CN116096739A - 嵌合抗原受体间隔物 - Google Patents

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Y·宋
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Abstract

本公开涉及嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含免疫球蛋白(Ig)衍生的间隔物，例如铰链或环区、其片段或其组合。Ig衍生的间隔物赋予CAR改进的性质，例如，相对于具有不来源于铰链区及其片段、恒定区的环区及其片段、及其组合的间隔物的CAR，细胞因子释放增加。还提供了表达包含Ig衍生的间隔物区的CAR的细胞和使用CAR治疗疾病或病症例如癌症的方法。公开的Ig衍生的间隔物中的一些是来自例如IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM的片段。在一些方面，公开的Ig衍生的间隔物来源于非人免疫球蛋白，例如小鼠免疫球蛋白，诸如IgG2A。公开的其他Ig衍生的间隔物是包含若干个连接的Ig铰链或其片段的模块化构建体。

Description

嵌合抗原受体间隔物
相关申请的交叉引用
此PCT申请要求2020年5月12日提交的美国临时申请号63/023,751的优先权权益，所述临时申请以引用方式整体并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的以ASCII文本文件(名称：4385_016PC01_Seqlisting_ST25.txt；大小：2,351,479字节；和创建日期：2021年5月12日)以电子方式提交的序列表的内容以引用方式整体并入本文。
技术领域
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含来源于免疫球蛋白铰链区或恒定区的间隔物。
背景技术
使用表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继免疫疗法是一种很有前途的癌症治疗方法，因为这些细胞可以以不依赖人白细胞抗原(HLA)的方式直接识别和杀死表达抗原的肿瘤细胞。然而，除了仔细选择靶肿瘤相关抗原之外，这种治疗方法还高度依赖于CAR的最佳分子设计。
因此，需要允许系统优化CAR中的细胞外间隔物以最大限度地增强CAR T细胞功效的方法。
发明内容
本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中(a)间隔物的长度为约150个氨基酸至约125个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA0004043865630000021
(b)间隔物的长度为约125个氨基酸至约100个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA0004043865630000022
(c)间隔物的长度为约100个氨基酸至约75个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA0004043865630000023
(d)间隔物的长度为约75个氨基酸至约36个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA0004043865630000024
(e)间隔物的长度为约35个氨基酸至约21个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离为约
Figure BDA0004043865630000025
至约
Figure BDA0004043865630000026
(f)间隔物的长度为约20个氨基酸至约16个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离为约
Figure BDA0004043865630000027
至约
Figure BDA0004043865630000028
(g)间隔物的长度为约15个氨基酸至约11个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离为约
Figure BDA0004043865630000029
至约
Figure BDA00040438656300000210
或(h)间隔物的长度为约10个氨基酸至约5个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面的距离大于约
Figure BDA00040438656300000211
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中(a)间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000212
至约
Figure BDA00040438656300000213
并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA00040438656300000214
(b)间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000215
至约
Figure BDA00040438656300000216
并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA00040438656300000217
(c)间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000218
至约
Figure BDA00040438656300000219
并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA00040438656300000220
(d)间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000221
至约
Figure BDA00040438656300000222
并且表位和靶细胞膜表面的距离小于约
Figure BDA00040438656300000223
(e)间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000224
Figure BDA00040438656300000225
至约
Figure BDA00040438656300000226
并且表位和靶细胞膜表面的距离为约
Figure BDA00040438656300000227
至约
Figure BDA00040438656300000228
(f)间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630000031
至约
Figure BDA0004043865630000032
并且表位和靶细胞膜表面的距离为约
Figure BDA0004043865630000033
至约
Figure BDA0004043865630000034
；(g)间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630000035
至约
Figure BDA0004043865630000036
并且表位和靶细胞膜表面的距离为约
Figure BDA0004043865630000037
至约
Figure BDA0004043865630000038
或(h)间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630000039
至约
Figure BDA00040438656300000310
并且表位和靶细胞膜表面的距离大于约
