CN115989033A - 用于使用cd70特异性融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法 - Google Patents

用于使用cd70特异性融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法 Download PDF

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罗伯特·霍夫梅斯特
达里奥·古铁雷斯
安德鲁·科拉德
詹森·拉乔伊
瓦尼亚·E·阿什米诺瓦
迈克尔·洛夫格伦
艾米·瓦特
德里克·麦卡锡
罗伯特·泰伊
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Abstract

本文提供了包含CD70结合结构域的T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、经工程改造成表达一种或多种TFP的T细胞、特异性地结合CD70的抗体，以及它们用于治疗包括癌症在内的疾病的使用方法。

Description

用于使用CD70特异性融合蛋白进行TCR重编程的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2020年5月5日提交的美国临时专利申请号63/020,196、2020年12月23日提交的美国临时申请号63/129,718、2021年2月9日提交的美国临时申请号63/147,618和2021年4月7日提交的美国临时申请号63/171,751的权益，这些临时申请中的每一篇都通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于治疗CD70相关疾病和病症的新型治疗剂和方法。
背景技术
人类癌症就其本质而言由正常细胞组成，这些正常细胞已经经历遗传或表观遗传转化而成为异常的癌细胞。在这情况下，癌细胞开始表达与正常细胞表达的那些不同的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可以被人体的先天免疫系统用来特异性地靶向和杀死癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来阻止免疫细胞(如T和B淋巴细胞)成功靶向癌细胞。
大多数晚期实体瘤患者用标准疗法是无法治愈的。另外，传统治疗选项通常具有严重的副作用。已经进行了许多尝试来使患者的免疫系统排斥癌细胞，这是一种统称为癌症免疫疗法的方法。然而，一些障碍使得实现临床有效性相当困难。尽管已鉴定出数百种所谓的肿瘤抗原，但这些抗原通常来源于自身，并且因此可以指导针对健康组织的癌症免疫疗法，或者具有较差的免疫原性。此外，癌细胞使用多种机制使自己不可见或对癌症免疫疗法的免疫攻击的启动和传播敌对。
人T细胞疗法依赖于富集的或经修饰的人T细胞来靶向和杀伤患者的癌细胞。为了增加T细胞靶向和杀伤特定癌细胞的能力，已经开发了将T细胞工程化成表达将T细胞引导至特定靶癌细胞的构建体的方法。包含能够与特定肿瘤抗原相互作用的结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)和工程化T细胞受体(TCR)，允许T细胞靶向并杀伤表达特定肿瘤抗原的癌细胞。
除了表达CAR或工程化TCR的遗传修饰的T细胞在体外/离体识别和破坏各自的靶细胞的能力之外，用工程化T细胞进行的成功患者疗法需要T细胞能够强烈活化、扩增、随时间持久存在、有效地靶向肿瘤，减少以及在复发性疾病的情况下，启用“记忆”反应。另外，目前正在开发的CAR疗法与高水平促炎细胞因子的释放相关，所述促炎细胞因子与剂量限制性毒性相关联。
发明内容
显然需要开发改良的基因工程化T细胞以对抗包括表达CD70的恶性肿瘤在内的各种人类恶性肿瘤。本文描述了具有对CD70特异的结合结构域的TCR亚基(包括CD3ε、CD3γ和CD3δ)和TCRα和TCRβ链的新型融合蛋白，这些新型融合蛋白具有克服现有方法的局限性的潜力。
本文提供了包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列的重组核酸分子，其中所述TFP包含：(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含：(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR跨膜结构域，(iii)TCR胞内结构域；和(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
在一些实施方案中，当所述TFP在T细胞中表达时，所述TFP与内源TCR复合物功能性地相互作用。
在一些实施方案中，所述TCR胞内结构域包含来自CD3γ、CD3δ或CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域。
在一些实施方案中，与不含所述TFP的T细胞相比，表达所述TFP的T细胞表现出增加的对表达CD70的人细胞的细胞毒性。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域通过接头序列连接到所述TCR胞外结构域。
在一些实施方案中，所述接头的长度为120个氨基酸或更少。
在一些实施方案中，所述接头序列包含(G4S)n，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。
在一些实施方案中，n是1至4的整数。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自相同的TCR亚基。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRα。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRβ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRγ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRδ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3ε。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3δ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3γ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域三者全部来自相同的TCR亚基。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域来自CD3ε。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域来自CD3δ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域来自CD3γ。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRα的恒定结构域。
在一些实施方案中，TCRα的恒定结构域是鼠的。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRβ的恒定结构域。
在一些实施方案中，TCRβ的恒定结构域是鼠的。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRγ的恒定结构域。
在一些实施方案中，所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRδ的恒定结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是骆驼抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是鼠抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是人或人源化抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，sdAb是VHH。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域以100nM或更低或约0.001nM至约100nM的KD值与人CD70结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域不与CD27竞争与CD70结合，不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与CD27竞争与CD70结合，抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与氨基酸序列HRDGIYMVHIQVTLAICSSTTAS(SEQ ID NO:1230)内的表位特异性地结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1207-1222、1246和1247的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的scFv。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1223-1227的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的sdAb结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含含有互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3的可变结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:603-620和622-688中的任一者具有至少90％序列同一性的可变结构域。
在一些实施方案中，(i)CDR1包含SEQ ID NO:87-104和107-172中任一者的序列；(ii)CDR2包含SEQ ID NO:259-276和279-344中任一者的序列；和(iii)CDR3包含SEQ IDNO:431-448和451-516中任一者的序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:618具有至少90％序列同一性的可变结构域。
在一些实施方案中，所述可变结构域与SEQ ID NO:618具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，所述可变结构域包含SEQ ID NO:618的序列。
在一些实施方案中，CDR1是SEQ ID NO:102，CDR2是SEQ ID NO:274且CDR3是SEQID NO:446。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1224-1227的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的sdAb结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含具有SEQ ID NO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方案中，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836-888中任一者的序列的重链互补决定区1(CDRH1)、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。
在一些实施方案中，所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048-1100中任一者的序列的轻链互补决定区1(CDRL1)、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1249的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1249的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域的N端。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域的N端。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1248的序列的所述VH和SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1251的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1251的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域的N端。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域的N端。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1250的序列的所述VH和SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1209或SEQ ID NO:1210具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1209或SEQ ID NO:1210的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1253的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1253的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域的N端。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域的N端。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1252的序列的所述VH和SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1246或SEQ ID NO:1247具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1246或SEQ ID NO:1247的序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与氨基酸序列ASRHHPTTLAVGICSPASRSISL(SEQ ID NO:1231)内的第二表位特异性地结合。
在一些实施方案中，所述scFv包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQID NO:853的CDRH1、SEQ ID NO:906的CDRH2和SEQ ID NO:959的CDRH3，所述VL结构域包含SEQ ID NO:1065的CDRL1、SEQ ID NO:1118的CDRL2和SEQ ID NO:1171的CDRL3。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:800的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1012的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:800的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1012的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:782的接头序列。
在一些实施方案中，当在T细胞中表达时，表达所述TFP的T细胞抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，表达所述TFP的T细胞相对于具有不同抗原结合结构域的TFP具有增加的自相残杀。
在一些实施方案中，表达所述TFP的T细胞相对于具有不同抗原结合结构域的TFP具有减少的自相残杀。
在一些实施方案中，所述重组核酸分子编码选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列中的任一氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含编码特异性地结合CD70的抗体或其片段的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是骆驼抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是鼠抗体、人或人源化抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，sdAb是VHH。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段以100nM或更低或约0.001nM至约100nM的KD值与人CD70结合。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段不与CD27竞争与CD70结合，不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段与CD27竞争与CD70结合，抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与氨基酸序列HRDGIYMVHIQVTLAICSSTTAS(SEQ ID NO:1230)内的表位特异性地结合。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:1207-1222、1246和1247的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的scFv。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:1223-1227的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的sdAb结构域。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:603-620和622-688中的任一者具有至少90％序列同一性的可变结构域。
在一些实施方案中，(i)CDR1包含SEQ ID NO:87-104和107-172中任一者的序列；(ii)CDR2包含SEQ ID NO:259-276和279-344中任一者的序列；和(iii)CDR3包含SEQ IDNO:431-448和451-516中任一者的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:618具有至少90％序列同一性的可变结构域。
在一些实施方案中，所述可变结构域与SEQ ID NO:618具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，所述可变结构域包含SEQ ID NO:618的序列。
在一些实施方案中，CDR1是SEQ ID NO:102，CDR2是SEQ ID NO:274且CDR3是SEQID NO:446。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:1224-1227的序列中的任一序列具有至少约80％序列同一性的sdAb结构域。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是scFv。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含具有SEQ ID NO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方案中，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836-888中任一者的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。
在一些实施方案中，所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048-1100中任一者的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1249的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1249的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域的N端。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域的N端。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1248的序列的所述VH和SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1251的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1251的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域的N端。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域的N端。
重组核酸分子如本文所述，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1250的序列的所述VH和SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1209或SEQ ID NO:1210具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1209或SEQ ID NO:1210的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1253的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域和SEQ IDNO:1253的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域的N端。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域的N端。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1252的序列的所述VH和SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1246或SEQ ID NO:1247具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:1246或SEQ ID NO:1247的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段与氨基酸序列ASRHHPTTLAVGICSPASRSISL(SEQ ID NO:1231)内的第二表位特异性地结合。
在一些实施方案中，所述scFv包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQID NO:853的CDRH1、SEQ ID NO:906的CDRH2和SEQ ID NO:959的CDRH3，所述VL结构域包含SEQ ID NO:1065的CDRL1、SEQ ID NO:1118的CDRL2和SEQ ID NO:1171的CDRL3。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:782的接头序列。
在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子还包含编码TCR恒定结构域的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段操作性地连接到编码TCR恒定结构域的序列，从而形成TFP。
在一些实施方案中，所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子还包含前导序列。
在一些实施方案中，所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
在一些实施方案中，所述核酸是mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸是环状RNA。
在一些实施方案中，所述核酸包含核苷酸类似物。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物选自由2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的核酸，锁核酸(LNA)，乙烯核酸(ENA)，肽核酸(PNA)，1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)，吗啉代核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸和2'-氟代N3-P5’-亚磷酰胺组成的组。
在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子还包含启动子。
在一些实施方案中，所述核酸是体外转录的核酸。
在一些实施方案中，所述核酸还包含编码聚(A)尾的序列。
在一些实施方案中，所述核酸还包含3'UTR序列。
在一个方面，本公开提供了由如本文所述的重组核酸分子编码的多肽。
在一个方面，本公开提供了包含编码如本文所述的TFP的重组核酸分子的载体。
在一个方面，本公开提供了包含编码如本文所述的抗体或抗原结合片段的重组核酸分子的载体。
在一些实施方案中，如本文所述的载体还包含编码用于降低CD70内源水平的siRNA、shRNA或miRNA的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的载体还包含编码抑制性分子的序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
在一些实施方案中，如本文所述的载体还包含编码TCR恒定结构域的序列。
在一些实施方案中，所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体组成的组。
在一些实施方案中，如本文所述的载体还包含启动子。
在一些实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
在一些实施方案中，所述载体中的核酸序列还包含聚(A)尾。
在一些实施方案中，所述载体中的核酸序列还包含3'UTR。
在一个方面，本公开提供了包含如本文所述的重组核酸分子、如本文所述的多肽或如本文所述的载体的细胞。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的细胞，所述重组核酸分子包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含：(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR跨膜结构域，(iii)TCR胞内结构域；和(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是人T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+或CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是人αβT细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是人γδT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是人NKT细胞。
在一个方面，本公开提供了包含如本文所述的重组核酸分子、如本文所述的多肽或如本文所述的载体的T细胞。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的T细胞，所述重组核酸分子包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含：(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR跨膜结构域，(iii)TCR胞内结构域；和(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
在一些实施方案中，所述T细胞是人T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+或CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是人αβT细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是人γδT细胞。
在一些实施方案中，如本文所述的细胞或T细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
在一些实施方案中，所述抑制性分子包含：构成PD-1的至少一部分的第一多肽及包含共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
在一些实施方案中，所述抑制性分子包含SEQ ID NO:1239或SEQ ID NO:1244的序列。
在一些实施方案中，编码所述TFP的所述序列和编码抑制性分子的所述核酸被包含在单个核酸分子中。
在一些实施方案中，编码所述TFP的所述序列和编码抑制性分子的所述核酸被包含在两个单独的核酸分子中。
在一些实施方案中，如本文所述的细胞或T细胞还包含编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的第二核酸序列。
在一些实施方案中，编码TFP的所述序列和第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。
在一些实施方案中，编码TFP的所述序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。
在一些实施方案中，编码TFP的所述序列和所述第二核酸序列通过第二接头操作性地连接。
在一些实施方案中，所述第二接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点是2A切割位点。
在一些实施方案中，所述2A切割位点是T2A切割位点。
在一些实施方案中，IL-15的表达增加细胞的持久性。
在一些实施方案中，当IL-15多肽在所述细胞或T细胞中表达时，该IL-15多肽被分泌。
在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:1242的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列还编码IL-15受体(IL-15R)亚基或其片段。
在一些实施方案中，所述IL-15R亚基是IL-15R alpha(IL-15Rα)。
在一些实施方案中，IL-15和IL-15Rα通过第三接头操作性地连接。
在一些实施方案中，第三接头不是可切割接头。
在一些实施方案中，第三接头包含含有(G4S)n的序列，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。
在一些实施方案中，n是1至4的整数。
在一些实施方案中，n为3。
在一些实施方案中，第三接头包含SEQ ID NO:1243的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列编码包含连接到IL-15Rα亚基的IL-15多肽的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述IL-15多肽连接到所述IL-15Rα亚基的N端。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含IL-15的氨基酸30-162。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含IL-15Rα的氨基酸31-267。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含sushi结构域。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1244的序列。
在一些实施方案中，当所述融合蛋白在所述细胞或T细胞中表达时，所述融合蛋白是在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，当所述融合蛋白在所述细胞或T细胞中表达时，所述融合蛋白被分泌。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含编码PD-1多肽的第三核酸序列。
在一些实施方案中，所述PD-1多肽经由其C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。
在一些实施方案中，所述第三核酸序列与所述第一核酸序列和第二核酸序列被包含在同一核酸分子中。
在一些实施方案中，所述PD-1多肽经由PD-1的跨膜结构域连接到共刺激多肽的胞内结构域。
在一些实施方案中，所述共刺激多肽选自包含OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD28、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、CD226、FcγRI、FcγRII和FcγRIII的组。
在一些实施方案中，所述共刺激多肽的所述胞内结构域包含CD28的至少一部分。
在一些实施方案中，PD-1的胞外结构域和跨膜结构域连接到CD28的胞内结构域。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞包含融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到CD28胞内结构域的PD-1的胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1254或SEQ ID NO:1262的序列。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的第二核酸序列。
在一些实施方案中，编码TFP的所述序列和第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。
在一些实施方案中，编码TFP的所述序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。
在一些实施方案中，编码TFP的所述序列和所述第二核酸序列通过第二接头操作性地连接。
在一些实施方案中，所述第二接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点是2A切割位点。
在一些实施方案中，所述2A切割位点是T2A切割位点。
在一些实施方案中，第二核酸序列还编码PD-1或其片段。
在一些实施方案中，第二核酸序列编码PD-1的胞外结构域。
在一些实施方案中，第二核酸序列编码PD-1的胞外和跨膜结构域。
在一些实施方案中，第二核酸序列还编码CD28或其片段。
在一些实施方案中，第二核酸序列编码CD28的胞内结构域。
在一些实施方案中，所述第二核酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到所述CD28胞内结构域的所述PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα。
在一些实施方案中，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα的胞内结构域。
在一些实施方案中，所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:1245的序列。
在一些实施方案中，所述重组核酸分子还包含编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的第三核酸序列。
在一些实施方案中，当IL-15多肽或其片段在所述细胞或T细胞中表达时，所述IL-15多肽或其片段被分泌。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞响应于T细胞活化剂而分泌所述IL-15多肽。
在一些实施方案中，IL-15信号传导响应于T细胞活化剂而增加。
在一些实施方案中，所述T细胞活化剂包括抗CD3抗体或其片段、抗CD28抗体或其片段、细胞因子、结合所述TFP的所述抗原结合结构域的抗原，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，当所述TFP在T细胞中表达时，所述TFP与内源TCR复合物功能性地相互作用。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞包含内源TCR的功能性破坏。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞是同种异体的细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞包含内源CD70基因的功能性破坏。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞包含内源CIITA基因的功能性破坏。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含用于降低CD70内源水平的反义siRNA、shRNA或miRNA。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含用于降低CIITA内源水平的反义siRNA、shRNA或miRNA。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列。
在一些实施方案中，所述重组核酸包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列。
在一些实施方案中，编码所述TFP的所述序列和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列被包含在同一操纵子中。
在一些实施方案中，所述ER滞留结构域由SEQ ID NO:756-779中的任一者编码。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的所述序列还包含介于所述抗CD70抗体结构域和所述ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的序列还包含编码位于编码所述抗CD70抗体结构域的序列的5’的CD8α信号肽的序列。
在一些实施方案中，所述抗体结构域包含如本文所述的重组核酸。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞包含与抗CD70抗体结合的细胞表面表达的CD70。
在一些实施方案中，所述抗CD70抗体是由如本文所述的重组核酸编码的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由如本文所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含编码抑制性分子的异源序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含编码TCR恒定结构域的异源序列。
在一些实施方案中，所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
在一些实施方案中，TCRα恒定结构域或TCRβ恒定结构域是鼠的。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞包含编码选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的重组核酸分子。
在一个方面，本公开提供了包含如本文所述的细胞或T细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物。
在一个方面，本公开提供了产生如本文所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括：(i)破坏内源CD70基因，从而产生含有内源CD70基因的功能性破坏的细胞或T细胞；并且(ii)用如本文所述的重组核酸或如本文所述的载体转导含有内源CD70基因的功能性破坏的细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述破坏包括用靶向所述内源CD70基因的核酸酶蛋白或编码所述核酸酶蛋白的核酸序列转导所述细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括破坏内源TCR。
在一个方面，本公开提供了产生如本文所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括用如本文所述的重组核酸或如本文所述的载体转导包含内源CD70基因的破坏的细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含内源TCR的破坏。
在一个方面，本公开提供了产生如本文所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括：(i)用如本文所述的重组核酸或如本文所述的载体转导细胞或T细胞；以及(ii)使所述细胞或T细胞同与细胞表面上的CD70结合的抗CD70抗体接触。
在一些实施方案中，所述抗CD70抗体是由如本文所述的重组核酸编码的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由如本文所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导之前。
在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导前至多1天。
在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导之后。
在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导之后至多5天。
在一些实施方案中，如本文所述的方法还包括在所述转导之后4天或更多天，在不包含所述抗CD70抗体的培养基中对所述细胞进行继代培养。
在一些实施方案中，所述继代培养包括在所述转导之后7天或更多天，在不包含所述抗CD70抗体的培养基中对所述细胞进行继代培养。
在一个方面，本公开提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的药物组合物。
在一个方面，本公开提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)如本文所述的细胞或T细胞；和(b)药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，所述癌症是与CD70表达升高相关的癌症。
在一些实施方案中，如本文所述的方法还包括向所述受试者施用增加癌细胞中的CD70水平的剂。
在一些实施方案中，所述增加CD70水平的剂是低甲基化剂。
在一些实施方案中，所述低甲基化剂是5-阿扎胞苷或地西他滨(decitabine)。
在一些实施方案中，所述疾病或所述病状选自由T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)+癌症和/或人乳头瘤病毒(HPV)+癌症组成的组。
在一些实施方案中，所述疾病或所述病状选自由肾癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、胸腺癌、乳腺癌、头颈癌和胃癌组成的组。
在一些实施方案中，所述受试者是人。
在一个方面，本公开提供了产生如本文所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括：(i)破坏内源CIITA基因，从而产生含有内源CIITA基因的功能性破坏的细胞或T细胞；以及(ii)用如本文所述的重组核酸或如本文所述的载体转导含有内源CIITA基因的功能性破坏的细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述破坏包括用靶向所述内源CIITA基因的核酸酶蛋白或编码所述核酸酶蛋白的核酸序列转导所述细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括破坏内源TCR。
在一个方面，本公开提供了产生如本文所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括用如本文所述的重组核酸或如本文所述的载体转导包含内源CIITA基因的破坏的细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞或T细胞还包含内源TCR的破坏。
在一个方面，本公开提供了产生如本文所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括用如本文所述的重组核酸或如本文所述的载体以及编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列转导细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述重组核酸或载体和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列同时被转导。
在一些实施方案中，所述重组核酸或载体包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列。
在一些实施方案中，编码所述TFP的所述序列和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列被包含在同一操纵子中。
在一些实施方案中，所述重组核酸或载体在编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列之前或之后被转导。
在一些实施方案中，所述ER滞留结构域由SEQ ID NO:756-779中的任一者编码。
在一些实施方案中，编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列还包含介于所述抗CD70抗体结构域和所述ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列还包含编码位于编码所述抗CD70抗体结构域的序列的5’的CD8α信号肽的序列。
在一些实施方案中，所述抗体结构域构成如本文所述的抗CD70抗体。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，就如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文的程度一样。其程度如同每个单独出版物、专利和专利申请具体地和单独地指出通过引用方并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述和附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在说明性实施方案中利用了本发明的原理，并且在附图中：
图1是ELISA测定法的图示，该ELISA测定法检测所示抗CD70VHH和scFv与CHO-CD70细胞(高CD70表达)、JVM3细胞(中-低CD70表达)、野生型CHO细胞(阴性对照)、HL60细胞(阴性对照)的结合。
图2示出了用于确定所示抗CD70 VHH和scFv中的每一者对CD70的亲和力的octet结合测定法的结果。
图3示出了用于确定所示抗CD70 VHH和scFv中的每一者以及针对CD27的聚类的表位聚类(epitope binning)测定法的结果。
图4是实施例2中描述的竞争测定法的示意图。
图5是用于评估所示抗CD70 VHH和scFv与CD27竞争与CD70结合的图4所示竞争测定法的图示。
图6A-6C是流式细胞术数据的图示，该流式细胞术数据通过用抗VHH抗体和CD70-Fc标签染色来检测用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞中的细胞表面TFP表达。图6A示出了用抗VHH抗体和CD70-Fc标签进行的检测。图6B示出了用抗VHH抗体进行的检测。图6C示出了用CD70-Fc标签进行的检测。
图7A-7C是检测用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞中的CD4+和CD8+阳性率的流式细胞术数据的图示。图7A示出了总T细胞。图7B示出了TFP+ T细胞。图7C示出了TFP-T细胞。
图8A-8F是流式细胞术数据的图示，该流式细胞术数据通过针对CD45RA和CCR7的细胞表面表达进行染色来检测用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞中的T细胞记忆状态。图8A示出了总CD4+ T细胞。图8B示出了TFP-CD4+ T细胞。图8C示出了TFP+CD4+ T细胞。图8D示出了总CD8+ T细胞。图8E示出了TFP-CD8+ T细胞。图8F示出了TFP+CD8+ T细胞。
图9A-9D是流式细胞术数据的图示，该流式细胞术数据检测用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞中CD45RA和CD27的细胞表面表达。图9A和图9B示出了TFP-T细胞。图9C和图9D示出了TFP+ T细胞。
图10是一系列图表，该图表示出了来自于三个供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与CHO-WT细胞或THP-1细胞一起以9:1、3:1和1:1的效应细胞:靶细胞比率共同培养24小时时的增殖。
图11是一系列图表，该图表示出了来自于三个供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与CHO-WT细胞或THP-1细胞一起以9:1、3:1和1:1的效应细胞:靶细胞比率共同培养24小时时的细胞毒性。
图12A和图12B是一系列图表，该图表示出了来自于三个供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与CHO-WT细胞或THP-1细胞一起以9:1、3:1和1:1的效应细胞:靶细胞比率共同培养24小时时的细胞因子分泌。图12A示出了IFN-γ、TNF-α和IL-2。图12B示出了GM-CSF。
图13提供了一系列图表，该图表示出了根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下产生的用所示TFP转导的T细胞和未经转导的对照在扩增10天后的扩增和活力。
图14示出了例示出根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下用所示TFP转导的细胞的转导效率的图表。
图15提供了一系列图表，该图表示出了当根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成TFP+ T细胞时CD4+和CD8+ T细胞的比例。
图16A和图16B是一系列图表，该图表例示了当根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成TFP+ T细胞时T细胞的记忆表型。图16A示出了CD4+ T细胞且图16B示出了CD8+ T细胞。
图17提供了一系列图表，该图表示出了当根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成TFP+ T细胞时CCR7+CD4+和CD8+ T细胞的比例。
图18提供了一系列图表，该图表示出了当根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成TFP+ T细胞时CCR69+CD4+和CD8+ T细胞的比例。
图19A和图19B是一系列图表，该图表例示了根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成TFP+ T细胞时CD27+和CD70+ T细胞的比例。图19A示出了CD4+ T细胞且图19B示出了CD8+ T细胞。
图20是一系列图，该图例示了明根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的TFP+ T细胞上的RNAseq。
图21是一系列图表，该图表例示了根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的TFP+ T细胞的细胞毒性。将细胞以1:1、3:1或9:1的靶细胞:效应细胞比率共同培养，将CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞或CD70阳性RCC786-O细胞修饰成过表达萤火虫荧光素酶并通过活细胞的荧光素酶活性来确定细胞裂解。
图22A-22H是一系列图表，该图表例示了当与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞或CD70阳性RCC 786-O细胞一起以1:1、3:1或9:1的靶细胞:效应细胞比率共同培养24小时或72小时时所示TFP+ T细胞的细胞因子表达。TFP+ T细胞是根据实施例9中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的。示出了24小时(图22A)和72小时(图22B)的GM-CSF水平。示出了24小时(图22C)和72小时(图22D)的IFN-γ水平。示出了24小时(图22E)和72小时(图22F)的IL-2水平。示出了24小时(图22G)和72小时(图22H)的TNF-α水平。
图23A和图23B是一系列图表，该图表例示了在进行CRISPR编辑以敲除CD70后7天(图23A)和9天(图23B)TFP+CD70+和CD70-细胞的比例。
图24示出了例示出在未编辑的细胞和经CD70 CRISPR编辑的细胞中根据实施例10中描述的方法用所示TFP转导的细胞的转导效率的图表和图。
图25提供了一系列图表，该图表示出了当在未编辑的细胞和经CD70 CRISPR编辑的细胞中根据实施例10中描述的方法生成TFP+T细胞时CD4+和CD8+ T细胞的比例。
图26是一系列图，该图例示了当在未编辑的细胞和经CD70CRISPR编辑的细胞中根据实施例10中描述的方法生成TFP+ T细胞时CD27+和CD70+ T细胞的比例。
图27A和图27B是一系列图表，该图表例示了当在未编辑的细胞和经CD70 CRISPR编辑的细胞中根据实施例10中描述的方法生成TFP+ T细胞时T细胞的记忆表型。图27A示出了CD4+ T细胞且图27B示出了CD8+ T细胞。
图28提供了一系列图表，该图表示出了当在未编辑的细胞和经CD70 CRISPR编辑的细胞中根据实施例10中描述的方法生成TFP+T细胞时CCR69+CD4+和CD8+ T细胞的比例。
图29是一系列图表，该图表示出了通过流式细胞术用CD70-生物素/SA-PE和抗VHH-AF488检测野生型和CD3ε敲除的jurkat细胞中的70-001TFP表达。使用VIN70069病毒(IU滴度6.5E7)生成TRuC
图30是一系列图，该图例示了当在存在或不存在5μM41D12抗CD70抗体的情况下以1:1的比率与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞、CD70阳性JVM3细胞或无靶细胞对照一起共同培养16小时时，用70-001TFP转导的VHH+和CD69+jurkat细胞(野生型或CD3ε敲除)的比例。
图31是图30所示的流图数据的图示。
图32是一系列图，该图例示了当在存在或不存在抗CD70抗体(5μM 1F6-hFc或70-001-hFc或10μM 41D12)的情况下以1:1的比率与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞、CD70阳性JVM3细胞或无靶细胞对照一起共同培养16小时时，用70-001TFP转导的VHH+和CD69+CD3ε敲除jurkat细胞的比例。
图33是图32所示的流图数据的图示。
图34是用于测量CD27阻断CD70结合的能力的ELISA测定法的示意图，其通过实施例12中描述的ELISA进行测量。
图35是示出了测量抗CD70 scFv抗体1885(B08)、1985(A11)和1867(C10)对CD70的亲和力的octet滴定的图表。通过淘选天然的全人scFv文库发现一组scFv，并且这些的子集已经转化为TRuC并在此进行了表征。
图36示出了用于确定所示抗CD70 VHH和scFv中的每一者以及针对CD27的聚类的表位聚类测定法的结果。
图37A-37C示出了表位作图分析的结果。图37A是示出所示VHH抗体的表位作图结果的图表并且图37B是示出所示scFv抗体的表位作图结果的图表。图37C是汇总来自图36、图37A和图37B的表位聚类和表位作图数据的示意图。
图38是一系列图，该图示出了在用具有所示scFv结合剂的TFP转导的CD3ε敲除的jurkat细胞或未经转导的对照T细胞中如通过CD3表达所确定的检测CD69表达和转导效率的流式细胞术数据。
图39A和图39B是一系列图，该图示出了在与K562、THP-1、ACHN细胞或786-O靶细胞一起以1:1的比率共同培养24小时后，在用具有所示scFv结合剂的TFP转导的CD3ε敲除的jurkat细胞中检测CD3表达和CD69表达的流式细胞术数据。图39A示出了呈vLvH取向的scFv结合剂并且图39B示出了呈vHvL取向的scFv结合剂。
图40是示出了在与K562、THP-1、ACHN细胞或786-O靶细胞一起以1:1的比率共同培养24小时后用具有所示scFv结合剂的TFP转导的CD3ε敲除的jurkat细胞的细胞因子TNF-α、GM-CSF和IL-2的产生的图表。CD70 TFP T细胞与CD70-K562细胞或CD70+ TFP+、ACHN或786-0细胞一起共同培养。
图41是示出用具有所示scFv结合剂的CD 70TFP，用70-001CD70 TFP或用TC-110转导的T细胞的扩增的图表。
图42是例示出如实施例16所指示的那样用所示TFP构建体转导的细胞的转导效率的图表。
图43提供了一系列图，该图示出了如实施例16所指示的那样用所示的TFP转导的T细胞群或未经转导的对照T细胞中CD4+和CD8+ T细胞的比例。一些CD70 TRuC示出与NT和TC-110相似的CD4/CD8比率。
图44是示出了如实施例16所指示的那样用具有所示结合剂的TFP转导的CD69+ T细胞或未经转导的对照T细胞的比例的图表。
图45是示出了如通过流式细胞术确定的记忆表型的图表，该流式细胞术检测如实施例16所指示的那样用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞中CD45RA和CD27的细胞表面表达。
图46是汇总图42-45所示的数据的表格。
图47是示出了在THP-1、ACHN和786-O细胞系中的CD70表面表达的检测的一系列图。
图48是一系列图表，该图表示出了来自于一个代表性供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞毒性。
图49A-49D是一系列图表，该图表示出了来自于一个代表性供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞因子产生。测量IFN-γ(图49A)、IL-2(图49B)、TNF-α(图49C)和GM-CSF(图49D)。
图50是示出来自于三个供者的用具有所示scFv或人源化VHH结合剂的CD 70TFP，或用70-001CD70 TFP(P3E8)、TC-110转导的T细胞，或未经转导的对照的扩增的图表。
图51是一系列图，该图示出了在来自于三个供者的用具有所示scFv或人源化VHH结合剂的CD 70TFP，或用70-001CD70 TFP(P3E8)、TC-110转导的T细胞，或未经转导的对照中如通过VHH表达的检测所确定的细胞表面CD70表达和转导效率。
图52是一系列图，该图示出了在来自于三个供者的用具有所示scFv或人源化VHH结合剂的CD 70TFP，或用70-001CD70 TFP(P3E8)、TC-110转导的T细胞，或未经转导的对照中检测CD4+和CD8+阳性率的流式细胞术数据。
图53是一系列图，该图示出了在来自于两个供者的用具有所示scFv或人源化VHH结合剂的CD 70TFP，或用70-001CD70 TFP(P3E8)、TC-110转导的T细胞，或未经转导的对照中，如通过检测CD45RA和CD27的细胞表面表达的流式细胞术所确定的记忆表型。
图54是一系列图，该图示出了在来自于三个供者的用具有所示scFv或人源化VHH结合剂的CD 70TFP，或用70-001CD70 TFP(P3E8)、TC-110转导的T细胞，或未经转导的对照中检测CD69的细胞表面表达的流式细胞术数据。
图55是一系列图表，该图表示出了来自于一个代表性供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞毒性。
图56是一系列图表，该图表示出了来自于一个代表性供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞因子产生。测量IFN-γ、IL-2、TNF-α和GM-CSF。
图57是一系列图表，该图表示出来自于三个供者的用具有所示scFv或人源化VHH结合剂的CD 70TFP，或用70-001CD70 TFP(P3E8)、C10 TFP转导的T细胞，或未经转导的对照的扩增。
图58是一系列图，该图示出了在来自于一个代表性供者的用具有所示人源化VHH结合剂的CD70 TFP，用70-001CD70 TFP(P3E8)转导的T细胞，或未经转导的对照中，如通过VHH表达的检测所确定的转导效率。
图59是一系列图，该图示出了在来自于一个代表性供者的用具有所示人源化VHH结合剂的CD70 TFP，用70-001CD70 TFP(P3E8)转导的T细胞，或未经转导的对照中检测CD4+和CD8+阳性率的流式细胞术数据。
图60A-60C是一系列图，该图示出了在来自于一个代表性供者的用具有所示人源化VHH结合剂的CD70 TFP，用70-001CD70 TFP(P3E8)转导的T细胞，未经转导的对照中，如通过检测CD45RA和CD27的细胞表面表达的流式细胞术所确定的记忆表型。图60A示出了总CD3+ T细胞。图60B示出了CD4+ T细胞。图60C示出了CD8+T细胞。
图61是一系列图表，该图表示出了来自于一个代表性供者的在存在或不存在所指示的41D12抗体的情况下生成的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞，或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O、MOLM14或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞毒性。
图62A-62D是一系列图表，该图表示出了来自于一个代表性供者的在存在或不存在所指示的41D12抗体的情况下生成的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O、MOLM13或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞因子产生。测量IFN-γ(图62A)、GM-CSF(图62B)、IL-2(图62C)和TNF-α(图62D)。
图63是示出了在具有或不具有PD-1-CD28融合蛋白或膜结合的IL-15的情况下用C10 CD 70TFP转导的T细胞或未经转导的对照的扩增的图表。
图64是一系列图，该图示出了在具有或不具有PD-1-CD28融合蛋白或膜结合的IL-15的情况下用C10 CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照的转导效率(如通过VHH表达的检测所确定的)、细胞表面的PD-1表达和细胞表面的IL15Rα表达。
图65是一系列图，该图示出了在具有或不具有PD-1-CD28融合蛋白或膜结合的IL-15的情况下用C10 CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照中检测CD4+阳性率的流式细胞术数据。
图66是一系列图，该图示出了在具有或不具有PD-1-CD28融合蛋白或膜结合的IL-15的情况下用C10 CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照中，如通过检测CD45RA和CD27的细胞表面表达的流式细胞术所确定的记忆表型。
图67是示出了来自两个供者的用具有所示人scFv结合剂的CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照的扩增的一系列图表。
图68A和图68B是一系列图，该图示出了在来自两个代表性供者的用具有所示的人scFv结合剂的CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照中，如通过scFv表达的检测所确定的CD8阳性率和转导效率。图68A示出了来自供者R017的T细胞并且图68B示出了来自供者R022的T细胞。
图69A和图69B是一系列图，该图示出了在来自两个供者的用具有所示的人scFv结合剂的CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照中，检测CD70细胞表面表达的流式细胞术数据。图69A示出了来自供者R017的T细胞并且图69B示出了来自供者R022的T细胞。
图70A-70D是一系列图，该图示出了在来自于两个供者的用具有所示的人scFv结合剂的CD70 TFP转导的T细胞或未经转导的对照中，如通过检测CD45RA和CD27的细胞表面表达的流式细胞术所确定的记忆表型。图70A示出了来自供者R017的CD8+ T细胞。图70B示出了来自供者R017的CD4+ T细胞。图70C示出了来自供者R022的CD8+ T细胞。图70D示出了来自供者R022的CD4+ T细胞。
图71A和图71B是一系列图表，该图表示出了来自于两个供者的用具有所示结合剂的TFP转导的T细胞或未经转导的对照T细胞在与THP-1、ACHN、786-O或K562细胞一起以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时时的细胞毒性。图71A示出了来自供者R017的T细胞并且图71B示出了来自供者R022的T细胞。
图72A和图72B是一系列图表，该图表示出了在肾细胞癌的鼠模型中用根据实施例21中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的CD70 TFP+ T细胞处理的小鼠中的肿瘤体积。图72A示出了初始治疗时的肿瘤体积并且图72B示出了再激发时的肿瘤体积。
图73A-73C示出了在全身性人伯基特淋巴瘤的鼠模型中用根据实施例21中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的CD70 TFP+ T细胞处理的小鼠中的肿瘤生长。通过发光确定肿瘤生长。图73A在单张图中示出了所有组中肿瘤生长的图表。图73B示出了每个组的单独图。图73C示出了每个受试者的发光图像。
图74A和图74B示出了在系统性人急性髓性白血病的鼠模型中用根据实施例21中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的CD70 TFP+ T细胞处理的小鼠中的肿瘤生长。通过发光确定肿瘤生长。图74A在单张图中示出了所有组中肿瘤生长的图表。图74B示出了在1e7个TFP+ T细胞的剂量下每个组的单独图。
图75是示出了在肾细胞癌(ACHN)的鼠模型中用根据实施例21中描述的方法在存在和不存在抗CD70抗体的情况下生成的CD70TFP+ T细胞处理的小鼠的肿瘤体积的图表。
具体实施方式
本公开提供了一种重组核酸分子，其包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含：(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR跨膜结构域，(iii)TCR胞内结构域；和(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接，或者本公开提供了包含所述重组核酸分子的载体。本文还提供了一种重组核酸分子，其包含编码特异性地结合CD70的抗体或其片段的序列。本文还公开了包含重组核酸的细胞，例如T细胞，所述重组核酸包含编码如本文所述的TFP的序列。所述细胞还可包含：编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含构成抑制性分子(例如，PD-1)的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域(例如，共刺激结构域和初级信号传导结构域)的阳性信号的第二多肽缔合；和/或编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段、IL-15受体(IL-15R)亚基或其片段，或它们的组合的核酸。本文还公开了包含如本文所述的细胞和药学上可接受的载剂的药物压缩物、通过向受试者施用如本文所述的药物组合物来治疗受试者的癌症的方法，以及产生如本文所述的细胞的方法。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有专门术语、符号和其他科学用辞旨在具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且将此类定义包括在本文中不一定要解释为表示与本领域通常理解的不同。本文描述或引用的技术和程序通常是本领域技术人员充分理解并且使用常规方法常用的，该常规方法为诸如例如Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中描述的广泛利用的分子克隆方法。视情况而定，除非另有说明，否则涉及使用市售试剂盒和试剂的程序通常根据制造商定义的方案和条件进行。
如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。除非另外明确指示，否则术语“包括”、“诸如”等旨在传达包括，而没有限制。
如本文所用，术语“包含”或其变型如“含有”或“包括”应理解为指示包括任何列举的整数(例如特征、要素、特点、特性、方法/过程步骤或限制)或整数(例如特征、要素、特点、特性、方法/过程步骤或限制)的组，但不排除任何其他整数或整数的组。因此，如本文所述，术语“包含”是包容性的并且不排除另外的、未列举的整数或方法/过程步骤。
在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含”可以用“基本上由......组成”或“由......组成”代替。短语“基本上由......组成”在本文中用于要求具体指定的整数或步骤以及不实质性影响所要求保护的发明的性质或功能的那些。如本文所用，术语“由......组成”用于指示单独存在所列举的整数(例如特征、要素、特点、特性、方法/过程步骤或限制)或整数(例如特征、要素、特点、特性、方法/过程步骤或限制)的组。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
术语“约”指示并涵盖所指示的值及高于和低于该值的范围。在某些实施方案中，术语“约”指示指定值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案中，在适用的情况下，术语“约”指示指定值±该值的一个标准偏差。
如本文所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其与抗原特异性地结合。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以源自天然或重组来源。
术语“抗原结合结构域”意指抗体的能够与抗原或表位特异性地结合的部分。抗原结合结构域的一个示例是由抗体的VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。抗原结合结构域的另一个示例是通过来自阿德奈汀(Adnectin)的第十个III型纤连蛋白结构域的某些环的多样化形成的抗原结合结构域。
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体或其重组变体的至少一个部分，该部分含有抗原结合结构域(即完整抗体的抗原决定可变区)，该抗原结合结构域足以赋予抗体片段对靶标诸如抗原及其限定表位的识别和特异性结合。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdAb”)(VL或VH)、骆驼VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”(或在单结构域抗体例如纳米抗体的情况下，为“VHH”)是指含有插入在称为框架区的侧翼链段之间的三个CDR的重链片段，这些框架区通常比CDR更高度保守并且形成用于支撑CDR的支架。
除非有说明，否则如本文所用，scFv可以具有呈任何顺序(例如，相对于多肽的N端和C端)的VL和VH可变区，该scFv可包含VL-接头-VH或者可包含VH-接头-VL。
