KR20220004226A - 항-lgr5 단클론성 항체의 투여 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 암 생물학 분야에 관한 것이다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 구체예들은 특정 암을 치료하기 위하여 LGR5에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그것의 항원-결합 단편들의 투여에 관련된다.

Description

항-LGR5 단클론성 항체의 투여{ADMINISTRATION OF AN ANTI-LGR5 MONOCLONAL ANTIBODY}
관련 출원
본 출원은 2016년 3월 22일에 "항-LGR5 단클론성 항체의 투여"라는 제목으로 출원된 미국 가출원 번호 62/311,631호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 참조로 본원에 분명하게 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 암 생물학 분야에 관한 것이다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 구체예는 특정 암을 치료하기 위하여 류신-풍부한 반복부-함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 방식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 크기가 대략 40 Kb이고 2017년 3월 8일에 생성된, BIONO14WOSEQLISTING의 명칭의 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 방식의 정보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
GPR49/HG38/FEX로도 알려져 있는, 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질-결합된 수용체 5(LGR5)는 당단백질 호르몬 수용체들에 구조적으로 유사한 수용체 단백질들의 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질-결합된 수용체(LGR) / G-단백질-결합된 수용체(GPR) 단백질 패밀리에 속한다. LGR은 3개의 하위그룹으로 나누어진다:(1) 갑상선-자극 호르몬(TSH) 수용체, 여포-자극 호르몬(FSH) 수용체, 및 황체 형성 호르몬(LH) 수용체를 포함하는 당단백질 호르몬 수용체들;(2) 릴랙신 수용체 LGR7 및 LGR8; 및(3) LRG4, LGR5, 및 LGR6. LGR5는 장, 골격근, 태반, 뇌, 및 척수를 포함하여 여러 조직에서 발현된다.
본원에 제공된 방법들 및 조성물들의 구체예들은 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 전이성 대장암을 가진 인간 대상체의 치료 방법을 포함하며, 이때 단클론성 항체는 서열번호13을 포함하는 중쇄 및 서열번호14를 포함하는 경쇄를 포함하고; 단클론성 항체는 4주 이상 매주 투여되며; 단클론성 항체는 정맥내로 투여되고; 단클론성 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체는 폴리닌산(folinic acid), 플루오로우라실(fluorouracil), 및 이리노테칸(irinotecan)과 병용 투여된다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체의 초기 용량은 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸의 투여 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여되고; 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여되며; 플루오로우라실의 초기 용량은 상기 폴리닌산의 초기 용량의 투여 후 약 400 mg/m2가 투여되고; 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여된다.
본원에 제공된 방법들 및 조성물들의 구체예들은 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 대상체의 치료 방법을 포함하며, 이때 단클론성 항체는 서열번호13을 포함하는 중쇄 및 서열번호14를 포함하는 경쇄를 포함하고; 단클론성 항체는 4주 이상 매주 투여되며; 단클론성 항체는 정맥내로 투여되고; 단클론성 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체는 화학요법제와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, 화학요법제는 폴리닌산, 플루오로우라실, 이리노테칸, 젬시타빈 및 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(ABRAXANE)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체의 초기 용량은 화학요법제의 투여 전에 투여된다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체는 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸과 병용 투여된다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체의 초기 용량은 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸의 투여 전에 투여된다.
일부 구체예에서, 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여된다. 일부 구체예에서, 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여된다. 일부 구체예에서, 플루오로우라실의 초기 용량 약 400 mg/m2는 폴리닌산의 초기 용량을 투여한 후 투여된다. 일부 구체예에서, 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여된다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체는 베바시주맙(bevacizumab), 애플리버셉트(aflibercept), 세툭시맙(cetuximab), 및 파니투무맙(panitumumab)으로 구성되는 군으로부터 선택된 추가의 치료제와 병용 투여된다.
일부 구체예에서, 암은 고체 종양을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 결장암, 대장암, 췌장암, 유방암, 및 폐암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 APC 돌연변이를 포함하는 결장암, KRAS 돌연변이를 포함하는 결장암, 전이성 대장암, 전이성 췌장암, 삼중 음성 유방암, 및 소세포 폐암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 전이성 대장암이다.
일부 구체예에서, 대상체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 특징을 가진다: 단클론성 항체의 투여 전 전이성 질환에 대한 선행 화학요법의 1개 이상의 라인이 실패하고; 공지된 뇌 전이가 없으며; 12주 이상의 기대 수명을 가지고; 단클론성 항체의 투여 전 14일 내에 성장 인자 지지 없이 약 1500개의 세포/mL보다 큰 절대 호중구 수를 가지며; 단클론성 항체의 투여 전 14일 내에 수혈 없이 100,000개의 혈소판/mL보다 큰 혈소판 수를 가지고; 9.0 g/dL 이상의 헤모글로빈을 가지며; 3 g/dL 이상의 혈청 알부민을 가진다.
일부 구체예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
본원에 제공된 방법들 및 조성물들의 구체예들은 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체의 용량, 및 적합한 제약학적 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 포함하는 용기를 포함하며, 여기서 단클론성 항체의 용량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 정맥내 투여에 적합하다.
본원에 제공된 방법들 및 조성물들의 구체예들은 전이성 대장암을 치료하는 데 사용하기 위한 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체를 포함하며, 여기서 단클론성 항체는 서열번호13을 포함하는 중쇄 및 서열번호14를 포함하는 경쇄를 포함하고; 단클론성 항체는 4주 이상 매주 투여되며; 단클론성 항체는 정맥내로 투여되고; 단클론성 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체는 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸과 병용 투여된다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체의 초기 용량은 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸의 투여 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여되고; 상기 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 상기 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여되며; 상기 플루오로우라실의 초기 용량은 상기 폴리닌산의 초기 용량의 투여 후 약 400 mg/m2가 투여되고; 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여된다.
도 1은 인간화 단클론성 항체 18G7H6A3의 인간 LGR5(CHO)에 대한 직접적인 FACS 결합을 나타내는 그래프이다.
도 2는 CT3 CRC 종양 부피에 미치는 FOLFIRI 단독 및 18G7H6A3과 조합된 FOLFIRI의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 18G7H6A3 치료가 MDA-MB-231-LM3 일차 종양 부피를 유의미하게 감소시켰음을 보여주는 그래프이다.
도 4는 LGR5의 상향조절을 초래하는, CT1, 또는 CT3 종양을 가진 마우스에서 FolFiri 치료의 그래프를 도시한다.
도 5는 JH109 종양에서 LGR5의 상향조절(4배 이상)을 초래하는 화학요법을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 화학요법(젬시타빈)과 병용 투여될 때 관찰된 18G7H6A3의 유의미한 활성을 보여주는 그래프이다.
도 7은 항체 18G7H6A3이 CT1 암 줄기 세포 집단에서 생존한 사건의 수를 감소시키는 것을 보여주는 포인트 플롯이다.
도 8은 FOLFIRI와 조합된 항-LGR5 항체 18G7H6A3으로 치료된 마우스로부터 분리된 세포들이 FOLFIRI 단독으로 치료된 마우스로부터 분리된 세포들과 비교하여 크게 감소된 종양 형성을 나타냈음을 보여주는 선 그래프이다.
도 9는 18G7H6A3 FOLFIRI 조합으로부터 재이식된 세포들이 진행되기까지 유의미하게 지연된 시간을 가졌음을 보여주는 선 그래프이다.
도 10은 화학요법(FOLFIRI)과 병용하여 예방적으로 투여될 때 인간화 항체 18G7H6A3의 유의미한 활성이 관찰된 것을 보여주는 선 그래프이다.
도 11은 항체 18G7H6A3이 포스포-Thr41/Ser45-β-카테닌 면역검정에 의하여 나타난 것과 같이 생체내의 종양 세포에서 Wnt 신호전달을 억제할 수 있음을 보여주는 포인트 플롯이다.
도 12는 가용성 항체 18G7H6A3의 농도를 증가시키는 것이 Wnt3a 플러스 RSPO2의 조합에 의하여 TCF/LEF 프로모터가 구동된 GFP 발현의 유도에 영향을 미치지 못하였고, 항-LGR5 항체 18G7H6A3이 RSPO-구동된 TCF/LEF 프로모터 활성화를 차단하지 못한 것을 증명하는 것을 보여주는 막대 그래프이다. 양성 대조군 항체 C12는 Wnt3a/RSPO2 구동된 TCF/LEF 프로모터 활성화를 억제하는 것으로 나타난다.
도 13은 R-스폰딘이 LGR5에 대한 항체 18G7H6A3 결합을 차단하지 못하는 것을 보여주는 선 그래프이다.
도 14는 LGR5에 대한 항체 18G7H6A3 결합이 3개로 이루어진 복합체의 형성을 억제하는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 15는 치료된 샘플에서 LGR5 발현의 수준을 도시한다.
도 16은 치료된 샘플에서 CTNNB1 발현, 및 p-β-카테닌 발현의 수준을 도시한다.
도 17은 다양한 치료된 샘플에서 차등적으로 발현된 전사물들을 도시한다.
도 18은 18G7H6A3-(BNC101)로 치료된 종양에서 차등적으로 발현된 유전자들을 도시한다.
도 19는 FOLFIRI로 치료된 종양에서 차등적으로 발현된 유전자들을 도시한다.
도 20은 조합-치료된 종양에서 차등적으로 발현된 유전자들을 도시한다.
도 21은 순환하는 HLA+ 세포에서 LGR5의 수준을 도시한다.
도 22a 및 도 22b는 순환하는 HLA+ 세포에서 LGR5의 수준을 도시한다.
도 23은 젬시타빈/아브락산으로 또는 젬시타빈/아브락산 및 18G7H6A3으로 치료된 마우스의 동물 생존율을 보여주는 그래프이다.
본원에 제공된 방법들 및 조성물들의 일부 구체예들은 특정 암을 치료하기 위하여 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그것의 항원-결합 단편들의 투여에 관련된다. 그러한 인간화 항체 및 그것의 항원-결합 단편들의 구체예는 2017년 10월 8일에 공개된 PCT 공개 번호 WO 2015/153916에 개시되어 있고, 상기 출원은 그 전문이 참조로 포함된다.
LGR5는 소화관의 정상적인 줄기 세포 및 종양-개시 세포의 고도로 특이적인 마커로서 계통 추적 연구를 통해 확인되었다. 앞서 약 150개의 유전자가 확인되었고 그것들의 발현은 Wnt 발현의 중단 후에 퀀칭되었다. 이 'Wnt 표적 유전자들'의 포괄적인 특성화는 LGR5가 크립트 베이스(crypt base)에서 10 내지 14개의 증식하는 쐐기-형상 세포의 집단에서 선택적으로 발현되는 것임을 발견하였다. 이 크립트-기반 원주상 세포들은 앞서 후보 줄기 세포 집단인 것으로 제안되었다. 유전성 lacZ-LGR5 리포터 유전자를 이용한 생체내 계통 추적을 사용하여, LGR5 장 줄기 세포가 크립트 베이스(crypt base)로부터 시작하여 융모 끝까지 뻗어 있는 lacZ+ 자손 세포들의 연속된 리본을 발생시키는 성인의 장 줄기 세포의 다능성, 자가증식 집단인 것이 확인되었다.
암 줄기 세포(CSC)상에서 LGR5의 특이적 발현은 선택적 및 효과적으로 CSC를 타겟하는 기회를 제공한다. LGR5는 정상 조직과 비교하여 CRC, 췌장 및 대부분의 다른 고체 종양에서 고도로 과잉 발현되고, 그로써 CRC, 췌장, 유방, 난소, 폐, 위 및 간암에서 CSC를 표적화하는 광범위한 치료 범위를 제공한다.
CRC에서의 게이트 키핑(gate keeping) 돌연변이는 Wnt 신호전달의 비정상적 활성화를 초래하는 선종성 결장 폴립증(adenomatous polyposis coli, APC)의 손실로, Wnt 신호전달은 정상적으로는 줄기 세포 자가증식과 결장 크립트의 분화 사이의 균형을 조절하는 작용을 한다. 장 줄기 세포에서 조절되지 않는 Wnt 신호전달은 악성 CRC에 대한 전구체인 결장의 선종성 폴립의 형성으로 이어진다. LGR5 줄기 세포는 유도성 APC 유전자 녹아웃 마우스를 LGR5 줄기 세포가 4개의 형광 유전자 마커(GFP/YFP/ECFP/RFP) 중 하나로 특이적으로 및 무작위로 표지된 마우스와 교배시키는 전략을 사용하여, 이 마우스들의 장 종양의 근원 또는 뿌리인 것으로 확인되었다. APC 결실의 유도 후 4주 후에 단일 유색 종양(즉, 모든 GFP 또는 모든 REP)의 출현은 이 종양들이 단일한 LGR5 줄기 세포로부터 발생하였음을 확인해주었다. 나아가, 이 모델은 또한 LGR5 줄기 세포의 형광 유전자 태그가 상이한 색으로 바뀌게 하여서, 적색 종양을 생성하는 RFP+ LGR5 암 줄기 세포가 ECFP+ LGR5 암 줄기 세포로 중간에 형질전환될 수 있고, 계속해서 종양을 접종하여도 이전에 모두 적색인 GFP+ 종양 덩어리를 침범하는 청색 종양 세포를 이제는 발생시키지 않도록 하였다. 이런 뒤집기(flipping) 실험은 LGR5 CSC가 장 종양의 기원이고, 장 종양의 성장을 개시하고 접종할 수 있을 뿐만 아니라, 장 종양이 계속해서 종양 형성을 유지한다(즉 장기간 재거주능)는 추가의 확증을 제공하였다.
암에서 LGR5의 기능적 역할은 리보핵산 간섭(RNAi) 녹다운 연구들을 통해 확인되었다. CRC 종양 세포주의 패널에서 LGR5의 녹다운은 시험관내에서 소프트아가 콜로니들의 성장, 및 또한 생체내에서 HCT116 결장 종양 이종이식편의 성장을 유의미하게 억제하였다. LGR5 RNAi 녹다운은 계속해서 시험관내에서 환자-유래 CRC 종양 세포로부터의 CSC 콜로니들의 성장을 감소시키는 것으로 나타났다(데이터 미도시). 마지막으로, 분류된 LGR5+ PATIENT DERIVED 이종이식 CRC 종양 세포는 대조군 LGR5- 세포와 비교하여 생체내에서 고도로 종양을 형성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
CSC는 수술 및 표준 케어 화학요법으로 치료된 많은 암 환자에서 높은 종양 재발율에 기여하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 유방암 환자로부터의 CD44+ CSC는 화학요법 후에 풍부해지는 것으로 밝혀졌고, 그 고수준의 CSC는 화학요법에 대한 부족한 임상 반응과 상관되었다. 유사하게, 전이성 CRC에서, LGR5 발현은 화학요법 후에 손상된 간에서 상향조절되었고, 그것은 화학요법에 대한 반응으로 증가된 LGR5 CSC은 전이성 질환을 개시 및/또는 불러 일으키는 것을 시사한다. 실제로, LGR5 발현은 일차 CRC 종양에 비교하여 전이성 부위에서 유의미하게 더 큰 것으로 밝혀졌다.
항-LGR5 항체
본원에서 사용되는 용어 "항체"는, 한정하는 것은 아니지만, 합성 항체, 단클론성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 인트라바디(intrabodies), 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 합성 항체, 단일-사슬 Fvs(scFv), Fab 단편, F(ab′) 단편, 이황화-결합 Fvs(sdFv)(이중특이적 sdFvs를 포함함), 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 본원에 제공된 여러 구체예들의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 항체이거나 또는 더 큰 다중특이성의 항체일 수 있다. 다중특이적 항체는 폴리펩타이드의 상이한 에피토프들에 대해 특이적이거나 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 폴리펩타이드 또는 고체 지지 물질과 폴리펩타이드에 대해서 특이적일 수 있다. 예컨대, PCT 공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69(1991); 미국 특허 제 4,474,893호; 4,714,681호; 4,925,648호; 5,573,920호; 5,601,819호; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553(1992) 참조; 상기의 각각은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, LGR5는, 한정하는 것은 아니지만, NM_003667.2 내의 암호화 뉴클레오타이드 서열, 또는 그것의 단편에 의해 암호화되는, NCBI 등록 번호 NP_003658.1의 폴리펩타이드, 또는 그것의 단편을 포함하는 인간 LGR5를 포함한다. NCBI 등록 번호 NP_003658.1의 아미노산 서열 및 전체 엔트리 및 NM_003667.2의 뉴클레오타이드 서열 및 엔트리는 그 전체가 참조로 완전히 포함된다. 본원에서 고려된 LGR5 단편의 실례는 LGR5 엑토도메인, 경막 도메인, 또는 세포내 도메인 및 그것들의 부분들을 포함한다.
여러 구체예들은 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체를 포함하여, 항-LGR5 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생성하는 하이브리도마에 관련된다. 한 측면으로, 하이브리도마는 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1의 것과 같은 인간화 또는 전체 인간 단클론성 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생성한다.
일부 구체예는 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 임의의 하나를 포함하여, 항-LGR5 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자에 관련된다. 일부 측면으로, 핵산 분자는 인간화 또는 완전 인간 단클론성 항체, 예컨대 하기 실시예에서 제조되고 기술된 항체 18G7H6A3 및 18G7H6A1의 경쇄 또는 중쇄를 암호화한다.
다양한 구체예들이 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 임의의 하나를 포함하여, 항-LGR5 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터에 관련된다.
다양한 구체예에서, 항체의 글리코실화는 변형될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화되지 않은 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결핍된다). 글리코실화는, 예를 들어, 표적 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위하여 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어지고 그 결과로 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위가 제거되고 그로써 그 부위에서의 글리코실화가 제거될 수 있다. 그러한 아글리코실화(aglycosylation)는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 그런 접근법은 미국 특허 제 5,714,350호 및 6,350,861호에 더 상세하게 기술되어 있고, 이 특허들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
여러 구체예에서, 항체는 NCBI 등록 번호 NP_003658.1(서열번호 47)의 인간 LGR5 폴리펩타이드 또는 그것의 단편에 대해 적어도 60% 동일성, 또는 적어도 70% 동일성, 또는 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 적어도 97% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성, 또는 100% 동일성을 가지는 LGR5 폴리펩타이드를 포함하는 또는 그것으로 구성되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 그러한 단편은, 예를 들어, LGR5 폴리펩타이드의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 또는 900개의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산일 수 있거나, 또는 상기 언급된 길이 중 어느 것들 사이의 임의의 수의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산일 수 있다.
