CN105873609B - 葡萄球菌感染的被动免疫 - Google Patents

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Abstract

本文公开特异性结合至葡萄球菌属自溶素N‑乙酰胞壁酰‑L‑丙氨酸酰胺酶催化结构域和/或细胞壁结合结构域的单克隆抗体或其结合部分，以及含有所述抗体或其结合部分的药物组合物。还公开表达所述单克隆抗体的细胞系，包括杂交瘤。描述使用所述单克隆抗体来安装矫形植入物、移植物或医疗装置，治疗或预防葡萄球菌感染，和治疗骨髓炎的方法，并且描述检测样品中的葡萄球菌的诊断方法。

Description

葡萄球菌感染的被动免疫
本申请要求2013年12月13日提交的美国临时专利申请序列号61/915,953的优先权权益，所述申请全部以引用方式并入本文。
使用领域
本文公开用于针对葡萄球菌感染的被动免疫，尤其预防或治疗骨髓炎和由于植入医疗装置，或矫形植入物或移植物引起的感染的方法和组合物。特异性结合至葡萄球菌属自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶催化结构域和/或细胞壁结合结构域的抗体，和含有所述抗体的药物组合物可用于这些用途。
背景
存在对于慢性骨髓炎(OM)的新干预措施的极大需求，因为在美国每年发生大约112,000例矫形装置相关感染，每个感染事件的医院成本大概为$15,000-70,000(Darouiche,“Treatment of Infections Associated With Surgical Implants,”N.Engl.J.Med.350(14):1422-9(2004))。虽然外科技术和积极抗生素预防的改进将矫形植入物手术之后的感染率降低至1-5％，但是骨髓炎(OM)仍然是严重问题并且似乎由于微创手术而出现上升势头(Mahomed等人,“Rates and Outcomes of Primary and RevisionTotal Hip Replacement in the United States Medicare Population,”J.Bone JointSurg.Am.85(A-1):27-32(2003)；WHO Global Strategy for Containment ofAntimicrobial Resistance,2001)。骨髓炎再次激增的80％是由金黄色葡萄球菌造成的，这一现象的重要性由于以下事实而增加：～50％的临床分离物是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。虽然在最近十年间，关节假体和骨折固定装置的感染率仅分别占病例的0.3-11％和5-15％(Lew和Waldvogel,“Osteomyelitis,”Lancet 364(9431):369-79(2004)；Toms等人,“The Management of Peri-Prosthetic Infection in Total JointArthroplasty,”J.Bone Joint Surg.Br.88(2):149-55(2006))，但是此结果可导致截肢或死亡。另外，在选任的全关节置换(TJR)的“微创手术”中，极小切口经常导致由于假体在植入期间接触皮肤而引起并发症，这种微创手术的普及化显著地增加OM的发病率(Mahomed等人,“Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in theUnited States Medicare Population,”J.Bone Joint Surg.Am.85(A-1):27-32(2003)；WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance,2001)。这些感染需要极高代价的两阶段翻修手术，并且最近的报告表明成功率可低至50％(Azzam等人,“Outcome of a Second Two-stage Reimplantation for Periprosthetic KneeInfection,”Clin.Orthop.Relat.Res.467(7):1706-14(2009))。然而，最大的问题是出现药物抗性葡萄球菌菌株，最显著地MRSA，它已经超越HIV成为北美洲最致命的病原体，并且继续使慢性OM的控制变得更加困难和高代价，导致对于治疗患有这些感染的患者的新治疗干预措施的极大需求。存在对于替代干预策略的极大需求，尤其对于作为TJR的主要接受者的免疫受损老年人来说更是如此。
目前，不存在可保护高风险患者免遭MRSA的预防性疗法，最显著地是占每年在美国进行的150万TJR中的大多数的逐渐衰老的“在婴儿潮时期出生的人”。降低MRSA发病率50-80％的疫苗将不仅减少关节置换和开放骨折修复程序的头号并发症，而且在类似的程度上削减医疗保健负担。
研究证明80％的慢性OM由金黄色葡萄球菌导致。这些细菌含有使得它们成为骨骼病原体的若干因素，包括促进其结合至骨骼基质的若干细胞表面粘附分子(Flock等人,“Cloning and Expression of the Gene for a Fibronectin-Binding Protein fromStaphylococcus aureus,”EMBO J.6(8):2351-7(1987))、能够刺激骨骼再吸收的毒素(Nair等人,“Surface-Associated Proteins from Staphylococcus aureus DemonstratePotent Bone Resorbing Activity,”J.Bone Miner.Res.10(5):726-34(1995))，以及通过刺激破骨细胞活性增加而使骨骼降解(Marriott等人,“Osteoblasts Express theInflammatory Cytokine Interleu kin-6 in a Murine Model of Staphylococcusaureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue,”Am.J.Pathol.164(4):1399-406(2004))。感染进展和持续的速率限制步骤是在植入装置周围形成生物膜(Costerton等人,“Bacterial Biofilms:A Common Cause of Persistent Infections,”Science 284(5418):1318-22(1999))。在植入之后不久，由来源于宿主的细胞外基质组分(包括纤维蛋白原、纤连蛋白和胶原蛋白)组成的调节层在植入物的表面上形成并且引起来源于血行性传染的自由漂浮细菌或来自以下来源的细菌的粘附：邻近感染病灶诸如伤口附近皮肤、在手术过程中细菌在骨骼中的接种，或与相关联软组织骨骼壳层的显著破坏一致的外伤(Darouiche,“Treatment of Infecti ons Associated With Surgical Implants,”N.Engl.J.Med.350(14):1422-9(2004))。在随后几天，增加的菌落粘附、细菌细胞分裂、募集额外浮游生物体和分泌细菌细胞外聚合物(诸如形成糖萼的聚合物)产生细菌生物膜。此生物膜充当保护细菌免于抗生素、吞噬细胞和抗体作用的主要屏障并且削弱宿主淋巴细胞功能(Gray等人,“Effect of Extracellular Slime Substance from Staphylococcusepidermidis on the Human Cellular Immune Response,”Lancet 1(8373):365-7(1984)；Johnson等人,“Interference with Granulocyte Function by Staphy lococcusepidermidis Slime,”Infect.Immun.54(1):13-20(1986)；Naylor等人,“AntibioticResistance of Biomaterial-Adherent Coagulase-Negative and Coagulase-PositiveStaphylococci,”Clin.Orthop.Relat.Res.261:126-33(1990))。
另一个最近发现是金黄色葡萄球菌不仅移居骨骼基质，而且由成骨细胞在体外(Ellington等人,“Involvement of Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways inStaphylococcus aureus Invasion of Normal Osteoblasts,”Infect.Immun.69(9):5235-42(2001))和体内(Reilly等人,“In Vivo Internalization of Staphylococcusaureus by Embryonic Chick Osteoblasts,”Bone 26(1):63-70(2000))内在化。这提供另一层的抗体和抗生素抗性。此阶段的感染在代谢活动显著减少的状况下发生并且有时以所谓小菌落变体形式出现，这些变体可能造成其持续性(Proctor等人,“Persistent andRelapsing Infections Associated with Small-Colony Variants of Staphylococcusaureus,”Clin.Infect.Dis.20(1):95-102(1995))。在此时点，细菌还可表达对于抗菌剂治疗的表型抗性，这也为短治疗过程的较高失效率提供原因(Chuard等人,“Resistance ofStaphylococcus aureus Recovered From Infected Foreign Body in Vivo to Killingby Antimicrobials,”J.Infect.Dis.163(6):1369-73(1991))。由于这些广泛发病机理，众所周知OM往往甚至在被遏制几年之后也会复发，并且通常认为最终完全治愈是不可能的(Mader和Calhoun,“Long-Bone Osteomyelitis Diagnosis and Management,”Hosp.Pract.(Off Ed)29(10):71-6,9,83多处(1994))。
慢性OM领域中的一个关键问题是为什么当前对于调控慢性OM的因素的了解如此有限。按照推测，阐明细菌致病基因所需要的实验工具一个多世纪以来已经为人所利用。对于此不正常情况，存在三种解释。首先，虽然骨髓炎病例的总数较高，但是对于严格前瞻性临床研究来说，其1-5％的发病率太低，并且有可能不需要翻修关节成形术。其次，熟知体外培养物迅速地对于不获取细胞外包膜的生物体的生长作出有利的选择，以使得生物膜生物学只可使用体内模型来研究(Costerton等人,“Bacterial Biofilms:A Common Cause ofPersistent Infections,”Science 284(5418):1318-22(1999))。这导致此领域中的“最大障碍，”即不存在可评估在生物膜形成之前的细菌初始浮游生长阶段的定量动物模型。迄今为止，其致病原因的很多知识来自动物模型(Norden,“Lessons Learned from AnimalModels of Osteomyelitis,”Rev.Infect.Dis.10(1):103-10(1988))，所述模型针对鸡(Daum等人,“A Model of Staphylococcus aureus Bacteremia,Septic Arthritis,andOsteomyelitis in Chickens,”J.Orthop.Res.8(6):804-13(1990))、大鼠(Rissing等人,“Model of Experimental Chronic Osteomyelitis in Rats,”Infect.Immun.47(3):581-6(1985))、豚鼠(Passl等人,“A Model of Experimental Post-Traumatic Osteomyelitisin Guinea Pigs,”J.Trauma 24(4):323-6(1984))、兔(Worlock等人,“AnExperimentalModel of Post-Traumatic Osteomyelitis in Rabbits,”Br.J.Exp.Pathol.69(2):235-44(1988))、犬(Varshney等人,“Experimental Model ofStaphylococcal Osteomyelitis in Dogs,”Indian J.Exp.Biol.27(9):816-9(1989))、绵羊(Kaarsemaker等人,“New Model for Chronic Osteomyelitis With Staphylococcusaureus in Sheep,”Clin.Orthop.Relat.Res.339:246-52(1997))和最近小鼠(Marriott等人,“Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleukin-6in a MurineModel of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue,”Am.J.Pathol.164(4):1399-406(2004))来开发。虽然这些模型用于证实从体外测定中识别的细菌粘附素的重要性(Chuard等人,“Susceptibility of Staphylococcus aureusGrowing on Fibronectin-Coated Surfaces to Bactericidal Antibiotics,”Antimicrob.Agents Chemo ther.37(4):625-32(1993)；Buxton等人,“Binding of aStaphylococcus aureus Bone Pathogen to Type I Collagen,”Microb.Pathog.8(6):441-8(1990)；Switalski等人,“A Collagen Receptor on Staphylococcus aureusStrains Isolated From Patients With Septic Arthritis Mediates Adhesion toCartilage,”Mol.Microbiol.7(1):99-107(1993))，但是其不具有体内生长、细菌负载或骨质溶解的结果量度。因此，其不能有效地用于评估药物效果、细菌突变体，和使用转基因小鼠的宿主因子的作用。
基于超过150年的研究，解释葡萄球菌致病原因的清楚范式已经出现。此模型也适用于OM。初始感染步骤在单细胞细菌侵入身体时发生。在此时点，微生物必须对于环境变化作出响应并且表达帮助它战胜先天性免疫并且为它提供连接至宿主的粘附素受体的致病基因。为了使粘附和表面移生能够发生，细菌还依赖于来自坏死组织或外来物体诸如植入物的宿主粘附目标的随机可获得性。这些步骤的成功完成导致指数生物膜生长阶段，所述阶段在营养物耗尽和/或显现适应性免疫的时点处停止。在指数生长阶段之后，细菌在多层生物膜内、在隐匿生长条件下继续存在直到群体感测驱动的基因表达变化允许生物膜的一部分分离为浮游细胞或生物膜斑片的移动片段为止(Yarwood等人,“Quorum Sensing inStaphylococcus aureus Biofilms,”J.Bact.186(6):1838–1850(2004))。然而，在此时点，感染现在是慢性的并且不能通过药物或宿主免疫来根除。因此，此领域的焦点在于细胞表面细胞外基质组分，所述组分与被称为MSCRAMM(识别粘附基质分子的微生物表面组分)的一类细菌粘附素特异性相互作用(Patti等人,“MSCRAMM-Mediated Adherence ofMicroorganisms to Host Tissues,”Annu.Rev.Microbiol.48:585-617(1994))。事实上，迄今为止开发的基本上所有抗金黄色葡萄球菌疫苗一直针对对于宿主组织移生和侵入至关重要的MSCRAMM。这些疫苗的目标是产生抗体，所述抗体结合至这些细菌表面抗原，从而抑制其连接至宿主组织并且抑制充当长期感染储槽的生物膜的形成。通过调理细菌表面，这些抗体也可介导通过吞噬细胞来实现的金黄色葡萄球菌清除。遗憾的是，金黄色葡萄球菌具有许多粘附素，以使得抑制一或多种可能不足以防止细菌连接。此外，通过吞噬细胞的细菌清除可在无血管组织诸如骨骼中受到限制以使得单独抗体可能需要额外抗微生物作用机制以显著减少金黄色葡萄球菌的体内浮游生长并且防止慢性OM的确立或翻修全关节置换手术期间的再感染。
虽然Schwarz等人的PCT公布号WO2011/140114和WO2013/066876描述特异性结合至葡萄球菌氨基葡萄糖苷酶并且抑制葡萄球菌菌株的体内生长的多种单克隆抗体(以下“mAb”)，但是仍然需要识别特异性结合至不同葡萄球菌目标并且抑制其功能的额外mAb。
本发明旨在克服本领域中的这些和其它不足。
发明概述
第一方面涉及特异性结合至葡萄球菌属自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶催化结构域或细胞壁结合结构域的单克隆抗体或其结合部分。
第二方面涉及表达如本文公开的单克隆抗体或其结合部分的细胞系。
第三方面涉及包括载体和如本文公开的一或多种单克隆抗体或单克隆抗体结合部分的药物组合物。
第四方面涉及将矫形植入物或医疗装置引入患者的方法，涉及向需要矫形植入物的患者施用有效量的根据如本文公开的第一方面的单克隆抗体或单克隆抗体结合部分、根据如本文公开的第三方面的药物组合物或其组合，并且将矫形植入物、组织移植物或医疗装置引入患者。
第五方面涉及治疗或预防葡萄球菌感染的方法，包括向易患或患有葡萄球菌感染的患者施用有效量的根据如本文公开的第一方面的单克隆抗体或单克隆抗体结合部分、根据如本文公开的第三方面的药物组合物或其组合。
第六方面涉及治疗骨髓炎的方法，涉及向患有葡萄球菌骨骼或关节感染的患者施用有效量的根据如本文公开的第一方面的单克隆抗体或单克隆抗体结合部分、根据如本文公开的第三方面的药物组合物或其组合。
第七方面涉及确定样品中的葡萄球菌的存在的方法，涉及将样品暴露于根据如本文公开的第一方面的单克隆抗体或结合部分，并且检测是否在单克隆抗体或结合部分与存在于样品中的葡萄球菌或葡萄球菌酰胺酶之间形成免疫复合物，由此所述暴露之后的免疫复合物的存在指示样品中的葡萄球菌的存在。
葡萄球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(以下“Amd”或“酰胺酶”)具有使它成为被动免疫的有吸引力的目标的多种性质。酰胺酶涉及多种关键细胞功能，包括细菌细胞粘附、细胞分裂、经由其介导产生糖萼细胞外DNA的自溶作用来分泌和生物膜糖萼形成；它在金黄色葡萄球菌临床分离物之间是高度保守的；它是万古霉素的目标并且它在整个细胞周期中表达。此外，因为Amd展示于细胞壁上，所以它可被存在于细胞外环境中的抗体接近。
单克隆抗体和其结合部分，以及含有所述抗体或其结合部分的药物组合物是适合于在患有葡萄球菌菌株感染或处于所述感染风险中的患者中进行免疫疗法的治疗剂。这些单克隆抗体的能力来自于其阻碍葡萄球菌菌株的生长、粘附和免疫逃避的多种活性。首先，作为抗体，其在初始葡萄球菌感染位点处促进嗜中性白细胞的噬菌作用。其次，作为葡萄球菌酰胺酶，一种在葡萄球菌存活和表面移生中具有多种作用的酶的抑制剂，这些抗体潜在地阻碍细胞分裂和生物膜形成中的一个或两个。最后，如在本文中展示，所公开的抗体减少葡萄球菌扩散，如形成较少脓肿所证明，并且提供脓肿的巨噬细胞侵入，促进形成无菌脓肿并且加速骨骼愈合。
附图简述
图1是代表所有葡萄球菌属双功能自溶素蛋白质的金黄色葡萄球菌双功能自溶素(AtlA)的结构域结构的示意图。双功能自溶素作为1276氨基酸前酶原来合成。31-氨基酸信号肽(aa 1-31)在分泌期间移除并且167-氨基酸前肽(aa 32-197)在自溶素插入细胞壁中时移除。细胞分裂之后，成熟自溶素在氨基酸775处裂解以产生独立AmdR1R2(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，或酰胺酶(Amd)；aa198-775)和R3Gmd(内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Gmd)；aa776-1276)。
