JP2023520658A - 抗ｔｎ－ｍｕｃ１キメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞免疫療法を提供することにより、異常なグルコシル化のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌などの疾患を治療するための改善された組成物および方法に関し、この細胞免疫療法は、異常なグルコシル化のＭＵＣ１タンパク質に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫調節細胞である。本発明はさらに、ポリヌクレオチド、発現ベクター、および免疫調節細胞を含む免疫療法ならびに関連の方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年３月２６日に出願されたＧＢ特許出願第２００４３７１．７号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書の一部とされる。
電子提出された配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含んでおり、その全内容が参照により本明細書の一部とされる。２０２１年３月２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＰＢ６６８０２配列表」の名称で、サイズは１０７ＫＢである。
発明の分野
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子、そのようなＣＡＲ分子を含んでなるポリペプチド、そのようなＣＡＲ分子をコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。本発明はまた、そのようなＣＡＲ分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターを含んでなる免疫エフェクター細胞に関する。本発明はまた、そのような免疫エフェクター細胞を含んでなる医薬組成物に関する。本発明はまた、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発言する細胞を含んでなる癌の治療のためのそのようなＣＡＲ分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、および医薬組成物の使用に関する。
発明の背景
養子Ｔ細胞療法は、癌患者の治癒力を備えた画期的な治療法である。これらの強力な自家細胞療法を患者に向けて操作するために、末梢血を用いてＴ細胞を採取し、次にそれらを遺伝的に改変する。これらの細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入することで、選択した抗原に特異的に結合することができるようになる。これらの改変細胞を、一致する抗原を発現する癌細胞に送り込み、次いで殺傷する目的で、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、患者に再注入する(Yeku et al., Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2017; 37: 193-204; McBride et al., Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2019; 11(5): e1557)。
ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性、機能および持続性をリプログラミングする合成抗原受容体である。ＣＡＲは、抗体一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の抗原特異的領域とＴ細胞活性化ドメイン、例えば、ＣＤ３複合体のζ鎖）および共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢの融合物からなる。この構成により、ヒト初代Ｔ細胞の抗原特異的な活性化が促進され、増殖および抗アポトーシス機能が高まる。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ある範囲の液性腫瘍であるＢ細胞悪性腫瘍に対して顕著な有効性を示し、初期の臨床試験の結果では、多発性骨髄腫における活性が示唆されている(Sadelain et al, Nature. 2017; 545(7655): 423-31; June et al., N Engl J Med. 2018; 379(1): 64-73; Brudno et al., Nat Rev Clin Oncol. 2017; 15(1): 31-46)。２０１７年にリンパ腫および白血病に対するＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴのＦＤＡ承認は、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の開発に集中的な取り組みを再燃させた。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、これまで固形腫瘍において示された有効性は限られたものであった。
固形癌に対する安全で有効なＴ細胞療法を実現するためには、Ｔ細胞は作製中、高く有効な殺傷能力を保持し、腫瘍に送り込むことができ、免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に打ち勝つ必要がある。大きな成功要因の１つは、抗原標的の選択である。抗原は、癌細胞表面に十分な量が発現し、健康な細胞との低い交差反応（オフターゲット効果とオンターゲット効果の両方）を保証するために正常組織での発現は低く維持されている必要がある。固形癌におけるＣＡＲ免疫療法は、主として発現が悪性組織に限定された適切な表面抗原がないために、依然として困難である。抗原標的の腫瘍外発現は、罹患した臓器組織によって重症度が異なるオンターゲット毒性を引き起こす可能性がある(Watanabe et al. 2018; 9: 2486; Park et al, Sci Rep. 2017; 7(1): 14366)。
細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）は、Ｏ－グリカンを持つタンデム反復配列を有する大型のタンパク質であり、正常細胞の頂膜表面に発現する。癌における末端切断型糖型を有するグリコシル化異常型のＭＵＣ１（図１）は、ほとんどの腺癌で過剰に発現している。癌に最も多く見られる異常糖型は、ＴｎおよびシアリルＴｎ（ｓＴｎ）糖型である。突然変異またはＣＯＳＭＣのエピジェネティックサイレンシングによるＴ合成酵素活性の喪失、およびＧａｌＮＡｃ－Ｔｓ２３の異所性発現を含むいくつかのメカニズムがＴｎ糖型の蓄積をもたらし得る。健康な組織では、Ｔｎ抗原はほとんど発現しておらず、ヒトは天然の抗Ｔｎ ＩｇＭ抗体を持っている。さらに、ＭＵＣ１が頂膜表面に限局している正常上皮とは異なり、腫瘍細胞膜上ではＭＵＣ－１が異常に過剰発現するようになる（図１）。しかしながら、異常なグリコシル化は主として変異した癌細胞の細胞表面に存在することを示すデータにもかかわらず、ＭＵＣ１タンパク質を発現する健康な細胞または炎症細胞に低レベルのグリコシル化異常のＭＵＣ１が存在することは完全に排除できない(Cascio et al., Biomolecules. 2016; 6(4): E39)。最近、ＴｎＭＵＣ１を標的とする高親和性糖ペプチド特異的抗体が開発された。マウス５Ｅ５ ｍＡｂは、補体媒介性および抗体依存性の細胞傷害性を介して乳癌細胞を溶解させることができる。５Ｅ５ ｍＡｂの可変ドメインを含んでなるＴｎＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、異種移植モデルにおいて膵臓および白血病を排除し、オリジナルの抗体と同様に、正常組織に対する反応性は無視できるものであって、癌特異性を示し得る。
本発明者らは、Ｔｎ－ムチン１（ＴｎＭＵＣ１）抗原をＣＡＲ－Ｔ開発のターゲットとして特定し、Ｔｎ－ＭＵＣ１抗原を特異的に標的とする第２世代ＣＡＲを設計した。ＴｎＭＵＣ１抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔは、ＴｎＭＵＣ１抗原に対する高い特異性、低い基底活性化レベル、ＴｎＭＵＣ１陽性腫瘍細胞の高い殺傷力を有する。
本発明は、第１の側面において、
ａ）グリコシル化異常のＭＵＣＩタンパク質上の１以上のエピトープに結合するヒト化抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる細胞外ドメインであって、その抗体または抗原結合ドメインが、
配列番号２８と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ１配列；
配列番号２９と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ２配列；
配列番号３０と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ３配列；
配列番号３１と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ１配列；
配列番号３２と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ２配列；および
配列番号３３と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ３配列
を含んでなり、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、非ヒト化型の前記抗体またはその抗原結合ドメインに比べて、より速い解離速度定数（ｋｄ）で前記エピトープに結合する、細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１以上の共刺激ドメイン；および
ｄ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
本発明はまた、第２の側面において、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提供する。
本発明はまた、第３の側面において、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、第４の側面において、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、第５の側面において、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチドおよび／または本発明の第５の側面に記載のベクターを含んでなるベクター産生細胞を提供する。
本発明はまた、第６の側面において、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、または本発明の第４の側面に記載のベクターを含んでなる免疫エフェクター細胞を提供する。
本発明はまた、第７の側面において、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞および薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はまた、第８の側面において、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲを含んでなる免疫エフェクター細胞を作製する方法であって、免疫エフェクター細胞に本発明の第４の側面に記載のベクターを導入することを含んでなる方法を提供する。
本発明はまた、第９の側面において、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞を含んでなる癌の治療において使用するための、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第４の側面に記載のベクター、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞、または本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を提供する。
本発明はまた、第１０の側面において、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞を含んでなる癌の治療のための薬剤の製造における、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第４の側面に記載のベクター、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞、または本発明の第７の側面に記載の医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、第１１の側面において、必要とする対象における癌の治療のための方法であって、前記対象に治療上有効な量の本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第４の側面に記載のベクター、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞、または本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を投与することを含んでなり、前記癌がグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞を含んでなる方法を提供する。
本発明はまた、第１２の側面において、癌を有する対象においてグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞で細胞傷害性を増強するための方法であって、前記対象に本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第４の側面に記載のベクター、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞、または本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を、投与前のグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の細胞傷害性に比べて、グリコシル化異常のＭＵＣ１を発現する癌細胞における細胞傷害性を増強するのに十分な量で投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明はまた、第１３の側面において、癌を有する対象においてグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の数を減少させるための方法であって、前記対象に治療上有効な量の本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第４の側面に記載のベクター、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞、または本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を投与することを含んでなり、前記治療上有効な量が、投与前のグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の数に比べて、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の数を減少させるのに十分なものである方法を提供する。
本発明はまた、第１４の側面において、療法において使用するための、本発明の第１の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第２の側面に記載のポリペプチド、本発明の第３の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第４の側面に記載のベクター、本発明の第６の側面に記載の免疫エフェクター細胞、または本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を提供する。
図１－正常対癌性粘膜／上皮上のＭＵＣ１発現の概略図。腫瘍進行時、癌性細胞上でのＭＵＣ１の差次的発現が生じて強い過剰発現、頂膜分布の制御不全（極性の消失）、および異常な低グリコシル化がもたらされる。 図２－ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）対非グリコシル化ＭＵＣ１（３６－４）に対する陽性対照タンパク質の結合。 ３Ａ～３Ｃ－ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質上清の結合プロファイル。 精製した抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖ構築物の図４－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。 図５－ＴｎまたはＳＴｎ糖残基：ＭＵＣ１ペプチド（配列番号９７）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（完全グリコシル化）；配列番号９６）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド１（配列番号９８）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド２（配列番号９９）、ＳＴｎＭＵＣ１ペプチド（配列番号１００）の位置を詳細に特定するＢＩＡｃｏｒｅアッセイで試験したＭＵＣ１ペプチドの概略図。 図６－ＴｎＭＵＣ１およびＳＴｎＭＵＣ１ペプチドとの結合に関するヒト化ｓｃＦｖタンパク質およびマウス５Ｅ５ ｓｃＦｖタンパク質のｋａ（１／Ｍｓ）、ｋｄ（１／ｓ）、およびＫＤ（Ｍ）をまとめたデータ表。 図７－ＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＭＵＣ１ペプチドに対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖｓ結合の結合プロファイルおよび親和性。 図８－完全グリコシル化および差次的グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＭＵＣ１ペプチド：ＭＵＣ１ペプチド（配列番号９７）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（完全グリコシル化）；配列番号９６）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド１（配列番号９８）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド２（配列番号９９）に対するマウス５Ｅ５ ｓｃＦｖおよびヒト化ｓｃＦｖタンパク質の結合。 図９－ＳＴｎＭＵＣ１およびＭＵＣ１ペプチドの両方に対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の結合プロファイルおよび親和性。 図１０－種々のＭＵＣ１ペプチド：ＭＵＣ１ペプチド（配列番号９７）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（完全グリコシル化）；配列番号９６）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド１（配列番号９８）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド２（配列番号９９）、ＳＴｎＭＵＣ１ペプチド（配列番号１００）に対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質１３Ｐ１６の結合。 図１１－ＴｎＭＵＣ１陽性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるヒト化ｓｃＦｖ結合のフィット曲線（ｎ＝１の実験からの代表的データ）。 図１２－ＴｎＭＵＣ１陰性ＰＣ３細胞におけるヒト化ｓｃＦｖ結合のフィット曲線（ｎ＝１の実験からの代表的データ）。 図１３－ＴｎＭＵＣ１陽性度の高いＪｕｒｋａｔ細胞におけるヒト化ｓｃＦｖ結合のフィット曲線（最高濃度１６Ｐ４（８２Ａ）および１３Ｐ１８（１９Ａ）におけるＭＦＩ値は、フック効果の証拠のために曲線フィッティングの前に除外した（ｎ＝１の実験からの代表的データ））。 図１４－Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞およびＰＣ３細胞におけるヒト化ｓｃＦｖ １３Ｐ１６（９７Ａ）結合のフィッティング結合曲線（標準誤差バーはｎ＝２の実験からのデータに基づく）。 図１５－Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＰＣ３細胞の表面でのＴｎＭＵＣ１発現のパーセント。 図１６Ａ～１６Ｄ－原形質膜タンパク質アレイスポッティングパターン：図１６Ａ：対照スポッティングパターン；図１６Ｂ～１６Ｄ：様々なドナーからの非形質導入細胞およびＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ形質導入細胞。 図１７－抗ヒトＭＵＣ１ ｍＡｂおよび対照を用いた原形質膜タンパク質アレイスポッティングパターン。 図１８Ａ～１８Ｄ－非形質導入細胞およびＴｎＭＵＣ１形質導入細胞を用いた原形質膜タンパク質アレイスポッティングパターン（プレスクリーン研究）；図１８Ｂ：非形質導入Ｔ細胞；図１８Ｃ：ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞；および図１８Ｄ：ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞。 図１９Ａ～１９Ｄ－原形質膜タンパク質アレイパターン（確認画面）。図１９Ａ：対照スポッティングパターン；図１９Ｂ：非形質導入細胞；図１９Ｃ ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞；および図１９Ｄ：ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞。 図２０Ａ～２０Ｃ－非形質導入および形質導入５Ｅ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞の基本表現型分析。図２０Ａは、形質導入効率（発現パーセンテージおよび発現度として）を示し；図２０Ｂは、平均ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比を示し；図２０Ｃは、非形質導入Ｔ細胞と比較した場合の、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９＋４１ＢＢ＋）および疲弊（ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋ＴＩＭ３＋）状態を示す。 図２１－総ての供試サンプルのメモリーＴ細胞サブセットのパーセンテージを示す、図２０からのｎ＝３ドナーのヒートマップ。 図２２Ａ～２２Ｃ－非刺激ＣＡＲ－Ｔ細胞における基底活性化の評価：図２２Ａ：ＣＤ４／ＣＤ８比；図２２Ｂ：Ｔ細胞サブ集団中のＣＤ６９＋ＴＩＭ３＋ＰＤ１＋細胞を表す活性化／疲弊状態；図２２Ｃ：上清サイトカインおよびグランザイムＢ放出。グラフは総て平均応答を示し、エラーバーは標準偏差を示す。バー付きの散布図は、異なる色の円によって表される個々のドナー応答の拡がりを示す。 図２３Ａ～２３Ｂ－ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）およびＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ６２）と比較したＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原依存性シグナル伝達の評価：図２３Ａ：総ＣＤ３ζおよびＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化したｐＣＤ３ζシグナル伝達；図２３Ｂ ＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化したｐＺＡＰ７０シグナル伝達。 図２４Ａ～２４Ｂ－キャピラリーウエスタン（ＰＥＧＧＹ－ＳＵＥ）を用いたＣＡＲ－Ｔシグナル伝達形質導入の検出。図２４Ａ：ＣＤ１９－ＢＢζ（ＭＢ０４９）およびＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＭＢ０４０）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較したＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化プロファイルを示すウエスタンデータ、ｐＣＤ３ζ、ｐＺＡＰ７０、ｐＥＲＫ１／２に増加、総ＩκＢαに減少が見られる；図２４Ｂ：ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較したＣＤ１９－ＢＢζ（ＭＢ０４９）、ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＭＢ０４０）ＣＡＲ－Ｔ細胞の有意に低い活性化を示す正規化ｐＣＤ３ζシグナルの計算値。 図２５－ＴｎＭＵＣ１ ＰＣ３腫瘍細胞株の存在下でＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化（ＩＦＮγ放出を介する）を測定するＭＳＤアッセイ（共培養２４時間後、データはｎ＝４ドナーの平均）。 図２６Ａ～２６Ｃ－ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔにより媒介されるＰＣ３ ＴｎＭＵＣ１細胞の殺傷の分析。図２６Ａは、ＭＢ０２４による標的濃度依存性の殺傷速度を示し、高～低標的発現は、それぞれ最も速い～最も遅い殺傷に関連する；図２６Ｂは、ＰＣ３ ＷＴ対照に対するＰＣ３ ＴｎＭＵＣ１陽性細胞における７２時間時点の生細胞パーセントの統計的有意性評価を示す；図２６Ｃは、ＭＳＤによる２４時間時点のＩＦＮγ放出により評価される活性化を示す。 図２７－ＰＣ３．ｗｔ細胞株およびＣＯＳＭＣノックアウト細胞株に対する正規化したＩｎｃｙＣｙｔｅ ＣＡＲ－Ｔ殺傷応答：正規化した速度論的ＴｎＭＵＣ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０５１、ＭＢ０５２、ＭＢ０５３およびＭＢ０５４）殺傷応答は、標的発現のレベルに応じて、ＰＣ３．ｗｔ（ＴｎＭＵＣ－１陰性）、ＰＣ３．４Ｃ１１（５％ＴｎＭＵＣ－１）およびＰＣ３．５Ｆ５（１００％ＴｎＭＵＣ１）細胞株の殺傷に異なる速度および閾値を示す（ｎ＝９）。 図２８Ａ～２８Ｄ－ＰＣ３．ｗｔ細胞株およびＣＯＳＭＣノックアウト細胞株において閾値終点で得られたＫｔ５０および生細胞％：ＭＢ０５１、ＭＢ０５２、ＭＢ０５３およびＭＢ０５４に関するボンフェローニ一元配置ＡＮＯＶＡ検定、図２８Ａは、ＴｎＭＵＣ－１発現細胞株に対するＣＡＲ－Ｔ細胞に関して計算されたＫｔ５０を示し、図２８Ｂは、ＴｎＭＵＣ－１高発現ＰＣ３．５Ｆ５細胞株に対する生細胞％を示し、図２８Ｃは、ＴｎＭＵＣ－１低発現ＰＣ３．４Ｃ１１細胞株に対する生細胞％を示し、図２８Ｄは、ＴｎＭＵＣ－１陰性細胞株（ＰＣ３．ｗｔ）に対する生細胞％を示す（ｎ＝９）。 図２９－ＣＡＲ ＭＢ０２４によるペプチド刺激ＩＦＮγの活性化：完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド（配列番号９６）、ならびに部分的グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド１（配列番号９８）およびＳＴｎＭＵＣ１ペプチド（配列番号１００）と共培養した際にＣＡＲ ＭＢ０２４により放出されたＩＦＮγを示すプロット。ＣＡＲ Ｔ－細胞がＭＵＣ１ペプチド（配列番号９７）またはＴｎＭＵＣ１ペプチド２（配列番号９９）の存在下で培養された際にはＩＦＮγは見られなかった。ＩＦＮγ分析は、ＭＳＤによって行った。 図３０－ＷＴ細胞株およびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋細胞株との共培養に応答したＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカインおよびグランザイムＢ放出。Ｊｕｒｋａｔ ＷＴ細胞株およびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋腫瘍細胞株との２４時間の共培養に応答したヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞からのサイトカイン放出。ドットプロットグラフは平均応答を示し、エラーバーは標準偏差を示す。ＭＢ０２１、ＭＢ０２２およびＭＢ０２４ Ｔ細胞のみの条件Ｎ＝８（４名のドナー、２反復）、ＭＢ０２５ Ｔ細胞のみＮ＝６（３名のドナー、２反復）、ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＣＯＳＭＣ－／ＣＯＳＭＣ＋条件Ｎ＝４（４名のドナーで１反復）、ＣＯＳＭＣ－およびＣＯＳＭＣ＋標的細胞のみＮ＝４。ＵＴ＝非形質導入Ｔ細胞；ＣＯＳＭＣ（－）＝Ｊｕｒｋａｔ ＷＴおよびＣＯＳＭＣ（＋）＝ＪｕｒｋａｔＣＯＳＭＣ＋腫瘍細胞株。 図３１Ａ～３１Ｃ－ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣ７Ｆ ＭＵＣ１ ＫＯ腫瘍細胞株と２４時間共培養したヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。図３１Ａ：単独で培養した、および共培養した２４時間後のヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋比。図３１Ｂ～３１Ｃ：単独で培養した、および共培養した２４時間後のヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞。単独で培養した、および共培養した２４時間後の細胞内サイトカインレベル；図３１Ｂ：細胞内サイトカインに関して陽性のＣＡＲ Ｔ細胞のパーセンテージを表し、図３１Ｃ：中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって評価されるような細胞内サイトカイン陽性度。ＭＢ０２１、ＭＢ０２２、ＭＢ０２４についてはＮ＝４、ＭＢ０２５についてはＮ＝３のドナーを検査した。グラフは総て平均応答を示し、エラーバーは標準偏差を示す。バー付きの散布図は、異なる色の円によって表される個々のドナー応答の拡がりを示す。４６８＝ＭＤＡ－ＭＢ－６８およびＫＯ＝ＭＣＦ７－ＫＯ腫瘍細胞株。 図３２Ａ～３２Ｂ－ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣ７Ｆ ＭＵＣ１ ＫＯ腫瘍細胞株と２４時間共培養したヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞の上清サイトカイン分析。図３２Ａ：上清サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイ結果。図３２Ｂ：Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ結果。ＭＢ０２１、ＭＢ０２２、ＭＢ０２４についてはＮ＝４、ＭＢ０２５についてはＮ＝３のドナーを検査した。グラフは総て平均応答を示し、エラーバーは標準偏差を示す。バー付きの散布図は、異なる色の円によって表される個々のドナー応答の拡がりを示す。４６８＝ＭＤＡ－ＭＢ－６８およびＫＯ＝ＭＣＦ７－ＫＯ 腫瘍細胞株。 図３３－細胞内染色の前にＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ７－ＫＯ腫瘍細胞株の細胞表面全般ＭＵＣ１および特異的Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ１発現レベルを評価して、それらの発現特異性を確認した。ゲートの設定は、ＢＶ４２１二次抗体単独対照に基づいた。矢印は、ＭＵＣ１およびＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ１の個々の陽性集団を示した。 図３４－Ｔｎ－ＭＵＣ１発現癌細胞株に応答したＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖：分裂指数に基づく増殖応答（左のパネル）；ＣＡＲ ＴおよびＴ細胞増殖の％（右のパネル）。ＴｎＭＵＣ ＣＡＲＴおよびＵＴ Ｔ細胞条件では４名のドナー、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔでは３名のドナーを検査した。プロットは総て平均と標準偏差を示す。Ｐ値＝ｎｓ（有意でない）＞０．０５＊＜０．０５ ＊＊＜０．０１ ＊＊＊＜０．００１。ＴＡ＝ＴｒａｎｓＡＣＴ。Ｆａｂ（２）＝Ｔｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ。 図３５Ａ～３５Ｃ－Ｔｎ－ＭＵＣ１発現癌細胞株との共培養に応答したＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ発現およびＣＤ４／ＣＤ８比の評価。図３５Ａ：ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度％。図３５Ｂ：中程度の蛍光強度に基づくＴ細胞表面のＣＡＲ発現レベル。図３５Ｃ：ＵＴ Ｔ細胞（ＣＡＲ陰性）と比較したＣＡＲ陽性細胞（Ｔｎ－ＭＵＣ１およびＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ）におけるＣＤ４／ＣＤ８比を示すグラフ。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲおよびＵＴ Ｔ細胞条件では４名のドナー、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔでは３名のドナーを検査した。プロットは総て平均と標準偏差を示す。Ｐ値＝ｎｓ（有意でない） ＞０．０５ ＊＜０．０５ ＊＊＜０．０１ ＊＊＊＜０．００１。ＴＡ＝ＴｒａｎｓＡＣＴ。Ｆａｂ（２）＝ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ検出。 図３６－ＩＦＮ－γ産生の定量。共培養プレートから取り出した上清を、ＣＡＲ Ｔ細胞集団によるＩＦＮ－γの産生を低領するためにＭＳＤで分析した。４名のドナーを検査した。エラーバーは平均とＳＤ（Ｎ＝３）を示す。データはＬｏｇ１０スケールで示す。 図３７－ＰＣ３ ５Ｆ５ヒト前立腺細胞株を接種し、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または対照ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＰＢＳ（ビヒクル）で処置したＮＳＧマウスの腫瘍体積。最初の腫瘍測定の１１日後に、腫瘍にＰＢＳ（Ｔ細胞無し）、ＢＣＭＡ（対照ＣＡＲ）またはＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を１×１０７の用量で投与した。グラフは試験３１日目の腫瘍体積（ｍｍ３）（最初の腫瘍測定の２５日後；Ｔ細胞投与の１４日後）を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定を行った。エラーバーは標準偏差を示す。ｎｓ≧０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図３８Ａ～３８Ｂ－ＰＢＳ（Ｔ細胞無し）、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照ＣＡＲ）またはＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞投与の前（処置前－Ｄ０）および７日後（処置後－Ｄ７）に、ＰＣ３ ５Ｆ５腫瘍担持ＣＤＸマウスの血清で測定されたＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α放出。図３８Ａ：ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－αの分泌レベルをｐｇ／ｍｌで示す（ｙ軸）。各ドットは、所与のマウスに関する所与の時点でのサイトカイン濃度である。同じマウスの点は点線でつながれている。データは、ｙ軸にｌｏｇ１０変換で表される。データが１時点について＜ＬＬｏＱであれば、これは図示のために０に設定した。図３８Ｂ：ベイズ線形回帰を用いた各サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）の直接比較であり、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲＴ群が処置前（Ｄ０）から処置後（Ｄ７）まで、３つ総てのサイトカインのより高いレベルをもたらすことを示す（左から右へプロットした「処置前」および「処置後」データのそれぞれは、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ、ＰＢＳ、およびＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔに関して示される）。 図３９Ａ～３９Ｂ－ＪｕｒｋａｔおよびＰＣ－３共培養上清中、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞の漸増レベルにおけるＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ ＴおよびＵＴ Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌。 図３９Ａ：各細胞株条件においてプロットしたＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ ＴおよびＵＴ Ｔ細胞の平均ＩＦＮγ分泌。データは、ｌｏｇ１０変換ＩＦＮγ濃度（ｐｇ／ｍＬ）として表される。エフェクターのみは、標的細胞の不在下で培養されたＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を表す。図３９Ｂ：比として計算した、各細胞株条件におけるＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞とＵＴ Ｔ細胞の比較。比が１（点線）より大きい場合、ＵＴ Ｔ細胞よりもＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞でＩＦＮγが高いことを示す。エフェクターのみは、標的細胞の不在下で培養されたＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を表す。データは３名のドナーの平均であり、エラーバーは９５％信頼区間を表す。
発明の具体的説明
概要
ＭＵＣ１は、正常細胞の頂膜表面に発現する膜貫通型糖タンパク質であり、広範なＯ－グリコシル化によって特徴付けられる（図１、左）。 ＭＵＣ１は、他のムチンファミリーのメンバーとともに、病原体および環境の攻撃に対する保護層である粘液を形成している(Hattrup and Gendler, Annu Rev Physiol. 2008; 70: 431-57)。癌では、ＭＵＣ１はしばしば腫瘍細胞によって過剰発現され、その極性を失い、重要なことに、ＭＵＣ１は末端切断型グリカンで異常にグリコシル化されている（図１、右）。癌に最も多く見られる末端切断型グリカンは、Ｔｈｏｍｓｅｎ－ｎｏｕｖｅａｕ（Ｔｎ）とシアリル－Ｔｎ（ＳＴｎ）糖型である(Springer, 1984)。「グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質」および「ＡＧ－ＭＵＣ１」という用語は、本明細書で使用する場合、総てのグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質またはグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質の個々の変異体、例えば、ＴｎＭＵＣ１、ＳＴｎＭＵＣ１などを総称する場合がある。
ＡＧ－ＭＵＣ１レベルの上昇は、予後不良および高い死亡率と相関する癌の進行および転移と関連している(Cascio and Finn, 2016; Finn et al, 2011)。健康な組織と腫瘍組織の発現量およびグリコシル化状態の顕著な違いから、グリコシル化異常のＴｎ／ＳＴｎ－ＭＵＣ１はＣＡＲ Ｔ細胞療法の魅力的な標的となる。
本発明は、一般に、これらのＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質に標的化された改良型キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本発明の改良型ＣＡＲ分子は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌を予防または治療するための組成および方法において使用され、それにより、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質発現癌に関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、または改善することが意図される。特定の実施形態において、本発明は、遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞を用いた、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌の改善された細胞療法に関する。
本明細書で意図する養子細胞療法の改良された組成物および方法は、容易に拡大することができ、ｉｎ ｖｉｖｏで長期持続性を示し、ＡＧ－ＭＵＣ１を発現する細胞に対して抗原依存性の細胞傷害性を示し得る遺伝子的に改変された免疫エフェクター細胞を提供する。
特に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の特に速い解離速度および低い親和性と高い効力は、他の遺伝子操作Ｔ細胞療法でこれまで観察されていたオフターゲット・腫瘍外毒性の可能性を最小限とし、解離速度の遅いＣＡＲのリスクとされてきた注入後のＴ細胞の疲弊を防止する可能性がある。
ＣＡＲ分子の重要な要件の１つは、腫瘍組織と健康な組織を識別する能力である。以前、高親和性を有するＣＡＲは、健康な組織の付随的な標的化によるオン／オフターゲット、腫瘍外毒性をもたらすことが示されている(Johnson et al., 2015; Park et al., 2017; Watanabe et al., 2018)。従って、本発明者らは、ＴｎＭＵＣ１陽性細胞と陰性細胞を識別する能力について、解離速度の遅いＣＡＲ－Ｔと解離速度の速いＣＡＲ－Ｔを比較した。解離速度の速いＣＡＲ－Ｔと解離速度の遅いＣＡＲ－Ｔはともに、ＴｎＭＵＣ１陽性細胞株に応答してＩＦＮγを分泌したが、解離速度の遅いＣＡＲ－ＴはＭＵＣ１タンパク質を欠く腫瘍細胞に応答してＩＦＮγを生産し、解離速度の速いＣＡＲ－Ｔはそうではなかった。これらのデータは、解離速度の速いＣＡＲ－Ｔ細胞がＴｎＭＵＣ１標的を特異的に認識し、患者におけるオフターゲット：オフ腫瘍毒性のリスクを最小化することを示唆している。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞をＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞にリダイレクトする遺伝子操作受容体が提供される。これらの遺伝子操作受容体は、本明細書ではキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれ、所望の抗原（例えば、ＡＧ－ＭＵＣ１）に対する抗体に基づく特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、特定の抗ＡＧ－ＭＵＣ１細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。「キメラ」とは、異なる起源のタンパク質またはＤＮＡ部分から構成されることを表す。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質に結合する細胞外ドメイン（結合ドメイン、抗原結合ドメイン、または抗原特異的結合ドメインとも呼ばれる）、膜貫通ドメイン、１以上の共刺激ドメインおよび１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。ＣＡＲの抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗原結合ドメインが標的細胞表面の抗原に結合すると、ＣＡＲはクラスター化し、ＣＡＲを含む細胞に活性化刺激を誘導する。ＣＡＲの主な特徴は、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を利用して、主要組織適合性（ＭＨＣ）に依存しない方法で、免疫エフェクター細胞の特異性を転換し、それにより、増殖、サイトカイン産生、貪食作用および／または標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する能力である。
細胞外ドメイン
様々な実施形態において、ＣＡＲは、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１以上の共刺激シグナル伝達ドメイン；および１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞外結合ドメインを含んでなる。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間にヒンジドメインをさらに含んでなる。ＣＡＲはまた、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインのいずれかの間にヒンジドメインまたはスペーサードメインも含んでなり得る。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、標的細胞、例えば、癌細胞上で発現するＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質と特異的に結合する抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗原結合ドメインを含んでなる細胞外結合ドメインを含んでなる。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は互換的に使用され、対象とする標的抗原、例えば、ＡＧ－ＭＵＣ１と特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来し得る。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合ドメインである。
「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合する」または「特異的結合」または「特異的に標的化する」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗原結合ドメイン（またはそれを含んでなるＣＡＲ）の、バックグラウンド結合よりも大きい結合親和性でのＡＧ－ＭＵＣ１への結合を表す。結合ドメイン（または結合ドメインまたは結合ドメインを含有する融合タンパク質を含んでなるＣＡＲ）がＡＧ－ＭＵＣ１と例えば約１０５Ｍ－１以上の親和性またはＫａすなわち、Ｉ／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡会合定数）で結合する場合、それはＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質と「特異的に結合する」。特定の実施形態では、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ－１、１０７Ｍ－１、１０８Ｍ－１、１０９Ｍ－１、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、または１０１２Ｍ－１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０７Ｍ－１、または少なくとも１０８Ｍ－１、または少なくとも１０９Ｍ－１、または少なくとも１０１０Ｍ－１、または少なくとも１０１１Ｍ－１、または少なくとも１０１２Ｍ－１またはそれより大きいＫａを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ以下）として表すこともできる。本開示による結合ドメインポリペプチドおよびＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって、または標識リガンドを用いた結合会合もしくは解離アッセイによって、またはＢｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ＮＪから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ Ｔ １００などの表面プラズモン共鳴装置、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術（例えば、Scatchard, Ann NY Acad Sci. 1949; 51(4): 660；および米国特許第５，２８３，１７３号；またはその同等物も参照）を使用して容易に決定することができる。
Ｋ Ｄ ／Ｋ Ａ ／ｋ ｄ ／ｋ ａ
ある実施形態において、ＣＡＲ：ＡＧ－ＭＵＣ１相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下である。あるいは、ＫＤは、５ｎＭ～１０ｎＭ；または１ｎＭ～２ｎＭであり得る。ＫＤは、１ｐＭ～５００ｐＭ；または５００ｐＭ～１ｎＭであり得る。当業者は、ＫＤ数値は小さいほど結合が強いことを認識するであろう。ＫＤの逆数（すなわち、１／ＫＤ）は、Ｍ－１を単位とする平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者は、ＫＡ数値が大きいほど結合が強いことを認識するであろう。
解離速度定数（ｋｄ）または「解離速度」は、ＣＡＲ：ＡＧ－ＭＵＣ１複合体の安定性、すなわち、毎秒減衰する複合体の画分を表す。例えば、ｋｄ ０．０１秒－１は、毎秒減衰する複合体が１％であることに相当する。ある実施形態において、解離速度定数（ｋｄ）は、１×１０－２秒－１以下、１×１０－３秒－１以下、１×１０－４秒－１以下、１×１０－５秒－１以下、または１×１０－６秒－１以下である。ｋｄは、１×１０－５秒－１～１×１０－４秒－１；１×１０－４秒－１～１×１０－３秒－１；または１×１０－３秒－１～１×１０－２ｓ－１であり得る。
結合速度定数（ｋａ）または「結合速度」は、ＣＡＲ：ＡＧ－ＭＵＣ１複合体形成の速度を表す。ある実施形態において、結合速度定数（ｋａ）は、１×１０６Ｍ－１秒－１以下、１×１０５Ｍ－１秒－１以下、１×１０４Ｍ－１秒－１以下、１×１０３Ｍ－１秒－１以下、または１×１０２Ｍ－１秒－１以下である。ｋａは、１×１０６Ｍ－１秒－１～１×１０５Ｍ－１秒－１；１×１０４ Ｍ－１秒－１～１×１０３Ｍ－１秒－１；および１×１０３Ｍ－１秒－１～１×１０２Ｍ－１秒－１であり得る。
１つの実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２倍を超え、バックグラウンド結合の約５倍を超え、バックグラウンド結合の約１０倍を超え、バックグラウンド結合の約２０倍を超え、バックグラウンド結合の約５０倍を超え、バックグラウンド結合の約１００倍を超え、またはバックグラウンド結合の約１０００倍を超え、またはそれを超える。
特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる。「抗体」は、免疫細胞により認識されるものなどの抗原決定基を含有する脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸などの抗原のエピトープを特異的に認識し結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含んでなるポリペプチドである結合剤を指す。
「抗原（Ａｇ）」は、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（例えば、癌特異的タンパク質を含むものなど）を含む。例示的抗原としては、限定するものではないが、脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸が挙げられる。抗原は、開示される抗原などの異種抗原によって誘導されるものを含め、特異的体液性または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態において、標的抗原は、ＡＧ－ＭＵＣ１抗原である。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
抗体には、その抗原結合ドメイン、例えば、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）および抗原結合を担う全長抗体の一部が含まれる。この用語にはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその抗原結合ドメインなどの遺伝子操作形態も含まれる。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 第3版, W. H. Freeman & Co., New York, 1997も参照のこと。
当業者に理解され、本明細書に記載されるように、完全な抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖を含んでなる。各重鎖は１つの可変領域と第１、第２、および第３の定常領域からなり、各軽鎖は１つの可変領域と１つの定常領域からなる。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびυとして分類される。哺乳動物軽鎖は、δまたはκとして分類される。
用語「抗体」は、本明細書では、免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を有する分子を指して最も広義で使用され、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、およびヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン（例えば、ドメイン抗体（ＤＡＢ））、抗原結合抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢＳなど、および以上のいずれかの改変型（別の「抗体」形式の概要については、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136を参照のこと）を含む。
α、δ、ε、γおよびυ重鎖を含んでなる免疫グロブリンは、免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭとして分類される。完全な抗体は、「Ｙ」型を形成する。このＹのステムは、相互に結合した２つの重鎖の第２および第３の定常領域（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合には、第４の定常領域）からなり、ヒンジにおいてジスルフィド結合（鎖内）が形成される。重鎖γ、αおよびδは、３つのタンデム（一直線）のＩｇドメイン、およびフレキシビリティを付加するためのヒンジ領域から構成される定常領域を有し；重鎖υおよびεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有する。第２および第３の定常領域は、それぞれ「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」と呼ばれる。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変領域および定常領域に結合された、単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合を担う。
軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域が挿入された「フレームワーク」領域を含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖と３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって、「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、３つ総ての重鎖ＣＤＲ３つ総ての軽鎖ＣＤＲ、総ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２つのＣＤＲを指す。
本明細書において、全長抗原結合配列内、例えば、抗体重鎖配列または抗体軽鎖配列内の可変ドメイン配列および可変ドメイン領域のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従って符番される。同様に、実施例に使用される「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」という用語は、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従う。さらなる情報については、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照のこと。
当業者には、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基の別のナンバリング規則も存在することが明らかであろう。例えば、Chothia et al., Nature. 1989; 342(6252): 877-83などのＣＤＲ配列の別のナンバリング規則も存在する。抗原結合タンパク質の構造およびタンパク質折りたたみは、他の残基がＣＤＲ配列の一部と見なされ、当業者によってそのように理解されることを意味し得る。
当業者に利用可能なＣＤＲ配列の他のナンバリング規則として、「ＡｂＭ」（バース大学）および「ｃｏｎｔａｃｔ」（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）法が含まれる。「最小結合単位」を提供するために、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｃｈｉａ、ＡｂＭおよびｃｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いた最小オーバーラッピング領域を決定することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの下位部分であり得る。
下表１は、各ＣＤＲまたは結合単位の各ナンバリング規則を用いた１つの定義を表す。表１では、可変ドメインアミノ酸配列を符番するためにＫａｂａｔナンバリングスキームを使用している。ＣＤＲ定義は、使用する個々の刊行物によって異なる場合があることに留意されたい。
Figure 2023520658000001
よって、以下のＣＤＲ：
配列番号３１のＣＤＲＨ１（ＤＨＡＩＨ）、（または配列番号１３、１９、２５、３７、もしくは４３のＣＤＲＨ１、それらはそれぞれ配列番号１３と同一である）；
配列番号３２のＣＤＲＨ２（ＨＦＳＰＧＮＴＤＩＫＹＮＤＫＦＫＧ）、（または配列番号１４、２０、２６、３８、もしくは４４のＣＤＲＨ１、それらはそれぞれ配列番号３２と同一である）；
配列番号３３のＣＤＲＨ３（ＳＴＦＦＦＤＹ）、（または配列番号１５、２１、２７、３９、もしくは４５のＣＤＲＨ３、それらはそれぞれ配列番号３３と同一である）；
配列番号２８のＣＤＲＬ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＤＱＫＮＹＬＴ）、（または配列番号１０、１６、２２、３４、もしくは４０のＣＤＲＬ１、それらはそれぞれ配列番号２８と同一である）；
配列番号２９のＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＥＳ）、（または配列番号１１のＣＤＲＬ２、１７、２３、３５、もしくは４１、それらはそれぞれ配列番号２９と同一である）；
配列番号３０のＣＤＲＬ３（ＱＮＤＹＳＹＰＬＴ）、（または配列番号１２、１８、２４、３６、もしくは４２のＣＤＲＬ３、それらはそれぞれ配列番号３０と同一である）；あるいは
配列番号５３からのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３（または配列番号４７、４９、５１、５５、もしくは５７からのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）；