여러 구체예에서, 항체는 항체 18G7H6A3이고 서열번호 13의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 11의 DNA 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 항체 18G7H6A3이고 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 가진다. 여러 구체예에서, 항체는 항체 18G7H6A3이고 서열번호 14의 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 항체 18G7H6A3이고 서열번호 21의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 상기 서열들 중의 서열에 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 상기 서열들의 중쇄, 경쇄, 또는 가변 도메인의 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 또는 118개의 잔기의 구간에 걸쳐있는 상기 항체 서열에 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 항체 서열들에 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 항체 서열들에 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 또는 111개의 잔기의 구간에 걸쳐 있는 항체 서열들에 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 GYSFTAYW(서열번호23)를 포함하는 중쇄 CDR1, ILPGSDST(서열번호2)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ARSGYYGSSQY(서열번호3)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 ESVDSYGNSF(서열번호4)를 포함하는 경쇄 CDR1, LTS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQNAEDPRT(서열번호33)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 (a) 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 가지는 상기 서열들의 변종을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함한다. 항체는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변종을 가지는 중쇄 CDR2를 가질 수 있다. 항체는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변종을 가지는 중쇄 CDR3을 가질 수 있다. 중쇄의 이런 변형들에 더불어, 항체는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변종을 가지는 경쇄 CDR1을 가질 수 있다. 항체는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변종을 가지는 경쇄 CDR2를 가질 수 있다. 항체는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 가지는 경쇄 CDR3을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환이다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 첨부된 서열 목록에 본원에서 기술된 서열들에 대해 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 항체는 또한 본원에서 기술된 항체 서열들에 대해 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
두 개의 아미노산 서열(또는 두 개의 핵산 서열)의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, 서열들을 최적의 비교 목적으로 일렬배열함으로써(예컨대 갭이 제 1 서열의 서열에 도입될 수 있음) 측정될 수 있다. 그런 다음 상응하는 위치의 아미노산들 또는 뉴클레오타이드들이 비교되고, 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 두 서열의 실제 비교는 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 그러한 수학적 알고리즘의 특이적이고, 비-제한적인 실례는 Karlin 등에 의해 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)에 기술되어 있고, 그 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러한 알고리즘은 Schaffer 등에 의해 Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)(전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이 BLASTN 및 BLASTX 프로그램(버전 2.2)에 포함된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예컨대 BLASTN)의 디폴트 변수들이 사용될 수 있다. 2002년 4월 10일자로 이용가능한, http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 한 구체예에서, 검색된 데이터베이스는 비-이중화(NR) 데이터베이스이고, 서열 비교를 위한 변수들은 다음과 같이 설정될 수 있다: 필터 없음; 10의 기대값; 3의 워드 크기; 매트릭스는 BLOSUM62임; 그리고 갭 코스트(Gap Cost)는 11의 이그지스턴스(Existence) 및 1의 확장자를 가진다.
여러 구체예들은 또한 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 임의의 하나를 포함하여, 가변 경쇄(VL ) 도메인 및/또는 가변 중쇄(VH ) 도메인에 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 상기 기술된 항체들의 변종을 포함한다. 여러 구체예는 또한 하나 이상의 VL CDR 및/또는 하나 이상의 VH CDR에 하나 이상의 추가 아미노산 잔기 치환을 가지는 상기 기술된 항체들의 변종을 포함한다. 상기 기술된 항체의 VH 도메인, VH CDRs, VL 도메인 및/또는 VL CDR에 치환을 도입함으로써 생성된 항체는 시험관내에서 및 생체내에서, 예를 들어, 그것들의 LGR5에 결합하는 능력에 대해 테스트될 수 있다(예컨대 한정하는 것은 아니지만, ELISA 및 BIAcore를 포함하는 면역검정에 의해).
다양한 구체예들은 항-LGR5 항체의 VH 도메인, VH CDR, VL 도메인, 또는 VL CDR의 유도체를 포함하는 LGR5에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 LGR5에 특이적으로 결합하는, 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로 지정된 항-LGR5 항체들 중 임의의 하나를 포함한다. 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이(예컨대 첨가, 결실, 및/또는 치환)를 도입하기 위해 사용될 수 있는, 당업자들에게 알려져 있는 표준 기법, 예를 들어, 부위-특정 돌연변이생성 및 PCR-매개 돌연변이생성이 아미노산 치환을 생성하기 위해 기본적으로 사용된다. 한 구체예에서, VH 및/또는 VL CDR 유도체는 원래의 VH 및/또는 VL CDR에 비해 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL CDR 유도체는 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기(즉 LGR5에 특이적으로 결합하는 항체에 중요하지 않은 아미노산 잔기)에서 만들어진 보존성 아미노산 치환(예컨대 상기 동일)을 가진다. 다르게는, 돌연변이는 VH 및/또는 VL CDR 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라, 예컨대 포화 돌연변이생성에 의해 무작위로 도입될 수 있고, 그 결과의 돌연변이체들은 활성을 보유하는 돌연변이체들을 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이생성 후에, 암호화된 항체는 발현되고 항체의 활성이 측정될 수 있다.
여러 구체예들은 또한 LGR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편, 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 것들을 포함하여 항-LGR5 항체들 중 임의의 하나를 포함하여, 본원에서 기술된 항체들 중 임의의 것의 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
다른 구체예는 항-LGR5 항체, 예컨대 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 임의의 하나의 임의의 부분에의 보존성 아미노산 치환의 도입을 포함한다. 기술분야에서 "보존성 아미노산 치환"은 기능적으로 동등한 아미노산을 치환하는 아미노산 치환을 언급하는 것으로 잘 알려져 있다. 보존성 아미노산 변화는 그 결과 펩티드의 아미노산 서열의 사일런트(silent) 변화를 초래한다. 예를 들어, 유사한 극성(polarity)의 하나 이상의 아미노산은 기능적 동등물로서 작용하고 펩타이드의 아미노산 서열 내에서 사일런트 변경을 초래한다. 전하가 중성이고 잔기를 더 작은 잔기로 대체하는 치환은 잔기들이 상이한 그룹에 있을지라도 또한 "보존성 치환"으로 간주될 수 있다(예컨대 페닐알라닌보다 더 작은 이소류신으로의 교체). 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기들의 패밀리가 기술분야에서 규정되어 있다. 보존성 아미노산 치환의 여러 패밀리가 하기 표 1에 제시된다.
패밀리 아미노산
비극성 Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala, Pro
대전되지 않은 극성 Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys
산성/음으로 대전됨 Asp, Glu
염기성/양으로 대전됨 Arg, Lys, His
베타-분지됨 Thr, Val, Ile
사슬 방향에 영향을 미치는 잔기들 Gly, Pro
방향족 Trp, Tyr, Phe, His
항-LGR5 항체로 암 줄기 세포 성장의 차단
여러 구체예들이 시험관내에서 및 생체내에서 암 줄기 세포 성장을 항-LGR5 항체로 차단하는 것에 관련된다. 일부 구체예에서, 암 줄기 세포 성장을 차단하는 방법은 항-LGR5 항체의 유효량을 암 줄기 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항-LGR5 항체의 유효량은 암 줄기 세포의 성장을 감소시키기에 충분하다.
일부 구체예에서, 암 줄기 세포 성장을 차단하는 방법은 항-LGR5 항체의 유효량을 암 줄기 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항-LGR5 항체의 유효량은 암 줄기 세포의 증식을 감소 또는 차단시키거나, 또는 성장을 감소 또는 차단시키기에 충분하다.
일부 측면으로, 항-LGR5 항체의 유효량은 시험관내에서 암 줄기 세포에 투여된다. 다른 측면으로, 항-LGR5 항체의 유효량은 생체내에서, 치료를 필요로 하는 환자의 암 줄기 세포에 투여된다.
본원에서 사용되는 용어 "암 줄기 세포(들)"은 광범위하게 또는 무기한으로 증식할 수 있고 암에서 높은 비율의 암세포를 발생시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 일부 측면으로, 높은 비율의 암세포는 주어진 암에서 대부분의 암세포를 나타낸다. 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 암 줄기 세포(들)은 암 덩어리의 대부분을 포함하는 종양의 시조(founder) 또는 암세포의 전구세포일 수 있다. 일부 측면으로, 암 줄기 세포는 세포에 대한 임의의 추가적인 돌연변이의 부재시에, 또는 외인성 세포 증식-유도 또는 발암성 작용제의 도입시에, 면역손상된 개체에 이식되었을 때 하나 이상의 종양을 형성하기 위해 분할되는 세포를 나타낸다. 일부 측면으로 암 줄기 세포는 분할되어 최종 분화된 암세포 또는 암조직뿐만 아니라 추가적인 암 줄기 세포도 얻어진다.
일부 구체예에서, 암 줄기 세포 성장, 증식, 또는 생존력은 LGR5-RSpo 결합 또는 신호전달을 간섭하지 않으면서 차단된다. 일부 구체예에서, 암 줄기 세포 성장, 증식, 또는 생존력은 Wnt를 통한 LGR5 신호전달을 차단 또는 억제하는 것을 통해 LGR5-RSpo 결합 또는 신호전달을 간섭하지 않으면서 차단된다.
암 줄기 세포 성장을 차단하는 것과 관련하여 사용되는 바, 용어 "유효량"은 어느 정도로든 암 줄기 세포의 성장을 감소시키기에 충분한 항-LGR5 항체의 양을 나타낸다. 기술분야에 공지된 어떠한 검정이든지 암 줄기 세포 성장을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 줄기 세포 성장은 콜로니 수, 총 세포 수, 또는 세포 집단 또는 콜로니의 부피/크기에 의해 측정될 수 있다. 여러 구체예에서, 암 줄기 세포 성장은 하기 실시예 1에서 기술된 종양구(tumor sphere) 성장 검정에 의해 측정될 수 있다.
특정 구체예에서, 항-LGR5 항체의 유효량은 암 줄기 세포 집단 또는 종양구 성장에서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 만큼의 감소, 또는 상기 언급된 수 중 임의의 것들 사이의 임의의 백분율 만큼의 감소로 측정되는 바와 같이 암 줄기 세포 성장을 차단할 수 있다. 일부 측면으로, 항-LGR5 항체는 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 어느 하나 또는 그것들의 조합이다.
예를 들어, 일부 구체예에서, 항-LGR5 항체의 유효량은 암 줄기 세포 집단 또는 종양구 성장에서 적어도 약 5% 내지 99%, 5% 내지 80%, 5 내지 40%, 10% 내지 99%, 10 내지 80%, 10 내지 60%, 10% 내지 40%, 20 내지 99%, 20% 내지 80%, 20% 내지 60%, 20% 내지 40%, 50% 내지 98%, 50% 내지 80%, 또는 60% 내지 99% 만큼의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 암 줄기 세포 성장을 차단할 수 있다. 일부 측면으로, 항-LGR5 항체는 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 어느 하나 또는 그것들의 조합이다.
다른 구체예에서, 항-LGR5 항체의 유효량은 암 줄기 세포 집단 또는 종양구 성장에서 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 또는 1000-배 만큼의 감소, 또는 상기 언급된 숫자들 중 어느 것 사이의 임의의 배수의 감소로 측정되는 바 암 줄기 세포 성장을 차단할 수 있다. 일부 측면으로, 항-LGR5 항체는 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들 중 어느 하나 또는 그것들의 조합이다.
일부 구체예에서, 상기 기술된 임의의 정도로 암 줄기 세포 성장을 차단하기에 충분한 항-LGR5 항체의 유효량은 약 1 nM, 50 nM, 75 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM, 400 μM, 500 μM, 550 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 900 μM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM, 1000 mM, 1 M, 5 M, 10 M, 15 M, 20 M, 25 M, 30 M, 35 M, 40 M, 45 M, 50 M, 75 M, 100 M의 농도, 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 두 농도 사이의 임의의 수의 농도 이다. 일부 측면으로, 항-LGR5 항체 조성물은 하기 실시예에서 제조되고 기술된 18G7H6A3 및 18G7H6A1로서 지정된 항-LGR5 항체들을 모두 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 1 nM 미만, 및 전술한 값들 중 임의의 값들 사이의 범위의 KD로 인간 LGR5에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 약 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM 미만, 및 전술한 값들 중 임의의 범위 내의 친화도로 LGR5에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 약 0.0001 nM, 0.001 nM, 0.01 nM보다 큰, 및 전술한 값들 중 임의의 범위 내의 친화도로 LGR5에 결합한다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 서열번호 47의 아미노산 T175, E176, Q180, R183, S186, A187, Q189, D247, E248, T251, R254, S257, N258, K260을 포함하는 또는 그것들로 구성되는 또는 그것들 내에 있는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 류신 풍부한 반복부 6-9를 포함하는 또는 그것으로 구성되는 또는 그것 내에 있는 에피토프에 결합한다(예컨대 Chen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50 참조, 이것의 전문이 참조로 포함됨). 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-LGR5 항체는 LGR5 엑토 도메인의 볼록한 표면을 포함하는 또는 그것으로 구성되는 또는 그것 내에 있는 에피토프에 결합한다(예컨대 Chen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50 참조, 이것의 전문이 참조로 포함됨).
일부 구체예는 본원에 제공된 항-LGR5 항체의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 췌장암, 대장암, 폐암, 췌장암, 및 유방암, 예컨대 삼중 음성 유방암으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 대장암은 선종성 결장 폴립증(APC) 유전자에 비활성화 돌연변이를 포함하거나, APC 유전자에 비활성화 돌연변이를 포함하지 않거나, 또는 야생형 APC 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 이다. 일부 구체예에서, 암은 상승된 수준의 LGR5 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 상승된 수준의 LGR5 단백질을 발현하는 결장암이다. 일부 구체예에서, 암은 상승된 수준의 LGR5를 발현하는 췌장암이다. 일부 구체예에서, 암은 상승된 수준의 LGR5를 발현하는 유방암이다.
일부 구체예는 대상체의 질환을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 질환은 β-카테닌의 활성화, 및/또는 비정상적인 β-카테닌 신호전달과 관련된다. 일부 구체예는 본원에 제공된 항-LGR5 항체의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예는 본원에 제공된 항-LGR5 항체의 치료적 유효량을 적어도 하나의 추가적인 치료제와 병용하여 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 추가적인 치료제는 화학요법제를 포함한다. 일부 구체예에서, 추가적인 치료제는 생물학적 작용제를 포함한다. 일부 구체예는 화학요법제 및 생물학적 작용제와 병용하여 본원에 제공된 항-LGR5 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 화학요법제와 병용하여 본원에 제공된 항-LGR5 항체를 투여하는 것은 암, 예컨대 종양에서의 LGR5의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 본원에 제공된 방법의 일부 구체예는 종양 또는 암에서 LGR5단백질 발현의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 구체예는 본원에 제공된 항-LGR5 항체로의 치료를 위해 대상체를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구체예는 대상체가 정상 조직에서의 동일한 LGR5 단백질의 발현과 비교하여 LGR5의 상승된 발현 수준을 포함하는 종양을 가지는지의 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예는 종양이 상승된 수준의 LGR5 발현을 가진다면 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구체예는 또한 대상체가 APC 유전자에 비활성화 돌연변이를 포함하는 종양을 가지는지의 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예는 또한 종양이 APC 유전자에 비활성화 돌연변이를 포함한다면 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
상기와 관련하여 방법, 조성물 및 관련된 개시는, 예를 들어 2013년 5월 10일에 공개된 PCT 공보 제 WO 2013/067055(이 공보의 내용은 전문이 참조로 본원에 포함됨), 뿐만 아니라 2013년 5월 10일에 공개된 PCT 공보 제 WO 2013/067054(이 공보의 내용은 전문이 참조로 본원에 포함됨), 뿐만 아니라 2013년 5월 10일에 공개된 PCT 공보 제 WO 2013/067057(이 공보의 내용은 전문이 참조로 본원에 포함됨), 뿐만 아니라 2013년 5월 10일에 공개된 PCT 공보 제 WO 2013/067060(이 공보의 내용은 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 제공된다.
제약학적 조성물
본원에서 제공된 LGR5에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 투여에 적합한 제약학적 조성물에 포함될 수 있다. 그러한 조성물은 전형적으로 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 제약학적 투여와 부합하는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 업계의 표준 참조 텍스트인, Remington's Pharmaceutical Sciences의 가장 최신판에 기술되어 있고, 그것은 본원에 참조로 포함된다. 그러한 담체 또는 희석제의 바람직한 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 물, 염수, 링거액, 덱스트로오스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 리포좀 및 고정 오일과 같은 비수성 비히클(vehicle) 또한 사용될 수 있다. 제약학적으로 활성인 물질을 위한 그러한 매질 및 작용제들의 사용은 업계에 잘 알려져 있다. 임의의 편리한 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 부합할 수 없는 것인 경우를 제외하고, 조성물에 그것들의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물들 또한 조성물에 포함될 수 있다.
발명의 제약학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 부합하도록 제형된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대 정맥내, 피내, 피하, 경구(예컨대 흡입), 경피(즉 국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용된 용액 또는 현탁액은 다음의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균된 희석제, 예컨대 주사용 물, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소 나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 등장성 조절제, 예컨대 염화 나트륨 또는 덱스트로오스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화 나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사용으로 사용하기에 적합한 제약학적 조성물은 멸균된 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균된 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL.TM.(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 그것들의 적합한 혼합물을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 다가알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화 나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장시간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유발될 수 있다.
멸균된 주사용 용액은 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 한 성분 또는 여러 성분의 조합물과 포함시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하고 있는 멸균된 비히클에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균된 주사용 용액의 제조를 위한 멸균된 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조로, 그 과정으로 앞서 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 얻어진다.
조성물을 투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위로 제형하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 사용되는 투여 단위는 치료될 대상체에 대한 일원화된 투여량으로서 적당한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며; 각각의 단위는 필요한 제약학적 담체와 결합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 소정의 양을 함유한다. 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세한 내용은 활성 화합물의 고유 특성들 및 이루고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 그런 활성 화합물을 합성하는 기술분야에 고유한 제한에 의해 및 직접적으로 그에 의존하여 좌우된다.
제약학적 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
키트
본원에 제공된 일부 구체예는 키트를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에서 제공된 인간화 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 동결건조된다. 일부 구체예에서, 항체는 수용액으로 있다. 일부 구체예에서, 키트는 항체의 투여를 위한 제약학적 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 또한 화학요법제를 포함한다. 일부 구체예에서, 화학요법제는 폴리닌산, 플루오로우라실, 이리노테칸, 젬시타빈 및 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(ABRAXANE)로부터 선택된다.
일부 구체예는 LGR5에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 용량, 및 적합한 제약학적 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 포함하는 용기를 포함하고, 여기서 용량은 암을 가진 대상체를 치료하기에 적합하다. 인간화 단클론성 항체 또는 항원-결합 단편의 용량은 약 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 또는 전술한 투여량 중 임의의 두 개의 투여량 사이의 범위보다 크거나, 미만이거나 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 용량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 정맥내 투여에 적합하다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 복강내 주사에 적합하다.
치료 방법
상기 방법의 일부 실시예에서, 조성물 및 키트는 암을 가진 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 그런 방법은 LGR5에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다.
일부 구체예에서, 암은 고체 종양을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 결장암, 대장암, 췌장암, 유방암, 또는 폐암일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 APC 돌연변이를 포함하는 결장암, KRAS 돌연변이를 포함하는 결장암, 전이성 대장암, 전이성 췌장암, 삼중-음성 유방암, 또는 소세포 폐암일 수 있다.
LGR5에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중쇄 CDR, 예컨대 서열번호23을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호25를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호27을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 서열번호19를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 서열번호13을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경쇄 CDR, 예컨대 서열번호29를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호31을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 서열번호33을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 서열번호21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 서열번호14를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 서열번호3을 포함하는 중쇄 및 서열번호14를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 18G7H6A3이다.
암을 가진 대상체를 치료하기 위한 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여량은 약 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 또는 전술한 투여량 중 임의의 두 개의 투여량 사이의 범위보다 크거나, 미만이거나 또는 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다.
인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여 빈도는 매일, 매주, 매월일 수 있다. 일부 구체예에서, 투여는 1일에 1회, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 또는 6일마다 1회일 수 있다. 일부 구체예에서, 투여는 1주에 1회, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 1회일 수 있다. 일부 구체예에서, 투여는 매월 1회일 수 있다.
인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여 경로는 생물제제의 투여에 적합할 수 있다. 예를 들어, 투여는 복강내 주사를 통하거나, 정맥내 경로를 통할 수 있다.
