JP2023549441A - キメラ抗原受容体ｔ細胞および方法 - Google Patents

キメラ抗原受容体ｔ細胞および方法 Download PDF

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Abstract

癌などの増殖性疾患の免疫治療のための新規かつ代替の選択肢が必要とされている。この必要性は、癌幹細胞関連タンパク質Ｌｇｒ５を認識する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインを有するキメラ抗原受容体を提供することによって対処し得る。そのようなＣＡＲ Ｔ細胞は、対象において癌細胞を死滅させ、癌を処置または予防するために使用され得る。したがって、本発明は、Ｌｇｒ５を認識する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれからなるキメラ抗原受容体を提供する。

Description

優先権主張
本出願は、オーストラリア仮出願第２０２０９０４２５６号の優先権を主張するものであり、その内容全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、キメラ抗原Ｔ細胞受容体、キメラ抗原Ｔ細胞受容体を発現する免疫細胞、キメラ抗原Ｔ細胞受容体を含む医薬組成物、癌などの増殖性疾患の予防および／または処置に使用するためにキメラ抗原Ｔ細胞受容体およびそのようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞を使用する方法に関する。
発明の背景
本発明の背景に関する以下の考察は、本発明の理解を容易にすることを意図している。しかしながら、考察は、言及された物質のいずれかが、本明細書の特許請求の範囲のいずれか１項の優先日に公開され、公知であり、または通常の一般的知識の一部であることの承認または了解ではないことを理解されたい。
免疫系は、様々な日和見微生物による感染を予防し、新生細胞または前新生細胞などの異常な細胞増殖を予防することによって、対象の身体の完全性を能動的に維持する。免疫系の特異性および有効性のために、新生細胞を特異的に標的とするように適応免疫系を操作する多くの試みがなされてきた。これらの技術はまとめて免疫腫瘍学と呼ばれる。
免疫腫瘍学は、抗体の使用、癌抗原ワクチン接種、サイトカイン処置および養子Ｔ細胞移入を含む多くの異なる技術を含む。おそらく、免疫腫瘍学の最も利用される形態は、腫瘍関連抗原に対する特異的モノクローナル抗体の開発である。抗体は、免疫腫瘍学の優れた選択肢となる様々な特性を実証する。一個体（ヒト）内では、それぞれ異なる抗原特異性および親和性を有する１０１１～１０１２個もの固有の抗体を作製し得ると推定される。したがって、抗体は、ほぼあらゆる表面抗原に対して生成され得る。さらに、抗体は、不死化ハイブリドーマ細胞株を使用してインビトロで容易に組換え生産され得る。これは、大量に製造され得ることを意味する。さらに、抗体は、長期間にわたって安定であるように製剤化（例えば、凍結乾燥）され得ることにより、容易な貯蔵および分配が可能になる。最後に、抗体の投与量は、応答性を高めるために、または副作用が発生した場合に副作用を低減するために容易に制御され得る。
抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して標的細胞を直接死滅させるために利用され得ることにより、標的への抗体の結合が抗体結合細胞の溶解を指示する。あるいは、抗体を使用して、癌細胞上に発現される受容体およびシグナル伝達分子の機能性を阻害し得る。
上記の特性の結果として、抗体は免疫腫瘍学においてますます普及してきている。しかしながら、それらにはいくつかの制限がある。例えば、抗体のサイズは、不十分な血管新生であることが多い固形腫瘍内の細胞にアクセスする能力を低下させる。さらに、癌細胞は、日常的に、標的とされる抗原を低レベルで発現するか、または発現しないように適応する。したがって、抗体は、典型的には、患者を治癒させるのではなく、癌感染個体の生存を延長させる。
近年、科学者および医師は、癌を処置するための適応免疫系の細胞アームの使用を探求し始めている。例えば、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）として知られるＴ細胞は、切除された腫瘍から単離されている。これらのＴＩＬＳは、個々の腫瘍関連抗原に対する応答性に基づいて選択的に増殖させ、患者に投与して戻され得る。いくつかの例では、追加の処置と共に投与された場合、これらのＴＩＬは患者を完全寛解させた（ＮＩＨ（２０１８）’’Ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ’’）。他の最先端処置が失敗した場合の細胞処置の成功は、Ｔ細胞が能動的に腫瘍に浸潤し、免疫系の他の部分の応答を誘導および調整する能力に起因するかもしれない。
しかしながら、これらの細胞処置の成功率は非常に変わりやすく、処置は、個々の腫瘍の固有の抗原特性の特徴付け、およびこれらの固有の抗原と反応する少数のＴＩＬの同定に大きく依存している。これは、極めて高額で、ＴＩＬの生成に長期間かかり、場合によっては適切なＴＩＬを分離および増殖し得ない。
したがって、癌などの増殖性疾患の免疫治療のための新規かつ代替の選択肢が必要とされている。
発明の概要
本発明は、一部には、腫瘍関連抗原であるＬｇｒ５を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の開発に基づいている。
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（Ｌｇｒ５）は、その同種リガンドによって結合されるとＷｎｔシグナル伝達を活性化する受容体である。Ｌｇｒ５は、シグナル伝達の上昇が癌の発症および再発に関与している癌幹細胞のマーカーとして同定されている。
したがって、本発明は、Ｌｇｒ５を認識する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれからなるキメラ抗原受容体を提供する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞の表面上での発現時に抗原特異的細胞応答を誘導し得る人工的に構築されたタンパク質である。ＣＡＲは、活性化されると宿主細胞内でシグナル伝達カスケードを引き起こす細胞内部分を利用する。キメラ抗原受容体は、ＣＡＲの抗原特異性を決定する結合ドメインを有する細胞外ドメインをさらに含む。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体などの抗原受容体の機能を模倣するが、カスタマイズ可能な抗原特異性およびカスタマイズ可能な細胞内シグナル伝達を有するように設計され得る。しかしながら、Ｔ細胞受容体とは異なり、ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの主要組織適合性（ＭＨＣ）分子とは無関係に、細胞内部分の設計に応じて、追加のまたは外因性の共刺激とは無関係に、活性化されるように設計され得る。
したがって、Ｔ細胞などの適切な宿主細胞で発現する場合、本発明のＣＡＲは、Ｌｇｒ５を発現する細胞の死滅をもたらし得る細胞活性を誘導し得る。したがって、本発明のＣＡＲを使用して、Ｌｇｒ５を発現する細胞を死滅させるか、またはその死滅を誘導し得る。
Ｌｇｒ５は、凸面および凹リガンド結合面の両方を有する馬蹄形を形成する１７個のロイシンリッチリピートを含むソレノイドタンパク質ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、Ｌｇｒ５の凸面上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、エピトープは、Ｌｇｒ５のロイシンリッチリピート６～９内にある。
Ｌｇｒ５に結合する結合部分（ＣＤＲなど）を含む抗体が生成されている。これらには、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１）、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７．１が含まれる。したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、少なくとも、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１または１８Ｇ７．１から選択される抗体の結合部分を含む。
当技術分野で理解されるように、抗体は、可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖によって定義される可変領域を含む。これらの可変領域の各々は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）による４つのフレームワーク領域の間隙を含み、合計６つのＣＤＲをもたらす。しかしながら、抗体の一本鎖はエピトープに特異的に結合し得る。一次可変重鎖を使用して、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を形成し得る。さらに、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）融合タンパク質が生成され得ることによって可変重鎖および可変軽鎖が融合ペプチド（融合リンカー）を介して一緒に融合される。あるいは、Ｆａｂとして知られる抗体の結合断片（断片抗原結合）を、抗体の酵素消化によって生成して、Ｆｃ断片をＦａｂ断片から分離し得る。消化は、抗体から２つのＦａｂを作製するヒンジ領域で、または抗体ジスルフィド架橋によって連結された抗体の２つのＦａｂ領域を含むＦ（ａｂ）２を作製するヒンジの下方でなされ得る。
したがって、一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖と同一の配列、またはＬｇｒ５に結合する抗体のＦａｂ断片と同一の配列、またはＬｇｒ５に結合する抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と同一の配列を含む単一ドメイン抗体である。
一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変重鎖を少なくとも含む。しかしながら、単一ドメイン抗体の形態の可変軽鎖も抗原に特異的に結合し得る。したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変軽鎖を少なくとも含む。
開示されるように、各可変鎖は３つのＣＤＲを含む。したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するか、または１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するか、または１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するか、または１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９と同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するか、または１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するか、または１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するか、または１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む。
結合ドメインが一本鎖可変断片である一部の実施形態では、可変重（ＶＨ）鎖のＣ末端は可変軽（ＶＬ）鎖のＮ末端に連結されている。一部の代替的な実施形態では、一本鎖可変断片は、ＶＨ鎖のＮ末端に連結されたＶＬ鎖のＣ末端を含む。これらの実施形態の好ましい形態では、ＶＨ鎖は、配列番号３７の配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３９の配列を有するＣＤＲ３を含み、ＶＬ鎖は、配列番号４０の配列を有するＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４２の配列を有するＣＤＲ３を含み、各ＣＤＲは、１、２または３個のアミノ酸修飾を有し得る。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号９５を有する重鎖ＣＤＲ１、および配列番号３８、３９または９６に示される重鎖ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号９６を有する重鎖ＣＤＲ３、および配列番号３７、９５または３８に示される重鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２のいずれかを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、配列番号４９および／もしくは配列番号５０、または配列番号４９もしくは５０と少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらの変異体を含む。一部の実施形態では、結合ドメインの配列は、配列番号４９または５０と少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、結合ドメインの配列は、配列番号４９または５０と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、ＶＬおよびＶＨは、配列番号９８の配列を含むか、または配列番号９８の配列からなる融合ドメインによって連結される。したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号５３もしくは配列番号５４、または配列番号５３もしくは５４と少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらの変異体を含む。一部の実施形態では、結合ドメインの配列は、配列番号５３または５４と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
ＣＡＲの抗原認識ドメインは、膜貫通ドメインに直接連結され得る。しかしながら、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカードメインを提供することが有利な場合がある。ＣＡＲ Ｔ細胞は、リンカードメインを含まずに機能するように設計および産生されており、したがって、この文脈では、リンカードメインはＣＡＲの機能に必須ではない場合がある。
しかしながら、一部のＣＡＲは、リンカードメインの不在下では機能し得ないか、または最適に機能しない場合がある。したがって、ＣＡＲの一部の実施形態では、細胞外ドメインは、結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するリンカードメインを含む。
リンカードメインの長さは、ＣＡＲおよびＣＡＲを発現するＴ細胞の機能性を改変する場合がある。ＣＡＲの一部の実施形態では、リンカードメインは、少なくとも１２アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、約１２アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約１２アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、１１９アミノ酸の長さであるか、または少なくとも１１９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、約１１９アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約１１９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、２２９アミノ酸の長さであるか、または少なくとも２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、約２２９アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、１２アミノ酸の長さ～２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、約１２アミノ酸の長さ～約２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、１１９アミノ酸の長さ～２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカードメインは、約１１９アミノ酸の長さ～約２２９アミノ酸の長さである。
ＣＡＲのリンカードメインを提供するために、様々なペプチド配列が利用され得る。本発明の一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ４ヒンジなどの免疫グロブリンヒンジの配列と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカー領域は、ＩｇＧ４ヒンジの修飾型と同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジの修飾型は、１、２または３個のアミノ酸修飾、好ましくは１個のアミノ酸修飾を含む。
一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンのＣＨ３領域、例えばＩｇＧ４のＣＨ３領域の配列と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンのＣＨ２領域、例えばＩｇＧ４のＣＨ２領域の配列と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ヒンジ領域、ＣＨ３領域および／またはＣＨ２領域の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、リンカードメインは、配列番号５５、配列番号５６もしくは配列番号５７、もしくはそれらの機能的変異体から選択される配列を含むか、またはそれからなる。
ＣＡＲを発現するＴ細胞がその同種抗原を認識すると、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞の活性化をシグナル伝達する。したがって、ＣＡＲの細胞内シグナルは、細胞活性化の種類および規模に影響を及ぼし得る。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、活性化受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分を含む。一部の実施形態では、活性化受容体はＣＤ３共受容体複合体またはＦｃ受容体の一員である。特に想定されるシグナル伝達ドメインには、少なくともＣＤ３－ζ（ＣＤ３ゼータ）のシグナル伝達部分、またはＦｃεＲＩもしくはＦｃγＲＩのシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列が含まれる。
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分を含む。一部の実施形態では、共刺激受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳからなる群より選択される。一部の実施形態では、共刺激受容体は４－１ＢＢである。
一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ζ（ＣＤ３ゼータ）の少なくともシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列、および４－１ＢＢのシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
一部の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号５８および／もしくは配列番号５９と同一のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６０、６１、６２、６３、６４もしくは６５、またはそれらの機能的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６２、６３、６４もしくは６５、またはそれらの機能的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
上に開示されるようなＣＡＲをコードする核酸分子またはその核酸分子を含む核酸構築物がさらに提供される。一部の実施形態では、核酸構築物はベクターである。一部の実施形態では、核酸構築物中の核酸分子の発現は、転写制御配列の制御下にある。一部の実施形態では、転写制御配列は構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｐ－アクチン、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子－１アルファ（ＥＦ１Ａ）、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧＧ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
本発明の核酸または核酸構築物は、遺伝子改変細胞を調製するのに使用するため、またはウイルスベクターを調製するのに使用するため、または医薬を調製するのに使用するためであり、または細胞を遺伝子改変する方法、または医薬のウイルスベクターを調製する方法に使用され得る。
したがって、本明細書に記載のＣＡＲをコードおよび／または発現する核酸分子または核酸構築物を含むウイルスベクターも本明細書で提示される。一部の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、遺伝子改変細胞を調製する方法で使用される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、癌の処置のための医薬、またはＬｇｒ５を発現または異常発現する細胞の死滅のための医薬の調製に使用するためのものである。
本発明によってさらに提供されるのは、本明細書に記載のキメラ抗原受容体、または本明細書に記載の核酸分子もしくは構築物、または核酸分子もしくは構築物のゲノムに組み込まれた形態を含む、細胞または遺伝子改変細胞である。
一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、白血球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーＴ細胞である。
一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
本開示はまた、Ｌｇｒ５を発現または異常発現する標的細胞を死滅させる方法を提示し、本方法は、ＣＡＲを発現する細胞または遺伝子改変細胞に標的細胞を曝露することを含み、ＣＡＲは、Ｌｇｒ５を標的とする。一部の実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載のいずれか１またはそれを超える特性を含む。
一部の実施形態では、細胞または遺伝子改変細胞は、標的細胞に対して自己である。一部の実施形態では、細胞または遺伝子改変細胞は、標的細胞に対して同種異系である。一部の実施形態では、標的細胞は対象の体内にある。一部の実施形態では、標的細胞は癌細胞である。
標的細胞を死滅させる方法の一部の実施形態では、本方法は、キメラ抗原受容体を発現する細胞または遺伝子改変細胞に標的細胞を曝露する前に、標的細胞上のＬｇｒ５の表面発現を分析することをさらに含む。標的細胞が癌細胞である一部の実施形態では、癌細胞上のＬｇｒ５の表面発現を同等の非癌性細胞と比較して、異常発現を同定する。
本開示はまた、癌患者を予防または処置する方法も提示し、本方法は患者をＣＡＲに曝露することを含み、ＣＡＲはＬｇｒ５を標的とする。好ましくは、ＣＡＲは、本明細書に記載されるものなどの細胞または遺伝子改変細胞で発現される。したがって、一部の実施形態では、癌患者を予防または処置する方法は、本明細書に記載のＣＡＲを含むまたは発現する細胞に患者を曝露することを含む。一部の実施形態では、細胞は患者にとって自己である。一部の実施形態では、細胞は患者に対して同種異系である。一部の実施形態では、患者の癌を予防または処置する方法は、患者の癌幹細胞の存在を同定することをさらに含む。
癌細胞を死滅させるための方法または癌を予防もしくは処置するための方法の一部の実施形態では、癌細胞は、乳房、膵臓、前立腺、結腸、結腸直腸、胃腸、肺（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、卵巣またはＢ細胞リンパ腫のうちの１またはそれを超える種類から選択される。一部の実施形態では、癌細胞は、結腸直腸癌、Ｂ細胞リンパ腫または卵巣癌のうちの１またはそれを超える種類から選択される。一部の実施形態では、癌は、結腸癌、結腸直腸癌または別の胃腸癌である。一部の実施形態では、癌は転移性癌であるか、または再発性癌である。
ＣＡＲ、核酸、ベクターまたは本明細書に記載の遺伝子改変細胞と、薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物がさらに提供される。一部の実施形態では、医薬組成物はサイトカインを含む。
本発明の範囲内に入る場合がある他の形態にもかかわらず、本発明の好ましい実施形態は、添付の図面を参照して単なる例として説明される。
図面の簡単な説明
図１は、抗体１８Ｇ７．１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および本明細書に例示するキメラ抗原受容体の実施形態の重鎖および軽鎖のＣＤＲのアラインメントである。
図２は、抗体１８Ｇ７．１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の可変重鎖および可変軽鎖の領域と、本明細書に例示するキメラ抗原受容体の実施形態の可変重鎖および可変軽鎖とのアラインメントである。ＣＤＲは囲み枠で示されている。
図３は、１２（４ａ）、１１９（４ｂ）および２２９（４ｃ）アミノ酸の長さの３つの異なるリンカードメインを示す、本発明の実施形態によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概略図である。
図４Ａおよび図４Ｂは、本発明によるＣＡＲの結合ドメインの２つの実施形態を示す概略図である。具体的には、Ｌｇｒ５に対する２つのｓｃＦｖ融合タンパク質であって、融合ドメインによって連結された抗体可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む２つのｓｃＦｖ融合タンパク質が例示される。
図５Ａおよび図５Ｂは、リンパ球（前方散乱および側方散乱ゲーティングに基づく）のフローサイトメトリーヒストグラムであり、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＥＧＦＲ発現（ＣＡＲ発現のプロキシマーカーとして）について染色され、図５Ａは、ＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００３およびＣＮＡ３００４、ならびに形質導入されていないＴ細胞による形質導入の５日後のＣＡＲ発現を示す。図５Ｂは、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４ならびに形質導入されていないＴ細胞による形質導入の５日後のＣＡＲ発現を示す。
