매개하는 특정한 항-BMP-2 항체의 능력을 조사하기 위하여, 두개골 결손부 모형이 이용되었다. BMP-2 단일클론성 항체의 골원성 반응 (실시예 1에서 조사됨)은 수술후 2주 시점에, 4-6주령 쥐에서 생체내 조사되었다. BMP-2-특이적 단일클론성 항체 (실시예 1에서 기술됨) 또는 아이소타입 대조 항체 (음성 대조)는 4℃에서 하룻밤동안 배양에 의해 흡수가능 콜라겐 스펀지 (ACS)에 고정되었다. 콜라겐 막 (Biogide 또는 Collacote), 소 무기골 (bovine Inorganic bone) (BioOss) 및 마이크로비드 (Dynabeads)를 비롯한 다양한 다른 담체가 조사되었다. 4 mm 크기의 결손부가 4-6주령 쥐의 두개관에서 외과적으로 만들어지고, 이후 상기 결손부를 채우지 않음으로써, 또는 막 담체 단독으로 채움으로써 대조로서 처리되었다. 대안으로, 상기 결손부는 콜라겐 막에 고정된 4가지 실험용 BMP-2 단일클론성 항체 각각으로 채워졌다. 총 3마리의 생쥐가 이용되었다. 다양한 BMP-2 특이적 항체 (실시예 1)는 탄산염 완충액에서 4℃에서 하룻밤동안 배양에 의한 흡수가능 콜라겐 스펀지 (ACS)에서 흡수에 의해 고정되었다. 이용된 항체에는 항-BMP-2 다중클론성 Ab (pAb), 여러 mAb, 그리고 아이소타입-정합된 Ab가 포함되었다. 이들 쥐는 2주 치유 기간이 허용되었다. 두개골 결손부 영역은 μ-CT에 의해 스캐닝되고, 그리고 이들 쥐는 넴부탈의 복막내 주사로 희생되었다. 이후, 골 채움 비율을 평가하기 위하여 조직학적 검사 및 조직형태계측이 수행되었다.
도 9에서 결과 (패널 A-F)는 골형성의 생체내 검사를 위한 두개골 결손부 모형을 이용하여 BMP-2-특이적 항체의 잠재력을 조사하는, 수술후 2주 시점에 쥐에서 획득된 μ-CT 및 조직학적 데이터를 보여준다. 대조: 두개골 결손부가 채워지지 않거나 (A), 또는 막 담체 단독으로 채워졌다 (B). 실험체: 두개골 결손부가 콜라겐 막에 흡수된 다양한 BMP-2 특이적 항체로 채워졌다 (C-F). 실시예 1에서 기술된 아래의 항체가 콜라겐 막에 흡수되었다: mAb1 (C); pAb (다중클론성 항체) (D); mAb2 (E) 및 mAb3 (F). 수술후 2주 시점에, 쥐는 μ-CT에 의해 스캐닝되고, 이후 조직학적 및 조직형태계측 분석을 위하여 희생되었다.
도 9, 열 (i)에서는 μ-CT 스캔의 횡단면을 도시하고, 열 (ii)에서는 μ-CT 스캔의 관상면을 도시하고, 그리고 열 (iii)에서는 관상면 스캔 (coronal scan)의 세부를 도시하다. μ-CT 스캔에서, 방사성투과 (radiolucency) (어두운 구역)는 빈 공간을 지시하고, 반면 방사성비투과 (radioopacity) (밝은 구역)는 밀집된 조직의 존재를 지시한다.
대조의 경우에, 두개골 결손부가 채워지지 않을 때 (패널 A), 상기 결손부는 어두운 구역에 의해 확인되는 바와 같이 존속하고, 이들 임계 크기 결손부 내에서 매우 낮은 자발적인 치유를 예증하였다. 이들 결손부가 아이소타입 대조 항체 (B)를 포함하는 콜라겐으로 채워질 때, 물질의 얇은 층 (잔류 콜라겐 막)이 횡단면에 존속하고 낮은 밀도를 나타냈다. μ-CT 스캔의 관상면은 결손부가 얇게 채워져 있음을 보여준다.