本发明的TFP组合物的包含抗体或其抗体片段的部分可以呈多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)或重链抗体HCAb，源自鼠、人源化或人抗体的单链抗体(scFv)(Harlow等人，1999，见：UsingAntibodies:A Laboratory Manual中，Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow等人，1989，在：Antibodies:A Laboratory Manual中，Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等人，1988,Science242:423-426)。在一个方面，本公开的TFP组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在进一步的方面，TFP包含含有scFv或sdAb的抗体片段。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者，其通常决定所述抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。kappa(“κ”)和lambda(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，诸如例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，所述DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列，其中已使用本领域可用和公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得所述DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”或“Ag”是指能够被抗体特异性结合或以其他方式激发免疫反应的分子。这种免疫反应可涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的活化，或者两者。
技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可用作抗原。此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因而编码“抗原”，正如该术语在本文使用的含义那样。此外，本领域技术人员将理解抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本公开包括但不限于不止一个基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫反应的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成生成，或者可以源自生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。此类生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
“CD70”是属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的细胞因子。该细胞因子是TNFRSF27/CD27的配体。它是活化的而不是静息的T淋巴细胞和B淋巴细胞上的表面抗原。CD70诱导经共刺激的T细胞增殖，增强溶细胞性T细胞的生成，并促进T细胞活化。据报道CD70在调控B细胞活化、天然杀伤细胞的细胞毒性功能和免疫球蛋白合成中起作用。
“II类主要组织相容性复合物反式激活因子”或“CIITA”编码具有一个酸性转录激活结构域、4个LRR(富亮氨酸重复序列)和一个GTP结合结构域的蛋白。该蛋白位于细胞核中并充当II类主要组织相容性复合物基因转录的正调控因子，被称为这些基因表达的“主控因子”。该蛋白还结合GTP并使用GTP结合促进其自身转运到细胞核中。一旦处于细胞核中，它就不结合DNA，而是使用内在乙酰转移酶(AT)活性以共活化剂样的方式起作用。
术语“抗肿瘤作用”是指可通过各种方式表现出来的生物作用，包括但不限于例如肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移灶数目的减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活率的降低或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”还可通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。
非人抗体的“人源化”形式是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人抗体(受者抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基被来自非人抗体(供者抗体)的一个或多个CDR的残基置换。供者抗体可以是具有所需的特异性、亲和力或生物效应的任何合适的非人抗体，诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类抗体。在一些情况下，受者抗体的所选框架区残基被来自供者抗体的相应框架区残基置换。人源化抗体还可以包含在受者抗体或供者抗体中没有发现的残基。可以进行此类修饰以进一步改进抗体功能。更多详情，参见Jones等人，Nature,1986,321:522-525；Riechmann等人，Nature,1988,332:323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，其各自通过引用整体并入。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体：该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体，或源自利用人抗体组库或人抗体编码序列(例如，从人类来源获得的或重新设计的)的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体特别排除人源化抗体。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或表位)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对成员(例如，抗体和抗原或表位)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力可以用解离平衡常数(KD)表示。下面更详细地描述了有助于解离平衡常数的动力学组分。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，常用方法包括本文描述的那些方法，诸如表面等离子体共振(SPR)技术(例如，
Figure BDA0004038419630000501
)或生物层干涉测量法(例如，
Figure BDA0004038419630000502
)。
关于抗体或其片段与靶分子的结合，术语“结合特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位”、“特异性地结合特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位”、“与特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位特异性地结合”、“对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位具有特异性”、“选择性结合特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位”和“对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位具有选择性”意指可测量地不同于(例如与非靶分子的)非特异性或非选择性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过测量与靶分子的结合并将其与非靶分子的结合进行比较来测量。也可以通过与模拟靶分子上被识别的表位的对照分子竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果抗体与靶分子的结合受对照分子竞争性抑制，则表明是特异性结合。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何物质，该物质之后将被重新引入到该个体中。
术语“同种异体”是指任何这样的物质，该物质源自与引入该物质的个体相同的物种的不同动物或与引入该物质的个体不同的患者。当一个或多个基因座上的基因不同一时，两个或多个个体被说成是彼此同种异体的。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体物质可能在遗传上充分不同以在抗原性方面相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
术语“治疗(treating)”(及其变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指试图改变有需要的受试者的疾病或病状的自然过程的临床干预。治疗可以是为了预防和在临床病理学过程中进行。理想的治疗效果包括：防止疾病的发生或复发、缓和症状、缩减疾病的任何直接或间接的病理学后果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或减低疾病状态以及缓解或改善预后。
如本文所用，“治疗有效量”是足以向施用组合物的个体提供有益效果或以其他方式减少有害的非有益事件的组合物或其活性组分的量。本文中的“治疗有效剂量”意指对于其施用产生一种或多种所需的或期望的(例如，有益的)作用的剂量，此类施用在给定的时间段内发生一次或多次。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar,Dosage Calculations(1999))。
如本文所用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括源自构成TCR的各种多肽的重组多肽，该TCR通常能够i)与靶细胞上的表面抗原结合并且ii)通常在共同定位于T胞内或其表面上时，与完整TCR复合物的其他多肽组分相互作用。“TFP T细胞”是已经根据本文公开的方法转导并且表达TFP(例如，并入到天然TCR中的TFP)的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+/CD8+ T细胞。在一些实施方案中，TFP T细胞是NK细胞或调控性T细胞。
如本文所用，术语“T细胞受体”和“T细胞受体复合物”可互换使用，是指在T细胞表面上发现的，通常负责识别抗原的分子。在95％的T细胞中TCR包含由TCRα链和TCRβ链组成的异二聚体，而5％的T细胞具有由TCRγ链和TCRδ链组成的TCR。TCR还包含CD3ε、CD3γ和CD3δ中的一者或多者。在一些实施方案中，TCR包含CD3ε。在一些实施方案中，TCR包含CD3γ。在一些实施方案中，TCR包含CD3δ。在一些实施方案中，TCR包含CD3ζ。TCR与抗原的接合，例如与抗原和MHC的接合，导致其T细胞通过由相关的酶、共受体和专门的辅助分子介导的一系列生化事件而活化。在一些实施方案中，人TCRα的恒定结构域具有SEQ ID NO:711的序列。在一些实施方案中，人TCRα的恒定结构域具有：具有SEQ ID NO:712的序列的IgC结构域；具有SEQ ID NO:713的序列的跨膜结构域；及具有SS的序列的胞内结构域。在一些实施方案中，鼠TCRα的恒定结构域具有SEQ ID NO:1267的序列。在一些实施方案中，人TCRβ的恒定结构域具有SEQ ID NO:715的序列。在一些实施方案中，人TCRβ的恒定结构域具有：具有SEQ ID NO:716的序列的IgC结构域；具有SEQ ID NO:717的序列的跨膜结构域；及具有SEQID NO:719的序列的胞内结构域。在一些实施方案中，鼠TCRβ的恒定结构域具有SEQ ID NO:1268的序列。在一些实施方案中，TCRδ的恒定结构域具有SEQ ID NO:725的序列。在一些实施方案中，TCRδ的恒定结构域具有：具有SEQ ID NO:726的序列的IgC结构域；具有SEQ IDNO:727的序列的跨膜结构域；及具有L的序列的胞内结构域。在一些实施方案中，TCRγ的恒定结构域具有SEQ ID NO:721的序列。在一些实施方案中，TCRγ的恒定结构域具有：具有SEQ ID NO:722的序列的IgC结构域；具有SEQ ID NO:723的序列的跨膜结构域；及具有SEQID NO:724的序列的胞内结构域。在一些实施方案中，CD3ε具有SEQ ID NO:694的序列。在一些实施方案中，CD3ε具有：具有SEQ ID NO:696的序列的胞外结构域；具有SEQ ID NO:697的序列的跨膜结构域；及具有SEQ ID NO:698的序列的胞内结构域，例如胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3δ具有SEQ ID NO:704的序列。在一些实施方案中，CD3δ具有：具有SEQ ID NO:706的序列的胞外结构域；具有SEQ ID NO:707的序列的跨膜结构域；及具有SEQ ID NO:708的序列的胞内结构域，例如胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3γ具有SEQ ID NO:699的序列。在一些实施方案中，CD3γ具有：具有SEQ ID NO:701的序列的胞外结构域；具有SEQ ID NO:702的序列的跨膜结构域；及具有SEQ ID NO:703的序列的胞内结构域，例如胞内信号传导结构域。
如本文所用，术语“受试者”意指哺乳动物受试者。示例性的受试者包括人、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊、兔和绵羊。在某些实施方案中，受试者是人。“患者”是患有疾病、病症或病状或处于发展疾病、病症或病状的风险中或以其他方式需要本文提供的组合物和方法的受试者。在一些实施方案中，受试者患有癌症，例如本文所述的癌症。
如本文所用，“防止”是指在患者中对疾病或病状，例如肿瘤形成的防止。例如，如果用本发明的方法治疗了有发展肿瘤或其它形式的癌症的风险的个体，并且所述个体后来没有发展该肿瘤或其它形式的癌症，则在该个体中在至少一段时间内该疾病已被预防。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗或诊断产品(例如，试剂盒)的商业包装中的说明，该说明含有关于此类治疗或诊断产品使用的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。
“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其起到调控、降低、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的影响的作用。
术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性病症”、“增生性病症”和“肿瘤”在本文中被提及时并不互斥。术语“细胞增生性病症”和“增生性病症”是指与一定程度的异常细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，细胞增生性病症是癌症。在一些方面，肿瘤是实体瘤。在一些方面，肿瘤是血液恶性肿瘤。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的示例，其包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
术语“药物组合物”是指这样的制备物，其形式使得其中所含的活性成分的生物活性在治疗受试者方面有效，并且其不含在药物组合物中提供的量下对受试者有不可接受的毒性的另外的组分。
术语“调节”是指降低或抑制，或者可替代地活化或增加所列举的变量。
术语“增加”和“活化”是指所列举的变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
术语“降低”和“抑制”是指所列举的变量减小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
术语“激动”是指活化受体信号传导以诱导与受体活化相关的生物反应。“激动剂”是与受体结合并激动受体的实体。
术语“拮抗”是指抑制受体信号传导以抑制与受体活化相关的生物反应。“拮抗剂”是与受体结合并拮抗受体的实体。
术语“效应T细胞”包括T辅助(即，CD4+)细胞和细胞毒性(即，CD8+)T细胞。CD4+效应T细胞促成几个免疫过程的发展，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。CD8+效应T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。关于效应T细胞的另外的信息，参见通过引用整体并入的Seder和Ahmed，Nature Immunol.,2003,4:835-842。
术语“调控性T细胞”包括例如通过阻抑效应T细胞来调控免疫耐受性的细胞。在一些方面，调控性T细胞具有CD4+CD25+Foxp3+表型。在一些方面，调控性T细胞具有CD8+CD25+表型。参见通过引用整体并入的Nocentini等人，Br.J.Pharmacol.,2012,165:2089-2099中关于表达CD70的调控性T细胞的另外的信息。
术语“树突细胞”是指能够活化天然T细胞并刺激B细胞生长和分化的专职性抗原呈递细胞。
短语“与CD70表达相关的疾病”包括但不限于与CD70表达相关的疾病或与表达CD70的细胞相关的病状，包括例如增生性疾病诸如癌症或恶性肿瘤或癌前病状。在一个方面，所述疾病是癌症。
在一些情况下，所述癌症选自T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)+癌症或人乳头瘤病毒(HPV)+癌症。在一些情况下，所述癌症是肾癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、胸腺癌、乳腺癌、头颈癌或胃癌。
在一些情况下，所述癌症可以是急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱癌瘤)、骨癌、脑癌(例如，成神经管细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、RCC、ccRCC、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或输尿管癌。
术语“保守性序列修饰”是指不会显著影响或改变包含氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特点的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。通过本领域已知的标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变，可以将修饰引入到本发明的抗体或抗体片段中。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的TFP内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且改变的TFP可以使用本文所述的功能测定法来测试。
术语“刺激”是指通过刺激结构域或刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体(cognate ligand)结合从而介导信号转导事件(诸如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导)而诱导的初级反应。刺激可介导某些分子表达的改变，和/或细胞骨架结构的重组织等。
术语“刺激性分子”或“刺激结构域”是指由T细胞表达的分子或其部分，其提供一个或多个初级细胞质信号传导序列，所述序列对T细胞信号传导途径的至少某些方面以刺激性方式调控TCR复合物的初级活化。在一个方面，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合启动，并且所述结合导致T细胞反应(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或“ITAM”的信号传导基序。在本发明中特别有用的含ITAM的初级细胞质信号传导序列的示例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)和CD66d的那些。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，诸如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递给T细胞。
如本文所用，“胞内信号传导结构域”是指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域生成促进含TFP的细胞(例如表达TFP的T细胞)的免疫效应子功能的信号。例如在表达TFP的T细胞中的免疫效应子功能的示例包括溶细胞活性和T辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些。在实施方案中，胞内信号传导域可包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的那些。
初级胞内信号传导结构域可包含ITAM(“基于免疫受体酪氨酸的活化基序”)。含有初级胞质信号传导序列的ITAM的示例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其是高效免疫反应所需的。共刺激分子包括但不限于MHC 1类分子、BTLA和Toll配体受体，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。此类分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体等。胞内信号传导结构域可包含其所源自的分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。术语“4-1BB”是指具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等效残基的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等效残基。
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列在具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性的生物过程中，用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性。因此，基因、cDNA或RNA编码蛋白质，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质的话。其中的核苷酸序列与mRNA序列是同一的且通常在序列表中提供的编码链，以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并型式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，达到编码蛋白质的核苷酸序列在一些型式中可以包含一个或多个内含子的程度。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“功能性破坏”是指特定(例如，靶)核酸(例如，基因、RNA转录物、由其编码的蛋白质)的物理或生物化学变化，所述变化阻止其在细胞中的正常表达和/或行为。在一个实施方案中，功能性破坏是指通过基因编辑方法对基因的修饰。在一个实施方案中，功能性破坏阻止了靶基因(例如，内源基因)的表达。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还应解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件以用于表达；用于表达的其他元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或被包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是最高效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的示例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如例如Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中所提供的自灭活慢病毒载体。可在临床使用的慢病毒载体的其他示例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的LENTIVECTORTM基因递送技术，来自Lentigen Technology的LENTIMAXTM载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。
术语“环化RNA”或“环状RNA”是指一类具有连续结构的单链RNA，其具有增强的稳定性而缺乏与各种细胞蛋白相互作用所必需的末端基序。环状RNA是3-5'共价闭合的RNA环，并且环状RNA不显示Cap或聚(A)尾。环状RNA缺乏核酸外切酶介导的降解所必需的游离末端，致使它们对RNA周转的几种机制具有抗性，并且与它们的线性mRNA对应物相比，赋予它们延长的寿命。出于这个原因，环化可以使通常具有短半衰期的mRNA稳定化并且因此可以提高mRNA在各种应用中的总体功效。环状RNA通过剪接过程产生，并且环化主要在注释的外显子边界处使用常规剪接位点发生(Starke等人，2015；Szabo等人，2015)。对于环化，反向使用剪接位点：下游剪接供体“反剪接”到上游剪接受体(参见Jeck和Sharpless,2014；Barrett和Salzman,2016；Szabo和Salzman,2016；Holdt等人，2018中的综述)。
迄今为止已经报道了用于RNA环化的三种通用策略：使用溴化氰或类似缩合剂的化学方法、使用RNA或DNA连接酶的酶促方法和使用自剪接内含子的核酶方法。在优选的实施方案中，通过失控转录合成前体RNA，然后在镁离子和GTP的存在下加热以促进环化。如此产生的RNA可高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括TFP、CAR和TCR或其组合的序列。
在一些示例性的实施方案中，使用利用排列的I组催化内含子的核酶方法。该方法更适用于长RNA的环化，并且仅需要添加GTP和Mg2+作为辅因子。这种排列的内含子-外显子(PIE)剪接策略由侧接有半内含子序列的融合部分外显子组成。在体外，这些构建体经历I组催化内含子特有的双重酯交换反应，但是因为外显子是融合的，所以它们作为共价5'和3'连接的环被切除。
术语“同源”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子，诸如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，则它们在该位置处是同源或同一的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半位置(例如，长度为十个亚基的多聚体中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。
术语“分离的”意指从自然状态改变或去除的。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以实质上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，使用通常出现的核酸碱基的以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能性键联，该功能性键联导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子实现编码序列的转录或表达，则启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此连续，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地说，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语指短链和长链，短链在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚物，长链在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指由细胞的转录机器或引入的合成机器识别的DNA序列，其可以启动多核苷酸序列的特异性转录。
术语“启动子/调控序列”是指可用于表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列并且在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，实质上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指这样的核苷酸序列，当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，仅当细胞为对应于所述启动子的组织类型的细胞时，才实质上在细胞中产生基因产物。
如在scFv的情况下所用，术语“接头”和“柔性多肽接头”是指被单独或组合使用以将可变重链与可变轻链区域连接在一起的肽接头，其由氨基酸诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1,n＝2,n＝3,n＝4,n＝5,n＝6,n＝7,n＝8,n＝9以及n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复序列。在WO2012/138475(通过引用并入本文)中描述的接头也包括在本发明的范围内。在一些情况下，接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的“前面”或5’末端。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的末端基团组成。其存在对于被核糖体识别和免受RNA酶降解的保护至关重要。帽的添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得彼此影响。转录开始后不久，所合成的mRNA的5'末端被与RNA聚合酶缔合的合成帽的复合物结合。这种酶复合物催化mRNA封端所需的化学反应。合成作为多步生化反应继续进行。可修饰封端部分以调节mRNA的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体生成。体外转录载体包含用于生成体外转录的RNA的模板。
如本文中所用，“聚(A)”是通过多腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，聚A为50至5000，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。可以化学或酶促修饰聚(A)序列，以调节mRNA功能性，诸如定位、稳定性或翻译效率。
如本文中所用，“多腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价键联。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被多腺苷酸化。3’聚(A)尾是通过酶即多腺苷酸聚合酶的作用添加到前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常为数百个)。在高级真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列即多腺苷酸化信号的转录物上。聚(A)尾及与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受外切核酸酶的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出以及翻译也很重要。DNA转录为RNA后，多腺苷酸化立即在细胞核中发生，但另外地也可在细胞质中稍后发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常特征在于切割位点附近存在碱基序列AAUAAA(SEQ ID NO:689)。切割mRNA后，将腺苷残基添加到切割位点的3’末端。
如本文中所用，“瞬时”是指非整合的转基因表达数小时、数天或数周的时间，其中如果被整合到基因组中或者被包含在宿主细胞中的稳定的质粒复制子内，则表达的时间段短于基因表达的时间段。
术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用的多种信号传导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传递信号的分子和分子的复合物。
术语“实质上纯化的”细胞是指基本上不含其他细胞类型的细胞。实质上纯化的细胞也指已经与在其天然存在的状态下通常与其结合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，实质上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已与在它们的天然状态下与它们天然结合的细胞分离的细胞。在一些方面，体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
如本文中所用，术语“治疗的”意指治疗。通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文所用，术语“预防”意指对疾病或疾病状态的防止或防止性治疗。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症抗原”或“与过度增生性病症相关的抗原”是指特定过度增生性病症共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性病症抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、NHL、白血病、子宫癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、脑癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、子宫内膜癌和胃癌。
在一些情况下，所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱癌瘤)、骨癌、脑癌(例如，成神经管细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、RCC、ccRCC、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或输尿管癌。
在一些情况下，所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)+癌症或人乳头瘤病毒(HPV)+癌症。在一些情况下，所述癌症是肾癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、胸腺癌、乳腺癌、头颈癌或胃癌
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指借以将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语“特异性地结合”是指这样的抗体、抗体片段或特异性配体，它们识别并结合存在于样品中的同源结合配偶体(例如，CD70)，但不一定且实质上不会识别或结合样品中的其他分子。
范围：贯穿本公开，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式进行的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应该被认为已经具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个示例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的东西，以及包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。无论范围有多广，这都适用。
“程序性细胞死亡蛋白1”，也称为PD-1、CD279(分化簇279)、PDCD1、PD1、SLEB2、hPD-1、hSLE1和程序性细胞死亡1，是指细胞表面上的这样的蛋白质，该蛋白质起到通过下调免疫系统来调节免疫系统对人体细胞的反应和通过阻抑T细胞炎症活性来促进自身耐受性的作用。这可以防止自身免疫性疾病，但也可阻止免疫系统杀伤癌细胞。PD-1是免疫检查点并且例如通过两种机制防护自身免疫。首先，它促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，它减少调控性T细胞(抗炎、阻抑性T细胞)的凋亡。PD-1是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，在T细胞和祖B细胞上表达。PD-1结合两个配体，PD-L1和PD-L2。如本文所用的PD-1包括PD-1或其具有或保持PD-1活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)的变体或同源物的任何重组或天然存在形式。在一些方面，所述变体或同源物与天然存在的PD-1相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，PD-1与由UniProt参考号Q15116标识的蛋白质或与其具有实质性同一性的变体或同源物是实质上同一的。PD-1的人和鼠氨基酸序列和核酸序列可以在公共数据库诸如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，鼠和人PD-1序列分别对应于UniProt登录号Q02242和Q15116，并具有以下序列：
人PD-1(UniProt登录号Q15116)
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ IDNO:1228)。
鼠PD-1(UniProt登录号Q02242)
MWVRQVPWSFTWAVLQLSWQSGWLLEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQGMVIGIMSALVGIPVLLLLAWALAVFCSTSMSEARGAGSKDDTLKEEPSAAPVPSVAYEELDFQGREKTPELPTACVHTEYATIVFTEGLGASAMGRRGSADGLQGPRPPRHEDGHCSWPL(SEQ IDNO:1229)
“程序性死亡配体1(PD-L1)”，也称为分化簇274、CD274、B7同源物1、B7-H、B7-H1、B7H1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1、hPD-L1和CD274分子，是指40kDa的1型跨膜蛋白。在一些实施方案中，PD-L1可以在特定事件诸如妊娠、组织同种异体移植、自身免疫性疾病和其他疾病状态诸如肝炎期间在阻抑免疫系统的适应性臂中起主要作用。通常，适应性免疫系统对与由外源或内源危险信号进行的免疫系统活化相关的抗原起反应。抗原特异性CD8+ T细胞和/或CD4+辅助细胞的克隆扩增进而得以传播。PD-L1与抑制性检查点分子PD-1的结合经由基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)传递基于与磷酸酶(SHP-1或SHP-2)的相互作用的抑制性信号。这减少了淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，同时减少了调控性T细胞(抗炎、阻抑性T细胞)的凋亡——进一步由基因Bcl-2的较低调控介导。如本文所用的PD-L1包括PD-L1或其具有或保持PD-L1活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)的变体或同源物的任何重组或天然存在形式。在一些方面，所述变体或同源物与天然存在的PD-L1相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，PD-L1与由UniProt参考号Q9NZQ7标识的蛋白质或与其具有实质性同一性的变体或同源物是实质上同一的。
在本发明的上下文中，“PD-1配体”、“PD-L1”和“PD-L2”是指对PD-1具有结合亲和力的蛋白质。在一些实施方案中，PD-1蛋白或其结合片段(诸如PD-1蛋白的胞外结构域)的特征在于：与天然PD-1蛋白相比，能够以相同(即相等)、增强或降低(即减弱)的亲和力结合人PD-1的天然配体，即人PD-L1(也称为CD274，UniProt登录号Q9NZQ7)和/或人PD-L2(也称为CD273，UniProt登录号Q9BQ51)。
如本文所用，术语“融合蛋白”涉及由不同来源的多肽部分组成的蛋白质。因此，它也可以理解为嵌合蛋白。在本文所述的PD-1融合蛋白的上下文中，术语“融合蛋白”可与术语“转换受体”可互换使用。通常，融合蛋白是通过最初编码单独的蛋白质的两个或更多个基因(或优选cDNA)的联接产生的蛋白质。该融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单个多肽，优选具有源自每种原始蛋白质的功能特性的单个多肽。重组融合蛋白通过用于生物研究或治疗的重组DNA技术人工产生。本文描述了产生本发明的融合蛋白的进一步细节。
如本文所用的术语“PD-1融合蛋白”、“PD-1转换受体”或“PD-1转换分子”是指所描述的这样的PD-1融合蛋白，该PD-1融合蛋白通过与PD-L1或PD-L2结合来接收抑制信号，并且经由融合蛋白的共刺激结构域将该信号转化(即“转换”)为活化信号。
如本文所用的术语“IL-15”，也称为白细胞介素15和IL15，是指在各种免疫细胞的维持和稳态扩张中起重要作用的多效性细胞因子。在一些实施方案中，IL-15在NK谱系的发育，以及NK细胞的存活、扩增和功能中起关键作用。在一些实施方案中，IL-15有助于增强的抗肿瘤免疫。在一些实施方案中，IL-15参与淋巴细胞稳态。在一些实施方案中，IL-15在外周先天性和适应性免疫细胞功能中起多种作用。在一些实施方案中，IL-15在诱导中枢记忆T细胞亚群以及在抗原呈递细胞反式呈递后增强的溶细胞效应子中具有关键作用。在一些实施方案中，IL-15通过减少活化诱导的细胞死亡(AICD)来帮助T细胞存活。在一些实施方案中，人IL-15前体蛋白基于信号肽的长度具有两种已知的同种型：例如，IL-15(对于“长信号肽”而言，也称为IL-15-S48AA或IL-15LSP)具有48个氨基酸的信号肽和前肽，而由交替剪接的mRNA表达的IL-15-S21AA或IL-15SSP(对于“短信号肽”而言)具有21个氨基酸的信号肽和前肽。在一些实施方案中，IL-15SSP不被分泌，而是在细胞内储存在细胞质中。如本文所用，IL-15包括IL-15或其具有或保持IL-15活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)的变体或同源物的任何重组或天然存在形式。在一些方面，所述变体或同源物与天然存在的IL-15相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，IL-15与由UniProt参考号P40933标识的蛋白质或与其具有实质性同一性的变体或同源物是实质上同一的。
在一些实施方案中，IL-15信号肽包含IL-15蛋白序列的氨基酸1-29。在一些实施方案中，IL-15信号肽包含SEQ ID NO:1246的序列。在一些实施方案中，IL-15包含IL-15蛋白序列的氨基酸30-162。在一些实施方案中，IL-15包含表11中列出的序列中的任一序列或其片段。在一些实施方案中，IL-15包含SEQ ID NO:1242的序列。
术语“白细胞介素15受体”或“IL-15R”是指I型细胞因子受体，IL-15与其结合并通过其发出信号。在一些实施方案中，IL-15R由三个亚基组成：IL-15受体α链(“IL-15Rα”或CD215)、IL-2受体β链(“IL-2Rβ”或CD122)和IL-2受体γ/共有γ链(“IL-2Rγ/γc”或CD132)。例如，在一些实施方案中，人IL-15Rα前体蛋白具有30个氨基酸的信号肽、175个氨基酸的胞外结构域、23个氨基酸的单一横跨膜的跨膜链段和39个氨基酸的胞质(或胞内)结构域，并且含有N-和O-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，IL-15Rα含有对于IL-15结合必不可少的Sushi结构域(氨基酸31-95)。在一些实施方案中，IL-15Rα以可溶形式(sIL-15Rα)存在。在一些实施方案中，sIL-15Rα由跨膜受体通过限定的蛋白水解切割组成性生成，并且该过程可以被某些化学剂诸如PMA增强。在一些实施方案中，约42kDa大小的人sIL-15Rα可以通过IL-15结合和IL-2Rβ/γc异二聚体延长IL-15的半衰期或加强IL-15信号传导。尽管IL-15R与含有信号转导所需的胞质基序的IL-2R共用亚基，但在一些实施方案中，IL-15信号传导除了具有与IL-2信号传导重叠的许多生物活性之外，还具有单独的体内生物效应，这归因于IL-15R独有的IL-15Rα亚基、IL-15的可用性和浓度、IL-15-IL-15Rα结合的动力学和亲和力。在一些实施方案中，IL-15以高亲和力与IL-15Rα特异性结合，然后该IL-15Rα与由同一细胞上表达(“顺式呈递”)或不同细胞上表达(“反式呈递”)的IL-2Rβ和IL-2Rγ/γc亚基组成的复合物缔合。在一些实施方案中，IL-15与IL-15Rα之间的相互作用不依赖于由IL-2Rβ和IL-2Rγ/γc亚基组成的复合物。在一些实施方案中，IL-15与IL-2Rβ/γc异二聚体受体的结合诱导经由β链使STAT3磷酸化的JAK1活化和经由γ链使STAT5磷酸化的JAK3活化。在一些实施方案中，IL-15/IL-15R相互作用调节记忆CD8+ T细胞中的T细胞发育和稳态。在一些实施方案中，IL-15/IL-15R相互作用还调节NK细胞发育、维持、扩增和活性。
如本文所用，“IL-15Rα”，也称为CD215、IL-15受体亚基α、IL-15R-α、IL-15RA和白细胞介素-15受体亚基α，包括IL-15Rα或其具有或保持IL-15Rα活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)的变体或同源物的任何重组或天然存在形式。在一些方面，所述变体或同源物与天然存在的IL-15Rα相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，IL-15Rα与由UniProt参考号Q13261标识的蛋白质或与其具有实质性同一性的变体或同源物是实质上同一的。
如本文所用，“IL-2Rβ”，也称为CD122、IL-2受体亚基β、IL-2R亚基β、IL-2RB、P70-75、IMD63和白细胞介素-2受体亚基β，包括IL-2Rβ或其具有或保持IL-2Rβ活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)的变体或同源物的任何重组或天然存在形式。在一些方面，所述变体或同源物与天然存在的IL-2Rβ相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，IL-2Rβ与由UniProt参考号P14784标识的蛋白质或与其具有实质性同一性的变体或同源物是实质上同一的。
如本文所用，“IL-2受体γ/共有γ链”，也称为IL-2Rγ/γc、IL2RG、CIDX、IL-2RG、IMD4、P64、SCIDX、SCIDX1、白细胞介素2受体亚基γ或CD132，包括IL-2Rγ/γc或其具有或保持IL-2Rγ/γc活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)的变体或同源物的任何重组或天然存在形式。在一些方面，所述变体或同源物与天然存在的IL-2Rγ/γc相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，IL-2Rγ/γc与由UniProt参考号P31785标识的蛋白质或与其具有实质性同一性的变体或同源物是实质上同一的。
在一些实施方案中，IL-15Rα胞质(或胞内)结构域包含IL-15Rα蛋白的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα胞质(或胞内)结构域包含SEQ ID NO:1248的序列。在一些实施方案中，IL-15RαSushi结构域包含IL-15Rα蛋白的氨基酸31-95。在一些实施方案中，IL-15RαSushi结构域包含SEQ ID NO:1250的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα包含IL-15Rα蛋白的跨膜结构域和胞质(胞内)结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα包含IL-15Rα蛋白的氨基酸96-267。在一些实施方案中，IL-15Rα包含SEQ ID NO:1251的序列。在一些实施方案中，sIL-15Rα包含IL-15Rα蛋白的氨基酸21-205。在一些实施方案中，sIL-15Rα包含SEQ IDNO:1249的序列。
CD70结合结构域
CD70是肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族的三聚体II型跨膜蛋白。CD70可以调控T细胞和B细胞的活化、增殖和分化，并且可以在维持机体的免疫反应中起作用。CD70与其配体CD27(TNF受体超家族(TNFRSF)的成员)结合，随后诱导T细胞共刺激和B细胞活化。当与CD27结合时，CD70可触发胞内信号传导和CD27切割。
CD70在高度活化的T细胞和B细胞、胸腺上皮细胞和一些树突细胞上表达。通过CD27结合进行的免疫细胞共刺激激活共刺激CD27/CD70途径，可促进增殖或凋亡。CD70在癌症发病机理中起作用。例如，CD70可增加肿瘤微环境中调控性T细胞(例如Treg)的频率和活化。在一些血液恶性肿瘤(例如，AML和MCL)中，CD70可与CD27共同过表达，从而导致自我信号传导，从而产生存活/增殖信号。可溶性CD27在许多AML患者中升高，并且可与更差的预后相联系。切割的CD27保持与CD70结合。CD70表达可与AML中的癌症“干性”相关并且可使患者结局恶化。
在生理条件下，CD70表达限于在高度活化的T细胞和B细胞、胸腺上皮细胞和一些树突细胞上瞬时表达，但在AML、DLBCL、RCC、MPM和许多其他癌症类型中上调。例如，CD70在38％至68％的肾透明细胞癌病例、30％至60％的肾乳头状细胞癌病例和表达CD70的原发性肿瘤中高度表达。在转移瘤中也可以发现C70的高表达。在多种癌细胞类型上CD70表达水平的升高使其成为肿瘤和血液免疫疗法有前景的靶标。靶向CD70可被用于治疗患有表达CD70的癌症的患者。
T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)。本公开涵盖编码TFP及其变体的重组核酸构建体，其中TFP包含与CD70(例如人CD70)特异性结合的结合结构域，例如抗原结合结构域，例如抗体或抗体片段、配体或配体结合蛋白，其中该结合结构域的序列与编码TCR亚基或其部分的核酸序列相邻并与之处于相同的阅读框中。本文提供的TFP可与一个或多个内源性(或者可替代地，一或多个外源性，或内源性与外源性组合)TCR亚基缔合以便形成功能性TCR复合物。本文所述与CD70特异性地结合的TFP可称为抗CD70 TFP或CD70.TFP。
本公开还涵盖不是抗CD70 TFP的组分的结合结构域，例如本文所述的抗CD70抗体或其片段。在一些实施方案中，该结合结构域仅包含本文所述的抗CD70抗体并且不与任何其他多肽融合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD70抗体或其片段是除TFP以外的融合蛋白，例如CAR或其他融合蛋白的组分。
本文提供的结合结构域可以是抗原结合结构域。该抗原结合结构域可以是抗CD70结合结构域。本文提供的结合结构域可以是与CD70结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体，诸如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)，以及起到抗原结合结构域作用的替代支架，诸如重组纤连蛋白结构域、anticalin、DARPIN等。同样，特异性识别并结合CD70的天然或合成配体可用作TFP的抗原结合结构域。在一些情况下，抗原结合结构域可以源自TFP将用于其中的相同物种。例如，对于在人类中使用，TFP的抗原结合结构域可以包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基。
在一个方面，抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个方面，抗原结合结构域是VHH。在一个方面，抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体。在一个方面，本文公开的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD70蛋白。
人源化抗体或抗体片段可保持与原始抗体相似的抗原特异性(例如，在本公开中，结合人CD70的能力)。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可具有改善的与CD70结合的亲和力和/或特异性。
在一个方面，抗原结合结构域包含人源化或人抗体或抗体片段，或骆驼抗体或抗体片段，或鼠抗体或抗体片段。TFP的抗原结合结构域可以包含本文所述的人源化或人抗CD70结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人源化或人抗CD70结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如人源化或人抗CD70结合结构域包含一个或多个(例如全部三个)LC CDR和一个或多个(例如全部三个)HC CDR。TFP的抗原结合结构域可以包含本文所述的人源化或人抗CD70结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。例如，TFP的抗原结合结构域可以包含一个HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。对于另一个示例，TFP的抗原结合结构域可以具有两个可变重链区，每个可变重链区包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。TFP的抗原结合结构域可包含本文所述的人源化或人轻链可变区和/或本文所述的人源化或人重链可变区。TFP的抗原结合结构域可包含本文所述的人源化重链可变区，例如至少两个本文所述的人源化或人重链可变区。TFP的抗原结合结构域可以是包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。TFP的抗原结合结构域可以是单结构域抗体，诸如包含重链可变区的VHH。TFP的抗原结合结构域(例如，scFv或VHH)可以包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含本文提供的重链可变区的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，TFP的抗原结合结构域是scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区经由接头，例如本文所述的接头附接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，TFP的抗原结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以处于例如以下取向中的任一种取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。在一些情况下，接头序列包含长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域经修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一个方面，抗原结合结构域是人源化的。
人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每一个通过引用整体并入本文)、饰面(veneering)或重修表面(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人，1994,PNAS,91:969-973，其每一个通过引用整体并入本文)、链改组(参见，例如美国专利号5,565,332，其通过引用整体并入本文)以及在例如以下文献中描述的技术：美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 9317105，Tan等人，J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas等人，Protein Eng.,13(5):353-60(2000),Morea等人，Methods,20(3):267-79(2000),Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska等人，Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto等人，Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto等人，Cancer Res.,55(8):1717-22(1995),Sandhu JS,Gene,150(2):409-10(1994)，及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其每一个通过引用整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供者抗体的相应残基取代以改变(例如改善)抗原结合。这些框架取代通过本领域公知的方法鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定特定位置处的罕见框架残基(参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；和Riechmann等人，1988,Nature,332:323，所述文献通过引用整体并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有一个或多个保留在其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。如本文所提供的，人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR和其中构成框架的氨基酸残基完全或主要源自人种系的框架区。用于抗体或抗体片段的人源化的多种技术是本领域公知的，并且基本上可以按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列(即，CDR移植)(EP 239,400；PCT公开第WO91/09967号；和美国专利第4,816,567号、第6,331,415号、第5,225,539号、第5,530,101号、第5,585,089号、第6,548,640号，其内容通过引用整体并入本文)来进行。在此类人源化抗体和抗体片段中，实质上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化还可通过饰面或重修表面(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6):805-814(1994)和Roguska等人，PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利第5,565,332号)来实现，所述文献的内容通过引用整体并入本文。
选择人可变结构域(轻和重可变结构域)用于制备人源化抗体是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳适配”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库，筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后，将最接近啮齿动物的人序列接受为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用整体并入本文)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(参见，例如，Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993)，所述文献的内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区，例如，所有四个框架区，源自VH4-4-59种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如，来自相应鼠序列的氨基酸。在一个实施方案中，框架区，例如，轻链可变区的所有四个框架区源自VK3-1.25种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如，来自相应鼠序列的氨基酸。
在一些方面，包含抗体片段的本公开的TFP组合物的部分被人源化，保留了对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本公开的一个方面，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。这样，可从受者和输入序列中选择和结合FR残基，从而获得所需抗体或抗体片段特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。一般来说，CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
在一个方面，抗原结合结构域(例如，抗CD70结合结构域)的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个方面，本公开的TFP组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性地结合人CD70。在一个方面，本公开涉及构成抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域与CD70蛋白或其片段特异性地结合，其中所述抗体或抗体片段包含可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链和/或可变重链包含本文提供的氨基酸序列。在某些方面，抗原结合结构域(例如，scFv或sdAb)与前导序列相邻并且与前导序列处于同一阅读框中。
本文还提供了用于获得对靶抗原(例如，CD70，或本文别处针对融合部分结合结构域的靶标所描述的任何靶抗原)具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括通过本文阐述的VH结构域的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的添加、缺失、取代或插入来提供作为该VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选地将这样提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，以及测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合以鉴定对目标靶抗原(例如，CD70)具有特异性并且任选地具有一种或多种所需特性的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。
在一些情况下，VHH结构域和scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。scFv分子可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起而产生。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果使用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则链内折叠被阻止。也可能需要链间折叠来使两个可变区结合在一起以形成功能性表位结合位点。在一些情况下，接头序列包含长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。接头取向和大小的示例，参见例如Hollinger等人，1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，美国专利号7,695,936，美国专利申请公布号20050100543和20050175606及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，所有这些通过引用并入本文。
scFv可在其VL与VH区之间包含约10个、11个、12个、13个、14个、15个或大于15个残基的接头。接头序列可包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复序列，诸如(G4S)n，其中n是等于或大于1的正整数。在一个实施方案中，接头可以是(G4S)4或(G4S)3。接头长度的变化可以保持或增强活性，从而在活性研究中产生了更高的功效。在一些情况下，接头序列包含长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
本文所述的抗原结合结构域可以是骆驼抗体或其结合片段。所述抗原结合结构域可以是鼠抗体或其结合片段。所述抗原结合结构域可以是人或人源化抗体或其结合片段。所述抗原结合结构域可以是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。所述抗原结合结构域可以是单结构域抗体(sdAb)。sdAb可以是VHH。
所述抗原结合结构域可以以至多约100、98、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、40、30、20、10、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001nM或更小的KD值与人CD70结合。在一些情况下，KD值可为约0.001nM至约100nM、约0.01nM至约10nM、约0.1nM至约10nM，或约0.1nM至约100nM。所述抗原结合结构域可能不与CD27竞争与CD70结合，可能不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者可能不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。所述抗原结合结构域可能与CD27竞争与CD70结合，可能抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者可能与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
所述抗原结合结构域包含含有互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3的可变结构域。所述抗原结合结构域的CDR1、CDR2和CDR3可选自由以下组成的组：
(i)包含X1X2FX3IX4RGX5的序列的CDR1；
包含AIX6TSGX7ATX8YA的序列的CDR2；和
包含CNMEX11X12X13YRX14YW的序列的CDR3；
(ii)包含X15X16X17X18X19YX20X21X22的序列的CDR1；
包含X23CX24X25SX26X27X28X29X30KYA的序列的CDR2；和
包含CX31AAX32PX33DDCSVX34GX35YGLNYW的序列的CDR3；
(iii)包含X36TFDAYAIG的序列的CDR1；
包含ICLSPSDGSTYYA的序列的CDR2；和
包含CAX37PSWCSLKADFGSW的序列的CDR3；
(iv)包含SIIRDNVMA的序列的CDR1；
包含AIINX38GGSX39NVD的序列的CDR2；和
包含CNVYYRX40LW的序列的CDR3；
(v)包含SIFSIARMN或FTLDYYAIA的序列的CDR1；
包含AILNRAGRTDYA的序列的CDR2；和
包含CNLQTISYHDFW的序列的CDR3；以及
(vi)包含SIFSATRME的序列的CDR1；
包含AIVTSGGRTNYA的序列的CDR2；和
包含CKFERYDYVNYW的序列的CDR3；
其中X1-X39是任何天然存在的氨基酸。
在一些情况下，X4是非极性氨基酸；X5是极性氨基酸；X6是非极性氨基酸；X11是极性氨基酸；X12是非极性氨基酸；X16是极性氨基酸；X18是带负电荷的氨基酸；X21是非极性氨基酸；X24是非极性氨基酸；X25是极性氨基酸；X29是非极性氨基酸；以及/或者X39是非极性氨基酸。
在一些情况下，CDR1包含X1X2FX3IX4RGX5的序列，其中X1是S或G；X2是I或T；X3是D或G；X4是V或A；并且X5是S或N；CDR2包含AIX6TSGX7ATX8YA的序列，其中X8是I或V；X9是G或D；并且X10是N或D；并且CDR3包含CNMEX11X12X13YRX14YW的序列，其中X11是S或T；X12是F、V或L；X13是R或S；并且X14为N或H。
在一些情况下，CDR1包含X15X16X17X18X19YX20X21X22的序列，其中X15是F、L或R；X16是T、S或N；X17是L、F或R；X18是D或E；X19是R、H、Y、K、N；X20是S、A或T；X21是I、V或M；并且X22是G或N；CDR2包含X23CX24X25SX26X27X28X29X30KYA的序列，其中X23是S、A、T或L；X24是I或V；X25是S或T；X26是S、K或N；X17是G或S；X28是G或D；X29是I、L或V；并且X30是P、T、I或V；并且CDR3包含CX31AAX32PX33DDCSVX34GX35YGLNYW的序列，其中X31是G、T或A；X32是T、G或D；X33是D、P、A或K；X34是P、A或H；并且X35是H或Y。
在一些情况下，CDR1包含X36TFDAYAIG的序列，其中X36是F或H；CDR2包含ICLSPSDGSTYYA的序列；并且CDR3包含CAX37PSWCSLKADFGSW的序列，其中X37是T或A；或者CDR1包含SIIRDNVMA的序列；CDR2包含AIINX38GGSX39NVD的序列，其中X38是T或I；并且X39是A或G；并且CDR3包含CNVYYRX40LW的序列，其中X40是D或G。
抗原结合结构域可以包含与SEQ ID NO:603-620或622-688中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、855、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的可变结构域。该可变结构域可以与SEQ ID NO:603-620或622-688中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、855、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性。该可变结构域可包含SEQ ID NO:603-620或622-688中任一者的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:605的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:611的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:613的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:620的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:618的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:603的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:615的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:608的序列。该可变结构域可包含SEQ ID NO:610的序列。