인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 투여는 화학요법제와 병용할 수 있다. 화학요법제의 실례는 폴리닌산(류코보린), 플루오로우라실(5-FU), 이리노테칸, 젬시타빈 및 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(ABRAXANE)을 포함한다. 일부 구체예에서, FOLFIRI 조합: 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸이 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 병용 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 병용하여 암을 치료하는 방법에서 화학요법제의 초기 용량은 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 초기 용량의 투여 전에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 병용하여 암을 치료하는 방법에서 화학요법제의 초기 용량은 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 초기 용량의 투여 후에 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여되고; 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여되며; 플루오로우라실의 초기 용량은 상기 폴리닌산의 초기 용량의 투여 후 약 400 mg/m2가 투여된다. 일부 구체예에서, 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여된다.
일부 구체예에서, 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 추가적인 치료제와 병용 투여될 수 있다. 추가적인 치료제의 실례는 베바시주맙(bevacizumab), 애플리버셉트(aflibercept), 세툭시맙(cetuximab), 및 파니투무맙(panitumumab)을 포함한다.
실시예
실시예 1 - LGR5 항체의 인간화
인간 생식선 서열은 쥐과(murine) 항체 18G7.1을 인간화하기 위한 수용기(acceptor) 프레임워크로서 사용하였다. 가장 가까운 생식선 서열을 찾기 위하여, 가장 유사하게 발현된 경쇄 및 가장 유사한 중쇄를 NCI IgBLAST(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)에 의한 생식선 서열의 데이터베이스에서 확인하였다. 이 연구에서 18G7.1의 CDR 서열은 개시되지 않았다. 가장 적합한 발현된 서열의 선택은 정식 및 인터페이스 잔기의 서열 동일성을 체크하는 것과 CDR 루프 길이의 유사성에 대해 체크하는 것을 포함하였다.
후보 인간화 서열과 부모(parent) 쥐과 단클론성 항체 18G7.1 사이의 핵심 구조적 프레임워크 잔기의 잠재적인 구조적 충돌을 확인하기 위하여, 3차원 모델을 생성하였다. 항체 구조의 복합물을 사용하여 후보 인간화 서열이 이식된 후 분자 에너지 최소화가 이루어진 상동성 모델을 생성하였다. 컴퓨터 소프트웨어 Pymol을 사용한 구조적 분석을 사용하여 적절한 접힘에 잠재적으로 부정적으로 영향을 줄 수 있는 잔기들을 확인하였다.
이 분석으로부터, 6개의 후보 VH 사슬을 구성하였는데: 1) 접힘에 대한 유사한 영향의 분석을 기반으로 후보 인간화 프레임워크 영역 내에서의 선택된 치환을 함유하는 기능적 인간 프레임워크 및 ii) 인간 IgG1 불변 영역에 인(in)-프레임으로 융합된 부모의 18G7.1 쥐과 항체 CDRs(서열번호 1, 2, 및 3)를 화학적으로 합성하였다.
유사하게, 2개의 후보 VL 사슬: 1) 접힘에 대한 유사한 영향의 분석을 기반으로 후보 인간화 프레임워크 영역 내에서의 선택된 치환을 함유하는 기능적 인간 프레임워크 및 ii) 부모의 18G7.1 쥐과 항체 CDR(서열번호 4, 5, 및 6)을 구성하였다. 인간 IgG1 불변 영역에 인-프레임으로 융합된 후보 VL 사슬 및 후보 VH 사슬을 화학적으로 합성하였다.
선택된 후보 변종 인간화 중쇄 및 경쇄 조합의 기능성에 대하여 포유동물 세포로의 동시-트랜스펙션에 의해 테스트하였다. 위에서 기술한 6개의 후보 인간화 18G7.1 중쇄의 각각을 후보 18G7.1 경쇄들 중 하나와 함께 HEK 293 세포로 동시-트랜스펙션하고, 조건화 배지를 LGR5 항원 결합 활성에 대해 유동 세포분석에 의해 검정하였다. 이에 더불어, 위에서 기술한 3개의 후보 인간화 18G7.1 중쇄를 제 2 후보 18G7.1 경쇄와 함께 HEK 293 세포로 동시-트랜스펙션하고, 조건화 배지를 LGR5 항원 결합 활성에 대해 유동 세포분석에 의해 검정하였다. 18G7H6으로서 알려지고, 가장 강력한 결합을 나타낸 18G7.1 후보 중쇄/경쇄 조합(인간화 변종)을 친화성 성숙을 위해 선택하였다.
실시예 2 - 인간화 LGR5 항체 친화성 성숙
선택된 인간화 변종 18G7H6의 친화성을 증가시키기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis) 및 포화 돌연변이유발(saturation mutagenesis)의 조합을 사용하였다. 중쇄 CDR1 및 경쇄 CDR1 및 CDR3의 잔기들을 알라닌으로 돌연변이 시키고, HEK 293 세포로 트랜스펙션하고, 그 결과의 조건 배지를 LGR5 항원 결합 활성에 대해 유동 세포분석에 의하여 검정하였다. 포화돌연변이는 중쇄 CDR3에서 수행되었으며, CDR3의 모든 잔기는 그 자리의 원래의 아미노산을 제외한, 자연적으로 발생하는 19개의 아미노산으로 돌연변이 되었다. 각각의 돌연변이체를 HEK 293 세포에 트랜스펙션하고, 그 결과의 조건 배지를 LGR5 항원 결합 활성에 대해 유동 세포분석에 의하여 검정하였다.
이 돌연변이들을 그 수를 증가시켜가면서 3개의 구성물에 포함시켰다. 그런 다음 이 3개의 구성물을 HEK 293 세포에 트랜스펙션하고, 그 결과의 조건 배지를 LGR5 항원 결합 활성에 대해 유동 세포분석에 의하여 검정하였다. 2개의 구성물 18G7H6A1 및 18G7H6A3을 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 하기 표 1A는 항체의 특정 서열을 나타낸다.
표 1A
Figure pat00001
Figure pat00002
실시예 3 - 인간화 LGR5 항체의 제조
18G7Ch로 명명한, 18G7H6A1, 18G7H6A3 및 키메릭 18G7.1(인간 IgG1 Fc에 융합된 18G7.1로부터의 쥐과 Fab)에 대한 GS 단일 유전자 벡터를 구성하고, 증폭시키고, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHOK1SV GS-KO)에 발현 평가를 위해 일시적인 트랜스펙션을 사용하여 200 ml의 부피로 일시적으로 동시-트랜스펙션하였다. 그런 다음 18G7CH에 대하여 5리터의 최종 부피, 그리고 18G7H6A1 및 18G7H6A3 둘 다에 대하여 2.5리터의 최종 부피로 CHOK1SV GS-KO 세포의 대규모 일시적 트랜스펙션을 시작하였다. 정화된 배양 상층액을 1-단계 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. SE-HPLC, SDS-PAGE 및 내독소 측정의 형태로의 생성물 품질 분석을, 대조군 샘플로서 인-하우스 인간 항체를 포함하여 1 mg/ml의 농도로 정제된 물질을 사용하여 수행하였다. 그 결과는 회수된 생성물은 고순도를 나타냈다(>95.7%).
실시예 4 - 인간화 LGR5 항체에 대한 세포주의 구성
18G7H6A3 항체를 발현하는, 안정적인 GS-CHO 형질전환체 풀을 발현 벡터 p18G7H6A3/DGV로의 CHOK1SV GS-KO 숙주 세포의 트랜스펙션에 의해 생성하였다. 그 항체를 암호화하는 유전자를 함유하는 DGV를 구성하고, 트랜스펙션하고, 그 결과의 클론 세포주를 계속해서, FACS 방법을 사용하여 형질전환체 풀의 단일 세포 분류에 의해 생성하였다. 클로닝 중에 생성된 96-웰 플레이트를 단일 콜로니의 존재에 대해 주마다 스크리닝하였다. 대략 2주 후에, 1000개의 콜로니로부터의 상층액을 Octet® 시스템 방법을 사용하여 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝한 1000개의 콜로니 중에서, 991개가 검출 가능한 수준의 항체를 생성하였다. Octet 데이터를 순위를 매기고 최고 생성 콜로니들을 진행을 위해 선택하였다.
최고 순위의 콜로니들을 CD CHO 배지의 96-딥(deep) 웰 플레이트에서 현탁 배양으로 진행시키고, 계속해서 하위배양 배지에 적응시켰다. 선택된 세포주의 생산성을 생물 반응장치 프로세스를 가능한 밀접하게 모방한 공급 체계를 사용하여 수행하였다. 배양물을 제 12일에 수득하고 항체 농도에 대하여 Octet® 시스템 방법을 사용하여 검정하였다. 수득할 때 항체 농도는 <20 mg/L 내지 3000 mg/L의 범위였다. 20개의 세포주를 생산성 스크린에서의 순위 위치, 세포주가 유래된 원래의 풀 및 각각의 세포주가 단일 콜로니로부터 발생하였다는 증거를 기반으로 추가의 평가를 위해 선택하였다. 20개의 선택된 세포주의 배양을 96 딥 웰 플레이트로부터의 연속 하위배양에 의해 진동-플라스크로 팽창시켰다. '요약된' 유가(fed-batch) 현탁 배양 생산성 스크린에서의 순위 위치를 기반으로 하고 진동-플라스크 배양에서의 기본적인 하위배양(기본적인 하위배양에서 일관되게 ≥ 1 x 106 생존 세포/mL) 중의 수용할 수 있는 성장 특징들을 고려하여, 선도 세포주를 2개의 10 L 실험실 규모의 교반 탱크 생물 반응장치에서의 평가를 위해 선택하였다. 선도 세포주는 기본적인 하위배양 중에 일관되게 고성장 및 생존력을 증명하였고 수득할 때 >2000mg/L의 역가를 나타낸다. 이 세포주를 마스터 세포 뱅크(MCB)의 생성을 위해 및 10 L 실험실 규모의 생물 반응장치에서의 평가를 위해 사용하였다.
실시예 5 - 인간화 LGR5 항체는 인간 LGR5에 결합한다
FACS-기반 검정을 사용하여 CHO 세포의 표면에서 과잉발현된 재조합 인간 LGR5에 대한 정제된 18G7H6A1 및 18G7H6A3의 결합을 측정하였다. CHO 및 CHO-LGR5 세포를 18G7H6A1 또는 18G7H6A3의 연속 희석물로 4℃에서 염색하고, 표면 염색을 PE-컨쥬게이트된 항-인간 IgG 이차 항체로 검출하고 FACScalibur에서 분석하였다. 18G7H6A1 및 18G7H6A3의 인간 LGR5 결합에 대한 EC50은 < 10 nM이었다. LGR5가 없는 야생형 CHO뿐만 아니라 항체 대조군(MOPC)을 이 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 18G7H6A3은 야생형 CHO에 대한 결합을 보이지 않았고 아이소타입 대조군은 인간 LGR5에 대해 어떠한 측정 가능한 결합을 나타내지 않았다.
18G7H6A3의 치료 효능 및 안전성을 조사하기 위한 잠재적 동물 모델 종을 확인하기 위하여, 종 상동체에 의해 발현된 LGR5에 대한 18G7H6A3의 교차-반응성을 일련의 시험관내 결합 연구로 측정하였다. 도 1 참조. 도시된 것과 같이, 항체 18G7H6A3(BNC101)는 인간 및 시노(cyno) LGR5에 강력하게 결합하는 것으로 나타났지만, 래트 또는 마우스 LGR5에 결합하지는 않았다.
실시예 6 - 플레이트-결합 재조합체, 인간 LGR5 엑토도메인에 대한 인간화 LGR5 항체의 결합
인간 LGR5에 대한 18G7H6A1 및 18G7H6A3의 결합을 ELISA-기반 플레이트 결합 검정을 사용하여 시험관내에서 평가하였다. 검정은 양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이트된 항-인간 IgG-CH1 이차 항체를 사용한 LGR5-결합 항체의 검출로, ELISA 플레이트-결합 정제된 재조합체, LGR5 엑토도메인-IgG-Fc 융합물에 대한 항체 결합을 측정하였다. 인간 LGR5-Fc에 대한 18G7H6A3의 EC50은 300 pM인 것으로 나타났다.
실시예 7 - 종양 세포에 대한 인간화 LGR5 항체의 결합 특징
LGR5을 상이한 수준으로 발현하는 인간 암 세포주에 대한 18G7H6A3의 결합 특징을 유동 세포분석에 의해 분석하여 이종성 종양 집단에 대한 18G7H6A3의 잠재적인 표적화 특성을 규정하였다. 다중 종양 세포주에서 LGR5의 발현 수준을 유동 세포분석에 의해 정량하였다.
이 연구들에서 분석한 인간 종양 세포주는 결장 암종 암 세포주(CT1(Bionomics), CT3(Bionomics), DLD1(ATCC), Ls174T(ATCC), LoVo(ATCC), SW48(ATCC), SW480(ATCC), SW620(ATCC) 및 HCT116(ATCC)), 삼중 음성 유방암 세포주(Hs578T(ATCC) 및 MDA-MB-231(ATCC)), 췌장암 세포주(AsPC-1(ATCC), BxPC3(ATCC), Capan2(ATCC), HPAFII(ATCC), SW1990(ATCC), CFPAC(ATCC), Panc10.05(ATCC) 및 PANC-1(ATCC)), 시스플라틴-민감성 난소암 세포주(OVCAR3(ATCC) 및 SK-OV-3(ATCC)), 시스플라틴-내성 난소암 세포주(SK-OV-3/CP, OVCAR8/CP, Igrov1/ CP 및 A2780/CP(TGEN)) 및 폐 선암종 세포주 HOP62(ATCC)를 포함하였다.
거의 융합지점까지 성장한 세포들을 TrypLE 세포 해리 완충제(Life Technologies)로 리프팅하고, 계수하고 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 웰당 1x105 세포로 플레이팅하였다. 18G7H6A3을 100 nM의 출발 농도에서 염색 완충액(PBS/0.8% 소 혈청 알부민)에서의 연속 희석액으로 테스트하였다. 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 1800 rpm에서 2분 동안 4℃에서 원심분리하고 염색 완충액으로 3회 세척하였다. 1:250 희석(Southern Biotech)의 50 μl의 이차 항체 염소 항-인간 IgG-PE 컨쥬게이트를 염색 완충액 중의 각각의 상응하는 웰에 첨가하였다. 샘플을 얼음 위에서 추가로 15분 동안 인큐베이션한 후, 위에서 기술한 것과 같이 세척하였고 죽은 세포를 축출하기 위해 요오드화 프로피듐(PI)(Life Technologies)을 함유한 100 μl의 염색 완충액에 재현탁하였다. 샘플을 FACScalibur 유동 세포분석기 상에서 CellQuest(Becton Dickinson) 및 FlowJo(TreeStar, Inc) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
다중 종양 세포주에서 LGR5의 세포 표면 발현 수준을 유동 세포분석에 의해 정량하였다. CT1 대장 종양 세포 및 췌장암 세포주 Panc-1, Capan2 및 CFPAC는 최고의 LGR5 발현자들 중에 있었다. 적당한 발현 수준을 췌장암 세포주(AsPC-1, SW1990, HPAFII), 시스플라틴-내성 난소암 세포주(OVCAR8/ CP, A2780/CP 및 Igrov1/CP), 뿐만 아니라 결장, 유방 및 난소암 세포주(SW48, Hs578T 및 OVCAR3)에서 관찰하였다. 낮지만 검출 가능한 수준의 LGR5 세포 표면 발현을 결장(SW480, LoVo), 및 유방암 세포주(MDA-MB-231)에서 관찰하였다. 하기의 표 2는 종양 세포주에의 18G7H6A3 FACS 결합에 대한 데이터를 요약한다.
종양 세포주 18G7H6A3(18G7.1) IgG
CRC
CT1 + -
CT3 + -
DLD1 +/- -
Ls174T +/- -
LoVo +/- -
SW48 + -
SW480 +/- -
SW620 +/- -
HCT116 +/- -
유방
MDA-MB-231 +/- -
MDA-MB-231 LM2 +/- -
Hs578T + -
CN34 +/- -
CN34 LM1 +/- -
전립선
PC-3 +/- -
PCSD1 +/- -
난소
OVCAR-3 + -
SK-OV-3 +/- -
SK-OV-3/CP +/- -
OVCAR8/CP + -
Igrov1/CP + -
A2780/CP + -
폐
HOP-62 +/- -
췌장
AsPC-1 + -
Capan2 ++ -
HPAFII + -
Sw1990* + -
CFPAC ++ -
PANC-1 ++ -
실시예 8 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 악액질 대장 종양 성장의 억제CT1 일차 CRC 이종이식 모델을 4기 전이성 결장암 환자로부터 유도하였다. 이 종양의 DNA 서열분석은 K-Ras, PI3K, PTEN, p53 및 APC를 포함한 다중 유전자에서의 공통 결장암 돌연변이를 확인해주었다. 혈청이 없는 조건하에서 배양중에 유지된 낮은 계대수의 CT1 종양구를 제 0일에 SCID/Bg 마우스에 마트리겔로 피하로 주입하였고, 종양 크기 및 체중에 대해 주 2회 모니터링하였다. 제 25일에 종양이 120 mm3에 도달하였을 때 CT1 피하 종양을 무작위로 10마리씩의 그룹들로 나누었다. 마우스들을 PBS, 항체 대조군 MOPC, 18G7H6A1, 18G7H6A3 또는 인간/쥐과 키메릭 18G7Ch 중 어느 하나로 치료하였다. 마우스에게 2.5주 동안 15 mg/kg으로 BIW로 투여하였다(총 5회 용량).
항체 18G7H6A3은 4용량의 과정(15mg/kg, 주 2회) 중에 PBS 및 MOPC 항체 대조군과 비교하여 생체내에서 유의미한 항-종양 활성을 나타냈다. 항체 18G7H6A1이 항-종양 활성을 나타낸 한편, 단클론성 18G7H6A3은 18G7H6A1 및 부모 쥐과 키메릭 18G7Ch 항체 둘 다에 대해 월등할 활성을 나타냈다. 하기 표 3은 Lgr5+ Abs의 1 내지 4 용량 후의 % CT1 종양 부피 감소(그룹 대비 MOPC)를 나타낸다.
용량의 수: 1 2 3 4
18G7Ch 9.2% 30.6% 19.5% 29.0%
18G7H6A1 17.5% 19.1% 14.2% 19.0%
18G7H6A3 38.8% 42.0% 28.9% 35.4%
실시예 9 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 대장 종양 성장의 억제CT3 일차 CRC 이종이식 모델을 K-Ras, H-Ras, APC, PI3K, PTEN, STK11, RB1, TP53, FGFR2, VANGL2, 및 ISCO에 돌연변이를 가진, 3기 mCRC 환자로부터 유도하였다. 낮은 계대수의 저온보존된 CT3 일차 이종이식 종양 단편을 5마리의 SCID/Bg 마우스에 이식하였다. 5마리의 CT3 일차 이종이식-포함 SCID 마우스로부터 모은 평균 ~1150 mm3의 종양을 이식 후 제 41일에 제거하고, 분리하고 CB.17 SCID 마우스에 마트리겔로 피하로 재이식하고, 주 2회 종양 크기 및 체중에 대해 모니터링하였다. 종양이 평균 130 mm3에 도달하였을 때, 마우스들을 무작위로 나누었다(이식 후 34일). 마우스들을 PBS, 항체 대조군 MOPC, 18G7H6A3, 18G7H6A1 또는 인간/쥐과 키메릭 18G7Ch 중 어느 하나로 치료하였다. 마우스에게 제 34일부터 시작하여 2.5주 동안 15 mg/kg으로 BIW로 투여하였다(총 5회 용량). 모든 마우스를 체중 및 종양 크기뿐만 아니라, 전체 건강상태 및 외관에 대해, 종결할 때까지 주 2회 모니터링하였다.항체 18G7H6A1이 항-종양 활성을 보인 한편, 단클론성 18G7H6A3은 4용량(15 mg/kg, 주 2회) 후에 PBS 및 MOPC 항체 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 활성을 보였다. 18G7H6A3은 부모의 쥐과 키메릭 18G7Ch 항체에 대해 월등한 활성 및 18G7H6A1에 대해 동등한 활성을 나타냈다. 하기 표 4는 테스트 Ab의 n 용량 후의 % CT3 종양 부피 감소(그룹 대비 MOPC)를 나타낸다.