도 9에서 패널 C-F의 실험은 두개골 결손부가 콜라겐 막에 고정된 BMP-2-항체로 채워질 때, 이들 모두 대조에서 획득되는 것 (패널 A-B)보다 증가된 조직 질량 (tissue mass)을 보인다는 것을 증명한다. 증가된 골 밀도는 횡단면 (열 i) 및 종축 스캔 (longtitudinal scan) (열 ii와 iii) 둘 모두에서 μ-CT 스캔의 영역에서 밀집된 채움에 의해 명백하게 관찰되었다. 이와 같이 획득된 채움은 상응하는 횡단면도에서 명백하였다. 패널 C- F에 대한 μ-CT 스캔의 관상면의 비교는 횡단면 데이터로부터 결과를 확증하였다. 최대 채움은 BMP-2 하이브리도마 mAb1과 mAb3에서 획득되었다. 이들 μ-CT 데이터는 이들 결손부가 BMP-2-고정된 콜라겐 막으로 채워질 때, 골 밀도에 대한 향상된 결과가 단지 2주간의 치유 이후에 관찰된다는 것을 증명하였다. (mAb1, 클론 100221) 및 한 가지 다중클론성 AB (pAb, 친화성 정제된 염소 항-BMP-2 다중클론성 항체).
이들 두개골 결손부의 조직학적 검사는 새로운 골의 형성에 관한 추가적인 정보를 제공하였다 (도 6, 열 iv). 대조의 경우에, 이들 데이터는 예로써, 채워지지 않은 결손부의 단지 제한된 골형성 잠재력을 증명하고, 또는 아이소타입 대조 항체-처리된 콜라겐 막으로 채워진 결손부의 경우에, 이들 데이터는 단지 제한된 골형성 잠재력을 증명하는데, 그 이유는 상기 두개골 결손부의 대부분이 연결 조직으로 채워졌기 때문이다. 다른 한편, BMP2-처리된 콜라겐 막으로 채워진 결손부는 생존 골로 채워지는 결손부의 더욱 높은 비율에 의해 지시되는 바와 같이, 증가된 골형성을 보였다. 조사된 4가지 BMP-2 특이적 항체 제조물 (mAb1, pAb, mAb2와 mAb3) 모두에서, 새로운 골의 연속 층이 결손부의 경뇌막 면 (dural side)에서 관찰되었다. 콜라겐 막은 밀집된 돼지 콜라겐 (Bio-Gide; Osteohealth, Shirley, New York)이었다. (mAb1, 클론 100221; mAb2, 클론 100230; mAab3, 클론 65529).
본 실험에 대한 조직형태계측 분석의 상응하는 결과는 도 10에 도시된다. 골 채움 비율의 측정의 결과는 도 9에서 관찰된 μ-CT 스캔 데이터를 확증하였다. 3가지 BMP-2 단일클론성 항체 (mAb1, mAb2 및 mAb3) 모두 대조보다 높은 골 채움 비율을 가졌다. pAb에 대한 골 채움 비율은 대조 값보다 약간 적었다. 본 실험에서 조사된 3가지 단일클론성 항체 중에서, BMP-2 특이적 단일클론성 항체 mAb1이 조사된 4가지 실험체의 최대 골 채움 비율을 보였다.
실시예 7: 고정된 BMP-2 특이적 항체로 채워진 쥐 두개골 결손부에서 생체내 골 재생: 수술후 2, 4와 6주
실시예 5-6에서 기술된 바와 같은 기술을 이용하여, 흡수가능 콜라겐 스펀지 (ACS; Collacote, Tutogen Medical, Zimmer Dental, Carlsbad, California)에 고정된 다른 BMP-2 특이적 항체가 쥐 두개골 결손부 내에 이식되었다. BMP-2 특이적 항체 클론에는 pAb, C3, C7, C9, C13, C21, C22, C24, 4B17 및 3G7S (실시예 1)가 포함되었다. 생존 동물은 수술후 2, 4와 6주 시점에 마이크로-CT로 스캐닝되고, 이후 6주 시점에 안락사되었다. 실시예 5-6에서 기술된 바와 같이, 두개관 표본이 수확되고, 파라핀-포매되고, 그리고 절단되었다. 헤마톡실린과 에오신 (H & E), 그리고 트리크롬 (tri)으로 조직학적 염색, 그리고 골 채움 비율로 골 재생을 평가하는 조직형태계측 분석이 수행되었다.