该抗原结合结构域可以包含：包含SEQ ID NO:87-104或107-172中任一者的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:259-276或279-344中任一者的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:431-448或451-516中任一者的序列的CDR3。该CDR1可以是SEQ ID NO:89，CDR2可以是SEQID NO:261且CDR3可以是SEQ ID NO:433。该CDR1可以是SEQ ID NO:95，CDR2可以是SEQ IDNO:267且CDR3可以是SEQ ID NO:439。该CDR1可以是SEQ ID NO:97，CDR2可以是SEQ ID NO:269且CDR3可以是SEQ ID NO:441。该CDR1可以是SEQ ID NO:104，CDR2可以是SEQ ID NO:276且CDR3可以是SEQ ID NO:448。该CDR1可以是SEQ ID NO:102，CDR2可以是SEQ ID NO:274且CDR3可以是SEQ ID NO:446。该CDR1可以是SEQ ID NO:87，CDR2可以是SEQ ID NO:259且CDR3可以是SEQ ID NO:431。该CDR1可以是SEQ ID NO:99，CDR2可以是SEQ ID NO:271且CDR3可以是SEQ ID NO:443。该CDR1可以是SEQ ID NO:92，CDR2可以是SEQ ID NO:264且CDR3可以是SEQ ID NO:436。该CDR1可以是SEQ ID NO:94，CDR2可以是SEQ ID NO:266且CDR3可以是SEQ ID NO:439。
该抗原结合结构域可以包含与SEQ ID NO:621具有至少60％、65％、70％、75％、80％、855、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的可变结构域。该可变结构域可以与SEQ ID NO:621具有至少60％、65％、70％、75％、80％、855、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。该可变结构域可包含SEQ ID NO:621的序列。该CDR1可以是SEQ ID NO:105，CDR2可以是SEQ ID NO:227且CDR3可以是SEQ ID NO:449。
在一些情况下，该抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。该scFv可包含与SEQID NO:783-835中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变(VH)结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
该scFv可包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。该VH结构域可包含具有SEQ ID NO:836-888中任一者的序列的重链互补决定区1(CDRH1)、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。该VL结构域可包含具有SEQ ID NO:1048-1100中任一者的序列的轻链互补决定区1(CDRL1)、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
该scFv可以包含与SEQ ID NO:800具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:800具有至少95％序列同一性的VH结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:800的序列的VH结构域。该scFv可以包含与SEQ ID NO:1012具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:1012具有至少95％序列同一性的VL结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:1012的序列的VL结构域。该VH结构域可包含具有SEQ ID NO:853的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:906的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:959的序列的CDRH3。该VL结构域可包含具有SEQ ID NO:1065的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1118的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1171的序列的CDRL3。
该scFv可以包含与SEQ ID NO:783具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:783具有至少95％序列同一性的VH结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:783的序列的VH结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:995具有至少90％序列同一性的VL结构域。该scFv可包含与SEQID NO:995具有至少95％序列同一性的VL结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:995的序列的VL结构域。该VH结构域可包含具有SEQ ID NO:836的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:889的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942的序列的CDRH3。该VL结构域可包含具有SEQ ID NO:1048的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1101的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154的序列的CDRL3。
该scFv可以包含与SEQ ID NO:784具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:784具有至少95％序列同一性的VH结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:784的序列的VH结构域。该scFv可以包含与SEQ ID NO:996具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域。该scFv可包含与SEQ ID NO:996具有至少95％序列同一性的VL结构域。该scFv可包含具有SEQ ID NO:996的序列的VL结构域。该VH结构域可包含具有SEQ ID NO:837的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:890的序列的CDRH2和具有SEQID NO:943的序列的CDRH3。该VL结构域可包含具有SEQ ID NO:1049的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1102的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1155的序列的CDRL3。
该scFv可包含接头序列。该接头序列可包含SEQ ID NO:782的序列。
稳定性和突变
抗CD70结合结构域(例如scFv或sdAb分子(例如，可溶性scFv或sdAb))的稳定性可参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理特性(例如，热稳定性)来评价。在一个实施方案中，人源化scFv或人scFv在所描述的测定中具有比亲本scFv高约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10摄氏度、约11摄氏度、约12摄氏度、约13摄氏度、约14摄氏度或约15摄氏度的热稳定性。
随后将抗CD70结合结构域(例如，scFv)的改善的热稳定性赋予给整个抗CD70 TFP构建体，从而导致抗CD70 TFP构建体的改善的治疗特性。与常规抗体相比，抗CD70结合结构域(例如scFv)的热稳定性可被提高至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规抗体相比，抗CD70结合结构域(例如，scFv)具有提高了1℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，抗CD70结合结构域(例如，scFv)具有提高了2℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，scFv具有提高了4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃的热稳定性。例如，可在本文公开的scFv分子与scFv VH和VL所源自的抗体的scFv分子或Fab片段之间进行比较。可使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一个实施例中，可测量TM。下面描述了测量TM的方法和确定蛋白质稳定性的其他方法。
抗原结合结构域诸如scFv或sdAb中的突变(通过可溶性scFv或sdAb的人源化或诱变产生)改变该抗原结合结构域的稳定性并提高该抗原结合结构域和抗CD70 TFP构建体的总体稳定性。可以使用诸如TM、温度变性和温度聚集的测量将人源化抗原结合结构域的稳定性与鼠抗原结合结构域进行比较。在一个实施方案中，抗原结合结构域，例如scFv或sdAb，可包含至少一个由人源化过程产生的突变，使得突变的抗原结合结构域赋予抗CD70TFP构建体提高的稳定性。在另一个实施方案中，抗CD70结合结构域，例如scFv或sdAb，包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个由人源化过程产生的突变，使得突变的抗原结合结构域赋予抗CD70 TFP构建体提高的稳定性。
在一个方面，TFP的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且该抗原结合结构域保留了本文所述的抗CD70抗体片段的所需功能特性。在一个具体方面，本发明的TFP组合物包含抗体片段。在进一步的方面，该抗体片段包含scFv或sdAb。
在各个方面，通过修饰一个或两个可变区(例如，VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸来对TFP的抗原结合结构域进行工程化。在一个特定方面，本公开的TFP组合物包含抗体片段。在进一步的方面，该抗体片段包含scFv或sdAb。
本领域普通技术人员将理解，本公开的抗体或抗体片段可被进一步修饰，使得它们的氨基酸序列(例如，来自野生型)发生改变，但是所需活性不改变。例如，可对蛋白质进行导致在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的另外的核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被相异在于侧链家族成员的顺序和/或组成的结构相似的串替代，例如，可进行其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的保守取代。
具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下的同一性百分比是指两个或更多个相同的序列。如果两个序列在比较窗口或指定区域上进行比较和对齐以获得最大一致性(如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的)时，具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域上，或者，当未指定时，在整个序列上，具有60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，则两个序列是“实质上同一的”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100个至500个或1000个或更多个核苷酸(或20个、50个、200个或更多个氨基酸)的区域上。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，也可以指定其可选的参数。然后序列比较算法基于所述程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman，(1970)Adv.Appl.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过手工比对和目视检查(参见，例如，Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)来进行。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个示例是分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402；和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中的BLAST和BLAST2.0算法。可通过国家生物技术信息中心公开获得用于进行BLAST分析的软件。用于使用核苷酸BLAST确定核苷酸序列同一性的算法参数可以使用匹配/错配评分为1、-2的评分参数，其中空位代价(gap cost)是线性的。启动比对的序列长度或BLAST算法中的字长可设定为28以进行序列比对。用于使用蛋白质BLAST确定肽序列同一性的算法参数可以使用评分参数与BLOSUM62矩阵来分配用于比对残基对的得分并确定总体比对得分，其中空位代价可具有11的存在罚分和1的延伸罚分。补偿序列的氨基酸组成的矩阵调整方法可以是条件性组成得分矩阵调整。启动比对的序列长度或BLAST算法中的字长可设定为6以进行序列比对。
在一个方面，本公开考虑了生成功能等效分子的起始抗体或片段(例如，scFv或VHH)氨基酸序列的修饰。例如，TFP中包含的结合结构域(例如，scFv或VHH)的VH或VL可被修饰成保留至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的与抗CD70结合结构域(例如，scFv或VHH)的起始VH或VL框架区的同一性。本公开考虑了整个TFP构建体的修饰，例如，TFP构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以生成功能等效分子。TFP构建体可以被修饰成保留起始TFP构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一些实施方案中，CD70结合剂包含与表5、表7、表8和表9中列出的序列中的任一序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD70结合剂包含表5、表7、表8和表9中列出的序列中的任一序列。
胞外结构域
胞外结构域可源自天然或重组来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可源自任何蛋白质，但尤其为膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，胞外结构域能够与跨膜结构域缔合。在本公开中特别有用的胞外结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β、γ或δ链，或CD3ε、CD3γ或CD3δ，或在替代实施方案中，CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的胞外区。在一些情况下，TCR胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，以及它们的具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TCR胞外结构域包含TCRα链、TCRβ链，TCRδ链或TCRγ链的胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，TCR胞外结构域包含TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ链的IgC结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含或至少包含TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ链的胞外结构域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞外结构域包含与编码TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ链的胞外结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的截短的TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ链的胞外结构域的序列。
在一些实施方案中，胞外结构域包含或至少包含TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的IgC结构域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞外结构域包含与编码TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的IgC结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的截短的TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的IgC结构域的序列。
在一些实施方案中，胞外结构域包含或至少包含CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞外结构域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞外结构域包含与编码CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞外结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的截短的CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞外结构域的序列。
跨膜结构域
一般来说，TFP序列包含由单个基因组序列编码的胞外结构域和跨膜结构域。在替代实施方案中，可将TFP设计为包含与TFP的胞外结构域异源的跨膜结构域。跨膜结构域可包含与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜结构域所源自的蛋白质的胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，胞外区的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞内区相关的一种或多种另外的氨基酸(例如，胞内区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸)。在一些情况下，跨膜结构域可包括胞外区的至少30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个氨基酸。在一些情况下，跨膜结构域可包含胞内区的至少30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个氨基酸。在一个方面，跨膜结构域是与所使用的TFP的其他结构域之一都还的跨膜结构域。在一些情况下，可通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜结构域能够与TFP-T细胞表面上的另一TFP同源二聚化。在不同的方面，可修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以使与存在于同一TFP中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可源自天然或重组来源。如果来源是天然的，则所述结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，每当TFP已与靶标结合时，跨膜结构域就能够向一个或多个胞内结构域传导信号。在一些情况下，TCR整合亚基包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，以及它们的具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含或至少包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的跨膜结构域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的跨膜结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的截短的TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的跨膜结构域的序列。
在一些情况下，跨膜结构域可经由铰链(例如，来自人蛋白的铰链)附接到TFP的胞外区(例如，TFP的抗原结合结构域)。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如，IgG4铰链或CD8a铰链。
接头
任选地，长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可在结合元件与TFP的TCR胞外结构域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。在一些情况下，接头的长度可以为至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个。例如，在一个方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:690)的氨基酸序列或序列(GGGGS(SEQ ID NO:1232))x，其中X为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更大。在一些实施方案中，X为2。在一些实施方案中，X为4。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGG TGGAGGTTCC(SEQ ID NO:691)的核苷酸序列编码。
胞质结构域
TFP的胞质结构域可包括胞内结构域。在一些实施方案中，该胞内结构域来自CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。在一些实施方案中，如果TFP含有CD3γ、δ或ε多肽，则该胞内结构域包含信号传导结构域；TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ亚基通常具有短的(例如，长度为1-19个氨基酸)胞内结构域并且通常缺乏信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责活化已向其中引入了TFP的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。虽然TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ的胞内结构域没有信号传导结构域，但它们能够募集具有本文所述的初级胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的蛋白质，该初级胞内信号传导结构域起到胞内信号传导结构域的作用。术语“效应子功能”是指细胞的专用功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专用功能的蛋白质的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，此类截短的部分可用来代替完整链，只要其传导效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以传导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本公开的TFP中的胞内结构域的示例包括能够协同作用以在抗原受体接合后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体(co-receptor)的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
在一些实施方案中，该胞内结构域包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域。
在一些实施方案中，该胞内结构域包含或至少包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的胞内结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，该胞内结构域包含与编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的胞内结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，该跨膜结构域包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的截短的TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的胞内结构域的序列。
在一些实施方案中，该胞内结构域包含或至少包含CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，该胞内结构域包含与编码CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，该胞内结构域包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的截短的CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域的序列。
已知由单独TCR产生的信号不足以完全活化原初T细胞，并且需要次级/共刺激信号。因此，原初T细胞活化可以被说成是由以下两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号传导结构域)和以不依赖于抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可包含信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
在本公开中特别有用的含ITAM的初级胞内信号传导结构域的示例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本公开的TFP包含胞内信号传导结构域，例如CD3ε、CD3δ或CD3γ的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域，例如，突变的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强的或减弱的)活性。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括经修饰的含ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，优化的和/或截短的含ITAM的初级胞内信号传导结构域。在实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
TFP的胞内信号传导结构域可以本身包含CD3信号传导结构域，例如CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ，或者可以与在本公开的TFP的背景下有用的任何一个或多个其他所需的胞内信号传导结构域组合在一起。例如，TFP的胞内信号传导结构域可包含CD3ε链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的TFP的部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的高效反应所必需的。此类分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体等。例如，CD27共刺激已被证明在体外增强人TFP-T细胞的扩增、效应子功能和存活，并在体内加强人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等人，Blood.2012；119(3):696-706)。
在一些实施方案中，TFP的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域源自TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ，并且胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域包含TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的恒定结构域。TFP可包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定结构域。TFP可包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定结构域的片段(例如，功能片段)。
本文所述的TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链可源自各种物种。TCR链可以是鼠或人TCR链。例如，TFP可包含鼠TCRα链、鼠TCRβ链、人TCRγ链或人TCRδ链的恒定结构域。
本公开的TFP的胞质部分内的胞内信号传导序列可以以随机或具体指定的顺序相互连接。任选地，例如长度为2至10个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可在胞内信号传导序列之间形成键联。
在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
在一个方面，本文所述的表达TFP的细胞还可包含第二TFP，例如包含例如针对相同靶标(例如，CD70)或不同靶标(例如，MSLN、CD19或MUC16)的不同抗原结合结构域的第二TFP。在一个实施方案中，当表达TFP的细胞包含两种或更多种不同的TFP时，不同TFP的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不会彼此相互作用。例如，表达第一TFP和第二TFP的细胞可具有第一TFP的抗原结合结构域，例如，作为片段(例如，scFv)，其不会与第二TFP的抗原结合结构域形成缔合，例如，第二TFP的抗原结合结构域为VHH。
在另一个方面，本文所述的表达TFP的细胞还可表达另一种剂，例如，增强经修饰的T细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如PD1，可降低经修饰的T细胞引发免疫效应物反应的能力。抑制性分子的示例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，所述剂包含：例如抑制性分子(诸如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT，或这些中任一者的片段(例如，这些中任一者的胞外结构域的至少一部分))的第一多肽；和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文所述)的胞内信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述剂包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓样细胞上表达(Agata等人，1996,Int.Immunol 8:765-75)。已经证明PD1的两种配体，PD-L1和PD-L2，在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人，2000J.Exp.Med.192:1027-34；Latchman等人，2001Nat.Immunol.2:261-8；Carter等人，2002Eur.J.Immunol.32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人，2003J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人，2005Cancer Immunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人，2004Clin.Cancer Res.10:5094)。免疫阻抑可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。
在一个实施方案中，所述剂包含抑制性分子的胞外结构域(ECD)，例如，程序性死亡蛋白1(PD1)可与跨膜结构域和任选的胞内信号传导结构域诸如41BB和CD3ζ融合(在本文中也称为PD1 TFP)。在一个实施方案中，PD1 TFP在与本文所述的抗CD70 TFP组合使用时，改善T细胞的持久性。在一个实施方案中，TFP是包含PD-1胞外结构域的PD1 TFP。可替代地，提供含有与程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性死亡配体2(PD-L2)特异性地结合的抗体或抗体片段(诸如scFv)的TFP。
在另一个方面，本公开提供了表达TFP的T细胞(例如，TFP-T细胞)群。在一些实施方案中，表达TFP的T细胞群包括表达不同TFP的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，TFP-T细胞群可包括表达具有本文所述的抗CD70结合结构域的TFP的第一细胞，和表达具有特异性地靶向不同抗原的结合结构域(例如本文所述的与第一细胞所表达的TFP中的抗CD70结合结构域不同的结合结构域)的TFP的第二细胞。作为另一个示例，表达TFP的细胞群可包括表达包括第一结合结构域(例如，如本文所述的结合结构域)的TFP的第一细胞和表达包括针对除第一细胞的结合结构域以外的靶标(例如，另一种肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域的TFP的第二细胞。
在另一个方面，本公开提供了细胞群，其中该群中的至少一种细胞表达具有本文所述的结构域的TFP，并且第二细胞表达另一种剂，例如增强经修饰的T细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。例如，在一些实施方案中，抑制性分子可以降低经修饰的T细胞引发免疫效应物反应的能力。抑制性分子的示例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一些实施方案中，所述剂是细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-15。在一些实施方案中，IL-15增加本文所述的T细胞的持久性。
编码TFP的重组核酸
在一些实施方案中，本文公开了编码本文公开的TFP的重组核酸。
在一些情况下，重组核酸还包含前导序列。在一些情况下，重组核酸还包含启动子序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码聚(A)尾的序列。在一些情况下，重组核酸还包含3’UTR序列。在一些情况下，该核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。非天然存在的核酸是本领域技术人员熟知的。在一些情况下，该核酸是体外转录的核酸。
本文公开了用于产生体外转录的编码TFP的RNA的方法。本公开还包括可被直接转染到细胞中的编码TFP的RNA构建体。用于生成用于转染的mRNA的方法可包括用特别设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚A，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和聚A尾(通常长度为50-2000个碱基)的构建体。如此产生的RNA可高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括TFP的序列。
在一个方面，抗CD70 TFP由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码抗CD70 TFP的mRNA引入T细胞中以产生TFP-T细胞。在一个实施方案中，可将体外转录的RNA TFP作为瞬时转染的形式引入细胞中。使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生RNA。可使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR将来自任何来源的目标DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本公开TFP。在一个实施方案中，用于PCR的DNA包含开放阅读框。DNA可来自生物体的基因组中天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可包括5’和/或3’非翻译区(UTR)的一些或全部。核酸可包含外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，用于PCR的DNA是包括5’和3’UTR的人核酸序列。可替代地DNA可以是在天然存在的生物体中不正常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因的部分的人工序列，所述基因的部分被连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA的部分可以来自单个生物体，也来自多个生物体。
将PCR用于产生用于mRNA的体外转录的模板，所述mRNA用于转染。进行PCR的方法在本领域是公知的。用于PCR的引物被设计成具有与被用作PCR的模板的DNA的区域实质上互补的区域。如本文中所用，“实质上互补的”是指这样的核苷酸序列，其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的，或者错配的。在用于PCR的退火条件下，实质上互补的序列能够与预期的DNA靶标退火或杂交。引物可被设计成与DNA模板的任何部分实质上互补。例如，引物可被设计成扩增通常在细胞中转录的核酸的部分(开放阅读框)(包括5’和3’UTR)。引物也可被设计成扩增编码特定的目标结构域的核酸的部分。在一个实施方案中，引物被设计成扩增人cDNA的编码区，包括5’和3’UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可通过本领域公知的合成方法产生。“正向引物”是指含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与在待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸实质上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链处于待扩增的DNA序列的5’的位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与在待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板实质上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链处于待扩增的DNA序列的3’的位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶都可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶可从多种来源商购获得。
还可使用具有提高稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。所述RNA优选具有5’和3’UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度介于1与3,000个核苷酸之间。待添加到编码区的5’和3’UTR序列的长度可通过不同的方法改变，该方法包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域的普通技术人员可以修改可以被用于在经转录的RNA转染后实现最佳翻译效率的5’和3’UTR长度。
5’和3’UTR可以是目标核酸的天然存在的内源5’和3’UTR。可替代地，可通过将UTR序列掺入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰来添加对于目标核酸不是内源的UTR序列。对于目标核酸不是内源的UTR序列的使用对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，可基于本领域公知的UTR的特性，选择或设计3’UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5’UTR可包含内源核酸的Kozak序列。可替代地，当通过如上所述的PCR添加对于目标核酸不是内源的5’UTR时，可通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA都需要它来实现高效翻译。在其他实施方案中，5'UTR可以是其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒的5’UTR。在其他实施方案中，各种核苷酸类似物可用于3’或5’UTR中以阻碍mRNA的外切核酸降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，应将转录启动子在待转录的序列上游连接至DNA模板。当将用作RNA聚合酶的启动子的序列添加到正向引物的5’末端时，将RNA聚合酶启动子在待转录的开放阅读框上游掺入PCR产物中。在一个优选实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个优选的实施方案中，mRNA具有位于5’末端上的帽和3’聚(A)尾，其决定了细胞中的核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性。在环状DNA模板(例如质粒DNA)上，RNA聚合酶产生长串联产物，该产物不适合在真核细胞中表达。在3’UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，该mRNA在真核细胞转染中是无效的，即使其在转录后被多聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可将转录物的3’末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
将聚A/T链段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞中获得的质粒DNA模板常常受到缺失和其他畸变的高度污染。这使得克隆过程不仅费力费时，而且常常不可靠。这就是为什么无需克隆就能构建具有聚A/T 3’链段的DNA模板的方法是非常理想的。
转录DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有聚T尾，诸如100个T的尾(大小可以是50-5000个T)的反向引物产生，或者在PCR之后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。聚(A)尾也为RNA提供了稳定性并且减少了它们的降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚(A)尾介于100至5000个腺苷之间。
可在体外转录后，借助于聚(A)聚合酶诸如大肠杆菌(E.coli)聚A聚合酶(E-PAP)进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一个实施方案中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸，引起RNA的翻译效率增加约两倍。另外，将不同的化学基团附接至3’末端可增加mRNA稳定性。这种附接可包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物掺入聚(A)尾中。ATP类似物可进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一个优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文所述的技术(Cougot，等人，Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski，等人，RNA,7:1468-95(2001)；Elango，等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))提供5’帽。
通过本文公开的方法产生的RNA也可包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列，该序列启动不依赖于帽的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的启始。可包括任何适于细胞电穿孔的溶质，该溶质可包含促进细胞渗透性和活力的因子，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用多种不同方法中的任一种方法将RNA引入靶细胞中，该方法为例如可商购获得的方法，包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或基因脉冲仪(Gene Pulser)II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物弹道粒子递送系统(biolistic particle delivery system)诸如“基因枪”(参见例如，Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。
关于制备和使用TFP T细胞的其他信息，参见美国专利号10,442,849、10,358,473、10,358,474和10,208,285，其各自通过引用并入本文。
编码TFP和TCR恒定结构域的重组核酸
在一些实施方案中，本文所述的CD70 TFP还可包含编码TCR恒定结构域的序列，其中该TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域、TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域、TCRγ恒定结构域、TCRδ恒定结构域或TCRγ恒定结构域和TCRδ恒定结构域。TCR亚基和抗体可以被操作性地连接。当所述TFP在T细胞中表达时，所述TFP可功能性地掺入到TCR复合物(例如，内源性TCR复合物)中。
恒定结构域可包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域。恒定结构域可包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定结构域。恒定结构域可包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定结构域的片段(例如，功能片段)。例如，恒定结构域可包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个氨基酸残基。编码TCR恒定结构域的序列还可编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的跨膜结构域和/或胞内区。编码TCR恒定结构域的序列可以编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定区。TCR链的恒定区可包含恒定结构域、跨膜结构域及胞内区。TCR链的恒定区也可以排除TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的跨膜结构域和胞内区。
本文所述的TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链可源自各种物种。TCR链可以是鼠或人TCR链。例如，恒定结构域可包含鼠或人TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域。
鼠TCRα恒定结构域可包含SEQ ID NO:1267的位置2-137。鼠TCRα恒定结构域可包含本文所述的恒定结构域序列的截短、添加或取代。例如，恒定结构域可包含本文所述的恒定结构域的截短型式，该截短型式具有SEQ ID NO:1267的位置2-137的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个氨基酸残基。例如，恒定结构域可包含具有SEQ ID NO:1267的位置2-137的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个另外的氨基酸残基的序列。例如，恒定结构域可包含具有SEQ ID NO:1267的位置2-137的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个氨基酸取代的序列。恒定结构域可包含SEQ ID NO:1267的位置2-137的序列或其片段。恒定结构域可包含SEQ IDNO:1267的位置2-137的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个修饰、突变或缺失。恒定结构域可包含SEQ ID NO:1267的位置2-137的序列的至多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰、突变或缺失。恒定结构域可包含与SEQ ID NO:1267的位置2-137的序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
鼠TCRβ恒定结构域可包含SEQ ID NO:1268的位置2-173。鼠TCRβ恒定结构域可包含本文所述的恒定结构域的序列的截短、添加或取代。例如，恒定结构域可包含本文所述的恒定结构域的截短型式，该截短型式具有SEQ ID NO:1268的位置2-173的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个氨基酸残基。例如，恒定结构域可包含具有SEQ ID NO:1268的位置2-173的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个另外的氨基酸残基的序列。例如，恒定结构域可包含具有SEQ ID NO:1268的位置2-173的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150个或更多个氨基酸取代的序列。恒定结构域可包含SEQ ID NO:1268的位置22-173的序列或其片段。恒定结构域可包含SEQID NO:1268的位置2-173的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个修饰、突变或缺失。恒定结构域可包含SEQ ID NO:1268的位置2-173的序列的至多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰、突变或缺失。恒定结构域可包含与SEQ ID NO:1268的位置2-173的序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
TCRγ恒定结构域可包含SEQ ID NO:721、其功能片段，以及它们的具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情况下，编码TCRγ恒定结构域的序列还编码TCRγ可变结构域，从而编码完整TCRγ结构域。完整TCRγ结构域可以是γ9或γ4。完整TCRγ结构域可包含SEQ ID NO:1269、其功能片段，以及它们的具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
TCRδ恒定结构域可包含SEQ ID NO:725、其功能片段，或它们的具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情况下，编码TCRδ恒定结构域的序列还编码TCRδ可变结构域，从而编码完整TCRδ结构域。完整TCRδ结构域可以是δ2或δ1。完整TCRδ恒定结构域可包含SEQ ID NO:1270、其功能片段，以及它们的具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些情况下，编码TCR恒定结构域的序列还可编码与编码TCR恒定结构域的序列操作性地连接的第二抗原结合结构域或配体结合结构域。
在一些实施方案中，TCRα和/或TCRβ恒定结构域与TFP一起在TRAC或TRBC已经被灭活的细胞中表达。在一些实施方案中，TCRγ和/或TCRδ恒定结构域与TFP一起在TRAC或TRBC已经被灭活的细胞中表达。
转换分子
在一些情况下，经修饰的T细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些情况下，所述抑制性分子包含：构成PD-1的至少一部分的第一多肽及包含共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。在一些实施方案中，当在T细胞中表达时，表达如本文所述的TFP和如本文所述的PD-1转换分子的T细胞可抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码如本文所述的TFP的第一序列和编码可增强表达如本文所述的TFP的经修饰的T细胞的活性的剂的第二核酸序列。在一些实施方案中，第二核酸序列被包含在单独的核酸序列中。在一些实施方案中，第二核酸序列与重组核酸分子被包含在同一核酸分子中。例如，在一个实施方案中，所述可增强经修饰的T细胞的活性的剂可以是PD-1多肽。在这些实施方案中，PD-1多肽可以经由该PD-1多肽的C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。例如，在另一个实施方案中，所述可增强经修饰的T细胞的活性的剂可以是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在该实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以经由该抗PD-1抗体或其抗原结合片段的C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。在一些实施方案中，PD-1多肽或抗PD-1抗体经由PD-1的跨膜结构域连接到共刺激多肽的胞内结构域。在一些实施方案中，该共刺激多肽选自由以下组成的组：OX40、CD2、CD27、CD5、ICAM-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD28、CD30、CD40、IL-15Ra、IL12R、IL18R、IL21R、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、CD226、FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在一些实施方案中，该共刺激肽是CD28。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码如本文所述的TFP的序列的重组核酸分子，其中该重组核酸分子还包含可增强表达如本文所述的TFP的经修饰的T细胞的活性的剂。在另一个方面，表达如本文所述的TFP的细胞还可表达另一种剂，例如，增强经修饰的T细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如PD-1可降低经修饰的T细胞引发免疫效应物反应的能力。抑制性分子的示例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160和2B4。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，如本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，所述剂包含：例如抑制性分子(诸如PD-1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT，或这些中任一者的片段(例如，这些中任一者的胞外结构域的至少一部分))的第一多肽；和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文所述)的胞内信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述剂包含PD-1或其片段(例如，PD-1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子还包含编码PD-1或其片段的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子还包含编码PD-1的胞外结构域的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子还可包含编码CD28或其片段的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码CD28的胞内结构域的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白包含连接到CD28胞内结构域的PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到胞内结构域。在一些实施方案中，所述剂包含与CD28的胞内信号传导结构域融合的PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，所述剂包含SEQ ID NO:1239。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓样细胞上表达(Agata等人，1996,Int.Immunol8:765-75)。已经证明PD1的两种配体，PD-L1和PD-L2，在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人，2000J.Exp.Med.192:1027-34；Latchman等人，2001Nat.Immunol.2:261-8；Carter等人，2002Eur.J.Immunol.32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人，2003J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人，2005Cancer Immunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人，2004Clin.Cancer Res.10:5094)。免疫阻抑可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。
在一个实施方案中，所述剂包含抑制性分子的胞外结构域(ECD)，例如，PD-1可与跨膜结构域和任选的胞内信号传导结构域诸如41BB和CD3ζ融合(在本文中也称为PD-1TFP)。在一个实施方案中，PD-1TFP在与本文所述的抗TAA TFP组合使用时，改善T细胞的持久性。在一个实施方案中，TFP是包含PD-1胞外结构域的PD-1TFP。可替代地，提供含有与程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性死亡配体2(PD-L2)特异性地结合的抗体或抗体片段(诸如scFv)的TFP。
在一个方面，本公开提供了细胞群，其中该群中的至少一种细胞表达具有本文所述的结构域的TFP，并且第二细胞表达另一种剂，例如增强经修饰的T细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。例如，在一些实施方案中，抑制性分子可以降低经修饰的T细胞引发免疫效应物反应的能力。抑制性分子的示例包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160和2B4。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。
编码转换分子的重组核酸
本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码如本文所述的转换分子的第二核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码抑制性分子的第二核酸序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码抑制性分子的第二核酸序列，所述抑制性分子包含构成PD-1的至少一部分的第一多肽和包含共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。在一些实施方案中，当在T细胞中表达时，表达如本文所述的TFP和如本文所述的PD-1转换分子的T细胞可抑制肿瘤生长。
IL-15和IL-15受体α多肽
在一些方面，本文所述的表达TFP的细胞还可表达另一种剂，例如，可增强本文所述的表达TFP的细胞的寿命或活性的剂。在一些实施方案中，所述剂是细胞因子，诸如在免疫细胞的维持和稳态扩增中起重要作用的多效性细胞因子。在一些实施方案中，多效性细胞因子在肿瘤微环境(TME)中的局部分泌可有助于增强抗肿瘤免疫。在一些实施方案中，所述剂活化细胞因子信号传导。在一些实施方案中，所述剂活化白细胞介素-15(IL-15)信号传导。在一些实施方案中，所述剂包含白细胞介素-15(IL-15)和/或白细胞介素-15受体(IL-15R)。在一些实施方案中，所述IL-15R是IL-15R alpha(IL-15Rα)亚基。
本公开涵盖编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的重组核酸分子。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段包含IL-15的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段包含与编码IL-15的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、个25或更多个氨基酸的截短的IL-15的序列。
在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含IL-15信号肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含IL-15的氨基酸1-29。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1245的氨基酸1-29。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含SEQ IDNO:1246的序列。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含IL-15的氨基酸30-162。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1245的氨基酸30-162。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含表11中列出的序列中的任一序列或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1242的序列。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1245的氨基酸1-162。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1246的序列和SEQ ID NO:1242的序列。在一些实施方案中，当IL-15多肽在细胞诸如T细胞中表达时，该IL-15多肽被分泌。
本公开还涵盖编码白细胞介素-15受体(IL-15R)亚基多肽或其片段的重组核酸分子。例如，IL-15R亚基可以是IL-15受体α链(“IL-15Rα”或CD215)、IL-2受体β链(“IL-2Rβ”或CD122)和IL-2受体γ/共有γ链(“IL-2Rγ/γc”或CD132)。在一些实施方案中，IL-15R亚基是IL-15Rα或其片段。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段包含IL-15Rα的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段包含与编码IL-15Rα的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段包含编码在N端或C端或在N端和C端二者处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸的截短的IL-15Rα的序列。
在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα信号肽。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα的氨基酸1-30。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1247的氨基酸1-30。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段不包含IL-15Rα信号肽。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段不包含IL-15Rα的氨基酸1-30。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段不包含SEQ ID NO:1247的氨基酸1-30。
在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15RαSushi结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα的氨基酸31-95。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1247的氨基酸31-95。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1250的序列。
在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα的胞内结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1248的序列。
在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15RαSushi结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα的氨基酸31-267。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1247的氨基酸31-267。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1250的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1251的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1247的氨基酸96-267。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1250的序列和SEQ ID NO:1251的序列。
在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可为可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含IL-15Rα的氨基酸21-205。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸21-205。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽或其片段可包含SEQ ID NO:1249的序列。
本公开涵盖编码融合蛋白的重组核酸分子，所述融合蛋白包含连接到IL-15R亚基的IL-15多肽。在一些实施方案中，IL-15和IL-15R亚基通过接头操作性地连接。在一些实施方案中，所述IL-15R亚基是IL-15R alpha(IL-15Rα)。例如，IL-15多肽可连接到IL-15Rα亚基的N端。例如，IL-15多肽可连接到IL-15Rα亚基的C端。在一些实施方案中，IL-15和IL-15Rα通过接头操作性地连接。在一些实施方案中，所述接头不是可切割接头。例如，所述接头可以包含含有(G4S)n的序列，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。在一些实施方案中，n是1至4的整数。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，所述接头包含SEQID NO:1243的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15的氨基酸30-162。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1245的序列的氨基酸30-162。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含表11中列出的序列中的任一序列或其片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1242的序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白不包含IL-15信号肽。在一些实施方案中，所述融合蛋白不包含IL-15的氨基酸1-29。在一些实施方案中，所述融合蛋白不包含SEQ ID NO:1245的序列的氨基酸1-29。在一些实施方案中，所述融合蛋白不包含SEQ ID NO:1246的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含Sushi结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的氨基酸31-95。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ IDNO:1247的序列的氨基酸31-95。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1250的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的胞内结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的氨基酸229-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸229-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQID NO:1248的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的氨基酸21-205。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸21-205。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1249的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的氨基酸96-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸96-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1251的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的Sushi结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含IL-15Rα的氨基酸31-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸31-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:1250的序列和SEQ ID NO:1251的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含表位标签。如本文所述的表位标签可以是肽表位标签或蛋白质表位标签。肽表位标签的示例包括但不限于6X His(也称为His-标签或六组氨酸标签)、FLAG(例如3X FLAG)、HA、Myc和V5。蛋白质表位标签的示例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、荧光素酶、麦芽糖结合蛋白(MBP)、红色荧光蛋白(RFP)和水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)。在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含FLAG标签。在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含3X FLAG标签。在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含SEQ ID NO:1255的序列。
