KR101503937B1 - Angptl3 에 대한 단일클론 항체 - Google Patents

Angptl3 에 대한 단일클론 항체 Download PDF

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Abstract

ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다. ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체가 제공된다. 중화 단일클론 항체를 사용하여 지질 대사 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
Figure R1020097013595
ANGPTL3, 단일클론 항체, 중화 항체, 지질 대사 장애

Description

ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체 {MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ANGPTL3}
본 출원은 2006 년 12 월 8 일에 출원된 미국 가출원 번호 제 60/873,834 호의 유익을 청구하며, 이는 임의의 목적을 위해 본원에 참조병합된다.
I. 기술분야
안지오포이에틴-유사 단백질 3 (ANGPTL3) 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다. 안지오포이에틴-유사 단백질 3 (ANGPTL3) 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 사용하는 방법이 제공된다. 안지오포이에틴-유사 단백질 3 (ANGPTL3) 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
II. 서론
안지오포이에틴-유사 단백질 3 (ANGPTL3) 은 다수의 포유동물 종에서 보존되어 있다(Li, C. (2006) Curr. Opin. Lipidol. 17(2):152-156). ANGPTL3 에는 N-말단 이중코일 (coiled-coil) 도메인 및 C-말단 피브리노겐-유사 도메인이 포함되어 있다(Conklin, D. 등 (1999) Genomics 62:477-482). 상기 N-말단 이중코 일 도메인은 ANGPTL3 의 올리고머화를 매개한다(Ge, H. 등 (2005) J. Lipid Res. 46(7):1484-1490). 올리고머화된 ANGPTL3 은 생체 내에서 단백질분해 가공과정을 거치는데, 그 결과 피브리노겐-유사 도메인의 절단이 일어난다(Ono M. 등 (2003) J. Biol. Chem. 278(43):41804-41809).
ANGPTL3 은 일차적으로 간에서 발현된다(Koishi, R. 등 (2002) Nat. Genet. 30(2):151-157). ANGPTL3 은 지질단백질 리파아제 (LPL) 활성을 저해하는 것으로 보이며, 초저밀도 지질단백질 (VLDL) 제거를 감소시킨다(Shimizugawa T. 등 (2002) J. Biol. Chem. 277(37):33742-33748). KK/San 자연 돌연변이체 마우스는 Angptl3 유전자의 엑손 6 에서 삽입을 갖고 있으며 두드러진 혈청 저지혈증 (hypolipidemia) 을 나타낸다(Koishi 등 (2002) Nat. Genet., 30(2):151-157). KK/San 마우스들에서 아데노바이러스-매개 ANGPTL3 발현 또는 ANGPTL3 직접 투여는 저지혈증을 역전시켰다(Koishi 등 (2002) Nat. Genet. 30(2):151-157). Angptl3 녹아웃 (knockout) 마우스들은 급식 수컷 마우스들에서 및 급식 또는 단식 암컷 마우스들에서 감소된 중성지방 수준을 갖는 것으로 나타났다(Koster, A. 등, (2005) Endocrinol. 146:4943-4950). 이들 마우스들은 또한 급식 및 단식 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 감소된 콜레스테롤 수준을 갖는 것으로 나타났다(Koster, A. 등, (2005) Endocrinol. 146:4943-4950). Angptl3 발현은 스트렙토조토신 당뇨병 마우스 모두에서, db/db 마우스에서, 및 ob/ob 마우스에서 증가하는 것으로 나타났다(Inukai, K. 등, (2004) Biochem. Biophys. Res. Comm. 317(4):10751079; Shimamura, M. 등 (2004) Biochem. Biophys. Res. Comm. 322(3):1080-1085).
III. 발명의 개요
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 결합하여 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 마우스 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 인간화된 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 생체 내에서 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 59 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합한다.
특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 28 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 24 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 64 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 68 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호: 66 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 4.7.1 과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 4.8.3 과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 4.9.1 과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 1.315.1 과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 5.35 와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 5.50 과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 단일클론 항체는 항체 절편이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 scFv 절편이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 Fab 절편이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 F(ab')2 절편이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 Fab' 절편이다.
특정 구현예에서는, 중쇄 및 경쇄를 포함하는, ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 분리된 항체가 제공되는데, 이 때 중쇄는 하기를 포함하고: a) 서열번호: 19 내지 26 및 63 내지 66 중 어느 하나에 개시된 바의 아미노산 서열; b) 서열번호: 35, 36 및 37 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; c) 서열번호: 38, 39 및 40 에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열; d) 서열번호: 41, 42 또는 43 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; e) 서열번호: 53, 54 및 55 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; f) 서열번호: 71, 72 및 73 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 또는 g) 서열번호: 74, 75 및 76 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 이 때 상기 항체는 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시킨다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 35 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 36 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 37 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 38 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 39 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 40 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 41 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 42 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 43 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 53 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 54 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 55 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 71 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 72 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 73 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 74 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 75 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 76 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다.
특정 구현예에서는, 중쇄 및 경쇄를 포함하는, ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 분리된 항체가 제공되는데, 이 때 중쇄는 하기를 포함하고: a) 서열번호: 19 내지 26 및 63 내지 66 중 어느 하나에 개시된 바의 아미노산 서열; b) 서열번호: 35, 36 및 37 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; c) 서열번호: 38, 39 및 40 에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열; d) 서열번호: 41, 42 또는 43 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; e) 서열번호: 53, 54 및 55 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; f) 서열번호: 71, 72 및 73 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 또는 g) 서열번호: 74, 75 및 76 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 이 때 상기 항체는 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시키고; 상기 경쇄는 하기를 포함한다: a) 서열번호: 27 내지 34 및 67 내지 70 중 어느 하나에 개시된 바의 아미노산 서열; b) 서열번호: 44, 45 및 46 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; c) 서열번호: 47, 48 및 49 에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열; d) 서열번호: 50, 51 또는 52 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; e) 서열번호: 56, 57 및 58 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; f) 서열번호: 77, 78 및 79 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 또는 g) 서열번호: 80, 81 및 82 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 35 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 36 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 37 에 개시된 바의 CDR3 을 포함하고; 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 44 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 45 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 46 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 38 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 39 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 40 에 개시된 바의 CDR3 을 포함하고; 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 47 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 48 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 49 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 41 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 42 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 43 에 개시된 바의 CDR3 을 포함하고; 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 50 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 51 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 52 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 53 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 54 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 55 에 개시된 바의 CDR3 을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 56 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 57 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 58 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 71 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 72 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 73 에 개시된 바의 CDR3 을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 77 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 78 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 79 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호: 74 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 75 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 76 에 개시된 바의 CDR3 을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 80 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 81 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 82 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다.
특정 구현예에서는, 중쇄 및 경쇄를 포함하는, ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 분리된 항체가 제공되는데, 이 때 경쇄는 하기를 포함하고: a) 서열번호: 27 내지 34 및 67 내지 70 중 어느 하나에 개시된 바의 아미노산 서열; b) 서열번호: 44, 45 및 46 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; c) 서열번호: 47, 48 및 49 에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열; d) 서열번호: 50, 51 또는 52 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; e) 서열번호: 56, 57 및 58 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; f) 서열번호: 77, 78 및 79 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 또는 g) 서열번호: 80, 81 및 82 에 개시된 바의 하나 이상의 아미노산 서열; 이 때 상기 항체는 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시킨다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 44 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 45 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 46 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호: 47 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 48 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 49 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 경쇄는 서열번호: 50 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 51 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 52 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 경쇄는 서열번호: 56 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 57 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 58 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 경쇄는 서열번호: 77 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 78 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 79 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 경쇄는 서열번호: 80 에 개시된 바의 CDR1, 서열번호: 81 에 개시된 바의 CDR2, 및 서열번호: 82 에 개시된 바의 CDR3 을 포함한다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 결합하여 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체가 제공되는데, 이 때 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 대한 상기 항체의 친화력이 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 88, 서열번호: 90, 및 서열번호: 92 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 대한 상기 항체의 친화력보다 적어도 최소한 3 배 더 크다. 특정 구현예에서는, 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 대한 상기 항체의 친화력이 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 88, 및 서열번호: 90 각각에 대한 상기 항체의 친화력보다 적어도 최소한 3 배 더 크다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 결합하여 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체가 제공되는데, 이 때 상기 항체는 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 50 nM 미만의 KD 로 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 30 nM 미만의 KD 로 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 10 nM 미만의 KD 로 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 5 nM 미만의 KD 로 결합한다.
특정 구현예에서는, 상기 기술한 바의 항체를 함유하는 약학 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 고중성지방혈증의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 비만 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 허혈성 심장 질환의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 증후군의 치료 방법이 제공된다.
IV. 도면의 간단한 설명
도 1 은, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항체 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1 및 대조군 항체 항-KLH 로의 주사 4 일 후의 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 중성지방 수준을 보여준다.
도 2 는, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항체 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 및 대조군 항체 항-KLH 로의 주사 4 일 후의 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.
도 3 은, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항-ANGPTL3 항체 4.8.3, 항-ANGPTL4 항체 14D12, 및 대조군 항체 항-KLH 로의 주사 4 일 후의 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 중성지방 수준을 보여준다.
도 4 는, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항-ANGPTL3 항체 4.8.3, 항-ANGPTL4 항체 14D12, 및 대조군 항체 항-KLH 로의 주사 4 일 후의 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.
도 5 는, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항-ANGPTL3 항체들인 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 항-ANGPTL4 항체 14D12, 및 대조군 항체 항-KLH 로의 주사 4 일 후의 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 중성지방 수준을 보여준다.
도 6 은, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항-ANGPTL3 항체들인 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 항-ANGPTL4 항체 14D12, 및 대조군 항체 항-KLH 의 주사 4 일 후의 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.
도 7 은, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항체 1.125.1, 1.132.1, 1.173.2, 1.315.1, 1.424.1, 1.431.1, 및 대조군 항체 항-KLH 로의 주사 4 일 (상부 패널) 및 8 일 (하부 패널) 후의 마우스들에서 혈청 중성지방 수준을 보여준다.
도 8 은, 실시예 B 에 기술된 바와 같이, 다양한 투여량의 Ad5-hAngptl3T 바이러스 또는 2 x 109 vp 의 대조군 바이러스 주사 후의 마우스들에서 혈청 중성지방 수준을 보여준다.
도 9 는, 실시예 H 에 기술된 바와 같이, ANGPTL3 SP1, ANGPTL3T, 및 대조군 단백질 BTS324 에 대한 항체 4.1.1, 4.4.1, 4.6.3, 4.7.1, 4.8.1, 4.8.2, 4.8.3, 및 4.9.1 의 결합을 보여준다.
도 10 은 항체 4.7.1 (서열번호: 19), 4.8.3 (서열번호: 21), 및 4.9.1 (서열번호: 23) 의 중쇄 가변 영역들의 정렬을 보여준다. 또한 중쇄 공통 (consensus) 서열 (서열번호: 25), 및 신호 펩티드 (SP), 구조형성 (framework) 영역 1 (FWR1), 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 구조형성 영역 2 (FWR2), 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 구조형성 영역 3 (FWR3), 상보성 결정 영역 3 (CDR3), 및 구조형성 영역 4 (FWR4) 에 해당하는 중쇄 서열들의 영역들이 나타나 있다.
도 11 은 항체 4.7.1 (서열번호: 27), 4.8.3 (서열번호: 29), 및 4.9.1 (서열번호: 31) 의 경쇄 가변 영역들의 정렬을 보여준다. 또한 경쇄 공통 서열 (서열번호: 33), 및 신호 펩티드 (SP), 구조형성 영역 1 (FWR1), 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 구조형성 영역 2 (FWR2), 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 구조형성 영역 3 (FWR3), 상보성 결정 영역 3 (CDR3), 및 구조형성 영역 4 (FWR4) 에 해당하는 경쇄 서열들의 영역들이 나타나 있다.
도 12 는, 실시예 L 에 기술된 바와 같이, 마우스 단일클론 항-ANGPTL3 항체 4.9.1, 4.8.3, 1.315.1, 4.7.1, 및 1.173.2 로 처리한 후의 시험관내 LPL 활성을 보여준다.
도 13 은, 실시예 N 에 기술된 바와 같이, 특정 마우스 단일클론 항-ANGPTL3 항체들의 생체 내 약동학을 보여준다.
도 14 는, 실시예 H 에 기술된 바와 같이, SP1 펩티드의 알라닌-스캐닝 (alanine-scanning) 돌연변이체들에 대한 항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 의 결합을 보여준다.
도 15 는, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항체 5.35 또는 5.50 으로의 주사 4 일 (상부 패널) 및 7 일 (하부 패널) 후의 마우스들에서의 혈청 중성지방 수준을 보여준다.
도 16 은, 실시예 J 에 기술된 바와 같이, 항체 5.35 또는 5.50 의 주사 4 일 (상부 패널) 및 7 일 (하부 패널) 후의 마우스들에서의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.
도 17 은, 실시예 N 에 기술된 바와 같이, 항체 5.35 및 5.50 의 생체 내에서 약동학을 보여준다.
도 18 은, 실시예 N 에 기술된 바와 같이, 항체 4.7.1, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 의 생체 내에서 약동학을 보여준다.
도 19 는, 항체 5.35 및 5.50 및 대조군 항체 항-KLH 가 주사된 ApoE 마우스들에서 혈청 중성지방 및 혈청 콜레스테롤의 감소를 보여준다.
V. 다양한 구현예들에 대한 상세한 설명
본 출원서에서, 단수의 사용은 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한, 복수를 포함한다. 본 출원서에서, 단수형 단어는 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한, "하나 이상"을 의미한다. 본 출원서에서, "또는" 의 사용은 다르게 언급되지 않는 한, "및/또는" 을 의미한다. 나아가, "포함하는" 이라는 용어, 뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함하였다" 와 같은 다른 형태의 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한, 하나의 단위를 포함하는 요소 또는 성분, 및 하나 초과의 단위를 포함하는 요소 또는 성분 둘 다를 포함한다.
본원에서 사용된 단락 제목은 구성상의 목적일 뿐이고, 기술되는 주제 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이에 제한되는 것은 아니나 특허, 특허 출원, 기사, 도서, 및 논문을 포함하는, 본 출원서에서 인용된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부분은 그 전체가 임의의 목적으로 참조로써 본원에 명백히 포함된다. 상기 포함된 문헌 및 유사 자료 중 하나 이상이 본 출원서에서의 용어의 정의에 모순되는 용어를 정의하는 경우, 본 출원서가 제어한다.
A. 특정 정의들
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질" 은 아미노산 잔기들의 중합체를 말한다. 상기 용어는 자연발생적 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체뿐 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연발생적 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 아미노산 중합체는 임의의 길이일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체" 는 본래의 항체, 또는 항원 결합에 있어서 본래의 항체와 경합하는 항체의 절편을 말한다. 항체 절편에는 본래의 항체의 가변 영역의 일부 이상을 보유하는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, 디아바디 (diabody), 및 기타 항체 절편이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 항체 절편은 본래의 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. 특정 구현예에서, 항체 절편은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다.
용어 "본래적 폴리펩티드" 는 자연발생적 폴리펩티드를 말한다. 용어 "본래적 항체" 는 자연발생적 항체를 말한다.
용어 "단일클론 항체" 는 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터의 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 하이브리도마에 의해 분비된다. 일부 그러한 구현예에서, 하이브리도마는 당업자에게 알려진 특정 방법에 따라 제조된다(예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499] 참조). 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생성된다(예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조). 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리한 항체 절편을 말한다(예를 들어, 문헌 [Clackson 등 (1991) Nature 352: 624-628], 및 [Marks 등 (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597] 참조). 다양한 기타 단일클론 항체 제조 기술에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다.
용어 "키메라" 항체는 2 가지 이상의 상이한 원천으로부터의 성분으로 제조된 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 키메라 항체는 제 1 의 종으로부터 유래된 항체의 일부가 또 다른 분자, 예를 들어, 제 2 의 종에서 유래된 항체의 일부에 융합된 것을 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 키메라 항체는 비-인간 동물 유래의 항체의 일부가 인간 유래의 항체의 일부에 융합된 것을 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 키메라 항체는 비-인간 동물 유래의 항체의 가변 영역의 전부 또는 일부가 인간 유래의 항체의 불변 영역에 융합된 것을 포함한다.
"인간화된" 항체는 (아미노산 서열에서) 인간 항체에 더욱 밀접하게 일치하도록 개질된 비-인간 항체를 말한다. 따라서, 인간화된 항체는 키메라 항체의 한 유형이다. 특정 구현예에서, 비-인간 항체의 가변 영역의 항원 결합 잔기의 외부에 있는 아미노산 잔기가 개질된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는, 인간 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 전부 또는 일부를, 목적하는 항원 결합 특이성을 갖는, 비-인간 항체와 같은 또 다른 항체의 CDR 의 전부 또는 일부로 대체함으로써 구축된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 CDR 의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 항체의 CDR 에 상응하고 구조형성 영역 (framework region; FR) 의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 FR 에 상응하는 가변 영역을 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 인간화된 항체는 추가로 인간 항체의 불변 영역 (Fc) 을 포함한다.
용어 "인간 항체" 는 인간 항체 서열을 포함하고 비-인간 동물의 항체 서열을 포함하지 않는 단일클론 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간 항체는 본래적 항체에서 발견되지 않는 합성 서열을 포함할 수 있다. 상기 용어는 항체가 생성되는 방식에 의해 제한받지 않는다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 인간 항체는 유전자도입 마우스에서, 파지 디스플레이로, 인간 B-림프구로, 또는 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "중화 항체" 또는 "중화시키는 항체" 는 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 감소시키는 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 중화 항체는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 활성을 감소시킨다.
용어 "항원-결합 부위" 는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 말한다. 특정 구현예에서, 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 영역에 의해 제공된다.
용어 "에피토프" 는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정소를 말한다. 특정 구현예에서, 에피토프는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원의 영역이다. 특정 구현예에서, 에피토프에는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 술포닐기와 같은 분자의 화학 활성 표면기들이 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 특이적인 3 차 구조 특징 (예를 들어, "구조적" 에피토프) 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다.
하나의 에피토프가 또 다른 에피토프와 "동일" 하다고 하는 경우는 특정 항체가 에피토프 둘 다에 특이적으로 결합하는 경우이다. 특정 구현예에서, 상이한 1 차 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드는 동일한 에피토프를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 동일한 에피토프는 상이한 1 차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상이한 항체가 동일한 에피토프에의 특이적인 결합에 대해 경합한다면, 상기 항체들은 동일한 에피토프에 결합한다고 한다.
항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 항원을 우선적으로 인지할 때, 항체는 항원에 "특이적으로 결합한다". 특정 구현예에서, 항체는 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 상이한 항원이 그러한 특정 에피토프를 포함하는 한, 항체는 상이한 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 상이한 종으로부터의 동종 단백질은 동일한 에피토프를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서는 해리 상수 (KD) 가 1 μM 이하일 때, 특정 구현예에서는 해리 상수가 100 nM 이하일 때, 특정 구현예에서는, 해리 상수가 10 nM 이하일 때, 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
용어 "ANGPTL3" 는 달리 특정되지 않는 한, 이에 제한되는 것은 아니나 인간, 소, 닭, 설치류, 마우스, 래트, 돼지, 양, 영장류, 원숭이, 및 기니피그를 포함하는 임의의 척추동물 또는 포유동물 기원의 아미노산 서열을 가진 안지오포이에틴 유사 단백질 3 을 말한다. 상기 용어는 또한 본래적 ANGPTL3 의 하나 이상의 생체 내 또는 시험관 내 활성을 유지하는 본래적 ANGPTL3 의 절편 및 변형체를 말한다. 상기 용어는 ANGPTL3 의 전장 비가공 전구체 형태뿐만 아니라, 신호 펩티드의 번역-후 절단으로부터 생성된 성숙한 형태, 및 피브리노겐 도메인의 단백질분해 가공과정으로부터 생성된 형태를 모두 포함한다. 특정 구현예에서, 전장의 비가공 마우스 ANGPTL3 은 서열번호: 1 에 개시된 아미노산 서열 (Genbank 등록번호: NP_038941) 을 갖는다. 특정 구현예에서, 전장의 비가공 인간 ANGPTL3 은 서열번호: 3 에 개시된 아미노산 서열 (Genbank 등록번호: NP_055310) 을 갖는다.
용어 "Angptl3" 은 ANGPTL3 을 암호화하는 핵산을 말한다.
용어 "LPL" 은, 이들에 제한되는 것은 아니나 인간, 소, 닭, 설치류, 마우스, 래트, 돼지, 양, 영장류, 원숭이, 및 기니피그를 포함하는 임의의 척추동물 또는 포유동물 기원의 아미노산 서열을 가진 지질단백질 리파아제를 말한다. 특정 구현예에서, 지질단백질 리파아제는 유미지립 (chylomicron) 및 초저밀도 지질단백질 (VLDL) 내 트리아실글리세롤이 디아실글리세롤 및 하나의 자유 지방산 음이온으로 가수분해되는 것을 촉매한다. 특정 구현예에서, 지질단백질 리파아제는 또한 디아실글리세롤을 가수분해할 수 있다.
용어 "제제" 는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터의 추출물을 말한다.
용어 "ANGPTL3 의 길항제" 는 ANGPTL3 의 활성을 감소시키는 제제를 말한다.
용어 "ANGPTL3 의 효현제" 는 ANGPTL3 의 활성을 증가시키는 제제를 말한다.
용어 "환자" 는 인간 및 동물 대상체를 포함한다. 특정 구현예에서, 환자는 포유동물이다. 일부 그러한 구현예에서, 환자는 인간이다.
참조 폴리펩티드의 "절편" 은 참조 폴리펩티드의 임의의 일부의 아미노산의 연속된 스트레치 (contiguous stretch) 를 말한다. 절편은 참조 폴리펩티드의 길이보다 더 짧은 임의의 길이일 수 있다.
참조 폴리펩티드의 "변형체" 는 참조 폴리펩티드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 폴리펩티드를 말한다.
"보존적" 아미노산 치환은 폴리펩티드 내 아미노산의, 크기 또는 전하와 같은 특성이 유사한 또 다른 아미노산으로의 치환을 말한다. 특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 비치환 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 생물계에서의 합성에 의해서보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 삽입된 비-자연발생적 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들에는 펩티드모방체 및 아미노산 부분의 기타 가역 형태 또는 전환 형태가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
자연발생적 잔기는 공통된 측쇄 특성을 바탕으로 하기 부류로 구분될 수 있다:
1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비-보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 비-인간 항체와 동종인 인간 항체의 영역, 또는 상기 분자의 비-동종 영역 내로 도입될 수 있다.
치환을 가할 때, 특정 구현예에 따르면, 아미노산의 수치료 지수 (hydropathic index) 를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징을 바탕으로 수치료 지수를 할당받는다. 이들은 하기와 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
특정 경우에, 단백질에 상호활성의 생물학적 기능을 부여하는 수치료 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 인지되고 있다([Kyte 등, J. Mol. Biol., 157 : 105-131 (1982)]). 특정 경우에, 일부 아미노산이 유사한 수치료 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되어도 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다. 특정 구현예에서, 수치료 지수를 기준으로 변화를 가할 때, 수치료 지수가 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 포함된다. 특정 구현예에서, ±1 이내인 것들이 포함되고, 특정 구현예에서는, ±0.5 이내인 것들이 포함된다.
유사 아미노산들의 치환이 친수성을 바탕으로 효과적으로 이루어질 수 있다는 것, 특히 그렇게 해서 제조되는 생물학적 기능성 단백질 또는 펩티드를 본 경우에서처럼 면역학적 구현예에서 사용하고자 한다는 것 또한 당업계에 인지되어 있다. 특정 구현예에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 부여되는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관된다.
이들 아미노산 잔기들에 하기 친수성 값들이 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 0.1); 글루타메이트 (+3.0 ± 0.1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2.); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 0.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값을 바탕으로 변화를 가할 때, 특정 구현예에서는 친수성 값이 ± 2 이내인 아미노산들의 치환이 포함되고, 특정 구현예에서는 ± 1 이내인 것들이 포함되고, 특정 구현예에서는 ± 0.5 이내인 것들이 포함된다. 친수성을 바탕으로 1 차 아미노산 서열로부터 에피토프를 규명할 수 있다. 이들 영역을 또한 "에피토프 코어 영역" 이라고도 한다.