Ab 용량의 수: 1 2 3 4
18G7Ch 22.6% 8.9% 17.0% 13.8%
18G7H6A1 18.3% 12.6% 28.8% 28.7%
18G7H6A3 34.2% 38.1% 23.4% 28.2%
실시예 10 - FOLFIRI와 조합된 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 대장 종양 성장의 억제CB.17 SCID 마우스에 CSC 조건하에서 성장한 CT3 세포를 이식하였다. 이식 후 제 40일에, 종양이 ~160 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 i) PBS, ii) 15일 동안 5일마다 제공된(총 3 용량) FolFiri(5FU 30 mg/kg, 류코보린 90 mg/kg 및 이리노테칸 24 mg/kg), 및 iii) FolFiri(ii.에서와 같음)와 18G7H6A3(15 mg/kg, 주 2회)의 조합을 포함하는 치료 그룹으로 무작위로 나누었다. 종양 부피의 분석은 18G7H6A3과 FolFiri의 조합이 FolFiri 처방과 비교하여 CT3 종양의 성장을 감소시킨 것을 보여주었다. 조합 치료는 제 61, 65, 68, 71 및 75일에 각각 약 58%, 53%, 45%, 33% 및 37%만큼 종양 부피를 감소시켰다(도 2).
실시예 11 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 췌장암 종양 성장의 억제
단일 작용제로서 또는 표준 돌봄과 조합한 18G7H6A3의 효능을 평가하기 위하여, 췌장암 이종이식 모델을 테스트하였다. CB17.SCID 마우스에 AsPC-1 세포를 이식하였다(1:1 비율로 마트리겔(matrigel)+RPMI로). 종양을 이식 후 제 20일에 5개의 그룹으로 무작위로 나누었다: i) PBS, ii) MOPC(15 mg/kg, 주 2회, ip), iii) 18G7H6A3(15 mg/kg, 주 2회, ip), iv) 젬시타빈(90 mg/kg, 주 2회, ip) 및 v) 상기 용량에서 젬시타빈(gemcitabine)과 18G7H6A3의 동시 조합.
단일 작용제로서의 18G7H6A3은 이식 후 제 41일에 염수 및/또는 대조군 IgG 에 비교하여 종양 성장을 거의 40%까지 억제하였다. 이에 더불어, 18G7H6A3과 젬시타빈의 조합은 젬시타빈 단독과 비교하여 AsPC-1 모델에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(이식 후 제 61일에 최대 36%까지). 단일 작용제로서의 18G7H6A3은 또한 제 65일까지 PBS 및 대조군 IgG에 비교하여 종양 성장의 일부 억제를 제공하였다.
실시예 12 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 삼중 음성 유방암 종양 성장의 억제
이 생체내 연구를 낮은 계대수의 삼중 음성 유방암 세포(ER-, PR-, HER2 과잉발현 없음)를 사용하여 수행하였다. MDA-MB-231-LM3 세포를 DMEM/ 10% FBS/ 항-항 배지를 가진 접착 배양으로 유지하였다. CB.17 SCID 마우스를 제 0일에 RPMI:마트리겔(1:1) 중의 MDA-MB-231-LM3 세포로 4번째 유선 지방 패드에 주사하고 종양 크기 및 체중에 대해 주 2회 모니터링하였다. 제 27일에, MDA-MB-231-LM3 종양을, 종양이 ~155 mm3에 도달했을 때 10마리 마우스의 4 그룹으로 무작위로 나누었다. 마우스를 PBS, 항체 대조군 MOPC, 또는 18G7H6A3으로 치료하였다. 마우스에게 3.5주 동안(7 용량) 15 mg/kg으로 BIW로 투여하였다. 항체 18G7H6A3은 PBS(60.7% 종양 성장 억제) 또는 MOPC 항체(49.3% 종양 성장 억제) 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 활성을 나타낸 것으로 발견되었다(도 3).
실시예 13 - SN38 또는 PI3K/mTOR 억제제로 치료된 대장 암세포에서 LGR5의 발현의 유도
DLD1, HCT116, LS174t, LoVo, SW48, SW480 및 SW620을 포함하여 CRC 세포주의 패널을 PI3K/mTOR 이중 억제제(NVP) 또는 SN38(이리노테칸의 활성 대사산물) 또는 5FU(5 플루오로우라실)을 포함하는 2개의 상이한 세포독성 작용제로 치료하였다. 세포를 1 um의 상기 작용제로 치료하고 72시간 후에 수득하였다. 그런 다음 세포를 Alexa Fluor647에 컨쥬게이트된 항-LGR5 Mab로 염색하고 데이터를 FACScalibur를 사용하여 유동 세포분석에 의해 분석하였다.
CRC 세포주의 유동 세포분석에 의한 분석은 PI3K/mTOR 억제제로 치료했을 때 LoVo, HCT116, LS174t, SW48, SW480 및 SW620 세포에서 LGR5의 더 큰 발현을 보여주었다. 추가적으로, SN38로의 치료는 HCT116, LS174t, SW48, SW480 및 특히 SW620 세포에서 LGR5 발현을 촉진시켰다. 그러나, 5FU 치료는 이 세포주들 중 어느 것에서도 LGR5 발현을 유도하지 못하였고, 그것은 LGR5 발현을 지배하는 기저의 메커니즘이 이 세포주들에서 별개인 것을 시사한다. 이 데이터들은 LGR5+ 세포가 상기 작용제들로의 치료에 더 내성인 것을 가리키는데, 이것은 치료가 LGR5 네거티브 비-암 줄기 세포 집단을 대부분 표적화하였기 때문이다. 이 작용제들로의 치료가 이 세포들에서의 LGR5 발현을 상향조절한 경우를 이해하기 위하여, 본 발명자들은 모든 세포주에서 유동 세포분석에 의하여 LGR5 세포 표면 발현을 분석하였다. PI3K/mTOR 억제제로 치료시에 LGR5 발현은 Lovo에서 유의미하게 상향조절되었다. 이 데이터는 소분자 억제제 또는 세포독성제로의 치료가 LGR5neg 세포를 표적으로 하여 이 세포들에서 LGR5의 증가된 발현을 유발하는 것을 가리킨다.
실시예 14 - LGR5 발현은 소분자 억제제 또는 세포독성제로 치료된 췌장암 세포주에서 촉진된다
상기 발견을 한층 더 확장하기 위하여 CRC 세포주에 더불어, LGR5의 발현을 nab-파클리탁셀, 젬시타빈 및 탁솔 및 또한 PI3K, MEK 및 GSK3β의 억제제와 같은 췌장암의 가장 관련된 경로를 표적화하는 소분자 억제제를 포함하여 관련된 케어 표준으로 치료된 일련의 췌장 세포주에서 조사하였다. 테스트한 췌장 세포주는 AsPc1, HPAFII, PANC1, BxPC3, CFPAC, PANC10.05, Capan2 및 SW1990을 포함하였다. nab-파클리탁셀로의 치료는 유동 세포분석에 의해 평가되는 바 PANC1, BxPc3 및 PANC10.05에서의 LGR5 상향조절을 초래한다. 젬시타빈 치료는 PANC1에서 LGR5를 상향조절하고 탁솔 치료는 HPAFII에서 증가된 LGR5 발현을 초래한다. PI3K/mTOR 치료는 CFPAC에서 LGR5의 상향조절을 초래하고 MEK 억제제는 HPAFII 및 SW1990에서 LGR5를 상향조절한다.
실시예 15 - LGR5는 FOLFIRI 처방(5FU, 류코보린 및 이리노테칸)으로 치료된 대장암 종양에서 상향조절된다
화학요법 치료가 대장 종양에서 LGR5 발현을 변경시키는지를 조사하기 위하여, 마우스를 5일마다 5FU(30 mg/kg i.p), 류코보린(90 mg/kg) 및 2가지 상이한 용량의 이리노테칸(24 mg/kg 또는 8 mg/kg)으로 치료하였다. 이 연구들의 결과는 CT3 종양이 화학요법 처방에 민감한 한편, CT1 종양은 완전히 퇴행되지 않았으며 처방에 대해 일부 내성을 보였다(도 4). LGR5 발현의 FOLFIRI 치료의 효과를 조사하기 위하여, 총 mRNA를 CT1 및 CT3 환자 유도된 종양으로부터 추출하고 LGR5의 발현을 qRT-PCR에 의해 측정하고 각 샘플의 LGR5의 Ct 값(사이클 한계값)을 그것의 상응하는 GAPDH 전사물로부터 제하여서 DCT(델타 Ct) 값을 생성함으로써 분석하였다. 데이터를 2 대 DCT의 동력으로서 표시되었다. LGR5의 풍부성의 분석은 LGR5 전사물이 상응하는 염수 치료된 종양과 비교하여 CT1(약 2배의 경우) 및 CT3 종양(대략 3.5배)에서 모두 증가한 것을 보여주었다.
실시예 16 - LGR5는 젬시타빈 단독으로 및 nab-파클리탁셀과 조합하여 치료된 췌장암 종양에서 상향조절된다
췌장암에 대한 표준 케어 화학요법 치료가 췌장 종양에서 LGR5 발현을 변경시키는지는 조사하기 위하여, 마우스를 주 2회 젬시타빈과 nab-파클리탁셀의 조합으로 치료하였다(JH109 일차 이종이식으로). 말단 분석에서, 종양 cDNA를 사용한 qRT-PCR 데이터는 상응하는 염수-치료된 종양에 비교하여 화학요법 치료된 종양에서 LGR5 발현의 뚜렷한 증가를 보였고, 그것은 표준 돌봄으로의 치료가 종양 세포에서 LGR5의 상향조절을 초래하는 것을 나타낸다.
췌장 종양의 환자 유래된 이종이식 모델인 JH109 모델의 LGR5 발현. 마우스에 수령체에서 연속적으로 계대되었지만 시험관내 배양 조건에 노출되지 않았던 종양 덩어리를 이식하였다. 종양-포함 마우스를 화학요법 처방(젬시타빈과 nab-파클리탁셀의 조합)으로 치료한 결과 종양 성장의 유의할만한 억제를 초래하였다. 결장암 모델과 일관되게, 화학요법은 JH109 종양에서 LGR5의 상향조절(4배 이상)을 초래하였고, 추가로 화학요법으로의 치료시에 암 줄기 세포 집단의 풍부화를 시사한다. 예를 들어 도 5 참조.
실시예 17 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 췌장 종양 성장의 억제
18G7H6A3의 효능을 또한 췌장암 이종이식 모델에서 조사하였다. CB.17 SCID 마우스에 PANC1 세포(1E6/마우스 s.c, 마트리겔+RPMI 1:1 비율로)를 이식하고, 이식 후 제 41일에 무작위로 다음의 치료 그룹으로 나누었다: i) PBS, ii) IgG 대조군(15 mg/kg, 주 2회, ip), iii) 18G7H6A3(15 mg/kg, 주 2회, ip), iv) 젬시타빈(90 mg/kg, 주 2회, ip) 및 v) 젬시타빈과 18G7H6A3의 동시 조합(15 mg/kg, 주 2회 ip). 젬시타빈을 종양 성장을 억제하기 위하여 3주 동안 배정된 그룹에 투여하였다. 모든 마우스를 주 2회 체중 및 종양 크기에 대해서뿐만 아니라, 전체 건강 및 외관에 대해 모니터링하였다.
종양 부피의 분석은 종양 성장을 억제하는 단일 작용제로서(이식 후 제 70일에 최대 30%까지) 18G7H6A3에 선호적인 경향이 있는 한편, 18G7H6A3과 젬시타빈의 조합은 젬시타빈 단독 그룹과 비교하여 PANC1 종양의 성장을 유의미하게 억제하였다(이식 후 제 80일에 최대 52%까지). 도 6 참조.
이 실시예에서, 화학요법(젬시타빈)과 조합하여 투여될 때 관찰된 18G7H6A3의 유의미한 활성은 젬시타빈 치료에 대한 반응으로 표적 항원 LGR5의 증가된 발현에 기여할 수 있다.
실시예 18 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 사전-치료된 췌장 종양 성장의 억제
세포주에 더불어, 본 발명자들은 또한 췌장암의 JH109 일차 환자 유래된 이종이식 모델에서 단일 작용제로서 또는 표준 케어와 조합된 18G7H6A3의 효능을 조사하였다. JH109 이종이식 모델은 5-FU, 젬시타빈, 에르비툭스(Erbitux) 및 방사선요법을 포함한 4가지 치료 처방을 받았던 환자로부터 유래한다. 원래의 환자 종양은 면역-결핍 마우스에서 시험관내 배양에 대한 임의의 노출 없이 연속적으로 계대되었다. JH109 모델에서 18G7H6A3의 효능을 테스트하기 위하여, 종양 포함 마우스(n=7마리)를 대조군 IgG(15 mg/kg i.p, 2회/주), 18G7H6A3(15 mg/kg i.p, 2회/주) 단일 작용제, 화학요법 케어 표준(젬시타빈(50 mg/kg i.p, 주 1회; 및 nab-파클리탁셀 30 mg/kg, i.v, 주 1회의 조합), 화학요법과 대조군 IgG의 조합, 및 화학요법과 18G7H6A3의 조합으로 치료하였다. 단일 18G7H6A3 mAb가 종양 성장에 영향을 미치지 않았던 한편, 18G7H6A3의 Nab-파클리탁셀 및 젬시타빈 화학요법과의 조합은 화학요법 단독과 비교하여 유의미하게 더 큰 정도의 종양 억제로 이어졌다. 화학요법과 조합된 18G7H6A3은 화학요법 단독과 비교하여 77% 더 큰 종양 성장 억제로 이어졌다. 18G7H7A3 화학요법 조합으로 치료된 3마리의 마우스는 그것들의 종양의 완전한 근절을 나타냈다(측정 가능한 종양이 검출되지 않음). 18G7H6A3 화학요법 조합 그룹은 치료를 중단한 후에도 종양 성장의 억제가 계속되었고 한 마리의 마우스는 화학요법을 중단한 후 3개월 후에 어떠한 측정가능한 종양이 여전히 없었다. 이 실시예에서, 화학요법(젬시타빈 플러스 nab-파클리탁셀)과 조합하여 투여될 때 관찰된 18G7H6A3의 유의미한 활성은 젬시타빈 nab-파클리탁셀 치료에 대한 반응으로 표적 항원 LGR5의 증가된 발현에 기여할 수 있고 일차 종양 벌크(bulk)를 근절하기 위한 화학요법 치료 후 생체내에서 일차 종양의 재성장 또는 재발의 방지를 증명한다.
실시예 19 - 인간화 LGR5 항체 치료는 암 줄기 세포 집단을 감소시킨다
유동 세포분석적 분석을 위해, 5개의 개별적인 종양으로부터의 세포를 줄기 세포 특이적 마커 CD44, 및 CD166에 대한 다양한 항체로 염색하였다. 종양을 해리시키고, 마우스 세포에 대해 격감시킨 후 생존 세포를 계수하였다. 해리된 세포를 유동 세포분석에 의한 세포 표면 줄기 세포 마커 발현의 분석에 사용하였다.
CD166+/ CD44+, LGR5+/ CD166+, 또는 LGR5+/ CD166+/ CD44+ 하위집단에 의해 규정되는 것과 같이 암 줄기 세포 집단에 감소가 있었다(도 7).
실시예 20 - 인간화 LGR5 항체 치료는 생체내에서 결장암 종양 재발 및 암 줄기 세포 빈도를 감소시킨다
FolFiri와 조합된 18G7H6A3의 효과를 결장암 CT3 모델에서 테스트하였다(실시예 10). 이 일차 종양 효능 연구의 결과는 3 사이클의 FOLFIRI 처방과 조합된 18G7H6A3이 종양 성장을 감소시키는 데 있어 FolFiri 단독보다 더 효과적이었음을 보여주었다. 18G7H6A3 FOLFIRI 조합 처방이 또한 암 줄기 세포(CSC) 빈도를 줄이는 데에도 효과적이었는지를 측정하기 위하여, 제 78일에 종양을 회수하고, 해리하고 모으고, 제한 희석 검정으로 10, 30, 100개의 세포/플랭크(flank)로 종양 나이브 CB17.Scid 마우스의 새로운 집단으로 재이식하였다. 그런 다음 마우스를 종양 성장에 대해 주 2회 모니터링하였고, 종양은 추가의 치료 없이 성장하도록 하였다.
FOLFIRI와 조합된 항-LGR5 항체 18G7H6A3으로 치료된 마우스로부터 분리된 세포는 FOLFIRI 단독으로 치료된 마우스로부터 분리된 세포와 비교하여 종양 형성성이 크게 감소하였다(도 8). 이에 더불어, 18G7H6A3 FOLFIRI 조합으로부터 재이식된 세포는 FOLFIRI 단독과 비교하여 유의미하게 더 느린 종양 성장 프로파일 및 진행까지의 지연된 시간을 가졌다(도 9). 마지막으로, 18G7H6A3 치료는 제 40일에 6 팩터 선형 회귀 분석에 의하면 암 줄기 세포 빈도를 감소시켰다(1/856.3 18G7H6A3/FOLFIRI 대비 FOLFIRI에 대해 1/138.6). 이 데이터들은 FOLFIRI와 조합된 18G7H6A3이 종양 개시 또는 암 줄기 세포 집단을 효과적으로 표적화하는 것을 가리킨다. 제 68일은 30개 세포/동물 데이터에 대한 마지막 날이었다. 데이터는 p=0.0039에서 유의미하다.
실시예 21 - 인간화 LGR5 항체 치료는 생체내에서 췌장암 종양 재발 및 암 줄기 세포 빈도를 감소시킨다
젬시타빈과 조합된 18G7H6A3의 효과를 췌장암 PANC1 모델에서 테스트하였다. 이 연구는 젬시타빈과 조합된 18G7H6A3이 젬시타빈 단독과 비교하여 PANC1 모델에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였음을 보여주었다. 이 치료 그룹으로부터의 종양 세포를 수득하고, 해리하고, 모으고, 제한 희석 검정(500, 1500, 4500 또는 13500개의 세포/동물)으로 CB.17 SCID 마우스의 새로운 집단으로 재이식하고 치료 없이 성장하도록 하였다.
젬시타빈과 조합된 항-LGR5 항체 18G7H6A3으로 치료된 마우스로부터 분리한 세포들은 젬시타빈 단독으로 치료된 마우스로부터 분리된 세포들과 비교하여 제한 희석 검정 재이식에서 종양 형성성이 크게 감소하였다. 젬시타빈과 18G7H6A3의 조합으로 치료된 재이식된 PANC1 종양은 4500개의 세포로 이식된 마우스에서 접종 빈도의 감소를 보였고(젬시타빈으로 40% 대비 조합으로 20%) 또한 13500개의 세포로 이식된 마우스에서도 감소를 보였다(젬시타빈으로 100% 대비 조합으로 70%). 선형 회귀를 사용하여, 젬시타빈 이식된 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 조합 그룹과 비교하여 젬시타빈에서 약 1.5배 더 높았다(14833 중 1 대비 21336 중 1). 이 데이터는 젬시타빈과 조합된 18G7H6A3이 종양 개시 또는 암 줄기 세포 집단을 효과적으로 표적화하는 것을 가리킨다.