Figure BDA00040438656300000311
在一些方面，(a)表位与靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000312
并且间隔物的长度为125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个氨基酸；(b)表位与靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000313
并且间隔物的长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸；(c)表位与靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000314
并且间隔物的长度为75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸；(d)表位与靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000315
并且间隔物的长度为36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸；(e)表位与靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300000316
至约
Figure BDA00040438656300000317
并且间隔物的长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸；(f)表位与靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300000318
至约
Figure BDA00040438656300000319
并且间隔物的长度为16、17、18、19或20个氨基酸；(g)表位与靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300000320
至约
Figure BDA00040438656300000321
并且间隔物的长度为11、12、13、14或15个氨基酸；或(h)表位与靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300000322
并且间隔物的长度为5、6、7、8、9或10个氨基酸。
在一些方面，(a)表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000323
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000324
约
Figure BDA00040438656300000325
约
Figure BDA00040438656300000326
、约
Figure BDA00040438656300000327
、约
Figure BDA00040438656300000328
约
Figure BDA00040438656300000329
约
Figure BDA00040438656300000330
约
Figure BDA00040438656300000331
或约
Figure BDA00040438656300000332
(b)表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000333
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000334
约
Figure BDA00040438656300000335
约
Figure BDA0004043865630000041
约
Figure BDA0004043865630000042
约
Figure BDA0004043865630000043
约
Figure BDA0004043865630000044
约
Figure BDA0004043865630000045
约
Figure BDA0004043865630000046
或约
Figure BDA0004043865630000047
Figure BDA0004043865630000048
(c)表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630000049
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000410
约
Figure BDA00040438656300000411
约
Figure BDA00040438656300000412
约
Figure BDA00040438656300000413
约
Figure BDA00040438656300000414
约
Figure BDA00040438656300000415
约
Figure BDA00040438656300000416
约
Figure BDA00040438656300000417
或约
Figure BDA00040438656300000418
(d)表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300000419
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000420
约
Figure BDA00040438656300000421
约
Figure BDA00040438656300000422
约
Figure BDA00040438656300000423
约
Figure BDA00040438656300000424
约
Figure BDA00040438656300000425
约
Figure BDA00040438656300000426
约
Figure BDA00040438656300000427
约
Figure BDA00040438656300000428
约
Figure BDA00040438656300000463
Figure BDA00040438656300000462
、约
Figure BDA00040438656300000429
约
Figure BDA00040438656300000430
约
Figure BDA00040438656300000431
或约
Figure BDA00040438656300000432
(e)表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300000433
至约
Figure BDA00040438656300000434
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000435
约
Figure BDA00040438656300000436
约
Figure BDA00040438656300000437
约
Figure BDA00040438656300000438
约
Figure BDA00040438656300000439
约
Figure BDA00040438656300000440
约
Figure BDA00040438656300000441
约
Figure BDA00040438656300000442
或约
Figure BDA00040438656300000443
(f)表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300000444
至约
Figure BDA00040438656300000445
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000446
约