Flag x3
DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK(SEQ ID NO:1255)
在一些实施方案中，当所述融合蛋白在T细胞中表达时，所述融合蛋白是在细胞表面上表达。在一些实施方案中，当所述融合蛋白在T细胞中表达时，所述融合蛋白被分泌。
在一些方面，表达本文所述的TFP、IL-15多肽或其片段、IL-15Rα多肽或其片段和/或包含IL-15多肽和IL-15Rα多肽的融合蛋白的细胞还可进一步表达可增强表达TFP的经修饰的T细胞的活性的另一种剂。例如，在一个实施方案中，所述可增强经修饰的T细胞的活性的剂可以是PD-1多肽。在这些实施方案中，PD-1多肽可以经由该PD-1多肽的C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。例如，在另一个实施方案中，所述可增强表达TFP的经修饰的T细胞的活性的剂可以是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在该实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以经由该抗PD-1抗体或其抗原结合片段的C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。在一些实施方案中，PD-1多肽或抗PD-1抗体经由PD-1的跨膜结构域连接到共刺激多肽的胞内结构域。在一些实施方案中，共刺激多肽选自由以下组成的组：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD28、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、CD226、FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在一些实施方案中，共刺激多肽是CD28。
在一些方面，所述可增强表达TFP的经修饰T细胞的活性的剂可连接到IL-15Rα多肽或其片段。例如，所述剂可以是可抑制抑制性分子的剂，所述抑制性分子可降低表达TFP的T细胞引发免疫效应物反应的能力。在一些实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，所述剂可包含：例如抑制性分子(诸如PD-1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT，或这些中任一者的片段(例如，这些中任一者的胞外结构域的至少一部分))的第一多肽；和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的4-1BB、CD27或CD28)的胞内信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的IL-15Rα)。在一些实施方案中，所述剂可以是PD-1或其片段。例如，所述剂可包含PD-1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述剂可包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，所述剂还可包含CD28或其片段。在一些实施方案中，所述剂可包含CD28的胞内结构域。在一些实施方案中，所述剂可包含融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到CD28胞内结构域的PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα。在一些实施方案中，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα的胞内结构域。
在一些实施方案中，PD-1或其片段可包含表10中列出的序列中的任一序列或其片段。在一些实施方案中，PD-1或其片段可包含SEQ ID NO:1256的序列。在一些实施方案中，PD-1或其片段可包含SEQ ID NO:1257的序列。在一些实施方案中，PD-1或其片段可包含SEQID NO:1258的序列。在一些实施方案中，PD-1或其片段可包含SEQ ID NO:1259的序列。在一些实施方案中，PD-1的跨膜结构域可包含SEQ ID NO:1239的序列。在一些实施方案中，CD28的胞内结构域可包含SEQ ID NO:1260的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含IL-15Rα的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸229-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1248的序列。
在一些方面，所述可增强表达TFP的经修饰的T细胞的活性的剂可连接到包含IL-15多肽和IL-15Rα多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，所述剂可以是PD-1或其片段。例如，所述剂可包含PD-1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述剂可包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，所述剂还可包含CD28或其片段。在一些实施方案中，所述剂可包含CD28的胞内结构域。在一些实施方案中，所述剂可包含融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到CD28胞内结构域的PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到包含IL-15多肽和IL-15Rα多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα的胞内结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域通过本文所述的接头连接到IL-15多肽。在一些实施方案中，该接头包含切割位点。该切割位点可以是自切割肽，诸如T2A、P2A、E2A或F2A切割位点。在一些实施方案中，该切割位点可包含SEQ ID NO:1261的序列(P2A：GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)。
在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含PD-1或它的包含表10中列出的序列中的任一序列或其片段的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含PD-1或它的包含SEQID NO:1256的序列的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含PD-1或它的包含SEQID NO:1257的序列的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含PD-1或它的包含SEQID NO:1258的序列的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含PD-1或它的包含SEQID NO:1259的序列的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含PD-1或PD-1的包含PD-1的跨膜结构域的片段，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:1239的序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含CD28，或包含CD28的胞内结构域的片段，所述胞内结构域包含SEQ IDNO:1260的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含IL-15Rα的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含SEQ ID NO:1247的序列的氨基酸229-267。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1248的序列。在一些实施方案中，IL-15多肽包含IL-15信号肽。在一些实施方案中，IL-15多肽包含IL-15的氨基酸1-29。在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:1245的序列的氨基酸1-29。在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:1246的序列。在一些实施方案中，IL-15多肽包含IL-15的氨基酸30-162。在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:1245的序列的氨基酸30-162。在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:1242的序列。
在一些实施方案中，本文公开了由本文所述的重组核酸分子中的任一种重组核酸分子编码的多肽。
编码IL-15和/或IL-15Rα的重组核酸
本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的第二核酸序列。本文公开了重组核酸分子，其包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的第二核酸序列。本文还公开了重组核酸分子，其包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码包含与IL-15Rα多肽或其片段连接的IL-15多肽或其片段的融合蛋白的第二核酸序列。本文进一步公开了重组核酸分子，其包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一核酸序列和编码包含有包含与PD-1或其片段和/或CD28或其片段连接的IL-15Rα多肽或其片段的融合蛋白的融合蛋白的第二核酸序列。
本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的第二核酸序列。包含编码本文所述的TFP的核酸序列的任何重组核酸分子还可包含编码IL-15多肽或其片段的第二核酸序列。本文进一步公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15Rα多肽或其片段的第二核酸序列。包含编码本文所述的TFP的核酸序列的任何重组核酸分子还可包含编码IL-15Rα多肽或其片段的第二核酸序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列通过第一接头操作性地连接。在一些实施方案中，本文进一步公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15Rα多肽或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。在一些实施方案中，本文进一步公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15Rα多肽或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列通过第一接头操作性地连接。例如，第一接头可以是可切割接头。在一些实施方案中，第一接头可以包含蛋白酶切割位点。该切割位点可以是自切割肽，例如2A切割位点诸如T2A、P2A、E2A或F2A切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是T2A切割位点。当该切割位点表达时，该切割位点可包含SEQ ID NO:1238的序列。在一些实施方案中，当该第一接头表达时，该第一接头包含SEQ IDNO:1238的序列。
在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15信号肽的序列。在一些实施方案中，当IL-15信号肽表达时，该IL-15信号肽包含SEQ ID NO:1245的氨基酸1-29。在一些实施方案中，当IL-15信号肽表达时，该IL-15信号肽包含SEQ ID NO:1246的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ IDNO:1245的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸1-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1246的序列和SEQ ID NO:1242的序列的序列。在一些实施方案中，当所述IL-15多肽或其片段在T细胞中表达时，所述IL-15多肽或其片段被分泌。在一些实施方案中，当所述IL-15多肽表达时，所述IL-15多肽包含SEQ ID NO:1242的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列及编码IL-15多肽或其片段和IL-15R亚基或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15多肽或其片段和IL-15R亚基或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列通过本文所述的第一接头操作性地连接。IL-15R亚基可以是IL-15R alpha(IL-15Rα)、IL-2Rβ(IL-2β)或IL-2Rγ/共同γ链(IL-2Rγ/γc)。在一些实施方案中，所述IL-15R亚基是IL-15R alpha(IL-15Rα)。在一些实施方案中，IL-15和IL-15R亚基通过第二接头操作性地连接。在一些实施方案中，IL-15和IL-15Rα通过第二接头操作性地连接。在一些实施方案中，第二接头不是可切割接头。例如，第二接头可以包含含有(G4S)n的序列，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。在一些实施方案中，n是1至4的整数。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，第二接头包含SEQ ID NO:1243的序列。
在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸229-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸229-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1248的序列的序列。
在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15RαSushi结构域的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸31-95的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸31-95的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1250的序列的序列。
在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的跨膜结构域和胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸96-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸96-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1251的序列的序列。
在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的Sushi结构域、跨膜结构域和胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸31-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸31-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1250的序列和SEQ ID NO:1251的序列的序列。
在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸21-205的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸21-205的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1249的序列的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码包含与IL-15Rα亚基连接的IL-15多肽的融合蛋白的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码包含与IL-15Rα亚基连接的IL-15多肽的融合蛋白的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列通过本文所述的第一接头操作性地连接。例如，IL-15多肽可连接到IL-15Rα亚基的N端。例如，IL-15多肽可连接到IL-15Rα亚基的C端。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQID NO:1246的序列的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸1-162的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸1-162的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1246的序列的序列和编码SEQ ID NO:1242的序列的序列。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸229-267的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ IDNO:1247的氨基酸229-267的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1248的序列的序列。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列还可包含编码IL-15RαSushi结构域的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸31-95的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸31-95的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1250的序列的序列。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的跨膜结构域和胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸96-267的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸96-267的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1251的序列的序列。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的Sushi结构域、跨膜结构域和胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸31-267的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1247的氨基酸31-267的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1250的序列和SEQ ID NO:1251的序列的序列。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码IL-15Rα的氨基酸21-205的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQID NO:1247的氨基酸21-205的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1249的序列的序列。
在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列还可包含编码表位标签的序列。如本文所述的表位标签可以是肽表位标签或蛋白质表位标签。肽表位标签的示例包括但不限于6X His(也称为His-标签或六组氨酸标签)、FLAG(例如3X FLAG)、HA、Myc和V5。蛋白质表位标签的示例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、荧光素酶、麦芽糖结合蛋白(MBP)、红色荧光蛋白(RFP)和水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列还包含编码FLAG标签的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列还包含编码3X FLAG标签的序列。在一些实施方案中，编码所述融合蛋白的核酸序列还包含编码SEQ ID NO:1255的序列的序列。
在一些实施方案中，当所述融合蛋白在T细胞中由本文所述的重组核酸分子表达时，所述融合蛋白是在细胞表面上表达。在一些实施方案中，当所述融合蛋白在T细胞中由本文所述的重组核酸分子表达时，所述融合蛋白被分泌出来。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列，编码IL-15多肽或其片段的第二核酸序列，及编码可增强表达TFP的经修饰的T细胞的活性的剂的第三核酸序列。在一些实施方案中，第三核酸序列被包含在单独的核酸序列中。在一些实施方案中，第三核酸序列与第一核酸序列或第二核酸序列，或第一和第二核酸序列被包含在同一核酸分子中。例如，在一个实施方案中，所述可增强经修饰的T细胞的活性的剂可以是PD-1多肽。在这些实施方案中，PD-1多肽可以经由该PD-1多肽的C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。例如，在另一个实施方案中，所述可增强经修饰的T细胞的活性的剂可以是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在该实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以经由该抗PD-1抗体或其抗原结合片段的C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。在一些实施方案中，PD-1多肽或抗PD-1抗体经由PD-1的跨膜结构域连接到共刺激多肽的胞内结构域。在一些实施方案中，共刺激多肽选自由以下组成的组：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD28、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、CD226、FcγRI、FcγRII和FcγRIII。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列和编码IL-15Rα多肽或其片段的第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列通过本文所述的第一接头操作性地连接，并且其中第二核酸序列还编码可增强表达TFP的经修饰的T细胞的活性的剂。例如，所述剂可以是可抑制抑制性分子的剂，所述抑制性分子可降低表达TFP的T细胞引发免疫效应物反应的能力。在一些实施方案中，所述抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，所述剂可包含：例如抑制性分子(诸如PD-1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT，或这些中任一者的片段(例如，这些中任一者的胞外结构域的至少一部分))的第一多肽；和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的4-1BB、CD27或CD28)的胞内信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的IL-15Rα)。在一些实施方案中，第二核酸序列还包含编码PD-1或其片段的序列。在一些实施方案中，第二核酸序列包含编码PD-1的胞外结构域的序列。在一些实施方案中，第二核酸序列包含编码PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，第二核酸序列还可包含编码CD28或其片段的序列。在一些实施方案中，第二核酸序列包含编码CD28的胞内结构域的序列。在一些实施方案中，第二核酸序列包含编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白包含连接到CD28胞内结构域的PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα。在一些实施方案中，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα的胞内结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含IL-15Rα的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含SEQ ID NO:1247的氨基酸229-267。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含SEQ ID NO:1248的序列。
在一些实施方案中，编码PD-1或其片段的第二核酸序列可包含编码表10中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1或其片段的第二核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1256的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1或其片段的第二核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1257的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1或其片段的第二核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1258的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1或其片段的第二核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1259的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1的跨膜结构域的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1239的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码CD28的胞内结构域的核酸序列可包含编码SEQID NO:1260的序列的核酸序列。在一些实施方案中，IL-15Rα的胞内结构域包含IL-15Rα的氨基酸229-267。在一些实施方案中，编码IL-15Rα的胞内结构域的核酸包含编码SEQ IDNO:1247的氨基酸229-267的核酸。在一些实施方案中，编码IL-15Rα的胞内结构域的核酸包含编码SEQ ID NO:1248的序列的核酸。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的第一核酸序列，编码IL-15Rα多肽或其片段和可增强表达本文所述的TFP的经修饰的T细胞活性的剂的第二核酸序列，以及编码IL-15多肽或其片段的第三核酸序列。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列被包含在两个单独的核酸序列中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列被包含在单个核酸序列中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列通过本文所述的第一接头操作性地连接。在一些实施方案中，第三核酸序列被包含在单独的核酸序列中。在一些实施方案中，第三核酸序列与第一核酸序列或第二核酸序列，或第一和第二核酸序列被包含在同一核酸分子中。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1246的序列的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的序列。在一些实施方案中，当所述IL-15多肽在T细胞中表达时，所述IL-15多肽被分泌。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸1-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1245的氨基酸1-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的第三核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1246的序列和SEQ ID NO:1242的序列的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的核酸序列、编码PD-1多肽或其片段的核酸序列、编码CD28多肽或其片段的核酸序列、编码本文所述的IL-15Rα或其片段的核酸序列，和编码本文所述的IL-15多肽或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CSF2RA信号肽的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1234的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CD3ε的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1235的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1信号肽的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码表10中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1256的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1N-环的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1257的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1IgV的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1258的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1茎的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1259的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1239的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码CD28多肽或其片段的核酸序列包含编码CD28胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ IDNO:1260的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15Rα的氨基酸229-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1248的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1246的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列和编码PD-1多肽或其片段的核酸序列通过T2A接头操作性地连接。在一些实施方案中，T2A接头可包含SEQ ID NO:1238的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα或其片段的核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的核酸序列通过P2A接头操作性地连接。在一些实施方案中，P2A接头可包含SEQ ID NO:1261的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的核酸序列，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列，编码CD28多肽或其片段的核酸序列，和编码本文所述的IL-15Rα或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CSF2RA信号肽的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1234的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CD3ε的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1235的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1信号肽的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码表10中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ IDNO:1256的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1N-环的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQID NO:1257的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1IgV的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1258的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1茎的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1259的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码PD-1跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1239的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码CD28多肽或其片段的核酸序列包含编码CD28胞内结构域的序列。在一些实施方案中，编码PD-1多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1260的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15Rα的氨基酸229-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1248的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列和编码PD-1多肽或其片段的核酸序列通过T2A接头操作性地连接。在一些实施方案中，T2A接头可包含SEQ ID NO:1238的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的核酸序列、编码本文所述的IL-15多肽或其片段的核酸序列，和编码本文所述的IL-15Rα或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CSF2RA信号肽的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1234的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CD3ε的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1235的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1246的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15Rα的氨基酸21-205的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1249的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的核酸序列通过T2A接头操作性地连接。在一些实施方案中，T2A接头可包含SEQ ID NO:1238的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列和编码IL-15Rα或其片段的核酸序列通过不可切割的接头操作性地连接。在一些实施方案中，不可切割的接头可包含SEQ ID NO:1243的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的核酸序列和编码本文所述的IL-15多肽或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CSF2RA信号肽的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1234的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CD3ε的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1235的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ IDNO:1246的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的核酸序列通过T2A接头操作性地连接。在一些实施方案中，T2A接头可包含SEQ ID NO:1238的序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组核酸分子，其包含编码本文所述的TFP的核酸序列、编码本文所述的IL-15多肽或其片段的核酸序列，和编码本文所述的IL-15Rα或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CSF2RA信号肽的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1234的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码CD3ε的序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1235的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15的氨基酸1-29的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列包含编码SEQ ID NO:1246的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码IL-15的氨基酸30-162的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码表11中列出的序列中的任一序列或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1242的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15Rα的氨基酸31-95的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1250的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列包含编码IL-15Rα的氨基酸96-267的序列。在一些实施方案中，编码IL-15Rα多肽或其片段的核酸序列可包含编码SEQ ID NO:1251的序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码TFP的核酸序列和编码IL-15多肽或其片段的核酸序列通过T2A接头操作性地连接。在一些实施方案中，T2A接头可包含SEQ ID NO:1238的序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽或其片段的核酸序列和编码IL-15Rα或其片段的核酸序列通过不可切割的接头操作性地连接。在一些实施方案中，不可切割的接头可包含SEQ IDNO:1243的序列。
在一些实施方案中，本文所述的重组核酸分子还包含前导序列。在一些实施方案中，该重组核酸分子选自由DNA和RNA组成的组。在一些实施方案中，该重组核酸分子是mRNA。在一些实施方案中，该重组核酸分子是环状RNA。在一些实施方案中，该重组核酸分子包含核酸类似物。在一些实施方案中，该核酸类似物不在重组核酸的编码序列中。在一些实施方案中，所述核酸类似物选自由2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的核酸，锁核酸(LNA)，乙烯核酸(ENA)，肽核酸(PNA)，1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)，吗啉代核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸和2'-氟代N3-P5’-亚磷酰胺组成的组。在一些实施方案中，该重组核酸分子还包含前导序列。在一些实施方案中，该重组核酸分子还包含启动子序列。在一些实施方案中，该重组核酸分子还包含编码聚(A)尾的序列。在一些实施方案中，该重组核酸分子还包含3’UTR序列。在一些实施方案中，该重组核酸分子是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些实施方案中，该核酸是体外转录的核酸。
本公开还提供了一种载体，该载体包含编码本文所述的TFP、本文所述的IL-15多肽或片段和/或本文所述的IL-15Rα多肽或片段的核酸分子。在一个方面，编码本文所述的TFP、本文所述的IL-15多肽或片段和/或本文所述的IL-15Rα多肽或片段的载体可被直接转导至细胞，例如T细胞中。在一个方面，所述载体是克隆性载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆性载体、微环、微载体、双微染色体(doubleminute chromosomes))、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，所述载体能够在哺乳动物T细胞中表达TFP构建体、IL-15构建体和/或IL-15Rα构建体。在一个方面，所述哺乳动物T细胞是人T细胞。
在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码与表12中列出的氨基酸序列中的任一氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码表12中列出的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列中的任一氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，如本文所述的重组核酸分子包含编码选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的序列。
载体
在一些实施方案中，本发明提供了载体，所述载体包含编码TFP和/或另外的目标分子(例如由TFP T细胞分泌的一种或多种蛋白质)的一种或多种重组核酸。在一些情况下，所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。在一些情况下，所述载体是AAV6载体。在一些情况下，所述载体还包含启动子。在一些情况下，所述载体是体外转录的载体。
编码所需分子的核酸序列可使用本领域已知的重组方法获得，例如，通过筛选来自表达该基因的细胞的文库，通过从已知包含该基因的载体中获得该基因，或者通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离。可替代地，可通过合成而非克隆来产生目标基因。
本公开还提供了其中插入了本公开的DNA的载体。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源自肿瘤逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体具有额外优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有免疫原性低的额外优势。
在另一个实施方案中，包含编码本公开的所需TFP的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码TFP的核酸的表达可使用转座子诸如sleepingbeauty、crisper、CAS9和锌指核酸酶来完成。参见例如，June等人，2009Nature ReviewsImmunology 9.10:704-716，其通过引用并入本文。
本发明的TFP可被用于多顺反子载体或在同一转录单元中表达几种蛋白的载体中。此类载体可以使用内部核糖体进入位点(IRES)。由于IRES在所有宿主中都不具有功能并且不允许多种蛋白的化学计量表达，因此可以改为使用自切割肽。例如，几种病毒肽在翻译期间被切割并允许多种蛋白从单个转录单元表达。此类肽包括来自微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)成员的2A肽或2A样序列。参见例如Szymczak等人，2004,NatureBiotechnology；22:589-594。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸编码与所述剂一起在框内的TFP，其中该两个序列被自切割肽(诸如2A序列或T2A序列)分开。
还可使用标准的基因递送方案将本公开的表达构建体用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其中的每一篇均通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，本公开提供了基因疗法载体。
可将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
另外，还可以以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且在例如Sambrook等人，2012，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起始位点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个可选择标志物(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并在体内或离体地将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如，增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管许多启动子也显示出在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，可将启动子元件之间的间隔增加至相隔50bp，然后活性开始下降。根据启动子的不同，似乎单个元件可以协同或独立地活化转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达TFP转基因的启动子的示例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基表达，所述亚基负责氨酰基tRNA向核糖体的酶促递送。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒中，并已被证明能有效地驱动从克隆到慢病毒载体中的转基因表达TFP(参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一个示例是早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本公开不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本公开的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其在需要这种表达时，能够开启与其有可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时，关闭该表达。诱导型启动子的示例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。
为了评估TFP多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可包含可选择标志物基因或报告基因或这两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可在单独的DNA片段上携带可选择标志物并将其用于共转染程序。可选择标志物基因和报告基因两侧都可具有适当的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因用于鉴定潜在地转染的细胞和用于评估调控序列的功能性。一般而言，报告基因是受者生物体或组织中不存在或不由其表达的基因，其编码其表达表现为一些可易于检测的性质(例如，酶促活性)的多肽。在将DNA引入受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。一般而言，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可与报告基因连接，并用于评估剂的调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞并表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情况下，载体可通过本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、微粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见，例如，Sambrook等人，2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，ColdSpring Harbor Press,NY)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I型、腺病毒和腺相关病毒等(参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术水平的核酸靶向递送的其他方法也是可用的，诸如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。设想了使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，可将核酸与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可被包封在脂质体的含水内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都缔合的连接分子附接至脂质体上，被包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液被包含在脂质中，被包含在胶束中或与胶束复合，或者以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，如胶束，或具有“塌陷的”结构。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪族烃及其衍生物诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类。
适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,Mo.获得；磷酸联十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的原液可在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体可被表征为具有拥有磷脂双层膜和内部含水介质的囊泡结构。多层脂质体具有被含水介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物也被涵盖在内。例如，脂质可能呈现胶束结构，或者仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体而存在。还设想了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的鉴定属于本发明范围内的剂的测定。
本公开还提供了包含编码TFP的核酸分子的载体。在一个方面，可将TFP载体直接转导到细胞(例如，T细胞)中。在一个方面，所述载体是克隆性载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆性载体、微环、微载体、双微染色体(doubleminute chromosomes))、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达TFP构建体。在一个方面，所述哺乳动物T细胞是人T细胞。
在一些实施方案中，TFP构建体位于还含有编码IL-15肽或IL15-Rα肽的序列的载体中。IL-15可以在相同的开放阅读框中编码并由自切割肽(例如，P2A或T2A自切割肽)分开。在一些实施方案中，IL-15肽包括分泌型IL-15。分泌型IL-15可具有SEQ ID NO:1242的序列。在一些实施方案中，IL-15肽是IL-15-IL15Rα融合体。在一些实施方案中，IL-15Rα包含SEQ ID NO:1251或SEQ ID NO:1247的序列。在一些实施方案中，IL-15-IL15Rα融合体包含接头，随后是连接IL-15和IL-15Rα的sushi结构域。在一些实施方案中，IL-15-IL15Rα融合体包含SEQ ID NO:1253的序列。在一些实施方案中，IL-15Rα肽包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。PD-1的胞外结构域和跨膜结构域可以与CD28的胞内结构域融合。IL-15Rα肽还可包含融合到CD28的C端(例如，CD28胞内结构域)的IL-15Rα胞内结构域。在一些实施方案中，PD-1-CD28-IL-15Rα融合体包含SEQ ID NO:1254的序列。在一些实施方案中，载体还含有编码PD-1-CD28融合蛋白的序列。所述融合蛋白可以具有PD-1的跨膜结构域。在某些实施方案中，PD-1-CD28融合蛋白包含SEQ ID NO:1244的序列。
环状RNA
在一些实施方案中，用RNA分子转导TFP T细胞。在一些实施方案中，所述RNA是环状RNA。在一些实施方案中，所述环状RNA是外源性的。在其他实施方案中，所述环状RNA是内源性的。在其他实施方案中，具有内部核糖体进入位点(IRES)的环状RNA可以在体外或在体内或离体被翻译。
环状RNA是一类具有连续结构的单链RNA，其具有增强的稳定性并且缺乏与各种细胞蛋白相互作用所必需的末端基序。环状RNA是3-5'共价闭合的RNA环，并且环状RNA不显示Cap或聚(A)尾。由于环状RNA缺乏核酸外切酶介导的降解所必需的游离末端，这致使它们对RNA周转的几种机制具有抗性，并且使它们与它们的线性mRNA对应物相比，具有延长的寿命。出于这个原因，环化可以使通常具有短半衰期的mRNA稳定化并且因此可以提高mRNA在各种应用中的总体功效。环状RNA通过剪接过程产生，并且环化主要在注释的外显子边界处使用常规剪接位点发生(Starke等人，2015；Szabo等人，2015)。对于环化，反向使用剪接位点：下游剪接供体“反剪接”到上游剪接受体(参见Jeck和Sharpless,2014；Barrett和Salzman,2016；Szabo和Salzman,2016；Holdt等人，2018中的综述)。
为了生成可以随后转移到细胞中的环状RNA，可以对具有自催化剪接内含子的环状RNA的体外产生进行编程。用于生成环状RNA的方法可涉及用专门设计的引物对前体线性RNA模板进行体外转录(IVT)。迄今为止已经报道了用于RNA环化的三种通用策略：使用溴化氰或类似缩合剂的化学方法、使用RNA或DNA连接酶的酶促方法和使用自剪接内含子的核酶方法。在优选的实施方案中，通过失控转录(run-off transcription)合成前体RNA，然后将其在镁离子和GTP的存在下加热以促进环化。如此产生的RNA可高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括TFP、CAR和TCR或其组合的序列。
噬菌体T4胸苷酸合酶(td)基因的I组内含子经充分表征为环化，而外显子线性剪接在一起(Chandry和Bel-fort，1987；Ford和Ares，1994；Perriman和Ares，1998)。当td内含子顺序排列在任何外显子序列两侧时，外显子经由两个自催化酯交换反应环化(Ford和Ares，1994；Puttaraju和Been，1995)。在优选的实施方案中，噬菌体T4胸苷酸合酶(td)基因的I组内含子被用于生成外源环状RNA。
在一些示例性的实施方案中，已经使用了利用排列的I组催化内含子的核酶方法，因为它更适用于长RNA环化，并且仅需添加GTP和Mg2+作为辅因子。这种排列的内含子-外显子(PIE)剪接策略由侧接有半内含子序列的融合部分外显子组成。在体外，这些构建体经历I组催化内含子特有的双重酯交换反应，但是因为外显子是融合的，所以它们作为共价5'至3'连接的环被切除。
在一个方面，本文公开了一种序列，其含有全长脑心肌炎病毒(诸如EMCV)IRES，编码TFP、CAR、TCR或它们的组合的基因，对应于外显子片段(E1和E2)的两个短区，以及在T4噬菌体的胸苷酸合酶(Td)基因中的排列的I组催化内含子或在鱼腥藻(Anabaena)的前tRNA基因中的排列的I组催化内含子的3′和5′内含子之间的PIE构建体。在更优选的实施方案中，所提到的序列还包含互补‘同源臂’，该互补同源臂被放置于前体RNA的5′和3′末端，目的是使5′和3′剪接位点彼此靠近。为了确保主要剪接产物是环状的，可以用RNA酶R处理剪接反应。
在一个方面，抗CD70 TFP是由环状RNA编码的。在一个方面，将编码抗CD70 TFP的环状RNA引入到T细胞中以产生TFP-T细胞。在一个实施方案中，可将体外转录的RNA TFP作为瞬时转染的形式引入细胞中。
在一些方面，如本文所述的那样使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生线性前体RNA。
关于通过上述方法产生的TFP T细胞的另外的信息，参见共同未决的临时申请序列号62/836,977，其通过引用并入本文。
经修饰的T细胞
本文公开了经修饰的T细胞，其包含编码本文公开的核酸的TFP的序列或由本文公开的核酸的序列编码的TFP。在一些实施方案中，本文还公开了经修饰的同种异体T细胞，其包含编码本文公开的TFP的序列或由本文公开的核酸的序列所编码的TFP。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸或本文公开的载体的经修饰的T细胞包含内源TCR的功能性破坏。在一些实施方案中，本文还公开了经修饰的同种异体T细胞，其包含编码本文公开的TFP的序列或由本文公开的核酸的序列所编码的TFP。
在一些情况下，T细胞还包含编码TCR恒定结构域的异源序列，其中TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域。在一些情况下，被功能性地破坏的内源TCR是内源TCRα链、内源TCRβ链或内源TCRα链和内源TCRβ链。在某些情况下，T细胞还包含编码TCR恒定结构域的异源序列，其中所述TCR恒定结构域是TCRγ恒定结构域、TCRδ恒定结构域或TCRγ恒定结构域和TCRδ恒定结构域。在一些情况下，受功能性地破坏的内源TCR是内源TCRγ链、内源TCRδ链，或内源TCRγ链和内源TCRδ链。在一些情况下，与未经修饰的对照T细胞相比，被功能性地破坏的内源TCR与MHC-肽复合物的结合减少。在一些情况下，功能性破坏是编码内源TCR的基因的破坏。在一些情况下，编码内源TCR的基因的破坏是从T细胞的基因组中去除编码内源TCR的基因序列。在一些情况下，T细胞是人T细胞。在一些情况下，T细胞是CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。在一些情况下，T细胞是同种异体T细胞。在一些情况下，T细胞是TCRα-βT细胞。在一些情况下，T细胞是TCRγ-δT细胞。在一些情况下，TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ中的一者或多者已被修饰成产生同种异体T细胞。参见，例如共同未决的PCT公布号WO2019173693，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，经修饰的T细胞是γδT细胞并且不包含内源TCR的功能性破坏。在一些实施方案中，所述γδT细胞是Vδ1+Vδ2-γδT细胞。在一些实施方案中，所述γδT细胞是Vδ1-Vδ2+γδT细胞。在一些实施方案中，所述γδT细胞是Vδ1-Vδ2-γδT细胞。
在一些情况下，经修饰的T细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些情况下，抑制性分子包含构成PD1的至少一部分的第一多肽和包含共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的重组核酸、本文公开的多肽或本文公开的载体的细胞，其中细胞包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列。在一些实施方案中，当所述IL-15多肽或其片段在细胞中表达时，所述IL-15多肽或其片段被分泌。例如，本文公开的细胞可响应于细胞活化剂分泌由本文公开的重组核酸分子表达的IL-15多肽。在一些实施方案中，IL-15信号传导响应于细胞活化剂而增加。在一些实施方案中，所述细胞活化剂包括T细胞活化剂。如本文所述的T细胞活化剂可包括但不限于抗CD3抗体或其片段、抗CD28抗体或其片段、细胞因子、结合本文所述的TFP的抗原结合结构域的抗原，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞，所述细胞与不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞相比，可具有增强的存活率、增强的效应子功能和/或增强的细胞毒性。在一些实施方案中，所述细胞与不具有IL-15信号传导的细胞相比，具有增强的存活率。在一些实施方案中，所述细胞与不表达IL-15多肽或其片段和/或IL-15Rα多肽或其片段的细胞相比，具有增强的存活率。在一些实施方案中，所述细胞与不具有IL-15信号传导的细胞相比，具有增强的效应子功能。在一些实施方案中，所述细胞与不表达IL-15多肽或其片段和/或IL-15Rα多肽或其片段的细胞相比，具有增强的效应子功能。在一些实施方案中，所述细胞与不具有IL-15信号传导的细胞相比，具有增强的细胞毒性。在一些实施方案中，所述细胞与不表达IL-15多肽或其片段和/或IL-15Rα多肽或其片段的细胞相比，具有增强的细胞毒性。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞，所述细胞与不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞相比，可具有增加的寿命。在一些实施方案中，所述细胞的寿命与不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞相比增加。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞，所述细胞与不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞相比，可具有增加的持久性。在一些实施方案中，所述细胞的持久性与不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞相比增加。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞，所述细胞与不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞相比，可具有增加的细胞毒性。在一些实施方案中，所述细胞的细胞毒性与不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞相比增加。
在一些实施方案中，本文公开了包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞，所述细胞与不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞相比，可具有增加的细胞因子产生。在一些实施方案中，所述细胞的细胞因子产生与不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞相比增加。
在一些实施方案中，本文公开的细胞保留原初和/或中枢记忆表型。在一些实施方案中，本文公开的细胞尚未分化成终末效应细胞。
在一些实施方案中，本文公开了包含本文所述的细胞中的任一种细胞的细胞群。在一些实施方案中，本文公开了包含本文所述的细胞中的任一种细胞的细胞群，其中所述细胞群相对于不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞群，具有增大的比例的具有中枢记忆表型的细胞。在一些实施方案中，所述细胞群相对于不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞群，具有增大的比例的具有中枢记忆表型的细胞。
在一些实施方案中，本文公开了包含本文所述的细胞中的任一种细胞的细胞群，其中所述细胞群相对于不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞群，具有增大的比例的具有原初表型的细胞。在一些实施方案中，所述细胞群相对于不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞群，具有增大的比例的的具有原初表型的细胞。
在一些实施方案中，本文公开了包含本文所述的细胞中的任一种细胞的细胞群，其中所述细胞群相对于不包含编码本文公开的TFP、本文公开的IL-15多肽或片段和/或本文公开的IL-15Rα多肽或片段的序列的细胞群，具有减小的比例的具有终末效应表型的细胞。在一些实施方案中，所述细胞群相对于不包含(i)编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的核酸序列或(ii)编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的核酸序列的细胞群，具有减小的比例的具有终末效应表型的细胞。
T细胞的来源
在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”旨在包括其中能够引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的示例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，所述来源包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，T细胞可以从白细胞单采物(leukopak)获得。在本公开的某些方面，可使用本领域中可用的任何数量的T细胞系。在本公开的某些方面，可使用本领域技术人员已知的多种技术，诸如FicollTM分离，由从受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个优选方面，通过血液单采获得来自个体循环血液的细胞。血液单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过血液单采收集的细胞以去除血浆级分，并将细胞置于适当缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在本公开的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在另一方面，洗涤溶液缺乏钙，并且可以缺乏镁，或者可以缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在钙不存在的情况下，初始活化步骤会导致更大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，诸如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，
Figure BDA0004038419630001521
2991细胞处理器、Baxter OncologyCytoMate或
Figure BDA0004038419630001526
5)来完成。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容的缓冲液中，例如，不含钙、不含镁的PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含缓冲剂的盐溶液。可替代地，可以除去血液单采样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在实施方案中，所述T细胞是αβT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是γδT细胞。γδT细胞获自例如脐带血、外周血、人胚胎干细胞或诱导多能干细胞库。
在一个方面，通过裂解红血细胞并耗竭单核细胞，例如通过经过
Figure BDA0004038419630001524
梯度离心或通过对流离心淘洗从外周血淋巴细胞中分离出T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、CD45RO+、α-β或γ-δT细胞。例如，在一个方面，用抗CD4和抗CD8微珠分离CD4+和CD8+ T细胞。在另一个方面，通过与缀合有抗CD3/抗CD28(例如，3x28)的珠粒，诸如
Figure BDA0004038419630001525
M-450CD3/CD28T或
Figure BDA0004038419630001531