図６Ａおよび図６Ｂは、リンパ球のフローサイトメトリーヒストグラム（前方散乱および側方散乱ゲーティングに基づく）であり、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＥＧＦＲ発現について（ＣＡＲ発現のマーカーとして）染色される。図６Ａは、ＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００３およびＣＮＡ３００４ならびに形質導入されていないＴ細胞による形質導入の１５日後のＣＡＲ発現を例示する。図６Ｂは、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４ならびに形質導入されていないＴ細胞による形質導入の１５日後のＣＡＲ発現を例示する。
図７は、野生型ＣＨＯ細胞およびＬｇｒ５を過剰発現するＣＨＯ細胞におけるＬｇｒ５発現のフローサイトメトリーヒストグラムであり、これらは染色されなかったか、抗Ｌｇｒ５抗体ＢＮＣ１０１で染色された。
図８Ａおよび図８Ｂは、Ｌｇｒ５発現標的の溶解におけるＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の有効性を示す。具体的には、図８Ａは、ＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４のうちの１つで形質導入されたＴ細胞が、１０：１、３：１および１：１の標的細胞対エフェクター細胞比で、Ｌｇｒ５を過剰発現するＣＨＯ細胞を効果的に溶解し得る一方で、形質導入されていないＴ細胞は、同じ標的細胞を最小限しか溶解しないことを実証する細胞傷害性（死滅）アッセイを示す。図８Ｂは、同じ形質導入されたＴ細胞が、Ｌｇｒ５を過剰発現しないＣＨＯ細胞に対して最小限の死滅のみをもたらすことを示す。
図９Ａ～図９Ｇは、様々な癌細胞株を死滅させることにおけるＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００３、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４の有効性を示す。アッセイされる癌細胞株には、（９Ａ）ＬｏＶｏ細胞（転移性結腸上皮細胞癌）、（９Ｂ）ＬＩＭ １２１５細胞（結腸直腸上皮細胞癌腫）、（９Ｃ）Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫）、（９Ｄ）Ｎａｍａｌｗａ細胞（バーキットリンパ腫）、（９Ｅ）ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌腫）、（９Ｆ）ＳＨＹ－５Ｙ－ＳＹ（神経芽腫）、および（９Ｇ）ＢＥ（２）－Ｍ１７（神経芽細胞腫）が含まれる。これらのアッセイを、１０：１、３：１および１：１のエフェクターＣＡＲ Ｔ細胞対標的癌細胞（Ｅ：Ｔ）比で行った。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、図９Ａおよび図９Ｂに示される死滅アッセイの反復の結果を示すが、エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は１０：１～１：３０である。
図１１は、１０：１および１：１のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比での原発性卵巣癌細胞の死滅におけるＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４の有効性を示す。
図１２Ａ～図１２Ｃは、ＬｏＶｏ標的細胞のＣＡＲ Ｔ細胞媒介性死滅におけるＬｇｒ５遮断抗体の効果を例示する。図は、具体的に、１０：１および１：３０のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比での原発性卵巣癌細胞の死滅におけるＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４の有効性を示す。
図１３Ａは、癌のマウス異種移植モデルにおけるＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４のインビボ有効性（腫瘍成長によって測定した場合）を示す。
図１４Ａおよび図１４Ｂは、癌のマウス異種移植モデルにおける生存期間（１４Ａ）および無腫瘍日数（１４Ｂ）を示す。
詳細な説明
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（Ｌｇｒ５）は、ＧＰＣＲのクラスＡロドプシン様ファミリーの７回膜貫通タンパク質である。Ｌｇｒ５は、そのリガンドＲ－スポンジンに結合すると、Ｗｎｔ受容体ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＰＲ５／６と相互作用して、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を増強する（Ｃａｒｍｏｎ，Ｋ．Ｓ．ら、ＰＮＡＳ．，２０１１；１０８，１１４５２－７）。
Ｌｇｒ５が活性化されると、β－カテニンは細胞のサイトゾルに蓄積し、核に移行し、そこでｃ－ｍｙｃ、サイクリンＤ１およびサバイビンを含むがん原性遺伝子を活性化する。正常条件下では、Ｌｇｒ５は、成体幹細胞のいくつかの系統の胚発生ならびに細胞可塑性、増殖および分化に不可欠である。したがって、Ｌｇｒ５は、乳腺組織、小腸および大腸ならびに毛包を含むいくつかの組織における成体幹細胞のマーカーである（Ｘｕ，Ｌら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．，２０１９；１０：２１９）。
注目すべきことに、Ｌｇｒ５は、腺癌、基底細胞癌腫、神経膠芽腫、肝細胞癌腫、結腸直腸癌、膵臓癌、Ｂ細胞悪性腫瘍、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）および卵巣癌を含む様々な種類の癌で上方制御されていると同定されている（Ｔａｎｅｓｅ Ｋら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ。２００８；１７３（３）：８３５－４３、Ｃａｒｍｏｎ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１；１０８，１１４５２－７、Ｊｉａｎｇ ＸＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３；１１０（３１）：１２６４９－５４、Ｇａｏら、Ｔｒａｎｓｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１９；８（１）：２０３－２１１およびＭｃＣｌａｎａｈａｎ Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ。２００６；５（４）：４１９－２６）。
癌における主にＬｇｒ５の上方制御は、癌幹細胞の増殖および再生を刺激し、癌の移動性および腫瘍形成を促進することが実証されている。Ｌｇｒ５はまた、乳癌で上皮から間葉への移行を促進することが示されている（Ｙａｎｇ Ｌら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１５；３３（１０）：２９１３－２４）。したがって、Ｌｇｒ５は、癌転移および二次腫瘍形成において重要な役割を有し、癌幹細胞（ＣＳＣ）上に発現する。
本発明は、一部には、Ｌｇｒ５に対するキメラ抗原受容体を発現する細胞が、Ｌｇｒ５発現細胞を死滅させるという本発明者らによる認識に基づくものであり、したがって癌に罹患している患者のための代替処置を提供し得る。
したがって、本発明は、Ｌｇｒ５を認識する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれからなるキメラ抗原受容体を提供する。
本明細書を通して、本発明のＣＡＲ構築物（集合的にＣＮＡ ＣＡＲファミリー構築物と呼ばれる）は、ＣＮＡ３０ｘｘまたはＣＮＡ３１ｘｘと呼ばれ、末尾「ｘｘ」は連続番号（すなわち、０２、０３または０４）である。したがって、本明細書に例示される６つのＣＮＡは、ＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００３、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４である。接頭語のＣＮＡ３０ｘｘは、結合領域において可変軽鎖および可変重鎖の第１の配向を有するＣＡＲを指し、ＣＮＡ３１ｘｘは逆の配向を有する。連続番号（「ｘｘ」）は、様々なリンカーの長さを指す。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞の表面上での発現時に抗原特異的細胞応答を誘導し得る人工的に構築されたタンパク質である。それらの最も基本的な形態では、ＣＡＲは少なくとも３つのドメインを含む。第１のドメインは、抗原、またはより具体的には、抗原の１つのエピトープ部分または複数のエピトープ部分を特異的に認識する細胞外抗原認識ドメインである。第２のドメインは、細胞内シグナル伝達経路を誘導することができるか、または誘導に関与することができる細胞内シグナル伝達ドメインである。第３のドメインは、原形質膜を横切り、細胞外抗原認識ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを架橋する膜貫通ドメインである。
最初の２つのドメインの組み合わせは、ＣＡＲの抗原特異性およびＣＡＲが所望の細胞応答を誘導する能力を決定し、後者はＣＡＲの宿主細胞にも依存する。例えば、Ｔヘルパー細胞で発現し、ＣＤ３活性化ドメインを含むシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲの活性化は、その同種抗原によって活性化されると、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を誘導して様々なサイトカインを分泌する場合がある。さらなる例では、同じＣＡＲは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で発現した場合（同種抗原を発現する細胞によって活性化されると）、最終的に抗原発現細胞のアポトーシスの誘導をもたらす細胞毒素の放出を誘導する場合がある。
第３のドメイン（膜貫通ドメイン）は、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインの一部を含んでもよいか、またはそれと会合してもよい。膜貫通ドメインは、典型的には、細胞の脂質二重層にまたがり、ＣＡＲを細胞膜内に埋め込む１またはそれを超える疎水性ヘリックスである。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞に関連する場合、ＣＡＲの発現パターンにおける１つの決定因子であり得る。例えば、ＣＤ３共受容体に関連する膜貫通ドメインの使用は、とりわけ、ナイーブＴ細胞におけるＣＡＲの発現を可能にし得るが、ＣＤ４共受容体由来の膜貫通ドメインの使用は、Ｔヘルパー細胞におけるＣＡＲの発現を指示する場合がある。ＣＤ８共受容体膜貫通ドメインの使用は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）における発現を指示する場合があるが、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＣＴＬおよびＴヘルパー細胞の両方における発現を可能にする場合があり、ＣＡＲの安定化を補助し得る。
キメラ抗原受容体のさらなる構成要素または部分は、リンカードメインである場合がある。リンカードメインは、膜貫通ドメインの細胞外側から抗原認識ドメインに広がり、それによって抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結する。典型的には、当技術分野では、いくつかのＣＡＲはリンカードメインなしで機能するため、リンカードメインは任意選択のドメインと見なされる。
結合ドメイン
本明細書を通して使用される場合、「認識する」という用語は（Ｌｇｒ５に関して）、Ｌｇｒ５の所望のエピトープまたはＬｇｒ５分子の任意の部分と会合する結合ドメインの能力を指す。好ましくは、この認識は、結合ドメインがＬｇｒ５に排他的にまたは主に結合するという点で選択的である。一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５またはそのエピトープに直接結合する場合がある。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、Ｌｇｒ５のプロセシングされた形態に結合する場合がある。この文脈で使用される場合、「プロセシングされた形態」という用語は、典型的には、主要組織適合遺伝子複合体（例えばヒト白血球抗原）上に提示されるＬｇｒ５の形態およびエピトープを含む細胞内プロセシングの結果として、切断または消化されたＬｇｒ５の形態に関する。
ＣＡＲ結合ドメインは、Ｌｇｒ５またはそのエピトープを認識し得る任意の適切なドメインであり得る。本明細書を通して使用される場合、「結合ドメイン」という用語は、Ｌｇｒ５に対するＣＡＲの特異性を提供するＣＡＲの部分を指す。結合ドメインは、本発明の状況では、ＣＡＲの細胞外領域（またはエクトドメイン）の一部のみを含む。
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（配列番号１－Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ７５４７３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３６５８．１およびＮＭ＿００３６６７．２－同義のＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７、ＦＥＸおよびＧＰＲ ＨＧ３８によっても知られている）は、９０７アミノ酸の長さの膜結合受容体である。Ｌｇｒ５は、２１アミノ酸シグナル伝達ドメインおよびアミノ酸６７～４４６からの最大１７個のロイシンリッチリピートを含む５６１アミノ酸の細胞外ドメインからなる。ロイシンリッチリピートは、細胞外ドメインに凸面と、ＲＳＰＯ１およびＲＮＦ４３と相互作用する凹面とを有する弓状構造を形成する（Ｋｕｍａｒ Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１４；２３（５）：５５１－６５ Ｃｈｅｎ Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２０１３；２７（１２）：１３４５－５０）。Ｌｇｒ５は、２１アミノ酸の７つの膜貫通らせんドメインおよび８４アミノ酸の細胞質側末端をさらに含む。細胞外ドメインの最もｃ末端の領域は、４８１～５５２にわたるヒンジドメインを含む。
したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、残基２２～５６１の間のエピトープを認識する。一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５の凸面上のＬｇｒ５のエピトープを認識する。いくつかの態様において、結合ドメインは残基６７～４４６の間のエピトープを認識する。
ＣＡＲの結合ドメインは、様々な結合分子を含み得る。これらには、抗体（重鎖抗体などの非従来型抗体を含む）、抗体断片、およびタンパク質結合足場が含まれる。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｌｇｒ５を認識する抗体の結合部分を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変重鎖を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変軽鎖を含む。
Ｌｇｒ５を認識する抗体は当技術分野で知られており、Ｈｕａｂｉｏ（ＥＴ１６０８－１８）、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳ－Ａ１２３６）、ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（ＭＢＳ８５６９５０、ＭＢＳ７１１３１１８およびＭＢＳ９６０４３３０）、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＮＬＳ１２３６）、Ｂｉｏｒｂｙｔ（ｏｒｂ１３７１３６およびｏｒｂ１３７１７７）、ＰｒｏＳｃｉ（２３－３９４）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ａ１００７－１００）、Ｃｕｓａｂｉｏ（ＣＳＢ－ＰＡ０１２９０６ＬＡ０１ＨＵ）、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（ＳＰＣ－７６４）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（３７３８０３および３７３８０４）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＡＢ８２４０）、Ｂｉｏｓｓ（ｂｓｍ－５２４１２Ｒ）、Ｂｉｏｒａｄ（ＡＨＰ２７４２）、Ｇ０Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＩＴＡ３７５５）、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（１４４－１０５４５－５０）、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＨＰＡ０１２５３０）、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＴＡ８９００１３）、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ（Ｅ－ＡＢ－６３４３２）、ＧｅｎｅＴｅｘ（ＧＴＸ７１１４３）、Ｓｔ Ｊｏｈｎ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＴＪ１１２５６３）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ＭＡ５－３２９７８およびＭＡ５－３２９７９）、ＮＳＪ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｆ４８１６６）、Ａｃａｍ（ａｂ２１９１０７）、Ａｂｎｏｖａ（ＰＡＢ３０４５６およびＰＡＢ２５９１）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（１３０－１１１－３９０）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（１００６８７－Ｔ０４）、Ａｂｂｅｘａ Ｌｔｄ（ａｂｘ０１９１２６）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＭＣ－１２３６およびＭＣ－１２３５）、ＢｏｓｔｅｒＢｉｏ（Ｍ００２３９）、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（２１６５９およびＣ４４９７４）、Ｗｕｈａｎ Ｆｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＦＮａｂ０４７６５）、メルク（ＨＰＡ０１２５３０）、Ｌｅａｄｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＡＭＭ０３０６９Ｇ）、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ（ＲＡ２５０７１）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１１１３０２）、Ｂｏｎ Ｏｐｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＡ１１１４９９）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｌ６４０）およびＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＡＢ－１６５０－ＶＨＨ）から入手可能な抗Ｌｇｒ５抗体を含む。さらなる抗Ｌｇｒ５抗体は、米国第２０１９０２４８８８９号（抗体ＧＥＮ８９．ＬＧＲ５．１－１２および抗体ＧＥＮ８９．ＬＧＲ５．２６－１）に開示されている。
一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。好ましい実施形態では、Ｌｇｒ５を認識する抗体は、ＷＯ第２０１５１５３９１６号（表題：ｌｇｒ５に結合するヒト化抗体）およびＷＯ第２０１８２３２１６４号（表題：ｌｇｒ５に結合する抗体薬物複合体）に記載されている１８Ｇ７Ｈ６Ａ３または１８Ｇ７Ｈ６Ａ１（ＢＮＣ１０１）である（その開示全体は全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの結合ドメインは、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合部分を含む。
水素－重水素交換質量分析（Ｍｏｒｒｉｓ，１９９６’’Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，’’ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい）を使用した抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＬｇｒ５との相互作用のエピトープマッピングにより、重要なエピトープ残基がＬｇｒ５のＴ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８およびＫ２６０として同定された（配列番号１）。これらの残基は、ロイシンリッチリピート６～９の凸面内にある。したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、Ｌｇｒ５のロイシンリッチリピート６～９内のエピトープを認識する。一部の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、Ｌｇｒ５の１またはそれを超えるエピトープ残基Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８およびＫ２６０を認識する。
抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３または１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は、マウス抗体１８Ｇ７．１のヒト化型および親和性成熟型である。アラニンスキャニング変異誘発を行うことによって、重鎖ＣＤＲ１ならびに軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３の個々の残基をアラニンに変異させ、ＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクションし、得られた馴化培地をフローサイトメトリーによってＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。重鎖ＣＤＲ３に対して飽和変異誘発を実施し、ＣＤＲ３のすべての残基を、その位置での元のアミノ酸同一性を除いて、１９個の天然アミノ酸のそれぞれに変異させた。各変異体をＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクションし、得られた馴化培地をフローサイトメトリーによってＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。重鎖および軽鎖のＣＤ２配列に対して、同等の変異誘発が用いられ得る。
図１は、１８Ｇ７．１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１のＣＤＲ領域および本発明の本ＣＡＲ構築物のＣＤＲのアラインメントを示す。分かるように、１８Ｇ７．１と本発明のＣＡＲ構築物との間の重鎖ＣＤＲ１では、最大３個のアミノ酸残基が異なる。
さらに、図２は、ＣＡＲの１８Ｇ７．１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１およびＣＮＡ３ｘｘｘファミリーの重鎖可変領域のアラインメントを示す（リーダー配列なし）。分かるように、本発明の重鎖可変領域は、ＹからＬへの置換を１０１番目に有する１８Ｇ７Ｈ６Ａ１とは異なる（図２参照）。ＣＮＡ３ｘｘｘ ＣＡＲの重鎖ＣＤＲ３領域（配列番号３９）と抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の重鎖ＣＤＲ３領域（配列番号９６）との比較は、この修飾が重鎖のＣＤＲ３領域内にあることを示す（図１を参照のこと）。
図１に示されるように、１８Ｇ７．１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１およびＣＮＡ３ｘｘｘのＣＡＲの軽鎖ＣＤＲ３領域は、１８Ｇ７．１がＮからＡへの変異（配列番号９７を参照）を４番目に含むことを示す。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号３７、３８および３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号９５を有する重鎖ＣＤＲ１、および配列番号３８、３９または９６に示される重鎖ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかを含む。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号９６を有する重鎖ＣＤＲ３、および配列番号３７、９５または３８に示される重鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２のいずれかを含む。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大１、２もしくは３個のアミノ酸修飾を有する配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号４０、４１および４２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号９７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号４１および４２を有するＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含む。
抗体および抗体断片
上述のように、ＣＡＲの結合ドメインは、抗体、または抗体の結合部分、または抗体に由来する結合部分を含む場合がある。抗体は、さらなる多様性を可能にする個体間の遺伝的変異を有する、単一個体において潜在的に１０１１～１０１２個もの固有分子を有する例示的な多様性を有するタンパク質結合分子である。インビボでの抗体多様性は、Ｖ（Ｄ）Ｊ連結における一連の遺伝子のランダムな組換えによって駆動される。
抗体の結合は、主に、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３と呼ばれる重鎖および軽鎖の３つの超可変領域によって決定される。したがって、各成熟抗体は、６つのＣＤＲ（可変重（ＶＨ）鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有する。これらの超可変領域は、三次元抗原結合ポケットを形成し、抗体の結合特異性はＣＤＲ、主にＣＤＲ３の特異的アミノ酸配列によって決定される。