Figure BDA00040438656300000447
约
Figure BDA00040438656300000448
和约
Figure BDA00040438656300000449
(g)表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300000450
至约
Figure BDA00040438656300000451
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000452
Figure BDA00040438656300000453
约
Figure BDA00040438656300000454
约
Figure BDA00040438656300000455
或约
Figure BDA00040438656300000456
或(h)表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300000457
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300000458
约
Figure BDA00040438656300000459
约
Figure BDA00040438656300000460
或约
Figure BDA00040438656300000461
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含式CN-(X1PRX2P)m-[L-(X1PRX2P)]n-CC的氨基酸序列，其中(a)间隔物位于CAR的配体结合结构域和跨膜结构域之间；(b)间隔物具有至少15个氨基酸的长度；(c)m为选自0或1的整数；(d)n为1至20的整数；(e)L为接头多肽序列；(f)CN为任选的N末端加帽序列；(g)CC为任选的C末端加帽序列；以及(h)X1和X2独立地选自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
在一些方面，间隔物包含两个、三个、四个、五个或六个X1PRX2P基序。在一些方面，X1PRX2P包含至少一个半胱氨酸。在一些方面，X1PRX2P是SEQ ID NO:4749。在一些方面，L包含SEQ ID NO:4223的多肽或其片段或变体。在一些方面，当n>1时，所有L都是相同的。在一些方面，当n>1时，至少一个L与其他L不同。在一些方面，CN包含SEQ ID NO:4088的多肽或其片段或变体。
在一些方面，CC包含SEQ ID NO:4533的多肽或其片段或变体。在一些方面，CAR间隔物包含式(CPRCP)o(EPKSCDTPPPCPRCP)p的序列，其中o是0或1的整数，并且p是1、2或3的整数，其中CPRCP是SEQ ID NO:4740中列出的序列，并且其中EPKSCDTPPPCPRCP是SEQ ID NO:4477中列出的序列。
.在一些方面，CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:2813、2903、2983、3358、3728和4477组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，CAR间隔物包含CC加帽序列，所述CC加帽序列包含SEQ ID NO:4533的多肽的子序列或其片段或变体。在一些方面，SEQ ID NO:5的多肽的子序列是N末端AP。在一些方面，CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4833、4834、4835、4836、4837和4838组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，CAR间隔物包含CN加帽序列，所述CN加帽序列包含SEQ ID NO:4088的多肽的子序列或其片段或变体。在一些方面，CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4833的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含SEQ ID NO:4841的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含与SEQ ID NO:4839具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含式(EX3KX4X5X6X7DTX8X9X10TCPRCP)q的氨基酸序列，
其中q为1至10的整数，并且其中：X3为L或P；X4为T或S；X5为P或C；X6为L或不存在；X7为G或不存在；X8为T或P；X9为H或P；并且X10为T或P。
还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含SEQ ID NO:4466的至少一个氨基酸序列A和/或SEQ IDNO:4477的至少一个氨基酸序列B，其中CAR间隔物的氨基酸序列对应于式A、B、AB、ABB、ABBB、ABBBB、ABBBBB、AA、AAA、AAAA、AAAAA、BB、BBB、BBBB或BBBBB。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含选自表11中的序列的氨基酸序列或与表11中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG3 CH1C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG3CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgG3 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG3 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表12中的序列的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:1的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与选自由SEQ ID NO:2015、1889、1768、4852及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含选自表1中的序列的氨基酸序列或与表1中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，CAR间隔物还包含：(i)包含1、2、3、4或5个IgD CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或(ii)包含1、2、3、4或5个IgD CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，IgD CH1和CH2序列C末端结构域氨基酸和/或IgD CH1和CH2序列N末端结构域氨基酸包含选自表2中的序列的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:2560的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含选自表3中的序列的氨基酸序列或与表3中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4847、4845、4846、2560、4844及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgA1 CH1C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgA1CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgA1 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgA1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表4中的序列的氨基酸序列。