도 11에서는 유리한 골 재생을 매개하는 3가지의 유의하게 반응하는 단일클론성 클론 (3G7S, 4B12와 C22), 골 재생을 매개하는데 실패한 단일클론성 클론 (C13), 그리고 채워지지 않은 결손부 (-) 또는 아이소타입 정합된 항체의 대조에 대하여 획득된 μ-CT 데이터를 도시한다. 2, 4와 6주 시점에 쥐에서 클론 3G7S, 4B12, C22와 C13의 골원성 분화의 생체내 측정의 결과는 도 11A-11N에서 대조와 함께 도시된다. 대표적인 두개관 표본이 도시된다. 도 11M에서는 더욱 나은 비교를 위하여 한 페이지에 정렬된 데이터를 도시한다.
다른 BMP-2 특이적 항체가 조사될 때 (실시예 1), BMP-2 항체 클론의 골원성 반응에서 현저한 차이가 다시 한 번 관찰되었다. 결과는 다른 항체 클론보다, 콜라겐 막에 고정된 항-BMP-2 항체 (3G7S, 4B12와 C22)의 특정한 클론으로 결손부가 채워질 때 훨씬 많은 골 채움을 증명하였다. 이들 클론 각각은 대조와 비교할 때, 훨씬 많은 새로운 골 조직을 산출하였다. 다른 한편, 많은 단일클론성 항체 클론은 골질 활성을 거의 나타내지 않았다. 가령, C13 클론은 대조에서 관찰되는 것과 유사하게, 골원성 분화를 거의 나타내지 않았다.
도 12에서는 조사된 BMP-2 특이적 항체 클론에 대하여 2주, 4주와 6주의 3가지 시점에서 획득된 μ-CT 분석을 도시한다. 도 13에서는 골상 골 채움 비율의 조직형태계측 정량을 도시한다. 항체 클론 4B12, 3G7S, C21과 C22는 다른 BMP-2 특이적 항체 클론보다 더욱 많은 양의 골 밀도 및 더욱 높은 비율의 골 채움을 보였다. 클론 C3과 클론13은 대조의 것과 유사한 낮은 수준의 골 채움을 보였다.
요약하면, 골질 재생을 매개하는 최대 능력을 갖는 항체 클론에는 C3, C7, C21, C22, 3G7과 4B12가 포함되었다. 특히, 클론 C22 (IgM), 3G7 (IgG2a)과 4B12 (IgG2a)로 골 채움의 정도는 이들 실험에서 다른 BMP-2 특이적 클론을 일관되게 능가하였다. 반대로, 클론 C9, C13, C15, C18, C19, C20, C24와 C29는 생체내에서 골 재생을 증진하는데 일관되게 실패하였다.
실시예 8: BMP-2 특이적 항체에 의한 골 균질현탁액으로부터 BMP-2의 시험관내 포획
시험관내에서 특정한 항체에 의한 골로부터 BMP-2 포획의 정도가 측정되었다. 아이소타입 항체 또는 BMP-2 항체 클론 (4B12, 3G7S 또는 pAb)은 토실-활성화된 비드에 결합되었다. 기능체화된 비드는 인간 골 균질현탁액과 함께 배양되었다. 이후, 단백질이 이들 비드로부터 용리되고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 분해되고, 그리고 표지된 항-BMP-2 항체로 탐침되었다. 결과는 도 14에 도시된다. 상당한 양의 BMP-2가 비드에 부착된 BMP-2 특이적 항체에 의해 포획되었다. 레인 3 (3G7S 클론) (214.6) 대(對) 겔에 직접적으로 적하된 2 ng의 rhBMP-2 (22.5)에 대한 밀도의 정량적 측정에서, 대략 19ng의 BMP-2가 3G7S 항체 클론에 의해 골로부터 포획되는 것으로 추정되었다.