特定の分析物に対する抗体は、商業的に得られてもよく、または当技術分野で公知の方法によって生成されてもよい。例えば、特定の分析物に対する抗体は、ＨｏｗａｒｄおよびＫａｓｅｒ（Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００７）によって一般的に開示されている方法を使用して調製されてもよい。
対象内で生成された抗体の特異性、結合活性および親和性は、親和性成熟（例えば、Ｆｕｊｉｎｏ Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．，２０１２；４２８（３）：３９５－４００、Ｌｉ，Ｂ．ら、ＭＡｂｓ．２０１４；６（２）：ｐｐ．４３７－４５およびＨｏ ＭおよびＰａｓｔａｎ Ｉ，’’Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ’’，Ｍｅｔｈｏｄ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２００９；５２５：２９３－ｘｉｖを参照）などのインビトロプロセスによって改変され得る。これらの技術には、（限定されるものではないが）部位特異的変異誘発およびＰＣＲ駆動変異誘発、ファージライブラリーの開発およびアフィニティースクリーニングが含まれる。例えば、（コード免疫グロブリンＤＮＡに関して）Ａ／Ｇ－Ｇ－Ｃ／Ｔ－Ａ／Ｔ（ＲＧＹＷ）およびＡＧ－Ｃ／Ｔ（ＡＧＹ）配列によって定義されるホットスポット位置に隣接する変異は、産生された抗体の親和性を改変する可能性が高い。あるいは、インビトロ走査飽和変異誘発（Ｃｈｅｎ，Ｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．、１９９９；（１２）４：３４６－３５６）などのプロセスを使用して、ＣＤＲ領域内のありとあらゆる改変を互いに可能性な変異で置き換え得る。次いで、各変異体を抗原親和性および特異性について評価した。したがって、インビボ由来抗体またはその結合断片をさらに改変して、異なるが系統的に関連する抗体を産生し得る。その結果、「抗体」（およびその断片）という用語は、インビボで生成された抗体と比較した場合に固有配列を有するように、ＣＤＲ結合部位を改変する変異のプロセスを受けたインビボ由来抗体およびインビトロ由来分子を包含する。さらに、抗体の結合部分、特にＣＤＲを、当技術分野で公知の技術を使用して親和性成熟および変異させ得る。
抗体という用語はまた、ラクダ科動物、サメおよびアゴアマダイなどの種から産生される非従来型抗体を含む。したがって、抗体という用語は、ラクダ抗体、ＩｇＮＡＲおよび可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）を含む重鎖抗体を含む。さらに、これらは、それらの結合部分（ＶＮＡＲ－ＩｇＮＡＲの単一結合部分など）に断片化され得るか、または融合タンパク質に組換えで組み込まれ得る。そのような非従来型抗体を作製および適合させるための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２０１２；９１１：ｐｐ．２７－３６およびＶｉｎｃｋｅ Ｃ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１２；９０７：ｐｐ．１４５－７６を参照のこと。
Ｌｇｒ５の特異的に同定されたエピトープ領域に結合する抗体を生成し得る。さらに、生存親和性（ａｂｉｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）および結合活性を最適化するために、そのような抗体を親和性成熟させ得る。したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体の結合領域と同一の配列を含むか、またはＬｇｒ５に結合する結合領域の親和性成熟形態に対応する配列を含む。親和性成熟結合領域は元の抗体結合領域と有意に異なり得るが、好ましい形態では、結合領域の親和性成熟形態は、Ｌｇｒ５に結合する抗体に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有する。したがって、ＣＡＲの結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含んでもよい。
抗体結合断片
一部の実施形態では、結合ドメインは抗体結合断片である。抗体結合断片は、抗体に由来し得るか、または抗体もしくは抗体断片のＣＤＲと同一の配列で組換え生成される場合がある。実際、これらのＣＤＲは、親和性成熟抗体に由来する場合があるため、インビボ由来抗体と同一ではない場合がある。
抗体は４本の鎖（２本の重鎖および２本の軽鎖）から構成され、Ｆｃ（分別結晶可能）ドメインとＦａｂ（分画抗原結合）ドメインに分離され得る。抗体のＦｃ部分は、Ｆｃ受容体および補体系と相互作用する。したがって、Ｆｃ部分は、抗体の免疫機能にとって重要である。しかし、Ｆａｂ部分は抗体の結合領域を含み、所望のエピトープに対する抗体の特異性にとって重要である。
したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは抗体のＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片は、個々のＦａｂ断片（すなわち、抗体断片は、連結ジスルフィド架橋の不在下で生成される）またはジスルフィド架橋を介して連結された抗体の２つのＦａｂ断片を含むＦ（ａｂ’）２断片であり得る。これらの断片は、典型的には、ペプシンなどの消化酵素を使用して抗体を断片化することによって生成される。方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｊｏｇｒｅｎ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１７；１５３５：ｐｐ．３１９－３２９を参照のこと。
抗体の各Ｆａｂ断片は、合計６つのＣＤＲを有し、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを含む（４つのフレームワーク領域からなるフレームワーク内）。Ｆａｂ断片の定常領域を除去して、抗体のＶＨおよびＶＬ領域のみを残し得る。個々のＶＨ鎖およびＶＬ鎖（それぞれ３つのＣＤＲのみを含む）は、高い親和性で特異的に結合することが示されている。典型的には、個々の結合領域は、単一抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）として知られている。あるいは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をリンカーを介して連結して、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ－二重特異性抗体としても知られる）として公知の融合タンパク質を形成し得る。Ｆａｂとは異なり、ｓｃＦｖは抗体から断片化されず、むしろ典型的には抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域に基づいて組換え形成される。さらに、ｓｄＡｂを組換え生産し、さらなる部分も含む場合があるより大きな融合タンパク質の結合構成要素を形成し得る。その結果、一部の実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂであるか、またはそれらを含む。ｓｃＦｖは、ジｓｃＦｖまたはトリｓｃＦｖなどの多価ｓｃＦｖを形成するために互いに連結された複数のＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含んでもよい。
したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変重鎖もしくは可変軽鎖と同一の配列、またはＬｇｒ５に結合する抗体の断片抗原結合（Ｆａｂ）断片と同一の配列、またはＬｇｒ５に結合する抗体の可変重鎖領域および可変軽鎖領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と同一の配列を含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。
一部の実施形態では、可変重鎖領域は、配列番号５０のアミノ酸配列、または少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するその変異体を有する。一部の実施形態では、可変軽鎖領域は、配列番号４９のアミノ酸配列、または少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するその変異体を有する。
一部の実施形態では、結合ドメインは、ＶＬ鎖のＮ末端に連結されたＶＨ鎖のＣ末端を含む一本鎖可変断片であり、ＶＨ鎖は、配列番号３７の配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３９の配列を有するＣＤＲ３を含み、ＶＬ鎖は、配列番号４０の配列を有するＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４２の配列を有するＣＤＲ３を含み、各ＣＤＲは、１、２または３個のアミノ酸修飾を有し得る。
一部の実施形態では、結合ドメインは、ＶＨ鎖のＮ末端に連結されたＶＬ鎖のＣ末端を含む一本鎖可変断片であり、ＶＬ鎖は、配列番号４０の配列を有するＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４２の配列を有するＣＤＲ３を含み、ＶＨ鎖は、配列番号３７の配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３９の配列を有するＣＤＲ３を含み、各ＣＤＲは、１、２または３個のアミノ酸修飾を有し得る。
一部の実施形態では、可変軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域は、最大１、２または３個の変異を含む。一部の実施形態では、重鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３領域は、最大１、２または３個の変異を含む。一部の実施形態では、軽鎖のＣＤＲ３は、最大１、２、または３個の変異を含む。
可変重鎖および可変軽鎖は、任意の適切な融合ドメインによって融合され得る。一部の実施形態では、融合ドメインは、配列番号９８の配列を有する。したがって、一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号５３または配列番号５４に示される配列を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号５３または５４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号５３または配列番号５４の変異体を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号５３または５４と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列番号５３または配列番号５４の変異体を含む。
抗体、抗体の断片、または抗体由来配列を含有する融合タンパク質は、商業的に得られてもよく、または上記で考察したような当技術分野で公知の方法によって生成されてもよい。
上記の文脈（および本明細書を通して使用される）において、「配列同一性」または「と同一の」などの用語は、アミノ酸または核酸の配列間の類似性の程度として解釈されるべきである。数値パーセンテージまたは数値範囲によって限定されない限り、これらの用語は、デフォルトでは、機能的配列同一性を必要とすると解釈されるべきである。すなわち、配列は、配列に機能的に影響を及ぼさない重複する修飾および変異を除外して同一であると解釈されるべきである。そのような変異は、本明細書に記載されている。
本明細書を通して、「由来する」という用語は、ポリペプチドまたはヌクレオチド自体の供給源を指すのではなく、むしろ結合ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインの一部または全体などのポリペプチドまたはヌクレオチドの一部を構成する配列情報の由来を指すことを理解されたい。したがって、「由来する」という用語は、それらが由来するペプチドまたは核酸と配列同一性を有する合成的、人工的または他の方法で作製されたポリペプチドまたはヌクレオチドを含む。
タンパク質結合足場
本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインは、タンパク質足場であってもよく、またはタンパク質足場を含んでもよい。タンパク質結合足場は、多様な範囲の分子およびタンパク質と結合するための実行可能な分子として浮上している。タンパク質結合足場は、典型的には、結合ドメインの相対的な配置を変更することなく、指定された結合領域内のアミノ酸の修飾に耐え得る安定なタンパク質構造（足場）を含む。これらのタンパク質結合足場には、以下が含まれる（ただし、これらに限定されない）：アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）（Ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アフィマー（Ａｆｆｉｍｅｒ）分子、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（Ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アプタマー、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アルマジロリピートタンパク質系足場、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）足場、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインペプチド、モノボディ（Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）（ＡｄＮｅｃｔｉｎｓ（商標））およびナノフィチン（Ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ）。
アフィリンは、約２０ｋＤａの人工的に作製されたタンパク質である。それらは、ヒトユビキチンおよび脊椎動物ガンマ－Ｂクリスタリンに構造的に関連し、標的分析物に特異的に結合するように設計され得る８個の表面露出した操作可能なアミノ酸を有する足場を含む。アフィリン分子は、部位特異的変異誘発およびファージディスプレイライブラリーなどの技術を使用して、多種多様な分子に結合するように特異的に適合され得る。アフィリン分子を産生および選択するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｌｏｒｅｙ，Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．２０１４；２８９（１２）：ｐｐ．８４９３－５０７である。
アフィボディは、ＩｇＧアイソタイプ抗体のＺドメインのタンパク質足場を含む約６ｋＤａのタンパク質であり、その２つのアルファ－ヘリックスの結合ドメインに位置する１３個のアミノ酸残基のうちの１またはそれを超える残基に対する修飾を有する。アフィボディ分子を操作および産生するための方法は、当技術分野で公知であり、Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈ，Ｊ．およびＴｏｌｍａｃｈｅｖ，Ｖ．’’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｆｆｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ’’，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２）；８９９：ｐｐ１０３－１２６を含む。
アフィマー分子は、シスタチンのシステインプロテアーゼ阻害剤ファミリーに由来するタンパク質足場を利用する約１２～１４ｋＤａのタンパク質である。アフィマー分子は、標的特異的結合に適合され得るＮ末端配列に加えて、２つのペプチドループ領域を含む。結合部位に１０１０のアミノ酸の組み合わせを有するアフィマー分子は、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０１０；２３（５）：ｐｐ４０３－１３などの当技術分野で公知のファージディスプレイライブラリーおよび技術を使用して生成され得る。
アフィチンは６６残基（約７ｋＤａ）のタンパク質であり、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓに見出されるＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに由来するタンパク質足場を使用する。それらは、原核細胞培養物からインビトロで容易に産生され、３×１０１２を超える構造変異体を産生するように変異させ得る１４個の結合残基を含む。アフィチンを産生するための技術は当技術分野で公知であり、Ｍｏｕｒａｔｏｕら、ＰＮＡＳ．２００７；Ｎｏｖ １３；１０４（４６）：１７９８３－１７９８８を含む。表面プラズモン共鳴などのスクリーニング技術を使用して、これらの分子の特異的結合を同定し得る。
アルファボディは、ほとんどの高分子とは異なり、細胞膜を貫通し得るため、細胞内および細胞外の分子に結合し得る、約１０ｋＤａの分子である。アルファボディの足場は、天然構造に類似していない３つのアルファ－ヘリックス（Ａ、ＢおよびＣ）を有する計算的に設計されたコイルドコイル構造に基づいている。ＡおよびＣアルファ－ヘリックス上のアミノ酸は、特異的抗原を標的とするように修飾され得る。アルファボディを生成し、標的分子へのそれらの結合をスクリーニングするための方法は、少なくともＵＳ第２０１００３０５３０４号に記載されている。
タンパク質を結合させるためのアプタマーとしては、特定の標的分子への結合についてスクリーニングされ得る様々な核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＸＮＡ）およびペプチドが挙げられる。核酸アプタマーのデータベース（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１，１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００４，ｐｐ．９５－１００，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ０９４を参照のこと）は、インビトロで同定されたＤＮＡアプタマーの選択を可能にする。ペプチドアプタマーは、一般に、安定なタンパク質足場フレーム内のループ構造（「フレーム上のループ」）に埋め込まれた短いアミノ酸配列からなる。典型的には、５～２０残基のペプチドループが、標的分子への選択的結合の可変性の原因である。コンビナトリアルライブラリーおよび酵母－２ハイブリッドスクリーニングなどの技術を使用して、ペプチドアプタマーを生成およびスクリーニングし得る。タンパク質アプタマーを生成およびスクリーニングするための他の技術は公知であり、Ｒｅｖｅｒｄａｔｔｏ Ｓ．ら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（１２）：ｐｐ１０８２－１１０１を含む文献に記載されている。
アンチカリンタンパク質は、リポカリンに由来するタンパク質結合分子である。典型的には、アンチカリンは抗体よりも小さな分子に結合する。アンチカリンをスクリーニングおよび開発するための方法は、Ｇｅｂａｕｅｒ，Ｍ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．，’’Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ：ｓｍａｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ’’，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３（２０１２），ｐｐ．１５７－１８８ならびにＲｉｃｈｔｅｒ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２０１４；５８８（２）：ｐｐ２１３－２１８を含む当技術分野で開示されている。
アルマジロリピートタンパク質系足場は、それぞれ３つのα－ヘリックスで構成される反復単位のスーパーヘリックスに形成された、約４２アミノ酸のタンデムアルマジロリピートで構成されるアルマジロドメインを特徴とする。保存された結合ドメイン内の残基の修飾は、標的特異的結合剤（例えばＰａｒｍｅｇｇｉａｎｉ Ｆら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８；３７６（５）：ｐｐ１２８２－３０４）の選択に使用され得る様々なコンビナトリアルライブラリーの調製を可能にする。
アビマー（結合活性多量体、マキシボディまたは低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）ドメインＡとしても知られている）は、システインに富む細胞表面受容体タンパク質の範囲のＡドメインに基づく少なくとも２つの連結された３０～３５アミノ酸の長さのペプチドを含む。Ａドメインの修飾は、同一の標的上の、または複数の標的にわたる、様々なエピトープへの指令結合を可能にし、連結されたペプチドの数が、アビマーあたりの可能な標的の数を決定する。Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓのライブラリーなどの市販のライブラリーを含む様々なアビマーファージディスプレイライブラリーが当技術分野で公知である。
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、アンキリンタンパク質に由来する操作された結合タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎをスクリーニングおよび同定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｔｕｍｐｐ ＭＴら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ２００８；１３（１５－１６）：ｐｐ６９５－７０１およびＰｌｕｃｋｔｈｕｒｎ Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２０１５；５５：ｐｐ４８９－５１１である。
阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）足場は、高い配列可変性を有する一連のループを連結する３つのジスルフィド架橋を含む安定した三次元構造を形成するミニタンパク質（３０～５０アミノ酸残基長）のファミリーである。阻害剤シスチンノットには、ノッチンである３つのファミリーメンバーが含まれる；シクロチドおよび成長因子システイン－ノット。配列、構造および機能などの既知のノッチンおよびシクロチドの特定の特性を開示するＫＮＯＴＴＩＮデータベース（ｗｗｗ．ｄｓｉｍｂ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ／ＫＮＯＴＴＩＮ／）などのデータベースは、当技術分野で公知である。さらに、Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐａｒｔ Ｂ－Ｃｈａｐｔｅｒ ９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２０１２），５０３；ｐｐ．２２３－２５１を含めて、ＩＣＫを作製するための方法および結合についてスクリーニングするための方法が知られている。
モノボディ（商標名ＡｄＮｅｃｔｉｎｓとしても知られる）は、多様で操作可能な可変基を有するＦＮ３（フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）足場を利用する。アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｓ）は、抗体可変ドメインおよびベータ－シートループを抗体と共有する。モノボディの結合和性は、ｍＲＮＡディスプレイ、ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイなどのインビトロ進化法によって多様化およびカスタマイズされ得る。モノボディをスクリーニングおよび産生するための方法は、Ｐａｒｋ ＳＨら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１５；１０（７）ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．３１４８およびＬｉｐｏｖｓｅｋ，Ｄ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２０１１；２４（１－２）：３－９を含む当技術分野で開示されている。
リンカードメイン
リンカードメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと抗原認識ドメインとを連結する。リンカードメインを含まずに機能するＣＡＲ Ｔ細胞が形成されており、したがって、この文脈では、リンカードメインは、すべてのＣＡＲの機能に一般に必須であるとは考えられていない。
理論に拘束されることを望まないが、リンカードメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞と標的細胞との間に正しい免疫学的シナプス距離を形成しながら、抗原認識ドメインによるエピトープの認識を可能にするために、ＣＡＲのエクトドメイン（細胞外ドメイン）に適切な分子長を提供してもよい。さらに、リンカードメインは、抗原認識ドメインがそのエピトープを認識するために正しい様式で配向されるための適切な柔軟性を提供してもよい。
したがって、一部の実施形態では、細胞外ドメインは、結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するリンカードメインを含む。一部の実施形態では、連結ドメインは、少なくとも１２アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは、少なくとも約１２アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは１２アミノ酸の長さを超える。一部の実施形態では、連結ドメインは、少なくとも１１９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは、少なくとも約１１９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは１１９アミノ酸の長さを超える。一部の実施形態では、連結ドメインは、少なくとも２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは、少なくとも約２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは２２９アミノ酸の長さを超える。
一部の実施形態では、連結ドメインは、最長１１９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは、最長約１１９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは、最長２２９アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、連結ドメインは、最長約２２９アミノ酸の長さである。