珠粒一起孵育足以对所需T细胞进行阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个方面，所述时间段为约30分钟。在进一步的方面，所述时间段的范围从30分钟到36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的方面，所述时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选方面，所述时间段为10至24小时。在一个方面，孵育时间段为24小时。在T细胞与其他细胞类型相比较少的任何情况下，诸如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)时，可使用更长的孵育时间来分离T细胞。另外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞的捕获效率。因此，仅通过缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或在培养过程中的其他时间点优先选择或选除T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠粒或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其他期望的时间点优先选中或选除T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本公开的说明书中也可使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选中的”细胞。还可使“未选中的”的细胞经历进一步轮次的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可利用针对阴性选择的细胞所特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，该细胞分选和/或选择使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合液。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调控性T细胞。可替代地，在某些方面，通过缀合有抗C25的珠粒或其他类似的选择方法来耗竭调控性T细胞。
在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γTNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B和穿孔蛋白中的一者或多者或其他适当的分子(例如，其他细胞因子)的T细胞群。针对细胞表达进行筛选的方法可以例如通过PCT公布号WO2013126712中描述的方法来确定，该PCT公布通过引用并入本文。
为了通过阳性或阴性选择来分离所需的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中将珠粒和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一个方面，使用20亿个细胞/mL的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/mL的浓度。在进一步的方面，使用超过1亿个细胞/mL。在进一步的面，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一方面，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在进一步的方面，可使用1.25亿个或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可以增加细胞产率、细胞活化和细胞扩增。另外，高细胞浓度的使用允许更高效地捕获可能微弱表达目标靶抗原的细胞(诸如CD28阴性T细胞)，或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且是所希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用降至最低。这就选择了与颗粒结合的表达大量所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更高效地被捕获。一方面，所用细胞的浓度为5x106/mL。在其他方面，所使用的浓度可以是从约1x105/mL至1x106/mL，以及介于两者之间的任何整数值。在其他方面，可将细胞在旋转器上以不同的速度在2-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
也可在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞来提供更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的，并且在这种情况下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或者含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基或者其他含有例如羟乙基淀粉溶液(Hespan)和PlasmaLyte A的合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的汽相(vapor phase)中。可使用其他受控冷冻的方法，以及立即在-20℃或在液氮中进行非受控冷冻。在某些方面，如本文所述解冻和洗涤冷冻保存的细胞，并使其在室温下静置一小时，然后使用本公开的方法进行活化。
在本公开的说明书中还设想了在可能需要本文所述的扩增的细胞之前的一段时间从受试者收集血液样品或血液单采产物。因此，可在任何必要的时间点收集待扩增的细胞的来源，分离所需的细胞(诸如T细胞)并将其冷冻，以待以后用于许多将受益于T细胞疗法的疾病或疾患(诸如本文所述的那些)的T细胞疗法。在一个方面，血液样品或血液单采物取自一般健康的受试者。在某些方面，从一般健康的受试者(所述受试者有发展疾病的风险，但尚未发展成疾病)获取血液样品或血液单采物，并分离出目标细胞，将其冷冻以备后用。在某些方面，可将T细胞扩增、冷冻并在以后使用。在某些方面，在如本文所述的特定疾病诊断后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。在进一步的方面，在受试者接受任意数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或血液单采物中分离细胞，所述治疗模式包括但不限于利用剂(诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂)、化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和霉酚酸酯)、抗体或其他免疫消融剂(诸如阿伦珠单抗、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢霉素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地新)和辐照进行的治疗。
在本公开的进一步的方面，直接在使患者具有功能性T细胞的治疗后从该受试者获取T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在治疗后不久在患者通常从治疗中恢复期间，所获得的T细胞的质量对于它们离体扩增的能力而言可能是最佳的或得到改善的。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可能处于增强的植入和体内扩增的优选状态。因此，在本公开的说明书中，设想了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或其他造血谱系的细胞。另外，在某些方面，动员(例如，利用GM-CSF的动员)和条件化方案可用于在受试者中创造条件，在所述条件下，尤其在治疗后的限定时间窗内，有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增。说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
T细胞的活化和扩增
通常可以使用如例如以下美国专利中所述的方法使T细胞活化和扩增：美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和7,572,631。
通常，可通过与表面接触来扩增本公开的T细胞，所述表面附接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可如本文所述，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触来刺激T细胞群。对于在T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以使T细胞群在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞、CD8+ T细胞，或CD4+CD8+ T细胞增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的示例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，可以如本领域公知的其他方法一样使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人，J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。在一些实施方案中，通过与缀合有抗CD3/抗CD28的珠粒，诸如
Figure BDA0004038419630001571
或
Figure BDA0004038419630001572
珠粒一起孵育足以活化T细胞的时间段来活化T细胞。在一个方面，所述时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个优选方面，所述时间段为10至24小时，例如24小时。在一些实施方案中，通过用抗CD3抗体和抗CD28抗体与结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)的组合刺激来活化T细胞。在一些实施方案中，通过用抗CD3抗体和抗CD28抗体与10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或100U/mL的IL-2、IL-7和/或IL-15的组合刺激来活化T细胞。在一些实施方案中，所述细胞被活化24小时。在一些实施方案中，在转导后，所述细胞在抗CD3抗体、抗CD28抗体与相同细胞因子的组合的存在下被扩增。在一些实施方案中，在与结合共同γ链的细胞因子组合的抗CD3抗体和抗CD28抗体的存在下活化的细胞在转导后，在相同细胞因子的存在下，在不存在抗CD3抗体和抗CD28抗体的情况下被扩增。在一些实施方案中，转导后，所述细胞在与相同细胞因子组合的抗CD3抗体、抗CD28抗体的存在下被扩增直至第一洗涤步骤，将所述细胞在包含细胞因子而不包含抗CD3抗体和抗CD28抗体的培养基中继代培养时。在一些实施方案中，每1、2、3、4、5或6天对所述细胞进行传代培养。在一些实施方案中，所述细胞被扩增4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
可以用唑来膦酸(Zometa)、阿仑膦酸(Fosamax)或其他相关的二膦酸盐药物以0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10或100μM的浓度在饲养细胞(经过照射的癌细胞、PBMC、人工抗原呈递细胞)的存在下刺激T细胞的扩增。可以用异戊烯焦磷酸酯(IPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMBPP或HMB-PP)或其他结构相关的化合物以0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10或100μM的浓度在饲养细胞(经过照射的癌细胞、PBMC、人工抗原呈递细胞)的存在下刺激T细胞的扩增。在一些实施方案中，可以用合成的磷酸抗原(例如，溴醇焦磷酸酯；BrHPP)、2M3B1 PP或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸酯在IL-2的存在下刺激T细胞的扩增1至2周。在一些实施方案中，可以在IL-2的存在下用固定的抗TCRyd(例如，泛TCRY6)刺激T细胞的扩增，例如，大约14天。在一些实施方案中，可以在IL-2的存在下，用固定的抗CD3抗体(例如OKT3)的培养物刺激T细胞的扩增。在一些实施方案中，将前面提到的培养物维持约7天，然后在可溶性抗CD3和IL-2中进行继代培养。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特点。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)更大的辅助性T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生了T细胞群，所述T细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，T细胞群体包含越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，用主要由TH细胞组成的T细胞群输注受试者可以是有利的。类似地，如果已经分离出抗原特异性的TC细胞亚群，则将该亚群扩增至更大的程度可以是有益的。
另外，除了CD4和CD8标志物以外，其他表型标志物也有显著变化，但在很大程度上，在细胞扩增过程中是可再现的。因此，这种再现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
一旦构建了TFP，就可以使用各种测定法来评价分子的活性，诸如但不限于T细胞活化和扩增刺激的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。评价TFP效果的测定法在下面进一步详细描述。
防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀
考虑到CD70由T细胞表达，表达抗CD70 TFP的一种可能作用可以是在生产过程中杀伤其他T细胞，例如表达抗CD70 TFP的T细胞，即自相残杀。本公开涵盖一种减少或防止表达T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的T细胞的自相残杀的方法，所述融合蛋白包含与CD70特异性地结合的抗原结合结构域(CD70-TFP)。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括在表达CD70-TFP之前或之后不久用CD70破坏剂例如抗CD70抗体掩蔽或阻断T细胞上的CD70。在一些实施方案中，CD70可用CD70抗体、CD27抗体或可溶性CD27掩蔽。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括降低细胞表面处的CD70水平，例如通过在其基因座处敲低CD70基因，抑制或减少转录，抑制或减少翻译，靶向CD70蛋白进行降解。
在许多实施方案中，抗CD70抗体或其片段可包括鼠抗体或其结合片段、人抗体或其结合片段或人源化抗体或其结合片段、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体及其结合或功能片段，包括但不限于单结构域抗体诸如骆驼来源的纳米抗体的VH、VL和VHH。在许多实施方案中，抗CD70抗体或其片段也可包含单链片段，诸如scFv或sdAb。在一些实施方案中，sdAb是VHH。在其他实施方案中，抗CD70抗体或其片段可包含Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括本文所述的任何抗CD70抗体。在一些实施方案中，抗CD70抗体包括表1-4中公开的任何抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括本文所述的70-001VHH抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括本文所述的C10抗体。抗CD70抗体的非限制性示例包括古妥珠单抗(cusatuzumab)(ARGX-110)、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)、MDX-1411和本文所述的新型抗CD70抗体。
还可以通过将细胞或细胞群与结合CD27的剂组合来实现防止自相残杀。与CD27结合的剂可阻断同一细胞或相邻细胞上的CD27。在一些实施方案中，抗CD27抗体或其片段被外源性地提供给细胞并且与细胞表面上的CD27结合。在一些实施方案中，外源抗CD27抗体或其片段是在细胞体外扩增期间提供的。
在许多实施方案中，抗CD27抗体或其片段可包括鼠抗体或其结合片段、人抗体或其结合片段，或人源化抗体或其结合片段、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体，以及它们的结合或功能片段，包括但不限于单结构域抗体诸如骆驼来源的纳米抗体的VH、VL和VHH。在许多实施方案中，抗CD27抗体或其片段也可包含单链片段，诸如scFv或sdAb。在一些实施方案中，sdAb是VHH。在其他实施方案中，抗CD27抗体或其片段可包含Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体。
还可以通过将细胞或细胞群与可溶性CD27组合来实现防止自相残杀。在一些实施方案中，可溶性CD27被外源性地提供给细胞并且与细胞表面上的CD70结合。在一些实施方案中，外源可溶性CD27是在细胞体外扩增期间提供的。据信提供的可溶性CD27与天然CD27竞争与CD70结合。
在一些方面，本文提供了一种产生包含本文所述的抗CD70 TFP或编码本文所述的CD70-TFP的重组核酸分子的细胞(例如，T细胞)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)用编码本文所述的CD70-TFP的重组核酸或载体转导细胞；以及(ii)使该细胞同与细胞表面上的CD70结合的CD70破坏剂(例如，CD70破坏剂，例如抗CD70抗体、抗CD27抗体或可溶性CD27)接触。在一些实施方案中，所述抗CD70抗体是由本文所述的重组核酸编码的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由本文所述的重组核酸编码的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞，例如人T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人CD8+ T细胞或人CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人αβT-细胞或人γδT细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人NKT细胞。
在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导之前。在一些实施方案中，所述接触发生在转导之前至多1天，例如在转导之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导之后。在一些实施方案中，所述接触发生在所述转导之后至多5天。在一些实施方案中，所述接触发生在转导之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些实施方案中，所述接触发生在转导之后1.0天、1.5天、2.0天、2.5天、3.0天、3.5天、4.0天、4.5天或5.0天。在一些实施方案中，所述方法还包括在不包含CD70破坏剂CD70(例如，抗CD70抗体、抗CD27抗体或可溶性CD27)的培养基中对所述细胞进行继代培养。在一些实施方案中，对所述细胞进行继代培养包括在转导之后4天或更多天，例如在转导后7天，在不包含CD70破坏剂CD70的培养基中对所述细胞进行继代培养。在一些实施方案中，所述继代培养包括在转导后4.5天、5天、5.5天、6天或6.5天在不包含CD70破坏剂CD70的培养基中对所述细胞进行继代培养。在一些实施方案中，所述继代培养包括在转导后7天在不包含CD70破坏剂CD70的培养基中对所述细胞进行继代培养。
在一些实施方案中，所述细胞的活化和/或扩增在抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段的存在下发生。在一些实施方案中，所述细胞在CD70抗体或其片段的存在下被扩增10天或更多天。在一些实施方案中，细胞在一种或多种细胞因子诸如IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的存在下被活化和/或扩增，如下文进一步详细描述的。在一些实施方案中，所述细胞在CD70抗体或其片段的存在下被扩增10天或更多天。在一些实施方案中，T细胞在转导之前在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下被活化。在一些实施方案中，T细胞在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下被转导。在一些实施方案中，T细胞在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下被扩增。在一些实施方案中，通过在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)和任选一种或多种结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激来活化T细胞。在一些实施方案中，通过在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)和任选一种或多种结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激来活化T细胞，并然后在转导后(例如，在存在或不存在抗CD3/抗CD28抗体和任选细胞因子的情况下)在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下将该T细胞扩增1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。在一些实施方案中，通过在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)和任选一种或多种结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)的存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激来活化T细胞，并然后在转导后(例如，在存在或不存在抗CD3/抗CD28抗体和任选细胞因子的情况下)在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下将该T细胞扩增1、2、3、4、5天或更多天，接着在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)不存在的情况下对该T细胞进行后续扩增。
在一些实施方案中，通过在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)和任选一种或多种结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)不存在的情况下用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激来活化T细胞，并然后在转导后(例如，在存在或不存在抗CD3/抗CD28抗体和任选细胞因子的情况下)，在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下将该T细胞扩增1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。
在一些实施方案中，通过在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)和任选一种或多种结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)不存在的情况下用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激来活化T细胞，并然后在转导后(例如，在存在或不存在抗CD3/抗CD28抗体和任选细胞因子的情况下)，在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下将该T细胞扩增1、2、3、4或5天或更多天，接着在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)不存在的情况下对该T细胞进行后续扩增。
在一些实施方案中，通过在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)和任选一种或多种结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)不存在的情况下用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激来活化T细胞，然后在转导后(例如，在存在或不存在抗CD3/抗CD28抗体和任选细胞因子的情况下)，在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)不存在的情况下将该T细胞扩增1、2、3、4或5天或更多天，接着在CD70破坏剂(例如，CD70抗体或其片段)的存在下将该T细胞后续扩增1、2、3、4或5天或更多天。
在一些实施方案中，CD70破坏剂是CD70抗体，并且CD70抗体在本文所述的方法中以100nM-100uM的浓度使用。在一些实施方案中，CD70抗体以1-50uM或2-20uM的浓度使用。在一些实施方案中，CD70抗体以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mM的浓度使用。
本文还考虑了胞内抗CD70融合蛋白和用于防止自相残杀的方法。在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括通过将CD70隔绝在细胞内部来减少CD70在T细胞上的细胞表面表达。在一些实施方案中，通过在T细胞中表达胞内定位的抗CD70抗体，即包含CD70抗体结构域和胞内定位结构域的融合蛋白，将CD70隔绝在细胞内部。本领域已知的任何抗CD70抗体均可用于所述融合蛋白中。在一些实施方案中，胞内定位结构域是内质网(ER)滞留结构域。这些将构建体固定至ER/高尔基体，从而防止靶蛋白的分泌或膜表达。
ER滞留结构域可以是将CD70保留在ER或高尔基器中的任何结构域。滞留结构域可以是靶肽。靶肽是3至70个氨基酸的短肽链，其指导蛋白质转运到细胞的特定区域，诸如ER或高尔基器，并且/或者将蛋白质保留在特定区域中。本领域已知多种靶肽。
滞留结构域优选为KDEL序列(SEQ ID NO:777)、KKXX基序、KXKXX基序、腺病毒E19蛋白质的具有序列KYKSRRSFIDEKKMP(SEQ ID NO:778)的尾部，或HLA恒定链的具有序列MHRRRSRSCR(SEQ ID NO:779)的片段。滞留结构域优选为结合结构域的C端。滞留结构域可以为结合结构域的N端。
KDEL是蛋白质的氨基酸结构中的靶肽序列，其防止蛋白质从ER中分泌。具有KDEL序列的蛋白质将通过逆行转运到ER腔而从高尔基器中被回收。KDEL序列还可以使蛋白质从其他位置(诸如细胞质)靶向ER。蛋白质只能在KDEL序列被切割掉后才能离开ER。因此，只要驻留在ER中的蛋白质含有KDEL序列，它就会保留在ER中。
ER滞留结构域可以是KKXX(Lys-Lys-xxx-xxx)基序。KKXX是通常位于蛋白质的氨基酸结构的C端的靶肽基序。KKXX负责经由与外壳蛋白(COPI)复合物的相互作用，通过逆行转运从高尔基器的顺式末端回收ER膜蛋白。
滞留结构域可以是已知ER蛋白(诸如腺病毒E19蛋白)的C端胞质尾部。例如，结合结构域可以是具有序列KYKSRRSFIDEKKMP(SEQ ID NO:778)的腺病毒E19蛋白的尾部。可替代地，结合结构域可以是HLA恒定链的N端片段，诸如具有序列MHRRRSRSCR(SEQ ID NO:779)的片段。在一些实施方案中，ER滞留序列包含SEQ ID NO.756-776中任一者的序列。
示例性ER滞留序列
AEKDEL(SEQ ID NO:756)
EQKLISEEDLKDEL(SEQ ID NO:757)
GGGGSGGGGSKDEL(SEQ ID NO:758)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKDEL(SEQ ID NO:759)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL(SEQ ID NO:760)
KYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:761)
LKYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:762)
LYKYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:763)
LYCKYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:764)
LYCNKYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:765)
LYKYKSRRSFIDEKKMP(SEQ ID NO:766)
LYCNKYKSRRSFIDEKKMP(SEQ ID NO:767)
LYEQKLISEEDLKYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:768)
LYCYPYDVPDYAKYKSRRSFIEEKKMP(SEQ ID NO:769)
LYKKLETFKKTN(SEQ ID NO:770)
LYEQKLISEEDLKKLETFKKTN(SEQ ID NO:771)
LYYQRL(SEQ ID NO:772)
LYEQKLISEEDLYQRL(SEQ ID NO:773)
LYKRKIIAFALEGKRSKVTRRPKASDYQRL(SEQ ID NO:774)
LYRNIKCD(SEQ ID NO:775)
LYEQKLISEEDLRNIKCD(SEQ ID NO:776)
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含介于CD70抗体结构域和ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
其他合适的结合结构域是本领域已知的。例如，LocSigDB(http://genome.unmc.edu/LocSigDB/)是八个不同亚细胞位置的实验蛋白质定位信号的数据库(Negi等人，LocSigDB:a database of protein localization signals,Database(Oxford),2015,1-7)。此外，已知的方法可用于鉴定将CD70复合物中的一种或多种组分保留在ER或高尔基器内的进一步的结合结构域(参见，例如Bejarano和Gonzalez,MotifTrap:a rapid method to clone motifs that can target proteins to definedsubcellular localizations,Journal of Cell Science,112,4207-4211(1999))。
该分子可以包含两个或更多个，诸如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个滞留结构域。在这种情况下，所述滞留结构域中的两个或更多个可以是相同的。所述滞留结构域中的两个或更多个可以是不同的。
在一些实施方案中，在T细胞中表达胞内定位的抗CD70抗体包括用编码融合蛋白的核酸序列转导T细胞。在一些实施方案中，编码融合蛋白的核酸序列包含CD70抗体结构域，并且胞内定位结构域包含例如ER滞留结构域。在一些实施方案中，所述序列还包含编码介于CD70抗体结构域和ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，核酸序列还包含信号肽，例如位于编码抗CD70抗体结构域的序列的5'的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码本文所述的抗CD70 TFP的重组核酸(例如，包含编码本文所述的抗CD70 TFP的重组核酸的载体)转导到具有编码本文所述的包含CD70抗体结构域和胞内定位结构域的融合蛋白的核酸序列的T细胞中。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码本文所述的抗CD70 TFP的重组核酸(例如，包含编码本文所述的抗CD70 TFP的重组核酸的载体)转导到T细胞中，并且在用编码所述CD70 TFP的重组核酸转导T细胞之前或之后，将编码本文所述的包含CD70抗体结构域和胞内定位结构域的融合蛋白的重组核酸(例如，编码所述融合蛋白的载体)转导到T细胞中。在一些实施方案中，防止或减少表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码本文所述的抗CD70 TFP的重组核酸与编码本文所述的包含CD70抗体结构域和胞内定位结构域的融合蛋白的核酸同时转导到T细胞中。在一些实施方案中，编码CD70-TFP的重组核酸分子或载体还包含编码融合蛋白的序列。在一些实施方案中，编码CD70-TFP的序列和编码融合蛋白的序列被包含在单个操纵子中。
在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将抗CD70TFP转导到具有内源CD70基因的功能性破坏的T细胞中。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将抗CD70 TFP转导到T细胞中，并且在用抗CD70 TFP转导T细胞之前或之后，使用本文所述的基因编辑方法破坏内源CD70基因。SEQ ID NO.744-749是用于与CRISPR/Cas9系统一起用于破坏内源CD70的示例性向导RNA序列。
用于破坏内源CD70的示例性向导RNA序列
GTGCATCCAGCGCTTCGCAC(SEQ ID NO:744)
ATCACCAAGCCCGCGACCAA(SEQ ID NO:745)
CAGCTACGTATCCATCGTGA(SEQ ID NO:746)
GCCCCCCTGCCAGTATAGCC(SEQ ID NO:747)
GAGCTGCAGCTGAATCACAC(SEQ ID NO:748)
CTCACCCCAAGTGACTCGAG(SEQ ID NO:749)
在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将抗CD70TFP转导到具有内源CIITA基因的功能性破坏的T细胞中。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将抗CD70 TFP转导到T细胞中，并且在用抗CD70 TFP转导T细胞之前或之后，使用本文所述的基因编辑方法破坏内源CIITA基因。SEQ ID NO.750-755是用于与CRISPR/Cas9系统一起用于破坏内源CIITA的示例性向导RNA序列。
用于破坏内源CIITA的示例性向导RNA序列
TTCCTACACAATGCGTTGCC(SEQ ID NO:750)
GATATTGGCATAAGCCTCCC(SEQ ID NO:751)
TCAACTGCGACCAGTTCAGC(SEQ ID NO:752)
CATCGCTGTTAAGAAGCTCC(SEQ ID NO:753)
GCCCCTAGAAGGTGGCTACC(SEQ ID NO:754)
TCCTACCTGTCAGAGCCCCA(SEQ ID NO:755)
如上所述，在一些实施方案中，应用多重基因组编辑技术生成在内源TCR，和/或人白细胞抗原(HLA)，和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，和/或CD70和/或CIITA和/或其他基因的表达方面有缺陷的基因被破坏的T细胞。
在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括在用编码抗CD70 TFP的重组核酸转导T细胞之前或之后使所述细胞与靶向CD70的反义寡核苷酸接触。在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码抗CD70TFP的重组核酸转导到具有编码靶向CD70基因的siRNA、shRNA或miRNA的序列的T细胞中。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码抗CD70 TFP的重组核酸转导到T细胞中，并且在用所述抗CD70 TFP转导T细胞之前或之后，将编码靶向CD70基因的siRNA、shRNA或miRNA的核酸转导到T细胞中。在一些实施方案中，防止或减少表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码抗CD70 TFP的重组核酸与编码靶向CD70基因的siRNA、shRNA或miRNA的核酸同时转导到T细胞中。在一些实施方案中，CD70-TFP和siRNA、shRNA或miRNA由相同的核酸分子编码。
在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括在用编码抗CD70 TFP的重组核酸转导T细胞之前或之后使所述细胞与靶向CIITA的反义寡核苷酸接触。在一些实施方案中，减少或防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码抗CD70TFP的重组核酸转导到具有编码靶向CIITA基因的siRNA、shRNA或miRNA的序列的T细胞中。在一些实施方案中，防止表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码抗CD70 TFP的重组核酸转导到T细胞中，并且在用所述抗CD70 TFP转导T细胞之前或之后，将编码靶向CIITA基因的siRNA、shRNA或miRNA的核酸转导到T细胞中。在一些实施方案中，防止或减少表达CD70-TFP的T细胞的自相残杀包括将编码抗CD70 TFP的重组核酸与编码靶向CIITA基因的siRNA、shRNA或miRNA的核酸同时转导到T细胞中。在一些实施方案中，CD70-TFP和siRNA、shRNA或miRNA由相同的核酸分子编码。
在一些实施方案中，CD70-TFP对自相残杀具有抗性。在一些实施方案中，相对于具有不同抗原结合结构域的TFP，CD70-TFP没有增加的自相残杀。在一些实施方案中，相对于表现出自相残杀的CD70-TFP，CD70-TFP具有减少的自相残杀。在一些实施方案中，产生包含本文所述的抗自相残杀的CD70 TFP或编码本文所述的抗自相残杀的CD70-TFP的重组核酸分子的T细胞的方法不包括减少或防止T细胞的自相残杀。在一些实施方案中，抗自相残杀的CD70 TFP包含scFv或其片段。所述scFv或其片段可包含具有SEQ ID NO:800的序列的VH结构域。所述scFv或其片段可包含具有SEQ ID NO:1012的序列的VL结构域。该VH结构域可包含具有SEQ ID NO:853的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:906的序列的CDRH2和具有SEQ IDNO:959的序列的CDRH3。所述VL结构域可包含具有SEQ ID NO:1065的序列的CDRL1、具有SEQID NO:1118的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1171的序列的CDRL3。
TCR复合物或内源蛋白编码基因的基因编辑
在一些实施方案中，使用基因编辑技术，诸如成簇的规律间隔短回文重复序列(
Figure BDA0004038419630001701
参见，例如美国专利第8,697,359号)、转录激活物样效应子(TALE)核酸酶(TALEN，参见，例如美国专利第9,393,257号)、大范围核酸酶(具有包含12至40个碱基对的双链DNA序列的大识别位点的内切脱氧核糖核酸酶)、锌指核酸酶(ZFN，参见，例如，Urnov等人，Nat.Rev.Genetics(2010)第11卷，第636-646页)或megaTAL核酸酶(大范围核酸酶与TAL重复序列的融合蛋白)方法对本文公开的经修饰的T细胞进行工程化。这样，可对嵌合构建体进行工程化以组合每个亚基的所需特征，诸如构象或信号传导能力。另请参见Sander和Joung,Nat.Biotech.(2014)v32,347-55；and June et al.,2009Nature ReviewsImmunol.9.10:704-716，每篇文献均通过引用并入本文。在一些实施方案中，对TFP亚基的胞外结构域、跨膜结构域或胞质结构域中的一种或多种进行工程化以具有超过一个天然TCR亚基结构域(即，是嵌合的)的方面。
永久性改变人基因组以及在疾病相关基因中引入位点特异性基因组修饰的技术的最新发展为治疗应用奠定了基础。这些技术现在通常被称为“基因组编辑”。
在一些实施方案中，采用基因编辑技术来破坏内源TCR或B2M基因。在一些实施方案中，所提及的内源TCR基因编码TCRα链、TCRβ链或TCRα链和TCRβ链。在一些实施方案中，所提及的内源TCR基因编码TCRγ链、TCRδ链或TCRγ链和TCRδ链。在一些实施方案中，基因编辑技术为多重基因组编辑铺平了道路，所述多重基因组编辑允许同时破坏内源TCR基因中的多个基因组基因座。在一些实施方案中，应用多重基因组编辑技术生成在内源TCR，和/或人白细胞抗原(HLA)，和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，和/或其他基因的表达方面有缺陷的基因被破坏的T细胞。
目前的基因编辑技术包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统。这四大类基因编辑技术在结合用户定义的DNA序列和介导双链DNA断裂(DSB)方面具有共同的作用模式。然后DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)或者-当存在供者DNA时-同源重组(HR)来修复，同源重组是引入来自供者DNA片段的同源序列的事件。另外，切口酶产生单链DNA断裂(SSB)。DSB可通过单链DNA掺入(ssDI)或单链模板修复(ssTR)来修复，单链模板修复是从供者DNA中引入同源序列的事件。
基因组DNA的遗传修饰可使用位点特异性的、稀有切割的内切核酸酶来完成，所述内切核酸酶被工程化来识别目标基因座中的DNA序列。产生工程化的位点特异性内切核酸酶的方法在本领域中是已知的。例如，可对锌指核酸酶(ZFN)进行工程化以识别和切割基因组中的预定位点。ZFN是嵌合蛋白，其包含与Fokl限制性酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域。锌指结构域可通过合理的或实验性手段重新设计，以生产与预先确定的长度为18个碱基对的DNA序列结合的蛋白质。通过将这种工程化的蛋白质结构域与Fokl核酸酶融合，就有可能以基因组水平特异性来靶向DNA断裂。ZFN已广泛地用于靶向多种真核生物中的基因添加、去除和取代(在Durai等人(2005)Nucleic Acids Res 33,5978中有综述)。同样地，可以产生TAL-效应子核酸酶(TALEN)来切割基因组DNA中的特定位点。与ZFN一样，TALEN包含与Fokl核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性的DNA结合结构域(综述于Mak等人(2013),Curr Opin Struct Biol.23:93-9)中。然而，在这种情况下，DNA结合结构域包括一个串联阵列的TAL效应子结构域，其每一个特异性识别单个DNA碱基对。紧凑型TALEN具有替代的内切核酸酶架构，避免了对二聚化的需要(Beurdeley等人(2013),Nat Commun.4:1762)。紧凑型TALEN包含与I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性TAL-效应子DNA结合结构域。与Fokl不同，I-TevI不需要二聚化来产生双链DNA断裂，因此紧凑型TALEN作为单体是有功能的。
基于CRISPR/Cas9系统的工程化的内切核酸酶在本领域也是已知的(Ran等人(2013),Nat Protoc.8:2281-2308；Mali等人(2013),Nat Methods 10:957-63)。CRISPR基因编辑技术由其DNA靶向特异性和切割活性可通过短的引导RNA或双链体crRNA/TracrRNA来编程的内切核酸酶蛋白组成。CRISPR内切核酸酶包含两个组分：(1)半胱天冬酶效应子核酸酶，通常为微生物Cas9；和(2)包含18至20个核苷酸靶向序列的短的“引导RNA”或RNA双链体，其将核酸酶导向基因组中的目标位置。通过在同一细胞中表达多种引导RNA，每种引导RNA具有不同的靶向序列，就可能将DNA断裂同时靶向基因组中的多个位点(多重基因组编辑)。
本领域中已知两类CRISPR系统(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)，每类均含有多个CRISPR类型。1类包括通常存在于古细菌的I型和III型CRISPR系统。而II类包括II型、IV型、V型和VI型CRISPR系统。尽管最广泛使用的CRISPR/Cas系统是II型CRISPR-Cas9系统，但CRISPR/Cas系统已被研究人员重新用于基因组编辑。在过去的几年里，已重塑(remodel)了10多种不同的CRISPR/Cas蛋白(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)。在这些蛋白中，诸如来自酸性氨基球菌属的某一种(Acid-aminococcus sp)(AsCpf1)和毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)(LbCpf1)的Cas12a(Cpf1)蛋白是特别令人感兴趣的。
归巢核酸内切酶是一组天然存在的核酸酶，其识别通常在植物和真菌基因组中发现的15-40个碱基对的切割位点。它们经常与寄生物的DNA元件，诸如组1自我剪接内含子和内含肽(intein)缔合。它们通过在染色体上产生双链断裂(这募集细胞的DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95))来自然地促进同源重组或在宿主基因组的特定位置处的基因插入。特定的氨基酸取代可重新编程归巢核酸酶的DNA切割特异性(Niyonzima(2017),Protein Eng Des Sel.30(7):503–522)。大范围核酸酶(MN)是具有天然核酸酶活性的单体蛋白，该单体蛋白源自细菌归巢内切核酸酶，并针对独特的靶位点进行了工程化(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430–446)。在一些实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-CreI归巢内切核酸酶。在其他实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-SceI归巢内切核酸酶。
除了提及的四种主要的基因编辑技术以外，还已对包含大范围核酸酶、ZFN和TALEN的融合体的嵌合蛋白进行工程化，以生成新型单体酶，该酶利用ZFN和TALEN的结合亲和力及大范围核酸酶的切割特异性(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430–446)。例如，megaTAL是单一嵌合蛋白，其是来自TALEN的易于定制的DNA结合结构域与大范围核酸酶的高切割效率的组合。
为了执行基因编辑技术，核酸酶，以及在CRISPR/Cas9系统的情况下，gRNA，必须被高效地递送到目标细胞。诸如物理、化学和病毒方法等的递送方法也是本领域已知的(Mali(2013).Indian J.Hum.Genet.19:3-8.)。在一些情况下，物理递送方法可选自但不限于电穿孔、显微注射或使用弹道粒子的方法。另一方面，化学递送方法需要使用复杂分子，诸如磷酸钙、脂质或蛋白质。在一些实施方案中，使用病毒(诸如但不限于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒)将病毒递送方法应用于基因编辑技术。
治疗应用
本文提供的TFP T细胞可用于治疗牵涉CD70的任何疾病或病状(例如，表达CD70的癌症)。在一些实施方案中，所述疾病或病状是可受益于用过继细胞疗法进行的治疗的疾病或病状。在一些实施方案中，所述疾病或病状是细胞增殖性病症。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病状是血癌。在一些实施方案中，所述疾病或病状是肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病状是病毒感染。
在一些实施方案中，本文提供了治疗有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法通过向受试者施用有效量的本文提供的TFP T细胞来实现。在一些方面，所述疾病或病状是癌症。在一些方面，所述疾病或病状是病毒感染。
可以用本文提供的TFP T细胞治疗任何合适的癌症。示例性合适的癌症包括，例如，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、附件癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆道癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、原发原因不明的癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、导管癌、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、眼癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增多病、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、嘴唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐性原发性转移性鳞状颈部癌、牵涉NUT基因的中线呼吸道癌、口腔癌、多发性内分泌赘瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性赘瘤、鼻腔和鼻旁鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征(Sezarysyndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和威尔姆斯瘤(Wilms’tumor)。
在一些情况下，所述癌症可以是急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱癌瘤)、骨癌、脑癌(例如，成神经管细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、RCC、ccRCC、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或输尿管癌。所述癌症的特征在于CD70的表达。在一些情况下，CD70可在多种血液恶性肿瘤诸如非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病中高度表达，并且可以在实体瘤型透明细胞肾细胞癌(ccRCC)中高度表达。在一些情况下，所述癌症可以是RCC(例如，ccRCC)、成胶质细胞瘤、NHL、CLL、弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤中的任一者。
治疗方法
在一个方面，本发明提供了治疗与至少一种肿瘤相关抗原表达相关的疾病的方法。在一个方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其中肿瘤的一部分对肿瘤相关抗原呈阴性，并且肿瘤的一部分对肿瘤相关抗原呈阳性。例如，本发明的抗体或TFP可用于治疗已经接受针对与所述肿瘤抗原表达升高相关的疾病的治疗的受试者，其中已经接受针对肿瘤相关抗原水平升高的治疗的受试者表现出与肿瘤相关抗原水平升高相关的疾病。
在一个方面，本发明涉及包含抗肿瘤相关抗原抗体或TFP的载体，所述抗肿瘤相关抗原抗体或TFP与启动子可操作地连接以在哺乳动物T细胞中表达。在一个方面，本发明提供了表达肿瘤相关抗原TFP的重组T细胞，其用于治疗表达肿瘤相关抗原的肿瘤，其中表达肿瘤相关抗原TFP的重组T细胞被称为肿瘤相关抗原TFP-T。在一个方面，本发明的肿瘤相关抗原TFP-T能够使肿瘤细胞与在其表面上表达的本发明的至少一种肿瘤相关抗原TFP接触，使得TFP-T靶向肿瘤细胞并且肿瘤的生长受到抑制。
在一个方面，本发明涉及抑制表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本发明的肿瘤相关抗原抗体或TFP T细胞接触，使得TFP-T响应于抗原而被活化并且靶向癌细胞，其中肿瘤的生长受到抑制。
在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用本发明的肿瘤相关抗原抗体、双特异性抗体或TFP T细胞，使得在受试者中癌症得以治疗。可通过本发明的肿瘤相关抗原TFP T细胞可治疗的癌症的示例是与肿瘤相关抗原的表达相关的癌症。
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原抗体或TFP疗法可与本文所述的一种或多种另外的疗法组合使用。
在一个方面，本文公开了细胞疗法的方法，其中将T细胞遗传修饰成表达TFP，并将表达TFP的T细胞输注给有需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，表达TFP的T细胞能够在体内复制，导致可导致持续肿瘤控制的长期持久性。在各个方面，向患者施用的T细胞或其后代在向患者施用T细胞后在患者体内存留至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。
在一些情况下，本文公开了一种类型的细胞疗法，其中例如通过体外转录的RNA修饰T细胞以瞬时表达TFP，并将表达TFP的T细胞输注给有需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，向患者施用的T细胞在向患者施用T细胞后存留少于一个月，例如，3周、2周或1周。
不希望受任何特定理论的束缚，由表达TFP的T细胞引起的抗肿瘤免疫反应可以是主动免疫反应或被动免疫反应，或者可替代地是由于直接或间接免疫反应引起。在一个方面，经TFP转导的T细胞响应于表达肿瘤相关抗原的人癌细胞表现出特异性促炎细胞因子分泌和强效的溶细胞活性，抵抗可溶性肿瘤相关抗原抑制，介导旁观者杀伤和/或介导已建立的人肿瘤的消退。例如，表达肿瘤相关抗原的肿瘤的异质场内的少抗原肿瘤细胞(antigen-less tumor cell)可能易受先前已与相邻抗原阳性癌细胞反应的肿瘤相关抗原重定向T细胞的间接破坏。
在一个方面，本发明的人TFP修饰的T细胞可以是一种类型的用于哺乳动物的离体免疫和/或体内疗法的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。
就离体免疫而言，在将细胞施用给哺乳动物之前，体外进行以下中的至少一者：i)细胞扩增，ii)将编码TFP的核酸引入到细胞中，或iii)如本文所述的细胞低温保存。
除了使用就离体免疫而言的基于细胞的疫苗外，本发明还提供了用于体内免疫以引发针对患者中抗原的免疫反应的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和防止免疫受损的个体中出现的疾病。具体而言，本发明的经TFP修饰的T细胞用于治疗与肿瘤相关抗原表达相关的疾病、病症和病状。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于发展与肿瘤相关抗原的表达相关的疾病、病症和病状的风险中的患者。因此，本发明提供了用于治疗或防止与肿瘤相关抗原的表达相关的疾病、病症和病状的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的经TFP修饰的T细胞。
本发明的抗体或经TFP修饰的T细胞可以单独施用，或者作为与稀释剂和/或与如下面进一步详细描述的其他组分组合的药物组合物施用。
本发明还提供用于抑制表达肿瘤相关抗原的细胞群的增殖或减少表达肿瘤相关抗原的细胞群的方法，所述方法包括使包含表达肿瘤相关抗原的细胞的细胞群同与表达肿瘤相关抗原的细胞结合的本发明的抗肿瘤相关抗原TFP-T细胞接触。在一个具体方面，本发明提供了用于抑制表达肿瘤相关抗原的癌细胞群的增殖或减少表达肿瘤相关抗原的癌细胞群的方法，所述方法包括使表达肿瘤相关抗原的癌细胞群同与表达肿瘤相关抗原的细胞结合的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞接触。在一个方面，本发明提供了用于抑制表达肿瘤相关抗原的癌细胞群的增殖或减少表达肿瘤相关抗原的癌细胞群的方法，所述方法包括使表达肿瘤相关抗原的癌细胞群同与表达肿瘤相关抗原的细胞结合的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞接触。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞使患有多发性骨髓瘤或另一种与表达肿瘤相关抗原的细胞相关的癌症的受试者或者多发性骨髓瘤或另一种与表达肿瘤相关抗原的细胞相关的癌症的动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，所述受试者是人。
本发明还提供了用于防止、治疗和/或管理与表达肿瘤相关抗原的细胞相关的疾病(例如，表达肿瘤相关抗原的癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用与表达肿瘤相关抗原的细胞结合的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞。在一个方面，所述受试者是人。与表达肿瘤相关抗原的细胞相关的病症的非限制性示例包括自身免疫性病症(诸如狼疮)、炎性病症(诸如变态反应和哮喘)和癌症(诸如血液学癌症或表达肿瘤相关抗原的非典型癌症)。
用于获得治疗效果的本文所述的TFP-T细胞的合适剂量将为，例如，优选在一系列给药周期中每剂至少105个或约105至约1010个细胞。示例性的给药方案由4个1周剂量递增的给药周期组成，其中第0天以至少约105个细胞开始，例如在启动患者内剂量递增方案的数周内逐渐增加直至约1010个细胞的目标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过贮库接入装置)、腹膜内和直接注射到肿瘤块中。
有效量或足够数目的分离的T细胞存在于组合物中并且被引入到受试者中，从而建立长期、特异性的抗癌和/或抗肿瘤反应，以与原本在不存在此类治疗的情况下将会发生的情况相比减小肿瘤的大小或消除肿瘤生长或再生长。理想地，当与其中不存在T细胞的其他方面相同的条件相比时，引入到受试者中的T细胞的量引起肿瘤大小减小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。
因此，所施用的T细胞的量应考虑施用途径，并且应使得将会引入足够数目的T细胞以便实现所需治疗反应。此外，本文所述的组合物中包含的每种活性剂的量(例如，待接触的每个细胞的量或每个特定体重的量)可以在不同应用中变化。
组合疗法
本文所述的抗体或表达TFP的细胞可以与其他已知剂和疗法组合使用。如本文所用的“组合”施用意指在受试者患有病症的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已经被诊断患有病症之后并且在病症已经被治愈或消除或因其他原因停止治疗之前递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在进行，因此在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二治疗比在没有第一治疗的情况下施用第二治疗或在对于第一治疗看到类似情况的情况下施用第二治疗更有效，例如，用较少的第二治疗可看到等效效果，或者第二治疗可在更大程度上减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其他参数的减少大于在没有另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的所述减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的效果仍然是可检测的。
在一些实施方案中，所述“至少一种另外的治疗剂”包括表达TFP的细胞。还提供了表达多种与相同或不同的靶抗原或相同靶抗原上相同或不同的表位结合的TFP的T细胞。还提供了T细胞群，其中第一T细胞亚群表达第一TFP，第二T细胞亚群表达第二TFP。
本文所述的表达TFP的细胞和所述至少一种另外的治疗剂可同时以同一组合物或以单独的组合物施用，或相继施用。对于相继施用，本文所述的表达TFP的细胞可以首先施用，所述另外的剂可以第二次施用，或者该施用顺序可以颠倒。
在一些实施方案中，本文提供的TFP T细胞与至少一种另外的治疗剂一起施用。任何合适的另外的治疗剂可以与本文提供的TFP T细胞一起施用。在一些方面，所述另外的治疗剂选自放射、细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞生长抑制剂、抗激素剂、EGFR抑制剂、免疫刺激剂、抗血管生成剂以及它们的组合。
在进一步的方面，可以将本文所述的表达TFP的细胞以与外科手术、化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和他克莫司(tacrolimus))、抗体或其他免疫消融剂(诸如阿仑单抗(alemtuzumab)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛(romidepsin)、细胞因子和辐射)、肽疫苗(诸如Izumoto等人2008J Neurosurg 108:963-971中描述的肽疫苗)组合的治疗方案使用。
在一个实施方案中，可以给受试者施用减少或改善与施用表达TFP的细胞相关的副作用的剂。与施用表达TFP的细胞相关的副作用包括但不限于细胞因子释放综合征(CRS)和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，也称为巨噬细胞活化综合征(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。因此，本文所述的方法可包括向受试者施用本文所述的表达TFP的细胞，并进一步施用用于管理由用表达TFP的细胞进行的治疗引起的可溶性因子水平升高的剂。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一者或多者。因此，被施用来治疗这种副作用的剂可以是中和这些可溶性因子的一者或多者的剂。此类剂包括但不限于类固醇、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的示例是依那西普(以名称
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销售)。IL-6抑制剂的示例是托珠单抗(以名称
Figure BDA0004038419630001812
销售)。
在一个实施方案中，可以给受试者施用增强表达TFP的细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如程序性死亡1(PD1)可降低表达TFP的细胞引发免疫效应物反应的能力。抑制性分子的示例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达TFP的细胞的性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，可用于抑制抑制性分子在表达TFP的细胞中的表达。在一个实施方案中，所述抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，抑制性分子在表达TFP的细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子表达的dsRNA分子与编码TFP的组分(例如，所有组分)的核酸连接。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，所述剂可以是与PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并且作为
Figure BDA0004038419630001821
销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(tremelimumab)(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，以前称为替西木单抗(ticilimumab)，CP-675,206))。在一个实施方案中，所述剂是与含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白3(TIM3)结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述剂是与淋巴细胞活化基因3(LAG3)结合的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，增强表达TFP的细胞的活性的剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含如本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域，和/或例如CD3ζ的初级信号传导结构域，例如本文所述的。在一个实施方案中，所述融合蛋白由表达TFP的同一细胞表达。在另一个实施方案中，所述融合蛋白由细胞，例如不表达抗肿瘤相关抗原TFP的T细胞表达。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括免疫刺激剂。
在一些实施方案中，所述免疫刺激剂是阻断免疫细胞的抑制性受体或其配体的信号传导的剂。在一些方面，所述抑制性受体或配体选自细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(也称为PD-1或CD279)、程序性死亡配体1(也称为PD-L1或CD274)、转化生长因子β(TGFβ)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3，也称为CD223)、Tim-3(甲型肝炎病毒细胞受体2或HAVCR2或CD366)、神经突蛋白、B和T淋巴细胞衰减子(也称为BTLA或CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)以及它们的组合。在一些方面，所述剂选自抗PD-1抗体(例如派姆单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab))和抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗(atezolizumab))、抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗(ipilimumab))、抗TIM3抗体、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CECAM-1，也称为CD66a)和癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM-5，也称为CD66e)、vset免疫调控受体(也称为VISR或VISTA)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(也称为LAIR1或CD305)、CD160、天然杀伤细胞受体2B4(也称为CD244或SLAMF4)以及它们的组合。在一些方面，所述剂是派姆单抗。在一些方面，所述剂是纳武单抗。在一些方面，所述剂是阿特珠单抗。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的剂。在一些方面，所述抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的另外的治疗剂选自抗体、肽模拟物和小分子。在一些方面，所述抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的另外的治疗剂选自派姆单抗(KEYTRUDA)、纳武单抗(OPDIVO)、阿特珠单抗、阿维单抗(avelumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、磺胺间甲氧嘧啶1和磺胺甲二唑(sulfamethizole)2。在一些实施方案中，所述抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的另外的治疗剂是本领域已知具有此类活性的任何治疗剂，例如如Weinmann等人Chem Med Chem,2016,14:1576(DOI:10.1002/cmdc.201500566)中所述，其通过引用整体并入。在一些实施方案中，将抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的剂配制在与本文提供的抗体相同的药物组合物中。在一些实施方案中，将抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的剂配制在与本文提供的抗体不同的药物组合物中。在一些实施方案中，在施用本文提供的抗体之前施用所述抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的剂。在一些实施方案中，在施用本文提供的抗体之后施用所述抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的剂。在一些实施方案中，所述抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的剂与本文提供的抗体同时施用，但所述剂和抗体以单独的药物组合物施用。
在一些实施方案中，所述免疫刺激剂是免疫细胞的共刺激受体的激动剂。在一些方面，所述共刺激受体选自GITR、OX40、ICOS、LAG-2、CD27、CD28、4-1BB、CD40、STING、toll样受体、RIG-1和NOD样受体。在一些实施方案中，所述激动剂是抗体。
在一些实施方案中，所述免疫刺激剂调节精氨酸酶、吲哚胺-2,3-双加氧酶或腺苷A2A受体的活性。
在一些实施方案中，所述免疫刺激剂是细胞因子。在一些方面，所述细胞因子选自IL-2、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫刺激剂是溶瘤病毒。在一些方面，所述溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、腺病毒、新城疫病毒、痘苗病毒和马拉巴病毒。
另外的治疗剂的进一步示例包括紫杉烷(例如，紫杉醇或多西他赛)；铂类剂(例如卡铂、奥沙利铂和/或顺铂)；拓扑异构酶抑制剂(例如，伊立替康、拓扑替康、依托泊苷和/或米托蒽醌)；亚叶酸(例如，甲酰四氢叶酸)；或核苷代谢抑制剂(例如，氟尿嘧啶、卡培他滨和/或吉西他滨)。在一些实施方案中，另外的治疗剂是亚叶酸、5-氟尿嘧啶和/或奥沙利铂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些实施方案中，另外的治疗剂是紫杉烷和铂类剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是紫杉醇和卡铂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是培美曲塞(pemetrexate)。在一些实施方案中，另外的治疗剂是靶向治疗剂，诸如EGFR、RAF或MEK靶向剂。
另外的治疗剂可以通过任何合适的手段施用。在一些实施方案中，本文提供的药物和另外的治疗剂被包含在同一药物组合物中。在一些实施方案中，本文提供的抗体和另外的治疗剂被包含在不同的药物组合物中。
在其中本文提供的抗体和另外的治疗剂被包含在不同的药物组合物中的实施方案中，抗体的施用可以在另外的治疗剂的施用之前、同时和/或之后发生。在一些方面，本文提供的抗体和另外的治疗剂的施用在彼此的约一个月内发生。在一些方面，本文提供的抗体和另外的治疗剂的施用在彼此的约一周内发生。在一些方面，本文提供的抗体和另外的治疗剂的施用在彼此的约一天内发生。在一些方面，本文提供的抗体和另外的治疗剂的施用在彼此的约十二小时内发生。在一些方面，本文提供的抗体和另外的治疗剂的施用在彼此的约一小时内发生。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是增加与CD70表达升高相关的癌细胞中的CD70水平的剂。在一些实施方案中，增加CD70水平的剂是抑制DNA甲基化的剂。在一些实施方案中，增加CD70水平的剂是抑制DNA甲基转移酶的剂。在一些实施方案中，增加CD70水平的剂是低甲基化剂。低甲基化剂的示例包括但不限于5-阿扎胞苷和地西他滨，并且还包括本领域已知的任何低甲基化剂。在一些实施方案中，低甲基化剂是5-阿扎胞苷。在一些实施方案中，低甲基化剂是地西他滨。在一些实施方案中，低甲基化剂是地西他滨的衍生物或5-阿扎胞苷的衍生物。在一些实施方案中，低甲基化剂是酯化的氮杂胞苷、乙酰化的氮杂胞苷、酯化的地西他滨或乙酰化的地西他滨。
诊断方法
还提供了用于检测来自受试者的细胞上CD70的存在的方法。此类方法可用于例如预测和评价对用本文提供的抗体进行的治疗的反应性。
在一些实施方案中，从受试者获得血液样品并确定表达CD70的细胞的分数。在一些方面，确定由此类细胞表达的CD70的相对量。表达CD70的细胞的分数和由此类细胞表达的CD70的相对量可以通过任何合适的方法确定。在一些实施方案中，使用流式细胞术进行此类测量。在一些实施方案中，使用荧光辅助细胞分选(FACS)进行此类测量。参见Li等人，J.Autoimmunity,2003,21:83-92中评价外周血中的CD70表达的方法。
