KR20160099557A - 스타필로코커스 감염에 대한 수동 면역 - Google Patents

스타필로코커스 감염에 대한 수동 면역 Download PDF

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Abstract

본원에는 스타필로코커스 종 자가용해소 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제 촉매 도메인 및/또는 세포 벽 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 이의 결합부, 뿐만 아니라 이를 함유하는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 하이브리도마를 포함한, 단클론성 항체를 발현하는 세포주가 또한 개시되어 있다. 샘플 중의 스타필로코커스의 검출을 위한 진단방법이 그러한 바와 같이 정형외과용 임플란트, 이식편 또는 의료 기기의 설치를 위해 단클론성 항체를 사용하고, 스타필로코커스 감염을 치료 또는 예방하고, 골수염을 치료하는 방법이 기재되어 있다.

Description

스타필로코커스 감염에 대한 수동 면역 {PASSIVE IMMUNIZATION FOR STAPHYLOCOCCUS INFECTIONS}
본 출원은 2013년 12월 13일자로 출원된 미국 가특허원 시리즈 제61/915,953호의 우선권 이익을 청구하며, 이는 전문이 본원에 참고로 인용된다.
사용 분야
본원에는 스타필로코커스 감염에 대한 수동 면역을 위한, 특히 골수염의 예방 또는 치료를 위한 및 의료 기기, 또는 정형외과용 임플란트 또는 이식편의 이식으로부터 야기되는 감염을 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 스타필로코커스 종 자가용해소 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제 촉매 도메인 및/또는 세포 벽 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체, 및 이를 함유하는 약제학적 조성물이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
US에서 대략 112,000건의 정형외과 기기-관련 감염이 발병당 $15,000-70,000의 개산 병원비로 매년 발생하고 있기 때문에 만성 골수염(OM)의 신규한 개입이 크게 요구되고 있다(Darouiche, "Treatment of Infections Associated With Surgical Implants," N. Engl . J. Med . 350(14):1422-9 (2004)). 수술 기술의 향상 및 공격적인 항생제 예방이 정형외과용 임플란트 수술 후 감염률을 1-5%로 감소시키기는 하지만, 골수염(OM)은 심각한 문제로 남아있으며 최소 침습적 수술로부터 증가하고 있는 것으로 보인다(Mahomed et al., "Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in the United States Medicare Population," J. Bone Joint Surg . Am. 85(A-1):27-32 (2003); WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance, 2001). 이러한 재기(이의 80%는 스타필로코커스 아우레우스로 인한 것이다)의 중요성은, 임상 단리물의 ~50%가 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)라는 사실에 의해 증폭된다. 관절 보철물 및 골절-고정 기기에 대한 감염률이 지난 10년에 걸쳐 각각 사례의 단지 0.3-11% 및 5-15%이기는 하지만(Lew and Waldvogel, "Osteomyelitis," Lancet 364(9431):369-79 (2004); Toms et al., "The Management of Peri-Prosthetic Infection in Total Joint Arthroplasty," J. Bone Joint Surg . Br. 88(2):149-55 (2006)), 이 결과는 절단 또는 사망을 초래할 수 있다. 게다가, 매우 작은 절개가 종종 이식 동안 피부와 접촉하는 보철물로부터 합병증을 야기하는, 선택적 전 관절 치환술(TJR)을 위한 "최소 침습적 수술"의 대중화가 OM의 발생률을 현저하게 증가시켰다(Mahomed et al., "Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in the United States Medicare Population," J. Bone Joint Surg . Am. 85(A-1):27-32 (2003); WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance, 2001). 이러한 감염은 매우 비용이 많이 드는 2단계 재수술을 필요로 하며, 최신 보고에서는 성공률이 50% 정도로 낮을 수 있음을 시사하고 있다(Azzam et al., "Outcome of a Second Two-stage Reimplantation for Periprosthetic Knee Infection," Clin . Orthop . Relat . Res. 467(7):1706-14 (2009)). 그러나, 가장 큰 걱정은 약물-내성 스타필로코커스 균주, 가장 특히 MRSA의 출현이며, 이것은 북미에서 가장 치명적인 병원체로서 HIV를 뛰어넘으며, 만성 OM의 관리를 계속해서 더욱 어렵고 비용이 많이 들게 만들어, 이러한 감염을 지닌 환자를 치료하기 위한 신규한 치료적 개입이 크게 요구되고 있다. 특히 TJR의 주 대상자인 면역-약화 노인을 위한 대안적인 개입 전략이 크게 요구되고 있다.
현재, MRSA로부터 고위험 환자, 가장 특히 미국에서 매년 시행되는 1.5백만건의 TJR의 대부분을 차지하는 나이든 "베이비 부머"를 보호할 수 있는 예방적 치료법은 없다. MRSA 발생률을 50-80%까지 감소시키는 백신은 관절 치환술 및 개방 골절 치유 시술의 최고 합병증을 감소시킬 뿐만 아니라 의료 부담을 유사한 양까지 삭감한다.
연구들은 만성 OM의 80%가 S. 아우레우스에 의해 유발된다고 기록하였다. 이러한 박테리아는 골 기질에 대한 이들의 결합을 촉진시키는 몇 가지 세포-표면 부착 분자(Flock et al., "Cloning and Expression of the Gene for a Fibronectin-Binding Protein from Staphylococcus aureus," EMBO J. 6(8):2351-7 (1987)), 골 흡수를 자극할 수 있는 독소(Nair et al., "Surface-Associated Proteins from Staphylococcus aureus Demonstrate Potent Bone Resorbing Activity," J. Bone Miner. Res. 10(5):726-34 (1995)), 및 증가된 파골세포 활성을 자극함으로써 뼈의 분해(Marriott et al., "Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleukin-6 in a Murine Model of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue," Am. J. Pathol . 164(4):1399-406 (2004))를 포함하는 이들을 골 병원체로 만드는 몇 가지 인자들을 함유한다. 감염의 진화 및 지속에 있어서의 율속 단계는 이식된 기기 주위의 생물막의 형성이다(Costerton et al., "Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections," Science 284(5418):1318-22 (1999)). 이식 직후, 숙주-유래 세포외 기질 성분(피브리노겐, 피브로넥틴, 및 콜라겐 포함)으로 이루어진 컨디셔닝 층이 임플란트의 표면에 형성되고 혈행성 시딩으로부터 유래되는 부유(free-floating) 박테리아, 또는 상처에 인접한 피부, 뼈로의 박테리아의 수술적 접종, 또는 연관된 연조직 골 엔빌로프의 상당한 붕괴와 일치하는 외상으로부터와 같은 감염의 인접 병소로부터의 박테리아의 부착을 불러온다(Darouiche, "Treatment of Infections Associated With Surgical Implants," N. Engl . J. Med . 350(14):1422-9 (2004)). 다음 며칠에 걸쳐, 증가된 콜로니 부착, 박테리아 세포 분열, 추가의 부유생물 유기체의 보충, 및 박테리아성 세포외 중합체 물질(예를 들면, 당질피질을 형성하는 것들)의 분비가 박테리아성 생물막을 생성한다. 이러한 생물막은 항생제, 식세포 및 항체의 작용으로부터 박테리아를 보호하는 주요 장벽으로서 역할을 하며, 숙주 림프구 기능을 손상시킨다(Gray et al., "Effect of Extracellular Slime Substance from Staphylococcus epidermidis on the Human Cellular Immune Response," Lancet 1(8373):365-7 (1984); Johnson et al., "Interference with Granulocyte Function by Staphylococcus epidermidis Slime," Infect. Immun . 54(1):13-20 (1986); Naylor et al., "Antibiotic Resistance of Biomaterial-Adherent Coagulase-Negative and Coagulase-Positive Staphylococci," Clin . Orthop . Relat . Res. 261:126-33 (1990)).
또 다른 최근의 발견은 S. 아우레우스가 골 기질을 정착시킬 뿐만 아니라 시험관내에서(Ellington et al., "Involvement of Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways in Staphylococcus aureus Invasion of Normal Osteoblasts," Infect. Immun. 69(9):5235-42 (2001)) 및 생체내에서(Reilly et al., "In Vivo Internalization of Staphylococcus aureus by Embryonic Chick Osteoblasts," Bone 26(1):63-70 (2000)) 조골세포에 의해 내재화된다는 것이다. 이것은 항체 및 항생제 내성의 또 다른 층을 제공한다. 이러한 감염 단계는 현저하게 감소된 대사 활성 상태하에서 발생하며, 때때로 이의 지속성을 설명할 것 같은 소위 소-콜로니 변이체로서 보인다(Proctor et al., "Rersistent and Relapsing Infections Associated with Small-Colony Variants of Staphylococcus aureus," Clin . Infect. Dis . 20(1):95-102 (1995)). 이 시점에서 박테리아가 또한 항미생물 치료에 대한 표현형 내성을 발현할 수 있으며, 이것 또한 짧은 치료 과정의 높은 실패률을 설명한다(Chuard et al., "Resistance of Staphylococcus aureus Recovered From Infected Foreign Body in Vivo to Killing by Antimicrobials," J. Infect. Dis. 163(6):1369-73 (1991)). 이러한 광범위한 발병 메카니즘으로 인해, OM은 수년간의 휴지기 후에도 재발하는 경향으로 악명이 높으며, 완치는 가능성이 없는 결과인 것으로 인정되고 있다(Mader and Calhoun, "Long-Bone Osteomyelitis Diagnosis and Management," Hosp . Pract . (Off Ed) 29(10):71-6, 9, 83 passim (1994)).
만성 OM 분야에서의 주요 질문들 중의 하나는 만성 OM을 조절하는 인자들에 관한 현재의 지식들이 왜 그렇게 제한되어 있느냐는 것이다. 추정상, 박테리아 독성 유전자를 규명하는데 필요한 실험 기구들은 1세기가 넘도록 이용 가능하였다. 이러한 이례에 대한 세가지 이유가 있다. 첫째, 골수염의 총 사례수가 높기는 하지만, 1-5%의 발생률은 가능하게는 교정 관절성형술을 제외하고는 엄격한 전향적 임상 연구를 위해 너무 낮다. 둘째, 시험관내 배양물은 치밀하게 세포외 캡슐을 만들지 못하는 유기체의 성장을 위해 신속하게 선택되므로, 생물막 생물학은 단지 생체내 모델로만 연구될 수 있는 것으로 널리 공지되어 있다(Costerton et al., "Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections," Science 284(5418):1318-22 (1999)). 이것은 이 분야에, 생물막 형성 전에 박테리아의 초기 부유생물 성장기를 평가할 수 있는 정량적 동물 모델의 부재라는 "엄청난 장애물"을 야기한다. 지금까지, 이의 병인에 대한 지식의 대부분은 동물 모델로부터 나오며(Norden, "Lessons Learned from Animal Models of Osteomyelitis," Rev. Infect. Dis . 10(1):103-10 (1988)), 이것은 닭(Daum et al., "A Model of Staphylococcus aureus Bacteremia, Septic Arthritis, and Osteomyelitis in Chickens," J. Orthop . Res. 8(6):804-13 (1990)), 랫트(Rissing et al., "Model of Experimental Chronic Osteomyelitis in Rats," Infect. Immun . 47(3):581-6 (1985)), 기니 피그(Passl et al., "A Model of Experimental Post-Traumatic Osteomyelitis in Guinea Pigs," J. Trauma 24(4):323-6 (1984)), 토끼(Worlock et al., "An Experimental Model of Post-Traumatic Osteomyelitis in Rabbits," Br. J. Exp . Pathol . 69(2):235-44 (1988)), 개(Varshney et al., "Experimental Model of Staphylococcal Osteomyelitis in Dogs," Indian J. Exp . Biol . 27(9):816-9 (1989)), 양(Kaarsemaker et al., "New Model for Chronic Osteomyelitis With Staphylococcus aureus in Sheep," Clin . Orthop . Relat . Res. 339:246-52 (1997)) 및 가장 최근에 마우스(Marriott et al., "Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleukin-6 in a Murine Model of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue," Am. J. Pathol . 164(4):1399-406 (2004))에 대해 개발되었다. 이들 모델이 시험관내 검정으로부터 동정된 박테리아 부착의 중요성을 확인하는데 사용되기는 하지만(Chuard et al., "Susceptibility of Staphylococcus aureus Growing on Fibronectin-Coated Surfaces to Bactericidal Antibiotics," Antimicrob . Agents Chemother . 37(4):625-32 (1993); Buxton et al., "Binding of a Staphylococcus aureus Bone Pathogen to Type I Collagen," Microb . Pathog . 8(6):441-8 (1990); Switalski et al., "A Collagen Receptor on Staphylococcus aureus Strains Isolated From Patients With Septic Arthritis Mediates Adhesion to Cartilage," Mol . Microbiol . 7(1):99-107 (1993)), 이들은 생체내 성장, 박테리아 부하, 또는 골용해의 결과 측정을 갖지는 못한다. 따라서, 이들은 약물 효과, 박테리아 돌연변이체, 및 유전자도입 마우스를 갖는 숙주 인자의 역할을 평가하는데 효율적으로 사용될 수 없다.
150년에 걸친 연구에 기반하여, 스타필로코커스 병인을 설명하는 분명한 패러다임이 출현하였다. 이 모델은 OM에도 적용된다. 감염의 초기 단계는 반세포 박테리아가 체내에 침입할 때 일어난다. 이 시점에서 미생물이 환경 변화에 반응하고, 선천 면역을 이기는데 도움을 주는 독성 유전자를 발현하고, 이에 숙주에 부착하는 부착 수용체를 제공해야 한다. 박테리아는 또한 부착 및 표면 정착이 일어나기 위한 임플란트와 같은 이물질 또는 괴저성 조직으로부터의 숙주 부착 표적의 확률적 이용가능성에 의존적이다. 이러한 단계의 성공적인 완료는 기하급수적인 생물막 성장기를 초래하며, 이것은 영양분 고갈 및/또는 적응 면역의 발달의 시점에서 중단된다. 기하급수적인 성장기 후 박테리아는 유전자 발현에 있어서의 쿼럼 센싱(quorum sensing)-구동된 변화로 생물막의 일부가 생물막 패치의 이동성 세그먼트 또는 부유생물 세포로서 박리될 때까지 다층 생물막 내에서 휴면 성장 상태하에 유지된다(Yarwood, et al., "Quorum Sensing in Staphylococcus aureus Biofilms," J. Bact . 186(6): 1838-1850 (2004)). 그러나, 이 시점에서 감염은 이제 만성이고 약물 또는 숙주 면역에 의해 근절될 수 없다. 따라서, 이 분야에서는 MSCRAMM(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules)로서 알려진 박테리아 부착소 부류와 특이적으로 상호작용하는 세포 표면 세포외 기질 성분에 주력하였다(Patti et al., "MSCRAMM-Mediated Adherence of Microorganisms to Host Tissues," Annu . Rev. Microbiol . 48:585-617 (1994)). 사실상, 지금까지 개발된 본질적으로 모든 항-S. 아우레우스 백신은 숙주 조직 정착 및 침입을 위해 중요한 MSCRAMM에 향해져 있었다. 이러한 백신의 목표는 이들 박테리아 표면 항원에 결합하는 항체를 생성시킴으로써 숙주 조직으로의 이들의 부착을 저해하고 감염의 장기 병원소로서 작용하는 생물막 형성을 억제하는것이다. 박테리아 표면을 옵소닌화함으로써, 이들 항체가 또한 식세포에 의한 S. 아우레우스 제거를 매개할 수 있다. 불행하게도, S. 아우레우스는 많은 부착소를 가지고 있어서, 하나 이상의 억제로는 박테리아 부착을 예방하는데 충분하지 않을 수 있다. 더욱이, 식세포에 의한 박테리아 제거는 뼈와 같은 무혈관 조직에 제한될 수 있어, 항체 단독으로는 S. 아우레우스의 생체내 부유동물 성장을 상당히 감소시키고 수정 전 관절 치환술 동안 만성 OM의 확립 또는 재감염을 예방하기 위해 추가의 항미생물 작용 메카니즘을 필요로 할 수 있다.
슈바르츠 등(Schwarz et al.)의 PCT 공개 제WO2011/140114호 및 제WO2013/066876호에 스타필로코커스 글루코사미니다제에 특이적으로 결합하여 스타 필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제하는 몇가지 단클론성 항체(이하, "mAbs")가 기술되어 있기는 하지만, 상이한 스타필로코커스 표적에 특이적으로 결합하여 이의 기능을 억제하는 추가의 mAbs를 동정하는 것이 계속 필요하다.
개시된 발명은 당해 분야의 이러한 및 기타의 약점을 극복하기 위한 것이다.
개시내용의 요약
제1 양태는 스타필로코커스 종 자가용해소 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제 촉매 도메인 또는 세포 벽 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 이의 결합부에 관한 것이다.
제2 양태는 본원에 개시된 바와 같은 단클론성 항체 또는 이의 결합부를 발현하는 세포주에 관한 것이다.
제3 양태는 담체 및 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 단클론성 항체 또는 단클론성 항체 결합부를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제4 양태는 정형외과용 임플란트를 필요로 하는 환자에게 본원에 개시된 바와 같은 제1 양태에 따르는 유효량의 단클론성 항체 또는 단클론성 항체 결합부, 본원에 개시된 바와 같은 제3 양태에 따르는 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합물을 투여하고, 정형외과용 임플란트, 조직 이식편, 또는 의료 기기를 환자에게 도입함을 포함하여, 정형외과용 임플란트 또는 의료 기기를 환자에게 도입하는 방법에 관한 것이다.
제5 양태는 스타필로코커스 감염에 걸리기 쉽거나 걸린 환자에게 본원에 개시된 바와 같은 제1 양태에 따르는 유효량의 단클론성 항체 또는 단클론성 항체 결합부, 본원에 개시된 바와 같은 제3 양태에 따르는 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합물을 투여함을 포함하여, 스타필로코커스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
제6 양태는 스타필로코커스 뼈 또는 관절 감염을 갖는 환자에게 본원에 개시된 바와 같은 제1 양태에 따르는 유효량의 단클론성 항체 또는 단클론성 항체 결합부, 본원에 개시된 바와 같은 제3 양태에 따르는 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합물을 투여함을 포함하여, 골수염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
제7 양태는 샘플을 본원에 개시된 바와 같은 제1 양태에 따르는 단클론성 항체 또는 결합부에 노출시키고, 단클론성 항체 또는 결합부와 샘플에 존재하는 스타 필로코커스 또는 스타필로코커스 아미다제 사이에 면역 복합체가 형성되었는지 검출함(상기 노출 후 면역 복합체의 존재는 샘플 중의 스타필로코커스의 존재를 나타낸다)을 포함하여, 샘플에서 스타필로코커스의 존재를 측정하는 방법에 관한 것이다.
스타필로코커스 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제(이하, "Amd" 또는 "아미다제")는 이것을 수동 면역화를 위한 매력적인 표적으로 만드는 몇 가지 특성들을 갖는다. 아미다제는 박테리아 세포 부착, 세포 분열, 분비, 및 당질피질 세포외 DNA를 생산하는 자가분해의 매개를 통한 생물막 당질피질 형성을 포함하는 다수의 중요한 세포 기능에 관여하며; 이것은 S. 아우레우스 임상 단리물 중에서 고도로 보존되며; 이것은 반코마이신의 표적이고 세포 주기 전반에 걸쳐 발현된다. 또한, Amd는 세포 벽에 나타나기 때문에, 세포외 환경에 존재하는 항체에 접근할 수 있다.
단클론성 항체 및 이의 결합부, 뿐만 아니라 이를 함유하는 약제학적 조성물은 스타필로코커스 균주에 의한 감염 위험을 갖거나 위험이 있는 환자에서 면역요법에 적합한 치료제이다. 이러한 단클론성 항체의 힘은 스타필로코커스 균주에 의한 성장, 부착, 및 면역 회피를 방해하는 이들의 다중 활성으로부터 유래한다. 첫째, 항체로서, 이들은 초기 스타필로코커스 감염 부위에서 호중구에 의한 식균작용을 촉진시킬 것이다. 둘째, 스타필로코커스 생존 및 표면 정착에 있어서 다수의 역할을 하는 효소인 스타필로코커스 아미다제의 억제제로서, 이들 항체는 세포 분열 및 생물막 형성 중의 하나 또는 둘 다를 잠재적으로 방해한다. 마지막으로, 본원에서 입증된 바와 같이, 개시된 항체는 더 적은 농양의 형성에 의해 증명되는 바와 같이 스타필로코커스 확산을 감소시키고, 농양의 대식세포 침입을 제공하는데, 이것이 무균성 농양의 형성을 촉진시키고 골 치유를 가속화시킨다.