配列番号５２からのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３（または配列番号４８、５０、５４、もしくは５６からのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）
のうちのいずれか１つまたは組合せを含んでなる抗原結合タンパク質が提供される。
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内で比較的保存されている。成分である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域を合わせたものである抗体のフレームワーク領域は、三次元空間でＣＤＲを配置し、整列させる働きをする。ＣＤＲは、主として抗原のエピトープへの結合を担う。
「ＶＬ」または「ＶＬ」という場合には、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されているような他の抗体フラグメントのものを含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。本明細書で企図される抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲを構築するために好適な軽鎖可変領域の具体例としては、限定するものではないが、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、および５６に示される軽鎖可変領域配列が挙げられる。
「ＶＨ」または「ＶＨ」という場合には、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されているような他の抗体フラグメントのものを含む免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。本明細書で企図される抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲを構築するために好適な重鎖可変領域の具体例としては、限定するものではないが、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７に示される重鎖可変領域配列が挙げられる。
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当技術分野で、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによるなど、当業者に公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体としては、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
「キメラ抗体」は、ヒトなどのある種に由来するフレームワーク残基と、マウスなどの別の種に由来するＣＤＲ（一般に抗原結合を付与する）を有する。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合ドメインである抗原特異的結合ドメインを含んでなる。
好ましい実施形態では、抗体は、ヒトＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質と特異的に結合するヒト抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体）またはその抗原結合ドメインである。
１つの実施形態において、ＣＡＲは、「ヒト化」抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる。「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分は１（または複数の）ヒト免疫グロブリンに由来する操作抗体の一種を指す。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更されてもよい（例えば、Queen, et al., Proc. Natl Acad Sci USA. 1989; 86(24): 10029-10032; Hodgson, et al., Biotechnology, 1991; 9(5): 421-5参照）。好適なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ Ｐｒｐｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性によって選択されるものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸に基づく）によって特徴付けられたヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに好適であり得る。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を提供することができる好適なアクセプター抗体も同様に選択することができる。アクセプター抗体重鎖と軽鎖は同じアクセプター抗体に由来する必要はないことに留意されたい。このようなヒト化抗体を生産するための方法の非限定例は、ＥＰ－Ａ－０２３９４００およびＥＰ－Ａ－０５４９５１に詳説されている。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合ドメインとしては、限定するものではないが、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）が挙げられる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
例示的ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含んでなるＡＧ－ＭＵＣ１に特異的な免疫グロブリン可変領域である。「ヒトフレームワーク領域」は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型（すなわち、天然に存在する）フレームワーク領域、その領域内のアミノ酸の約５０％未満（例えば、好ましくは、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満）が欠失もしくは置換されている（例えば、対応する位置において非ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１以上のアミノ酸残基で）ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域、またはその領域内のアミノ酸の約５０％未満（例えば、好ましくは、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満）が欠失または置換されている（例えば、露出した残基の位置でおよび／または対応する位置においてヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１以上のアミノ酸残基で）非ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域を指し、従って、１つの実施形態において、免疫原性が低減されている。
特定の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型フレームワーク領域である。ある特定の他の実施形態において、ヒトフレームワーク領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える位置にアミノ酸欠失または置換を有するヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域である。他の実施形態において、ヒトフレームワーク領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える位置にアミノ酸欠失または置換を有する非ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域である。
特定の実施形態において、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、ヒト重鎖ＦＲ３、ヒト軽鎖ＦＲ４、およびヒト重鎖ＦＲ４から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなる。
ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインに存在し得るヒトＦＲＳはまた、例示的ＦＲＳの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるアミノ酸が置換または欠失されている、本明細書に提供される例示的ＦＲＳの変異体も含む。
特定の実施形態では、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、（ａ）ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、およびヒト軽鎖ＦＲ４を含んでなるヒト化軽鎖可変領域と、（ｂ）ヒト重鎖ＦＲＩ、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ３、およびヒト重鎖ＦＲ４を含んでなるヒト化重鎖可変領域を含んでなる。
本明細書に提供されるＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインはまた、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲも含んでなる。このようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される非ヒトＣＤＲまたは変更された非ヒトＣＤＲであり得る。特定の実施形態では、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、および軽鎖ＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖可変領域と、（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ１、および重鎖ＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。
１つの実施形態において、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、配列番号１０～１２、１６～１８、２２～２４、２８～３０、３４～３６、および４０～４２に示される軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、配列番号１０～１２、１６～１８、２２～２４、２８～３０、３４～３６、および４０～４２に示される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。
１つの実施形態において、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、配列番号１３～１５、１９～２１、２５～２７、３１～３３、３７～３９、および４３～４５に示される重鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的結合ドメインは、配列番号１３～１５、１９～２１、２５～２７、３１～３３、３７～３９、および４３～４５に示される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合ドメインは、
配列番号５２からのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３；ならびに
配列番号５３からのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３
を含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合ドメインは、
配列番号２８と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ１配列；
配列番号２９と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ２配列；
配列番号３０と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ３配列；
配列番号３１と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ１配列；
配列番号３２と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ２配列；および
配列番号３３と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ３配列
を含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗体またはその抗原結合ドメインは、
配列番号２８のＣＤＲＬ１配列；
配列番号２９のＣＤＲＬ２配列；
配列番号３０のＣＤＲＬ３配列；
配列番号３１のＣＤＲＨ１配列；
配列番号３２のＣＤＲＨ２配列；および
配列番号３３のＣＤＲＨ３配列
を含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号４６に示されるＶＬ配列および配列番号４７に示されるＶＨ配列；
（ｂ）配列番号４８に示されるＶＬ配列および配列番号４９に示されるＶＨ配列；
（ｃ）配列番号５０に示されるＶＬ配列および配列番号５１に示されるＶＨ配列；
（ｄ）配列番号５２に示されるＶＬ配列および配列番号５３に示されるＶＨ配列；
（ｅ）配列番号５４に示されるＶＬ配列および配列番号５５に示されるＶＨ配列；または
（ｆ）配列番号５６に示されるＶＬ配列および配列番号５７に示されるＶＨ配列
を含んでなる。
いくつかの実施形態では、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨ配列およびＶＬ配列を含んでなるｓｃＦｖであり、ＶＨ配列とＶＬ配列は場合によりリンカー配列により分離される。他の実施形態では、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ配列およびＶＨ配列を含んでなるｓｃＦｖであり、ＶＨ配列とＶＬ配列は場合によりリンカー配列により分離される。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示される配列と少なくとも９０％同一の配列を有するｓｃＦｖを含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示される配列を有するｓｃＦｖを含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、配列番号９０、９１、９２、９３、９４、および９５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一の配列を有するｓｃＦｖを含んでなる。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、配列番号９０、９１、９２、９３、９４、および９５からなる群から選択される配列を有するｓｃＦｖを含んでなる。
特定の実施形態では、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、２００ナノモル（ｎＭ）未満のＫＤでグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに結合する。
ある実施形態において、ＣＡＲ：ＡＧ－ＭＵＣ１相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、２００ｎＭ以下である。あるいは、ＣＡＲ：ＡＧ－ＭＵＣ１相互作用のＫＤは、１ｎＭ～２００ｎＭ、１０ｎＭ～２００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～２００ｎＭ、１００ｎＭ～２００ｎＭ、１５０ｎＭ～２００ｎＭ、または１７０ｎＭ～２００ｎＭである。
他の実施形態では、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合ドメインであり、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに、非ヒト化抗体またはその抗原結合ドメインの解離速度定数（ｋｏｆｆ）よりも大きいｋｏｆｆで結合する。
特定の実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ相互作用の解離速度定数は、少なくとも１×１０－３秒－１である。例えば、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、少なくとも１×１０－３秒－１、少なくとも２×１０－３秒－１、少なくとも３×１０－３秒－１、少なくとも４×１０－３秒－１、少なくとも５×１０－３秒－１、少なくとも６×１０－３秒－１、少なくとも７×１０－３秒－１、少なくとも８×１０－３秒－１、または少なくとも９×１０－３秒－１であり得る。いくつかの実施形態では、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、１×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１である。いくつかの実施形態では、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、１×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１、２×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１、３×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１、４×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１、５×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１、または６×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１である。いくつかの実施形態では、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、２×１０－３秒－１～１×１０－２秒－１である。いくつかの実施形態では、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、６×１０－３秒－１１×１０－２秒－１である。
ＣＡＲ：ＡＧ－ＭＵＣ１相互作用の解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定することができる。特定の実施形態では、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ヒト化ｓｃＦｖタンパク質とＴｎＭＵＣ１ペプチド、例えば、配列番号９６のＴｎＭＵＣ１ペプチドの間の相互作用のＢｉａｃｏｒｅ測定によって決定される。解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、実施例４に詳細に記載されるようにＢｉａｃｏｒｅによって測定することができる。例えば、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＴｎＭＵＣ１ペプチドをチップ表面に捕捉し、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ポリソルベート２０を含んでなるバッファー中、３００秒結合、次いで９００秒解離を用いて、ヒト化ｓｃＦｖタンパク質をチップ表面に流すことによって測定することができる。ＴｎＭＵＣ１ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端において、当技術分野で公知の方法に従い、チップ表面にペプチドの捕捉を可能とするのに適当な官能基で修飾することができる。
リンカー
特定の実施形態では、ＣＡＲは、様々なドメイン間に、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、分子の適当な空間配置および立体配座のために付加される、リンカー残基を含んでなる。特定の実施形態において、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」は、ＶＨドメインとＶＬドメインを接続し、得られたポリペプチドが同じ軽鎖および重鎖可変領域を含んでなる抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持するように、２つの下位結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、リンカーは、１以上の重鎖または軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインを分離する。ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるまたはリンカーを含んでなる。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１～約２５アミノ酸、約５～約２０アミノ酸、または約１０～約２０アミノ酸、またはその間のいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８ ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれを超えるアミノ酸長である。
リンカーの具体例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン－セリンポリマー（Ｇ１-５Ｓ１-５）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；および当技術分野で公知の他のフレキシブルリンカーが挙げられる。
スペーサードメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後に、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能とするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離す領域(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419)を指す１以上の「スペーサードメイン」が続く。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来し得る。特定の実施形態では、スペーサードメインは、限定するものではないが、１以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含む免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
１つの実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ｌｇＧ４、またはｌｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる。
ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインの後に、一般に、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能とするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離す役割を果たす１以上の「ヒンジドメイン」が続く。ＣＡＲは、一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１以上のヒンジドメインを含んでなる。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載のＣＡＲに使用するために好適な例示的ヒンジドメインとしては、ＣＤ８α、およびＣＤ４などのＩ型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これらはこれらの分子に由来する野生型ヒンジ領域であってもよいし、または変更されていてもよい。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含んでなる。
膜貫通ドメイン
「膜貫通ドメイン」（ＴＭ）は、細胞外結合部分と共刺激ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の原形質膜に係留するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかから単離または誘導され得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のαもしくはＢ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、またはＰＤ１の少なくとも膜貫通領域から単離または誘導され得る（すなわち、含んでなる）。特定の実施形態では、ＴＭドメインは、合成品であり、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでなる。
１つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αから単離または誘導されたＴＭドメインを含んでなる。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、ＴＭドメインとＣＡＲの共刺激／細胞内シグナル伝達ドメインを連結する短い、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長のオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーを含んでなる。グリシン－セリンに基づくリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質への有効な抗Ａｇ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖および／または細胞傷害活性、例えば、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原の結合に伴って惹起される他の細胞応答を惹起することに関与するＣＡＲの部分を指す。
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性またはヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む）であり得る。よって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を遂行させるタンパク質の部分を指す。通常、全長細胞内シグナル伝達ドメインが使用可能であるが、多くの場合、全長ドメインを使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの末端切断部分が使用される限り、このような末端切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、全長ドメインの代わりに使用することができる。
細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な細胞内シグナル伝達ドメインのいずれの末端切断部分も含むことを意味する。
ＴＣＲだけを介して生じたシグナルでは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要とされることが知られている。よって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスのシグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を介して抗原依存性の一次活性化を誘発する細胞内シグナル伝達ドメインおよび抗原に依存しない方法で二次または共刺激シグナルを提供する働きをする共刺激シグナル伝達ドメインによって媒介されるということができる。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、１以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および１以上の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含んでなる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、刺激様式または阻害様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で働く細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
特定の実施形態において使用するのに好適なＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインの具体例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、またはＣＤ７９ｂから単離または誘導されたものが挙げられる。特に好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでなる。細胞内シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、場合により膜貫通ドメインのカルボキシル末端からリンカー領域によって分離された膜貫通ドメインのカルボキシル末端に任意の順序で直列に連結することができる。
共刺激ドメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および拡大増殖を高めるために１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでなる。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合した際にＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要な二次シグナルを提供する、抗原受容体またはＦＣ受容体以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の具体例としては、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。
１つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、およびＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）からなる群から選択される共刺激分子から単離または誘導された１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでなる。
別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）から単離または誘導された共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζから単離または誘導された細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書で企図される抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲとしては、限定するものではないが、配列番号５８、５９、６０、および６１に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
１つの実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲは、配列番号５８の配列を含んでなる。
１つの実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲは、配列番号５９の配列を含んでなる。
１つの実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲは、配列番号６０の配列を含んでなる。
１つの実施形態において、抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲは、配列番号６１の配列を含んでなる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、
ａ）グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン、前記抗体またはその抗原結合ドメインは、前記エピトープと２００ナノモル（ｎＭ）未満のＫＤで結合する；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１以上の共刺激ドメイン；および
ｄ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、
ａ）グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン、前記抗体またはその抗原結合ドメインは、前記エピトープと少なくとも１×１０－３秒－１の解離速度定数（ｋｏｆｆ）で結合する；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１以上の共刺激ドメイン；および
ｄ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、
ａ）グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに結合するヒト化抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン、前記抗体またはその抗原結合ドメインは、
配列番号２８と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ１配列、好ましくは、配列番号２８のＣＤＲＬ１配列；
配列番号２９と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ２配列、好ましくは、配列番号２９のＣＤＲＬ２配列；
配列番号３０と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ３配列、好ましくは、配列番号３０のＣＤＲＬ３配列；
配列番号３１と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ１配列、好ましくは、配列番号３１のＣＤＲＨ１配列；
配列番号３２と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ２配列、好ましくは、配列番号３２のＣＤＲＨ２配列；および
配列番号３３と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ３配列、好ましくは、配列番号３３のＣＤＲＨ３配列
を含んでなり、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記エピトープと、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含んでなる非ヒト化抗体またはその抗原結合ドメインの解離速度定数（ｋｏｆｆ）よりも大きいｋｏｆｆで結合する；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１以上の共刺激ドメイン；および
ｄ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなる。
ある実施形態において、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含んでなる非ヒト化抗体またはその抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその抗原結合フラグメントである。
ある実施形態において、ＣＡＲは、
ａ）グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに結合するヒト化一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含んでなる細胞外ドメイン、前記ｓｃＦｖは、
配列番号２８のＣＤＲＬ１配列；
配列番号２９のＣＤＲＬ２配列；
配列番号３０のＣＤＲＬ３配列；
配列番号３１のＣＤＲＨ１配列；
配列番号３２のＣＤＲＨ２配列；および
配列番号３３のＣＤＲＨ３配列
を含んでなり、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記エピトープと、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含んでなる非ヒト化抗体またはその抗原結合ドメインの解離速度定数（ｋｏｆｆ）よりも大きいｋｏｆｆで結合する；
ｂ）ＣＤ８αから単離された膜貫通ドメイン；
ｃ）ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）から単離された共刺激ドメイン；および
ｄ）ＣＤ３ζから単離された細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなる。
本発明の他の実施形態では、ＣＡＲは、
（ａ）グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質上の１以上のエピトープに結合するヒト化抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン、前記抗体またはその抗原結合ドメインは、前記エピトープと、少なくとも１×１０－３秒－１の解離速度定数（ｋｏｆｆ）で結合し、かつ、以下の付加的特性：
（ｉ）グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞に対する特異性の増大；および／または
（ｉｉ）Ｔ細胞疲弊の低減
のうち少なくとも１つを有する；
（ｂ）膜貫通ドメイン；
（ｃ）１以上の共刺激ドメイン；および
（ｄ）以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなる。
グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞に対するＣＡＲの特異性の増大とは、前記ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞がグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞とグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現しない細胞を識別する能力が増大していることを意味する。グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞に対する特異性は、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質に関して陽性または陰性いずれかの細胞と共培養した際に本明細書に提供されるＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞のサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ－γ放出）を測定することによるなど、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。ＩＦＮ－γ放出などのサイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化のマーカーである。
解離速度がより速い（すなわち、解離速度定数（ｋｏｆｆ）がより高い）ＣＡＲはまた、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質の存在下でのＴ細胞疲弊の低減も生じ得る。Ｔ細胞疲弊は、本明細書に提供されるＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞の抗原非依存性（基底）シグナル伝達を測定するなど、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞の基底活性化は、抗原の不在下でＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３マーカー（疲弊マーカー）およびインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）分泌（活性化マーカー）のレベルを測定することによって決定することができる。
ポリペプチド
本明細書では、限定するものではないが、ＣＡＲポリペプチドおよびそのフラグメントを含む様々なポリペプチド、それらを含んでなる細胞および組成物、抗体、ならびにポリペプチドを発現するベクターが企図される。好ましい実施形態では、１以上のＣＡＲを含んでなるポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５８、５９、６０、または６１のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を含んでなる抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲである。
「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」および「タンパク質」は、特に指定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として互換的に使用される。ポリペプチドは、合成されるか、または組換え生産され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは全長タンパク質配列または全長タンパク質のフラグメントを含んでなり得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在するものおよび天然に存在しないもの両方の当技術分野で公知のその他の修飾を含み得る。様々な実施形態において、ＣＡＲポリペプチドは、タンパク質のＮ末端に、そのタンパク質の輸送を翻訳と同時にまたは翻訳後に指示するシグナル（またはリーダー）配列を含んでなる。本明細書で企図されるＣＡＲにおいて有用な好適なシグナル配列の具体例としては、限定するものではないが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体αシグナルポリペプチドが挙げられる。ＣＡＲに有用な例示的シグナル配列は、配列番号８に示される。
ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技術のいずれかを使用して作製することができる。本明細書で企図されるポリペプチドは、特に、本開示のＣＡＲ、または本明細書で企図されるようなＣＡＲの１以上のアミノ酸からの欠失、付加、および／または置換を有する配列を包含する。
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、それは細胞環境からの、および細胞の他の成分との会合からのペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ単離および／または精製を指し、すなわち、それはｉｎ ｖｉｖｏ物質と有意に会合していない。同様に、「単離された細胞」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ組織または器官から得られ、細胞外マトリックスを実質的に含まない細胞を指す。
ポリペプチドには、「ポリペプチド変異体」が含まれる。ポリペプチド変異体は、天然に存在するポリペプチドとは１以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なり得る。このような変異体は、天然に存在するものであってもよいし、または例えば、上記のポリペプチド配列のうち１以上を改変することによって合成生成してもよい。
ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、１以上のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドとしては、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。
様々な例示的実施形態において、ポリヌクレオチドとしては、発現ベクター、ウイルスベクター、およびトランスファープラスミド、ならびにそれらを含んでなる組成物および細胞が含まれる。様々な例示的実施形態において、ポリヌクレオチドは、限定するものではないが配列番号２～７、および１０～６１に示されるポリペプチド配列を含む、本明細書で企図されるポリペプチドをコードする。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接している配列から取り出されているＤＮＡフラグメントを指す。「単離されたポリヌクレオチド」とはまた、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または自然界には存在しない、また、人の手で作製されたその他のポリヌクレオチドも指す。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知および利用可能な十分に確立された様々な技術のいずれかを用いて作製、操作および／または発現させることができる。所望のポリペプチドを発現させるために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適当なベクターに挿入することができる。
ベクター
本発明は、本明細書に記載されるような１以上のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を導入または輸送することができる核酸分子を指して使用される。導入される核酸は一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入される。ベクターは、細胞において自律的複製を指示する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能とするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠陥レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
特定の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、本発明のＣＡＲおよびポリペプチドを生産するために使用可能である。さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの生産を可能とする付加的成分を含んでもよく、これは次に本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。ウイルスベクターは、対象または対象の細胞への本発明のポリヌクレオチドの送達のために使用することができる。発現ベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、自立複製配列、および転移要素が挙げられる。さらなる例示的ベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、トランスポゾン、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、λファージまたはＭｌ ３ファージ、および動物ウイルスが挙げられる。
発現ベクターのさらなる例は、哺乳動物細胞での発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；レンチウイルスを介した遺伝子導入および哺乳動物細胞での発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴＴＭ ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴＴＭおよびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲおよびポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞においてＣＡＲおよび／またはポリペプチドの発現のためのこのような発現ベクターに連結することができる。
特定の実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるＢＡＣである。特定の実施形態において、ＢＡＣは、産生細胞株またはパッケージング細胞株で発現された際にウイルスベクターの生産を可能とするのに必要なタンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドをさらに含んでなる。例として、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０８９３０７およびＷＯ２０１７／０８９３０８は、レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクターを生産するために使用される発現ベクターを記載している。特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるＷＯ２０１７／０８９３０７およびＷＯ２０１７／０８９３０８に記載されている発現ベクターを含む。
発現ベクター中に存在する「制御要素」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行するベクターの非翻訳領域、すなわち、複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域である。このような要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。使用するベクター系および宿主によって、偏在性プロモーターおよび誘導プロモーターを含むいくつの好適な転写および翻訳要素を用いてもよい。
送達用ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象および／または対象の細胞へ送達するためのベクターを提供する。このようなベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、自立複製配列、転移要素、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、λファージまたはＭｌ ３ファージ、およびウイルスベクターが挙げられる。
ウイルスベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。これらのベクターは、本明細書では「ウイルスベクター」と呼ばれる。
当業者が認識しているように、「ウイルスベクター」という用語は、広く、一般に核酸分子の導入または細胞のゲノムへの組込みを補助するウイルス由来核酸要素を含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）または核酸導入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指して使用される。
レトロウイルスは、遺伝子送達のための一般的なツールである(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460)。特定の実施形態において、レトロウイルスは、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーへと逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。ウイルスはひと度、宿主ゲノムに組み込まれると、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として働き、新たなウイルス粒子を生産するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。
特定の実施形態において使用するために好適な例示的レトロウイルスとしては、限定するものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複雑型レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的レンチウイルスとしては、限定するものではないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；１型ＨＩＶ、および２型ＨＩＶを含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。１つの実施形態では、ＨＩＶに基づくベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が好ましい。
レトロウイルスベクター、より詳しくは、レンチウイルスベクターは、特定の実施形態の実施に使用可能である。よって、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。
ウイルス粒子は一般に、様々なウイルス成分を含み、核酸に加えて宿主細胞成分を含む場合もある。
上述のように、「ウイルスベクター」という用語は、細胞に核酸を導入することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または導入された核酸そのもののいずれかを指し得る。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主としてウイルスに由来する構造および／または機能的遺伝要素を含む。「レトロウイルスベクター」という用語は、主としてレトロウイルスに由来する構造および機能的遺伝要素、またはその一部を含むウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主としてレンチウイルスに由来するＬＴＲを含め、構造および機能的遺伝要素、またはその一部を含むウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス配列と非レンチウイルスウイルス配列の両方を含むベクター、ＬＴＲまたはその他核酸を指す。１つの実施形態において、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルス配列を含んでなるベクターまたは導入プラスミドを指す。
特定の実施形態において、「レンチウイルスベクター」、および「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指して使用する場合がある。本発明において、クローニング部位、プロモーター、調節要素、異種核酸などの要素に言及する場合、これらの要素の配列はレンチウイルス粒子ではＲＮＡの形態で存在し、ＤＮＡプラスミドではＤＮＡの形態で存在すると理解されるべきである。
プロウイルスの各末端には、「長い末端反復配列」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造がある。「長い末端反復配列（ＬＴＲ）」という用語は、レトロビルＤＮＡの末端に位置する、天然配列に関して、ダイレクトリピートであり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含む塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現に基本的な機能（例えば、遺伝子転写産物の促進、誘導およびポリアデニル化）およびウイルス複製に基本的な機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御要素、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組込みに必要な配列を含む多くの調節シグナルを含む。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵＳと呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサー要素およびプロモーター要素を含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（リピート）領域は、Ｕ３およびＵ５領域が隣接している。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含んでなり、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端の両方に見られる。５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（Ｐｓｉ部位）である。
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、レトロウイルスゲノム内に位置する、ウイルスＲＮＡのウイルスキャプシドまたは粒子への挿入に必要な配列を指す（例えば、Clever et al., J Virol. 1995; 69(4): 2101-9参照）。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド封入に必要な最小パッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ｗ］配列とも呼ばれる）を使用する。よって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「ｐｓｉ」という用語および「Ｗ」という記号は、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド封入に必要な非コード配列を指して使用される。
様々な実施形態において、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含んでなる。ＬＴＲの一方または両方が、限定するものではないが、１以上の欠失、挿入、または置換を含む１以上の改変を含んでなり得る。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠陥とすることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を向上させるためになされる。本明細書で使用される場合、「複製欠陥」という用語は、感染力のあるビリオンが生産されないように完全な有効複製ができないウイルス（例えば、複製欠陥レンチウイルス後代）を指す。「複製可能な」という用語は、ウイルスのウイルス複製が感染力のあるビリオン（例えば、複製可能なレンチウイルス後代）を生産できるような野生型ウイルスまたは複製可能な変異型ウイルスを指す。
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、Ｕ３領域として知られる右の（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、初回のウイルス複製以降のウイルス転写を妨げるように改変されている（例えば、欠失または置換による）複製欠陥ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の際に右の（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域が左の（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域の鋳型として使用されるために、Ｕ３エンハンサー－プロモーターがなければウイルス転写産物が行えないためである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が例えば理想的なポリ（Ａ）配列で置換されるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’および５’ＬＴＲの両方に対する改変などのＬＴＲに対する改変も含まれることに留意されたい。
ウイルス粒子の生産中にウイルスゲノムの転写を駆動するために５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置換することにより、さらなる安全性の強化が提供される。使用可能な異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ依存的に高レベルの転写を駆動することができる。この置換は、ウイルス産生系の完全なＵ３配列がないために、複製可能なウイルスを生成するための組換えの可能性を低減する。特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式を制御する上でさらなる利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導因子が存在する場合にのみウイルスゲノムの総てまたは一部の転写が起こるように誘導することができる。誘導因子としては、限定するものではないが、１以上の化学化合物または宿主細胞が培養される温度もしくはｐＨなどの生理学的条件が挙げられる。