本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:4848的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4523、4850、2713、4524、4525及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含选自表5中的序列的氨基酸序列或与表5中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgA2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgA2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgA2CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgA2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表6中的序列的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:2723或SEQ ID NO:4843的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4839、4840、4843及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物包含选自表7中的序列的氨基酸序列或与表7中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG1 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgG1CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表8中的序列的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:2768或SEQ ID NO:4842的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:4842具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物包含选自表9A中的序列的氨基酸序列或与表9A中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG2CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表10A中的序列的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:4926的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4830、4831、4832及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含选自表9B中的序列的氨基酸序列或与表9B中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表10B中的序列的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:4374的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:4856具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物包含选自表15中的序列的氨基酸序列或与表15中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgE CH1C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgE CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgE CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgE CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表16中的序列的氨基酸序列。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含有包含SEQ ID NO:4857的至少五、六或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:4858、4959、4857及其任何组合的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含选自表17中的序列的氨基酸序列或与表17中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgM CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgM CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。在一些方面，包含1、2、3、4或5个IgM CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgM CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表18中的序列的氨基酸序列。在一些方面，CAR间隔物包含任选的L1接头和/或任选的L2接头。在一些方面，任选的L1接头和/或任选的L2接头是柔性接头。在一些方面，任选的L1接头和/或任选的L2接头的长度为1至100个氨基酸。在一些方面，L1接头的长度为1至10个氨基酸。在一些方面，L1接头包括Gly-Ser接头。在一些方面，L1接头包含SEQ ID NO:4818中列出的序列。在一些方面，L2接头的长度为1至10个氨基酸。在一些方面，L2包含序列PGG。在一些方面，人免疫球蛋白铰链区来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3或IgM。在一些方面，人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的功能片段包含：(a)铰链和/或恒定区的内部子序列；(b)铰链和/或恒定区的C末端子序列；(c)铰链和/或恒定区的N末端子序列；(d)向N末端CH1结构域和/或C末端CH2结构域延伸1至10个氨基酸的铰链区；(e)向N末端CH1结构域延伸1至10个氨基酸的铰链区的子序列；(f)向C末端CH2结构域延伸1至10个氨基酸的铰链区的子序列；(g)包含(a)-(f)中的两个或更多个重复的序列；(h)对应于相同铰链和/或恒定区的(a)-(g)的组合；(i)对应于不同铰链和/或恒定区的(a)-(g)的组合；或(j)其任何组合。在一些方面，使用x射线结晶学、NMR或cryo-EM结构来估计表位和靶细胞膜表面之间的距离。在一些方面，使用荧光共振能量转移(FRET)来估计表位和靶细胞膜表面之间的距离。在一些方面，与包含参考间隔物的对应CAR相比，所述CAR诱导IFNγ和/或IL-2表达增加。在一些方面，与包含参考间隔物的对应CAR相比，所述CAR诱导IFNγ表达增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍。在一些方面，与包含参考间隔物的对应CAR相比，所述CAR诱导IL-2表达增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍。在一些方面，抗原结合结构域包含与肿瘤抗原上的表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，肿瘤抗原包括ROR1、HER2、AFP、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺素(prostase)、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分、及其任何组合。