肿瘤抗原相关疾病或病症
许多用针对肿瘤细胞上的一个靶标(例如，BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、MUC16、MSLN等)的癌症治疗剂治疗的患者随着时间变得耐受，因为逃逸机制(诸如交替的信号传导途径和反馈环)被活化。双特异性治疗剂试图通过组合经常相互替代的靶标作为逃生路线来解决这个问题。具有对超过一种肿瘤相关抗原具有特异性的TCR的治疗性T细胞群是有前景的组合治疗剂。在一些实施方案中，双特异性TFP T细胞与另外的抗癌剂一起施用；在一些实施方案中，所述抗癌剂是抗体或其片段、另一种TFP T细胞、CAR T细胞或小分子。示例性的肿瘤相关抗原包括但不限于，癌胚抗原(例如，在胎儿组织和癌性体细胞中表达的那些)、致癌病毒抗原(例如，由致瘤性转化病毒编码的那些)、过表达/积聚的抗原(例如，由正常组织和赘生性组织两者表达的那些，在赘瘤形成中表达水平高度升高)、癌-睾丸抗原(例如，仅由癌细胞和成人生殖组织诸如睾丸和胎盘表达的那些)、谱系性限制抗原(例如，主要由单一癌症组织型表达的那些)、突变的抗原(例如，由于基因突变或转录改变而由癌症表达的那些)、翻译后改变的抗原(例如，那些肿瘤相关的糖基化改变等)和独特型抗原(例如，来自高度多态性基因的那些，其中肿瘤细胞表达特定克隆型，例如，如在由克隆异常引起的B细胞、T细胞淋巴瘤/白血病中)。示例性的肿瘤相关抗原包括但不限于α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、甲胎蛋白(AFP)、BCR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、COA-1、CSNK1A1、CD79、CD79B、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FNDC3B、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、HSDL1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、MART2、MATN、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、I类肌球蛋白、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARα融合蛋白、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、D393-CD20n、细胞周期蛋白-A1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、LY6K、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12 m、MAGE-C1、MAGE-C2、mucink、NA88-A、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b/GAGED2a、基因/蛋白、CEA、gp100/Pmel17、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PAP、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、脂肪分化相关蛋白、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、HLA-DOB、Hepsin、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠道羧基酯酶、α-胎蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子(Midkine)、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活蛋白、端粒酶、TPBG、VEGF和WT1。
药物组合物
本发明的药物组合物可包含如本文所述的表达TFP的细胞(例如多种表达TFP的细胞)与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或防止)的疾病的方式施用。尽管通过临床试验可以确定适当的剂量，但施用的数量和频率将由诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度之类的因素决定。
在一个实施方案中，药物组合物实质上不含污染物，例如，不存在可检测水平的污染物，例如，选自由以下组成的组的污染物：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠粒、小鼠抗体、汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，所述细菌是选自下组的至少一种细菌：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)和化脓性链球菌A组(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及状况的个体差异的情况下确定待施用的本发明的组合物的精确量。通常可以说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量施用。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。所述细胞可通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要向受试者施用活化的T细胞，随后重新抽取血液(或进行血液单采)，根据本发明从血液中活化T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注给患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可从10cc至400cc的取血中活化T细胞。在某些方面，可从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的取血中活化T细胞。
本发明组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内途径向患者施用本文所述的组合物。在一个方面，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用给患者。在一个方面，本发明的T细胞组合物通过静脉内注射施用。可将T细胞的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在一个特定的示例性方面，受试者可经受白细胞去除术，其中离体收集、富集或耗竭白细胞，以选择和/或分离目标细胞，例如T细胞。这些T细胞分离物可通过本领域已知的方法来扩增并且可被处理成使得可以引入本发明的一种或多种TFP构建体，从而产生本发明的表达TFP的T细胞。有需要的受试者可随后经受用高剂量化学疗法的标准治疗，接着经受外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或同时，受试者接受本发明的扩增的TFP T细胞的输注。在另一个方面，扩增的细胞在外科手术之前或之后施用。
对患者进行的上述治疗的剂量将随着所治疗病状的确切性质和治疗的接受者而变化。用于人施用的剂量缩放(scaling of dosages)可以根据本领域公认的实践进行。例如，对于成年患者，阿仑珠单抗
Figure BDA0004038419630001901
的剂量通常在1mg至约100mg的范围内，通常每天施用，持续1至30天的时段。优选的日剂量为1至10mg/天，但是在一些情况下可以使用高达40mg/天的更大剂量(例如在美国专利号6,120,766中描述的)。
在一个实施方案中，例如使用体外转录将TFP引入T细胞中，并且受试者(例如，人)接受本发明的TFP T细胞的初始施用，和本发明的TFP T细胞的一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用在前一次施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如，人)施用多于一次的本发明的TFP T细胞的施用，例如，每周施用2次、3次或4次本发明的TFP T细胞的施用。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周接受多于一次的TFP T细胞的施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(在本文中也称为一个周期)，随后一周不进行TFP T细胞施用，然后向受试者施用一次或多次另外的TFP T细胞的施用(例如，每周超过一次的TFP T细胞施用)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受超过一个周期的TFP T细胞，并且每个周期之间的时间少于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用TFP T细胞一次，每周施用3次。在一个实施方案中，施用本发明的TFP T细胞至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一个方面，肿瘤相关抗原TFP T细胞使用慢病毒病毒载体诸如慢病毒生成。以这种方式生成的TFP T细胞将具有稳定的TFP表达。
一方面，TFP T细胞在转导后瞬时表达TFP载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。TFP的瞬时表达可通过RNA TFP载体递送来实现。一方面，通过电穿孔将TFP RNA转导到T细胞中。
使用瞬时表达TFP的T细胞(尤其是携带鼠scFv的TFP T细胞)治疗的患者中可出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受这一理论束缚，据信这种过敏反应可能是由患者产生体液性抗TFP反应引起的，即抗TFP抗体具有抗IgE同种型。据认为，当中断暴露于抗原10至14天时，患者的产生抗体的细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果患者在短暂TFP疗法过程中处于产生抗TFP抗体反应(诸如通过RNA转导生成的那些)的高风险中，则TFP T细胞输注中断不应持续超过10至14天。
细胞因子释放
细胞因子释放综合征是全身性炎性反应综合征的一种形式，其作为一些疾病或感染的并发症出现，并且也是一些单克隆抗体药物以及过继T细胞疗法的不良作用。TFP T细胞可以表现出比CAR-T细胞更好的杀伤活性。施用给受试者的TFP T细胞可以表现出比施用给受试者的CAR-T细胞更好的杀伤活性。这可能是TFP T细胞优于CAR-T细胞的优点之一。TFP T细胞可以表现出比CAR-T细胞更少的细胞因子释放。施用TFP T细胞的受试者可表现出比施用CAR-T细胞的受试者更少的细胞因子释放。这可能是TFP T细胞疗法优于CAR-T细胞疗法的优点之一。TFP T细胞可以表现出与CAR-T细胞相比相似或更好的杀伤活性，并且TFP T细胞可以表现出比CAR-T细胞更少的细胞因子释放。施用给受试者的TFP T细胞可以表现出与施用给受试者的CAR-T细胞相比相似或更好的杀伤活性，并且受试者可以表现出比施用CAR-T细胞的受试者更少的细胞因子释放。这可能是TFP T细胞疗法优于CAR-T细胞疗法的优点之一。
在一些情况下，用TFP T细胞进行的治疗的细胞因子释放小于用CAR-T细胞进行的治疗的细胞因子释放。在一些实施方案中，用TFP T细胞进行的治疗的细胞因子释放比用CAR-T细胞进行的治疗的细胞因子释放少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。与CAR-T细胞相比，在用TFP T细胞进行的T细胞治疗中，各种细胞因子释放较少。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β或它们的组合。在一些情况下，与用CAR-T细胞进行的治疗相比，用TFP T细胞进行的治疗释放较少的穿孔蛋白、颗粒酶A、颗酶B或它们的组合。在一些实施方案中，在用TFP T细胞进行的治疗中释放的穿孔蛋白、颗粒酶A或颗酶B比用CAR-T细胞进行的治疗少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％。
在一些实施方案中，对于给定细胞因子，治疗后释放的给定细胞因子的量与用包含相同结合结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的给定细胞因子的量相比少至少10％。在一些实施方案中，给定细胞因子包含一种或多种选自由IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β以及它们的任何组合组成的组的细胞因子。
TFP T细胞在杀伤肿瘤细胞方面可以表现出与CAR-T细胞相比相似或更好的活性。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长受到抑制，使得在至少8天的治疗后，该肿瘤的大小是用不表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物中的肿瘤的大小的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％或至多60％，其中用表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物和用不表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物在治疗之前具有相同的肿瘤大小。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长被完全抑制。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长被完全抑制至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更长时间。在一些实施方案中，用TFP转导的T细胞群杀伤与包含相同结合结构域的CAR-T细胞相比相似的量的肿瘤细胞。
TFP T细胞可以表现出与不表达TFP的细胞不同的基因表达谱。在一些情况下，TFPT细胞可以表现出与CAR-T细胞相似的基因表达谱。在一些其他情况下，TFP T细胞可以表现出与CAR-T细胞不同的基因表达谱。在一些实施方案中，用TFP转导的T细胞群具有与包含相同结合结构域的CAR-T细胞不同的基因表达谱。在一些实施方案中，在用TFP转导的T细胞中基因的表达水平与包含相同结合结构域的CAR-T细胞中所述基因的表达水平不同。在一些实施方案中，所述基因在抗原呈递、TCR信号传导、稳态、代谢、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、toll样受体信号传导、MMP和粘附分子信号传导或TNFR相关信号传导中具有功能。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且除非另有说明，不旨在限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖任何和所有的变型，所述变型由于本文提供的教导而变得明显。无需进一步描述，据信本领域普通技术人员可使用前面的描述和下面的说明性实施例，制备和利用本发明的化合物，并实施所要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于本文提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。
本文引用的所有专利和非专利出版物的全部公开内容各自出于所有目的通过引用整体并入。
实施例1：抗CD70纳米抗体的产生
将经过阉割的原初公羊驼用以下5个癌细胞系免疫接种：
1.人KOPN-8(人B细胞前体白血病，DSMZ编号ACC 552)。
2.人HCC-1419(人乳腺、乳房、上皮，ATCC CRL-2326)。
3.人RERF-LC-KJ(腺癌，JCRB编号JCRB0081)。
4.人JVM-3(慢性B细胞白血病，DSMZ编号ACC 18)，其被工程化为过表达人EGFRvIII。
5.人UACC-62(人黑变病黑素瘤、皮肤，Addex Bio目录号C0020003)，其被工程化为过表达结构域1-4缺失的截短的人CD22。
用在Gerbu佐剂P中的每个细胞系2e7个细胞皮下进行四轮注射。注射时间表如下：第1次和第2次注射间隔3周，第2次和第3次注射间隔2周，以及第3次和第4次注射间隔2周。第4次注射后4天和8天，收集100ml抗凝血用于制备外周血淋巴细胞(PBL)。然后汇集从PBL制备的总RNA样品，并且将约50μg总RNA的汇集物用作模板以用寡聚dT引物进行第一链cDNA合成。使用这种cDNA，通过PCR扩增VHH编码序列，将其用SAPI消化，并克隆到噬菌粒pMECS-GG载体的SAPI位点中。将电感受态大肠杆菌TG1细胞用重组pMECS-GG噬菌粒转化，从而产生约108个独立转化株的噬菌体展示VHH文库。
抗人CD70的免疫VHH文库的淘选
进行三轮淘选以从免疫文库中分离抗CD70 VHH。在所有轮次中，通过携带VHH文库噬菌粒的TG1大肠杆菌的辅助噬菌体感染和随后的PEG/NaCl沉淀产生了展示VHH的噬菌体。在每轮淘选中，将～1012个噬菌体颗粒封闭在淘选缓冲液(PBS+0.01％吐温20+4％w/v脱脂奶粉)中，然后与包被有生物素化人IgG1 Fc(Acro，IG1-H82E2)的链霉亲和素磁珠一起孵育以减去非特异性噬菌体。在减去后，将噬菌体与包被有生物素化人CD70(Acro，CDL-H82Q9)的链霉亲和素磁珠一起在室温下孵育至少1小时。洗涤后，从磁珠上洗脱噬菌体并将其用于感染大肠杆菌以繁殖噬菌粒并产生用于下一轮淘选的噬菌体。每轮中人CD70的浓度变化如下：
第1轮：100nM
第2轮：100nM
第3轮：50nM
第2a轮：0.1nM
第3a轮：0.1nM+与溶液中的100nM人CD70的过夜解离速率竞争
最后一轮淘选后，将回收的噬菌体用于感染SS320大肠杆菌。SS320菌株允许表达可溶性his标记的VHH，其可用于ELISA以鉴定靶结合克隆物。
用于鉴定抗CD70 VHH的重组人CD70 ELISA
将携带单克隆噬菌粒的单个SS320大肠杆菌菌落挑取到96孔培养板中并使其在37℃下在振荡培养箱中生长过夜。第二天，将培养物在200μL体积中重置为～0.05OD600并使其生长至对数中期(0.5<OD600<0.8)。此时，通过添加IPTG至最终浓度为1mM来诱导VHH-his的表达。还向培养物中添加TritonX-100洗涤剂至最终浓度为1％，以促进VHH-His分泌到培养物上清液中。使板在30℃下在振荡培养箱中生长过夜。第二天将板离心并且将含有分泌的VHH-His的上清液施加到用1μg/mL人CD70包被的预封闭ELISA板上。将板在室温下孵育至少1小时。接着，将板用PBST(PBS+0.01％吐温20)洗涤3次，施加二抗(抗his-HRP)，并将板在室温下再孵育30分钟。在3次PBST洗涤之后，将TMB底物施加到板上并且使反应继续进行1-5分钟，然后施加1M HCl作为终止溶液。在施加终止溶液后立即在分光光度计上测量每个孔在450nm下的吸光度(OD450)。将OD450是背景信号的3倍的孔鉴定为阳性结合剂。将阳性结合剂送至Genewiz进行sanger测序以鉴定VHH序列，并保留独特的克隆物用于进一步表征。鉴定出至少87种不同的结合剂。这些结合剂的序列提供于表5中。还已经生成了R3P15F6、R3P3H12、R3aP3E8、R3aP9D10和R3P5A1的人源化型式。R3P15F6的人源化型式具有SEQ ID NO728-731。
人源化R3P15F6
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R3P3H12的人源化型式具有SEQ ID NO 732-734。
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R3aP3E8的人源化型式具有SEQ ID NO 735-737。
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R3aP9D10的人源化型式具有SEQ ID NO 738-740。
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R3P5A1的人源化型式具有SEQ ID NO 741-743。
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实施例2：抗CD70纳米抗体的表征
具有独特抗CD70 VHH的细胞结合ELISA
通过ELISA进一步表征结合剂R3P2G8 VHH、R3P3H12 VHH、R3aP9D10 VHH、R3aP3E8VHH、R2P14A12 VHH和R3P5A1 VHH。使携带独特VHH噬菌粒的SS320大肠杆菌在37℃下在振荡培养箱中生长过夜。第二天，将培养物在1-3mL体积中重置为～0.05OD600并使其生长至对数中期(0.5<OD600<0.8)。此时，通过添加IPTG至最终浓度为1mM来诱导表达VHH-his以用于分泌到大肠杆菌周质中。然后使培养物在30℃下在振荡培养箱中生长过夜。第二天，离心培养物，保留沉淀物，并使用BugBuster主混合物(EMD Millipore,71456)经由制造商的方案提取周质蛋白。使用Ni-NTA磁珠(Promeaga，V8500)和制造商的纯化方案从周质提取物中纯化VHH-his蛋白。纯化后，经由Bradford或BCA蛋白定量测定法或通过NanoDrop A280测量估计VHH-his蛋白的浓度。
进行细胞结合ELISA以确定抗CD70 VHH是否可以识别细胞上的抗原。将各～500nM的VHH-his在封闭缓冲液(PBS+0.01％吐温20+2％脱脂奶粉)中稀释，并添加到含有100,000-200,000个预封闭的CHO-CD70细胞(高CD70表达)、JVM3细胞(中-低CD70表达)、野生型CHO细胞(阴性对照)、HL60细胞(阴性对照)的孔中。将板在室温下搅拌孵育1小时。孵育后，通过离心和倾倒上清液，接着添加PBST来将细胞洗涤3次。随后，施加二抗(抗His-HRP)并将混合物孵育30分钟。在洗涤3次之后，将TMB底物施加到板上并且使反应继续进行1-5分钟，然后施加1M HCl作为终止溶液。在施加终止溶液后立即在分光光度计上测量每个孔在450nm下的吸光度(OD450)。结果示于图1。如图所示，除了1F6和41D12 scFv CD70结合剂以外，所鉴定的R3P2G8 VHH、R3P3H12 VHH、R3aP9D10 VHH、R3aP3E8VHH、R2P14A12 VHH和R3P5A1 VHH结合剂中的每一者也显示出与CHO-CD70细胞(高CD70表达)的最高结合，并且也显示出与CHO型细胞(阴性对照)和HL60细胞(阴性对照)的结合很少。
Octet结合测定
使用生物层干涉测量法测量CD70与CD70靶向抗体41D12、R3P3H12、R3P5A1、R3aP3E8和R3aP9D10以及与人Fc结构域融合的人CD27(CD27-Fc；Acro Biosystems目录号CD7-h5254)的结合亲和力。将N端生物素化的CD70(残基39-193)(Acro Biosystems目录号CDL-H82Q9)在Octet缓冲液[含有0.02％吐温20(体积/体积)和0.1％牛血清白蛋白(重量/体积)的PBS]中稀释到最终浓度为3μg/mL，并固定在Pall ForteBio Dip和ReadTM链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio目录号185019)上至最终生物层厚度为0.5-1.0nm。在CD70固定后，将生物传感器浸入Octet缓冲液中以去除未结合的生物素化CD70并建立平坦的基线传感器信号。然后将负载CD70的生物传感器转移到含有400nM的CD27-Fc或αCD70抗体的Octet缓冲液中，并且在30℃下在以1,000RPM搅拌的同时监测缔合5分钟。源自人源化美洲驼αCD70抗体41D12并与人Fc融合的scFv片段(41D12-Fc)用作CD70结合的阳性对照并且使用α溶菌酶单结构域骆驼抗体(克隆D2-L19)作为阴性对照。通过将传感器转移到Octet缓冲液中引发CD27-Fc或αCD70抗体解离并对该解离监测5分钟。使用ForteBio数据分析套件9.0分析数据。使用1:1曲线拟合模型确定单结构域抗体与CD70结合的观测缔合(k缔合)和解离(k解离)速率，以在所有情况下获得R2≥0.95。从k解离和k缔合的比率确定与CD70结合的平衡解离常数KD的值。将41D12-Fc和CD27-Fc的结合拟合为2:1模型以适应融合Fc结构域的二价，并且在所有情况下实现R2≥0.95。
图2所示的结果证明每种新生成的抗CD70抗体对CD70具有高亲和力。
抗CD70纳米抗体的表位聚类(Epitope bin)分类
使用生物层干涉测量法将CD70靶向抗体1F6、41D12、R3AP3E8、R3AP9D10、R3P3H12和R3P5A1以及与人Fc结构域融合的人CD27(CD27-Fc；Acro Biosystems目录号CD7-h5254)基于CD70结合的成对竞争而分类成表位聚类。所有步骤均在30℃下在以1,000RPM搅拌的同时进行。将N端生物素化的CD70(残基39-193)(Acro Biosystems目录号CDL-H82Q9)在Octet缓冲液[含有0.02％吐温20(体积/体积)和0.1％牛血清白蛋白(重量/体积)的PBS]中稀释到最终浓度为3μg/mL，并固定在Pall ForteBio Dip和ReadTM链霉亲和素生物传感器(PallForteBio目录号185019)上至最终生物层厚度为0.5-1.0nm。将负载CD70的传感器转移到Octet缓冲液中以建立稳定的负载后基线。通过使用400nM的在Octet缓冲液中的Ab1溶液实现CD70的缔合和完全饱和，所述Ab1溶液由单独的αCD70 VHH、单独的人Fc与αCD70 scFv片段的融合体(41D12-Fc和1F6-Fc)，或CD27-Fc组成。该步骤称为饱和步骤。此后，使用Octet缓冲液洗涤CD70生物传感器10秒，并将生物传感器转移到Octet缓冲液中，该缓冲液含有200nM饱和步骤中使用的相同抗体或受体和200nM在Octet缓冲液中的单Ab2(αCD70 VHH、scFv 41D12和1F6或CD27-Fc)。该步骤称为竞争步骤。针对竞争步骤中所有可能的Ab2组合筛选饱和步骤中所有可能的Ab1身份(identities)。
基于竞争步骤的CD70结合信号阈值鉴定表位聚类对。信号阈值被定义为在相同的结合剂被用于饱和和竞争步骤时观察到的最大自阻断CD70结合信号。当Ab1和Ab2在竞争步骤期间都不阻断CD70结合并产生>自阻断阈值的信号时，将非竞争性Ab1/Ab2对分选为独特的表位聚类。竞争性Ab1/Ab2对通过生成≤自阻断阈值的值来加强对CD70结合信号的相互阻断。单向Ab1/Ab2聚类对被定义为基于比较抗原亲和力对CD70结合表现出不对称竞争的对。通过Pall ForteBio数据分析9.0软件分析数据以生成表位聚类矩阵并鉴定聚类、非聚类和单向对。
本文呈现和图3所示的结果证明，抗CD70抗体1F6、41D12、R3AP3E8、R3AP9D10、R3P3H12和R3P5A1中的每一者都一起聚类到CD70的相同表位区，并且除R3P3H12外，所有抗CD70抗体都与CD27聚类。抗体41D12表现出对抗体1F6的单向置换。41D12和1F6两者都置换或阻断CD27和抗体R3AP3E8、R3AP9D10、R3P3H12和R3P5A1与CD70的结合。
CD27竞争测定
CD27竞争测定是通过使抗CD70抗体(1F6、4D12、R3P2G8、R3P3H12、R2P14A12、R3P15F6、R3aP9D10、R3aP4D6、R2P16D9或R3P5A1)与
表达细胞表面附着的CD70的CHO细胞以多种构型在有或无CD27-Fc竞争的情况下接触来进行。图4中例示了实验设计。在第一种条件下，将抗CD70或CD27Fc各自在没有来自于另一种的竞争(无竞争)的情况下直接施加到CHO细胞。在第二种条件(直接竞争)下，将抗CD70抗体与CD27-Fc混合，然后将混合物施加到该细胞。在第三种条件下，首先使CHO细胞与CD27-Fc接触(即预包被)，洗涤，然后施加抗CD70抗体和CD27-Fc的混合物。在第四种条件下，首先将CHO细胞与经过洗涤的抗CD70抗体接触，然后施加抗CD70抗体和CD27-Fc的混合物。然后测量结合信号。图5中呈现的结果证明在所有测试的条件下抗CD70抗体在CD70结合方面的竞争胜过CD27。
实施例3：TFP构建体
通过将CD70 VHH结构域(或scFv结构域)DNA片段克隆到pLRPO载体中来工程化抗CD70 TFP构建体，该CD70 VHH结构域(或scFv结构域)DNA片段通过编码短接头(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:692)或长接头(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:693)的DNA序列连接到CD3或TCR DNA片段。可以使用各种其他载体生成融合蛋白构建体。生成的抗CD70 TFP构建体的示例包括抗CD70-接头-人CD3ε链(包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域)，其中抗CD70抗原结合结构域为1F6 scFv、41D12 scFv、R3P2G8 VHH、R3P3G1 VHH、R3P3H12 VHH、R2P14A12 VHH、R3P15F6 VHH、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3aP4D6 VHH、R2P16D9 VHH和R3P5A1 VHH。
TCR亚基来源
人T细胞受体(TCR)复合物的亚基全部含有胞外结构域和跨膜结构域。CD3ε、CD3δ和CD3γ亚基具有胞内结构域。人TCR复合物含有CD3ε多肽、CD3γ多肽、CD3δ多肽、TCRα链多肽和TCRβ链多肽或TCRδ链多肽和TCRγ链多肽。TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ募集CD3ζ多肽。人CD3ε多肽规范序列为Uniprot登录号P07766。人CD3γ多肽规范序列为Uniprot登录号P09693。人CD3δ多肽规范序列为Uniprot登录号P043234。人CD3ζ多肽规范序列为Uniprot登录号P20963。人TCRα链规范序列为Uniprot登录号Q6ISU1。人TCRβ链C区规范序列为Uniprot登录号P01850，人TCRβ链V区序列为P04435。
人CD3ε多肽规范序列为：MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:694)。
成熟人CD3ε多肽序列为：
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:1235)
人CD3ε的信号肽为：
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQ(SEQ ID NO:695)。
人CD3ε的胞外结构域为：
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD(SEQ ID NO:696)。
人CD3ε的跨膜结构域为：
VMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWS(SEQ ID NO:697)。
人CD3ε的胞内结构域为：
KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:698)。
人CD3γ多肽规范序列为：MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:699)。
成熟人CD3γ多肽序列为：
QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:1265)人CD3γ的信号肽为：
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLA(SEQ ID NO:700)。
人CD3γ的胞外结构域为：
QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATIS(SEQ ID NO:701)。
人CD3γ的跨膜结构域为：
GFLFAEIVSIFVLAVGVYFIA(SEQ ID NO:702)。
人CD3γ的胞内结构域为：
GQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:703)。
人CD3δ多肽规范序列为：MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS(SEQ ID NO:704)。
成熟人CD3δ多肽序列为：
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS(SEQ ID NO:1266)。
人CD3δ的信号肽为：
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSP(SEQ ID NO:705)。
人CD3δ的胞外结构域为：
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVA(SEQID NO:706)。
人CD3δ的跨膜结构域为：
GIIVTDVIATLLLALGVFCFA(SEQ ID NO:707)。
人CD3δ的胞内结构域为：
GHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO:708)。
人CD3ζ多肽规范序列为：MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:709)。
人TCRα链规范序列为：MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA(SEQ ID NO:710)。
人TCRα链恒定区规范序列为：PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:711)。
人TCRα链人IgC序列为：
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLS(SEQ ID NO:712)人TCRα链的跨膜结构域为：
VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(SEQ ID NO:713)。
人TCRα链的胞内结构域为：
SS
人TCRα链V区CTL-L17规范序列为：MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(SEQ ID NO:714)。
鼠TCRα链恒定(mTRAC)区规范序列为：
XIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ IDNO:1267)。
人TCRβ链C区(恒定结构域)规范序列为：EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ IDNO:715)。
人TCRβ链人IgC序列为：
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYE(SEQ ID NO:716)
人TCRβ链的跨膜结构域为：
ILLGKATLYAVLVSALVLMAM(SEQ ID NO:717)。
人TCRβ链V区CTL-L17规范序列为：MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(SEQ ID NO:718)。
人TCRβ链的胞内结构域为：
VKRKDF(SEQ ID NO:719)
人TCRβ链V区YT35规范序列为：MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(SEQ ID NO:720)。
鼠TCRβ链恒定区规范序列为：
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS(SEQ ID NO:1268)
TCRγ9G115
AGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS(SEQ ID NO:1269)
人TCRγ链C区(恒定结构域)规范序列为：
DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS(SEQ ID NO:721)。
人TCRγ人IgC序列为：
DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSA(SEQ IDNO:722)
人TCRγ链的跨膜结构域为：
YYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLL(SEQ ID NO:723)。
人TCRγ链的胞内结构域为：
RRTAFCCNGEKS(SEQ ID NO:724)
TCRδ2cl5
MQRISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDALKRTDTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL(SEQ IDNO:1270)
人TCRδ链C区规范序列为：
SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL(SEQ ID NO:725)。
人TCRδ人IgC序列为：
SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTV(SEQ ID NO:726)
人TCRδ链的跨膜结构域为：
LGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFF(SEQ ID NO:727)。
人TCRδ链的胞内结构域为：
L
TFP表达载体
提供的表达载体包含：启动子(真核延伸因子1α(EF1α启动子)、用于实现分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许附加型复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和用于允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和吉欧霉素(zeocin)标志物)。
如上所述的那样将编码TFP的核酸构建体克隆到pLRPO慢病毒表达载体中。使用抗CD70.TFP慢病毒转移载体产生包装到VSV-G假型慢病毒颗粒中的基因组物质。将Expi293F细胞悬浮在游离式(FS)培养基中并在37℃、8％ CO2、150rpm下孵育1-3小时。将转移DNA质粒、Gag/Pol质粒，Rev质粒和VSV-G质粒在FS培养基中稀释。然后将PEIpro在FS培养基中稀释并添加到DNA和培养基的混合物中。将经孵育的细胞添加到该混合物中，并在37℃、8％CO2、150rpm下孵育18-24小时。第二天，用新鲜培养基更换上清液并补充丁酸钠，并在37℃下再孵育24小时。然后将含有慢病毒的上清液收集到50mL无菌、加盖的锥形离心管中并置于冰上。在4℃下以3000rpm离心30分钟后，用低蛋白结合的0.45μm无菌过滤器过滤澄清的上清液。随后通过Lenti-X浓缩病毒。将病毒储备制备物立即用于感染或等分并储存在-80℃以备将来使用。
实施例4：T细胞受体融合蛋白T细胞的生成
T细胞活化、转导和扩增
通过用来自Miltenyi Biotech的CD4和CD8微珠阳性选择CD4+和CD8+ T细胞来从健康供者白细胞单采物中纯化出T细胞。在第0天，在人IL-7和IL-15(两者均来自MiltenyiBiotech，优质级)的存在下，通过MACS GMP T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)活化从先前制备的冷冻小瓶新鲜分离或解冻的T细胞。在第1天，用编码CD70.TFP的慢病毒转导活化的T细胞。在第4天，洗涤细胞，将其在含有细胞因子的新鲜培养基中继代培养，然后通过在第7天和第9天补充新鲜培养基扩增到第10天。在继代培养的每一天，收获细胞，将其洗涤并用含细胞因子的新鲜培养基重悬，以将细胞悬浮液维持为0.5X106个细胞/mL。
通过细胞染色验证TFP表达
在慢病毒转导后，在细胞扩增的第10天，使用CD70-Fc标签或抗VHH抗体通过流式细胞术证实经转导的T细胞对CD70.TFP的表达。将T细胞在PBS中洗涤三次，然后以每孔2x105个细胞重悬于PBS中。对于死细胞排除，将细胞与
Figure BDA0004038419630002111
可固定的蓝色死细胞染剂(Invitrogen)一起在4℃下在黑暗中孵育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤两次并用人FcR封闭试剂(Miltenyi Biosciences)封闭20分钟。然后将细胞与CD70-Fc标签或抗VHH抗体一起在4℃下在黑暗中孵育30分钟。然后将细胞用染色缓冲液(含2％ FBS的PBS)洗涤两次，并用分别用于检测CD70-Fc标签或抗VHH的FITC缀合的抗人Fc或FITC缀合的链霉亲和素在4℃下在黑暗中染色20分钟。然后将细胞洗涤两次并用染色缓冲液(含2％ FBS的PBS)重悬，并且提交用于在LSR FortessaTM-X20(BD Biosciences)上使用FACS Diva软件进行数据采集。用
Figure BDA0004038419630002121
(BD Biosciences)分析活T细胞(CD3+活细胞)的TFP表达。如图6所示，在所有经CD70.TFP转导的T细胞中检测到CD70-Fc标签的结合。示出了来自一个供者的T细胞的代表性数据。未检测到未经转导的细胞的结合。在用具有结合剂R3P2G8VHH、R3P3H12VHH、R3P15F6 VHH、R3aP9D10 VHH、R2P16D9VHH和R3P5A1 VHH的CD70.TFP转导的T细胞中检测到抗VHH抗体的结合。在未经转导的T细胞中或在用具有结合剂1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R2P14A12 VHH、R3aP4D6 VHH或抗CD19 scFv结合剂的TFP转导的T细胞中未检测到结合。
实施例5：CD70.TFP T细胞的表型分析
测量经CD70.TFP转导的T细胞的表型。如上所述的那样生成CD70.TFP T细胞或非经转导的T细胞。在扩增的第10天，收获来自三个供者的T细胞并通过流式细胞术表征该细胞。通过流式细胞术用APC-Cy7(用于检测CD4+)和PerCP-Cy5.5(用于检测CD8+)确定TFP-T细胞和TFP+ T细胞中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比例。通过流式细胞术用BV786(用于检测CD45RA)和BV421(用于检测CCR7)确定TFP-CD4+ T细胞和TFP+CD4+ T细胞(图8A-图8C)和TFP-CD8+ T细胞和TFP+CD8+ T细胞(图8D-图8F)中T细胞的记忆状态。图9A-图9D示出了CD4+和CD8+ T细胞中针对CD45RA的CD27染色。如图8和图9所示，TFP+细胞展示出比TFP-阴性细胞更高的活化水平，同时仍保留在TFP+细胞的CD8+级分中特别明显的原初样细胞群。为每个FACS图示出了来自1个代表性供者的T细胞。
实施例6：CD70.TFP T细胞的增殖
评估CD70.TFP T细胞的增殖。将具有指示的结合结构域的CD70.TFP T细胞与靶肿瘤细胞以指定的效应细胞:靶细胞比率混合并测量增殖。使用的靶细胞系是具有阴性CD70表达的CHO-WT细胞和具有高CD70表达的THP-1。在第10天，将TFP T细胞解冻并在TexMACS培养基+3％人AB血清+1％青霉素/链霉素+12.5ng/mL IL-7+12.5ng/mL IL-15中于37℃静置24小时。在该静置期后，将T细胞用PBS洗涤两次，并以1e6个T细胞/mL用1uL CellTraceViolet染料(按照制造商的说明重构)一起在预温热的PBS中在37℃水浴中避光孵育20分钟。用含血清的培养基诸如RPMI-1640+10％ FBS(R10)终止反应物，将其孵育5分钟，并洗涤两次。同时，将靶肿瘤细胞以5e6个细胞/mL的浓度重悬于PBS中，并以1:1的比率与Streck细胞防腐剂一起孵育25分钟。然后将靶肿瘤细胞洗涤两次，然后以1e5个细胞/mL的浓度重悬于R10中，并将每孔100uL等分到96孔板中。然后将经CellTrace染色的CD70.TFP T细胞以1e6个细胞/mL的浓度重悬于R10中，并以9:1、3:1和1:1的效应细胞:靶细胞比率添加到同一96孔板中。用R10将孔体积全部调节至200uL，然后孵育72小时。72小时后，将板进行处理用于流式细胞分析并测量MFI(平均荧光强度)。MFI的降低指示细胞分裂/增殖。如图10所示，相对于CHO-WT细胞，当与表达CD70的THP-1细胞接触时，所示表达CD70.TFP的T细胞展现出增强的增殖。
实施例7：基于荧光素酶的细胞毒性测定
基于荧光素酶的细胞毒性测定通过间接测量共同培养后残余活靶细胞中的荧光素酶酶活性来评估TFP T细胞的细胞毒性。经由用编码萤火虫荧光素酶的慢病毒转导来修饰CD70阳性THP-1和CD70阴性K562细胞以使其过表达萤火虫荧光素酶，接着进行抗生素选择以生成稳定的细胞系。
将靶细胞以每孔10000个细胞平板接种在96孔板中。将经CD70.TFP转导的或非经转导的T细胞以不同的效应细胞:靶细胞比率(9:1、3:1或1:1)添加到靶细胞中。然后将细胞的混合物在37℃和5％CO2下培养24小时，之后通过
Figure BDA0004038419630002141
荧光素酶测定系统(
Figure BDA0004038419630002142
目录号E2610)测量活的靶细胞中的荧光素酶酶活性。将细胞离心成沉淀物并重悬于含有荧光素酶底物的培养基中。然后用下式计算肿瘤细胞杀伤百分比：细胞毒性％＝100％x[1-RLU(肿瘤细胞+ T细胞)/RLU(肿瘤细胞)]。
如图11所示，对于所有三个供者，在效应细胞与靶细胞比率的这两种比率下，来自三个供者的具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3P3H12 VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域中的每一者的经CD70.TFP转导的T细胞相对于与CD70阴性K562靶细胞共同培养的经CD70.TFP转导的T细胞或与THP-1或K562细胞共同培养的非经转导的对照T细胞对CD70阳性THP-1细胞展示出增强的细胞毒性。对于每种效应细胞:靶细胞比率，从右到左示出的是所示靶细胞与未经转导的T细胞或具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3P3H12VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域的CD70.TFP T细胞。
实施例8：通过MSD测量细胞因子分泌
与带有同源抗原的细胞的识别相关的效应T细胞活化和增殖的量度是效应细胞因子诸如干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生。
从T细胞与CD70阳性THP-1细胞和CD70阴性K562靶细胞共同培养后24小时收获的上清液，使用
Figure BDA0004038419630002143
生物标志物I组(hu)测定法(Meso Scale
Figure BDA0004038419630002144
LLC，目录号：K15067L-4)测量TFP T的靶特异性细胞因子(包括IFN-γ、IL-2、TNF-αm和GM-CSF)产生。
如图12A和图12B所示，在来自三个供者的与CD70阳性THP-1靶细胞共同培养的具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3P3H12 VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域中的每一者的经CD70.TFP转导的T细胞中观察到IFN-γ、IL-2、TNF-α和GM-CSF的水平相对于与CD70阴性K562靶细胞共同培养的经CD70.TFP转导的T细胞或与THP-1或K562细胞共同培养的非经转导的对照T细胞增加。对于每种效应细胞:靶细胞比率，对于IFN-γ、IL-2和TNF-α，从左到右示出的是K562靶细胞与未经转导的T细胞或具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3P3H12 VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域的CD70.TFP T细胞及THP-1靶细胞与具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3P3H12 VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域的CD70.TFP T细胞。对于每种效应细胞:靶细胞比率，对于GM-CSF，从左到右示出的是K562靶细胞与未经转导的T细胞或具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10 VHH、R3P3H12VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域的CD70.TFP T细胞及THP-1靶细胞与未经转导的T细胞或具有1F6 scFv、R3aP3E8 VHH、R3aP9D10VHH、R3P3H12 VHH和R3P5A1 VHH抗原结合结构域的CD70.TFP T细胞。
实施例9：在具有和没有CD70抗体的情况下生成的T细胞受体融合蛋白T细胞
T细胞活化、转导和扩增。通过用来自Miltenyi Biotech的CD4和CD8微珠阳性选择CD4+和CD8+ T细胞来从健康供者白细胞单采物中纯化出T细胞。在第0天，在人IL-7和IL-15(两者均来自Miltenyi Biotech，优质级)的存在下，通过MACS GMP T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)活化从先前制备的冷冻小瓶新鲜分离或解冻的T细胞。在不存在抗CD70抗体的情况下或在5μM 41D12抗CD70中培养细胞。在第1天，用编码CD70.TFP(具有R3aP3E8 VHH结合结构域，其在一些情况下也标记为70-001)或具有PD-1(PD-1)CD28转换的CD70.TFP的慢病毒以1X106个细胞/mL转导活化的T细胞。在第4天，洗涤细胞，将其在含有细胞因子的新鲜培养基中继代培养，然后扩增至第10天。如果在最初添加，则添加5.0μM的41D12抗体。在第7和9天继代培养细胞。在继代培养的每一天，收获细胞，洗涤，并用含细胞因子的新鲜培养基重悬以将细胞悬浮液维持为0.5X106个细胞/mL。在第7天以1.0μM将41D12添加到经41D12处理的细胞中。
图13中示出了扩增。对于用所述TFP中的每种TFP转导的细胞，在41D12的存在下细胞扩增增加。图13还显示用所述TFP中的每种TFP转导并且在41D12的存在下扩增的细胞的活力增加。
通过细胞染色验证TFP表达
在慢病毒转导后，在细胞扩增的第10天，使用抗VHH抗体通过流式细胞术证实经转导的T细胞对TFP的表达。将T细胞在PBS中洗涤三次，然后以每孔2x105个细胞重悬于PBS中。对于死细胞排除，将细胞与
Figure BDA0004038419630002161
可固定的蓝色死细胞染剂(Invitrogen)一起在4℃下在黑暗中孵育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤两次并用人FcR封闭试剂(MiltenyiBiosciences)封闭20分钟。然后将细胞与iFluor488缀合的抗VHH抗体(GenScript)和BV605缀合的抗CD3抗体(Biolegend)一起在BD Horizon Brilliant Stain缓冲液(BDBiosciences)中在4℃下在黑暗中孵育30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)洗涤两次，然后在4℃下在黑暗中在PBS和4％甲醛的溶液中固定20分钟。然后将细胞洗涤两次并用FACS缓冲液(含2％ FBS的PBS)重悬，并且提交用于在LSR FortessaTM-X20(BDBiosciences)上使用FACS Diva软件进行数据采集。用
Figure BDA0004038419630002162
(BD Biosciences)分析活T细胞(CD3+活细胞)的TFP表达。如图14所示，在所有经TFP转导的T细胞中都检测到抗VHH抗体的结合，表明TFP在细胞表面表达。
TFP T细胞的表型分析
通过流式细胞术评估经TFP转导的T细胞的表型并且将其用图形呈现。如上所述的那样生成TFP T细胞或非经转导的T细胞。在扩增的第10天，收获T细胞并通过流式细胞术用具有以下标签的抗体表征细胞。通过流式细胞术用APC-Cy7(检测CD4+)和PerCP-Cy5.5(用于检测CD8+)确定CD4+与CD8+ T细胞的比例(图15)。通过流式细胞术用BV786(检测CD45RA)和BV421(用于检测CCR7)确定CD4+ T细胞(图16A)和CD8+ T细胞(图16B)中T细胞的记忆状态。图17示出了CCR7水平。图18示出了CD4+和CD8+ T细胞中CD69+(PECy7)细胞的比例。图19A和图19B示出了CD4+和CD8+ T细胞中针对CD70(PE)的CD27(APC)染色。
如图15所示，在用抗CD70抗体处理的TFP+细胞中CD4+和CD8+细胞的比例相对于未处理的细胞是相似的。
如图16A和图16B所示，对于CD4+和CD8+ T细胞两者，相对于未处理的细胞，用抗CD70抗体处理的CD70.TFP+ T细胞和具有PD-1转换的CD70.TFP+ T细胞展示出增加的原初样细胞水平和减少的TEMRA细胞。如图17所示，CD4+和CD8+CD70.TFP+ T细胞及具有PD-1转换的CD70.TFP+ T细胞在用41D12抗体处理时相对于未处理的细胞显示出CCR7水平适度增加。如图18所示，CD4+和CD8+CD70.TFP+ T细胞及具有PD-1转换的CD70.TFP+ T细胞在用41D12抗体处理时相对于未处理的细胞显示出CD69水平增加。这些结果表明在扩增期间用抗CD70抗体处理促进TFP+ T细胞中的原初或中央记忆表型。
图19A和图19B证明，所述抗体阻断非经转导的细胞和所有TFP+ T细胞(包括具有和不具有PD-1转换的CD70.TFP+ T细胞)的细胞表面处的CD70检测。
RNA-seq
还对根据本文所述的方法制备的细胞进行RNA-seq。扩增10天后，从在存在或不存在41D12抗体的情况下生成的具有和不具有PD-1转换的CD70.TFP+ T细胞生成RNA。分析结果示于图20中。对于具有和不具有PD-1转换的CD70.TFP+ T细胞，相对于在不存在抗CD70抗体的情况下生成的细胞，对于在抗CD70抗体的存在下生成的细胞可见原初/记忆相关表型中牵涉的基因上调和效应子/耗竭表型中牵涉的基因下调。
用抗CD70抗体生成的T细胞的细胞毒性和细胞因子产生
基于荧光素酶的细胞毒性测定通过间接测量共同培养后残余活靶细胞中的荧光素酶酶活性来评估TFP T细胞的细胞毒性。经由用编码萤火虫荧光素酶的慢病毒转导来修饰CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞和CD70阳性RCC 786-O细胞以使其过表达萤火虫荧光素酶，接着进行抗生素选择以生成稳定的细胞系。
将靶细胞以每孔10000个细胞平板接种在96孔板中。将经TFP转导的或非经转导的T细胞以不同的效应细胞:靶细胞比率(9:1、3:1或1:1)添加到靶细胞中。然后将细胞的混合物在37℃和5％ CO2下(仅以1:1比率)培养24或72小时，之后通过
Figure BDA0004038419630002181
荧光素酶测定系统(
Figure BDA0004038419630002182
目录号E2610)测量活的靶细胞中的荧光素酶酶活性。将细胞离心成沉淀物并重悬于含有荧光素酶底物的培养基中。然后用下式计算肿瘤细胞杀伤百分比：细胞毒性％＝100％x[1-RLU(肿瘤细胞+ T细胞)/RLU(肿瘤细胞)]。
如图21所示，共同培养24小时后，经CD70.TFP转导的T细胞和经CD70-TFP-PD-1转换转导的TFP细胞在抗CD70抗体的存在下扩增时相对于在CD70抗体不存在的情况下扩增的细胞，特别是在3:1和1:1的效应细胞:靶细胞比率下展示出对CD70阳性THP-1和786-O细胞增强的细胞毒性，表明在扩增期间用抗CD70抗体处理增加了TFP+ T细胞的细胞毒性。本文呈现的结果可以指示，由于在CD70TFP T细胞生成期间自相残杀减少，TFP+ T细胞具有增加的细胞毒性。
在24小时或72小时后从相同的共同培养测定中取出上清液以评估T细胞的以下细胞因子产生：GM-CSF、IFNγ、IL2和TNFα。使用中观尺度发现(MesoScale Diagnostics，LLC)，用U-PLEX生物标志物I组(hu)测定法(目录号：K15067L-4)分析细胞因子的产生。
如图22A-图22H所示，当在抗CD70抗体的存在下扩增时，经CD70.TFP转导的T细胞和经CD70-TFP-PD-1转换转导的TFP细胞在与表达CD70的THP-1或786-O细胞接触时，在24和72小时时展现出相对于未处理的细胞增加的GM-CSF、IFNγ和TNFα产生，但786-O细胞与经CD70-TFP-PD-1转换转导的TFP细胞接触的72小时时间点除外。这些结果指示，当被靶细胞活化时，在扩增期间用抗CD70抗体的处理增加TFP+ T细胞的细胞因子产生。本文呈现的结果可以指示，由于在CD70 TFP T细胞生成期间自相残杀减少，TFP+T细胞具有增加的细胞毒性。
实施例10：T细胞受体融合蛋白T细胞的CD70敲除
T细胞活化、编辑、转导和扩增
通过用来自Miltenyi Biotech的CD4和CD8微珠阳性选择CD4+和CD8+ T细胞来从健康供者白细胞单采物中纯化出T细胞。在第0天，在人IL-7和IL-15(两者均来自MiltenyiBiotech，优质级)的存在下，通过MACS GMP T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)活化从先前制备的冷冻小瓶新鲜分离或解冻的T细胞。在第1天，用编码CD70.TFP的慢病毒以1X106个细胞/mL转导活化的T细胞。在第4天，洗涤细胞，将其在含有细胞因子的新鲜培养基中继代培养，然后通过在第7天和第9天补充新鲜培养基扩增到第10天。在继代培养的每一天，收获细胞，将其洗涤并用含细胞因子的新鲜培养基重悬，以将细胞悬浮液维持为0.5X106个细胞/mL。
对于经CRISPR编辑的CD70 KO细胞，CD70在上述T细胞中在第1天(在转导的同一天)灭活。靶向CD70基因的SpCas9核糖核蛋白(RNP)通过将靶向CD70的crRNA与tracrRNA以1:1的分子比率退火制备。将退火的双链体与SpCas9蛋白以1.5:1的分子比率混合。将0.61μM的RNP与2.5x106个T细胞混合，并按照制造商的氖转染系统的方案进行电穿孔，电穿孔设定为1600V、10ms、3个脉冲。立即将细胞转移至温热培养基中并在37℃下孵育以允许经过编辑的T细胞扩增。
通过细胞染色验证编辑和TFP表达
通过在细胞扩增的第7天和第9天使用PE缀合的CD70抗体(Biolegend)和BV605缀合的抗CD3抗体(Biolegend)经由流式细胞术测量CD70的表面表达的损失来评估编辑功效。如图23A和图23B所示，在第7天和第9天，在测试的所有经过编辑的细胞类型的细胞表面检测到很少的CD70。
在细胞扩增的第10天，如实施例9所述的那样通过流式细胞术证实经转导的T细胞的TFP表达。如图24所示，在所有经TFP转导的T细胞中都检测到抗VHH抗体的结合，表明TFP在细胞表面表达，并且转导效率在非编辑的细胞和经过编辑的细胞之间是相当的。
TFP T细胞的表型分析
如以上在实施例9中所述的那样对经TFP转导的T细胞进行表型分析。在扩增的第10天，收获T细胞并通过流式细胞术用具有以下标签的抗体表征细胞。通过流式细胞术用APC-Cy7(检测CD4+)和PerCP-Cy5.5(用于检测CD8+)确定CD4+与CD8+ T细胞的比例(图25)。图26示出了CD4+和CD8+ T细胞中针对CD70(PE)的CD27(APC)染色。通过流式细胞术用BV786(检测CD45RA)和BV421(用于检测CCR7)确定CD4+ T细胞(图27A)和CD8+ T细胞(图27B)中T细胞的记忆状态。图28示出了CD4+和CD8+ T细胞中CD69+(PECy7)的比例。
如图27A和图27B所示，相对于具有WT CD70的细胞，缺乏CD70的CD4+和CD8+CD70.TFP T细胞具有较高的原初样细胞水平和降低的TEMRA细胞水平。如图28所示，相对于具有WT CD70的细胞，缺乏CD70的CD4+CD70.TFP T细胞和CD8+CD70.TFP T细胞具有降低的CD69+细胞水平。这些结果表明CD70敲除促进TFP+T细胞中的原初表型。
实施例11：CD70 TFP T细胞的抗体阻断
评估抗CD70抗体阻断CD70 TFP活性的能力。在WT或CD3ε敲除的Jurkat中表达70-001(P3E8)TFP。通过流式细胞术评估CD70TFP的表达。通过用生物素标记的CD70或抗VHH抗体染色来确定CD70 TFP表达(图29)。在存在或不存在抗CD70抗体的情况下，将表达CD70TFP的细胞与靶表达细胞共同培养，以评估抗CD70抗体阻断表达TFP的细胞活化的能力。在存在或不存在5μM41D12抗CD70抗体的情况下，将表达CD70 TFP的细胞与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞或CD70阳性JVM3细胞以1:1的比率共同培养16小时。通过CD69表达评估TFP T细胞活化。当与表达CD70的THP-1或JVM3细胞系接触时，表达70-001(P3E8)TFP的野生型和CD3ε敲除的jurkat细胞显示出增加的CD69表达，并且这种T细胞活化的增加在抗CD70抗体的存在下减少(图30和图31)。当与表达CD70的靶细胞接触时，在表达CD70 TFP的细胞中观察到的CD69表达的增加对于JVM3靶细胞比THP-1靶细胞更大，这与JVM3靶细胞具有比THP-1细胞更高的CD70表达水平一致。用三种不同的抗CD70抗体重复实验，在存在或不存在5μM的抗CD70抗体1F6-hFc或70-001-hFc或10μM的41D12的情况下，将表达CD70TFP的CD3ε敲除的jurkat细胞与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞和CD70阳性JVM3细胞以1:1的比率共同培养16小时。用表达CD70 TFP的CD3ε敲除的jurkat细胞观察到类似的结果，该细胞在与THP-1或JVM3靶细胞共同培养后表现出增加的CD69表达，这对于JVM3靶细胞尤其显著。通过向共同培养物中添加三种抗CD70抗体中的任一种来减少这种增加(图32和图33)。这些结果表明抗CD70抗体抑制表达CD70 TFP的Jurkat细胞中通过与靶细胞上的CD70接合所介导的CD69表达的靶细胞依赖性诱导，并且抗体阻断CD69诱导的程度与靶细胞CD70的表达正相关。
实施例12：人scFv抗CD70抗体的生成
通过淘选具有CD70的胞外结构域(aa39-193)的原初人类文库生成结合CD70的人scFv抗体。鉴定了53种抗体。使用两种不同的测定法通过ELISA测量CD27阻断所鉴定的抗体的CD70结合的能力。在第一种测定法中，将CD27和his标记的scFv抗CD70结合剂同时添加到表面结合的CD70中，并用抗His HRP检测scFv结合剂结合CD70的能力。在第二种测定法中，将板结合的CD70与CD27一起预孵育30分钟，然后添加另外的CD27和his标记的scFv抗CD70结合剂。用抗His HRP检测scFv结合剂结合CD70的能力。图34是两种不同的CD27阻断测定法的示意图。还通过SPR分析测量CD70亲和力。还测试了scFv抗体结合具有高CD70表达水平(CHO-CD70、JVM3和U266)和低CD70表达水平(CHO WT和K562)的肿瘤细胞系的能力。39种抗体的结果示于下表1。
表1：人抗CD70 scFv抗体的表征
Figure BDA0004038419630002221
Figure BDA0004038419630002231
Figure BDA0004038419630002241
进行Octet滴定以更充分地表征三种抗CD70 scFv抗体1885(上面的B08)、1985(上面的A11)和1867(上面的C10)对CD70的亲和力(图35)。将生物素化的CD70固定在SA生物传感器上并用指示的6His标记的scFv滴定。数据显示1885和1985结合剂n＝1和1867结合剂n＝2的数据被良好地拟合。该数据是高质量的并且显示scFv以40nM至约55nM的亲和力结合CD70。
实施例13：scFv和VHH抗CD70抗体的表征
对鉴定的scFv和VHH抗体进行表位聚类分析。这通过将CD70生物素固定在SA生物传感器上，使CD70预负载有给定抗体，然后用第二抗体攻击抗体结合的CD70以检测结合来实现。示出了该测定法的示意图(图36)。为了理解CD70 scFv 1885(上面的B08)、1985(上面的A11)和1867(上面的C10)的聚类图谱，将它们针对具有独特聚类行为的VHH抗体进行聚类。虽然测试的所有VHH都映射到CD70的同一通用表位区，但是在聚类实验中，它们可以基于它们彼此竞争的有效程度而被分成小组，它们彼此竞争的有效程度可以反映结合的细微差异。出于该原因，使用70-001和P3H12 VHH以及41d12和CD70受体CD27。所示聚类矩阵证明以红色方框标记的抗体对彼此阻断，并且抗体对以成对方式彼此阻断或置换，并且那些方框以黄色示出(图36)。所述抗体全部属于相同的较大聚类组，但scFv 1985(A11)可以归类为与70-001VHH最相似，1867(C10)在可被70-001VHH和1885(B08)置换的聚类中，并且1885与70-001、1985和1867相似，但大大胜过该子聚类中的其他结合剂。这些数据显示，包括70-001在内的所有CD70结合剂都符合2个聚类，并且在所示聚类矩阵中都以粗体加方框。注意黄色为单向置换，深红色为阻断，浅红色为自阻断，绿色为结合。我们在此显示了所有结合剂与所有其他结合剂一起聚类，但它们可基于CD27阻断细分为2个聚类，因为虽然大多数结合剂阻断CD27与CD70结合，但VHH R3P3H12不会阻断。这些聚类行为似乎是由于结构因素和/或结合动力学，而不仅仅是亲和力。左侧的群落图将亲和力相关的结合剂分组到单个节点并且共有的聚类由箭头连接。箭头方向指示从CD70的置换方向(图36)。
然后通过测试抗体与具有所指示的CD70位置的氨基酸序列的肽的结合，对VHH和scFv抗CD70抗体的子集进行表位作图。发现测试的所有抗体都结合HIQVTLAICSS表位(图37)。C10结合剂还结合第二表位ASRHHPTTLAVGICSPASRSISL(SEQ ID NO:1231)。
实施例14：scFv TFP构建体
通过将通过编码短接头(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:692)或长接头(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:693)的DNA序列连接到CD3或TCR DNA片段的CD70 scFv DNA片段克隆到慢病毒载体中来工程化人scFv抗CD70 TFP构建体。可以使用各种其他载体生成融合蛋白构建体。可以使用的TCR亚基在上述实施例3中有描述。生成的抗CD70 TFP构建体的示例包括抗CD70-接头-人CD3ε链(包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域)，其中抗CD70抗原结合结构域是以下scFv CD70结合结构域中的任一者：
表2：抗CD70结合结构域
Figure BDA0004038419630002261
实施例15：T细胞受体融合蛋白Jurkat细胞的生成和表征
Jurkat细胞活化、转导和扩增
通过如例如共同未决的美国专利公布号2017-0166622中所述的那样用CRISPR技术从野生型(WT)Jurkat细胞中敲除CD3ε亚基来生成CD3ε敲除的Jurkat细胞并且将该细胞用具有上表2中所示的结合剂1-10的CD3εTFP转导，并扩增该细胞。
扩增后，基于检测CD3ε敲除的Jurkat细胞中的CD3表达来验证Jurkat细胞中TFP的表达。也将CD69表达作为T细胞活化的标志物进行评估。所有构建体均显示出高转导效率。观察到CD70 TFP表达使CD69表达增加(图38)。
Jurkat细胞活化的测量
通过与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞及CD70阳性ACHN细胞和CD70阳性786-O细胞共同培养24小时来评估CD70 TFP介导的表达TFP构建体的Jurkat细胞的活化。通过流式细胞术评估CD69表达。如图39所示，相对于与不表达CD70的K562细胞共同培养，与表达CD70的细胞系(THP-1、ACHN或786-O)共同培养后，表达CD70 TFP的Jurkat细胞显示出增加的CD69表达。
还使用实施例8中描述的方法从相同的共同培养实验测量细胞因子产生。测量TNF-α、GM-CSF和IL-2的水平。当与不表达CD70的K562细胞接触时，Jurkat细胞都不产生可检测水平的细胞因子。当与表达CD70的细胞系THP-1、ACHN和786-O接触时，用所述CD70 TFP构建体中的许多CD70 TFP构建体转导的Jurkat细胞表达的细胞因子水平超过非经转导细胞的细胞因子水平(图40)。
实施例16：T细胞受体融合蛋白T细胞的生成和表征
如上所述，细胞表面抗原CD70由于其在各种血液和实体瘤适应症中的选择性过表达而代表了癌症免疫疗法的有前景的靶标。因为CD70的正常组织表达发生在活化的淋巴细胞(包括活化的T细胞)上，自相残杀(自我杀伤)已被认为是CD70靶向的T细胞疗法的重要挑战。为了解决这一挑战，使用上述全人抗CD70 scFv结合剂的不同库来制备TFP T细胞，然后在体外针对自相残杀抗性对该细胞进行功能筛选。鉴定了表现出正常的T细胞扩增和改善的记忆表型的scFv CD70靶向的TFP T细胞候选物(C10 TFP)，其明显区别于有自相残杀倾向的候选物，全部同时维持了针对表达低水平和高水平CD70的肿瘤细胞的有效细胞毒性和细胞因子产生。另外，scFv CD70 TFP T细胞在多种异种移植小鼠模型中显示出强效的抗肿瘤功效(参见实施例21)，没有体内自相残杀的证据。总的来说，如下所示，已经开发了具有治疗多种血液癌症和实体癌的潜力的抗自相残杀的CD70 TFP T细胞疗法。
从三个健康供者中纯化T细胞，根据实施例4中描述的方法用具有上表2所示的结合剂1-10的CD3εTFP、TC-110或70-001CD3εTFP转导该细胞。用人T细胞TransAct(MiltenyiBiotech)，用重组人IL-7和IL-15活化和扩增具有所指示的TFP的T细胞10天。三个供者的T细胞扩增示于图41。“有自相残杀倾向的结合剂”指示70-001TFP。将每个测试的构建体在制造过程结束时的扩增倍数针对NT T细胞(n＝3个供者)的扩增作归一化。
扩增后，通过流式细胞术评估转导效率。使用Fc-CD70蛋白通过流式细胞术检测抗CD70结合剂表面表达来评估转导效率。“无自相残杀”指示TC-110，“有自相残杀倾向”指示70-001TFP。1-10对应于具有表2中所示的结合剂1-10的CD3εTFP。如图42所示，所有TFP构建体都实现高转导效率。
TFP T细胞的表型分析
在扩增的第10天，收获T细胞并通过流式细胞术表征细胞。在图43中示出了一个代表性供者的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率。在构建体之间没有检测到CD4+ T细胞与CD8+T细胞比率的显著差异。通过表面CD69表达评价T细胞活化。在图44中示出了一个代表性供者的数据。对一些scFv TFP(例如，TC7-VI-H08 vHvL TFP)观察到高水平的CD69表达，可能指示由于CD70 TFP顺式结合、自身活化和/或自相残杀引起的细胞活化。通过CD45RA和CCR7的表面表达确定T细胞分化(原初的，CD45RA+CCR7+；CM，CD45RA-CCR7+；EM，CD45RA-CCR7-；TEMRA，CD45RA+CCR7-)。在图45中示出了一个代表性供者的数据。对包括TC4-I-C10 vLvH、TC6-IV-B08 vLvH和TC6-IV-B08 vHvL在内的几种scFv CD70结合剂TFP观察到原初T细胞群(CD45RA+CCR7+)的保存。图46汇总了每种人scFv CD70 TFP的特征。
T细胞的细胞毒性和细胞因子产生
通过在与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞和CD70阳性ACHN细胞以及CD70阳性786-O细胞共同培养后评估细胞毒性和细胞因子产生来评估CD70 TFP介导的表达TFP构建体的供者T细胞的活化。图47示出了如通过流式细胞术确定的THP-1、ACHN和786-O细胞系的CD70表达。
如实施例7所述的那样测量细胞毒性。将表达CD70 TFP的T细胞或对照与表达荧光素酶的THP-1、ACHN、786-O或K562细胞以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时。然后测量活的靶细胞中的荧光素酶活性并如上所述的那样计算细胞毒性。在图48中示出了一个代表性供者的数据。如图所示，表达所述scFv CD70 TFP中的许多scFv CD70 TFP的T细胞对表达CD70的细胞表现出细胞毒性，但对不表达CD70的K562细胞未表现出细胞毒性。具体而言，包括TC4-I-C10 vLvH、TC7-VI-H08 vLvH、TC7-III-A11 vLvH、TC6-IV-B08vLvH、TC4-I-C10vHvL、TC7-VI-H08 vHvL和TC7-III-A11 vHvL在内的scFv CD70结合剂TFP对表达CD70的细胞系THP-1、ACHN和786-O表现出高水平的细胞毒性。