图2是展示八种抗Amd单克隆抗体和具有不相关特异性的同种型匹配抗体抑制Amd酶活性的图表。重组Amd(rAmd)在大肠杆菌中制备(表1中的His-AmdR1R2-B)。rAmd(1.5μg/mL)在PBS中与从金黄色葡萄球菌细胞壁制备的肽聚糖的混浊悬浮液混合并且其溶解活性在37℃下孵育60分钟(Δ60)之后通过混浊度(测量为A490)的减少来测量。对于抑制测试，rAmd的浓度足以减少A490达70％。将纯化抗Amd mAb在指示浓度下添加至rAmd，然后测量肽聚糖通过Mab:rAmd混合物的溶解。抑制百分比计算为：100x(1-(Δ60A490抑制剂/Δ60A490无抑制剂对照))。
图3是通过代表性抗Amd抗体的金黄色葡萄球菌沉淀的图像。当金黄色葡萄球菌细胞在最具有葡萄球菌特异性的mAb存在下培养时，其形成较大集群，所述集群从悬浮液中沉降以产生相对透明上清液。在各自25μg/mL的所指示抗Amd mAb存在下，USA300LAC金黄色葡萄球菌在37℃下在TSB中培养八小时。不含有抗体(无Ab)并且具有不相关同种型匹配抗体(同种型对照)的样品具有混浊上清液而没有明显细胞球团；mAb Amd1.1、Amd1.6、Amd1.8、Amd1.11和Amd1.16具有透明上清液和细胞球团。产生透明上清液和细胞球团的其他mAb与未能使金黄色葡萄球菌从悬浮液中沉淀的mAb一样在以下表2中列出。
图4示出固定mAb Amd1.6与可溶性Amd的生物分子相互作用分析。mAb Amd1.6与可溶性Amd之间的相互作用的亲和力在Biacore T-200上测量。将兔抗小鼠Fc IgG固定于CM-5生物传感器芯片表面上并且用于捕获mAb Amd1.6，其然后捕获来自流动场的Amd。由mAbAmd1.6结合的Amd的质量相对于x轴上的时间以共振单位(y轴)来测量。呈现捕获(缔合，t＝0至120sec)和释放(解离，t＝120至420sec)阶段。使用以两倍增量从1.56至25nM变化的Amd的浓度来重复实验。测量根据制造商说明书来进行并且动力学数据使用来自Biacore AB的生物分子相互作用分析(BIA)评估软件(版本3.1)来分析。
图5是示出如与Amd、Gmd和自溶素缺失突变体菌株相比，抗Amd抗体对于体外生物膜形成的抑制效应的图表。使用卡尔加里板的生物膜测定通过在4℃下将板和盖销用人血浆涂布16小时来进行。然后在存在或不存在25μg/mL抗Amd(Amd1.6)，抗Gmd(1C11)和抗Amd+抗Gmd(Amd1.6+1C11)mAb的组合的情况下，金黄色葡萄球菌在0.05的OD 600nm下接种。在37℃下允许生物膜形成24小时。冲刷之后，生物膜用结晶紫染色并且生物膜内含物通过595nm下的分光光度测定法来测量。作为生物膜抑制的阳性对照，酰胺酶(Δamd)、氨基葡萄糖苷酶(Δgmd)或自溶素(Δatl)的UAMS-1缺陷菌株在相同OD下接种。结果以作为野生型(WT)，未处理的UAMS-1培养物(A)的百分比的生物膜形成(即，结晶紫染色)的量来报告；*与WT相比，p<0.05。
图6A-E示出如与自溶素缺陷相比，使用抗Amd单克隆抗体和抗Amd与抗Gmd单克隆抗体的组合的被动免疫对于体内植入物上的生物膜形成的效应。六至十周龄、雌性Balb/c小鼠(n≥3)用40mg/kg剂量的抗Amd(Amd1.6)、抗Amd与抗Gmd的组合(Amd1.6+1C11)或IgG同种型匹配对照mAb来腹膜内被动免疫。一天后，每个小鼠使用以USA300LAC CA-MRSA菌株或其同基因Δatl突变体污染的经胫骨不锈钢销钉来感染。销钉保持在适当位置以允许基于生物膜的感染变成熟。感染后第14天，将销钉移除并且通过扫描电子显微术(SEM)来检查。示出展示感染植入物(销钉)上的生物膜形成程度的代表性显微照片：IgG对照(图6A)；抗Amd(Amd1.6，图6B)；抗Amd+抗Gmd(Amd1.6+1C11，图6C)；和用Δatl突变体感染(图6D)。以生物膜覆盖的所关注区域(扁平销钉的0.5x2.0mm端面)的百分比使用NIH软件(图像J)来量化并且展示于图6E中；*p≤0.05。
图7A-C示出用抗Amd、抗Gmd和抗Amd与抗Gmd单克隆抗体的组合的被动免疫对于减少骨骼破坏量的效应。雌性Balb/c小鼠(n＝5)用PBS或40mg/kg剂量的抗Gmd(1C11)、抗Amd(1.6)或组合(1C11+1.6)来腹膜内被动免疫，如前所述(Varrone等人,“PassiveImmunization With Anti-Glucosaminidase Monoclonal Antibodies Protects MiceFrom Implant-Associated Osteomyelitis by Mediating Opsonophagocytosis ofStaphylococcus aureus Megaclusters,”J Orthop Res 32(10):1389-96(2014)，其全部以引用方式并入本文)。二十四小时后，所有小鼠接收用USA300LAC::lux污染的经胫骨销钉，并且生物发光成像在第3天进行以证实感染(图7A)。小鼠在感染之后14天安乐死，并且将胫骨收获用于微观CT分析。示出来自内侧和外侧的感染胫骨的代表性3D效果图(图7B)以例示每一组(B)胫骨中的骨质溶解的相对水平。每个胫骨中的骨质溶解体积使用下式来量化：骨质溶解体积(mm3)＝[内侧骨质溶解面积+外侧骨质溶解面积(mm2)]X皮质厚度(mm)(*相比于PBS，p<0.05)。结果在图7C中图形化示出。
图8A-C示出使用Amd1.6被动免疫的效应，其示出显著减少细菌扩散，如在骨髓管中形成较少脓肿所证明。6-10周龄、雌性Balb/c小鼠(n＝5)用40mg/kg总剂量的PBS(阴性对照)、抗Gmd mAb 1C11、抗Amd mAb Amd1.6或组合(1C11+Amd1.6)来腹膜内免疫。二十四小时后，每个小鼠在其右胫骨中插入用USA300LAC::lux，一种生物发光CA-MRSA菌株污染的销钉。允许所得感染发展十四天，此时将动物处死并且将感染胫骨收获、固定、脱钙并且切片供组织学分析。对于(图8A)未处理的对照和(图8B)用抗Gmd 1C11与抗Amd Amd1.6的组合处理的小鼠，描绘用橙黄G/阿尔新蓝(ABG/OH)染色的代表性感染胫骨。呈现在每一组小鼠中观察到的脓肿的数目(图8C)。*，p≤0.05；**，p≤0.01。
图9A-H示出使用抗Amd、抗Gmd和抗Amd与抗Gmd单克隆抗体的组合的被动免疫在预防形成葡萄球菌脓肿群落(SAC)中的效应，所述效应导致无菌脓肿。小鼠(n＝5)用40mg/kg剂量的PBS(阴性对照)或mAb 1C11、Amd1.6或组合(1C11+Amd1.6)腹膜内免疫。二十四小时后，所有小鼠接收用USA300LAC::lux生物发光CA-MRSA菌株污染的经胫骨销钉。对于经过革兰氏染色以展示细菌的组织学切片，示出来自感染后第14天的代表性感染胫骨。PBS处理的胫骨示出典型SAC病变，含有脓肿区域内的由嗜酸粒细胞性假包膜包围的中心细菌病灶(图9A-B)，这在用以下mAb处理的小鼠是不存在的：1C11(图9C-D)、Amd1.6(图9E-F)和组合1C11+Amd1.6(图9G-H)。
图10A-H示出用抗Amd、抗Gmd和抗Amd与抗Gmd单克隆抗体的组合的被动免疫对于脓肿内的巨噬细胞样细胞的募集的效应。六至十周龄雌性Balb/c小鼠(n＝5)用PBS或40mg/kg剂量的mAb 1C11、Amd1.6或组合(1C11+Amd1.6)来腹膜内免疫。二十四小时后，所有小鼠接收用USA300LAC::lux生物发光CA-MRSA菌株污染的经胫骨销钉。对于用橙黄G/阿尔新蓝(ABG/OH)染色的组织学切片，示出来自感染后第14天的代表性感染胫骨。用抗Amd、抗Gmd和抗Amd与抗Gmd mAb的组合的被动免疫将巨噬细胞样细胞募集至脓肿中心(图10C-H，箭头)，而PBS免疫的小鼠不展示脓肿内的巨噬细胞样细胞募集(图10A-B)并且显示在形态上类似于嗜中性白细胞的细胞。多个脓肿存在于PBS处理胫骨(图10A)的骨髓管和骨骼周围的软组织中，与Amd1.6和组合1C11+Amd1.6处理小鼠中的单一脓肿(分别为图10E和10G)，或1C11处理小鼠中的两个脓肿结构(图10C)形成对比。
图11A-E示出用抗Amd与抗Gmd单克隆抗体的组合的被动免疫的效应，其通过将M2巨噬细胞募集至无菌脓肿内来加速骨骼愈合。六至十周龄雌性Balb/c小鼠(n＝5)用PBS或40mg/kg剂量的mAb1C11、Amd1.6或组合(1C11+Amd1.6)来腹膜内免疫。二十四小时后，所有小鼠接收用USA300LAC::lux生物发光CA-MRSA菌株污染的经胫骨销钉。对于用橙黄G/阿尔新蓝(ABG/OH)染色的组织学切片，示出来自手术后第14天的代表性胫骨(图11A-C)。在用mAb免疫的小鼠中明显可见与接受无菌销钉对照的小鼠中的愈合类似的显著愈合(图11A-C)。为了确定使用与重构相关联的巨噬细胞表现型的愈合与伤口愈合过程的相互关系，使用抗精氨酸酶-1抗体来进行免疫组织化学以将M2巨噬细胞染色。在被动免疫的小鼠中，M2巨噬细胞被募集至脓肿中心(褐色染色)(图11E)，但是在阴性对照PBS组中，所述巨噬细胞不存在于脓肿中心(图11D)。
详述
本文公开特异性结合至葡萄球菌属自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(Amd)催化结构域或细胞壁结合结构域的一或多种单克隆抗体或其结合部分。
如在本文中使用的术语“抗体”意欲包括来源于天然来源或重组来源的免疫球蛋白以及免疫球蛋白的免疫活性部分(即，抗原结合部分)。本文公开的单克隆抗体可以各种形式存在或可以各种形式分离，包括例如大致上纯单克隆抗体、抗体片段或结合部分、嵌合抗体和人源化抗体(Ed Harlow和David Lane,USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)，其全部以引用方式并入本文)。
本文公开的单克隆抗体的特征是结合至葡萄球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶或其片段的特异性。抗体特异性结合至葡萄球菌自溶素(Atl)的酰胺酶亚单位中的表位，通常是但是并不一定是免疫显性表位。在某些实施方案中，这些单克隆抗体抑制葡萄球菌菌株的体内生长。在其他实施方案中，这些单克隆抗体抑制金属、塑料和/或有机表面上的生物膜建立。在更进一步实施方案中，一或多种单克隆抗体可一起用于抑制葡萄球菌菌株的体内生长和金属、塑料和/或有机表面上的生物膜建立。
根据本文公开的此和所有其他方面，葡萄球菌菌株是对于人或动物具有致病性或可致病的菌株。葡萄球菌可为凝结酶阳性或凝结酶阴性。示例性葡萄球菌菌株包括但不限于金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、路邓葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、山羊葡萄球菌和猿葡萄球菌。在一个实施方案中，本文公开的单克隆抗体有效抗御葡萄球菌的抗生素抗性菌株，包括甲氧西林抗性或万古霉素抗性菌株。
在某些实施方案中，酰胺酶亚单位的表位(由mAb或其结合片段结合的表位)是免疫显性表位。免疫显性抗原是抗原决定簇的一部分，其最容易由免疫系统识别并且因此对于所诱导抗体的特异性发挥最大影响。“免疫显性表位”是指抗原上的如下表位，此表位选择性地在宿主生物体中引发免疫响应以致于大致上排除此抗原上的其他表位。
通常，可能带有免疫显性表位的抗原可通过选择致病生物体的外表面上的抗原来识别。举例来说，最简单生物体，诸如真菌、细菌和病毒具有在致病生物体的外表面上暴露的一种或两种蛋白质。这些外表面蛋白质很可能带有适当抗原。很可能带有免疫显性表位的蛋白质可在蛋白质印迹测定中识别，其中总蛋白质在凝胶上相对于来自感染致病生物体的生物体的血清运作。来自血清的结合抗体通过经过标记的抗抗体，诸如在一种熟知ELISA技术中来识别。免疫显性表位可通过检查来自感染致病生物体的宿主生物体的血清来识别。将血清针对其结合至已识别抗原的抗体内含物来进行评估，所述抗原可能在宿主生物体中导致免疫响应。如果免疫显性表位存在于这些抗原中，那么血清中的大致上所有抗体结合至免疫显性表位，并且极少抗体结合至存在于抗原中的其他表位。
AtlA是金黄色葡萄球菌中的在有丝分裂期间消化细胞壁所需要的一种催化性独特肽聚糖水解酶(Baba和Schneewind,“Targeting of Muralytic Enzymes to the CellDivision Site of Gram-Positive Bacteria:Repeat Domains Direct Autolysin tothe Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus,”EMBO.J.17(16):4639-46(1998)，其全部以引用方式并入本文)。除了作为有利于生长的必需基因以外，扫描电子显微研究证明在二等分裂期间结合至金黄色葡萄球菌的抗AtlA抗体定位于未由细胞壁覆盖的细菌区域(Yamada等人,“An Autolysin Ring Associated With Cell Separation ofStaphylococcus aureus,”J.Bacteriol.178(6):1565-71(1996)，其全部以引用方式并入本文)。
AtlA酶包含经由裂解过程从相同AtlA前体蛋白产生的酰胺酶(62kD)和氨基葡萄糖苷酶(53kD)(Baba和Schneewind,“Targeting of Muralytic Enzymes to the CellDivision Site of Gram-Positive Bacteria:Repeat Domains Direct Autolysin tothe Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus，”Embo.J.17(16)：4639-46(1998)；Komatsu zawa等人，“Subcellular Localization of the Major Autolysin，ATLand Its Processed Proteins in Staphylococcus aureus，”Microbiol Immunol.41：469-79(1997)；Oshida等人，“A Staphylococcus aureus Autolysin That Has an N-acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Domain and an Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Domain：Cloning，Sequence Analysis，and Characterization，”Proc.Nat’l.Acad. Sci.U.S.A.92(1)：285-9(1995)，其全部以引用形式并入本文)。自溶素通过指定为R1、R2和R3的三个～150氨基酸细胞壁结合结构域来保持于细胞壁。在最后成熟步骤中，蛋白裂解将酰胺酶结构域和其相关联的R1和R2结构域(共同地称为“Amd”)与氨基葡萄糖苷酶和其相关联的N末端R3结构域(共同地称为“Gmd”)分离。参见图1。
His-Amd的示例性所编码共有蛋白质和编码开放解读码组序列识别为以下SEQ IDNO：1和2。
SEQ ID NO：I
MHHHHHHSASAQPRSVAATPKTSLPKYKPQVNSSINDYIRKNNLKAPKIEEDYTSYFPKYAYRNGVGRPEGIVVHDTANDRSTINGEISYMKNNYQNAFVHAFVDGDRIIETAPTDYLSWGVGAVGNPRFINVEIVHTHDYASFARSMNNYADYAATQLQYYGLKPDSAEYDGNGTVWTHYAVSKYLGGTDHADPHGYLRSHNYSYDQLYDLINEKYLIKMGKVAPWGTQSTTTPTTPSKPTTPSKPSTGKLTVAANNGVAQIKPTNSGLYTTVYDKTGKATNEVQKTFAVSKTATLGNQKFYLVQDYNSGNKFGWVKEGDVVYNTAKSPVNVNQSYSIKPGTKLYTVPWGTSKQVAGSVSGSGNQTFKASKQQQIDKSIYLYGSVNGKSGWVSKAYLVDTAKPTPTPTPKPSTPTTNNKLTVSSLNGVAQINAKNNGLFTTVYDKTGKPTKEVQKTFAVTKEASLGGNKFYLVKDYNSPTLIGWVKQGDVIYNNAKSPVNVMQTYTVKPGTKLYSVPWGTYKQEAGAVSGTGNQTFKATKQQQIDKSIYLFGTVNGKSGWVSKAYLAVPAAPKKAVAQPKTAVK
SEQ ID NO：2
ATGCACCATCACCACCACCACAGCGCAAGCGCACAGCCTCGTTCCGTCGCCGCCACCCCGAAAACCAGCTTGCCGAAGTACAAACCGCAAGTTAATAGCAGCATCAACGACTACATCCGCAAAAACAACCTGAAGGCCCCGAAAATTGAAGAGGACTATACCAGCTATTTCCCGAAATATGCTTACCGTAATGGTGTCGGTCGTCCGGAGGGTATTGTGGTCCACGACACCGCGAATGACCGTAGCACCATCAACGGTGAGATTAGCTACATGAAAAACAATTACCAAAACGCGTTCGTGCACGCCTTCGTCGATGGCGATCGCATCATCGAAACCGCGCCAACCGACTATCTGTCCTGGGGTGTGGGTGCCGTTGGCAACCCGCGTTTCATCAATGTGGAGATTGTTCATACCCACGACTACGCGAGCTTTGCACGTAGCATGAACAACTACGCCGATTATGCTGCAACGCAGCTGCAGTACTACGGCCTGAAACCGGATAGCGCGGAGTATGACGGTAACGGTACGGTGTGGACGCATTATGCGGTGAGCAAATACCTGGGTGGTACCGATCATGCTGATCCGCATGGCTACCTGCGCTCTCACAACTATAGCTACGACCAGTTGTACGACCTGATCAATGAGAAATATCTGATTAAGATGGGTAAGGTTGCACCGTGGGGTACGCAGAGCACCACGACGCCGACCACGCCGAGCAAACCGACGACCCCGTCCAAACCGTCTACCGGCAAACTGACGGTCGCGGCTAATAACGGTGTCGCGCAGATTAAACCGACCAACAGCGGTCTGTACACCACCGTCTATGATAAAACGGGCAAAGCCACCAATGAGGTTCAAAAGACGTTCGCAGTTAGCAAAACGGCGACCCTGGGTAACCAAAAGTTCTACCTGGTTCAGGATTACAATAGCGGCAACAAATTTGGTTGGGTGAAAGAAGGCGACGTTGTGTACAATACCGCGAAGTCCCCGGTGAACGTTAATCAGAGCTATAGCATCAAGCCGGGTACCAAATTGTATACGGTGCCGTGGGGTACCAGCAAGCAAGTTGCGGGTAGCGTCAGCGGCTCTGGTAACCAGACCTTCAAGGCGTCTAAGCAACAACAAATTGACAAAAGCATTTACCTGTATGGTAGCGTTAATGGTAAAAGCGGCTGGGTGTCTAAAGCGTATCTGGTCGACACCGCAAAGCCGACGCCAACGCCGACCCCGAAGCCGAGCACCCCAACCACCAACAACAAGCTGACGGTCAGCTCCCTGAATGGTGTTGCGCAAATCAATGCGAAGAATAATGGCCTGTTTACCACCGTTTACGATAAGACGGGCAAGCCAACGAAAGAAGTCCAGAAAACCTTTGCTGTCACCAAAGAAGCCAGCCTGGGCGGTAACAAGTTCTATCTGGTTAAGGACTACAACTCCCCGACGCTGATCGGTTGGGTCAAACAAGGCGATGTCATTTACAATAACGCGAAAAGCCCGGTTAATGTGATGCAAACCTATACCGTCAAACCGGGTACGAAGCTGTATTCCGTTCCGTGGGGCACGTACAAACAAGAAGCAGGCGCGGTGAGCGGTACCGGCAATCAGACCTTTAAGGCCACCAAGCAGCAGCAGATCGATAAATCTATTTACTTGTTTGGCACCGTGAATGGCAAGAGCGGTTGGGTTTCTAAGGCATACCTGGCGGTGCCGGCAGCACCGAAGAAGGCGGTGGCGCAGCCAAAGACCGCAGTGAAG