도 1은 S. 아우레우스 이작용성 자가용해소(AtlA)의 도메인 구조를 개략적으로 예시하며, 이것은 모든 스타필로코커스 종 이작용성 자가용해소 단백질을 대표한다. 이작용성 자가용해소는 1276 아미노산 프리-프로-효소로서 합성된다. 31-아미노산 신호 펩타이드(aa 1-31)는 분비 동안 제거되고 167-아미노산 프로-펩타이드(aa 32-197)는 자가용해소가 세포 벽에 삽입되는 경우에 제거된다. 세포 분열 후, 성숙 자가용해소는 아미노산 775에서 절단되어 비의존성 AmdR1R2(N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제, 또는 아미다제 (Amd); aa 198-775) 및 R3Gmd(엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 (Gmd); aa 776-1276)를 생성한다.
도 2는 8개 항-Amd 단클론성 항체 및 무관한 특이성의 이소형-매칭된 항체의 Amd 효소 활성의 억제를 보여주는 그래프이다. 재조합 Amd(rAmd)는 이. 콜라이(E. coli)에서 제조되었다(표 1의 His-AmdR1R2-B). rAmd(1.5㎍/mL)을 PBS 중에서 S. 아우레우스 세포벽으로부터 제조된 펩티도글리칸의 혼탁한 현탁액과 혼합하고, 이의 용균 활성을 37℃에서 60분간 배양한 후 (A490로서 측정된) 혼탁도의 감소에 의해 측정하였다(△60). 억제 시험을 위해, rAmd의 농도는 A490을 70%까지 감소시키기에 충분하였다. 정제된 항-Amd mAbs를 제시된 농도로 rAmd에 가한 다음 Mab:rAmd 혼합물에 의한 펩티도글리칸의 용균을 측정하였다. 억제 퍼센트는 다음과 같이 계산하였다: 100 x (1-(△60A490 억제제/△60A490 억제제 없는 대조군)).
도 3은 대표적인 항-Amd 항체에 의한 S. 아우레우스 침전의 이미지이다. S. 아우레우스 세포가 가장 스타필로코커스-특이적인 mAbs의 존재하에서 배양되는 경우, 이들은 큰 클러스터를 형성하여 현탁액으로부터 빠져 나와 비교적 투명한 상청액을 수득한다. USA300LAC S. 아우레우스는 각각 25㎍/mL의 제시된 항-Amd mAbs의 존재하에서 TSB 중에서 37℃에서 8시간 동안 배양하였다. 항체를 함유하지 않는 샘플(No Ab) 및 무관한 이소형-매칭된 항체를 함유하는 샘플(이소형 대조군)은 눈에 띄는 세포 펠렛이 없는 혼탁한 상청액을 가졌다; mAbs Amd1.1, Amd1.6, Amd1.8, Amd1.11, 및 Amd1.16은 투명한 상청액 및 세포 펠렛을 가졌다. 기타의 mAbs 생산 투명 상청액 및 세포 펠렛이 현탁액으로부터 S. 아우레우스를 침전시키지 못한 mAbs와 같이 아래 표 2에 열거되어 있다.
도 4는 고정화된 mAb Amd1.6과 가용성 Amd의 생체분자 상호작용 분석을 예시한다. mAb Amd1.6 및 가용성 Amd 간의 상호작용의 친화도는 Biacore T-200 상에서 측정하였다. 토끼 항-마우스 Fc IgG를 CM-5 바이오센서 칩의 표면에 고정시켜 mAb Amd1.6을 포획하는데 사용하였으며, 그후 유동장으로부터 Amd를 포획하였다. mAb Amd1.6에 의해 결합된 Amd의 질량은 x축의 시간에 대해 공명 단위(Resonance Unit)(y축)로 측정된다. 포획(결합, t = 0 내지 120 초) 및 방출(해리, t = 120 내지 420 초) 단계가 나타내어져 있다. Amd의 농도를 1.56 내지 25nM로 2배 증분시키면서 실험을 반복하였다. 제조자의 지침에 따라 측정을 수행하였으며, 동력학적 데이터는 Biacore AB로부터의 생체분자 상호작용 분석(BIA) 평가 소프트웨어(버젼 3.1)를 사용하여 분석하였다.
도 5는 Amd, Gmd 및 자가용해소 결실 돌연변이 균주와 비교하여 시험관내 생물막 형성에 대한 항-Amd 항체의 억제효과를 예시하는 그래프이다. Calgary 플레이트를 사용하는 생물막 검정은 플레이트와 뚜껑 핀을 인간 혈장으로 4℃에서 16시간 동안 코팅시킴으로써 수행하였다. 그후, S. 아우레우스를 25㎍/mL 항-Amd (Amd1.6), 항-Gmd (1C11) 및 항-Amd + 항-Gmd의 조합물(Amd1.6 + 1C11) mAbs의 존재 또는 부재하에서 0.05의 OD 600nm에서 시딩하였다. 생물막 형성을 37℃에서 24시간 동안 허용하였다. 세척 후, 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 생물막 함량을 595nm에서 분광광도법으로 측정하였다. 생물막 억제에 대한 양성 대조군으로서, 아미다제(△amd), 글루코사미니다제(△gmd) 또는 자가용해소(△atl)에 대한 UAMS-1 결핍 균주를 동일한 OD에서 시딩하였다. 결과는 야생형(WT), 비처리 UAMS-1 배양물(A)의 퍼센트로서 의 생물막 형성(즉, 크리스탈 바이올렛 염색)의 양으로서 보고된다; * WT와 비교하여 p < 0.05.
도 6a-e는 자가용해소 결핍과 비교하여 생체내에서 임플란트 상의 생물막 형성에 대한 항-Amd 단클론성 항체 및 항-Amd와 항-Gmd 단클론성 항체의 조합물로의 수동 면역화의 효과를 예시한다. 6 내지 10주령의 암컷 Balb/c 마우스(n ≥ 3)를 항-Amd(Amd1.6), 항-Amd와 항-Gmd의 조합물(Amd1.6 + 1C11) 또는 IgG 이소형-매칭된 대조군 mAb으로 40mg/kg의 용량으로 복강내에서 수동 면역화하였다. 하루 후 각 마우스를 USA300 LAC CA-MRSA 균주 또는 이의 이소형 △atl 돌연변이체로 오염된 경골-관통(trans-tibial) 스테인리스강 핀으로 감염시켰다. 핀을 그 자리에 두어 생물막-기반 감염이 숙성되도록 하였다. 감염후 14일째에, 핀을 제거하고, 주사 전자 현미경법(SEM)으로 실험하였다. 감염된 임플란트(핀) 상의 생물막 형성의 정도를 보여주는 대표적인 현미경 사진이 도시되어 있다: IgG 대조군 (도 6a); 항-Amd (Amd1.6, 도 6b); 항-Amd + 항-Gmd (Amd1.6 + 1C11, 도 6c); 및 △atl 돌연변이체로 감염(도 6d). 생물막으로 덮힌 관심 대상 영역(평침의 0.5 x 2.0mm 면)의 퍼센트를 NIH 소프트웨어(Image J)로 정량하였으며, 도 6e에 나타내어져 있다;* p ≤ 0.05.
도 7a-c는 골 손상의 양 감소에 대한 항-Amd, 항-Gmd, 및 항-Amd와 항-Gmd 단클론성 항체의 조합물로의 수동 면역화의 효과를 예시한다. 암컷 Balb/c 마우스(n=5)를 PBS 또는 항-Gmd (1C11), 항-Amd (1.6) 또는 조합물(1C11+1.6)로 상기한 바와 같이 40mg/kg 용량으로 i.p. 수동으로 면역화하였다(Varrone et al., "Passive Immunization With Anti-Glucosaminidase Monoclonal Antibodies Protects Mice From Implant-Associated Osteomyelitis by Mediating Opsonophagocytosis of Staphylococcus aureus Megaclusters," J Orthop Res 32(10):1389-96 (2014), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 24시간 후 모든 마우스는 USA300 LAC::lux로 오염된 경골-관통 핀을 제공받았으며, 3일째에 생물발광 이미징을 수행하여 감염을 확인하였다(도 7a). 감염시킨지 14일 후에 마우스를 안락사시키고, 경골을 마이크로-CT 분석을 위해 수거하였다. 감염된 경골의 대표적인 3D 렌더링이 경골의 각 그룹(B)에서의 골용해의 상대적인 수준을 예시하기 위해 내측 및 측면으로부터 나타내져 있다(도 7b). 각 경골에서의 골용해 체적은 다음의 식을 사용하여 정량하였다: 골용해 체적(mm3) = [내측 골용해 면적 + 측면 골용행 면적(mm2)] X 피질 두께(mm)(*p < 0.05 vs. PBS). 결과는 도 7c에 그래프로 예시되어 있다.
도 8a-c는 수강에서의 더 적은 농양의 형성에 의해 증명되는 바와 같이 상당히 감소된 박테리아 확산을 보여주는, Amd1.6로의 수동 면역화의 효과를 예시한다. 6 내지 10주령 암컷 Balb/c 마우스(n = 5)를 PBS (음성 대조군), 항-Gmd mAb 1C11, 항-Amd mAb Amd1.6 또는 조합물(1C11+Amd1.6)으로 40mg/kg의 총 용량으로 복강내 면역화하였다. 24시간 후 각 마우스에 이의 우측 경골을 통해 USA300 LAC::lux, 생물발광 CA-MRSA 균주로 오염된 핀을 삽입하였다. 감염을 동물을 희생시키는 14일 동안 진행되도록 하고, 감염된 경골을 조직학적 분석을 위해 수거하고, 고정시키고, 석회질을 제거하고, 절개하였다. 오렌지 G/알시안 블루(ABG/OH)로 염색된 대표적인 감염된 경골이 (도 8a) 비처리 대조군 및 (도 8b) 항-Gmd 1C11과 항-Amd Amd1.6의 조합물로 치료된 마우스에 대해 나타내어져 있다. 각 마우스 그룹에서 관찰된 농양의 수가 (도 8c)에 나타내어져 있다. *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01.
도 9a-h는 무균성 농양을 야기하는 스타필로코커스 농양 군집(SACs)의 형성을 예방하는데 있어서의 항-Amd, 항-Gmd, 및 항-Amd와 항-Gmd 단클론성 항체의 조합물로의 수동 면역화의 효과를 예시한다. 마우스(n = 5)를 PBS (음성 대조군) 또는 mAbs 1C11, Amd1.6 또는 조합물(1C11+Amd1.6)으로 40mg/kg 용량으로 i.p. 면역화하였다. 24시간 후 모든 마우스는 USA300 LAC::lux 생물발광 CA-MRSA 균주로 오염된 경골-관통 핀을 제공받았다. 감염된지 14일 후로부터의 대표적인 감염된 경골이 박테리아를 드러내도록 그램-염색된 조직학적 절편에 대해 나타내어져 있다. PBS-처리된 경골은 다음의 mAbs로 처리된 마우스에는 부재하는 농양 부위(도 9a-b) 내에 호산구성 가성피막(pseudocapsule)에 의해 둘러싸인 박테리아의 중심 병소를 함유하는 전형적인 SAC 병리학을 보여준다: 1C11 (도 9c-d), Amd1.6 (도 9e-f), 및 조합물 1C11+Amd1.6 (도 9g-h).
도 10a-h는 농양 내의 대식세포-유사 세포의 보충에 대한 항-Amd, 항-Gmd, 및 항-Amd와 항-Gmd 단클론성 항체의 조합물로의 수동 면역화의 효과를 예시한다. 6 내지 10주령 암컷 Balb/c 마우스(n = 5)를 PBS 또는 mAb 1C11, Amd1.6 또는 조합물(1C11 + Amd1.6)로 40mg/kg 용량으로 i.p. 면역화하였다. 24시간 후 모든 마우스는 USA300 LAC::lux 생물발광 CA-MRSA 균주로 오염된 경골-관통 핀을 제공받았다. 감염된지 14일 후로부터의 대표적인 감염된 경골이 오렌지 G/알시안 블루(ABG/OH)로 염색된 조직학 절편에 대해 나타내어져 있다. 항-Amd, 항-Gmd, 및 항-Amd와 항-Gmd mAbs의 조합물로의 수동 면역화는 대식세포-유사 세포를 농양의 중심으로 보충시키는 반면(도 10c-h, 화살표) PBS 면역화된 마우스는 농양 내에 대식세포-유사 세포 보충을 보이지 않으며(도 10a-b) 형태상으로 호중구와 닮은 세포를 나타낸다. Amd1.6 및 조합물 1C11+Amd1.6 처리된 마우스(각각 도 10e 및 10g)에서의 단일 농양, 또는 1C11 처리된 마우스에서의 두 개의 농양 구조(도 10c)와 비교하여, 다수의 농양은 골 주위의 수강 및 연조직에서 PBS 처리된 경골(도 10a)에 존재한다.
도 11a-e는 무균성 농양 내에 M2 대식세포를 보충함으로써 골 치유를 촉진시키는, 항-Amd와 항-Gmd 단클론성 항체의 조합물로의 수동 면역화의 효소를 예시한다. 6 내지 10주령 암컷 Balb/c 마우스(n = 5)를 PBS 또는 mAb 1C11, Amd1.6 또는 조합물(1C11 + Amd1.6)로 40mg/kg 용량으로 i.p. 면역화하였다. 24시간 후 모든 마우스는 USA300 LAC::lux 생물발광 CA-MRSA 균주로 오염된 경골-관통 핀을 제공받았다. 수술한지 14일 후로부터의 대표적인 경골이 오렌지 G/알시안 블루(ABG/OH)로 염색된 조직학 절편에 대해 나타내어져 있다(도 11a-c). 두드러진 치유가 무균성 핀 대조물을 제공받은 마우스에 필적하는 mAbs로 면역화된 마우스에서 자명하다(도 11a-c). 재형성 및 상처 치유 프로세스와 관련된 대식세포 표현형과 치유와의 상관성을 구하기 위해, 면역조직화학을 항-아르기나제-1 항체로 수행하여 M2 대식세포를 염색시켰다. M2 대식세포는 수동 면역화된 마우스(도 11e)에서는 농양(갈색 염색)의 중심으로 보충되지만, 음성 대조군 PBS 그룹(도 11d)에서는 농양 중심으로부터 배제된다.
본원에는 스타필로코커스 종 자가용해소 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제 (Amd) 촉매 도메인 또는 세포 벽 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단클론성 항체 또는 이의 결합부가 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유도되는 면역글로불린 뿐만 아니라 면역글로불린의 면역반응부(즉, 항원 결합부)를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 개시된 단클론성 항체는, 예를 들면, 실질적으로 순수한 단클론성 항체, 항체 단편 또는 결합부, 키메라 항체, 및 인간화 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있거나 단리되 수 있다(Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
본원에 개시된 단클론성 항체는 스타필로코커스 N-아세틸무라모일-L-알라닌-아미다제 또는 이의 단편에 결합하기 위한 특이성을 특징으로 한다. 항체는 스타필로코커스 자가용해소(Atl)의 아미다제 하위-단위에서, 전형적으로 전적으로는 아니지만 면역-우성 에피토프를 통해, 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 이들 단클론성 항체는 스타필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제한다. 다른 실시형태에서, 이들 단클론성 항체는 금속, 플라스틱 및/또는 유기 표면 상의 생물막 확립을 억제한다. 여전히 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 단클론성 항체들은 스타필로코커스 균주의 생체내 성장 및 금속, 플라스틱 및/또는 유기 표면 상의 생물막 확립 둘 다를 억제하기 위해 함께 사용될 수 있다.
본원에 개시된 이러한 및 모든 다른 양태에 따르면, 스타필로코커스 균주는 인간 또는 동물에게 병원성이거나 병원성일 수 있는 균주이다. 스타필로코커스는 응고효소-양성 또는 응고효소-음성일 수 있다. 예시적인 스타필로코커스 균주는, 제한 없이, 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ), 스타필로코커스 에피데르미 스(S. epidermidis ), 스타필로코커스 루주네시스 (S. lugdunensis ), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(S. saprophyticus ), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 (S. haemolyticus), 스타필로코커스 카프라에 (S. caprae ), 및 스타필로코커스 시미아 에(S. simiae )를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 단클론성 항체는 메티실린-내성 또는 반코마이신-내성 균주를 포함한 스타필로코커스의 항생제-내성 균주에 대해 효과적이다.
특정 실시형태에서, (mAb 또는 이의 결합 단편에 의해 결합된) 아미다제 하위단위의 에피토프는 면역-우성 에피토프이다. 면역-우성 항원은 면역계에 의해 가장 쉽게 인지되어 유도된 항체의 특이성에 대한 가장 큰 영향을 발휘하는 항원 결정기의 일부이다. "면역-우성 에피토프"는 그 항원 상의 다른 에피토프를 실질적으로 배제하고서 숙주 유기체에서 면역 반응을 선택적으로 유발하는 항원 상의 에피토프를 나타낸다.
통상적으로, 면역-우성 에피토프를 운반할 것 같은 항원은 병원성 유기체의 외부 표면에 항원을 선택함으로써 동정할 수 있다. 예를 들면, 진균류, 박테리아 및 바이러스와 같은 가장 단순한 유기체는 병원성 유기체의 외부 표면에 노출된 하나 또는 두 개의 단백질을 갖는다. 이러한 외부 표면 단백질들이 아마도 적당한 항원을 운반하는 것 같다. 아마도 면역-우성 에피토프를 운반하는 것 같은 단백질은, 전체 단백질이 병원성 유기체로 감염된 유기체로부터의 혈청에 대해 겔 상에서 시험되는 웨스턴 검정(Western assay)으로 동정될 수 있다. 혈청으로부터의 결합된 항체는 널리 공지된 ELISA 기술 중의 하나에서와 같이 표지된 항-항체에 의해 동정된다. 면역-우성 에피토프는 병원성 유기체로 감염된 숙주 유기체로부터의 혈청을 실험함으로써 동정될 수 있다. 혈청은 숙주 유기체에서 면역 반응을 야기할 것 같은 동정된 항원에 결합하는 항체의 함량에 대해 평가된다. 면역-우성 에피토프가 이러한 항원에 존재하면, 혈청 중의 실질적으로 모든 항체는 면역-우성 에피토프에 결합할 것이며, 항원에 존재하는 다른 에피토프에는 거의 결합하지 않을 것이다.
AtlA는 유사분열 동안 세포 벽을 소화시키는데 필요한 스타필로코커스 아우레우스의 촉매적으로 분명한 펩티도글리칸 가수분해효소 중의 하나이다(Baba and Schneewind, "Targeting of Muralytic Enzymes to the Cell Division Site of Gram-Positive Bacteria: Repeat Domains Direct Autolysin to the Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus," EMBO . J. 17(16):4639-46 (1998), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 성장을 위한 필수 유전자인 것 이외에, 주사 전자 현미경법 연구에서는 2분열 동안 S. 아우레우스에 결합되는 항-AtlA 항체가 세포 벽에 의해 덮히지 않은 박테리아의 영역으로 편재됨을 입증하였다(Yamada et al., "An Autolysin Ring Associated With Cell Separation of Staphylococcus aureus," J. Bacteriol. 178(6):1565-71 (1996), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
AtlA 효소는 아미다제(62kD) 및 글루코사미니다제(53kD)로 구성되며, 이것은 절단 과정(cleavage process)을 통해 동일한 AtlA 전구 단백질로부터 생산된다(Baba and Schneewind, "Targeting of Muralytic Enzymes to the Cell Division Site of Gram-Positive Bacteria: Repeat Domains Direct Autolysin to the Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus," Embo . J. 17(16):4639-46 (1998); Komatsuzawa et al., "Subcellular Localization of the Major Autolysin, ATL and Its Processed Proteins in Staphylococcus aureus," Microbiol Immunol . 41:469-79 (1997); Oshida et al., "A Staphylococcus aureus Autolysin That Has an N-acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Domain and an Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Domain: Cloning, Sequence Analysis, and Characterization,"Proc. Nat'l . Acad . Sci . U.S.A. 92(1):285-9 (1995), 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨). 자가용해소는 R1, R2, 및 R3라고 하는 세 개의 ~150 아미노산 세포 벽 결합 도메인에 의해 세포 벽에 유지된다. 최종 성숙 단계에서, 단백질분해성 절단이 글루코사미니다제 및 이의 관련 N-말단 R3 도메인(총칭하여, "Gmd")로부터 아미다제 도메인 및 이의 관련 R1 및 R2 도메인(총칭하여, "Amd")을 분리한다. 도 1 참조.