特定の具体的実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは総ては、レンチウイルス、例えばＨＩＶ－Ｉに由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用するまたは組み合わせることができ、また、導入ベクターの本明細書に記載の機能を遂行する能力を損なうことなくある種のレンチウイルス配列において多くの置換および変更が適用可能であると理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、Naldini et al., (Science. 1996; 272(5259): 263-7; Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(21): 11382-8; Curr Opin Biotechnol. 1998; 9(5): 457-63); Zufferey al., Nat Biotechnol. 1997; 15(9): 871-5; Dull et al., J Virol. 1998; 72(11): 8463-71;米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号参照、その多くがウイルスベクターまたは導入プラスミドを作製するように適合可能である。
様々な実施形態において、ベクターは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含んでなる。
特定の実施形態において、ベクターは、限定するものではないが、エピソームベクターまたは染色体外で維持されるベクターを含む非組込みベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソームの」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれることなく、かつ、分裂中の宿主細胞から徐々に消失することなく複製することができるベクターを指し、これはまた、前記ベクターが染色体外でまたはエピソームで複製することも意味する。
制御要素
特定の実施形態において、限定するものではないが、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むベクターとしては、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性の、内因性の、または異種の制御配列が含まれる。「内因性」制御配列は、ゲノム中の所与の遺伝子と本来連結されているものである。「外因性」制御配列は、ある遺伝子の転写が連結されているエンハンサー／プロモーターによって指示されるように遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によってその遺伝子に並置されたものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを誘導および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写の開始部から７０～８０塩基上流に見られる別の配列、すなわちＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎはいずれのヌクレオチドであってもよい）を含んでなる。
「エンハンサー」という用語は、転写の増強を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、いくつかの例では、別の制御配列に対するそれらの配向に依存せずに機能することができる。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協力的または相加的に機能することができる。プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。
「機能的に連結された」という用語は、記載された成分が、それらの意図された様式で機能することを可能とする関係にある並置を意味する。１つの実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、および／またはエンハンサー）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、対象とするポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、機能的に連結された配列の転写を継続的または連続的に可能とするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織種での発現を可能とする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであってもよく、またはそれぞれ限定された様々な細胞および組織種での発現を可能とする「細胞特異的」、「細胞種特異的」、「細胞系統特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
特定の実施形態において使用するために好適な例示的遍在性発現制御配列としては、限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＮ４ＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、Ｈ５、Ｐ７．５、およびワクシニアウイルス由来Ｐ１１プロモーター、延長因子１α（ＥＦ１ａ）プロモーター、早期成長応答１(early growth response 1)（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａβ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（βＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007))、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブコントロール、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター(Challita et al., J Virol. 69(2)・748-55 (1995))が挙げられる。
１つの実施形態において、ベクターは、ＰＧＫプロモーターを含んでなる。
特定の実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーター由来のＣＡＲを含んでなるポリヌクレオチドを発現させることが望ましい場合がある。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、限定するものではないが、誘導性発現；抑制性発現；特定の生理的、生物学的、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含むいずれのタイプの条件付き発現も指し得る。この定義は、細胞種または組織特異的発現を除外することを意図するものではない。特定の実施形態は、対象とするポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、発現は、ポリヌクレオチドを発現させる、または対象とするポリヌクレオチドがコードするポリヌクレオチドの発現の増加または減少を引き起こす処理または条件に、細胞、組織、生物などを曝すことにより制御される。
誘導プロモーター／系の具体例としては、限定するものではないが、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体（対応するホルモンによる処理により誘導可能）、メタロチオネインプロモーター(metallothionine promoter)（様々な重金属による処理により誘導可能）をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導プロモーター、ＭＸ－Ｉプロモーター（インターフェロンにより誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系("GeneSwitch" mifepristone-regulatable system) (Sirin et al., 2003, Gene, 323 :67)、クマリン酸誘導可能遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系が挙げられる。
いくつかの実施形態では、あるポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含んでなる細胞では、直接的毒性および／または制御されない増殖のリスクを軽減するために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、そのポリヌクレオチドまたは細胞を含んでなる宿主に免疫原性がない。使用可能な自殺遺伝子の特定の例は、カスパーゼ－９またはカスパーゼ－８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ－９は、二量体形成の特定の化学インデューサー（ＣＩＤ）を用いて活性化することができる。
特定の実施形態では、ベクターは、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞がｉｎ ｖｉｖｏで負の選択を受けやすくする遺伝子セグメントを含んでなる。「負の選択」とは、注入された細胞が、個体のｉｎ ｖｉｖｏ状態の変化の結果として排除され得ることを意味する。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入によるものであってもよい。
負の選択可能遺伝子は当技術分野で公知であり、とりわけ、以下のものが挙げられる：ガンシクロビル感受性を付与するＩ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｉ ＴＫ）遺伝子(Wigler et al., Cell I :223, 1977)；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼ(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89・33 (1992))。
いくつかの実施形態では、遺伝的に改変されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて負の選択表現型の細胞の選択を可能とする正のマーカーをさらに含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる。正の選択マーカーは、宿主細胞に導入されると、その遺伝子を有する細胞の正の選択を可能とする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種の遺伝子は当技術分野で公知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられる。
好ましくは、正の選択マーカーと負の選択要素は、負の選択要素の損失が正の選択マーカーの損失も必ず伴うように連結されている。いっそうより好ましくは、正の選択マーカーと負の選択マーカーは、一方の欠損が他方の欠損を必然的にもたらすように融合されている。上記の所望の正と負の選択特徴の両方を付与するポリペプチドを発現産物として得る融合ポリヌクレオチドの一例として、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）がある。この遺伝子を発現させると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの正の選択ではハイグロマイシンＢ耐性を、ｉｎ ｖｉｖｏでの負の選択ではガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドが得られる。Lupton S. D., et al, Mol. And Cell. Biology 11:3374- 3378, 1991を参照のこと。さらに、好ましい実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、融合遺伝子を含むレトロウイルスベクター、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの正の選択ではハイグロマイシンＢ耐性を、ｉｎ ｖｉｖｏでの負の選択ではガンシクロビル感受性を付与するもの、例えばLupton, S. D. et al. (1991), 前掲に記載のＨｙＴＫレトロウイルスベクター内にある。
ベクターの作製
特定の実施形態において、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターが形質導入される。例えば、免疫エフェクター細胞に、本発明のＣＡＲをコードするベクターが形質導入される。これらの形質導入細胞は、ＣＡＲ媒介細胞傷性害応答を惹起し得る。
「宿主細胞」には、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでベクターまたはポリヌクレオチドによるエレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、または形質導入を受けた細胞が含まれる。宿主細胞には、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターで形質導入された細胞を含み得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質転換された宿主細胞は、治療を必要とする対象に投与される。特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、所望の細胞種のトランスフェクト、感染、または形質転換された細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、Ｔ細胞である。
適切なウイルス力価を達成するためには、大規模なウイルスベクター生産がしばしば必要である。ウイルス粒子は、ウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えばｇａｇ、ＰＯＩ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含んでなるパッケージング細胞株に、導入ベクターをトランスフェクトすることにより製造することができる。
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超えるウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般に、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染を介して細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染の方法は、当業者に周知である。特定の実施形態において、レトロウイルス／レンチウイルス導入ベクターがトランスフェクション、形質導入または感染を介してパッケージング細胞株に導入され、産生細胞または細胞株が作出される。特定の実施形態において、パッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む標準的な方法によってヒト細胞または細胞株に導入される。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンセターゼまたはＡＤＡなどの優性選択マーカーとともに細胞に導入した後、適当な薬物の存在下でクローンの選択および単離を行う。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクター、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断ウイルスペプチドがコードする遺伝子に物理的に連結させることができる。
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子の適正なパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞株を指して使用される。いずれの好適な細胞株もパッケージング細胞を作製するために使用可能である。一般に、これらの細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を作製するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用可能な好適な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＯＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ ＩＯＴ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１ＩＡ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、ＨＥＫＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
本明細書で使用される場合、「産生細胞株」という用語は、組換えレトロウイルス粒子を生産することができる細胞株を指し、パッケージング細胞株とパッケージングシグナルを含む導入ベクター構築物とを含んでなる。感染性ウイルス粒子およびウイルス原液の生産は、従来の技術を使用して行うことができる。産生細胞株は、ＷＯ２０１７／０８９３０７およびＷＯ２０１７／０８９３０８に記載されている細胞株を含み、レトロウイルスベクターの生産に必要な総ての要素を、宿主細胞ゲノム内の単一の遺伝子座に含んでなる。
ウイルス原液を作製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, and N. R. Landau al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113により説明されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技術を用いてパッケージング細胞から回収することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知のように、細胞溶解または細胞培養の上清の回収によって回収することができる。場合により、回収されたウイルス粒子は、場合より精製することができる。好適な精製技術は当業者に周知である。
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞株から生成された組換えレトロウイルスにより最終的に感染および形質転換され得る宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合、ｅｎｖタンパク質はｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスのエンベロープタンパク質が、好ましい特徴を有する別のウイルスのものと置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ Ｇ）エンベロープタンパク質で偽型化することができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常、ＣＤ４＋提示細胞にウイルスを標的化するので、ＨＩＶがより広範囲の細胞に感染することを可能とする。好ましい実施形態では、レンチウイルスのエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇで偽型化される。１つの実施形態において、パッケージング細胞は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いて偽型化された組換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生する。
他の実施形態では、ウイルスベクターは、別のレトロウイルスまたは無関係なウイルスのいずれかからのエンベロープタンパク質で偽型化することができる。当業者は、本発明のウイルスベクターが、いずれの好適なエンベロープタンパク質で偽偽型されてもよいことを理解するであろう。
レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用い、トランスフェクションではなくウイルス感染による遺伝子または他のポリヌクレオチド配列の送達は「形質導入」と呼ばれる。１つの実施形態において、レトロウイルスベクターは、感染およびプロウイルスの組込みを介して細胞に形質導入される。特定の実施形態では、標的細胞、例えば、Ｔ細胞は、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する感染によって細胞に送達される遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含んでなる場合に、「形質導入されている」。特定の実施形態において、形質導入細胞は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによってその細胞ゲノムに送達された１以上の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含んでなる。
免疫エフェクター細胞
様々な実施形態において、癌の治療において使用するための、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された細胞が提供される。本明細書で使用される場合、「遺伝的に操作された」または「遺伝的に改変された」という用語は、細胞内の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態で余分な遺伝物質の付加を指す。「遺伝的に改変された細胞」、「改変細胞」および「リダイレクト細胞」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、細胞の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態での、遺伝子の発現を回復させる、矯正する、または改変する、または治療ポリペプチド、例えばＣＡＲを発現する目的の余分な遺伝物質の導入を指す。
特定の実施形態において、対象とする標的抗原、例えば、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質に対するそれらの特異性をリダイレクトするために、本発明により企図されるＣＡＲを免疫エフェクター細胞に導入し、発現させる。
「免疫エフェクター細胞」は、１以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書で企図される例示的免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞である。１つの実施形態において、免疫エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。１つの実施形態において、免疫エフェクター細胞としては、ナチュラルキラーＴ細胞が含まれる。１つの実施形態において、免疫エフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔリンパ球が含まれる。
免疫エフェクター細胞は、自己(autologous)／同種（「自己(self)」または非自己（「非自己、例えば、同種異系、同系または異種）であり得る。
「自己」とは、本明細書で使用される場合、同じ対象由来の細胞を指す。
「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは遺伝学的に異なる同種の細胞を指す。
「同系」は、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝学的に同一の異なる対象の細胞を指す。
「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。
特定の実施形態では、細胞は同種異系である。
特定の実施形態では、細胞は自己である。
本明細書で企図されるＣＡＲとともに使用される例示的免疫エフェクター細胞には、Ｔリンパ球が含まれる。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、技術分野で認識され、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むものとする。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、ＴヘルパーＩ（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態における使用に好適なＴ細胞の他の例示的集団としては、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。
当業者に理解されるように、他の細胞も、本明細書に記載されるようなＣＡＲを有する免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞としてはまた、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、およびマクロファージも含まれる。免疫エフェクター細胞としてはまた、エフェクター細胞の前駆細胞も含まれ、このような前駆細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫エフェクター細胞へと分化誘導することができる。よって、特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞としては、対象に投与した際に成熟免疫エフェクター細胞へと分化する、または成熟免疫エフェクター細胞へと分化誘導することができる、臍帯血、骨髄または動員性末梢血に由来する細胞のＣＤ３４集団内に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆細胞が含まれる。
本明細書で使用される場合、ＡＧ－ＭＵＣ１特異的ＣＡＲを含むように遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、「ＡＧ特異的リダイレクト免疫エフェクター細胞」と呼ばれる場合がある。
本発明のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法が、特定の実施形態において提供される。１つの実施形態において、この方法は、個体から単離された免疫エフェクター細胞を、免疫エフェクター細胞が本発明の１以上のＣＡＲを発現するように、トランスフェクトまたは形質導入することを含んでなる。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに操作されることなく遺伝的に改変される。次いで、そのような細胞は、個体に直接再投与することができる。さらなる実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変される前に、まずｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖するように活性化および刺激される。この点に関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝的に改変される（すなわち、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる）前および／または改変された後に培養することができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ操作または遺伝的改変の前に、免疫エフェクター細胞は対象から取得される。特定の実施形態において、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含んでなる。
特定の実施形態において、ＰＢＭＣは、本明細書で企図される方法を用いてＣＡＲを発現するように直接遺伝的に改変することができる。特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離の後にＴリンパ球がさらに単離され、特定の実施形態では、細胞傷害性リンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝的改変および／または拡大増殖の前または後のいずれかに選別して、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞サブ集団の選別を得ることができる。
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を用いて単離した後に遺伝的に改変することもできるし、または遺伝的に改変する前に、免疫エフェクター細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化および拡大増殖（または前駆細胞の場合には分化）させることもできる。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本発明のＣＡＲで遺伝的に改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含んでなるウイルスベクターで形質導入され）、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化および拡大増殖される。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現させるための遺伝子的改変の前または後に活性化および拡大増殖させることもできる。
特定の実施形態において、癌の治療のための改変免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に開示されるＣＡＲを含んでなる。例えば、改変免疫エフェクター細胞の集団は、癌と診断された患者（自己ドナー）から取得された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の異種集団を形成する。
ＰＢＭＣはまた、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球も含み得る。本発明のＣＡＲのコード配列を有するベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。特定の実施形態において、発現ベクターを有する、形質導入に成功したＴ細胞は、フローサイトメトリーを用いて選別してＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いで、抗ＣＤ３抗体および／もしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ－２または本明細書の他所に記載されているような当技術分野で公知の他のいずれかの方法を用いた細胞の活性化に加えて、これらのＣＡＲタンパク質発現Ｔ細胞の数を増すためにさらに増殖させることができる。
ＣＡＲタンパク質Ｔ細胞を発現するＴ細胞の凍結保存には、ヒト対象に使用するための保存および／または調製のための標準的な手順が使用される。
さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝的に改変する際に、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える異なるベクターの混合物を使用することができ、各ベクターは、本明細書で企図するように異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。得られた改変免疫エフェクター細胞は、改変細胞の混合集団を形成し、ある割合の改変細胞が２つ以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現している。
Ｔ細胞作製方法
ヒト治療のためのＴ細胞の作製方法は、当該技術分野において既知である。好ましい実施形態では、本明細書で企図される方法によって作製されたＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、本明細書で企図される特定の実施形態における方法によって作製されたＴ細胞組成物は、生存率の向上、分化の相対的不在下での拡大増殖、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性および優れた抗疲弊性を含む優れた特性を付与されると考えられている。抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、ＡＧ－ＭＵＣ１標的へのより低い結合速度を示し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＧ－ＭＵＣ１標的の存在下で疲弊する可能性が低い。抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊傾向が低いと、エフェクター機能が維持され、抑制性受容体の低い持続的発現がもたらされ、機能的エフェクターまたはメモリーＴ細胞の転写状態が維持される。疲弊は、感染症および腫瘍の最適な制御を妨げるため、ＣＡＲ－Ｔ療法に望まれる特徴ではない。
１つの実施形態において、Ｔ細胞は、本明細書で企図される抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲを含んでなるウイルスベクターでＴ細胞を形質転換することによって改変される。抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ療法の望ましい属性である抗原の不在下での低レベルの基底ＣＡＲ活性化およびインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）分泌を示す。ＣＡＲの抗原非依存性（基底）シグナル伝達の傾向は、抗原非依存性ＣＡＲ活性化につながる自己凝集を示し、これは次に、治療効力の喪失をもたらす早期ＣＡＲ疲弊を引き起こす可能性がある(Ajina and Maher, 2018; Long et al., 2015a)。ＣＡＲ－Ｔ細胞の基底活性化は、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３マーカーのレベルおよび抗原の不在下でＩＦＮγを分泌するＣＡＲ－Ｔの能力によって決定される。結合速度が低いヒト化抗ＡＧ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、形質転換されていない適合ドナーＴ細胞と比較して、低いＩＦＮγ分泌を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで記憶表現型を保持した。
１つの実施形態において、Ｔ細胞は、それを「より安全な」ＣＡＲとする活性化に高い標的閾値を必要とする本明細書で企図される抗ＡＧ－Ｍｕｃ１ ＣＡＲを含んでなるウイルスベクターでＴ細胞を形質転換することによって改変される。高い親和性を有するＣＡＲは、オン／オフターゲット、腫瘍外毒性をもたらす健康な組織の付随的ターゲティングにつながり得ることが示されている(Johnson et al., 2015; Park et al., 2017; Watanabe et al., 2018)。よって、本発明者らは、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞と陰性細胞を識別する能力について、解離速度の遅いＣＡＲ Ｔｓと解離速度の払いＣＡＲ Ｔｓを比較した。解離速度の速いＣＡＲ Ｔｓと遅いＣＡＲ ＴｓはともにＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞株に応答してＩＦＮγを分泌したが、解離速度の遅いＣＡＲ ＴｓはＭＵＣ１タンパク質を欠く腫瘍細胞に応答してＩＦＮγを生産したが、解離速度の速いＣＡＲ Ｔｓはそうではなかった。これらのデータは、解離速度の速い抗ＡＧ－Ｍｕｃ１ ＣＡＲ Ｔ細胞がＴｎ－ＭＵＣ１標的を特異的に認識し、それらの抗疲弊作用に加えて、患者における標的外：腫瘍外毒性のリスクを最小化することを示唆した。
医薬組成物
本明細書に記載の免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載のヒト疾患の治療に使用するための医薬組成物に組み込むことができる。１つの実施形態において、医薬組成物は、免疫エフェクター細胞を、場合により１以上の薬学上許容可能な担体および／または賦形剤と組み合わせて含んでなる。
このような組成物は、公知であり、許容可能な薬学的実践によって呼ばれるような薬学上許容可能な担体を含んでなる、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.を参照のこと。
医薬組成物は、注射または持続注入によって投与することができる（例としては、限定するものではないが、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、および門脈内が挙げられる）。１つの実施形態において、組成物は、静脈内投与に好適である。
遺伝的に改変された治療細胞の「治療上有効な量」は、疾患の状態、個人の年齢、性別および体重、ならびに幹細胞および前駆細胞の個人に望ましい応答を惹起する能力などの要因によって変化し得る。治療上有効な量とはまた、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の毒性または有害な影響が、治療上有益な効果に勝るものである。「治療上有効な量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与される組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者（対象）の病態における個人差を考慮して、医師によって決定することができる。一般に、本明細書に記載のＴ細胞を含んでなる医薬組成物は、１０２～１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（それらの範囲内の総ての整数値を含む）の用量で投与され得ると言える。細胞の数は、そこに含まれる細胞の種類と同様に、組成物が意図される最終的な用途に依存する。本明細書で提供される用途のために、細胞は一般に１リットル以下の体積であり、５００ｍｌ以下、さらには２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下であり得る。従って、所望の細胞の密度は、一般には１０６細胞／ｍｌより大きく、例えば１０６、１０７、１０８または１０９細胞／ｍｌより大きい。
臨床的に関連する数の免疫細胞は、累積して１０５、１０６、１０７、１０８ １０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞以上の複数の注入に配分することができる。いくつかの実施形態では、特に、注入された総ての細胞が特定の標的抗原にリダイレクトされ、１０６／キログラム（患者当たり１０６～１０１１）の範囲の、より少ない数の細胞が投与され得る。ＣＡＲ発現細胞組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与されてもよい。細胞は、治療を受ける患者に対して同種異系、同種同系、異種異系、または自己のものであり得る。所望により、治療は、免疫応答の誘導を増強するために、本明細書に記載されるような分裂促進因子（例えば、ＰＨＡ）またはリンパカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦα、ＩＬ－１８、およびＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も含み得る。
一般に、本明細書に記載されるように活性化および拡大増殖された細胞を含んでなる組成物は、免疫不全の個体に生じる疾患の治療および予防に利用され得る。特に、本明細書で企図されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含んでなる組成物は、癌の治療において使用される。特定の実施形態では、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、または担体、希釈剤、賦形剤、および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、１以上の薬学上または生理学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせた量の遺伝的に改変されたＴ細胞を含んでなる。
ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団、例えばＴ細胞を含んでなる医薬組成物は、バッファー、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでなり得る。特定の実施形態において、組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与のために処方される。
液体医薬組成物は、それらが溶液、懸濁液または他の同様の形態であるかどうかにかかわらず、以下の１以上を含み得る：注射用水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成モノまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖など張力調整のための薬剤剤を含み得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多回用量バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
１つの実施形態において、本明細書で企図されるＴ細胞組成物は、薬学上許容可能な細胞培養培地中に配合される。このような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学上許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。
別の好ましい実施形態では、本明細書で企図されるＴ細胞を含んでなる組成物は、凍結保存媒体を含んでなる溶液中に配合される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存媒体が、解凍後の高い細胞生存率の結果を維持するために使用できる。特定の組成物に使用される凍結保存倍体の具体例としては、限定するものではないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられる。
特定の実施形態では、組成物は、有効量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を単独でまたは１以上の治療薬と組み合わせて含んでなる。よって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独でまたは放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法などの他の既知の癌治療と組み合わせて投与することができる。これらの組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。このような治療薬は、特定の癌などの本明細書に記載されるような特定の疾患のための標準治療として当技術分野で認知されている。企図される例示的治療薬としては、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＤＥ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療抗体、または他の活性剤および補助剤が含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物は、当技術分野で公知のいくつの化学療法薬とともに投与してもよい。
様々な他の治療薬が、本明細書に記載の阻害剤とともに使用できる。１つの実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物が抗炎症剤とともに投与される。抗炎症剤または抗炎症薬は当技術分野で公知である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、サイトカインとともに投与される。「サイトカイン」とは、本明細書で使用される場合、ある細胞集団によって放出される、別の細胞に細胞間メディエーターとして働くタンパク質に対する一般用語を意味する。このようなサイトカインの例は当技術分野で公知である。
この医薬組成物は、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を他の薬剤、場合によりおよび／または使用説明書とともに含むパーツキットに含んでもよい。便宜のため、このキットは所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。このキットはまた、医薬組成物の投与のために使用される装置を含んでもよい。
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書の他所で企図される遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて治療することができる疾患、障害、または病態の症状を示す任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、本明細書の他所で企図される遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法で治療することができる癌に関連する疾患、障害、または病態の症状を示す任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、農場動物、および家畜またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象としては、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌と診断された、またはそのリクスがあるヒト患者が含まれる。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書の他所に開示される遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて治療することができる特定の疾患、障害、または病態を診断された対象を指す。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」という用語およびその派生語は、治療法を意味し、疾患また病態の症状または病理に対する任意の有益なまたは望ましい効果を含み、治療される疾患または病態の１以上の測定可能マーカーにおける最小限の減少さえも含み得る。治療は、場合により、疾患もしくは病態の軽減、または疾患もしくは病態の進行の遅延、例えば、腫瘍の成長の遅延のいずれかを含むことができる。「治療」は、必ずしも疾患もしくは病態、またはその関連の症状の完全な根絶もしくは治癒を示すものではない。特定の病態に関して、治療は、（１）その病態もしくはその病態の生物学的徴候の１以上を改善すること、（２）（ａ）その病態につながるかその原因となる生物学的カスケードの１以上のポイント、または（ｂ）その病態の生物学的徴候の１以上を妨げること、（３）その病態に関連する症状、影響もしくは副作用の１以上、またはその病態もしくはその治療に関連する症状、影響もしくは副作用の１以上を軽減すること；あるいは（４）その病態もしくはその病態の生物学的発現の１以上の進行を遅らせることを意味する。
本明細書で使用される場合、「予防」とは、病態もしくはその生物学的発現の可能性もしくは重症度を実質的に軽減するため、またはそのような病態もしくはその生物学的発現の発症を遅らせるための、薬剤などの薬物の予防的投与を意味する。当業者は、「予防」が絶対的な用語でないことを認識するであろう。予防療法は、例えば、対象が癌の強い家族歴を有する場合、または対象が発癌物質に曝露されている場合など、対象が癌を発症するリスクが高いと考えられる場合に適切である。
癌
本明細書で使用される場合、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、互換的に使用され、単数形または複数形のいずれにおいても、悪性転換を受けた細胞、または異常なもしくは無秩序な成長もしくは過増殖をもたらす細胞変化を受けた細胞を指す。このような変化または悪性転換は、通常、宿主生物にとってそのような細胞を病的なものにすることから、病的であるかまたは病的になる可能性があり、介入を必要とするかまたは介入から利益を受け得る前癌または前癌細胞も含まれるものとする。原発性癌細胞（すなわち、悪性転換の部位付近から得られた細胞）は、組織学的検査などの十分に確立された技術によって非癌細胞から容易に識別することができる。
本明細書で使用される場合、癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞の祖先に由来するいずれの細胞も含まれる。これには、転移した癌細胞、癌細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株も含まれる。通常、固形腫瘍として現れる癌の種類に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍質量に基づいて検出可能腫瘍；例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波または触診などの処置によって、および／または患者から得られる試料中の１以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能である腫瘍である。言い換えれば、本明細書の用語は、臨床医が前癌、腫瘍、ｉｎ ｓｉｔｕ増殖、ならびに後期転移性増殖と呼ぶものを含む、いずれの段階の細胞、新生物、癌、および腫瘍を含む。
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞群が、制御されない増殖（すなわち、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入および破壊）、転移（すなわち、リンパまたは血液を介して体内の他の場所への拡散）の１以上を示す癌を指す。
「癌細胞」は、癌性増殖または組織の個々の細胞を指す。癌細胞には、固形癌および液性癌の両方が含まれる。「腫瘍」または「腫瘍細胞」は、一般に、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常な増殖によって形成された腫脹または病変を指す。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、白血病などの液性癌は必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌については、癌（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は互換的に使用される。個体内の腫瘍の量は「腫瘍量」と呼ばれ、腫瘍の数、体積、重量として測定することができる。
１つの実施形態において、標的細胞は、抗原、例えば、他の正常な（望ましい）細胞の表面には実質的に見られない標的抗原を発現する。
１つの実施形態において、標的細胞は、骨細胞、オステオサイト、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、グリア細胞、星状細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、消化管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、鼻咽頭細胞、卵巣細胞、卵胞細胞、子宮頸細胞、膣細胞、子宮細胞、膵臓細胞、膵臓実質細胞、膵管細胞、膵島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、性腺細胞、精巣細胞、造血細胞、リンパ細胞、または骨髄細胞である。
１つの実施形態において、標的細胞は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する。１つの実施形態において、標的細胞は、造血細胞、食道細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮頸細胞、膵臓細胞、胆嚢または胆管細胞、胃細胞、結腸細胞、乳房細胞、杯細胞、腸細胞、幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する任意の細胞である。
１つの実施形態において、標的細胞は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する固形癌細胞である。
特定の実施形態において企図される組成物および方法により標的とされ得る細胞の具体例としては、限定するものではないが、以下の固形癌：副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型テラトイド／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織球腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、乏突起膠腫、口腔癌、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂および尿管 癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑液膜腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびビルムス腫瘍が挙げられる。
別の実施形態では、細胞は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する固形癌細胞である。これらの組成物で予防、治療、または改善され得る例示的ＡＧ－ＭＵＣ１発現固形癌細胞としては、限定するものではないが、食道癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、胆管癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、および乳癌が挙げられる。
特定の実施形態では、標的細胞は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する液性癌または血液癌細胞である。
特定の実施形態において企図される組成物で予防、治療、または改善され得る液性癌または血液癌の具体例としては、限定するものではないが、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。特定の実施形態において企図される抗ＳＴＮ ＣＡＲにより標的化され得る細胞の具体例としては、限定するものではないが、以下の白血病：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＮＮＬ）および真性赤血球増加症の細胞が挙げられる。
細胞傷害性を増強する方法
本明細書で企図される遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌の予防、治療、および改善に使用するための、またはＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質発現癌に関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、もしくは改善するための養子免疫療法の改善された方法を提供する。
様々な実施形態において、本明細書で企図される遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞は、対象におけるＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞での細胞傷害性の増強に使用するための、または対象におけるＡＧ－ＭＵＣ１を発現する癌細胞の数の低減に使用するための、養子免疫療法の改善された方法を提供する。
特定の実施形態において、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、一次免疫エフェクター細胞を本明細書で企図されるＣＡＲで遺伝的に改変することによって、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞、例えば癌細胞にリダイレクトされる。様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞を、ＡＧ－ＭＵＣ１に結合する抗ＡＧ－ＭＵＣ１抗体または抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および１以上の共刺激ドメイン；および１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなるＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドで遺伝的に改変するためにウイルスベクターが使用される。
１つの実施形態において、Ｔ細胞が、癌細胞上に発現するＡＧ－ＭＵＣ１発現タンパク質を標的とするＣＡＲを発現するように遺伝的に改変され、ＣＡＲ Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入されるタイプの細胞療法が提供される。注入された細胞は、レシピエントにおいて疾患を引き起こす細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで複製が可能であり、持続的な癌療法をもたらし得る長期持続性を生じる。
１つの実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、堅牢なｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞拡大増殖を受けることができ、長時間持続し得る。別の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、任意の追加の腫瘍形成または増殖を阻害するために再活性化され得る特定のメモリーＴ細胞へと進化する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲを含んでなる免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物は、ＡＧ－ＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞または癌幹細胞に関連する病態の治療において使用される。
本明細書で使用される場合、「の少なくとも1つの症状を改善する」という語句は、対象が治療されている疾患または病態の１以上の症状を軽減することを指す。特定の実施形態では、治療される疾患または病態は癌であり、改善される１以上の症状としては、限定すれるものではないが、衰弱、倦怠感、息切れ、打撲および出血しやすい、頻回の感染、リンパ節の腫脹、（腹部臓器の腫脹による）腹部の膨張または疼痛、骨または関節痛、骨折、予定外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続する微熱、（腎機能障害による）排尿減少が挙げられる。
「増強」または「促進」または「増大」または「拡大」とは、対照分子／組成物により引き起こされる応答に比べてより大きな生理学的応答（すなわち、下流効果）を生成、惹起、または引き起こす、本明細書で企図される組成物、例えば、遺伝的に改変されたＴ細胞またはＣＡＲをコードするベクターの能力を指す。測定可能な生理学的応答は、当技術分野および本発明の記載の理解から明らかな、とりわけ、Ｔ細胞の拡大増殖、活性化、持続性の増大、および／または癌細胞殺傷能の増大を含み得る。「増大」または「増強」量は一般に、「統計的に有意な」量であり、対照組成物により生成される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、５００倍またはそれを超える倍率の増大を含み得る。
「低減」または「低下」または「弱化」または「減少」または「緩和」とは、一般に、対照分子／組成物により引き起こされる応答に比べて生理学的応答（すなわち、下流効果）に比べてより小さな生理学的応答を生成する、惹起する、または引き起こす、本明細書で企図される組成物の能力を指す。「低下」または「減少」量は一般に、「統計的に有意な」量であり、対照組成物により生じる応答（参照応答）、または特定の細胞株における応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、５００倍またはそれを超える倍率の減少を含み得る。