葡萄球菌Amd可通过固相或液相肽合成、重组表达来合成，或可从天然来源获得。自动肽合成仪可商购自众多供应商，如Applied Biosystems，Foster City，Califomia。化学肽合成的标准技术在本领域中是熟知的(参见例如，SYNTHETIC PEPTIDES：A USERSGUIDE 93-210(Gregory A.Grant编辑，1992)，其全部以引用方式并入本文)。经由重组表达的蛋白质或肽产生可使用细菌诸如大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞和表达系统来进行。重组蛋白/肽表达的程序在本领域中是熟知的并且由Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual(C.S.H.P.Press，NY第2版，1989)描述。
重组表达肽可使用在本领域中容易已知的多种方法中的任何一种，包括离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、凝胶过滤和反相色谱来纯化。肽优选地通过常规技术以纯化形式(优选地至少约80％或85％纯，更优选地至少约90％或95％纯)产生。取决于是否使重组宿主细胞将肽分泌至生长培养基中(参见Bauer等人的美国专利号6,596,509，其全部以引用方式并入本文)，肽可通过离心来分离并纯化(将细胞组分从含有分泌肽的上清液中分离)，随后顺序进行上清液的硫酸铵沉淀。含有肽的部分在适当大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中经受凝胶过滤以将肽与其他蛋白质分离。必要时，肽部分可通过HPLC和/或透析来进一步纯化。
在某些实施方案中，单克隆抗体或结合部分可特异性结合至Amd催化结构域的表位。如本文使用，Amd催化结构域与SEQ ID NO：1的氨基酸9-252至少70％相同，或与SEQ IDNO：1的氨基酸9-252至少75％或80％相同，或甚至与SEQ ID NO：1的氨基酸9-252至少85％或90％相同。在某些实施方案中，酰胺酶催化结构域与SEQ ID NO：1的氨基酸9-252至少95％相同。
在某些实施方案中，单克隆抗体或结合部分由称为Amd1.6、Amd1.10、Amd1.13、Amd1.16、Amd1.17、Amd2.1或Amd2.2的杂交瘤细胞系产生。
在另一个实施方案中，单克隆抗体或结合部分结合至全部或部分在Amd R1或R2细胞壁结合结构域内的表位。如本文使用，R1或R2细胞壁结合结构域分别与SEQ ID NO：1的氨基酸253-399或421-568至少70％相同；或分别与SEQ ID NO：1的氨基酸253-399或421-568至少75％或80％相同；或甚至分别与SEQ ID NO：1的氨基酸253-399或421-568至少85％或90％相同。在某些实施方案中，细胞壁结合结构域分别与SEQ ID NO：1的氨基酸253-399或421-568至少95％相同。
在某些实施方案中，单克隆抗体或结合部分由称为Amd1.1、Amd1.2、Amd1.5、Amd1.7、Amd1.8、Amd1.9、Amd1.11、Amd1.12、Amd1.14、Amd1.15、Amd2.4或Amd2.5的杂交瘤细胞系产生。
在某些实施方案中，本文公开的单克隆抗体以大于10-8M或10-9M，但是优选地大于10-10M的亲和力结合至Amd催化结构域或细胞壁结合结构域。
如以上提及，在某些实施方案中，单克隆抗体或结合部分还抑制葡萄球菌的体内生长。葡萄球菌的体内生长的抑制可根据许多合适标准来测量。在一个这类实施方案中，葡萄球菌的体内生长可根据生物发光测定来评估。举例来说，生物发光金黄色葡萄球菌(Xen29；ATCC 12600)(Francis等人,“Monitoring Bioluminescent StaphylococcusaureusInfections in Living Mice Using a Novel luxABCDE Construct,”Infect.Immun.68(6):3594-600(2000)；也参见Contag等人,“Photonic Detection of BacterialPathogens in Living Hosts,”Mol.Microbiol.18(4):593-603(1995)，其各自全部以引用方式并入本文)用于在手术植入之前给予经胫骨植入物500,000CFU。五周龄雌性BALB/cJ小鼠可在手术之前3天接受腹膜内注射盐水或0.25ml盐水中的1mg纯化抗体/抗体片段。可在不同日期(例如，0、3、5、7、11和14)对小鼠成像以评估生物发光并且可比较BLI图像的比较以评估相对于盐水对照或注射安慰剂抗体的对照小鼠，抗体是否抑制金黄色葡萄球菌的体内生长。
在另一个实施方案中，葡萄球菌的体内生长可根据生物膜形成来评估。举例来说，雌性Balb/c小鼠可用40mg/kg剂量的抗体/抗体片段或对照来腹膜内被动免疫，并且一天后每个小鼠可用以MRSA菌株污染的经胫骨不锈钢销钉来感染。感染后第14天，销钉可移除并且通过扫描电子显微术(SEM)来检查，并且以生物膜覆盖的所关注的区域(例如，扁平销钉的0.5x 2.0mm端面)的百分比可用NIH软件(图像J)来量化。
在另一个实施方案中，感染骨骼的骨质溶解体积可使用显微CT成像来测量。举例来说，雌性Balb/c小鼠可用40mg/kg剂量的抗体/抗体片段或对照来腹膜内被动免疫，并且一天后每个小鼠可用以MRSA菌株污染的经胫骨不锈钢销钉来感染。14天之后，可将小鼠安乐死并且收获胫骨。使用所得图像，病灶面积可在两个不同视图(例如，内侧和外侧)中测量，相加在一起并且乘以皮质厚度(参见Varrone等人,“Passive Immunization WithAnti-Glucosaminidase Monoclonal Antibodies Protects Mice From Implant-Associated Osteomyelitis by Mediating Opsonophagocytosis of StaphyloCoCCusaureus Megaclusters，”J Orthop Res 32(10)：1389-96(2014)，其全部以引用方式并入本文)。
在另一个实施方案中，葡萄球菌的体内生长可通过骨髓管或骨骼周围的软组织中的葡萄球菌脓肿群落(SAC)的存在(包括频率)或不存在来评估。举例来说，雌性Balb/c小鼠可用40mg/kg剂量的抗体/抗体片段或对照来腹膜内被动免疫，并且一天后每个小鼠可用以MRSA菌株污染的经胫骨不锈钢销钉来感染。14天之后，可将小鼠安乐死并且收获胫骨和相关联软组织。组织学样品可制备并且用橙黄G/阿尔新蓝(ABG/OH)染色，然后脓肿的存在或不存在可在分析组织学样品后确定。
根据一个实施方案，单克隆抗体或结合部分包括包含以下氨基酸序列之一的VH结构域(CDR结构域加下划线)：
SEQ ID NO：5(Amd1.2)：
PELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYIMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDXAVYYCARLDGYYDCFDYWGQGTTLTVSS
其中X可为任何氨基酸。此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：6)编码：
CCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATATTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTNTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACTTGATGGTTACTACGACTGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCNTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCNGGTCAAGGG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7(Amd1.1)：
QQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGITNYDPKFQGRATITADTSSNIAYLQLTSLTSEGTAVYYCARGGYLSPYAMDYWGQGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：8)编码：
NTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTATTACTAATTATGACCCGAAGTTCCAGGGCAGGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAATATAGCCTACCTGCAGCTCACCAGCCTGACATCTGAGGGCACTGCCGTCTACTACTGTGCTAGAGGGGGTTACCTATCCCCTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTNCCCTGAGCCAG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9(Amd1.5)：
QQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIQDYYLHWMKQRPEQGLEWIGWIDPENDNTVYDPKFRDRASLTADTFSNTAYLQLSGLTSEDTAVYYCARRDGITTATRAMDYWGQGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：10)编码：
TGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAATTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTCAAGACTACTATCTACACTGGATGAAACAGAGGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGATAATACTGTATATGACCCGAAGTTCCGGGACAGGGCCAGTTTAACAGCAGACACATTTTCCAACACAGCCTACCTACAGCTCAGCGGCCTGACATCTGAAGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAAGAGACGGCATTACTACGGCTACGCGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCNNNNNCCTGAGCCAG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11(Amd1.6)：
QSGTVLARPGTSVKMSCKASGYSFTNYWMHWVRQRPGQGLEWIGSIYPGNSDTTYNQKFKDKAKLTAVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTGDDYSRFSYWGQGTLVTVSA
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：12)编码：
CAGTCTGGGACTGTACTGGCAAGGCCTGGGACTTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACCAACTACTGGATGCACTGGGTAAGACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTTCTATTTATCCTGGAAATAGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACGGGGGATGATTACTCTCGGTTTTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTNGTCAAGGGCTNTTTCCCNGAGCCA
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
SEQ ID NO 13：(Amd1.7)：
QQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYIFPYNGDTDYNQKFKNKATLTVDNSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCSRWGSYFDYWGQGTTLTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：14)编码：
TGCAGCAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTTTCCTTACAATGGTGATACTGACTACAACCAGAAATTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCAGCACAGCCTACATGGACCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGATGGGGGTCTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGNGTCAAGGGCT
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15(Amd1.9)：
VESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPKKSLEWVASITSGGSAYYPDSVKGRFTISRDNARNILNLQMSSLRSEDTAMYYCARDDGYFDYWGQGTTLTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：16)编码：
GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAAAAAAGAGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTACTAGTGGTGGTAGCGCCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGAACCTGCAGATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGACGACGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAA
SEQ ID NO：17(Amd1.11)：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLLINNLKNEDTATYFCARRDGYFDAMDYWGQGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：18)编码：
NNCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAGAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACTTATGCTGATGACTTCAAGGGACGCTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCTGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAAGGGATGGTTACTTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19(Amd1.12)：
QQSGAELVRPGTSVKVSCKTSGYAFTNYLIEWVNQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKAKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARSERGYYGNYGAMDYWGQGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：20)编码：
NNGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGACTTCTGGATACGCCTTCACTAATTACTTGATAGAGTGGGTAAATCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGGGTGATTAATCCTGGAAGTGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCAGAGCGAGGCTACTATGGTAACTACGGAGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATNTCCCTGAGCCAG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21(Amd1.13)：
QQPGPELVKPGASLKISCKASGYSFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPVDGDTNYNGKFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARTGPYAMDYWGRGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：22)编码：
NNGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCACTGAAGATTTCCTGCAAAGCTTCTGGCTACTCATTCAGTTCCTCTTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACGGATTTATCCTGTAGATGGAGATACTAACTACAATGGGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGTGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAACTGGGCCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCGAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23(Amd1.16)：
GAELVRPGSSVKISCKASGYTFSTYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARSMVTNYYFAMDYWGQGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：24)编码：
GGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTACCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGACCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGACGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGATGGTAACGAACTATTACTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCNGGTCAAGGG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25(Amd1.17)：
GGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKKLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGLLGFDYWGQGTTLTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：26)编码：
GGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAAACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGGGGGCTACTGGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGG
SEQ ID NO：27(Amd2.1)：
GFVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEMRLEWVASISSGGSXTYYPDSVMGRFTISRDNARNILNLQMSSLRSEDTAMYYCARVGLYYDYYYSMDYWGQGTSVTVSS
其中X可为任何氨基酸。此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：28)编码：
GGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGATGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGNNNCACCTACTATCCAGACAGTGTGATGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGAACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGTGGGTCTCTACTATGATTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29(Amd2.2)：
ESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVRQSHGKSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREDGYYGYFDYWGQGTTLTGSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：30)编码：
GAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATAACATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGTAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGATGGTTACTACGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGGCTCCTCAG
SEQ ID NO：31(Amd 2.4)：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASAAYLQINNLKNEDTATYFCARDYDGYYYYAMDYWGQGTSVTVSS
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：32)编码：
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCGCTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGGGACTATGATGGTTACTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG
根据一个实施方案，单克隆抗体或结合部分包括包含以下氨基酸序列之一的VL结构域(CDR结构域加下划线)：
SEQ ID NO：33(Amd1.1)：
ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMTCRASSSVNYMFWFQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQEFTSFPYTFG
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：34)编码：
NTCAGTGTCTCAGTTGTAATGTCCAGAGGAGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGTTCTGGTTCCAGCAGAAGTCAGATGCCTCCCCCAAATTGTGGATTTATTATACATCCAACCTGGCTCCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAACTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGGTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGGAGTTTACTAGTTTCCCGTACACGTTCGGA
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35(Amd1.2)：
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPQYTF
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：36)编码：
TTATGCTTTTTTGGATTTCAGCCTCCAGAGGTGATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCTCAGTACACGTTCGG
SEQ ID NO：37(Amd1.6)：
SIVMTQTPKFLLVSAGDRLTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYNSPWTFGGGTK
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：38)编码：
CCAGGTCTTCGTATTTCTACTGCTCTGTGTGTCTGGTGCTCATGGGAGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCAGGAGACAGGCTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACTATACATCCAATCGCTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGGATTATAACTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAG
SEQ ID NO：39(Amd1.7)：
SIVMTQTPKFLLVSAGDRLTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYNSPWTFGGGTK
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：40)编码：
TGGTGCTCATGGGAGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCAGGAGACAGGCTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACTATACATCCAATCGCTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGGATTATAACTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGC
SEQ ID NO：41(Amd1.8)：
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQRSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPYTFG
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：42)编码：
CTTGGACTTTTGCTTTTCTGGACTTCAGCCTCCAGATGTGACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGACTACTTACACTGGTATCAACAAAGATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATATGTTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTGGAGTGTATTATTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGTACACGTTCGCA
SEQ ID NO：43(Amd1.9)：
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRTSENIFSNFAWYQQQPGKSPQLLVYGATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSLQSEDFGSYYCQHFWGSPWTF
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：44)编码：
TTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAAAATATTTTCAGTAATTTCGCATGGTATCAGCAGCAACCGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCAGATGGTCTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCACCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTAGTCCGTGGACGTTCGG
SEQ ID NO：45(Amd1.10)：
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPYTFG
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：46)编码：
TCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGGGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAAGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCTACACGTTCGGA
SEQ ID NO：47(Amd1.11)：
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPALTFG
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：48)编码：
GGACTTTTGCTTTTCTGGATTCCAGCCTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGCATTGGCACAAGCATACACTGGTATCAACAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTAATAGCTGGCCAGCGCTCACGTTCGGT
SEQ ID NO：49(Amd1.12)：
DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTFAEGVRSRFSGSGSGTQFSLQITSLQPEDFGSYYCQHHYGSPYTF
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：50)编码：
TCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGATACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTCGGAGAAGGTGTGCGATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGACACAGTTTTCTCTGCAGATCACCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTTCTCCGTACACGTTCGG
SEQ ID NO.51(Amd1.13)：
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFG
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：52)编码：
GGTACCTCTGGGGACATTGTGATGACGCAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAAAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTCCTGGGCATGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGACTATAGTTATCCATTCACGTTCGGC
SEQ ID NO：53(Amd1.15)：
DIAMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVRDRFXGSRCGTDFTFPISSVQGEDLAVYYCQQHYSIHSRS
其中X可为任何氨基酸。此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：54)编码：
NCTGCTATTCTGCTATGGGTATCTGGTGTTGACGGAGACATTGCGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCGTGATCGCTTCANTGGCAGTCGATGTGGGACGGATTTCACTTTCCCCATCAGCAGTGTGCAGGGTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTATCCATTCACGTTCGG
其中每个N可为A、T、C或G，只要核酸分子编码SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55(Amd1.17)：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGT
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：56)编码：
TGGATCCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAA
SEQ IDNO：57(Amd 2.1)：
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLYSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKMLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTHFTLTISSVQAEDLAIYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELK
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：58)编码：
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTATACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAAATGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACACATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAATTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC
SEQ ID NO：59(Amd 2.2)：
EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVNYMHWYQQKSGTSPKPWIYEISKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQQWNYPLITFGAGTKLELK
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：60)编码：
GAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGGCAAAAGGTCACCATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAACCATGGATTTATGAAATATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCATTTATTACTGCCAGCAGTGGAATTATCCTCTTATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC
SEQ ID NO：61(Amd 2.4)：
ENALTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSSMSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEEVATYYCFQGSGFPVHVRRGDQVGNKT
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：62)编码：
GAAAATGCTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAAGCATGTCCCCCAAACTCTGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGGTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAAACTCTTACTCTCTCACGATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGAGGTTGCCACTTATTACTGTTTTCAGGGGtAGTGGGTTCCCAGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATAAAAC
SEQ ID NO：63(Amd 2.5)：
DIQMTQSPASLSASVGETITITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPHLLVFHARSLADGVPSRFSGSGSGTQYSLNINSLQPEDFGIYYCQHFWYTPYTFGGGTKLEIK
此氨基酸序列由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：64)编码：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTATCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCACCTCCTGGTCTTTCATGCAAGATCCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAATATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGATTTATTACTGTCAACATTTTTGGTATACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAC
本公开还涵盖结合至与一种或多种公开的抗Amd抗体相同Amd表位的Amd抗体和其Amd结合部分。因此，额外抗体和Amd结合抗体部分可基于其在Amd结合测定中与公开抗体交叉竞争(例如，以统计上显著方式竞争性抑制其结合)的能力来识别。测试抗体抑制本文公开的抗Amd参考抗体结合至Amd蛋白质(例如，具有SEQ ID NO：1的至少一部分序列，诸如催化结构域或SEQ ID NO：1的氨基酸9-252或细胞壁结合结构域的Amd蛋白质或多肽)的能力证明测试抗体可与参考抗体竞争结合至Amd。根据非限制性理论，这类抗体可结合至Amd蛋白质上的与它所竞争的参考抗体相同或相关(例如，在结构上类似或在空间上最接近)表位。在某些实施方案中，结合至Amd上的与本文公开的参考抗体相同表位的抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，结合至Amd上的与本文公开的参考抗体相同表位的抗体是人抗体。Amd-结合抗体和Amd结合抗体部分也可为结合至与参考抗体相同表位的其他小鼠或嵌合Amd-结合抗体和Amd结合抗体部分。
阻断或与参考抗体结合竞争的能力指示Amd-结合测试抗体或Amd-结合抗体部分结合至与参考抗体限定的表位相同或类似的表位，或结合至足够接近由参考Amd-结合抗体结合的表位的表位。这类抗体尤其可能共有针对参考抗体所识别的有利性质。
阻断或与参考抗体竞争的能力可使用在本领域中已知的技术诸如竞争结合测定来确定。使用竞争结合测定，所测试的抗体或Amd-结合抗体部分针对抑制参考抗体特异性结合至Amd蛋白质或Amd蛋白质的一部分(例如，催化结构域或SEQ ID NO：1的氨基酸9-252，或细胞壁结合结构域)的能力来检查。如果过量测试抗体大致上抑制参考抗体的结合，那么测试抗体与参考抗体竞争特异性结合至作为抗原的Amd蛋白质或其一部分。大致上抑制意味着测试抗体减少参考抗体的特异性结合通常至少10％、25％、50％、75％或90％。
已知竞争结合测定可总体上采用或常规调适以评估Amd-结合抗体或Amd-结合抗体部分与参考Amd-结合抗体竞争结合至Amd蛋白质或其一部分。这类竞争结合测定包括但不限于固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见
Figure BDA0001015363610000301
等人,“Distinction of Epitopes by Monoclonal Antibodies,”Methods in Enzymology 92:242-253,(1983)，其全部以引用方式并入本文)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人,“Analysis of the Fine Specificity andCross-reactivity of Monoclonal Anti-lipid A Antibodies,”J.Immunol.137:3614-3619(1986)，其全部以引用方式并入本文)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(EdHarlow和David Lane,USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring HarborLaboratory Press,1999)，其全部以引用方式并入本文)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人,“Monoclonal Antibodies to Bovine Serum Albumin:Affinity andSpecificity Determinations,”Molec.Immunol.25:7-15(1988)，其全部以引用方式并入本文)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,“Epitope-Specific AntibodyResponse to the Surface.Antigen of Duck Hepatitis B Virus in Infected Ducks,”Virology 176:546-552(1990)，其全部以引用方式并入本文)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人,“Identity of HML-1Antigen on Intestinal Intraepithelial TCells and of B-ly7 Antigen on Hairy Cell Leukaemia,”Scand.J.Immunol.32:77-82(1990)，其全部以引用方式并入本文)。通常，所述分析涉及使用与固体表面结合的纯化抗原，或带有这些未标记测试Amd结合抗体和标记的参考抗体中任一者的细胞。竞争性抑制是通过测定在测试抗体存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试抗体过量存在。由竞争测定(竞争抗体)识别的抗体和抗原结合抗体部分包括结合至与参考抗体相同表位的抗体和抗原结合抗体部分以及结合至与由参考抗体结合的表位充分接近的相邻表位以致于发生位阻的抗体。
在一些实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与本文描述的抗Amd抗体交叉竞争。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与选自Amd1.1、Amd1.2、Amd1.5、Amd1.6、Amd1.7、Amd1.8、Amd1.9、Amd1.10、Amd1.11、Amd1.12、Amd1.13、Amd1.14、Amd1.15、Amd1.16、Amd1.17、Amd2.1、Amd2.2、Amd2.4和Amd2.5的抗Amd抗体交叉竞争。在具体实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与抗体Amd1.6交叉竞争。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与抗体Amd2.1交叉竞争。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd，与一种或多种上述抗Amd抗体交叉竞争，并且抑制Amd催化活性。
在额外实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与本文所述抗体相同的表位。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与选自Amd1.1、Amd1.2、Amd1.5、Amd1.6、Amd1.7、Amd1.8、Amd1.9、Amd1.10、Amd1.11、Amd1.12、Amd1.13、Amd1.14、Amd1.15、Amd1.16、Amd1.17、Amd2.1、Amd2.2、Amd2.4和Amd2.5的抗体相同的表位。在具体实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与抗体Amd1.6相同的表位。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与抗体Amd2.1相同的表位。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与一种或多种上述抗Amd抗体相同的表位并且抑制Amd催化活性。
在一些实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与结合葡萄球菌属Amd催化结构域的抗Amd抗体交叉竞争。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与选自Amd1.6、Amd1.10、Amd1.13、Amd1.16、Amd1.17、Amd2.1和Amd2.2的抗Amd抗体交叉竞争。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd，与一种或多种以上识别抗Amd抗体交叉竞争，并且抑制Amd催化活性。
在额外实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与本文所述抗体相同的Amd催化结构域表位。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与选自Amd1.6、Amd1.10、Amd1.13、Amd1.16、Amd1.17、Amd2.1和Amd2.2的抗体相同的Amd催化结构域表位。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与一种或多种以上识别抗Amd抗体相同的表位并且抑制Amd催化活性。
在一些实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与结合葡萄球菌属Amd细胞壁结合结构域的抗Amd抗体交叉竞争。在额外实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与本文描述的结合细胞壁结合结构域的抗Amd抗体交叉竞争。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分特异性结合至Amd并且与选自Amd1.1、Amd1.2、Amd1.5、Amd1.7、Amd1.8、Amd1.9、Amd1.11、Amd1.12、Amd1.14、Amd1.15、Amd2.4和Amd2.5的抗体交叉竞争。
在一些实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与本文所述抗Amd抗体相同的Amd细胞壁结合结构域表位。在其他实施方案中，抗体或其Amd结合部分结合至与选自Amd1.1、Amd1.2、Amd1.5、Amd1.7、Amd1.8、Amd1.9、Amd1.11、Amd1.12、Amd1.14、Amd1.15、Amd2.4和Amd2.5的抗体相同的Amd细胞壁结合结构域表位。
本文公开的抗体也可为合成抗体。合成抗体是使用重组DNA技术产生的抗体，例如像通过噬菌体来表达的抗体。或者，合成抗体的产生方法是通过合成编码抗体的DNA分子，随后表达抗体(即，合成指定抗体的氨基酸)，其中DNA或氨基酸序列已经使用可利用并且在本领域中熟知的合成DNA或氨基酸序列技术来获得。
在某些实施方案中，合成抗体使用如以上识别的重链可变结构域的一个或多个CDR、如以上识别的不同重链可变结构域的CDR的组合、所识别轻链可变结构域的一个或多个CDR或来自如以上识别的不同轻链可变结构域的CDR的组合来产生。举例来说，Amd1.6和Amd2.1包括以下CDR：
Figure BDA0001015363610000331
在Amd2.1 VH，CDR2(SEQ ID NO:71)中，X可为任何氨基酸。
在一个实施方案中，单克隆抗体或结合部分是部分人源化或完全人抗体或结合部分。
人源化抗体是在可变区内含有来自非人(例如鼠科)抗体的最小序列的抗体。当施用至人受试者时，这类抗体在治疗上用于减少抗原性和人抗小鼠抗体反应。实际上，人源化抗体通常是具有最小直至没有非人序列的人抗体。人抗体是由人产生的抗体或具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。
抗体可通过将人抗体的互补决定区(CDR)替换成具有所需特异性、亲和力和能力的非人抗体(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的互补决定区来人源化(Jones等人,“Replacingthe Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From aMouse,”Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,“Reshaping Human Antibodies forTherapy,”Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,“Reshaping Human Antibodies:Grafting an Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536(1988)，其全部以引用形式并入本文)。人源化抗体可以通过Fv构架区中的和/或所置换的非人残基内的另外残基的取代来进行进一步修饰，以便改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。
人源化抗体可使用在本领域中已知的各种技术来产生。可产生在体外免疫的或从产生针对目标抗原的抗体的免疫个体分离的永生人B淋巴细胞(参见例如Reisfeld等人,MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77(Alan R.Liss编辑,1985)和Garrard的美国专利号5,750,373，其全部以引用形式并入本文)。另外，人源化抗体可选自噬菌体文库，其中此噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人,“Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage DisplayLibrary,”Nature Biotechnology,14:309-314(1996)；Sheets等人,“EfficientConstruction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library:The Production ofHigh-Affinity Human Single-Chain Antibodies to Protein Antigens,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.95:6157-6162(1998)；Hoogenboom等人,“By-passingImmunisation.Human Antibodies from Synthetic Repertoires of Germline VH GeneSegments Rearranged in vitro,”J.Mol.Biol.227:381-8(1992)；Marks等人,“By-passing Immunization.Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed onPhage,”J.Mol.Biol.222:581-97(1991)，其全部以引用形式并入本文)。还可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中来制备人源化抗体，在免疫时所述小鼠能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的全部谱系。此方法描述于Surani等人的美国专利号5,545,807；Lonberg等人的美国专利号5,545,806；Lonberg等人的美国专利号5,569,825；Lonberg等人的美国专利号5,625,126；Lonberg等人的美国专利号5,633,425；和Lonberg等人的美国专利号5,661,016，其全部以引用形式并入本文。
在某些实施方案中，人源化单克隆抗体是IgG1、IgG2、IgG3类别或IgG4类别。IgG3类别由于其减少的蛋白质A结合而为尤其优选的(参见Natsume等人,“EngineeredAntibodies of IgG1/IgG3 Mixed Isotype with Enhanced Cytotoxic Activities,”Cancer Res 68(10):3863–72(2008)，其全部以引用方式并入本文)。
这些抗体类别的循环半衰期可通过Fc结构域的修饰来增强，诸如由Petkova等人描述的N434A和T307A/E380A/N434A取代(“Enhanced Half-life of GeneticallyEngineered Human IgG1Antibodies in a Humanized FcRn Mouse Model:PotentialApplication in Humorally Mediated Autoimmune Disease,”InternationalImmunology 18(12):1759–1769(2006)，其全部以引用方式并入本文)或由Balsitis等人描述的N297Q取代(“Lethal Antibody Enhancement of Dengue Disease in Mice IsPrevented by Fc Modification,”PloS Pathogens 6(2):e1000790(2010)，其全部以引用方式并入本文)。
以上分别识别为SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61和63的重链和轻链序列可用于识别密码子优化DNA序列，所述序列可引入合适表达系统中以产生根据本发明的重组、嵌合抗体。或者，以上识别的DNA序列可用于制备合适表达系统以产生根据本发明的重组、嵌合抗体。
除了完整抗体以外，本发明涵盖这类抗体的Amd结合部分。这类Amd结合部分包括但不限于一价Fab片段、Fv片段(例如，单链抗体，scFv)、单一可变VH和VL结构域和二价F(ab’)2片段、Bis-scFv、双功能抗体、三功能抗体和微抗体。这些抗体片段可通过常规程序制成，诸如如在James Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE 98-118(Academic Press,1983)；Ed Harlow和David Lane,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)；Houston等人,“Protein Engineering ofAntibody Binding Sites:Recovery of Specific Activity in an Anti-DigoxinSingle-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)；Bird等人,“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science242:423-426(1988)中所描述的蛋白水解断裂程序，其全部以引用形式并入本文，或在本领域中已知的其他方法。