His-Amd에 대한 예시적인 암호화된 공통 단백질 및 암호화 개방 판독 프레임 서열이 아래 서열번호 1 및 2로서 동정된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
스타필로코커스 Amd는 고체 상 또는 용액 상 펩타이드 합성, 재조합 발현에 의해 합성될 수 있거나, 또는 천연 공급원으로부터 입수될 수 있다. 자동 펩타이드 합성기가 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 Applied Biosystems와 같은 수많은 공급업체로부터 상업적으로 이용 가능하다. 화학적 펩타이드 합성의 표준 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 참조: Synthetic Peptides: A Users Guide 93-210 (Gregory A. Grant ed., 1992), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 재조합 발현을 통한 단백질 또는 펩타이드 생산은 박테리아, 예를 들면, 이. 콜라 이, 효모, 곤충 또는 포유류 세포 및 발현 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. 재조합 단백질/펩타이드 발현을 위한 절차는 당업계에 널리 공지되어 있으며 문헌[참조: Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989)]에 기재되어 있다.
재조합적으로 발현된 펩타이드는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 겔 여과, 및 역상 크로마토그래피를 포함한, 당업계에 용이하게 공지된 몇 가지 방법들 중의 어느 하나를 사용하여 정제될 수 있다. 펩타이드는 바람직하게는 통상의 기술에 의해 정제된 형태로(바람직하게는 적어도 약 80% 또는 85% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 95% 순수) 생산된다. 재조합 숙주 세포가 펩타이드를 성장 배지로 분비하도록 하는지의 여부에 따라(Bauer et al.의 미국 특허 제6,596,509호 참조, 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨), 펩타이드는 원심분리(분비된 펩타이드를 함유하는 상청액으로부터 세포 성분을 분리하기 위함)에 이은 상청액의 순차적 황산암모늄 침전에 의해 단리되고 정제될 수 있다. 펩타이드를 함유하는 분획은 적절한 크기의 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 컬럼에서 겔 여과에 적용되어 다른 단백질들로부터 펩타이드를 분리한다. 필요에 따라, 펩타이드 분획은 HPLC 및/또는 투석에 의해 추가로 정제될 수 있다.
특정 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 결합부는 Amd 촉매 도메인의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, Amd 촉매 도메인은 is 서열번호 1의 아미노산 9-252와 적어도 70% 동일하거나, 서열번호 1의 아미노산 9-252와 적어도 75% 또는 80% 동일하거나, 또는 심지어 서열번호 1의 아미노산 9-252와 적어도 85% 또는 90% 동일하다. 특정 실시형태에서, 아미다제 촉매 도메인은 서열번호 1의 아미노산 9-252와 적어도 95% 동일하다.
특정 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 결합부는 Amd1.6, Amd1.10, Amd1.13, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, 또는 Amd2.2로서 명명된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된다.
또 다른 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 결합부는 Amd R1 또는 R2 세포 벽 결합 도메인 내에서 전적으로 또는 부분적으로 에피토프에 결합한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, R1 또는 R2 세포 벽 결합 도메인은 각각 서열번호 1의 아미노산 253-399 또는 421-568과 적어도 70% 동일하거나; 또는 각각 서열번호 1의 아미노산 253-399 또는 421-568과 적어도 75% 또는 80% 동일하거나; 또는 심지어 각각 서열번호 1의 아미노산 253-399 또는 421-568과 적어도 85% 또는 90% 동일하다. 특정 실시형태에서, 세포 벽 결합 도메인은 각각 서열번호 1의 아미노산 253-399 또는 421-568과 적어도 95% 동일하다.
특정 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 결합부는 Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.14, Amd1.15, Amd2.4, 또는 Amd2.5로서 명명된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된다.
특정 실시형태에서 본원에 개시된 단클론성 항체는 10-8 M 또는 10-9 M 초과, 바람직하게는 10-10M 초과의 친화도로 Amd 촉매 도메인 또는 세포 벽 결합 도메인에 결합한다.
상기 주지된 바와 같이, 특정 실시형태에서 단클론성 항체 또는 결합부는 또한 스타필로코커스의 생체내 성장을 억제한다. 스타필로코커스의 생체내 성장의 억제는 다수의 적합한 표준에 따라 측정할 수 있다. 이러한 하나의 실시형태에서, 스타필로코커스의 생체내 성장은 생물발광 검정에 따라 평가할 수 있다. 예를 들자면, 생물발광 S. 아우레우스(Xen 29; ATCC 12600)(Francis et al., "Monitoring Bioluminescent Staphylococcus aureus Infections in Living Mice Using a Novel luxABCDE Construct," Infect. Immun. 68(6):3594-600 (2000); see also Contag et al., "Photonic Detection of Bacterial Pathogens in Living Hosts," Mol . Microbiol. 18(4):593-603 (1995), 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용됨)가 수술용 임프란트 전에 500,000 CFU로 경골관통 임플란트를 투여하는데 사용된다. 5주령 암컷 BALB/cJ 마우스는 수술하기 3일 전에 염수 또는 0.25ml 염수 중의 1mg의 정제된 항체/항체 단편의 복강내 주사를 제공받을 수 있다. 마우스를 다양한 날짜(예를 들면, 0, 3, 5, 7, 11, 및 14일)에 생물발광을 평가하기 위해 이미지화시킬 수 있고, BLI 이미지를 염수 대조군 또는 위약 항체를 주사한 대조군 마우스에 비해 항체가 S. 아우레우스의 생체내 성장을 억제하는지를 평가하기 위해 비교할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 스타필로코커스의 생체내 성장은 생물막 형성에 따라 평가할 수 있다. 예를 들자면, 암컷 Balb/c 마우스를 항체/항체 단편 또는 대조물로 40mg/kg의 용량으로 복강내 수동 면역화할 수 있으며, 하루 뒤에 각 마우스를 MRSA 균주로 오염된 경골-관통 스테인리스강 핀으로 감염시킬 수 있다. 감염후 14일째에, 핀을 제거하고, 주사 전자 현미경법(SEM)으로 실험할 수 있으며, 생물막으로 덮힌 관심 대상 영역(평침의 0.5 x 2.0mm 면)의 퍼센트를 NIH 소프트웨어(Image J)로 정량할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 감염된 뼈의 골용해 체적을 MicroCT 이미징을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들자면, 암컷 Balb/c 마우스를 항체/항체 단편 또는 대조물로 40mg/kg의 용량으로 복강내 수동 면역화할 수 있으며, 하루 뒤에 각 마우스를 MRSA 균주로 오염된 경골-관통 스테인리스강 핀으로 감염시킬 수 있다. 14일 후, 마우스를 안락사시키고 경골을 회수할 수 있다. 생성된 이미지를 사용하여, 병변 부위를 두 가지 상이한 시각(예를 들면, 내측 및 측면)으로 측정할 수 있으며, 이것을 함께 더하고 피질 두께와 곱한다(문헌 참조: Varrone et al., "Passive Immunization With Anti-Glucosaminidase Monoclonal Antibodies Protects Mice From Implant-Associated Osteomyelitis by Mediating Opsonophagocytosis of Staphylococcus aureus Megaclusters," J Orthop Res 32(10):1389-96 (2014), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
또 다른 실시형태에서, 스타필로코커스의 생체내 성장은 뼈를 둘러싼 수강 및 연조직에서의 스타필로코커스 농양 군집(SACs)의 존재(빈도 포함) 또는 부재에 의해 평가할 수 있다. 예를 들자면, 암컷 Balb/c 마우스를 항체/항체 단편 또는 대조물로 40mg/kg의 용량으로 복강내 수동 면역화할 수 있으며, 하루 뒤에 각 마우스를 MRSA 균주로 오염된 경골-관통 스테인리스강 핀으로 감염시킬 수 있다. 14일 후, 마우스를 안락사시키고 경골 및 관련 연조직을 회수할 수 있다. 조직학적 샘플을 준비하고 오렌지 G/알시안 블루(ABG/OH)로 염색한 다음 조직학적 샘플의 분석시 농양의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
하나의 실시형태에 따르면, 단클론성 항체 또는 결합부는 다음의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 VH 도메인을 포함한다(CDR 도메인은 밑줄그어짐):
Figure pct00003
여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다. 이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 6):
Figure pct00004
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00005
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 8):
Figure pct00006
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 7의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00007
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 10):
Figure pct00008
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 9의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00009
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 12):
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 11의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00011
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 14):
Figure pct00012
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 13의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00013
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 16):
Figure pct00014
Figure pct00015
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 18):
Figure pct00016
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 17의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00017
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 20):
Figure pct00018
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 19의 아미노산 서열을 암호화하는 한A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00019
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 22):
Figure pct00020
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 21의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00021
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 24):
Figure pct00022
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 23의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00023
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 26):
Figure pct00024
Figure pct00025
여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다. 이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 28):
Figure pct00026
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 27의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00027
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 30):
Figure pct00028
Figure pct00029
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 32):
Figure pct00030
하나의 실시형태에 따르면, 단클론성 항체 또는 결합부는 다음의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 VL 도메인을 포함한다(CDR 도메인은 밑줄그어짐):
Figure pct00031
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 34):
Figure pct00032
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 33의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00033
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 36):
Figure pct00034
Figure pct00035
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 38):
Figure pct00036
Figure pct00037
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 40):
Figure pct00038
Figure pct00039
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 42):
Figure pct00040
Figure pct00041
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 44):
Figure pct00042
Figure pct00043
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 46):
Figure pct00044
Figure pct00045
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 48):
Figure pct00046
Figure pct00047
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 50):
Figure pct00048
Figure pct00049
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 52):
Figure pct00050
Figure pct00051
여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다. 이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 54):
Figure pct00052
여기서, 각각의 N은 핵산 분자가 서열번호 53의 아미노산 서열을 암호화하는 한 A, T, C, 또는 G일 수 있다.
Figure pct00053
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 56):
Figure pct00054
Figure pct00055
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 58):
Figure pct00056
Figure pct00057
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 60):
Figure pct00058
Figure pct00059
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 62):
Figure pct00060
Figure pct00061
이 아미노산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다(서열번호 64):
Figure pct00062
개시된 항-Amd 항체 중의 하나 이상과 동일한 Amd의 에피토프에 결합하는 Amd 항체, 및 이의 Amd 결합부가 또한 본 개시내용에 의해 포함된다. 따라서, 추가의 항체 및 Amd 결합 항체 부분은 이들이 Amd 결합 검정에서 개시된 항체와 교차경쟁(예를 들면, 통계학적으로 유의적인 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 능력에 기반하여 동정될 수 있다. 시험 항체가 Amd 단백질(예를 들면, 촉매 도메인 또는 서열번호 1의 아미노산 9-252 또는 세포 벽 결합 도메인과 같은 서열번호 1의 서열의 적어도 일부를 갖는 Amd 단백질 또는 폴리펩타이드)에 대한 본원에 개시된 항-Amd 기준 항체의 결합을 억제하는 능력은, 시험 항체가 Amd에 대한 결합을 위해 기준 항체와 경쟁할 수 있음을 입증한다. 이러한 항체는, 비제한적인 이론에 따르면, 이것이 경쟁하는 기준 항체와 Amd 단백질 상의 동일한 또는 관련(예를 들면, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 가까운) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 기준 항체와 Amd 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 기준 항체와 Amd 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 항체이다. Amd-결합 항체 및 Amd 결합 항체 부분은 또한 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 마우스 또는 키메라 Amd-결합 항체 및 Amd 결합 항체 부분일 수 있다.
기준 항체 결합을 차단하거나 경쟁하는 능력은 Amd-결합 시험 항체 또는 Amd-결합 항체 부분이 기준 항체로서 정의된 것과 동일하거나 유사한 에피토프에, 또는 기준 Amd-결합 항체에 의해 결합된 에피토프와 충분히 가까운 에피토프에 결합함을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 기준 항체에 대해 확인된 유리한 특성들을 공유할 것 같다.
기준 항체를 차단하거나 경쟁하는 능력은 경쟁 결합 검정과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 경쟁 결합 검정을 사용하여, 시험 하에 있는 항체 또는 Amd-결합 항체 부분을, Amd 단백질 또는 Amd 단백질의 일부(예를 들면, 촉매 도메인 또는 서열번호 1의 아미노산 9-252, 또는 세포 벽 결합 도메인)에 대한 기준 항체의 특이 결합을 억제하는 능력에 대해 실험한다. 시험 항체는, 과량의 시험 항체가 기준 항체의 결합을 실질적으로 억제한다면, 항원으로서, Amd 단백질 또는 이의 일부에 대한 특이 결합을 위해 기준 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제란 시험 항체가 기준 항체의 특이 결합을 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 90%까지 감소시킴을 의미한다.
공지된 경쟁 결합 검정이 일반적으로 적용될 수 있거나, Amd 단백질 또는 이의 일부로의 결합을 위한 Amd-결합 항체 또는 Amd-결합 항체 부분과 기준 Amd-결합 항체의 경쟁을 평가하도록 일상적으로 조정될 수 있다. 이러한 경쟁 결합 검정은 고체 상 직접 또는 간접 방사면역검정(RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(문헌 참조: Stahli et al., "Distinction of Epitopes by Monoclonal Antibodies," Methods in Enzymology 92:242-253, (1983), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨); 고체 상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌 참조: Kirkland et al., "Analysis of the Fine Specificity and Cross-reactivity of Monoclonal Anti-lipid A Antibodies," J. Immunol . 137:3614-3619 (1986), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨); 고체 상 직접 표지화 검정, 고체 상 직접 표지화 샌드위치 검정(Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨); I-125 표지를 사용한 고체 상 직접 표지 RIA(문헌 참조: Morel et al., "Monoclonal Antibodies to Bovine Serum Albumin: Affinity and Specificity Determinations," Molec . Immunol . 25:7-15 (1988), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨); 고체 상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., "Epitope-Specific Antibody Response to the Surface. Antigen of Duck Hepatitis B Virus in Infected Ducks," Virology 176:546-552 (1990), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨); 및 직접 표지화 RIA(Moldenhauer et al., "Identity of HML-1 Antigen on Intestinal Intraepithelial T Cells and of B-ly7 Antigen on Hairy Cell Leukaemia," Scand . J. Immunol . 32:77-82 (1990), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면 또는 이들을 갖는 세포에 결합된 정제된 항원, 비표지된 시험 Amd-결합 항체 및 표지된 기준 항체의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 구함으로써 측정된다. 통상적으로 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체 및 항원 결합 항체 부분(경쟁 항체)은 기준 항체와 동일한 에피토프 에 결합하는 항체 및 항원 결합 항체 부분 및 입체 장애가 일어나기 위해 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 항-Amd 항체와 교차 경쟁한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.6, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.10, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.13, Amd1.14, Amd1.15, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, Amd2.2, Amd2.4, 및 Amd2.5로부터 선택된 항-Amd 항체와 교차 경쟁한다. 특정 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 항체 Amd1.6과 교차 경쟁한다. 다른 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 항체 Amd2.1과 교차 경쟁한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 상기 항-Amd 항체들 중의 하나 이상과 교차 경쟁하고, Amd 촉매 활성을 억제한다.
추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 본원에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.6, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.10, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.13, Amd1.14, Amd1.15, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, Amd2.2, Amd2.4, 및 Amd2.5로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 항체 Amd1.6과 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 항체 Amd2.1과 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 상기 항-Amd 항체들 중의 하나 이상과 동일한 에피토프에 결합하고 Amd 촉매 활성을 억제한다.
일부 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 스타필로코커스 종 Amd 촉매 도메인에 결합하는 항-Amd 항체와 교차 경쟁한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, Amd1.6, Amd1.10, Amd1.13, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, 및 Amd2.2로부터 선택된 항-Amd 항체와 교차 경쟁한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 상기 확인된 항-Amd 항체들 중의 하나 이상과 교차 경쟁하고, Amd 촉매 활성을 억제한다.
추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 본원에 기재된 항체와 Amd 촉매 도메인의 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd1.6, Amd1.10, Amd1.13, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, 및 Amd2.2로부터 선택된 항체와 Amd 촉매 도메인의 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 상기 확인된 항-Amd 항체들 중의 하나 이상과 동일한 에피토프에 결합하고 Amd 촉매 활성을 억제한다.
일부 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 스타필로코커스 종 Amd 세포 벽 결합 도메인에 결합하는 항-Amd 항체와 교차 경쟁한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, 세포 벽 결합 도메인에 결합하는 본원에 기재된 항-Amd 항체와 교차 경쟁한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd에 특이적으로 결합하고, Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.14, Amd1.15, Amd2.4, 및 Amd2.5로부터 선택된 항체와 교차 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 본원에 기재된 항-Amd 항체와 Amd 세포 벽 결합 도메인의 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.14, Amd1.15, Amd2.4, 및 Amd2.5로부터 선택된 항체와 Amd 세포 벽 결합 도메인의 동일한 에피토프에 결합한다.
본원에 개시된 항체는 또한 합성 항체일 수 있다. 합성 항체는, 예를 들면, 박테리오파지에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체이다. 대안적으로, 합성 항체는 DNA 분자 암호화 항체의 합성에 이은 항체의 발현(즉, 아미노산 특이 항체의 합성)에 의해 생성되며, 여기서, DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 이용 가능하고 널리 공지되어 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
특정 실시형태에서, 합성 항체는 상기 확인된 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 CDR 중의 하나 이상, 상기 확인된 바와 같은 상이한 중쇄 가변 도메인으로부터의 CDR의 조합, 확인된 바와 같은 경쇄 가변 도메인의 CDR 중의 하나 이상, 또는 상기 확인된 바와 같은 상이한 경쇄 가변 도메인으로부터의 CDR의 조합을 사용하여 생성된다. 예를 들자면, Amd1.6 및 Amd2.1은 다음 CDR을 포함한다:
Figure pct00063
Amd2.1 Vh, CDR2(서열번호 71)에서, X는 임의의 아미노산일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 결합부는 부분 인간화되거나 완전히 인간이다.
인간화 항체는 가변 영역 내에 비-인간(예를 들면,뮤린) 항체로부터의 최소 서열을 함유하는 항체이다. 이러한 항체는 인간 대상체에 투여되는 경우 항원성 및 인간 항-마우스 항체 반응을 감소시키기 위해 치료학적으로 사용된다. 사실상, 인간화 항체는 전형적으로 비-인간 서열을 최소로 갖거나 전혀 갖지 않는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체 또는 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
항체는 인간 항체의 상보성 결정 부위(CDR)를 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 항체(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터 등)의 그것으로 치환함으로써 인간화될 수 있다(Jones et al., "Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse," Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536 (1988), 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨). 인간화 항체는 Fv 골격 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형되어 항체 특이성, 친화도, 및/또는 능력을 개선 및 최적화할 수 있다.
인간화 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리되거나 시험관내에서 면역화된 불멸성 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌 참조: Reisfeld et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (Alan R. Liss ed., 1985) and Garrard의 미국 특허 제5,750,373호, 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨). 또한, 인간화 항체는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서, 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다(Vaughan et al., "Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library," Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996); Sheets et al., "Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library: The Production of High-Affinity Human Single-Chain Antibodies to Protein Antigens," Proc . Nat'l. Acad . Sci . U.S.A . 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom et al., "By-passing Immunisation. Human Antibodies from Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged in vitro," J. Mol . Biol . 227:381-8 (1992); Marks et al., "By-passing Immunization. Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage," J. Mol . Biol . 222:581-97 (1991), 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨). 인간화 항체는 또한 면역화시 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 유전자도입 마우스에서 만들어질 수 있다. 이러한 접근법은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 수라니 등(Surani et al.)의 미국 특허 제5,545,807호; 론버그 등(Lonberg et al.)의 제5,545,806호; 론버그 등의 제5,569,825호; 론버그 등의 제5,625,126호; 론버그 등의 제5,633,425호; 및 론버그 등의 제5,661,016호에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 인간화 단클론성 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 부류 또는 IgG4 부류이다. IgG3 부류가 이의 감소된 단백질 A 결합 때문에 특히 바람직하다(문헌 참조: Natsume et al., "Engineered Antibodies of IgG1/IgG3 Mixed Isotype with Enhanced Cytotoxic Activities," Cancer Res 68(10):3863-72 (2008), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
이러한 항체 부류의 순환 반감기는 페트코바 등(Petkova et al.)에 의해 기재된 N434A 및 T307A/E380A/N434A 치환("Enhanced Half-life of Genetically Engineered Human IgG1 Antibodies in a Humanized FcRn Mouse Model: Potential Application in Humorally Mediated Autoimmune Disease," International Immunology 18(12):1759-1769 (2006), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨) 또는 발시티스 등(Balsitis et al.)에 의해 기재된 N297Q 치환("Lethal Antibody Enhancement of Dengue Disease in Mice Is Prevented by Fc Modification,," PloS Pathogens 6(2): e1000790 (2010), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨)과 같은 Fc 도메인에 대한 변형으로 증진될 수 있다.