PANC1 종양에 더불어, 본 발명자들은 단일 작용제로서 또는 18G7H6A3과 조합된 젬시타빈으로 치료된 AsPC-1 종양을 포함한 마우스에서 제한 희석 실험(500, 1500, 4500 및 13500개의 세포를 사용함)으로 접종의 백분율 및 암 줄기 세포 빈도를 분석하였다. 치료 후 제 40일에서의 종양 부피 측정은 4500 또는 13500개의 세포로 이식된 마우스에서 젬시타빈 대비 조합에서의 종양 포함 마우스의 백분율의 감소(각각 40% 및 80% 대비 30% 및 50%)를 보였다. 암 줄기 세포의 빈도 또한 젬시타빈 대비 조합 그룹에서 1.5배 이상 더 컸고, 그것은 젬시타빈과 조합된 18G7H6A3이 췌장암에서 암 줄기 세포 집단을 표적화하는 것을 추가로 가리킨다.
실시예 22 - 인간화 LGR5 항체 치료는 생체내에서 삼중 음성 유방암 종양 재발 및 암 줄기 세포 빈도를 감소시킨다
파클리탁셀과 조합된 18G7H6A3의 효과를 삼중 음성 유방암 MDA-MB-231-LM3 모델에서 테스트하였다(실시예 12). 이 연구는 파클리탁셀과 조합된 18G7H6A3이 파클리탁셀 단독과 비교하여 종양 성장을 최소한으로 추가 억제하는 것을 보여주었다. 이 종양들을 수득하고, 해리하고, 모으고, 10, 30, 100개의 세포/플랭크로 제한 희석 검정으로 CB.17 SCID 마우스의 새로운 집단으로 재-이식하고 치료 없이 성장하도록 하였다.
파클리탁셀과 조합된 항-LGR5 항체 18G7H6A3으로 치료된 마우스로부터 분리한 세포들은 파클리탁셀 단독으로 치료된 마우스로부터 분리된 세포들과 비교하여 종양 형성성이 크게 감소하였다. 이에 더불어, 18G7H6A3 플러스 파클리탁셀 종양으로부터 재-이식된 세포는 파클리탁셀 단독과 비교하여 유의미하게 더 느린 종양 성장 프로파일 및 진행까지의 지연된 시간을 가졌다. 마지막으로, 18G7H6A3 플러스 파클리탁셀 치료는 선형 회귀 분석에 의하면 암 줄기 세포 빈도를 감소시켰다. 이 데이터들은 파클리탁셀과 조합된 18G7H6A3이 종양 개시 또는 암 줄기 세포 집단을 효과적으로 표적화하는 것을 가리킨다.
실시예 23 - 인간화 항-LGR5 항체 및 화학요법으로의 예방적 치료에 의한 생체내에서의 전이성 대장암 성장의 억제
대장암 환자의 간 메트(liver met)로부터 유래된 낮은 계대수의 대장암 세포(BMCRC086)를 사용하여 생체내 연구를 수행하였다. 제 0일에, BMCRC086 세포를 해동하고, RPMI:마트리겔(1:1)에 현탁하여 CB.17 SCID 마우스의 뒤쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 동물들을 종양 크기 및 체중에 대해 주 2회 모니터링하였다. 제 7일에, 마우스들을 PBS, 18G7H6A3, FOLFIRI 또는 18G7H6A3과 조합된 FOLFIRI로 치료하였다. 마우스를 PBS 및 18G7H6A3로, 7.5주 동안 15 mg/kg으로 BIW로 투여하였다(16 용량). 마우스에 4주 동안(6 용량) FOLFIRI를 투여하였다(제 7, 12, 17, 22, 27 및 32일에 30 mg/kg 플루오로우라실 및 90 mg/kg 류코보린; 제 8, 13, 18, 23, 28 및 33일에 24 mg/kg 이리노테칸). FOLFIRI와 조합된 18G7H6A3은 FOLFIRI 단독과 비교하여 유의미한 항-종양 활성을 보였다(도 10).
실시예 24 - 인간화 LGR5 항체 치료는 Wnt 신호전달 경로를 억제한다
생체내 종양 효능 연구에서 결장암 CT1(실시예 8) 및 CT3(실시예 9)으로부터의 18G7H6A3 치료된 종양을 웨스턴 블롯 분석에 의해 특성화하였다. 각각의 치료된 마우스들(그룹당 n=5 내지 10마리 마우스)로부터의 종양 샘플을 희생 후 절제하고, 즉시 액체 질소로 냉각된 모르타르에서 냉동시키고, 막자(pestle)로 갈은 후(저온 분쇄), 액체 질소에서 순간 냉동시켜 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 저온 분쇄된 종양을 극저온 용해 완충액(포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유한 환원 RIPA 완충액)으로 30분 동안 얼음 위에서 때때로 볼텍싱하면서(vortexing) 용해시켰다. 종양 용해 단백질을 함유한 상층액을 SDS-PAGE 겔 상에서 작동시킨 후 얼마간의 Wnt-신호 단백질(및 그것들의 인산화된 형태)에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. CT1 및 CT3 종양의 웨스턴 블롯에서 치료 그룹들 사이의 얼마간의 유의미한 차이가 관찰되었다. 도 11에서, 포스포-Thr41/Ser45-β-카테닌(Wnt-신호 단백질)은 비활성의, 그리고 계속해서 분해된, 단백질의 형태의 마커이고, 18G7H6A3이 생체내에서 종양 세포의 LGR5 신호전달을 억제할 수 있는 것을 입증한다.
실시예 25 - 인간화 LGR5 항체 치료는 시험관내에서 Wnt-신호전달 경로를 억제하지 못한다
부모 HEK-293T 세포들 및 LGR5를 안정적으로 발현하는 HEK-293T 세포를 TCF-LEF 리포터 벡터-함유 렌티바이러스(GFP Cignal, QIAGEN)로 형질유도하고 리포터의 안정적인 발현에 대해 선택하였다. 부모 및 LGR5 발현 안정적 리포터 세포주를 96 웰 플레이트에 25,000개/웰로 플레이팅하고, 밤새 부착시키고, 혈청을 고갈시키고 항체 또는 비히클로 6시간 동안 처리한 후, 재조합 인간 Wnt3a(3nM) 및 재조합 인간 R-스폰딘으로 18시간 동안 처리하였다. 각각의 R-스폰딘 1-3에 대한 2개의 농도 및 R-spo4의 한 가지 농도를 TCF/LEF 리포터 세포주의 활성화에서 상이한 R-스폰딘의 활성에 대한 본 발명자들의 분석을 기반으로 테스트하였다(100pM, 300pM, 1nM,3nM 또는 10nM). 리포터 구동된 GFP 신호를 플레이트 판독기에서 측정하였다. 제시한 모든 실험을 모으고 테스트한 각각의 R-스폰딘에 대해 3개의 독립적인 실험(각 실험을 2회 반복하여 수행하였다)으로부터 데이터를 모았다(데이터는 평균 + SD임).
도 12에서 나타낸 것과 같이, 가용성 18G7H6A3의 증가하는 농도는 Wnt3a 플러스 RSPO1, RSPO2 또는 RSPO3의 조합에 의한 TCF/LEF 프로모터 구동 GFP 발현의 유도에 영향을 미치지 않았다. RSPO 및 Wnt의 존재하에 LGR4 및 LGR5 둘 다를 통한 신호전달 활성의 유도를 억제하는 것으로 나타난, 양성 대조군 항체 76C12가 또한 나타났다. 이 데이터는 항-LGR5 항체 18G7H6A3가 RSPO-구동 TCF/LEF 프로모터 활성화를 차단하지 못하는 것을 증명한다.
실시예 26 - 인간화 LGR5 항체는 ADCC(항체 의존성 세포 세포독성) 메커니즘을 통해 종양 세포를 표적화한다
CHO-LGR5 세포를 융합지점까지 성장시키고 회전시키고, PBS에 재현탁하고 계수하였다. 세포의 분액(대략 100k)을 100 μM의 사전-가온된(37℃) CFSE(카르복시플루오레세인석신이미딜 에스테르)를 함유한 다른 튜브에 첨가하고 그 혼합물을 세포 인큐베이터에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 최종 CFSE 농도는 약 1 μM이었다. 다음에, 세포를 세척하고 사전-가온된 배지에 재현탁하여 인큐베이터에 또 다시 30분 동안 넣어둔 후 PBS로 세척하였다. 그런 다음 염색된 세포를 18G7H6A3(100 μM)으로 염색하였다. 항체의 CHO-LGR5 세포에의 결합을 확실하게 하기 위하여, 일부 연구에서, 세포의 분액을 또한 이차 염소 항-인간 PE 컨쥬게이트된 항체로 염색하고 실험실의 calibur 기계에서 분석하였다. U937 세포를 DDAO-SE(DDAO 석신이미딜 에스테르; 100K 세포에 대해 2 μM의 염료)로, 실험실의 빛이 차단된 곳에서 및 실온에서 15분 동안 염색하였다. 그런 다음 세포를 1 ml의 FBS(소 태아 혈청)로 이어서 빛이 차단된 곳에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 다음에 세포를 FBS(10%)가 첨가된 PBS로 세척하고 FBS(2.5%)가 첨가된 RPMI에 재현탁하였다. CHO-LGR5-18G7H6A3 및 U937-DDAO-SE 표지된 세포를 모두 세포 인큐베이터에서 5시간 동안 동시-인큐베이션하고 실험실에서 calibur 기계에서 분석하였다. 음성 대조군으로서, CHO-LGR5-CFSE 세포(18G7H6A3 염색이 없음)의 분액을 또한 U937과 동시에 인큐베이션하고 calibur 기계에서 분석하였다.
유동 세포분석 데이터의 분석은 CFSE 및 18G7H6A3으로 염색된 CHO-LGR5 세포의 대부분이 생존 가능하고 calibur 기계에서 검출 가능한 것을 보여주었다. 추가적으로, U937(U937(인간 단핵세포 세포주; 이펙터 세포) 및 CHO-LGR5 세포가 모두 염색되었을 때 검출 가능하였고 개별적으로 획득할 수 있었다. 최종적으로 U937-DDAO-SE 및 CHO-LGR5-CFSE-18G7H6A3의 동시 인큐베이션은 세포들의 이중 양성 집단을 증명해주었지만, U937 및 18G7H6A3이 없는 CHO-LGR5-CFSE의 동시 인큐베이션은 이중 양성 집단을 생성하지 못하였다. 이중 양성 집단의 존재는 U937(FcR을 발현함)의 CHO-LGR5-18G7H6A3(Fc 부분을 발현함)에의 교차 결합의 지표이고 추가로 ADCC가 18G7H6A3의 항-종양 활성의 메커니즘들 중 하나인 것을 시사한다.
실시예 27 - 인간화 LGR5 항체는 LGR5를 내재화한다
18G7H6A3의 내재화를 LGR5를 과잉발현하는 CHO 세포에 대해 조사하였다. 세포를 100 nM의 항체로 30분 내지 2시간 동안 4℃에서 염색하고, 과잉 Ab를 세척하여 제거하고 염색된 세포를 4℃ 또는 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 다양한 시점에 AlexaFluor488-컨쥬게이트된 이차 항체로 염색하여 세포 표면-결합 항체의 내재화를 모니터링하였다. 37℃에서 인큐베이션할 때, 내재화된 비율은 6.703±1.282 분의 표면 국지화에 대해 측정된 t1/2 값을 가졌다. 표면-결합 항체에서 약간의 감소가 관찰되긴 하였지만 내재화는 4℃에서 인큐베이션에 의해 크게 차단되었다.
실시예 28 - 인간화 LGR5 항체는 가용성 RSPO의 LGR5에 대한 결합을 경합적으로 차단하지 못한다
인간 R-스폰딘 1/2/3/4 단백질의 존재하에 비오틴-18G7H6A3의 hLGR5-Fc와의 상호작용을 경합 ELISA 방식을 사용하여 조사하였다. LGR5-Fc를 96-웰 고결합 ELISA 플레이트에서 2 μg/mL로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS + 1% BSA로 차단하였다. 비오틴-18G7H6A3을 결합 완충액으로 1 μg/mL로 희석하였다. 농도를 LGR5-Fc와 비오틴-18G7H6A3 사이의 사전의 직접 결합 ELISA로부터 선택하여 EC50 농도를 넘은 왕성한 신호를 얻었다. 경합자 단백질을 ELISA 플레이트에 비오틴-18G7H6A3과 동시에 다양한 농도에서 첨가하였다. 스트렙트아비딘-HRP(R&D Systems, cat # 890803)의 1:1,000의 희석을 검출에 대해 사용하였다. 플레이트를 TMB(Thermo)로 전개시키고, 데이터를 SpectraMaxPlus 384 플레이트 판독기에서 450 nm에서 수집하였다. 데이터 분석을 GraphPad Prism 6 프로그램을 사용하여 시행하였다. ELISA를 비오틴-mAb 및 경합자 농도를 약간 변형시켜서 3회 반복하였다.
양성 대조군으로서, LGR5-Fc를 플레이트상에서 비오틴-18G7H6A3의 hLGR5-Fc에 대한 결합과 경합시켰다. R-스폰딘 1/2/3/4를 플레이트상에 코팅된 LGR5-Fc에 대한 비오틴-18G7H6A3의 결합을 차단하는 능력에 대해 테스트하였다. 단백질은 R&D Systems으로부터 구입하였고, 포유동물 세포에서 발현된 전체 길이 구성물이다. R-스폰딘 단백질의 최고 농도에서, 항체 결합의 LGR5에 대한 완전한 차단은 관찰되지 않았다(도 13).
실시예 29 - 인간화 LGR5 항체는 가용성 RSPO의 LGR5에 대한 결합을 경합적으로 차단하지 못한다
리간드 단독(RSPO 또는 노린(Norrin))의 LGR5에 대한 결합은 LGR5 신호전달을 유도하기에는 충분하지 못하다. 대신, LGR5는 신호전달을 구동하기 위해 다중 보조-수용체들과의 사차 복합체를 형성한다. LGR5 사차 복합체의 형성에 대한 18G7H6A3의 영향을 조사하기 위하여, R-스폰딘 1/2/3/4 및 노린의 존재하에 RNF43, ZNRF3, 및 LRP6에 대한 LGR5의 결합을 ELISA 방식을 사용하여 조사하였다. RNF43-Fc, ZNRF3-Fc, 및 LRP6-Fc를 96-웰 고결합 플레이트에 1x PBS 중의 4 μg/mL로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하고 PBS + 1% BSA로 차단하였다. LGR5-Fc를 일차 완충액에 1 μg/mL로, 전부 1 μg/mL의 R-스폰딘 1/2/3/4 또는 0.5 μg/mL의 노린의 존재 또는 부재하에 희석하였다. R-스폰딘 1/2/3/4 또는 노린을 ELISA 플레이트에 첨가하기 전에 hLGR5-Fc와 함께 사전인큐베이션하였다. 3회 반복 웰을 각 조건에 대해 사용하고 3회 반복으로 테스트하였다. 1:2,000 항-FLAG mAb(세포 신호전달)를 사용하여 결합된 hLGR5-Fc를 검출하였다. 1:10,000 희석의 항-마우스 IgG HRP(JIR)를 사용하여 검출하였다. 플레이트를 TMB(Thermo)로 전개시키고, 데이터를 SpectraMaxPlus 384 플레이트 판독기에서 450 nm에서 수집하였다. 데이터 분석을 GraphPad Prism 6 프로그램을 사용하여 시행하였다. LGR5, 리간드 RSPO 또는 노린, 및 보조-수용체(RNF43-Fc, ZNRF3-Fc, 및 LRP6-Fc)와의 사차 복합체의 형성을 관찰하였다.
다음에, 18G7H6A3을 ELISA 플레이트에 LGR5-Fc 및 RSPO 또는 노린의 존재하에 첨가하였다. 18G7H6A3은 RSPO 및 노린 리간드 두가지뿐만 아니라 모두 3개의 보조-수용체(RNF43, ZNRF3, 및 LRP6)와의 LGR5 사차 복합체의 형성을 유의미하게 감소시켰다. 도 14 참조. 18G7H6A3이 리간드 결합과 직접적으로 또는 경합적으로 경쟁하지 않기 때문에, 이 데이터는 억제의 알로스테릭 모델의 증거이다.
실시예 30 - 항-LGR5 항체 18G7H6A3의 에피토프 지도화
항체 18G7H6A3이 결합하는 LGR5의 특이적인 영역(들)을 추가로 특성화하기 위하여, 에피토프 지도화 실험을 수소 중수소 교환 질량 분광분석을 사용하여 수행하였다. 수소-중수소 교환 실험을 시행하기에 앞서, 달라지는 농도의 구아니딘 염산염(GdnHCl) 중의 중수소가 첨가되지 않은 완충액으로 제조된 테스트 소화물을 LGR5 단독의 최상 펩타이드 포함범위에 대한 단백질분해 조건을 최적화하기 위해 만들었다. DXMS에 대한 펩신 소화를 위해, 샘플을 5℃에서 해동한 후 즉시 돼지의 펩신(Sigma)이 채워진 프로테아제 칼럼 상에서 0.05% 트라이플루오로아세트산과 함께 100 μl/분의 유량으로 소화시켰다. 펩신 단편을 C18 트랩 칼럼에 수집하고 6 내지 38%의 선형 아세토니트릴 구배로 C18 역상 칼럼(Vydac)에서 분리하였다. 칼럼 유출물을 LCQ 고전적(ThermoFinnigan, Inc.) 또는 Q-TOF 질량 분광분석기(Micromass)에 직접 전기분무하였다. MS/MS 데이터 세트로부터의 펩신-생성된 펩타이드의 측정을 SEQUEST(ThermoFinnigan, Inc.)의 사용을 통해 용이하게 하였다. 그런 다음 이 세트의 펩타이드를 DXMS Explorer(Sierra Analytics Inc., Modesto, CA)에 의해 추가로 확인하였다. GdnHCl의 상이한 농도에 대한 펩타이드 포함범위 지도를 비교하였고, 각각의 개별 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 최상의 포함범위 지도를 가진 조건을 후속되는 중수소 교환 실험에 사용하였다. 모든 단계를 앞서 기술한 것과 같이 0℃에서 수행하였다.
교환 실험을 단백질 완충액 중의 LGR5-Fc, 또는 18G7H6A3과 사전인큐베이션한 LGR5-Fc를 D20 완충액과 50% D20의 최종 농도로 혼합함으로써 시작하였다. 혼합물을 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 또는 10,000초 동안 0℃에서 인큐베이션한 후 교환 반응을 극저온 퀀칭 용액(0.96%의 포름산, 0 ~ 0.8 M 구아니딘 염산염)을 첨가함으로써 퀀칭하여 0.58%의 포름산 및 0 ~ 0.5 M 구아니딘 염산염, pH 2.5의 최종 농도를 가진 샘플을 만들었다. 그런 다음 샘플을 즉시 드라이아이스상에서 냉동시켜서 -80℃에서 보관하였다. DXMS 실험의 데이터 처리를 앞서 기술한 것과 같이 특수화된 소프트웨어를 사용하였다(DXMS Explorer, Sierra Analytics Inc.).