適切なリンカードメインの選択は、（ｉ）ＣＡＲ発現細胞の「オフターゲット」活性化を最小限に抑える、Ｆｃ受容体（ＦｃγおよびＦｃＲｎ受容体など）に対する結合親和性の低減、および（ｉｉ）抗原結合領域の柔軟性を高めることによってＣＡＲ構築物の有効性を最適化し、免疫シナプス（例えば、立体障害の低減およびシナプス距離の最適化）の形成の空間的制約を低減することに基づいてもよい。
一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリン由来のヒンジ領域、またはＴ細胞シナプスの形成に関与する膜結合分子由来のヒンジもしくは細胞外領域と同一の配列を含む。例えば、リンカードメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ７またはＣＤ２８由来のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列を有する領域を含んでもよい。
一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンの一部と同一の配列を含む。一部の実施形態では、その部分は、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域またはその修飾型）、定常重（ＣＨ）１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域またはＣＨ４領域のうちの１またはそれを超える領域である。一部の実施形態では、その部分は、免疫グロブリンのＣＨ２領域、ＣＨ３領域もしくはヒンジ領域であるか、または当該ＣＨ領域と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、その部分は、免疫グロブリンのＣＨ２領域またはＣＨ３領域およびヒンジ領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧサブタイプから選択される。
一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１ヒンジ領域およびＩｇＧ４のＣＨ２もしくはＣＨ３領域のうちの１またはそれを超える一部分に対する類似性を有する配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域の全部または一部を含む。当技術分野で理解されるように、免疫グロブリンのヒンジ領域を形成する特定の領域は、異なるアイソタイプで異なる。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンは、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間にヒンジ領域を有するが、ヒンジ領域の機能は、ＩｇＥおよびＩｇＭアイソタイプ免疫グロブリンのＣＨ２領域によって提供される。
本発明のＣＡＲの少なくとも一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ４ヒンジの配列と同一のアミノ酸配列を含むか、またはＩｇＧ４ヒンジの修飾型と同一の配列を含み、好ましくは１、２または３個のアミノ酸修飾を有する。
可変重鎖のＮ末端に連結された可変軽鎖のＣ末端によって形成された一本鎖可変断片を含む結合ドメインを含む一部の実施形態では、可変軽鎖は、配列番号４９（またはその機能的変異体）を含むか、またはそれからなり、可変重鎖は、配列番号５０（またはその機能的変異体）を含むか、またはそれからなり、リンカー領域は少なくとも１１９アミノ酸の長さであるか、または１１９アミノ酸の長さを超えるか、または少なくとも２２９アミノ酸の長さであり、結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し、リンカードメインは可変重鎖のＣ末端に連結されている。
一部の実施形態では、結合ドメインは、可変重鎖のＮ末端に連結された可変軽鎖のＣ末端を含み、可変軽鎖は、配列番号４０（ＣＤＲ１－ＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦ）、配列番号４１（ＣＤＲ２－ＬＴＳ）および配列番号４２（ＣＤＲ３－ＱＱＮＡＥＤＰＲＴ）のアミノ酸配列を有するＣＤＲまたはその機能的変異体を含み、可変重鎖は、配列番号３７（ＣＤＲ１－ＧＹＳＦＴＡＹＷ）、配列番号３８（ＣＤＲ２－ＩＬＰＧＳＤＳＴ）および配列番号３９（ＣＤＲ３－ＡＲＳＧＬＹＧＳＳＱＹ）のアミノ酸配列を有するＣＤＲまたはその機能的変異体を含み、リンカー領域は、１２アミノ酸、または少なくとも１２アミノ酸の長さ、または約１２アミノ酸の長さである。この実施形態の一部の形態では、リンカーは最大１１９アミノ酸、または最大約１１９アミノ酸である。この実施形態の一部の代替形態では、リンカーは最大２２９アミノ酸または最大約２２９アミノ酸である。誤解を避けるために、リンカーの長さは、１２またはそれを超える、１２～１１９、または１２～２２９アミノ酸の長さであり得る。
一部の実施形態では、結合ドメインは、可変重鎖のＮ末端に連結された可変軽鎖のＣ末端を含み、可変軽鎖は、配列番号４０（ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＣＤＲ２）および配列番号４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲまたはその機能的変異体を含み、可変重鎖は、配列番号３７（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲまたはその機能的変異体を含み、リンカー領域は、１１９アミノ酸、または少なくとも１１９アミノ酸の長さ、または約１１９アミノ酸の長さである。この実施形態の一部の形態では、リンカーは最大２２９アミノ酸、または最大約２２９アミノ酸である。
一部の実施形態では、結合ドメインは、可変重鎖のＮ末端に連結された可変軽鎖のＣ末端を含み、可変軽鎖は、配列番号４０（ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＣＤＲ２）および配列番号４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲまたはその機能的変異体を含み、可変重鎖は、配列番号３７（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲまたはその機能的変異体を含み、リンカー領域は、２２９アミノ酸、または少なくとも２２９アミノ酸の長さ、または約２２９アミノ酸の長さである。
一部の実施形態では、結合ドメインは、可変軽鎖のＮ末端に連結された可変重鎖のＣ末端を含み、可変重鎖は、配列番号３７（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、またはその機能的変異体を含み、可変軽鎖は、配列番号４０（ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＣＤＲ２）および配列番号４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、またはその機能的変異体を含み、リンカー領域は、１２アミノ酸であるか、少なくとも１２アミノ酸の長さであるか、または約１２アミノ酸の長さである。この実施形態の一部の形態では、リンカーは最大１１９アミノ酸、または最大約１１９アミノ酸である。この実施形態の一部の代替形態では、リンカーは最大２２９アミノ酸または最大約２２９アミノ酸である。誤解を避けるために、リンカーの長さは、１２またはそれを超える、１２～１１９、または１２～２２９アミノ酸の長さであり得る。
一部の実施形態では、結合ドメインは、可変軽鎖のＮ末端に連結された可変重鎖のＣ末端を含み、可変重鎖は、配列番号３７（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、またはその機能的変異体を含み、可変軽鎖は、配列番号４０（ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＣＤＲ２）および配列番号４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、またはその機能的変異体を含み、リンカー領域は、１１９アミノ酸であるか、少なくとも１１９アミノ酸の長さであるか、または約１１９アミノ酸の長さである。この実施形態の一部の形態では、リンカーは最大２２９アミノ酸、または最大約２２９アミノ酸である。
一部の実施形態では、結合ドメインは、可変軽鎖のＮ末端に連結された可変重鎖のＣ末端を含み、可変重鎖は、配列番号３７（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、またはその機能的変異体を含み、可変軽鎖は、配列番号４０（ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＣＤＲ２）および配列番号４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、またはその機能的変異体を含み、リンカー領域は、２２９アミノ酸であるか、少なくとも２２９アミノ酸の長さであるか、または約２２９アミノ酸の長さである。
リンカードメインに組み込まれてもよい配列の非網羅的なリストを以下の表１に示す。いくつかの実施形態では、本発明のリンカードメインは、表１に提示される構成要素のうちのいずれか１またはそれを超える構成要素を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカードメインは、表１に提示されるリンカーのうちのいずれか１またはそれを超えるリンカーからなってもよい。さらに、リンカードメインは、ポリグリシン配列またはＧＧＧＧＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）配列のリピートなどの人工的に合成された配列（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）であってもよい。
表１
可能なリンカードメイン構成要素
一部の実施形態では、リンカードメインは、配列番号２～３０から選択されるいずれか１またはそれを超える配列に記載の配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有する機能的変異体もしくはその一部を含む。
一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方と同一の配列を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域および１またはそれを超えるＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインと同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域は、ＩｇＧ抗体のＩｇＧ４サブクラスに由来する。
一部の実施形態では、リンカードメインは、配列番号５５、配列番号５６もしくは配列番号５７、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体もしくは部分からなる群より選択される配列を含むか、またはそれからなる。
免疫グロブリン、特にＩｇＧアイソタイプ抗体のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、Ｆｃガンマ受容体およびＦｃ新生児受容体などのＦｃ受容体によって結合される場合がある。キメラ抗原受容体のリンカードメインの結合は、受容体の有効性を低下させ、オフターゲット死滅をもたらし得る。したがって、一部の実施形態では、リンカードメインは、Ｆｃ受容体と結合する能力が低いか、または結合する能力がないように設計される。一部の実施形態では、リンカードメインは、他の免疫グロブリンアイソタイプと比較して、Ｆｃ受容体と結合する能力が低下した免疫グロブリンと同一である。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、Ｆｃ受容体と実質的に結合するアミノ酸配列を含まない。
Ｆｃ受容体が異なるＩｇＧアイソタイプと結合する能力を以下の表２に示す。
表２
ＩｇＧサブタイプに結合するＦｃ受容体
一部の実施形態では、リンカードメインが免疫グロブリンのＦｃ領域と同一の部分を含む場合、その部分は、Ｆｃ受容体への結合を減少させるように修飾されてもよい。Ｆｃ受容体による結合を減少させるためにタンパク質を修飾する方法は、当技術分野で公知である。Ｆｃガンマ受容体は、免疫グロブリン領域の下部ヒンジ領域およびＣＨ２領域のｎ末端に主に結合し、新生児型Ｆｃ受容体は、ＣＨ２領域のＣ末端およびＣＨ３領域のＮ末端のアミノ酸に主に結合する。ＩｇＧ抗体へのＦｃ受容体の結合に関する指針は、「’’Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ：Ｌｉｎｋｉｎｇ Ａｄａｐｔｉｖｅ ａｎｄ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ’’ Ａｃｋｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４」の第７章に見出され得る。したがって、これらの領域における修飾は、免疫グロブリンのＦｃ部分と相同性を有するリンカードメインへのＦｃ受容体の結合を変化させる場合がある。Ｆｃ－ガンマ受容体およびＦｃＲｎ結合を減少させることが示されているヒトＩｇＧ１に対する変異の非網羅的な例示的リストとしては、Ｅ１１６Ｐ、Ｌ１１７Ｖ、Ｌ１１８Ａ、Ｇ１１９欠失、Ｐ１２１Ａ、Ｓ１２２Ａ、Ｉ１３６Ａ、Ｓ１３７Ａ、Ｒ１３８Ａ、Ｔ１３９Ａ、Ｅ１４１Ａ、Ｄ１４８Ａ、Ｓ１５０Ａ、Ｓ１５０Ａ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ１５３Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｎ１５９Ａ、Ｄ１６３Ａ、Ｈ１６８Ａ、Ｎ１６９Ａ、Ｋ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｒ１７５Ａ、Ｅ１７６Ａ、Ｑ１７８Ａ、Ｙ１７９Ｆ、Ｎ１８０Ａ、Ｓ１８１Ａ、Ｒ１８４Ａ、Ｖ１８８Ａ、Ｔ１９０Ａ、Ｌ１９２Ａ、Ｑ１９４Ａ、Ｄ１９５Ａ、Ｎ１９８Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｋ２０５Ａ、Ｋ２０９Ａ、Ａ２１０Ｑ、Ａ２１０Ｓ、Ａ２１０Ｇ、Ｐ２１２Ａ、Ｐ２１４Ａ、Ｅ２１６Ａ、Ｋ２１７Ａ、Ｓ２２０Ａ、Ｋ２２１Ａ、Ａ２２２Ｔ、Ｋ２４３Ａ、Ｑ２４５Ａ、Ｈ２５１Ａ、Ｄ２５９Ａ、Ａ２６１Ｑ、Ｅ２６３Ａ、Ｅ２６５Ａ、Ｖ２８６Ａ、Ｓ２８８Ａ、Ｋ２９７Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｅ３１３Ａ、Ｈ３１６Ａ、Ｎ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｙ３１９Ａが含まれる（付番は、Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号Ｐ０１８５７－１に記載の配列に対応する）。
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞外部分（エクトドメイン）を細胞内部分（エンドドメイン）に架橋し、その役割は主に構造的である。したがって、膜貫通ドメインは、細胞の脂質二重層を固定および貫通し得る任意の配列からなり得る。しかしながら、膜貫通ドメインの性質は、その局在化および発現に影響を及ぼし得る。
好ましい実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞シナプス形成またはＴ細胞シグナル誘導に関与する分子の配列と相同性を有する。一部の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部と同一の配列を含む膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部に対して同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部に対して配列同一性を有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号７２、またはＤＮＡの機能的変異体もしくはコードされたアミノ酸配列と配列同一性を有する。
抗原認識ドメイン、リンカードメインおよび膜貫通ドメインに加えて、本発明のキメラ抗原受容体は、シグナル伝達部分（シグナル伝達ドメイン）を含む細胞内（エンド）ドメインを含む。
キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原認識ドメインによる抗原の認識の結果として、ＣＡＲの活性化時に細胞内シグナル伝達カスケードを誘導できるか、またはその誘導に関与できる任意の適切なドメインであり得る。ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの活性化後の意図される細胞結果に応じて特異的に選択されるであろう。多くの可能なシグナル伝達ドメインが存在するが、免疫治療および癌治療で使用される場合、シグナル伝達ドメインは、それらが由来する受容体、すなわち活性化受容体および共刺激受容体に基づいて２つの一般的なカテゴリーに分類され得る（以下のさらなる詳細を参照）。したがって、一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分、またはその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分、または機能的変異体を含む。
本明細書を通して使用されるように、「部分」という用語は、活性化受容体または共刺激受容体に関して使用される場合、受容体とその同種抗原またはリガンドとの相互作用後の細胞内シグナル伝達カスケードの開始／誘導に関与するまたは関わる配列を含む受容体の任意のセグメントに関する。ＣＤ３を介したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内シグナル伝達カスケードの開始／誘導の例を以下に概説する。
理論に拘束されることを望まないが、ＴＣＲの細胞外部分は、大部分が、クローン型ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖（ＴＣＲα／β受容体）またはＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖（ＴＣＲγδ受容体）のいずれかのヘテロ二量体を含む。これらのＴＣＲヘテロダイマーは、一般に、固有のシグナル伝達能力を欠き、したがって、それらは、ＣＤ３の複数のシグナル伝達サブユニット（主にＣＤ３－ゼータ、－ガンマ、－デルタおよび－イプシロン）と非共有結合で会合している。ＣＤ３のガンマ、デルタおよびイプシロン鎖の各々は、単一の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内（細胞質）部分を有するが、ＣＤ３－ゼータ鎖は３つのタンデムＩＴＡＭを含む。ＭＨＣの存在下でのその同種抗原によるＴＣＲの会合、およびＣＤ４またはＣＤ８などの必須の共受容体の会合時に、ＣＤ３鎖の細胞内ＩＴＡＭ内の２つのチロシン残基をリン酸化するチロシンキナーゼ（すなわちＬｃｋ）をもたらすシグナル伝達が開始される。続いて、第２のチロシンキナーゼ（ＺＡＰ－７０－それ自体がＬｃｋリン酸化によって活性化される）が、ＩＴＡＭを二リン酸化するために動員される。結果として、いくつかの下流の標的タンパク質が活性化され、最終的には細胞内の立体構造変化、カルシウム動員、およびアクチン細胞骨格の再編成をもたらし、これらが組み合わさると、最終的には転写因子の活性化およびＴ細胞免疫応答の誘導をもたらす。
本明細書を通して使用される場合、「活性化受容体」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素を形成するか、その形成に関与する受容体、または共受容体、または抗原性もしくは他の免疫原性刺激の認識の結果として免疫細胞の特異的活性化に関与する受容体に関する。
そのような活性化受容体の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体（ＣＤ３－ゼータ、－ガンマ、－デルタおよび－イプシロン）、ＣＤ４共受容体、ＣＤ８共受容体、Ｆｃ受容体またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞関連活性化受容体、例えばＬＹ－４９（ＫＬＲＡ １）、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ、好ましくはＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０もしくはＮＫＧ２またはＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロ二量体）の構成要素が挙げられる。したがって、本発明のＣＡＲの一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３共受容体複合体の一員（好ましくはＣＤ３－ゼータ（ζ）鎖の少なくともシグナル伝達部分）、ＣＤ４共受容体、ＣＤ８共受容体、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）のシグナル伝達部分（好ましくはＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩのシグナル伝達部分）またはＮＫ関連受容体、例えばＬＹ－４９のうちのいずれか１またはそれを超える種類に由来する部分を含む。
各ＣＤ３鎖の特異的な細胞内シグナル伝達部分は当技術分野で公知である。例として、ＣＤ３ζ鎖の細胞内細胞質領域は、配列番号３１に示される配列のアミノ酸５２～アミノ酸１６４に及び、３つのＩＴＡＭ領域は、配列番号３１のアミノ酸６１～８９、１００～１２８および１３１～１５９に及んでいる。さらに、ＣＤ３ε鎖の細胞内部分は、配列番号３２に示される配列のアミノ酸１５３～２０７に及び、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号３２のアミノ酸１７８～２０５に及んでいる。ＣＤ３γ鎖の細胞内部分は、配列番号３３に示される配列のアミノ酸１３８～１８２に及び、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号３３のアミノ酸１４９～１７７に及んでいる。ＣＤ３δの細胞内部分は、配列番号３４に示される配列のアミノ酸１２７～１７１に及び、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号３４のアミノ酸１３８～１６６に及んでいる。
本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（好ましくはＣＤ３－ζ鎖またはその一部）に由来するか、またはＣＤ３と配列相同性を有する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３－ζ）の細胞内ドメインの全部または一部と同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３－ζ共受容体複合体の部分は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
代替的なシグナル伝達ドメインには、当該分野で公知のＦｃ受容体の細胞内部分が含まれる。例えば、ＦｃεＲ１の細胞内部分は、配列番号３５に示される配列のアミノ酸１～５９、１１８～１３０および２０１～２４４、またはその機能的変異体に及ぶ。さらに、ＦｃγＲＩの細胞内部分は、配列番号３６に示される配列のアミノ酸３１４～３７４、またはその機能的変異体に及ぶ。
活性化受容体の部分の様々な組み合わせを利用して、ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）部分および細胞内（ＩＣ）部分、例えば、ＣＤ３ζ ＴＭおよびＣＤ３ζ ＩＣ（Ｌａｎｄｍｅｉｅｒ Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００７；６７：８３３５－４３、Ｇｕｅｓｔ ＲＤ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００５，２８：２０３－１１、Ｈｏｍｂａｃｈ ＡＡ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００７；１７８：４６５０－７）、ＣＤ４ ＴＭおよびＣＤ３ζ ＩＣ（Ｊａｍｅｓ ＳＥ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８；１８０：７０２８－３８）、ＣＤ８ ＴＭおよびＣＤ３ζ ＩＣ（Ｐａｔｅｌ ＳＤ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９９；６：４１２－９）、ならびにＦｃεＲＩγ ＴＭおよびＦｃεＲＩγ ＩＣ（Ｈａｙｎｅｓ ＮＭ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１；１６６：１８２－７、Ａｎｎｅｎｋｏｖ ＡＥ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８；１６１：６６０４－１３）を形成し得る。
上記のように、本発明のキメラ抗原受容体の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分を含む。
本明細書を通して使用される場合、「共刺激受容体」という用語は、活性化受容体の抗原特異的誘導時に免疫細胞の活性化を補助する受容体または共受容体に関する。理解されるように、共刺激受容体は抗原の存在を必要とせず、抗原特異的ではないが、典型的には２つのシグナルのうちの一方であり、他方は免疫細胞応答の誘導に必要な活性化シグナルである。免疫応答の状況では、共刺激受容体は、典型的には、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のその発現リガンドの存在によって活性化される。Ｔ細胞に関して具体的には、共刺激は、細胞の活性化、増殖、分化および生存をもたらすために必要である（これらはすべて、一般にＴ細胞活性化の傘下で言及される）一方、共刺激の不在下でのＴ細胞への抗原の提示は、アネルギー、クローン欠失および／または抗原特異的寛容の発達をもたらし得る。重要なことに、共刺激分子は、同時に遭遇する抗原に対するＴ細胞応答を伝え得る。一般に、「陽性」共刺激分子に関連して遭遇する抗原は、Ｔ細胞の活性化およびその抗原を発現する細胞を排除することを目的とした細胞性免疫応答をもたらす。一方、「陰性」共受容体に関連して遭遇する抗原は、同時に遭遇する抗原に対する寛容の誘導状態をもたらす。
Ｔ細胞共刺激受容体の非限定的な例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳが挙げられる。具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳはすべて、Ｔ細胞応答の活性化を増強する「陽性」共刺激分子を表す。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳのうちのいずれか１またはそれを超える種類に由来する部分を含む。
本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４－１ＢＢ共刺激受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢの一部を含む。一部の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激受容体の部分は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