실례의 아미노산 치환을 하기 표 1 에 나타낸다.
Figure 112009039444074-pct00001
당업자는 주지의 기술을 사용하여 본원에 개시된 폴리펩티드의 적합한 변형체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적으로 함으로써, 활성 파괴없이 변화될 수 있는, 분자의 적합한 영역을 규명할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 유사한 폴리펩티드 사이에서 보존되는 분자의 잔기 및 부위를 동정할 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역일지라도 생물학적 활성을 파괴하지 않고 또는 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 가할 수 있다.
추가로, 특정 구현예에서, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드 내 잔기를 규명하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 그러한 비교를 고려하여, 특정 구현예에서, 당업자는 유사한 단백질 내의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질 내 아미노산 잔기들의 중요성을 예견할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 그러한 예견된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
특정 구현예에서, 당업자는 유사한 폴리펩티드 내의 3-차원 구조와 관련된 3-차원 구조 및 아미노산 서열을 또한 분석할 수 있다. 특정 구현예에서, 그러한 정보를 고려하여, 당업자는 항체의 3차원 구조에 대해 그의 아미노산 잔기의 배열을 예견할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 단백질의 표면 상에 있을 것으로 예견되는 아미노산 잔기에 극단적인 변화를 일으키지 않는 것을 선택할 수 있는데, 이는 그러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 연루될 수 있기 때문이다. 나아가, 특정 구현예에서, 당업자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변형체를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서는, 그 후 상기 변형체가 당업자에게 공지된 활성 검정들을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 변형체는 적합한 변형체에 대한 정보를 모으는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 특정 아미노산 잔기에 생긴 한 가지 변화가 활성을 파괴시키거나, 바람직하지 못하게 감소시키거나, 또는 부적합하게 되도록 만든다는 것을 발견한다면, 그러한 변화를 가진 변형체를 피할 수 있다. 즉, 특정 구현예에서, 그러한 일상적인 실험으로부터 수집한 정보를 바탕으로, 당업자는 단독으로 또는 기타의 돌연변이와 함께의 추가의 치환을 피해야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
수많은 과학 출판물이 2 차 구조의 예측에 할애하고 있다. 예를 들어, 문헌 [Moult J., Curr. Opin. Biotechnol. (1996) 7(4):422-427]; [Chou 등, (1974) Biochemistry, 13(2):222-245]; [Chou 등 (1974) Biochemistry 113(2):211-222]; [Chou 등 (1978); Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148]; [Chou 등 (1976) Ann. Rev. Biochem. 47:251-276]; 및 [Chou 등 (1979) Biophys. J. 26:367-384] 를 참조한다. 나아가, 컴퓨터 프로그램이 현재 2 차 구조를 예측하는데 도움을 주는 것으로서 이용가능하다. 2 차 구조를 예측하는 한 방법은 상동성 모델링을 바탕으로 한다. 예를 들어, 30% 초과의 서열 동일성, 또는 40% 초과의 유사성을 갖는 2 개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 형상을 가진다. 단백질 구조 데이타베이스 (PDB) 의 성장은 폴리펩티드의 구조 내 잠재적인 접힘의 개수를 포함하여, 2 차 구조에 대한 강화된 예측을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [Holm 등 (1999) Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247] 를 참조한다. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질 내에 한정된 수의 접힘이 있고 일단 임계 수의 구조가 분석되면, 구조 예견이 급격히 더욱 정확하게 될 것이라는 것이 제안되어 있다(Brenner 등 (1997) Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376).
2 차 구조를 예견하는 추가의 방법에는 "스레딩 (threading)" (예를 들어, 문헌 [Curr. Opin. Struct. Biol. 7(3):377-387 (1997)]; [Sippl 등 (1996) Structure, 4(1):15-19] 참조), "프로필 분석" (예를 들어, 문헌 [Bowie 등 (1991) Science, 253:164-170]; [Gribskov 등 (1990) Meth. Enzym. 183:146-159]; [Gribskov 등 (1987) Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358] 참조), 및 "진화적 연결" (예를 들어, 문헌 [Holm 등 (1999) Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247], 및 [Brenner 등 (1997) Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376] 참조) 이 포함된다.
특정 구현예에서, 참조 항체의 변형체에는 참조 항체의 아미노산 서열과 비교해 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 변경된 글리코실화 변형체가 포함된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드의 변형체는 본래적 폴리펩티드에 비해 더 많거나 또는 더 적은 수의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결 글리코실화 부위는 하기 서열을 특징으로 한다: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr (여기서, X 로서 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 아미노산 잔기일 수 있음). 상기 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결 탄수화물 사슬의 첨가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안적으로, 상기 서열을 제거하는 치환은 기존의 N-연결 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. 특정 구현예에서는, N-연결 탄수화물 사슬의 재배열이 제공되는데, 여기서, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위 (전형적으로 자연발생적인 것들) 가 제거되고, 하나 이상의 신규 N-연결 부위가 생성된다. 예시적인 항체 변형체에는 하나 이상의 시스테인 잔기가 참조 항체의 아미노산 서열에 비해 결실되거나 또는 또 다른 아미노산 (예를 들어, 세린) 으로 치환된 시스테인 변형체가 포함된다. 특정 구현예에서, 시스테인 변형체는, 항체가 불용성 봉입체의 단리 후 등에서 생물학적으로 활성인 구조로 재접힘되어야 할 때, 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 시스테인 변형체는 본래적 폴리펩티드보다 더 적은 수의 시스테인 잔기를 갖는다. 특정 구현예에서, 시스테인 변형체는 짝을 이루지 못한 시스테인으로부터 발생하는 상호작용을 최소화하기 위해 짝수의 시스테인 잔기를 갖는다.
특정 구현예에 따르면, 아미노산 치환은 하기와 같은 것들이다: (1) 단백질 가수분해에 대한 취약성을 감소시킴, (2) 산화에 대한 취약성을 감소시킴, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화력을 변경시킴, (4) 결합 친화력 변경시킴, 및/또는 (4) 상기 폴리펩티드 상에서 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 또는 개질시킴. 특정 구현예에 따르면, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환) 은 자연-발생 서열 (특정 구현예에서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분) 내에서 일어날 수 있다. 특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 참조 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않을 수 있다(예를 들어, 특정 구현예에서, 대체 아미노산은 참조 서열에서 발생하는 나선 (helix) 을 깨뜨리거나, 또는 참조 서열을 특징화하는 2 차 구조의 다른 유형을 파괴해서는 안됨). 특정 당업계에 인지된 폴리펩티드 2 차 및 3 차 구조의 예는 예를 들어, 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden 및 J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton 등, Nature 354:105 (1991)] 에 기술되어 있다.
"백분율 동일성" 또는 "%동일성" 은 핵산 서열과 관련하여, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 엔진을 사용하여 정렬된 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 말한다. [Tatusova 등 (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250] 를 참조한다. BLAST 엔진 (버전 2.2.10) 은 Bethesda, MD 에 있는 미국 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 에 의해 일반에 제공되었다. 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열을 정렬하기 위해, "Blast 2 Sequences" 툴이 사용되는데, 이는 하기와 같은 디폴트값으로 설정된 변수들을 이용하는 "blastin" 프로그램을 이용한다:
매트릭스 : 이용가능하지 않음
일치 가산점 : 1
불일치 벌점 : -2
오픈 갭: 5 벌점
신장 갭: 2 벌점
갭_x 드롭오프 : 50
기대값 : 10.0
워드 크기 : 11
필터 : 온 (on).
폴리펩티드 서열과 관련하여, "백분율 동일성" 또는 "%동일성" 은 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 엔진을 사용하여 정렬된 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 동일한 아미노산들의 백분율을 말한다. [Tatusova 등 (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250] 를 참조한다. BLAST 엔진 (버전 2.2.10) 은 Bethesda, MD 에 있는 미국 생명공학 정보 센터 (NCBI) 에 의해 일반에 제공되었다. 2 개의 폴리펩티드 서열을 배열하기 위해, "Blast 2 Sequences" 툴이 사용되는데, 이는 하기와 같은 디폴트값으로 설정된 변수들을 이용하는 "blastp" 프로그램을 이용한다:
매트릭스 : BLOSUM62
오픈 갭 : 11 벌점
신장 갭 : 1 벌점
갭_x 드롭오프 : 50
기대값 : 10.0
워드 크기 : 3
필터 : 온 (on).
용어 "유효 용량" 또는 "유효량" 은 환자에서 증상을 감소시키거나 또는 목적하는 생물학적 결과를 초래하는, 중화 항체와 같은 제제의 양을 말한다. 특정 구현예에서, 유효 용량 또는 유효량은 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 감소시키기에 충분하다. 특정 구현예에서, 유효 용량 또는 유효량은 하기 V.G 단락에서 기술된 바와 같이 결정된다.
용어 "치료" 는 달리 지시되지 않는 한, 치료적 및 예방적/방지적 목적을 모두 포함한다. 치료가 필요한 사람에는, 이미 특정 상태 또는 장애를 가진 개인뿐만 아니라, 특정 상태 또는 장애를 가질 위험에 있는 개인 (예를 들어, 예방적/방지적 대책이 필요한 사람) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "치료하다" 는 치료적 및/또는 예방적/방지적 목적을 위해 환자에게 제제를 투여하는 것을 말한다.
"치료제" 는 치료적 및/또는 예방적/방지적 효과를 초래하기 위해 생체 내에 투여될 수 있는 제제를 말한다.
"치료 항체" 는 치료적 및/또는 예방적/방지적 효과를 초래하기 위해 생체 내에 투여될 수 있는 항체를 말한다.
용어 "단리된 핵산" 및 "단리된 폴리뉴클레오티드" 는 상호교환적으로 사용된다. 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 게놈 DNA, RNA, cDNA, 합성 DNA 또는 RNA 또는 이들의 일부 조합이 포함된다. "단리된 폴리뉴클레오티드" 는 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드" 가 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되지 않거나, (2) 천연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 부분으로서 천연에서는 발생하지 않는다.
B. 본래적 항체 및 특정 항체 절편의 구조
본래적 항체는 전형적으로 4 량체 구조를 갖는다. 사량체는 전형적으로 폴리펩티드 사슬의 2 개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 (특정 구현예에서, 약 25 kDa) 및 하나의 중쇄 (특정 구현예에서, 약 50 - 70 kDa) 를 갖는다. 본래적 항체에서, 중쇄는 가변 영역인 VH, 및 3 개의 불변 영역인 CH1, CH2, 및 CH3 을 포함한다. VH 도메인은 중쇄의 아미노-말단에 있고, CH3 도메인은 카르복시-말단에 있다. 본래적 항체에서, 경쇄는 가변 영역인 VL, 및 불변 영역인 CL 을 포함한다. 경쇄의 가변 영역은 경쇄의 아미노-말단에 있다. 본래적 항체에서, 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다. 불변 영역은 전형적으로 효과기 기능을 담당한다.
본래적 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 본래적 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE 로서 항체의 아이소타입을 규정한다. IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하위부류를 갖는다. IgM 은 IgM1 및 IgM2 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하위부류를 갖는다. IgA 는 IgA1 및 IgA2 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하위부류를 갖는다. 본래적 인간 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 전형적으로 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10 개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology (1989) Ch. 7 (Paul, W., ed., 제 2 판, Raven Press, N.Y.)] 를 참조한다.
본래적 항체에서, 가변 영역은 전형적으로 비교적 보존된 구조형성 영역 (FR) 이 상보성 결정 영역 (CDR) 이라고도 하는 3 개의 과가변 영역으로 연결된 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2 개의 사슬의 CDR 은 전형적으로 구조형성 영역에 의해 나란히 정렬되고, 이는 특이적인 에피토프에 결합할 수 있게 한다. N-말단부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 둘 다 전형적으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인들을 포함한다. 중쇄 상의 CDR 을 H1, H2, 및 H3 라고 하고, 한편 경쇄 상의 CDR 을 L1, L2, 및 L3 이라고 한다. 전형적으로, CDR3 은 항원-결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 제공자이다. 예를 들어, H3 은 특정한 경우에, 2 개의 아미노산 잔기 정도로 짧거나 또는 26 보다 더 길 수 있다. 각각의 도메인에의 아미노산의 배열은 전형적으로 문헌 [Kabat 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, 공개공보 제 91-3242, vols. 1-3, Bethesda, MD)]; [Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; 또는 [Chothia 등 Nature 342:878-883 (1989)] 의 정의를 따른다. 본 출원서에서, 용어 "CDR" 은 다르게 지시되지 않는 한, 경쇄 또는 중쇄로부터의 CDR 을 말한다.
"Fab" 절편은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fab'" 절편은 하나의 경쇄, 및 CH1 및 CH2 도메인 사이에 존재하는 추가의 불변 영역을 포함하는 하나의 중쇄를 포함한다. 사슬간 이황화 결합이 Fab' 절편의 2 개의 중쇄 사이에서 형성되어, "F(ab')2" 분자를 형성할 수 있다.
"Fv" 절편은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하나, 불변 영역은 결여한다. 단일-사슬 Fv (scFv) 절편은 항원-결합 영역과 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하는 유연한 연결기에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예시적인 단일 사슬 항체는 WO 88/01649 및 미국 특허 제 4,946,778 호 및 제 5,260,203 호에 상세히 논의되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 가변 영역 (즉, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역) 은 항원을 인지하고 결합할 수 있는 능력을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바, 용어 "중쇄" 는 단독으로 또는 경쇄와 조합되어 항원 특이성을 부여하기에 충분한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
본원에 사용된 바, 용어 "경쇄" 는 단독으로 또는 중쇄와 조합되어 항원 특이성을 부여하기에 충분한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
C. 특정 항체
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다. 일부 그러한 구현예에서, 단일클론 항체는 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 감소시키는 중화 단일클론 항체이다.
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 하나 이상의 혈청 지질 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 혈청 중성지방 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 총 콜레스테롤 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 자유 지방산 (FFA) 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 이들 중 둘 이상의 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 이들 중 셋 이상의 수준을 감소시킨다.
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 LDLr 녹아웃 마우스에서 생체 내 혈청 중성지방을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 LDLr 녹아웃 마우스에서 생체 내 총 콜레스테롤을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 ApoE 녹아웃 마우스에서 생체 내 혈청 중성지방을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 ApoE 녹아웃 마우스에서 생체 내 총 콜레스테롤을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 db/db 마우스에서 생체 내 혈청 중성지방을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 db/db 마우스에서 생체 내 총 콜레스테롤을 감소시킨다.
특정 구현예에서는, 마우스 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 인간 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 상이한 종의 ANGPTL3 에 있는 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체 (즉, 교차-반응성을 갖는 항체) 가 제공된다. 일부 그러한 구현예에서, 상기 항체는 마우스 ANGPTL3 및 인간 ANGPTL3 둘 다에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 의 N-말단 이중코일 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 마우스 ANGPTL3 의 N-말단 이중코일 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 1 의 잔기 17 에서 잔기 240 까지 (서열번호: 59) 의 마우스 ANGPTL3 의 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 1 의 잔기 32 에서 잔기 57 까지 (서열번호: 9) 의 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 1 의 아미노산 34 내지 37 및 40 (서열번호: 9 의 아미노산 3 내지 6 및 9) 을 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 1 의 아미노산 33 내지 37 및 40 (서열번호: 9 의 아미노산 2 내지 6 및 9) 을 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 1 의 아미노산 34 내지 37, 40, 및 42 (서열번호: 9 의 아미노산 3 내지 6, 9, 및 11) 를 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 1 의 아미노산 34 내지 37 및 40 내지 42 (서열번호: 9 의 아미노산 3 내지 6 및 9 내지 11) 를 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서는, 인간 ANGPTL3 의 N-말단 이중코일 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 3 의 잔기 20 에서 잔기 143 까지 (서열번호: 60) 의 인간 ANGPTL3 의 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 3 의 잔기 32 에서 잔기 57 까지 (서열번호: 10) 의 인간 ANGPTL3 의 SP1 영역에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 3 의 아미노산 34 내지 37 및 40 (서열번호: 10 의 아미노산 3 내지 6 및 9) 을 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 3 의 아미노산 33 내지 37 및 40 (서열번호: 10 의 아미노산 2 내지 6 및 9) 을 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 3 의 아미노산 34 내지 37, 40, 및 42 (서열번호: 10 의 아미노산 3 내지 6, 9, 및 11) 를 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 3 의 아미노산 34 내지 37 및 40 내지 42 (서열번호: 10 의 아미노산 3 내지 6 및 9 내지 11) 를 포함하는 마우스 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
다양한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 88, 서열번호: 90, 및 서열번호: 92 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 결합할 때보다 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 7 배, 또는 적어도 10 배 더 큰 친화력으로 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 다양한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 88, 서열번호: 90, 및 서열번호: 92 각각에 결합할 때보다 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 7 배, 또는 적어도 10 배 더 큰 친화력으로 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, 친화력은 실시예 H(2) 에 기술된 바와 같이 측정된다.
특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 비-인간 단일클론 항체이다. 그러한 일부 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 설치류 단일클론 항체이다. 그러한 일부 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 마우스 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 키메라 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 인간화된 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 인간 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 키메라, 인간화된, 및/또는 인간 단일클론 항체는 인간에서의 치료 항체로 유용하다.
특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 항체 절편이다. 예시적인 항체 절편에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, 디아바디, 및 기타 항체 절편이 포함된다.
다양한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 인간 ANGPTL3 에 1 μM 미만, 500 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 또는 2 nM 미만의 KD 로 결합한다. 다양한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 인간 SP1 펩티드에 1 μM 미만, 500 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 또는 2 nM 미만의 KD 로 결합한다. 다양한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 1 μM 미만, 500 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 또는 2 nM 미만의 KD 로 결합한다. 다양한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 서열번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 1 μM 미만, 500 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 또는 2 nM 미만의 KD 로 결합한다.
다양한 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 마우스 ANGPTL4 (서열번호: 107) 에 결합할 때보다 적어도 10 배 더 큰 친화력, 적어도 15 배 더 큰 친화력, 적어도 20 배 더 큰 친화력, 적어도 25 배 더 큰 친화력, 적어도 30 배 더 큰 친화력, 적어도 40 배 더 큰 친화력, 적어도 50 배 더 큰 친화력, 적어도 100 배 더 큰 친화력, 또는 적어도 200 배 더 큰 친화력으로 마우스 ANGPTL3 (서열번호: 1) 에 결합한다. 다양한 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 인간 ANGPTL4 (서열번호: 108) 에 결합할 때보다 적어도 10 배 더 큰 친화력, 적어도 15 배 더 큰 친화력, 적어도 20 배 더 큰 친화력, 적어도 25 배 더 큰 친화력, 적어도 30 배 더 큰 친화력, 적어도 40 배 더 큰 친화력, 적어도 50 배 더 큰 친화력, 적어도 100 배 더 큰 친화력, 또는 적어도 200 배 더 큰 친화력으로 인간 ANGPTL3 (서열번호: 3) 에 결합한다. 다양한 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 마우스 ANGPTL4 SP1 영역의 아미노산 서열을 가진 펩티드 (서열번호: 109) 에 결합할 때보다 적어도 10 배 더 큰 친화력, 적어도 15 배 더 큰 친화력, 적어도 20 배 더 큰 친화력, 적어도 25 배 더 큰 친화력, 적어도 30 배 더 큰 친화력, 적어도 40 배 더 큰 친화력, 적어도 50 배 더 큰 친화력, 적어도 100 배 더 큰 친화력, 또는 적어도 200 배 더 큰 친화력으로 마우스 ANGPTL3 SP1 영역의 아미노산 서열을 가진 펩티드 (서열번호: 9) 에 결합한다. 다양한 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 인간 ANGPTL4 SP1 영역의 아미노산 서열을 가진 펩티드 (서열번호: 110) 에 결합할 때보다 적어도 10 배 더 큰 친화력, 적어도 15 배 더 큰 친화력, 적어도 20 배 더 큰 친화력, 적어도 25 배 더 큰 친화력, 적어도 30 배 더 큰 친화력, 적어도 40 배 더 큰 친화력, 적어도 50 배 더 큰 친화력, 적어도 100 배 더 큰 친화력, 또는 적어도 200 배 더 큰 친화력으로 인간 ANGPTL3 SP1 영역의 아미노산 서열을 가진 펩티드 (서열번호: 10) 에 결합한다.
4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 1.315.1, 5.35, 및 5.50 으로 지정된 예시적인 중화 단일클론 항체들이 제공된다. 항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 은 마우스 ANGPTL3 또는 인간 ANGPTL3 의 잔기 32 에서 57 (서열번호: 9 및 10) 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 4.7.1 및 4.9.1 은 서열번호: 2 또는 서열번호: 3 의 아미노산 33 내지 37 및 40 (서열번호: 9 또는 서열번호: 10 의 아미노산 2 내지 6 및 9) 을 포함하는 마우스 ANGPTL3 또는 인간 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 5.35 및 5.50 은 서열번호: 2 또는 서열번호: 3 의 아미노산 34 내지 37 및 40 내지 42 (서열번호: 9 또는 서열번호: 10 의 아미노산 3 내지 6 및 9 내지 11) 를 포함하는 마우스 ANGPTL3 또는 인간 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 4.8.3 은 서열번호: 2 또는 서열번호: 3 의 아미노산 34 내지 37, 40, 및 42 (서열번호: 9 또는 서열번호: 10 의 아미노산 3 내지 6, 9, 및 11) 를 포함하는 마우스 ANGPTL3 또는 인간 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 결합한다. 항체 1.315.1 은 마우스 ANGPTL3 의 잔기 42 에서 116 (서열번호: 61) 내의 에피토프에 결합한다.
항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 1.315.1, 5.35, 및 5.50 은 하나 이상의 ANGPTL3 활성을 중화시킨다. 즉, 항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 1.315.1, 5.35, 및 5.50 중 하나 이상에 의해 결합되는 에피토프 (예컨대, 인간 또는 마우스 ANGPTL3 중 하나에서의 것) 에 결합하는 항체 또한 중화 활성을 지닐 것으로 예상된다. ANGPTL3 에 대한 특정 중화 단일클론 항체는 서열번호: 9, 10, 12, 13 및 61 에서 선택되는 하나 이상의 펩티드에 결합한다. ANGPTL3 에 대한 특정 중화 단일클론 항체는 서열번호: 9 및 10 에서 선택되는 하나 이상의 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 서열번호: 61 의 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체는 서열번호: 12 의 서열을 가진 펩티드 및 서열번호: 13 의 서열을 가진 펩티드에 결합한다.
특정 구현예에서는, 단일클론 항체 4.7.1 에 의해 결합되는 동일 에피토프에 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체 4.8.3 에 의해 결합되는 동일 에피토프에 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체 4.9.1 에 의해 결합되는 동일 에피토프에 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체 5.35 에 의해 결합되는 동일 에피토프에 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체 5.50 에 의해 결합되는 동일 에피토프에 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체 1.315.1 에 의해 결합되는 동일 에피토프에 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다.
특정 중화 항체는 서열번호: 20 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 22 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 24 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 28 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 30 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 32 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 중화 항체는 서열번호: 20 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 28 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 22 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 30 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 서열번호: 24 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 32 에 개시된 바의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
1. 키메라화 및 인간화된 단일클론 항체
특정 구현예에서, 비-인간 항체는 키메라화된다. 특정 구현예에서, 인간 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체가 키메라화된다. 키메라 항체를 제조하는 특정한 예시적인 방법은 예를 들어, 문헌 [Morrison 등 (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855]; [Neuberger 등 (1984) Nature 312:604-608]; [Takeda 등 (1985) Nature 314:452-454]; 및 미국 특허 제 6,075,181 호 및 제 5,877,397 호에서 제공된다.
특정 구현예에서, 비-인간 항체는 "인간화"된다. 특정 구현예에서, 인간 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체가 인간화된다. 특정 구현예에서, 마우스 ANGPTL3 에 대항하여 발생되나, 인간 ANGPTL3 과 특이적으로 결합하는 (즉, 교차-반응하는) 마우스 단일클론 항체가 인간화된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 인간에게 투여될 때, 그의 결합 특이성은 유지하면서, 감소된 면역원성 (예를 들어, 감소된 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응) 을 갖는다. 특정 구현예에서, 인간화는 하기 상세히 기술되는 바와 같이, 이들에 제한되는 것은 아니나, CDR 그래프팅 및 인간 조작을 포함하는 방법에 의해 달성된다.