１つの実施形態において、必要とする対象において癌を治療する方法は、本明細書で企図される遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞を含んでなる、有効量、例えば治療上有効な量の組成物を投与することを含んでなる。投与の量および頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定されるが、適当な用量は臨床試験によって決定することができる。
当業者は、所望の療法に影響を与えるために、本明細書で企図される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、２年、５年、１０年、またはそれを超える期間にわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回またはそれを超える回数投与することができる。
１つの実施形態において、それを必要とする対象に、対象において癌に対する細胞性免疫応答を増大させるために有効量の組成物を投与する。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞性免疫応答を含んでもよい。Ｂ細胞を活性化し、抗体産生をもたらすことができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答もまた誘導され得る。組成物によって誘導される免疫応答の種類を分析するために、様々な技術が使用され得、これらは当該技術分野において十分に記載されている；例えば、Current Protocols in Immunology，Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & sons, NY, N.Y.。
Ｔ細胞を介した殺傷の場合、ＣＡＲリガンド結合によりＴ細胞へのＣＡＲシグナル伝達が開始され、その結果、Ｔ細胞を様々なメカニズムで標的細胞のアポトーシスを誘導することができるタンパク質を産生または放出するよう誘導する様々なＴ細胞シグナル伝達経路が活性化される。これらのＴ細胞介在メカニズムとしては、Ｔ細胞から標的細胞への細胞内の細胞傷害性顆粒の移動、標的細胞の殺傷を直接（または他のキラーエフェクター細胞の動員を介して間接的に）誘導することができる炎症性サイトカインのＴ細胞分泌、および標的細胞上の同族死受容体（例えばＦａｓ）との結合後に標的細胞のアポトーシスを誘導するＴ細胞表面の死受容体リガンド（例えばＦａｓＬ）の上方調節などが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
以上の実施形態は、理解を明確にする目的で、図示および例によってある程度詳細に説明されたが、添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がそれらになされ得ることは、本明細書に企図される教示に照らして当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、例示のために提供されるにすぎず、限定するものではない。当業者には、本質的に同様の結果を得るために変更または修正することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識するであろう。
本発明者らは、マウスを起源とするｍＡｂ ５Ｅ５に由来するＶＬおよびＶＨ免疫グロブリンドメインをヒト化することによってｓｃＦｖ（ＣＡＲの標的結合部分）を生成した(Sorensen et al., 2006)。ＶＬおよびＶＨのヒト化は、ｓｃＦｖ形式で行った。ヒト化ｓｃＦｖは、完全マウスｓｃＦｖと比較して異なる動力学的プロファイルを有するにもかかわらず、ＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいてＴｎ／ＳＴｎ－ＭＵＣ１ペプチドに対する特異性を保持した。ヒト化Ｔｎ／ＳＴｎ－ＭＵＣ１特異的ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する操作されたヒトＴ細胞を使用して、ヒト化Ｔｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力および特異性を示す重要なデータを生成した。
実施例１－結合ドメインの生成
ＴｎＭＵＣ１を標的とするように高親和性糖ペプチド特異的抗体を開発した(Sorensen et al., 2006)(Tarp et al., 2007)。マウス５Ｅ５ ｍＡｂは、１．７ｎＭの親和性で結合し、補体媒介性および抗体依存性の細胞傷害性を介して乳癌細胞を溶解することができる(Lavrsen et al., 2013)。５Ｅ５ ｍＡｂの可変ドメインを含んでなるＴｎＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、異種移植モデルで膵臓および白血病を排除することができ、元の抗体と同様に、癌特異性を示し、正常組織に対する反応性はごくわずかである(Posey et al., 2016)。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して、マウス５Ｅ５ ＶＨおよびＶＬのヒト化変異体を生成し、後のタンパク質の発現および標的結合の特性評価のために一連のヒト化ｓｃＦｖ構築物をクローニングした。さらに、この研究は、フレームワーク鋳型およびヒト化の際に使用されたマウスアミノ酸の復元（復帰突然変異）を考慮することによって、各ｓｃＦｖの免疫原性リスクを予測することを目的とした。
方法
マウスｓｃＦｖ発現構築物の設計および分子クローニング
マウス５Ｅ５ ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（表２－Ｋａｂａｔ定義によるＣＤＲ残基に下線を施している）をＶＬ－ＶＨ配向およびＶＨ－ＶＬ配向で組み合わせて、２つのｓｃＦｖ分子のアミノ酸配列を生成した。ｓｃＦｖ配列は、ＶＬ鎖とＶＨ鎖の間の（Ｇ４Ｓ）３リンカー、Ｎ末端キャンパスシグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）と、Ｃ末端６－Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、ＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖ）またはＣ末端７－Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ、ＶＨ－ＶＬ ｓｃＦｖ）のいずれかを含んでなった。
Figure 2023520658000002
ソフトウエア Ｌｅｔｏ １．０．２６（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨ）を使用してコドン最適化ＤＮＡ配列を生成した。次に、これらを、制限エンドヌクレアーゼ部位ＨｉｎｄＩＩＩの後にＫｏｚａｋ配列を含む５’アダプターと、タンデム終止コドンおよび制限エンドヌクレアーゼ部位ＥｃｏＲＩを含む３’アダプターを含むように改変した。ＤＮＡ配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）Ｉｎｃ．によって二本鎖フラグメント（ｇＢｌｏｃｋ）として合成された。
多重クローニング部位が改変されたｐＴＴ５主鎖およびｇＢｌｏｃｋｓをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、切断されたベクター主鎖と切断されたｇＢｌｏｃｋインサートを連結した。連結混合物をＮＥＢ ５－αコンピテント大腸菌に形質転換させ（サブクローニング効率）、１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１％ｗ／ｖグルコースを添加したＬＢ寒天プレート上で陽性形質転換体を選択した。推定クローンのコロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡをサンガーシーケンシングに供して、正確なクローンを同定した。
マウスｍＡｂ ５Ｅ５に由来するヒト化ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生成
マウスｍＡｂ ５Ｅ５のＶＬおよびＶＨドメイン内の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するアミノ酸配列を同定した（表２）。これらから、Ｋａｂａｔ定義によるＣＤＲ(Kabat et al., 1991)をマスキングしたＶＨおよびＶＬ配列（不特定のアミノ酸を示す一文字アミノ酸記号Ｘに置き換えられている（表３－マスキングした残基に下線を施している）を生成した。これらの４つの配列をＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム(Altschul et al., 1997)の入力データとして使用して、ヒトＶ遺伝子（重鎖、κ、λ）生殖細胞系データベースから類似のフレームワークを同定した。加えて、５Ｅ５ ＶＨおよびＶＬからのフレームワークの４アミノ酸配列を使用して、類似のヒトＪ遺伝子セグメントを同定した。
Figure 2023520658000003
ヒトＶおよびＪ遺伝子セグメントは、５Ｅ５配列との同一性、Ｖ遺伝子の個々の頻度および対合頻度の社内分析および従来のヒト化のための特定の鋳型の使用に関する以前の経験に基づいて、鋳型フレームワークとして選択した。
選択したヒトＶ遺伝子フレームワークをそれぞれのマウスＶＨおよびＶＬ配列と比較して、その位置で対応するマウスアミノ酸への復帰突然変異を受ける可能性のある潜在的な部位を同定した（Ｋａｂａｔナンバリング）。ＣＤＲ立体配座（および抗原結合親和性）の維持の見込みにおける特定のフレームワーク位置の重要性に関する所内で照合された証拠則を使用して、最も重要であると考えられる復帰突然変異（一次突然変異）と重要性がより低いもの（二次突然変異）を同定した。同定した復帰突然変異の空間的クラスタリングの程度は、ソフトウエアＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＣＣＧ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）２０１６．０８０２を使用してマウス５Ｅ５ Ｆｖドメインの３Ｄ相同性モデルを構築することによって調べた。最初のヒト化ＶＨおよびＶＬ配列（鎖Ｈ０およびＬ０）は、選択したヒト生殖細胞系鋳型内にマウスＣＤＲのストレートグラフトを構築することによって生成した。復帰突然変異部位の明らかな空間的クラスタリングを使用して、空間的にクラスタリングした突然変異を同時に導入することによってヒト化鎖を含む復帰突然変異の変異体の潜在的な数を減らした。
全体で、６つのヒト化ＶＨアミノ酸配列（Ｈ０－Ｈ５）と４つのヒト化ＶＬアミノ酸配列（Ｌ０－Ｌ３）を生成した。
ヒト化ｓｃＦｖ発現構築物の設計および分子クローニング
ヒト化ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列をＶＬ－ＶＨ配向で体系的に組み合わせて、２４のｓｃＦｖ分子のアミノ酸配列を生成した。さらに、ＶＨ－ＶＬ配向でＬ３鎖およびＨ３鎖からなる単一のｓｃＦｖも構築した。ｓｃＦｖ配列は、ＶＬ鎖とＶＨ鎖の間の（Ｇ４Ｓ）４リンカー、Ｎ末端キャンパスシグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）と、Ｃ末端６－Ｈｉｓタグ（ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ、ＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖｓ）またはＣ末端７－Ｈｉｓタグ（ＡＡＡＨＨＨＨＨＨＨ、Ｈ３－Ｌ３ ｓｃＦｖ）のいずれかを含んでなった。ｓｃＦｖタンパク質配列を逆翻訳し、ソフトウエア Ｌｅｔｏ １．０．２６（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨ）を使用してコドンを最適化した。
さらに、特許出願ＷＯ２０１５／１５９０７６に含まれる情報を使用して、２つの対照α－ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖ分子を設計した。ヒト化抗体Ａｂ１およびＡｂ２のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列（５Ｅ５に匹敵するＴｎＭＵＣ１に対する結合を有することが示されている）を、上記と同じ処理に供して、Ａｂ１およびＡｂ２に由来する２つのｓｃＦｖ分子のコドン最適化ＤＮＡ配列を生成した。
総てのコドン最適化ＤＮＡ配列を、５’アダプターおよび３’アダプターを含むように改変し、上記のように合成した。
発現構築物の分子クローニングは、連結工程中に、標準的な方法に従って連結反応ごとに１つのインサートを使用するか、または単一連結反応に最大６つのインサートが含まれる多重アプローチを使用したことを除いて、上記のように完了した。個々のインサートとベクターのモル比は約３：１を維持した。
免疫原性リスク予測
ヒト化ｓｃＦｖ分子およびＶＬ－ＶＨマウスｓｃＦｖ（キャンパスシグナルペプチドおよびＣ末端Ｈｉｓタグを除去したもの）のアミノ酸配列を免疫原性リスク予測に使用した。ＷＯ２０１５／１５９０７６から得られる２つのヒト化対照ｓｃＦｖｓは、この処理から除外した。Ｔ細胞エピトープは、複数のＭＨＣクラスＩＩアロタイプマトリックス（Ｓｉｎｇｈ、２００１）を使用し、３パーセンタイル閾値で、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（Ａｎｔｏｎｅｔｓ、２０１０）を使用してｓｃＦｖ配列全体で予測した。予測された９量体ペプチドエピトープ配列は、社内パールスクリプトを使用してヒト抗体生殖細胞系配列およびｔレジトープ配列のデータベース（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ、２００８）に対してスキャンし、これらの配列に一致するいかなるペプチドも除去した。免疫原性リスクスコアは、残りのＴ細胞エピトープの数を合計することによって得た。スコアは、臨床現場で既知の免疫原性応答を有する抗体の試験セットの同様のスコアに対してランク付けした。
結果
５Ｅ５ ＶＨおよびＶＬのヒト化
６つのヒト化ＶＨ鎖（Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４およびＨ５と表記）は、ＩＧＨＪ６（ヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖ＩＧＨＪ６ Ｊ遺伝子）に結合したＩＧＨＶ１－６９（ヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖ＩＧＨＶ１－６９ Ｖ遺伝子）からなるフレームワークに基づいて生成した（表４）。４つのヒト化ＶＬ鎖（Ｌ０、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３と表記）は、ＩＧＫＪ２（ヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖ＩＧＫＪ２ Ｊ遺伝子）に結合したＩＧＫＶ４－１（ヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖ＩＧＫＶ４－１（Ｂ３）Ｖ遺伝子）からなるフレームワークに基づいて生成した（表５）。
Figure 2023520658000004
Figure 2023520658000005
１０のヒト化鎖総ては、それぞれの５Ｅ５ ＶＨ鎖およびＶＬ鎖に見られる完全マウスＣＤＲを保持した。Ｌ０およびＨ０には、復帰突然変異は含まれず、他の総ての鎖には、同定された復帰突然変異クラスターの異なる組合せが含まれた（表６）。
Figure 2023520658000006
発現構築物
両方のマウスｓｃＦｖ構築物（ＶＬ－ＶＨおよびＶＨ－ＶＬ）をクローニングし、配列を検証した。２５の社内ヒト化ｓｃＦｖ発現構築物のうち、２４をクローニングし、配列を検証した。Ｌ０－Ｈ０ ｓｃＦｖをコードする構築物はクローニングしなかった。両方の特許出願から得られるヒト化対照ｓｃＦｖ構築物をクローニングし、配列を検証した。
ＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞における社内ヒト化ｓｃＦｖおよび対照ｓｃＦｖの異種発現、ならびに細胞培養物上清に存在する分泌ｓｃＦｖの、ＭＵＣ１ペプチドおよびＴｎＭＵＣ１ペプチドに対する結合の特性評価を下に記載する。この研究から、社内ヒト化分子のうち６つを対照分子の１つとともにさらなる研究のために選択した。選択した社内ヒト化ｓｃＦｖのアミノ酸配列を表７に詳述する。
Figure 2023520658000007
実施例２－ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖ分子（ＣＡＲ結合剤部分）の発現および標的結合についてのスクリーニング
この研究の目的は、２０ｍｌ ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ懸濁培養物の一過性トランスフェクションを介して２６の抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖコード構築物を発現させることおよび上清に存在する分泌ｓｃＦｖの発現および標的結合を特性評価することであった。２４の構築物は社内ヒト化ｓｃＦｖ構築物をコードした。さらに、２つの対照構築物（１０Ｄ１および１０Ｄ２）も調べた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＯｃｔｅｔアッセイを使用して、上清に存在するｓｃＦｖタンパク質の相対発現レベルを評価した。さらに、上清中のｓｃＦｖのビオチン化非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドおよびグリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチドに対する結合を評価した。
方法
ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ懸濁培養
ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞の懸濁培養物は、トランスフェクション前に培養下においたものであった。１０％プルロニックおよび１％ジェネティシンを添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で２５０ｍｌ保存培養物を調製した。培養物は、生存細胞密度５．００×１０５細胞／ｍｌまで週３回分割した。
Ｏｃｔｅｔアッセイ
ペプチド全体のセリンおよびトレオニンアミノ酸にＴｎ糖残基を含むビオチン化２０アミノ酸ペプチド（Ｔａｒｐ、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００７に記載のとおり）を設計し、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＲＢ）で注文し、「ＴｎＭＵＣ１ペプチド」（ビオチン－ＰＥＧ２－ＧＶ－Ｔ（ＡｃＮＨ－ａ－Ｇａｌ）－Ｓ（ＡｃＮＨ－ａ－Ｇａｌ）－ＡＰＤ－Ｔ（ＡｃＮＨ－ａ－Ｇａｌ）－ＲＰＡＰＧＳ（ＡｃＮＨ－ａ－Ｇａｌ）－Ｔ（ＡｃＮＨ－ａ－Ｇａｌ）－ＡＰＰＡＨ－アミド（配列番号７６））と名付けた。対照として、同じ配列を有するがセリンおよびトレオニンアミノ酸にＴｎ残基がない非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドも注文し、「ＭＵＣ１ペプチド」（ビオチン－［ＰＥＧ２］－ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ－アミド（配列番号７７））と名付けた。ＭＵＣ１ペプチドおよびＴｎＭＵＣ１ペプチドは、７５％ＤＭＳＯ／２５％ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌに再懸濁させた。次に、これらのペプチドを等分し、－８０℃で保存した。Ｏｃｔｅｔアッセイで試験した上清を表８に詳述する（６Ｄ１０および６Ｄ１１を除く）。
Figure 2023520658000008
ｓｃＦｖコード構築物のＨＥＫ ２９３ ６Ｅ懸濁培養物への一過性トランスフェクション
一過性トランスフェクションを４つの独立したバッチで行った。各プラスミド構築物の２０μｇのＤＮＡを、２９３ Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、生存細胞密度１．８５×１０６細胞／ｍｌでＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞の独立した２０ｍｌ培養物にトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞を含む培養物を陰性対照としてトランスフェクションの１つのバッチで調製した；この培養物には、２９３ Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を加えたが、プラスミドは加えなかった。これらの培養物を、５％ＣＯ２、１２４ｒｐｍで３７℃の振盪インキュベーターに入れた。
トランスフェクションの７２時間後に、各培養物の生存率（％）および生存細胞密度（細胞／ｍｌ）をＶｉ－Ｃｅｌｌ細胞カウンターおよび生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。培養物が≦７０％生存率に達したため、培養物を４℃、２８４４×ｇで２０分間の遠心分離により回収し、０．２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターにより濾過した。濾過した上清は、後の分析に必要になるまで４℃で保存した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥによる上清の分析
各上清の２０μｌを７μｌの４×還元ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、サンプルを９８℃で５分間加熱した。ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ １２ウェルゲルにウェル当たり１５μｌのサンプルをロードし、ゲルを１×ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー中、２００Ｖでおよそ４０分間泳動した。参照として総てのゲルにＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２タンパク質マーカーをロードした。分離されたタンパク質バンドをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色剤で染色し、ゲルを画像化した。
Ｏｃｔｅｔアッセイによる上清の分析
ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の発現レベルの定量
Ｏｃｔｅｔ Ｎｉ－ＮＴＡセンサーは、使用前に１×ＰＢＳＦバッファーに１０分間浸漬した。２×１６ウェルヘッドを使用し、Ｎｉ－ＮＴＡセンサーに対する結合の量を単一時点で捕捉した。上清原液をＮｉ－ＮＴＡセンサーにロードし、総ての構築物について一レポートポイントでデータを取得して、上清内の６Ｈｉｓタグ付きｓｃＦｖタンパク質の発現レベルを相互に比較した。
１３０μｌの非トランスフェクト培地およびヒト化抗Ｔｎ ＭＵＣ１ ６ｘＨｉｓ－ｓｃＦｖ上清のそれぞれをアッセイプレートに加え、ブランクのウェルには１３０μｌのバッファーを加えた。
このアッセイは、ヒト化抗Ｔｎ ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ構築物の上清の相対定量を可能にした。これは、ＯｃｔｅｔアッセイでのＮｉ－ＮＴＡセンサーに対する結合により異なる構築物の発現が相互にのみ測定可能になったためである。
Ｏｃｔｅｔ結合実験－ビオチン化ＭＵＣ１ペプチドに対するヒト化抗Ｔｎ ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ
ビオチン化ＭＵＣ１ペプチド（７－３６－４）およびＴｎＭＵＣ１ペプチド（７－３６－２）をＯｃｔｅｔランニングバッファー（１×ＰＢＳＦ）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、Ｏｃｔｅｔ ＳＡ（ストレプトアビジン）センサーにロードした。陽性対照タンパク質は、５００ｎＭの単一濃度でＯｃｔｅｔアッセイにおいて試験した。総てのヒト化抗Ｔｎ ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ発現上清はそのままアッセイした。
データは、データ収集ソフトウエア ｆｏｒｔｅＢＩＯバージョン８．０．２．５およびデータ分析ソフトウエア ｆｏｒｔｅＢＩＯバージョン８．０．２．３を使用して分析した。
結果および考察
ｓｃＦｖコード構築物のＨＥＫ ２９３ ６Ｅ懸濁培養物への一過性トランスフェクション
ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖをコードする構築物をＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞へ一過性にトランスフェクトして、分泌ｓｃＦｖを含む培養上清を生成した。社内ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより様々なレベルの発現を示した。Ｏｃｔｅｔアッセイによるさらなる発現分析により、総ての分子が非トランスフェクトサンプルおよびブランクサンプルで見られるレベルを超える顕著な発現を有することが明らかになった。各培養物の生存率（％）および生存細胞密度（細胞／ｍＬ）をトランスフェクション時点（０時間）およびトランスフェクションの７２時間後に記録した（表９）。
Figure 2023520658000009
Figure 2023520658000010
Figure 2023520658000011
上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる細胞培養上清におけるｓｃＦｖ発現レベルの評価および後のゲルの目視検査は、レベルが分子間で有意に異なることを示した（データ記載せず）。
非トランスフェクト細胞から生成された対照上清は、ｓｃＦｖ発現を示さなかった。軽鎖Ｌ０（復帰突然変異を含まない；６Ｄ２～６Ｄ６）を含む総ての社内ヒト化ｓｃＦｖ分子は堅牢に発現し、対応する上清に主要なタンパク質産物を含んでなった。重鎖Ｈ０（復帰突然変異を含まない；構築物６Ｄ７、６Ｄ１３および６Ｄ１９）または軽鎖Ｌ３（構築物６Ｄ１９～６Ｄ２４）の存在は、（目視検査で推定し得る限り）発現の低下と相関しているように見えた。同様に、ＶＨ－ＶＬ配向の単一分子（Ｈ３－Ｌ３、構築物６Ｄ２５）も見かけの発現が低下しているように見えた。両方の対照ｓｃＦｖ分子（構築物１０Ｄ１および１０Ｄ２でコードされる）は、堅牢な発現レベルを示した。
Ｏｃｔｅｔアッセイ ビオチン化ＭＵＣ１ペプチドに対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖの結合を含む分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの目視検査によって評価された定性的発現レベルおよびＯｃｔｅｔアッセイによって決定された相対的な定量的発現レベルは、十分に相関しているように見えた。
総ての陽性対照は、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）と特異的に結合したが、非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチド（３６－４）に対する結合は観察されなかった（図２）。試験した対照タンパク質または上清のいずれについてもＭＵＣ１ペプチド（３６－４）に対する結合は観察されなかった。Ｔｎ－ＭＵＣ１ペプチド（３６－２）結合に対する選択性は、ヒト化抗Ｔｎ－ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ構築物（６Ｄ４、６Ｄ６、６Ｄ１２、６Ｄ１６、６Ｄ１８および６Ｄ２４）、ならびに対照構築物１０Ｄ１の選択について見られた（図３Ａ～３Ｃ）。
Ｏｃｔｅｔ結合アッセイによりＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）に対する結合を示した社内ヒト化ｓｃＦｖのうち、構築物６Ｄ２４のトランスフェクションから生じた上清を除いて、総てが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより感知できるクーマシー染色バンドを示した。
両方の対照（１０Ｄ１および１０Ｄ２）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析およびＯｃｔｅｔアッセイにより堅牢な発現を示した。驚くべきことに、１０Ｄ１から発現されたｓｃＦｖのみがＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）に対する結合を示した。これらの構築物でコードされる２つのＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖは、マウスｍＡｂ ５Ｅ５に匹敵するＴｎＭＵＣ１に対する結合を有することが示されている２つのヒト化全抗体（Ａｂ１およびＡｂ２）に由来する。１０Ｄ２でコードされるｓｃＦｖ（Ａｂ２に由来するｓｃＦｖ）の結合の欠如は、ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインの再初期化によって無傷抗体に見られる結合特性がなくなったことにより説明される。
ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）に対する発現されたヒト化ｓｃＦｖの特異的結合を調べるＯｃｔｅｔアッセイの結果に基づいて、６つの社内ヒト化ｓｃＦｖ（構築物６Ｄ４、６Ｄ６、６Ｄ１２、６Ｄ１６、６Ｄ１８および６Ｄ２４でコードされる）、ならびにヒト化対照ｓｃＦｖ（１０Ｄ１でコードされる）を大規模発現および精製のために選択した。
実施例３－タンパク質精製の特性評価
選択したヒト化ｓｃＦｖを哺乳類細胞（ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞）で発現させ、得られた上清からアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
実験準備
この研究で使用されるｓｃＦｖ構築物を表１０および１１に記載する。この研究で使用されるｓｃＦｖ構築物には、アフィニティークロマトグラフィーによる細胞上清からの精製を可能にするために、Ｃ末端６Ｘ－Ｈｉｓタグを含めた。これらの構築物は、これまでに発現および試験を行った２６の構築物からトリアージされた（上記の実施例２を参照）。ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞の懸濁培養物は、トランスフェクション前に培養下においたものであった。０．１％プルロニックおよび５００μｇ／ｍｌジェネティシンを添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で２５０ｍｌ保存培養物を調製した。培養物は、生存細胞密度５．００×１０５細胞／ｍｌまで週３回分割した。
Figure 2023520658000012
Figure 2023520658000013
Figure 2023520658000014
実験プロトコール
ｓｃＦｖコード構築物のＨＥＫ ２９３ ６Ｅ 懸濁培養物への一過性トランスフェクション
各プラスミド構築物の２５０μｇのＤＮＡを、２９３ Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、生存細胞密度１．８５×１０６細胞／ｍｌでＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞の独立した２５０ｍｌ培養物にトランスフェクトした。これらの培養物を、５％ＣＯ２、１２４ｒｐｍで３７℃の振盪インキュベーターに入れた。４８時間および７２時間時点で、培養物に６．２ｍｌのトリプトン（２００ｇ／ｌ）および６．２ｍｌの３Ｍフルクトースをそれぞれ添加した。
トランスフェクションの４８時間後に、各培養物の生存率（％）および生存細胞密度（細胞／ｍｌ）をＶｉ－Ｃｅｌｌ細胞カウンターおよび生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して２４時間ごとに測定した。培養物が≦７０％生存率に達したら、培養物を４℃、４４１５×ｇで３０分間の遠心分離により回収し、０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターにより濾過した。濾過した上清は、タンパク質精製に必要になるまで４℃で保存した。
ｓｃＦｖ構築物の一段階アフィニティータンパク質精製および後のタンパク質特性評価
一段階アフィニティータンパク質精製
得られた上清からＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＫＴＡ）によってｓｃＦｖタンパク質を精製した。バッファーＡ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で予め平衡化した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラムに上清を５ｍｌ／分でロードした。ロードしたら、カラムを２カラム容量のバッファーＡで５ｍｌ／分で洗浄し、ベースラインに戻した。５０％バッファーＢ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍイミダゾール）の段階溶出でタンパク質を溶出した。カラムは、３カラム容量の５０％バッファーＢ中に保持した。この段階溶出中、８８Ａの精製において０．５ｍｌ画分を集め、次に、後の総ての精製において１ｍｌ画分を集めた。溶出工程はベースラインに戻るまで続けた後、３カラム容量の１００％バッファーＢで洗い流し工程を行った。
得られたクロマトグラムでは、２８０ｎＭにおいて、目的のタンパク質の溶出を示す単一のピークが観察された。このピークに対応する画分をプールし、５０００ＭＷカットオフ遠心濃縮器に移した。サンプルをバッファーＢから６０ｍｌ ＰＢＳにバッファー交換して、バッファーＢ中に存在するイミダゾールから精製タンパク質を分離した。サンプルを≦１ｍｌまで濃縮した。濃度をｎａｎｏｄｒｏｐによって決定し、精製タンパク質をＰＢＳで希釈して、終濃度１ｍｇ／ｍｌを得た。最終タンパク質産物を等分し、将来の使用のために－８０℃で保存した。特性評価の完了後、精製したタンパク質にＳｃＦｖタンパク質ＩＤ番号を割り当てた（表１１）。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
画分から３０μｌサンプルを採取して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって可視化した後、それらをプールした。１０μｌの４×還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、サンプルを９５℃で１０分間加熱した。各サンプル２０μｌをＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、泳動した（１×ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー中、２００Ｖで４０分間）。ゲルを振盪プラットフォーム上でＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅで一晩染色し、水で脱染し、Ｓｙｎｇｅｎｅ ｇＢｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）によって画像化した。
タンパク質のサイズと純度を視覚的に確認するために、最終精製タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）
分析用ＳＥＣは、２つの異なる機器を使用して行った。精製タンパク質（９７Ａ、１９Ａ、および７７Ａの最初の精製）の均一性を、ＳＩＬ－２０ＡＣオートサンプラーとＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ７５ １０／３００カラム（島津製作所製）に接続されたＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を備えた島津製作所製ＬＣ－２０ＡＢ液体クロマトグラフィーシステムを使用して評価した。１ｍｇ／ｍｌの濃度の各タンパク質サンプルについて５０μｌの注入量を、ｍｑＰＢＳランニングバッファー中０．５ｍｌ／分で実施した。ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウエアにより、検出されたピークの面積のパーセンテージを計算した。これらの値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで使用して、それらの均一性を計算した。
精製タンパク質（８８Ａ、８２Ａ、８９Ａ、９４Ａ、および７７Ａの２回目の精製）の均一性を、ＴＳＫｇｅｌ ＱＣ－ＰＡＫ ３００カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩを使用して評価した。１ｍｇ／ｍｌの濃度の各タンパク質サンプルについて５０μｌの注入量を、ｍｑＰＢＳランニングバッファー中０．５ｍｌ／分で実施した。Ｌａｂ Ａｄｖｉｓｏｒソフトウエアで使用して、検出されたピークの面積のパーセンテージと均一性を計算した。
質量分析
各タンパク質の無傷質量を、オープンアクセス質量分析計（ＱＴＯＦ－Ｕｌｔｉｍａ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して測定した。１ｍｇ／ｍｌの濃度の各タンパク質サンプルについて０．５μｌの注入量を機器にロードした。得られたクロマトグラムを、設備の指示に従ってＭａｓｓｌｙｎｘソフトウエアによって分析した。
ペプチドマスフィンガープリンティング
７７Ａの無傷質量は、質量分析により検証しなかった。ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を行って、タンパク質同一性を確認した（表１１）。
タンパク質サンプルを還元ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプルバッファーで調製し、１０μｇのタンパク質をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした（１×ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー中、２００Ｖで４０分間）。ゲルを振盪プラットフォーム上でＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅで一晩染色し、水で脱染し、画像化した。ゲルは、ＰＭＦのためにオープンアクセス設備に送った。
結果および考察
ｓｃＦｖ構築物のＨＥＫ ２９３ ６Ｅ懸濁培養物への一過性トランスフェクション
各トランスフェクト培養物についての生存率（％）および生存細胞の細胞密度／ｍｌを記録した（表１２）。これらの実験の結果、７つのヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖコード構築物は、対数期で増殖するＨＥＫ ２９３ ６Ｅ懸濁細胞の２５０ｍｌ培養物へのトランスフェクションに成功した。得られた上清からｓｃＦｖタンパク質を精製し、特性評価した。
Figure 2023520658000015
ｓｃＦｖ構築物の一段階アフィニティータンパク質精製および後のタンパク質特性評価
６つのヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖ分子と１つの対照は、哺乳類発現を介してＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞での発現に成功した。これらのタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって、得られた上清（２５０ｍＬの上清）からの精製に成功した。バッチ中の精製サンプルの５μｇアリコートを、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって還元条件下で実施し、精製タンパク質の純度および正確な分子量を示した（図４）。これらの属性は、ａＳＥＣおよび質量分析による解析によって裏付けられた（データ記載せず）。精製したｓｃＦｖタンパク質は、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で使用し、その結果を用いて、ＣＡＲへの再フォーマット化のためのｓｃＦｖコード領域を選択した。
実施例４－ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質のＢｉａｃｏｒｅ分析
精製したヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質のＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびｓＴｎＭＵＣ１ペプチドに対する結合を、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて試験した。ｓｃＦｖが結合するＴｎＭＵＣ１ペプチド内のエピトープも決定した。
方法
実験準備
ｓｃＦｖタンパク質の生成、ペプチドの調製
ヒト化ｓｃＦｖタンパク質を、上記の実施例３で詳述したように生成した（試験したヒト化ｓｃＦｖ分子についての詳細については表１３を参照）。
Figure 2023520658000016
ペプチド全体のセリンおよびトレオニンアミノ酸にＴｎ糖残基を含むビオチン化２０アミノ酸ペプチド（Ｔａｒｐ、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００７に記載のとおり）を設計し、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＲＢ）で注文した。対照として、同じ配列を有するがセリンおよびトレオニンアミノ酸にＴｎ残基またはＳＴｎ残基がない非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドも注文した。ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質がＴｎペプチドに結合するエピトープを決定するために、
さらに２つの差次的グリコシル化ペプチドを注文した。１つは、ペプチドのＳｅｒ／Ｔｈｒアミノ酸にＴｎ糖残基を含み、ｓｃＦｖタンパク質が結合する場所であると文献で報告されている。また、１つは、セリンおよびトレオニンアミノ酸にＴｎ糖残基を含むが、報告によると、ここではｓｃＦｖタンパク質は結合しない（Ｔａｒｐ、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００７に記載のとおり）。
これらのペプチドの配列およびＩＤ番号を表１４に詳述し、図５に概略的に表す。
Figure 2023520658000017
捕捉レベルの決定－ＣＡＰｔｕｒｅチップの表面の調製
これらの実験で使用されるアッセイ形式において、ビオチン化ペプチドをＣＡＰチップ（リガンド）上に捕捉して活性表面を生成し、そのチップ表面（アナライト）上をｓｃＦｖタンパク質に通過させた。動力学的測定のための活性表面は、低い最大アナライト結合能（Ｒｍａｘ）を保証するように設計される。これにより、アナライトの輸送制限が軽減されることにより高速結合速度および解離速度の測定が容易になる。Ｒｍａｘに好適な値は、最高性能のＢｉａｃｏｒｅシステムでタンパク質間相互作用について２０～１００ＲＵ（応答単位）の範囲である。
表面の理論上のアナライト結合能（ＲＵ）は、次式で与えられる：
標的捕捉レベル＝Ｒｍａｘ×Ｍｗｔリガンド／化学量論×Ｍｗｔアナライト
これらの実験の場合：
・リガンドＭＷ（ペプチド）＝２５００Ｄａ
・アナライトＭＷ（抗Ｔｎ ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ）＝２７０００Ｄａ＊
・化学量論：１
・Ｒｍａｘ＝１００（再結合イベントを防ぐため）
標的捕捉レベル＝Ｒｍａｘ×Ｍｗｔリガンド／化学量論×Ｍｗｔアナライト
＝１００×２５００／１×２７０００
＝１１ＲＵ
＊この分子量は、ｓｃＦｖ分子の平均分子量として、試験した総てのｓｃＦｖタンパク質に使用した。
上記の計算により、各ペプチドの理論上の１１ＲＵを各サイクルで捕捉する必要がある。
実験プロトコール
ＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＳＴｎＭＵＣ１ペプチドの捕捉レベルの決定
ＣＡＰチップ（Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅキットから）をＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器にドッキングして、製造業者の指示に従って一晩水和させた。チップをドッキングするとき（初回または保存後）、センサーチップの表面は、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅキットから）を１分で３回注入することにより調整する必要がある。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、３部のＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｔｏｃｋ１（８Ｍグアニジン－ＨＣｌ）と１部のＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｔｏｃｋ２（１Ｍ ＮａＯＨ）とを混合することにより調製した。センサーチップの参照フローセルおよびアクティブフローセルの両方を、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを流速１０μｌ／分にて６０秒で３回注入することにより調整した。
ＣＡＰｔｕｒｅチップ上への最初の捕捉のために、総てのビオチン化ペプチドを、ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファー（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋＝１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ポリソルベート２０）で希釈して、上記の式で詳述されているように、必要な結合レベルを確認した。捕捉レベルの決定実験は、アクティブフローセルのみで実施した。このアッセイ形式での参照フローセルはＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ試薬を含み、ビオチン化ペプチドはアクティブフローセルおよび参照フローセルの両方に結合することから、参照フローセルに対する非特異的結合を確認することはできなかった。
Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅキットから）を、流速２μｌ／分で、３００秒の接触時間の後、６０秒の安定化期間でアクティブフローセル上に捕捉した。
流速１０μｌ／分、会合時間１２０秒の後、解離段階６０秒（ここで、ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファーを流速１０μｌ／分で注入した）で、リガンド（ビオチン化ペプチド）にアクティブフローセル上を通過させた。
Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅチップは、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して再生した。このＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、前述のように調製した。
捕捉実験からの各ペプチドの捕捉について得られたＹ値を使用して、１１ＲＵに近い捕捉レベルを得るために必要な捕捉の長さを計算した。最初に、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）およびＭＵＣ１ペプチド（３６－４）を希釈し、ＣＡＰチップ上のＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ試薬に捕捉した。この実験で得られたＹ値を使用して、上記で詳述したように、必要な理論値に近い捕捉レベルを提供するために結合分析アッセイでペプチドを捕捉する必要がある時間を決定した。実際に捕捉される量は、（総てのタンパク質が活性化されているわけではないため）理論値よりも低くなる可能性があるため、１１ＲＵに近い捕捉レベルが得られるようにするために、これらの実験では、これらの実験ではより高い捕捉レベルを目指した。
結合アッセイ
Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ試薬を２μｌ／分で３００秒間、アクティブフローセルおよび参照フローセル上に捕捉した。ビオチン化ペプチドをＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファー（上記の通り）で希釈し、流速１０μｌ／分でアクティブフローセル上にのみ捕捉して、上記に詳述した式で計算した捕捉レベルを得た。
ＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＭＵＣ１ペプチドに対する結合について５００、１２５、３１．２５、７．８、１．９、０ｎＭでヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質に、３００秒の会合後、ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファーによる流速３０μｌ／分での９００秒の解離で、参照フローセルおよびアクティブフローセル上を通過させた。
ＳＴｎＭＵＣ１ペプチドに対する結合では、ＳＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＭＵＣ１ペプチドに対する結合について１０００、２５０、６２．５、１５．６、３．９、０．９８、０ｎＭでヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の総てに、５２０秒の会合後、１×ＨＢＳ－ＥＰ＋による流速３０μｌ／分での９００秒の解離で、参照フローセルおよびアクティブフローセル上を通過させた。ＴｎＭＵＣ１ペプチドと比較して、ＳＴｎＭＵＣ１ペプチドに対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の親和性が低いと予想されるため、これらの実験には、より高い最高濃度のｓｃＦｖｓを使用した。センサーグラムのより良い曲率を得るために、これらの実験の会合時間も３００秒から５２０秒に延ばした。９００秒の解離時間はこれらの実験には十分であった。
どちらの場合も、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅチップは、上記のように再生した。
総てのＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＳＴｎＭＵＣ１ペプチドに対する結合について、各ヒト化ｓｃＦｖタンパク質のＮ＝２のデータを生成した。ＭＵＣ１ペプチドを総ての実験で陰性対照として使用した。
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアｖ３．０を使用して、データを分析した。得られたデータは、Ｒｍａｘパラメーターをローカルに設定した１：１結合モデルに当てはめた。これは捕捉実験であるため、タンパク質は毎回再捕捉され、理論的には、再捕捉ごとに表面がわずかに異なり、毎回わずかに異なる捕捉が生じる可能性があるため、ローカルＲｍａｘパラメーターは真に反映される。総てのヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質について、動力学的パラメーター（ＫＤ、ｋｄおよびｋａ）を計算した。
結果および考察
ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質のＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２／６５－１）およびＭＵＣ１ペプチド（３６－４）に対する結合
７つの精製されたヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の総てを、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）およびＭＵＣ１ペプチド（３６－４）に対する結合について試験した。完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＳＴｎＭＵＣ１ペプチドに対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の特異的結合、ＭＵＣ１ペプチドに対する結合は見られなかった（図７、図９および表１５）。総ての実験について再現可能なｎ＝２のデータが得られ、得られた値は平均値である。表１５は、ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）に対する総てのヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の結合について得られたｋａ値、ｋｄ値およびＫＤ値を示す。ｓｃＦｖタンパク質１６－Ｐ４および１３－Ｐ１６を除くｓｃＦｖの総てについて同等のｋａ値、ｋｄ値およびＫＤ値が得られ、これらは、図７に見られるようなセンサーグラムの形状および表１５に詳述した値から、他のｓｃＦｖタンパク質と比較して、完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２）についてより速いｋｄ（解離速度）を有し、次には、より低いＫＤを有する。
Figure 2023520658000018
ＴｎＭＵＣ１ペプチド内のヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質のエピトープの決定
４つのｓｃＦｖタンパク質（１６－Ｐ４、１１－Ｐ１２、１３－Ｐ１６、１３－Ｐ１８）、ならびにＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したマウス５Ｅ５ ｓｃＦｖタンパク質（２３－Ｐ１）を総て、ＭＵＣ１ペプチド（３６－４）および完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド（６５－１）、ならびに差次的グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド（９６－１および９６－２）に対する結合について試験して、ＴｎＭＵＣ１ペプチド上のヒト化ｓｃＦｖタンパク質の結合エピトープを決定した。これらの実験は、完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド（６５－１）および差次的グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド１（９６－１）に対してヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質が同等に結合することを示し、ＭＵＣ１ペプチド（３６－４）に対してもＴｎＭＵＣ１ペプチド２（９６－２）に対しても結合は観察されなかった。これらの実験で得られたデータにより、試験したペプチド内のヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質のエピトープが確認された。図８に示したセンサーグラムは、２つのペプチド（６５－１および９６－１）に対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の会合および解離が同等であることを示している。動力学的パラメーターの値は図６に示した。マウス５Ｅ５ ｓｃＦｖタンパク質もまた、図１０に見られるように、完全グリコシル化ペプチド（６５－１）および差次的グリコシル化ペプチド（９６－１）に対する結合が同等であることを示した。完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチドの２つのバッチを試験し（６５－１および３６－２）、バッチ間でヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖの同等の結合が見られた。このデータは、図６に要約している。
ＳＴｎＭＵＣ１ペプチドおよびＭＵＣ１ペプチドに対するヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質の結合
上記のように、４つのｓｃＦｖタンパク質ならびにマウス５Ｅ５ ｓｃＦｖタンパク質を総て、ＭＵＣ１ペプチドおよびＳＴｎＭＵＣ１ペプチド（３５－１）に対する結合について試験した。ヒト化ｓｃＦｖタンパク質は、ＳＴｎペプチド（３５－１）と特異的に結合することを示し、ＭＵＣ１ペプチド（３６－４）との結合は見られなかった。しかしながら、それらは、図６および９に見られるように、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓで生成されたマウス５Ｅ５ ｓｃＦｖタンパク質と比較して、ＳＴｎＭＵＣ１ペプチドに対しておよそ１０倍低い親和性を有することが見出された。ＴｎＭＵＣ１結合実験に見られるように、ｓｃＦｖタンパク質１６Ｐ４および１３Ｐ１６は、図６および９に見られるように、ｓｃＦｖタンパク質１１Ｐ１２および１３Ｐ１８と比較して、ＳＴｎペプチド（３５－１）に対してより速いｋｄ（オフレート）、次には、より低いＫＤを有することを示した。
要するに、ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質のＴｎＭＵＣ１ペプチド（３６－２、６５－１、９６－１）およびＳＴｎＭＵＣ１ペプチド（３５－１）との特異的結合が観察され、ＭＵＣ１（３６－４）ペプチドとの結合は観察されなかった。このアッセイは、ヒト化ｓｃＦｖタンパク質について得られた２つの異なる結合プロファイルを強調するものであり、１６Ｐ４および１３Ｐ１６はより速いｋｄ（解離速度）を有し、１１Ｐ１２および１３Ｐ１８は比較的遅いｋｄ（解離速度）を有することが示された。試験した総てのヒト化ｓｃＦｖタンパク質およびマウス５Ｅ５ ｓｃＦｖタンパク質は、これらの実験で、ＴｎＭＵＣ１ペプチド内の同じエピトープに結合することが示された。
この実験では、ＣＡＲ分子のｓｃＦｖフラグメントだけを試験し、最終的なＣＡＲ分子は、このアッセイシステムでは試験できない。これらのペプチドと結合する同等のＣＡＲのさらなる特性評価は、実施例１２に記載するペプチド刺激アッセイで行った。１３Ｐ１６ ｓｃＦｖについての試験した総てのペプチドに対する結合は、図１０に要約している。
実施例５－細胞結合方法
精製ｓｃＦｖタンパク質のＴｎＭＵＣ１陽性および陰性腫瘍細胞株に対する結合を、フローサイトメトリーで決定した。この研究の目的は、フローサイトメトリーで決定されたＴｎＭＵＣ１陽性および陰性腫瘍細胞株の力価調整されたｓｃＦｖタンパク質の相対的な結合有効性に基づいて、ＣＡＲ構築物のヒト化ｓｃＦｖ領域を識別することであった。
実験準備
接着細胞培養
接着ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株およびＰＣ３細胞株は、週２回の分割比１：３で継代培養を行うことによって、培養下で維持した。細胞単層をＤＰＢＳで洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴＥ）とともに数分間インキュベートした。分離したら、細胞を適当な細胞培養培地に再懸濁させ（最終量は使用したＴＥの５倍量に等しい）、新しい細胞培養フラスコに播種した。細胞は、必要になるまで、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターで保存した。
懸濁細胞培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、コンフルエント細胞培養物の１０％を新しい細胞培養フラスコに移した後、適当な量の細胞成長培地を添加する（最終分割比１：１０を得る）ことにより週２回の継代培養を行うことによって、培養下で維持した。細胞は、必要になるまで、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターで保存した。
フローサイトメトリーアッセイのための細胞調製