共刺激受容体の様々な部分を利用して、ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）部分および細胞内（ＩＣ）部分を単独または組み合わせて形成し得る。組み合わせの例としては、ＣＤ８ ＴＭおよびＤＡＰ１０ ＩＣまたはＣＤ８ ＴＭおよび４－１ＢＢ ＩＣ（Ｍａｒｉｎ Ｖ．ら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００７；３５：１３８８－９７）、ＣＤ２８ ＴＭおよびＣＤ２８ ＩＣ（Ｗｉｌｋｉｅ Ｓ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８；１８０：４９０１－９、Ｍａｈｅｒ Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２；２０：７０－５）、ならびにＣＤ８ ＴＭおよびＣＤ２８ ＩＣ（Ｍａｒｉｎ Ｖ．ら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００７；３５：１３８８－９７）が挙げられる。
上記の活性化および共刺激受容体の配列情報は、様々なデータベースで容易にアクセス可能である。例えば、これらの受容体のヒトアミノ酸、遺伝子およびｍＲＮＡ配列の実施形態を表３に提示する。
表３
活性化および共刺激受容体配列情報の要約
表３は、ヒト活性化および共刺激受容体を参照して提示されるが、各受容体の相同型およびオルソロガス型が哺乳動物および脊椎動物種の大部分に存在することは当業者によって理解されよう。したがって、上記の配列は、本発明の第１の態様のＣＡＲに含まれてもよい受容体配列の非限定的な例としてのみ提供され、任意の所望の種からの相同配列およびオルソロガス配列を使用して、所与の種に適したＣＡＲを生成してもよい。
本発明の一部の実施形態では、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインの一部は、同じ分子と相同性を共有する。例えば、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むＣＤ３の一部が利用されてもよい。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部と同一の配列を含むか、またはそれからなり、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内ドメインの全部または一部と同一の配列を含むか、またはそれからなる。
本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分および共刺激受容体に由来する部分を含む。理論に拘束されることを望まないが、これに関連して、ＣＡＲの抗原認識ドメインによる抗原の認識は、細胞内活性化シグナルと細胞内共刺激シグナルの両方を同時に誘導する。その結果、これは、共刺激リガンドを発現するＡＰＣによる抗原の提示をシミュレートする。あるいは、ＣＡＲは、活性化受容体または共刺激受容体のいずれかに由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有し得る。この代替形態では、ＣＡＲは、活性化細胞内シグナル伝達カスケードまたは共刺激細胞内シグナル伝達カスケードのいずれかのみを誘導する。
本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢおよびＣＤ３－ζ鎖の細胞内ドメインの全部または一部と同一の配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号５９および配列番号５８、またはそれらの機能的変異体を含む、またはそれらからなる細胞内ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、単一の活性化受容体の一部および複数の共刺激受容体の部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、複数の活性化受容体の部分および単一の共刺激受容体に由来する一部と同一の配列を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、複数の活性化受容体の部分および複数の共刺激受容体の部分と同一の配列を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、単一の活性化受容体の一部および２つの共刺激受容体の部分と同一の配列を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、単一の活性化受容体の一部および３つの共刺激受容体に由来する部分と同一の配列を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、２つの活性化受容体の部分と同一の配列を含むシグナル伝達ドメイン、および１つの共刺激受容体の一部を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、２つの活性化受容体の部分および２つの共刺激受容体の部分と同一の配列を含むシグナル伝達ドメインを有する。理解されるように、活性化受容体および共刺激受容体の数にはさらなるバリエーションがあり、上記の例は、本明細書に含まれる可能な組み合わせを限定するものではないと考えられる。
本発明の一部の実施形態では、膜貫通ドメインの配列およびシグナル伝達ドメインの少なくとも一部は、異なる分子の部分と配列類似性を有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部と同一の配列を含むか、またはそれからなり、シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢおよびＣＤ３－ζ鎖の細胞内ドメインの全部または一部と同一の配列を含むか、またはそれからなる。
キメラ抗原受容体
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｌｇｒ５に特異的な抗原認識ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域と配列同一性を有するリンカードメイン、ＣＤ２８膜貫通配列と配列同一性を有する膜貫通領域、４－１ＢＢのシグナル伝達領域と配列同一性を有する細胞内部分および／もしくはＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分と配列同一性を有する細胞内部分、または記載された部分、ドメインもしくは領域の機能的変異体を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｌｇｒ５に特異的な抗原認識ドメイン、ＩｇＧ４ ＣＨ３領域と組み合わされたＩｇＧ４ヒンジ領域と配列同一性を有するリンカードメイン、ＣＤ２８膜貫通配列と配列同一性を有する膜貫通領域、４－１ＢＢのシグナル伝達領域と配列同一性を有する細胞内部分および／もしくはＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分と配列同一性を有する細胞内部分、または記載された部分、ドメインもしくは領域の機能的変異体を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｌｇｒ５に特異的な抗原認識ドメイン、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域と組み合わされたＩｇＧ４ヒンジ領域と配列同一性を有するリンカードメイン、ＣＤ２８膜貫通配列と配列同一性を有する膜貫通領域、４－１ＢＢのシグナル伝達領域と配列同一性を有する細胞内部分および／もしくはＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分と配列同一性を有する細胞内部分、または記載された部分、ドメインもしくは領域の機能的変異体を含む。
本発明の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号６０、６１、６２、６３、６４もしくは６５、またはそれらの機能的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号６２、６３、６４もしくは６５、またはそれらの機能的変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
当業者によって理解されるように、本明細書中に記載されるＣＡＲ受容体の修飾は、本発明の範囲から逸脱することなく行われ得る。例えば、配列番号６０、６１、６２、６３、６４および６５に関して、ＣＡＲの好ましい機能は、Ｌｇｒ５を認識し、ＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化をもたらす細胞内シグナルを誘導することである。当業者によって理解されるように、キメラ抗原受容体のアミノ酸配列の部分に対する変異は、ＣＡＲの特異性および／またはＣＡＲを発現する細胞（Ｔ細胞など）の活性化を有意に改変することなく行われてもよい。そのような変異としては、限定されないが、キメラ抗原受容体のヒンジ領域の変異、膜貫通ドメインの変異、ならびにキメラ抗原受容体の細胞内ドメインを含む活性化受容体および／または共刺激受容体の部分の変異が挙げられる場合がある。そのような変異を行う場合、当業者は、機能するＣＡＲに到達することを意図して、知識および技能を利用するであろう。したがって、変異の範囲は、ＣＡＲの機能の抑止をもたらすものとして当業者に直ちに認識され得るものを除外する。
核酸構築物および細胞の遺伝子改変
本明細書に記載されるＣＡＲは、当技術分野で公知の任意の手段によって産生され得るが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸を調製し、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的変異誘発など）によって都合の良いように完全なコード配列に組み立て得る。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
したがって、本発明はさらに、上記のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、核酸分子または核酸分子を含む核酸構築物を提供する。
さらに、核酸構築物は、上記キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号６０、６１、６２、６３、６４もしくは６５に示されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。
核酸分子は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含んでもよく、これは、修飾されていないか、または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、核酸分子は、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含んでもよい。さらに、核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を含んでもよい。核酸分子はまた、１もしくはそれを超える修飾塩基または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格も含んでもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して様々な修飾がなされ得るため、「核酸分子」という用語は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
本発明の一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号６６、６７、６８、６９、７０もしくは７１に示されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体を含む。
誤解を避けるために、配列番号６６、６７、６８、６９、７０または７１の機能的変異体は、１またはそれを超える異なる核酸を有する配列変異体を含むが、依然として同一のアミノ酸配列をコードすることを理解されたい。遺伝暗号の縮重のために、多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードし得る。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。当業者は、核酸配列（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）の各コドンを修飾して、機能的に同一の分子を生じ得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の各サイレント変異は、記載された各配列に暗黙的である。
本発明による核酸構築物は、１またはそれを超える宿主に対する複製起点、１またはそれを超える宿主で活性な選択マーカー遺伝子、および／または１またはそれを超える転写制御配列のうちの１またはそれを超える種類をさらに含んでもよいことが理解されるべきであり、核酸分子の発現は転写制御配列の制御下にある。
本明細書で使用される場合、「選択マーカー遺伝子」という用語は、構築物でトランスフェクションまたは形質導入された細胞の同定および／または選択を容易にするために、それが発現される細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含む。
「選択マーカー遺伝子」は、構築物で形質導入された細胞によって発現される場合、これらの形質導入細胞の同定および／または選択を容易にする表現型を細胞に付与する任意のヌクレオチド配列を含む。適切な選択マーカーをコードする様々なヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｒｔｅｓｅｎ，ＲＭ．およびＫｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９；Ｕｎｉｔ ９．５）。選択マーカーをコードする例示的なヌクレオチド配列には、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ）遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）遺伝子、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子または抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子、緑色、赤色、黄色または青色の蛍光タンパク質コード遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子、および、とりわけ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの技術を使用して細胞の光学的選択を可能にするルシフェラーゼ遺伝子などの発光系レポーター遺伝子が含まれる。さらに、Ｔ細胞の細胞選択マーカーは、Ｂａｒｅｓｅ，Ｃ．Ｎ．およびＤｕｎｕｂａｒ Ｃ．Ｅ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１１；２２（６）：ｐｐ．６５９－６８において具体的に論じられている。これらのマーカーには、ネオマイシン（ＮＥＯ）耐性遺伝子、ΔＮＧＦＲ（非シグナル伝達ＮＧＦＲ）、切断型ＣＤ３４および切断型非シグナル伝達ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）が含まれる。本発明の実施形態（本明細書にさらに記載される）は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の切断型を利用する。修飾ｅＤＨＦＤを含むＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで追跡するためのさらなる技術が開発されている（Ｓｅｌｌｍｙｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０２０；２８（１）：ｐｐ．４２－５１を参照）。
さらに、選択マーカー遺伝子は、構築物における別個のオープンリーディングフレームであってもよく、または別のポリペプチド（例えばＣＡＲ）との融合タンパク質として発現されてもよいことに留意されたい。
上記のように、核酸構築物はまた、１またはそれを超える転写制御配列を含んでもよい。「転写制御配列」という用語は、作動可能に連結された核酸の転写をもたらす任意の核酸配列を含むと理解されるべきである。転写制御配列は、例えば、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、および転写ターミネーターを含んでもよい。典型的には、転写制御配列は、少なくともプロモーターを含む。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、細胞内の核酸の発現を付与、活性化または増強する任意の核酸を表す。
一部の実施形態では、少なくとも１つの転写制御配列が、本発明の第２の態様の核酸分子に作動可能に連結される。本明細書の目的のために、転写制御配列は、転写制御配列が核酸分子の転写を促進、阻害、または他の方法で調節することができる場合、所与の核酸分子に「作動可能に連結されている」と見なされる。したがって、一部の実施形態では、核酸分子は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの転写制御配列の制御下にある。
プロモーターは、発現が起こる細胞、組織または器官に関して、構成的にまたは示差的に、作動可能に連結された核酸分子の発現を調節する場合がある。したがって、プロモーターは、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含んでもよい。「構成的プロモーター」は、ほとんどの環境および生理学的条件下で活性なプロモーターである。「誘導性プロモーター」は、特定の環境または生理学的条件下で活性なプロモーターである。本発明は、目的の細胞において活性である任意のプロモーターの使用を意図する。したがって、幅広いプロモーターが当業者によって容易に確認されるであろう。
哺乳動物の構成的プロモーターには、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｐ－アクチン、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子－１アルファ（Ｅ３Ａ）、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧＧ）が含まれてもよいが、これらに限定されない。
誘導性プロモーターには、化学的誘導性プロモーターおよび物理的誘導性プロモーターが含まれてもよいが、これらに限定されない。化学的誘導性プロモーターには、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化学化合物によって調節される活性を有するプロモーターが含まれる。化学的誘導性プロモーターの例としては、とりわけ、テトラサイクリン制御プロモーター（例えば、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号を参照）、糖質コルチコイド受容体プロモーター（例えば、米国特許第５，５１２，４８３号を参照）、エクジソン受容体プロモーター（例えば、米国特許第６，３７９，９４５号を参照）などのステロイド応答性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーター（例えば、米国特許第４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号を参照）などの金属応答性プロモーターが挙げられる。
上述のように、制御配列はターミネーターも含んでもよい。「ターミネーター」という用語は、転写の終結をシグナル伝達する転写単位の末端のＤＮＡ配列を指す。ターミネーターは、一般にポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳ＤＮＡ配列であり、一次転写物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を促進する。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、それが使用されることが意図される細胞、組織または器官において操作可能である任意のターミネーター配列であってもよい。適切なターミネーターは当業者に公知であろう。
理解されるように、本発明による核酸構築物は、さらなる配列、例えば発現、細胞質または膜輸送、および位置シグナルの増強を可能にする配列をさらに含み得る。具体的な非限定的な例としては、とりわけ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｎ末端インターロイキン－２シグナルペプチド（Ｍｏｏｔ Ｒ．ら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，２０１６；３：１６０２６）、ＣＳＦ２ＲＡ、ＩｇＥリーダー配列（ＷＯ第２０１７１４７４５８号）、インフルエンザヘマグルチニンシグナル配列（Ｑｕｉｔｔｅｒｅｒ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．，２０１１：４０９（３）：ｐｐ．５４４－５７９）が挙げられる。シグナルペプチドの総説は、Ｏｗｋｉ，Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１８；９７（６）：ｐｐ．４２２－４４１で提示され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、本質的に本明細書に記載されるすべての遺伝子構築物に及ぶ。これらの構築物は、真核生物における遺伝子構築物の維持および／もしくは複製、ならびに／または真核細胞のゲノムへの遺伝子構築物もしくはその一部の組み込みを意図したヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
核酸構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ベクターなどの形態などの任意の適切な形態であってもよく、これは、適切な制御エレメントと会合すると複製することができ、構築物内に含まれる遺伝子配列を細胞間で移入し得る。
したがって、ベクターという用語は、クローニングおよび発現のビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、核酸構築物はベクターである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、したがって、本発明は、上記のＣＡＲをコードする核酸分子または核酸構築物を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターまたはｍＲＮＡベクターである。
少なくとも一部の実施形態では、本発明は、遺伝子改変細胞の調製に使用するための、上記のＣＡＲをコードする核酸分子または核酸構築物を提供する。さらに、少なくとも一部の実施形態では、本発明は、細胞の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入のためのベクターの調製における核酸分子の使用を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８のうちの１またはそれを超える種類を発現するＴ細胞である。遺伝子改変に適した細胞は、異種または自己であり得る。
一部の実施形態では、細胞は、癌の予防または処置のための方法または医薬の調製で使用される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、癌の予防または処置のための医薬の調製におけるベクターの使用を提供する。
核酸構築物などの外因性遺伝物質を真核細胞に意図的に導入（トランスフェクション／形質導入）する方法は、当技術分野で公知である。理解されるように、核酸構築物を所望の宿主細胞に導入するために最も適した方法は、核酸構築物のサイズ、宿主細胞のタイプ、トランスフェクション／形質導入の所望の効率、およびトランスフェクション／形質導入細胞の最終的な所望の生存率または必要とされる生存率などの多くの因子に依存する。そのような方法の非限定的な例としては、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウムなどの化学物質、またはリポソームおよびデンドリマーなどの構造体による化学トランスフェクション、エレクトロポレーション（ＰｏｔｔｅｒおよびＨｅｌｌｅｒ．’’Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．’’ Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｅｄ．Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３：Ｕｎｉｔ－９．３を参照）、ソノポレーション（Ｗａｎｇ，Ｍら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐｓ．，２０１８；８：３８８５）、ヒートショックまたは光トランスフェクションなどの非化学的方法、「遺伝子銃」送達、マグネトフェクションまたはインペールフェクション、脂質ナノ粒子またはウイルス形質導入などの粒子系の方法が含まれる。
哺乳動物細胞のための様々なウイルス形質導入技術が当技術分野で公知である。一般的なウイルスベクターには、レンチウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。例示的なプロトコルは、Ｗａｎｇ Ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０１１；１０８：Ｅ８０３－１２で提示される。代替ウイルスベクターとしては、ＨＳＶ、アデノウイルスおよびＡＡＶ（Ｈｏｗａｒｔｈ Ｊら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．＆Ｔｏｘｉｃ．，２０１０，ｖｏｌ．２６，ｉｓｓｕｅ １，ｐｐ １－２０）が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスを提供する。さらに、本発明は、癌の予防もしくは処置のための、またはＬｇｒ５を発現するもしくはＬｇｒ５を異常発現する細胞の死滅のための遺伝子改変細胞または医薬の調製におけるウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスまたはガンマレトロウイルスなどのレトロウイルスの使用を提供する。
細胞の形質導入は、上記のＣＡＲをコードするＤＮＡのゲノム組込みをもたらし得る。あるいは、ＤＮＡは、形質導入された細胞内で一過性に発現され得る。これらの各々は、陽性および陰性である。ゲノムに組み込まれたＤＮＡは、細胞複製中に安定に発現され、子孫細胞に複製される。これにより、強い免疫応答およびインビボでのＣＡＲ発現Ｔ細胞の有意な増加が保証される。
あるいは、一過性の形質導入（多くの場合、ｍＲＮＡを用いた形質導入によって達成される）は、細胞における一時的なＣＡＲ発現をもたらす。これは通常、はるかに低い応答をもたらすが、必要に応じて「投与量」を増減するように医師により多くの制御を提供する。
上記のように、一部の実施形態では、本発明は、細胞の遺伝子形質導入のためのウイルスベクターの調製におけるＤＮＡベクターまたは組換えＤＮＡの使用を提供する。細胞は任意の細胞であり得るが、適切な例を以下に提示する。