수소/중수소(H/D)-교환 데이터는 18G7H6A3의 결합으로 인한 용매 노출에서의 변화 및 항체의 항원에의 결합시 표면 노출된 잔기들의 묻힘과 관련된 상세한 내용을 제공한다. HD 교환 데이터 분석은 X-선 결정학 연구에 의해 확인된 바와 같이 R-스폰딘 결합 부위의 면과 반대쪽에서, 18G7H6A3이 류신 풍부한 반복부 6-9의 볼록한 표면 내에서 서열번호 47의 아미노산 T175, E176, Q180, R183, S186, A187, Q189, D247, E248, T251, R254, S257, N258, K260 아미노산에 결합하는 것을 나타낸다(예컨대 Chen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50, 그 전문이 참조로 포함됨). 이 데이터는 LGR5의 R-스폰딘에의 결합에 포함된 잔기들이 18G7H6A3에의 결합에는 포함되지 않는 것을 보인다. 이 예비 결과들은 LGR5의 다른 구조적 요소들이 18G7H6A3의 결합 부위에 포함될 수 있다는 사실을 배제하지는 않는다.
실시예 31 - 결장암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여
결장암에 걸린 인간 환자의 집단을 화학요법으로 치료하고 종양 부피를 모니터링한다. 평균 종양 부피는 화학요법을 시작할때 확장되는 것이 중단되고 실제로 감소하는 것으로 관찰된다. 연장된 기간 후에, 종양 부피는 안정화되고 결국에는 증가하기 시작한다.
결장암에 걸린 제 2 인간 환자 집단을 18G7H6A3과 병용-투여된 화학요법으로 치료한다. 다시, 평균 종양 부피를 모니터링한다. 종양 부피는 화학요법을 시작할때 확장되는 것이 중단되고 실제로 감소하는 것으로 관찰된다. 종양 부피는 제 1 집단의 그것보다 실질적으로 더 낮은 최소 부피로 감소하는 것으로 관찰된다. 또한 종양 크기는 제 1 집단에 비하여 실질적으로 연장된 시간 동안 낮게 유지되는 것으로 나타난다.
실시예 32 - 결장암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여
결장암에 걸린 인간 환자의 제 1 집단에게 화학요법만을 투여한다. 결장암에 걸린 인간 환자의 제 2 집단에는 18G7H6A3과 조합된 화학요법을 투여한다.
제 1 집단은 종양 크기 및 성장에서 일시적인 감소를 보인 후에, 종양 성장은 재개되고 증상도 복귀된다. 화학요법 치료 후 종양 성장은 후속되는 화학요법 치료에 대해 다루기 힘든 것이 된다.
제 2 집단은 종양 크기의 기저 수준으로의 감소 및 종양 성장의 중단을 보인다. 종양 성장은 치료 처방 중에 또는 치료 처방의 완료 후에 재개되지 않는다. 처방을 완료한 후에, 성장은 복귀되지 않고 암의 증상들은 더 이상 제 2 집단에 존재하지 않는다.
실시예 33 - 결장암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여는 생존율을 증가시킨다
결장암에 걸린 인간 환자의 제 1 집단에게 화학요법만을 투여한다. 결장암에 걸린 인간 환자의 제 2 집단에게는 18G7H6A3과 조합된 화학요법을 투여한다.
치료 후 설정된 기간(1년)에 환자 생존율을 모니터링한다. 제 2 집단에서의 환자 생존율은 제 1 집단에서의 환자 생존율보다 실질적으로 더 높은 것으로 관찰된다. 즉, 제 2 집단의 유의미하게 더 높은 비율이 제 1 집단의 생존률에 비교하여 치료 후 1년이 지난 후에 생존한다.
유사한 관찰이 후속 간격에서 이루어지고, 제 1 간격에서의 생존자 중에서, 제 2 그룹의 구성원들이 제 2 간격(치료 후 2년)에 유의미하게 더 많이 생존할 가능성이 있고 그들은 치료 후 1년째에 살아 있는 제 1 그룹의 구성원들인 것으로 관찰된다.
실시예 34 - 유방암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여
유방암에 걸린 인간 환자 집단을 화학요법으로 치료하고 종양 부피를 모니터링한다. 평균 종양 부피는 화학요법을 시작할 때 확장되는 것이 중단되고 실제로 감소하는 것으로 관찰된다. 연장된 기간 후에, 종양 부피는 안정화되고 결국에는 증가하기 시작한다.
유방암에 걸린 제 2 인간 환자 집단을 18G7H6A3과 병용-투여된 화학요법으로 치료한다. 다시, 평균 종양 부피를 모니터링한다. 종양 부피는 화학요법을 시작할때 확장되는 것이 중단되고 실제로 감소하는 것으로 관찰된다. 종양 부피는 제 1 집단의 그것보다 실질적으로 더 낮은 최소 부피로 감소하는 것으로 관찰된다. 또한 종양 크기는 제 1 집단에 비하여 실질적으로 연장된 시간 동안 낮게 유지되는 것으로 나타난다.
실시예 35 - 유방암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여
유방암에 걸린 인간 환자의 제 1 집단에게 화학요법만을 투여한다. 유방암에 걸린 인간 환자의 제 2 집단에게는 18G7H6A3과 조합된 화학요법을 투여한다.
제 1 집단은 종양 크기 및 성장에서 일시적인 감소를 보인 후에, 종양 성장은 재개되고 증상도 복귀된다. 화학요법 치료 후 종양 성장은 후속되는 화학요법 치료에 대해 다루기 힘든 것이 된다.
제 2 집단은 종양 크기의 기저 수준으로의 감소 및 종양 성장의 중단을 보인다. 종양 성장은 치료 처방 중에 또는 치료 처방의 완료 후에 재개되지 않는다. 처방을 완료한 후에, 성장은 복귀되지 않고 암의 증상들은 더 이상 제 2 집단에 존재하지 않는다.
실시예 36 - 유방암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여는 생존율을 증가시킨다
유방암에 걸린 인간 환자의 제 1 집단에게 화학요법만을 투여한다. 유방암에 걸린 인간 환자의 제 2 집단에게는 18G7H6A3과 조합된 화학요법을 투여한다.
치료 후 설정된 기간(1년)에 환자 생존율을 모니터링한다. 제 2 집단에서의 환자 생존율은 제 1 집단에서의 환자 생존율보다 실질적으로 더 높은 것으로 관찰된다. 즉, 제 2 집단의 유의미하게 더 높은 비율이 제 1 집단의 생존률에 비교하여 치료 후 1년이 지난 후에 생존한다.
유사한 관찰이 후속 간격에서 이루어지고, 제 1 간격에서의 생존자 중에서, 제 2 그룹의 구성원들이 제 2 간격(치료 후 2년)에 유의미하게 더 많이 생존할 가능성이 있고 그들은 치료 후 1년째에 살아 있는 제 1 그룹의 구성원들인 것으로 관찰된다.
실시예 37 - 결장암에 걸린 인간 환자에게 18G7H6A3의 투여는 부작용을 감소시킨다
결장암에 걸린 인간 환자의 제 1 집단에게 화학요법 및 LGR5-RSPO 결합 및 신호전달을 차단하는 항-LGR5 항체를 투여한다. 결장암에 걸린 인간 환자의 제 2 집단에게 화학요법 및 18G7H6A3을 투여한다.
제 1 집단은 LGR5를 통한 RSPO1 신호전달의 간섭과 관련된 비-치료적 부작용을 입증한다. 이런 부작용들은 환자 건강에 해롭다.
화학요법과 조합된 18G7H6A3을 투여한 제 2 집단은 LGR5를 통한 RSPO1 신호전달의 간섭과 관련된 비-치료적 부작용을 나타내지 않는다.
실시예 38 - 진전된 CRC 종양에서의 LGR5 발현
LGR5 전사물 발현을 LGR5 특이적 프로브를 사용하여 RNAscope 기술을 사용하여 조사하였다. LGR5 전사물은 결장, 장, 소뇌 및 췌장을 포함한 조직에서 검출 가능하였다. LGR5 전사물은 또한 CT1 CRC 및 JH109 췌장 종양을 포함하여 환자 유래 이종이식(PDX) 조직에서 검출 가능하였다. LGR5 발현을 초기(등급 I) 대비 진전된(전이성) 병변을 포함하여 종양 형성의 상이한 단계들에서 분리된 CRC 환자 샘플에서 조사하였다. LGR5 전사물은 CRC 등급 I, II 및 III 병변에서 발현되었고, CRC 전이성 병변에서 고도로 발현되었다.
실시예 39 - 전이성 췌장 환자 유래 이종이식에서의 LGR5 발현
전이성 췌장 환자 유래 이종이식에서의 LGR5 발현을 정량적 중합효소 연쇄 반응(QPCR)을 사용하여 조사하였다. 종양 조직의 샘플을 순간 냉동시키거나 RNAlater(Qiagen, CA)를 함유한 저온 바이알에 첨가하고, 4℃에서 여러 시간 동안 인큐베이션한 후에 -70℃에 옮겼다. 총 RNA를 Qiagen RNeasy 추출 키트(Qiagen, CA)를 사용하여 추출하고, cDNA를 SuperScriptIII 키트(Life Technologies, CA) 및 제조업체에 의해 제공된 프로토콜을 사용하여 합성하였다. 인간 LGR5 전사물 풍부성을 인간 특이적 LGR5 및 GAPDH 프라이머 및 스텝원 서모사이클러(StepOne Thermocycler)(Life Technologies, CA)에서 다음의 열 조건: 50℃(2분); 90℃(2분) 및 40 사이클의 90℃(15초) 및 60℃(1분) 및 용융 곡선 평가(65℃-95℃)를 사용하여 측정하였다. LGR5 풍부성을 2^δCt 방정식을 사용하여 정량하였다.
LGR5는 전이성 췌장 환자 유래 이종이식에서 고도로 발현되었다. 화학요법으로의 치료는 췌장 종양에서 증가된 LGR5 발현을 초래하였다. 인간 특이적 프라이머를 사용하여, LGR5 전사물은 일련의 췌장 환자 유래 이종이식에서 QPCR을 사용하여 측정 가능하였다. LGR5가 대부분의 종양에서 검출 가능하였던 한편, 전이성 종양에서 증가된 LGR5 발현의 경향이 있었고, 그것은 진전된 종양 형성에서 LGR5에 대한 역할을 추가로 시사한다.
LGR5 발현을 JH109, ASPC1 및 PANC1을 포함한 일련의 췌장 종양에서 조사하였다. 돌봄 치료 표준(SOC)(JH109에서 겜자(Gemzar) 및 아브락산(Abraxane) 및 PANC1 및 ASPC1에서 겜자 단독)으로의 치료는 전술한 종양의 각각에서 LGR5 발현의 유도를 초래하였다(도 15). 특히, LGR5 발현은 18G7H6A3 및 SOC의 조합으로 치료된 종양에서 대조군(염수 또는 MOPC)과 비슷한 수준으로 감소하였다. 이 데이터들은 LGR5 발현이 PANC 종양에서 조합 요법(18G7H6A3+SOC)에 대한 반응의 생체마커로서 작용할 수 있음을 추가로 나타낸다.
실시예 40 - CTNNB1은 CRC 및 췌장 종양에서 18G7H6A3 표적 유전자들 중 하나이다
18G7H6A3에 대한 Wnt 경로에서 잠재적 표적들을 조사하였다. Wnt QPCR 플레이트(Qiagen, CA)를 96 웰 PCR 플레이트에서 약 80개의 Wnt 경로 유전자에 대한 프라이머들을 사용하여 제조하였다. 18G7H6A3 또는 MOPC(대조군) 치료된 종양으로부터의 cDNA를 모으고 Wnt 플레이트에서의 QPCR을 수행하였다. 각 플레이트에서의 데이터를 상응하는 GAPDH에 대해 표준화하였고 각 유전자의 풍부성을 2^δCt 방정식을 사용하여 측정하였다. 배수 차이를 측정하기 위하여, 각각의 18G7H6A3 치료된 종양의 데이터를 MOPC 치료된 그룹으로부터의 상응하는 값으로 나누었다. 1보다 큰 또는 1 아래의 값들은 18G7H6A3 치료된 그룹에서 각각 상향조절 또는 하향조절의 지표였다. 상향- 또는 하향-조절된 유전자들의 수의 예비 평가는 두 종양 모델(CT1 및 CT3)에서 모두 상향조절된 유전자보다 하향조절된 유전자가 더 많은 것을 나타냈고, 그것은 18G7H6A3이 유전자 발현에 대해 억제 효과를 나타내는 것을 시사한다. 상세한 분석은 FZDB, FZD7, WNT7B, FBXW11, FZD1, DVL1, CSNK2A1 및 CTNNB1을 포함하여 차등적으로 발현된 여러 유전자를 확인해주었다.
자궁경부암에서는, LGR5 발현과 CTNNB1 사이에 밀접한 관계가 있을 수 있다. 다른 연구에서, LGR5의 과잉 발현(LGR5 재조합 벡터를 사용함) 또는 하향조절(shRNA를 사용함)은 각각 CTNNB1의 상향조절 또는 하향조절을 초래하였다(Chen Q, Cao HZ, Zheng PS. 2014. Oncotarget 5: 9092-105). 추가적으로, 자궁경부암 환자로부터의 면역조직화학 슬라이드의 분석은 LGR5와 CTNNB1 발현 사이에 유의미한 상관관계를 보여주었다. 이 연구에서, CTNNB1 발현을 추가로 QPCR(전사물 수준을 측정하기 위하여) 및 웨스턴 블롯팅(단백질 발현을 평가하기 위하여)을 사용하여 조사하였다. 인간 특이적 프라이머를 사용하여, CTNNB1 발현을 췌장 및 CRC 종양에서 조사하였다. 실시예 45에서 설명된 LGR5 발현과 유사하게, SOC로의 치료는 CTNNB1 발현을 증가시켰고 18G7H6A3과 SOC의 조합은 CTNNB1 발현의 감소를 초래하였다. 추가적으로, CTNNB1 발현은 18G7H6A3으로 치료된 CT1 종양에서 약 35% 감소하였다. 그러므로, 18G7H6A3으로의 치료는 CTNNB1을 억제한다. β-카테닌 및 포스포-β-카테닌(Wnt 경로에서 활성의 결핍의 지표)의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 조사하였다. ASPC1 종양에서의 웨스턴 블롯 데이터는 단일 작용제로서 또는 SOC와 조합된 18G7H6A3이 pβ-카테닌을 상향조절하였고, 그것은 이들 종양에서 Wnt 경로 활성의 억제를 시사한 것인 QPCR 데이터를 확인시켜주었다(도 16).
p-β-카테닌, GSK-3β-카테닌(총 및 포스포), 및 LRP6을 포함하는 Wnt 경로의 다른 성분들을 일련의 CRC, 췌장 및 유방 종양에서 조사하였다. 웨스턴 블롯 데이터의 정량은 ASPC1 및 PANC1 종양에서 Wnt 경로 신호전달의 유의미한 억제를 보였을뿐만 아니라 다른 모델에서도 Wnt 경로 하향조절이 우선시되는 일부 경향을 드러냈다. 18G7H6A3으로의 치료에 반응하지 않았던 BMCRC086 종양은 또한 LGR5 발현 및 Wnt 신호전달 경로 성분들에 대해 음성이었고, 이것은 18G7H6A3에 대한 작용 메커니즘이 LGR5를 특이적으로 표적화하고 Wnt 신호전달을 억제하는 것을 추가로 지지한다.
ASPC1, PANC1 및 JH109를 포함하는 췌장 종양에서 Wnt 경로 유전자들의 발현을 조사하였다. 생체내 데이터를 기반으로, PANC1 및 ASPC1에서는 모두 18G7H6A3- 대비 PBS- 치료된 종양 사이에 종양 부피의 차이가 있었다. 대조적으로, JH109 종양은 18G7H6A3 단일 작용제 또는 SOC 화학요법 조합 중 어느 하나로의 표준 치료 처방에 반응하지 않았다. 반응성 세포(PANC1 및 ASPC1)에서의 Wnt 유전자 발현 및 비-반응성 세포(JH109)에서의 Wnt 유전자 발현의 차이를 조사하였다. 조합 치료된 그룹에서, Wnt6, FZD8, FOSL1, Wnt11, NFATC 및 FZD5는 ASPC1 및 PANC1 조합-치료된 종양에서 모두 하향조절되었고, JH109 종양에서는 상향조절되었다. 췌장 및 CRC 데이터에서는 모두, WNT11, WNT6, FRZB 및 PRICKEL을 포함한 유전자가 PANC1, ASPC1, CT1 및 CT3 세포에서는 하향조절되었지만, JH109 세포에서는 그렇지 않았다.
유전자 나무 분석은 Wnt11, FRAT1, LEF1, GSK3B, FZD8 및 LRP6을 포함하여, 18G7H6A3으로 치료된 췌장 종양에서 동시-조절된 잠재적 유전자들을 확인해주었다. 각 치료에서 차등적으로 발현된 전사물의 분석은 또한 췌장 종양에서 2배 이상 상향/하향 조절된 유전자들을 확인해주었다(도 17). Wnt7A와 같은 일부 유전자는 18G7H6A3 대비 대조군 치료된 종양에서 모든 종양 사이에 공통적이었다.
실시예 41 -18G7H6A3은 CT1 종양에서 전사를 억제한다
18G7H6A3-표적화된 유전자들의 발현을 초기 대비 후기 종양형성에서 조사하였다. 마우스는 CT1으로 이식된 마우스였고, 종양을 대조군, 18G7H6A3, FOLFIRI 또는 조합 그룹으로부터 제 3, 10 및 17일에 수득하였다. 제 3일에 각 종양으로부터의 총 RNA를 수득하고 Illumina 인간 칩을 사용하여 유전자 어레이 혼성화에 대해 준비하였다. 차등적으로 발현된 유전자(1.5 또는 2배 이상, p<0.05)의 총 분석은 18G7H6A3(단일 작용제로서 또는 FOLFIRI와의 조합으로)으로 치료된 종양에서 상향조절된 유전자보다 하향조절된 유전자가 더 많은 것을 보여주었다. 이것은 18G7H6A3으로의 치료가 전체 세포 전사 기작에 더 억제적인 영향을 나타낼 수 있었음을 시사하였다. PCA(주요 성분 분석) 또한 18G7H6A3 및 대조군 치료된 종양에서 전체 유전자 발현에서와 비슷한 결과를 보였다. 그러나, 18G7H6A3이 FOLFIRI에 첨가되었을 때(즉 조합 그룹) 조합 대비 FOLFIRI 사이에 분명한 분리가 있었고, 이것은 표적화 LGR5이 FOLFIRI-치료된 종양에서 유의미하게 변화된 유전자 발현을 가질 수 있음을 시사한다.
18G7H6A3 대비 비히클에서 차등적으로 발현된 유전자들의 분석은 18G7H6A3 치료된 종양에서 하향조절된 ANGPT2, AKAP12 및 ADM과 같은 여러 종양 프로모터, 및 또한 18G7H6A3 치료된 종양에서 상향조절된 DAB1, MIR655, NKX1-2와 같은 여러 종양 억제자를 확인해주었다(도 18). 역으로 FOLFIRI 치료는 종양 프로모터들(FBN2, HKDC1, ABCB1, FGF2), 및 또한 TRIB3, ATF3 및 TIMP3과 같은 일부 종양 억제자를 상향조절하는 것으로 나타난다(도 19). FOLFIRI와 18G7H6A3의 조합은 ALDOC, CDH5, ITGA2와 같은 더 많은 종양 프로모터의 하향조절 및 또한 ZBTB11, ITPKA, PSMC3IP 및 BAK1과 같은 더 많은 종양 억제자의 상향조절을 초래하였다(도 20).