还使用实施例8中描述的方法从相同的共同培养实验测量细胞因子产生。检测IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-2的水平。在图49中示出了一个供者的代表性数据。表达scFvCD70结合剂TFP(包括TC4-I-C10 vLvH、TC7-III-A11 vLvH、TC4-I-C10 vHvL和TC7-III-A11vHvL)的T细胞在与表达CD70的细胞系THP-1、ACHN和786-O共同培养时，表现出高水平的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-2表达，并且在与CD70-K562细胞共同培养时不表达细胞因子。
实施例17：具有人源化VHH结合结构域的CD70 TFP的生成
人源化CD70 VHH TFP是通过将70-001结合剂人源化以生成具有SEQ ID NO:1224-1227的人源化VHH抗CD70抗原结合结构域来生成的。通过将通过编码短接头(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:692)或长接头(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:693)的DNA序列连接到CD3或TCR DNA片段的CD70 VHH DNA片段克隆到慢病毒载体中来工程化抗CD70 TFP构建体。可以使用各种其他载体生成融合蛋白构建体。可以使用的TCR亚基在上述实施例3中有描述。本实施例中呈现的数据还包括来自上述实施例12的人scFv结合剂TC1.2-I-F07-6和TC7-VII-C02的数据。
根据实施例4中描述的方法，从三个健康供者纯化T细胞，将该细胞用TC-110(具有CD3ε的FMC63抗CD19)，具有VHH结合剂70-001(P3E8)的CD3εTFP，人源化VHH结合剂h7、h8、h9或h11，人scFv结合剂TC1.2-I-F07-6(F07-6)、TC7-VII-C02(C02)或TC4-I-C10vLvH(C10)转导。用人T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)，用重组人IL-7和IL-15活化和扩增具有所指示的TFP的T细胞10天。在图50中示出了对于具有结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6、TC-110的TFP和非经转导的细胞，三个供者的T细胞扩增。在图57中示出了具有结合剂70-001、h9、h11、C10的TFP和非经转导的细胞的三个供者的T细胞扩增。
通过细胞染色验证TFP表达
扩增后，通过流式细胞术评估转导效率。对于具有结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6和TC-110的TFP，在图51中示出了使用Fc-CD70蛋白通过流式细胞术检测抗CD70结合剂表面表达对转导效率的评估。表达具有所有人源化结合剂的TFP的细胞显示出强转导效率，而对于人scFv结合剂C02和F07-6而言转导效率较弱。对于具有结合剂70-001、h9和h11的TFP，在图58中示出了通过流式细胞术检测抗VHH抗体对转导效率的评估。用所有构建体都观察到强转导效率。
TFP T细胞的表型分析
在扩增的第10天，收获T细胞并通过流式细胞术表征细胞。图52中示出了对于用具有结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6、TC-110的TFP转导的T细胞和非经转导的细胞，对来自三个供者的CD4+和CD8+ T细胞的检测。图59中示出了对于用具有结合剂70-001、h9、h11的TFP转导的T细胞和非经转导的细胞，对来自三个供者的CD4+和CD8+ T细胞的检测。虽然供者之间CD4+:CD8+ T细胞的比率不同，但是在构建体之间没有显著差异。通过CD45RA和CCR7的表面表达确定T细胞分化(原初的，CD45RA+CCR7+；CM，CD45RA-CCR7+；EM，CD45RA-CCR7-；TEMRA，CD45RA+CCR7-)。图53中示出了两个供者的表达具有结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6、TC-110的TFP的T细胞和非经转导的细胞的结果。图60中示出了对于CD3+ T细胞及对于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，一个代表性供者的表达具有结合剂70-001、h9、h11的TFP的T细胞和非经转导的细胞的结果。对于结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6和TC-110，还测量CD69的细胞表面表达作为来自三个供者的细胞中的细胞活化的量度(图60)。
T细胞的细胞毒性和细胞因子产生
通过在与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞和CD70阳性ACHN细胞以及CD70阳性786-O细胞共同培养后评估细胞毒性和细胞因子产生来评估CD70 TFP介导的表达TFP构建体的供者T细胞的活化。对于具有结合剂70-001和C10的TFP，还评价了如实施例9中所述在41D12抗CD70抗体的存在下生成的T细胞，并且还测试了CD70阳性MOLM13靶细胞。THP-1、ACHN和MOLM13具有中等水平的表达，而786-O具有高水平的CD70表达。
如实施例7所述的那样测量细胞毒性。将表达CD70 TFP的T细胞或对照与表达荧光素酶的THP-1、ACHN、786-O、MOLM13或K562细胞以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时。然后测量活的靶细胞中的荧光素酶活性并如上所述的那样计算细胞毒性。图55中示出了对于表达具有结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6、TC-110的TFP的T细胞或非经转导的对照，一个代表性供者的数据。如图所示，表达70-001TFP和每种人源化CD70 TFP(v7、v8和v9)的T细胞对表达CD70的细胞THP-1、ACHN、786-O表现出高水平的细胞毒性，但对不表达CD70的K562细胞未表现出细胞毒性。表达C02和F07-6 TFP的T细胞对表达CD70的靶细胞表现出中等细胞毒性，而F07-6展示出比C02更高的细胞毒性。在图61中示出了对于在41D12抗体不存在的情况下生成的表达具有结合剂70-001、h9、h11和C10的TFP的T细胞，对于在41D12抗体的存在下生成的具有70-001或C10 TFP的T细胞，以及对于非经转导的细胞，一个代表性供者的数据。所有表达TFP的细胞对表达CD70的THP-1、ACHN、786-O和MOLM 13靶细胞表现出高细胞毒性，但对不表达CD70的K562细胞未表现出细胞毒性。
还使用实施例8中描述的方法从相同的共同培养实验测量细胞因子产生。检测IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-2的水平。在图56中示出了对于表达具有结合剂70-001、h7、h8、h9、C02、F07-6、TC-110的TFP的T细胞或非经转导的对照，一个代表性供者的数据。如图所示，表达70-001TFP和每种人源化CD70 TFP(h7、h8和h9)的T细胞响应于与表达CD70的细胞THP-1、ACHN、786-O共同培养表现出高水平的细胞因子产生，但是响应于与ACHN细胞系共同培养的IL-2表达的诱导是中等的。表达C02和F07-6 TFP的T细胞响应于与表达CD70的靶细胞的共同培养表现出中等水平的细胞因子产生，而F07-6展示出比C02更高的水平的细胞因子产生。
图62示出了对于在41D12抗体不存在的情况下生成的表达具有结合剂70-001、h9、h11或C10的TFP的T细胞，对于在41D12抗体的存在下生成的具有70-001或C10 TFP的T细胞，以及对于非经转导的细胞，一个代表性供者的数据。在存在或不存在41D12抗体的情况下生成的C10 TFP响应于与表达CD70的细胞THP-1、ACHN、786-O和MOLM13共同培养表现出最高水平的细胞因子产生。表达具有结合剂70-001(在存在或不存在41D12抗体的情况下生成)、h9和h11的TFP的T细胞也响应于与表达CD70的细胞THP-1、ACHN、786-O和MOLM13共同培养而产生细胞因子。所述T细胞中的任何T细胞响应于与不表达CD70的K562细胞共同培养产生的细胞因子可忽略不计。
实施例18：用另外的融合蛋白生成CD70 TFP
C10 CD70 scFv TFP T细胞被工程化成进一步表达PD-1CD28融合蛋白或膜结合的IL15(通过柔性接头与IL15Ra融合的Il15)。TFP和PD-1CD28融合蛋白或膜结合的IL-15在相同的阅读框中表达并且通过自切割肽与TFP分开。例如，在一些实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列。对于另一个示例，在一些实施方案中，表达构建体包含编码选自SEQ ID NO:1233、1236、1240或1264的氨基酸序列的重组核酸分子。对于另一个示例，在一些实施方案中，融合蛋白包含选自表12中列出的序列的氨基酸序列。对于另一个示例，在一些实施方案中，表达构建体包含编码选自表12中列出的序列的氨基酸序列的重组核酸分子。
根据实施例4中描述的方法纯化和转导T细胞。用人T细胞TransAct(MiltenyiBiotech)，用重组人IL-7和IL-15活化和扩增具有所指示的TFP的T细胞10天。T细胞扩增示于图63。
通过细胞染色验证TFP表达
在扩增的第10天，收获T细胞并通过流式细胞术表征细胞。评估转导效率。结果示于图64中。还测量了IL-15Ra和PD-1的表面表达。所有构建体均表现出高转导效率。在用C10CD70 TFP和PD-1CD28融合蛋白转染的细胞表面上检测到PD-1。在用C10 CD70 TFP和膜结合的IL15转染的细胞表面上检测到IL15Ra。
TFP T细胞的表型分析
在图65中示出了在用C10 TFP，用C10 TFP与PD-1CD28融合蛋白，或用C10 TFP与膜结合的IL15转导的细胞中对CD4+ T细胞的检测。T细胞分化通过CD45RA和CCR7(原初，CD45RA+CCR7+；CM，CD45RA-CCR7+；EM，CD45RA-CCR7-；TEMRA，CD45RA+CCR7-)在CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的表面表达确定。图66中的结果显示，相对于表达CD10 TFP的T细胞，表达C10 TFP与膜结合的IL15的细胞显示出增加的原初T细胞比例。
实施例19：另外的人scFv抗CD70抗体的生成
为了生成另外的人scFv抗CD70抗体，将alloy人源化小鼠用CD70免疫接种。选择滴度阳性小鼠收获组织并生成杂交瘤。针对与表达CD70的细胞系的结合以及它们在CD27的存在下结合CD70的能力，对杂交瘤产生的抗体进行筛选。靶细胞结合示于下表3。CD70的Octet亲和力数据示于下表4中。
表3：alloy小鼠生成的CD70抗体与+/-CD70细胞系的结合
Figure BDA0004038419630002341
Figure BDA0004038419630002351
表4：alloy小鼠生成的CD70抗体的Octet结合数据
Figure BDA0004038419630002352
Figure BDA0004038419630002361
将对CD70具有高亲和力的抗体9A11、15F8、13C1、9A1、1E3、4G7和2F1以vLvH和vHvL取向克隆到scFv格式(format)中以生成scFv抗体15F8D8 VH VL、15F8D9 VL VH、9A11E8 VHVL、9A11E8 VL VH、9A1H6 VH VL、9A1H6 VL VH、4G7E8 VH VL、4G7E8 VL VH、2F1F7 VH VL、2F1F7 VL VH、1E3D9 VH VL、1E3D9VL VH、13C1G6 VH VL1、13C1G6 VL1 VH、13C1G6 VH VL2和13C1G6 VL2 VH。
实施例20：另外的scFv TFP构建体
通过将通过编码短接头(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:692)或长接头(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:693)的DNA序列连接到CD3或TCR DNA片段的CD70 scFv DNA片段克隆到慢病毒载体中来工程化人scFv抗CD70 TFP构建体。可以使用各种其他载体生成融合蛋白构建体。可以使用的TCR亚基在上述实施例3中有描述。生成的抗CD70 TF P构建体的示例包括抗CD70-接头-人CD3ε链，其中抗CD70抗原结合结构域是1E3D9 vHvL、2F1F7 vLvH、9A11E8 vLvH、13C1G6 v LvH、13G6E8 vLvH或15F8D8 vLvH。
根据实施例4中描述的方法，纯化来自两个供者的T细胞并用上述人scFv TFP或用C10 TFP转导该细胞。用人T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)，用重组人IL-7和IL-15活化和扩增具有所指示的TFP的T细胞10天。T细胞扩增示于图67。
通过细胞染色验证TFP表达
在扩增的第10天，收获T细胞并通过流式细胞术表征细胞。用抗Fab抗体评估转导效率。还测量了CD8阳性率。两个供者的结果示于图68中。所有构建体均表现出高转导效率。
TFP T细胞的表型分析
在两个供者中测量经转导的T细胞表面上的CD70表达。还测量CD8表达以评估表达CD70的CD4+和CD8+细胞的比例。相对于未转导的对照，用C10 TFP、9A11E8 vLvH TFP、13G6E8 vLvH TFP和15F8D8 vHvL TFP转导的T细胞具有极低水平的表达CD70的细胞(图69)。
T细胞分化通过两个供者中CD45RA和CCR7(原初，CD45RA+CCR7+；CM，CD45RA-CCR7+；EM，CD45RA-CCR7-；TEMRA，CD45RA+CCR7-)在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的表面表达确定。结果在图70中示出。
T细胞的细胞毒性
通过在与CD70阴性K562细胞、CD70阳性THP-1AML细胞和CD70阳性ACHN细胞以及CD70阳性786-O细胞共同培养后评估细胞毒性来评估CD70 TFP介导的表达TFP构建体的供者T细胞的活化。
如实施例7所述的那样测量细胞毒性。将表达CD70 TFP的T细胞或对照与表达荧光素酶的THP-1、ACHN、786-O或K562细胞以3:1、1:1或1:3的比率共同培养24小时。然后测量活的靶细胞中的荧光素酶活性并如上所述的那样计算细胞毒性。两个供者的数据示于图71中。如图所示，表达C10 TFP、9A11E8 vLvH TFP、13G6E8 vLvH TFP和15F8D8 vHvL TFP的T细胞对表达CD70的细胞表现出细胞毒性，但对不表达CD70的K562细胞未表现出细胞毒性。
实施例21：CD70 TFP的体内功效
RCC小鼠模型
在皮下人肾细胞癌786-O、NSG小鼠模型中评价如上所述在存在或不存在抗CD70抗体的情况下生成的具有或不具有PD-1转换的表达CD70.TFP的T细胞的体内抗肿瘤功效。
向NSG小鼠的胁腹皮下(SC)注射3x106个786-O-luc细胞(200ul)。在肿瘤植入后18天，当小鼠的肿瘤体积为100-150mm3时，将小鼠分配到功效组(N＝5)，使得每组具有相同的平均肿瘤体积(+/-10％)。给小鼠静脉内注射3x106个CD70 TFP T细胞(具有或不具有PD-1转换)或～3.3x106个总T细胞(NT)。用RPMI媒介物治疗媒介物组的小鼠。试验品注射日为研究第0天。每周2次通过卡尺测量确定肿瘤体积。
如图72A所示，用在抗CD70抗体的存在下生成的70-001CD70TFP T细胞(具有或不具有PD-1转换)治疗的小鼠和用C10 CD70 TFP T细胞(在不存在抗CD70抗体的情况下生成)治疗的小鼠相对于用在不存在CD70抗体的情况下生成的70-001CD70 TFP T细胞治疗的小鼠和相对于用媒介物或未经转导的T细胞治疗的小鼠具有明显减小的肿瘤体积。
然后在研究第43天用每只动物3x106个786-O细胞(皮下)再次攻击无肿瘤小鼠。未接受治疗的原初小鼠被接种了肿瘤细胞作为对照。结果示于图72B中。相对于对照小鼠，用任何CD70 TFP治疗的小鼠继续表现出肿瘤体积减小。结果证明CD70靶向的TFP T细胞表现出有效和持久的体内功效。
全身性人伯基特淋巴瘤Raji小鼠模型
在全身性人伯基特淋巴瘤Raji小鼠模型中评价如上所述在存在或不存在抗CD70抗体的情况下生成的具有或不具有PD-1转换的表达CD70.TFP的T细胞的体内抗肿瘤功效。
向NSG小鼠尾静脉中静脉内注射5x105个Raji-luc细胞(100ul)。肿瘤植入后4天，当小鼠具有5-7e6的全身发光时，将小鼠分配到功效组(N＝5)，使得每组的平均肿瘤体积相似。给小鼠静脉内注射2x106个CD70 TFP T细胞(具有或不具有PD-1转换)或～3.3x106个总T细胞(NT)。用RPMI媒介物治疗媒介物组的小鼠。试验品注射日为研究第0天。每周两次通过IVIS生物发光全身成像确定肿瘤体积。
如图73所示，用70-001CD70 TFP T细胞或C10 CD70 TFP细胞治疗的小鼠相对于未经转导的T细胞减小了肿瘤体积。在抗CD70抗体的存在下生成的70-001TFP细胞(具有或不具有PD-1转换)相对于用在不存在CD70抗体的情况下生成的CD70 TFP T细胞治疗的小鼠和相对于用媒介物或未经转导的T细胞治疗的小鼠具有明显减小的肿瘤体积。
全身性人类急性骨髓性白血病MOLM-13小鼠模型
在全身性人类急性骨髓性白血病MOLM-13小鼠模型中评价如上所述在存在或不存在抗CD70抗体的情况下生成的表达CD70.TFP的T细胞的体内抗肿瘤功效。
向NSG小鼠静脉内注射5x104个MOLM-13-Luc细胞。四天后，当小鼠具有5x106-9x106的全身发光时，在研究第0天，荷瘤小鼠接受所指示的TFP T细胞的单次静脉内输注。给单个动物施用5x106或1x107个TRuC-T细胞或～1.7x107个总T细胞(NT)。N＝5只小鼠/组。用RPMI媒介物治疗媒介物组的小鼠。每周两次通过IVIS生物发光全身成像确定肿瘤生长。
如图74所示，用70-001CD70 TFP T细胞或C10 CD70 TFP细胞治疗的小鼠相对于未经转导的T细胞减少了肿瘤体积。当使用1x107个TRuC-T细胞时，肿瘤体积的减小特别显著，无论TFP T细胞是在存在还是不存在41D12抗体的情况下生成的。
ACHN肾癌鼠模型
在皮下人肾细胞癌ACHN、NSG小鼠模型中评价如上所述在存在或不存在抗CD70抗体的情况下生成的表达CD70.TFP的T细胞的体内抗肿瘤功效。
向NSG小鼠胁腹皮下注射2x106个ACHN-luc细胞(200ul，含1:1Matrigel)。肿瘤植入后12天，当小鼠肿瘤体积为～150mm3(50-200mm3)时，将小鼠分配到功效组(N＝5)，使得每组的平均肿瘤体积相似(+/-10％)。将剩余小鼠分选到卫星队列(对于媒介物对照组N＝6，NT)，使得每组具有相同的平均肿瘤体积(+/-10％)。给小鼠静脉内注射5x106个CD70 TFPT细胞或～7x106个总T细胞(NT)。用RPMI媒介物治疗媒介物组的小鼠。试验品注射日为研究第0天。每周2次通过卡尺测量确定肿瘤体积。
如图75所示，用在存在或不存在41D12抗体的情况下生成的70-001CD70 TFP T细胞或C10 CD70 TFP细胞治疗的小鼠相对于未经转导的T细胞明显减少了肿瘤体积。
其他实施方案
上述公开内容可以涵盖具有独立效用的多个不同的发明。尽管这些发明中的每一个都已经以其优选形式公开，但是如本文公开和说明的其具体实施方案不应在有限的意义上进行考虑，因为许多变型是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种要素、特征、功能和/或特性的所有新的且非显而易见的组合和子组合。所附权利要求书特别指出了被认为是新的且非显而易见的某些组合和子组合。以特征、功能、要素和/或特性的其他组合和子组合实施的发明可以在本申请中，在要求本申请优先权的申请中，或在相关申请中要求保护。此类权利要求，无论是针对不同的发明还是针对相同的发明，以及无论与原始权利要求相比在范围上是更宽的、更窄的、相等的还是不同的，也都被认为包括在本公开的发明的主题内。
示例性实施方案
以下是前述实施方案和示例的各方面和各方面的组合的说明性示例：
1.一种重组核酸分子，其包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：
(a)TCR亚基，其包含：
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR跨膜结构域，
(iii)TCR胞内结构域，和
(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且
其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
2.如实施方案1所述的重组核酸分子，其中当所述TFP在T细胞中表达时，所述TFP与内源TCR复合物功能性地相互作用。
3.如实施方案1或2所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞内结构域包含来自CD3γ、CD3δ或CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域。
4.如实施方案1-3中任一项所述的重组核酸分子，其中与不含所述TFP的T细胞相比，表达所述TFP的T细胞表现出增加的对表达CD70的人细胞的细胞毒性。
5.如实施方案1-4中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域通过接头序列连接到所述TCR胞外结构域。
6.如实施方案5所述的重组核酸分子，其中所述接头的长度为120个氨基酸或更少。
7.如实施方案5所述的重组核酸分子，其中所述接头序列包含(G4S)n，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。
8.如实施方案7所述的重组核酸分子，其中n是1至4的整数。
9.如实施方案1-8中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自相同的TCR亚基。
10.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRα。
11.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRβ。
12.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRγ。
13.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRδ。
14.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3ε。
15.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3δ。
16.如实施方案9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3γ。
17.如实施方案9-16中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域三者全部来自相同的TCR亚基。
18.如实施方案1-17中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是骆驼抗体或其结合片段。
19.如实施方案1-17中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是鼠抗体或其结合片段。
20.如实施方案1-17中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是人或人源化抗体或其结合片段。
21.如权利实施方案1-20中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。
22.如实施方案1-21中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)。
23.如实施方案22所述的重组核酸分子，其中所述sdAb是VHH。
24.如实施方案1-23中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域以100nM或更低或约0.001nM至约100nM的KD值与人CD70结合。
25.如实施方案1-24中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域不与CD27竞争与CD70结合，不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
26.如实施方案1-24中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与CD27竞争与CD70结合，抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
27.如实施方案1-26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含可变结构域，所述可变结构域包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3。
28.如实施方案27所述的重组核酸分子，其中所述CDR1、CDR2和CDR3选自由以下组成的组：
(vii)包含X1X2FX3IX4RGX5的序列的CDR1；
包含AIX6TSGX7ATX8YA的序列的CDR2；和
包含CNMEX11X12X13YRX14YW的序列的CDR3；
(viii)包含X15X16X17X18X19YX20X21X22的序列的CDR1:
包含X23CX24X25SX26X27X28X29X30KYA的序列的CDR2；和
包含CX31AAX32PX33DDCSVX34GX35YGLNYW的序列的CDR3；
(ix)包含X36TFDAYAIG的序列的CDR1；
包含ICLSPSDGSTYYA的序列的CDR2；和
包含CAX37PSWCSLKADFGSW的序列的CDR3；
(x)包含SIIRDNVMA的序列的CDR1；
包含AIINX38GGSX39NVD的序列的CDR2；和
包含CNVYYRX40LW的序列的CDR3；
(xi)包含SIFSIARMN或FTLDYYAIA的序列的CDR1；
包含AILNRAGRTDYA的序列的CDR2；和
包含CNLQTISYHDFW的序列的CDR3；以及
(xii)包含SIFSATRME的序列的CDR1；
包含AIVTSGGRTNYA的序列的CDR2；和
包含CKFERYDYVNYW的序列的CDR3；
其中X1-X39是任何天然存在的氨基酸。
29.如实施方案28所述的重组核酸分子，其中：
(i)X4是非极性氨基酸；
(ii)X5是极性氨基酸；
(iii)X6是非极性氨基酸；
(iv)X11是极性氨基酸；
(v)X12是非极性氨基酸；
(vi)X16是极性氨基酸；
(vii)X18是带负电荷的氨基酸；
(viii)X21是非极性氨基酸；
(ix)X24是非极性氨基酸；
(x)X25是极性氨基酸；
(xi)X29是非极性氨基酸；以及/或者
(xii)X39是非极性氨基酸。
30.如实施方案28或29所述的重组核酸分子，其中：
(i)CDR1包含X1X2FX3IX4RGX5的序列，
其中X1为S或G；X2为I或T；X3为D或G；X4为V或A；并且X5为S或N；
CDR2包含AIX6TSGX7ATX8YA的序列，
其中X8为I或V；X9为G或D；并且X10为N或D；并且
CDR3包含CNMEX11X12X13YRX14YW的序列，
其中X11为S或T；X12为F、V或L；X13为R或S；并且X14为N或H；
(ii)CDR1包含X15X16X17X18X19YX20X21X22的序列，
其中X15为F、L或R；X16为T、S或N；X17为L、F或R；X18为D或E；X19为R、H、Y、K、N；X20为S、A或T；X21为I、V或M；并且X22为G或N；
CDR2包含X23CX24X25SX26X27X28X29X30KYA的序列，
其中X23为S、A、T或L；X24为I或V；X25为S或T；X26为S、K或N；X17为G或S；X28为G或D；X29为I、L或V；并且X30为P、T、I或V；并且
CDR3包含CX31AAX32PX33DDCSVX34GX35YGLNYW的序列，
其中X31为G、T或A；X32为T、G或D；X33为D、P、A或K；X34为P、A或H；并且X35为H或Y；
(iii)CDR1包含X36TFDAYAIG的序列，
其中X36为F或H；
CDR2包含ICLSPSDGSTYYA的序列；并且
CDR3包含CAX37PSWCSLKADFGSW的序列，
其中X37为T或A；或
(iv)CDR1包含SIIRDNVMA的序列；
CDR2包含AIINX38GGSX39NVD的序列，
其中X38为T或I；且X39为A或G；并且
CDR3包含CNVYYRX40LW的序列，
其中X40为D或G。
31.如实施方案1-30中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:603-620或622-688中的任一者具有至少90％序列同一性的可变结构域。
32.如实施方案31所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域与SEQ ID NOs:603-620或622-688中的任一者具有至少95％序列同一性。
33.如实施方案32所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:603-620或622-688中任一者的序列。
34.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:605的序列。
35.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:611的序列。
36.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:613的序列。
37.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:620的序列。
38.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:618的序列。
39.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:603的序列。
40.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:615的序列。
41.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:608的序列。
42.如实施方案33所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:610的序列。
43.如实施方案28-42中任一项所述的重组核酸分子，其中
(i)CDR1包含SEQ ID NO:87-104或107-172中任一者的序列；
(ii)CDR2包含SEQ ID NO:259-276或279-344中任一者的序列；并且
(iii)CDR3包含SEQ ID NO:431-448或451-516中任一者的序列。
44.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:89，CDR2是SEQ ID NO:261并且CDR3是SEQ ID NO:433。
45.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:95，CDR2是SEQ ID NO:267并且CDR3是SEQ ID NO:439。
46.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:97，CDR2是SEQ ID NO:269并且CDR3是SEQ ID NO:441。
47.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:104，CDR2是SEQ ID NO:276并且CDR3是SEQ ID NO:448。
48.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:102，CDR2是SEQ ID NO:274并且CDR3是SEQ ID NO:446。
49.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:87，CDR2是SEQ ID NO:259并且CDR3是SEQ ID NO:431。
50.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:99，CDR2是SEQ ID NO:271并且CDR3是SEQ ID NO:443。
51.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:92，CDR2是SEQ ID NO:264并且CDR3是SEQ ID NO:436。
52.如实施方案28-43中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:94，CDR2是SEQ ID NO:266并且CDR3是SEQ ID NO:439。
53.如实施方案1-28中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:621具有至少90％序列同一性的可变结构域。
54.如权利实施方案53所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域与SEQ ID NO:621具有至少95％序列同一性。
55.如实施方案54所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:621的序列。
56.如实施方案28或53-55中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:105，CDR2是SEQ ID NO:227并且CDR3是SEQ ID NO:449。
57.如实施方案1-21中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
58.如实施方案57所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
59.如实施方案57所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
60.如实施方案57所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
61.如实施方案57-60中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:995-1047中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
62.如实施方案57-60中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
63.如实施方案57-60所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。
64.如实施方案58-63中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836-888中任一者的序列的重链互补决定区1(CDRH1)、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。
65.如实施方案58-64中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048-1100中任一者的序列的轻链互补决定区1(CDRL1)、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
66.如权利实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域。
67.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:800具有至少95％序列同一性的VH结构域。
68.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:800的序列的VH结构域。
69.如实施方案66-68中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
70.如实施方案66-68中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1012具有至少95％序列同一性的VL结构域。
71.如实施方案66-68中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:1012的序列的VL结构域。
72.如实施方案66-71中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:853的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:906的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:959的序列的CDRH3。
73.如实施方案66-72中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1065的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1118的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1171的序列的CDRL3。
74.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:783具有至少90％序列同一性的VH结构域。
75.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:783具有至少95％序列同一性的VH结构域。
76.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:783的序列的VH结构域。
77.如实施方案74-76中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:995具有至少90％序列同一性的VL结构域。
78.如实施方案74-76中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:995具有至少95％序列同一性的VL结构域。
79.如实施方案74-76中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:995的序列的VL结构域。
80.如实施方案74-79中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:889的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942的序列的CDRH3。
81.如实施方案74-80中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1101的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154的序列的CDRL3。
82.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:784具有至少90％序列同一性的VH结构域。
83.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:784具有至少95％序列同一性的VH结构域。
84.如实施方案57-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:784的序列的VH结构域。
85.如实施方案82-84中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:996具有至少90％序列同一性的VL结构域。
86.如实施方案82-84中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:996具有至少95％序列同一性的VL结构域。
87.如实施方案82-84中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:996的序列的VL结构域。
88.如实施方案82-87中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:837的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:890的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:943的序列的CDRH3。
89.如实施方案82-88中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1049的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1102的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1155的序列的CDRL3。
90.如实施方案57-89中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ IDNO:782的接头序列。
91.如实施方案1-90中任一项所述的重组核酸分子，其中当在T细胞中表达时，表达所述TFP的T细胞抑制肿瘤生长。
92.如实施方案1-90中任一项所述的重组核酸分子，其中表达所述TFP的T细胞相对于具有不同抗原结合结构域的TFP具有增加的自相残杀。
93.如实施方案1-90中任一项所述的重组核酸分子，其中表达所述TFP的T细胞相对于具有不同抗原结合结构域的TFP具有减少的自相残杀。
94.一种重组核酸分子，其包含编码特异性地结合CD70的抗体或其片段的序列。
95.如实施方案94所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是骆驼抗体或其结合片段。
96.如实施方案94所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是鼠抗体、人或人源化抗体或其结合片段。
97.如实施方案94-96中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。
98.如权利实施方案97所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是单结构域抗体(sdAb)。
99.如实施方案98所述的重组核酸分子，其中所述sdAb是VHH。
100.如实施方案94-99中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段以100nM或更低或约0.001nM至约100nM的KD值与人CD70结合。
101.如实施方案94-100中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段不与CD27竞争与CD70结合，不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
102.如实施方案94-100中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段与CD27竞争与CD70结合，抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
103.如实施方案94-102中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含变结构域，所述可变结构域包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3。
104.如实施方案103所述的重组核酸分子，其中CDR1、CDR2和CDR3选自由以下组成的组：
(i)包含X1X2FX3IX4RGX5的序列的CDR1；
包含AIX6TSGX7ATX8YA的序列的CDR2；和
包含CNMEX11X12X13YRX14YW的序列的CDR3；
(ii)包含X15X16X17X18X19YX20X21X22的序列的CDR1:
包含X23CX24X25SX26X27X28X29X30KYA的序列的CDR2；和
包含CX31AAX32PX33DDCSVX34GX35YGLNYW的序列的CDR3；
(iii)包含X36TFDAYAIG的序列的CDR1；
包含ICLSPSDGSTYYA的序列的CDR2；和
包含CAX37PSWCSLKADFGSW的序列的CDR3；
(iv)包含SIIRDNVMA的序列的CDR1；
包含AIINX38GGSX39NVD的序列的CDR2；和
包含CNVYYRX40LW的序列的CDR3；
(v)包含SIFSIARMN或FTLDYYAIA的序列的CDR1；
包含AILNRAGRTDYA的序列的CDR2；和
包含CNLQTISYHDFW的序列的CDR3；以及
(vi)包含SIFSATRME的序列的CDR1；
包含AIVTSGGRTNYA的序列的CDR2；和
包含CKFERYDYVNYW的序列的CDR3；
其中X1-X39是任何天然存在的氨基酸。
105.如实施方案104所述的重组核酸分子，其中：
(i)X4是非极性氨基酸；
(ii)X5是极性氨基酸；
(iii)X6是非极性氨基酸；
(iv)X11是极性氨基酸；
(v)X12是非极性氨基酸；
(vi)X16是极性氨基酸；
(vii)X18是带负电荷的氨基酸；
(viii)X21是非极性氨基酸；
(ix)X24是非极性氨基酸；
(x)X25是极性氨基酸；
(xi)X29是非极性氨基酸；以及/或者(xii)X39是非极性氨基酸。
106.如实施方案104或105所述的重组核酸分子，其中：(i)CDR1包含X1X2FX3IX4RGX5的序列，
其中X1为S或G；X2为I或T；X3为D或G；X4为V或A；并且X5为S或N；
CDR2包含AIX6TSGX7ATX8YA的序列，
其中X8为I或V；X9为G或D；并且X10为N或D；并且
CDR3包含CNMEX11X12X13YRX14YW的序列，
其中X11为S或T；X12为F、V或L；X13为R或S；并且X14为N或H；
(ii)CDR1包含X15X16X17X18X19YX20X21X22的序列，
其中X15为F、L或R；X16为T、S或N；X17为L、F或R；X18为D或E；X19为R、H、Y、K、N；X20为S、A或T；X21为I、V或M；并且X22为G或N；
CDR2包含X23CX24X25SX26X27X28X29X30KYA的序列，
其中X23为S、A、T或L；X24为I或V；X25为S或T；X26为S、K或N；X17为G或S；X28为G或D；X29为I、L或V；并且X30为P、T、I或V；并且
CDR3包含CX31AAX32PX33DDCSVX34GX35YGLNYW的序列，
其中X31为G、T或A；X32为T、G或D；X33为D、P、A或K；X34为P、A或H；并且X35为H或Y；
(iii)CDR1包含X36TFDAYAIG的序列，
其中X36为F或H；
CDR2包含ICLSPSDGSTYYA的序列；并且
CDR3包含CAX37PSWCSLKADFGSW的序列，
其中X37为T或A；或
(iv)CDR1包含SIIRDNVMA的序列；
CDR2包含AIINX38GGSX39NVD的序列，
其中X38为T或I；且X39为A或G；并且
CDR3包含CNVYYRX40LW的序列，
其中X40为D或G。
107.如实施方案94-106中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:603-620或622-688中的任一者具有至少90％序列同一性的可变结构域。
108.如实施方案107所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域与SEQ ID NOs:603-620或622-688中的任一者具有至少95％序列同一性。
109.如实施方案108所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:603-620或622-688中任一者的序列。
110.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:605的序列。
111.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:611的序列。
112.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:613的序列。
113.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:620的序列。
114.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:618的序列。
115.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:603的序列。
116.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:615的序列。
117.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:608的序列。
118.如实施方案109所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:610的序列。
119.如实施方案104-118中任一项所述的重组核酸分子，其中
(i)CDR1包含SEQ ID NO:87-104或107-172中任一者的序列；
(ii)CDR2包含SEQ ID NO:259-276或279-344中任一者的序列；并且
(iii)CDR3包含SEQ ID NO:431-448或451-516中任一者的序列。
120.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:89，CDR2是SEQ ID NO:261并且CDR3是SEQ ID NO:433。
121.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:95，CDR2是SEQ ID NO:267并且CDR3是SEQ ID NO:439。
122.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:97，CDR2是SEQ ID NO:269并且CDR3是SEQ ID NO:441。
123.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:104，CDR2是SEQ ID NO:276并且CDR3是SEQ ID NO:448。
124.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:102，CDR2是SEQ ID NO:274并且CDR3是SEQ ID NO:446。
125.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:87，CDR2是SEQ ID NO:259并且CDR3是SEQ ID NO:431。
126.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:99，CDR2是SEQ ID NO:271并且CDR3是SEQ ID NO:443。
127.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:92，CDR2是SEQ ID NO:264并且CDR3是SEQ ID NO:436。
128.如实施方案104-119中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:94，CDR2是SEQ ID NO:266并且CDR3是SEQ ID NO:439。
129.如实施方案94-97中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是单链可变片段(scFv)。
130.如实施方案129所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
131.如实施方案129所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
132.如实施方案129所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
133.如实施方案129-132中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:995-1047中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
134.如实施方案129-132中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
135.如实施方案129-132所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ IDNO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。
136.如实施方案130-135中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836-888中任一者的序列的重链互补决定区1(CDRH1)、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。
137.如实施方案130-136中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048-1100中任一者的序列的轻链互补决定区1(CDRL1)、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
138.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域。
139.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:800具有至少95％序列同一性的VH结构域。
140.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:800的序列的VH结构域。
141.如实施方案138-140中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
142.如实施方案138-140中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:1012具有至少95％序列同一性的VL结构域。
143.如实施方案138-140中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:1012的序列的VL结构域。
144.如实施方案138-143中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:853的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:906的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:959的序列的CDRH3。
145.如实施方案138-144中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1065的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1118的序列的CDRL2和具有SEQ IDNO:1171的序列的CDRL3。
146.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:783具有至少90％序列同一性的VH结构域。
147.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:783具有至少95％序列同一性的VH结构域。
148.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:783的序列的VH结构域。
149.如实施方案146-148中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:995具有至少90％序列同一性的VL结构域。
150.如实施方案146-148中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:995具有至少95％序列同一性的VL结构域。
151.如实施方案146-148中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:995的序列的VL结构域。
152.如实施方案146-151中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:889的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942的序列的CDRH3。
153.如实施方案146-152中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1101的序列的CDRL2和具有SEQ IDNO:1154的序列的CDRL3。
154.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:784具有至少90％序列同一性的VH结构域。
155.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:784具有至少95％序列同一性的VH结构域。
156.如实施方案129-137中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:784的序列的VH结构域。
157.如实施方案154-156中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:996具有至少90％序列同一性的VL结构域。
158.如实施方案154-156中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQID NO:996具有至少95％序列同一性的VL结构域。
159.如实施方案154-156中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:996的序列的VL结构域。
160.如实施方案154-159中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:837的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:890的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:943的序列的CDRH3。
161.如实施方案154-160中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1049的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1102的序列的CDRL2和具有SEQ IDNO:1155的序列的CDRL3。
162.如实施方案129-161中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQID NO:782的接头序列。
163.如实施方案94-162中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子还包含编码TCR恒定结构域的序列。
164.如实施方案163所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段操作性地连接到编码TCR恒定结构域的序列，从而形成TFP。
165.如实施方案163或164所述的重组核酸分子，其中所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分，或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
166.如实施方案94-165中任一项所述的重组核酸分子，其还包含前导序列。
167.如实施方案1-166中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
168.如实施方案167所述的重组核酸分子，其中所述核酸是mRNA。
169.如实施方案167所述的重组核酸分子，其中所述核酸是环状RNA。
170.如实施方案1-169中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
171.如实施方案170所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自由2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的核酸，锁核酸(LNA)，乙烯核酸(ENA)，肽核酸(PNA)，1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)，吗啉代核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸和2'-氟代N3-P5’-亚磷酰胺组成的组。
172.如实施方案1-171中任一项所述的重组核酸分子，其还包含启动子。
173.如实施方案1-172中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸是体外转录的核酸。
174.如实施方案1-173中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸还包含编码聚(A)尾的序列。
175.如实施方案1-174中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸还包含3’UTR序列。
176.一种由实施方案1-175中任一项所述的重组核酸分子编码的多肽。
177.一种载体，其包含编码实施方案1-93、164或165中任一项所述的TFP的重组核酸分子。
178.一种载体，其包含编码实施方案94-163所述的抗体或抗原结合片段的重组核酸分子。
179.如实施方案177所述的载体，其还包含编码用于降低CD70内源水平的siRNA、shRNA或miRNA的序列。
180.如实施方案177所述的载体，其还包含编码抑制性分子的序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
181.如实施方案177所述的载体，其还包含编码TCR恒定结构域的序列。
182.如实施方案181所述的载体，其中所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分，或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
183.如实施方案177-182中任一项所述的载体，其中所述载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体组成的组。
184.如实施方案177-183中任一项所述的载体，其还包含启动子。
185.如实施方案177-184中任一项所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体。
186.如实施方案177-185中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含聚(A)尾。
187.如实施方案177-186中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含3’UTR。
188.一种细胞，其包含实施方案1-175中任一项所述的重组核酸分子、实施方案176所述的多肽，或实施方案177-187中任一项所述的载体。
189.如实施方案188所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
190.如实施方案189所述的T细胞，其中所述T细胞是人T细胞。
191.如实施方案189或190所述的T细胞，其中所述T细胞是CD8+或CD4+ T细胞。
192.如实施方案189所述的T细胞，其中所述T细胞是人αβT细胞。
193.如实施方案189所述的T细胞，其中所述T细胞是人γδT细胞。
194.如实施方案188所述的细胞，其中所述细胞是人NKT细胞。
195.如实施方案188-194中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含内源TCR的功能性破坏。
196.如实施方案188-195中任一项所述的细胞，其中所述细胞是同种异体细胞。
197.如实施方案188-196中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含内源CD70基因的功能性破坏。
198.如实施方案188-196中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含内源CIITA基因的功能性破坏。
199.如实施方案188-196中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含用于降低CD70内源水平的反义siRNA、shRNA或miRNA。
200.如实施方案188-196中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含用于降低CIITA内源水平的反义siRNA、shRNA或miRNA。
201.如实施方案188-196中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列。
202.如实施方案201所述的细胞，其中所述重组核酸包含编码所述融合蛋白的所述序列。
203.如实施方案202所述的细胞，其中编码所述TFP的序列和编码所述融合蛋白的所述序列被包含在同一操纵子中。
204.如实施方案201-203中任一项所述的细胞，其中所述ER滞留结构域由SEQ IDNO:756-779中的任一者编码。
205.如实施方案201-204中任一项所述的细胞，其中编码所述融合蛋白的所述序列还包含介于所述抗CD70抗体结构域和所述ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
206.如实施方案201-205中任一项所述的细胞，其中编码所述融合蛋白的所述序列还包含编码位于编码所述抗CD70抗体结构域的所述序列的5’的CD8α信号肽的序列。
207.如实施方案201-206中任一项所述的细胞，其中所述抗体结构域构成实施方案94-128中任一项所述的抗CD70抗体。
208.如实施方案188-196中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含与抗CD70抗体结合的细胞表面表达的CD70。
209.如实施方案208所述的细胞，其中所述抗CD70抗体是由实施方案94-128所述的重组核酸编码的抗体或抗原结合片段。
210.如实施方案208所述的细胞，其中所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由实施方案94-163所述的重组核酸编码的抗体或抗原结合片段。
211.如实施方案188-210中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码抑制性分子的异源序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
212.如实施方案188-211中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码TCR恒定结构域的异源序列。
213.如实施方案212所述的细胞，其中所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分，或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
214.一种药物组合物，其包含实施方案188-213中任一项所述的细胞和药学上可接受的载剂。
215.一种产生实施方案197所述的细胞的方法，所述方法包括：
(i)破坏内源CD70基因，从而产生含有内源CD70基因的功能性破坏的细胞；以及
(ii)用实施方案1-93、164或165中任一项所述的重组核酸或实施方案177和180-187中任一项所述的载体转导含有所述内源CD70基因的所述功能性破坏的所述细胞。
216.如实施方案215所述的方法，其中所述破坏包括用靶向所述内源CD70基因的核酸酶蛋白或编码所述核酸酶蛋白的核酸序列转导所述细胞。
217.如实施方案215或216所述的方法，其中所述方法还包括破坏内源TCR。
218.一种产生实施方案197所述的细胞的方法，所述方法包括用如实施方案1-93、164或165中任一项所述的重组核酸或实施方案177或180-187中任一项所述的载体转导包含内源CD70基因的破坏的细胞。
219.如实施方案218所述的方法，其中所述细胞还包含内源TCR的破坏。
220.一种产生实施方案188-196或208-210中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括：
(i)用实施方案1-93、164或165中任一项所述的重组核酸或实施方案177或180-187中任一项所述的载体转导细胞；以及
(ii)使所述细胞同与所述细胞表面上的CD70结合的抗CD70抗体接触。
221.如实施方案220所述的方法，其中所述抗CD70抗体是由如实施方案94-163所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
222.如实施方案220所述的方法，其中所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由如实施方案94-163所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
223.如实施方案220-222中任一项所述的方法，其中所述接触发生在所述转导之前。
224.如实施方案223所述的方法，其中所述接触发生在所述转导前至多1天。
225.如实施方案220-222中任一项所述的方法，其中所述接触发生在所述转导之后。
226.如实施方案225所述的方法，其中所述接触发生在所述转导之后至多5天。
227.如实施方案220-226中任一项所述的方法，其还包括在所述转导之后4天或更多天，在不包含所述抗CD70抗体的培养基中对所述细胞进行继代培养。
228.如实施方案227所述的方法，其中所述继代培养包括在所述转导之后7天或更多天，在不包含所述抗CD70抗体的培养基中对所述细胞进行继代培养。
229.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的实施方案214所述的药物组合物。
230.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)实施方案188-213中任一项所述的细胞；和(b)药学上可接受的载剂。
231.如实施方案229或230所述的方法，其中所述癌症是与CD70表达升高相关的癌症。
232.如实施方案229-231中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用增加所述癌细胞中的CD70水平的剂。
233.如实施方案232所述的方法，其中所述增加CD70水平的所述剂是低甲基化剂。
234.如实施方案233所述的方法，其中所述低甲基化剂是5-阿扎胞苷或地西他滨。
235.如实施方案229-234中任一项所述的方法，其中所述疾病或所述病状选自由以下组成的组：T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)+癌症和/或人乳头瘤病毒(HPV)+癌症。
236.如实施方案229-234中任一项所述的方法，其中所述疾病或所述病状选自由以下组成的组：肾癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、胸腺癌、乳腺癌、头颈癌和胃癌。
237.如实施方案229-236中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
238.一种产生实施方案198所述的细胞的方法，所述方法包括：
(i)破坏内源CIITA基因，从而产生含有内源CIITA 0基因的功能性破坏的细胞；以及
(ii)用实施方案1-93、164或165中任一项所述的重组核酸或实施方案177和180-187中任一项所述的载体转导含有所述内源CIITA基因的所述功能性破坏的所述细胞。
239.如实施方案238所述的方法，其中所述破坏包括用靶向所述内源CIITA基因的核酸酶蛋白或编码所述核酸酶蛋白的核酸序列转导所述细胞。