인간화된 항체의 특정 구현예에서는, 목적하는 결합 특이성을 가진 항체 ("공여자" 항체) 의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 "수용기" 항체에 있는 인간 구조형성 영역 (FR) 에 그래프팅한다. 예시적인 CDR 그래프팅은 예를 들어, 미국 특허 제 6,180,370 호, 제 5,693,762 호, 제 5,693,761 호, 제 5,585,089 호, 및 제 5,530,101 호; 문헌 [Queen 등 (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033] 에 기술되어 있다. 특정 구현예에서는, 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로부터의 하나 이상의 CDR 을 수용기 항체 내의 공통 인간 FR 에 그래프팅한다. 공통 인간 FR 을 제조하기 위해, 특정 구현예에서는, 다수의 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 FR 들을 정렬시켜, 공통 아미노산 서열을 규명한다.
특정 구현예에서, 수용기 항체 내의 특정 FR 아미노산은 공여자 항체의 FR 아미노산으로 대체된다. 일부 그러한 구현예에서, 공여자 항체의 FR 아미노산은 표적 항원에 대한 공여자 항체의 친화력에 기여하는 아미노산이다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,180,370 호, 제 5,693,762 호, 제 5,693,761 호, 제 5,585,089 호, 및 제 5,530,101 호; 문헌 [Queen 등 (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 항원 결합에 관련되고/되거나 또는 항원 결합 부위의 구조에 기여할 가능성이 있는 잔기를 규명하기 위해, 공여자 및/또는 수용자 항체를 모델링하여, 공여자 항체에 대체되는 FR 잔기와 같은 잔기의 선택을 돕는데에 컴퓨터 프로그램이 사용된다.
특정 구현예에서, 공여자 항체의 CDR 은 인간 불변 영역을 포함하는 수용자 항체 상에 그래프팅된다. 일부 그러한 구현예에서, FR 은 또한 수용자 상에 그래프팅되기도 한다. 특정 구현예에서, 공여자 항체의 CDR 은 단일 사슬 Fv 항체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 공여자 항체의 FR 은 단일 사슬 Fv 항체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체 내의 그래프팅된 CDR 은 표적 항원에 대한 인간화된 항체의 친화력이 증가되도록 추가로 개질된다(예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 개질). 특정 구현예에서, 인간화된 항체 내의 그래프팅된 FR 은 표적 항원에 대한 인간화된 항체의 친화력이 증가되도록 추가로 개질된다(예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 개질).
특정 구현예에서, 비-인간 항체는 "인간 조작" 방법을 사용하여 인간화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,766,886 호 및 제 5,869,619 호를 참조한다. 인간 조작의 특정 구현예에서, 항체 가변 도메인의 구조에 대한 정보 (예를 들어, 결정 구조 및/또는 분자 모델링으로부터 수득된 정보) 는, 가변 영역 내의 주어진 아미노산 잔기가 (a) 항원 결합에 관련되거나, (b) 항체 표면상에서 노출되거나 (즉, 용매에 접근하기 쉬움), 또는 (c) 항체 가변 영역 내에 묻혀 있는지의 (즉, 가변 영역의 구조를 유지하는데 관련됨) 경향성을 평가하는데 사용된다. 나아가, 특정 구현예에서, 인간 가변 영역 사이에서 보존되는 잔기를 규명하기 위해, 인간 가변 영역 공통 서열을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 정보는 비-인간 항체의 가변 영역 내의 아미노산 잔기를 치환하여야 하는지에 대한, 지침을 제공한다.
특정 중화 항체는 4.7.1 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.8.3 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.9.1 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.35 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.50 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 1.315.1 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.7.1 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.8.3 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.9.1 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.35 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.50 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 1.315.1 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.7.1 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.8.3 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.9.1 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.35 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.50 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 1.315.1 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 중화 항체는 4.7.1 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.8.3 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.9.1 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.35 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.50 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 1.315.1 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.7.1 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.8.3 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.9.1 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.35 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.50 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 1.315.1 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.7.1 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.8.3 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 4.9.1 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.35 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 5.50 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 1.315.1 의 적어도 2 개의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다.
2. 항체 아이소타입
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE 로부터 선택되는 임의의 아이소타입 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 IgG 아이소타입이다. 일부 그러한 구현예에서, 항체는 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 IgM 아이소타입이다. 일부 그러한 구현예에서, 항체 는 하위부류 IgM1 또는 IgM2 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 IgA 아이소타입이다. 일부 그러한 구현예에서, 항체는 하위부류 IgA1 또는 IgA2 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1 또는 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 마우스 카파 경쇄 및 마우스 IgG1 또는 IgG2 중쇄를 포함한다.
3. 개질된 항체
다양한 구현예에서, 항체는 그의 특성 중 하나 이상이 변경되도록 개질된다. 특정 구현예에서, 개질된 항체는 증가된 안정성, 증가된 순환 시간, 또는 감소된 면역원성과 같은, 비개질된 항체에 비해 이점을 가질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 4,179,337 호 참조). 특정 구현예에서, 항체는 비단백질성 부분에 연결시킴으로써 개질된다. 특정 구현예에서, 항체는 그의 글리코실화 상태를 변경함으로써, 예를 들어, 상기 항체 상의 탄수화물 사슬의 수, 유형, 연결, 및/또는 위치를 변경함으로써 개질된다. 특정 구현예에서, 항체는 글리코실화되지 않도록 개질된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 화학적 부분은 항체의 아미노산 골격 및/또는 탄수화물 잔기에 연결된다. 항체에 화학적 부분을 연결시키는 일부 예시적인 방법이 당업자에게 알려져 있다. 상기 방법에는, 이에 제한되지 않으나, 아실화 반응 또는 알킬화 반응이 포함된다. 예를 들어, EP 0 401 384; 문헌 [Malik 등 (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035]; [Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2):4-10, Mediscript (Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK) 출판]; EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; WO 95/13312; WO 96/11953; WO 96/19459 및 WO 96/19459 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 상기 반응 중 임의의 것이 항체의 아미노-말단에서 화학적으로 개질된 항체를 생성하는데 사용된다.
특정 구현예에서, 항체는 효소성, 형광성, 동위원소성 또는 친화성 표지와 같은 검출가능한 표지에 연결된다. 일부 그러한 구현예에서, 검출가능한 표지는 항체의 검출 또는 단리를 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 항체에 의해 결합된 항원의 검출을 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 항체는 하나 이상의 중합체에 연결시킴으로써 개질된다. 특정 구현예에서, 항체는 하나 이상의 수용성 중합체에 연결된다. 일부 그러한 구현예에서, 수용성 중합체에의 연결은 항체가 생리학적 환경과 같은 수성 환경에 참여할 경향성을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 치료 항체는 수용성 중합체에 연결된다. 특정 구현예에서, 당업자는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 중합체/항체 접합체가 환자의 치료에 사용될 것인지와, 만약 그렇다면 항체의 약리학적 프로필 (예를 들어, 반감기, 투여량, 활성, 항원성, 및/또는 기타 요소) 을 포함하는 고려사항을 바탕으로 적합한 수용성 중합체를 선택할 수 있다.
일부 예시적인 임상적으로 허용가능한 수용성 중합체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드; 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체; 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜; 카르복시메틸셀룰로오스; 덱스트란; 폴리비닐 알콜 (PVA); 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란; 폴리-1,3,6-트리옥산; 에틸렌/말레산 무수물 공중합체; 폴리-β-아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체 중 하나); 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜; 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체 (PPG) 및 기타 폴리알킬렌 옥시드; 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체; 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POG) (예를 들어, 글리세롤) 및 기타 폴리옥시에틸화된 폴리올; 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 폴리옥시에틸화된 포도당, 콜론산 (colonic acid) 또는 기타 탄수화물 중합체; 및 피콜 (Ficoll), 덱스트란, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 예시적인 PEG 에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-PEG 와 같이, 항체 개질에 유용한 것으로 당업계에 알려진 일부 형태가 포함된다. 특정 구현예에서, PEG 프로피온알데히드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 수용성 중합체는 임의의 분자량의 중합체이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체는 분지 또는 비분지되어 있다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa (범위의 끝점 사이의 모든 점을 포함) 이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 40 kDa 이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 10 kDa 내지 약 35 kDa 이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 15 kDa 내지 약 30 kDa 이다.
특정 구현예에서, 항체는 PEG 에 연결된다(즉, 항체가 "PEG화됨"). 다양한 구현예에서, PEG 는 포유동물에서 낮은 독성을 가진다. 문헌 [Carpenter 등 (1971) Toxicol. Appl. Pharmacol., 18, 35-40] 를 참조한다. 두드러지게는, 아데노신 탈아미노효소의 PEG 부가물은 중증 복합 면역결핍 증후군의 치료를 위해 인간에서의 사용이 미국에서 승인되었다. 다양한 구현예에서, PEG 는 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 비-인간 서열을 갖는 항체에의 PEG 의 연결은 인간에게 투여되는 경우, 상기 항체의 항원성을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 중합체는 항체에 있는 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기에 연결된다. 특정 예시적인 반응성 아미노산 잔기에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 아미노-말단 아미노산의 알파-아미노기, 리신 측쇄의 엡실론 아미노기, 시스테인 측쇄의 술프히드릴기, 아스파르틸 및 글루타밀 측쇄의 카르복실기, 카르복시-말단 아미노산의 알파-카르복실기, 티로신 측쇄, 및 일부 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기에 연결된 활성화된 글리코실 사슬이 포함된다. 단백질과의 직접적인 반응에 적합한, 일부 예시적인 활성화된 형태의 PEG ("PEG 시약") 은 당업자들에게 알려져 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 아미노기에의 연결에 적합한 PEG 시약에는, 이에 제한되는 것은 아니나, PEG 의 카르복실산 또는 탄산염 유도체의 활성 에스테르, 예를 들어, 이탈기가 N-히드록시숙신이미드, p-니트로페놀, 이미다졸 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-술포네이트인 것이 포함된다. 특정 구현예에서, 말레이미도 또는 할로아세틸기를 함유하는 PEG 시약은 술프히드릴기를 개질하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 아미노, 히드라진 및/또는 히드라지드기를 함유하는 PEG 시약은 단백질 내 탄수화물기의 과요오드산 산화에 의해 생성되는 알데히드와의 반응에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 수용성 중합체는 하나 이상의 반응성기를 가진다. 특정 구현예에서, PEG 와 같은 수용성 중합체의 활성화된 유도체는 수용성 중합체를 활성화기와 반응시킴으로써 생성된다. 특정 구현예에서, 활성화기는 단일작용성, 이작용성, 또는 다작용성일 수 있다. 수용성 중합체를 2 개 이상의 항체에 연결시키는데 사용될 수 있는 일부 예시적인 활성화기에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 하기 기가 포함된다: 술폰 (예를 들어, 클로로술폰, 비닐술폰 및 디비닐술폰), 말레이미드, 술프히드릴, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지디린, 옥시란 및 5-피리딜. 특정 구현예에서, PEG 유도체는 전형적으로 pH 약 11 이하의 pH 에서 수성 환경에서 장기간 동안 가수분해에 대해 안정하다. 특정 구현예에서, 항체와 같은 또 다른 분자에 연결된 PEG 유도체는 해당 분자에 가수분해에 대한 안정성을 부여한다. 일부 예시적인 단독이작용성 PEG 유도체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, PEG-비스-클로로술폰 및 PEG-비스-비닐술폰이 포함된다(WO 95/13312 참조).
D. 단일클론 항체의 특정 제조 방법
1. 특정 하이브리도마 방법
특정 구현예에서는, 단일클론 항체를 표준 기술로 제조한다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체를 하이브리도마에 기초한 방법으로 제조한다. 일부 그러한 방법은 당업자들에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Kohler 등 (1975) Nature 256:495-497]; [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 6 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다. 일부 그러한 구현예에서, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 또는 기타 포유동물과 같은 적당한 동물을 면역원으로 면역화하여, 항체-분비 세포를 제조한다. 특정 구현예에서, 항체-분비 세포는 림프구 또는 비장세포와 같은 B-세포이다. 특정 구현예에서는, 림프구 (예를 들어, 인간 림프구) 를 시험관 내에서 면역화하여, 항체-분비 세포를 발생시킨다. 예를 들어, 문헌 [Borreback 등 (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:3995-3999] 를 참조한다.
특정 구현예에서, 항체 분비 세포를 골수-형 세포주와 같은 "불멸화" 세포주와 융합하여, 하이브리도마 세포를 생성한다. 특정 구현예에서, 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 예를 들어, ELISA 에 의해 동정한다. 그런 후, 특정 구현예에서, 상기 세포를 서브클로닝하고, 표준 방법을 사용하여 배양할 수 있다. 특정 구현예에서는, 상기 세포를 또한 적합한 동물 숙주에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체를 친화 크로마토그래피와 같은 표준 분리 과정을 사용하여 하이브리도마 배양 배지, 혈청, 또는 복수액로부터 단리한다. 일부 구현예에 따른 하이브리도마의 생성 및 단일클론 항체의 정제에 대한 지침은 예를 들어, 문헌 [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 8 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에 제공되어 있다.
특정 구현예에서는, 유전적으로 변형된 마우스를 면역원으로 면역화시킴으로써 마우스 단일클론 항체를 제조한다. 일부 그러한 구현예에서, 마우스는 ANGPTL3 기능이 부분적으로 또는 완전히 결여된 ANGPTL3-결핍 마우스이다. 일부 그러한 구현예에서, 마우스는 ANGPTL3 을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부가 결여된 "녹아웃" 마우스이다. 특정 구현예에서는, 상기 녹아웃 마우스를 마우스 ANGPTL3 으로 면역화한다. 특정 구현예에서는, 상기 녹아웃 마우스를 인간 ANGPTL3 으로 면역화한다.
특정 구현예에서는, 인간 단일클론 항체를 인간 항체를 생성할 수 있는 유전자도입 (transgenic) 동물 (예를 들어, 마우스) 에서 발생시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,075,181 A 호 및 제 6,114,598 A 호; 및 WO 98/24893 A2 를 참조한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 인간 면역글로불린 유전자를 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 마우스 내에 도입한다(예를 들어, 효모 인공 염색체, 인간 염색체 절편, 또는 생식선 혼입을 사용하여 도입). 예를 들어, 문헌 [Jakobovits 등 (1993) Nature 362:255-258]; [Tomizuka 등 (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:722-727]; 및 [Mendez 등 (1997) Nat. Genet. 15:146-156 (유전자도입 마우스의 XenoMouse II
Figure 112009039444074-pct00002
주를 기술)] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, 상기 유전자도입 마우스를 면역원으로 면역화한다. 일부 그러한 구현예에서, 항체를 발현하는 마우스의 림프구 세포 (예컨대 B-세포) 를 수득한다. 일부 그러한 구현예에서, 상기 회수된 세포를 골수-형 세포주와 같은 "불멸화" 세포와 융합하여, 하이브리도마 세포를 제조한다. 일부 그러한 구현예에서, 하이브리도마 세포를 스크리닝하고, 선별하여, 관심 항원에 특이적인 항체를 생성하는 세포를 동정한다. 인간 단일클론 항체의 생성에 적합한 일부 예시적인 방법 및 유전자도입 마우스는, 예를 들어, 문헌 [Jakobovits 등 (1993) Nature 362:255-258; Jakobovits (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:561-566; Lonberg 등 (1995) Int'l Rev. Immunol. 13:65-93; Fishwild 등 (1996) Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez 등 (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Tomizuka 등 (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:722-727; 및 Little 등 (2000) Immunol. Today 21:364-370 에서의 리뷰된 것; 및 WO 98/24893] 에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 인간 단일클론 항체는 치료 항체로서 사용되기에 적합하다. 하기 V.G. 단락을 참조한다.
2. 특정 디스플레이-기재 방법
특정 구현예에서는, 인간 단일클론 항체를 예를 들어, 하기 기술되는 것들 중 임의의 것과 같은 디스플레이-기재 방법을 사용하여 제조한다.
특정 구현예에서는, 단일클론 항체를 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조한다. 일부 예시적인 항체 파지 디스플레이 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom, Methods in Molecular Biology: Antibody Phage-Dispaly: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien 및 Aitken, eds., Humana Press, Totowa, NJ) 의 Overview of Antibody Phage-Dispaly Technology and Its Applications] 에 기술되어 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항체 라이브러리를 비용해성 섬유성 파지 fd 또는 M13 과 같은 섬유성 파지의 표면 상에 디스플레이한다. 특정 구현예에서, 항체는 VH-VL 쌍을 안정화시키는 조작된 분자간 이황화 결합이 있는 scFv, Fab, Fv 와 같은 항체 절편, 및 디아바디이다. 특정 구현예에서는, 그 후, 목적하는 결합 특이성을 가진 항체를 선별할 수 있다. 항체 파지 디스플레이 방법의 일부 예시적인 구현예는 하기에서 추가로 상세히 설명된다.
특정 구현예에서는, 항체 파지-디스플레이 라이브러리가 당업자들에게 공지된 특정 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom, Methods in 분자 Biology: Antibody Phage-Dispaly: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien 및 Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ) 의 Overview of Antibody Phage-Dispaly Technology and Its Applications] 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 항체-분비 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA 유래의 cDNA 의 PCR 증폭에 의해 가변 유전자 저장소 (repertoire) 를 제조한다. 예를 들어, 특정 구현예에서는, B-세포의 mRNA 로부터 cDNA 를 제조한다. 특정 구현예에서는, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA 를, 예를 들어, PCR 에 의해 증폭시킨다.
특정 구현예에서는, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를 적당한 벡터 내에 클로닝한다. 특정 구현예에서는, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를 클로닝 과정 동안에 무작위로 조합하고, 그리하여 다양한 scFv 또는 Fab 를 암호화하는 cDNA 라이브러리의 집합체를 생성한다. 특정 구현예에서는, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를, 적당한 벡터 내로 클로닝하기 전에, 연결시킨다. 특정 구현예에서는, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를 적당한 벡터 내로 순차적으로 클로닝하여 연결한다.
특정 구현예에서는, cDNA 를 파지미드 벡터와 같은 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝한다. pCES1 와 같은 특정 예시적인 파지미드 벡터가 당업자들에게 알려져 있다. 특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 cDNA 는 동일한 벡터 상에 존재한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, scFv 를 암호화하는 cDNA 를, 최소의 파지 코트 단백질 pIII 을 암호화하는 유전자 III 의 전부 또는 일부와 함께 프레임에 맞게 클로닝한다. 일부 그러한 구현예에서, 파지미드는 파지 표면 상에서의 scFv-pIII 융합물의 발현을 직접 지휘한다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 중쇄 (또는 경쇄) 를 암호화하는 cDNA 를 유전자 III 의 전부 또는 일부와 함께 프레임에 맞게 클로닝하고, 경쇄 (또는 중쇄) 를 암호화하는 cDNA 를 동일한 벡터 내에서 신호 서열의 하류에 클로닝한다. 신호 서열은, 중쇄 및 경쇄가 Fab 절편 내로 조립되는 숙주 세포의 주변세포질로의 경쇄 (또는 중쇄) 의 발현을 직접 지휘한다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 중쇄를 암호화하는 cDNA 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 는 별개의 벡터 상에 존재한다. 일부 그러한 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 cDNA 를 개별적으로 클로닝하는데, 하나는 파지미드에, 그리고 다른 하나는 파지 벡터에 클로닝한다(둘 다 숙주 세포 내에서의 생체 내 재조합을 위한 신호를 포함하고 있음).
특정 구현예에서, 재조합 파지미드 또는 파지 벡터를 대장균 (E. coli) 와 같은 적합한 박테리아 숙주에 도입한다. 파지미드를 사용하는 특정 구현예에서, 숙주를 파지 구조 단백질을 공급하는 조력자 파지로 감염시켜서, 파지 표면상에 항체-pIII 융합 단백질을 운반하는 파지 입자를 발현시킬 수 있다.
특정 구현예에서는, 시험관 내에서 재배열된 가변 유전자의 레퍼토리를 사용하여 "합성" 항체 라이브러리를 구축한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 개별 유전자 분절들 (각각 V-D-J 또는 V-J) 을 PCR 을 사용하여 무작위로 조합한다. 일부 그러한 구현예에서는, 예를 들어, 에러 프론 PCR 에 의해, 추가의 서열 다양성을 CDR, 및 가능하게는 FR 내에 도입할 수 있다. 일부 그러한 구현예에서, 추가의 서열 다양성을 CDR3, 예를 들어, 중쇄의 H3 내에 도입한다.
특정 구현예에서는, 비면역화된 동물의 핵산을 사용하여 "고유의 (naive)" 또는 "보편적인 (universal)" 파지 디스플레이 라이브러리를 상기 기술된 바와 같이 구축한다. 특정 구현예에서, 비면역화된 동물은 인간이다. 특정 구현예에서는, 면역화된 동물의 핵산을 사용하여 "면역화된" 파지 디스플레이 라이브러리를 상기 기술된 바와 같이 구축한다. 특정 구현예에서, 면역화된 동물은 인간, 래트, 마우스, 햄스터, 또는 원숭이이다. 일부 그러한 구현예에서, 동물을 하기 기술되는 면역원 중 임의의 것을 사용하여 면역화한다.
일부 예시적인 보편적인 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리는 시중에서 구입가능하다. 일부 예시적인 라이브러리에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, MorphoSys AG (Martinstreid/Munich, 독일) 의 HuCAL? 라이브러리 시리즈; MAbstract? 기술을 사용한 Crucell (Leiden, 네덜란드) 의 라이브러리; BioInvent (Lund, 스웨덴) 의 n-CoDeRTM Fab 라이브러리; 및 Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK) 의 라이브러리가 포함된다.
특정 구현예에서, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체를 선별하는 것은 연속 패닝 단계 (successive panning step) 에 의해 달성된다. 패닝의 특정 구현예에서, 라이브러리 파지 제제를 항원에 노출시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 파지-항원 복합체를 세정하고, 비결합 파지를 버린다. 일부 그러한 구현예에서, 결합 파지를 회수하고, 이어서 대장균을 감염시킴으로써 이를 증폭시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 단일 플라크를 집어냄으로써, 단일클론 항체-생성 파지를 클로닝할 수 있다. 특정 구현예에서는, 상기 과정을 반복한다.
특정 구현예에서, 패닝에 사용된 항원은 하기 기술되는 면역원 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서는, 항원을 고체 지지체 상에서 고정시켜, 친화 크로마토그래피에 의해 항원-결합 파지를 정제할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원에 비오틴처리하고, 그리하여 스트렙타비딘-코팅 자기 비드를 사용하여 결합 파지를 비결합 파지로부터 분리해낼 수 있다. 특정 구현예에서는, 상기 항원을 세포 상에 (직접 패닝을 위해), 조직 동결편 내에, 또는 막 상에 (예를 들어, 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막) 고정시킬 수 있다. 일부 패닝 과정의 기타 변형이 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
특정 구현예에서는, 효모 디스플레이 시스템을 사용하여 단일클론 항체를 제조한다. 일부 그러한 시스템에서는, 항체를 효모 AGA2 단백질의 전부 또는 일부와의 융합 단백질로서 발현시키는데, 이는 효모 세포벽의 표면상에서 나타나게 된다. 일부 그러한 구현예에서는, 그 후, 목적하는 결합 특이성을 가진 항체를 발현하는 효모 세포를 형광 표지된 항원에 상기 세포를 노출시킴으로써 동정할 수 있다. 일부 그러한 구현예에서는, 그 후, 항원에 결합하는 효모 세포를 유세포분석기에 의해 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Boder 등 (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557] 를 참조한다.
3. 특정 친화력 성숙화 방법
특정 구현예에서는, 항체를 시험관 내에서 친화력 성숙화 (또는 "방향성 진화") 를 시킴으로써, 특정 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시킨다. 생체 내에서, 고유의 항체는 체세포 과변이를 통해 친화력 성숙화를 겪는데, 그 후 선별된다. 일부 시험관 내 방법은 상기 생체 내 방법을 흉내내어, 고유의 항체의 친화력과 동일하거나 또는 그를 능가하는 친화력을 갖는 항체의 제조를 가능하게 한다.