核酸構築物は、トランスフェクション／形質導入の所望の方法に応じて選択される。一部の実施形態では、核酸構築物はウイルスベクターであり、核酸構築物を宿主細胞に導入する方法はウイルス形質導入である。Ｔ細胞などのＰＢＭＣにおいてＣＡＲの発現を誘発するためにウイルス形質導入を利用する方法（Ｐａｒｋｅｒ，ＬＬ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００；１１：２３７７－８７）、より一般的には哺乳動物細胞の形質導入のためにレトロウイルス系を利用する方法（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．およびＰｅａｒ，Ｗ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１，ｕｎｉｔ ９．９）は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、核酸構築物は、プラスミド、コスミド、人工染色体などであり、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって細胞にトランスフェクションされ得る。
細胞サブセットの選択／単離のための技術は当技術分野で公知である。これらには、蛍光活性化細胞選別（Ｂａｓｕ Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１０；４１：１５４６）、所望のマーカー（Ｚｏｌａ Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ，２００５；１０６（９）：３１２３－６）を発現する細胞を免疫磁気的に選択するための磁気細胞単離（ＭＡＣＳ（登録商標））デバイスなどの基板上に固定化された抗体を利用する技術、またはマイクロ流体チップの使用が含まれる。一連の細胞マーカーは、免疫系の細胞を単離するために使用され得、ＢＣＲ、ＣＣＲ１０、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１０３ ＣＤ１０６、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６５、ＣＤ１６９、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９８、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＣＤ２１２、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８アルファ、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＣＤ２６８、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８９、ＣＤ２９４、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３１４、ＣＤ３１９、ＣＤ３２４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＸＣＲ３、デクチン－１、Ｔｃイプシロル（ｅｐｓｉｌｏｒ）Ｒ１アルファ、Ｆｌｔ３、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－９、ＩＬ－１３アファ（ａｐｈａ）１、ＩＬ－２１Ｒ、ｉＮＯＳ、ＫＬＲＧ１、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＲＡＧ、ＲＯＲガンマＴ、Ｓｉｎｇｌｅｃ－８、ＳＴ２、ＴＣＲアルファ／ベータ、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＶＥＧＦ、ＺＡＰ７０を含む（が、これらに限定されない）。
特に注目すべきは、Ｔ細胞マーカーのＣＣＲ１０、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５６、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１０３、ＣＤ１２２、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６５、ＣＤ１７８、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９８、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８アルファ、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２９４、ＣＤ３０４、ＣＤ３１４、ＣＸＣＲ３、Ｆｌｔ３、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－９、ＩＬ－１３アルファ１、ＩＬ－２１Ｒ、ＫＬＲＧ１、ＭＨＣクラスＩＩ、ＲＡＧ、ＲＯＲガンマＴ、ＳＴ２、ＴＣＲアルファ／ベータ、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＺＡＰ７０である。Ｔ細胞選択のための特に好ましい細胞マーカーとしては、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８が挙げられる。
次いで、単離された細胞を培養して、細胞活性を改変し、増殖または活性化させ得る。細胞を増殖および活性化させるための技術が当技術分野で公知である（Ｗａｎｇ Ｘ．およびＲｉｖｉｅｒｅ Ｉ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．２０１６；３：１６０１５）。これらには、抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃまたはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－製造者の説明書の通り）または固定化ＣＤ３／ＣＤ２８活性化抗体の他の形態を使用することが含まれる。次いで、活性化／遺伝子改変細胞をサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－１７）の存在下でインビトロで増殖させ、次いで凍結保存され得る。ＣＡＲ Ｔ細胞を増殖させるための方法の概要は、ＷａｎｇおよびＲｉｖｉｅｒａ（同書）に提示されている。
本発明はさらに、上記のキメラ抗原受容体、核酸分子または核酸構築物を含む遺伝子改変細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、核酸分子または構築物のゲノムに組み込まれた形態を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は白血球である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は骨髄系細胞である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は単球である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞はマクロファージである。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、アルファベータ（αβ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞はガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞（ナイーブＣＤ３＋Ｔ細胞またはメモリーＣＤ３＋Ｔ細胞など）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞（ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞など）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞（ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞またはメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞など）である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞はナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞はナチュラルキラーＴ細胞である。
キメラ抗原受容体を発現する細胞の使用。
本明細書に記載のＣＡＲ Ｔ細胞などの遺伝子改変細胞は、Ｌｇｒ５を発現する細胞を標的化するために使用され得、（細胞型に応じて）Ｌｇｒ５を発現する細胞または異常に発現するＬｇｒ５の死滅を補助するか、または導く場合がある。一部の実施形態では、本発明は、Ｌｇｒ５を発現する細胞、またはＬｇｒ５を異常発現する細胞を死滅させる方法を提供し、本方法は、Ｌｇｒ５を発現する細胞を、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変細胞（例えば、上記のＣＡＲ Ｔ細胞）に曝露することを含み、キメラ抗原受容体は、Ｌｇｒ５に対するものである。
一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｌｇｒ５を発現する細胞に対して自己である。一部の実施形態では、Ｌｇｒ５を発現または異常発現する細胞は、対象の体内にある。一部の実施形態では、Ｌｇｒ５を発現または異常発現する細胞は、癌細胞である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
したがって、本発明は、癌を予防または処置するための上記の遺伝子改変細胞の使用を提供する。したがって、本発明は、癌患者を予防または処置する方法を提供し、本方法は、キメラ抗原受容体を発現する細胞に患者を曝露することを含み、キメラ抗原受容体は、Ｌｇｒ５を標的とする。好ましくは、患者は、キメラ抗原受容体を発現する細胞または遺伝子改変細胞を投与される。
さらに、本発明は、Ｌｇｒ５を発現する細胞を死滅させる方法を提供し、本方法はＬｇｒ５を発現する細胞を上記のＣＡＲを発現する細胞と接触させることを含む。一部の実施形態では、Ｌｇｒ５を発現または異常に発現する細胞は癌細胞である。
一部の実施形態では、Ｌｇｒ５を発現または異常発現する細胞を死滅させる方法、および患者を予防または処置する方法は、標的細胞または癌細胞上のＬｇｒ５の表面発現を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、標的細胞および癌細胞上のＬｇｒ５の表面発現は、同等の非癌性細胞と比較される。これらの同等の細胞は、自己または異種であり得る。本方法は、インビトロまたはインビボで実施されてもよい。
一部の実施形態では、Ｌｇｒ５の表面発現の分析は、標的細胞または癌細胞を、キメラ抗原受容体を発現する細胞または遺伝子改変細胞に曝露する前に行われる。
一部の実施形態では、標的細胞を死滅させる方法は、標的細胞が癌細胞であり、非癌性細胞と比較した場合にＬｇｒ５を異常発現する場合に行われる。患者の癌を処置する方法の一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、癌細胞が同等の非癌性細胞と比較してＬｇｒ５を過剰発現する場合に投与される。
一部の実施形態では、患者の癌を予防または処置する方法は、キメラ抗原受容体を発現する細胞または遺伝子改変細胞に患者を曝露する前に、患者の癌幹細胞の存在を同定することを含む。
癌幹細胞のマーカーには、以下が含まれる（しかし、これらに限定されない）。ＡＢＣＢ５、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＣＤ２００、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ３４、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭおよびＬｇｒ５
様々な癌型における癌幹細胞を同定するためのマーカーの使用は、当技術分野で公知である。その例には、乳癌（Ｆｅｒｒｏ ｄｅ Ｂｅｃａ Ｆ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，２０１３；６６（３）：１８７－９１）、結腸直腸癌（Ｍｕｎｒｏ Ｍ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，２０１８；７１（２）：１１０およびＣｈｅｒｃｉｕ Ｉ．Ｃｕｒｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ Ｊ．，２０１４；４０（３）：１５３－１６１）、リンパ腫（Ｋｉｍ Ｓ．ら、Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０１１；４６（４）：２１１－２１３およびＳｏｎｇ Ｓ．ら、Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，２０２０；１１（１）：１４２－１５２）、胃腸癌（Ａｈｍａｄ Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１６；５（２）：２０２）、肺癌（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ Ａ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，２０１４；１（９）およびＨｕａｎｇ Ｚ．ら、Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，２０１７；８（１６）：３１９０－３１９７）、神経膠芽腫（Ｌａｔｈｉａ Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１５；２９（１２）：１２０３－１７）、膵臓癌（Ｇｚｉｌ Ａ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ．，２０１９；４６：６６２９－４５）、および肝臓癌（Ｓｕｎ Ｊ．ら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２０１６；７（２２）：３５４７－５７）が含まれる。
一部の実施形態では、癌は固形癌である。一部の実施形態では、癌は、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、上皮癌、食道癌、肺癌、口腔癌、卵巣癌、腎臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌および舌癌からなる群から選択される。
一部の実施形態では、癌は、乳房、膵臓、前立腺、結腸、結腸直腸、肺（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、卵巣、胃腸またはＢ細胞リンパ腫からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌は、結腸直腸癌、結腸癌、Ｂ細胞リンパ腫、卵巣癌または胃腸癌からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌は転移性癌である。一部の実施形態では、癌は、ＩＩＩ期癌であるか、またはＩＶ期癌である。
一部の実施形態では、癌は血液癌である。一部の実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫および／または骨髄腫からなる群から選択される。一部の実施形態では、白血病は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。一部の実施形態では、リンパ腫はホジキンリンパ腫であるか、または非ホジキンリンパ腫である。一部の実施形態では、骨髄腫は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥである。一部の実施形態では、骨髄腫は軽鎖骨髄腫または非分泌性骨髄腫である。
一部の実施形態では、本発明によるＣＡＲは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）で発現される場合、３０：１もしくはそれを超える、１０：１もしくはそれを超える、３：１もしくはそれを超える、または１：１もしくはそれを超えるＣＡＲ形質導入ＣＴＬ：標的細胞の比で、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＬｇｒ５を発現するか、または異常発現する標的細胞に対してインビトロで細胞傷害性を誘導する。主にＣＴＬはＣＤ８を発現する（すなわち、ＣＤ８＋）が、ＣＤ４発現細胞のサブセットは細胞傷害特徴を有することが実証されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ａ．およびＳａｉｔｏ，Ｔ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８：ａｒｔ．１９４）。したがって、一部の実施形態では、ＣＴＬはＣＤ８＋である。一部の実施形態では、ＣＴＬはＣＤ４＋である。
一部の実施形態では、本発明によるキメラ抗原受容体は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞で発現される場合、Ｌｇｒ５を発現するか、または異常発現する標的細胞と共培養されると、ＩＬ－２、ＴＮＦアルファおよび／またはＩＦＮガンマの産生を増加させる。一部の実施形態では、増大は統計学的に有意な増大である。一部の実施形態では、統計学的に有意な増加は、０．０５、０．０１または０．００１のＰ値に対するものである。
本発明はさらに、免疫細胞で発現される場合、癌を処置するための本明細書に記載されるようなキメラ抗原受容体の使用を提供する。適切な免疫細胞には、上記に開示される遺伝子改変細胞が含まれる。
本発明はまた、上記のキメラ抗原受容体、核酸分子または核酸構築物を含む遺伝子改変細胞と、１またはそれを超える薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」または「希釈剤」は、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、懸濁剤、コロイドなどを含む（ただし、これらに限定されない）。医薬活性物質のためのそのような媒体および／または薬剤の使用は、当技術分野で周知である。遺伝子改変細胞と適合しない任意の従来の培地または薬剤は、医薬組成物における使用のために企図される。補助活性成分も組成物に組み込まれ得る。「薬学的に許容され得る」とは、生物学的に望ましくないのではなく、または望ましくない反応性もしくは毒性ではない任意の物質、望ましくない生物学的作用を引き起こさずに、または含有される医薬組成物の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞と共に個体に投与されてもよい任意の物質を意味する。一部の実施形態では、医薬組成物は、同時に、協同的にまたは相乗的に作用するさらなる活性成分を含む。一部の実施形態では、医薬組成物はサイトカインを含む。
医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した様々な形態で製剤化されてもよい。したがって、組成物は、例えば、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）を含む公知の経路を介して投与され得る。医薬組成物はまた、持続放出または遅延放出を介して投与され得る。キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル、または任意の形態の混合物を含むが、これらに限定されない任意の適切な形態で提供されてもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、１週間に約１～約５回投与されてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は１回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は２回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は３回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は４回投与される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０８個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも３×１０８個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０８個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０８個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０７個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０７個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０７個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０６個の細胞を含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０８個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも３×１０８個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０８個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０８個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０７個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０７個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０７個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０６個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０６個の細胞を提供するために投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０６個の細胞を提供するために投与される。
一般に、医薬組成物は、任意の程度まで、癌の症状または臨床徴候を減少させるか、その進行を制限するか、改善するか、または解消するのに有効な量および投与レジメンで対象に投与される。本明細書で使用される場合、「改善する」とは、癌の症状または臨床徴候の程度、重症度、頻度および／または可能性の任意の減少を指す。「症状」とは、疾患または患者の症状の任意の主観的根拠を指す。「兆候」または「臨床兆候」とは、特定の症状に関する客観的な身体所見を指す。癌の状況では、組成物は、１またはそれを超える腫瘍の成長を制限する、１またはそれを超える腫瘍のサイズ、体積もしくは重量を減少させる、癌の転移速度もしくは転移数を減少させる、癌細胞の増殖を減少させる、または対象の平均余命を延長するのに有効な量および投与レジメンで対象に投与される。
定義および必要条件
本明細書で言及されるヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、配列識別子番号（配列番号）によって表される。配列識別子の概要を表４に示す。配列表も本明細書の一部として提供される。
表４
配列記載
本明細書で考察されるように、上記の配列は、配列中に修飾および変異を有してもよい機能的変異体を含む。当業者には理解されるように、「機能的変異体」は、配列の元のタンパク質または核酸の機能の一部または全部を依然として維持する。したがって、機能的変異体は、例えば、上記に提示された配列番号の１つと比較して、１またはそれを超えるアミノ酸の挿入、欠失または置換を有してもよい。または、核酸の場合、機能変異体は、コードされたタンパク質が最初にコードされたタンパク質の機能変異体である限り、１またはそれを超える同義変異を含み、それによって依然として同じアミノ酸配列をコードしてもよく、または１またはそれを超える非同義変異を含んでもよい。
例として、抗体の機能的変異体または抗体の結合部分は、同じまたは類似の特異性を提供する任意の変異体であり得る。抗体に関して、抗体の機能は、その使用の状況で考慮されなければならない。例えば、抗体の結合部分の機能性は、エピトープを認識するその能力である。しかしながら、任意の抗体は、その全体が、補体の活性化またはエフェクター細胞の活性化などの免疫応答を誘導するようにも機能する場合がある。
一部の実施形態では、機能的変異体または変異体は、本明細書に記載し列挙した配列番号のいずれか１つと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも５５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９１％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９４％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９９％のアミノ配列同一性、または少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、もしくは９９．９％のアミノ酸配列同一性を含んでもよい。一部の実施形態では、機能的変異体は、元のペプチド／タンパク質の機能の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．９％を維持する。
本明細書で使用される場合、「異常発現する」は、同等の細胞の正常な発現から逸脱する任意の発現に関する。一部の実施形態では、異常発現するとは、Ｌｇｒ５の変異形態またはＬｇｒ５の機能不全形態もしくは非機能性形態を発現することを意味する。一部の実施形態では、異常発現するとは、正常細胞と比較したＬｇｒ５の過剰発現を意味する。一部の実施形態では、過剰発現とは、同等の正常細胞と比較した場合、発現の少なくとも１０％の上昇、または発現の少なくとも２０％の上昇、または発現の少なくとも３０％の上昇、または発現の少なくとも４０％の上昇、または発現の少なくとも５０％の上昇、または発現の少なくとも６０％の上昇、または発現の少なくとも７０％の上昇、または発現の少なくとも８０％の上昇、または発現の少なくとも９０％の上昇、または発現の少なくとも１００％の上昇、または発現の少なくとも１２５％の上昇、または発現の少なくとも１５０％の上昇、または発現の少なくとも１７５％の上昇、または発現の少なくとも２００％の上昇、または発現の少なくとも２５０％の上昇、または発現の少なくとも３００％の上昇、または発現の少なくとも３５０％の上昇、または発現の少なくとも４００％の上昇、または発現の少なくとも４５０％の上昇、または発現の少なくとも５００％の上昇を意味する。