在一些实施方案中，抗体或其Amd结合部分包括构架，其中在来自相应人VH或VL种系序列的抗体构架中已经发生氨基酸取代。以下实施例6识别本文描述的许多抗体的种系序列。
修饰抗体以增加它的血清半衰期也是所需的，尤其是在抗体片段的情况下。这可以(例如)通过以下方式来实现：通过经由抗体片段中的适当区的突变将补救受体结合表位并入至所述抗体片段中，或通过将所述表位结合位点并入至肽标签中，所述肽标签然后与所述抗体片段在任一端或在中间融合(例如，通过DNA或肽合成)。
抗体模拟物也适合于根据本发明的用途。许多抗体模拟物在此项技术中为已知的，包括但不限于被称为纤维连接蛋白或单功能抗体的模拟物，其来源于第十个人类纤连蛋白III型结构域(10Fn3)(Koide等人,“The Fibronectin Type III Domain as aScaffold for Novel Binding Proteins,”J.Mol.Biol.284:1141–1151(1998)；Koide等人,“Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using DesignerBinding Proteins:Application to the Estrogen Receptor,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:1253–1258(2002)，其各自全部以引用方式并入本文)；和被称为亲和体的模拟物，其来源于葡萄球菌蛋白质A的稳定α螺旋细菌受体结构域Z(Nord等人,“Binding ProteinsSelected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial ReceptorDomain,”Nature Biotechnol.15(8):772-777(1997)，其全部以引用方式并入本文)。
在制备这些抗体模拟物的过程中，VH和/或VL链的CDR可剪接或枝接至这些抗体模拟物的可变环区域中。接枝可涉及缺失至少两个氨基酸残基，直至缺失大致上所有氨基酸残基，除了在取代CDR序列时出现在特定环区域中的一个氨基酸残基以外。插入可为例如在一个环区域处插入一个CDR，任选地在第二环区域处插入第二CDR，和任选地在第三环区域处插入第三CDR。多肽上的任何缺失、插入和置换可使用以已知核苷酸序列开始的重组技术来实现(参见以下)。
单克隆抗体产生方法可使用本文所述技术或在本领域中熟知的其他技术来实现(MONOCLONAL ANTIBODIES–PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATIONS(MaryA.Ritter和Heather M.Ladyman eds.,1995)，其全部以引用方式并入本文)。通常，所述方法包括从先前已经用目标抗原(即，葡萄球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶或其肽片段)免疫的哺乳动物的脾中获得免疫细胞(淋巴细胞)。
分泌抗体的淋巴细胞随后与能够在细胞培养物中无限地复制的骨髓瘤细胞或转化的细胞融合，由此生成永生的分泌免疫球蛋白的细胞系。与能够在细胞培养物中无限地复制的哺乳动物骨髓瘤细胞或其它融合搭配物融合通过标准且熟知的技术，例如通过使用聚乙二醇(PEG)或其它融合剂实现(Milstein和Kohler,“Derivation ofSpecificAntibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion,”Eur.J.Immunol.6:511(1976)，其全部以引用方式并入本文)。选择优选为鼠科、但也可来源于其它哺乳动物物种的细胞的永生细胞系，以缺乏利用某些营养素所必需的酶、能够迅速生长且具有良好的融合能力。将所产生的融合细胞或杂交瘤培养，且筛选所产生的群落以生成所要的单克隆抗体。将生成所述抗体的群落克隆并使其体内或体外生长以生成大量的抗体。
因此，本发明的第二方面涉及表达本文公开的单克隆抗体或结合部分的细胞系。在一个实施方案中，本文公开的单克隆抗体由称为Amd1.1、Amd1.2、Amd1.3、Amd1.5、Amd1.6、Amd1.7、Amd1.8、Amd1.9、Amd1.10、Amd1.11、Amd1.12、Amd1.13、Amd1.14、Amd1.15、Amd1.16、Amd1.17、Amd2.1、Amd2.2、Amd2.4和Amd2.5的杂交瘤细胞系产生。
或者，单克隆抗体可使用如在Cabilly等人的美国专利4,816,567中所述的重组DNA方法制造，该专利全部以引用方式并入本文。编码单克隆抗体的多核苷酸例如通过RT-PCR使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物从成熟的B细胞或杂交瘤细胞中分离。然后将编码重链和轻链的分离多核苷酸克隆至合适表达载体中，所述载体在转染至不另外产生免疫球蛋白质的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中时，产生表达并分泌单克隆抗体的宿主细胞。另外，所需物种的重组单克隆抗体或其片段可从噬菌体展示文库分离(McCafferty等人,“PhageAntibodies:Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains,”Nature348:552-554(1990)；Clackson et al.,“Making Antibody Fragments using PhageDisplay Libraries,”Nature 352:624-628(1991)；和Marks等人,“By-PassingImmunization.Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage,”J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，其全部以引用形式并入本文)。
另一个方面涉及DNA构建体，其包括编码本文公开的抗体或结合部分的DNA分子，可操作地偶联至DNA分子的5’的启动子效应DNA分子，和可操作地偶联至DNA分子的3’的转录终止DNA分子。本发明还涵盖DNA构建体插入其中的表达载体。多肽的合成基因可被设计成使得它包括便于诱变的便利限制位点并且使用有利于较高水平蛋白质表达的特定密码子(Gribskov等人,“The Codon Preference Plot:Graphic Analysis of Protein CodingSequences and Prediction of Gene Expression,”Nucl.Acids.Res.12:539-549(1984)，其全部以引用方式并入本文)。
基因可组装如下：首先基因序列可划分成在设计限制位点处具有边界的部分；对于每个部分，可合成编码相反链并且具有约15个碱基的互补重叠的一对寡核苷酸；两个寡核苷酸可粘接并且单链区域可使用DNA聚合酶的Klenow片段来填充；双链寡核苷酸可使用限制酶位点在片段的末端处克隆至载体诸如pET3a载体(Novagen)中并且其序列可通过DNA测序器来证实；并且这些步骤可对于每个部分来重复以获得完整基因。与一步聚合酶链反应(PCR)方法相比，此方法耗费更多时间来组装基因(Sandhu等人,“Dual Asymetric PCR:One-Step Construction of Synthetic Genes,”BioTech.12:14-16(1992)，其全部以引用方式并入本文)。可能由于低保真性复制而由Taq多聚酶引入突变并且将需要进行耗费时间的基因编辑。除非另外说明，否则重组DNA操作可根据SAMBROOK&RUSSELL,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL(第2版1989)来进行，其全部以引用方式并入本文。为了在一步PCR期间避免引入突变，可使用如在本领域中已知的高保真性/低误差聚合酶。
所需突变可使用盒式诱变、寡核苷酸定点诱变技术(Deng和Nickoloff,“Site-Directed Mutagenesis of Virtually any Plasmid by Eliminating a Unique Site,”Anal.Biochem.200:81-88(1992)，其全部以引用方式并入本文)或Kunkel诱变(Kunkel等人,“Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without PhenotypicSelection,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等人,“Rapid andEfficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection,”MethodsEnzymol.154:367-382(1987)，其全部以引用形式并入本文)来引入多肽序列中。
盒式诱变和定点诱变可用于制备特定需要的核苷酸编码序列。盒式诱变可使用如上所述基因构建的相同方案来进行并且编码新序列的双链DNA片段可克隆至合适表达载体中。许多突变可通过将新合成的链(编码突变)与用于基因合成的寡核苷酸组合来产生。不论用于将突变引入编码根据本发明的多肽的核苷酸序列的方法为何，可进行测序来证实所设计的突变(并且没有其他突变)通过诱变反应来引入。
相比之下，Kunkel诱变可用于随机产生可用于制备多肽的组合文库供筛选的多个突变多肽编码序列。基本上，目标环区域(或C末端或N末端尾部区域)可使用NNK密码子(N表示A、T、G、C的混合物并且K表示G和T的混合物)来随机化(Kunkel等人,“Rapid andEfficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection,”MethodsEnzymol.154:367-382(1987)，其全部以引用方式并入本文)。
不论用于制备编码抗体或Amd结合部分的核酸分子的方法为何，核酸可使用常规重组DNA技术来并入宿主细胞中。总体上，此涉及将DNA分子插入DNA分子对于其为异源的表达系统(即，通常不存在于其中)。异源DNA分子以适当有义方向和正确的解读码组插入表达系统或载体中。载体含有用于转录和翻译所插入蛋白质编码序列的必需元件(启动子、抑制子、操作子、转录终止序列等)。重组基因或DNA构建体可在其插入表达载体中之前制备。举例来说，使用常规重组DNA技术，启动子效应DNA分子可操作地偶联至编码多肽的DNA分子的5’并且转录终止(即，多聚腺苷酸化序列)可操作地偶联至其3’。
根据此方面，将多核苷酸插入分子对于其为异源的表达系统或载体中。将异源核酸分子相对于启动子和任何其他5’调控分子的正确的有义(5’→3’)方向，和正确的解读码组来插入表达系统或载体中。核酸构建体的制备可使用如SAMBROOK&RUSSELL,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Springs Laboratory Press,2001)所描述的本领域中熟知的标准克隆方法来进行，其全部以引用方式并入本文。Cohen和Boyer的美国专利号4,237,224，其全部以引用方式并入本文，还描述使用限制酶裂解和通过DNA连接酶的连接来产生呈重组质粒形式的表达系统。
合适表达载体包括含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的载体。举例来说，如果大肠杆菌用作宿主细胞，可使用质粒诸如pUC19、pUC18或pBR322。当使用昆虫宿主细胞时，与昆虫宿主细胞相容的适当转移载体包括pVL1392、pVL1393、pAcGP67和pAcSecG2T，其并入融合至所需蛋白质的分泌信号，和pAcGHLT和pAcHLT，其含有GST和6xHis标签(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)。适合于在进行此方面中使用的病毒载体包括腺病毒载体、腺病毒相关联病毒载体、痘苗病毒载体、nodaviral载体和逆转录病毒载体。其他合适表达载体描述于SAMBROOK AND RUSSELL,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL(Cold Springs Laboratory Press,2001)中，其全部以引用方式并入本文。例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中和基因表达以及分析蛋白质过程中操作核酸的许多已知技术和方案详细描述于CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(FredM.Ausubel等人编,2003)中，其全部以引用方式并入本文。
不同遗传信号和处理事件控制许多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使RNA(“mRNA”)翻译)以及随后由宿主细胞产生并表达的抗体或抗体片段的量。DNA的转录依赖于启动子的存在，所述启动子是引导RNA聚合酶的结合，并且由此促进mRNA合成的DNA序列。启动子在其“强度”(即，其促进转录的能力)方面变化。出于表达克隆基因的目的，需要使用强启动子以获得高水平转录和由此表达。取决于所使用的宿主系统，可使用许多合适启动子中的任何一个。例如，在使用大肠杆菌、其噬菌体或质粒时，启动子诸如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ和其他噬菌体的PR和PL启动子包括但是不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等可用于引导相邻DNA片段的高水平转录。另外，混合trp-lacUV5(tac)启动子或通过重组DNA或其他合成DNA技术产生的其他大肠杆菌启动子可用于提供插入基因的转录。当使用昆虫细胞时，合适杆状病毒启动子包括晚期启动子，诸如39K蛋白质启动子或碱性蛋白启动子，和极晚期启动子诸如p10和多角体启动子。在一些情况下，可需要使用含有多个杆状病毒启动子的转移载体。适合于在哺乳动物细胞中引导表达的常见启动子包括但不限于SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒Ela、CMV、立即早期、免疫球蛋白重链启动子和增强子和RSV-LTR。启动子可为组成性的或替代地组织特异性或可诱导的。另外，在一些情况下可使用可诱导(TetOn)启动子。
原核生物中的mRNA的翻译取决于不同于真核生物的那些信号的适当原核生物信号的存在。mRNA在原核生物中的有效翻译需要mRNA上的称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。此序列是位于通常为AUG的起始密码子之前的短mRNA核苷酸序列，所述起始密码子编码蛋白质的氨基末端甲硫氨酸。SD序列与16SrRNA(核糖体RNA)的3’末端互补并且通过与rRNA双重运作以允许核糖体的正确定位来促进mRNA结合至核糖体。关于最大化基因表达的综述，参见Roberts和Lauer,“Maximizing Gene Expression on a PlasmidUsing Recombination in vitro,”Methods in Enzymology,68:473–82(1979)，其全部以引用方式并入本文。
本发明还包括以本文公开的DNA构建体转化的宿主细胞。宿主细胞可为原核或真核细胞。适合于表达本文公开多肽的宿主细胞包括更通常可获得革兰氏阴性细菌中的任何一种。合适的微生物包括绿脓杆菌、大肠杆菌、胃肠炎沙门氏菌(typhimirium)、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、索氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、胸膜肺炎嗜血杆菌、溶血巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、嗜肺军团菌、梅毒密螺旋体、齿垢密螺旋体、口腔密螺旋體、伯氏疏螺旋体、疏螺旋体属、钩端螺旋体、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、摩氏变形杆菌、奇异变形杆菌、普氏立克次体、伤寒立克次体、立氏立克次体、牙龈卟啉单胞菌(类杆菌)、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、空肠弯曲杆菌、中间型弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌、幽门螺旋杆菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、百日咳杆菌、类鼻疽伯克氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、小螺菌、鼻疽假单胞菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和鼠疫杆菌。
除了细菌细胞以外，动物细胞，尤其哺乳动物和昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞或藻类细胞也是转染/转化负载本文公开类型的分离多核苷酸分子的重组表达载体的合适宿主细胞。通常在本领域中使用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、宫颈癌细胞、幼仓鼠肾细胞、COS细胞和许多其他细胞。合适昆虫细胞系包括易患杆状病毒感染的细胞，包括Sf9和Sf21细胞。
用表达载体转化/转染宿主细胞的方法在本领域中是熟知的并且取决于所选择的宿主系统，如SAMBROOK&RUSSELL,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(ColdSprings Laboratory Press,2001)所描述，其全部以引用方式并入本文。对于细菌细胞，合适技术包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。对于真核细胞，合适技术包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导转染，和使用逆转录病毒或任何其他病毒载体的转导。对于昆虫细胞，含有多核苷酸构建体的转移载体与杆状病毒DNA，诸如AcNPV一起共转染，以促进重组病毒的产生。Sf细胞的随后重组病毒感染导致重组蛋白产生的较高速率。不论用于促进蛋白质产生的表达系统和宿主细胞为何，表达抗体、抗体片段或抗体模拟物可使用在本领域中已知并且在PHILIP L.R.BONNER,PROTEIN PURIFICATION(Routledge2007)中描述的标准纯化方法来容易地纯化，其全部以引用方式并入本文。
编码单克隆抗体的多核苷酸可进一步使用重组DNA技术来修饰以产生替代抗体。举例来说，小鼠单克隆抗体的轻和重链的恒定结构域可替换为人抗体的那些区域以产生人源化(或嵌合)抗体，如以上论述。或者，小鼠单克隆抗体的轻和重链的恒定结构域可替换为非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在其他实施方案中，所述恒定区被截断或称除以便产生单克隆抗体的所需的抗体片段。可变区的定点或高密度组合诱变可以用于优化单克隆抗体的特异性和亲和力。
另一个方面涉及包括载体和根据本发明的一或多种单克隆抗体或一或多种其Amd结合部分的药物组合物。此药物组合物可含有两种或更多种抗体或结合片段，其中所有抗体或结合片段识别相同表位。或者，药物组合物可含有抗体或结合片段混合物，其中一或多种抗体或结合片段识别葡萄球菌Amd的一个表位并且一或多种抗体或结合片段识别葡萄球菌Amd的不同表位。举例来说，混合物可含有特异性结合至葡萄球菌Amd的R1或R2结构域的一或多种抗体与结合至Amd的任何其他抗体，诸如结合至Amd的催化结构域的抗体。药物组合物可进一步含有药学上可接受的载体或如以下描述的其他药学上可接受的组分。在一个优选实施方案中，载体是水溶液。