실시예 9: 면역조직화학에 의한 BMP-2와 오스테오칼신 발현의 In situ 분포
BMP-2 (도 15)와 오스테오칼신 (도 16)의 발현의 in situ 분포를 조사하기 위하여 면역조직화학 (IHC)이 이용되었다. 오스테오칼신이 조골세포에 의해 생산되는 호르몬이기 때문에, 활성 조골세포는 오스테오칼신을 발현할 것으로 예상된다. 실시예 6에 기술된 콜라겐 막에 고정된 항체로 이식된 쥐 두개골 결손부로부터 획득된 표본은 BMP-2 항원의 발현을 in situ 검출하기 위한 일차 Ab로서 항-BMP-2 다중클론성 항체로 표지되었다. 이용된 항체에는 BMP-2 특이적 단일클론성 클론 C13, 3G7S, 4B12, C21과 C22가 포함되었다. 절편은 항-BMP-2 다중클론성 항체, 그 이후에 HRP-접합된 이차 항체로 표지되었다. 유사하게, 절편은 오스테오칼신을 검출하기 위하여 표지되었다. 각 조직학적 절편에 대한 확대된 세부는 도 15-16에서 화살표로 지시된다. 도 17에서는 비교를 위하여 한 페이지에 정렬된 절편을 도시한다.
도 15A-15B에 도시된 결과는 골 재생을 매개하는 것으로 앞서 확인된 항체 클론 (3G7S, 4B12, C21과 C22)으로 이식된 부위에서 BMP-2의 발현에 대한 강렬한 염색을 증명하였다. 대조적으로, 골 재생을 일관되게 매개하지 못한 BMP-2 특이적 항체 클론 (C13)은 훨씬 적은 BMP-2 표지화를 보였다. 더욱 적은 양의 BMP-2 표지화의 유사한 결과는 유의미한 골 재생과 일관되게 무관한 다른 항체 클론 (C9, C13, C15, C18, C19, C20, C24와 C29)에서도 관찰되었다 (데이터 제시되지 않음).
조골세포성 활성의 정도를 결정하기 위하여, 유사한 시료에서 면역조직화학에 의해 오스테오칼신의 발현이 측정되었다. 결과는 도 16A-16B에 도시된다. BMP-2 발현에서처럼, 표지화의 양은 대조 및 C13 하이브리도마 클론과 비교하여, 4가지 BMP-2 특이적 항체 클론 (C21, C22, 3G7S와 4B12)에서 매우 증가하였다.
중요하게는, 뮤린 단일클론성 라이브러리에서 산출된 모든 항-BMP-2 Ab 클론 (실시예 1 참조)은 rhBMP-2에 대한 그들의 높은 친화성으로 인하여 선택되었다. 이론적으로, 이용된 모든 단일클론성 항체 클론은 생체내에서 BMP-2를 동등하게 포획해야 한다. 이런 이유로, 더욱 많은 BMP-2 표지화가 유리한 골 재생 및 오스테오칼신의 더욱 높은 발현을 나타내는 부위와 관련하여 주목된다는 사실은 일부 Ab 클론에 의해 포획된 BMP-2가 골 재생을 유발하는 반면, 다른 단일클론성 항체 클론이 골 재생에 도움이 되지 못한다는 것을 암시한다. 유의미한 골 재생이 일어나는 부위에서, 더욱 강한 조골세포성 활성의 결과로써 아마도 더욱 많은 BMP-2 검출이 나타난다.
실시예 10: 토끼 두개관 내에서 고정된 항-BMP-2 항체의 이식 이후에 생체내 골 재생: 수술후 2, 4와 6주
다른 종에서 골 재생을 매개하는 고정된 항-BMP-2 Ab의 능력을 조사하기 위하여, 쥐에서 이용된 두개골 결손부 모형 (실시예 5-7)이 6월령 토끼에서 반복되었다. 8 mm 외과 결손부가 만들어지고, 그리고 흡수가능 콜라겐 스펀지 (ACS) 단독 또는 고정된 항체로 이식되었다. 이용된 항체에는 아이소타입 정합 항체 (iso), 항-BMP-2 다중클론 Ab (pAb8) 또는 다양한 항-BMP-2 단일클론성 항체 클론이 포함되었다. 토끼는 4주 시점에 안락사되고, 그리고 두개관이 수확되었다. 표본은 μ-CT로 스캐닝되고, 그 이후에 H&E 및 트리크롬으로 조직학적 염색이 수행되었다. 조직형태계측이 수행되었다. 아이소타입-정합된 항체에 상대적인 t-검증은 유의성 p< 0.005 (*)를 지시하였다.