細胞を分離し、細胞を適当な細胞培養培地に再懸濁させるかまたはＦａｌｃｏｎチューブに移した。次に、各細胞懸濁液のサンプルをＤＰＢＳで１：５希釈し（最終量０．５ｍＬを得た）、各細胞懸濁液について（トリパンブルー排除に基づく）１ｍＬ当たりの生存細胞数を、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率分析装置（デフォルト細胞種設定を使用）を使用して決定した。次に、細胞懸濁液を適当な細胞培養培地で希釈し、新しい細胞培養フラスコに１ｃｍ２当たり６．２５×１０４生存細胞の密度で播種した。細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターで４８時間（または必要になるまで）インキュベートした。アッセイ当日、細胞をフラスコから分離し、適当な細胞培養培地に再懸濁させ（必要に応じて）、前述のように、１ｍＬ当たりの生存細胞数を計数した。細胞懸濁液を５００×ｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーに１ｍＬ当たり４×１０６生存細胞の密度で再懸濁させた。
実験プロトコール
細胞結合アッセイ
ｓｃＦｖタンパク質をＤＰＢＳで６２．５ｎＭに希釈し、９６ウェルＶ底プレートのＡ列に分注した後、そのプレートをＦＡＣＳバッファーで１：４連続希釈を行った、ウェル当たり２５ｍＬ（最終量）を得た（Ｈ列のみＦＡＣＳバッファー）。抗Ｈｉｓｔ－ＰＥ検出抗体をＤＰＢＳで１：５希釈し、ウェル当たり２５ｍＬを、連続希釈したｓｃＦｖタンパク質を含むウェルに分注し、その後、光から保護したプレートを４℃で１時間インキュベートし、ｓｃＦｖタンパク質を抗Ｈｉｓｔ－ＰＥ検出抗体と事前に複合体化した。次に、前述のように調製した細胞懸濁液をプレートに分注した（ウェル当たり５０ｍＬ）後、光から保護したプレートを４℃でさらに１時間インキュベートした。細胞は、ウェル当たり２００ｍＬ（最大量）のＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁させ、５００×ｇで５分間細胞を遠心分離した後、上清を除去し、洗浄工程を２回以上繰り返して細胞を洗浄することによって洗浄した。細胞ペレットは、ウェル当たり２００ｍＬのＦＡＣＳバッファー（１ｍＬ当たり１ｍｇ（最終）のＤＡＰＩおよび２ｍＭ（最終）のＥＤＴＡを含む）に再懸濁させた後、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーターを使用してデータを取得した。
標的発現アッセイ
細胞懸濁液（前述のように調製した）を９６ウェルプレートＶ底プレートに分注し（ウェル当たり２５ｍＬ）、ＦＡＣＳバッファーでウェル当たり２００ｍＬの量にした後、細胞を５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーで１ｍＬ当たり５μｇに希釈した一次抗体（または必要に応じて同濃度のアイソタイプ抗体／ＦＡＣＳバッファーのみ）、ウェル当たり１００ｍＬに再懸濁させた。細胞を４℃で４５分間インキュベートした。次に、前述のように細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーで１：１０００希釈したヤギ抗マウスＰＥ結合二次抗体、１ｍＬ当たり１００ｍＬに再懸濁させ、細胞を４℃でさらに４５分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩおよびＥＤＴＡを添加したＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、前述のようにデータを取得した。
試験したヒト化ｓｃＦｖタンパク質は：９Ｐ１（８８Ａ）、１６Ｐ４（８２Ａ）、１１Ｐ６（８９Ａ）、１１Ｐ１２（９４Ａ）、１３Ｐ１６（９７Ａ）、１３Ｐ１８（１９Ａ）、および１３Ｐ２４（７Ａ）（上記表１３参照）であった。
データ分析
細胞結合アッセイデータ
生データを、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。ウェルサンプルを細胞株によって分類し、各細胞株について細胞のみのウェルサンプルを使用して生存単一陽性細胞を区別するためにゲートを設定し、その後、同じ群のウェルサンプルに対してゲートを適用した。蛍光強度（ＭＦＩ）値の中央値をＰｒｉｓｍにエクスポートし、対数スケール（すなわち、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ））に変換した後、可変傾斜４パラメーター方程式：Ｙ＝下位＋（最高－最低）／（１＋１０＾（（－ｐＥＣ５０－Ｘ）＊ヒル勾配））を使用してデータを当てはめた。Ｊｕｒｋａｔ細胞においてヒト化ｓｃＦｖタンパク質の最高濃度でフック効果の証拠が観察されたＭＦＩ値は、曲線フィッティングの前に除外した。標準誤差値はＰｒｉｓｍにより計算された。このレポートのために生成されたデータは、リード分子の選択に役立つものではないため、このデータに対して統計分析方法は実行されなかった。
標的発現アッセイデータ
生データを、前述のようにＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。各細胞株の一次抗体ウェルからアイソタイプ対照ウェルにおけるＰＥ陽性百分率値を差し引き、Ｐｒｉｓｍを使用してプロットした。
結果および考察
データは、ヒト化ｓｃＦｖタンパク質の総てが、ｓｃＦｖ濃度でＴｎＭＵＣ１発現に依存する様式で、ＴｎＭＵＣ１発現腫瘍細胞（ＴｎＭＵＣ１陽性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞）と選択的に結合することを実証している。図１１の代表的なデータを参照。総てのヒト化ｓｃＦｖタンパク質について１１Ｐ６（８９Ａ）および１１Ｐ１２（９４Ａ）を除いて、ＥＣ５０平均値およびｐＥＣ５０平均値はｎ＝２の実験に基づいて計算し、平均ＥＣ５０濃度は１３Ｐ１８（１９Ａ）の１．６８ｎＭ～２８Ｐ２４（７７Ａ）の８４．３８ｎＭの範囲であり；１１Ｐ６（８９Ａ）および１１Ｐ１２（９４Ａ）のＥＣ５０濃度は、それぞれ４．９６８および３４．２ｎＭであった（ｎ＝１の実験データに基づく）。表１６参照。
１３Ｐ１６（９７Ａ）ヒト化ｓｃＦｖタンパク質は、９Ｐ１（８８Ａ）、１６Ｐ４（８２Ａ）、１１Ｐ６（８９Ａ）および１３Ｐ１８（１９Ａ）と比較して結合効力の低下を示し、ＥＣ５０値はおよそ１１ｎＭであるのに対し、最も強力なヒト化ｓｃＦｖタンパク質のＥＣ５０値は５ｎＭ以下であった。
Figure 2023520658000019
ＴｎＭＵＣ１陰性対照ＰＣ３細胞における９Ｐ１（８８Ａ）、１１Ｐ６（８９Ａ）、１１Ｐ１２（９４Ａ）、１３Ｐ１８（１９Ａ）ヒト化ｓｃＦｖタンパク質の結合について、ＰｒｉｓｍによりＥＣ５０値を生成した（データ記載せず）。図１２の代表的なデータは、最高のｓｃＦｖタンパク質濃度でフック効果のいくつかの証拠も示しているが、付随する負のヒルスロープ値（ヒルスロープ値記載せず）に沿った図１２のデータは、ＰＣ３細胞におけるヒト化ｓｃＦｖタンパク質結合の証拠がないことを示唆している。
図１３の代表的なフィットＭＦＩデータは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と比較して陽性度の高いＴｎＭＵＣ１陽性対照Ｊｕｒｋａｔ細胞における総てのヒト化ｓｃＦｖタンパク質についての結合の増加を示しており（図１１）、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＰＣ３細胞の代表的なＴｎＭＵＣ１膜発現データに対応している（図１５）。
図１４のｎ＝２の実験からのフィット曲線は、ＴｎＭＵＣ陽性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＴｎＭＵＣ陽性度が高いＪｕｒｋａｔ細胞に対する１３Ｐ１６（９７Ａ）の選択的結合を具体的に示しており、この場合も、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＰＣ３細胞の代表的なＴｎＭＵＣ１膜発現データに対応している（図１５）。フック効果の証拠は、Ｊｕｒｋａｔ細胞における二反復実験で１６Ｐ４（８２Ａ）および１３Ｐ１８（１９Ａ）の最高濃度で観察され、また２回の繰り返し実験のうち１回のみで９Ｐ１（８８Ａ）および１１Ｐ６（８９Ａ）でも観察された（ＭＦＩ値は、曲線フィッティングの前に除外した）。
実施例６－前臨床の安全性
これらの研究の目的は、原形質膜タンパク質アレイを使用して、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的外結合を評価することであった。
方法
実験プロトコール
パイロット研究を支援するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
末梢血単球（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１０７７１）およびＡｃｃｕｓｐｉｎチューブ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ７０５４）を製造者の説明書に従って使用して、ヒト血液から単離した。細胞をＴＥＸＭａｃｓ培地に再懸濁させた。ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞活性化ビーズ（１：１００希釈）をＰＢＭＣに加え、細胞を、加湿インキュベーターにて、５％ＣＯ２、３７℃で２日間インキュベートした。ＰＢＭＣをＭＯＩ ２．７５のＢＣＭＡベクター、ＢＣＭＡ－０３０で形質導入し、５％ＣＯ２、３７℃で２日間インキュベートした。培養期間中、細胞は、ＴＥＸＭａｃｓ培地および１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２で維持した。形質導入の１３日後に細胞を回収し、１×１０８細胞／ｍｌで凍結した。陰性対照として非形質導入細胞を生成した。Ｔ細胞のバッチは３名のドナーから生成した。
形質導入効率は、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０）およびＡＰＣチャネルを使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合ＢＣＭＡ－ＦｃでＣＡＲ発現を検出することにより決定した。データはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１を使用して分析した。
プレスクリーニング、一次スクリーニングおよび確認スクリーニングを支援するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＰＢＭＣは、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１０７７１）およびＡｃｃｕｓｐｉｎチューブ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ７０５４）を製造者の説明書に従って使用して、ヒト血液から単離した。細胞をＴＥＸＭａｃｓ培地に再懸濁させた。ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞活性化ビーズ（１：１００希釈）をＰＢＭＣ加え、細胞を、加湿インキュベーターにて、５％ＣＯ２、３７℃で２日間インキュベートした。ＰＢＭＣをＭＯＩ ２．４のＢＣＭＡベクター、ＢＣＭＡ－０３０で、またはＭＯＩ ５のＴｎＭＵＣ１ベクター、ＭＢ－０３７で形質導入し、５％ＣＯ２、３７℃で２日間インキュベートした。培養期間中、細胞は、ＴＥＸＭａｃｓ培地および１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２で維持した。形質導入の１２日後に細胞を回収し、ＣｒｙＳｔｏｒ ＣＳ５凍結培地中１×１０８細胞／ｍｌで凍結した。陰性対照として非形質導入Ｔ細胞を生成した。Ｔ細胞は１ドナーから生成した。
ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０）を使用して、ＢＣＭＡ－ＡＦ６４７に対する結合を測定することにより決定した。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は、ＰＥ結合抗ＬＮＧＦＲ Ａｂおよびフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０）を使用して、ＬＮＧＦＲ発現を測定することにより決定した。データはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１を使用して分析した。
原形質膜タンパク質アレイ
パイロット研究
ドナーＴ細胞を、固定した非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞と、ＢＣＭＡ、既知のＴ細胞相互作用因子、および対照タンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞のスライドに追加した。バックグラウンドに対するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の結合レベルにより、予備審査スクリーニング、一次スクリーニング、および確認スクリーニングに好適なドナーの選択が可能であった、
陽性対照ＴｎＭＵＣ１ペプチドを、純ペプチドから始める連続希釈でスライド上にスポットした。ペプチドをマウス抗ヒトＭＵＣ１ ｍＡｂ、クローン５Ｅ５で検出し、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体での検出を行った。
Figure 2023520658000020
プレスクリーニング研究
非形質導入Ｔ細胞およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、固定した非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞と、ＢＣＭＡ、既知のＴ細胞相互作用因子、および対照タンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞のスライドに追加した。
一次スクリーニング
一次スクリーニングでは、全長ヒト原形質膜タンパク質をコードする４０７０のタンパク質、リバーストランスフェクションを使用して、ヒトＨＥＫ２９３細胞で個別に発現させた。細胞は、１３のマイクロアレイスライド全体に二反復で並べ、固定した。発現ベクター、ｐＩＲＥＳ－ｈＥＧＦＲ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１は、トランスフェクション効率の最小閾値が達成または超過されたことを確認するために、各スライド上に四反復でスポットした。バックグラウンドに対する平均ｐＩＲＥＳ－ｈＥＧＦＲ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１シグナルとして最小閾値１．５が従前に決定された。
非形質導入Ｔ細胞およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をセルトレーサーレッド色素で標識し、事前に最適化した比率のＴ細胞とＨＥＫ２９３細胞で原形質膜タンパク質アレイに使用した。
確認スクリーニング
一次スクリーニングで特定されたヒットをコードするベクターを二反復でスポットし、ヒトＨＥＫ２９３細胞をリバーストランスフェクトするために使用した。細胞を固定し、続いて、陽性および陰性ＭＵＣ１ペプチドでスポットした。二反復用のスライドを用意した。ドナー９０９２８からの非形質導入Ｔ細胞および形質導入Ｔ細胞（スライド当たり３．２×１０７細胞）、または抗ヒトＭＵＣ１ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）を原形質膜タンパク質アレイに適用した。抗ヒトＭＵＣ１結合をａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体で検出した。
データ分析
フローサイトメトリー：データは、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１を使用して分析した。
原形質膜タンパク質アレイ：結合は、蛍光撮像法によって評価し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（ＧＥ）を使用して形質導入効率を定量した。バックグラウンド結合のレベルは、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の領域を使用して決定した。
タンパク質の「ヒット」は、バックグラウンドレベルと比較して上昇したシグナルを示す二反復のスポットとして定義された。これは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアでグリッド化された画像を使用した目視検査によって達成された。ヒットは、二反復のスポットの強度に応じて「強い、中程度、弱い、または非常に弱い」に分類した。
結果および考察
パイロット研究を支援するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＢＣＭＡ－ＡＦ６４７を使用して、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率を決定した。形質導入および拡大培養過程の７日目に、ドナー１２０２１、３０８６５および９０９２８の形質導入効率は、それぞれ８５．５％、８０．３％および６９．６％であった（表１７）。形質導入および拡大培養過程の１４日目に、ドナー１２０２１、３０８６５および９０９２８の形質導入効率は、それぞれ６２．２％、５０．６％および５５．８％であった。
Figure 2023520658000021
一次スクリーニングおよび確認スクリーニングを支援するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
形質導入効率は、形質導入の１２日後に決定した。ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は６３．１％であった（表１８）。形質導入Ｔ細胞に適用したものと同じゲート設定戦略を使用し、非形質導入Ｔ細胞の０．８％が陽性ゲートの範囲内にあった。抗ＬＮＧＦＲ Ａｂを使用すると、ＴｎＭＵＣ１、ＭＢ－０３７、ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は２９．２％であった。形質導入Ｔ細胞に適用した同じゲート設定戦略を使用して、非形質導入Ｔ細胞の１．４％が陽性ゲートの範囲内にあった。
Figure 2023520658000022
原形質膜タンパク質アレイ：パイロット研究
ＨＥＫ形質導入細胞のスポッティングパターンを図１６Ａに示している。非形質導入Ｔ細胞では、既知のＴ細胞相互作用因子（ＰＶＲ、ＣＤ２４４、ＴＮＦＳＦ４、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＤ８６）に対して結合が観察された（図１６Ｂ～Ｄ）。ＢＣＭＡ形質導入Ｔ細胞では、ＢＣＭＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に対して結合が観察された（図１７）。結合の強度は３ドナー間で同等であった。
原形質膜タンパク質アレイ：プレスクリーニング
ドナー９０９２８を一次スクリーニングに選択した。
ＨＥＫ形質導入細胞のスポッティングパターンを図１８Ａ～１８Ｄに示している。非形質導入Ｔ細胞では、既知のＴ細胞相互作用因子（ＰＶＲ、ＣＤ２４４、ＴＮＦＳＦ４、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＤ８６）に対して結合が観察された。ＢＣＭＡ形質導入Ｔ細胞では、ＢＣＭＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に対して結合が観察された。ＴｎＭＵＣ１形質導入Ｔ細胞では、ＴｎＭＵＣ１ペプチドまたはＭＵＣ１ペプチドとの結合は起こらなかった。
原形質膜タンパク質アレイ：一次スクリーニング
ＩｍａｇｅＱｕａｎｔで蛍光を分析することによって、合計２８のヒットが特定された。染色の強度は非常に弱いものから強いものまで様々であった。
原形質膜タンパク質アレイ：確認スクリーニング
２８のヒットのスポッティングパターンを図１９Ａ～１９Ｄに示している。非形質導入Ｔ細胞では、既知のＴ細胞相互作用因子に対して結合が観察された。ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞について、強い強度で１つの特異的相互作用が確認された。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞について、２つのＣＡＲ特異的相互作用が確認された。これらは、ＤＣＣネトリン１受容体（ＤＣＣ）（中強度）およびセレクチンＰリガンド（ＳＥＬＰＬＧ）（非常に弱い／弱い強度）であった。
要約すると、４０７０のヒトタンパク質の完全ライブラリーを過剰発現するヒトＨＥＫ２９３に対する結合についてＣＡＲ－Ｔ細胞をスクリーニングした後、非形質導入Ｔ細胞は、多くの既知のＴ細胞相互作用因子に対して結合を示した。陽性対照として使用したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、強い強度でＢＣＭＡとの単一の特異的相互作用を示した。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、中強度でＤＣＣネトリン１受容体と、非常に弱い／弱い強度でセレクチンＰリガンドとの結合を示した。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＴｎＭＵＣ１またはＭＵＣ１ペプチドとの結合は観察されなかった。ＤＣＣネトリン１受容体との結合は中強度の結合が観察されたためさらに評価を行った（実施例１６参照）。セレクチンＰリガンドとの結合は非常に弱く／弱く、信頼性の低い結合剤と見なされるため、このタンパク質にはこれ以上の評価は行わなかった。
実施例７－Ｔ細胞表現型に対するＣＡＲ発現の影響
この研究の目的は、１２色の表現型パネルを使用して、形質導入の１４日後に基礎状態の（障害のない）７つのヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型の状態を、非形質導入Ｔ（ＵＴ）およびマウス型Ｔ細胞と比較することによって特性評価することであった。試験したヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞にはＨｕＣＡＲ０２０－２６が含まれ、マウスＣＡＲ Ｔ細胞にはＭＢ００４（マウス型陽性ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ）およびＭＢ００７（シグナル伝達ドメイン４－１ＢＢおよびＣＤ３ｚを欠くマウス型陰性ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲＴ）が含まれた。設計した１２色の表現型パネルには、系統（ＣＤ３およびＣＤ８）、活性化／疲弊チェックポイント（ＬＡＧ３、ＴＩＭ３およびＰＤ１）、メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７）およびＣＡＲ形質導入（ｚｓＧｒｅｅｎ）バイオマーカーが含まれる。計算データ分析アルゴリズムを備えた機械学習プラットフォームＣｙｔｏｂａｎｋを使用して、生成された高次元フローデータを分析した。ＦｌｏｗＬｏｇｉｃを使用して並列データ分析を行った。
方法
実験準備
ドナー番号９１８６０、９１４６２および９２０９１の先行実験から精製Ｔ細胞を調製した（形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞は総て構築物でｚｓＧｒｅｅｎ遺伝子発現を示す）。簡単に述べれば、Ｔ細胞（形質導入後１４日）を、ＴｅｘＭＡＣＳ培地と１００ＵのＩＬ－２を含む６ウェル細胞培養プレートで培養した。一晩インキュベートした後、障害のないＴ細胞を回収し、染色の前に比較目的のため、各サンプルをＵＴ Ｔ細胞を使用して３２％の同じ形質導入効率（ＴＥ）に正規化した。試験したＴ細胞には、非形質導入Ｔ（ＵＴ）、ＭＢ００４（マウス型陽性ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ）、ＭＢ００７（シグナル伝達ドメイン４－１ＢＢおよびＣＤ３ｚを欠くマウス型陰性ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲＴ）およびＭＢ０２０－２６（ヒト化型陽性ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ）が含まれた。
実験プロトコール
Ｆｃのブロックおよび細胞表面染色
ストック濃度５ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧをＦｃブロック薬として使用した（１：５０希釈）。Ｔ細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した後、ＢＤ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色バッファーで１：５０希釈した過剰な無関係なヒトＩｇＧアイソタイプ対照４０μＬを加えてＦｃ受容体をブロックし、室温で１５分間インキュベートした。次に、ＢＤ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色バッファーで希釈した総ての抗体－蛍光色素コンジュゲートを含む２倍濃縮抗体カクテル４０μＬで細胞を染色した。細胞を抗体カクテルとともに室温、暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＰＢＳで１：２０００希釈した生死判定色素Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ １００μＬを加えた。細胞を生死判定色素とともに室温、暗所で１５分間インキュベートした後、細胞をＤＢＰＳでさらに２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩ フローサイトメーターで読み取った。
サイトメーターのセットアップと補正
ＣＳ＆Ｔビーズを毎日使用して、サイトメーターの性能を評価し、各時点でのデータ取得を調整するために正確なアプリケーション設定を通知した。ＦＡＣＳＤｉｖａでサンプルデータを取得する前に、各抗体蛍光色素コンジュゲートで染色したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｍｐ ｅＢｅａｄｓを使用して補正を計算した。
データ分析
フローサイトメトリーデータは、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ ７．２．１ソフトウエアおよびＣｙｔｏｂａｎｋ ７．０プラットフォームを使用して分析して、一次メトリクスおよびプロットを作成した。活性化状態は、ＣＤ６９＋４１ＢＢ＋共発現Ｔ細胞と定義した。疲弊状態は、ＬＡＧ３＋ＴＩＭ３＋ＰＤ１＋共発現Ｔ細胞と定義した。メモリーサブセットは、幹細胞メモリー／ナイーブ（Ｔｓｃｍ／ナイーブ：ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ：ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７－）、セントラルメモリー（Ｔｃｍ：ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７－）および最終分化エフェクターメモリー（Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７＋）と定義した。データは、各ドナー内の総ての条件をＭＢ００７（非シグナル伝達ＣＡＲ対照）と比較することにより、ドナー間変動を説明するために正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して、３名のドナーの結果を表すメトリクスをグラフ化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ内で、一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定を使用して統計分析を適用した。
結果および考察
形質導入効率（ＴＥ）およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋比
ｚｓＧｒｅｅｎ陽性細胞のパーセンテージに基づいて、ＵＴ Ｔ細胞を使用してＣＡＲ－Ｔサンプルを正規化して、総てのドナー（ｎ＝３）で全体ＴＥが約３２％となった（図２０Ａ）。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、ドナー間変動があるＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのＴＥ（約２０～３０％）と比較して、より高いＴＥ（約３０～５０％）を有する。これらの形質導入Ｔ細胞の陽性度も、特にＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットでは、ドナーに大きく依存する。一般に、ＣＤ４／ＣＤ８比もドナーに依存し、ＵＴおよびＭＢ００７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、他の総てＣＡＲ－Ｔサンプルと比較して、より多くのＣＤ８＋サブセットを有する（図２０Ｂ）。
Ｔ細胞の活性化および疲弊状態の分析
この研究では、１２色のフローサイトメトリーパネルを使用して、３名のドナーに関する１０の産物、すなわち、７つのヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲＴ構築物（ＭＢ０２０－２６）、マウスＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ（ＭＢ００４）、非特異的ＣＡＲ－Ｔ対照（ＭＢ００７）および非形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）の基礎状態の表現型を評価した。活性化状態は、ＣＤ６９および４１ＢＢを共発現する細胞により定義され、疲弊状態は、ＰＤ１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３を共発現する細胞により定義される。全体的に見れば、基礎状態のレベルでは、ＭＢ００４およびＭＢ０２６を除く総てのサンプルで活性化状態も疲弊状態も低い（図２０Ｃ）。全体的な傾向では、基礎状態のレベルで、ＭＢ００４およびＭＢ０２６ Ｔ細胞が相対的に高い活性化状態（ＣＤ６９＋４１ＢＢ＋）および疲弊状態（ＰＤ－１＋ＬＡＧ－３＋ＴＩＭ－３＋）にあるように見えた。ＭＢ０２３ Ｔ細胞は、他の総てのサンプルと比較して、中程度に高い状態を示し、高い自己活性化／早期バーンアウト傾向を示している可能性がある。
Ｔ細胞のメモリーサブセットの分析
基礎状態のレベルでは、Ｔメモリーサブセットにわずかなドナー間変動がある。これは、蛍光マイナスワン(fluorescence minus ones)（ＦＭＯ）を使用した手動ゲーティングによる従来のフローサイトメトリーゲーティング分析によって明らかにすることができる。パーセンテージに関しては、ドナー９２０９１で、総ての非形質導入サンプルおよび形質導入サンプルにＴｅｍおよびＴｃｍサブセットがほとんどなかったことを除いて、総てのサンプルで非形質導入Ｔ細胞および形質導入Ｔ細胞のメモリーサブセットに大きな違いはない。３ドナー総てが、ヒト化ＣＡＲ ＭＢ００４およびＭＢ０２６ Ｔ細胞でＴｓｃｍサブセット／ナイーブ（およびＴｃｍ）サブセットのパーセンテージがわずかに高いことを示した（図２１）。
ドナー間変動が高いにもかかわらず、ＭＢ００４およびＭＢ０２６は、一般に、他の総てのヒト化ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、相対的に高いレベルの活性化（ＣＤ６９＋４１ＢＢ＋）を示すことが観察された。それらはまた、有意に高いレベルの疲弊（ＰＤ－１＋ＬＡＧ－３＋ＴＩＭ－３＋）を示し、これは、これらのＣＡＲＴ構築物の高い自己活性化／早期疲弊状況を示している可能性がある。
実施例８－ヒト化ＴｎＭＵＣ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性シグナル伝達（抗原非依存性シグナル伝達）
この研究の目的は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでのヒト化ＴｎＭＵＣ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性シグナル伝達（抗原非依存性シグナル伝達）の効果を評価することであった。持続性シグナル伝達を示すＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞機能の障害および疲弊およびｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の低下につながる。持続性シグナル伝達は、ＣＡＲ構造、リンカーまたはヒンジ、シグナル伝達ドメイン、表面発現の位置およびレベルの特徴の組合せによって影響を受ける。この実施例で研究したヒト化ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ヒト化５Ｅ５ ＳｃＦｖ、ＰＧＫプロモーターおよびＬＮＧＦＲ検出モチーフを有するレンチベクター形質導入を使用して生成されたＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３リンカーを含まない４－１ＢＢζ細胞質ドメインから構成される。
方法
実験準備
ＣＡＲ－Ｔ細胞の融解および培養
低温凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した場合、細胞を３７℃に設定した水浴で半融解し、安全キャビネット内、無菌条件下で、１ｍＬの冷ＴＥＸＭＡＣＳ培地を用いて、ペレットが完全に融解するまで再懸濁させた。細胞懸濁液量を１５ｍＬのＦＡＬＣＯＮチューブで冷ＴＥＸＭＡＣＳ培地を使用して総量１０ｍＬに調整し、室温で５分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、保持された細胞ペレットを１０ｍＬのＴＥＸＭＡＣＳ培地に２回再懸濁させた。
融解した細胞または新鮮な細胞の再懸濁液および培養のために、洗浄後に得られた細胞ペレットを室温で２ｍＬ ＴＥＸＭＡＣＳ培地に再懸濁させ、細胞カウンターを使用して細胞密度を得た。細胞を再懸濁させ、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を含むＴＥＸＭＡＣＳ培地で密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。細胞再懸濁物７ｍＬを２４ディープウェルＧ－Ｒｅｘプレートの各ウェルに移し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間、加湿インキュベーター内に置いた後、ＬＮＧＦＲ濃縮を行った。
ＣＡＲ－Ｔ細胞ＬＮＧＦＲの濃縮
ＥＡＳＹＳＥＰ Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７１ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＥＡＳＹＳＥＰ Ｄｅｘｔｒａｎ ＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳを使用して、ＬＮＧＦＲを発現するＣＡＲ－Ｔのウェルを確実に選択した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに回収し、室温で５分間、３００×ｇで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを、５μＬのＥＡＳＹＳＥＰ Ｈｕｍａｎ ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｅｒおよび１０μＬのＥＡＳＹＳＥＰ Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７１ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（アッセイキットで提供される）を添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地２００μＬに１０～２０×１０６細胞の密度で再懸濁させ、組織培養処理しないＵ底９６ウェルプレートに移し、室温で１５分間インキュベートした。細胞懸濁液を含む各ウェルに１０μＬのＥＡＳＹＳＥＰ Ｄｅｘｔｒａｎ ＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳを加え、室温で１５分間インキュベートした。洗浄バッファー（２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｄＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウム不含））６０μＬを加えることによって、細胞懸濁液を再懸濁させ、プレートをＥＡＳＹＰＬＡＴＥ ＥＡＳＹＳＥＰ Ｍａｇｎｅｔ上に置き、１０分間インキュベートした。マルチチャネルピペットを使用して、細胞ペレットを乱さずに注意深く細胞上清を除去し、２００μＬの洗浄バッファーを使用して洗浄サイクルを４回繰り返した。最終洗浄の後、細胞を、１０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２を添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地２００μＬに再懸濁させ、１０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２を添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地６．５ｍＬを含むＧ－Ｒｅｘプレートの各ウェルに移し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間、加湿インキュベーター内に置いた後、後のアッセイを行った。
溶解物の生成およびタンパク質の定量
溶解バッファーは、１ｍＬの冷ＲＩＰＡバッファーに１錠のｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＳｔｏｐおよびＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）を溶解して調製し、氷上で保存した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を、培養物から１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブに回収し、細胞カウンターを使用して細胞密度を取得した。２×１０６細胞に相当する量を別の１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブに移した。細胞を室温で５分間、３００×ｇで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを１ｍＬの冷ｄＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウム含有）に再懸濁させ、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに移した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）マイクロフュージを使用して、細胞を４℃で５分間、２０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を除去した。残りの上清は、１００μＬのピペットを使用して除去した。得られた細胞ペレットを、７０μＬの冷溶解バッファーを１時間にわたって２０分間隔でピペット操作を繰り返すことにより溶解した。溶解物を４℃で５分間、１３，５００ＲＰＭで遠心分離し、２０μＬのアリコートをドライアイスで瞬間凍結した。アリコートは、長期貯蔵のために－８０℃で保存することができる。
溶解物のタンパク質レベルは、ＢＳＡアッセイを使用して定量し、ＢＳＡを次の濃度で力価調整した：０、２５、１２５、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、および２０００μｇ／ｍＬ。２０μＬのＢＳＡ力価調整品を二反復で入れ、細胞溶解物の単一サンプルを９６平底ウェルポリスチレンＮＵＮＣプレートに入れた。使用試薬は、２００μＬのＢＣＡ試薬Ｂを１０ｍＬの試薬Ａ希釈剤で希釈することによって調製した。２００μＬの使用試薬を、ＢＳＡまたは細胞溶解物のいずれかを含む各ウェルに加えた。マルチドロッププレート振盪オプションを使用して、プレートを３０秒間振盪し、室温で２時間インキュベートした後、ＣＬＡＲＩＯＳＴＡＲプレートリーダーで読み取った。
実験プロトコール
ＣＡＲ－Ｔ細胞上清におけるサイトカイン放出の決定
ＣＳ＆Ｔビーズを使用して、サイトメーターの性能を評価した。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａでサンプルデータを取得する前に、各抗体蛍光色素コンジュゲートで染色したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｍｐ ｅＢｅａｄｓを使用して補正を計算した。ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を、培養物から１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに回収し、室温で５分間、３００×ｇで遠心分離した。各サンプルの上清５０μＬを９６ウェルＶ底アッセイプレートに分注した。
ＢＤ（商標）ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩおよびＢＤ（商標）ＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７を組み合わせて１回のマルチプレックスアッセイを行い、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイム－Ｂを決定するために使用した。アッセイ標準凍結乾燥品を１ｍＬの細胞培養培地で再構成し、再構成したサンプル１００μＬを使用して、１：２、１１ポイント連続希釈を行い、較正プロットを作成した。５０μＬの細胞培養培地を使用して、バックグラウンドサイトカインレベルを定義した。
各試験サンプルウェル用の、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ捕捉ビーズそれぞれ４μＬとＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７捕捉ビーズ０．５μＬからなるビーズミックスを、２ｍＬの微小遠心管で調製し、ボルテックスで攪拌した。同様に、ＰＥ検出試薬マスターミックスを、ＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７ ＰＥ検出試薬０．５μＬをＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ ＰＥ検出試薬２５μＬに加えることによって、別の２ｍＬの微小遠心管で各試験サンプルウェル用に調製した。２５μＬの捕捉ビーズマスターミックスおよび２５μＬのＰＥ検出試薬マスターミックスを、５０μＬの上清と５０μＬのアッセイ標準品それぞれに加えた。アッセイプレートを密閉し、毎分６００回転（ＲＰＭ）に設定したプレートシェーカー上で、暗所にて室温で３時間インキュベートした。
アッセイプレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。ビーズを１００μＬのＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ洗浄バッファーで２回洗浄し、６０μＬの洗浄バッファーに再懸濁させた後、ＢＤ ＬＳＲＩＩサイトメーターでサンプルを取得した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞表現型の決定
ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を、培養物から１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに回収し、細胞カウンターを使用して細胞密度を取得した。２×１０５細胞を採取し、室温で５分間、３００×ｇで遠心分離し、上清を除去し、細胞をｄＰＢＳで洗浄した。遠心分離と上清の除去を繰り返した後、ＢＤ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで１：５０希釈した無関係な抗ヒトＩｇＧアイソタイプ対照を過剰に加えて、Ｆｃ受容体をブロックした。Ｆｃ受容体のブロックは、室温で１５分間、４０μＬで実施した。続いて、ＢＤ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで希釈した総ての抗体－蛍光色素コンジュゲートを含む２倍濃縮抗体カクテル４０μＬで細胞を染色した。細胞を抗体カクテルとともに暗所にて室温で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの生死判定色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＤＰＢＳで１：２０００希釈）中で暗所にて室温で１５分間インキュベートした。細胞をＤＢＰＳでさらに２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで読み取った。
ＣＳ＆Ｔビーズを使用して、サイトメーターの性能を評価した。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａでサンプルデータを取得する前に、各抗体蛍光色素コンジュゲートで染色したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｍｐ ｅＢｅａｄｓを使用して補正を計算した。
下流シグナル伝達の決定（Ｐｅｇｇｙ－Ｓｕｅ（商標））
アッセイ試薬およびラダーは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（アッセイキットで提供される）を４０μＬのミリＱ水で再構成することによって調製した。ビオチン化ラダーを１６μＬのミリＱ水、２μＬのサンプルバッファー、２μＬの再構成ＤＴＴで希釈し、１６μＬを２５０μＬのＰＣＲチューブに移した。蛍光マーカーは、２０μＬのＤＴＴおよび２０μＬのサンプルバッファーで希釈した。３μＬアリコートの蛍光マーカーを２５０μＬのＰＣＲチューブに分注した。
細胞溶解物を、ＲＩＰＡバッファーを使用して３７０μｇ／ｍＬに希釈し、１２μＬアリコートを、３μＬの蛍光マーカーを含むＰＣＲチューブに移した。蛍光溶解物混合物およびビオチン化ラダーをボルテックスで攪拌した後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）マイクロフュージを使用して２０００ＲＰＭで遠心分離し、９５℃に設定したサーモサイクラーの加熱ブロック上に５分間置いた。サンプルを氷上で冷却し、１０μＬのビオチン化ラダーおよび蛍光細胞溶解物を、プレートマップによって定義された３８４ウェルＰｅｇｇｙ－Ｓｕｅ（商標）アッセイプレートの各ウェルに分注した。
１５μＬのｐＣＤ３ζ、ｐＺＡＰ７０および総ＩκＢα、３μＬの総ＣＤ３ζ、ｐＥＲＫ１／２および０．３μＬのＧＡＰＤＨ抗体を、サンプルバッファーを使用して、最終量３００μＬに希釈した。１５０μＬのルミノール（商標）を１５０μＬの過酸化物に希釈した。
２０μＬの希釈抗体、ルミノール（商標）－過酸化物ミックス、ミリＱ水、分離マトリックス、スタッキングマトリックス、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンおよび抗ウサギ二次抗体を、プレートマップによって定義された各ウェルに分注した。３８４ウェルアッセイプレートを１０００×ｇで１分間遠心分離して、気泡を除去した後、Ｐｅｇｇｙ－Ｓｕｅ（商標）機にロードした。
試薬および材料
ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成に使用したＰＢＭＣドナー
ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞は、６健康ヒトドナー（＃９２２０５、９０７７４、９２０８４、９０２４４、９２１９０および９２１９２）からの末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来した。アッセイにおいて試験したＣＡＲ－Ｔ細胞を表１９に詳述する。
Figure 2023520658000023
データ分析
フローサイトメトリーのデータ分析は、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ ７．２．１ソフトウエアを使用して行い、一次メトリクスおよびプロットを作成した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、活性化および疲弊マーカーＣＤ６９、ＴＩＭ３およびＰＤ１の発現および共発現について比較した。
ＣＢＡのデータ分析は、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ ７．２．１ソフトウエアを使用して行い、一次メトリクス（蛍光強度値の中央値）を作成した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用し、二次多項式（Ｙ＝Ａ＋Ｂ＊Ｘ＋Ｃ＊Ｘ＾２）非線形曲線フィットモデルを使用して標準曲線を計算した。標準曲線からの補間を使用して、上清サイトカインの濃度をｐｇ／ｍＬで決定した。
抗原非依存性シグナル伝達のデータ分析は、ＳＷソフトウエア用コンパス（Ｐｅｇｇｙ－Ｓｕｅ（商標））を使用して行い、一次メトリクスを作成した。この場合、それぞれの染色のピーク下面積（ＡｕＰ）を、ソフトウエアを使用して決定し、ＧＡＰＤＨ（総タンパク質負荷）レベルのＡｕＰに基づいて応答を正規化した。
リン酸化ＣＤ３ζの場合、正規化には以下が含まれる：
Figure 2023520658000024
最大６ドナーからなる２つの独立した実験のデータを集約した。ボンフェローニ一元配置ＡＮＯＶＡ分析を行って、試験ＣＡＲ－Ｔ細胞および対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の間の統計的差異を示した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して、最大６ドナーの結果を表す総てのデータをグラフ化した。
結果および考察
ＬＮＧＦＲ高密度化および２４時間の回復培養の後、６名のドナーからの総てのＣＡＲ－Ｔ細胞で形質導入効率８０％を達成した。ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性シグナル伝達（抗原非依存性シグナル伝達）を評価し、ここで、応答は、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）およびＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して評価した。持続性シグナル伝達のレベルは、以下を含む一連のアッセイによって決定した：上清のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢ）の基礎状態のレベル、活性化マーカー（ＣＤ６９）および疲弊マーカー（ＰＤ－１およびＬＡＧ－３）の測定による連続Ｔ細胞表現型の分化、ならびに増大した抗原非依存性シグナル伝達（ｐＣＤ３ζ、ｐＺＡＰ７０、ｐＥＲＫおよびＩκＢα）の測定。
Ｔ細胞でのＣＡＲ発現のレベルは、総ＣＤ３ζ染色から推定した。ＥＦ１ａプロモーターを用いたレンチベクター形質導入を使用して発現させたＧＤ２ ＣＡＲは、ＰＧＫプロモーターを使用して発現させたＣＡＲと比較して、より高いレベルの染色を与えた。ＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０６０）ＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＥＦ１ａプロモーターでの同じ構築物と比較して、活性化および疲弊表現型におけるリン酸化ＣＤ３ζ、サイトカイン放出および分化のレベルが低いことが観察された。これにより、ベクターの効率がＣＡＲの過剰発現によって持続性シグナル伝達を誘導し得ることが再確認される(Gomes-Silva et al., 2017)。ＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫおよびＥＦｌａ）（ＭＢ０５９およびＭＢ０６１）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、持続性シグナル伝達の増加を示さなかった。しかしながら、ＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）（ＭＢ０６０およびＭＢ０６２）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）（ＭＢ０５９およびＭＢ０６１）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、持続性シグナル伝達の増加を示した。持続性シグナル伝達の効果は、ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）ＣＡＲ－Ｔ細胞でさらに増強された。このデータにより、４－１ＢＢζ細胞質ドメインが、使用したレンチベクター形質導入プロモーターとは無関係に、ＣＤ２８ζ膜貫通および細胞質ドメインと比較して、持続性シグナル伝達のレベルを低下させたことが再確認される(Long et al., 2015)。しかしながら、ＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＤ２－ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞上には存在しないＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３細胞外リンカーを含み、観察される持続性シグナル伝達のレベルにも寄与する可能性がある(Frigault et al., 2015)(Mamonkin et al., 2016)。
一般に、このアッセイにおいてサンプル採取した３名のドナー全体で、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞がわずかに多く存在した（図２２Ａ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、活性化表現型（ＣＤ６９）および疲弊表現型（ＰＤ－１、ＴＩＭ－３）の組合せの発現がより高いことを示し、この特徴は、総てのＣＡＲ－Ｔ細胞で一貫していた。三重陽性（ＣＤ６９、ＰＤ－１およびＴＩＭ－３）、二重陽性疲弊のみ（ＰＤ－１、ＴＩＭ－３）またはＰＤ－１のみのプロファイルを調査した場合、活性化表現型および疲弊表現型の傾向が保持された（図２２Ｂ）。
試験ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのサイトカイン放出（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢ）ならびに活性化（ＣＤ６９）および疲弊（ＴＩＭ－３、ＰＤ－１）は、持続性シグナル伝達のないＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）およびＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）ＣＡＲ－Ｔ（ＭＢ０５９、ＭＢ０６１）細胞について観察されたものと類似のプロファイルを示す。ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）およびＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０６０）ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのサイトカイン放出、活性化および疲弊表現型のわずかな増加が観察された。しかしながら、このサイトカイン放出、活性化および疲弊表現型は、ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）について観察されたものよりも有意に低かった。このデータは、４つのヒト化ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞総てについて観察された持続性シグナル伝達の最小レベルを示している。
総てのＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０３７～ＭＢ０４１）が、ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０６２）と比較して、より低い活性化および疲弊表現型を付与した。ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０６０）について観察された活性化および疲弊表現型は同等であった。しかしながら、ヒト化ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）についての活性化および疲弊表現型は、非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）またはＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０５９、ＭＢ０６１）と比較して、わずかな増加を示した（図２２Ｂ）。
基底状態のサイトカイン放出プロファイルから、ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）およびＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０６０）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）と比較して、有意に低いＩＦＮγ、グランザイムＢおよびＴＮＦαのレベルを与えた（ボンフェローニ一元配置ＡＮＯＶＡ）。ＣＤ１９－ＢＢζ（ＭＢ０４９）およびＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）（ＭＢ０５９、ＭＢ０６１）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、基底状態のサイトカイン放出の最小の検出を与えた（図２２Ｃ）。
下流Ｔ細胞シグナル伝達検出の最適化は、Ｔ細胞受容体を架橋し、ｐＣＤ３ｚ、ｐＺＡＰ７０、ｐＥＲＫの動力学的増加および最初の数分でピークに達する総ＩκＢαの減少を測定することによって行った。ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０６２）の下流シグナル伝達分析により、ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）、ＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）およびＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ｐＣＤ３ζおよびｐＺＡＰ７０、ｐＥＲＫの増加ならびにＩκＢαの減少がもたらされた（図２３Ａおよび図２４Ａ。Ｐｅｇｇｙ－Ｓｕｅ（商標）ウエスタンアッセイで検出されたシグナル伝達プロファイルから、ヒト化Ｔｎ－ＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）およびＧＤ２－２８ζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０６０）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）と比較して、有意に低いレベルのｐＣＤ３ζを与えた。ｐＣＤ３ζレベルは、陰性対照ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）と一致して、総てのヒト化ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞で同様であった。このデータにより、ＴｎＭＵＣ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ－ｖｉｔｒｏでＣＡＲ－Ｔ細胞機能に悪影響を与えるには持続性シグナル伝達のレベルが不十分であることが再確認される。