含有本文公开的抗体的药物组合物可施用至患有葡萄球菌感染或处于患有葡萄球菌感染的风险中的受试者。各种输送系统已知并且可用于施用本文公开的抗体。引入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。治疗剂可例如通过输注或快速浓注、通过经由上皮或皮肤粘膜衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)来吸收而施用并且可与其他生物活性剂，诸如化学治疗剂、抗生素剂或其他免疫治疗剂一起施用。施用可全身或局部，即，在葡萄球菌感染位点或直接施用至手术或植入位点。
药物组合物还可包括施用至患者的第二治疗剂，其中第二治疗剂是抗生素剂或免疫治疗剂。示例性抗生素剂包括但不限于万古霉素、妥布霉素、头孢唑林、红霉素、克林霉素、利福平、庆大霉素、夫西地酸、米诺环素、复方新诺明、克林霉素、利奈唑胺、奎奴普丁-达福普丁、达托霉素、替加环素、达巴万星、特拉万星、奥利万星、头孢比普、头孢洛林、艾拉普林、碳青霉烯CS-023/RO-4908463及其组合。示例性免疫治疗剂包括但不限于替巴珠单抗、BSYX-A110、AurexisTM及其组合。抗生素剂和免疫治疗剂的以上列表意图为非限制实例；因而，还涵盖其他抗生素剂或免疫治疗剂。第二治疗剂的组合或混合物也可用于这些用途。这些剂可同时或作为单一制剂来施用。
在一个实施方案中，免疫治疗剂包括特异性结合至葡萄球菌氨基葡萄糖苷酶(Gmd)并且抑制葡萄球菌菌株的体内生长的第二单克隆抗体或其结合部分。优选地，第二单克隆抗体由称为1C11、1E12、2D11、3A8、3H6或4A12的杂交瘤细胞系、其人源化变体或其结合部分产生(Schwarz等人的PCT公布号WO2011/140114和WO2013/066876，其全部以引用形式并入本文)。还根据此方面，第二单克隆抗体的人源化变体优选地为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类别。
在另一个实施方案中，第二单克隆抗体的结合部分包括Fab片段、Fv片段、单链抗体、VH结构域或VL结构域。
药物组合物通常包括一或多种药物载体(例如无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。当药物组合物静脉内施用时，水是较典型载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液可用作液体载剂，尤其用于可注射溶液。适合的药物赋形剂还包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。组合物可用传统粘合剂和载体(如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体诸如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这些组合物将包含治疗有效量的核酸或蛋白质(通常呈纯化形式)和适合量的载体以便提供用于适当施用至所述患者的形式。制剂应该适合于施用模式。
治疗上述细菌感染的组合物的有效剂量可取决于许多不同因素而变化，包括施用模式、目标位点、患者的生理状态、施用的其他药物，和是否治疗是预防性或治疗性。在预防性的应用中，经长时间以相对低的频率的时间间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性的应用中，有时需要以相对短的时间间隔施用相对高的剂量，直到疾病的发展减弱或停止，并且优选直到患者显示病症的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。对于针对葡萄球菌细菌感染的预防性治疗，规定本文公开的药物组合物可在个体暴露于细菌之前施用并且所得免疫响应可抑制或减少细菌感染的严重性以使得细菌可从个体消除。举例来说，单克隆抗体或药物组合物可在手术程序，诸如关节置换或涉及假体植入物的任何手术之前、期间和/或之后立即施用。
对于使用本文公开的抗体或结合片段的被动免疫，剂量在约0.0001至约100mg/kg，并且更通常约0.01至约10mg/kg宿主体重范围内。举例来说，剂量可为约1mg/kg体重或约10mg/kg体重，或在约1至约10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。在一些方法中，可同时施用具有不同结合特异性的两种或两种以上单克隆抗体，在所述状况下，所施用每一种抗体的剂量在所指示的范围内。抗体通常在多个场合施用。单个剂量之间的间隔可为每天、每周、每月或每年。在某些方法中，剂量被调整到获得1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在某些方法中是25-300μg/ml。或者，可将抗体以持续释放制剂形式施用，在所述状况下，需要较低频率的施用。剂量和频率视患者中抗体的半衰期而变化。通常，人抗体展示最长半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。
另一个方面涉及将矫形植入物、组织移植物或医疗装置引入患者的方法，包括向需要这类植入物的患者施用有效量的本文公开的单克隆抗体、结合部分或药物组合物，并且将矫形植入物或医疗装置引入患者。
如本文使用，“引入”医疗装置定义为第一次引入或安装装置或移植物，以及将以前安装的装置或移植物重修表面或以其他方式修整，全部或部分地替换以前安装的装置或移植物，或另外手术修整以前安装的装置或移植物。
在一个实施方案中，引入矫形植入物、医疗装置或移植物的方法包括向需要矫形植入物、医疗装置或移植物的患者全身性施用有效量的单克隆抗体或结合片段或含有所述抗体或其结合片段的药物组合物，或直接施用至植入位点。替代地或附加地，矫形植入物、医疗装置或移植物可在将其植入于植入位点之前、期间或之后立即用单克隆抗体或结合片段或含有所述抗体或结合片段的药物组合物涂布或处理。
矫形植入物可为易于葡萄球菌感染的任何类型的植入物，诸如关节假体、移植物或合成植入物。示例性关节假体包括不限于膝盖假体、髋假体、手指假体、肘假体、肩假体、颞下颌假体和踝假体。也可使用其他假体。示例性移植物或合成植入物包括但不限于血管移植物、心瓣植入物、人工椎间板、半月板植入物，或合成或同种异体移植物前十字韧带、内侧副韧带、外侧副韧带、后十字韧带、阿基里斯腱，和旋转肌群。也可使用其他移植物或植入物。
医疗装置可为易于葡萄球菌感染的任何医疗装置。示例性医疗装置包括但不限于心脏起搏器、脑脊液分流器、透析导管或假体心瓣。
根据此方面，第二治疗剂也可施用至患者。第二治疗剂可为抗生素剂或免疫治疗剂。示例性抗生素剂和免疫治疗剂如上所述。
在一个实施方案中，引入矫形植入物或医疗装置的方法规定包括安装翻修全关节置换物的过程。当发生感染，尤其原始关节置换的葡萄球菌属感染时，唯一可行的治疗是翻修全关节置换。在此实施方案中，感染关节假体首先移除然后治疗患者的潜在感染。感染的治疗在较长时间(即6个月)内发生，在此时间期间患者不能移动的(或只具有有限活动性)并且接收治疗潜在感染的高剂量抗生素和任选地本文公开的一或多种单克隆抗体或结合部分或药物组合物。在治疗潜在感染后，安装新的关节假体。在安装新的关节假体之前立即(即，安装新的关节假体之前两周内)和任选地在所述安装之后，向患者施用本文公开的一或多种单克隆抗体或结合部分，或药物组合物。此治疗可在安装后时段期间重复一次或多次。抗生素治疗可与本文公开的一或多种单克隆抗体或结合部分或药物组合物组合或同时施用。这些治疗有效预防翻修全关节置换期间的感染或再感染。
另一个方面涉及治疗或预防葡萄球菌感染的方法，涉及向易患或患有葡萄球菌感染的患者施用有效量的本文公开的单克隆抗体、单克隆抗体结合部分或药物组合物或其组合。
在治疗葡萄球菌感染的一个实施方案中，重复施用单克隆抗体、单克隆抗体结合部分、药物组合物或其组合。初始和重复施用可相对于其他治疗同时或依序进行并且全身进行或直接进行施用至葡萄球菌感染位点，或两种情况都有。
治疗葡萄球菌感染的方法可用于治疗包括但不限于皮肤、肌肉、心脏、呼吸道、胃肠道、眼睛肾和泌尿道感染和骨骼或关节感染的位点处的葡萄球菌感染。
在一个实施方案中，进行此方法以通过向患有葡萄球菌骨骼或关节感染的患者施用有效量的单克隆抗体或其结合片段或药物组合物来治疗骨髓炎。施用这些药剂或组合物可使用上述任何途径来进行；在某些实施方案中，可进行直接施用至骨骼或关节感染位点。
在每个前述实施方案中，第二治疗剂也可施用至患者。第二治疗剂可为抗生素剂或免疫治疗剂。示例性抗生素剂和免疫治疗剂如上所述。
如本文公开的治疗方法可用于治疗有需要的任何患者，包括人和非人哺乳动物，然而，所述方法尤其适用于任何年龄的免疫受损患者，以及年长于50岁龄的患者。
在前述实施方案中，预防性或治疗性治疗方法可减少感染率、感染严重性、感染持续时间或其任何组合。在某些实施方案中，预防性或治疗性治疗方法可减少或完全地消除全部数量的SRC或脓肿，和/或增加无菌SRC或脓肿的数量(假定SRC或脓肿存在)。在某些实施方案中，设想骨质溶解病变的部分或完全愈合，如病灶大小或体积的减少所指示。
另一个方面涉及确定样品中存在葡萄球菌的方法，其涉及使样品暴露于本文公开的单克隆抗体或结合部分并且检测是否在单克隆抗体或结合部分与存在于样品中的葡萄球菌或葡萄球菌酰胺酶之间形成免疫复合物，由此所述暴露之后的免疫复合物的存在指示样品中的葡萄球菌的存在。
样品可为血液样品、血清样品、血浆样品、粘膜相关联淋巴组织(MALT)样品、脑脊液样品、关节液样品、胸膜液样品、唾液样品、尿样或组织活检样品。
检测免疫复合物的形成可通过在本领域中熟知的方法来进行。在一个实施方案中，检测使用免疫测定来进行。所用免疫测定方法可为已知免疫测定方法，并且例如，可提及常见免疫测定方法诸如胶乳凝集方法，浊度方法，放射免疫测定方法(例如，RIA和RIMA)，酶免疫测定方法(例如，ELISA和EIA)，凝胶扩散沉淀反应，流式细胞术，免疫电泳(例如蛋白质印迹)，斑点印迹方法，免疫扩散测定，蛋白质A免疫测定，荧光免疫测定(例如，FIA和IFMA)，免疫色谱方法和抗体阵列方法，但是不限于这些方法。这些免疫测定方法本身在此领域中是已知的，并且可容易地由本领域技术人员进行。
单克隆抗体或结合部分可通过在本领域中已知的各种方法来直接标记。标记充当确定单克隆抗体或结合部分在免疫测定中由分析物结合的程度的试剂手段。标记可为不限于放射性同位素、酶、发色团、荧光团、光吸收或折射颗粒。优选地，标记是放射性同位素标记、荧光团或化学发光标记。优选尽可能广泛地标记抗体或结合部分而不破坏其免疫反应性。
实施例
以下实例意欲例示实施要求保护的标的，但是决不意欲限制其范围。
实施例1–制备抗原
制备金黄色葡萄球自溶素菌的整个酰胺酶结构域的重组形式，其包括其N末端附近的六组氨酸序列(His-Amd)。His-Amd的开放解读码组通过收集金黄色葡萄球菌自溶素的已知序列、使用GeneiousTM软件来确定共有蛋白质序列，然后优化用于在大肠杆菌中表达的密码子来设计。His-Amd的编码共有蛋白质和编码开放解读码组序列识别为以下SEQ IDNO：1和2。
SEQ ID NO：1(Hex-组氨酸前导序列加上自溶素aa 198-775)
MHHHHHHSASAQPRSVAATPKTSLPKYKPQVNSSINDYIRKNNLKAPKIEEDYTSYFPKYAYRNGVGRPEGIVVHDTANDRSTINGEISYMKNNYQNAFVHAFVDGDRIIETAPTDYLSWGVGAVGNPRFINVEIVHTHDYASFARSMNNYADYAATQLQYYGLKPDSAEYDGNGTVWTHYAVSKYLGGTDHADPHGYLRSHNYSYDQLYDLINEKYLIKMGKVAPWGTQSTTTPTTPSKPTTPSKPSTGKLTVAANNGVAQIKPTNSGLYTTVYDKTGKATNEVQKTFAVSKTATLGNQKFYLVQDYNSGNKFGWVKEGDVVYNTAKSPVNVNQSYSIKPGTKLYTVPWGTSKQVAGSVSGSGNQTFKASKQQQIDKSIYLYGSVNGKSGWVSKAYLVDTAKPTPTPTPKPSTPTTNNKLTVSSLNGVAQINAKNNGLFTTVYDKTGKPTKEVQKTFAVTKEASLGGNKFYLVKDYNSPTLIGWVKQGDVIYNNAKSPVNVMQTYTVKPGTKLYSVPWGTYKQEAGAVSGTGNQTFKATKQQQIDKSIYLFGTVNGKSGWVSKAYLAVPAAPKKAVAQPKTAVK
SEQ ID NO：2
ATGCACCATCACCACCACCACAGCGCAAGCGCACAGCCTCGTTCCGTCGCCGCCACCCCGAAAACCAGCTTGCCGAAGTACAAACCGCAAGTTAATAGCAGCATCAACGACTACATCCGCAAAAACAACCTGAAGGCCCCGAAAATTGAAGAGGACTATACCAGCTATTTCCCGAAATATGCTTACCGTAATGGTGTCGGTCGTCCGGAGGGTATTGTGGTCCACGACACCGCGAATGACCGTAGCACCATCAACGGTGAGATTAGCTACATGAAAAACAATTACCAAAACGCGTTCGTGCACGCCTTCGTCGATGGCGATCGCATCATCGAAACCGCGCCAACCGACTATCTGTCCTGGGGTGTGGGTGCCGTTGGCAACCCGCGTTTCATCAATGTGGAGATTGTTCATACCCACGACTACGCGAGCTTTGCACGTAGCATGAACAACTACGCCGATTATGCTGCAACGCAGCTGCAGTACTACGGCCTGAAACCGGATAGCGCGGAGTATGACGGTAACGGTACGGTGTGGACGCATTATGCGGTGAGCAAATACCTGGGTGGTACCGATCATGCTGATCCGCATGGCTACCTGCGCTCTCACAACTATAGCTACGACCAGTTGTACGACCTGATCAATGAGAAATATCTGATTAAGATGGGTAAGGTTGCACCGTGGGGTACGCAGAGCACCACGACGCCGACCACGCCGAGCAAACCGACGACCCCGTCCAAACCGTCTACCGGCAAACTGACGGTCGCGGCTAATAACGGTGTCGCGCAGATTAAACCGACCAACAGCGGTCTGTACACCACCGTCTATGATAAAACGGGCAAAGCCACCAATGAGGTTCAAAAGACGTTCGCAGTTAGCAAAACGGCGACCCTGGGTAACCAAAAGTTCTACCTGGTTCAGGATTACAATAGCGGCAACAAATTTGGTTGGGTGAAAGAAGGCGACGTTGTGTACAATACCGCGAAGTCCCCGGTGAACGTTAATCAGAGCTATAGCATCAAGCCGGGTACCAAATTGTATACGGTGCCGTGGGGTACCAGCAAGCAAGTTGCGGGTAGCGTCAGCGGCTCTGGTAACCAGACCTTCAAGGCGTCTAAGCAACAACAAATTGACAAAAGCATTTACCTGTATGGTAGCGTTAATGGTAAAAGCGGCTGGGTGTCTAAAGCGTATCTGGTCGACACCGCAAAGCCGACGCCAACGCCGACCCCGAAGCCGAGCACCCCAACCACCAACAACAAGCTGACGGTCAGCTCCCTGAATGGTGTTGCGCAAATCAATGCGAAGAATAATGGCCTGTTTACCACCGTTTACGATAAGACGGGCAAGCCAACGAAAGAAGTCCAGAAAACCTTTGCTGTCACCAAAGAAGCCAGCCTGGGCGGTAACAAGTTCTATCTGGTTAAGGACTACAACTCCCCGACGCTGATCGGTTGGGTCAAACAAGGCGATGTCATTTACAATAACGCGAAAAGCCCGGTTAATGTGATGCAAACCTATACCGTCAAACCGGGTACGAAGCTGTATTCCGTTCCGTGGGGCACGTACAAACAAGAAGCAGGCGCGGTGAGCGGTACCGGCAATCAGACCTTTAAGGCCACCAAGCAGCAGCAGATCGATAAATCTATTTACTTGTTTGGCACCGTGAATGGCAAGAGCGGTTGGGTTTCTAAGGCATACCTGGCGGTGCCGGCAGCACCGAAGAAGGCGGTGGCGCAGCCAAAGACCGCAGTGAAG
编码His-Amd的DNA分子通过DNA2.0(Menlo Park，CA)重新合成，然后插入pJexpress大肠杆菌表达载体中。
在大肠杆菌中表达的His-Amd蛋白质主要呈不溶性包含体形式，其收获并溶解于具有8M尿素的PBS中。在TALON树脂上的金属螯合色谱来进一步纯化之后，His-Amd通过相对于含有1mM Zn2+和逐步减小水平尿素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的广泛透析过程来复性。
Amd催化结构域(His-Amd-cat)以相同方式制备，除了编码R1和R2结构域的开放解读码组部分省略以外(参见图1)。His-Amd-cat的编码共有蛋白质和编码开放解读码组序列识别为以下SEQ ID NO：3和4。
SEQ ID NO：3(Hex-组氨酸前导序列加上自溶素aa 198-441)
MHHHHHHSASAQPRSVAATPKTSLPKYKPQVNSSINDYIRKNNLKAPKIEEDYTSYFPKYAYRNGVGRPEGIVVHDTANDRSTINGEISYMKNNYQNAFVHAFVDGDRIIETAPTDYLSWGVGAVGNPRFINVEIVHTHDYASFARSMNNYADYAATQLQYYGLKPDSAEYDGNGTVWTHYAVSKYLGGTDHADPHGYLRSHNYSYDQLYDLINEKYLIKMGKVAPWGTQSTTTPTTPSKPTTPSKPSTGK
SEQ ID NO：4
ATGCACCATCACCACCACCACAGCGCAAGCGCACAGCCTCGTTCCGTCGCCGCCACCCCGAAAACCAGCTTGCCGAAGTACAAACCGCAAGTTAATAGCAGCATCAACGACTACATCCGCAAAAACAACCTGAAGGCCCCGAAAATTGAAGAGGACTATACCAGCTATTTCCCGAAATATGCTTACCGTAATGGTGTCGGTCGTCCGGAGGGTATTGTGGTCCACGACACCGCGAATGACCGTAGCACCATCAACGGTGAGATTAGCTACATGAAAAACAATTACCAAAACGCGTTCGTGCACGCCTTCGTCGATGGCGATCGCATCATCGAAACCGCGCCAACCGACTATCTGTCCTGGGGTGTGGGTGCCGTTGGCAACCCGCGTTTCATCAATGTGGAGATTGTTCATACCCACGACTACGCGAGCTTTGCACGTAGCATGAACAACTACGCCGATTATGCTGCAACGCAGCTGCAGTACTACGGCCTGAAACCGGATAGCGCGGAGTATGACGGTAACGGTACGGTGTGGACGCATTATGCGGTGAGCAAATACCTGGGTGGTACCGATCATGCTGATCCGCATGGCTACCTGCGCTCTCACAACTATAGCTACGACCAGTTGTACGACCTGATCAATGAGAAATATCTGATTAAGATGGGTAAGGTTGCACCGTGGGGTACGCAGAGCACCACGACGCCGACCACGCCGAGCAAACCGACGACCCCGTCCAAACCGTCTACCGGCAAA
实施例2-接种小鼠和制备杂交瘤
对于初始杂交瘤融合(融合#1)，六个雌性Balb/c小鼠通过腹膜内注射以七周间隔用Sigma Adjuvant System(Sigma，Cat.No.S6322)中的75μg His-AmdR1R2免疫两次。选择在固定His-AmdR1R2上的ELISA中具有最高滴度的两只小鼠用于杂交瘤融合。在处死和杂交瘤融合之前四天，每只小鼠接受350μg His-AmdR1R2的腹膜内最终免疫。