친화력 성숙화의 특정 구현예에서는, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열 내에 돌연변이를 도입한다. 예를 들어, 문헌 [Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134; Brekke 등 (2002) Nat. Reviews 2:52-62] 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다의 가변 영역에 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서는, 하나 이상의 CDR 내에 돌연변이를 도입한다. 일부 그러한 구현예에서는, H3, L3, 또는 둘 다 내에 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서는, 하나 이상의 FR 내에 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서는, 예를 들어, 파지, 리보솜, 또는 효모 디스플레이 라이브러리 내에서 돌연변이의 라이브러리를 생성시켜, 증가된 친화력을 갖는 항체를 표준 스크리닝 방법에 의해 동정할 수 있도록 한다. 예를 들어, 문헌 [Boder 등 (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:10701-10705; Foote 등 (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:10679-10681; Hoogenboom, Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien 및 Aitken, eds., Humana Press, Totowa, NJ) 의 Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications; 및 Hanes 등 (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:14130-14135] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, 예컨대 항원 결합 부위와 같은 항체의 구조에 대한 정보를 바탕으로 위치-특이적 돌연변이생성에 의해 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서는, CDR 의 조합 돌연변이생성을 사용하여 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서는, 가변 영역 코딩 서열의 전부 또는 일부를, 예를 들어, 대장균 돌연변이자 세포, 동종 유전자 재배열, 또는 실수 유발 (error prone) PCR 을 사용하여 무작위로 돌연변이시킨다. 특정 구현예에서는, "DNA 셔플링"을 사용하여 돌연변이를 도입한다. 예를 들어, 문헌 [Crameri 등 (1996) Nat. Med. 2:100-102; Fermer 등 (2004) Tumor Biol. 25:7-13] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, "사슬 셔플링(chain shuffling)" 을 사용하여, 증가된 친화력을 갖는 항체를 제조한다. 사슬 셔플링의 특정 구현예에서는, 사슬 중 하나, 예를 들어, 경쇄를 경쇄의 레퍼토리로 대체하고, 한편, 나머지 다른 사슬, 예를 들어, 중쇄를 변화시키지는 않음으로써, 특이성을 제공한다. 일부 그러한 구현예에서, 사슬 셔플링된 항체의 라이브러리를 제조하고, 여기서 변하지 않은 중쇄는 경쇄의 레퍼토리의 각각의 경쇄와 조합되어 발현된다. 특정 구현예에서는, 그 후, 상기 라이브러리를 증가된 친화력을 가진 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 특정 구현예에서는, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 순차적으로 대체한다. 특정 구현예에서는, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역만을 대체한다. 특정 구현예에서는, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 중 일부만을 예를 들어, CDR 만을 대체한다. 예를 들어, 문헌 [Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134; Brekke 등 (2002) Nat. Reviews 2:52-62; Kang 등 (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:11120-11123; Marks 등 (1992) Biotechnol. 10:779-83] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, 인간 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체 (이에 제한되는 것은 아니나, 마우스 ANGPTL3 에 대해 발생되었으나 인간 ANGPTL3 과 특이적으로 결합하는 (즉, 교차 반응하는) 마우스 단일클론 항체 포함) 를 연속적인 사슬 셔플링시킨다. 특정 구현예에서는, 예를 들어, 주어진 마우스 단일클론 항체의 중쇄를 인간 경쇄의 새로운 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화력을 가진 항체를 선별한다. 일부 그러한 구현예에서는, 그 후, 선별된 항체의 경쇄를 인간 중쇄의 새로운 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화력을 가진 항체를 선별한다. 따라서, 특정 구현예에서는, 목적하는 항원 결합 특이성 및 친화력을 가진 항체를 선별한다.
대안적으로, 특정 구현예에서는, 주어진 마우스 단일클론 항체의 중쇄를 인간 경쇄의 새로운 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화력을 가진 항체를 이러한 셔플링의 첫 라운드에서 선별한다. 특정 구현예에서는, 원래의 마우스 단일클론 항체의 경쇄를 인간 중쇄의 새로운 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화력을 가진 항체를 이러한 셔플링의 두번째 라운드에서 선별한다. 특정 구현예에서는, 그 후, 첫 라운드의 셔플링에서 선별된 항체의 인간 경쇄를 두번째 라운드의 셔플링에서 선별된 항체의 인간 중쇄와 조합한다. 따라서, 특정 구현예에서는, 목적하는 항원 결합 특이성 및 친화력을 가진 인간 항체를 선별한다.
특정 구현예에서는, 친화력 성숙화에 의한 항체 선별의 대안이 되는 "리보솜 디스플레이" 방법을 사용한다. 리보솜 디스플레이 방법의 특정 구현예에서는, 항체-암호화 핵산을 선별 단계들 사이의 RT-PCR 에 의해 증폭시킨다. 따라서, 특정 구현예에서는, 실수 유발 중합효소를 사용하여, 핵산에 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 상기 방법의 비제한적 예는 [Hanes 등 (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:14130-14135] 에서 상세히 기술되어 있다.
4. 특정 재조합 방법
특정 구현예에서는, 단일클론 항체를 재조합 기술에 의해 제조한다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호를 참조한다. 일부 그러한 구현예에서는, 단일클론 항체 사슬을 암호화하는 핵산을 적당한 숙주 세포에 클로닝하고, 발현시킨다. 예를 들어, 특정 구현예에서는, 표준 방법을 사용하여, 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포와 같은 목적하는 항체를 발현하는 세포로부터 RNA 를 제조할 수 있다. 특정 구현예에서는, 그 후, 상기 RNA 를 사용하여, 표준 방법을 사용하여 cDNA 를 제조할 수 있다. 특정 구현예에서는, 예를 들어, 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해, 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 를 증폭시킨다. 특정 구현예에서는, cDNA 를 적당한 발현 벡터 내에 클로닝한다. 특정 구현예에서는, 그 후, 상기 발현 벡터를, 내생적으로 항체를 생성하지 않는 숙주 세포와 같은 적당한 숙주 세포 내로 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨다. 일부 예시적인 숙주 세포에는, 대장균, COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 골수종 세포가 포함되나 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서는, 중쇄 및 경쇄가 동일한 숙주 내에서 공동발현되는 경우, 재구축된 항체를 단리할 수 있다.
특정 구현예에서는, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 cDNA 를 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서는, 마우스 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역을 인간 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역으로 대체할 수 있다. 이러한 방식으로, 특정 구현예에서는, 인간 항체 불변 영역을 가지나 마우스 항체의 결합 특이성을 유지하는 키메라 항체를 제조할 수 있다.
특정 구현예에서는, 재조합 항체를 특정 세포주에서 발현시킬 수 있다. 특정 구현예에서는, 특정 항체를 암호화하는 서열을 적당한 포유동물 숙주 세포의 형질전환에 사용할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 특정 예시적인 방법에는, 미국 특허 제 4,399,216 호, 제 4,912,040 호, 제 4,740,461 호 및 제 4,959,455 호에서 예시된 바와 같은, 당업계에 공지된 특정 트랜스펙션 과정을 사용하는 것, 및 폴리뉴클레오티드를 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 넣고, 숙주 세포를 바이러스 (또는 벡터) 로 형질도입시키는 것을 포함하나, 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서는, 사용된 형질전환 과정은 형질전환되는 숙주에 따라 다를 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하는 특정 예시적인 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌 매개 트랜스펙션, 원형질체 융합법, 전기천공법, 리포좀 내에서의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 DNA 를 핵 내로 직접 마이크로주사하는 것을 포함하나, 이들에 제한되지 않는다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 특정 예시적인 포유동물 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 이들에 제한되는 것은 아니나 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 수많은 기타 세포주를 포함하는, American Type Culture Collection (ATCC) 로부터 입수가능한 많은 불멸화 세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서는, 어떤 세포주가 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 항체를 높은 수준으로 생성하는가를 결정함으로써 세포주를 선별할 수 있다.
E. 특정 폴리펩티드 면역원
특정 구현예에서는, 항체를 생성하기 위해, 동물을 면역원으로 면역화한다. 특정 구현예에서는, 면역원은 ANGPTL3 을 포함한 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서는, 면역원은 ANGPTL3 의 절편을 포함한 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서는, 면역원은 ANGPTL3 의 N-말단 이중 코일 도메인을 포함한 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서는, 면역원은 ANGPTL3 의 SP1 영역을 포함한 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 면역원은 마우스 ANGPTL3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 인간 ANGPTL3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 1 의 아미노산 서열을 포함한 마우스 ANGPTL3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 3 의 아미노산 서열을 포함한 인간 ANGPTL3 을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 마우스 ANGPTL3 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 1 의 잔기 17 내지 잔기 240 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 59 의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 1 의 잔기 32 내지 잔기 57 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 9 의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 61 의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 인간 ANGPTL3 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 3 의 잔기 20 내지 잔기 243 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서는, 면역원은 서열번호: 3 의 잔기 32 내지 잔기 57 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 10 의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 1 의 잔기 17 내지 잔기 240 중의 약 10 - 20 개의 서로 인접한 아미노산들로 된 임의의 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 3 의 잔기 20 내지 잔기 243 중의 약 10 - 20 개의 서로 인접한 아미노산들로 된 임의의 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 9, 10, 12, 13, 59, 60 및 61 로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 9 및 10 으로부터 선택되는 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 59 및 60 으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 서열번호: 12, 13 및 61 을 포함한 펩티드를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 펩티드는 면역원성일 가능성이 있는 것이 선별된다. 일부 그러한 구현예에서, 펩티드는 친수성인 것으로 예측되고/되거나, 또는 그의 접힌 상태에서 고유의 ANGPTL3 의 표면 상에 노출될 가능성이 있는 것이 선별된다. 적합한 면역원성 펩티드를 선별하기 위한 예시적인 지침은 예를 들어, 문헌 [Ausubel 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 11.14 (John Wiley & Sons, NY)]; 및 [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 기술되어 있다.
단백질의 펩티드 분절이 친수성인지 그래서 단백질의 표면 상에 노출될 가능성이 있는지를 예측하게 하는 특정 예시적인 알고리즘이 당업자들에 공지되어 있다. 특정의 그러한 알고리즘은 상기 예측을 하기 위해 단백질의 1 차 서열 정보를 이용한다. 특정의 그러한 알고리즘은 예를 들어, 문헌 [Hopp 및 Woods (1981) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824-3828], 또는 [Kyte 및 Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132] 의 방법을 바탕으로 한다. 단백질의 1 차 아미노산 서열을 바탕으로 단백질의 2 차 구조를 예측하도록 하는 특정의 예시적인 알고리즘이 당업자들에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Corrigan 등 (1982) Comput. Programs Biomed. 3:163-168] 를 참조한다. 특정의 그러한 알고리즘은 예를 들어, 문헌 [Chou 및 Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:25-276] 의 방법을 바탕으로 한다. 특정 구현예에서는, β-회전 (β-turn) 을 형성할 것으로 예상되고, 따라서 단백질의 표면상에 노출될 가능성이 있는 펩티드 분절을 면역원으로서 선별할 수 있다.
특정 구현예에서는, 동물을 면역원 및 하나 이상의 보조제로 면역화한다. 특정 구현예에서는, 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위해 보조제를 사용한다. 일부 예시적인 보조제에는, 프로인트 보조제 (Freund's adjuvant) (완전 또는 불완전), 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 무기염, 표면 활성 물질, 키토산, 리소레시틴, 플루로닉 (pluronic) 폴리올, 다중음이온 (polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum) 과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제가 포함되나 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서는, 면역원, 예를 들어, 펩티드 면역원에 대한 면역 반응은 또 다른 면역원성 분자 또는 "담체 단백질" 에 면역원을 커플링시킴으로써 증진된다. 일부 예시적인 담체 단백질에는, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin, KLH), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 오브알부민, 콜레라 톡소이드, 및 이들의 면역원성 절편이 포함되나 이들에 제한되지 않는다. 펩티드 면역원을 담체 단백질에 커플링시키는데 있어서 예시적인 지침은 예를 들어, 문헌 [Ausubel 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 11.15 (John Wiley & Sons, NY)]; 및 [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에 기술되어 있다.
특정 구현예에서는, 상기 면역원 중 임의의 것을 표준 재조합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서는, 마우스 또는 인간 ANGPTL3 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 절편을 적당한 발현 벡터 내에 클로닝시킬 수 있다. 특정 구현예에서는, 폴리뉴클레오티드는 서열번호:5 또는 서열번호:6 의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서는, 그 후, 상기 재조합 벡터를 적당한 숙주 세포 내에 도입한다. 특정 구현예에서는, 그 후, 폴리펩티드를 표준 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리한다. 재조합 단백질 발현의 일부 예시적인 방법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Ausubel 등 (1991) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 16 (John Wiley & Sons, NY)] 를 참조한다.
F. 특정 검정
1. 특정 결합 검정
특정 구현예에서는, 항체의 항원에의 결합을 검출하는 특정의 일상적인 방법을 사용하여 ANGPTL3 에 결합하는 항체를 스크리닝한다. 예를 들어, 특정 구현예에서는, 단일클론 항체의 ANGPTL3 에의 결합 능력을 웨스턴 블롯과 같은 표준 면역블롯팅 방법에 의해 검정한다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel 등 (1992) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 10.8 (John Wiley & Sons, NY)]; [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 이러한 검정에 사용되는 ANGPTL3 은 단리된 것일 수 있거나, 또는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에 존재하는 것일 수 있다.
특정 구현예에서는, 단일클론 항체의 ANGPTL3 에의 결합 능력을 경합 결합 검정을 사용하여 검정하는데, 이는 ANGPTL3 에의 결합에 대해서, 공지된 항-ANGPTL3 항체와 경합하는 후보 항체의 능력을 평가하는 것이다. 일부 그러한 구현예에서, 공지된 항-ANGPTL3 항체는 하기 VI.J 단락에서 기술되는 단일클론 항체 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서는, ELISA 를 사용하여 경합 결합 검정을 수행한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, 결합 검정을 사용하여 ANGPTL3 에 대한 항체의 결합 반응속도 (예를 들어, 속도 상수) 또는 결합 친화력 (예를 들어, 결합 또는 해리 상수) 을 정량화한다. 특정 구현예에서는, 항원 (예를 들어, ANGPTL3) 을 고체 지지체 상에 고정함으로써 "고체-상"에서 결합의 반응속도 또는 친화력을 측정한다. 고정화된 항원은 용액으로부터 항체를 "포획한다". 특정 구현예에서는, 결합의 반응속도 또는 친화력을 항체 (예를 들어, ANGPTL3 에 대한 항체) 를 고체 지지체 상에 고정시킴으로써 "고체-상"에서 측정한다. 고정화된 항체는 용액으로부터 항원을 "포획한다".
특정 구현예에서는, 결합의 반응속도 또는 결합 친화력을 ELISA-기재 방법을 사용하여 측정한다. 특정 구현예에서는, 결합의 반응속도 또는 결합 친화력을 Biacore 표면 플라즈몬 공명 기술 (Biacore, Piscataway, NJ) 과 같은 바이오센서-기재 기술을 사용하여 측정한다. 일부 그러한 방법은 당업자들에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [McCafferty 등 (eds.) (1996) Antibody Engineering: A Practical Approach (IRL, Oxford, UK)]; [Goldberg 등 (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:278-281]; [Karlsson 등 (1991) J. Immunol. Methods 145:229-240]; [Malmqvist (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:282-286]; 개관을 위해서는, [Hoogenboom, Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 at 19 (O'Brien 및 Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ) 의 Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 Fab 절편의 결합의 반응속도 또는 결합 친화력을 측정한다. 일부 경우, Fab 절편은 다량체화하지 않는 특성을 가진다. 다량체화는 일부 경우에서, "고체상" 방법에서의 결합의 반응속도 및 결합 친화력의 측정을 복잡하게 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom, Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 at 19 (O'Brien 및 Aitken, eds., Humana Press, Totowa, NJ) 의 Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications] 를 참조한다. 따라서, 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 Fab 절편은 예를 들어, ELISA-기재 검정 또는 Biacore 검정과 같이, 항원이 고체 지지체에 고정되는 결합 검정에서 이용하기에 적합하다. 특정 구현예에서는, 효소적 방법을 사용하여 ANGPTL3 에 특이적으로 결합하는 본래적 항체로부터 Fab 절편을 발생시킨다. 특정 구현예에서는, Fab 절편은, 상기 V.D.3 단락에서 기술된 것과 같은 재조합 발현 시스템에서 Fab 절편을 암호화하는 핵산을 발현시킴으로써 제조된다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체의 결합의 반응속도 또는 결합 친화력을 "용액상" 방법을 사용하여 측정한다. 이러한 방법에서, 결합의 반응속도 또는 친화력을 용액 내에서 항체-항원 복합체에 대해 측정한다. 일부 이러한 방법은 당업자들에 공지되어 있다. 상기 방법의 비제한적 예는 "속도 배제 검정" 또는 "KinExA" 이다. 예를 들어, 문헌 [Blake 등 (1996) J. Biol. Chem. 271:27677-27685]; [Drake 등 (2004) Anal. Biochem. 328:35-43 (Biacore "고체상" 및 KinExA "용액상" 방법 비교)] 를 참조한다. 특정 구현예에서, KinExA 를 수행하는 장비는 Sapidyne Instruments, Inc. (Boise, ID) 에서 공급받은 것이다.
특정 구현예에서는, 다가 항체 또는 다량체화하는 항체의 결합의 반응속도 또는 결합 친화력을 용액상 방법을 사용하여 측정한다. 일부 경우에, 다가 항체 또는 다량체화하는 항체의 결합의 반응속도 또는 결합 친화력의 측정은 용액상 분석을 따를 수 있다.
특정 구현예에서는, 항-ANGPTL3 항체의 결합 친화력은 그의 KD 에 의해 측정되는 바, 약 10-6M 이하이다. 특정 구현예에서는, 항-ANGPTL3 항체의 결합 친화력은 약 10-7 M, 약 10-8 M, 또는 약 10-9 M 이하이다. 일부 그러한 구현예에서, 항-ANGPTL3 항체는 치료 항체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134] 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 예를 들어, 친화력 성숙화 기술을 사용하여, 10-9 M 미만 (예를 들어, 이들에 제한되는 것은 아니나, 약 100 pM 내지 약 5 pM 의 결합 친화력을 포함하는, 약 500 pM 내지 약 0.5 pM 의 결합 친화력) 의 결합 친화력이 달성가능하다. 예를 들어, 문헌 [Boder 등 (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:10701-10705] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 항-ANGPTL3 항체의 결합 친화력은 약 5×10-8 M 미만이다.
특정 구현예에서는, 마우스 ANGPTL3 에 대해 일어난 단일클론 항체를 본원에 기술된 것과 같은 일부 일상적인 검출 방법을 사용하여 인간 ANGPTL3 에의 특이적인 결합에 대해 스크리닝한다. 단일클론 항체가 마우스 및 인간 ANGPTL3 둘 다에 결합하는 (즉, "교차 반응성"을 나타내는) 능력은 마우스 및 인간 ANGPTL3 에 동일한 에피토프가 존재한다는 것을 가리킨다. 변성 조건을 사용하는 검출 방법 (예를 들어, 웨스턴 블롯) 의 특정 구현예에서, 교차-반응성은, 마우스 단일클론 항체가 마우스 및 인간 ANGPTL3 내의 동일한 "선형" 에피토프에 결합한다는 것을 가리킨다. 비-변성 조건을 사용하는 검출 방법의 특정 구현예에서, 교차-반응성은, 마우스 단일클론 항체가 마우스 및 인간 ANGPTL3 내의 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프) 에 결합한다는 것을 가리킨다.
2. 특정 에피토프 맵핑 방법
다양한 구현예에서, 단일클론 항체가 결합하는 에피토프는 수많은 검정 중 임의의 것에 의해 동정된다. 일부 예시적인 검정은, 예를 들어, 문헌 [Morris, Methods in Molecular Biology Vol.66: Epitope Mapping Protocols (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 기술되어 있다. 예를 들어, 유전자 절편 발현 검정 또는 펩티드-기재 검정에 의해 에피토프 맵핑을 할 수 있다. 유전자 절편 발현 검정의 특정 구현예에서는, 예를 들어, ANGPTL3 의 절편을 암호화하는 핵산을 원핵 세포에서 발현시키고, 단리한다. 일부 그러한 구현예에서는, 단일클론 항체가 상기 절편에 결합하는 능력을 예를 들어, 면역침전 또는 면역블로팅에 의해 평가한다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 의 절편을 암호화하는 핵산을 전사시키고, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관 내에서 번역시킨다. 그런 다음, ANGPTL3 의 방사성으로 표지된 절편을, 단일클론 항체에 결합하는지에 대해 시험한다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 의 절편을 단백질분해 절편화에 의해 생성한다. 특정 구현예에서는, 에피토프를 파지 또는 효모의 표면상에 나타내어진 무작위 펩티드들의 라이브러리를 사용하여 동정한다. 특정 구현예에서는, 단일클론 항체에의 결합에 대해 ANGPTL3 의 오버랩핑 합성 펩티드 절편의 라이브러리를 시험함으로, 에피토프를 동정한다. 특정 구현예에서는, 하기 기술되는 바와 같은, 경합 검정을 사용하여 에피토프를 동정한다. 특정 구현예에서는, 에피토프를, 예컨대 하기 기술되는 바와 같은, 알라닌-스캐닝 돌연변이생성을 사용하여 추가로 규명할 수 있다.
3. 특정 경합 검정
특정 구현예에서는, ANGPTL3 의 동일한 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 관심 단일클론 항체로서 동정한다. 특정 구현예에서는, 상기 단일클론 항체를 예를 들어 상기 기술된 바와 같이, 에피토프 맵핑에 의해 동정한다. 특정 구현예에서는, 그러한 단일클론 항체를 일상적인 경합 검정에 의해 동정한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다. 비제한적 예시적인 경합 검정에서는, ANGPTL3 또는 그의 절편을 멀티웰 플레이트의 웰에 고정시킨다. 일부 그러한 구현예에서는, 관심의 단일클론 항체를 표준 방법에 의해 형광 표지 (특정 구현예에서는, 형광 이소티오시아네이트) 로 표지한다. 일부 그러한 구현예에서는, 표지된 관심 단일클론 항체 및 비표지 시험 단일클론 항체의 혼합물을 상기 웰에 첨가한다. 일부 그러한 구현예에서, 각 웰의 형광을 정량화하여, 비표지 시험 단일클론 항체가 표지된 관심 단일클론 항체의 결합을 막는 정도를 측정하였다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체들은, 각각이 다른 항체의 결합을 50% 이상으로 막는다면, 에피토프를 공유하는 것으로 간주된다. 예시적인 경합 검정은 또한, 예를 들어, 문헌 [Morris, Methods in Molecular Biology Vol.66: Epitope Mapping Protocols (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 기술되어 있다. 비제한적 예시적인 경합 검정은 하기 VI.O 단락에서 제공된다.
4. 중화 항체를 동정하기 위한 특정 검정
특정 구현예에서는, 단일클론 항체를, 중화 항체인 것, 즉, 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 ANGPTL3 의 활성을 감소시키는 것들에 대해 스크리닝한다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 의 활성은 ANGPTL3 의 LPL 억제 능력이다. 따라서, 특정 구현예에서, 중화 항체는, ANGPTL3 의 존재 하에서 LPL 활성을 증가시키는 능력에 의해 동정된다. 일부 그러한 구현예에서, 중화 항체는 LPL 활성을 대조군 항체에 대해, 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상 증가시킨다. 생체 내에서 및 시험관 내에서의 LPL 활성의 측정을 위한 일부 예시적인 검정은 당업계에 공지되어 있다.