고정된 BMP-2 특이적 항체로 채워진 토끼 두개관에서 골 재생의 결과는 도 18-19에 도시된다. 도 18에서는 아이소타입 정합된 항체 대조와 비교하여, 2가지 BMP-2 특이적 항체 클론 (C20과 C22) 중에서 어느 한쪽이 고정된 콜라겐 막으로 채워진 두개골 결손부의 μ-CT 스캔의 횡단면 (도 18A)과 관상면 (도 18B)을 도시한다. 한정된 골 채움이 클론 C20 및 아이소타입 대조에 대한 토끼 두개골 결손부에서 관찰되었다. 대안으로, 클론 C22는 횡단면과 관상면 스캔 둘 모두에서 골 채움의 현저한 증가를 보였다.
도 19에서는 상응하는 조직학적 검사를 도시한다. 골 조직 질량에서 이러한 증가는 C22 클론의 경우에 명백하지만, 대조 또는 C21 단일클론성 항체 클론의 경우에 명백하지 않다.
도 20에서는 토끼 두개골 결손부에서 다양한 항체 클론과 대조에 의해 획득된 골 채움 비율의 조직형태계측 분석을 도시한다. 토끼에서 조사된 단일클론성 항체 클론 중에서, 클론 C22와 3G7S는 두개골 결손부에서 성공적인 골 재생을 산출하는 유의미한 능력을 보였다 (p< 0.005). 반대로, 클론 C9, C13, C15, C18, C19, C20, C24와 C29는 생체내에서 골 재생을 증진하는데 여전히 실패하였다.
실시예 11: 헤파린 에피토프를 보유하는 BMP-2 특이적 항체의 농축
BMP-2 분자는 헤파린-결합 도메인 (HBD), 그리고 손목 (wrist)과 손가락 마디 (knuckle) 도메인을 보유한다 (도 4) (S. Daopin, K. A. Piez, Y. Ogawa, and D. R. Davies, Crystal structure of transforming growth factor-beta 2; an unusual fold for the superfamly. Science, Vol. 257, Issue 5068, 369-373). 손목과 손가락 마디 도메인은 각각, 수용체 BMP-R1과 BMP-R2의 연동 (engagement)을 담당하는 것으로 생각된다. HBD는 BMP-2 수용체에 대한 결합에 관련되는 것으로 보이지 않고, 그리고 헤파린에 결합된 BMP-2는 더욱 높은 생물학적 활성을 갖는 것으로 보인다 (Zhao et al., J. Biol. Chem. 281: 23246-23253, 2006). 이런 이유로, 다양한 BMP 에피토프에 대한 특이성을 갖는 면역글로불린을 비롯한 다중클론 항-BMP 항체가 헤파린 황산염에 결합된 BMP-2를 포함하는 친화성 칼럼에 통과되면, HBD 이외의 모든 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항-BMP-2 항체는 제거될 수 있는 것으로 판단되었다. BMP-2: 헤파린 칼럼으로부터 BMP-2 항체를 분리함으로써, BMP가 헤파린에 결합되는 동안 공간적으로 방해되는 HBD 또는 에피토프에 특이적인 항체에 대한 농축이 있어야 한다.
BMP-2는 먼저, 헤파린 황산염 칼럼에 결합되고, 이후 다중클론성 항체 (클론 pAb) (실시예 1)가 상기 칼럼에 통과되었다. 결과의 헤파린-흡수된 pAb는 이후, 상기 칼럼을 세척함으로써 제거되었다. 항체 분획물 (AB-pAb)은 실시예 5-7에서 기술된 바와 같이, 쥐 두개관 모형에서 조사되었다. 시료에는 콜라겐 단독(콜라겐)으로 또는 콜라겐 막에 고정된 아이소타입 정합된 항체 (콜라겐-아이소타입)로 채워진 결손부의 대조, 헤파린-황산염 칼럼에 배치되지 않은 흡수된 다중클론성 항체 (pAb)를 포함하는 콜라겐 막, 그리고 BMP-2: 헤파린 황산염 칼럼으로부터 용리된 헤파린-농축된 항체 (AB-pAb)가 포함되었다. 마이크로-CT 스캔이 2주와 4주 시점에 실시되었다. 4주 시점에, 동물은 희생되고, 그리고 조직학적 검사 및 조직형태계측 분석이 수행되었다.