本明細書を通して、文脈上他の解釈を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むが、任意の他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外しないことを意味すると理解される。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」などの用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、本発明に直接関係する他の要素を除外する本発明のバージョンをそれらの範囲内で（限定されない）本質的に含むことをさらに理解されたい。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語と置き換えられ得、本発明の範囲を具体的に列挙された要素に限定する効果を有する。特に、本発明が網羅的に考慮されることが明示的に意図される場合、そのような制限は、本明細書に開示された発明概念のみに関連すると見なされるべきであり、本発明概念の範囲外にある他の特性が追加され得る。そのような特性または要素には、「からなる」または「から本質的になる」などの用語によって除外されるべきではない賦形剤、製剤、添加剤、希釈剤、包装、アジュバントおよび並置された特性が含まれてもよいが、これらに限定されない。
核酸配列を比較する場合、配列は、核酸の長さによって決定されるか、または他の方法で指定される比較ウィンドウにわたって比較されるべきである。例えば、表４に列挙された配列のいずれか１つの少なくとも２０残基、少なくとも５０残基、少なくとも７５残基、少なくとも１００残基、少なくとも２００残基、少なくとも３００残基、少なくとも残基、少なくとも５００残基、少なくとも６００残基、または全長にわたる比較ウィンドウ。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％、約１８％、約１６％、約１４％、約１２％、約９％、約８％、約６％、約４％または約２％またはそれ未満の付加または欠失を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７；２５：３３８９－３４０２により開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーなどのアルゴリズムのコンピューター実装により実行されてもよい。グローバルアライメントプログラムを使用して、ほぼ等しいサイズの類似配列をアライメントしてもよい。グローバルアライメントプログラムの例には、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｒｉｃｅ Ｐら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，２０００；１６：２７６－２７７）の一部であるＮＥＥＤＬＥ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）、およびＦＡＳＴＡパッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷおよびＬｉｐｍａｎ Ｄ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８）の一部であるＧＧＳＥＡＲＣＨプログラム（ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｃｏｍｐａｒｅ＆ｐｇｍ＝ｇｎｗで入手可能）が含まれる。これらのプログラムは両方とも、それらの全長に沿った２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つけるために使用されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら編のＵｎｉｔ １９．３にも見出され得る（’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９，２００３）。
「置換」という用語は、親ペプチドまたはタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを指す。置換を行って、得られたタンパク質のアミノ酸を非保存的様式（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸を別の分類に属するアミノ酸に変更することによって、例えば、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換すること）または保存的様式（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸を同じ分類に属するアミノ酸に変更することによって、例えば、親水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換すること）で変化させ得る。そのような保存的変化は、一般に、修飾ペプチド／タンパク質の立体構造および機能変化の減少をもたらす。以下は、アミノ酸の様々な分類の例である。１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸、４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンであってもよい。
当業者は、任意のアミノ酸が化学的に（機能的に）類似のアミノ酸で置換され、ポリペプチドの機能を保持し得ることを認識するであろう。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野で周知である。表５および表６の以下の群は、いくつかの保存的アミノ酸を提示する。
表５
例示的なアミノ酸保存的置換
表６
保存的アミノ酸のグループ
「挿入」という用語は、配列の内部にアミノ酸を付加することを指す。「付加」とは、配列の末端へのアミノ酸の付加を指す。「欠失」とは、配列からのアミノ酸の除去を指す。
理解されるように、「修飾」または「変異」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列に対する任意の付加、欠失、挿入または置換を含む。
本発明に包含される基本的な技術を実施するための方法を含む分子生物学の標準的な教科書を参照する。例えば、Ｇｒｅｅｎ ＭＲおよびＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい。
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行し得る。ありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」、「すなわち」）の使用は、単に例示された実施形態をよりよく明らかにすることを意図しており、明示的に特許請求されない限り、特許請求される発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、特許請求されていない要素を必須として示すと解釈されるべきではない。
本明細書で提示される説明は、共通の特徴および特性を共有する場合がある一部の実施形態に関するものである。一実施形態の１またはそれを超える特性は、他の実施形態の１またはそれを超える特性と組み合わせる場合があることを理解されたい。さらに、実施形態の単一の特性または特性の組み合わせは、追加の実施形態を構成する場合がある。
本明細書で使用される見出し語は、読者の参照を容易にするためにのみ含まれ、本開示または特許請求の範囲を通して見出される主題を限定するために使用されるべきではない。見出し語は、特許請求の範囲または特許請求の範囲の限定を解釈する際に使用されるべきではない。
当業者は、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されたもの以外の変形および改変を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、すべてのそのような変形および改変を含むことを理解されたい。本発明はまた、個々にまたは集合的に、本明細書で言及されるかまたは示されるステップ、特性、組成物および化合物のすべて、ならびに任意の２またはそれを超えるステップまたは特性の任意のおよびすべての組み合わせを含む。
また、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が既に他を指示していない限り、複数の態様を含むことに留意されたい。
本発明は、明確さおよび理解のために本明細書に詳細に記載されているが、本明細書に開示された発明概念の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態および方法に対して様々な修正および変更を行ってもよいことは当業者には明らかであろう。
実施例
本発明を以下の実施例でさらに説明する。実施例は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、上記の説明に関して限定することを意図するものではない。
実施例１－抗Ｌｇｒ５キメラ抗原受容体の設計調製および発現
本発明の実施形態によるキメラ抗原受容体を設計および発現するプロセスを詳述する例示的なプロトコルを以下に詳述する。
図３に示すように、抗体軽鎖リーダー配列（ＣＮＡ３０ｘｘ－配列番号８５）または重鎖リーダー配列（ＣＮＡ３１ｘｘ－配列番号８７）のいずれかであるリーダー配列２、Ｌｇｒ５に対する抗原結合ドメイン３（ＣＮＡ３０ｘｘ－配列番号５３およびＣＮＡ３１ｘｘ－配列番号５４）、およびＣＤ２８膜貫通ドメイン５（配列番号７２）に連結された３つのリンカードメイン４ａ～ｃ（配列番号５５、５６および５７）のうちの１つとを含む細胞外ドメイン１と、４－１ＢＢのシグナル伝達部分７（配列番号５９）、ＣＤ３－ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達部分８（配列番号５８）、Ｔ２Ａ自己切断部位９（配列番号７９）、および細胞内シグナル伝達ドメインを欠く切断型のＥＧＦＲ受容体（ＥＧＦＲｔ）１０（配列番号８１）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメイン６とからなるＣＡＲ構築物（まとめてＣＮＡ ＣＡＲファミリー構築物と呼ばれる）を調製した。その結果、ＥＧＦＲｔの表面発現を、ＣＡＲ構築物による形質導入効率を測定するための代理として使用し得る。
図３に例示されるように、細胞外ドメイン１および膜貫通ドメイン５は、下記の３つのリンカードメインのうちの１つによって連結された。
４ａ．ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号５５）の変異型を含む、１２アミノ酸のリンカードメイン。これらのＣＡＲは、連続末尾（ｘｘ）番号０２で示される。
４ｂ．ＩｇＧ４ヒンジ領域およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域（配列番号８３）の変異型を含み、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有するリンカードメインを提供する、１１９アミノ酸のリンカードメイン。このリンカーを有するＣＡＲは、連続末尾（ｘｘ）番号０３で示される。ならびに
４ｃ．配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有するリンカードメインを提供するための、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域（Ｌ２３５ＤおよびＮ２９７Ｑの変異を有する配列番号８４）の変異型を含む、２２９アミノ酸のリンカードメイン。このリンカーを有するＣＡＲは、連続末尾（ｘｘ）番号０４およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域で示される。
図４Ａおよび図４Ｂに例示されるように、エクトドメイン１の抗原結合ドメイン３は、２つの融合タンパク質（接頭語ＣＮＡ３０ｘｘおよび接頭語ＣＮＡ３１ｘｘで示され、末尾は、上記で考察される「ｘｘ」連続番号のうちの１つである）のうちの１つからなった。具体的には、２つの一本鎖変異断片（ｓｃＦｖ）融合タンパク質を形成した。これらは、１８アミノ酸融合ドメイン１３（配列番号９８）によって融合された可変重（ＶＨ）鎖１１（配列番号５０）および可変軽（ＶＬ）鎖１２（配列番号４９）を含んでいた。図４Ａは、ＶＬ鎖のＣ末端が融合ドメイン１３によってＶＨ鎖のＮ末端に連結されている第１の結合ドメイン（ＣＮＡ３０ｘｘ－配列番号５３）を示す。第２の結合ドメイン（ＣＮＡ３１ｘｘ－配列番号５４）が図４Ｂに示されており、ＶＨ鎖のＣ末端は融合ドメイン１３によってＶＬ鎖のＮ末端に連結されている。前述のように、ＣＡＲの可変ドメインの順序がＣＡＲの表面発現および活性に影響を及ぼす場合があるため、ｓｃＦｖの２つの異なる配向が生成された（Ｂｕｒｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：２０１０，７０，３０２７－３０３３）。
その結果、３つのリンカー領域および２つの結合ドメインのうちの１つを有する６つの異なるＣＡＲを設計した。これらの６つのＣＡＲを以下に要約する。
・ＣＮＡ３００２－ＶＬ－ＶＨ－ＩｇＧ４ヒンジ（短いヒンジ－１２アミノ酸）：アミノ酸配列－配列番号６０
・ＣＮＡ３００３－ＶＬ－ＶＨ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ３（中間のヒンジ－１１９アミノ酸）：アミノ酸配列－配列番号６１
・ＣＮＡ３００４－ＶＬ－ＶＨ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（長いヒンジ－２２９アミノ酸）：アミノ酸配列－配列番号６２
・ＣＮＡ３１０２－ＶＨ－ＶＬ－ＩｇＧ４ヒンジ（短いヒンジ－１２アミノ酸）：アミノ酸配列－配列番号６３
・ＣＮＡ３１０３－ＶＨ－ＶＬ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ３（中間のヒンジ－１１９アミノ酸）：アミノ酸配列－配列番号６４
・ＣＮＡ３１０４－ＶＨ－ＶＬ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（長いヒンジ－２２９アミノ酸）：アミノ酸配列－配列番号６５
６つのＣＡＲ構築物の各々は、最適化されたヒトコドン使用頻度であった。各構成要素をコードするそれぞれの配列を以下の表７に示す。合計６つのＣＡＲ ＤＮＡコード配列を合成した（配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０および配列番号７１は、それぞれＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００３、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４に対応する）。これらをＧｅｎｅＢｌｏｃｋ（商標）二本鎖ＤＮＡ断片として合成し、ＮＥＢ ＨｉＦｉアセンブリ反応を使用して、消化されたｅｐＨＩＶ－７．２レンチウイルスＤＮＡベクター骨格にクローニングして、６つのベクターを得た。
表７
ＣＡＲ構成要素のためのタンパク質およびコードＤＮＡ
実施例２－レンチウイルスベクターの調製。
２３９ Ｔ細胞を、ＣＡＲのＣＮＡファミリーを含有するベクターで一過性にトランスフェクションして、レンチウイルスを作製した。
２９３Ｔ細胞を、５％血清が補充されたＯｐｔｉ－ＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地に播種し、細胞をフラスコに付着させるために５％ ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションした。
ＤＮＡプラスミド、ウイルスパッケージングプラスミド、リポフェクタミン３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐ３０００エンハンサー試薬をコードするＣＡＲを２９３Ｔ細胞と共に培地中でインキュベーションすることによって、６つの異なるＣＮＡ ＣＡＲ用のウイルスを産生した。
上清を回収し、回転させて細胞片を除去した。次いで、上清を濾過し（０．４５μＭ）、ウイルスを遠心分離によって濾過した上清から濃縮し、－８０℃で保存した。
実施例３－Ｔ細胞の単離および形質導入。
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅｓｅｐヒトＴ細胞濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造者のプロトコルに従って使用して全血から単離した。
単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞を、単離後１時間、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で刺激した（３７℃、５％ ＣＯ２）。その後、刺激された細胞に、ＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００３、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３またはＣＮＡ３１０４ ＣＡＲ含有ウイルスのうちの１つを形質導入した。形質導入されていない試料を対照として利用した。単離された細胞を、磁気分離によってｄｙｎａｂｅａｄｓを除去する前に、ポリブレンを含有する完全培地で３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。細胞を、ＩＬ－２１、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含有する完全培地でさらに培養した。細胞を定期的な培地交換によって維持し、日常的に分裂して増殖を維持した。
ＩＬ－２１、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含む完全培地中で、照射されたＰＢＭＣ細胞およびＣＤ３抗体を使用して、６つのＣＡＲ形質導入Ｔ細胞ならびに形質導入されていない対照細胞のそれぞれ１×１０６個に第２の刺激を与えた。この期間中、細胞を、インビトロ細胞溶解アッセイ（下記を参照のこと）に使用する前に、または将来の使用のために凍結する前に、上記のように培養し、分裂させた。
上記のように、ＣＡＲ構築物は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドに連結されたＥＧＦＲｔを含む。ＣＡＲ構築物の発現時に、ＥＧＦＲｔは、成熟キメラ抗原受容体ポリペプチドから切断され、細胞表面上に別々に発現される。その結果、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）の表面発現を用いて、Ｔ細胞における形質導入効率を測定した。
ＣＤ３細胞の形質導入効率を、形質導入された細胞を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＥＧＦＲ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、フローサイトメトリーによって表面発現を分析することによって、形質導入後５日目（図５Ａおよび図５Ｂ）および形質導入後１５日目（図６Ａおよび図６Ｂ）に決定した。
図５Ａおよび図５Ｂに見られるように、形質導入後５日目に、形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞の６つの群すべてが９０％を超えるＥＧＦＲ発現を示し、関連するＣＡＲの発現を示した。具体的には、ＣＮＡ３００２ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ３＋リンパ球の９５．３％がＥＧＦＲを発現し、ＣＮＡ３００３ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ３＋リンパ球の９４．７％がＥＧＦＲを発現し、ＣＮＡ３００４ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ３＋リンパ球の９２．２％がＥＧＦＲを発現し、ＣＮＡ３１０２ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ３＋リンパ球の９４．５％がＥＧＦＲを発現し、ＣＮＡ３１０３ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ３＋リンパ球の９５．５％がＥＧＦＲを発現し、ＣＮＡ３１０４ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ３＋リンパ球の９４．０％がＥＧＦＲを発現した。比較すると、形質導入されていないＣＤ３＋細胞の０．２１％のみが抗ＥＧＦＲ抗体で染色された。しかしながら、１５日目までに（図６Ａおよび図６Ｂ）、ＥＧＦＲ発現は低下した。
実施例４－ＣＡＲ Ｔ細胞エフェクター機能。
抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性を評価するために、インビトロ死滅アッセイを行った。
ＦＦルシフェラーゼを発現するように改変されたＣＨＯ細胞（対照）およびＬｇｒ５を過剰発現し、ＦＦルシフェラーゼを発現するＣＨＯ細胞を、モデル標的細胞として利用した。図７は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７に結合した抗Ｌｇｒ５抗体ＢＮＣ１０１によるＣＨＯ細胞（野生型およびＬｇｒ５過剰発現）の染色を示す。簡潔には、２×１０５個のＣＨＯ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＮＣ１０１抗体を各チューブに４００ｕｇ／ｕｌの最終濃度で５０ｕｌのＰＢＳの総体積で添加した。ＣＨＯ細胞をＢＮＣ１０１抗体の存在下で４℃で３０分間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
図７に見られるように、Ｌｇｒ５を過剰発現するＣＨＯ細胞は、野生型ＣＨＯ細胞と比較してＬｇｒ５の発現増加を明確に示し、ＣＮＡ ＣＡＲ構築物に対する標的細胞としてのそれらの適合性を示した。
上記のＣＨＯ標的細胞を、丸底９６ウェルプレート中５０ｕｌの培地／ウェルで１×１０４細胞の濃度で播種した。各試験を３回実施し、結果を平均した。非形質導入Ｔ細胞を対照として使用した。
６つのＣＡＲ構築物のうちの５つで形質導入されたＴ細胞（ＣＮＡ３００２、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３０１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４）ならびに形質導入されていない（ＵＴ）Ｔ細胞を、１０：１、３：１および１：１のＴ細胞対標的比で、５％ ＣＯ２、３７℃で１８時間、標的癌細胞株と共培養した。
製造業者の指示に従って、共培養における標的細胞の溶解を測定するために、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ系アッセイシステムを使用した。
図８Ａに見られるように、５つの試験抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ構築物はすべて、Ｌｇｒ５を過剰発現するＣＨＯ標的細胞の有意な溶解（７０％を超える）を示したが、形質導入されていないＴ細胞は２０％未満の溶解を有した。比較すると、野生型ＣＨＯ細胞は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のいずれによっても有意に溶解されなかった（図８Ｂ）。
実施例５－腫瘍細胞株に対する抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞活性。
モデル標的細胞に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性が確立されたため、それらをＣｅｌｌＢａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａから供給された以下の癌細胞株に対してインビトロ試験した。ＬｏＶｏ（転移性結腸上皮細胞癌）、ＬＩＭ１２１５（結腸直腸上皮細胞癌腫）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫）、ＯＶＣＡＲ－３（卵巣癌腫）、ＳＨＹ－５Ｙ－ＳＹ（神経芽細胞腫）およびＢＥ（２）－Ｍ１７（神経芽細胞腫）。
様々な細胞株（ルシフェラーゼレポーターを安定に発現する）を、９６ウェル丸底プレートの５０ｕｌ／ウェルで１×１０４細胞で播種した。各比および試験したＴ細胞処置について３回の測定を行った。形質導入されていないＴ細胞を対照細胞に使用した。
６つのＣＡＲ－Ｔ細胞集団および形質導入されていないＴ細胞の各々を、標的癌細胞株と、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で１８時間共培養した。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ系アッセイシステムを上記のように使用して、５つの異なる癌細胞株に対するＣＤ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解能を測定した。
図９Ａ～図９Ｇは、上記で特定された７つの癌細胞株に対する抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性を示す。
分かるように、ＣＮＡ３００４（ＶＬ－ＶＨ－長いヒンジ）ならびにＣＮＡ３１０２（ＶＨ－ＶＬ－短いヒンジ）、ＣＮＡ３１０３（ＶＨ－ＶＬ－中間のヒンジ）およびＣＮＡ３１０４（ＶＨ－ＶＬ－長いヒンジ）はすべて、ＬｏＶｏ、ＬＩＭ１２１５細胞、Ｎａｍａｌｗａ、ＳＨＹ－５Ｙ－ＳＹおよびＢＥ（２）－Ｍ１７細胞の有効な溶解を示した。さらに、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４は、特に１０対１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比でＲａｊｉ細胞の有効な溶解を示し、ＣＮＡ１０３およびＣＮＡ１０４が最も効果的であった。さらに、抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＶＣＡＲ３細胞を効果的に溶解し、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４は、ＯＶＣＡＲ３を標的化するのに最も有効であった。
抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞が、１０：１、３：１および１：１のエフェクター対標的細胞比でＬｏＶｏおよびＬＩＭ１２１５を溶解するのに有効であることを実証したため、標的細胞に対するエフェクターのさらにより小さい比（１：３、１：１０、１：３０）を試験した（図１０）。
図１０Ａおよび図１０Ｂに見られるように、エフェクター対標的比が１：１０であっても、抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞は癌細胞を効果的に溶解することができた。
実施例６－原発性腫瘍細胞に対する抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞活性。
抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｌｇｒ５を過剰発現するＣＨＯ細胞および癌細胞株を溶解し得ることを確立したため、原発性卵巣癌細胞に対する抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価した。