특정 구현예에서는, 생체 내에서 ANGPTL3 의 활성을 감소시키는 중화 항체는, 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 감소시키는 능력에 의해 동정된다. 일부 예시적인 혈청 지질에는, 중성지방, 콜레스테롤, 및 자유 지방산이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 그러한 구현예에서, 중화 항체는 대조군 항체에 대해, 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상 감소시킨다. 특정 구현예에서는, 생체 내에서 ANGPTL3 의 활성을 감소시키는 중화 항체를 지방-함유 식이의 특정 효과를 상쇄하거나 또는 상기 효과로부터의 보호를 부여하는 능력에 의해 동정된다. 일부 예시적인 효과에는, 체중 증가, 비만, 포도당 불내성 (고혈당증), 인슐린 둔감증 (고인슐린혈증), 간 지방증 (지방간), 및 근육세포내 지질 축적이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
G. 중화 단일클론 항체를 사용하는 특정 약학 조성물 및 치료 방법
특정 구현예에서는, 중화 항체를 치료 항체로서 사용할 수 있다. 치료 항체로서 사용되는 일부 예시적인 중화 항체에는, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 당업자는 치료제로서 일부 항체를 사용하는 것에 친숙하다. 예를 들어, 12 가지 초과의 항체가 1980 년대 중반부터 치료제로서의 용도에 대해 FDA 승인을 받았다. 예를 들어, 문헌 [Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134]; [Gura (2002) Nature 417:584-586]; [Brekke 등 (2002) Nat. Reviews 2:52-62] 를 참조한다. 일부 FDA-승인 항체는 다양한 암, 염증, 및 바이러스 감염을 치료하고, 이식 거부반응을 예방하는데 사용되는 것들을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Gura (2002) Nature 417:584-586]; [Brekke 등 (2002) Nat. Reviews 2:52-62] 를 참조한다. 나아가, 12 개 초과의 항체는 현재 임상 시험 중이다. 예를 들어, 문헌 [Brekke 등 (2002) Nat. Reviews 2:52-62] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, 유효량의 ANGPTL3 에 대한 중화 항체를 투여하는 것을 포함하는 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 ANGPTL3 에 대한 중화 항체를 투여하는 것을 포함하는 급성 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 ANGPTL3 에 대한 중화 항체를 투여하는 것을 포함하는 만성 지질 대사 장애의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서는, 지질 대사 장애 치료 방법이 유효량의 ANGPTL4 에 대한 중화 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, PCT 공개공보 제 WO 2006/074228 호를 참조한다.
본원에 사용된 바, "지질 대사 장애" 에는, 2 차 고지혈증 (고중성지방혈증 및 고콜레스테롤혈증 포함) 을 유발할 수 있는 장애가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 예시적인 지질 대사에는, 죽상동맥경화증, 이상지질혈증, 고중성지방혈증 (약물-유도 고중성지방혈증, 이뇨-유도 고중성지방혈증, 알콜-유도 고중성지방혈증, β-아드레날린 차단제-유도 고중성지방혈증, 에스트로겐-유도 고중성지방혈증, 글루코코르티코이드-유도 고중성지방혈증, 레티노이드-유도 고중성지방혈증, 시메티딘-유도 고중성지방혈증, 및 가족성 고중성지방혈증 포함), 고중성지방혈증 관련 급성 췌장염, 유미지립 증후군, 유미지립혈증 (chylomicornemia), Apo-E 결핍증, LPL 결핍증 또는 저활성, 고지혈증 (가족성 결합성 고지혈증 포함), 고콜레스테롤혈증, 고콜레스테롤혈증 관련 통풍, 황색종증 (피하 콜레스테롤 침착), 관상동맥질환 (허혈성 심질환이라고도 함), 관상동맥질환 관련 염증, 재협착, 말초 혈관 질환, 및 뇌졸중이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 예시적인 지질 대사 장애에는, 비만과 같은 체중 관련 장애, 대사 증후군의 독립적인 성분들 (예를 들어, 중심 비만, FBG/전-당뇨병/당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 및 고혈압) 을 포함하는 대사 증후군, 갑상선기능저하증, 요독증, 및 체중 증가 (급격한 체중 증가 포함), 체중 감소, 체중 감소의 유지, 또는 체중 감소 후 체중 재증가의 위험과 관련된 기타 상태가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 예시적인 지질 대사 장애에는, 관련 혈당 장애, 예컨대 당뇨병, 고혈압, 및 인슐린 저항과 관련된 다낭성 난소 증후군이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 예시적인 지질 대사 장애에는, 신장 이식, 신증후군, 쿠싱 증후군, 말단비대증, 전신성 홍반성 낭창, 이상글로불린혈증, 지방이영양증, 글리코겐증 I 형, 및 애디슨 질환이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
지질 대사 장애에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 식습관 (이들에 제한되는 것은 아니나, 과다 알콜 소비, 체중 증가, 및 비만 포함), 약물 (이들에 제한되는 것은 아니나, 외인성 에스트로겐, 타목시펜, 레티노이드, 티아지드, 클로르탈리돈, 베타-클로커, 프로테아제 억제제 (이에 제한되지 않으나, 리토나비르 (ritonavir) 포함), 프로포폴 주입, 및 비경구 지질 주입이 포함됨), 대사 장애 (이들에 제한되는 것은 아니나, 당뇨병, 임신, 만성 신부전, 갑상선기능저하증, 가족성 고지혈증, 및 췌장염 포함) 로 인한 HTG 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 2 차 고트리글리세롤혈증 (제 I 형, V 형, 및 IV 형을 포함하나 이에 제한되지 않는, HTG) 이 포함된다.
지질 대사 장애에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 혈관통로 기능부전 관련 지질 장애, 신생물형성증 (이들에 제한되는 것은 아니나, 전립선암, 신장암, 간암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암 포함) 을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 증식 질환 관련 지질 장애, 염증에 반응하여 발생하는 장애로서, 예를 들어, 감염성 질환, 상처 치유, 면역결핍 증후군 (비정상 발달과 관련된 증후군을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, AIDS 및 기타), 반흔 형성, 죽상동맥경화증, 재협착 및 이식 거부반응과 관련된 것들을 포함하나 이들에 제한되는 것은 아닌 장애, 자가면역 장애, 및 만성 염증 질환 및 장애로서, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창을 포함하나 이에 제한되지 않는 질환, 및 크론병, 대장염, 염증성 장질환, 반응성 관절염(라임 질환 (Lyme disease) 포함), 인슐린 의존성 당뇨병, 기관 특이적 자가면역질환, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선종 및 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 접촉 피부염, 건선, 공피증, 숙주편대질환, 사르코이드증, 말라리아, 패혈증, 췌장염, 아토피 증상 (이들에 제한되는 것은 아니나, 천식 및 알레르기 (이들에 제한되는 것은 아니나, 알레르기성 비염, 위장관 알레르기 (이에 제한되는 것은 아니나, 식품 알레르기 포함) 포함), 호산구 증가증, 결막염 및 사구체 신염 포함), 혈관 응고 장애, 내독소 쇼크 및 기타 염증 매개 장애 (예컨대 수면무호흡증 및 졸음) 를 포함하나 이들에 제한되지 않는 장애가 포함된다.
특정 구현예에서는, 유효량의 ANGPTL3 에 대한 항체 및 하나 이상의 부가적인 치료제를 투여하는 것을 포함하는 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 일부 그러한 구현예에서, 추가의 치료제는 유효량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 ANGPTL3 에 대한 또 다른 항체이다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 ANGPTL4 에 대한 중화 항체이다. 예를 들어, PCT 공개공보 제 WO 2006/074228 호를 참조한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 비-항체 제제이다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 혈청 지질 수준을 저하시키는 제제이다. 일부 예시적인 추가의 치료제에는, HMG-CoA 환원효소 억제제 (예를 들어, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 및 플루바스타틴) 와 같은 콜레스테롤 합성 억제제 (스타틴); 콜레스티라민 및 기타 수지와 같은 담즙 격리제; 니아신과 같은 VLDL 분비 억제제; 프로부콜 (Probucol) 과 같은 친지성 항산화제; 아실-CoA 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 억제제; 파네소이드 X 수용체 길항제; 스테롤 조절 결합 단백질 절단 활성화 단백질 (SCAP) 활성화제; 미소체 중성지방 전이 단백질 (MTP) 억제제; 및 ApoE-관련 펩티드가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 고밀도 지질단백질 (HDL) 을 증가시키는 제제이다. 상기 제제의 비제한적 예에는, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질 (CETP) 억제제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서는, 유효량의 ANGPTL3 에 대한 항체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서는, 유효량의 ANGPTL3 에 대한 항체 및 유효량의 하나 이상의 부가적인 치료제를, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 치료제는 상기 기술된 것들로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 약학 조성물용 제형 물질은 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투성, 점도, 투명성, 색상, 등장성, 향, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡수 또는 침투를 변경, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함한다. 특정 구현예에서, 적합한 제형 물질에는, 아미노산 (예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신); 항균제; 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 아황산나트륨 및 아황산수소나트륨); 완충제 (예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 및 기타 유기산); 벌크화제 (예를 들어, 만니톨 및 글리신); 킬레이트제 (예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 및 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충진제; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물 (예를 들어, 포도당, 만노스 및 덱스트린); 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린); 착색제, 풍미제, 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온 (예를 들어, 나트륨); 보존제 (예를 들어, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 및 과산화수소); 용매 (예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜 (예를 들어, 만니톨 및 소르비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제 (예를 들어, 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80), 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 및 틸록사팔); 안정성 향상제 (예를 들어, 수크로스 및 소르비톨); 장력 향상제 (예를 들어, 알칼리금속 할로겐화물 (예를 들어, 염화나트륨 또는 -칼륨), 만니톨, 및 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제; 및 약학적 보조제가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)).
특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체 또는 기타 치료적 분자를 반감기 연장 비히클에 연결한다. 일부 예시적인 반감기 연장 비히클은 당업계에 공지되어 있다. 일부 그러한 비히클에는, Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜, 및 덱스트란이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 그러한 비히클은 예를 들어, 공개된 PCT 출원 제 WO 99/25044 호에 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 최적의 약학 조성물은 예를 들어, 의도하는 투여 경로, 전달 형식 및 희망하는 투여량에 따라, 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기 Remington's Pharmaceutical Sciences 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 상기 조성물은 중화 항체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 또는 생체 내 소멸 속도에 영향을 줄 수 있다.
특정 구현예에서, 약학 조성물 내의 1 차 비히클 또는 담체는 본래 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 통상적인 기타 물질로 보충된, 주사용수, 생리 식염수, 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 일부 예시적인 비히클에는, 중성 완충 식염수 및 혈청 알부민이 혼합된 식염수가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 약 pH 7.0 - 8.5 의 트리스 완충액, 또는 약 pH 4.0 - 5.5 의 아세트산 완충액을 포함하는데, 이는 추가로 소르비톨 또는 그에 대한 적당한 대체물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서는, 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이, ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 조성물을 동결건조된 케이크 또는 수성 용액의 형태로, 희망하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의적 제형화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조할 수 있다(상기 Remington's Pharmaceutical Sciences 참조). 특정 구현예에서는, 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 조성물을 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화할 수 있다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 비경구 전달을 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 흡입, 또는 경구와 같은 소화관을 통한 전달을 위해 선택된다. 약학적으로 허용가능한 조성물의 일부 예시적인 제조 기법은 당업자의 지식에 속한다.
특정 구현예에서, 제형 성분은 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 완충제는 조성물을 생리학적 pH 로 또는 약간 더 낮은 pH 로, 전형적으로 약 5 내지 약 8 의 pH 범위 내로 유지하는데 사용된다.
특정 구현예에서, 비경구 투여가 고려되는 경우, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클 내에서 ANGPTL3 에 대한 목적하는 항체를 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 포함하는, 발열물질-부재의, 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 비경구 주입용 비히클은 ANGPTL3 에 대한 항체가 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이, 적절하게 보존되는 멸균, 등장성 용액으로서 제형화되는 멸균 증류수이다. 특정 구현예에서, 상기 제제는 주사가능한 미세구, 생-분해성 입자, 중합체성 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 제제 (디폿 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 제어된 또는 서방성 방출을 위해 제공될 수 있음) 와 함께 목적하는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서는, 히알루론산이 또한 사용될 수 있는데, 이는 순환계에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 특정 구현예에서는, 상기 목적하는 분자를 도입하기 위해 이식가능한 약물 전달 장치를 사용할 수 있다.
특정 구현예에서는, 약학 조성물을 흡입용으로 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이, 흡입용 건성 분말로서 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 포함하는 흡입 용액을 에어로졸 전달용 추진체와 함께 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서는, 용액을 분무화할 수 있다.
특정 구현예에서는, 제제를 경구적으로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서는, 이러한 방식으로 투여되는, 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께의 또는 그것 없이의 ANGPTL3 에 대한 항체를, 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여 형태의 조제에 통상 사용되는 담체와 함께 또는 그것 없이 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서는, 생체이용률이 최대화되고, 전-전신성 분해가 최소화되는 위장관 내 지점에서 해당 제형물의 활성 부분을 방출시키도록 고안할 수 있다. 특정 구현예에서는, 임의의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 ANGPTL3 에 대한 항체의 흡수를 용이하게 하기 위해 하나 이상의 부가적인 제제를 포함시킬 수 있다. 특정 구현예에서는, 희석제, 풍미제, 저용융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕괴제 및/또는 결합제를 또한 이용할 수 있다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 유효량의 ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이, 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제를 함유한 혼합물 내에 포함한다. 특정 구현예에서는, 멸균수, 또는 또 다른 적절한 비히클 내에서 정제를 용해시킴으로써, 용액을 단위-투여 형태로 제조할 수 있다. 일부 예시적인 부형제에는, 불활성 희석제 (예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 락토스, 및 인산칼슘); 결합제 (예를 들어, 전분, 젤라틴, 및 아카시아); 및 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 탈크) 가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
서방형- 또는 제어형-전달 제형물 내에서 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 제형물을 포함하여, 추가의 약학 조성물은 당업자들에게 자명할 것이다. 일부 예시적인 서방형- 또는 제어형-전달 제형물에는, 리포좀 담체, 생-분해성 미세입자, 다공성 비드, 및 디폿 주사제가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 예시적인, 일부 제형물의 제조 기법은 당업자들에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 서방성 제제는 필름 또는 미세캡슐과 같은, 형태를 지닌 물품의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부 예시적인 서방성 매트릭스에는, 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드 (예를 들어, 미국 특허 제 3,773,919 호 및 제 EP 058,481 호 참조), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (예를 들어, 문헌 [Sidman 등 (1983) Biopolymers 22:547-556] 참조), 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (예를 들어, 문헌 [Langer 등 (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277] 및 [Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트 (상기 Langer 등 참조), 및 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988) 이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 서방성 조성물은 리포좀을 포함할 수 있는데, 이는 특정 구현예에서 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Eppstein 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692; EP 036,676; EP 088,046; 및 EP 143,949] 를 참조한다.
특정 구현예에서, 전형적으로 생체 내로 투여하기 위해 사용되는 약학 조성물은 멸균성이다. 특정 구현예에서, 멸균은 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 이루어질 수 있다. 조성물이 동결건조되는 특정 구현예에서는, 상기 방법을 이용한 멸균을 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행할 수 있다. 특정 구현예에서는, 비경구 투여용 조성물을 동결건조 형태 또는 용액 내에서 저장할 수 있다. 특정 구현예에서는, 비경구 조성물을 일반적으로 멸균 접근 포트를 가진 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 스토퍼 (stopper) 를 가진 정맥 내 용액 백 또는 바이알에 넣는다.
특정 구현예에서는, 일단 약학 조성물을 제형화하면, 그것을 용액, 현탁액, 젤, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이알 내에 저장할 수 있다. 특정 구현예에서는, 상기 제형물을 즉시-사용가능 형태 또는 투여 전에 재구성되는 형태 (예를 들어, 동결건조된 형태) 로 저장할 수 있다.
특정 구현예에서는, 단일-용량 투여 단위를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 특정 구현예에서는, 상기 키트는 각각 건조된 단백질을 가진 제 1 용기 및 수성 제형물을 가진 제 2 용기 둘 다를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서는, 단일 또는 다중-챔버 충전-전 주사기 (예를 들어, 액체 주사기 및 동결건조주사기) 를 포함하는 키트가 포함된다.
특정 구현예에서, 치료적으로 적용되는, ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 포함하는 유효량의 약학 조성물은, 예를 들어 치료의 맥락 및 목적에 따라 다를 것이다. 당업자는 일부 구현예에 따라서 치료를 위한 적절한 투여 수준이 부분적으로는 전달되는 분자, ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 사용되는 처방, 투여 경로, 및 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 기관 크기) 및/또는 상태 (연령 및 일반적인 건강상태) 에 따라 다를 것임을 인지할 것이다. 특정 구현예에서, 임상의는 최적의 치료 효과를 수득하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 특정 구현예에서, 통상적인 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라, 약 0.1 ㎍/kg (환자 체중) 내지 약 100 mg/kg 이상까지의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 5 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 의 범위 (전술한 종점 중 임의의 것 사이의 모든 점 (분획 포함) 을 포함함) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 약 10 mg/kg (체중) 내지 약 60 mg/kg (체중) 이다. 특정 구현예에서, 투여량은 약 10 mg/kg (체중), 약 20 mg/kg (체중), 약 30 mg/kg (체중), 약 40 mg/kg (체중), 약 50 mg/kg (체중), 또는 약 60 mg/kg (체중) 이다.
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 항체의 인간에 대한 용량은 상기 동일 항체의 마우스들에서의 유효한 용량에 기초하여 결정된다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 항체의 인간에 대한 용량은 문헌 ["Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers," U.S. 보건복지부, 식품의약국, 및 의약품평가연구센터 (CDER), 2005 년 7 월 (Pharmacology and Toxicology)] 을 이용하여 결정한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 항체의 인간에 대한 용량은 0.07 mg/kg 내지 7 mg/kg 이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 항체의 인간에 대한 용량은 0.1 mg/kg 내지 5 mg/kg 이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 항체의 인간에 대한 용량은 0.1 mg/kg 내지 2 mg/kg 이다. 다양한 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 중화 항체는 주 2 회, 주 1 회, 2 주마다 1 회, 또는 월 1 회로 환자에 투여된다.
특정 구현예에서, 적당한 투여량은 당업자에 의해, 예를 들어, 동물 연구를 바탕으로, 결정될 수 있다.
특정 구현예에서는, 투여 빈도는 ANGPTL3 에 대한 항체 및, 이용가능하다면, 임의의 추가의 치료제의 사용되는 제형물 내에서의 약동학적 변수를 고려할 것이다. 특정 구현예에서는, 임상의는 투여량이 목적하는 효과를 달성하는데에 이를 때까지 조성물을 투여할 것이다. 특정 구현예에서는, 따라서, 상기 조성물은 단일 용량으로서, 또는 시간의 경과에 따라 2 회 이상의 용량 (동일한 양의 목적 분자를 함유할 수도 있고 또는 그렇지 않을 수도 있음) 으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 적절한 투여량의 추가의 조정은 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무의 범위 내에 속한다. 특정 구현예에서, 적절한 투여량은 적절한 투여-반응 데이타를 사용하여 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 약학 조성물의 1 회 용량을 투여받는다. 특정 구현예에서는, 환자는 ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 약학 조성물을 일일 당 1, 2, 3, 또는 4 회 용량을 투여받는다. 특정 구현예에서는, 환자는 ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 약학 조성물을 주 당 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 회 용량을 투여받는다. 특정 구현예에서는, 환자는 ANGPTL3 에 대한 항체를 포함하는 약학 조성물을 월 당 1 또는 2 회 용량을 투여받는다.
특정 구현예에서는, 약학 조성물의 투여 경로는, 예컨대 경구, 정맥 내, 복강내, 뇌내 (뇌실질내), 측뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문정맥내, 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통해; 서방성계 또는 이식 장치에 의한 것과 같은 공지된 방법에 따른다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 일시 주사로 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은 목적하는 분자가 흡수 또는 캡슐화된 막, 스폰지 또는 또 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 특정 구현예에서는, 상기 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식될 수 있고, 목적하는 분자의 전달이 확산, 시간-방출형 볼루스, 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 포함하는 약학 조성물을 생체 외 방식으로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 그러한 경우에서, 환자로부터 적출한 세포, 조직 및/또는 기관을 ANGPTL3 에 대한 항체를 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 그것 없이 포함하는 약학 조성물에 노출시킨 후, 상기 세포, 조직 및/또는 기관을 그 후 환자에게 다시 이식한다.
특정 구현예에서는, 본원에서 기술된 방법과 같은 방법을 사용하여 해당 폴리펩티드를 발현 및 분비하도록 유전자 조작된 일부 세포를 이식함으로써, 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께인 또는 그것 없이의 ANGPTL3 에 대한 항체를 전달한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 자가, 이종, 또는 이종발생성 (xenogeneic) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 불멸화된 것일 수 있다. 특정 구현예에서는, 면역학적 반응의 기회를 감소시키기 위해, 세포를 캡슐화시켜서 주변 조직의 침윤을 피할 수 있게 한다. 특정 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로 단백질 생성물(들)의 방출은 허용하나 환자의 면역계 또는 주변 조직의 기타 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 방지하는, 생체친화성, 반-침투 중합체성 봉합물 또는 막이다.
H. 특정 검출 및 진단 방법
특정 구현예에서, ANGPTL3 에 대한 항체는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 ANGPTL3 의 존재를 검출하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 생체 내 ANGPTL3 의 수준은 지질 대사 장애와 같은 의학적 상태와 연관있으며, 그로 인해 의학적 상태의 진단을 가능하게 한다. ANGPTL3 에 대한 항체에 의해 진단될 수 있는 일부 예시적인 의학적 조건은 상기에 개시되어 있다.
일부 예시적인 검출 방법이 당업계에 알려져 있으며, ELISA, 방사면역검정, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 면역형광, 및 면역침전이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체를, 예를 들어 항체를 표지에 연결시킴으로써, 직접 검출될 수 있도록 개질시킨다. 일부 예시적인 표지에는, 형광물질, 발색단, 방사성 원자, 전자-밀집 시약, 효소 및 리간드가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체를 항체의 한 부류에 결합하는 표지된 "2 차" 항체 (예를 들어, 염소 항-마우스 항체) 를 사용하여 검출한다.
I. ANGPTL3 길항제 및 효현제에 대한 특정 스크리닝 방법
특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 결합하는 제제의 스크리닝 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 스크리닝 방법은 ANGPTL3 을 적당한 조건 하에서 하나 이상의 후보 제제에 노출시키고, ANGPTL3 의 하나 이상의 후보 제제에의 결합을 평가하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 스크리닝 방법은 경합 결합 검정에서 ANGPTL3 에 대한 항체를 사용하는 것을 포함한다. 일부 그러한 구현예에서는, ANGPTL3 에 대한 항체 및 ANGPTL3 을 포함하는 제 1 결합 혼합물을 사용한다. 상기 제 1 결합 혼합물 (M0) 내에서의 ANGPTL3 및 항체 사이의 결합량을 측정한다. 항체, ANGPTL3, 및 스크리닝되는 제제를 포함하는 제 2 결합 혼합물을 또한 사용한다. 상기 제 2 결합 혼합물 (M1) 내에서의 ANGPTL3 및 항체 사이의 결합량을 측정한다. 제 1 결합 혼합물 내에서의 결합량을 제 2 결합 혼합물 내에서의 결합량과 비교하는데, 예를 들어, M1/M0 비율을 계산함으로써 한다. 제 2 결합 혼합물 내에서의 항체의 ANGPTL3 에의 결합량이 제 1 혼합물 내에서의 항체의 ANGPTL3 에의 결합량보다 더 적다면, 제제가 ANGPTL3 에 결합할 수 있는 것으로 간주한다. 특정 구현예에서는, ANGPTL3 에 결합하는 제제는, 항체의 ANGPTL3 에의 결합을 약 10% (즉, M1/M0<0.9) 이상, 약 30% (즉, M1/M0<0.7) 이상, 약 50% (즉, M1/M0<0.5) 이상, 약 70% (즉, M1/M0<0.3) 이상, 약 80% (즉, M1/M0<0.2) 이상, 약 90% (즉, M1/M0<0.1) 이상, 또는 약 95% (즉, M1/M0<0.05) 이상 감소시킨다.
특정 구현예에서, 상기 기술된 임의의 스크리닝 방법에서 사용되는 ANGPTL3 은 ANGPTL3 의 N-말단 이중 코일 도메인 또는 그의 절편이다. ANGPTL3 의 N-말단 이중 코일 도메인 내에서 결합하는 일부 항체가 생체 내 혈청 중성 지방 및 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다는 본 출원인의 관찰을 바탕으로, ANGPTL3 의 N-말단 이중 코일 도메인에의 결합으로서 스크리닝 방법에 의해 규명되는 제제 (예를 들어, 항체 또는 비-항체 제제) 는 ANGPTL3 활성의 후보 길항제이다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 의 N-말단 이중 코일 도메인 내의 SP1 영역에의 결합으로서 스크리닝 방법에 의해 규명되는 제제 (예를 들어, 항체 또는 비-항체 제제) 는 ANGPTL3 활성의 후보 길항제이다.