실시예 42 - 18G7H6A3 치료는 췌장 환자 유래 이종이식의 같은 자리 모델에서 말초혈의 인간 CTC를 유의미하게 감소시킨다
일차 종양 성장 및 전이의 억제에서 18G7H6A3의 역할을 조사하기 위하여, LGR5 발현을 일련의 췌장 환자 유래 이종이식 샘플, 및 PANC1424 세포 및 PANC1427 세포에서 조사하였다.
종양 샘플을 NOD/SCID(비-비만 당뇨성 심각한 조합 면역결핍) 마우스에 피하로 이식하고 계속해서 생체내 연구를 위해 지정된 수령체의 췌장에 이식하였다. 종양 부피를 초음파로 주마다 측정하고 종양이 ~100 mm3인 마우스를 효능 연구에 등록하고 다음으로 치료하였다: 1- MOPC 아이소타입(15 mg/kg 2회/주; ip); 2- 18G7H6A3(15 mg/kg 2회/주; ip); 3- SOC(Gemzar 50 mg/kg; ip, 주 2회 및 Abraxane 30 mg/kg iv, 주 2회); 4- 상기 용량에서 18G7H6A3과 SOC의 조합. 연구의 끝에, 각 종양 포함 마우스로부터의 말초혈을 CTC(유동 세포분석을 사용하여) 및 순환하는 DNA 평가를 위하여 수집하였다. 유동 세포분석을 위하여, 혈액 샘플을 RBC 용해 완충액(ACK 완충액, Life Tech, CA)으로 제조자의 프로토콜을 사용하여 처리하고 인간 HLA-FITC(eBiosciences, CA) 및 인간 LGR5-AF647(BD Pharmingen, CA)로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포를 염색 완충액(PBS-FBS3%)으로 2회 및 7AAD(7-아미노악티노마이신)으로 세척한 후에 실험실에서 FACS calibur 기계에서 획득하고 그 데이터를 FCS Express 소프트웨어(De Novo, CA)를 사용하여 분석하였다.
LGR5는 다양한 췌장 환자 유래 이종이식 샘플에서 발현되었다. 인간 CTC는 말초혈에서 검출되었다. HLA+ 세포의 백분율은 MOPC 대비 18G7H6A3에서 유의미하게 변화하지 않은 한편, 순환하는 HLA+LGR5+ 세포의 백분율은 18G7H6A3 치료된 마우스에서 유의미하게 감소하였다(도 21).
HLA+ 세포의 백분율은 화학요법 대비 조합 치료된 마우스에서 유의미하게 변화하지 않았지만, 18G7H6A3 및 SOC의 조합은 동시의 및 감축 세팅에서 모두 HLA+LGR5+ 세포를 거의 완전하게 제거하였다(도 22A 및 22B). 18G7H6A3 치료 (단일 작용제로서 또는 SOC와 조합하여)는 췌장 환자 유래 이종이식의 같은 자리 모델에서 말초혈의 인간 CTC를 유의미하게 감소시킨다.
실시예 43 - 다른 모델에서의 LGR5 발현
LGR5 발현을 시노몰구스 원숭이(Cynos, 시노스)로부터의 피부 샘플에서 유동 세포분석 및 RNAscope를 사용하여 조사하였다. 시노스로부터의 피부 샘플을 비히클 또는 다양한 용량의 18G7H6A3(G2:10 mg/kg; G3:50 mg/kg; 및 G4: 150 mg/kg)으로 제 0, 7, 14 및 21일에 처리하였다. 연구 종결시, 피부 샘플을 항생물질(페니실린 및 스트렙토마이신) 및 항진균성 용액(항-Anti 100X, Life Technologies, CA)이 보충된 DMEM에 제공하였다. 피부 샘플을 콜라게나제 및 써몰리신(Liberase, RochInc, CA)의 칵테일을 사용하여 소화시켰다. 피부 전구세포(SP)를 밤새 리버라제와 함께 인큐베이션 및 기계적 붕괴 후에 분리하였다. SP를 래트 항-인간 LGR5(AF647, BD Pharmingen, CA)로 염색하고 실험실에서 calibur 기계로 분석하였다. FCS Express(Denovo Software, CA)를 사용한 데이터 분석은 LGR5가 시노스 SP에서 검출 가능하였지만, 18G7H6A3(상이한 용량의) 대비 비히클 치료 그룹 사이에 LGR5 빈도에 유의미한 차이는 없었음을 보여주었다. RNAscope를 사용하여, LGR5는 피부 영역에서, 특히 모낭에서 및 훨씬 더 적은 정도로는 피부 상피 세포에서 검출 가능하였다. 비히클 대비 18G7H6A3 치료 샘플에서 LGR5 양성 영역에 유의미한 차이는 없었다.
시노스로부터 분리된 말초혈 단핵세포의 유전자 발현을 조사하였다. 총 RNA를 Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 추출하였고 cDNA를 Superscript cDNA 합성 키트(Life Technologies, CA)를 사용하여 합성하였다. 각각의 치료로부터의 cDNA를 모으고 RT2Sybergreen qPCR 마스터 믹스(SABiosciences, MA)에 첨가하였다. 최종 혼합물을 케모카인 또는 염증성 사이토카인에 대한 Cyno QPCR 프라이머를 함유한 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. PCR 온도 프로파일은 다음을 포함하였다: 95℃에서 10분 및 40 사이클의 95℃ 15초 및 60℃ 1분과 이어서 용융 곡선 단계. 각 플레이트의 데이터(Ct 값)를 상응하는 GAPDH로부터 제함으로써 표준화하고 각 전사물의 풍부성을 2^DCT 방정식을 사용하여 계산하였다. 18G7H6A3 그룹 중 임의 그룹 대비 비히클 치료 그룹 사이에서 차등적으로 발현된(2배 이상) 전사물의 수의 분석은, 유전자 어레이 데이터와 일관되게, 상향조절된 유전자보다 하향조절된 유전자가 훨씬 많이 있음을 보여주었다. 용량의 단계적 증가로 상향조절된 유전자는 적었고 하향조절된 유전자들은 더 많이 있었다. 시노스가 18G7H6A3의 최종 용량을 받은 후 4주 동안 어떠한 치료도 받지 않은 G4-회복(G4R) 그룹은 거의 유사한 수의 상향- 및 하향-조절된 유전자 수를 보였다. 상세한 분석은 발현이 18G7H6A3 용량과 반비례하는, 즉 10 mg/kg에서 가장 높고 150 mg/kg에서 가장 낮은, 차등적으로 발현된 유전자들(CCL11, IL3, SPP1, CCL13, CXCL6 및 TNFRSF11b)을 확인해주었다
치료들 사이에 통상적으로 하향조절된 유전자들은 CCL1, IFNγ, CCR8, IL2, IL3 및 IL4를 포함하였고, 그것들 중 일부는 M1 또는 M2 대식세포에서 풍부하다.
실시예 44 - 인간화 항-LGR5 항체에 의한 생체내에서의 소세포 폐암 종양 성장의 억제
환자 유래 소세포 폐암 이종이식 모델. BLG293 종양으로부터 해리된 종양 세포를 CB.17 SCID 마우스에 마트리겔로 피하로 이식하고, 주 2회 종양 크기 및 체중에 대해 모니터링하였다. 종양이 평균 130 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 무작위로 나누었다. 마우스를 PBS, 항체 대조군 MOPC, 또는 18G7H6A3 중 어느 하나로 치료하였다. 마우스에게 15 mg/kg으로 BIW를 투여하였다. 모든 마우스를 주 2회 체중 및 종양 크기, 뿐만 아니라 전체적인 건강 및 외관에 대해, 종결시까지 모니터링하였다.
18G7H6A3은 PBS(24.9% 종양 성장 억제) 및 MOPC 항체(24.7% 종양 성장 억제) 대조군에 비교하여 유의미한 항-종양 활성을 보였다.
실시예 45 - 18G7H6A3은 감축 화학요법 치료 후에 재발하는 췌장 종양을 가진 마우스에서 생존율을 증가시킨다
Panc1427(UCSD1427) 종양을 화학요법(젬시타빈/아브락산) 및 18G7H6A3으로의 치료에 의해 완전히 감축시켰다(퇴행시켰다). 종양이 퇴행되었을 때, 화학요법을 제거하고 마우스를 18G7H6A3으로 치료하거나 치료하지 않았다. 18G7H6A3으로 치료된 동물은 대조군 동물에 비교하여 현저하게 더 건강하였고, 이때 여러 마우스를 파행 또는 체중 손실과 같은 심각한 건강 관찰사항으로 인해 안락시켜야 했다. 제 150일에, 18G7H6A3 및 화학요법으로 치료된 8마리 마우스 중 7마리가 살아있었고, 그에 대비하여 화학요법 단독으로 치료된 8마리 마우스 중에는 4마리가 살아있었다. 도 23은 그 결과를 요약한 것이다.
실시예 46 - 환자에게 18G7H6A3의 투여
전이성 대장암 환자에서 BNC101(항-LGR5 인간화 단클론성 항체)의 단계 I, 용량의 단계적 증가 연구를 아래에서 기술한 대로 수행한다. 완제품의 명칭: 주입용 BNC101 용액. 활성 성분의 명칭: BNC101, 18G7H6A3, ET101, LGR5 항체.
연구 목적
전이성 대장암 환자에게 정맥내로 투여된 BNC101의 최대 허용 용량(MTD), 권장된 II 단계 용량(RP2D), 안전성, 내성, 및 약물동역학(PK) 프로파일을 측정하는 것이다. 일차 목적은 전이성 대장암 환자에서 단일 작용제로서 및 화학요법과의 조합에서의 BNC101의 MTD를 측정하는 것이다. 이차 목적은 다음과 같다. 전이성 대장암 환자에서 단일 작용제로서 및 화학요법과의 조합에서의 BNC101의 RP2D를 측정하는 것이다. BNC101의 안전성 및 내성을 평가하는 것이다[부작용(AE), 용량 누락 또는 지연]. BNC101의 면역원성을 평가하는 것이다(BNC101에 대한 항체의 생성). 단일 작용제로서 및 화학요법과의 조합으로, BNC101의 약물동역학(PK)(반감기, 분포 부피 및 제거)을 측정하는 것이다. BNC101로 치료된 전이성 대장암 환자의 전체 반응 속도(ORR), 진행이 없는 생존율(PFS) 및 전체 생존율(OS)을 예비 평가하는 것이다. 탐색 목적은 다음과 같다. 질환-관련 생체마커(CEA)의 변화를 평가한다. 활성의 생체마커[약물역학, 예컨대 순환하는 종양 세포(CTC), LGR5+ 세포, 순환하는 종양 DNA]를 평가한다.
안전성 종점
치료-응급 사건(임상 및 실험실 데이터)을 평가한다. 용량 중단 및 불연속을 평가한다.
핵심적인 환자 선택 기준
1. 서면상의 고지에 의한 동의. 2. 연령 > 18세. 3. 0 내지 1의 동부 종양학 협력 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG) 수행 상태 점수. 4. 전이성 질환에 대한 화학요법의 적어도 2선(단일요법 치료 집단) 또는 화학요법의 적어도 1선(조합 치료 집단)이 실패하고, 의사와 환자 쌍방의 의견에 따라 실험적 치료법을 시도하는 것이 합리적인, 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 대장암 환자. 마지막 6개월 이내에 보조제 FOLFOX(폴리닌산; 플루오로우라실(5-FU); 및 옥살리플라틴)은 치료 라인으로 간주된다. 제 1 선 치료 후 유지 전략은 추가적인 치료 라인으로 간주되지 않는다. 5. 환자들은 환자 또는 그들의 치료를 위험에 빠트리지 않을 생체검사를 받을 수 있는 접근 가능한 종양 병변을 가져야 한다. 단일요법 단계적 증가 집단 3 및 그 이상의 환자들, 단일요법 확대 집단, 및 모든 조합 치료 환자들은 2개의 연속적인 종양 병변 생체검사를 제공하는 데 동의하고 기꺼이 제공하고자 한다(가능한 최소 2개의 새로운 코어/펀치가 바람직하다). 생체검사는 원발성 종양 대신 간 전이로부터 받을 수 있다. 새로운 생체검사에서 종양 조직의 존재는 적절한 즉석의 조직학 또는 세포학 과정을 사용하여 훈련된 병리학자에 의해 확인되어야 한다. 6. 고체 종양(RECIST) 버전 1.1의 반응 평가 기준에 따른 측정 가능한 질환. 7. 공지된 뇌 전이가 없음. 8. 적어도 ≥ 12주의 기대 수명. 9. 정상적인 기관 및 골수 기능: a. 등록 전 14일 동안 성장 인자 지지 없이 절대 호중구 수 > 1,500개/mL. b. 등록 전 14일 동안 수혈 없이 혈소판 > 100,000/mL. c. 헤모글로빈 ≥ 9.0 g/dL - 환자는 이 기준을 충족하기 위하여 수혈받거나 조혈 치료를 받을 수 있다. d. 총 빌리루빈 < 1.5 x 정상의 제도적 상한선(ULN)(길버트 증후군을 가진 대상체의 경우 < 2 x ULN). e. 혈청 알부민 ≥ 3 g/dL. 10. 아스파테이트 아미노트란스페라제(AST)(혈청 글루탐산 옥살로아세트산 트란스아미나제, SGOT) 및 알라닌 아미노트란스페라제(ALT)(혈청 글루탐산 피루브산 트란스아미나제, SGPT) < 2.5 x 제도적 ULN(간의 문제가 있는 대상체의 경우 < 5 x 제도적 ULN이지만 상승된 빌리루빈과 관련되지 않을 수 있음). 11. 생체검사를 받는 환자들의 경우, 정상 한계(± 15%) 내의 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)/국제 표준화된 비율(INR). 12. 크레아티닌 < 1.5 x 제도적 ULN 또는 제도적 정상보다 위의 수준의 크레아티닌을 가진 대상체의 경우 크레아티닌 소멸 > 60 mL/분/1.73 m2. 13. 임신 가능성이 있는 여성과 남성의 적당한 피임.
투약 및 스케줄
단계적 증가는 시차를 두고 집단의 2개의 별도의 세트에서 일어날 것이다: 단일 작용제 BNC101 용량 단계적 증가는 조합 화학요법 집단의 용량 단계적 증가를 선행할 것이다. 후자에서, BNC101은 FOLFIRI와 함께 용량이 단계적으로 증가될 것이다. 조합 화학요법 집단은 단일요법 집단에서 RP2D가 측정될 때까지 치료를 시작하기 않을 것이다. 조합 화학요법 집단에서 단계적 증가는 단일요법 집단의 단일 작용제 RP2D보다 한 레벨 아래에서 시작할 것이다. 비록 추가되는 독성이 화학요법과 BNC101의 조합으로부터 예상되는 것은 아니지만, 초기 용량보다 아래의 2개의 추가적인 단계적 축소 수준이 활용될 수 있고, 아마도 그렇게 되는 것이 필요할 것이다.
BNC101 단일요법
표준 3 + 3 단계 I 연구 설계를 사용할 것이다. 출발 용량은 동물에서 최고 무독성량(no-observed-adverse-event-level, NOAEL) 용량의 1/30(인간에서는 2.5 mg/kg)일 것이며, 그 양은 수용체 결합의 종 차이를 고려하여 계산된 것이다. 후속되는 BNC101 용량 수준은 5, 10, 및 15 mg/kg일 것이다.
투여 스케줄은 주마다(q1w)일 것이다.
사이클 기간은 4주(28일)(4회의 주마다의 주입)이며, 사이클 사이에 휴식하는 주는 없다.
용량의 단계적 증가는 MTD를 측정하기 위해 수행될 것이다. 용량의 단계적 증가가 없거나 용량이 감소는 용량 집단 내에서 허용될 것이다. 모든 경우에, BNC101은 아침에 투여하여 같은 날에 중개 연구를 위해 혈액 샘플의 적절한 조제 및 이송이 가능해야 한다.
용량의 단계적 증가는 3명의 환자 집단에서 2.5 mg/kg의 용량(동물에서 최고 NOAEL 용량의 1/30)에서 시작할 것이다. 만약, 28일(BNC101의 4회 투여)이 끝났을 때 연구 약물에 기인한 CTCAE 등급 ≥ 2 AE가 관찰되지 않는다면, 3명의 환자의 제 2 집단을 다음 용량 수준(5 mg/kg)에서 치료할 것이다. 추가의 용량의 단계적 증가는 3명의 환자의 집단에서 계속될 것이다(10 mg/kg에서 출발한 다음 15 mg/kg).
만약 3-대상체 집단에서 3명의 대상체 중 1명이 용량-한정 독성(DLT)을 경험한다면, 그 용량 수준은 6명의 대상체에게 확대될 것이다. 만약 2명 이상의 대상체가 DLT를 경험하면, 그 수준에서는 추가로 대상체에게 투약하지 않을 것이고 6명의 대상체가 이미 그 용량 수준에서 치료되지 않은 한 3명의 추가 대상체가 선행 용량 집단에 추가될 것이다.
대상체들은 28일동안 제 1 용량의 시점으로부터 DLT에 대해 평가될 것이다. 새롭게 등록된 대상체들에 대한 용량의 단계적 증가는, 필요에 따라, 집단의 모든 대상체가 그들의 제 28일 DLT 평가가 완료된 후에 일어날 것이다. 안정적 질환 또는 제 56일에 또는 그 이후에(2 사이클 후) 반응을 보인 대상체들은 질환이 진행될 때까지 BNC101의 용량을 주마다 받는 것을 계속하도록 허용될 것이다.
만약 테스트된 최고 BNC101 용량에서 DLT가 보고되지 않으면, 실험실 동물(시노몰구스 원숭이)에서 입증된 최대 노출에 비슷한 BNC101 노출로 PK 프로파일을 입증한 환자 집단은 RP2D일 것이다.
6명의 대상체 중 2명 미만이 등급 3(24시간 안에 해소되는 등급 3 주입 반응은 포함시키지 않음) 또는 등급 4 AE(DLT)를 경험하는 것을 초래하거나, 또는 적당한 PK 노출이 이루어진 후에 그런 독성이 없을 때의 최고 용량 수준에서 최소 9명의 추가 대상체가 추가로 등록될 것이다.
FOLFIRI와 조합된 BNC101
BNC101 단일요법 용량의 단계적 증가가 완료되고, 명백한 안전성 및 RP2D가 도달된 후에, 전이성 대장암 환자들은 그들의 BNC101과의 조합 화학요법 집단에서 단일요법에서 확인된 RP2D보다 1 용량 수준 아래에서 시작할 수 있다. 이런 집단은 각각 3명의 대상체를 포함할 것이다. 단계적 증가는 단일요법 집단이 사용한 것과 동일한 규칙대로 진행될 것이다. 이 초기 BNC101 용량이 6명의 환자 중 최대 2명에게서 DLT를 보여야 한다면, 조합 화학요법에서 RP2D를 확인하기 위해 2개의 추가적인 단계적 축소 집단이 제공될 것이고, 3+3 규칙을 따를 것이다.
만약 테스트된 최고 BNC101 용량 조합에서 DLT가 보고되지 않으면, 실험실 동물에서 입증된 최대 노출과 비슷한 BNC101 노출로 PK 프로파일을 입증한 환자들의 집단은 화학요법과 조합된 RP2D일 것이다.