腹水由来の原発性卵巣癌細胞（ｎ＝８）を、患者のインフォームドコンセントおよびＲｏｙａｌ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て、進行期漿液性卵巣癌患者から収集した。培養方法は既に記載されている（Ｃａｒｍｏｎ，Ｋ．Ｓ．ら、ＰＮＡＳ．，２０１１，１０８，１１４５２－７ ａｎｄ Ｒｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ，Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２０１８，４２１，５１－５８）。簡潔には、腹水からの腫瘍細胞を、２ ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０％ ＦＢＳおよびＰＳＦ抗生物質を補充したａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で培養した。原発性卵巣癌細胞株を使用するまで液体窒素中で保存した。これらの細胞を、ＦＦルシフェラーゼを発現するように改変した。
単離された原発性卵巣癌細胞１×１０４個を、９６ウェル丸底プレートのウェルの５０μｌの培地に播種し、様々な比の抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞と共インキュベーションした。標的細胞の溶解を評価するために、上記のように、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ細胞溶解アッセイを行った。
図１１に見られるように、抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞は、１：１（エフェクター対標的比）という低い比で原発性卵巣癌細胞を効果的に溶解した。
実施例７－Ｌｒｇ５遮断抗体はＣＡＲ Ｔ細胞溶解を阻害する
ＣＮＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原特異的に標的細胞を溶解することを確認するために、抗体ＢＮＣ１０１を用いてＬｇｒ５上の標的エピトープをブロックした（上記参照）。
図９および図１０で実証されるように、ＬｏＶｏ結腸直腸癌細胞は、ＣＮＡファミリーＣＡＲ Ｔ細胞によって溶解され得る。したがって、抗原特異的溶解を評価するために、ＬｏＶｏ細胞をＢＮＣ１０１抗体と４時間インキュベーションし、続いてＰＢＳで洗浄し、続いて完全ＸＶＩＶＯ培地に懸濁し、９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルで播種した。
陰性対照については、同数の標的細胞もまた、ＰＢＳまたは完全ＸＶＩＶＯ培地で４時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、上記のように完全ＸＶＩＶＯ培地に播種した。
４つの抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４）を、播種されたＬｏＶｏ細胞と共インキュベーションして、１０：１、３：１、１：１、１：３、１：１０および１：３０のエフェクター対標的細胞比を生じた。ＣＡＲ Ｔ細胞の添加後、さらなるＢＮＣ １０１抗体（２ｍｇ／ｍｌ）を処置群（抗体前処置群）に添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で１６時間インキュベーションした。１６時間のインキュベーションの完了時に、標的細胞の溶解を評価するために、（上記のように）ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ細胞溶解アッセイを行った。
図１２Ａおよび図１２Ｂに見られるように、ＣＮＡファミリーのＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４）によって、抗体とインキュベーションしなかった（すなわち、ＸＶＩＶＯ培地のみまたはＰＢＳのいずれかとインキュベーションした）細胞を、１：１０および１：３０という低いエフェクター対標的比でさえ、効果的かつ広範囲に死滅させた。
比較すると、図１２Ｃは、標的ＬｏＶｏ細胞をプレインキュベーションし、抗Ｌｇｒ５抗体ＢＮＣ１０１と共インキュベーションした場合、試験したＣＮＡファミリーＣＡＲ Ｔ細胞による標的細胞の溶解が、対照ＸＶＩＶＯおよびＰＢＳでインキュベーションした標的細胞と比較して、かなり減少したことを実証している。
実施例８－ＣＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞はインビボで腫瘍成長を効果的に低下させる
ＣＮＡファミリーＣＡＲ Ｔ細胞がインビボでの癌細胞増殖の防止または低減に有効であるか否かを評価するために、マウス異種移植片癌モデルを以下に記載されるように利用した。
動物
５～６週齢の雄の免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスをＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ（西オーストラリア州パース）から購入した。マウスを１２時間の明／暗サイクルで病原体のない条件に収容し、少なくとも１週間順化させた。すべての実験は倫理的承認の下で行った。
組織培養
ヒト結腸直腸腺癌ＬｏＶｏ細胞株を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ；コーニング）および１００ Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖および維持し、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。滅菌ＰＢＳでフラスコをすすぎ、３７℃で約４分間トリプシン／ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を解離することによって、細胞を２～３日ごとに継代した。
ＣＡＲ－Ｔの製造
ＣＤ３＋Ｌｇｒ５標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を上記のように作製した。具体的には、ＣＮＡ３００４（長いリンカーを有する軽鎖－重鎖配向）、ＣＮＡ３１０２（短いリンカーを有する重鎖－軽鎖配向）、ＣＮＡ３１０３（中程度のリンカーを有する重鎖－軽鎖配向）およびＣＮＡ３１０４（長いリンカーを有する重鎖－軽鎖配向）をこのモデルで試験した。
異種移植マウスモデル
６～７週齢のＮＳＧマウスの下腹部に、滅菌ＰＢＳに再懸濁した２×１０６個のＬｏＶｏヒト結腸直腸腺癌細胞を皮下注射した。各群は５～７匹のマウスからなっていた。
合計２×１０７個の生抗Ｌｇｒ５ ＣＡＲ Ｔ細胞（具体的には、ＣＮＡ３００４、ＣＮＡ３１０２、ＣＮＡ３１０３およびＣＮＡ３１０４）を含む滅菌ダルベッコＰＢＳを、癌細胞の注射の３日後にマウスに静脈内注射した。形質導入されていないＴ細胞（２×１０７個）を陰性対照としてマウスに投与し、第２の対照群はＰＢＳのみを投与したマウスからなった。
腫瘍サイズは、デジタルキャリパーを使用して、最長距離を長さとして、垂直距離を幅として測定することにより、７日目から２日ごとに測定された。腫瘍面積を長さ×幅として計算した。注射、腫瘍測定およびモニタリングを含むインビボ手順を盲検実験として行った。
マウスの健康状態を毎日モニタリングし、腫瘍が潰瘍化し、腫瘍の長さが１５ｍｍまたはそれを超え、腫瘍面積が１００ｍｍ２またはそれを超える場合、またはマウスが以下（乱れた毛、猫背、動きたがらない、呼吸困難、初期体重の１０％またはそれを超える体重減少および／または行動もしくは歩行の変化）のいずれかを含む疾患症状の組み合わせを示した場合に、マウスをＣＯ２によって安楽死させた。さらに、マウスにおいて生存および腫瘍のない日を最長１００日間モニタリングした。
統計分析
すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて行った。統計は、ボンフェローニの事後検定を用いた二元配置分散分析検定を使用して行った。＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１、またはログランク分析（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）を図に示す有意値で行った。
図１３Ａに見られるように、４つすべてのＣＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたマウスにおいて、２１日目までに腫瘍サイズを統計学的に有意に減少させ、２１日目には腫瘍は全くまたはほとんど検出されなかった。したがって、ＣＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで機能性を示すマウス癌モデルにおいて、癌腫瘍形成を予防または低減するようにインビボで機能する。
図１４Ａおよび図１４Ｂに見られるように、４つすべてのＣＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたマウスにおいて、２１日目までに腫瘍サイズを統計学的に有意に減少させ、２１日目には腫瘍は全くまたはほとんど検出されず、ＣＮＡ３１０２およびＣＮＡ３１０３は、１００日目までのマウスの生存（図１４Ａ）および腫瘍のない日（図１４Ｂ）の両方に関してＣＮＡ３１０４およびＣＮＡ３００４よりも優れていた。

Claims (70)

  1. Ｌｇｒ５を認識する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    膜貫通ドメインと、
    細胞機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインと、
    を含む、キメラ抗原受容体。
  2. 前記結合ドメインが、Ｌｇｒ５の凸面上のエピトープを認識する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
  3. 前記結合ドメインが、Ｌｇｒ５のロイシンリッチリピート６～９内のエピトープを認識する、請求項１または請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
  4. 前記結合ドメインが、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変重鎖、または前記可変重鎖の機能的変異体を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  5. 前記結合ドメインが、Ｌｇｒ５に結合する抗体の可変軽鎖、または前記可変軽鎖の機能的変異体を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  6. 前記結合ドメインが、抗体１８Ｇ７．１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１もしくは１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、またはその機能的変異体の結合部分を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  7. 前記結合ドメインが、
    配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３と、
    を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  8. 前記結合ドメインが、
    配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３と、
    を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  9. 前記結合ドメインが、Ｌｇｒ５に結合する抗体のＶＨまたはＶＬ鎖と同一の配列を含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と同一の配列を含むか、またはＬｇｒ５に結合する抗体に由来する断片抗原結合（Ｆａｂ）と同一の配列を含むか、またはＬｇｒ５に結合する抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と同一の配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  10. 前記結合ドメインが、可変軽（ＶＬ）鎖のＮ末端に連結された可変重（ＶＨ）鎖のＣ末端を含み、
    前記ＶＨ鎖が、配列番号３７の前記配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８の前記配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３９の前記配列を有するＣＤＲ３を含み、
    前記ＶＬ鎖が、配列番号４０の前記配列を有するＣＤＲ１、配列番号４１の前記配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４２の前記配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに
    各ＣＤＲが、最大２個のアミノ酸修飾を有し得る、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  11. 前記一本鎖可変断片が、前記可変軽（ＶＨ）鎖のＮ末端に連結された前記可変軽（ＶＬ）鎖のＣ末端を含み、
    前記ＶＬ鎖が、配列番号４０の前記配列を有するＣＤＲ１、配列番号４１の前記配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４２の前記配列を有するＣＤＲ３を含み、
    前記ＶＨ鎖が、配列番号３７の前記配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８の前記配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３９の前記配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに
    各ＣＤＲが、最大２個のアミノ酸修飾を有し得る、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  12. 前記結合ドメインが、配列番号４９および／もしくは配列番号５０、または配列番号４９もしくは５０と少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異体を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  13. 前記結合ドメインが、配列番号５３もしくは配列番号５４、または配列番号５３もしくは５４と少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異体を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  14. 前記細胞外ドメインが、前記結合ドメインを前記膜貫通ドメインに連結するリンカードメインを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  15. 前記リンカードメインが、少なくとも１２アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約１２アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  16. 前記リンカードメインが、少なくとも１１９アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約１１９アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  17. 前記リンカードメインが、少なくとも２２９アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約２２９アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  18. 前記リンカードメインが、最長１１９アミノ酸の長さであるか、または最長約１１９アミノ酸の長さである、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体。
  19. 前記リンカードメインが、最長２２９アミノ酸の長さであるか、または最長約２２９アミノ酸の長さである、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体。
  20. 前記リンカードメインが、ＩｇＧ４ヒンジの配列と同一のアミノ酸配列を含むか、または最大２個のアミノ酸修飾を有する、前記ＩｇＧ４ヒンジの修飾型と同一の配列を含む、請求項１４～１９に記載のキメラ抗原受容体。
  21. 前記リンカードメインが、配列番号５５、配列番号５６もしくは配列番号５７、もしくはそれらの機能的変異体から選択される配列を含むか、またはそれからなる、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  22. 前記細胞外ドメインが、１２個を超えるアミノ酸の長さ、少なくとも１１９アミノ酸の長さ、１１９個を超えるアミノ酸の長さ、または少なくとも２２９アミノ酸の長さのリンカーを含み、前記結合ドメインを前記膜貫通ドメインに連結し、前記リンカードメインが、ＶＨドメインのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体。
  23. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、活性化受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分またはその機能的変異体を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  24. 前記活性化受容体が、ＣＤ３共受容体複合体の一員である、請求項２３に記載のキメラ抗原受容体。
  25. 前記活性化受容体が、ＣＤ３－ζ（ＣＤ３ゼータ）である、請求項２３に記載のキメラ抗原受容体。
  26. 前記シグナル伝達ドメインが、共刺激受容体のシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列を有する部分を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  27. 前記共刺激受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳからなる群より選択される、請求項２６に記載のキメラ抗原受容体。
  28. 前記共刺激受容体が、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である、請求項２６に記載のキメラ抗原受容体。
  29. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ３－ζ（ＣＤ３ゼータ）の少なくともシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列と、４－１ＢＢのシグナル伝達部分と同一のアミノ酸配列とを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  30. 前記細胞内ドメインが、配列番号５８および／または配列番号５９を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  31. 配列番号６０、６１、６２、６３、６４および６５、またはそれらの機能的変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、キメラ抗原受容体。
  32. 配列番号６２、６３、６４および６５またはそれらの機能的変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるキメラ抗原受容体。
  33. 請求項１～３２のいずれか１項に記載の前記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  34. 請求項３３に記載の核酸分子およびプロモーターを含む核酸構築物。
  35. 前記プロモーターが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｐ－アクチン、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子－１アルファ（ＥＦ１Ａ）、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧＧ）からなる群から選択される、請求項３４に記載の核酸構築物。
  36. 前記プロモーターが、前記ＣＭＶプロモーターである、請求項３４に記載の核酸構築物。
  37. 前記核酸構築物が、ベクターである、請求項３４～請求項３６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  38. 遺伝子改変細胞の調製に使用するための、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４～３７のいずれか１項に記載の前記核酸構築物。
  39. 遺伝子改変細胞の前記調製における、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４～３７のいずれか１項に記載の核酸構築物の使用。
  40. 請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４～３７のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むウイルスベクター。
  41. ウイルスベクターが、レンチウイルスである、請求項４０に記載のウイルスベクター。
  42. 遺伝子改変細胞を調製する方法に使用するための、請求項４０または請求項４１に記載のウイルスベクター。
  43. 遺伝子改変細胞を調製する方法における、請求項４０または請求項４１に記載のウイルスベクターの使用。
  44. Ｌｇｒ５発現に関連する癌の処置のための医薬品またはＬｇｒ５を発現するもしくは異常発現する細胞の死滅のための医薬品の調製に使用するための、請求項４０または請求項４１に記載のウイルスベクター。
  45. Ｌｇｒ５発現に関連する癌の処置のための医薬品またはＬｇｒ５を発現するもしくは異常発現する細胞の死滅のための医薬品の調製における請求項４０または請求項４１に記載のウイルスベクターの使用。
  46. 請求項１～３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を含む細胞。
  47. 請求項３３に記載の核酸分子、または請求項３４～３７のいずれか１項に記載の核酸構築物、または前記核酸分子もしくは構築物のゲノムに組み込まれた形態を含む、遺伝子改変細胞。
  48. 白血球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーＴ細胞である、請求項４６に記載の細胞または請求項４７に記載の遺伝子改変細胞。
  49. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項４８に記載の細胞または遺伝子改変細胞。
  50. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４８に記載の細胞または遺伝子改変細胞。
  51. Ｌｇｒ５を発現または異常発現する標的細胞を死滅させる方法であって、前記方法が、キメラ抗原受容体を発現する細胞または遺伝子改変細胞に前記標的細胞を曝露することを含み、前記キメラ抗原受容体が、Ｌｇｒ５を標的とする、方法。
  52. 前記細胞または遺伝子改変細胞が、請求項１～３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞または前記遺伝子改変細胞が、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の細胞または遺伝子改変細胞である、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記細胞または遺伝子改変細胞が、前記標的細胞に対して自己である、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記細胞または遺伝子改変細胞が、前記標的細胞に対して同種異系である、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記標的細胞が、対象の体内にある、請求項５１～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記癌細胞が、乳房、膵臓、前立腺、結腸、結腸直腸、胃腸、肺（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、卵巣またはＢ細胞リンパ腫のうちの１またはそれを超える種類から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記癌細胞が、結腸直腸癌、結腸癌または胃腸癌から選択される、請求項５７に記載の方法。
  60. キメラ抗原受容体を発現する前記細胞または遺伝子改変細胞に前記標的細胞を曝露する前に、前記標的細胞上のＬｇｒ５の表面発現を分析することをさらに含む、請求項５１～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記標的細胞が、癌細胞であり、前記標的細胞上のＬｇｒ５の前記表面発現が、異常発現を同定するために同等の非癌性細胞と比較される、請求項６０に記載の方法。
  62. Ｌｇｒ５発現に関連する癌患者を予防または処置する方法であって、前記方法が、キメラ抗原受容体を発現する細胞に前記患者を曝露することを含み、前記キメラ抗原受容体が、Ｌｇｒ５を標的とする、方法。
  63. 前記患者に、請求項１～３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体が投与される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記患者に、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の細胞または遺伝子改変細胞が投与される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記細胞または遺伝子改変細胞が、前記患者にとって自己である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記細胞または遺伝子改変細胞が、前記患者にとって同種異系である、請求項６４に記載の方法。
  67. キメラ抗原受容体を発現する細胞に患者を曝露する前に、前記患者における癌幹細胞の存在を同定することをさらに含む、請求項６２～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記癌が、転移性癌であるか、または再発性癌である、請求項６２～６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 請求項３３に記載の核酸分子、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項４０～４２のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは請求項４６～５０のいずれか１項に記載の細胞もしくは遺伝子改変細胞を含み、さらに薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤を含む、医薬組成物。
  70. サイトカインをさらに含む、請求項６９に記載の医薬組成物。
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