특정 구현예에서, 길항제 활성은 후보 길항제가 생체 내 또는 시험관 내 검정에서 ANGPTL3 활성을 중화시킨다는 것을 나타냄으로써 증명된다. 특정 예시적인 검정들은 본원에 기술되어 있다. 당업자는 본원에 기술된 것 및/또는 당업계에 공지된 것들로부터 적절한 검정을 선택 및/또는 적합하게 변경할 수 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 의 길항제는 지질 대사 장애의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 의 피브리노겐 도메인에 결합하는 제제의 스크리닝 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 의 피브리노겐 도메인 내에서 결합하는 제제는 ANGPTL3 활성을 증진시킨다. 즉, ANGPTL3 의 피브리노겐 도메인에의 결합으로서 스크리닝 방법에 의해 규명되는 제제 (예를 들어, 항체 또는 비-항체 제제) 는 ANGPTL3 활성의 후보 효현제이다. 특정 구현예에서, 효현제 활성은, 후보 효현제가 시험관 내 또는 생체 내 검정에서 ANGPTL3 활성을 증진시킨다는 것을 나타냄으로써 증명된다. 당업자는 당업계에 공지된 검정들 및/또는 본원에 기술된 검정들을 바탕으로 적절한 검정을 선택 및/또는 적합하게 변경할 수 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 의 효현제는 암, 낭성 섬유증, 및 AIDS 와 같은 질환과 관련된 신경성 거식증, 신경성 대식증 및 악액질 (소모성) 과 같은 과도한 체중 감소와 관련된 일부 장애의 치료에 사용된다.
ANGPTL3 에의 결합에 대해 스크리닝될 수 있는 일부 예시적인 제제에는, 항체, 소분자 (예를 들어, 유기 화합물, 유기금속 화합물, 유기 및 유기금속 화합물의 염, 당류, 아미노산, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드), 앱타머 (aptamer), 펩티드, 및 펩티드 모방체가 포함되나, 이들에 제하되지는 않는다. 일부 예시적인 펩티드에는 하기가 포함된다: 랜덤 펩티드 라이브러리의 구성원 (예를 들어, 문헌 [Lam 등 (1991) Nature 354:82-84]; [Houghten 등 (1991) Nature 354:84-86] 참조) 및 D- 및/또는 L-구조 아미노산으로 이루어진 조합 화학-유도 분자 라이브러리의 구성원이 포함되나 이들에 제한되지 않는 수용성 펩티드; 무작위 또는 부분적 축퇴성의, 방향성 인산화펩티드 (phosphopeptide) 라이브러리의 구성원이 포함되나 이들에 제한되지 않는 인산화펩티드(예를 들어, 문헌 [Songyang (1993) Cell 72:767-778] 참조).
특정 구현예에서, 컴퓨터 모델링 및 검색 기술은 ANGPTL3 에 결합하는 화합물의 동정, 또는 이미 동정된 화합물의 향상을 가능하게 한다. 일부 예시적인 분자 모델링 시스템에는 CHARMM 및 QUANTA 프로그램 (Polygen Corporation, Waltham, MA) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. CHARMM 은 에너지 최소화 및 분자 동역학 기능을 수행한다. QUANTA 는 분자 구조의 구축, 그래픽 모델링 및 분석을 수행한다. QUANTA 는 분자 서로의 상호작용 구축, 개질, 시각화, 및 거동 분석을 수행한다.
J. ANGPTL3 의 핵산 길항제
특정 구현예에서는, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 단리된 핵산이 제공된다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산은 마우스 ANGPTL3 을 암호화한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산은 인간 ANGPTL3 을 암호화한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산은 안티센스 핵산이다. 일부 그러한 구현예에서, 안티센스 핵산은 RNaseH-기재 기작에 의해 표적 mRNA 의 분해를 촉진하는 단일 가닥 DNA 분자이다. 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 길이가 약 8-30 (종점 사이의 모든 점을 포함) 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 길이가 약 18 - 26 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 RNA 간섭 (RNAi)-기재 기작에 의해 표적 핵산의 발현을 감소시키는 RNA 분자를 포함한다. RNAi 에 적합한 일부 예시적인 RNA 분자에는, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (mRNA), 작은 비-코딩 RNA (tncRNA), 및 작은 조절성 RNA (smRNA) 가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 예시적인 RNAi 기작 및 RNAi 의 사용을 위한 RNA 분자에 대한 리뷰를 위해서는, 예를 들어, 문헌 [Novina 등 (2004) Nature 430:161-164] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 가 제공된다. 특정 구현예에서, siRNA 는 길이가 약 18 - 26 (종점 사이의 모든 점을 포함) 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, siRNA 는 길이가 약 20 - 24 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드, 또는 길이가 약 21 - 23 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, siRNA 는 이중-가닥 RNA 이다. 특정 구현예에서, siRNA 는 siRNA 의 안티센스 가닥에 상보적인 표적 mRNA 분자의 분해를 유도할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Novina 등 (2004) Nature 430:161-164] 를 참조한다.
안티센스 DNA 분자 또는 siRNA 와 같은 안티센스 핵산의 활성은 종종 표적 mRNA 의 2 차 구조에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 문헌 [Vickers 등 (2003) J. Biol. Chem. 278:7108-7118] 를 참조한다. 따라서, 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 염기쌍에 이용가능한 표적 mRNA 의 영역에 상보적인 것이 선택된다. 특정 구현예에서, 표적 mRNA 의 적합한 영역은 예를 들어, 다수의 안티센스 올리고뉴클레오티드의, 표적 mRNA 를 따라 다양한 영역에 혼성화되는 능력 및/또는 표적 mRNA 발현을 감소시키는 능력을 경험론적으로 시험함으로써, "유전자 워크 (gene walk)" 를 수행함으로써 동정된다. 예를 들어, 문헌 [Vickers 등 (2003) J. Biol. Chem. 278:7108-7118]; [Hill 등 (1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 21:728-737] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 표적 mRNA 에 적합한 영역은 표적 mRNA 의 임의의 기타 영역에 혼성화하지 않는 표적 mRNA 의 영역을 동정하는 mRNA 2 차 구조 예측 프로그램 또는 관련 알고리즘을 사용하여 동정된다. 예를 들어, 문헌 [Hill 등 (1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 21:728-737] 를 참조한다. 특정 구현예에서는, 상기 방법 둘 다의 조합을 사용하여, 표적 mRNA 의 적합한 영역을 동정한다. 예를 들어, 문헌 [Hill 등 (1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 21:728-737] 를 참조한다.
특정 구현예에서는, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산의 발현을 감소시킴으로써 ANGPTL3 활성을 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포 내 ANGPTL3 을 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 ANGPTL3 을 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 안티센스 핵산을 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산은 인간 ANGPTL3 을 암호화한다. 특정 구현예에서, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산은 마우스 ANGPTL3 을 암호화한다.
특정 구현예에서는, 상기 기술된 것 중 임의의 것과 같은 지질 대사 장애의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은, ANGPTL3 을 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 안티센스 핵산의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서는, 안티센스 핵산은 ANGPTL3 을 암호화하는 핵산을 발현하는 기관에 전달된다.
ANGPTL3 은 일차적으로 간에서 발현된다(Oike, Y. 등 (2005) TRENDS Mol. Med. 11(10):473-479). 마우스들에서, 발현은 단기간의 단식에 의해서는 명백히 영향받는 것으로 보이지 않는다(Oike, Y. 등 (2005) TRENDS Mol. Med. 11(10):473-479). 그러나, 콜레스테롤 공급에 의해 및 일부 비만 및 당뇨병 마우스 모델 (예컨대, db/db 및 ob/ob 마우스들), 및 스트렙토조토신-유도성 I 형 당뇨병을 가진 마우스들에서는 발현이 증가하는데, 이는 ANGPTL3 이 당뇨병 및 대사 증후군의 이상지질혈증에 기여할 수 있다는 것을 시사한다(Oike, Y. 등 (2005) TRENDS Mol. Med. 11(10):473-379). 따라서, 특정 구현예에서는, 안티센스 핵산을 간으로 전달한다. 안티센스 핵산의 생체 내 투여 및, 간과 같은 특정 기관으로의 서방성 전달을 포함한 생체 내 안티센스 핵산의 서방성 전달에 대한 특정 예시적인 지침은, 예를 들어, 문헌 [Khan 등 (2004) J. Drug Targeting 12:393-404] 에 제시되어 있다. 특정 구현예에서, 서방성 전달은 생분해성 중합체로 캡슐화되거나 또는 다르게 담겨진 안티센스 핵산을 투여함으로써 이루어진다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 폴리(글리콜산) (PLGA) 미세구 (예컨대, 0.5-20 μm; 3000 MW) 내에 담겨질 수 있다. 특정 구현예에서는, 상기 안티센스 핵산을 친지성 부분에 접합시킨다. 문헌 [Khan 등 (2004) J. Drug Targeting 12:393-404] 를 참고한다.
VI. 실시예
A. 마우스 관리 및 식이 연구
마우스 연구는 연방 지침에 따라 수행되었다. 마우스를 24℃ 에서, 고정된 12 시간 광/12 시간 암 순환으로 사육하고, 하기 지시된 바와 같이 물 및 설치류 사료 (지방으로부터의 칼로리 22%) (제품 번호 5021; Purina, St. Louis, MO) 를 임의대로 먹게 하였다. 하기에 언급되는 "단식 상태" 에 놓인 마우스는 16 시간 동안 먹이가 허용되지 않았다.
B. 마우스들에서 인간 ANGPTL3 의 생체 내 과발현
전장 인간 ANGPTL3 (서열번호: 6) 을 암호화하는 cDNA 를 아데노바이러스 벡터 pFAD 의 Ad E1-결실 영역 내로 삽입하여, 그로 인해 상기 cDNA 를 거대세포바이러스 프로모터의 제어 하에 있게 하였다. 문헌 [Hitt 등, "Construction and propagation of Human Adenovirus Vetcors, Cell Biology: A Laboratory Handbook Vol. 1, pp. 500-512 (J.E. Celis, ed., 제 2 판, 1998)] 를 참조한다. 생성된 구축물인 Ad5-hAngptl3T 를 사용하여 CHO 세포를 감염시켰다. 대조군으로서, 공 (empty) Ad5 바이러스를 또한 사용하여 CHO 세포를 감염시켰다. 감염된 CHO 세포 추출물의 웨스턴 블롯으로 인간 ANGPTL3 의 발현을 확인하였다.
Ad5-hAngptl3T 를 하기 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 C57BL/6J 마우스에 주사하였다: 2 x 109 vp, 1 x 109 vp, 5 x 108 vp, 2 x 108 vp. 대조군으로서 공 (empty) Ad5 벡터를 2 x 109 vp 로 꼬리 정맥을 통해 C57BL/6J 마우스에 주사하였다. 각 군의 마우스들은 5 마리씩이었다. 4 일 후에 아데노바이러스-감염된 마우스들로부터의 혈액 시료를 수집하였는데, 그 동안에 마우스들은 (단식되지 않고) 정상적으로 급식되었다. Cobas Integra 500 (Roche, Basel, 스위스) 을 사용하여 혈청 내 중성지방 수준을 측정하였다.
결과는 도 8 에 나타나 있다. 당해 실험에서, 2 x 109 vp 또는 1 x 109 vp 의 Ad5-hAngptl3T 가 주사된 마우스들은 공 Ad5 벡터 대조군이 주사된 마우스들과 비교할 때 혈청 중성지방 수준이 유의미하게 증가하였다.
C. 마우스 및 인간 ANGPTL3 의 제조 및 정제
재조합 마우스 ANGPTL3 을 발현하기 위해, CHO 세포에 1.5 x 1011 vp 의 재조합 아데노바이러스 Ad5-mAngptlT 를 주사하였다. Ad5-mAngptlT 는 C-말단에 His6 태그를 가진 마우스 ANGPTL3 을 발현시키는데(ANGPTL3 및 His6 태그 사이에 글리신 잔기가 포함됨), 이는 mANGPTL3T (서열번호: 2) 로 언급된다. 배지를 16 - 24 시간 후에 무혈청 배지 (EX-CELL 325-PF CHO 배지, 14335, JRH, Lenexa, KS) 로 교환하였다. 상기 조건화된 배지를 수합하고, 총 5 회의 수합 동안 매 24 - 36 시간마다 새로운 무혈청 배지로 교환하였다.
조건화된 배지 (1 L) 를 Nickel-Chelating Resin (R801-01, Invitrogen, Carlsbad, CA) 의 10 - 12 ml 컬럼 상에 로딩하였다. 상기 컬럼을 이의 5 배 부피의 세척 완충액 (10 mM 이미다졸, 20 mM Tris pH 7.8, 500 mM NaCl) 으로 세척하였다. 결합된 mANGPTL3T 를 용출 완충액 (500 mM 이미다졸, 20 mM Tris pH 7.8, 500 mM NaCl) 으로 용출하고, 일련의 1.5 ml 분획물로 수집하였다. 수집된 분획물 내 mANGPTL3T 의 존재를 웨스턴 블롯 및 간단한 블루 염색에 의해 결정하였다. mANGPTL3T 를 함유하는 분획을 함께 모으고, 분취하여, -70℃ 에서 보관하였다.
재조합 인간 ANGPTL3 을 발현시키기 위해, CHO 세포를 1.5 x 1011 vp 의 재조합 아데노바이러스 Ad5-hAngptlT 로 감염시켰다. Ad5-hAngptlT 는 C-말단에 His6 태그를 가진 인간 ANGPTL3 을 발현하는데(ANGPTL3 및 His6 태그 사이에 글리신 잔기가 포함됨), 이는 hANGPTL3T (서열번호: 4) 로 언급된다. hANGPTL3T 를 상기 mANGPTL3T 에 대해 기술된 바와 같이 발현 및 정제하였다.
D. rN'-mANGPTL3T 및 rN'-hANGPTL3T 의 제조 및 정제
마우스 ANGPTL3 의 아미노산 17 내지 240 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 pET22b(+) (Novagen) 내로 클로닝하였다. 상기 벡터는 N-말단 pelB 선도 (leader) 서열, 및 C-말단 His 태그를 암호화한다. 생성된 발현 벡터를 pET-N'-mANGPTL3T 로 칭하였다. 상기 단백질을 번역시키고, pelB 서열 의 11 개 아미노산을 제외한 모든 아미노산을 제거하면, N'-mANGPTL3T 는 서열번호: 7 에 나타난 서열을 갖는다. 상기 서열은 pelB 서열로부터의 11 개 아미노산, 이어서 마우스 ANGPTL3 의 아미노산 17 내지 240 (표 7 에서 밑줄친 부분), 이어서 2 아미노산 링커 및 His6 태그를 포함한다.
유사하게, 인간 ANGPTL3 의 아미노산 20 내지 243 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 pET22b(+) (Novagen) 내로 클로닝하였다. 상기 벡터는 N-말단 pelB 선도 서열, 및 C-말단 His 태그를 암호화한다. 생성된 발현 벡터를 pET-N'-hANGPTL3T 라 칭하였다. 상기 단백질을 번역시키고, pelB 서열의 11 개 아미노산을 제외한 모든 아미노산을 제거하면, N'-hANGPTL3T 는 서열번호: 8 에 나타난 서열을 갖는다. 상기 서열은 pelB 서열로부터의 11 개 아미노산, 이어서 인간 ANGPTL3 의 아미노산 20 내지 243 (표 7 에서 밑줄친 부분), 이어서 2 아미노산 링커 및 His6 태그를 포함한다.
N'-mANGPTL3T 또는 N'-hANGPTL3T 를 하기와 같이 대장균으로부터 발현시키고 정제하였다. 클로람페니콜 50 ㎍/ml 및 카베니실린 100 ㎍/ml 를 함유하는 LB 10 ml 에 pET-N'-mANGPTL3T 로 형질전환된 대장균의 1 개 콜로니를 접종하였다. 배양물을 37℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후, 배양물 10 ml 를 항생제가 없는 LB 500 ml 에 옮기고, OD600 이 0.6 에 도달할 때까지 (약 2 시간) 37℃ 에서 인큐베이션하였다. IPTG 를 최종 농도 1 mM 이 되도록 첨가하고, 상기 배양물을 30℃ 에서 4 시간 동안 200 rpm 으로 진탕하면서 인큐베이션하였다. 그 후, 배양물을 얼음 위에 5 분간 두었다. 세포를 JLA16.25 로터 (rotor) 내에서 8000 rpm 으로 15 분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 그 후, 상기 펠렛을 용해 완충액 (50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1% Triton X-100, 1x 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche) 및 0.25 ml PMSF (이소프로판올 중 0.1 M)) 50 ml 중에 재현탁시켰다. 그 후, 용해된 세포를 JA25.5 로터 내에서 9700 rpm 으로 30 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취하여, 추가로 SW28 로터 내에서 28,000 rpm 으로 30 분 동안 원심분리시켜 투명하게 하였다. 그 후, Probond (Ni) 크로마토그래피 (Invitrogen) 를 사용하여 상기 투명하게 된 상청액으로부터 재조합 N'-mANGPTL3T 또는 N'-hANGPTL3T 를 정제할 수 있었다.
용해된 세포를 원심분리한 후 남아 있는 불용성 펠렛으로부터 재조합 N'-mANGPTL3T 또는 N'-hANGPTL3T 를 정제하기 위해, 상기 펠렛을 30 ml 용해 완충액으로 세척하고, JA25.5 로터 내에서 9700 rpm 으로 원심분리하였다. 상기 세척 단계를 2 회 반복하여, 총 3 회 세척하였다. 그 후, 상기 펠렛으로부터의 불용성 단백질을 변성 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 6 M Guanadine HCl) 10 ml 중에 용해시켰다. 그 후, 상기 용액을 JA25.5 로터 내에서 28,000 rpm 으로 30 분 동안 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 5 ml Probond 수지 컬럼 상에 로딩하였다. 상기 컬럼을 세척 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 8 M 우레아, 15 mM 이미다졸) 50 ml 로 세척하였다. 재조합 단백질을, 세척 완충액으로부터 재생 (renaturing) 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 0.5% Tween 20) 으로 되는 50 ml 구배로 컬럼 내에서 재접힘되게 하였다. 그 후, 재조합 단백질을 용 출 완충액 (250 mM 이미다졸을 함유한 재생 완충액) 으로 용출하였다. 재조합 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 저장 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.2% Tween 20) 에 대해 투석하였다. 정제된 N'-mANGPTL3T 또는 N'-hANGPTL3T 를 분취하고, -70℃ 에서 보관하였다.
E. SP1 및 SP2-KLH 의 제조 및 정제
정제된 SP1 (서열번호:9 및 10) 및 SP2-KLH (서열번호:62) 를 Sigma Genosys (The Woodlands, Texas) 로부터 구입하였다. ANGPTL3 의 SP1 영역의 서열은 마우스 및 인간 모두에서 동일하다. SP2-KLH 는 SP1 의 COOH-말단에 시스테인을 부가한 후, 당업계에 공지된 표준 방법들을 사용하여 키홀 림펫 헤모시아닌을 상기 시스테인을 통해 상기 펩티드에 접합시켜 제조하였다.
F. Angptl3 녹아웃 마우스들에서 ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체의 생성
각각 상이한 일련의 항원 주사를 받게 한 5-8 마리 마우스들의 3 개 코호트를 사용하여, Angptl3 녹아웃 마우스들에서 인간 및 마우스 ANGPTL3 둘 다에 교차반응하는 단일클론 항체를 일으켰다. 코호트 1 은, 상기 기술된 바와 같이 제조 및 정제된 mANGPTL3T (서열번호: 2) 로 초회감작 (priming) 되었다. 코호트 1 은 또한 mANGPTL3T 로 4 회 추가접종 (boosting) 되었다. 이의 림프 조직 수집 전 마지막 추가접종은 mANGPTL3T 로 하였다. 코호트 2 는, 상기 기술된 바와 같이 제조 및 정제된 rN'-hANGPTL3T (서열번호: 8) 로 초회감작되었다. 코호트 2 는 상기 기술된 바와 같이 제조 및 정제된 rN'-mANGPTL3T (서열번호: 7) 로 1 회, 및 그 후 mANGPTL3T (서열번호: 2) 로 3 회 추가접종되었다. 이의 림프 조직 수집 전 마지막 추가접종은 hANGPTL3T (서열번호: 4) 로였다. 코호트 3 은 상기 기술된 바와 같이 제조 및 정제된 hANGPTL3T (서열번호: 4) 로 초회감작되었고, 그 후, hANGPTL3T 로 1 회 및 그 후 상기 기술된 바와 같이 제조 및 정제된 합성 펩티드 SP2-KLH (서열번호: 62) 로 2 회 추가접종되었다. 코호트 3 에서의 2 마리의 높은 역가의 동물에는 림프 조직 수집 전에 SP2-KLH (서열번호: 62) 로 마지막 추가접종을 실시하였다. 나머지 코호트 3 동물들 (코호트 4 로 언급됨) 에 대해서는 상기 기술된 바와 같이 제조 및 정제된 합성 펩티드 SP2-KLH (서열번호: 62) 로 추가로 4 회 추가접종하였다. 림프 조직 수집 전 코호트 4 에 대한 마지막 추가접종은 SP2-KLH (서열번호: 62) 로 하였다.
각각의 마우스를 하기와 같이 초회감작시키고, 추가접종하였다. 각 마우스를 완전 프로인트 면역보강제 (Complete Freund's Adjuvant) 중의 40 μg 의 정제 항원으로 복강내로 초회감작시켰다. 상기 마우스들을 2 주 후에 불완전 프로인트 면역보강제 (Incomplete Freud's Adjuvant; IFA) 중의 30 μg 의 정제 항원으로 복강내로 추가접종하고, 그 후 다시 2 주 후에 IFA 중의 20 μg 정제 항원으로 복강내로 추가접종하였다. 대안적으로는, 키토산-기재 면역보강제를 사용할 수 있다. 예컨대, U.S. 특허 제 5,912,000 호; 제 5,965,144 호; 및 제 5,980,912 호를 참고한다. 상기 두번째 추가접종 1 주일 후, 항원-코팅된 플레이트로서 mANGPTL3 을 사용하여, 후술되는 바와 같이, ELISA 로 혈청 역가를 측정하였다. 상기 두번째 추가접종 2 주일 후, 마우스들을 IFA 중의 10 μg 정제 항원으로 복강내로 추가접종하였다. 상기 세번째 추가접종 1 주일 후, 상기와 같이 ELISA 로 혈청 역가를 다시 측정하였다. 코호트 4 에 있어서는, 높은 역가에 도달할 때까지 복강내 추가접종을 계속하였다. 높은 역가 생성시에는, 초회감작 항원 (코호트 1 및 2) 또는 추가접종 항원 (코호트 3 및 4) 중 하나를 사용하여 최종 추가접종을 실시하였다. 최종 추가접종은 직전의 추가접종 후 약 2 주반 후에 실시하였는데, 이는 10 μg 정제 항원으로 정맥내로 실시하였다.
최종 추가접종 3 일 후에 상기 면역화된 마우스들로부터 비장세포를 수집하고, 융합제로서 PEG1500 을 사용하여 골수종 세포 (NSI) 와 융합시켰다. 결과적인 세포 융합 생성물을 하이브리도마 배지 내로 희석하고, 96-웰 조직 배양 플레이트 내로 시딩 (seeding) 하였다. 1 일 후, 상기 하이브리도마 배양물에 HAT 배지를 첨가하였다. 상기 배지를 필요한 대로 3 일 또는 4 일마다 교환하였다.
10 내지 14 일간의 선별 및 배양 후, ELISA 로 하이브리도마들을 스크리닝하였다. 코호트 1 의 하이브리도마는 mANGPTL3T, hANGPTL3T, 및 N'-hANGPTL3T 를 사용하여 스크리닝하였다. 코호트 2 의 하이브리도마는 mANGPTL3T 및 hANGPTL3T 를 사용하여 스크리닝하였다. 코호트 3 및 4 의 하이브리도마는 hANGPTL3T, 및 ANGPTL3 의 SP1 영역을 나타내는 합성 펩티드를 사용하여 스크리닝하였다.