각각 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 및 63로서 상기 동정된 중쇄 및 경쇄 서열은 코돈-최적화된 DNA 서열을 동정하는데 사용될 수 있으며, 이것은 본 발명에 따르는 재조합, 키메라 항체의 생산에 적합한 발현 시스템에 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 동정된 DNA 서열은 본 발명에 따르는 재조합, 키메라 항체의 생산에 적합한 발현 시스템의 제조에 사용될 수 있다.
전체 항체 이외에, 본 발명은 이러한 항체의 Amd 결합부를 포함한다. 이러한 Amd 결합부는, 제한 없이, 1가 Fab 단편, Fv 단편(예를 들면, 단일쇄 항체, scFv), 단일 가변 VH 및 VL 도메인, 및 2가 F(ab')2 단편, Bis-scFv, 디아바디, 트리아바디, 및 미니바디를 포함한다. 이러한 항체 단편은 문헌[참조: James Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 98-118 (Academic Press, 1983); Ed Harlow and David Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988); Houston et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli ," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883 (1988); Bird et al, "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426 (1988), 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨]에 기재된 바와 같은 단백질분해성 단편화 과정, 또는 당업계에 공지된 기타의 방법들과 같은 통상의 과정에 의해 만들어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체, 또는 이의 Amd 결합부는 아미노산이 각각의 인간 Vh 또는 Vl 생식세포계열 서열로부터의 항체 골격으로 치환된 골격을 포함한다. 아래의 실시예 6은 본원에 기재된 수많은 항체에 대한 생식세포계열 서열을 동정한다.
특히 항체 단편의 경우에, 이의 혈청 반감기를 증가시키도록 항체를 변형시키는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 이것은, 예를 들면, 항체 단편에서의 적당한 영역의 돌연변이에 의해 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 단편에 삽입함으로써 또는 (예를 들면, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해) 말단 또는 중간에서 항체 단편에 이후에 융합되는 펩타이드 태그로 에피토프 결합 부위를 삽입함으로써 달성될 수 있다.
항체 모방체가 또한 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다. 열번째 인간 피브로넥틴 타입 III 도메인(10Fn3)으로부터 유도된 에드넥틴 또는 모노바디로서 알려진 것들(Koide et al., "The Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins," J. Mol . Biol . 284:1141-1151 (1998); Koide et al., "Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins: Application to the Estrogen Receptor," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:1253-1258 (2002), 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용됨); 및 스타필로코커스 단백질 A의 안정한 알파-나선형 박테리아 수용체 도메인 Z로부터 유도된 애피바디로서 공지된 것들(Nord et al., "Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain," Nature Biotechnol . 15(8):772-777 (1997), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨)을 제한 없이 포함하는 다수의 항체 모방체가 당업계에 공지되어 있다.
이러한 항체 모방체를 제조하는데 있어서, VH 및/또는 VL 쇄의 CDR을 이러한 항체 모방체의 가변 루프 영역으로 슬라이싱 또는 이식할 수 있다. 이식(grafting)은 CDR 서열의 치환과 함께 특히 루프 영역에서 출현하는 적어도 두 개의 아미노산 잔기 내지 실질적으로 전부는 아니지만 하나의 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 삽입은, 예를 들면, 하나의 루프 영역에서 하나의 CDR, 임의로 제2 루프 영역에서 제2 CDR, 및 임의로 제3 루프 영역에서 제3 CDR의 삽입일 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 임의의 결손, 삽입, 및 치환은 공지된 뉴클레오타이드 서열(아래에 나타냄)로 시작하는 재조합 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
단클론성 항체 생산을 위한 방법들은 본원에 기재된 기술들 또는 기타의 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다(Monoclonal Antibodies - Production, Engineering and Clinical Applications (Mary A. Ritter and Heather M. Ladyman eds., 1995), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 일반적으로, 공정은 관심 대상 항원(즉, 스타필로코커스 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제 또는 이의 펩타이드 단편)으로 이미 면역화된 포유류의 비장으로부터 면역 세포(림프구)를 수득함을 포함한다.
그 후, 항체-분비 림프구를 골수종 세포 또는 형질전환 세포와 융합하며, 이것은 세포 배양물에서 무한으로 복제함으로써 불멸성, 면역글로불린-분비 세포주를 생산할 수 있다. 포유류 골수종 세포와의 융합 또는 세포 배양물에서 무한으로 복제할 수 있는 기타의 융합 파트너는 표준 및 널리 공지된 기술들에 의해, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 기타의 융제를 사용함으로써 달성된다(Milstein and Kohler, "Derivation of Specific Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion," Eur . J. Immunol . 6:511 (1976), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 바람직하게는 뮤린이지만 기타의 포유류 종의 세포로부터도 유도될 수 있는 불멸 세포주는 특정 영양분의 이용을 위해 필요한 효소가 결핍되고, 신속하게 성장할 수 있으며, 우수한 융합 성능을 갖도록 선택된다. 생성된 융합 세포, 또는 하이브리도마를 배양하고, 생성된 콜로니를 목적하는 단클론성 항체의 생산을 위해 선별한다. 이러한 항체를 생산하는 콜러니를 클로닝하고, 생체내 또는 시험관내에서 성장시켜 다량의 항체를 생산한다.
따라서, 본 발명의 제2 양태는 본원에 개시된 단클론성 항체 또는 결합부를 발현하는 세포주에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서 본원에 개시된 단클론성 항체는 Amd1.1, Amd1.2, Amd1.3, Amd1.5, Amd1.6, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.10, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.13, Amd1.14, Amd1.15, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, Amd2.2, Amd2.4, 및 Amd2.5로 명명된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된다.
앞서 주지된 바와 같이, 단클론성 항체는 전문이 본원에 참고로 인용된 캐빌리 등(Cabilly et al.)의 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리한다. 그후, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터로 클로닝하며, 이것은, 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질전환되는 경우, 단클론성 항체를 발현 및 분비하는 숙주 세포를 생성한다. 또한, 목적하는 종의 재조합 단클론성 항체 또는 이의 단편은 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다(McCafferty et al., "Phage Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains," Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., "Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries," Nature 352:624-628 (1991); and Marks et al., "By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage," J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨).
여전히 추가의 양태는 본원에 개시된 항체 또는 결합부를 암호화하는 DNA 분자, DNA 분자의 프로모터-효과적인 DNA 분자 작동적으로 연결된 5', 및 DNA 분자의 전사 종결 DNA 분자 작동적으로 연결된 3'를 포함하는 DNA 작제물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA 작제물이 삽입된 발현 벡터를 포함한다. 폴리펩타이드를 위한 합성 유전자는 이것이 돌연변이유발 용이성을 위해 편리한 제한 부위를 포함하고 고-수준 단백질 발현을 위해 특정 코돈을 사용하도록 설계될 수 있다(Gribskov et al., "The Codon Preference Plot: Graphic Analysis of Protein Coding Sequences and Prediction of Gene Expression," Nucl . Acids. Res. 12:539-549 (1984), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
유전자는 다음과 같이 조립될 수 있다: 먼저 유전자 서열은 설계된 제한 부위에서 경계를 갖는 부분으로 나뉠 있다: 각 부분을 위해, 반대 가닥을 암호화하고 약 15개 염기의 상보적 중복을 갖는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있고; 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킬 수 있고, 단일 가닥 영역을 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편을 사용하여 채울 수 있으며; 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 단편의 종점에서 제한 효소 부위를 사용하여 pET3a 벡터(Novagen)와 같은 벡터에 클로닝할 수 있고, 이의 서열을 DNA 시퀀서에 의해 확인할 수 있으며; 이들 단계들은 전체 유전자를 수득하기 위해 각각의 부분에 대해 반복할 수 있다. 이러한 접근법은 1단계 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법보다 유전자를 조립하는데 더 많은 시간이 소요된다(Sandhu et al., "Dual Asymetric PCR: One-Step Construction of Synthetic Genes," BioTech . 12:14-16 (1992), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 돌연변이는 Taq 폴리머라제에 의한 저 충실도 복제에 의해 도입될 수 있을 것 같으며 시간-소모적 유전자-편집을 필요로 한다. 재조합 DNA 조작은 달리 나타내지 않는 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989)]에 따라 수행할 수 있다. 1단계 PCR 동안 돌연변이의 도입을 피하기 위해, 고 충실도/저 오류 폴리머라제가 당업계에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.
목적하는 돌연변이는 카세트 돌연변이법, 올리고뉴클레오티드 부위-지향성 돌연변이법 기술(Deng & Nickoloff, "Site-Directed Mutagenesis of Virtually any Plasmid by Eliminating a Unique Site," Anal. Biochem . 200:81-88 (1992), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨), 또는 Kunkel 돌연변이법(Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection," Proc . Natl. Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection," Methods Enzymol . 154:367-382 (1987), 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨)을 사용하여 폴리펩타이드 서열(들)에 도입될 수 있다.
카세트 돌연변이법 및 부위-지향성 돌연변이법 둘 다가 특히 목적하는 뉴클레오티드 암호화 서열을 제조하는데 사용될 수 있다. 카세트 돌연변이법은 상기한 유전자 작제를 위한 동일한 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있으며, 새로운 서열을 암호화하는 이중-가닥 DNA 단편은 적합한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 여러 돌연변이들은 새로 합성된 가닥(암호화 돌연변이) 및 유전자 합성에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 조합함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 돌연변이를 도입하는데 사용되는 접근법과는 무관하게, 서열화는 설계된 돌연변이가 돌연변이유발 반응에 의해 도입되었음을(그리고 다른 돌연변이는 도입되지 않았음을) 확인하기 위해 수행될 수 있다.
이와 달리, Kunkel 돌연변이법은 선별을 위한 폴리펩타이드의 조합 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있는 다수의 돌연변이된 폴리펩타이드 암호화 서열을 무작위로 제조하는데 사용될 수 있다. 기본적으로, 표적화된 루프 영역(또는 C-말단 또는 N-말단 꼬리 영역)은 NNK 코돈(N은 A, T, G, C의 혼합물을 나타내고, K는 G와 T의 혼합물을 나타냄)을 사용하여 무작위화할 수 있다(Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection," Methods Enzymol . 154:367-382 (1987), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
항체 또는 Amd 결합부를 암호화하는 핵산 분자를 제조하는데 사용되는 접근법과는 무관하게, 핵산은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 이것은 DNA 분자를 DNA 분자가 이종성인(즉, 정상적으로는 존재하지 않는) 발현 시스템으로 삽입함을 포함한다. 이종 DNA 분자는 센스 방향(sense orientation)에서 발현 시스템 또는 벡터로 삽입되며, 판독 프레임을 수정한다. 벡터는 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소들(프로모터, 억제인자, 작동인자, 전사 종결 서열 등)을 함유한다. 재조합 유전자 또는 DNA 작제물은 발현 벡터로의 삽입 전에 제조될 수 있다. 예를 들면, 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여, 프로모터-효과적인 DNA 분자를 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자의 작동적으로 연결된 5'일 수 있고 전사 종결(즉, 폴리아데닐화 서열)은 이의 작동적으로 연결된 3'일 수 있다.
이러한 양태에 따르면, 폴리뉴클레오티드는 분자가 이종성인 발현 시스템 또는 벡터에 삽입된다. 이종 핵산 분자는 프로모터 및 임의의 다른 5' 조절성 분자에 비해 적절한 센스(5'→3') 방향으로 발현 시스템 또는 벡터로 삽입되고, 판독 프레임을 수정한다. 핵산 작제물의 제조는 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Laboratory Press, 2001)]에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 표준 클로닝 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 전문이 본원에 참고로 인용된 코헨 및 보이어(Cohen and Boyer)의 미국 특허 제4,237,224호가 또한 제한 효소 절단 및 DNA 리가제로의 결찰을 사용하여 재조합 플라스미드의 형태로 발현 시스템을 생산하는 것을 기술하고 있다.
적합한 발현 벡터는 레플리콘 및 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유도된 조절 서열을 함유하는 것들을 포함한다. 예를 들면, 이. 콜라이가 숙주 세포로서 사용되면, pUC19, pUC18 또는 pBR322와 같은 플라스미드가 사용될 수 있다. 곤충 숙주 세포를 사용하는 경우, 곤충 숙주 세포와 양립할 수 있는 적합한 전달 벡터는 목적하는 단백질에 융합된 분비성 신호를 포함하는 pVL1392, pVL1393, pAcGP67 및 pAcSecG2T, 및 GST 및 6xHis 태그(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 pAcGHLT 및 pAcHLT를 포함한다. 이러한 양태를 수행하는데 사용하기에 적합한 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성 벡터, 아데노-관련 바이러스성 벡터, 백시니아 바이러스성 벡터, 노다바이러스성 벡터, 및 레트로바이러스성 벡터를 포함한다. 기타의 적합한 발현 벡터가 문헌[참조: Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Laboratory Press, 2001), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨]에 기재되어 있다. 예를 들면, 핵산 작제물의 제조, 돌연변이유발, 서열화, 세포로의 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석에 있어서의 핵산 조작을 위한 다수의 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology (Fred M. Ausubel et al. eds., 2003), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨]에 상세하게 기재되어 있다.
상이한 유전 신호 및 프로세싱 이벤트는 여러 수준의 유전자 발현(예를 들면, DNA 전사 및 메신저 RNA("mRNA") 번역) 및 후속적으로 숙주 세포에 의해 생산되고 발현되는 항체 또는 항체 단편의 양을 조절한다. DNA의 전사는 RNA 폴리머라제의 결합을 지시하여 mRNA 합성을 촉진시키는 DNA 서열인 프로모터의 존재에 따라 좌우된다. 프로모터는 이들의 "강도"(즉, 전사를 촉진시키는 능력)에 있어서 다양하다. 클로닝된 유전자를 발현시키려는 목적을 위해, 강한 프로모터를 사용하여 높은 수준의 전사, 및 이에 따른 발현을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 사용되는 숙주 시스템에 따라, 다수의 적합한 프로모터들 중의 어느 하나가 사용될 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이, 이의 박테리오파지, 또는 플라스미드를 사용하는 경우, T7 파지 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, recA 프로모터, 로보솜성 RNA 프로모터, 대장균 분해 바이러스 람다의 PR 및 PL 프로모터 및 lacUV5, ompF, bla , lpp 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 것들 등과 같은 프로모터들이 인접한 DNA 분절의 높은 수준의 전단을 지시하는데 사용될 수 있다. 게다가, 하이브리드 trp-lacUV5(tac) 프로모터 또는 재조합 DNA 또는 기타의 합성 DNA 기술에 의해 생산된 기타의 이. 콜라이 프로모터가 삽입된 유전자의 전사를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 곤충 세포를 사용하는 경우, 적합한 바큘로바이러스 프로모터는 후기(late) 프로모터, 예를 들면, 39K 단백질 프로모터 또는 염기성 단백질 프로모터, 및 초 후기(very late) 프로모터, 예를 들면, p10 및 다면체 프로모터를 포함한다. 몇몇 경우에 다중 바큘로바이러스성 프로모터를 함유하는 전달 벡터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 포유류 세포에서의 발현을 지시하는데 적합한 통상의 프로모터는, 제한 없이, SV40, MMTV, 메탈로티오네인-1, 아데노바이러스 Ela, CMV, 급초기, 면역글로불린 중쇄 프로모터 및 인핸서, 및 RSV-LTR을 포함한다. 프로모터는 구성적, 또는 대안적으로, 조직-특이적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 일부 상황에서는 유동성 (TetOn) 프로모터가 사용될 수 있다.
원핵생물에서의 mRNA의 번역은 진핵생물의 그것과는 상이한 적절한 원핵생물 신호의 존재에 따라 좌우된다. 원핵생물에서의 mRNA의 효율적인 번역은 mRNA 상에 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)("SD") 서열이라고 불리는 리보솜 결합 부위를 필요로 한다. 이 서열은 개시 코돈, 통상적으로 AUG 앞에 위치한 mRNA의 짧은 뉴클레오타이드 서열이며, 이것은 단백질의 아미노-말단 메티오닌을 암호화한다. SD 서열은 16S rRNA(리보솜성 RNA)의 3' 말단에 상보적이며, rRNA와 이중화(duplexing)하여 리보솜의 정확한 위치결정을 가능케 함으로써 리보솜으로의 mRNA의 결합을 촉진시킨다. 유전자 발현을 최대화하는 것에 관한 검토를 위해, 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Roberts and Lauer, "Maximizing Gene Expression on a Plasmid Using Recombination in vitro," Methods in Enzymology, 68:473-82 (1979)]을 참조한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 DNA 작제물로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩타이드를 발현하는데 적합한 숙주 세포는 여러 상업적으로 이용 가능한 그램 음성 박테리아 중의 어느 하나를 포함한다. 적합한 미생물은 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 에쉐리키아 콜라이 ( Escherichia coli ), 살모넬라 가스트로엔테리티스(Salmonella gastroenteritis)( typhimirium ), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 엔테리디티스 (S. enteriditis ), 시겔라 플렉스네리 ( Shigella flexneri), 시겔라 손니에 (S. sonnie ), 시겔라 디센테리아 (S. dysenteriae ), 나이 세리아 고노로에아 ( Neisseria gonorrhoeae ), 나이세리아 메민기티데스 (N. meningitides), 헤모필루스 인플루엔자( Haemophilus influenzae ), 헤모필루스 플레우로뉴모니아(H. pleuropneumoniae ), 파스퇴렐라 헤몰리티카( Pasteurella haemolytica), 파스퇴렐라 멀티로시다 (P. multilocida ), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila ), 트레모네마 팔리둠 ( Treponema pallidum ), 트레모네마 덴티콜라(T. denticola ), 트레모네마 오랄레스 (T. orales ), 보렐리아 부르도페 리( Borrelia burgdorferi ), 보렐리아 종( Borrelia spp .), 렙토스피라 인테로간스( Leptospira interrogans ), 클렙시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneumoniae ), 프로테우스 불가리스( Proteus vulgaris ), 프로테우스 모르가니 (P. morganii ), 프로테우스 미라빌리스(P. mirabilis ), 리케치아 프로바제키 (Rickettsia prowazeki ), 리케치아 티피 (R. typhi ), 리케치아 리셋시(R. richettsii ), 포르피로모나스( 박테리오데스 ) 긴기발리스 (( Porphyromonas )( Bacteriodes ) gingivalis ), 클라미디아 시타시( Chlamydia psittaci ), 클라미디아 뉴모니아 (C. pneumoniae ), 클라미디아 트리코마티스(C. trachomatis ), 캄필로박터 제주니( Campylobacter jejuni ), 캄필로박터 인테르메디스(C. intermedis ), 캄필로박터 페투스 (C. fetus), 헬리코박터 필로리( Helicobacter pylori), 프란시셀라 툴라레니시스 ( Francisella tularenisis ), 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ), 비브리오 파라헤모리티쿠스( Vibrio parahaemolyticus), 보르데텔라 페르투시스 ( Bordetella pertussis ), 부르크홀데리 에 슈도말레이 ( Burkholderie pseudomallei ), 브루셀라 아보르투스 ( Brucella abortus), 브루셀라 수시(B. susi ), 브루셀라 멜리텐시스 (B. melitensis ), 브루셀 라 칸니스(B. canis ), 스피릴룸 미누스 ( Spirillum minus), 슈도모나스 말레이( Pseudomonas mallei ), 아에로모나스 히드로필라 ( Aeromonas hydrophila ), 아에로 모나스 살모니시다 (A. salmonicida ), 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)를 포함한다.