对于第二杂交瘤融合(融合#2)，Balb/c小鼠免疫两次：第一次给予SigmaAdjuvant System(Sigma，Cat.No.S6322)中的120μg来自GenScript的His-AmdR1R2-B(批号222933S05/P20011303)，并且以十二周间隔第二次用100μg的与匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的His-AmdR1R2-B(Imject EDC mcKLH Spin Kit；Thermo Scientific；Cat#77671)免疫。选择在固定His-AmdR1R2上的ELISA中具有最高滴度的两只小鼠用于杂交瘤融合。处死和杂交瘤融合之前四天，每只小鼠接受100μg的His-AmdR1R2的腹膜内最终免疫。
杂交瘤通过常规方法从脾细胞制备。
实施例3–单株抗体的表征
新的单克隆抗体在多个相关蛋白质上筛选以确定其识别原生Amd(并非仅重组形式)和是否其表位存在于催化(C)或细胞壁结合结构域(R1、R2或R3)上。用于筛选单克隆抗体的蛋白质在下表1中识别。
表1：用于筛选单株抗体的蛋白质
Figure BDA0001015363610000531
筛选测定使用在表1中识别为捕获抗原的蛋白质通过ELISA来进行。ELISA测试使用广泛实施规范来进行。具体来说，将抗原吸附至NUNC Maxisorp微量滴定板的孔上。每个抗原在2μg/mL下制备为磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液并且100μL添加至指定微量滴定孔并且允许抗原在RT下吸附1小时或在4℃下吸附过夜。孔通过添加200μL的3％牛血清清蛋白(BSA)来阻断，而不移除涂布抗原，并且在RT下孵育1小时或在4℃下孵育过夜。然后，涂布并阻断的板用补充0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)冲刷3X并且直接使用或存储在4℃下。
将无细胞杂交瘤培养上清液添加至指定孔并且在RT下孵育1小时，然后用PBS-T冲刷六次。然后在0.1-0.5μg/mL下在PBS-T中以100μL/孔来添加二次抗体，辣根过氧物酶-缀合山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechnology)，并且在RT下孵育1小时。微量滴定板再次用PBS-T冲刷六次，然后通过添加100μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)或2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)来显影。这些ELISA的结果在下表2中示出。
表2.成功克隆并表征抗Amd mAb的概述
Figure BDA0001015363610000541
ND＝未确定。
实施例4–体外抑制Amd催化活性
可有助于治疗性单克隆抗体的效力的特性是其直接抑制细菌生长和存活必需的酶诸如酰胺酶的活性。通过测量一些抗Amd mAb抑制酰胺酶使金黄色葡萄球菌肽聚糖的混浊悬浮液澄清的能力的程度来测试其对于酰胺酶活性的抑制。来自融合#1的八种抗体的结果呈现于图2中。MAb Amd1.6是酰胺酶活性的有效抑制剂，而其他抗体不是有效抑制剂，并且似乎是低亲和力抑制剂的Amd1.16可能是例外。所有抗体的结果在表2中总结。
实施例5–大多数抗Amd mAb使金黄色葡萄球菌沉淀
治疗性单克隆抗体的效力可能至关重要的另一个特性是识别可从完整细菌细胞的外部接近的抗原性结构(表位)。此识别的可见表现是抗体介导的个别细菌群聚至较大聚集体，所述聚集体从悬浮液沉淀，产生富含细胞的球团和不太混浊的上清液。许多候选mAb形成明显沉淀物，如图3描绘。来自融合1和2的候选mAb的沉淀活性的概述是在表2中。
实施例6–每个mAb的独特性和基于测序来识别种系指定
基因指定通过将抗Amd重链和轻链的核苷酸序列与国家生物技术信息中心的IgBLAST中的已知鼠科V-区域序列的文件匹配来识别。该分析的结果呈现于下图3中。来自融合#1的每个抗体是唯一的，除了可能Amd1.1和1.4来自于相同种系VH基因片段以外。来自融合#2的两种抗体与在融合#1中分离的mAb共有重链VH和JH基因片段(mAb Amd2.4与mAbAmd1.11；mAb Amd2.2与mAb Amd1.7)。在每个情况下，轻链是不同的。
表3：最很可能的种系VH、JH、VL和JL基因片段
Figure BDA0001015363610000551
Figure BDA0001015363610000561
圆括号中的数字是抗Amd序列与假定种系前体之间观察到的非同义碱基变化的数目。NA＝测序是不成功的。
实施例7-测量抗Amd mAb对于金黄色葡萄球菌酰胺酶的亲和力
抗细菌抗体的必需特性是对于细菌抗原的高亲和力。亲和力越高，预防或治疗所需要剂量越低。虽然一些治疗性抗体具有10nM(KA＝108M-1)范围内的表达为KD的亲和力，但是总体上需要具有KD～1nM(KA～109M-1)的抗体。固定抗Amd mAb对于可溶性His-AmdR1R2-B的亲和力使用BiacoreT-200上的表面等离子体共振技术来测量。mAbAmd1.6的代表性数据呈现于图4中。虽然其对于Amd的平均亲和力是约2.1nM，图4示出约1nM的测量亲和力。对于其他候选mAb的测量亲和力在表2中列出。
实施例8–抗Amd mAb Amd1.6抑制金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1的体外生物膜形成
已经报告Amd参与生物膜的形成(Bose等人,“Contribution of theStaphylococcus aureus Atl AM and GL Murein Hydrolase Activities in CellDivision,Autolysis,and Biofilm Formation,”PLoS One 7:e42244(2012)；Chen等人,“Secreted Proteases Control Autolysin-mediated Biofilm Growth ofStaphylococcus aureus,”J Biol Chem.288:29440-29452(2013)；Houston等人,“Essential Role for the Major Autolysin in the Fibronectin-binding Protein-mediated Staphylococcus aureus Biofilm Phenotype,”Infect Immun.79:1153-1165(2011)，其各自全部以引用方式并入本文)。生物膜形成是被认为对于体内金黄色葡萄球菌感染，尤其与矫形植入物相关联的感染的持续性起根本作用的过程(Ehrlich和Arciola,“From Koch's Postulates to Biofilm Theory:The Lesson of Bill Costerton,”Internat’l J Artificial Organs 35:695-699(2012)，其全部以引用方式并入本文)。为了测量抗Amd mAb1.6抑制生物膜形成的能力，金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1在专门设计用于测量生物膜形成的卡尔加里板中生长(Ceri等人,“The Calgary Biofilm Device:NewTechnology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities ofBacterial Biofilms,”J Clin Microbiol.37:1771-1776(1999)，其全部以引用方式并入本文)。自溶素基因(Δatl)和在其Amd(Δamd)和Gmd(Δgmd)子结构域中的缺失突变体各自形成与WT UAMS-1相比大致上更小的生物膜(WT的20-35％)。单独或与抗Gmd mAb 1C11组合的Amd1.6(参见Schwarz等人的PCT公布号WO2011/140114，其全部以引用方式并入本文)减少生物膜形成超过50％，而具有不相关特异性的同种型匹配mAb没有效应(图5)。通过外源性抗Amd mAb来抑制细胞外Amd与缺失自溶素基因几乎一样有效。
实施例9–抗Amd mAb Amd1.6减少植入物相关联骨髓炎的体内模型中的生物膜形成
因为植入物相关联生物膜被认为是矫形适应症中的持续感染的主要来源，减少模型植入物上的生物膜形成程度的能力可理解为抗Amd预防法的潜在临床益处的量度。使用植入物相关联骨髓炎的鼠科模型，其中模型植入物在植入物上具有0.5x 2.0mm平面的限定关注区域，测量在用金黄色葡萄球菌感染14天期间以生物膜覆盖的面积。最大感染程度是如图6A所观察到的感染程度的约40-50％，其中小鼠用不相关特异性的同种型匹配抗体处理。相对于对照，单独或与抗Gmd mAb 1C11组合的mAb Amd1.6减少生物膜的形成约50％(图6B、6C、6E)。生物膜形成的此减少程度与自溶素基因(Δatl)的遗传缺陷导致的减少程度是类似的(图6B、6D、6E)，指示在生物膜形成方面，内部遗传缺失和通过外源性抗Amd抗体的干扰在功能上是等效的。
实施例10–用抗Amd mAb Amd1.6被动免疫减少由金黄色葡萄球菌感染导致的骨骼溶解的体积
骨骼中的金黄色葡萄球菌感染的一种特有特征是由感染细菌引起的炎症性响应所导致的骨骼溶解。因此，溶解的骨骼的体积(骨质溶解体积)的减少被视为限制感染的量度。为了获知是否抗Amd mAbAmd1.6将限制骨骼破坏，将五只6-10周龄、雌性Balb/c小鼠的群组用40mg/kg总剂量的PBS(未处理的对照)、抗Gmd mAb 1C11、抗Amd mAb Amd1.6或组合(1C11+Amd1.6)来腹膜内免疫。二十四小时后，每个小鼠在其右胫骨中插入用USA300LAC::lux，一种生物发光CA-MRSA菌株污染的销钉。
所有小鼠的生物发光成像在第0、3、5、7、10和14天使用XenogenIVIS Spectrum成像系统(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)来进行，并且第3天的峰BLI如前所述来量化(Li等人,“Quantitative MouseModel of Implant-associated Osteomyelitis andthe Kinetics of MicrobialGrowth,Osteolysis,and Humoral Immunity,”J Orthop Res26:96–105(2008)，其全部以引用方式并入本文)。来自每个治疗组的代表性BLI在图7A中示出，其指示细菌负载存在于每个治疗组中。
允许所得感染发展十四天，此时将动物处死并且将感染胫骨收获以供通过显微CT来分析，如前所述(Li等人,“Effects of Antiresorptive Agents on Osteomyelitis:Novel Insights into the Pathogenesis of Osteonecrosis of the Jaw,”Ann N YAcad Sci 1192:84–94(2010)，其全部以引用方式并入本文)。在未处理的对照中，内侧和外侧端面上的骨骼溶解是广泛的(图7B)；骨质溶解体积在0.4mm3内取平均值。骨质溶解体积的减少在抗体处理小鼠的所有三个群组中测量(图7C)。在接受组合疗法的一个个体中，骨质溶解体积计算为0，指示感染植入物位点的完全愈合。此个体中的组合抗体疗法的效应与无菌销钉和用有效抗生素疗法治愈的感染销钉等效(即，Li等人,“Quantitative MouseModel of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of MicrobialGrowth,Osteolysis,and Humoral Immunity,”J Orthop Res 26:96–105(2008)中的庆大霉素疗法，其全部以引用方式并入本文)。认为此个体代表在不存在抗生素疗法的情况下感染植入物位点的第一例成功愈合。
实施例11–用抗Amd mAb Amd1.6被动免疫显著减少细菌扩散
脓肿的形成是感染严重性的另一个适应症。所形成的脓肿的数目在实施例10中检查的相同小鼠中测量。组织学切片用橙黄G/阿尔新蓝(ABG/OH)染色，其揭示由未染色区域划定界限的呈圆形炎症性宿主细胞区域形式的脓肿，并且有时其中心具有深红色染色病灶。典型地，病灶是葡萄球菌脓肿群落(SAC)；炎症细胞是嗜中性白细胞，在中心附近大部分死亡并且在周界附近大部分存活并且未染色区域是由纤维蛋白形成的包膜。在未处理的小鼠中，形成多个脓肿(图8A)，并且每个胫骨平均有几乎4.5个脓肿(图8C)。相比之下，mAbAmd1.6处理小鼠平均只有两个脓肿，与用抗Gmd mAb 1C11或用组合处理的小鼠一样(图8B、8C)。
实施例12–用单独或与抗Gmd 1C11组合的抗Amd mAb Amd1.6被动免疫促进形成无菌脓肿并且加速骨骼愈合
图8B呈现的相同组织学切片的详细检查揭示意外的发现。一致地，髓内革兰氏染色脓肿仅发现于PBS处理小鼠的胫骨中(图9A-B)，而抗Atl处理小鼠的胫骨中的病灶是不含有革兰氏阳性细菌的无菌脓肿的特征(图9C-H)。此外，虽然安慰剂处理小鼠的胫骨中的病灶具有葡萄球菌脓肿群落(SAC)的明显组织学特征(Cheng等人,“Genetic Requirementsfor Staphylococcus aureus Abscess Formation and Persistence in Host Tissues,”FASEB J 23(10):3393-3404(2009)；Cheng等人,“Contribution of Coagulases TowardsStaphylococcus aureus Disease and Protective Immunity,”PLoS Pathog 6(8):e1001036(2010)，其各自全部以引用方式并入本文)，但是在抗Atl处理小鼠的胫骨中未观察到SAC(将图10A-B与图10C-H比较)。最后，并且最意外地，发现组合抗Amd和抗Gmd被动免疫不仅到第14天清除MRSA感染(证实在第3天是代谢活性的；图7A)，而且允许骨骼愈合，已经证明这在植入物相关联骨髓炎的此鼠科模型中从未发生过(比较图11A-C)。具体来说，金黄色葡萄球菌污染植入物的骨整合在图11B中得到记录，其显示与在无菌销钉对照中所观察到的水平类似水平的围绕销钉和皮质的新骨骼形成(图11C)。还使用精氨酸酶-1-阳性染色来分析组织愈合M2巨噬细胞的存在或不存在。不能进入PBS处理小鼠的胫骨中的SAC(图11D)的M2巨噬细胞广泛侵入组合抗Amd和抗Gmd处理小鼠的胫骨中的无菌脓肿以促进典型组织愈合(图11E)(Murray和Wynn,“Protective and Pathogenic Functions ofMacrophage Subsets,”Nat Rev Immunol 11(11):723-737(2011)，其全部以引用方式并入本文)。
实施例13–产生人源化抗Amd mAb Amd1.6
Amd1.6抗体的轻和重链的可变区使用引物来PCR扩增以允许克隆至人抗体表达载体中，Tiller等人所描述(“Efficient Generation of Monoclonal Antibodies fromSingle Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning,”J.Immunol.Methods 329(1-2):112-24(2008)，其全部以引用方式并入本文)。将含有Amd1.6轻和重链可变区和人κ和IgG1恒定区的质粒制备并且共转染至HEK293细胞中。3天之后，将培养基从细胞移除并且通过ELISA来测定人IgG的存在和结合至固定Amd蛋白质。结合抗体使用偶联至辣根过氧物酶和3,3',5,5'四甲基联苯胺底物的山羊抗人IgG抗体来检测。
为了证实人:小鼠嵌合Amd1.6与亲本小鼠Amd1.6一样与Amd反应，将每一种抗体针对其抑制His-Amd的酶活性的能力来测试。
人源化Amd1.6抗体可用于经历初次全关节置换的老年患者(>65岁)的I期临床试验。人源化Amd1.6抗体单独使用和与人源化1C11抗Gmd抗体组合使用，如美国专利申请公布号20130110249所描述，其全部以引用方式并入本文。
实施例14–产生人源化抗Amd mAb Amd2.1
Amd2.1抗体的轻和重链的可变区使用引物来PCR扩增以允许克隆至人抗体表达载体中，Tiller等人所描述(“Efficient Generation of Monoclonal Antibodies fromSingle Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning,”J.Immunol.Methods 329(1-2):112-24(2008)，其全部以引用方式并入本文)。将含有Amd2.1轻和重链可变区和人κ和IgG1恒定区的质粒制备并且共转染至HEK293细胞中。3天之后，将培养基从细胞移除并且通过ELISA来测定人IgG的存在和结合至固定Amd蛋白质。结合抗体使用偶联至辣根过氧物酶和3,3',5,5'四甲基联苯胺底物的山羊抗人IgG抗体来检测。
为了证实人:小鼠嵌合Amd2.1与亲本小鼠Amd2.1一样与Amd反应，将每一种抗体针对其抑制His-Amd的酶活性的能力来测试。
人源化Amd2.1抗体可用于经历初次全关节置换的老年患者(>65岁)的I期临床试验。人源化Amd2.1抗体单独使用和与人源化1C11抗Gmd抗体组合使用，如美国专利申请公布号20130110249所描述，其全部以引用方式并入本文。
尽管本文已经详细示出和描述了优选实施方案，相关领域技术人员显而易见的是可在不脱离本发明的精神的情况下进行各种修改、添加、替换等，因此，这些修改、添加、替换等被认为在如以下权利要求书中定义的本发明的范围内。
Figure IDA0001015363690000011
Figure IDA0001015363690000021
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Claims (8)

1.一种分离的人源化单克隆抗体或抗体的抗原结合部分，其特异性结合至葡萄球菌属自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(Amd)催化结构域且包含如SEQ ID NO:11所示的重链可变结构域和如SEQ ID NO:37所示的轻链可变结构域的互补决定区序列。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体的抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分抑制金黄色葡萄球菌的体内生长。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体的抗原结合部分，其抑制Amd催化活性。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述人源化单克隆抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类别。
5.如权利要求1所述的抗体的抗原结合部分，其包括Fab片段、Fv片段或单链抗体。
6.一种药物组合物，其包含载体和一种或多种如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体的抗原结合部分。
7.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体的抗原结合部分，其结合至包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的Amd。
8.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体的抗原结合部分，其包含如SEQ ID NO:65-67所示的重链可变结构域互补决定区和如SEQ ID NO:68和69所示的轻链可变结构域互补决定区。
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