ELISA 는 후술한 바와 같이 수행하였다.
G. ELISA 방법
항원에의 결합에 대해 ELISA 를 사용하여 항체를 스크리닝하였다. 각 코호트로부터의 항체를 mANGPTL3T, hANGPTL3T, N'-hANGPTL3T, 및/또는 hANGPTL3 SP1 펩티드에의 결합에 대해 스크리닝하였다. 코팅 완충액 (BupHTM 탄산염-중탄산염 완충액, Pierce #28382, Rockford, IL) 중의 mANGPTL3T, hANGPTL3T, N'-hANGPTL3T, 및/또는 hANGPTL3 SP1 펩티드의 2.5 ㎍/ml 용액을 웰 당 50 ㎕ 씩 첨가하여 4℃ 에서 하룻밤 두어 96-웰 Nunc Maxi-Sorp ImmunoPlatesTM (Nunc #446612, Roskilde, 덴마크) 를 코팅시켰다. 코팅 완충액을 제거하고, 차단 완충액 (PBS 중 1% BlockerTM BSA, Pierce #37525) 을 웰 당 250 ㎕ 씩 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 차단시켰다. 하이브리도마 상청액 (희석되지 않은 것 또는 차단 완충액 중에 희석된 것) 또는 단리된 항-ANGPTL3 항체 (희석되지 않은 것 또는 차단 완충액 중에 희석된 것) 50 ㎕ 를 상기 웰들에 첨가하고, 실온에서 1 시간 이상 동안 인큐베이션하였다. 웰들을 PBS/Tween 20 으로 4 회 세척하였다. 희석된 (1:5,000 내지 1:10,000) HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG (Pierce #31446) 100 ㎕ 를 상기 웰들에 첨가하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 웰들을 PBS/Tween 20 으로 6 회 세척하였다. TMB (테트라메틸 벤지딘) 용액 (ImmunoPure? TMB Substrate Kit, Pierce #34021) 50 ㎕ 를 웰들에 첨가하고 5 내지 10 분 동안 두어 항-ANGPTL3 항체를 검출하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 를 사용하여 450 nm 에서 분광광도법으로 플레이트들을 판독하였다.
H. 단일클론 항체들의 에피토프 매핑
1. 특정 ANGPTL3 펩티드에 대한 항체 결합
코호트 1 의 6 개 항체를, 마우스 ANGPTL3 의 N-말단으로부터의 3 가지 상이한 50 아미노산 펩티드 및 N'-mANGPTL3T 에 결합하는지에 대해 항체 포획 ELISA 로 시험하였다. 시험된 항체들은 1.251.1, 1.132.1, 1.173.2, 1.315.1, 1.424.1, 및 1.431.1 로 지정되었다. 이들 항체들은 S17-G66 펩티드 (서열번호: 11), D42-E91 펩티드 (서열번호: 12), Q67-M116 펩티드 (서열번호: 13), 및 N'-mANGPTL3T (서열번호: 7) 에 결합하는지에 대해 시험되었다.
상기 실험의 결과는 표 2 에 나타나 있다.
Figure 112009039444074-pct00003
시험된 항체 중 어느 것도 S17-G66 펩티드에 결합하지 않았다. 항체 1.251.1, 1.173.1, 1.315.1, 및 1.424.1 은 D42-E91 펩티드 및 N'-mANGPTL3T 둘 다에 결합하였다. 항체 1.173.1 은 또한 Q67-M116 펩티드에도 결합하였다. 항체 1.132.1 및 1.431.1 은 시험된 펩티드 중 어느 것에도, 또한 N'-mANGPTL3T 에도 결합하지 않았는데, 이는 이들 항체가 mANGPTL3 의 S17 내지 D240 사이의 영역 밖의 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다.
코호트 3 으로부터의 8 개 항체를, 항체 포획 ELISA 로, ANGPTL3 의 SP1 영역
Figure 112009039444074-pct00004
(서열번호:9 및 10) 및 전장 HIS-태깅된 인간 ANGPTL3T:
Figure 112009039444074-pct00005
(서열번호:4) 를 가진 합성 펩티드 (ANGPTL3 SP1 으로 언급됨) 및 전장 인간 ANGPTL3 (ANGPTL3T 를 사용하여, 상기 기술한 바와 같이 제조함) (서열번호:3) 에 결합하는지에 대해 시험하였다. 대조군으로서는 관련없는 재조합 단백질을 사용하였다.
상기 실험의 결과는 도 9 에 나타나 있다. 항체 4.1.1, 4.4.1, 4.8.1, 및 4.8.3 은 전장 ANGPTL3T 보다 ANGPTL3 SP1 에 더 잘 결합하였다. 항체 4.7.1 및 4.9.1 은 ANGPTL3 SP1 및 ANGPTL3T 둘 다에 결합하였다. 항체 4.6.3 은 전장 ANGPTL3T 에 결합하였으나, ANGPTL3 SP1 에는 결합하지 않았다. 마지막으로, 항체 4.8.2 는 대조군 단백질을 포함하여 시험된 모든 단백질들에 결합하였다.
코호트 4 로부터의 항체를 hANGPTL3T 및 hANGPTL3 SP1 펩티드 (데이타는 나타내지 않음) 에 결합하는지에 대해 시험하였다. 항체 5.35 및 5.50 은 두 항원 모두에 결합하였고, 이들은 추가의 분석을 위해 선택되었다.
2. SP1 펩티드의 알라닌-스캐닝 돌연변이생성
SP1 펩티드에 대한 알라닌-스캐닝 돌연변이생성을 사용하여 항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 에 대한 에피토프들을 추가로 규명하였다. 야생형 SP1 펩티드는 서열
Figure 112009039444074-pct00006
(서열번호: 9) 를 갖는다. 일련의 26 개 돌연변이체를 생성하였는데, 여기에서 상기 야생형 SP1 펩티드의 26 개 아미노산 각각이 표 3 에 나타난 바와 같이 알라닌으로 변경되었다:
Figure 112009039444074-pct00007
Figure 112009039444074-pct00008
"돌연변이체 7" 및 "돌연변이체 16"은 야생형 서열 내의 알라닌을 알라닌으로 "대체하였다". 따라서 이들 "돌연변이체들"은 야생형 SP1 펩티드 서열을 가져, 생성하지 않았다.
항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 을, 항체 포획 ELISA 로, 표 3 에 나타난 합성 펩티드들 ("돌연변이체 7" 및 "돌연변이체 16" 펩티드 제외) 에 결합하는지에 대해 하기와 같이 시험하였다. Flag-SUMO-SP1 유전자 카세트를 사용하여 점 돌연변이생성 PCR 로 알라닌 돌연변이체들을 생성시켰다. "Flag"는 플래그 (flag) 태그이고, "SUMO"는 소형 유비퀴틴-관련 조절자 (modifier) 이다. 각 돌연변이체를 시험관내에서 번역시키고, 항-플래그 M1 단일클론 항체로 웨스턴 블롯하여 농도를 표준화하였다. 각 돌연변이체에 대한 항체 결합을 하기와 같이 ELISA 방법으로 측정하였다. 항-플래그 M1 단일클론 항체로 코팅된 ELISA 플레이트의 웰에서 야생형 SP1 펩티드 및 각 돌연변이체 펩티드를 개별적으로 포획하였다. 그런 다음, 비오틴 부착 항체 (4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 또는 5.50) 를 상기 웰들에 첨가하였다. 상기 펩티드에 대한 항체의 결합을 HRP-접합 스트렙타비딘 (Pierce #21124) 으로 검출하였는데, 실시예 G 에 논의된 바와 같이 TMB 를 사용하여 현상하였다.
상기 실험의 결과는 도 14 에 나타나 있다. 당해 도면의 막대 그래프 각각에서, 야생형 SP1 펩티드는 "0"으로 표기되어 있는데, 각 막대 그래프의 맨 오른쪽에 위치해 있다. 항체 4.7.1 및 4.9.1 에 대한 에피토프는 당해 실험에서 SP1 펩티드의 아미노산 2 내지 6 및 9 (마우스 ANGPTL3 아미노산 33 내지 37 및 40; 인간 ANGPTL3 아미노산 33 내지 37 및 40) 를 포함하는 것으로 나타났다. 항체 5.35 및 5.50 에 대한 에피토프는 당해 실험에서 SP1 펩티드의 아미노산 3 내지 6 및 9 내지 11 (마우스 ANGPTL3 아미노산 34 내지 37 및 40 내지 42; 인간 ANGPTL3 아미노산 34 내지 37 및 40 내지 42) 을 포함하는 것으로 나타났다. 항체 4.8.3 에 대한 에피토프는 당해 실험에서 SP1 펩티드의 아미노산 3 내지 6, 9, 및 11 (마우스 ANGPTL3 아미노산 34 내지 37, 40, 및 42; 인간 ANGPTL3 아미노산 34 내지 37, 40, 및 42) 을 포함하는 것으로 나타났다. 따라서, 중화 항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 은 모두 ANGPTL3 의 아미노산 34 내지 37 및 40 을 포함하는 ANGPTL3 의 SP1 영역 내의 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다.
I. 아이소타입 결정
항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50, 및 1.315.1 의 아이소타입을 표준 방법에 의해 결정하였다. 4.7.1 및 5.50 은 IgG2b 아이소타입이고, 4.8.3, 1.315.1, 및 5.35 는 IgG2a 아이소타입이고, 4.9.1 은 IgG1 아이소타입이었다.
IgG2b 항체의 혈청내 예상 반감기는 3 내지 3.5 일이다. IgG2a 항체의 혈청내 예상 반감기는 6 내지 12 일이다. IgG1 항체의 혈청내 예상 반감기는 8 내지 11 일이다.
J. ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체의 생체 내 투여
ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체들을 마우스에 투여하여, 상기 항체들이 마우스에서 중성지방 및/또는 콜레스테롤 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있는지 측정하였다. 첫번째 실험에서는, 표준 식이가 공급된 8 주령의 C57 알비노 (albino) 마우스들 ("사료 공급" 마우스들) 에 체중 1 g 당 10 μl 부피 중의 단일클론 항체 30 μg 를 주사하였다. 당해 실험에서 시험된 항-ANGPTL3 항체는 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1 이었다. 대조군으로서 항-KLH 항체를 투여하였다. 각 항체별로 5 마리의 마우스들에 주사하였다. 4 일 후에 중성지방 및 콜레스테롤의 급식 및 단식시 혈청 수준을 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 1 및 2 에 나타나 있다. 도 1 은 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 및 항-KLH 이 투여된 마우스들에서 4 일 후의 급식 및 단식시의 중성지방 수준을 보여준다. 항체 4.7.1 을 정제하자, 2 개의 피크가 수집되었다. 이들 피크 각각을 상기 마우스들에 따로따로 투여하였다(4.7.1-P1 및 4.7.1-P2). 4 가지의 항-ANGPTL3 항체 모두 항-KLH 투여된 마우스들과 비교할 때 급식 상태의 마우스들의 혈청 중성지방 수준을 통계적으로 유의하게 감소시켰다. 그러나, 당해 실험에서, 항-ANGPTL3 항체 중 어느 것도 단식 상태의 마우스들의 혈청 중성지방 수준을 감소시키지 않았다. 실제로, 항체 4.7.1 은 당해 실험에서 단식 마우스들의 혈청 중성지방 수준을 증가시켰다.
도 2 는 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 및 항-KLH 가 투여된 마우스들에서 4 일 후의 급식 및 단식시 콜레스테롤 수준을 보여준다. 상기와 같이, 항체 4.7.1 에 대한 2 개의 별개의 피크를 당해 실험에서 시험하였다. 다시, 모든 항체는 항-KLH 투여 마우스들과 비교할 때 급식 상태의 마우스들의 혈청 콜레스테롤 수준을 통계적으로 유의하게 감소시켰다. 그러나, 당해 실험에서, 항-ANGPTL3 항체 중 어느 것도 단식 상태의 마우스들의 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시키지 않았다.
두번째 실험에서는, 사료 공급 8 주령 C57 알비노 마우스들에 체중 1 g 당 10 μl 부피 중의 단일클론 항체 30 μg 을 주사하였다. 당해 실험에서는 항-ANGPTL3 항체 4.8.3 을 시험하였다. 대조군으로서는 항-KLH 항체를 투여하였다. 부가적으로, 비교를 위해서 항-ANGPTL4 항체 14D12 를 시험하였다. 예컨대, PCT 공개공보 제 WO 2006/074228 호를 참조한다. 각 항체별로 5 마리의 마우스들에 주사하였다. 4 일 후에 중성지방 및 콜레스테롤의 급식 및 단식시 혈청 수준을 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 3 및 4 에 나타나 있다. 도 3 은 항-ANGPTL3 항체 4.8.3, 항-ANGPTL4 항체 14D12, 또는 항-KLH 항체가 투여된 마우스들에서의 급식 및 단식시의 혈청 중성지방 수준을 보여준다. 당해 실험에서, 4.8.3 은 급식 및 단식시 마우스 모두에서 혈청 중성지방 수준을 통계적으로 유의한 정도로 감소시켰다. 한편, 항체 14D12 는, 당해 실험에서 단식 마우스들에서만 혈청 중성지방 수준을 통계적으로 유의한 정도로 감소시켰다.
도 4 는 항-ANGPTL3 항체 4.8.3, 항-ANGPTL4 항체 14D12, 또는 항-KLH 항체가 투여된 마우스들에서 급식 및 단식시의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다. 당해 실험에서, 4.8.3 은 급식 및 단식 마우스 모두에서 혈청 콜레스테롤 수준을 통계적으로 유의한 정도로 감소시켰다. 한편, 항체 14D12 는, 당해 실험에서 단식 마우스들에서만 혈청 콜레스테롤 수준을 통계적으로 유의한 정도로 감소시켰다.
세번째 실험에서는, 표준 식이가 공급된 8 주령 C57 알비노 마우스들 ("사료 공급" 마우스들) 에 체중 1 g 당 10 μl 부피 중의 단일클론 항체 30 μg 을 주사하였다. 당해 실험에서 시험된 항-ANGPTL3 항체는 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1 이었다. 대조군으로서는 항-KLH 항체를 투여하였다. 부가적으로, 비교를 위해 항-ANGPTL4 항체 14D12 를 시험하였다. 각 항체별로 10 마리의 마우스들에 주사하였다. 4 일 후에 중성지방 및 콜레스테롤의 급식 및 단식시 혈청 수준을 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 5 및 6 에 나타나 있다. 도 5 는 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 14D12, 및 항-KLH 가 투여된 마우스들에서 4 일 후의 급식 및 단식시 중성지방 수준을 보여준다. 항-ANGPTL3 항체 4.8.3 및 4.9.1 은 당해 실험에서 급식 상태의 마우스들의 혈청 중성지방 수준을 통계적으로 유의하게 감소시켰다. 항체 4.7.1 이 급식 상태에서의 중성지방을 감소시키지 못한 것은, 부분적으로는, 그것이 IgG2b 항체였기 때문일 수 있는데, 이는 혈청에서의 예상 반감기가 3 내지 3.5 일밖에 되지 않는다. 항-ANGPTL3 항체 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1, 및 항-ANGPTL4 항체 14D12 는 당해 실험에서 단식 상태의 마우스들의 혈청 중성지방 수준을 감소시켰다.
도 6 은 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 14D12, 및 항-KLH 가 투여된 마우스들에서 4 일 후의 급식 및 단식시 콜레스테롤 수준을 보여준다. 항-ANGPTL3 항체 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1, 및 항-ANGPTL4 항체 14D12 는 당해 실험에서 급식 상태의 마우스들의 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시켰다. 그러나, 당해 실험에서는, 항-ANGPTL3 항체 4.9.1 및 항-ANGPTL4 항체 14D12 만이 단식 상태의 마우스들의 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시켰다.
네번째 실험에서는, 표준 식이가 공급된 8 주령 C57 알비노 마우스들 ("사료 공급" 마우스들) 에 체중 1 g 당 10 μl 부피 중의 단일클론 항체 30 μg 을 주사하였다. 당해 실험에서 시험된 항-ANGPTL3 항체는 1.125.1, 1.132.1, 1.173.2, 1.315.1, 1.424.1, 및 1.431.1 이었다. 대조군으로서는 항-KLH 항체를 투여하였다. 각 군에는 5 마리의 마우스들이 존재하였다. 4 일 후 및 8 일 후에 중성지방의 급식 및 단식시 혈청 수준을 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 7 에 나타나 있다. 당해 실험에서, 1.315.1 은 4 일 및 8 일 후 모두에서 혈청 중성지방을 통계적으로 유의한 정도로 감소시켰다.
다섯번째 실험에서는, 표준 식이가 공급된 8 내지 10 주령의 C57 알비노 마우스들 ("사료 공급" 마우스들) 에 체중 1 g 당 10 μl 부피 중의 단일클론 항체 0 μg, 3 μg, 10 μg, 30 μg, 또는 90 μg 을 주사하였다. 당해 실험에서 시험된 항-ANGPTL3 항체는 5.35 및 5.50 이었다. 각 용량의 각 항체별로 5 마리의 마우스들에 주사하였다. 4 일 후 및 7 일 후에 중성지방 및 콜레스테롤의 급식시 혈청 수준을 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 15 및 16 에 나타나 있다. 도 15 는 다양한 양의 항체 5.35 및 5.50 이 주사된 마우스들에서 4 및 7 일 후의 혈청 중성지방을 보여준다. 당해 실험에서, 항체 5.35 및 5.50 둘 다 30 mg/kg 또는 90 mg/kg 의 항체가 주사된 마우스들에서 4 일 후에 혈청 중성지방을 감소시켰다. 항체 5.50 은 또한 당해 실험에서 3 mg/kg 또는 10 mg/kg 의 항체가 주사된 마우스들에서 4 일 후에 혈청 중성지방을 감소시켰다. 당해 실험에서 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 90 mg/kg 의 항체 5.50 이 주사된 마우스들에서는 혈청 중성지방이 7 일 후에도 여전히 감소되어 있었지만, 항체 5.35 에 있어서는 90 mg/kg 이 주사된 마우스들만이 7 일 후에 감소된 혈청 중성지방을 유지하였다.
도 16 은 다양한 양의 항체 5.35 및 5.50 이 주사된 마우스들에서 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다. 당해 실험에서, 30 mg/kg 또는 90 mg/kg 의 항체 5.35, 또는 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 90 mg/kg 의 항체 5.50 이 주사된 마우스들은 4 일 후에 감소된 혈청 콜레스테롤 수준을 가졌다. 90 mg/kg의 항체 5.35 또는 90 mg/kg 의 항체 5.50 이 주사된 마우스들은 7 일 후에도 감소된 혈청 콜레스테롤 수준을 유지하였다.
K. ApoE 녹아웃 마우스들에서 ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체의 투여
ApoE 녹아웃 마우스에서는 자발성 고콜레스테롤혈증이 발병하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Piedrahita 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(10):4471-5]; 및 [Zhang 등 (1992) Science 258(5081):468-71] 을 참조한다. ANGPTL3 에 대한 특정 단일클론 항체가 ApoE 녹아웃 마우스에서 혈청 콜레스테롤 및 중성지방 수준을 감소시킬 수 있는지 알아보기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 14-주령 ApoE 녹아웃 마우스 (Taconic Aminal Models, 계통 B6.129P2-Apoe tm1Unc N11) 8 마리로 된 3 개의 군에 30 mg/kg 항-KLH, 30 mg/kg 항체 5.35, 또는 30 mg/kg 항체 5.50 을 복강내 주사하였다. 각각의 마우스는 제 0 일에 1 회 및 제 4 일에 1 회 주사되었다. 모든 마우스들에 표준 식이가 공급되었다("사료 공급"). 제 0 일 (주사 전), 제 4 일, 제 8 일, 및 제 12 일에 각 마우스에서 급식시 혈청 중성지방 수준 및 급식시 콜레스테롤 수준을 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 19 에 나타나 있다. 항체 5.35 는 제 4 일까지 혈청 중성지방 수준을 36% 감소시켰다. 상기 감소는 제 8 일까지 지속되었으나, 제 12 일에는 사라졌다. 항체 5.50 은 제 4 일까지 혈청 중성지방 수준을 60% 감소시켰다. 상기 감소는 제 8 일까지 지속되었고, 혈청 중성지방은 제 12 일까지 유의하게 감소된 상태로 남아있었다.
항체 5.35 는 당해 실험에서 혈청 콜레스테롤 수준을 17% 감소시켰으나, 그같은 감소가 제 8 일까지는 이루어지지 않았으며, 상기 감소는 제 12 일에는 다소 줄어들었다. 항체 5.50 은 제 4 일까지 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시켰고, 제 8 일 및 제 12 일까지 혈청 콜레스테롤 수준을 계속해서 감소시켜, 당해 실험 종료시에는 총 감소가 30% 에 달했다.
이러한 결과들은 항체 5.35 및 5.50 이 ApoE 마우스에서 혈청 중성지방 수준 및 혈청 콜레스테롤 수준을 모두 감소시켰다는 것을 나타내었다. 항체 5.50 은 당해 실험에서 혈청 중성지방 수준 및 혈청 콜레스테롤 수준을 모두 감소시키는데 더욱 효과적이었는데, 이는 상기 항체의 반감기가 더욱 긴 것에 기인한 것일 수 있다.
L. ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체의 시험관내 투여
LPL 활성에 대한 마우스 단일클론 항-ANGPTL3 의 영향을 시험관내 검정을 사용하여 시험하였다. LPL-조건화된 배지를 수득하기 위해, HEK293F 세포 (FreeStyle™ 293 발현 시스템) (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 IRES puro 플라스미드 (Clontech, Mountain View, CA) 에서 C-말단 FLAG 태그를 가진 LPL 을 암호화하는 DNA 를 포함한 LPL 발현 벡터로 트랜스펙션하였다.
형질전환된 세포를 선택 배지 (1X 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 2.4 μg/ml 의 퓨로마이신이 보충된 FreeStyle™ 293 System 배지 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)) 에서 배양하였다. 세포를 계수하고, 원심분리로 펠렛화하였다. 생성된 세포 펠렛을, 1x GPS 가 함유된 퓨로마이신 부재의 새로운 FreeStyle™ 293 배지에 1x106 세포/ml 의 농도로 재현탁시켰다. 48 시간 인큐베이션 후에, 상기 세포로부터 LPL 이 함유된 조건화된 배지를 수합하고, 5 ml 분취물로 배분한 후, 사용시까지 -70℃ 에서 동결하였다.
상기 조건화된 배지의 분취물들에 200 mg/dL Intralipid? (Pharmacia & Upjohn), 12 mM 포도당, 5 단위/ml 헤파린 및 200 μl 5% 마우스 혈청 (Apo C-II 의 공급원으로서) 을 첨가하여 조건화된 배지 중에서의 LPL 활성을 분석하였다. 상기 배지를 그 후 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 2 시간째, 4 시간째, 및 6 시간째에 시료를 수집하여, 즉시 -70℃ 에서 동결시켜, 검정 수행시까지 유지하였다. 희석하지 않은 조건화된 배지 및 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 및 1:32 희석물을 사용하여 FFA 수준을 측정하여 LPL 조건화된 배지에 대해 LPL 활성을 분석하였다. 2 시간째, 4 시간째, 및 6 시간째에 Wako FFA 키트 (Wako Chemical USA, Inc., Richmond, VA) 를 사용하여 FFA 수준을 측정하였다.
LPL 활성에 대한 시험관내 검정에서 단일클론 항체가 ANGPTL3 활성을 중화시키는 능력을 또한 측정하였다. LPL 활성에 대한 시험관내 검정은 Wako FFA 키트 (Wako Chemical USA, Inc., Richmond, VA) 를 사용하여 FFA 수준을 측정한다. 별도의 LPL 활성 검정을 25 nM 마우스 ANGPTL3 및 각각 4 가지 농도 (0.8 μg/ml, 2 μg/ml, 10 μg/ml 및 50 μg/ml) 의 5 가지 단일클론 항체 (항체 4.9.1, 4.8.3, 1.315.1, 4.7.1, 및 1.173.2) 의 존재 하에서 수행하였다. 결과는 도 12 에 나타나 있다. 각 항체에 있어서, 중화 활성은, LPL 활성을 증가시키는, 즉, ANGPTL3 에 의한 억제로부터 LPL 을 "구출하는" 항체의 능력으로 증명된다. 구출 활성은, ANGPTL3 이 단독으로 존재할 때의 LPL 활성과 비교하여 ANGPTL3 및 항-ANGPTL3 항체 둘 다 존재시 LPL 활성의 증가 백분율로 측정하였다. 4 가지 항체 (4.9.1, 4.8.3, 1.315.1 및 4.7.1) 는, 농도에 따라서는 50% 넘게, LPL 활성을 구출할 수 있었다. 이러한 결과는 이들 항체가 ANGPTL3 활성을 중화함으로써 LPL 활성을 구출할 수 있었음을 나타낸 것이다. 대조적으로, 항체 1.173.2 는 LPL 활성에 대한 유의한 구출을 나타내지 않았는데, 그렇기 때문에, 내부 음성 대조군으로 소용되었다.