240.如实施方案238或239所述的方法，其中所述方法还包括破坏内源TCR。
241.一种产生实施方案198所述的细胞的方法，所述方法包括用实施方案1-93、164或165中任一项所述的重组核酸或实施方案177或180-187中任一项所述的载体转导包含内源CIITA基因的破坏的细胞。
242.如实施方案218所述的方法，其中所述细胞还包含内源TCR的破坏。
243.一种产生实施方案201-207中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用实施方案1-93、164或165中任一项所述的重组核酸或实施方案177和180-187中任一项所述的载体和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列转导细胞。
244.如实施方案243所述的方法，其中所述重组核酸或载体和编码所述融合蛋白的所述序列同时被转导。
245.如实施方案244所述的方法，其中所述重组核酸或载体包含编码所述融合蛋白的所述序列。
246.如实施方案245所述的方法，其中编码所述TFP的所述序列和编码所述融合蛋白的所述序列被包含在同一操纵子中。
247.如实施方案243所述的方法，其中所述重组核酸或载体在编码所述融合蛋白的所述序列之前或之后转导。
248.如实施方案243-247中任一项所述的方法，其中所述ER滞留结构域由SEQ IDNO:756-779中的任一者编码。
249.如实施方案243-248中任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述序列还包含介于所述抗CD70抗体结构域和所述ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
250.如实施方案243-249中任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述序列还包含编码位于编码所述抗CD70抗体结构域的所述序列的5’的CD8α信号肽的序列。
251.如实施方案243-250中任一项所述的方法，其中所述抗体结构域构成如实施方案94-128中任一项所述的抗CD70抗体。
表5.示例性序列的表格
Figure BDA0004038419630002751
Figure BDA0004038419630002761
Figure BDA0004038419630002771
Figure BDA0004038419630002781
Figure BDA0004038419630002791
Figure BDA0004038419630002801
Figure BDA0004038419630002811
Figure BDA0004038419630002821
Figure BDA0004038419630002831
Figure BDA0004038419630002841
Figure BDA0004038419630002851
Figure BDA0004038419630002861
Figure BDA0004038419630002871
Figure BDA0004038419630002881
Figure BDA0004038419630002891
Figure BDA0004038419630002901
Figure BDA0004038419630002911
Figure BDA0004038419630002921
Figure BDA0004038419630002931
Figure BDA0004038419630002941
Figure BDA0004038419630002951
Figure BDA0004038419630002961
Figure BDA0004038419630002971
表6.示例性序列的表格
Figure BDA0004038419630002981
表7.示例性的抗CD70结合剂序列的表格
Figure BDA0004038419630002982
Figure BDA0004038419630002991
Figure BDA0004038419630003001
Figure BDA0004038419630003011
Figure BDA0004038419630003021
Figure BDA0004038419630003031
Figure BDA0004038419630003041
Figure BDA0004038419630003051
Figure BDA0004038419630003061
Figure BDA0004038419630003071
Figure BDA0004038419630003081
Figure BDA0004038419630003091
Figure BDA0004038419630003101
Figure BDA0004038419630003111
Figure BDA0004038419630003121
Figure BDA0004038419630003131
Figure BDA0004038419630003141
Figure BDA0004038419630003151
Figure BDA0004038419630003161
Figure BDA0004038419630003171
Figure BDA0004038419630003181
Figure BDA0004038419630003191
Figure BDA0004038419630003201
表8.示例性的抗CD70 scFv序列的表格
Figure BDA0004038419630003202
Figure BDA0004038419630003211
Figure BDA0004038419630003221
Figure BDA0004038419630003231
Figure BDA0004038419630003241
表9.示例性的抗CD70 sdAb序列的表格
Figure BDA0004038419630003242
Figure BDA0004038419630003251
表10.示例性PD-1序列的表格
Figure BDA0004038419630003252
Figure BDA0004038419630003261
表11.示例性IL-15或IL-15R序列的表格
Figure BDA0004038419630003262
Figure BDA0004038419630003271
Figure BDA0004038419630003281
表12.示例性构建体序列的表格
Figure BDA0004038419630003282
Figure BDA0004038419630003291
Figure BDA0004038419630003301
Figure BDA0004038419630003311
Figure BDA0004038419630003321
Figure BDA0004038419630003331

Claims (334)

1.一种重组核酸分子，其包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：
(a)TCR亚基，其包含：
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR跨膜结构域，
(iii)TCR胞内结构域，和
(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且
其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中当所述TFP在T细胞中表达时，所述TFP与内源TCR复合物功能性地相互作用。
3.如权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞内结构域包含来自CD3γ、CD3δ或CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组核酸分子，其中与不含所述TFP的T细胞相比，表达所述TFP的T细胞表现出增加的对表达CD70的人细胞的细胞毒性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域通过接头序列连接到所述TCR胞外结构域。
6.如权利要求5所述的重组核酸分子，其中所述接头的长度为120个氨基酸或更少。
7.如权利要求5所述的重组核酸分子，其中所述接头序列包含(G4S)n，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。
8.如权利要求7所述的重组核酸分子，其中n是1至4的整数。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自相同的TCR亚基。
10.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRα。
11.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRβ。
12.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRγ。
13.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自TCRδ。
14.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3ε。
15.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3δ。
16.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域中的至少两者来自CD3γ。
17.如权利要求9-16中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域三者全部来自相同的TCR亚基。
18.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域来自CD3ε。
19.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域来自CD3δ。
20.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域来自CD3γ。
21.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRα的恒定结构域。
22.如权利要求21所述的重组核酸分子，其中所述TCRα的恒定结构域是鼠的。
23.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRβ的恒定结构域。
24.如权利要求23所述的重组核酸分子，其中所述TCRβ的恒定结构域是鼠的。
25.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRγ的恒定结构域。
26.如权利要求17所述的重组核酸分子，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域包含TCRδ的恒定结构域。
27.如权利要求1-26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是骆驼抗体或其结合片段。
28.如权利要求1-26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是鼠抗体或其结合片段。
29.权利要求1-26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是人或人源化抗体或其结合片段。
30.如权利要求1-29中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。
31.如权利要求1-30中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)。
32.如权利要求31所述的重组核酸分子，其中所述sdAb是VHH。
33.如权利要求1-32中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域以100nM或更低或约0.001nM至约100nM的KD值与人CD70结合。
34.如权利要求1-33中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域不与CD27竞争与CD70结合，不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
35.如权利要求1-33中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与CD27竞争与CD70结合，抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
36.如权利要求1-33中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与氨基酸序列HRDGIYMVHIQVTLAICSSTTAS(SEQ ID NO:1230)内的表位特异性地结合。
37.如权利要求36所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1207-1222、1246和1247的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的scFv。
38.如权利要求36所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1223-1227的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的sdAb结构域。
39.如权利要求1-35中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含可变结构域，所述可变结构域包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3。
40.如权利要求1-35和39中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:603-620和622-688中的任一者具有至少90％序列同一性的可变结构域。
41.如权利要求1-35和39中任一项所述的重组核酸分子，其中
(i)CDR1包含SEQ ID NO:87-104和107-172中任一者的序列；
(ii)CDR2包含SEQ ID NO:259-276和279-344中任一者的序列；以及
(iii)CDR3包含SEQ ID NO:431-448和451-516中任一者的序列。
42.如权利要求1-35和39中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:618具有至少90％序列同一性的可变结构域。
43.如权利要求42所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域与SEQ ID NO:618具有至少95％序列同一性。
44.如权利要求43所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:618的序列。
45.如权利要求42-44中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:102，CDR2是SEQ ID NO:274并且CDR3是SEQ IDNO:446。
46.如权利要求42所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1224-1227的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的sdAb结构域。
47.如权利要求1-30中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
48.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
49.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
50.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
51.如权利要求47-50中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
52.如权利要求47-50中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
53.如权利要求47-50中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ IDNO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。
54.如权利要求48-53中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQID NO:836-888中任一者的序列的重链互补决定区1(CDRH1)、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。
55.如权利要求48-54中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQID NO:1048-1100中任一者的序列的轻链互补决定区1(CDRL1)、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
56.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域。
57.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域。
58.如权利要求47、56和57中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
59.如权利要求47、56和57中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ IDNO:1249的序列的VL结构域。
60.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ IDNO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
61.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域和SEQ ID NO:1249的序列的VL结构域。
62.如权利要求61所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域的N端。
63.如权利要求61所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域的N端。
64.如权利要求56-63中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
65.如权利要求62或63所述的重组核酸分子，其中所述SEQ IDNO:1248的序列的所述VH和所述SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
66.如权利要求56-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208具有至少90％序列同一性的序列。
67.如权利要求56-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ IDNO:1207或SEQ ID NO:1208的序列。
68.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域。
69.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域。
70.如权利要求47、68和69中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
71.如权利要求47、68和69中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQID NO:1251的序列的VL结构域。
72.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ IDNO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
73.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域和所述SEQ ID NO:1251的序列的VL结构域。
74.如权利要求73所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域的N端。
75.如权利要求73所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域的N端。
76.如权利要求68-75中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
77.如权利要求74或75所述的重组核酸分子，其中所述SEQ IDNO:1250的序列的所述VH和所述SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
78.如权利要求68-77中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1209或SEQ ID NO:1210具有至少90％序列同一性的序列。
79.如权利要求68-77中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ IDNO:1209或SEQ ID NO:1210的序列。
80.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域。
81.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域。
82.如权利要求47、80和81中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
83.如权利要求47、80和81中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQID NO:1253的序列的VL结构域。
84.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ IDNO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
85.如权利要求47所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域和所述SEQ ID NO:1253的序列的VL结构域。
86.如权利要求85所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域的N端。
87.如权利要求85所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域的N端。
88.如权利要求80-87中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1237的接头序列。
89.如权利要求86或87所述的重组核酸分子，其中所述SEQ IDNO:1252的序列的所述VH和所述SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
90.如权利要求80-89中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1246或SEQ ID NO:1247具有至少90％序列同一性的序列。
91.如权利要求79-88中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1246或SEQ ID NO:1247的序列。
92.如权利要求47-91中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与氨基酸序列ASRHHPTTLAVGICSPASRSISL(SEQ ID NO:1231)内的第二表位特异性地结合。
93.如权利要求92所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:853的CDRH1、SEQ ID NO:906的CDRH2和SEQ ID NO:959的CDRH3，所述VL结构域包含SEQ ID NO:1065的CDRL1、SEQ ID NO:1118的CDRL2和SEQ ID NO:1171的CDRL3。
94.如权利要求47-93中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域。
95.如权利要求47-93中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:800的序列的VH结构域。
96.如权利要求47-93中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
97.如权利要求47-93中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:1012的序列的VL结构域。
98.如权利要求47-93中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
99.如权利要求47-93中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ IDNO:800的序列的VH结构域和所述SEQ IDNO:1012的序列的VL结构域。
100.如权利要求47-99中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ ID NO:782的接头序列。
101.如权利要求1-100中任一项所述的重组核酸分子，其中当在T细胞中表达时，表达所述TFP的T细胞抑制肿瘤生长。
102.如权利要求1-100中任一项所述的重组核酸分子，其中表达所述TFP的T细胞相对于具有不同抗原结合结构域的TFP具有增加的自相残杀。
103.如权利要求1-100中任一项所述的重组核酸分子，其中表达所述TFP的T细胞相对于具有不同抗原结合结构域的TFP具有减少的自相残杀。
104.如权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列中的任一氨基酸序列。
105.一种重组核酸分子，其包含编码特异性地结合CD70的抗体或其片段的序列。
106.如权利要求105所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是骆驼抗体或其结合片段。
107.如权利要求105所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是鼠抗体、人或人源化抗体或其结合片段。
108.如权利要求105-107中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)结构域。
109.如权利要求108所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是单结构域抗体(sdAb)。
110.如权利要求109所述的重组核酸分子，其中所述sdAb是VHH。
111.如权利要求105-110中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段以100nM或更低或约0.001nM至约100nM的KD值与人CD70结合。
112.如权利要求105-111中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段不与CD27竞争与CD70结合，不抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者不与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
113.如权利要求105-111中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段与CD27竞争与CD70结合，抑制CD70与CD27相互作用，以及/或者与CD27所结合的CD70的相同表位结合。
114.如权利要求105-111中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与氨基酸序列HRDGIYMVHIQVTLAICSSTTAS(SEQ ID NO:1230)内的表位特异性地结合。
115.如权利要求114所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:1207-1222、1246和1247的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的scFv。
116.如权利要求114所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:1223-1227的序列中的任一序列具有至少约90％序列同一性的sdAb结构域。
117.如权利要求105-113中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域。
118.如权利要求105-113和117中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:603-620和622-688中的任一者具有至少90％序列同一性的可变结构域。
119.如权利要求105-113和117中任一项所述的重组核酸分子，其中
(i)CDR1包含SEQ ID NO:87-104和107-172中任一者的序列；
(ii)CDR2包含SEQ ID NO:259-276和279-344中任一者的序列；和(iii)CDR3包含SEQID NO:431-448和451-516中任一者的序列。
120.如105-113和117中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:618具有至少90％序列同一性的可变结构域。
121.如权利要求120所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域与SEQ ID NO:618具有至少95％序列同一性。
122.如权利要求121所述的重组核酸分子，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:618的序列。
123.如120-122中任一项所述的重组核酸分子，其中CDR1是SEQ ID NO:102，CDR2是SEQID NO:274并且CDR3是SEQ ID NO:446。
124.如权利要求120所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:1224-1227的序列中的任一序列具有至少约80％序列同一性的sdAb结构域。
125.如权利要求105-108中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段是scFv。
126.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
127.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:783-835中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)结构域。
128.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQ ID NO:783-835中任一者的序列的重链可变(VH)结构域。
129.如权利要求125-128中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:995-1047中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
130.如权利要求125-128中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:995-1047中的任一者具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)结构域。
131.如权利要求125-128中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含具有SEQID NO:995-1047中任一者的序列的轻链可变(VL)结构域。
132.如权利要求126-131中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO:836-888中任一者的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:889-941中任一者的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:942-994中任一者的序列的CDRH3。
133.如权利要求126-132中任一项所述的重组核酸分子，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO:1048-1100中任一者的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:1101-1153中任一者的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:1154-1206中任一者的序列的CDRL3。
134.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域。
135.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域。
136.如权利要求125、134和135中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
137.如权利要求125、134和135中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1249的序列的VL结构域。
138.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1248具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1249具有至少90％序列同一性的VL结构域。
139.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1248的序列的VH结构域和所述SEQ ID NO:1249的序列的VL结构域。
140.如权利要求139所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域的N端。
141.如权利要求139所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1248的序列的所述VH结构域的N端。
142.如权利要求134-141中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ IDNO:1237的接头序列。
143.如权利要求140或141所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1248的序列的所述VH和所述SEQ ID NO:1249的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
144.如权利要求134-143中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1207或SEQ ID NO:1208具有至少90％序列同一性的序列。
145.如权利要求134-143中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列。
146.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域。
147.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域。
148.如权利要求125、146和147中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
149.如权利要求125、146和147中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1251的序列的VL结构域。
150.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1250具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1251具有至少90％序列同一性的VL结构域。
151.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1250的序列的VH结构域和所述SEQ ID NO:1251的序列的VL结构域。
152.如权利要求151所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域的N端。
153.如权利要求151所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1250的序列的所述VH结构域的N端。
154.如权利要求146-153中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ IDNO:1237的接头序列。
155.如权利要求152或153所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1250的序列的所述VH和所述SEQ ID NO:1251的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
156.如权利要求68-155中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1209或SEQ ID NO:1210具有至少90％序列同一性的序列。
157.如权利要求68-155中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ IDNO:1209或SEQ ID NO:1210的序列。
158.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域。
159.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域。
160.如权利要求125、158和159中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
161.如权利要求125、158和159中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1253的序列的VL结构域。
162.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1252具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1253具有至少90％序列同一性的VL结构域。
163.如权利要求125所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQ ID NO:1252的序列的VH结构域和所述SEQ ID NO:1253的序列的VL结构域。
164.如权利要求163所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域的N端。
165.如权利要求163所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由其C端可操作地连接到所述SEQ ID NO:1252的序列的所述VH结构域的N端。
166.如权利要求158-165中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ IDNO:1237的接头序列。
167.如权利要求164或165所述的重组核酸分子，其中所述SEQ ID NO:1252的序列的所述VH和所述SEQ ID NO:1253的序列的所述VL结构域经由SEQ ID NO:1237的接头序列可操作地连接。
168.如权利要求158-167中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ IDNO:1246或SEQ ID NO:1247具有至少90％序列同一性的序列。
169.如权利要求158-167中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含所述SEQID NO:1246或SEQ ID NO:1247的序列。
170.如权利要求119-169中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段与氨基酸序列ASRHHPTTLAVGICSPASRSISL(SEQ ID NO:1231)内的第二表位特异性地结合。
171.如权利要求125-168中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:853的CDRH1、SEQ ID NO:906的CDRH2和SEQ IDNO:959的CDRH3，所述VL结构域包含SEQ ID NO:1065的CDRL1、SEQ IDNO:1118的CDRL2和SEQID NO:1171的CDRL3。
172.如权利要求125-168和171中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域。
173.如权利要求125-168和171中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
174.如权利要求125-168和171中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:800具有至少90％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:1012具有至少90％序列同一性的VL结构域。
175.如权利要求125-174中任一项所述的重组核酸分子，其中所述scFv包含SEQ IDNO:782的接头序列。
176.如权利要求105-175中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子还包含编码TCR恒定结构域的序列。
177.如权利要求176所述的重组核酸分子，其中所述抗体或抗体片段操作性地连接到编码TCR恒定结构域的序列，从而形成TFP。
178.如权利要求176或177所述的重组核酸分子，其中所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分，或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
179.如权利要求105-178中任一项所述的重组核酸分子，其还包含前导序列。
180.如权利要求1-179中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
181.如权利要求180所述的重组核酸分子，其中所述核酸是mRNA。
182.如权利要求180所述的重组核酸分子，其中所述核酸是环状RNA。
183.如权利要求1-182中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
184.如权利要求183所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自由2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的核酸，锁核酸(LNA)，乙烯核酸(ENA)，肽核酸(PNA)，1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)，吗啉代核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸和2'-氟代N3-P5’-亚磷酰胺组成的组。
185.如权利要求1-184中任一项所述的重组核酸分子，其还包含启动子。
186.如权利要求1-185中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸是体外转录的核酸。
187.如权利要求1-186中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸还包含编码聚(A)尾的序列。
188.如权利要求1-187中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸还包含3’UTR序列。
189.一种由权利要求1-188中任一项所述的重组核酸分子编码的多肽。
190.一种载体，其包含权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸分子。
191.一种载体，其包含权利要求105-176所述的重组核酸分子。
192.如权利要求190所述的载体，其还包含编码用于降低CD70内源水平的siRNA、shRNA或miRNA的序列。
193.如权利要求190所述的载体，其还包含编码抑制性分子的序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
194.如权利要求190所述的载体，其还包含编码TCR恒定结构域的序列。
195.如权利要求194所述的载体，其中所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分，或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
196.如权利要求190-195中任一项所述的载体，其中所述载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体组成的组。
197.如权利要求190-196中任一项所述的载体，其还包含启动子。
198.如权利要求190-197中任一项所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体。
199.如权利要求190-198中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含聚(A)尾。
200.如权利要求190-199中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含3’UTR。
201.一种细胞，其包含权利要求1-188中任一项所述的重组核酸分子、权利要求189所述的多肽或权利要求190-200中任一项所述的载体。
202.一种包含重组核酸分子的细胞，所述重组核酸分子包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：
(a)TCR亚基，其包含：
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR跨膜结构域，
(iii)TCR胞内结构域，和
(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且
其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
203.如权利要求201或202的细胞，其中所述细胞是T细胞。
204.如权利要求203所述的细胞，其中所述T细胞是人T细胞。
205.如权利要求203或204所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+或CD4+T细胞。
206.如权利要求203所述的细胞，其中所述T细胞是人αβT细胞。
207.如权利要求203所述的细胞，其中所述T细胞是人γδT细胞。
208.如权利要求201或202中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人NKT细胞。
209.一种T细胞，其包含权利要求1-175中任一项所述的重组核酸分子、权利要求176所述的多肽或权利要求177-187中任一项所述的载体。
210.一种包含重组核酸分子的T细胞，所述重组核酸分子包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，其中所述TFP包含：
(a)TCR亚基，其包含：
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR跨膜结构域，
(iii)TCR胞内结构域，和
(b)特异性地结合CD70的抗原结合结构域；并且
其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域操作性地连接。
211.如权利要求209或210的T细胞，其中所述T细胞是人T细胞。
212.如权利要求209或210所述的T细胞，其中所述T细胞是CD8+或CD4+T细胞。
213.如权利要求209或210所述的T细胞，其中所述T细胞是人αβT细胞。
214.如权利要求209或210的T细胞，其中所述T细胞是人γδT细胞。
215.如权利要求201或202所述的细胞或如权利要求209或210所述的T细胞，其还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
216.如权利要求215所述的细胞或T细胞，其中所述抑制性分子包含：构成PD-1的至少一部分的第一多肽及包含共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
217.如权利要求216所述的细胞或T细胞，其中所述抑制性分子包含所述SEQ ID NO:1239或SEQ ID NO:1244的序列。
218.如权利要求215-217中任一项所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的序列和编码抑制性分子的所述核酸被包含在单个核酸分子中。
219.如权利要求215-217所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和编码抑制性分子的所述核酸被包含在两个单独的核酸分子中。
220.如权利要求201或202所述的细胞或如权利要求209或210所述的T细胞，其中所述细胞或所述T细胞还包含编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的第二核酸序列。
221.如权利要求220所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和所述第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。
222.如权利要求220所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和所述第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。
223.如权利要求221所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和所述第二核酸序列通过第二接头操作性地连接。
224.如权利要求223所述的细胞或T细胞，其中所述第二接头包含蛋白酶切割位点。
225.如权利要求224所述的细胞或T细胞，其中所述蛋白酶切割位点是2A切割位点。
226.如权利要求225所述的细胞或T细胞，其中所述2A切割位点是T2A切割位点。
227.如权利要求220-226中任一项所述的细胞或T细胞，其中IL-15的表达使所述细胞的持久性增加。
228.如权利要求220-227中任一项所述的细胞或T细胞，其中当所述IL-15多肽在所述细胞或T细胞中表达时，所述IL-15多肽被分泌。
229.如权利要求220-228中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述IL-15多肽包含SEQID NO:1242的序列。
230.如权利要求220-229中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列还编码IL-15受体(IL-15R)亚基或其片段。
231.如权利要求230所述的细胞或T细胞，其中所述IL-15R亚基是IL-15R alpha(IL-15Rα)。
232.如权利要求231所述的细胞或T细胞，其中IL-15和IL-15Rα通过第三接头操作性地连接。
233.如权利要求232所述的细胞，其中所述第三接头不是可切割的接头。
234.如权利要求233所述的细胞或T细胞，其中所述第三接头包含含有(G4S)n的序列，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至10的整数。
235.如权利要求234所述的细胞或T细胞，其中n是1至4的整数。
236.如权利要求235所述的细胞或T细胞，其中n是3。
237.如权利要求236所述的细胞或T细胞，其中所述第三接头包含SEQ ID NO:1243的序列。
238.如权利要求230-237中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列编码包含连接到所述IL-15Rα亚基的所述IL-15多肽的融合蛋白。
239.如权利要求238所述的细胞或T细胞，其中所述IL-15多肽连接到所述IL-15Rα亚基的N端。
240.如权利要求238所述的细胞或T细胞，其中所述融合蛋白包含IL-15的氨基酸30-162。
241.如权利要求238所述的细胞或T细胞，其中所述融合蛋白包含IL-15Rα的氨基酸31-267。
242.如权利要求238所述的细胞或T细胞，其中所述融合蛋白还包含sushi结构域。
243.如权利要求238所述的细胞或T细胞，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1244的序列。
244.如权利要求238-243中任一项所述的细胞或T细胞，其中当所述融合蛋白在所述细胞或T细胞中表达时，所述融合蛋白是在细胞表面上表达。
245.如权利要求238-243中任一项所述的细胞或T细胞，其中当所述融合蛋白在所述细胞或T细胞中表达时，所述融合蛋白被分泌。
246.如权利要求220-245中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含编码PD-1多肽的第三核酸序列。
247.如权利要246所述的细胞或T细胞，其中所述PD-1多肽经由其C端可操作地连接到共刺激多肽的胞内结构域的N端。
248.如权利要求246或247所述的细胞或T细胞，其中所述第三核酸序列与所述第一核酸序列和第二核酸序列被包含在同一核酸分子中。
249.如权利要求247或248中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述PD-1多肽经由PD-1的跨膜结构域连接到所述共刺激多肽的所述胞内结构域。
250.如权利要求247-249中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述共刺激多肽选自包含OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD28、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、CD226、FcγRI、FcγRII和FcγRIII的组。
251.如权利要求247所述的细胞或T细胞，其中所述共刺激多肽的所述胞内结构域包含CD28的至少一部分。
252.如权利要求247所述的细胞或T细胞，其中PD-1的胞外结构域和所述跨膜结构域连接到CD28的胞内结构域。
253.如权利要求246所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞包含融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到CD28胞内结构域的PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28的胞内结构域连接到IL-15Rα。
254.如权利要求253所述的细胞或T细胞，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1254或SEQ ID NO:1262的序列。
255.如权利要求201或202所述的细胞或如权利要求209或210所述的T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含编码白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其片段的第二核酸序列。
256.如权利要求255所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和所述第二核酸序列被包含在单个核酸分子中。
257.如权利要求255所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和所述第二核酸序列被包含在两个单独的核酸分子中。
258.如权利要求256所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和所述第二核酸序列通过第二接头操作性地连接。
259.如权利要求258所述的细胞或T细胞，其中所述第二接头包含蛋白酶切割位点。
260.如权利要求259所述的细胞或T细胞，其中所述蛋白酶切割位点是2A切割位点。
261.如权利要求260所述的细胞或T细胞，其中所述2A切割位点是T2A切割位点。
262.如权利要求255-261中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列还编码PD-1或其片段。
263.如权利要求262所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列编码PD-1的所述胞外结构域。
264.如权利要求262或263的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列编码PD-1的所述胞外和跨膜结构域。
265.如权利要求262-264中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列还编码CD28或其片段。
266.如权利要求262-265中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列编码CD28的所述胞内结构域。
267.如权利要求262-266中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含连接到所述CD28胞内结构域的所述PD-1胞外结构域和跨膜结构域，所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα。
268.如权利要求267所述的细胞或T细胞，其中所述CD28胞内结构域连接到IL-15Rα的所述胞内结构域。
269.如权利要求262-268中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:1245的序列。
270.如权利要求255-269中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述重组核酸分子还包含编码白细胞介素-15(IL-15)多肽或其片段的第三核酸序列。
271.如权利要求270所述的细胞或T细胞，其中当所述IL-15多肽或其片段在所述细胞或T细胞中表达时，所述IL-15多肽或其片段被分泌。
272.如权利要求271所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞响应于T细胞活化剂而分泌所述IL-15多肽。
273.如权利要求220所述的细胞或T细胞，其中IL-15信号传导响应于T细胞活化剂而增加。
274.如权利要求273所述的细胞或T细胞，其中所述T细胞活化剂包括抗CD3抗体或其片段、抗CD28抗体或其片段、细胞因子、结合所述TFP的所述抗原结合结构域的抗原，或它们的任何组合。
275.如权利要求201-274中任一项所述的细胞或T细胞，其中当所述TFP在T细胞中表达时，所述TFP与内源TCR复合物功能性地相互作用。
276.如权利要求201-274中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞包含内源TCR的功能性破坏。
277.如权利要求201-276中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞是同种异体的细胞或T细胞。
278.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞包含内源CD70基因的功能性破坏。
279.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞包含内源CIITA基因的功能性破坏。
280.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含用于降低CD70内源水平的反义siRNA、shRNA或miRNA。
281.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含用于降低CIITA内源水平的反义siRNA、shRNA或miRNA。
282.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列。
283.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述重组核酸包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的序列。
284.如权利要求283所述的细胞或T细胞，其中编码所述TFP的所述序列和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列被包含在同一操纵子中。
285.如权利要求283或284所述的细胞或T细胞，其中所述ER滞留结构域由SEQ ID NO:756-779中的任一者编码。
286.如权利要求283-285中任一项所述的细胞或T细胞，其中编码所述融合蛋白的所述序列还包含介于所述抗CD70抗体结构域和所述ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
287.如权利要求283-286中任一项所述的细胞或T细胞，其中编码所述融合蛋白的所述序列还包含编码位于编码所述抗CD70抗体结构域的所述序列的5’的CD8α信号肽的序列。
288.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述抗体结构域包含如权利要求105-175中任一项所述的重组核酸。
289.如权利要求201-277中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞包含与抗CD70抗体结合的细胞表面表达的CD70。
290.如权利要求289所述的细胞或T细胞，其中所述抗CD70抗体是由如权利要求105-175所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
291.如权利要求289所述的细胞或T细胞，其中所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由如权利要求105-175所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
292.如权利要求201-291中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含编码抑制性分子的异源序列，所述抑制性分子包含构成抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
293.如权利要求201-292中任一项所述的细胞或T细胞，其中所述细胞或T细胞还包含编码TCR恒定结构域的异源序列。
294.如权利要求293所述的细胞或T细胞，其中所述TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域或其部分、TCRβ恒定结构域或其部分、TCRα恒定结构域或其部分和TCRβ恒定结构域或其部分、TCRγ恒定结构域或其部分、TCRδ恒定结构域或其部分，或TCRγ恒定结构域或其部分和TCRδ恒定结构域或其部分。
295.如权利要求294所述的细胞或T细胞，其中所述TCRα恒定结构域或所述TCRβ恒定结构域是鼠的。
296.如权利要求201或202所述的细胞或如权利要求209或210所述的T细胞，其中所述细胞或T细胞包含编码选自SEQ ID NO:1233、1236、1240和1264的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的重组核酸分子。
297.一种药物组合物，其包含权利要求201-296中任一项所述的细胞或T细胞和药学上可接受的载剂。
298.一种产生权利要求278所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括：
(i)破坏内源CD70基因，从而产生含有内源CD70基因的功能性破坏的细胞或T细胞；以及
(ii)用权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸或权利要求190和193-200中任一项所述的载体转导含有所述内源CD70基因的所述功能性破坏的所述细胞或T细胞。
299.如权利要求298所述的方法，其中所述破坏包括用靶向所述内源CD70基因的核酸酶蛋白或编码所述核酸酶蛋白的核酸序列转导所述细胞或T细胞。
300.如权利要求298或299所述的方法，其中所述方法还包括破坏内源TCR。
301.一种产生如权利要求278所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括用如权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸或如权利要求190和193-200中任一项所述的载体转导包含内源CD70基因的破坏的细胞或T细胞。
302.如权利要求301所述的方法，其中所述细胞或T细胞还包含内源TCR的破坏。
303.一种产生权利要求201-277和289-291中任一项所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括：
(i)用权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸或权利要求190和193-200中任一项所述的载体转导细胞或T细胞；以及
(ii)使所述细胞或T细胞同与所述细胞表面上的CD70结合的抗CD70抗体接触。
304.如权利要求303所述的方法，其中所述抗CD70抗体是由如权利要求105-175所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
305.如权利要求304所述的方法，其中所述抗CD70抗体对CD70的亲和力高于由如权利要求105-175所述的重组核酸编码的所述抗体或抗原结合片段。
306.如权利要求303-305中任一项所述的方法，其中所述接触发生在所述转导之前。
307.如权利要求306所述的方法，其中所述接触发生在所述转导前至多1天。
308.如权利要求303-305中任一项所述的方法，其中所述接触发生在所述转导之后。
309.如权利要求308所述的方法，其中所述接触发生在所述转导之后至多5天。
310.如权利要求303-305中任一项所述的方法，其还包括在所述转导之后4天或更多天，在不包含所述抗CD70抗体的培养基中对所述细胞进行继代培养。
311.如权利要求310所述的方法，其中所述继代培养包括在所述转导之后7天或更多天，在不包含所述抗CD70抗体的培养基中对所述细胞进行继代培养。
312.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求297所述的药物组合物。
313.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)如权利要求201-296中任一项所述的细胞或T细胞；和(b)药学上可接受的载剂。
314.如权利要求312或313所述的方法，其中所述癌症是与CD70表达升高相关的癌症。
315.如权利要求312-314中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用增加所述癌细胞中的CD70水平的剂。
316.如权利要求315所述的方法，其中增加CD70水平的所述剂是低甲基化剂。
317.如权利要求316所述的方法，其中所述低甲基化剂是5-阿扎胞苷或地西他滨。
318.如权利要求312-317中任一项所述的方法，其中所述疾病或所述病状选自由以下组成的组：T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)+癌症和/或人乳头瘤病毒(HPV)+癌症。
319.如权利要求312-317中任一项所述的方法，其中所述疾病或所述病状选自由以下组成的组：肾癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、胸腺癌、乳腺癌、头颈癌和胃癌。
320.如权利要求312-319中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
321.一种产生权利要求279所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括：
(i)破坏内源CIITA基因，从而产生含有内源CIITA基因的功能性破坏的细胞或T细胞；以及
(ii)用权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸或权利要求190和193-200中任一项所述的载体转导含有所述内源CIITA基因的所述功能性破坏的所述细胞或T细胞。
322.如权利要求321所述的方法，其中所述破坏包括用靶向所述内源CIITA基因的核酸酶蛋白或编码所述核酸酶蛋白的核酸序列转导所述细胞或T细胞。
323.如权利要求321或322所述的方法，其中所述方法还包括破坏内源TCR。
324.一种产生如权利要求279所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括用如权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸或如权利要求190和193-200中任一项所述的载体转导包含内源CIITA基因的破坏的细胞或T细胞。
325.如权利要求324所述的方法，其中所述细胞或T细胞还包含内源TCR的破坏。
326.一种产生权利要求282-288中任一项所述的细胞或T细胞的方法，所述方法包括用权利要求1-104、177、178和179中任一项所述的重组核酸或权利要求190和193-200中任一项所述的载体和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的融合蛋白的序列转导细胞或T细胞。
327.如权利要求326所述的方法，其中所述重组核酸或载体和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列同时被转导。
328.如权利要求327所述的方法，其中所述重组核酸或载体包含编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的序列。
329.如权利要求328所述的方法，其中编码所述TFP的所述序列和编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列被包含在同一操纵子中。
330.如权利要求326所述的方法，其中所述重组核酸或载体在编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列之前或之后被转导。
331.如权利要求326-330中任一项所述的方法，其中所述ER滞留结构域由SEQ ID NO:756-779中的任一者编码。
332.如权利要求326-331中任一项所述的方法，其中编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列还包含介于所述抗CD70抗体结构域和所述ER滞留结构域之间的CD8α跨膜结构域。
333.如权利要求326-332中任一项所述的方法，其中编码包含抗CD70抗体结构域和ER滞留结构域的所述融合蛋白的所述序列还包含编码位于编码所述抗CD70抗体结构域的所述序列的5’的CD8α信号肽的序列。
334.如权利要求326-333中任一项所述的方法，其中所述抗体结构域构成如权利要求105-175中任一项所述的抗CD70抗体。
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