BMP-2 항체 결합의 헤파린 에피토프 농축에 대한 결과는 도 21 및 도 22에 도시된다. 2주와 4주 시점에, pAb 클론으로 채워진 쥐 두개골 결손부 (도 21A와 C)로부터 획득된 μ-CT 스캔의 비교 변화는 헤파린 결합 농축을 보이는 다중클론성 항체로 채워진 결손부 (도 21B와 21D)보다 덜하였다. 4주 시점에, HBD 에피토프에 대하여 농축된 다중클론 항-BMP2 항체 (도 21D)는 pAb 클론 또는 대조와 비교하여, 현저하게 증가된 골 재생 생물학적 활성을 보였다. 이들 결과는 콜라겐 스펀지에 고정될 때, 헤파린-농축된 다중클론성 항체가 거의 완전한 두개골 결손부 채움을 결과할 수 있다는 것을 증명하였다.
도 21E에서는 본 연구에서 재생된 골 체적의 조직형태계측 정량을 도시한다. 헤파린-농축된 pAb 항체 분획물은 pAb 클론 또는 대조 (콜라겐)보다 더욱 많은 골 채움을 나타냈다. 도 22에서는 대조 및 실험용 시료에서 획득된 조직학적 염색을 도시한다. pAb가 2가지 대조 (콜라겐) 및 (아이소타입 지배된 항체) 중에서 어느 한쪽보다 큰 골 재생을 나타내긴 하지만, 헤파린-흡수된 pAb 클론은 증가된 체적과 밀도의 조직 질량 및 세포 수, 그리고 새로운 골 형성에 의해 지시되는 바와 같이, 골 재생에서 현저한 증가를 보였다.
실시예 12. 토끼 경골 내에서 치과 이식물 주변에 골형성.
BMP-2-특이적 단일클론성 항체 또는 아이소타입 대조 단일클론성 항체는 치과 이식물 (플루오르화물-변형된 표면을 보유하는 Astratech 3.5 x 8.0 mm 치과 이식물)에 흡착되었다. 항체-처리된 이식물은 토끼의 경골에 외과적으로 삽입되고 2-6주 동안 치유되도록 허용되었다. 치유 휴지기 (healing interval) 이후, 동물은 희생되고, 그리고 경골이 회수되었다. 이식물 중에서 일부는 주사 전자 검경 (scanning electron microscopy, SEM)을 위하여 이전되었다 (도 23). 경골 포함 이식물은 μ-CT로 촬영되었다. 경골 포함 이식물의 블록은 또한, 조직학적 검사에 종속되었다.
도 23에서 결과는 아이소타입 대조 단일클론성 항체로 코팅된 이식물 (음성 대조, A, C, E) 및 BMP-2-특이적 단일클론성 항체 (mAb1, 클론 100221)로 코팅된 이식물 (실험체, B, D, F) (클론 100221, R&D Systems; www.rndsystems.com)의 SEM 영상을 보여준다. 상기 실험용 이식물은 큰 섬조 구역 (macro-thread area) 뿐만 아니라 작은 섬조 구역 (micro-thread area) 내에서 더욱 높은 층의 부착 세포를 보였다.
도 24에서 이러한 μ-CT 데이터는 대조 (A)와 비교하여, 실험용 이식물 섬조 (B) 주변에 더욱 높은 골밀도를 증명하였다. 패널 C에서 막대그래프에서 확인되는 바와 같이, Houndsfield 단위로 섬조 주변에 밀도의 정량은 대조와 비교하여, BMP-2 특이적 단일클론성 항체로 코팅된 이식물의 큰 섬조 주변에 훨씬 높은 골 밀도를 증명하였다 (p < 0.05).