6명의 대상체 중 2명 미만이 등급 3(24시간 안에 해소되는 등급 3 주입 반응은 포함시키지 않음) 또는 등급 4 AE(DLT)를 경험하는 것을 초래하거나, 또는 적당한 PK 노출이 이루어진 후에 그런 독성이 없을 때의 최고 용량 수준의 조합 집단에 최소 9명의 추가 대상체가 추가로 등록될 것이다.
FOLFIRI 구성요소: 이리노테칸(IRI) - 출발 용량 180 mg/m2(제 1일에 90분에 걸쳐) 류코보린(LV) - 출발 용량 400 mg/m2(제 1일에 IRI와 동시에 120분에 걸쳐 투여됨) 5-FU 볼루스 - 출발 용량 400 mg/m2(제 1일에 LV 후에 투여됨, 그런 다음) 5-FU 주입 - 출발 용량 2400 mg/m2(제 1일에 시작하여 48시간에 걸쳐 투여됨). FOLFIRI 사이클을 14일마다 반복한다.
DLT 정의
DLT는 임의의 주어진 단계적 증가 집단의 사이클 1(제 0일에서 28일)에 발생하는 다음 중 임의의 것으로서 정의한다: 등급 3 또는 4, NCI CTCAE v4.0을 사용하여 비-혈액학적 독성(아나필락시스 반응을 포함함); 등급 3, 48시간 이상 계속되는 메스꺼움 또는 등급 4, 구토 또는 등급 ≥ 3, 적절한 치료에도 불구하고 발생하는 설사; 등급 4, 임의의 기간의 혈소판감소증 및 등급 4, 단일요법 집단에서 임의의 기간의 또는 조합 화학요법 집단에서 7일을 초과하여 지속되는 복잡하지 않은 호중성 백혈구 감소증(즉 열 또는 감염이 없음). 등급 4, 입원을 필요로 하는 발열상태의 호중성 백혈구 감소증 및 임의의 등급 3, 3주 이상의 치료 지연 및 기준선 평균 QTc 간격으로부터 ≥ 500 msec 또는 60 msec 증가를 위한 QTc 간격의 연장을 필요로 하는 혈액학적 독성. 임의의 다른 약물-관련된 ≥ 등급 3, 최대 의료 관리를 받지 않았거나 보충물로 관리될 수 있는 전해질 비정상을 보이는 대상체들의 고질혈증을 제외한, 비-혈액학적 부작용(아나필락시스 반응을 포함함). 모든 AE는 질환 진행(PD)에 대한 관찰된 독성 사이에 명백한 관계가 없는 한 잠재적으로 치료와 관련된 것으로 간주할 것이다. 이런 기준들을 만족하는 부작용은 DLT를 보고할 목적으로 또는 MTD를 측정하는 데 있어 고려되지 않을 것이다.
치료 기간
환자들은 PD, 허용할 수 없는 독성, 동의의 철회, 또는 스폰서에 의한 연구 중단 중 어느 것이든지 먼저 발생할 때까지 치료될 것이다.
샘플 크기
단일요법 및 화학요법과의 조합에서 모두 BNC101의 독성 프로파일, DLT, 및 MTD 및/또는 RP2D를 측정하기 위하여 최대 대략 54명의 환자를 이 연구에서 치료할 것이다. 용량 수준 집단당 1 내지 6명의 평가 가능한 환자들은 BNC101의 독성 및 PK 프로파일을 평가하기 위한 충분한 데이터를 제공할 것이다. 일단 RP2D가 확인되면, 이 집단의 확대(적어도 9명의 추가 환자까지의 확대)가 단일요법 및 조합 화학요법 그룹에서 모두 일어날 것이다. 만약 DLT가 테스트된 최고 BNC101 용량에서 보고되면, 실험실 동물에서 입증된 최대 노출과 비슷한 BNC101로의 PK 프로파일을 입증한 환자들의 집단은 RP2D일 것이다.
방문 빈도
4-주 사이클의 각 주에 대해 7일(± 3일)마다 1회 방문. 생존 추적 정보 및 후속되는 항암 치료는 치료 중단 후 3개월마다, 사망하거나, 추적하지 못하거나, 환자가 동의를 철회하거나, 또는 스폰서에 의해 연구가 종결될 때까지 수집될 것이다.
안전성 평가
대상체는 제 0일부터 28일까지(사이클 1) DLT에 대해 평가될 것이다. 부작용은 마지막 용량 후 30일 동안 보고될 것이다. 안전성은 계속해서 보고될 것이다. 마지막 용량 후 제 28일과 30일 사이에 발생하는 부작용은 보고되겠지만, MTD의 측정에는 포함되지 않을 것이다. 수행 상태는 주마다 채점될 것이고, 신체 검사는 기준선에서, 각각의 사이클을 시작할 때(예컨대 4주마다), 연구가 끝난(EOS) 방문시에 및 모든 AE가 해소된 시점에 수행될 것이다.
심전도(ECG) 모니터링
모든 12-유도 ECG가 3회 반복으로 및 적어도 5분 간격으로 얻어져야 한다. ECG는 기준선에서(제 1 투약에 앞서 14일 전에), 사이클 1의 제 1일 및 제 15일에 집중적으로 및 제 8일 및 22일에 사전-용량시에 얻어질 것이다. ECG는 사이클 2 및 후속되는 사이클들의 제 1일에 얻어질 것이다. EOS ECG는 수집해야 한다. ECG는 평가를 위해 지역 실험실로 보내질 것이다.
반응 평가
컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔은 기준선에서 및 8주마다 수행될 것이다. 제 1 반응 평가는 제 56일(2 사이클 후)에 이루어질 것이다. 항종양 반응에 대한 방사성 연구는 이전의 28일 내에 시행되지 않으면 EOS 방문시 반복될 것이다. 전화 추적 또는 기록의 리뷰는 6개월 동안 1개월 기준으로 시행될 것이고 그 후 18개월 동안에는 3개월마다 시행될 것이다(총 24개월).
약물동역학적 평가
약물동역학적 샘플은 사이클 1에서 제 1일 및 15일에, 및 드물게는 제 8일 및 22일에 집중적으로 얻어질 것이다. 샘플은 드물게 사이클 2 및 후속되는 사이클들의 제 1일에 얻어질 것이다. 혈액 샘플은 BNC101의 용량 전에(주입이 시작되기 전), 주입 중에, 그리고 주입 후에(주입이 끝난 후) 얻어질 것이다.
세포의 및 분자의 생체마커 평가
환자들은 기준선에서, 사이클 1 중에는 주마다, 후속되는 각 사이클의 제 1일에 및 치료가 끝났을 때, CTC의 수준 및 약물역학적 영향의 지표로서 생체마커(한정하는 것은 아니지만 LGR5를 포함함)를 측정하기 위하여 채혈될 것이다. 환자들은 또한 기준선에서 및 사이클 1, 제 22일에 2개의 매치된 피부 생체검사를 수행할 것이다(각각의 생체검사는 2개의 신선한 코어/펀치일 것이다). 환자들은 추가적인 모발 샘플(모낭의 수집을 포함함)을 채취할 수 있다.
종양 병변 생체검사
단일요법 단계적 증가 집단 1 및 2에는 생체검사가 필요하지 않다. 매치된 생체검사(기준선 및 제 22일)는 단일요법 단계적 증가 집단 3 및 그 이후, 및 단일요법 확대 집단에 대해 위임된 것이다. 매치된 생체검사는 모든 조합 치료 환자들에게 위임된 것일 것이다. 각각의 생체검사는 가능한 최소 2개의 신선한 코어/펀치가 바람직할 것이다. 생체검사는 원발성 종양 대신 간 전이로부터 비롯될 수 있다. 새로운 생체검사에서 종양 조직의 존재는 훈련된 병리학자에 의해 적절한 즉석의 조직학적 또는 세포학적 과정을 사용하여 확인되어야 한다. 모든 샘플은 개인정보가 제거될 것이다. 개체의 동일성은 조사자 또는 스폰서에 의해 확인될 수 없다. 중앙 기준 실험실에 보관되는 비밀번호-보호된 데이터는 환자 또는 환자를 치료하는 의사에게 방출되지 않을 것이다. 환자 정보는 연구 데이터의 익명의 보고서에서 엄격하게 사용될 것이다. 그런 연구 데이터는 환자 차트에 기록되거나 임상의에게 이용되지 않을 것이며 진단 또는 치료 목적으로 사용할 수 없고 사용되지 않을 것이다.
면역원성 평가
항-BNC101 항체의 존재는 기준선에서, 각각의 용량 전에, 치료가 종결될 때, 및 12주 동안 치료가 중단된 후 4주마다 테스트될 것이다. 단일요법 대비 조합 요법 집단의 환자들의 상이한 본질 및 예상된 진화로 인해, 상이한 수의 샘플이 각각의 경우에 얻어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는"은 "포함하고 있는", "함유하는" 또는 "~을 특징으로 하는"과 동의어이며, 일체를 포함하거나 양끝이 개방적이고 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
상기의 설명은 본 발명의 여러 방법 및 물질을 개시한다. 본 발명은 방법 및 물질의 변형뿐만 아니라, 제작 방법 및 장비의 변경에도 민감하다. 그러한 변형은 본원에 개시된 발명의 본 개시 또는 실시를 고려함으로써 당업자들에게는 명백해질 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 특정 구체예들에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 발명의 진정한 범주 및 사상에 포함되는 모든 변형 및 대안들을 포함한다.
한정하는 것은 아니지만 공개된 및 미공개의 출원, 특허, 및 문헌 참조를 포함하는 본원에서 인용된 모든 참고문헌들은 그 전문이 본원에 참조로 포함되고 그로써 본 명세서의 일부를 구성한다. 참조로 포함된 공보 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시와 어느 정도는 상충되지만, 본 명세서는 어떠한 그러한 상충되는 물질을 뛰어넘어 대체 및/또는 우선하는 것으로 의도된다.
<110> Bionomics, Inc. Christopher L. Reyes Peter Chu Elizabeth Doolin Jose Iglesias <120> ADMINISTRATION OF AN ANTI-LGR5 MONOCLONAL ANTIBODY <130> MPI18-014-D1 <150> 62/311631 <151> 2016-03-22 <160> 49 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> 18G7.1 Heavy Chain CDR1 Amino Acid <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> 18G7.1 Heavy Chain CDR2 Amino Acid <400> 2 Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> 18G7.1 Heavy Chain CDR3 Amino Acid <400> 3 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Gln Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> 18G7.1 Light Chain CDR1 Amino Acid <400> 4 Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> 18G7.1 Light Chain CDR2 Amino 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<220> <223> 18G7H6A3 Light Chain Variable Domain <400> 21 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 22 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A3 Light Chain Variable Domain DNA <400> 22 atgtccgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgccagatgc 60 gacatcgtgc tgacccagag ccctgcctct ctggctgtgt ctcctggcca gagggccacc 120 atcacctgta gagcctccga gtccgtggac tcctacggca actccttcat gcactggtat 180 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacc tgacctccaa cctggaatcc 240 ggcgtgcccg acagattctc cggctctggc tctggcaccg acttcaccct gaccatcaac 300 cccgtggaag ccaacgacgc cgccacctac tactgccagc agaacgccga ggaccccaga 360 acctttggcg gaggcaccaa gctggaaatc aag 393 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A3 Heavy Chain CDR1 Amino Acid <400> 23 Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr Trp 1 5 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A3 Heavy Chain CDR1 DNA <400> 24 ggctactcct tcaccgccta ctgg 24 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A3 Heavy Chain CDR2 Amino Acid <400> 25 Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr 1 5 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A3 Heavy Chain CDR2 DNA <400> 26 atcctgcccg gctccgactc cacc 24 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A3 Heavy Chain CDR3 Amino Acid <400> 27 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Gln Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 33 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Leu 50 55 60 Ser Val Phe Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Asn Pro Leu Pro Ser Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu Arg 85 90 95 Leu Ala Gly Asn Ala Leu Thr Tyr Ile Pro Lys Gly Ala Phe Thr Gly 100 105 110 Leu Tyr Ser Leu Lys Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg His 115 120 125 Val Pro Thr Glu Ala Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Asn His Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly 145 150 155 160 Leu His Ser Leu Arg His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr Glu 165 170 175 Ile Pro Val Gln Ala Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gln Ala Met Thr 180 185 190 Leu Ala Leu Asn Lys Ile His His Ile Pro Asp Tyr Ala Phe Gly Asn 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Val Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser 210 215 220 Leu Gly Lys Lys Cys Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp 225 230 235 240 Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala Ile Arg Thr Leu 245 250 255 Ser Asn Leu Lys Glu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Ile Arg Ser Ile 260 265 270 Pro Glu Lys Ala Phe Val Gly Asn Pro Ser Leu Ile Thr Ile His Phe 275 280 285 Tyr Asp Asn Pro Ile Gln Phe Val Gly Arg Ser Ala Phe Gln His Leu 290 295 300 Pro Glu Leu Arg Thr Leu Thr Leu Asn Gly Ala Ser Gln Ile Thr Glu 305 310 315 320 Phe Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ala Asn Leu Glu Ser Leu Thr Leu Thr 325 330 335 Gly Ala Gln Ile Ser Ser Leu Pro Gln Thr Val Cys Asn Gln Leu Pro 340 345 350 Asn Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Glu Asp Leu Pro 355 360 365 Ser Phe Ser Val Cys Gln Lys Leu Gln Lys Ile Asp Leu Arg His Asn 370 375 380 Glu Ile Tyr Glu Ile Lys Val Asp Thr Phe Gln Gln Leu Leu Ser Leu 385 390 395 400 Arg Ser Leu Asn Leu Ala Trp Asn Lys Ile Ala Ile Ile His Pro Asn 405 410 415 Ala Phe Ser Thr Leu Pro Ser Leu Ile Lys Leu Asp Leu Ser Ser Asn 420 425 430 Leu Leu Ser Ser Phe Pro Ile Thr Gly Leu His Gly Leu Thr His Leu 435 440 445 Lys Leu Thr Gly Asn His Ala Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ser Glu Asn 450 455 460 Phe Pro Glu Leu Lys Val Ile Glu Met Pro Tyr Ala Tyr Gln Cys Cys 465 470 475 480 Ala Phe Gly Val Cys Glu Asn Ala Tyr Lys Ile Ser Asn Gln Trp Asn 485 490 495 Lys Gly Asp Asn Ser Ser Met Asp Asp Leu His Lys Lys Asp Ala Gly 500 505 510 Met Phe Gln Ala Gln Asp Glu Arg Asp Leu Glu Asp Phe Leu Leu Asp 515 520 525 Phe Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu His Ser Val Gln Cys Ser Pro Ser 530 535 540 Pro Gly Pro Phe Lys Pro Cys Glu His Leu Leu Asp Gly Trp Leu Ile 545 550 555 560 Arg <210> 48 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A1 Heavy Chain Variable Amino acid <400> 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ala Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Gln Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 49 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18G7H6A1 Light Chain Variable Amino acid <400> 49 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130

Claims (28)

  1. 전이성 대장암을 가진 인간 대상체의 치료 방법으로서, 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 단클론성 항체는 서열번호 13을 포함하는 중쇄 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄를 포함하고;
    상기 단클론성 항체는 4주 이상 매주 투여되며;
    상기 단클론성 항체는 정맥내로 투여되고;
    상기 단클론성 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 폴리닌산(folinic acid), 플루오로우라실(fluorouracil), 및 이리노테칸(irinotecan)과 병용 투여되는 것인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 단클론성 항체의 초기 용량은 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸의 투여 전에 투여되는 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여되고; 상기 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 상기 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여되며; 상기 플루오로우라실의 초기 용량은 상기 폴리닌산의 초기 용량의 투여 후 약 400 mg/m2가 투여되고; 상기 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여되는 것인 방법.
  5. 암을 가진 대상체의 치료 방법으로서, 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 단클론성 항체는 서열번호 13을 포함하는 중쇄 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄를 포함하고;
    상기 단클론성 항체는 4주 이상 매주 투여되며;
    상기 단클론성 항체는 정맥내로 투여되고;
    상기 단클론성 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 화학요법제와 함께 투여되는 것인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 화학요법제는 폴리닌산, 플루오로우라실, 이리노테칸, 젬시타빈(gemcitabine) 및 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(ABRAXANE)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 단클론성 항체의 초기 용량은 상기 화학요법제의 투여 전에 투여되는 것인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸과 병용 투여되는 것인 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 단클론성 항체의 초기 용량은 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸의 투여 전에 투여되는 것인 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여되는 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여되는 것인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 플루오로우라실의 초기 용량 약 400 mg/m2는 폴리닌산의 초기 용량을 투여한 후 투여되는 것인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여되는 것인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 베바시주맙(bevacizumab), 애플리버셉트(aflibercept), 세툭시맙(cetuximab), 및 파니투무맙(panitumumab)으로 구성되는 군으로부터 선택된 추가의 치료제와 병용 투여되는 것인 방법.
  16. 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고체 종양을 포함하는 것인 방법.
  17. 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 결장암, 대장암, 췌장암, 유방암, 및 폐암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 APC 돌연변이를 포함하는 결장암, KRAS 돌연변이를 포함하는 결장암, 전이성 대장암, 전이성 췌장암, 삼중 음성 유방암, 및 소세포 폐암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 전이성 대장암인 것인 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 하기조건으로 구성되는 군으로부터 선택된 특징을 가지는 것인 방법: 상기 단클론성 항체의 투여 전 전이성 질환에 대한 선행 화학요법의 1개 이상의 라인이 실패하고; 공지된 뇌 전이가 없으며; 12주 이상의 기대 수명을 가지고; 상기 단클론성 항체의 투여 전 14일 내에 성장 인자 지원 없이 약 1500개의 세포/mL보다 큰 절대 호중구 수를 가지며; 상기 단클론성 항체의 투여 전 14일 내에 수혈 없이 100,000개의 혈소판/mL보다 큰 혈소판 수를 가지고; 9.0 g/dL 이상의 헤모글로빈을 가지며; 3 g/dL 이상의 혈청 알부민을 가진다.
  21. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물인 것인 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것인 방법.
  23. 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체의 용량 및 적합한 제약학적 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 포함하는 용기로서, 상기 단클론성 항체의 용량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg인 용기.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 정맥내 투여에 적합한 것인 용기.
  25. 전이성 대장암을 치료하는 데 사용하기 위한 류신-풍부한 반복부 함유 G-단백질 결합된 수용체 5(LGR5)에 특이적으로 결합하는 인간화 단클론성 항체로서,
    상기 단클론성 항체는 서열번호 13을 포함하는 중쇄 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄를 포함하고;
    상기 단클론성 항체는 4주 이상 매주 투여되며;
    상기 단클론성 항체는 정맥내로 투여되고;
    상기 단클론성 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg인, 인간화 단클론성 항체.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸과 병용 투여되는 것인, 전이성 대장암을 치료하는 데 사용하기 위한 인간화 단클론성 항체.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 단클론성 항체의 초기 용량은 상기 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸의 투여 전에 투여되는 것인, 전이성 대장암을 치료하는 데 사용하기 위한 인간화 단클론성 항체.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 이리노테칸의 초기 용량은 약 90분에 걸쳐 약 180 mg/m2이 투여되고; 상기 폴리닌산의 초기 용량은 약 120분에 걸쳐 약 400 mg/m2이 투여되고 상기 이리노테칸의 초기 용량과 동시에 투여되며; 상기 플루오로우라실의 초기 용량은 상기 폴리닌산의 초기 용량의 투여 후 약 400 mg/m2가 투여되고; 상기 폴리닌산, 플루오로우라실, 및 이리노테칸은 14일마다 투여되는 것인, 전이성 대장암을 치료하는 데 사용하기 위한 인간화 단클론성 항체.
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