溶解物は、２×１０６ＣＡＲ－Ｔ細胞から得、ローディングの前に濃度を３７０μｇ／ｍＬに対して正規化した。タンパク質レベルは、Ｐｅｇｇｙ－Ｓｕｅ（商標）ハイスループットキャピラリーウエスタンテクノロジーを使用して評価した。ｐＣＤ３ζの正規化レベルは、最大６名のドナーからの総ＣＤ３ζとＧＡＰＤＨローディング対照に基づいて計算した。結果の分析から、ヒト化ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０３７～ＭＢ０４１）は、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ｐＣＤ３ζまたはｐＺＡＰ７０のレベルにおいて有意差を与えなかった。しかしながら、ＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａ）では、ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、有意に高いレベルのｐＣＤ３ζが検出された。ＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫまたはＥＦ１ａ）（ＭＢ０５９およびＭＢ０６１）ＣＡＲ－Ｔ細胞では、低いｐＣＤ３ζシグナルが観察された（図２３Ａ）。ｐＺＡＰ７０についての同様の分析により、ＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ（ＥＦ１ａ）（ＭＢ０６２）で最高レベルのシグナルが確認され、ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＰＧＫ）、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＰＧＫ）（ＭＢ０４９）またはＧＤ２－ＢＢζ（ＰＧＫまたはＥＦ１ａ）ＣＡＲ－Ｔ細胞間に有意差はなかった（図２３Ｂ）。
ＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ ＣＡＲ（ＭＢ０４０）、ＣＤ１９－ＢＢｚ ＣＡＲ（ＭＢ０４９）およびＧＤ２－２８ζ（ＥＦ１ａプロモーター）ＣＡＲ（ＭＢ０６２）ＣＡＲ－Ｔ細胞について、ＴＣＲシグナル伝達経路への下流シグナル伝達マッピングを決定した。この場合、ドナー９０２４４から得られたＣＡＲ－Ｔ細胞について、ＣＡＲ特異的総ＣＤ３ζ、ｐＣＤ３ζ、ｐＺＡＰ７０、ｐＥＲＫ１／２、総ＩκＢαのレベルを確立した。ウエスタンブロットから示されるように（図２４、Ａ）、ＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ（ＭＢ０６２）は、ＣＤ１９－ＢＢζ（ＭＢ０４９）およびＴｎＭＵＣ－１－ＢＢζ（ＭＢ０４０）ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、総ＣＤ３ζ、ｐＣＤ３ζ、ｐＺＡＰ７０およびｐＥＲＫ１／２の有意な増加と総ＩκＢαのレベルの低下を示した。
実施例９－ＴｎＭＵＣ１腫瘍細胞株に対するヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性
この研究の目的は、陽性および陰性ＴｎＭＵＣ１腫瘍細胞株と共培養した場合のキリングアッセイにおけるＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性および特異性を評価することであった。具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイにおいて７２時間にわたってリアルタイムで測定した。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を、腫瘍細胞と２４時間共培養した後にＭＳＤアッセイを使用してＩＦＮγ放出を測定することによって評価した。
方法
ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの機能性は、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔを腫瘍細胞株と共培養することによって評価した。形質導入後１４日目にＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。直接の細胞傷害性は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイを用いてリアルタイムで測定し、Ｔ細胞を加える２０時間前に、腫瘍細胞を播種した。共培養は、２つの陽性ＴｎＭＵＣ１細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ７ ＷＴを使用して、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅで７２時間実施した。さらに、ＣＡＲ－Ｔの有効性は、Ｋ５６２細胞株、ＭＣＦ７ ＷＴ細胞株およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞株を用いた培養後２４時間目に、分泌されたＩＦＮγのレベルを測定することによって評価した。実験は、２つの独立した実験セットで３名のドナーを用いて設定した。
実験準備
Ｔ細胞の準備
Ｔ細胞は、形質導入後１４日目に、２４ウェルＧ－ＲＥＸプレートから回収した。Ｔ細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ培地で１×１０＾６細胞／ｍｌに希釈した。Ｔ細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、１０ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地で洗浄し、再び３００×ｇで５分間遠心分離した。Ｔ細胞を１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＣＡＲ－Ｔは、ドナー全体で最低の形質導入効率に対して正規化した。形質導入効率は、フローサイトメトリー分析からの陽性ＺｓＧｒｅｅｎ集団の割合％に基づいた。正規化は、非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞で一定数および体積のＴ細胞まで希釈することによって行った。
実験プロトコール
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイ
このインピーダンス実験には、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を適用した。標的細胞を加える前にバックグラウンドインピーダンスが測定できるように、９６ウェルＥプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各ウェルに５０μｌの標的細胞培養培地を充填した。標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ７ ＷＴを分離し、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ－７ ＷＴ）。各細胞株５０μｌを９６ウェルＥプレートの適当なウェルに加えた。標的細胞を播種した後、Ｅ－プレートを室温で１５～３０分間放置して、標的細胞をウェルに接着させた。次に、ＥプレートをＲＴＣＡ装置（細胞培養インキュベーター内）に移し、データの記録を実験時間中１時間間隔ですぐに開始した。播種後およそ２０時間で、データ取得を一時停止し、エフェクター細胞を、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株およびＭＣＦ－７ ＷＴ細胞株についてはＣＡＲ－Ｔ対標的比０．２：１で加えた。含めた対照は、標的細胞のみ、エフェクター細胞のみ、および標的と１００％溶解（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）のウェルであった。次に、Ｅプレートを装置に戻し、実験を再開した。サイトカイン分析のため、追加の共培養を同じ条件で設定した。
Figure 2023520658000025
ヒトＩＦＮγサイトカインアッセイ
Ｋ５６２、ＭＣＦ７ ＷＴおよびＭＣＦ７ ＫＯ細胞株を分離し、計数した。細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄し、３００×ｇで遠心分離した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。次に、１００μｌで、５×１０４個の細胞を９６ウェルプレートに加えた。次に、正規化したＴ細胞１００μｌをＥ：Ｔ比２．５：１（エフェクターは形質導入Ｔ細胞に基づく）でプレートに加え、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間共培養した。２４時間後、プレートを遠心分離し、上清を集め、－８０度で保存した。ＭＳＤ分析では、サンプルを室温で融解した。サンプルと較正物質を希釈剤１で希釈した。具体的には、１０μｌのストック較正物質を９９０μｌの希釈剤１で希釈した。１：４連続希釈を使用して、６つの追加の較正物質希釈液を調製した。最終希釈では希釈剤１単独を使用した。サンプルを希釈剤１で１：１０希釈し、各サンプル２５μｌをＭＳＤプレートに加えた。較正物質は、プレートの最初の２つの列に二反復で加えた。プレートを密閉し、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを、プレート洗浄機を使用して０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｏｄｅｘｏ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。検出抗体を希釈剤１００で希釈した（ＭＳＤプレート当たり６０μｌのＡｂ＋２．９４ｍＬの希釈剤１００）。２５μｌの検出抗体を加えた後、プレートを密閉し、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを前と同様に洗浄した。次に、１５０μｌの２×リードバッファーを各ウェルに加えた後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００ Ｉｍａｇｅｒで読み取った。データは、ｅｘｃｅｌおよびｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して分析した。簡単に述べれば、共培養から得られたＩＦＮ－γの放出量に対応する実験値。
データ分析
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ
インピーダンスの変化は、Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）として記録された。Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘは、エフェクター細胞を追加した時点に対して正規化された（Ｎｏｒｍａｌｉｓｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ（ＮＣＩ）として知られている）。下式を使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ製Ｅｘｃｅｌで標的細胞成長に対してデータを正規化することによって％生存細胞率および％細胞溶解率を計算した。
標的（溶解）に対する正規化＝（（（共培養物－エフェクター）－１００％溶解）／（標的－１００％溶解））＊１００
ＭＳＤ
データは、ｅｘｃｅｌおよびｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して分析した。簡単に述べれば、共培養から得られたＩＦＮγの放出量に対応する実験値は、線形補間により算出された（吸光度値を補間して濃度を算出）。回帰曲線は、以下の漸増濃度（ｐｇ／ｍＬ）を使用した：ＩＦＮγ（最高値：１０．０００ｐｇ／ｍＬ）。
結果および考察
細胞株の解糖系および細胞株のバイオマーカーの違いは、細胞株間での殺傷の差異をもたらす可能性がある。ＭＵＣ１は、ＴｎまたはｓＴｎによって差次的にグリコシル化される可能性があり、これは異なる細胞株間での殺傷の速度と量に影響する。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株とＭＣＦ７細胞株の間で殺傷の速度と全体的パーセンテージに差異が認められることを示した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性により、ドナー内のＣＡＲ－Ｔ間に大きな差異は認められない。ＭＢ０２４は、ＭＢ００４マウスおよびＭＢ０２０ヒト陽性対照ＣＡＲ－Ｔの両方に匹敵するレベルで、ＴｎＭＵＣ１陽性細胞を効率的に標的とすることができた。
ＴｎＭＵＣ１腫瘍細胞株に対するＭＢ０２４の細胞傷害性の評価
６つのヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔを、細胞傷害性アッセイにおける有効性および特異性について評価した。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性の検証は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによりリアルタイムで測定した。この場合、細胞成長はインピーダンス測定を使用して経時的に追跡される。２つのＴｎＭＵＣ１発現乳房細胞株（ＭＣＦ７およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を６つのＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの標的とし、細胞傷害性を１時間ごとに合計７２時間測定した。この場合、インピーダンスの欠如は腫瘍細胞殺傷と相関した。対照標的細胞の過剰集密により、細胞傷害性分析は３５時間までのみ有効となった。ドナー０２７７は、ＵＴ細胞の異常な交差反応を示したため、このドナーを分析から除外し、合計５ドナーとなった。ＭＢ０２４の７２時間時点での生存細胞のパーセンテージはドナー間で最大２０％の差異があったが、ドナー内のＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞間で細胞傷害性について有意差は認められなかった。
ＭＢ０２４は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において試験した他のＣＡＲ－Ｔと同等のＫＴ５０値を示した。ＭＣＦ７細胞における３ドナー（９１０３１、０２７７、９１６６６）の結果は、ＭＣＦ７細胞株が好適な密度に成長せず、アッセイ基準に合格しなかったため、省略し、分析から除外し、ＭＣＦ７細胞におけるドナー９２０９１、９１８６０および９１４６２のみを分析のために考慮した（図３１、Ｂ）。ＭＢ０２４は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８と比較して、ＭＣＦ７細胞におけるＫＴ５０が遅かったが、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞における殺傷と比較した場合、ＭＣＦ７細胞株でのドナー間変動は少なかった。
５０％殺傷に達するまでのＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの動態測定時間（ＫＴ５０）の要約の表を以下の表２０に示し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株におけるＫＴ５０平均値（ａ）、およびＭＣＦ７ ＷＴ細胞におけるＫＴ５０平均値（ｂ）を示す。
Figure 2023520658000026
ＩＦＮγサイトカインの評価によるＴ細胞活性化の評価
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅで見られたデータと同様に、結果は、ＭＢ０２４ ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔは、ＴｎＭＵＣ１陽性細胞と共培養したときにＩＦＮγを分泌することを示しており、ＣＡＲ－Ｔと標的抗原との相互作用の結果としてＴ細胞が活性化されることを示している。ＴｎＭＵＣ１を標的とすることによるＭＢ０２４の活性化は、Ｋ５６２細胞株、ＭＣＦ７ ＷＴ細胞株およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞株との共培養後のＩＦＮγの放出によって測定した。ＭＢ０２４は、ＴｎＭＵＣ１陽性細胞株との相互作用により、ＵＴおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ対照と比較して、Ｔ細胞の活性化を示した。ＭＢ０２４は、ＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞株においてＭＵＣ１の不在下で活性化されたＭＢ０２２、ＭＢ０２３、ＭＢ０２５およびＭＢ０２６とは異なり、ＭＣＦ７ ＫＯ細胞株で活性化のレベルを示さなかった。さらに、ＩＦＮγ放出の基底状態のレベルを見ると、ＭＢ０２４は、ＩＦＮγの分泌を示さなかったが、ＭＢ０２６は、活性化の基底状態のレベルが高かった。
従って、ＭＣＦ７細胞株におけるＣＡＲ－ＴのＩＦＮγ放出は、ＭＢ０２４が試験した他のＣＡＲ－Ｔよりも優れていることを示す。ＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞株で培養すると、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４を除き、６ドナーの総てのＣＡＲ－Ｔは活性化を示す。ＭＢ０２４はまた、標的細胞株の不在下では基底状態のＩＦＮγ放出レベルを示さなかった。ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの潜在的な交差反応タンパク質を考慮すると、総てのＣＡＲ－Ｔ分子は、ＭＵＣ１タンパク質の不在下でさえ細胞株に存在する他の糖タンパク質上のＴｎおよびｓＴｎグリカンを認識する可能性がある。Ｔｎ－グリカンが腫瘍でのみ発現することを考えれば、その腫瘍特異性から懸念はあまり生じないが、ｓＴｎ－グリカンは、正常組織において低レベルで発現し、ＣＡＲ－Ｔの交差反応の可能性は好ましくない安全性プロファイルを示すことになる。まとめると、ＭＢ０２４は、ＴｎＭＵＣ１腫瘍細胞株を標的とし、それを効率的に殺傷することができ、ＴｎＭＵＣ１陽性細胞株に特異的である。
実施例１０－標的密度の影響
本研究の目的は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅとＭＳＤアッセイでＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性および特異性を評価することであった。異なるレベルのＴｎＭＵＣ１を発現するリコンビナント細胞株を用いて、細胞傷害性を介した殺傷の差に基づきＣＡＲ－Ｔを分化させた。細胞傷害性は、７２時間にわたるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイにてリアルタイムで、また２４時間の共培養からのＭＳＤによりＩＦＮγ放出を測定することで測定した。
方法
ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔの機能性研究は、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－ＴとＴｎＭＵＣ１陽性および陰性腫瘍細胞株との共培養を確立することにより行った。解凍後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍細胞株に添加する前に２４時間回復させた。同じ細胞株とＥ：Ｔ比を用いて、ＭＳＤプレートとｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプレートを並行して設定した。実験は、２つの別個の実験セットで４名のドナーを用いて設定した。
実験準備
Ｔ細胞の解凍および回復
冷凍したＴ細胞の１ｍＬアリコートを室温で半解凍した後、１５ｍｌの氷冷細胞培養培地に移した。Ｔ細胞を３００×ｇにて室温で１０分間遠心分離し、１５ｍｌの冷細胞培養培地に再懸濁させた。遠心分離を繰り返した後、Ｔ細胞を２ｍＬの室温細胞培養培地に再懸濁させた。Ｔ細胞を計数し、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。Ｔ細胞は、２４ウェル平底細胞懸濁プレートにて、ＩＬ－２を１００Ｕ／ｍＬで含有する培地中、加湿インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅで懸濁細胞株を試験するためのＣＤ４０抗体によるＥプレートのコーティング
この係留溶液を組織培養グレードの水で１０倍に希釈した。次に、この係留溶液を用いて、抗ＣＤ４０抗体を５００μｇ／ｍＬから終濃度４μｇ／ｍＬに希釈した（１２５倍希釈）。Ｅプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の適切なウェルに抗ＣＤ－４０検量線用溶液を５０μｌコーティングし、室温で３時間インキュベートし、ＰＢＳ（－／－）で２回洗浄し、５０μｌの標的細胞培養培地とともに１時間培養した後、バックグラウンド測定を行った。
実験プロトコール
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイ
本インピーダンス測定には、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を適用した。９６ウェルＥプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各ウェルに５０μｌの標的細胞培養培地を充填し、従って、標的細胞添加前のバックグラウンドインピーダンスを測定することができる。接着性標的細胞を解離させ、懸濁細胞株とともに２０，０００（全ＰＣ３細胞株およびＡＲＨ ７７ ＷＴ）または４０，０００（ＭＣＦ－７ ＷＴおよびＭＣＦ－７ ＫＯ）細胞／ウェルの密度で播種した。９６ウェルＥプレートの適切なウェルに、５０μｌの各細胞株を添加した。標的細胞を播種した後、Ｅプレートを室温で１５～３０分放置して標的細胞をウェルに接着させた。その後、ＥプレートをＲＴＣＡ装置（細胞培養インキュベーター内）に移し、そのまま１０分間隔で６時間、その後、残りの実験は１時間間隔でデータ記録を開始した。播種後約２０時間、データ取得を一時停止し、ＰＣ３細胞株とＡＲＨ７７ ＷＴについてはエフェクター：標的比１：１で、ＭＣＦ－７ ＷＴとＭＣＦ－７ ＫＯについてはエフェクター：標的比０．５：１で、エフェクター細胞を添加した。存在する対照は、標的細胞のみ、エフェクター細胞のみ、標的＋１００％溶解（０．５％トリトンＸ）ウェルであった。その後、Ｅプレートを装置に戻し、実験を再開した。追加の共培養を、サイトカイン分析のために同じ条件で設定した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅデータは、実施例９で上記したように分析した。
ヒトＩＦＮγサイトカインアッセイ
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ共培養の設定中、平底９６ウェルプレートに２反復のプレートを設定し、２４時間インキュベートした。プレートの遠心分離の後、共培養２４時間後に上清を回収し、ＭＳＤのために室温で解凍するまで－８０℃で保存した。
サンプルおよび較正物質を希釈液１で希釈した。１０μｌの原液較正物質を９９０μｌの希釈液１で希釈した。１：４の連続希釈を使用して、６種類のさらなる較正物質希釈液を調製した。希釈液１のみが最終希釈で使用された。サンプルは希釈液１で１：１０希釈し、２５μｌの各サンプルをＭＳＤプレートに添加した。較正物質は、プレートの反対側に２反復で添加した。プレートを密封し、室温で２時間振盪しながらインキュベートした。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｏｄｅｘｏ）でプレートを３回洗浄した。検出抗体を希釈液１００で希釈した（ＭＳＤプレート当たり６０μｌのＡｂ＋２．９４ｍＬの希釈液１００）。２５μｌの検出抗体を添加した後、プレートを密封し、室温で２時間振盪しながらインキュベートした。プレートを従前のように洗浄した。１５０μｌの２倍リードバッファーを各ウェルに加えた後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャーで読み取った。ＭＳＤデータは、実施例９で上記したように分析した。
統計学的計算
２４時間、４８時間および７２時間のそれぞれについて、細胞株によるＣＡＲの相互作用項と、週、プレートおよびドナーのランダム切片項を用いた線形混合効果モデルを使用した。これらのモデルを用いて、下式：
生存率％の差＝（細胞株におけるＣＡＲ－Ｔ応答－細胞株におけるＵＴ応答）－（対照細胞株におけるＣＡＲ応答－対照細胞株におけるＵＴ応答）
を用い、「陰性対照細胞株に対する細胞生存率％の差」の線形対比を算出した。
結果および考察
ＴｎＭＵＣ１腫瘍細胞株に対するＴｎＭＵＣ１細胞傷害性の機能的評価
ＴｎＭＵＣ１細胞表面での発現レベルは、内因的に発現している細胞株では劇的に変化することがある。実験間で発現レベルを一定に保つ組換え細胞株を用いることで、ＣＡＲ－Ｔ供給のために異なるドナーを用いる場合、正確な実験の繰り返しが可能となる。様々な標的レベルを用いることで、ＣＡＲ－Ｔは動態およびＩＦＮγ測定により識別できる可能性がある。
ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるレベルでＴｎＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞を差次的に標的として殺傷する能力を調べるために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害アッセイを使用した。Ｔ細胞添加後１時間ごとに、７２時間にわたってリアルタイムで細胞傷害性を測定した。このアッセイでは、ＴｎＭＵＣ１を高（１００％）、中（６０％）および低（５％）陽性率で発現する３つの組換えＰＣ３腫瘍細胞株を、ＰＣ３ ＷＴ陰性対照とともに試験した。ＭＣＦ７ ＷＴおよびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞株も実験対照として使用した。ＴｎＭＵＣ１ ＰＣ３ ５Ｆ５細胞株は、Ｔ細胞添加２時間以内に標的細胞傷害性を示し、２４時間の時点でＭＢ０２２のみについて有意な殺傷が見られることが示された。他の細胞では、対照細胞株と比較して、２４時間の時点では殺傷が見られない。
４８時間の時点で、総てのＣＡＲ－Ｔは、ＭＣＦ７ ＷＴ、ＰＣ３ ２Ｂ６およびＰＣ３ ５Ｆ５に対して、ある程度の殺傷効果を示す。しかしながら、ＭＢ０２１はＰＣ３ ２Ｂ６に対して顕著な殺傷力を有する唯一のＣＡＲ－Ｔである。一方、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５は、この４８時間の時点でＭＣＦ７ ＷＴに対して顕著な殺傷を示し、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４は示さない。ＭＣＦ７細胞とＰＣ３細胞の間のＥ：Ｔ標的比は異なる（それぞれ０．５：１と１：１）ものの、７２時間の終りまでに総てのＣＡＲ－ＴはＭＣＦ７ ＷＴ、ＰＣ３ ２Ｂ６およびＰＣ３ ５Ｆ５に対して１００％の殺傷を示し、ＰＣ３ ４Ｃ１１に対しては殺傷が見られない。ＭＢ０２１でＰＣ３ ４Ｃ１１に対していくらかの殺傷効果が見られるが、これは統計的に有意ではない（表２１）。全体として、ＭＣＦ７ ＷＴとＰＣ３ ２Ｂ６は、ＰＣ３ ５Ｆ５よりもＴｎＭＵＣ１発現が少ないとしても、これらの細胞株では最も顕著な殺傷が見られる。
Figure 2023520658000027
ＩＦＮγサイトカイン放出によるＴ細胞活性化の評価
ＭＢ０２２ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０２４ ＣＡＲ Ｔ細胞は、高陽性のＴｎＭＵＣ１腫瘍細胞株と共培養した際に、高レベルのＩＦＮγを分泌した。ＩＦＮγの放出は、ＰＣ３ ＣＯＳＭＣ ＫＯ細胞株２Ｂ６で最も高く、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４で約８０００ｐｇ／ｍｌが検出されたが、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５は同等のレベル１００００ｐｇ／ｍｌに達した（図２６）。ＰＣ３ ５Ｆ５細胞株でも同様の傾向が見られたが、ＩＦＮγのレベルは低かった（３０００ｐｇ／ｍｌ～５０００ｐｇ／ｍｌ）。ＭＢ０２１およびＭＢ０２４は、ＰＣ３ ４Ｃ１１またはＰＣ３ ＷＴ細胞株では活性化を示さなかった。ＭＢ０２４は、ＭＢ０２５と比較して全体的にＩＦＮγ放出が２分の１であるが、陽性細胞と陰性細胞の発現レベルに大きな差があり、ＰＣ３ ＷＴまたは基底発現では活性化は見られない（図２６）。
この結果は、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞がそれらの標的細胞株と特異的に会合し、殺傷するために必要な発現閾値が存在することを示している。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅとＭＳＤの両方で、ＴｎＭＵＣ１を５％しか発現していないＰＣ３ ４Ｃ１１細胞株との共培養で細胞傷害効果を示さなかった。ＰＣ３ ５Ｆ５（高発現）およびＰＣ３ ２Ｂ６（中発現）細胞株は、ＭＢ０２４によって完全に排除することができ、ＰＣ３ ２Ｂ６では、ＰＣ３ ５Ｆ５から放出されるＩＦＮγレベルが低いにもかかわらず、より遅い細胞溶解速度が観察された。
実施例１１－ＴｎＭＵＣ－１発現ＰＣ３細胞株の機能的ＣＡＲ－Ｔ細胞殺傷
この研究の目的は、ＴｎＭＵＣ－１発現標的細胞を特異的に殺傷するその性質に基づいてＴｎＭＵＣ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞を選択することであった。
方法
実験プロトコール
ＣＡＲ－Ｔ細胞の解凍および培養
ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞は、３名の健康なヒトドナー（＃９２１５９、９２１６０および２７６４）の末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたものであった。凍結保存したＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する場合、３７℃に設定したウォーターバスで半解凍し、ペレットが完全に解凍されるまで１ｍＬの冷ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地で再懸濁させた。冷ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地を用いて細胞懸濁液を１５ｍＬファルコン（登録商標）チューブで全容量１０ｍＬに調整し、３００×ｇ、室温で５分間遠心分離した。上清を除去し、残った細胞ペレットを１０ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地に２回再懸濁させた。
解凍または新鮮な細胞の再懸濁および培養のために、洗浄後に得られる細胞ペレットを２ｍＬ ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地室温で再懸濁させ、セルカウンターを用いて細胞密度を求めた。細胞を再懸濁させ、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地で密度を２×１０６細胞／ｍＬに密度を調整した。７ｍＬの再懸濁細胞を２４穴ディープウェルＧ－Ｒｅｘプレートの各ウェルに移し、共培養を開始する前に３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに２４時間入れた。
このアッセイで試験したＣＡＲ－Ｔ細胞を以下に詳細に示す。
Figure 2023520658000028
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（商標）での細胞殺傷アッセイのための共培養の開始
３つの細胞株：ＰＣ３ ＣＯＳＭＣ ＫＯクローン５Ｆ５（ＰＣ３．５Ｆ５）、ＰＣ３ ＣＯＳＭＣ ＫＯクローン４Ｃ１１（ＰＣ３．４Ｃ１１）、およびＰＣ３ ＷＴ（ＰＣ３．ｗｔ）を試験した。標的細胞（ＰＣ３．ｗｔ、ＰＣ３．５Ｆ５およびＰＣ３．４Ｃ１１）を、加湿インキュベーターにて、３７℃で５分間、５ｍＬのＴｒｙｐｌＥ（商標）で細胞表面を処理することにより、Ｔ１７５フラスコから剥離した。これらのフラスコを軽くたたいて細胞を取り出し、ＴｒｙｐｌＥ（商標）を１５ｍＬの予温細胞培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱失活ＦＢＳ＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ）で中和した。細胞懸濁液を５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ（商標）チューブに回収し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットを１０ｍＬの細胞培養培地に再懸濁させた。セルカウンターで細胞密度を求め、細胞を細胞培養培地中０．４×１０６細胞／ｍＬをなるように再懸濁させた。１００μＬの細胞を、アッセイプレートマップに示されているようにアッセイプレートの各ウェルに移し、ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養の前に３６．５℃／５％ＣＯ２の加湿ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｓ３に２４時間移した。
細胞上清を各アッセイウェルから除去し、５００ｎＭ Ｃｙｔｏｔｏｘ（商標）Ｒｅｄ試薬を含有する１００μＬの新鮮細胞培養培に置き換え、エフェクター細胞を添加する前に、これらのプレートを３６．５℃／５％ＣＯ２の加湿ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｓ３に移した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ（商標）チューブに採取し、セルカウンターを用いて細胞密度を求めた。細胞を３００×ｇで室温にて５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞が０．４５×１０６細胞／ｍＬおよび１００μＬの密度となるように細胞培養培地に再懸濁させ、アッセイプレートマップにより示されるように各ウェルに移した。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２の加湿ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｓ３に入れた。６日間にわたって２時間間隔で画像採取を計画した。
データ分析
画像解析
以下に詳細に示す条件に相当する画像収集物を画像マスクの設定のために得た。
・２時間および９６時間のＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞の共培養
・２時間および９６時間の非形質導入Ｔ細胞と標的細胞の共培養
・２時間および９６時間の標的細胞のみ
・２時間および９６時間のＣＡＲ－Ｔ細胞のみ
・２時間の非形質導入細胞のみ
画像解析を行って、標的細胞殺傷を表す赤色の総面積の増加を明確に可視化し、赤色の総面積マスクを生成して総面積（μｍ２／画像）を決定した。
画像データの正規化および分析
各ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞の総面積をＷｉｎｄｏｗｓ Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。各ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞の生データおよび正規化生細胞％を、総クラスター面積（μｍ２／画像）の増加を表すために、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアとしてのＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０２にて時間の関数としてプロットした。正規化は以下に詳細に示すように計算した。
各ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞殺傷効果は、以下に挙げる式を用いて計算した。
Ｔ＝１およびＴ＝ｎ番目の読み取りにおけるその実験での最良のＣＡＲ－Ｔ殺傷効果に依存する正規化された応答、ここで使用される式は、以下の通りである。
ａ．共培養バックグラウンド応答（ＣＢＧ）の決定
＝共培養応答－（エフェクターのみ＋標的のみ応答）。
ｂ．生細胞率の決定＝｛［平均（最良のＣＡＲ－Ｔの最大ＣＢＧ－ＣＢＧｔｎ）］／［平均（最良のＣＡＲ－Ｔの最大ＣＢＧ－ＣＢＧｔ１）］｝×１００
３つのＰＣ３ ＣＯＳＭＣノックアウト細胞株（ＰＣ３．５Ｆ５－２８時間、ＰＣ３．４Ｃ１１－４４時間、ＰＣ３．ｗｔ－６０時間）の間で試験した、３名のＴ細胞ドナー（ｎ＝９データ点）の各リピートのそれぞれのエンドポイントでの生細胞率を得た。データはＷｉｎｄｏｗｓ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してプロットした。ボンフェローニ一元配置ＡＮＯＶＡ検定を実施し、異なる細胞株における試験ＣＡＲ－Ｔ細胞の生細胞応答率％間の有意差を判定した。
結果および考察
この研究の目的は、標的細胞株のＣＡＲ－Ｔ特異的殺傷が検出可能な標的発現の閾値を確立することであった。ＣＡＲの設計における主要な課題は、健康な組織を残して腫瘍細胞を確実に検出および除去することである。そのため、本研究では、ＴｎＭＵＣ－１標的発現が検出されないＰＣ３．ｗｔ細胞で観察される非特異的殺傷効果の検出も可能になるはずである。
本研究では、ＣＤ８膜貫通領域と４－１ＢＢζ細胞質領域を有するヒト化５Ｅ５ ＳｃＦｖからなる検出タグを持たないＣＡＲ－Ｔ細胞を、末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）へのレンチウイルス導入により作製し、凍結保存した。この細胞を新鮮な培養物に再導入し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率と導入効率を再確認した。ここでは、総てのＣＡＲ－Ｔ細胞は８０％を超えるＣＡＲ導入効率で、８０％を超える生存率を示した。
正規化された殺細胞応答から、非導入Ｔ細胞はいずれの標的細胞株に対しても特異的な殺傷を示さなかった。ＭＢ０５２およびＭＢ０５４はＰＣ３．ｗｔ細胞株に対し、６０時間のエンドポイントである程度の殺傷を与えた。ＭＢ０５１およびＭＢ０５３では、同じ時点で殺傷効果は認められなかった。試験ＣＡＲ－Ｔ細胞に関して、６０時間のエンドポイントでボンフェローニ一元配置分散分析を行ったところ、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＰＣ３．ｗｔ標的細胞株の殺傷に有意差が認められた。６０時間のエンドポイントでは、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４の平均生細胞パーセンテージは、ＭＢ０５１、ＭＢ０５３および非導入Ｔ細胞と比較して低かった（図２７および２８、ＡおよびＢ）。しかしながら、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４で観察された殺傷レベルは、６０時間のエンドポイントで標的細胞株の５０％を殺傷する時間（Ｋｔ５０）を予測するには不充分であった。
同様に，ＭＢ０５２およびＭＢ０５４も，ＰＣ３．４Ｃ１１細胞株に対して，４４時間のエンドポイントで、ＭＢ０５１およびＭＢ０５３に比べて殺傷レベルの上昇を示した。ボンフェローニ一元配置ＡＮＯＶＡにより，生細胞率％レベルに有意差が確認された（図２８Ｃ）。Ｋｔ５０解析では，ＭＢ０５２およびＭＢ０５４は、Ｋｔ５０が３６～３８時間の範囲にあったが、ＭＢ０５１およびＭＢ０５３のＫｔ５０は４５～４９時間の範囲に示された。
高レベルのＴｎＭＵＣ－１を付与するＰＣ３．５Ｆ５細胞株でＣＡＲ－Ｔ細胞を試験した結果は、２８時間の時点で完全殺傷エンドポイントが達成され、殺傷力が有意に向上したことを示した。このエンドポイントに対するボンフェローニ一元配置ＡＮＯＶＡ分析では、ＭＢ０５１、ＭＢ０５２およびＭＢ０５３の生細胞率％にほとんど差は見られなかった。唯一、ＭＢ０５１とＭＢ０５４の間に有意差が認められた。殺傷応答が高まるため、ＴｎＭＵＣ－１発現量の少ないＰＣ３．４Ｃ１１細胞株で試験した場合と比較して、Ｋｔ５０が大幅に短縮された。ここでは、計算されたＫｔ５０は１１～１４時間の範囲にあり、４つのＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれにも有意差はなかった（図２８Ａ～２８Ｄ）。
ＰＣ３．ｗｔおよびＣＯＳＭＣノックアウト細胞株が漸増レベルのＴｎＭＵＣ－１を発現する実験から得られた結果から、ＴｎＭＵＣ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性の代表的な上昇が確認された。ＴｎＭＵＣ１のレベルの変化を用いることで、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞株と特異的に結合し、殺傷するために必要な発量の閾値が存在することを実証した。ＴｎＭＵＣ－１を発現していないＰＣ３．ｗｔ細胞株(well line)との共培養では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は細胞毒性効果を示さないか、または低いことが示された。ＭＢ０５１およびＭＢ０５３は、ＰＣ３．ｗｔ細胞株の６０時間のエンドポイントにおける殺傷効果に有意差はなかった。しかしながら、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４は、ＴｎＭＵＣ－１陰性細胞株（ＰＣ３．ｗｔ）に対して、非導入Ｔ細胞またはＭＢ０５１およびＭＢ０５４で観察される殺傷力に比べて有意に高いレベルを示した。この所見は遅い解離速度によって駆動されるメカニズムに関連している可能性があり、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４のＳｃＦｖはＭＢ０５１およびＭＢ０５３に比べて遅い解離速度と高い親和性を付与した。
ＰＣ３．４Ｃ１１細胞株でＴｎＭＵＣ－１発現が５％増加すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞が結合して殺傷することを可能にするのに十分なターゲットが存在する。ＰＣ３．４Ｃ１１細胞株上でのＴｎＭＵＣ－１発現レベルが低いため、ＰＣ３ ５Ｆ５（高発現）と比較して観察される殺傷の最大閾値は３９～５０％の範囲である。このレベルの殺傷は、４４時間の時点で達成される。ＭＢ０５１およびＭＢ０５３は、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４に比べ、高い生細胞率％閾値、長いＫｔ５０を与え、ＰＣ３．４Ｃ１１細胞では殺傷速度が遅いことを示す（表２２）。その結果、ＴｎＭＵＣ－１高発現細胞株（ＰＣ３．５Ｆ５）では、２８時間で標的細胞のほぼ１００％の殺傷が達成される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１２～１４時間の範囲で平均Ｋｔ５０を与え、試験したいずれのクローンにおいても殺傷率に有意差はなかった（表２３）。
このデータから、特異的な腫瘍細胞殺傷を引き起こすためには、標的密度、ＣＡＲ－Ｔ細胞発現、およびＣＡＲ親和性の間の相互作用を理解することが重要であることが確認される。ここで、ＭＢ０５１およびＭＢ０５３は、ＭＢ０５２およびＭＢ０５４に比べてより良い安全性を提供し、ＴｎＭＵＣ－１発現レベルに応じて標的細胞の殺傷能力に差があることが示された。
Figure 2023520658000029
Figure 2023520658000030
実施例１２－ペプチド刺激アッセイ
本研究の目的は、（ｉ）ＭＢ０２４の開発に使用したｓｃＦｖがＴｎおよびＳＴｎ ＭＵＣ１の両方に結合できることを示すＢＩＡｃｏｒｅのこれまでの知見を検証すること、ならびに（ｉｉ）ＭＢ０２４ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＴｎ ＭＵＣ１ペプチドと報告されたエピトープでのみ結合することを証明することであった。
方法
試験的調製
ｓｃＦｖタンパク質の生成、ペプチドの調製
ヒト化ｓｃＦｖタンパク質は、従前に詳細に示されたように生成した。
ペプチドのセリンおよびトレオニンアミノ酸にＴｎ糖残基を含むビオチン化２０マーアミノ酸ペプチドを設計し、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＲＢ）に発注した。対照として、同じ配列であるが、セリンおよびトレオニンアミノ酸に糖残基を持たない非糖化ＭＵＣ１ペプチドも発注した。ヒト化抗ＴｎＭＵＣ１ ｓｃＦｖタンパク質がＴｎペプチドと結合するエピトープを決定するために、さらに２つの異なるグリコシル化ペプチドも発注し、１つはｓｃＦｖタンパク質が結合すると文献で報告されているペプチドのＳｅｒ／Ｔｈｒアミノ酸上にＴｎ糖残基を含み、もう一つは報告によればｓｃＦｖタンパク質が結合しないセリンおよびスレオニンアミノ酸上にＴｎ糖残基を含むものであった。
文献で報告されているエピトープのセリンおよびトレオニン残基にＳＴｎ糖残基を含むビオチン化２０マーアミノ酸ペプチドもまた設計し、ＣＲＢに発注した。
これらのペプチドの配列を以下に詳細に示し、図５に表す。
まず、ＴｎＭＵＣ１（３６－２）およびＭＵＣ１（３６－４）のみのペプチドを発注した。水溶液中でのそれらの溶解度が不明であったため、これらの最初のペプチドは７５％ＤＭＳＯ／２５％ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌに再構成した。ＭＵＣ１およびＴｎＭＵＣ１ペプチドを用いた最初の実験から、アッセイに使用する前にバッファーで大幅な希釈を行っていたため、ＤＭＳＯは有害ではなかった。従って、安定性を高めるために、残りの総てのペプチド、ＳＴｎＭＵＣ１（３５－１）およびグルコシル化の異なるＴｎＭＵＣ１ペプチド（９６－１、９６－２）を後日発注し、１００％ＤＭＳＯで再構成して無菌条件下で分注した。この再構成溶液の違いは、アッセイ中のペプチドに影響を与えなかった。総てのペプチドのアリコートは、実験に使用するまで－８０℃で保存した。
Ｔ細胞の調製
凍結したＴ細胞のバイアルを室温で半解凍し、１０ｍｌの氷冷細胞培養培地に移した。Ｔ細胞を３００×ｇ、１０分間、室温で遠心分離し、１５ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁させた。遠心分離を繰り返した後、Ｔ細胞を２ｍＬの室温細胞培養培地に再懸濁させた。Ｔ細胞を計数し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌに調整した。その後、Ｔ細胞をペプチドコーティングしたプレートに加えた。
実験プロトコール
Ｔ細胞表面でのＣＡＲ検出
Ｔ細胞上のＣＡＲ発現を確認するために、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＺｓＧｒｅｅｎ発現に関して分析した。簡単に述べれば、１００μｌのＴ細胞サンプルを９６ウェルＶ底プレートに移し、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）フローサイトメーターで分析した。
ペプチドアッセイ
アッセイ１日目に、ストレプトアビジン高結合９６ウェルプレートを室温に平衡化し、１５０μｌのＰＢＳ／ウェルで３回洗浄した。ペプチドは、アッセイ用にＰＢＳで２μＭの原液濃度で調製し、その後０．５～０．００７８μＭの濃度範囲をカバーする１：２連続希釈を行った。次に、ビオチン化ＭＵＣ１ペプチドをアッセイプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを上記のように３回洗浄した。この時点で、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１００μｌ中、ウェル当たり１×１０５細胞でプレートに添加した。その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。
２日目に、プレートを３００ｇで５分間回転させた。上清を回収し、その後のＭＳＤによるＩＦＮ解析のために－８０℃で保存した。
ＭＳＤによるＩＦＮγ産生分析
保存していた上清を室温で解凍した。サンプルおよび較正物質を製造者の説明書に従って調製し、各サンプル２５μｌをＭＳＤプレートに添加した。較正物質は、プレートの反対側に二連で添加した。プレートを密封し、振盪しながら室温でインキュベートした。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｏｄｅｘｏ）で３回洗浄した。検出抗体を希釈液１００で希釈した。２５μｌの検出抗体を添加した後、プレートを密封し、室温で１．５時間振盪しながらインキュベートした。プレートを従前の通りに洗浄した。１５０μｌの２倍リードバッファーを各ウェルに添加した後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャーで読み取った。
Figure 2023520658000031
Figure 2023520658000032
データ解析
フローサイトメトリーデータ解析
データは、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔｉｆｙ ２．８．１６１８．１６３８０ソフトウエアで解析した。
ＩＦＮγデータ解析
ＩＦＮγの初期定量計算は、ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０．１２．１２（ＭＳＤ）で行った。その後、プロット解析のためにデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）に転送した。
統計解析はＲバージョン３．５．１で行った。混合モデルはｌｍｅ４パッケージを使用して適合させ、周辺平均と線形コントラストはｅｍｍｅａｎｓパッケージを使用して計算した。ランダム切片は、ドナー、プレート、および実験日に関して含まれる。濃度、処理、およびペプチドについては、固定相互作用効果が適合された。異種分散性を減らすために、濃度は逆ハイパーボリックサイン変換（ゼロを処理するため）を使用して変換され、ＩＦＮ放出はモデル化の前にｌｏｇ１０変換した。これらは、解釈可能な結果を表示するために逆変換した。逆ハイパーボリックサイン変換した濃度は、自由度４（ＡＩＣを使用して決定）の自然スプラインを使用してモデル化した。各ペプチド対の間の、非形質転換Ｔ細胞（ＵＴ）とＭＢ０２４との間のＩＦＮ放出における差（変化倍率として）の用量反応曲線間の線形コントラストを、元の実験において使用した濃度で計算し、ＦＤＲ補正したｐ値とともに変化倍率として示した。
結果
ＺｓＧｒｅｅｎ形質導入効率の分析
ＭＢ０２４およびＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞をＺｓＧｒｅｅｎタグとともに発現させ、これをＴ細胞でのＣＡＲ発現の分析に使用する。ドナー９０７７４、９２１８７および９２２０５は、２５～３０％の範囲の形質導入レベルを示した。ドナー９２８０４の形質導入はより高く、ＭＢ０２４では５５％、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔでは５８％を示す。
ドナー９０７７４からのＣＤ１９ ＣＡＲは、極めて低い形質導入率（３％）であったことに留意されたい。これは、形質導入時またはフローアッセイ時の技術的なエラーによるものである可能性がある。
ペプチド刺激ＩＦＮ－ｇの活性化
図２９は、完全グリコシル化ＴｎＭＵＣ１ペプチド（６５－１）、グリコシル化の異なるＴｎＭＵＣ１ペプチド１（９６－１）およびＳＴｎペプチド（３５－１）の存在下でのＭＢ０２４ ＣＡＲ Ｔ細胞による特定のＩＦＮγ放出を示す。このアッセイでは、ドナー間のばらつきが観察された。各ドナーについて用量反応曲線を観察した。検出された最大ＩＦＮγは、４名の異なるドナーで１０００～４０００ｐｇ／ｍＬの範囲であった。
ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチド（３６－４）と、ｓｃＦｖタンパク質が結合しないとされる(Tarp, Sorensen et al, 2007)Ｔｎ糖が存在する、グリコシル化の異なるＴｎＭＵＣ１ペプチド２（９６－２）と共培養してもＩＦＮγの放出を示さなかった。
さらに、本発明者らは、総てのドナーで、メタ分析を行った（表２４および表２５）。各Ｔ細胞群（非形質導入されたＭＢ０２４およびＣＡＲ１９）内の総てのペプチドを比較したところ、ＳＴｎＭＵＣ１（３５－１）の存在下とＴｎＭＵＣ１（６５－１）およびＴｎＭＵＣ１ペプチド１（９６－１）の存在下でＴ細胞によるＩＦＮγ放出にわずかな違いが示された。この違いは、０．０１５および０．０３μＭのペプチド濃度で、Ｐ値＜０．０００１で有意であった（表２５）。
また、Ｐ値を計算した場合も、Ｔｎ ＭＵＣ１ペプチド２（９６－２）、完全グリコシル化）ＴｎＭＵＣ１ペプチド（６５－１）およびＳＴｎ ＭＵＣ１（３５－１）の間で有意差が示され（Ｐ値＞０．０００１）；および非グリコシル化ＭＵＣ１（３６－４）とは差はなく（表２４）、ＴｎＭＵＣ１ペプチド２はＣＡＲ Ｔ細胞を活性化できないことが統計学的に確認された。
Figure 2023520658000033
Figure 2023520658000034
考察
ペプチド刺激アッセイは、（ｉ）ＴｎおよびＳＴｎ ＭＵＣ１ペプチドの存在下でのＴ細胞活性化の違い、（ｉｉ）ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲがランダムなＴｎ陽性配列を認識する能力を分析する目的で設計した。
本研究のデータは、ＳＴｎＭＵＣ１（３５－１）とＴｎＭＵＣ１（６５－１）の０．０１５～０．０３μＭという極めて低い濃度でＭＢ０２４ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出に有意差があることを示している。これは、ＭＢ０２４の生成に使用されたｓｃＦｖはＳＴｎＭＵＣ１に結合できるが、ＴｎＭＵＣ１に対するよりも親和性が低いことを示すＢＩＡＣｏｒｅアッセイのデータを裏付けるものである。しかしながら、０．０３μＭより高濃度ではこの差はなくなり、ある閾値を超えるとＭＢ０２４はＴｎまたはＳＴｎ ＭＵＣ１の存在下で等しく活性化されることを示す。
ＣＡＲの標的に対する特異性を理解することは、Ｔ細胞免疫療法の安全性のために不可欠である。ペプチド刺激アッセイの結果、ＭＢ０２４ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴｎＭＵＣ１ペプチド２（９６－２）と共培養しても活性化されなかったことを示している。このペプチドはエピトープではなく、ランダムな配列でＴｎ糖を含んでいる。次のステップは、Ｔｎ／ＳＴｎ ＭＵＣ１に対するＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲの特異性を完全に確認するために、Ｔｎグリコシル化が陽性の相同配列を評価することである。
要約すると、本研究はＢＩＡＣｏｒｅデータを裏付け、低濃度のペプチドでは、ＳＴｎ ＭＵＣ１よりもＴｎの存在下でＣＡＲがより多くのＩＦＮγを放出することを明らかにした。さらに、ランダムなＴｎ陽性配列は、ＭＢ０２４を活性化することができなかった。
実施例１３－Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１陽性および陰性標的細胞株との共培養におけるヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞候補のＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１特異性の評価
本研究の目的は、Ｔ細胞白血病細胞株ＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１およびＣＯＳＭＣを導入したＪｕｒｋａｔと共培養した際のＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を評価することにより、４つのヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞候補（ＭＢ０２１、ＭＢ０２２、ＭＢ０２４およびＭＢ０２５）の細胞表面Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１の標的特異性を確認することであった。
方法
試験的作製
ヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞の作製
ＣＡＲ－Ｔ細胞は前述のように作製した。
細胞株の作製
ＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１細胞に、ｐＧ３．ＰＧＫ．ＣＯＳＭＣ．ＩＺＷレンチウイルスベクターを４種類のＭＯＩ（１、３、５、１０）で導入し、ＣＯＳＭＣ遺伝子を発現するように改変した。フローサイトメトリーを用い、形質導入効率とＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１の細胞表面発現を評価した。ＭＯＩ １０でＣＯＳＭＣを形質導入したＪｕｒｋａｔのプール集団を選択し、次いでＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ１陰性細胞株としてＣＡＲ Ｔ細胞との共培養に使用した。
Ｔ細胞の解凍および回復
凍結したＴ細胞の１ｍＬアリコートを室温で半解凍し、次いで１５ｍＬの冷細胞培養培地に移した。Ｔ細胞を３００×ｇ、１０分間、室温で遠心分離し、１５ｍＬの冷細胞培養培地に再懸濁させた。遠心分離を繰り返した後、Ｔ細胞を２ｍＬの温（３７℃）細胞培養培地に再懸濁させた。Ｔ細胞を計数し、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。Ｔ細胞は、６ウェル平底細胞懸濁プレートにてＩＬ－２を１００Ｕ／ｍＬで含有する培地で、加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
フローサイトメトリー分析のための細胞表面Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１、ＭＵＣ－１、ＳＴｎおよびＴｎ染色
Ｊｕｒｋａｔ ＷＴおよびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋細胞株をＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。１×１０５細胞をＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１、ＭＵＣ－１、総ＳＴｎ、および総Ｔｎに関してそれぞれ染色した。Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１、ＭＵＣ－１およびＳＴｎ間接的染色；染色はＦＡＣＳバッファーで希釈した５０μＬの一次抗体で行い、４５分間、室温、暗所でインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーで希釈した５０μＬのブリリアントバイオレット４２１（商標）ヤギ抗マウス二次抗体を加え、さらに４５分間、室温、暗所でインキュベートした。細胞をさらに２回ＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：２０００に希釈したＳｙｔｏｘ Ａｄｖａｎｃｅｄ生死判定色素を含有する１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた。直接染色；染色は、ＦＡＣＳバッファーで希釈した５０μＬの抗体で行い、４５分間、室温、暗所でインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次いで１：２０００に希釈したＳｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ生死判定色素を含有する１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた。サンプルをＬＳＲＩＩサイトメーターにかけた。ＢＤ ＣＳおよびＴビーズを用いてサイトメーターの性能を評価した後にデータを採取した。
実験プロトコール
共培養の準備
共培養は、平底４８ウェルプレートにて１：１ ＣＡＲ－Ｔ：標的細胞比で２×１０５のＪｕｒｋａｔ ＷＴまたは２×１０５のＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋腫瘍細胞株のいずれかに必要数のＣＡＲ Ｔ細胞を加えることにより準備した。ＣＡＲ－Ｔ：標的細胞比は、異なるＣＡＲ Ｔ細胞間で形質導入効率を正規化したＣＡＲ－Ｔ細胞の形質入効率パーセントに基づいて算出した（実験準備のヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞生成を参照）。共培養物は、加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間の時点で２００μＬの上清を回収し、その後のサイトカイン測定のために－８０℃で冷凍した。
上清サイトカイン検出－サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイ
ＢＤ（商標）ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩおよびＢＤ（商標）ＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７を併せて１つのマルチプレックスアッセイとし、これを用いてＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの上清サイトカインレベルを分析した。各キットに提供される各サイトカインの凍結乾燥タンパク質を組み合わせ、１ｍＬの細胞培養培地（アッセイ希釈液として使用）で再構成し、アッセイ用最大標準を作製した。最大標準を細胞培養培地で１１回、連続１：２希釈し、１０，０００～０ｐｇ／ｍＬの範囲のアッセイ標準を作製した。細胞培養培地のみをアッセイバックグラウンドとして使用した。上清を、細胞培養培地を用いて１：２希釈した。各試験サンプルに関して、ＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ捕捉ビーズ（全６サイトカインの捕捉ビーズを含む）各４μＬを、ＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７捕捉ビーズ（グランザイムＢ捕捉ビーズを１：５０希釈）と組み合わせることにより、捕捉ビーズのマスターミックスを調製した。また、各テストサンプルに対して、２５μＬのＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ ＰＥ検出試薬と０．５μＬのＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７ ＰＥ検出試薬（グランザイムＢ ＰＥ検出試薬１：５０希釈）を組み合わせることにより、ＰＥ検出試薬マスターミックスを調製した。２５μＬの捕捉ビーズマスターミックスと２５μＬ のＰＥ検出試薬マスターミックスを上清５０μＬとアッセイ標準５０μＬに同時に添加した。プレートを密封し、室温、暗所で３時間振盪しながら（６００ｒｐｍ）インキュベートした。１００μＬのＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ洗浄バッファーを加えてプレートを洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離した。洗浄を繰り返した後、６０μＬの洗浄バッファーに再懸濁させ、ＬＳＲＩＩサイトメーターで測定した。ＢＤ ＣＳ＆Ｔビーズを用いてサイトメーターの性能を評価した後にデータを取得した。
Figure 2023520658000035
データ分析
フローサイトメトリーデータは、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ ７．２．１ソフトウエアを使用して解析し、プライマリーメトリクスとプロットを作成した。サイトカインビーズアレイアッセイからのメトリクスは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌとＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で解析した。結果はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いてグラフ化した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて、多項式：２次（Ｙ＝Ａ＋Ｂ＊Ｘ＋Ｃ＊Ｘ＾２）非線形曲線フィットモデルを使用して標準曲線を算出した。標準曲線からの補間を用い、上清のサイトカイン濃度をｐｇ／ｍＬで決定した。
結果
腫瘍細胞株の特性決定
Ｊｕｒｋａｔ ＷＴ（ＣＯＳＭＣ－）細胞は、Ｊｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋細胞での１％発現に比べて細胞表面Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１発現が１００％陽性であった。ＨＭＦＧ２抗体により検出されるようにＭＵＣ－１発現は、Ｊｕｒｋａｔ ＷＴ細胞株およびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋細胞株の両方で低く、それぞれおよそ１０％および５％であった。
Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１陽性腫瘍細胞に対するサイトカイン応答
４種類のヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞は総て、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１が陽性のＪｕｒｋａｔ ＷＴ（ＣＯＳＭＣ－）腫瘍細胞との共培養に応答してサイトカインおよびグランザイムＢを分泌した（図３０）。ＭＢ０２２およびＭＢ０２５ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２４時間の共培養の後に上清中に検出されるサイトカインおよびグランザイムＢレベルがより高いＭＢ０２１およびＭＢ０２４ ＣＡＲ Ｔ細胞に比べて大きい応答を示した。ＭＢ０２１およびＭＢ０２４ ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカインおよびグランザイムＢの平均放出レベルに同等のプロファイルを示す。ＭＢ０２２およびＭＢ０２５は、若干の類似性を示したが、一般にＭＢ０２５はＭＢ０２２と比較してサイトカインおよびグランザイムＢの放出が多く、全４種類のＣＡＲ構築物の中で最も高い。統計解析は行っていない。
Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１陰性腫瘍細胞に対するサイトカイン応答
４種類のヒト化ＣＡＲ Ｔ細胞は総て、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１が陰性のＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋腫瘍細胞との共培養に応答してサイトカイン放出もグランザイムＢ放出を示さなかった。Ｊｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋との共培養で検出されたサイトカインおよびグランザイムＢの両レベルは、ＣＡＲ－Ｔ細胞単独培養の場合と同等であった。ＣＡＲ構築物間で差は見られなかった。統計解析は行っていない。
考察
４つのヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞は総て、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１を発現する腫瘍細胞に対して抗原特異的な反応性を示す。評価したサイトカインに基づけば、４つのＣＡＲ Ｔ細胞は総て、高レベルのＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２ならびにランザイムＢの放出を伴った強いＴｈ１腫瘍媒介応答を示す。試験した４つのＣＡＲ構築物のうち、ＭＢ０２５は、抗原刺激に対して全体的に最も大きな応答を示し、特に多量のグランザイムＢを産生した。
抗原特異性を示すことに加え、４種類のヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１陰性細胞に対して標的外反応を示さず、サイトカインおよびグランザイムＢのレベルは単独培養のＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。このことを考え合わせると、４種類のヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞候補は総て、このシステムにおいて有効かつ安全であることが証明される。
ＣＯＳＭＣは、Ｔ合成酵素機能に必要なＴ合成酵素シャペロンタンパク質である。Ｔ合成酵素は、Ｔｎ抗原を正常細胞特有の複雑なＯ－グリカン構造に伸長させる触媒となる。ＣＯＳＭＣを導入すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞における内因性のＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ１発現が消失した。これは、正常細胞のグリコシル化を回復させた結果としてのＴｎおよびＳＴｎ発現の消失を介するものであった。Ｔｎ／ＳＴｎ糖型の消失とそれに続くＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１発現の消失は、４種類のＣＡＲ－Ｔ細胞総ての活性化を抑制し、このことは、これらのＣＡＲの特異性が、部分的にはＴｎおよび／またはＳＴｎの認識によって駆動されていることを示している。興味深いことに、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞をＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞（またＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ１－）で刺激すると、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５は非特異的応答を示したが、ＭＢ０２１もＭＢ０２４も２４時間の共培養後に高レベルのＩＦＮγおよびグランザイムＢを産生していないことが示された。ＭＣＦ７細胞におけるＭＵＣ－１のノックアウトは、ＭＣＦ７ ＷＴ細胞に通常発現しているＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１の認識が、ＭＵＣ－１の発現消失により根絶されるというＣＡＲ特異性を研究するためのモデルを提供する。しかしながら、ＭＵＣ－１が存在しないため、グリコシル化の異常ならびに他のタンパク質（他のムチンなど）上のＴｎおよびＳＴｎの発現の可能性には対処できない。従って、ＭＣＦ７ ＭＵＣ－１ ＫＯ細胞に対するＭＢ０２２およびＭＢ０２５の反応性は、ＭＵＣ－１以外の他のタンパク質上のＴｎまたはＳＴｎを認識した結果であり得る。このことは、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５がＪｕｒｋａｔ ＷＴ細胞に対して、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４に比べて高いサイトカインおよびグランザイムＢ応答を示したことを説明し得る。
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１発現の特性決定に加えて、総ＭＵＣ－１発現も測定した。総ＭＵＣ－１発現は、Ｊｕｒｋａｔ ＷＴ（ＣＯＳＭＣ－）およびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ＋細胞の両方において、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１発現よりも実質的に低いことが示された。総ＭＵＣ－１は、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１と同等以上のレベルで発現していると予想された。しかしながら、これはＪｕｒｋａｔｓ細胞で一貫して観察されていたことである。ＭＵＣ－１発現を決定するために使用されるモノクローナル抗体であるＨＭＦＧ２は、ＭＵＣ－１ペプチドＤＴＲモチーフの認識を介して特異性を駆動し、一方、５Ｅ５はＭＵＣ－１ペプチド上のＴｎ／ＳＴｎグリカンに特異的なグリコペプチドエピトープを認識している。総ＭＵＣ－１とＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１の間の相違は、ＨＭＦＧ２と５Ｅ５の、ＭＵＣ－１に対する異なる結合エピトープに関係している可能性が高い。他の細胞株ではＨＭＦＧ２の使用がより予測しやすかったため、ＨＭＦＧ２結合の欠如はＪｕｒｋａｔｓに内在するものである可能性もある。ＭＵＣ－１のクラスター化、立体配座またはペプチド配列は総てが要因である可能性がある。また、ＨＭＦＧ２の結合はＭＵＣ１のグリコシル化状態によって影響を受けることも示されている。このことにも関わらず、ＭＵＣ－１上のＴｎ／ＳＴｎに対する５Ｅ５の特異性に基づけば、ＭＵＣ－１はＪｕｒｋａｔ細胞上で発現し、Ｔｎ／ＳＴｎ糖型で異常にグリコシル化されていると確信できる。
これらのことを考え合わせ、本発明者らは、４種類のヒト化５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ－１陽性の腫瘍細胞に対する強いＴｈ１応答を証拠として、極めて強力であることを示した。さらに、総てが、細胞は正常組織に固有の複雑なグリカンを腫瘍特異的な末端切断型のＴｎ／ＳＴｎ糖型から識別する。
実施例１４－ヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ産物の多機能性評価
本研究の目的は、抗原刺激に応答して、インターロイキン－２（ＩＬ２）、タイプＩＩインターフェロン（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびグランザイムＢ（Ｇｒｚ Ｂ）を含む一連の機能的サイトカインを分泌するＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を評価することである。ヒト化ＣＡＲ産物の完全なサイトカインプロファイルを構築するために、細胞表面、細胞内染色（ＩＣＳ）、上清サイトカイン測定を一緒に行う精密なプロトコールを設計した。ＩＣＳを使用して、陽性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（陰性細胞株ＭＣＦ７－ＫＯと比較）との共培養２４時間後のＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が分泌し得るエフェクター（ＧｒｚＢ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）および刺激（ＩＬ－２）サイトカイン発現レベルを調べた。サイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）およびＬｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８との共培養２４時間後の上清中のＧｒｚＢ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２（およびＣＢＡアッセイ用の追加サイトカインとしてＩＬ－４、６、１０）の実際の分泌サイトカイン量を相関させた（ＭＣＦ７－ＫＯと比較）。
方法
実験準備
Ｔ細胞の解凍および回復
供試Ｔ細胞は、形質導入後１２日目の非形質未導入Ｔ（ＵＴ）およびＨｕＣＡＲ０２１、０２２、０２４、０２５（構築物でｚｓＧｒｅｅｎ遺伝子を発現するヒト化型のＴｎＭＵＣ１ ５Ｅ５ ＣＡＲ Ｔ）細胞である。３名のドナー（ｎ＝３）から得た凍結精製ヒト化ＣＡＲ Ｔ細胞の１ｍＬアリコートを室温で半解凍し、次いで１５ｍＬの冷細胞培養培地に移した。Ｔ細胞を３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離し、１５ｍＬの冷細胞培養培地に再懸濁させた。遠心分離を繰り返した後、Ｔ細胞を２ｍＬの温（３７℃）細胞培養培地に再懸濁させた。Ｔ細胞を計数し、細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。Ｔ細胞は、６ウェル平底細胞懸濁プレートにて、ＩＬ－２を１００Ｕ／ｍＬで含有する培地中、加湿インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
腫瘍細胞の播種および共培養の準備
ヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞を採取し、温細胞培養培地に再懸濁させ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞を、ヒト化ＣＡＲ Ｔ細胞を加える前に６ウェルプレートにウェル当たり１×１０６細胞として播種し、一晩置いた。共培養のために、腫瘍細胞を含む６ウェルプレートに、エフェクター：標的比１：１として、非形質導入Ｔ細胞または形質導入ｈｕＣＡＲ Ｔ細胞を加えることでプレートを準備した。Ｔ細胞の正確な量は、各ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率のパーセンテージに基づいて計算し、この場合、形質導入効率は、ＵＴ細胞を加えることによって、４種類のヒト化ＣＡＲ－Ｔ構築物総ての最低パーセンテージに対して正規化した。形質導入効率は、フローサイトメトリー分析によって決定されたｚｓＧｒｅｅｎ陽性細胞の％として示す。共培養は、加湿インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。翌日、５００μＬの上清を回収し、次いでその後のサイトカイン解析のために－８０℃で冷凍した。次に、細胞内タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）をＴ細胞単独および共培養サンプルに１：２０００希釈で添加し、細胞内サイトカイン染色を可能にした。さらに、３７℃、５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベーションを行った。その後、各サンプル中の全細胞を回収し、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン染色を行った。
染色した同日にＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞のさらなるウェルに播種し、播種２４時間後の細胞表面Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現を評価した。また、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞は、播種時のＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現についても特性を評価した。
細胞表面Ｔｎ／ＳＴｎＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ細胞を培養フラスコから剥離し、次いでＤＰＢＳで２回洗浄した。次に１×１０５細胞を、ＦＡＣＳバッファーで希釈した一次抗体５０μＬを加えて細胞表面のＴｎ／ＳＴｎＭＵＣ１およびＭＵＣ１をそれぞれ染色し、室温、暗所で４５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーで希釈したブリリアントバイオレット４２１（商標）ヤギ抗マウス二次抗体５０μＬを加え、さらに４５分間、室温、暗所でインキュベートした。細胞をＤＰＢＳでさらに２回洗浄し、次いで１：２０００に希釈したＳｙｔｏｘ Ａｄｖａｎｃｅｄ生死判定色素を含有する１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた後、５－レーザーＬＳＲ ＩＩサイトメーターで測定した。
サイトメーターの設定および補正
ＣＳ＆Ｔビーズを使用して、毎日、サイトメーターの性能を評価し、各時点における調整されたデータ取得のための正確なアプリケーション設定を通知した。補正は、各抗体の蛍光色素コンジュゲートで個別に染色したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｍｐ ｅＢｅａｄｓを使用して、ＦＡＣＳＤｉｖａでサンプルデータを取得する前に計算した。
実験プロトコール
Ｆｃのブロッキングおよび細胞表面染色
細胞を回収した後、総てのサンプルをＤＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＰＢＳで１：２０００希釈した１００μＬの生死判定色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色し、室温、暗所で１５分間インキュベートした。染色後、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した。次に、Ｆｃ受容体のブロックは、１：５０希釈した過剰量の無関係なヒトＩｇＧアイソタイプ対照（原液濃度：５ｍｇ／ｍＬ）を含む４０μＬのＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁させ、室温、暗所で１５分間インキュベーションすることにより行った。次に、ＦＡＣＳバッファーに希釈したＣＤ３およびＣＤ８抗体－蛍光色素コンジュゲートを含む２倍濃縮抗体カクテル４０μＬを添加して、暗所、室温で３０分間、ＣＡＲ－Ｔ細胞を染色した。
細胞内サイトカイン染色
細胞表面染色インキュベーションの後、ＣＡＲ Ｔ細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、１００μＬのＢＤ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー中、４℃、暗所で２０分間固定した。その後、ＣＡＲ Ｔ細胞を１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで洗浄して透過処理を施した。次に、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで希釈した総ての細胞内サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧｍｚＢ）抗体－蛍光色素コンジュゲートを含む５０μＬの抗体カクテルで染色し、暗所、室温で４５分間インキュベートした。ＣＡＲ Ｔ細胞は、２００μＬのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーでさらに２回洗浄した後、１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた。サンプルはＬＳＲＩＩサイトメーターで分析した。
サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイを用いた上清サイトカインの検出
ＢＤ（商標）ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩとＢＤ（商標）ＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７を組み合わせて１つのマルチプレックスアッセイとし、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの上清サイトカインレベルを分析するために使用した。凍結上清を室温で解凍した。アッセイ最大標準は、各キットに提供される各サイトカインの凍結乾燥タンパク質を組み合わせ、１ｍＬの細胞培養培地で再構成することにより調製した（アッセイ希釈液として使用）。アッセイ最大標準を細胞培養培地で連続希釈してアッセイ標準を作製した。５０μＬの上清およびアッセイ標準をアッセイのために９６ウェル、Ｖ底プレートに移した。各試験サンプルに関して、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ捕捉ビーズ各４μＬおよび０．５μＬのＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７捕捉ビーズ（グランザイムＢ捕捉ビーズは１：５０希釈）を合わせることにより、７つ総てのサイトカインの捕捉ビーズを含む捕捉ビーズマスターミックスを作製した。また、各試験サンプルに関して、２５μＬのＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ ＰＥ検出試薬および０．５μＬのＣＢＡヒトグランザイムＢフレックスセットＤ７ ＰＥ検出試薬（グランザイムＢ ＰＥ検出試薬は１：５０希釈）を合わせることでＰＥ検出試薬マスターミックスを作製した。２５μＬの捕捉ビーズマスターミックスおよび２５μＬのＰＥ検出試薬マスターミックスを上清およびアッセイ標準に同時に添加した。プレートを密封し、室温、暗所で３時間振盪（６００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。１００μＬのＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ洗浄バッファーを加え、３００×ｇで５分間遠心することでプレートを洗浄した。洗浄を繰り返した後、６０μＬの洗浄バッファーに再懸濁させた後、ＬＳＲＩＩサイトメーターで測定した。
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを用いた上清サイトカインの検出
抗原標準セットは、アッセイキットに提供されているＰＣＲ ８チューブストリップを用いて４倍連続希釈で再構成した。９６ウェルプレートをハンドヘルドマグネティックプレートウォッシャーに取り付けた。磁性ビーズ溶液をまず３０秒間ボルテックスで撹拌し、５０μＬのビーズ溶液をプレートに加え、１５０μＬの洗浄バッファー（１倍）で１回洗浄した。プレートをハンドヘルドマグネティックプレートウォッシャーから取り出し、各ウェルに５０μＬの標準、対照またはサンプルを加え、密封し、室温で１２０分間振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレートをハンドヘルドマグネティックプレートウォッシャーに戻し、１５０μＬの洗浄バッファー（１倍）で２回洗浄した。次に、２５μＬの検出抗体混合物を加え、密封し、プレートシェーカー上、室温、５００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。プレートをハンドヘルドマグネティックプレートウォッシャーに戻し、１５０μＬの洗浄バッファー（１倍）で２回洗浄した。５０μＬのストレプトアビジン－ＰＥ溶液を加え、密封し、プレートシェーカー上、室温、５００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。最後に、プレートをハンドヘルドマグネティックプレートウォッシャーに戻し、１５０μＬの洗浄バッファー（１倍）で２回洗浄し、次いで１２０μＬのリーディングバッファーを各ウェルに加え、密封し、室温で５分間振盪した後、データ取得のためにＬｕｍｉｎｅｘ（商標）装置「Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ３Ｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ」に置いた。
データ解析
フローサイトメトリーデータは、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ ７．２．１ソフトウエアを用いて解析し、プライマリーメトリクスおよびプロットを作成した。メトリクスは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で解析した。ゲートの設定：ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットは、形質導入された（ＺｓＧｒｅｅｎ＋）Ｔ細胞集団と形質導入されていない（ＺｓＧｒｅｅｎ－）Ｔ細胞集団とで比較した。ＣＡＲ Ｔ細胞については、形質導入された集団のみのデータが示されている。蛍光強度のパーセンテージと中央値は、主要なメトリクスとしてエクスポートし。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して、４名のドナーの結果を表すメトリクスをグラフ化した。
ＣＢＡアッセイの場合：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７ソフトウエアを使用し、多項式：２次（Ｙ＝Ａ＋Ｂ＊Ｘ＋Ｃ＊Ｘ＾２）非線形曲線フィットモデルを用いて標準曲線を算出した。
標準曲線からの補間を用いて、サイトカイン濃度をｐｇ／ｍＬとして決定した。
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの場合：Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰｏｎｅｎｔ ｖ４．２ソフトウエアを使用してマシンのデータ取得し、ＢｉｏＰｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ６．１を使用して標準曲線の作成と標準曲線からの補間によるサンプル濃度（ｐｇ／ｍＬ）の算出を含むデータを解析した。グラフ化は、サンプル比較用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ行った。
結果
形質導入効率（ＴＥ）およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋比
両方の腫瘍細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ７ ＭＵＣ１ ＫＯ）と２４時間共培養した後の４種類のＨｕＣＡＲｓ総てについて、単一培養サンプルと比較してＴＥ（ｚｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率％に基づく）にわずかな減少がある（図３１、Ａ左および中央のチャート）。そして、両方の腫瘍細胞株と２４時間共培養した後の４種類のＨｕＣＡＲｓ総てについて、単一培養サンプルと比較して、形質導入されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋比について明らかな変化はない。しかしながら、非形質導入Ｔ細胞サンプルでは、より多くのＣＤ８＋細胞が存在し（約７０％）、一方、総ての形質導入サンプルでは大部分の細胞がＣＤ４＋細胞である（図３１、Ａ右のチャート）。
細胞内サイトカイン分析
サイトカインの発現レベルを評価するために、Ｔ細胞を単独培養またはＴｎＭＵＣ１陽性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８または陰性細胞株ＭＣＦ７－ＫＯのいずれかと共培養した後４時間の時点で細胞内染色を行った。発現レベルは、中程度の蛍光強度（ＭＦＩ）の観点から、細胞の陽性率％および陽性度により評価した（図３１、ＢおよびＣ）。全体として、４種類のｈｕＣＡＲは総て、ＭＢＡ－ＭＢ－４６８によるＴｎＭＵＣ１特異的抗原刺激に反応して、試験した総てのサイトカインについて同様の発現パターンを示す。腫瘍細胞の不在下（すなわち、Ｔ細胞単独）での、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５からの応答は、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４よりわずかに高い。特に、ＩＬ－２はＣＤ８＋サブセットと比較して、ＣＤ４＋サブセットで約２倍のＴｎＭＵＣ１誘導特異的発現量％を示す。ＩＦＮγは、ＣＤ４＋サブセットと比較して、ＣＤ８＋サブセットで約２倍のＴｎＭＵＣ１特異的発現量を示す。ＴＮＦαは、ＣＤ４＋サブセットとＣＤ８＋サブセットの両方で同様の傾向を示す。グランザイムＢは、予想通り総てのＣＤ８＋サブセットで主要に発現し、１名のドナー７４は、刺激がない場合でもグランザイムＢの高い構成的レベルを示した。ＭＣＦ７－ＫＯ株に対する応答は、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４についてはＭＤＡ－ＭＢ－４６８と同等であったが、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５による応答は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞ともに総てのサイトカインおよびグランザイムＢでＭＣＦ７－ＫＯ株に対しておよそ２倍高かった。ＭＦＩでは、グループ間で同様の傾向が見られたが、発現率％として示されたデータと比較すると、効果はより緩やかで変動があった。
上清サイトカイン分析
Ｔ細胞が上清中に分泌した実際のサイトカイン分泌量を評価するために、本発明者らは２つの技術、すなわちサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイを用いた（図３２Ａ～３２Ｂ）。全体として、両アッセイとも、腫瘍細胞の不在下で培養したｈｕＣＡＲと比較して、このＴｎＭＵＣ１陽性細胞株と共培養した後、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８によるＴｎＭＵＣ１特異的抗原刺激に応答して、４種類のｈｕＣＡＲ総てがサイトカインを分泌したことを示した。しかしながら、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５は、ＴｎＭＵＣ１陰性細胞株ＭＣＦ７－ＫＯと共培養した場合、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４よりも比較的高い応答を示した。
ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの分泌レベルは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８と共培養したＴｎＭＵＣ１特異的活性化後のＣＡＲ－Ｔ細胞間で同等であり、これはＵＴおよびＴ細胞単独サンプルよりも有意に高いものである。特に、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞と共培養した４種類のＨｕＣＡＲでは、他のどのサンプル条件よりも有意に高いＩＬ－６の分泌が見られる。ＣＢＡアッセイおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイ系の両方を使用しても同様の結果が見られた。
腫瘍細胞株の特徴
本アッセイに用いた細胞株の特性決定を行うために、本発明者らはまた、ＩＣＳおよび上清採取の前に、５Ｅ５－ＣＢ抗体によるＴｎＭＵＣ１発現レベルおよびＨＭＦＧ２抗体によるＭＵＣ１発現レベルの評価も行った。フローサイトメトリー分析の結果は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は約１０％のＴｎＭＵＣ１陽性細胞を含み、ＭＣＦ７－ＫＯ細胞はＭＵＣ１およびＴｎＭＵＣ１発現ともに陰性であることを示した（図３３）。
考察
ＣＡＲ Ｔ療法の成功は、一定範囲のエフェクター細胞およびメカニズムが関与する幅広い免疫反応に依存している。ＣＡＲ Ｔ細胞療法の範疇で極めて多機能なＴ細胞は臨床応答と有意に関連することが報告されている。最近の研究では、多機能で疲弊していないＴ細胞、特に幹細胞メモリー細胞が、治療の長期持続に不可欠であることが示された。本発明者らは、ヒト化ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の、刺激性サイトカイン－ＩＬ－２、エフェクターサイトカイン－ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよび細胞障害性グランザイム－ＧｒＢを含む４つの機能性サイトカインを分泌する能力を評価した。本発明者らは、ＴｎＭＵＣ１陽性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株または陰性ＭＣＦ７－ＫＯ細胞株のいずれかと共培養することにより、抗原刺激に応答したそれらの分泌レベルを比較した。単一培養サンプルを基底レベルの比較として使用した。本発明者らは、細胞表面、細胞内染色（ＩＣＳ）および上清サイトカイン測定を組み合わせて、本発明者らのヒト化ＣＡＲ産物の完全なサイトカインプロファイルを構築した。ＩＣＳを使用して、本発明者らのＴ細胞産物が分泌し得るＩＬ－２、ＧｒｚＢ、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを、陽性および陰性細胞株との共培養後２４時間で調べた。サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）およびＬｕｍｉｎｅｘアッセイを用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ７－ＫＯ細胞との共培養後２４時間の上清中のこれらのサイトカインの実際のサイトカイン分泌量を相関させた。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞と共培養した４種類のＨｕＣＡＲ総てで、他のどのサンプル条件よりも炎症性サイトカインＩＬ－６の分泌が明らかに多かったことから、もしそれがＴ細胞により分泌されるのであれば、その抗腫瘍の役割を示している可能性がある。しかし、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞自体により分泌されている可能性もある。ＩＬ－６は多機能サイトカインであり、その幅広い免疫および造血活性と急性期応答を誘導するその強力な能力のために、宿主防御において中心的な役割を果たす。多くの証拠が、ＩＬ－６は活発な免疫応答中のリンパ球の活性化、増殖および生存に重要な役割を果たすものであることが確立されている。
試験した４種類のＨｕＣＡＲに対するＴ細胞多機能性アッセイの一般的な要約を、以下の表２６に示す。この表は、細胞が細胞内で分泌できるものと上清中の実際の分泌物を考慮した上で、検討した４種類のサイトカインの総発現レベルを示したものである。全般的な一貫した傾向は、細胞の分泌能力が高いほど、上清中の実際の分泌量が多くなることである。本発明者らは、ＭＢ０２２およびＭＢ０２５は、ＭＵＣ１およびＴｎＭＵＣ１の発現が見られない陰性細胞株ＭＣＦ７－ＫＯに対して極めて高い非特異性を有していることを認めた。これに対して、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＭＵＣ１陰性細胞株であるＭＣＦ７－ＫＯと共培養した場合に分泌されるサイトカインレベルが有意に低くなることから明らかなように、ＭＢ０２１およびＭＢ０２４はＴｎＭＵＣ１に対して比較的高い特異性を示した。
Figure 2023520658000036
細胞表面の表現型バイオマーカーを分析するとともに重要なサイトカインの複雑な多機能性を理解することは、ＣＡＲ Ｔ療法における患者の応答とそれらの関係を特定するのに役立つ。例えば、ＩＬ－２はｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＲ Ｔ細胞を補助することができ、前臨床試験および多くの臨床試験で試験されているが、実際にＴｒｅｇを優先的に活性化し、その増殖を誘導する可能性があることが報告されている。これらのデータは、ＣＡＲ Ｔ療法におけるＩＬ－２の複雑な役割を強調している。多機能性をＴ細胞亜集団と相関させる他の研究では、多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＦＮγ＋／ＩＬ２＋／ＴＮＦα＋）が膀胱癌患者の無再発生存と有意に関連することが示された。さらに、高多機能性Ｔ細胞は、それらの増殖能とアポトーシス率に相関するはずである。例えば、高多機能性メモリーＴ細胞は、おそらく、多くのサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２など）を同時に産生することから、細胞溶解能を持ち、旺盛に増殖し得ることが報告されている。また、これらの細胞はかなりの生存能力を持ち、抗原がなくても長期維持される。
さらに、多機能性強度指数のような測定値を用いることで、高次元の単細胞タンパク質分泌データを、検討したサンプルの全体的な活性を表す単一の指標に統合することができる。これらの測定値は、最終的に主選択を強化する、ＣＡＲ Ｔ細胞サブセットと治療機序との潜在的な相関関係を明らかにする。
実施例１５：腫瘍細胞株に応答したＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖
ＣＡＲ Ｔ療法に対する臨床応答は、注入後の操作Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで堅牢な拡大増殖および持続に部分的に寄与し得る。このため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の潜在的な治療効力を測定するために、増殖を利用することができる。本研究の目的は、Ｔｎ／ＳＴｎ－ＭＵＣ１抗原（「Ｔｎ－ＭＵＣ１」）を発現する腫瘍細胞株に対するＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を決定することであった。
方法
実験準備
ＣＡＲ Ｔ細胞の作製および調製
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、従前に記載されているように作製した。
フローサイトメトリーによる細胞表面Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＭＵＣ１およびＢＣＭＡ発現
細胞株ＰＣ３（ＣＯＳＭＣ ＫＯ）５Ｆ５クローン（ＰＣ３ ５Ｆ５）、ＰＣ３ ＷＴおよびＡＲＨ７７クローン１０Ｂ５（ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ）を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで培養フラスコから剥離し、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．５％アジ化ナトリウム）で洗浄した。次に、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、染色準備のためにＦＡＣＳバッファー中に１×１０６細胞／ｍＬとなるように再懸濁させた。１×１０５細胞をＴｎ－ＭＵＣ１、ＭＵＣ１（ＨＭＦＧ２）およびＢＣＭＡに関してそれぞれ染色した。Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＭＵＣ１の間接染色：染色はＦＡＣＳバッファーに希釈した５０μＬの一次抗体で行い、４℃、暗所で４５分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーに希釈した５０μＬのブリリアントバイオレット４２１（商標）ヤギ抗マウス二次抗体を加え、４℃、暗所でさらに４５分間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳでさらに２回洗浄した後、１：２０００希釈したＳｙｔｏｘ ｏｒａｎｇｅ生死判定色素を含有する１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた。ＢＣＭＡの直接染色：染色はＦＡＣＳバッファーに希釈した５０μＬの抗体で行い、４℃、暗所で４５分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、１：２０００希釈したＳｙｔｏｘオレンジ生死判定色素を含有する１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた。サンプルをＣｙｔｏＦＬＥＸサイトメーターで測定した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＱＣビーズを用いてサイトメーターの性能を評価した後データを取得した。
実験プロトコール
ＣＡＲ Ｔ／ＵＴ Ｔ細胞のＶＰＤ４５０増殖色素標識
Ｔ細胞は、低ＩＬ－２で４８時間培養後、１５ｍＬファルコンに採取した。次に、Ｔ細胞を１０ｍＬダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水バッファー（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、計数し、ＤＰＢＳで１０×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。ＤＰＢＳに希釈した４μＭ（２倍）濃度のＶＰＤ４５０増殖色素を、最初の細胞懸濁液の２倍の量になるようにＴ細胞に加えた（ＶＰＤ４５０の終反応濃度は２μＭ）。非標識のＴ細胞対照は、ＤＰＢＳのみでインキュベートした。Ｔ細胞は、ＶＰＤ４５０とともに、３７℃で１５分間、遮光してインキュベートした。インキュベーション後、Ｔ細胞を１０ｍＬのＤＰＢＳで１回、次いで、１０ｍＬの室温共培養培地で洗浄した。Ｔ細胞を共培養培地で１５分間インキュベートしてＶＰＤ４５０色素の酢酸加水分解を行った後、標的細胞との共培養として播種した。
共培養の準備
共培養は、平底４８ウェル細胞培養処理プレートにて、１：１のＣ：Ｔ比で行った。Ｃ：Ｔ比は形質転換効率％に基づいて計算し、形質転換効率は異なるドナーおよび構築物間で正規化された。ＣＡＲ Ｔ／ＵＴ Ｔ細胞添加の２４時間前に、抗原発現レベルが高い（ＰＣ３ ５Ｆ５）または低い（ＰＣ３ ＷＴおよびＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ）３種類のＴｎ－ＭＵＣ１陽性癌細胞株から、１ウェル当たり３．３３×１０５の腫瘍細胞を播種した。ＭＢ０５３ ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＵＴ Ｔ細胞を０時点で腫瘍細胞株に添加し、加湿インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２で９６時間共培養した。非特異的ＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞対照では、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡＣＴビーズをＣＡＲ Ｔ／ＵＴ Ｔ細胞に１：５０の終アッセイ希釈で添加した。
Ｔ細胞の表現型分析－フローサイトメトリー
ＣＡＲ Ｔ／ＵＴ Ｔ細胞を共培養から１５ｍＬファルコンチューブに採取し、セルカウンターを用いて細胞密度求めた。９６ウェルＶ底プレートに各条件につき２×１０５細胞を播種し、３００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞をＤＰＢＳで洗浄した。洗浄を繰り返した後、ＦＡＣＳバッファーで１：５０希釈した４０μＬのＴｒｕｓｔａｉｎ ＦｃＸ中、室温で１５分間、ヒトＦｃ受容体ブロックを行うことでＦｃ受容体をブロックした。続いて、ＦＡＣＳバッファーで希釈した２倍濃度の抗Ｆａｂ（２）４０μＬを加えて細胞を染色した。細胞を抗ｆａｂ（２）とともに暗所、室温で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、抗Ｆａｂ（２）検出のためにＣＤ３、ＣＤ８およびＢＣＭＡ形質転換マーカーを含有する４０μＬの抗体カクテルとストレプトアビジンＰＥ二次抗体で染色した。細胞を暗所、室温で３０分間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳでさらに２回洗浄し、１：２０００希釈したＳｙｔｏｘグリーンを含有する１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁させた。Ｔ細胞は、ＢＤ Ｘ－２０フローサイトメーターで読み取る前に、Ｓｙｔｏｘグリーンとともに１５分間、室温、暗所で１５分間ンインキュベートした。サイトメーターセットアップおよびトラッキング（ＣＳ＆Ｔ）ビーズを使用してサイトメーターの性能を評価した。補正は、各抗体の蛍光色素コンジュゲートで染色したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｕｌｔｒａ Ｃｏｍｐ ｅＢｅａｄｓを用いて、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａでサンプルデータを取得する前に計算した。フローサイトメトリーデータは、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃ ７．２．１ソフトウエアを用いて分析した。
結果および考察
抗原刺激に応答したＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞増殖
ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔｎ－ＭＵＣ１発現癌細胞株と共培養した際に一貫して堅牢な増殖を示し、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖レベルは、癌細胞上のＴｎ－ＭＵＣ１発現の程度によって定義した。
ＣＯＳＭＣのノックアウトにより、低Ｔｎ－ＭＵＣ１発現細胞株（ＰＣ３ ＷＴ）から高Ｔｎ－ＭＵＣ１発現細胞株（ＰＣ３ ５Ｆ５）を作製した。ＣＯＳＭＣは、正常細胞においてＴｎ抗原の伸長に関与する重要な酵素であるＴ合成酵素の分子シャペロンである。その結果、Ｔ合成酵素の機能を欠くＰＣ３ ５Ｆ５細胞は、細胞表面に高レベルのＴｎ－ＭＵＣ１を発現する。ＰＣ３ ５Ｆ５、ＰＣ３ ＷＴ、およびＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ癌細胞株は総て、様々な程度でＴｎ－ＭＵＣ１を細胞表面に発現していた。ＰＣ３ ５Ｆ５細胞の９６．０％がＴｎ－ＭＵＣ１に対して陽性であった。比較すると、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡおよびＰＣ３ ＷＴ細胞は、それぞれ２．９７％および１．８９％がＴｎ－ＭＵＣ１陽性であるにすぎなかった。Ｔｎ－ＭＵＣ１の相対発現量も、ＰＣ３ ５Ｆ５ではＰＣ３ ＷＴに比べて有意に高かった。ＢＣＭＡは、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞では９８．３％に発現していたが、ＰＣ３ ５Ｆ５およびＰＣ３ ＷＴ細胞ではＢＣＭＡが陰性であった（バックグラウンドと同程度）。３種類の細胞株は総てＭＵＣ１を発現していた。ＰＣ３ ＷＴおよびＰＣ３ ５Ｆ５は、それぞれ８１．８％および９４．５％の細胞がＭＵＣ１陽性で、同程度の発現量であった。ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞は、６５．９％で低いレベルのＭＵＣ１を発現していた。
Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞株ＰＣ３ ５Ｆ５での刺激に応答して、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の平均９２％が増殖した（図３４）。これに対し、対照ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＵＴ Ｔ細胞は、ＰＣ３ ５Ｆ５との共培養では増殖せず（それぞれ７％および２％の増殖）、単独培養した場合と同等であった。Ｔｎ－ＭＵＣ１抗原に応答したＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖は、ＴｒａｎｓＡＣＴによるＴＣＲを介した刺激と同等であることも示された（約９５％）。ＣＤ３／Ｃ２８を介した刺激に対する増殖応答は、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＢＣＭＡ ＣＡＲ ＴおよびＵＴ Ｔ細胞で同等であった。
ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖の程度をさらに理解するために、分裂指数（ＤＩ）、増殖指数（ＰＩ）および拡大倍率を算出した。ＤＩは、分裂細胞と非分裂細胞の集団全体の平均分裂回数を算出したものである。ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞はＰＣ３ ５Ｆ５で刺激した際に平均２回の細胞分裂を起こしたのに対し、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＵＴ Ｔ細胞は同じ細胞株で刺激した際にそれぞれ０．０４および０．０２回の細胞分裂を起こした。ＰＣ３ ５Ｆ５に応答したＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＤＩは、ＢＣＭＡ陽性ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞株またはＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞で刺激したＢＣＭＡ ＣＡＲ ＴのＤＩよりも高かった（それぞれＤＩ １．５および１．６）。ＤＩは、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＰＣ３ ５Ｆ５に応答して４．８倍の拡大を示したのに対し、ＴｒａｎｓＡＣＴで刺激した場合は４．２倍の拡大であり、全体的な拡大にも同様に反映された。Ｔｎ－ＭＵＣ１に応答してＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ８ ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の間には有意な増殖差はなく、ＣＤ４／ＣＤ８比は、ＣＡＲ Ｔ培養単独またはＴｒａｎｓＡＣＴで刺激した場合に比べて大きな違いはなかった。
また、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞およびＰＣ３ ＷＴ細胞（両方とも低レベルのＴｎ－ＭＵＣ１を発現する）との共培養でも部分的に増殖することが示された（それぞれ２．９７％および１．８９％）。ＰＣ３ ５Ｆ５での刺激に対するＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖率は９２％であるのに対し、ＰＣ３ ＷＴに応答した増殖率はわずか２０％であり、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞での刺激に対する増殖率は８０％であった。しかし、ＰＣ３ ＷＴ細胞に応答して増殖するＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔの割合が少ないため、単独で培養したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＤＩ（ｐ＝０．１０１）にも全体的な拡大（ｐ＝０．４１７）にも有意な増加は起こらなかった。ＤＩはシステム全体（応答性および非応答性ＣＡＲ Ｔ細胞）の増殖を測定するため、ＤＩの低さは、応答性のＣＡＲ Ｔ細胞で観察される増殖の程度（反応性細胞のみを考慮する増殖指数で明らか）が低いこと、ならびに応答可能なＣＡＲ Ｔ細胞の割合が低いことを反映している。
このことは考え合わせると、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＰＣ３ ＷＴに対して全体的に弱い増殖応答を示す。しかしながら、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞による刺激は、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の２倍の増殖を誘導し、ＰＣ３ ５Ｆ５刺激と比較して低いものの、ＤＩに有意な増加が見られた（ＰＣ３ ５Ｆ５ ＤＩ＝２対ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ ＤＩ＝０．６）。興味深いことに、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞は、ＰＣ３ ＷＴまたはＰＣ３ ５Ｆ５のいずれの共培養でも観察されなかったＵＴ Ｔ細胞増殖を誘導することができた（図３４）。Ｔ細胞増殖に対するＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞のバックグラウンド効果を考慮すると、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ刺激に対するＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖は、依然としてＰＣ３ ＷＴの場合よりも有意に大きかった（図３４）。
ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞に応答したＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖は、Ｔｎ－ＭＵＣ１発現レベルが同等であるにもかかわらず、ＰＣ３ ＷＴ細胞の場合と大きく異なっていた（それぞれ２．９７％対１．８９％）。ＰＣ３ ＷＴ細胞とＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞に応答して見られたＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖の違いは、Ｔｎ－ＭＵＣ１抗原とは無関係に、腫瘍とＴ細胞の相互作用に影響を与える細胞株の特性に関連していると思われる。
これらのことを考え合わせると、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔｎ－ＭＵＣ１抗原による刺激に応答して抗原依存的に増殖を示し、これはＴｒａｎｓＡＣＴによる抗原非依存的ＴＣＲを介した刺激と同等であった。
抗原刺激ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現およびＣＤ４／ＣＤ８比
ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖の評価に加えて、Ｔ細胞上のＣＡＲ発現を、標的細胞株との共培養の前後にモニタリングした（図３５Ａ～３５Ｃ）。
ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞上のＣＡＲの発現は、抗原刺激の強さに影響を受けた。強い抗原刺激では、ＣＡＲの下方調節が誘導されたのに対し、中程度～低い抗原刺激では４日間の刺激の後にＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞のＴ細胞表面におけるＣＡＲ発現が上方調節された。ＰＣ３ ＷＴで刺激したＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴｒａｎｓＡＣＴで刺激したＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の間では、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を単独培養した場合のＣＡＲレベルと比較して、ＣＡＲ陽性細胞の頻度に有意差は認められなかった。
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＢＣＭＡ陽性ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡ細胞で刺激した場合、ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性細胞の頻度は約６０％から約１５％へと有意に低下した。しかしながら、ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性細胞の頻度は、ＢＣＭＡ陰性のＰＣ３ ＷＴまたはＰＣ３ ５Ｆ５との共培養においてもＣＤ３／ＣＤ２８刺激への応答においても影響を受けなかった。
全体的に見れば、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞上のＣＡＲ発現は、異なる抗原刺激レベル（強い抗原刺激ではＣＡＲ発現の消失が起こり、中程度の低刺激ではＣＡＲ発現が増加する）により影響を受けることが示された。ＴｒａｎｓＡＣＴを用いた内因性ＴＣＲによるＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化は一般にＣＡＲの発現を増強した。
また、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４／ＣＤ８比も評価した。４日後のＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ媒介性または内因性のいずれのＴＣＲ媒介活性化でも、単独培養したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞に比べてＣＤ４／ＣＤ８比に有意な変化は見られなかった（図３５Ｃ）。
同様に、ＢＣＭＡ ＣＡＲが強い抗原刺激で下方調節されることも示された。抗原刺激時の一過性のＣＡＲ下方調節は、文献で広く報告されている。ＣＡＲの下方調節は、おそらくＡＲＨ７７ ＢＣＭＡまたはＰＣ３ ＷＴ細胞に比べて、抗原発現の高いＰＣ３ ５Ｆ５細胞の存在下でＣＡＲ刺激に応答した内部移行が大きいことによると考えられる。しかしながら、ＡＲＨ７７ ＢＣＭＡまたはＰＣ３ ＷＴに応答したＣＡＲ発現の増加は、抗原がないことよるＣＡＲ内部移行の減少、一方、ＣＡＲ Ｔ細胞の全般的活性化によるＣＡＲ発現の増加の組合せによるものと思われる。同様に、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によるＣＡＲ発現の増加も、間接的にＣＡＲ合成および／または表面発現を増加させるＣＡＲ Ｔ細胞における活性の増加によるものであると考えられる。
これらのことを考え合わせると、抗原刺激時のＣＡＲ発現の動的な調節は、他のＣＡＲ Ｔ細胞で従前に公開された知見と同様であった。ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔｎ－ＭＵＣ１依存的に強力な増殖能を示した。強固な増殖は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の奏功の特徴であり、従って、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ Ｔ細胞療法としての有効性を示す。
実施例１６：ＤＣＣネトリン１受容体を過剰発現する細胞株へのＣＡＲ－Ｔの結合