도 25에서 확인되는 바와 같이, 토끼 경골 이식물의 조직학적 결과 역시 대조와 비교하여, BMP-2 특이적 단일클론성 항체로 코팅된 이식물의 섬조 사이에서 증가된 골 재생을 증명하였다. 골-이식물 접촉면적 (bone-to-implant contact area) 역시 대조에서보다 실험용 이식물에서 더욱 큰 것으로 나타났다. 이들 관찰 결과는 작은 섬조 구역 및 큰 섬조 구역 둘 모두에서 만들어졌다.
앞서 언급된 바와 같이, 골유착 과정이 치유를 증진할 때 다양한 의료용 이식물이 이용된다. 이들 이식물에는 특히, 치과 이식물, 두개안면 구조, 그리고 골과 관절 대체 성분을 비롯하여, 골 구조를 대체하거나 지지하기 위하여 신체의 골격 구조와 맞물리도록 설계된 다양한 생물적합성 구조가 포함된다. 의료용 이식물은 티타늄, 티타늄 합금, 스테인리스, 코발트 크롬 합금과 무정형 합금, 그리고 PEEK, UHMWPE와 같은 복합물과 중합체를 포함하는 합성물질을 비롯한 넓은 선택 범위의 생물적합성 물질로 만들어지고, 그리고 내생적 골, 외피, 망상 조직, 동종 이식편, 자가 이식편, 이종 이식편, 또는 탈염된 또는 부분적으로 탈염된 골과 같은 물질을 포함할 수 있다.

Claims (21)

  1. 호스트 내에서 골 재생 (bone regeneration)의 매개를 위한 제약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 골 형태형성 단백질 (bone morphogenetic protein) 2 (BMP-2) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하고,
    여기서 상기 항체는 BMP-2 수용체-결합 도메인으로부터 격리된 에피토프에 결합하고, 그리고
    여기서 상기 항체 BMP-2 복합체는 골원성 분화를 매개하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 BMP-2 복합체는 신호 전달 (signal transduction)에 의한 골원성 분화 (osteogenic differentiation)를 매개하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 골전구 세포 (osteoprogenitor cell) 상에서 BMP 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 항체와 내생적 BMP-2의 복합체는 골전구 세포 상에서 BMP 수용체에 결합하고 골 형성 (bone formation)을 향상시키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 세포를 둘러싸는 내생적 BMP-2 단백질의 이용도 (availability)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 단일클론성 항체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 다중클론성 항체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 항체는 단일클론성 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  9. 내생적 골 형태형성 단백질 2 (BMP-2)의 에피토프에 대한 결합 친화성 (binding affinity)을 포함하는 특성을 갖는 골 재생의 매개를 위한 항체에 있어서, 상기 항체와 내생적 BMP-2의 복합체는 골유착 (osseointegration) 또는 골형성 (osteogenesis)에 관련된 골의 형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 항체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 항체는 BMP-2 수용체 결합 도메인으로부터 멀리 떨어진 BMP-2 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 항체의 결합은 세포내 신호를 전달하는 것을 특징으로 하는 항체.
  12. 청구항 9에 있어서, 불변 영역의 적어도 일부분이 인간화되는 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 청구항 9에 있어서, 중쇄 영역의 적어도 일부분이 인간화되는 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 청구항 9에 있어서, 완전 인간인 것을 특징으로 하는 항체.
  15. 신체의 골격 구조와 맞물리도록 순응되는 생물적합성 이식물 구조; 그리고
    상기 이식물 구조 상에 코팅된 항체를 포함하는 의료용 이식물 (medical implant),
    여기서 상기 항체는 골 형태형성 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하고 골원성 분화를 매개한다.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항체는 합성 링커로 이식물 상에 코팅되는 것을 특징으로 하는 의료용 이식물.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 항체는 흡착에 의해 이식물 구조 상에 코팅되는 것을 특징으로 하는 의료용 이식물.
  18. 청구항 15에 있어서, 항체 BMP-2 복합체가 신호 전달에 의한 골원성 분화를 매개하는 것을 특징으로 하는 의료용 이식물.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 항체는 골전구 세포 상에서 BMP-2 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 의료용 이식물.
  20. 청구항 18에 있어서, 항체 BMP-2 복합체가 골 형성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 의료용 이식물.
  21. 청구항 15에 있어서, 상기 항체는 세포를 둘러싸는 내생적 BMP-2 단백질의 이용도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 의료용 이식물.
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