박테리아 세포 이외에, 동물 세포, 특히 포유류 및 곤충 세포, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 또는 해조류 세포가 또한 본원에 개시된 타입의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 운반하는 재조합 발현 벡터의 형질감염/형질전환에 적합한 숙주 세포이다. 당업계에서 통상적으로 사용되는 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, COS 세포, 및 다수의 기타 세포를 포함한다. 적합한 곤충 세포주는 Sf9 및 Sf21 세포를 포함한, 바큘로바이러스 감염에 민감한 것들을 포함한다.
숙주 세포를 발현 벡터로 형질전환/형질감염시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Laboratory Press, 2001)]에 기재된 바와 같이 선택된 숙주 세포에 따라 좌우된다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환법, 전기천공법, 및 박테리오파지를 사용한 형질감염법을 포함한다. 진핵세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염법, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포솜-매개된 형질주입, 및 레트로바이러스 또는 기타의 다른 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함한다. 곤충 세포의 경우, 폴리뉴클레오티드 작제물을 함유하는 전달 벡터를 AcNPV와 같은 바쿨로바이러스 DNA로 공동-형질주입하여 재조합 바이러스의 생산을 촉진시킨다. 후속적인 Sf 세포의 재조합 바이러스 감염은 높은 재조합 단백질 생산률을 초래한다. 단백질 생산을 촉진시키는데 사용되는 숙주 세포 및 발현 시스템과 관계없이, 발현된 항체, 항체 단편, 또는 항체 모방체는 당업계에 공지되고 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Philip L.R. Bonner, Protein Purification (Routledge 2007)에 기재된 표준 정제 방법을 사용하여 용이하게 정제될 수 있다.
단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 사용하여 더욱 변형시켜 또 다른 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 마우스 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인이 인간 항체의 이러한 영역을 치환하여 상기 논의된 바와 같이 인간화(또는 키메라) 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 마우스 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인이 비-면역글로불린 폴리펩타이드를 치환하여 융합 항체를 생성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 불변 영역을 잘라내거나 제거하여 단클론성 항체의 목적하는 항체 단편을 생성한다. 더욱이, 가변 영역의 부위-지향성 또는 고밀도 조합 돌연변이유발를 사용하여 단클론성 항체의 특이성과 친화도를 최적화할 수 있다.
추가의 양태는 담체 및 본 발명에 따르는 하나 이상의 단클론성 항체 또는 이의 하나 이상의 Amd 결합부를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 둘 이상의 항체 또는 결합 단편을 함유할 수 있으며, 여기서, 모든 항체 또는 결합 단편은 동일한 에피토프를 인지한다. 대안적으로, 약제학적 조성물은 항체 또는 결합 단편 혼합물을 함유할 수 있으며, 여기서, 하나 이상의 항체 또는 결합 단편은 스타필로코커스 Amd의 하나의 에피토프를 인지하고 하나 이상의 항체 또는 결합 단편은 스타필로코커스 Amd의 상이한 에피토프를 인지한다. 예를 들면, 혼합물은 Amd의 촉매 도메인에 결합하는 항체와 같은 Amd에 결합하는 어떠한 다른 항체와 조합하여 스타필로코커스 Amd의 R1 또는 R2 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 아래에 기재된 바와 같은 기타의 약제학적으로 허용가능한 성분을 추가로 함유할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 담체는 수용액이다.
본원에 개시된 항체를 함유하는 약제학적 조성물은 스타필로코커스 감염을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본원에 개시된 항체를 투여하는데 사용될 수 있다. 도입방법은 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료제는, 예를 들면, 주입 또는 농축괴 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들면, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며 화학요법제, 항생제, 또는 기타의 면역요법제와 같은 기타의 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소성, 즉, Staph 감염 부위에서 또는 수술 또는 임플란트 부위에 직접 이루어질 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 환자에 대한 제2 치료제를 포함할 수 있으며, 여기서, 제2 치료제는 항생제 또는 면역요법제이다. 예시적인 항생제는, 제한 없이, 반코마이신, 토브라마이신, 세파졸린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 겐타마이신, 푸시드산, 미노사이클린, 코-트리목사졸, 클린다마이신, 리네졸리드, 퀴누프리스틴-달포프리스틴, 다프토마이신, 티게사이클린, 달바반신, 텔라반신, 오리타반신, 세프토비프롤, 세프타롤린, 이클라프림, 카르바페넴 CS-023/RO-4908463, 및 이의 배합물을 포함한다. 예시적인 면역요법제는, 제한 없이, 테피바주맙, BSYX-A110, AurexisTM 및 이들의 배합물을 포함한다. 항생제 및 면역요법제의 상기 목록은 비제한적인 예인 것으로 의도된다; 따라서, 다른 항생제 또는 면역요법제가 또한 고려된다. 제2 치료제의 배합물 또는 혼합물이 또한 이러한 목적에 사용될 수 있다. 이들 제제는 동시에 또는 단일 제형으로서 투여될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 면역요법제는 스타필로코커스 글루코사미니다제(Gmd)에 특이적으로 결합하여 스타필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제하는 제2 단클론성 항체 또는 이의 결합부를 포함한다. 바람직하게는, 제2 단클론성 항체는 1C11, 1E12, 2D11, 3A8, 3H6, 또는 4A12로 명명된 하이브리도마 세포주, 이의 인간화 변이체, 또는 이의 결합부에 의해 생산된다(슈바르츠 등(Schwarz et al.)의 PCT 공개 제WO2011/140114호 및 제WO2013/066876호, 이들은 전문이 본원에 참고로 인용됨). 또한 이러한 양태에 따르면, 제2 단클론성 항체의 인간화 변이체는 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 부류이다.
또 다른 실시형태에서, 제2 단클론성 항체의 결합부는 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함한다.
약제학적 조성물은 전형적으로 하나 이상의 약제학적 담체(예를 들면, 멸균액, 예를 들면, 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함한 오일, 예를 들면, 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등)를 포함한다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 보다 전형적인 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액을 위해 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는, 예를 들면, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 등을 포함한다. 조성물은, 바람직한 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세라이드와 같은 전통적인 결합제 및 담체로 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적합한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적당량의 담체와 함께 치료학적 유효량의 핵산 또는 단백질을, 전형적으로 정제된 형태로 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 상응한다.
상기한 박테리아 감염의 치료를 위한 조성물의 유효량은 투여 방식, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 투여되는 기타의 약제, 및 치료가 예방용인지 치료용인지를 포함한 다수의 상이한 인자들에 따라 변할 수 있다. 예방적 용도에서는, 비교적 낮은 투여량이 장시간에 걸쳐 비교적 잦지 않은 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 생애 동안 계속해서 치료를 받는다. 치료적 용도에서는, 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 및 바람직하게는 환자가 질환의 증상들의 부분적 또는 완전한 호전을 보일 때까지 비교적 짧은 간격의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그후, 환자에게 예방적 섭생이 투여될 수 있다. 스타필로코커스 박테리아 감염에 대한 예방적 치료를 위해, 본원에 개시된 약제학적 조성물(들)은 개체가 박테리아에 노출되기 전에 투여될 수 있으며 야기된 면역 반응은 박테리아가 개체로부터 제거될 수 있도록 박테리아 감염의 중증도를 억제시키거나 감소시킬 수 있는 것으로 의도된다. 예를 들면, 단클론성 항체 또는 약제학적 조성물은 관절 치환술 또는 보철용 임플란트를 포함한 임의의 수술과 같은 수술 절차 전, 동안, 및/또는 직후에 투여될 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 결합 단편으로의 수동 면역화를 위해, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 약 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 약 0.01 내지 약 10 mg/kg에 이른다. 예를 들면, 투여량은 약 1 mg/kg 체중 또는 약 10 mg/kg 체중, 또는 약 1 내지 약 10 mg/kg 범위 이내일 수 있다. 예시적인 치료 섭생은 2주에 한번 또는 한달에 한번 또는 3 내지 6개월에 한번 투여를 수반한다. 몇몇 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 갖는 둘 이상의 단클론성 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 제시된 범위내에 든다. 항체는 통상적으로 여러 차례 투여된다. 단일 투여량 간의 간격은 매일, 매주, 매달, 또는 매년일 수 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 1-1000㎍/ml 및 일부 방법에서는 25-300㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하기 위해 조절된다. 대안적으로, 항체는 서방출 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 다르다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 보이고, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체가 그 뒤를 잇는다.
추가의 양태는 유효량의 본원에 개시된 단클론성 항체, 결합부, 또는 약제학적 조성물을 이러한 임플란트를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 정형외과용 임플란트 또는 의료 기기를 환자에게 도입함을 포함하여, 정형외과용 임플란트, 조직 이식편 또는 의료 기기를 환자에게 도입하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 의료 기기를 "도입하는(Introducing)"이란 처음으로 장치 또는 이식편을 도입하거나 설치하는 것 뿐만 아니라 이전에 설치된 장치 또는 이식편을 재생(resurfacing)하거나 달리 변형시키고, 이전에 설치된 장치 또는 이식편을 - 전부 또는 일부 - 대체하거나, 또는 달리 이전에 설치된 장치 또는 이식편을 수술적으로 변형시키는 것으로서 정의된다.
하나의 실시형태에서, 정형외과용 임플란트, 의료 기기 또는 이식편을 도입하는 방법은 정형외과용 임플란트, 의료 기기 또는 이식편을 필요로 하는 환자에게 유효량의 단클론성 항체 또는 결합 단편 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물을 전신으로 또는 이식 부위에 직접 투여함을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 정형외과용 임플란트, 의료 기기 또는 이식편은 임플란트 부위에서 이의 이식 전, 이식 동안 또는 이식 직후에 단클론성 항체 또는 결합 단편 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물로 코팅되거나 처리될 수 있다.
정형외과용 임플란트는 관절 보철물, 이식편 또는 합성 임플란트와 같은 스타필로코커스 감염에 민감한 임의의 타입의 임플란트일 수 있다. 예시적인 관절 보철물은, 제한 없이, 무릎 보철물, 엉덩이 보철물, 손가락 보철물, 팔꿈치 보철물, 어깨 보철물, 아래턱 보철물, 및 발목 보철물을 포함한다. 기타의 보철물들이 또한 사용될 수 있다. 예시적인 이식편 또는 합성 임플란트는, 제한 없이, 혈관 이식편, 심장 판막 임플란트, 인공 추간판, 반월상연골 임플란트, 또는 합성 또는 이종이식편 전방 십자 인대, 내측 측부 인대, 외측 측부 인대, 후방 십자 인대, 아킬레스 힘줄, 및 회전근개를 포함한다. 다른 이식편 또는 임플란트들이 또한 사용될 수 있다.
의료 기기는 스타필로코커스 감염에 민감한 임의의 의료 기기일 수 있다. 예시적인 의료 기기는, 제한 없이, 심박조율기, 뇌척수액 단락, 투석 카테터, 또는 인공 심장 판막(prosthetic heart valve)을 포함한다.
이러한 양태에 따르면, 제2 치료제가 또한 환자에게 투여될 수 있다. 제2 치료제는 항생제 또는 면역요법제일 수 있다. 예시적인 항생제 및 면역요법제는 상기한 바와 같다.
하나의 실시형태에서, 정형외과용 임플란트 또는 의료 기기를 도입하는 방법은 수정 전 관절 치환을 설치하는 공정을 포함하도록 의도된다. 원래의 관절 치환물의 감염, 특히 스타필로코커스 종 감염이 발생하는 경우, 유일하게 실행 가능한 치료는 수정 전 관절 치환이다. 이러한 실시형태에서, 감염된 관절 보철물을 먼저 제거한 다음 근본적인 감염에 대해 환자를 치료한다. 감염의 치료는 연장된 기간(즉, 6개월)에 걸쳐 일어나며, 이 시간 동안 환자는 움직이지 못하고(또는 단지 제한된 운동성을 가지며) 근본적인 감염을 치료하기 위한 고용량의 항생제 및 임의로 본원에 개시된 하나 이상의 단클론성 항체 또는 결합부, 또는 약제학적 조성물을 제공받는다. 근본적인 감염의 치료시, 새로운 관절 보철물이 설치된다. 새로운 관절 보철물의 설치 직전(즉, 새로운 관절 보철물 설치에 앞서 2주 내에) 및 임의로 설치 후에, 환자는 본원에 개시된 하나 이상의 단클론성 항체 또는 결합부, 또는 약제학적 조성물을 투여받는다. 이러한 치료를 설치후 기간 동안 1회 이상 반복할 수 있다. 항생제 치료는 본원에 개시된 하나 이상의 단클론성 항체 또는 결합부, 또는 약제학적 조성물과 병용하여 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 치료는 수정 전 관절 치환술 동안 감염 또는 재감염을 예방하는데 효과적이다.
또 다른 양태는 스타필로코커스 감염에 민감하거나 감염을 갖는 환자에게 본원에 개시된 유효량의 단클론성 항체, 단클론성 항체 결합부, 또는 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합물을 투여함을 포함하여, 스타필로코커스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
스타필로코커스 감염을 치료하는 하나의 실시형태에서, 단클론성 항체, 단클론성 항체 결합부, 약제학적 조성물, 또는 이의 배합물의 투여는 반복된다. 초기 투여 및 반복 투여는 다른 치료법과 동시에 또는 차례로 이루어질 수 있으며, 전신으로 실시되거나 스타필로코커스 감염 부위에 직접 실시되거나 둘 다일 수 있다.
스타필로코커스 감염을 치료하는 방법은, 제한 없이, 피부, 근육, 심장, 호흡기, 위장관, 눈, 신장 및 요로의 감염, 및 뼈 또는 관절 감염을 포함하는 부위에서 스타필로코커스 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 이 방법은 유효량의 단클론성 항체 또는 이의 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 스타필로코커스 뼈 또는 관절 감염을 갖는 환자에게 투여함으로써 골수염을 치료하기 위해 실시된다. 이러한 제제 또는 조성물의 투여는 위에 기재된 경로 중의 어느 것을 사용하여 실시될 수 있다; 특정 실시형태에서, 뼈 또는 관절 감염 부위에의 직접 투여가 수행될 수 있다.
이전의 실시양태들 각각에 있어서, 제2 치료제가 또한 환자에게 투여될 수 있다. 제2 치료제는 항생제 또는 면역요법제일 수 있다. 예시적인 항생제 및 면역요법제는 상기한 바와 같다.
본원에 개시된 바와 같은 치료방법은 인간 및 비-인간 포유류를 포함한, 필요로 하는 임의의 환자를 치료하는데 사용될 수 있지만, 상기 방법은 어느 연령의 면역-약화 환자 뿐만 아니라 50세 이상의 환자를 위해 특히 유용하다.
이전의 실시형태들에서, 예방적 또는 치료적 치료방법은 감염률, 감염의 중증도, 감염의 지속시간, 또는 이의 조합을 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 예방적 또는 치료적 치료방법은 SRC 또는 농양의 총 수를 감소시키거나 완전히 제거할 수 있고/있거나 무균성 SRC 또는 농양(SRC 또는 농양이 존재한다고 가정하면)의 수를 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 병변 크기 또는 체적의 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이 용골성 병변의 부분 또는 완전 치유가 고려된다.
또 다른 양태는 샘플을 본원에 개시된 단클론성 항체 또는 결합부에 노출시키고, 단클론성 항체 또는 결합부와 샘플에 존재하는 스타필로코커스 또는 스타필로코커스 아미다제 사이에 면역 복합체가 형성되었는지 검출함(상기 노출 후 면역 복합체의 존재는 샘플 중의 스타필로코커스의 존재를 나타낸다)을 포함하여, 샘플에서 스타필로코커스의 존재를 측정하는 방법에 관한 것이다.
샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 점막-관련 림프 조직(MALT) 샘플, 뇌척수액 샘플, 관절액 샘플, 늑막액 샘플, 타액 샘플, 뇨 샘플, 또는 조직 생검 샘플일 수 있다.
면역 복합체의 형성을 검출하는 것은 당업계에 널리 공지된 방법들에 의해 수행될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 검출은 면역검정을 사용하여 수행된다. 사용되는 면역검정 방법은 공지된 면역검정 방법일 수 있으며, 예를 들면, 라텍스 응집법, 비탁법, 방사면역검정법(예를 들면, RIA 및 RIMA), 효소 면역검정법(예를 들면, ELISA 및 EIA), 겔 확산 침전 반응, 유동 세포계측법, 면역전기영동법(예를 들면, 웨스턴 블롯팅), 도트 블롯법, 면역확산 검정, 단백질 A 면역검정, 형광 면역검정(예를 들면, FIA 및 IFMA), 면역크로마토그래피법 및 항체 어레이 방법와 같은 통상의 면역검정 방법이 언급될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 면역검정법은 자체로 당 분야에 공지되어 있으며, 당업계의 숙련가에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
단클론성 항체 또는 결합부는 당업계의 공지된 다양한 방법으로 직접 표지화될 수 있다. 표지는 단클론성 항체 또는 결합부가 면역검정에서 분석물에 의해 결합된 정도를 측정하기 위한 시약 수단으로서 작용한다. 표지는, 제한 없이, 방사성 동위원소, 효소, 발색단, 형광단, 광-흡수 또는 반사 입자일 수 있다. 바람직하게는, 표지는 방사표지, 형광단, 또는 화학발광 표지이다. 항체 또는 결합부를 이의 면역반응성을 파괴하지 않으면서 가능한 광범위하게 표지화하는 것이 바람직할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 청구된 주제를 실시하는 것을 예시하기 위한 것이지 결코 이의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 - 항원의 제조
N-말단 근처에 헥사-히스티딘 서열을 포함하는 S. 아우레우스 자가용해소의 전체 아미다제 도메인의 재조합 형태(His-Amd)를 제조하였다. His-Amd를 위한 개방 판독 프레임은, S. 아우레우스 자가용해소의 공지된 서열들을 수집하고, GeneiousTM 소프트웨어를 사용하여 공통 단백질 서열을 결정한 다음 이 . 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 사용을 최적화함으로써 설계하였다. His-Amd에 대한 암호화된 공통 단백질 및 암호화 개방 판독 프레임 서열이 아래 서열번호 1 및 2로서 확인된다.
서열번호 1 (Hex-히스티딘 선도 서열 + 자가용해소 aa 198-775)
Figure pct00064
Figure pct00065
His-Amd를 암호화하는 DNA 분자를 DNA2.0 (Menlo Park, CA)으로 드 노보 (de novo) 합성한 다음 pJexpress 이. 콜라이 발현 벡터에 삽입하였다.
이. 콜라이에서 발현된 His-Amd 단백질은 주로, 수거되어 8M 우레아를 갖는 PBS 중에서 가용화된 불용성 봉입체 형태이었다. TALON 수지 상에서 금속 킬레이트화 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한 후, His-Amd를 1mM Zn2 +를 함유하는 인산염 완충 염수(PBS)에 대한 투석 및 우레아 수준의 단계적 감소의 대규모 공정에 의해 재생시켰다.
Amd 촉매 도메인(His-Amd-cat)은 R1 및 R2 도메인을 암호화하는 개방 판독 프레임의 일부를 생략하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 제조하였다(도 1 참조). His-Amd-cat에 대한 암호화된 공통 단백질 및 암호화 개방 판독 프레임 서열이 아래 서열번호 3 및 4로서 확인된다.
서열번호 3 (Hex-히스티딘 선도 서열 + 자가용해소 aa 198-441)
Figure pct00066
서열번호 4
Figure pct00067
실시예 2 - 마우스의 접종 및 하이브리도마의 제조
초기 하이브리도마 융합(Fusion #1)을 위해, 6마리의 암컷 Balb/c 마우스를 Sigma Adjuvant System(Sigma, Cat. No. S6322)에서 복강내 주사에 의해 6주 간격으로 75㎍의 His-AmdR1R2로 2회 면역화시켰다. 고정화 His-AmdR1R2에 대한 ELISA에서의 최고 역가를 갖는 마우스 중의 두 마리를 하이브리도마 융합을 위해 선택하였다. 각각의 마우스는 희생 및 하이브리도마 융합하기 4일 전에 350㎍의 His-AmdR1R2의 최종 면역화를 i.p.로 제공받았다.
2차 하이브리도마 융합(Fusion #2)을 위해, Balb/c 마우스를 2회 면역화하였다: 1차는 Sigma Adjuvant System(Sigma, Cat. No. S6322)에서 GenScript(Lot Number 222933S05/P20011303)로부터의 His-AmdR1R2-B 120㎍ 용량으로 수행하고, 2차 면역화는 Keyhole limpet 헤모시아닌(KLH)(Imject EDC mcKLH Spin Kit; Thermo Scientific; Cat # 77671)과 접합된 100㎍의 His-AmdR1R2-B로 12주 간격으로 수행하였다. 고정화 His-AmdR1R2에 대한 ELISA에서의 최고 역가를 갖는 마우스 중의 두 마리를 하이브리도마 융합을 위해 선택하였다. 각각의 마우스는 희생 및 하이브리도마 융합하기 4일 전에 100㎍의 His-AmdR1R2의 최종 면역화를 i.p.로 제공받았다.