この研究は、ＭＢ０３７ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＬＮＧＦＲタグ付きレンチウイルスベクターで形質導入）がＤＣＣネトリン１受容体に中程度の強度で結合することが判明している上記実施例６の結果の検証を目的に、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞集団のＤＣＣネトリン１受容体への結合を評価するために行った。この研究では、タグレスレンチウイルスベクター（すなわち、ＬＮＧＦＲタグを欠くレンチウイルスベクター）を形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＤＣＣを過剰発現している細胞株と共培養した。特に、ＤＣＣを過剰発現する細胞株と共培養した場合のＭＢ０５１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０３７のＬＮＧＦＲタグレス変異体）およびＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の結合を評価した。
方法
実験準備
Ｔ細胞の形質導入および拡大培養
Ｔ細胞は、基本的に従前に記載したように形質導入し、拡大培養した。簡単に述べると、Ｔ細胞をＰＢＭＣから採取し、Ｄ４ Ｔｎ－ＭＵＣ１レンチウイルスベクター（ＭＢ０５１ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するため）またはＤ１６ Ｔｎ－ＭＵＣ１レンチウイルスベクター（ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するため）をＭＯＩ ３で形質導入し、３２℃、８００×ｇで２時間Ｔ細胞をスピノキュレートした後、加湿インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。形質導入２日後に、Ｔ細胞を１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加したＴＥＸＭＡＣｓ培地で拡大培養した。３日後、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を各ウェルに添加した。さらに２日後、６．５ｍＬのＴＥＸＭＡＣｓ培地を除去し、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加した６．５ｍＬの新鮮なＴＥＸＭＡＣｓ培地に置き換えることにより培地を交換した。さらに２日後、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を各ウェルに添加した。Ｔ細胞はさらに３日間インキュベートした後、共培養アッセイに使用するために採取、計数および冷凍した。形質導入後１２日目に、Ｔ細胞集団を採取し、Ｔ細胞サンプルを取り出し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０フローサイトメーターにて、抗Ｆａｂ’（２）－ビオチン抗体（Ａｂ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５－０６６－０７２）およびＰＥ－ストレプトアビジン二次Ａｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－１０６－７８９）を用いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって形質導入効率の分析を行った。
ＤＣＣプラスミドによる細胞株のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔｓａ細胞を培養容器から採取し、遠心分離し、ＨＥＫ２９３Ｔｓａ培地に再懸濁させ、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲで計数した。細胞を４Ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁させ、２Ｅ６細胞を９６ウェルディープウェルプレートに播種した。トランスフェクション試薬２９３Ｆｅｃｔｉｎを用いて、８μｇのプラスミドで細胞をトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。トランスフェクションの後、細胞株をフローサイトメトリーで分析し、ＤＣＣネトリン１受容体およびトランスフェクションのマーカーとして使用したＺｓＧｒｅｅｎの発現を決定した。細胞溶液のサンプルをＶ底９６ウェルポリプロピレンプレートに播種し、ＦＡＣｓバッファーで洗浄し、室温にて５分間、５０μＬの４０μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ溶液でブロックした。細胞をＦＡＣｓバッファーで洗浄し、細胞ペレットを室温にて３０分間、５０μＬの１０μｇ／ｍＬマウス抗ＤＣＣ一次Ａｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５４２２３）または５０μＬの１０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照Ａｂで染色した。細胞をＦＡＣｓバッファーで２回洗浄し、室温で３０分間、５０μＬの５μｇ／ｍＬ ＡＰＣ抗マウスＩｇＧ１二次Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４０６６１０）で染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１００μＬの１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ溶液で染色した後、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＳフローサイトメーターまたはＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０フローサイトメーターのいずれかで分析した。
ＤＣＣ発現の検出－ｑＰＣＲ
ＤＣＣ ｍＲＮＡの発現を相対的に定量するために、ＳＹＢＲグリーンに基づくリアルタイムｑＰＣＲを使用した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。その後、製造者のガイドラインに従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。導入遺伝子由来のＤＣＣを定量し、参照対照として用いた内因性ＡＣＴＢに対して正規化した。
ＤＣＣ発現の検出－ウエスタンブロット
細胞ペレットを氷上５で０μＬのプロテアーゼ阻害剤含有ＲＩＰＡバッファーに溶解させ、５分間のインキュベーションを３回行い、各インキュベーション間に３０秒のボルテックス攪拌を行った。細胞溶解液を１３，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、細胞残渣が移らないように溶解液を新しいチューブに移した。総タンパク質の定量化のために、製造者のプロトコールに従ってＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを実施した。ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳ電気泳動を製造者のプロトコールに従って実施した。膜、濾紙およびブロッティングパッドを転写バッファーに３０分間浸し、ＳＤＳゲルを転写バッファー中で３分間インキュベートした。Ｘｃｅｌｌ ＩＩトランスファーモジュールにトランスファーサンドイッチを設置し、３０Ｖ、１７０ｍＡで１時間ゲルを転写した。これらの膜をＰＢＳで洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファーでブロックした後、一次抗体で染色し、次いで二次抗体で染色した後、Ｌｉｃｏｒ ＯｄｙｓｓｅｙイメージャーおよびＬｉｔｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウエアで画像化した。
ＨＥＫ細胞上でのＴｎ－ＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現の分析
細胞溶液のサンプルをＶ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに播種し、ＦＡＣｓバッファーで洗浄後、５０μＬの４０μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ溶液で室温にて５分間ブロックした。細胞を洗浄し、細胞ペレットを５０μＬの１μｇ／ｍＬ ５Ｅ５ Ａｂ、５０μＬの２μｇ／ｍＬ ＨＭＦＧ２ Ａｂ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ．００７１２－１．１）または５０μＬの１μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照Ａｂで４℃にて４５分間染色した。細胞をＦＡＣｓバッファーで２回洗浄し、５０μＬの２μｇ／ｍＬ ＢＶ４２１ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０５３１７）で４℃にて４５分間染色した。細胞をＦＡＣｓバッファーで２回洗浄し、１００μＬのＳｙｔｏｘ ＡＡＤｖａｎｃｅｄ（２０００分の１希釈）で染色し、室温で１０分間インキュベートした後、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーターで分析した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞および細胞株の共培養
トランスフェクション４８時間後、ＨＥＫ細胞（非トランスフェクト、ＺｓＧｒｅｅｎトランスフェクトおよびＤＣＣ－ＺｓＧｒｅｅｎトランスフェクト）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＯＳＭＣ Ｊｕｒｋａｔ細胞を採取し、計数し、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＰＭＩ培地で２Ｅ６細胞／ｍＬの細胞密度になるように再懸濁させた。ＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、ＴＥＸＭＡＣｓ培地に１Ｅ６細胞／ｍＬの密度となるように再懸濁させた。ＩＬ－２（終濃度１００ＩＵ／ｍＬ）を細胞溶液に添加した。１Ｅ６細胞／ウェルを加えた平底２４ウェル細胞培養プレートに細胞を播種し、加湿インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間の回復期間の後、２４ウェルプレートからＴ細胞を採取し、再計数し、各細胞集団から６Ｅ６細胞を１５ｍＬチューブに移した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞密度が２Ｅ６細胞／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。
１００μＬ（２Ｅ５細胞／ウェル）の細胞株および１００μＬ（２Ｅ５細胞／ウェル）のＴ細胞を９６ウェル平底プレートに、４名ドナーを４つのプレートに分けて播種した。共培養実験内において設定した条件は以下の通りであった：Ｔ細胞単独；非トランスフェクトＨＥＫ細胞＋Ｔ細胞；ＺｓＧｒｅｅｎトランスフェクトＨＥＫ細胞＋Ｔ細胞；ＤＣＣトランスフェクトＨＥＫ細胞＋Ｔ細胞；ＣＯＳＭＣ Ｊｕｒｋａｔ細胞＋Ｔ細胞；ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞＋Ｔ細胞；および単独培養した全ての細胞株。プレートは、加湿チャンバーにて、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
ＣＡＲ Ｔ細胞のサンプルは、ＣＡＲ発現、フローサイトメトリーによるＤＣＣおよびＺｓＧｒｅｅｎ発現、フローサイトメトリーによるＴｎ－ＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現、ｑＰＣＲによるＤＣＣ遺伝子発現、およびウェスタンブロットによるＤＣＣタンパク質発現に関して分析した。４８時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、３００×ｇで５分間遠心分離し、各ウェルから１００μＬの上清を取り出し、９６ウェルＶ底プレートに移した。プレートを密封し、ＭＳＤ解析を行うまで上清を－８０℃で冷凍した。
上清のＭＳＤ分析
保存していた上清を室温で解凍した。サンプルおよび較正物質を製造者の説明書に従って調製し、２５μｌの各サンプルをＭＳＤプレートに添加した。プレートを密封し、室温で振盪しながらインキュベートした。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｏｄｅｘｏ）でプレートを３回洗浄した。検出抗体を希釈液１００で希釈した。２５μｌの検出抗体を添加した後、プレートを密封し、室温で１．５時間振盪しながらインキュベートした。プレートは前期と同様に洗浄した。１５０μｌの２倍リードバッファーを各ウェルに添加した後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャーで読み取りを行った。
結果および考察
Ｔｎ－ＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現分析
ＤＣＣ結合とは無関係にＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を引き起こす可能性のあるＴｎ－ＭＵＣ１発現のバックグラウンドレベルを決定するために、野生型（ＷＴ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＯＳＭＣ Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＷＴ ＨＥＫ細胞およびＡ６７３細胞を含む細胞株についてフローサイトメトリーによるＴｎ－ＭＵＣ１およびＭＵＣ１発現を分析した。ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞はＴｎ－ＭＵＣ１に関して１００％陽性であり、これは、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞がＴｎ－ＭＵＣ１の陽性対照であることから予想されたことである。ＣＯＳＭＣ Ｊｕｒｋａｔ細胞集団ではＴｎ－ＭＵＣ１の発現が１３％あったが、単一細胞集団のＢＶ４２１の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値は低く、これはおそらくＴｎ－ＭＵＣ１陰性ＣＯＳＭＣ Ｊｕｒｋａｔ細胞集団の極めて低レベルのバックグラウンド染色にすぎないことを示す。また、Ａ６７３およびＨＥＫ細胞集団のＴｎ－ＭＵＣ１発現細胞の頻度は低く、ＭＦＩはＣＯＳＭＣ Ｊｕｒｋａｔ細胞の４倍であった。これはバックグラウンド染色であるかもしれないし、これらの細胞株における極めて低レベルのＴｎ－ＭＵＣ１発現を示している可能性がある。
同様に、検出された低いＭＦＩと低頻度のＴｎ－ＭＵＣ１発現Ａ６７３細胞およびＨＥＫ細胞は、バックグラウンド染色であると判断された。この染色分析の結果により、ＤＣＣ－ＺｓＧｒｅｅｎトランスフェクトＨＥＫ細胞集団でＴｎ－ＭＵＣ１発現が増加する危険性はないと判断された。
共培養のためのＤＣＣプラスミドのトランスフェクション
最初に行った作業は、共培養アッセイのセットアップを可能にするために、ＤＣＣプラスミドを用いた細胞株のトランスフェクションを最適化することであった。ヌクレオフェクション、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、ＰＥＩｐｒｏおよび２９３Ｆｅｃｔｉｎなどのトランスフェクション試薬の使用を含む、いくつかのトランスフェクション法を試みた。使用した最終的なトランスフェクション法は、２９３Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬と８μｇのプラスミドの使用であった。この結果、ＺｓＧｒｅｅｎ発現の検出に基づき、ＨＥＫ細胞におけるトランスフェクション効率は３４％となった。これはＺｓＧｒｅｅｎ発現頻度としては低いが、ｑＰＣＲおよびウェスタンブロットの結果から、ＤＣＣ遺伝子とＤＣＣタンパク質の両方の高い発現が示された。抗ＤＣＣ ＡｂはＤＣＣ陽性細胞株に特異的に結合しないため、トランスフェクトＨＥＫ細胞の表面でのＤＣＣタンパク質の発現を実証することはできなかった。しかしながら、ｑＰＣＲ、ウエスタン、ＭＳＤの結果に基づき、表面発現が推定された。
特に、トランスフェクトＨＥＫ細胞のＰＣＲ解析では、後３日目のＤＣＣ－ＺｓＧｒｅｅｎｑでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞では、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢと比較して、ＤＣＣ遺伝子の高発現を示した。ＤＣＣ遺伝子の発現は、トランスフェクション後５日目までに減少したが、内因的に発現するＤＣＣ陽性細胞株Ａ６７３のＤＣＣ遺伝子の発現よりなお高い発現であった。ウエスタン解析は、ＤＣＣ－ＺｓＧｒｅｅｎでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞では、トランスフェクション後３日目と５日目にＤＣＣタンパク質が発現し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによる予測された分子量範囲（１６８～１７５ｋＤａ）にバンドがあったことを示した。
共培養およびＭＳＤ
無関係のＣＡＲと特性決定されていない細胞株との未知の相互作用が、無関係のＣＡＲ Ｔ細胞集団を予想外に活性化し得るリスクを低減するために、対照として使用される非形質導入Ｔ細胞を用い共培養アッセイで、一アミノ酸だけが異なるＭＢ０５１ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた。共培養実験の結果、ＤＣＣ発現ＨＥＫ細胞と共培養したＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの高い産生を示し、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性対照である野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した場合のＩＦＮ－γ産生量の２倍を超えるレベルであった。総てのドナーについて、ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞をＤＣＣ発現ＨＥＫ細胞と共培養した場合に産生されるＩＦＮ－γの量が多く、これは、上記実施例６で最初にスクリーニングされたＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞とＤＣＣとの間のより強い相互作用を示す可能性がある。ＤＣＣ発現Ｔ細胞と共培養したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞のほぼ２倍量のＩＦＮ－γを産生したが、ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞をＤＣＣ発現ＨＥＫ細胞と共培養すると野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞の４～５倍のＩＦＮ－γを産生した。
図３６に示すように、非トランスフェクトＴ細胞を細胞株と共培養した場合、バックグラウンドレベルのＩＦＮ－γ産生が見られた。ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞を、非トランスフェクトＨＥＫ細胞およびＺｓＧｒｅｅｎでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞と培養した場合、ＩＦＮ－γ産生のバックグラウンドレベルの増加が見られた。ＩＦＮ－γ産生の最も高いピークは、ＭＢ０５１ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞をＤＣＣトランスフェクトＨＥＫ細胞と共培養した場合に見られ、ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞では、ＩＦＮ－γ産生が非トランスフェクトＴ細胞のそれぞれ５４７３倍および３２３９倍の増加であった。ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞をＴｎ－ＭＵＣ１陽性対照のＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した場合、ＩＦＮ－γ産生の倍率変化は低く、ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞ではそれぞれ非形質導入Ｔ細胞の１９３７倍および１２８０倍の増加であった。
ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方を、非トランスフェクトＨＥＫ細胞およびＺｓＧｒｅｅｎトランスフェクトＨＥＫ細胞と共培養した場合、ＩＦＮ－γのバックグラウンドレベルにいくらかの増加が見られたが、これはＨＥＫ細胞株上のＴｎ－ＭＵＣ１発現レベルが低いことを示唆している可能性がある。ドナーＰＲ１９Ｘ１２８７６８およびＰＲ１９Ｗ１２８７７３はまた、Ｔ細胞単独集団内のＩＦＮ－γのバックグラウンド産生の増加を示したが、これはこれらのドナーの低レベルの基底活性化を示している可能性がある。
全体的に見れば、この結果は、上記実施例６の結果を検証するものであり、ＭＢ０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞のＤＣＣへの結合が確認された。これらの実験では過剰なレベルのＤＣＣを示したことから、生理的レベルのＤＣＣでのＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の結合を調べるために、さらなる研究を実施しているところである。
実施例１７：ＣＤＸ ＮＳＧマウスモデルにおけるＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
本研究の目的は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＢ０５３）の、Ｔｎ－ＭＵＣ１発現前立腺癌細胞株ＰＣ３ ５Ｆ５の標的化殺傷を誘導する能力を評価することであった。Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞株（ＰＣ３ ５Ｆ５）を細胞由来異種移植（ＣＤＸ）として用い、ＮＳＧ（ＮＯＤ酸γマウス）マウスモデルに移植した。ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を陰性対照として使用した。
方法
腫瘍細胞の接種およびＴ細胞の投与
ＰＣ３ ５Ｆ５前立腺細胞株を用いて、２×１０６個の腫瘍細胞をマウスに皮下注射することにより、腫瘍異種移植モデルを確立した。動物は、チャンバー内でイソフルラン－酸素混合物により短時間麻酔し、フェイスコーンに移した。右側腹部を剃毛した後、アルコールで拭いた。細胞はＰＢＳに再懸濁させた後、氷上でマトリゲルとよく混合した（１：１ ＰＢＳ／細胞：マトリゲル）。マウス１匹当たり、細胞を含むマトリゲルおよびＰＢＳ溶液の合計１００μＬをｓ／ｃ注射した。
腫瘍が触知可能（約１００ｍｍ３）になった際に、ＣＡＲ Ｔ細胞をマウス１匹当たり１×１０７細胞の用量で尾静脈注射により静脈内投与した。腫瘍移植１７日後に、キャリパーで測定した平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した際に、マウスにＭＢ０５３ Ｔｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＰＢＳまたはＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（無関係の特異性のＣＡＲ Ｔ）を１×１０７細胞／マウスで尾静脈注射により静脈内接種した。
腫瘍測定
総てのマウスの腫瘍の大きさを週３回キャリパーにより測定して記録し、その後、週２回体重を記録した。腫瘍体積は、以下に示すようにエクセルを用いて計算した。
腫瘍体積＝腫瘍長＊（腫瘍幅＾２）＊０．５
腫瘍体積のようなエンドポイント基準のため、個々のエンドポイントでマウスを選択し、組織を採取した。ＰＢＳ対照群およびＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞群については、腫瘍および必須臓器（腎臓、心臓、脾臓、脳および肺）を採取し、病理組織学的検査のために１０％緩衝ホルマリン食塩水（ＢＦＳ）で最大４８時間固定した。ＢＣＭＡ群のマウスからは、腫瘍および臓器は採取しなかった。
採血
ＣＡＲ Ｔ細胞が放出する血中サイトカインのレベルを評価するため、腫瘍接種６日後（ベースラインとして使用）とＣＡＲ Ｔ細胞投与７日後に、試験中の総てのマウスから血液サンプルを２回採取した。
血清サイトカインアッセイＭＳＤ
ＭＢ０５３ ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が分泌するサイトカインレベルを評価するために、総てのマウスから血液サンプル（約１００μｌ）を２回採取した。１回目の採血は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与７日前に行い、ベースライン（0日目）とした。２回目の採血は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与７日目後（７日目）に行った。採取した全血は、室温で最低３０分間凝固させた。血液が凝固したところで、１２５００ｒｐｍで３分間遠心分離して血清を得、これをアッセイで使用するまで－８０℃で冷凍した。採取した総てのマウス血清サンプルを室温で解凍し、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αに対する検出抗体（検出抗体混合物）を用いて、製造者の説明書に従って分析した。
プレートはＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャーで読み取り、データ解析はＲバージョン３．６．１のｂｒｍｓパッケージを用いて行った。血清サイトカイン濃度変化の定量は、ＭＳＤの外挿値を用いて分析した。この定量は、２つの技術的反復、すなわち２つの別個のプレートで繰り返した。対照群の多くの観測は、与えられたマウス／時間／サイトカイン濃度について定量限界（＜ＬＬｏＱ）を下回るほどの低値であった。
結果および考察
ＣＤＸ腫瘍担持マウスにおける腫瘍成長に及ぼすＭＢ０５３ ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の影響
形質導入効率は、ＭＢ０５３ ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞とＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞について、抗Ｆａｂ検出試薬とＢＣＭＡ Ａｂを用いたフローサイトメトリーを用い、投与１日前にそれぞれ測定した。また、基本的なＴ細胞表現型解析を実施し、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の集団を測定した。両ＣＡＲ Ｔ細胞サンプルは高い細胞生存率（９８～９９％）を示し、形質導入効率はＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞で４５．９２％、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞で７４．２２％と決定された。導入効率は、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の間のＵＴ細胞の場合の５０％に対して正規化した。
ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した腫瘍担持ＣＤＸマウスでは腫瘍消失に至る腫瘍体積の劇的な減少から明らかなように、強力な抗腫瘍効果を示した。これに対し、ＰＢＳまたはＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＣＤＸ腫瘍担持マウスでは、腫瘍体積の減少または腫瘍の消失は見られなかった。実際、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＣＤＸ腫瘍担持マウスは、試験エンドポイント前の早期の時点（試験３１日目）でも、腫瘍体積に統計的に有意な減少を示した（図３７）。病理組織学的検査により、腫瘍は、ＰＢＳまたはＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した腫瘍担持ＣＤＸマウスにおいてのみ存在することが確認された。対照的に、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した腫瘍担持ＣＤＸマウスでは、腫瘍部位は、コラーゲン、脂肪組織および骨格筋の可変混合物のみから構成され、腫瘍細胞は全く存在しなかった。なお、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔを投与したＣＤＸ腫瘍担持マウスをＰＢＳ対照群と比較したところ、腫瘍の体積に差は見られなかった。
全体的に見れば、ＣＤＸ腫瘍担持マウスにＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで投与したところ、腫瘍が縮小した。腫瘍担持マウスにＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞を注入すると、腫瘍のサイズが急速に縮小し、完全な腫瘍消失に至った。これに対し、ＰＢＳまたは対照ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ（無関係の特異性のＣＡＲ）を腫瘍担持マウスに注入しても、腫瘍体積の縮小は生じなかった。ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、キャリパー測定で見られたように、腫瘍成長を抑制した。興味深いことに、試験エンドポイント（試験３０日目）前でも、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した腫瘍担持ＣＤＸマウスでは、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した腫瘍担持ＣＤＸマウスまたはＰＢＳ対照群に比べて腫瘍体積の有意な減少が認められた。さらに、病理組織学的検査では、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した腫瘍担持ＣＤＸマウスの腫瘍部位に腫瘍細胞が存在しないことが確認された。
Ｔ細胞活性化を評価するための血清サイトカイン放出
Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性腫瘍に対するＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的応答を確認するために、血清中のＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）のレベルを測定した。ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカインの分泌は、標的との会合およびＣＡＲ Ｔ細胞の機能的活性化を示している。ＭＢ０５３ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したＣＤＸ腫瘍担持マウスは、０日目の処置前サイトカインレベルと比較して、３つのサイトカインの総てについてより高レベルを示したことが見出された（図３８Ａ）。ＩＦＮ－γのレベルは、ＰＢＳ群の血清中のサイトカインレベルと比較して、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞群の血清中で有意に高かった（図３８Ｂ）。ＩＬ－２の分泌は、処置後のＰＢＳ群およびＢＣＭＡ群と比較して、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞群で増加傾向が見られたが、分泌レベルはむしろ低く、生物学的な関連はなかった。全体として、総てのサイトカインの中で、ＩＦＮ－γの分泌レベルは、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞群において、治療後に最も顕著な増加を示した。
これらの結果は、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞を注射したマウスのＴ細胞投与後７日目のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの血清レベルの上昇によって、腫瘍体積の減少結果が裏付けられたことを示している。ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの血清レベルの上昇は、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞が標的とうまく会合合し、その後の活性化によってＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン分泌がもたらされることを示唆している。従って、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスに移植したＣＤＸ腫瘍に対して高い細胞傷害性効果を示した。
ＣＤ３ ＩＨＣによる腫瘍およびマウス組織におけるＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の分布
ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＣＤＸ腫瘍担持マウスの腫瘍部位に存在するヒトＴリンパ球の数は少なかった。これらは、一般に、部位全体に見かけ上ランダムに散在していた。ＰＢＳを投与したＣＤＸ腫瘍担持マウスの腫瘍には、ヒトＴリンパ球は存在していなかった。また、病理組織学的に評価されたマウス組織におけるＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞に関連する毒性の証拠がなかったことは言及に値する。さらに、ＰＢＳ群およびＢＣＭＡ群においても、特筆すべき顕微鏡的な変化はなかった。
実施例１８：低濃度のＴｎ－ＭＵＣ１陽性腫瘍細胞に応答したＴｎ－ＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔの評価
本研究の目的は、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性および陰性の同系統の細胞株と２４時間共培養した後の上清中のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌量の評価を通して、低レベルのＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞に応答したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能活性を測定することであった。
方法
実験準備
ＣＡＲ Ｔ細胞の作製
３名のドナーからのＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＵＴ Ｔ細胞を拡大培養し、形質導入効率（ＴＥ）を確認し、冷凍した。
腫瘍細胞株の作製
ＰＣ－３ ５Ｆ５およびＪｕｒｋａｔ ６Ｅは９０％を超えるＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞を含み、陽性対照（１００％Ｔｎ－ＭＵＣ１）として使用した。ＰＣ－３ ＷＴおよびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ ＫＩのＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞は１％未満であり、陰性対照として使用した。同系統ＰＣ－３細胞株（ＰＣ－３ ５Ｆ５およびＰＣ－３ ＷＴ）は３×１０５細胞／ｍＬに希釈し、同系統Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ６ＥおよびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ ＫＩ）は５×１０５細胞／ｍＬに希釈した。
２０％の陽性Ｔｎ－ＭＵＣ１細胞と８０％のＴｎ－ＭＵＣ１陰性細胞の混合からなる総容量１０ｍＬに、２０％のＴｎ－ＭＵＣ１陽性集団を作製した。続いて、２０％Ｔｎ ＭＵＣ－１陽性細胞集団を２分の１に４点連続希釈し、５ｍＬの１０％、５％、２．５％および１．２５％Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性条件を得た。次に、生成された総ての細胞株についてフローサイトメトリーにより表面のＴｎ－ＭＵＣ１発現を確認した。
実験プロトコール
Ｔ細胞フローサイトメトリーのためのプロトコール
Ｔ細胞（２×１０５細胞／条件）を５０μＬ抗Ｆａｂ（１０．４μｇ／ｍＬ）とともに４℃で４５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。次に、Ｔ細胞を５０μＬのｓｔｒｅｐ－ＰＥ二次抗体（１μｇ／ｍＬ）とともに４℃で４５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。細胞を１００μＬのＤＡＰＩ生死判定色素（１μｇ／ｍＬ）に再懸濁させた。データは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒフローサイトメーターで取得した。分析はＦｌｏｗＪｏを使用し、ゲートの設定に非染色対照を用いて行った。サイトメーターのＱＣ性能は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ較正ビーズを用いて毎日評価した。
共培養設定のためのプロトコール
１００μＬの５×１０４ Ｊｕｒｋａｔ細胞／ウェル、および３×１０４ ＰＣ－３細胞／ウェルを、９６ウェル組織培養プレートに播種した。１００μＬの細胞培養培地をプレートの残りの総てのウェルに添加した。培養プレートを加湿インキュベーターにて３７℃、５％Ｃ０２で２４時間インキュベートした後、Ｔ細胞を加えた。
ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＵＴ Ｔ細胞を、播種した標的細胞に１：１ ＣＡＲ－Ｔ：標的比で添加し、エフェクター数はＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率５０％に基づいた。ＵＴ Ｔ細胞の数は、添加したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞の総数と同じであった。９６ウェル細胞培養プレートに、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞、ＵＴ Ｔ細胞または培地１００μＬを添加した。これらの培養プレートを加湿インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した後、ＩＦＮγ検出を行った。
ＭＳＤアッセイ（ＩＦＮγ検出）のためのプロトコール
共培養物を含有するプレートから５０μＬの上清を採取し、９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレートに移し、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を希釈液２（ＭＳＤ）に３０分の１希釈した。ＩＦＮγ較正物質を希釈液２で原液１２３０ｐｇ／ｍＬとなるように調製し、室温で３０分間平衡化させた。２００μＬの較正物質を９６ウェルポリプロピレンＶ底プレートに移した。その後、希釈液２で４分の１の８点連続希釈を行った。
ＭＳＤアッセイプレートを１５０μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、３０分間乾燥させた。２５μＬの希釈上清と校正物質の用量反応曲線を各ＭＳＤプレートに移した。プレートを密封し、プレートシェーカー（６００ｒｐｍ）上、６００回転／分（ｒｐｍ）で室温にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１５０μＬの洗浄バッファーで３回洗浄した。検出抗体を希釈液３（ＭＳＤ）で希釈し、２５μＬの抗体をＭＳＤアッセイプレートに移した。プレートを密封し、６００ｒｐｍのプレートシェーカーで室温にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３回洗浄した。１５０μＬの２倍リードバッファーを各ウェルに加えた後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６００イメージャーで読み取った。データはＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（登録商標）ソフトウエアを用いて解析し、ＩＦＮγの濃度を推定した。
結果および考察
Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞のパーセンテージはＩＦＮγ分泌のレベルを定義する
Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞の比率の引き下げは、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞株であるＪｕｒｋａｔ ６ＥまたはＰＣ－３ ５Ｆ５を、Ｔｎ－ＭＵＣ１陰性細胞株であるＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ ＫＩまたはＰＣ－３ ＷＴでそれぞれ希釈することによって達成された。その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞：８２．７％、１９．３％、９．８％、４．８％、２．４％、１．４％、０．０５％）およびＰＣ－３細胞（Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞：９３％、１５％、８％、４％、２．４％、１．６％、０．７７％）で、異なるレベルのＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞を含有する一連の混合同系統系細胞株を確立した（図２）。ＰＣ－３ ＷＴ細胞株（０．７７％）およびＪｕｒｋａｔ ＣＯＳＭＣ ＫＩ細胞株（０．０５％）には、低パーセンテージのＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞が存在した。
ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞と一連の混合同系統細胞株との共培養により、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性に依存したＩＦＮγの分泌が示された。これに対し、これらの混合同系統細胞株をＵＴ Ｔ細胞と共培養した場合、明白なＩＦＮγの分泌は検出されなかった（図３９Ａ）
ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の濃度を増加倍率応答に変換した。すなわち、各混合細胞集団の共培養について、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞が産生するＩＦＮγの量を、そのそれぞれのＵＴ Ｔ細胞対照が産生するＩＦＮγの量で除算した。ＩＦＮγの増加倍率を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（０．０５％Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞）およびＰＣ－３細胞（０．７７％Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞）の最低パーセンテージＴｎ－ＭＵＣ１陽性条件と比較した。Ｊｕｒｋａｔ由来の細胞集団について、単独培養したＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクターのみ）と比較して、最低Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞集団間に有意な増加は見られなかった。これに対し、ＰＣ－３由来の細胞集団では、エフェクターのみの応答と比較して、最低Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞集団間に有意な増加が見られた。その後のＴｎ－ＭＵＣ１陽性の上昇は総て、ＪｕｒｋａｔおよびＰＣ－３に由来する総ての細胞集団にＩＦＮγレベルの有意な上昇をもたらした。
本研究のデータから、ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、極めて低レベルのＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞の存在下で、ＩＦＮγ分泌によって定義される機能的応答を認識し、発揮できることが確認された。ＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＦＮγ分泌の用量依存的応答がＴｎ－ＭＵＣ１陽性のレベルと関連しており、これは混合同系統細胞集団のＴｎ－ＭＵＣ１陽性細胞の数と相関していることが示された。Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞の数が少ない混合細胞集団（Ｊｕｒｋａｔ １．４％；ＰＣ－３ １．６％）とＭＢ０５３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を共培養すると、同じ混合細胞集団と共培養したＵＴ Ｔ細胞で見られたものと比較して、ＩＦＮγ放出が統計的に有意な増加に至ることが示された（図３９Ｂ）。ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔｎ－ＭＵＣ１陰性Ｊｕｒｋａｔ ＫＩ細胞株に応答して活性化を示さなかったが、ＭＢ０５３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔｎ－ＭＵＣ１陽性細胞がわずか０．７７％のＰＣ－３細胞株との共培養でＩＦＮγ放出において統計的に有意な増加が見られた。
配列表
Figure 2023520658000037
Figure 2023520658000038
Figure 2023520658000039
Figure 2023520658000040
Figure 2023520658000041
Figure 2023520658000042
Figure 2023520658000043
Figure 2023520658000044
Figure 2023520658000045

Claims (45)

  1. ａ）グリコシル化異常のＭＵＣＩタンパク質上の１以上のエピトープに結合するヒト化抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる細胞外ドメインであって、その抗原結合ドメインの抗体が、
    配列番号２８と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ１配列；
    配列番号２９と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ２配列；
    配列番号３０と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ３配列；
    配列番号３１と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ１配列；
    配列番号３２と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ２配列；および
    配列番号３３と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ３配列
    を含んでなり、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、非ヒト化型の前記抗体またはその抗原結合ドメインに比べて、より速い解離速度定数（ｋｄ）で前記エピトープに結合する、細胞外ドメイン；
    ｂ）膜貫通ドメイン；
    ｃ）１以上の共刺激ドメイン；および
    ｄ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
    を含んでなる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  2. 前記抗体またはその抗原結合ドメインが、
    配列番号２８のＣＤＲＬ１配列；
    配列番号２９のＣＤＲＬ２配列；
    配列番号３０のＣＤＲＬ３配列；
    配列番号３１のＣＤＲＨ１配列；
    配列番号３２のＣＤＲＨ２配列；および
    配列番号３３のＣＤＲＨ３配列
    を含んでなる、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記抗体またはその抗原結合ドメインが、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
  4. 前記抗体またはその抗原結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項３に記載のＣＡＲ。
  5. 前記抗体またはその抗原結合ドメインが、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、および５６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一の可変軽鎖配列、ならびに配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一の可変重鎖配列を含んでなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  6. 前記抗体またはその抗原結合ドメインが、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、および５６からなる群から選択される可変軽鎖配列、ならびに配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される可変重鎖配列を含んでなる、請求項５に記載のＣＡＲ。
  7. 前記グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質がＴｎＭＵＣ１またはＳＴｎＭＵＣ１のいずれかである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  8. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のαまたはＢ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離されたものである、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  9. 前記膜貫通ドメインがＣＤ８αから単離されたものである、請求項８に記載のＣＡＲ。
  10. 前記１以上の共刺激ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離されたものである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  11. 前記１以上の共刺激ドメインがＣＤ１３７（４－１ＢＢ）から単離されたものである、請求項１０に記載のＣＡＲ。
  12. 前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、およびＣＤ７９ｂからなる群から選択される細胞内シグナル伝達分子から単離されたものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  13. 前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζから単離されたものである、請求項１２に記載のＣＡＲ。
  14. 配列番号９０、９１、９２、９３、９４、および９５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  15. 配列番号９０、９１、９２、９３、９４、および９５からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  16. 配列番号５８、５９、６０、および６１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  17. 配列番号５８、５９、６０、および６１からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  18. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲのアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド。
  19. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
  20. 請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
  21. 前記ベクターが発現ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
  22. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
  23. 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
  24. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。
  25. 前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）；ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択される、請求項２４に記載のベクター。
  26. 請求項１９に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、ベクター産生細胞。
  27. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、または請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、免疫エフェクター細胞。
  28. Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の免疫エフェクター細胞。
  29. 細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）である、請求項２８に記載の免疫エフェクター細胞。
  30. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞および薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
  31. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲを含んでなる免疫エフェクター細胞を作製する方法であって、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含んでなる、方法。
  32. ＣＤ３に結合する抗体またはその抗原結合ドメインおよびＣＤ２８に結合する抗体またはその抗原結合ドメインと細胞を接触させることによって免疫エフェクター細胞を刺激し、細胞の増殖を誘導して、それにより、免疫エフェクター細胞集団を作製することをさらに含んでなる、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記免疫エフェクター細胞が、ベクターに導入する前に刺激され、増殖誘導される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記免疫エフェクター細胞がＴリンパ球を含んでなる、請求項３３に記載の方法。
  35. グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞を含んでなる癌の治療において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物。
  36. グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞を含んでなる癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  37. 必要とする対象における癌の治療のための方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物を投与することを含んでなり、前記癌がグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞を含んでなる、方法。
  38. 癌を有する対象においてグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞で細胞傷害性を増強するための方法であって、前記対象に請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物を、投与前のグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の細胞傷害性に比べて、グリコシル化異常のＭＵＣ１を発現する癌細胞における細胞傷害性を増強するのに十分な量で投与することを含んでなる、方法。
  39. 癌を有する対象においてグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の数を減少させるための方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物を投与することを含んでなり、前記治療上有効な量が、投与前のグリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の数に比べて、グリコシル化異常のＭＵＣ１タンパク質を発現する癌細胞の数を減少させるのに十分なものである、方法。
  40. 前記癌が固形癌である、請求項３５に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞もしくは医薬組成物、請求項３６に記載の使用、または請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記固形癌が食道癌、膀胱癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、胆管癌、胃癌、結腸癌、または乳癌である、請求項４０に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、医薬組成物、使用または方法。
  42. 前記癌が液性癌である、請求項３５に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物、請求項３６に記載の使用、または請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記液性癌が造血器悪性腫瘍である、請求項４２に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、医薬組成物、使用または方法。
  44. 前記造血器悪性腫瘍が急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＮＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ），または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項４３に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、医薬組成物、使用または方法。
  45. 療法において使用するための請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１８に記載のポリペプチド、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物。
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