CN102890153A - 脂磷壁酸elisa检测试剂盒及其制备技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂磷壁酸单克隆抗体的制备及应用其建立ELISA检测试剂盒。本产品是生物医药领域高科技产品，是一种体外诊断试剂。本产品经检索填补了国内空白，改变费时费力的血培养方法检测金黄色葡萄球菌的现状，采用灵敏度高特异性强的酶联免疫方法，缩短检测时间。本产品以金黄色葡萄球菌细胞壁中提取的脂磷壁酸抗原免疫Balb/c雌性小鼠，获得单克隆细胞株L，经检测为IgG免疫球蛋白，抗体效价为1×10⁶。通过饱和硫酸铵沉淀及亲和层析技术纯化单克隆抗体。将脂磷壁酸作为包被原，获得的单克隆抗体L作为酶标抗体，建立竞争法ELISA试剂盒，用来诊断金黄色葡萄球菌感染，作为临床诊断的参考之一。

Description

脂磷壁酸ELISA检测试剂盒及其制备技术

技术领域：

本发明涉及一种脂磷壁酸ELISA检测试剂盒及其制备技术，用于临床金黄色葡萄球菌感染的快速检测，属于生物医药领域范畴。

背景技术：

随着人群老龄化、器官移植手术的广泛开展及免疫抑制剂的使用，以及社会因素的影响，革兰氏阳性细菌感染发病率有所升高，菌血症的病原菌中革兰氏阳性菌占59.6％，其中葡萄球菌属占38.6％。目前自动化的血培养系统已在临床微生物实验室中广泛使用，通常情况下，当出现阳性报警瓶时，首先将瓶中的菌液转种于血平板，然后做鉴定和药敏试验，最后出结果是在阳性报警后的48-72小时，此方法费时费力且效率低下，对临床的抗感染治疗十分不利，因此，临床诊断革兰氏阳性菌感染急需一种快速、准确、敏感的检测方法。

酶联免疫吸附分析(ELISA)是目前较为先进的标志物检测法，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，近年已在国内外被广泛应用。本产品制备了高特异性的脂磷壁酸单克隆抗体，并应用其建立了ELISA检测试剂盒，确立了检测条件，检测时间为两个半小时左右，为临床诊断和治疗赢得时间。

发明内容：

本发明提供了一种脂磷壁酸ELISA检测试剂盒，应用于金黄色葡萄球菌的临床检测。

本发明涉及的脂磷壁酸单克隆抗体的制备方法主要涉及以下几个方面的内容：

1、使用动物为Babl/c小鼠6周龄，雌性，驯化一周后开始免疫。

2、磷壁酸免疫原(外购Sigma-Aldrich公司)，免疫浓度为75μg/只，腹腔注射，体积为0.5ml/只，混合等量的弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂/生理盐水，并充分乳化。

3、初次免疫混合等量的弗氏完全佐剂，二次和三次免疫混合等量的不完全弗氏佐剂，末次免疫混合等量的生理盐水。

4、阳性克隆筛选采用直接酶联免疫反应法检测，酶标抗体选用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG。

5、末次免疫后，脱颈猝死小鼠，取其脾脏细胞；另取阴性对照健康小鼠，获取腹腔巨噬细胞制备成饲养细胞；杂交瘤细胞选用sp2/0骨髓瘤细胞。

6、在无菌条件下，将脾脏细胞∶骨髓瘤细胞＝5∶1比例混合于基础培养基中，使用PEG1450作为融合剂，按照常规细胞融合技术进行细胞融合。融合后，转移至预先加有饲养细胞的HAT选择培养基中培养。

7、采用直接酶联免疫反应法筛选阳性融合细胞。

8、将阳性孔应用有限稀释法进行杂交瘤的克隆化培养。

9、将获得的单克隆细胞进行亚型鉴定，结果显示为IgG型，命名为L。

10、腹水的制备。将10周龄的Balb/c雌鼠提前一周腹腔注射降植烷，0.5ml/只。同时将单克隆细胞于10％胎牛血清的1640培养基中培养，按照每株单抗每只鼠5×106个细胞腹腔注射0.5ml。10天左右待腹水长成后收集，4000r/min，离心20min，收集上清液，于-20℃冻存。

本发明涉及的脂磷壁酸单克隆抗体分离纯化的方法主要涉及以下几个方面的内容：

1、饱和硫酸铵分级沉淀，浓度分别为50％、33％，4℃过夜后，10000rpm，4℃离心20min，0.01M PBS重悬沉淀至原体积。

2、将上述提取后的溶液进行透析，透析液采用pH值为7.4、0.01M的PBS，透析时间为48小时。

3、透析后进行抗体的纯化，采用亲和层析，应用Protein G纯化柱，pH值为7.0、0.02M的PB平衡液平衡，0.1M、PH 2.7的Glycine-HCl洗脱液洗脱。纯化后的抗体于-20℃保存备用。