하이브리도마는 통상의 방법으로 비장세포로부터 제조하였다.
실시예 3 - 단클론성 항체의 특성화
새로운 단클론성 항체를 다수의 관련 단백질에서 선별하여 이들이 천연 Amd(재조합 형태가 아님)를 인지하는지 및 이들의 에피토프가 촉매적(C) 또는 세포 벽 결합 도메인(R1, R2 또는 R3)에 존재하는지 여부를 결정하였다. 단클론성 항체를 선별하는데 사용되는 단백질은 아래 표 1에서 확인된다.
단클론성 항체를 선별하기 위해 사용되는 단백질
단백질/항원 명칭 자가용해소의 영역/서열 설명
His-AmdR1R2 MGHHHHHH - 자가용해소 aa 198 내지 775
His-Amdcat MGHHHHHH - 자가용해소 aa 198 내지 441
천연 Amd 전장 자가용해소 (aa 198-1276), Amd (aa 198 to 775), 및 Gmd (aa 776-1276)를 포함한 S. 아우레우스 UAMS-1 △spa 단백질의 혼합물
His-AmdR1R2-B MGHHHHHH - 자가용해소 aa 198 내지 775 - BirA 바이오티닐화 부위
His-R3Gmd-B MGHHHHHH - 자가용해소 aa 776 내지 1276 - BirA 바이오티닐화 부위
선별 검정(screening assay)은 포획 항원으로서 표 1에서 확인되는 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 수행하였다. ELISA 시험은 널리 실시되는 관례를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 항원을 NUNC Maxisorp 미세역가 플레이트의 웰에 흡착시켰다. 각 항원은 2㎍/mL로 인산염-완충 염수(PBS) 중의 용액으로서 제조하였으며, 100μL를 할당된 미세역가 웰에 가하고, 항원을 RT에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 흡착되도록 하였다. 코팅 항원을 제거하지 않고서 200μL의 3% 소 혈청 알부민(BSA)을 가하여 웰을 폐쇄하고, RT에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 코팅된 및 차단된 플레이트를 0.05% Tween 20(PBS-T)으로 보충된 PBS로 3X 세척하고, 즉시 사용하거나 4℃에서 저장하였다.
세포-비함유 하이브리도마 배양물 상청액을 할당된 웰에 가하고, RT에서 1시간 동안 배양한 다음 PBS-T로 6회 세척하였다. 그후, 이차 항원, 호스라디쉬 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 IgG(Southern Biotechnology)를 웰당 PBS-T 중의 0.1-0.5㎍/mL로 100μL 가하고, RT에서 1시간 배양하였다. 미세역가 플레이트를 PBS-T로 다시 6회 세척한 다음 100μL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 또는 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS)의 첨가에 의해 전개시켰다. 이러한 ELISA의 결과가 아래 표 2에 나타내어져 있다.
성공적으로 클로닝되고 특성화된 항- Amd mAbs의 요약
항-Amd mAb 중쇄 종류 아미다제
도메인
C 또는 R1R2		 천연 아미다제로의 IP S. 아우레우스의 침전 KD
아미다제
효소
억제
1.1 IgG1 R1R2 있음 있음 2.5 nM 없음
1.2 IgG1 R1R2 있음 있음 ND 없음
1.4 IgG1 R1R2 있음 있음 ND ND
1.5 IgG1 R1R2 있음 있음 ND 없음
1.6 IgG1 C 있음 있음 2.1 nM 있음
1.7 IgG1 R1R2 있음 있음 ND 없음
1.8 IgG1 R1R2 있음 있음 2.6 nM 없음
1.9 IgG1 R1R2 있음 있음 2.6 nM 없음
1.10 IgG1 C 없음 ND ND ND
1.11 IgG1 R1R2 있음 있음 3.4 nM 없음
1.12 IgG1 R1R2 없음 없음 ND ND
1.13 IgG1 C 있음 없음 ND ND
1.14 IgG1 R1R2 없음 ND ND ND
1.15 IgG1 R1R2 있음 있음 ND ND
1.16 IgG1 C 있음 있음 2.6 nM 없음
1.17 IgG1 C 있음 없음 ND 없음
2.1 IgG1 C 있음 있음 4.9 nM 있음
2.2 IgG1 C 있음 있음 1.4 nM 없음
2.4 IgG1 R1R2 있음 있음 1.9 nM 없음
2.5 IgG1 R1R2 있음 있음 6.3 nM 없음
ND = 측정 불가.
실시예 4 - 시험관내 Amd 촉매 활성의 억제
치료학적 단클론성 항체의 효능에 기여할 수 있는 특성은 아미다제와 같은 박테리아 성장 및 생존에 필수적인 효소의 활성의 직접적인 억제성이다. 항-Amd mAbs의 일부를, 이들이 아미다제가 S. 아우레우스 펩티도글리칸의 혼탁 현탁액을 청정화할 수 있는 능력을 억제시키는 정도를 측정함으로써 아미다제 활성의 억제에 대해 시험하였다. Fusion #1로부터의 8가지 항체에 대한 결과가 도 2에 나타내어져 있다. MAb Amd1.6은 아미다제 활성의 강력한 억제제인 반면 그외에는 그렇지 않으며, 가능하게는 Amd1.16은 제외되는데, 이것은 저 친화성 억제제인 것으로 보인다. 항체 모두에 대한 결과가 표 2에 요약되어 있다.
실시예 5 - 항- Amd mAbs의 대부분은 S. 아우레우스 를 침전시킨다
치료학적 단클론성 항체의 효능을 위해 중요할 것 같은 또 다른 특성은 원상태의 박테리아 세포의 외부로부터 접근가능한 항원성 구조(에피토프)의 인지이다. 이러한 인지의 가시적 소견은 현탁액으로부터 침전하여 세포-풍부 펠렛 및 덜 혼탁한 상청액을 생성하는 큰 응집물로의 개별 박테리아의 항체-매개된 클러스터화(clustering)이다. 후보물질 mAbs 중의 다수는 도 3에 도시된 바와 같이 뚜렷한 침전물을 형성하였다. fusion 1 및 2로부터의 후보물질 mAbs의 침전 활성의 요약이 표 2에 있다.
실시예 6 - 각각의 mAb 의 독특함 및 서열화에 기반한 생식세포 계열 할당의 확인
유전자 할당은 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 IgBLAST에서 알려진 뮤린 V-영역 서열의 파일을 갖는 항-Amd 중쇄 및 경쇄에 대해 뉴클레오타이드 서열을 매칭함으로써 확인하였다. 이러한 분석의 결과가 아래 표 3에 제시되어 있다. Fusion #1로부터의 항체의 각각은, 동일한 생식세포-계열 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 Amd1.1 및 1.4를 가능하게는 제외하고서, 독특하였다. Fusion#2로부터의 항체 중의 두 개는 Fusion #1에서 단리된 mAbs와 중쇄 VH 및 JH 유전자 세그먼트를 공유한다(mAb Amd2.4와 mAb Amd1.11; mAb Amd 2.2와 mAb Amd1.7). 각각의 경우에 경쇄는 상이하다.
최빈 생식세포 계열 V H , J H , V L 및 J L 유전자 세그먼트
하이브리도마 생식세포 계열 VH 생식세포 계열 JH 생식세포 계열 VL 생식세포 계열 JL
Amd 1.1 IGHV14-3 (7) IGHJ4 (0) IGKV4-50 (6) IGKJ2 (0)
Amd 1.2 IGHV1-14 (4) IGHJ2 (0) IGKV5-43 (0) IGKJ2 (0)
Amd 1.4 IGHV14-3 (6) IGHJ4 (0) NA NA
Amd 1.5 IGHV14-1 (11) IGHJ4 (0) NA NA
Amd 1.6 IGHV1-5 (8) IGHJ3 (0) IGKV6-32 (3) IGKJ1 (0)
Amd 1.7 IGHV1S29 (7) IGHJ2 (0) IGKV6-32 (3) IGKJ1 (0)
Amd 1.8 NA NA IGKV5-39 (2) IGKJ2 (0)
Amd 1.9 IGHV5S12 (5) IGHJ2 (0) IGKV12-46 (8) IGKJ1 (0)
Amd 1.10 NA NA IGKV4-68 (0) IGKJ2 (0)
Amd 1.11 IGHV9-3-1 (2) IGHJ4 (0) IGKV5-48 (0) IGKJ5 (0)
Amd 1.12 IGHV1-54 (3) IGHJ4 (0) IGKV12-44 (6) IGKJ2 (0)
Amd 1.13 IGHV1-82 (7) IGHJ4 (0) IGKV8-19 (1) IGKJ4 (0)
Amd 1.15 NA NA IGKV6-17 (7) IGKJ4 (0)
Amd 1.16 IGHV1-80 (6) IGHJ4 (0) NA NA
Amd 1.17 IGHV5-4 (2) IGHJ2 (0) IGKV1-117 (1) IGKJ1 (0)
Amd 2.1 IGHV5S12 (5) IGHJ4 (0) IGKV8-19 (4) IGKJ5 (0)
Amd 2.2 IGHV1S29 (5) IGHJ2 (0) IGKV4-86 (1) IGKJ5 (0)
Amd 2.4 IGHV9-3-1 (1) IGHJ4 (0) IGKV4-63 (7) IGKJ2 (0)
Amd 2.5 NA NA IGKV12-41 (9) IGKJ2 (0)
괄호 안의 숫자는 항-Amd 서열 및 추정상 생식세포 계열 전구체 사이에 관찰된 비-동일 염기 변화의 수이다. NA = 서열화가 성공적이지 못하였음.
실시예 7 - S. 아우레우스 아미다제에 대한 항- Amd mAbs의 친화도의 측정
항박테리아성 항체의 본질적인 특성은 박테리아성 항원에 대한 높은 친화도이다. 친화도가 높을수록, 예방 또는 치료를 위해 필요한 용량은 낮아진다. 몇 가지 치료 항체가, KD로서 표현하여, 10 nM (KA = 108 M-1) 범위의 친화도를 갖기는 하지만, 일반적으로는 항체가 KD ~ 1 nM (KA ~ 109 M-1)를 갖는 것이 바람직하다. 가용성 His-AmdR1R2-B에 대한 고정화 항-Amd mAbs의 친화도는 Biacore T-200 상에서 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 측정하였다. mAb Amd1.6에 대한 대표적인 데이터가 도 4에 제시되어 있다. Amd에 대한 이의 평균 친화도는 약 2.1 nM이지만, 도 4는 약 1 nM의 측정된 친화도를 예시하고 있다. 다른 후보물질 mAbs에 대한 측정된 친화도는 표 2에 열거되어 있다.
실시예 8 - 항- Amd mAb Amd1 .6은 S. 아우레우스 균주 UAMS -1에 의한 시험관내 생물막 형성을 억제한다
Amd는 생물막의 형성에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Bose et al., "Contribution of the Staphylococcus aureus Atl AM and GL Murein Hydrolase Activities in Cell Division, Autolysis, and Biofilm Formation," PLoS One 7:e42244 (2012); Chen et al., "Secreted Proteases Control Autolysin-mediated Biofilm Growth of Staphylococcus aureus," J Biol Chem . 288:29440-29452 (2013); Houston et al., "Essential Role for the Major Autolysin in the Fibronectin-binding Protein-mediated Staphylococcus aureus Biofilm Phenotype," Infect Immun .79:1153-1165 (2011), 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용됨). 생물막 형성은 생체내 S. 아우레우스 감염, 특히 정형외과용 임플란트와 관련된 이러한 감염의 지속성에 중심이 되는 것으로 믿어지는 과정이다(Ehrlich and Arciola, "From Koch's Postulates to Biofilm Theory: The Lesson of Bill Costerton," Internat'l J Artificial Organs 35:695-699 (2012), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 항-Amd mAb1.6이 생물막 형성을 억제하는 능력을 측정하기 위해, S. 아우레우스 균주 UAMS-1을 생물막 형성을 측정하기 위해 특별하게 고안된 Calgary 플레이트에서 성장시켰다(Ceri et al., "The Calgary Biofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms," J Clin Microbiol. 37:1771-1776 (1999), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 자가용해소 유전자(△atl)에서 및 이의 Amd(△amd) 및 Gmd(△gmd) 서브도메인에서의 결실 돌연변이은 각각 WT UAMS-1보다 생물막을 상당히 덜 형성하였다(WT의 20-35%). Amd1.6은 단독으로 또는 항-Gmd mAb 1C11와 함께(슈바르츠 등(Schwarz et al.)의 PCT 공개 제WO2011/140114호 참조, 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨) 생물막 형성을 50% 이상까지 감소시키는 반면 무관한 특이성의 이소형-매칭된 mAb는 영향이 없었다(도 5). 외인성 항-Amd mAb에 의한 세포외 Amd의 억제는 거의 자가용해소 유전자의 결실 만큼이나 효과적이다.
실시예 9 - 항- Amd mAb Amd1 .6은 임플란트-관련 골수염의 생체내 모델에서의 생물학 형성을 감소시킨다
임플란트-관련 생물막이 정형외과적 소견에서 지속 감염의 주요 근원인 것으로 생각되기 때문에, 임플란트 모델에서 생물막 형성 정도를 감소시키는 능력은 항-Amd 예방의 잠재적인 임상적 유용성의 척도인 것으로 해석될 수 있다. 임플란트 상의 0.5 x 2.0 mm 평편면인 정의된 관심 영역을 가진 모델 임플란트에서 임플란트-관련 골수염의 뮤린 모델을 사용하여, S. 아우레우스로 14일간 감염시키는 동안 생물막으로 덮힌 면적을 측정하였다. 마우스를 무관한 특이서의 이소형-매칭된 항체로 처리한 도 6A에서 관찰되는 바와 같이 최대 감염도는 대략 40-50%이다. MAb Amd1.6은, 단독으로 또는 항-Gmd mAb 1C11과 함께, 생물막의 형성을 대조군에 비해 약 50%까지 감소시켰다(도 6B, 6C, 6E). 생물막 형성에 있어서의 이러한 감소도는 자가용해소 유전자(△atl)에서 유전 결함으로부터 야기되는 것에 필적하며(도 6B, 6D, 6E), 이것은 생물막 형성 측면에서 내부 유전자 결실과 외인성 항-Amd 항체에 의한 방해가 기능적으로 동일하다는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 항- Amd mAb Amd1 .6으로의 수동 면역화는 S. 아우레우스 감염으로부터 야기되는 골 용해의 체적을 감소시킨다
뼈에서의 S. 아우레우스 감염의 특징적인 특성 중의 하나는 감염 박테리아에 의해 발휘되는 염증 반응으로부터 야기되는 뼈의 용해이다. 그 결과, 용해된 뼈의 체적(골용해 체적)의 감소가 감염의 제한의 척도로서 취해진다. 항-Amd mAb Amd1.6이 골 손상을 제한하는지를 알아보기 위해, 5마리의 6-10주령 암컷 Balb/c 마우스의 그룹을 40mg/kg의 총 용량에서 PBS(비처리 대조군), 항-Gmd mAb 1C11, 항-Amd mAb Amd1.6, 또는 배합물(1C11+Amd1.6)로 복강내 면역화하였다. 24시간 후 각 마우스에 이의 우측 경골을 통해 USA300 LAC::lux, 생물발광 CA-MRSA 균주로 오염된 핀을 삽입하였다.
모든 마우스의 생물발광 이미징은 Xenogen IVIS 스펙트럼 이미징 시스템(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)을 사용하여 0일, 3일, 5일, 7일, 10일, 및 14일째에 수행하였으며, 3일째의 피크 BLI는 이전에 기재된 바와 같이 정량하였다(Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity," J Orthop Res 26:96-105 (2008), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 각각의 처리군으로부터의 대표적인 BLI가 도 7A에 예시되어 있으며, 이것은 각 처리군에서 박테리아 부하가 존재하였음을 나타낸다.
초래된 감염을 동물을 희생시키는 14일 동안 진행시키고, 감염된 경골을 이전에 기재된 바와 같이 microCT에 의한 분석을 위해 수거하였다(Li et al., "Effects of Antiresorptive Agents on Osteomyelitis: Novel Insights into the Pathogenesis of Osteonecrosis of the Jaw," Ann N Y Acad Sci 1192:84-94 (2010), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). 비처리 대조군에서, 내측 및 측면 둘 다에서의 골 용해가 광범위하였으며(도 7B); 골용해 체적은 평균 0.4 mm3을 능가하였다. 골용해 체적의 감소는 세 가지 항체-처리된 마우스의 그룹 모두에서 측정되었다(도 7C). 병용 요법을 제공받은 하나의 개체에서, 골용해 체적은 0인 것으로 계산되었으며, 이것은 감염된 임플란트 부위의 완전 치유를 나타낸다. 이 개체에서의 병용 항체 요법의 효과는 효과적인 항생체 요법으로 치료되었던 무균성 핀 및 감염된 핀 둘 다에 대해 동일하다(즉, 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌[침조; Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity," J Orthop Res 26:96-105 (2008)]에서의 겐타마이신 치료). 이러한 개체는 항생제 요법의 부재하에서 감염된 임플란트 부위의 성공적인 치유를 최초로 나타내는 것으로 믿어진다.
실시예 11 - 항- Amd mAb Amd1 .6으로의 수동 면역화는 박테리아 확산을 상당히 감소시킨다
농양의 형성은 감염의 중증도의 또 다른 소견이다. 형성된 농양의 수를 실시예 10에서 실험된 동일한 마우스에서 측정하였다. 조직학적 절편을 오렌지 G/알시안 블루(ABG/OH)로 염색하였으며, 농양이 비염색 구역에 의해 범위가 정해진 염증성 숙주 세포의 원형 필드로서 및, 때때로, 이의 중심에 조밀한 적색 염색 병소로서 나타났다. 전형적으로, 병소(nidus)는 스타필로코커스 농양 군집(SAC)이고; 염증 세포는 호중구이며, 중심 부근에서는 거의 죽고 주변 부근에서는 거의 살아있으며 비염색 구역은 피브린으로부터 형성된 캡슐이다. 비처리 마우스에서 형성된 다중 농양(도 8A)은 경골 당 평균 거의 4.5이다(도 8C). 이와 달리, mAb Amd1.6-처리 마우스는 항-Gmd mAb 1C11로 또는 조합으로 처리한 마우스가 그러한 것과 같이 평균 단지 두 개의 농양을 가졌다(도 8B, 8C).
실시예 12 - 항- Amd mAb Amd1 .6 단독 또는 항- Gmd 1 C11 과 조합한 수동 면역화는 무균성 농양의 형성을 촉진시키고 골 치유를 가속화시킨다
도 8b에 나타낸 동일한 조직학적 절편의 상세한 실험 결과, 예측치 못한 조사결과가 밝혀졌다. 일관하여, 골수내 그램-염색된 농양은 PBS-처리된 마우스의 경골에서만 발견되는 반면(도 9a-b), 항-Atl 처리된 마우스의 경골에서의 병변은 그램-양성 박테리아를 함유하지 않는 무균성 농양의 특징이었다(도 9c-h). 더욱이, 위약 처리된 마우스의 경골에서의 병변은 스타필로코커스 농양 군집(SAC)의 명백한 조직학적 특징을 갖는 반면(Cheng et al., "Genetic Requirements for Staphylococcus aureus Abscess Formation and Persistence in Host Tissues," FASEB J 23(10):3393-3404 (2009); Cheng et al., "Contribution of Coagulases Towards Staphylococcus aureus Disease and Protective Immunity," PLoS Pathog 6(8):e1001036 (2010), 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용됨), 항-Atl 처리된 마우스의 경골에서는 SAC가 관찰되지 않았다(도 10a-b과 도 10c-h 비교). 마지막으로, 및 가장 놀랍게도, 조합된 항-Amd 및 항-Gmd 수동 면역화는 14일까지 MRSA 감염(3일째에 대사적으로 활성인 것으로 확임됨; 도 7a)을 제거할 뿐만 아니라 임플란트-관련 골수염의 이러한 뮤린 모델에서 일어날 것으로는 문서화된 적 없는 골 치유를 가능케 하는 것으로 밝혀졌다(도 11a-c 비교). 구체적으로, S. 아우레우스 오염된 임플란트의 골 통합(osseus integration)이 도 11b에 기록되어 있으며, 이것은 핀 및 피질 주위에서의 무균성 핀 대조군에서 관찰되는 것과 유사한 수준의 새로운 골 형성을 나타낸다(도 11c). 아르기나제-1-양성 염색을 사용하여, 조직 치유 M2 대식세포의 존재 또는 부재를 또한 분석하였다. PBS 처리된 마우스(도 11d)의 경골에서는 SAC에 들어가지 못하는 M2 대식세포가 조합된 항-Amd 및 항-Gmd 처리된 마우스의 경골에서는 무균성 농양을 광범위하게 침입하여 고전적인 조직 치유를 촉진시킨다(도 11e)(Murray and Wynn, "Protective and Pathogenic Functions of Macrophage Subsets," Nat Rev Immunol 11(11):723-737 (2011), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨).