M. ANGPTL3 에 대한 단일클론 항체의 결합 친화력
N'-hANGPTL3T 및 hANGPTL3T 에 대한 항체 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1 의 친화 상수 및 SP1 펩티드에 대한 항체 4.7.1, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 의 친화 상수를 BIACORE? 3000 시스템 (GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 을 사용하여 측정하였다. BIACORE? 3000 은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 검출 및 정량화하는 실시간 생체분자 분석 시스템이다. BIACORE? 3000 시스템에 대한 제조업자의 지시사항에 따라 하기 친화 상수들을 측정하였다: 평형 해리 상수 (KD), 결합 속도 상수 (kon), 및 해리 속도 상수 (koff).
N'-hANGPTL3T 및 hANGPTL3T 단백질 항원들에 대한 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1 항체의 친화 상수를 각각 하기와 같이 측정하였다. Amine Coupling Kit (제품 번호: BR-1000-50, GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 를 사용하여 N'-hANGPTL3T 10 μg/ml 또는 hANGPTL3T 20 μg/ml 중 하나를 칩 표면에 커플링시켜 BIACORE CM5 칩 표면을 단백질 항원으로 코팅시켰다. 해당 항체의 Fab 절편 (Fab Preparation Kit (제품 번호: 44885, Pierce, Rockford, IL 61105) 를 제조업자의 지시사항에 따라 사용하여 생성시킴) 을 칩 표면 코팅된 BIACORE? 3000 시스템 내로 30 μl/분의 유속으로 2 분간 최초 주입하여 kon 및 koff 상수들을 결정하는데 사용되는 결합 및 해리 상 (phase) 들을 생성시켰다. 시험된 Fab 절편의 농도는 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM, 1.5625 nM, 0.78125 nM, 및 0 nM 이었다. 상기 주입 상 (injection phase) 을 사용하여 결합 속도 상수, 또는 kon 을 결정하였다. 각각의 주입 후, 상기 BIACORE CM5 칩 표면 상의 항원-Fab 복합체에 대해 BIACORE HBS-EP 완충액 (제품 번호: BR-1001-88, GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 을 5 분간 흘려주어 Fab 절편을 단백질 항원으로부터 해리시켰다. 이러한 해리 상을 사용하여 해리 속도 상수, 또는 koff 를 결정하였다. 다음 주입 전에, 10 mM HCl 을 100 μl/분의 유속으로 30 초간 주입하여 BIACORE 칩 표면을 재생시켰다. 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1 표면의 Fab-특이적 결합 프로필로부터 (등가의 수준의 관련없는 단백질이 고정화된) 참조 표면의 비특이 결합 프로필을 제하여 데이타 분석을 위한 BIACORE 센소그램 (sensogram) 을 생성시켰다. BIAevalution 소프트웨어 버전 3.0 (GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 을 사용하여 물질 이동 교정 (mass transfer correction) 으로 결합 및 해리 데이타 세트들을 1:1 결합 모델에 전체적으로 맞춤으로써 KD, kon, 및 koff 값들을 비롯한 친화력 변수들을 결정하였다.
SP1 펩티드 항원에 대한 4.7.1, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 항체의 친화 상수는 각각 하기와 같이 결정하였다. Amine Coupling Kit (제품 번호: BR-1000-50, GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 를 사용하여 90 μg/ml 의 ImmunoPure 염소 항-마우스 IgG Fc (제품 번호: 31170, Pierce, Rockford, IL 61105) 를 칩 표면에 커플링시켜 BIACORE CM5 칩 표면을 항-마우스 IgG Fc 로 코팅시켰다. 그런 다음, 상기 항체를 10 μl/분의 유속으로 30 초간 주입하여 상기 항체를 항-마우스 IgG Fc BIACORE 칩 표면 상에서 포획하였다. SP1 펩티드를 항체-코팅된 칩 표면을 가진 BIACORE? 3000 시스템 내로 30 μl/분의 유속으로 2 분간 최초 주입하여 kon 및 koff 상수들을 결정하는데 사용되는 결합 및 해리 상들을 생성시켰다. 시험된 SP1 펩티드의 농도는 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM, 1.5625 nM, 0.78125 nM, 및 0 nM 이었다. 상기 주입 상을 사용하여 결합 속도 상수, 또는 kon 을 결정하였다. 각각의 주입 후, 상기 BIACORE CM5 칩 표면 상의 펩티드-항체 복합체에 대해 BIACORE HBS-EP 완충액 (제품 번호: BR-1001-88, GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 을 5 분간 흘려주어 SP1 펩티드를 상기 항체로부터 해리시켰다. 이러한 해리 상을 사용하여 해리 속도 상수, 또는 koff 를 결정하였다. 다음 주입 전에, 10 mM HCl 을 100 μl/분의 유속으로 30 초간 주입하여 BIACORE 칩 표면을 재생시켰다. 4.7.1, 4.9.1, 5.35 및 5.50 표면의 항원-특이적 결합 프로필로부터 (등가의 수준의 관련없는 마우스 IgG 를 포획한) 참조 표면의 비특이 결합 프로필을 제하여 데이타 분석을 위한 BIACORE 센소그램을 생성시켰다. BIAevalution 소프트웨어 버전 3.0 (GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 을 사용하여 물질 이동 교정으로 결합 및 해리 데이타 세트들을 1:1 결합 모델에 전체적으로 맞춤으로써 KD, kon, 및 koff 값들을 비롯한 친화력 변수들을 결정하였다.
상기 실험의 결과는 표 4, 5 및 6 에 나타나 있다. 각 항체를 이중으로 시험하였고, 각 실험에 대한 결과를 나타내었다.
Figure 112009039444074-pct00009
Figure 112009039444074-pct00010
Figure 112009039444074-pct00011
N. ANGPTL3 에 대한 특정 단일클론 항체의 생체 내 약동학
생체 내에서의 이들 항체들 (항체 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1) 의 약동학을 알아보기 위해, 각각을 4 마리의 상이한 마우스들에 개별적으로 kg 당 30 mg 의 용량으로 복강내 주사로 투여하였다. 도 13 에 나타난 시점들에서, 상기 마우스들을 출혈시켜, 혈청을 수득하였다. 항체 포획 ELISA 로 측정한 역가를, 상기 마우스 내로 주입한 동일 항체의 계단 희석물들을 항체 포획 ELISA 에서 사용하여 확립한 표준 곡선과 비교하여, 혈청 내 존재하는 항-ANGPTL3 항체의 수준을 측정하였다. 상기 항체 포획 ELISA 는 실시예 G 에 기술된 바와 같이 수행되었다. 결과는 도 13 에서 확인할 수 있다.
생체 내 항체 5.35 및 5.50 의 약동학을 알아보기 위해, 실시예 J, 다섯번째 실험에 기술된 마우스들에서, 주사 후 4 일, 7 일, 및 12 일째에 항체 수준을 측정하였다. 혈청 내 존재하는 항-ANGPTL3 항체의 수준은, 재조합 인간 ANGPTL3-코팅된 플레이트를 사용하여 항체 포획 ELISA 로 측정하였다. 혈청 내 항체의 농도는, 상기 마우스 내로 주입한 동일 항체의 계단 희석물들을 항체 포획 ELISA 에서 사용하여 확립한 표준 곡선과 비교하여 결정되었다. ELISA 는 실시예 G 에 기술된 바와 같이 수행되었다.
상기 실험의 결과는 도 17 에 나타나 있다. 당해 실험에서, 항체 5.50 은 생체 내에서의 반감기가 항체 5.35 보다 더 길었다. 더 긴 반감기는 실시예 J 에서 논의된 실험에서, 및 도 15 및 16 에 나타난 바와 같이 항체 5.35 와 비교하여 항체 5.50 의 생체 내 효능이 증가된 것과 연관되었다.
30 mg/kg 항체 단일 주사 후 C57 마우스들에서의 항체 4.7.1, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 의 약동학이 도 18 에 나타나 있다. 항체 농도는 항체 포획 ELISA 로 결정되었는데, 이는 실시예 G 에 기술된 바와 같이 수행되었다. 혈청 내 항체의 농도는, 상기 마우스 내로 주입한 동일 항체의 계단 희석물들을 항체 포획 ELISA 에서 사용하여 확립한 표준 곡선과 비교하여 결정되었다. 당해 실험에서, 항체 5.50 및 4.9.1 은 대략 등가의 반감기를 가졌다. 또한, 항체 5.50 및 4.9.1 의 반감기는 항체 5.35 및 4.7.1 의 반감기들보다 더 길었는데, 이들은 당해 실험에서 서로 대략 등가이었다. 나아가, 항체 5.35 및 5.50 의 Cmax 는 대략 등가이었고, 항체 4.9.1 의 Cmax 보다 더 컸는데, 항체 4.9.1 의 Cmax 는 또한 당해 실험에서 항체 4.7.1 의 Cmax 보다 더 컸다.
O. ANGPTL3 에 대한 특정 단일클론 항체들의 서열
항체 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 및 5.50 의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 결정하였다. 항체 4.7.1 의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 19 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 20 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 4.7.1 의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 28 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 4.8.3 의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 21 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 22 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 4.8.3 의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 29 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 30 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 4.9.1 의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 23 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 24 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 4.9.1 의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 31 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 32 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 5.35 의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 63 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 64 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 5.35 의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 67 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 68 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 5.50 의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 65 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 66 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다. 항체 5.50 의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 69 (N-말단 신호 펩티드 존재) 및 서열번호: 70 (N-말단 신호 펩티드 부재) 에 나타나 있다.
항체 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1 의 중쇄 가변 영역들을 정렬시킨 것이 도 10 에 나타나 있다. 상기 중쇄 가변 영역들의 공통 서열 역시 나타나 있다(서열번호: 25). 신호 펩티드가 없는 중쇄 가변 영역들의 공통 서열은 표 7 (서열번호: 26) 에 나타나 있다.
항체 4.7.1, 4.8.3, 및 4.9.1 의 경쇄 가변 영역들을 정렬시킨 것은 도 11 에 나타나 있다. 경쇄 가변 영역들의 공통 서열 또한 나타나 있다(서열번호: 33). 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역들의 공통 서열은 표 7 (서열번호: 34) 에 나타나 있다.
P. ANGPTL3 에 대한 특정 단일클론 항체들의 인간화
하기 프로토콜은 항체 4.7.1 의 인간화를 기술한다. 항체 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50, 및 1.315.1 도 동일한 방법으로 인간화할 수 있다. 항체 4.7.1 의 인간화된 형태는 "hu4.7.1"로 언급된다. 항체 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50, 및 1.315.1 의 인간화된 형태는, 각각 "hu4.8.3," "hu4.9.1," "hu5.35," "hu5.50," 및 "hu1.315.1"로 언급된다.
항체 4.7.1 에 존재하는 마우스 구조형성 영역들에 대한 이들의 상동성에 기초하여 군집-특이적 (family-specific) 공통 인간 구조형성 영역들의 집합으로부터 중쇄 및 경쇄 각각에 대한 인간 구조형성 영역들을 선택하였다. 선택된 V-유전자 군집 내에서 구조형성 다양성을 반영하기 위해, 선택된 인간 구조형성 영역들을 특이적인 아미노산 위치들에서 다양화하였다. 항체 4.7.1 의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들을 상기 중쇄에 대한 상기 다양화된 인간 구조형성 영역들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리 내로 클로닝하였다. 생성된 라이브러리를 인간화된 4.7.1 중쇄 가변 영역 라이브러리로 지칭하였다. 항체 4.7.1 의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들을 상기 경쇄에 대한 다양화된 인간 구조형성 영역들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리 내로 클로닝하였다. 생성된 라이브러리를 인간화된 4.7.1 경쇄 가변 영역 라이브러리로 지칭하였다. 상기 인간화된 4.7.1 중쇄 가변 영역 라이브러리 및 인간화된 4.7.1 경쇄 가변 영역 라이브러리를 단일 사슬 Fv (scFv) 형식으로 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다.
상기 scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 그 후 2-3 차례의 결합을 통해 표적 항원, 예컨대, 인간 ANGPTL3 에 대해 스크리닝하여, 고 친화력 scFv 를 선별하였다. 상기 scFv 를 그 후 가용성 형태로 발현시키고, 표적 친화력 및/또는 시험관내 중화 효력에 대해 시험하였다. 적합한 친화력 및 효력이 있는 것으로 선별된 scFv 의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 그 후 전장 IgG 로서 또는 scFv-CL-PEG (CL 은 인간 불변 경쇄임) 로서 발현시키고, 생체 내 활성, 예컨대, 마우스에서의 혈청 중성지방 및/또는 혈청 콜레스테롤 감소에 대해 시험하였다. PEG 는 상기 CL 기 상의 시스테인을 통해 부착시켰다.
Q. ANGPTL3 에 대한 특정 단일클론 항체들의 친화력 성숙화
하기 프로토콜은 항체 4.7.1 의 친화력 성숙화를 기술한다. 항체 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50, 및 1.315.1 의 친화력 성숙화는 동일한 방법을 사용하여 수행가능하다. 유사하게, hu4.7.1, hu4.8.3, hu4.9.1, hu5.35, hu5.50, 및 hu1.315.1 의 친화력 성숙화도 동일한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
항체 4.7.1 의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해, 예컨대, 실수-유발 PCR 을 사용하여, 무작위 돌연변이생성을 가할 수 있다. 실수-유발 PCR 은 GeneMorph? II Random Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) 를 제조업자의 지시사항에 따라 사용하여 수행하였다.
항체 4.7.1 의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해, 예컨대, 실수-유발 PCR 을 사용하여, 무작위 돌연변이생성을 가하였다. 실수-유발 PCR 은 GeneMorph? II Random Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) 를 제조업자의 지시사항에 따라 사용하여 수행하였다. 상기 무작위 돌연변이된 중쇄 폴리뉴클레오티드 및 무작위 돌연변이된 경쇄 폴리뉴클레오티드를 단일 사슬 Fv (scFv) 형식으로 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다.
상기 scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 그 후 2-3 차례의 결합을 통해 표적 항원, 예컨대, 인간 ANGPTL3 에 대해 스크리닝하여, 고 친화력 scFv 를 선별하였다. 상기 scFv 를 그 후 가용성 형태로 발현시키고, 표적 친화력 및/또는 시험관내 중화 효력에 대해 시험하였다. 적합한 친화력 및 효력이 있는 것으로 선별된 scFv 의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 그 후 전장 IgG 로서 또는 scFv-CL-PEG 로서 발현시키고, 생체 내 활성, 예컨대, 마우스에서의 혈청 중성지방 및/또는 혈청 콜레스테롤 감소에 대해 시험하였다.
선별된 친화력 성숙화된 항체가 이미 인간화된 것이 아니라면, 이를 그 후 상기 실시예 P 에 기술된 바와 같이 인간화할 수 있다.
상시 실시예들이 특히 마우스 ANGPTL3 에 대한 특정 중화 단일클론 항체 및 마우스들에서 이들 항체의 생체 내 효과를 기술하지만, 당업자는 인간 ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체가 생성될 수 있고, 이러한 항체가 인간에서 동일 또는 유사한 생체 내 효과를 가질 것이라는 것을 쉽게 인지할 것이다. 그와 같은 결론은, 부분적으로는, 인간 및 마우스 ANGPTL3 이 구조 및 기능상의 특징들을 공유하는 진화적으로 보존된 단백질이라는 관찰에 기초한다(Conklin, D., 등 (1999) Genomics 62:477-482). 예를 들어, 인간 및 마우스 ANGPTL3 은 약 76% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 인간 및 마우스 ANGPTL3 은 또한 공통된 2차 구조 요소, 예컨대, N-말단 이중코일 도메인 및 C-말단 피브리노겐-유사 도메인을 공유한다. 나아가, 인간 ANGPTL3 은 마우스들에서 과발현시 혈청 지질 수준을 높이는 능력으로 입증된 바, 인간 ANGPTL3 은 마우스 ANGPTL3 과 유사한 기능을 갖고 있다(Koishi 등 (2002) Nat. Genet. 30(2):151-157).
마우스들이 중화 항체를 사용하는 각종 상태 및 질환 치료에 대한 모델로서 일상적으로 사용된다는 것은 당업계에 일반적으로 인지되고 있다. 예를 들어, 중화 항체는 마우스에서 프리온 (prion) 질환, 당뇨병, 및 염증을 치료하는데 사용되어 왔다. 예컨대, 문헌 [White 등 (2003) Nature 422:80-83]; [Cailleau 등 (1997) Diabetes 46:937-940]; 및 [Lochner 등 (2002) J. Immunol. Methods 259:149-157] 을 참조한다. 맨 마지막의 연구에서는, IL-18 결핍 마우스에서 마우스 IL-18 을 중화시키는 단일클론 항체를 일으켰다. 이들 마우스 단일클론 항체들은 야생형 마우스에서 지질다당체-유도성 염증 반응을 억제할 수 있었다. 따라서, 당업자는 전술한 실시예들이 인간의 의학적 상태의 치료에서 인간 ANGPTL3 에 대한 중화 단일클론 항체의 사용을 뒷받침한다는 결론을 내릴 수 있을 것이다.
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<110> LEXICON PHARMACEUTICALS, INC. <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ANGPTL3 <130> 07705.0026-00304 <150> 60/873,834 <151> 2006-12-08 <160> 112 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met His Thr Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala 1 5 10 15 Ser Arg Val Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Thr Ala Leu Gln His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys 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aaagctttga atgaactgag 1440 gcaaatttaa aaggcaataa tttaaacatt aacctcattc caagttaatg tggtctaata 1500 atctggtatt aaatccttaa gagaaagctt gagaaataga ttttttttat cttaaagtca 1560 ctgtctattt aagattaaac atacaatcac ataaccttaa agaataccgt ttacatttct 1620 caatcaaaat tcttataata ctatttgttt taaattttgt gatgtgggaa tcaattttag 1680 atggtcacaa tctagattat aatcaatagg tgaacttatt aaataacttt tctaaataaa 1740 aaatttagag acttttattt taaaaggcat catatgagct aatatcacaa ctttcccagt 1800 ttaaaaaact agtactcttg ttaaaactct aaacttgact aaatacagag gactggtaat 1860 tgtacagttc ttaaatgttg tagtattaat ttcaaaacta aaaatcgtca gcacagagta 1920 tgtgtaaaaa tctgtaatac aaatttttaa actgatgctt cattttgcta caaaataatt 1980 tggagtaaat gtttgatatg atttatttat gaaacctaat gaagcagaat taaatactgt 2040 attaaaataa gttcgctgtc tttaaacaaa tggagatgac tactaagtca cattgacttt 2100 aacatgaggt atcactatac cttatt 2126 <210> 7 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 7 Ser Arg Val Asp Pro Asp Leu 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 19 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala 130 135 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 20 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val 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<400> 23 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala 130 135 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 24 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 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Sequence: Synthetic construct <400> 30 Glu Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Trp Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 31 Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly 1 5 10 15 Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 40 45 Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 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Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (49) <223> Variable amino acid <400> 33 Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 40 45 Xaa Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr 100 105 110 Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (30) <223> Variable amino acid <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Glu Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Trp Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <400> 53 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <400> 54 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 66 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Leu Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala 115 <210> 67 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 67 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Pro Ser Val Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu Asp Ser Asn 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Synthetic peptide <400> 79 Met Gln Pro Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 83 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Ala Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala 1 5 10 15 Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu 20 25 <210> 84 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Glu Ala Lys Ser Arg Phe 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Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala 1 5 10 15 Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly Ala Gly Leu 20 25 <210> 105 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala 1 5 10 15 Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Ala Leu 20 25 <210> 106 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala 1 5 10 15 Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Ala 20 25 <210> 107 <211> 410 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 50 55 60 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn 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275 280 285 Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr 290 295 300 Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn 305 310 315 320 Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp 325 330 335 His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly 340 345 350 Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe 355 360 365 His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp 370 375 380 Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser 405 410 <210> 108 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe 180 185 190 Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly 195 200 205 Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp 210 215 220 Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro 225 230 235 240 Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp 245 250 255 Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg 260 265 270 Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln 275 280 285 Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu 290 295 300 Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg 325 330 335 Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly 340 345 350 Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro 355 360 365 Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg 370 375 380 Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met 385 390 395 400 Ala Ala Glu Ala Ala Ser 405 <210> 109 <211> 27 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Gln Pro Glu Pro Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu 1 5 10 15 Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu 20 25 <210> 110 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ser Lys Ser Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala 1 5 10 15 His Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu 20 25 <210> 111 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 111 His His His His His His 1 5 <210> 112 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala 1 5 10 15 Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu 20 25

Claims (77)

  1. ANGPTL3 에 결합하여 ANGPTL3 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서,
    a) 서열 번호: 35의 CDR1, 서열 번호: 36의 CDR2, 및 서열 번호: 37의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 44의 CDR1, 서열 번호: 45의 CDR2, 및 서열 번호: 46의 CDR3 를 포함하는 경쇄;
    b) 서열 번호: 38의 CDR1, 서열 번호: 39의 CDR2, 및 서열 번호: 40의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 47의 CDR1, 서열 번호: 48의 CDR2, 및 서열 번호: 49의 CDR3 를 포함하는 경쇄;
    c) 서열 번호: 41의 CDR1, 서열 번호: 42의 CDR2, 및 서열 번호: 43의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 50의 CDR1, 서열 번호: 51의 CDR2, 및 서열 번호: 52의 CDR3 를 포함하는 경쇄;
    d) 서열 번호: 71의 CDR1, 서열 번호: 72의 CDR2, 및 서열 번호: 73의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 77의 CDR1, 서열 번호: 78의 CDR2, 및 서열 번호: 79의 CDR3 를 포함하는 경쇄; 또는
    e) 서열 번호: 74의 CDR1, 서열 번호: 75의 CDR2, 및 서열 번호: 76의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 80의 CDR1, 서열 번호: 81의 CDR2, 및 서열 번호: 82의 CDR3 를 포함하는 경쇄
    를 포함하는 단일클론 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 생체 내에서 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 감소시키는 단일클론 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 혈청 지질이 혈청 트리글리세리드, 콜레스테롤 및 자유 지방산으로부터 선택되는 단일클론 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 59 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 ANGPTL3 의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 50 nM 미만의 KD 로 결합하는 단일클론 항체.
  8. 제 7 항에 있어서, 서열 번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 30 nM 미만의 KD 로 결합하는 단일클론 항체.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열 번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 10 nM 미만의 KD 로 결합하는 단일클론 항체.
  10. 제 9 항에 있어서, 서열 번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 5 nM 미만의 KD 로 결합하는 단일클론 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 10 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 대한 제 1 친화력, 및 서열 번호: 84, 서열 번호: 85, 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 90, 또는 서열 번호: 92 의 아미노산 서열을 가진 펩티드에 대한 제 2 친화력을 갖고, 이때 제 1 친화력이 제 2 친화력보다 적어도 3 배 더 큰 단일클론 항체.
  12. 제 11 항에 있어서, 제 2 친화력이 서열 번호: 85, 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 또는 서열 번호: 90 에 대한 것인 단일클론 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 28 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 24 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 64 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 68 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  17. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 66 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 70 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  18. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 단일클론 항체.
  19. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 28 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체.
  20. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체.
  21. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 24 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체.
  22. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 64 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 68 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체.
  23. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 66 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 70 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체.
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  30. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 절편인 단일클론 항체.
  31. 제 30 항에 있어서, 항체 절편이 scFv 절편, Fab 절편, F(ab')2 절편, 또는 Fab' 절편인 단일클론 항체.
  32. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 함유하는, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 비만, 대사 증후군, 당뇨병 또는 허혈성 심장 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
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