本发明应用制备的抗体L建立竞争法ELISA试剂盒。试剂盒的建立主要涉及以下几个方面的内容：

1、确定最佳抗原包被浓度与酶标抗体工作稀释度。进行梯度稀释抗原与梯度稀释酶标抗体，应用棋盘法检测，确立最佳工作稀释度。

2、血清标本前处理方法的选择。对血清标本进行稀释、煮沸、EDTA处理液处理条件的对比试验，经检测确定前处理条件为血清稀释十倍后煮沸5min。

3、试剂盒最终确立的检测条件为：血清标本十倍稀释后煮沸5min，孔外与酶标抗体37℃温育1小时后加入已包被脂磷壁酸抗原的酶标板中，37℃温育1小时，洗板5次，每次2min，采用四甲基联苯胺(TMB)作为显色底物，显色时间为20min，2M H₂SO₄终止液终止后，经酶标仪测定其OD值。

4、质控方法：阈值法，即每个试剂盒中装有阳性对照、阴性对照和阈值对照品，每个对照品均应控制在一定范围内。

本发明与现有的血培养方法相比较具有如下优点：本发明简便、适用、快速、易操作和判读，灵敏度高特异性强，可及时提供临床诊断数据，作为临床诊断的参考之一。

具体实施方式：

实施例1：

本发明通过抗原免疫获得高特异性的脂磷壁酸单克隆抗体，对其进行分离纯化后建立竞争法ELISA试剂盒。抗体分离纯化采用硫酸铵分级沉淀及亲和层析技术。应用的硫酸铵浓度分别为50％、33％，4℃过夜后，10000rpm，4℃离心20min，0.01M PBS重悬沉淀至原体积。经pH值为7.4、0.01M的PBS透析48小时后，应用Protein G纯化柱，pH值为7.0、0.02M的PB平衡液平衡，0.1M、PH 2.7的Glycine-HCl洗脱液洗脱。纯化后的抗体于-20℃保存备用。

实施例2：

本发明进行梯度稀释抗原与梯度稀释酶标抗体，应用棋盘法检测，确立最佳工作稀释度。对血清标本进行稀释、煮沸、EDTA处理液处理条件的对比试验，经检测确定前处理条件为血清稀释十倍后煮沸5min。通过优化确立试剂盒检测条件为：血清标本十倍稀释后煮沸5min，孔外与酶标抗体37℃温育1小时后加入已包被脂磷壁酸抗原的酶标板中，37℃温育1小时，洗板5次，每次2min，加显色液反应20min后终止，经酶标仪测定其OD值。

Claims (9)

1.脂磷壁酸ELISA检测试剂盒，其特征在于：利用从金黄色葡萄球菌发酵物提取的脂磷壁酸抗原免疫Balb/c小鼠，制备单克隆抗体L，经检测为IgG免疫球蛋白，抗体效价为1×10⁶。经小鼠腹腔注射获得腹水，采用饱和硫酸铵沉淀与亲和层析提取纯化抗体。应用脂磷壁酸作为包被抗原，获得的抗体L作为酶标抗体，制备成竞争法ELISA试剂盒。本发明改变了费时费力的血培养方法检测金黄色葡萄球菌的现状，采用灵敏度高特异性强的酶联免疫方法，缩短检测时间，作为临床诊断的参考之一。

2.如权利要求1所述的脂磷壁酸抗原购于Sigma-Aldrich公司。

3.如权利要求1所述的脂磷壁酸抗原免疫Balb/c小鼠剂量为75μg/只，注射体积0.5ml，共免疫4次。

4.如权利要求1所述的脂磷壁酸抗体提取纯化的步骤为饱和硫酸铵沉淀、重悬后PBS透析、经Protein G亲和层析纯化。

5.如权利要求4所述的脂磷壁酸抗体提取纯化的第一步为饱和硫酸铵分级沉淀，浓度分别为50％、33％，4℃过夜后，10000rpm，4℃离心20min，0.01M PBS重悬沉淀至原体积。

6.如权利要求4所述的脂磷壁酸抗体提取纯化的第二步为透析，透析液采用pH值为7.4、0.01M的PBS，透析时间为48小时。

7.如权利要求4所述的脂磷壁酸抗体提取纯化的第三步为亲和层析，采用Protein G纯化柱，pH值为7.0、0.02M的PB平衡液，0.1M、PH 2.7的Glycine-HCl洗脱液。纯化后的抗体于-20℃保存备用。

8.如权利要求1所述的使用抗体L建立脂磷壁酸检测试剂盒，进行了包被抗原浓度、酶标抗体稀释度、血清标本前处理的优化，最终确立的检测条件为：血清标本十倍稀释后煮沸5min，孔外与酶标抗体37℃温育1小时后加入已包被脂磷壁酸抗原的酶标板中，37℃温育1小时，洗板5次，每次2min，加显色液反应20min后终止，经酶标仪测定其OD值。

9.如权利要求1所述的脂磷壁酸ELISA检测试剂盒检测范围为0.2-2μg/ml，本产品为液体试剂无需冷冻干燥，4℃冷藏有效期半年。