실시예 13 - 인간화 항- Amd mAb Amd1 .6의 생성
Amd1.6 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 틸러 등(Tiller et al.)에 의해 기재된 인간 항체 발현 벡터로 클로닝할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 것이다("Efficient Generation of Monoclonal Antibodies from Single Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning," J. Immunol . Methods 329(1-2):112-24 (2008), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). Amd1.6 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 인간 kappa 및 IgG1 불변 영역을 함유하는 플라스미드를 제조하고 HEK293 세포로 공동-형질감염시킬 것이다. 3일 후, 배지를 세포로부터 제거하고, ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대해 및 고정화 Amd 단백질에의 결합에 대해 검정할 것이다. 결합된 항체는 호스라디쉬 퍼옥시다제 및 3,3',5,5' 테트라메틸벤지덴 기질에 결합된 염소 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출할 것이다.
인간:마우스 키메라 Amd1.6이 Amd 뿐만 아니라 부모 마우스 Amd1.6와 반응함을 확립하기 위해, 각각을 His-Amd의 효소 활성을 억제시키는 능력에 대해 시험할 것이다.
인간화 Amd1.6 항체는 1차 전 관절 치환술을 받은 노인 환자(>65 세)에서 제I상 임상 시험에서 사용될 수 있다. 인간화 Amd1.6 항체는 단독으로 및 전문이 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원 공개 제20130110249호에 기재된 바와 같은 인간화 1C11 항-Gmd 항체와 함께 사용될 것이다.
실시예 14 - 인간화 항- Amd mAb Amd2 .1의 생성
Amd2.1 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 틸러 등(Tiller et al.)에 의해 기재된 인간 항체 발현 벡터로 클로닝할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 것이다("Efficient Generation of Monoclonal Antibodies from Single Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning," J. Immunol . Methods 329(1-2):112-24 (2008), 이는 전문이 본원에 참고로 인용됨). Amd2.1 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 인간 kappa 및 IgG1 불변 영역을 함유하는 플라스미드를 제조하고 HEK293 세포로 공동-형질감염시킬 것이다. 3일 후, 배지를 세포로부터 제거하고, ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대해 및 고정화 Amd 단백질에의 결합에 대해 검정할 것이다. 결합된 항체는 호스라디쉬 퍼옥시다제 및 3,3',5,5' 테트라메틸벤지덴 기질에 결합된 염소 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출할 것이다.
인간:마우스 키메라 Amd2.1이 Amd 뿐만 아니라 부모 마우스 Amd2.1과 반응함을 확립하기 위해, 각각을 His-Amd의 효소 활성을 억제시키는 능력에 대해 시험할 것이다.
인간화 Amd2.1 항체는 1차 전 관절 치환술을 받은 노인 환자(>65 yrs)에서 제I상 임상 시험에서 사용될 수 있다. 인간화 Amd2.1 항체는 단독으로 및 전문이 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원 공개 제20130110249호에 기재된 바와 같은 인간화 1C11 항-Gmd 항체와 함께 사용될 것이다.
바람직한 실시형태들이 본원에 개시되고 상세하게 기재되어 있지만, 다양한 개질, 부가, 치환 등이 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술의 숙련가에게 자명할 것이며 따라서 이들은 하기의 특허청구범위에 정의된 바와 같은 발명의 범위내에 드는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Rochester Daiss, John L. Schwarz, Edward Varrone, John J. Brodell, James Jr. Bello-Irizarry, Sheila N. <120> PASSIVE IMMUNIZATION FOR STAPHYLOCOCCUS INFECTIONS <130> 29556.3431 (6-2200) <150> 61/915,953 <151> 2013-12-13 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> His-labeled, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase from Staphylococcus aureus <400> 1 Met His His His His His His Ser Ala Ser Ala Gln Pro Arg Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Thr Pro Lys Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Lys Pro Gln Val Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Asn Asp Tyr Ile Arg Lys Asn Asn Leu Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Ile Glu Glu Asp Tyr Thr Ser Tyr Phe Pro Lys Tyr Ala Tyr Arg Asn 50 55 60 Gly Val Gly Arg Pro Glu Gly Ile Val Val His Asp Thr Ala Asn Asp 65 70 75 80 Arg Ser Thr Ile Asn Gly Glu Ile Ser Tyr Met Lys Asn Asn Tyr Gln 85 90 95 Asn Ala Phe Val His Ala Phe Val Asp Gly Asp Arg Ile Ile Glu Thr 100 105 110 Ala Pro Thr Asp Tyr Leu Ser Trp Gly Val Gly Ala Val Gly Asn Pro 115 120 125 Arg Phe Ile Asn Val Glu Ile Val His Thr His Asp Tyr Ala Ser Phe 130 135 140 Ala Arg Ser Met Asn Asn Tyr Ala Asp Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Gln 145 150 155 160 Tyr Tyr Gly Leu Lys Pro Asp Ser Ala Glu Tyr Asp Gly Asn Gly Thr 165 170 175 Val Trp Thr His Tyr Ala Val Ser Lys Tyr Leu Gly Gly Thr Asp His 180 185 190 Ala Asp Pro His Gly Tyr Leu Arg Ser His Asn Tyr Ser Tyr Asp Gln 195 200 205 Leu Tyr Asp Leu Ile Asn Glu Lys Tyr Leu Ile Lys Met Gly Lys Val 210 215 220 Ala Pro Trp Gly Thr Gln Ser Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro Ser Lys 225 230 235 240 Pro Thr Thr Pro Ser Lys Pro Ser Thr Gly Lys Leu Thr Val Ala Ala 245 250 255 Asn Asn Gly Val Ala Gln Ile Lys Pro Thr Asn Ser Gly Leu Tyr Thr 260 265 270 Thr Val Tyr Asp Lys Thr Gly Lys Ala Thr Asn Glu Val Gln Lys Thr 275 280 285 Phe Ala Val Ser Lys Thr Ala Thr Leu Gly Asn Gln Lys Phe Tyr Leu 290 295 300 Val Gln Asp Tyr Asn Ser Gly Asn Lys Phe Gly Trp Val Lys Glu Gly 305 310 315 320 Asp Val Val Tyr Asn Thr Ala Lys Ser Pro Val Asn Val Asn Gln Ser 325 330 335 Tyr Ser Ile Lys Pro Gly Thr Lys Leu Tyr Thr Val Pro Trp Gly Thr 340 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555 560 Trp Val Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Val Pro Ala Ala Pro Lys Lys Ala 565 570 575 Val Ala Gln Pro Lys Thr Ala Val Lys 580 585 <210> 2 <211> 1755 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid encoding His-labeled, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase from Staphylococcus aureus <400> 2 atgcaccatc accaccacca cagcgcaagc gcacagcctc gttccgtcgc cgccaccccg 60 aaaaccagct tgccgaagta caaaccgcaa gttaatagca gcatcaacga ctacatccgc 120 aaaaacaacc tgaaggcccc gaaaattgaa gaggactata ccagctattt cccgaaatat 180 gcttaccgta atggtgtcgg tcgtccggag ggtattgtgg tccacgacac cgcgaatgac 240 cgtagcacca tcaacggtga gattagctac atgaaaaaca attaccaaaa cgcgttcgtg 300 cacgccttcg tcgatggcga tcgcatcatc gaaaccgcgc caaccgacta tctgtcctgg 360 ggtgtgggtg ccgttggcaa cccgcgtttc atcaatgtgg agattgttca tacccacgac 420 tacgcgagct ttgcacgtag catgaacaac tacgccgatt atgctgcaac gcagctgcag 480 tactacggcc tgaaaccgga tagcgcggag tatgacggta acggtacggt gtggacgcat 540 tatgcggtga gcaaatacct gggtggtacc gatcatgctg atccgcatgg ctacctgcgc 600 tctcacaact atagctacga ccagttgtac gacctgatca atgagaaata tctgattaag 660 atgggtaagg ttgcaccgtg gggtacgcag agcaccacga cgccgaccac gccgagcaaa 720 ccgacgaccc cgtccaaacc gtctaccggc aaactgacgg tcgcggctaa taacggtgtc 780 gcgcagatta aaccgaccaa cagcggtctg tacaccaccg tctatgataa aacgggcaaa 840 gccaccaatg aggttcaaaa gacgttcgca gttagcaaaa cggcgaccct gggtaaccaa 900 aagttctacc tggttcagga ttacaatagc ggcaacaaat ttggttgggt gaaagaaggc 960 gacgttgtgt acaataccgc gaagtccccg gtgaacgtta atcagagcta tagcatcaag 1020 ccgggtacca aattgtatac ggtgccgtgg ggtaccagca agcaagttgc gggtagcgtc 1080 agcggctctg gtaaccagac cttcaaggcg tctaagcaac aacaaattga caaaagcatt 1140 tacctgtatg gtagcgttaa tggtaaaagc ggctgggtgt ctaaagcgta tctggtcgac 1200 accgcaaagc cgacgccaac gccgaccccg aagccgagca ccccaaccac caacaacaag 1260 ctgacggtca gctccctgaa tggtgttgcg caaatcaatg cgaagaataa tggcctgttt 1320 accaccgttt acgataagac gggcaagcca acgaaagaag tccagaaaac ctttgctgtc 1380 accaaagaag ccagcctggg cggtaacaag ttctatctgg ttaaggacta caactccccg 1440 acgctgatcg gttgggtcaa acaaggcgat gtcatttaca ataacgcgaa aagcccggtt 1500 aatgtgatgc aaacctatac cgtcaaaccg ggtacgaagc tgtattccgt tccgtggggc 1560 acgtacaaac aagaagcagg cgcggtgagc ggtaccggca atcagacctt taaggccacc 1620 aagcagcagc agatcgataa atctatttac ttgtttggca ccgtgaatgg caagagcggt 1680 tgggtttcta aggcatacct ggcggtgccg gcagcaccga agaaggcggt ggcgcagcca 1740 aagaccgcag tgaag 1755 <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> His-labeled, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase catalytic domain from Staphylococcus aureus <400> 3 Met His His His His His His Ser Ala Ser Ala Gln Pro Arg Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Thr Pro Lys Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Lys Pro Gln Val Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Asn Asp Tyr Ile Arg Lys Asn Asn Leu Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Ile Glu Glu Asp Tyr Thr Ser Tyr Phe Pro Lys Tyr Ala Tyr Arg Asn 50 55 60 Gly Val Gly Arg Pro Glu Gly Ile Val Val His Asp Thr Ala Asn Asp 65 70 75 80 Arg Ser Thr Ile Asn Gly Glu Ile Ser Tyr Met Lys Asn Asn Tyr Gln 85 90 95 Asn Ala Phe Val His Ala Phe Val Asp Gly Asp 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gcatcaacga ctacatccgc 120 aaaaacaacc tgaaggcccc gaaaattgaa gaggactata ccagctattt cccgaaatat 180 gcttaccgta atggtgtcgg tcgtccggag ggtattgtgg tccacgacac cgcgaatgac 240 cgtagcacca tcaacggtga gattagctac atgaaaaaca attaccaaaa cgcgttcgtg 300 cacgccttcg tcgatggcga tcgcatcatc gaaaccgcgc caaccgacta tctgtcctgg 360 ggtgtgggtg ccgttggcaa cccgcgtttc atcaatgtgg agattgttca tacccacgac 420 tacgcgagct ttgcacgtag catgaacaac tacgccgatt atgctgcaac gcagctgcag 480 tactacggcc tgaaaccgga tagcgcggag tatgacggta acggtacggt gtggacgcat 540 tatgcggtga gcaaatacct gggtggtacc gatcatgctg atccgcatgg ctacctgcgc 600 tctcacaact atagctacga ccagttgtac gacctgatca atgagaaata tctgattaag 660 atgggtaagg ttgcaccgtg gggtacgcag agcaccacga cgccgaccac gccgagcaaa 720 ccgacgaccc cgtccaaacc gtctaccggc aaa 753 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala 1 5 10 15 Ser Gly 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ctgtgcaaga cttgatggtt actacgactg ctttgactac 300 tggggccaag gcaccactct cacagtctcn tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 360 ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgccnggtc 420 aaggg 425 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu 1 5 10 15 Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp 20 25 30 Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp 35 40 45 Pro Ala Asn Gly Ile Thr Asn Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Ala 50 55 60 Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ile Ala Tyr Leu Gln Leu Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ser Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly 85 90 95 Tyr Leu Ser Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 460 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (449)..(449) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 ntgcagcagt ctggggcaga gcttgtgaag ccaggggcct cagtcaagtt gtcctgcaca 60 gcttctggct tcaacattaa agacacctat atacattggg tgaagcagag gcctgaacag 120 ggcctggagt ggattggaag gattgatcct gcgaatggta ttactaatta tgacccgaag 180 ttccagggca gggccactat aacagcagac acatcctcca atatagccta cctgcagctc 240 accagcctga catctgaggg cactgccgtc tactactgtg ctagaggggg ttacctatcc 300 ccttatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg 360 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 420 accctgggat gcctggtcaa gggctattnc cctgagccag 460 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu 1 5 10 15 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asp Tyr Tyr Leu His Trp 20 25 30 Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp 35 40 45 Pro Glu Asn Asp Asn Thr Val Tyr Asp Pro Lys Phe Arg Asp Arg Ala 50 55 60 Ser Leu Thr Ala Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser 65 70 75 80 Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp 85 90 95 Gly Ile Thr Thr Ala Thr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 464 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (450)..(454) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaaattg tcctgcaaag 60 cttctggctt caacattcaa gactactatc tacactggat gaaacagagg cctgagcagg 120 gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatgataa tactgtatat gacccgaagt 180 tccgggacag ggccagttta acagcagaca cattttccaa cacagcctac ctacagctca 240 gcggcctgac atctgaagac actgccgtct attactgtgc tagaagagac ggcattacta 300 cggctacgcg ggctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcca 360 aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca 420 tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggcn nnnncctgag ccag 464 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Met Ser 1 5 10 15 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Met His Trp Val 20 25 30 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aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 360 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctn 420 gtcaagggct ntttcccnga gcca 444 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile 1 5 10 15 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp 20 25 30 Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Phe 35 40 45 Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asn Lys Ala 50 55 60 Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly 85 90 95 Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 14 <211> 433 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (423)..(423) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 tgcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaagg 60 cttctggata cacattcact gactacaaca tgcactgggt gaagcagagc catggaaaga 120 gccttgagtg gattggatat atttttcctt acaatggtga tactgactac aaccagaaat 180 tcaagaacaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggacctcc 240 gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgttc aagatggggg tcttactttg 300 actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc caaaacgaca cccccatctg 360 tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc ctgggatgcc 420 tgngtcaagg gct 433 <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp 20 25 30 Val Arg Gln Thr Pro Lys Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr 35 40 45 Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55 60 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Asn Leu Gln Met Ser Ser 65 70 75 80 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly 85 90 95 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 16 <211> 422 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 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cgtctcctca 360 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 420 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatntcc ctgagccag 469 <210> 21 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Ile 1 5 10 15 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp 20 25 30 Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr 35 40 45 Pro Val Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala 50 55 60 Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Gly 85 90 95 Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 22 <211> 434 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 nngcagcagc ctggacctga gctggtgaag cctggggcct cactgaagat ttcctgcaaa 60 gcttctggct actcattcag ttcctcttgg atgaactggg tgaagcagag gcctggacag 120 ggtcttgagt ggattggacg gatttatcct gtagatggag atactaacta caatgggaag 180 ttcaagggca aggccacact gactacagac aaatcctcca gcacagccta catgcagctc 240 agcagcctga cctctgtgga ctctgcggtc tatttctgtg caagaactgg gccctatgct 300 atggactact ggggtcgagg aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca 360 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 420 tgcctggtca aggg 434 <210> 23 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln 20 25 30 Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp 35 40 45 Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60 Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Met Val Thr Asn 85 90 95 Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 24 <211> 434 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (425)..(425) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 ggggctgagc tggtgaggcc tgggtcctca gtgaagattt cctgcaaggc ttctggctat 60 acattcagta cctactggat gaactgggtg aagcagagac ctggacaggg tcttgagtgg 120 attggacaga tttatcctgg agatggtgat actaactaca atggaaaatt caagggtaaa 180 gccacactga ctgcagacaa atcctccagc acagcctaca tgcagctcag cagcctaaca 240 tctgacgact ctgcggtcta tttctgtgca agatcgatgg taacgaacta ttactttgct 300 atggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca 360 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 420 tgccnggtca aggg 434 <210> 25 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 1 5 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr 20 25 30 Pro Glu Lys Lys Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser 35 40 45 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser 65 70 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musculus <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly <210> 42 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 42 cttggacttt tgcttttctg gacttcagcc tccagatgtg acattgtgat gactcagtct 60 ccagccaccc tgtctgtgac tccaggagat agagtctctc tttcctgcag ggccagccag 120 agtattagcg actacttaca ctggtatcaa caaagatcac atgagtctcc aaggcttctc 180 atcaaatatg tttcccaatc catctctggg atcccctcca ggttcagtgg cagtggatca 240 gggtcagatt tcactctcag tatcaacagt gtggaacctg aagatgttgg agtgtattat 300 tgtcaaaatg gtcacagctt tccgtacacg ttcgga 336 <210> 43 <211> 98 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr 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Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly 100 105 <210> 52 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 ggtacctgtg gggacattgt gatgacgcag tctccatcct ccctgactgt gacagcagga 60 gagaaggtca ctatgagctg caagtccagt cagagtctgt taaacagtgg aaatcaaaaa 120 aactacttga cctggtacca gcagaaacca gggcagcctc ctaaactgtt gatctcctgg 180 gcatccacta gggaatctgg ggtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat 240 ttcactctca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagaat 300 gactatagtt atccattcac gttcggc 327 <210> 53 <211> 98 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 53 Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Arg Asp Arg Phe Xaa Gly 50 55 60 Ser Arg Cys Gly Thr Asp Phe Thr Phe Pro Ile Ser Ser Val Gln Gly 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile His Ser 85 90 95 Arg Ser <210> 54 <211> 331 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (224)..(224) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 nctgctattc tgctatgggt atctggtgtt gacggagaca ttgcgatgac ccagtctcac 60 aaattcatgt ccacatcagt aggagacagg gtcagcatca cctgcaaggc cagtcaggat 120 gtgagtactg ctgtagcctg gtatcaacag aaaccaggac aatctcctaa actactgatt 180 tactcggcat cctaccggta cactggagtc cgtgatcgct tcantggcag tcgatgtggg 240 acggatttca ctttccccat cagcagtgtg cagggtgaag acctggcagt ttattactgt 300 cagcaacatt atagtatcca ttcacgttcg g 331 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 <210> 56 <211> 344 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 tggatccctg cttccagcag tgatgttttg atgacccaaa ctccactctc cctgcctgtc 60 agtcttggag atcaagcctc catctcttgc agatctagtc agagcattgt acatagtaat 120 ggaaacacct atttagaatg gtacctgcag aaaccaggcc agtctccaaa gctcctgatc 180 tacagagttt ccaaccgatt ttctggggtc ccagacaggt tcagtggcag tggatcaggg 240 acagatttca cactcaagat cagcagagtg gaggctgagg atctgggagt ttattactgc 300 tttcaaggtt cacatgttcc gtggacgttc ggtggaggca ccaa 344 <210> 57 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Met Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 58 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 58 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta tacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaaatgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacacattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca atttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccggtcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac 340 <210> 59 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 60 <211> 319 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 60 gaaattgtgc tcactcagtc tccagccatc acagctgcat ctctggggca aaaggtcacc 60 atcacctgca gtgccagctc aagtgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaccatggat ttatgaaata tccaaactgg cttctggagt cccagctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca tttattactg ccagcagtgg aattatcctc ttatcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaac 319 <210> 61 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Glu Asn Ala Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Met Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Phe Pro Val His 85 90 95 Val Arg Arg Gly Asp Gln Val Gly Asn Lys Thr 100 105 <210> 62 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 62 gaaaatgctc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaagc 120 atgtccccca aactctggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttac tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa 240 gaggttgcca cttattactg ttttcagggg tagtgggttc ccagtacacg ttcggagggg 300 ggaccaagtt ggaaataaaa c 321 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Phe His Ala Arg Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Tyr Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 64 <211> 322 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 64 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactatcacc 60 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcacctcct ggtctttcat gcaagatcct tagcagatgg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca atatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggatttatta ctgtcaacat ttttggtata ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa ac 322 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd1.6Vh, CDR1 <400> 65 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd1.6Vh, CDR2 <400> 66 Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd1.6Vh, CDR3 <400> 67 Asp Asp Tyr Ser Arg Phe Ser Tyr 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd1.6Vl, CDR1 <400> 68 Gln Ser Val Ser Asn Asp 1 5 <210> 69 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd1.6Vl, CDR2 <400> 69 Tyr Thr Ser 1 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd2.1Vh, CDR1 <400> 70 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd2.1Vh, CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 71 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Xaa Thr 1 5 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd2.1Vh, CDR3 <400> 72 Val Gly Leu Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd2.1Vl, CDR1 <400> 73 Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amd2.1Vl, CDR2 <400> 74 Trp Ala Ser 1

Claims (107)

  1. 스타필로코커스 종 자가용해소 공통 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제(Amd) 촉매 도메인 및/또는 세포 벽 결합 도메인에 특이적으로 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 결합부.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 Amd 결합부가 스타필로코커스 균주의 생체내 성장 및/또는 금속, 플라스틱 및 유기 표면 상의 생물막 확립을 억제하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 스타필로코커스 균주가 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ), 스타필로코커스 에피데르미스 (S. epidermidis ), 스타필로코커스 루주네시스(S. lugdunensis ), 스타필로코커스 사프로피티쿠스 (S. saprophyticus ), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 (S. haemolyticus ), 스타필로코커스 카프라에(S. caprae) 또는 스타필로코커스 시미안(S. simian)을 포함하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 스타필로코커스 균주가 메티실린-내성 또는 반코마이신-내성인, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 Amd 결합부가 상기 Amd 촉매 도메인의 에피토프에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 Amd 결합부가 상기 Amd R1 또는 R2 세포 벽 결합 도메인 내에서 전적으로 또는 부분적으로 에피토프에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 Amd 결합부가 10-8 M 초과의 친화도로 Amd 촉매 도메인 또는 세포 벽 결합 도메인에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 Amd 결합부가 약 1 내지 약 6 nM의 KD로 상기 Amd 촉매 도메인 또는 세포 벽 결합 도메인에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 Amd 결합부가 다음의 아미노산 서열들 중의 하나를 포함하는 VH 도메인을 포함하고/하거나:
    Figure pct00068

    Figure pct00069

    상기 항체 또는 Amd 결합부가 다음의 아미노산 서열들 중의 하나를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부:
    Figure pct00070

    Figure pct00071
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 Amd 결합부가 다음의 아미노산 서열들 중의 하나를 포함하는 VH 도메인을 포함하고/하거나:
    Figure pct00072

    상기 항체 또는 Amd 결합부가 다음의 아미노산 서열들 중의 하나를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부:
    Figure pct00073

    Figure pct00074
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 Amd 결합부가 부분적으로 인간화되거나 완전 인간인 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 인간화 단클론성 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 부류인 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중의 어느 한 항의 Amd 결합부.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 Amd 결합부가 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하는 Amd 결합부.
  15. 스타필로코커스 종 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제(Amd)에 특이적으로 결합하고, Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.6, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.10, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.13, Amd1.14, Amd1.15, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, Amd2.2, Amd2.4, 및 Amd2.5로부터 선택된 항체와 교차 경쟁하는 단클론성 항체, 또는 이의 결합부.
  16. 청구항 15에 있어서, Amd에 결합하고 Amd 촉매 활성을 억제하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  17. 청구항 15에 있어서, Amd에 특이적으로 결합하고 항체 Amd1.6와 교차 경쟁하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  18. 청구항 15에 있어서, Amd에 특이적으로 결합하고 항체 Amd 2.1과 교차 경쟁하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  19. 청구항 15 내지 청구항 18 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 Amd 결합부가 부분적으로 인간화되거나 완전 인간인 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  20. 청구항 15 내지 청구항 19 중의 어느 한 항의 Amd 결합부.
  21. 스타필로코커스 종 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제(Amd)에 특이적으로 결합하고, Amd 촉매 도메인과 결합하는 항체와 교차 경쟁하는 단클론성 항체, 또는 이의 결합부.
  22. 청구항 21에 있어서, Amd에 특이적으로 결합하고, Amd 촉매 활성을 억제하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  23. 청구항 21에 있어서, Amd에 특이적으로 결합하고, Amd1.6, Amd1.10, Amd1.13, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, 및 Amd2.2로부터 선택된 항체와 교차 경쟁하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  24. 청구항 21 내지 청구항 23 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 Amd 결합부가 부분적으로 인간화되거나 완전 인간인 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  25. 청구항 21 내지 청구항 24 중의 어느 한 항의 Amd 결합부.
  26. Amd1.1, Amd1.2, Amd1.5, Amd1.6, Amd1.7, Amd1.8, Amd1.9, Amd1.10, Amd1.11, Amd1.12, Amd1.13, Amd1.14, Amd1.15, Amd1.16, Amd1.17, Amd2.1, Amd2.2, Amd2.4, 및 Amd2.5로부터 선택된 항체와 스타필로코커스 종 N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제(Amd)의 동일한 에피토프에 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 결합부.
  27. 청구항 26에 있어서, Amd에 결합하고, Amd 촉매 활성을 억제하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  28. 청구항 26에 있어서, 항체 Amd1.6과 동일한 에피토프에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  29. 청구항 26에 있어서, 항체 Amd 2.1과 동일한 에피토프에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  30. 청구항 26 내지 청구항 30 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 Amd 결합부가 부분적으로 인간화되거나 완전 인간인 단클론성 항체, 또는 이의 Amd 결합부.
  31. 청구항 26 내지 청구항 30 중의 어느 한 항의 Amd 결합부.
  32. 청구항 1 내지 12, 청구항 15 내지 19, 청구항 21 내지 24, 및 청구항 26 내지 30 중의 어느 한 항의 단클론성 항체, 또는 청구항 13, 14, 20, 25, 및 31 중의 어느 한 항의 Amd 결합부를 발현하는, 세포주.
  33. 청구항 32에 있어서, 하이브리도마인, 세포주.
  34. 청구항 32에 있어서, 재조합 세포주인, 세포주.
  35. 담체와, 청구항 1 내지 12, 청구항 15 내지 19, 청구항 21 내지 24, 및 청구항 26 내지 30 중의 어느 한 항의 하나 이상의 단클론성 항체, 또는 청구항 13, 14, 20, 25, 및 31 중의 어느 한 항의 하나 이상의 Amd 결합부를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 담체가 수용액인 약제학적 조성물.
  37. 청구항 35에 있어서, 항생제 또는 면역요법제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 항생제가 반코마이신, 토브라마이신, 세파졸린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 겐타마이신, 푸시드산, 미노사이클린, 코-트리목사졸, 클린다마이신, 리네졸리드, 테디졸리드, 퀴누프리스틴-달포프리스틴, 다프토마이신, 티게사이클린, 달바반신, 텔라반신, 오리타반신, 세프토비프롤, 세프타롤린, 이클라프림, 및 카르바페넴 CS-023/RO-4908463으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  39. 청구항 37에 있어서, 상기 면역요법제가 테피바주맙 또는 파기박시맙인 약제학적 조성물.
  40. 청구항 37에 있어서, 상기 면역요법제가 스타필로코커스 글루코사미니다제(Gmd)에 특이적으로 결합하고 스타필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제하는 제2 단클론성 항체 또는 이의 결합부인 약제학적 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11, 1E12, 2D11, 3A8, 3H6, 또는 4A12, 이의 인간화 변이체, 또는 이의 Gmd 결합부인 약제학적 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 인간화 변이체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부류인 약제학적 조성물.
  43. 청구항 41에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 Gmd 결합부가 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하는 약제학적 조성물.
  44. 청구항 40에 있어서, 상기 단클론성 항체가 Amd1.6 또는 Amd1.6의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체이고, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11 또는 1C11의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체인 약제학적 조성물.
  45. 정형외과용 임플란트, 이식편 또는 의료 기기를 환자에게 도입하는 방법으로서,
    정형외과용 임플란트, 이식편 또는 의료 기기를 필요로 하는 환자에게 유효량의 청구항 1 내지 12, 청구항 15 내지 19, 청구항 21 내지 24, 및 청구항 26 내지 30 중의 어느 한 항의 단클론성 항체, 청구항 13, 14, 20, 25, 및 31 중의 어느 한 항의 하나 이상의 Amd 결합부, 또는 청구항 35 내지 44 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계;
    상기 정형외과용 임플란트, 이식편 또는 의료 기기를 상기 환자에게 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 도입 전에 상기 투여를 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  47. 청구항 45에 있어서, 상기 도입 후에 상기 투여를 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 청구항 45 내지 청구항 47 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 전신에서 수행되는, 방법.
  49. 청구항 45 내지 청구항 47 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 이식 부위에 직접 수행되는, 방법.
  50. 청구항 45 내지 청구항 49 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 정형외과용 임플란트가 도입되는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 정형외과용(orthopedic) 임플란트가 관절 보철물, 이식편 또는 합성 임플란트인 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 관절 보철물이 전체 또는 부분 무릎 보철물, 엉덩이 보철물, 손가락 보철물, 팔꿈치 보철물, 어깨 보철물, 아래턱 보철물, 또는 발목 보철물인 방법.
  53. 청구항 51에 있어서, 상기 이식편 또는 합성 임플란트가 혈관 이식편, 심장 판막 임플란트, 인공 추간판, 반월상연골 임플란트, 또는 합성 또는 이종이식편 전방 십자 인대, 내측 측부 인대, 외측 측부 인대, 후방 십자 인대, 아킬레스 힘줄, 또는 회전근개인 방법.
  54. 청구항 45 내지 청구항 49 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이식편 또는 의료 기기가 도입되는 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 의료 기기가 심박조율기, 뇌척수액 단락, 투석 카테터, 또는 인공 심장 판막인 방법.
  56. 청구항 45 내지 청구항 50 또는 청구항 54 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 치료제가 항생제 또는 면역요법제인 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 항생제가 반코마이신, 토브라마이신, 세파졸린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 겐타마이신, 푸시드산, 미노사이클린, 코-트리목사졸, 클린다마이신, 리네졸리드, 토레졸리드, 퀴누프리스틴-달포프리스틴, 다프토마이신, 티게사이클린, 달바반신, 텔라반신, 오리타반신, 세프토비프롤, 세프타롤린, 이클라프림, 및 카르바페넴 CS-023/RO-4908463으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  58. 청구항 56에 있어서, 상기 면역요법제가 테피바주맙 또는 파기박시맙인 방법.
  59. 청구항 56에 있어서, 상기 면역요법제가 스타필로코커스 글루코사미니다제(Gmd)에 특이적으로 결합하고 스타필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제하는 제2 단클론성 항체 또는 이의 결합부인 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11, 1E12, 2D11, 3A8, 3H6, 또는 4A12, 이의 인간화 변이체, 또는 이의 Gmd 결합부인 방법.
  61. 청구항 59에 있어서, 상기 단클론성 항체가 Amd1.6 또는 Amd1.6의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체이고, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11 또는 1C11의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체인 방법.
  62. 청구항 59에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 인간화 변이체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부류인 방법.
  63. 청구항 59에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 Gmd 결합부가 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하는 방법.
  64. 청구항 45에 있어서,
    상기 정형외과용 임플란트가 수정 전 관절 치환술(revision total joint replacement)을 위한 관절 보철물이고,
    상기 방법이 상기 정형외과용 임플란트를 상기 환자에게 도입하기 전에 상기 환자로부터 감염된 관절 보철물을 제거하고 상기 감염에 대해 상기 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 치료가 유효량의 항생제의 투여, 상기 투여, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  66. 청구항 64 또는 청구항 65에 있어서, 수정 전 관절 치환술(revision total joint replacement) 동안 감염 또는 재감염을 예방하는데 효과적인 방법.
  67. 청구항 45 내지 청구항 66 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간인 방법.
  68. 청구항 45 내지 청구항 66 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 비-인간 포유류인 방법.
  69. 스타필로코커스 감염에 민감하거나 감염을 갖는 환자에게 유효량의 청구항 1 내지 12, 청구항 15 내지 19, 청구항 21 내지 24, 및 청구항 26 내지 30 중의 어느 한 항의 단클론성 항체, 청구항 13, 14, 20, 25, 및 31 중의 어느 한 항의 하나 이상의 Amd 결합부, 청구항 35 내지 44 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합물을 투여하는 단계를 포함하여, 스타필로코커스 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 투여를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 청구항 69 또는 청구항 70에 있어서, 상기 투여가 전신에서 수행되는 방법.
  72. 청구항 69 또는 청구항 70에 있어서, 상기 투여가 스타필로코커스 감염의 부위에 직접 수행되는 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 스타필로코커스 감염의 부위가 신경계, 피부, 근육, 심장, 호흡기, 위장관, 눈, 신장 및 요로, 또는 골 및 관절 감염을 포함하는 방법.
  74. 청구항 69 내지 청구항 73 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 치료제가 항생제 또는 면역요법제인 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 항생제가 반코마이신, 토브라마이신, 세파졸린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 겐타마이신, 푸시드산, 미노사이클린, 코-트리목사졸, 클린다마이신, 리네졸리드, 토레졸리드, 퀴누프리스틴-달포프리스틴, 다프토마이신, 티게사이클린, 달바반신, 텔라반신, 오리타반신, 세프토비프롤, 세프타롤린, 이클라프림, 및 카르바페넴 CS-023/RO-4908463으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  76. 청구항 74에 있어서, 상기 면역요법제가 테피바주맙 또는 파기박시맙인 방법.
  77. 청구항 74에 있어서, 상기 면역요법제가 스타필로코커스 글루코사미니다제(Gmd)에 특이적으로 결합하고/하거나 스타필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제하는 제2 단클론성 항체 또는 이의 결합부인 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11, 1E12, 2D11, 3A8, 3H6, 또는 4A12, 이의 인간화 변이체, 또는 이의 Gmd 결합부인 방법.
  79. 청구항 77에 있어서, 상기 단클론성 항체가 Amd1.6 또는 Amd1.6의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체이고, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11 또는 1C11의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체인 방법.
  80. 청구항 77에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 인간화 변이체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부류인 방법.
  81. 청구항 77에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 Gmd 결합부가 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하는 방법.
  82. 청구항 69 내지 청구항 81 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간인 방법.
  83. 청구항 69 내지 청구항 81 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 비-인간 포유류인 방법.
  84. 청구항 69 내지 청구항 83 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 스타필로코커스 균주가 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ), 스타필로코커스 에피데르미스 (S. epidermidis), 스타필로코커스 루주네시스 (S. lugdunensis ), 스타필로코커스 사프 로피티쿠스(S. saprophyticus ), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 (S. haemolyticus ), 스타필로코커스 카프라에 (S. caprae ) 또는 스타필로코커스 시미아에(S. simiae)인 방법.
  85. 청구항 69 내지 청구항 84 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 감염률, 감염의 중증도, 감염의 지속시간, 또는 이의 조합을 감소시키고; 농양(abscess)의 총 수를 감소시키거나 완전히 제거하고/제거하거나 무균성 농양의 수를 증가시키는데 효과적인 방법.
  86. 골수염을 치료하는 방법으로서,
    스타필로코커스 뼈 또는 관절 감염을 갖는 환자에게 유효량의 청구항 1 내지 12, 청구항 15 내지 19, 청구항 21 내지 24, 및 청구항 26 내지 30 중의 어느 한 항의 단클론성 항체, 청구항 13, 14, 20, 25, 및 31 중의 어느 한 항의 하나 이상의 Amd 결합부, 청구항 35 내지 44 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 투여를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  88. 청구항 86 또는 청구항 87에 있어서, 상기 투여가 전신에서 수행되는 방법.
  89. 청구항 86 또는 청구항 87에 있어서, 상기 투여가 스타필로코커스 아우레우스 뼈 또는 관절 감염의 부위에 직접 수행되는 방법.
  90. 청구항 86 내지 청구항 89 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 치료제가 항생제 또는 면역요법제인 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 항생제가 반코마이신, 토브라마이신, 세파졸린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 겐타마이신, 푸시드산, 미노사이클린, 코-트리목사졸, 클린다마이신, 리네졸리드, 토레졸리드, 퀴누프리스틴-달포프리스틴, 다프토마이신, 티게사이클린, 달바반신, 텔라반신, 오리타반신, 세프토비프롤, 세프타롤린, 이클라프림, 및 카르바페넴 CS-023/RO-4908463으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  92. 청구항 90에 있어서, 상기 면역요법제가 테피바주맙 또는 파기박시맙인 방법.
  93. 청구항 90에 있어서, 상기 면역요법제가 스타필로코커스 글루코사미니다제(Gmd)에 특이적으로 결합하고 스타필로코커스 균주의 생체내 성장을 억제하는 제2 단클론성 항체 또는 이의 결합부인 방법.
  94. 청구항 93에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11, 1E12, 2D11, 3A8, 3H6, 또는 4A12, 이의 인간화 변이체, 또는 이의 Gmd 결합부인 방법.
  95. 청구항 93에 있어서, 상기 단클론성 항체가 Amd1.6 또는 Amd1.6의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체이고, 상기 제2 단클론성 항체가 1C11 또는 1C11의 동일한 가변 도메인 또는 상보성 결정 부위를 포함하는 인간화 변이체인 방법.
  96. 청구항 95에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 인간화 변이체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부류인 방법.
  97. 청구항 95에 있어서, 상기 제2 단클론성 항체의 Gmd 결합부가 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하는 방법.
  98. 청구항 86 내지 청구항 97 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간인 방법.
  99. 청구항 86 내지 청구항 97 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 비-인간 포유류인 방법.
  100. 청구항 86 내지 청구항 99 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 스타필로코커스 균주가 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ), 스타필로코커스 에피데르미스 (S. epidermidis), 스타필로코커스 루주네시스 (S. lugdunensis ), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(S. saprophyticus ), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 (S. haemolyticus ), 스타필로코커스 카프라에 (S. caprae ) 또는 스타필로코커스 시미아에(S. simiae)인 방법.
  101. 청구항 86에 있어서, 상기 투여가 용골성 병변을 부분 또는 완전 치유하는데 효과적인 방법.
  102. 샘플에서 스타필로코커스의 존재를 측정하는 방법으로서,
    샘플을 청구항 1 내지 12, 청구항 15 내지 19, 청구항 21 내지 24, 및 청구항 26 내지 30 중의 어느 한 항의 단클론성 항체, 또는 청구항 13, 14, 20, 25, 및 31 중의 어느 한 항의 Amd 결합부에 노출시키는 단계; 및
    상기 단클론성 항체 또는 결합부와 상기 샘플에 존재하는 스타필로코커스 또는 스타필로코커스 아미다제 사이에 면역 복합체가 형성되었는지 검출하는 단계(상기 노출 단계 후 상기 면역 복합체의 존재는 상기 샘플 중의 스타필로코커스의 존재를 나타낸다)을 포함하는, 방법.
  103. 청구항 102에 있어서, 상기 검출이 면역검정을 사용하여 수행되는 방법.
  104. 청구항 103에 있어서, 상기 면역검정이 ELISA, 방사면역검정, 겔-확산 침전 반응 검정, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정, 또는 면역전기영동 검정인 방법.
  105. 청구항 102에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 결합부가 표지를 포함하는 방법.
  106. 청구항 104에 있어서, 상기 표지가 방사표지, 형광단, 또는 화학발광 표지인 방법.
  107. 청구항 102에 있어서, 상기 샘플이 체액 샘플 또는 조직 샘플인 방법.
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