在一些方面，肿瘤抗原包括ROR1、CD19或Her2。在一些方面，抗原结合结构域包含抗ROR1抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗原结合结构域与R11抗体、R12抗体或2A2抗体交叉竞争。在一些方面，抗原结合结构域结合与R11抗体、R12抗体或2A2抗体相同的表位。在一些方面，抗原结合结构域包含R11抗体、R12抗体或2A2抗体的重链可变区(VH)CDR3。在一些方面，抗原结合结构域还包含VH CDR1和VH CDR2。在一些方面，VH CDR1包括R11抗体、R12抗体或2A2抗体的VH CDR1，和/或VH CDR2包括R11抗体、R12抗体或2A2抗体的VH CDR2。在一些方面，抗原结合结构域还包含轻链可变区(VL)CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些方面，VL CDR1包括R11抗体、R12抗体或2A2抗体的VL CDR1，VL CDR2包括R11抗体、R12抗体或2A2抗体的VL CDR2，和/或VL CDR3包括R11抗体、R12抗体或2A2抗体的VL CDR3。在一些方面，抗原结合结构域包含；(i)SEQ ID NO:4888的VH CDR1；SEQ ID NO:4889的VH CDR2；和SEQ ID NO:4890的VH CDR3；和/或SEQ ID NO:4892的VL CDR1；SEQ ID NO:4893的VL CDR2；和SEQ ID NO:4894的VL CDR3；(ii)SEQ ID NO:4896的VH CDR1；SEQ ID NO:4897的VHCDR2；和SEQ ID NO:4898的VH CDR23；和/或SEQ ID NO:4900的VL CDR1；SEQ ID NO:4901的VL CDR2；和SEQ ID NO:4902的VL CDR3；或(iii)SEQ ID NO:4904的VH CDR1；SEQ ID NO:4905的VH CDR2；和SEQ ID NO:4906的VH CDR23；和/或SEQ ID NO:4908的VL CDR1；SEQ IDNO:4909的VL CDR2；和SEQ ID NO:4910的VL CDR3。
在一些方面，抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中：(i)VH包含SEQ ID NO:4887；或者VL包含SEQ ID NO:4891；(ii)VH包含SEQ ID NO:4895；或者VL包含SEQ ID NO:4899；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:4903；或者VL包含SEQ ID NO:4907。在一些方面，抗原结合结构域包含有包含SEQ ID NO:4895的VH和包含SEQ ID NO:4899的VL；并且其中间隔物由SEQ ID NO:4830组成。在一些方面，CAR被设计为标准CAR、分体CAR(split CAR)、关闭CAR(off-switch CAR)、开启CAR(on-switch CAR)、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。在一些方面，抗原结合结构域是lg NAR、Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、微抗体、双体抗体(diabody)、三体抗体(triabody)、四体抗体(tetrabody)、胞内抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单抗体(unibody)、纳米抗体(nanobody)、亲和体(affibody)、DARPin、单体抗体(monobody)、adnectin、α体、或设计的粘合剂。在一些方面，CAR的细胞内结构域是来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号传导结构域。在一些方面，CAR还包含来源于2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、ICOS(CD278)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的共刺激结构域。
在一些方面，多核苷酸是DNA分子或RNA分子。在一些方面，跨膜结构域通过接头连接至细胞内结构域。在一些方面，CAR是双特异性CAR。在一些方面，CAR是诱导型CAR。
本公开还提供了一种载体，其包含可操作地连接至调控元件的本文公开的多核苷酸。在一些方面，载体是细菌载体、哺乳动物载体或细菌载体。在一些方面，载体是逆转录病毒载体。在一些方面，载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒(lentivirus)、仙台病毒载体(Sendai virus vector)、杆状病毒载体(baculoviral vector)、爱泼斯坦巴尔病毒载体(Epstein Barr viral vector)、乳多空病毒载体(papovaviral vector)、牛痘病毒载体(vaccinia viral vector)、单纯疱疹病毒载体(herpes simplex viral vector)、杂交载体和腺相关病毒(AAV)载体。在一些方面，载体是慢病毒。
本公开还提供了一种组合物，其包含本文公开的多核苷酸或本文公开的载体。还提供了一种药盒，其包含本文公开的多核苷酸、载体或组合物。还提供了一种由本文公开的一种或多种多核苷酸序列或载体编码的CAR。还提供了一种经遗传修饰以表达CAR的细胞，其包含本文公开的多核苷酸或载体。在一些方面，细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、ILC细胞、巨噬细胞或抗原呈递细胞。
本公开提供了一种组合物，其包含本文公开的CAR或本文公开的细胞。本公开还提供了一种本文公开的用于治疗需要CAR疗法的受试者的组合物。还提供了一种药物组合物，其包含本文公开用于治疗有需要的受试者的癌症的细胞或组合物。还提供了一种药盒，其包含本文公开的CAR、细胞、组合物或药物组合物。
本公开还提供本文公开的多核苷酸、载体、组合物、药盒、CAR、细胞、药物组合物或药盒用于制造用于治疗有需要的受试者的癌症的药物的用途。还提供了一种刺激受试者的T细胞介导的对靶细胞群或组织的免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞。还提供了一种在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞。还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞。还提供了一种制备用于疗法的细胞群的方法，其包括用本文公开的多核苷酸或载体转导从受试者分离的细胞群。在一些方面，转导包括在合适的条件下培养细胞。
本公开还提供了一种在经诊断患有癌症的受试者中生成持续存在的遗传工程细胞群的方法，所述方法包括向受试者施用经遗传工程改造以表达本文公开的CAR的细胞。还提供了一种在经诊断患有癌症的受试者中扩增遗传工程细胞群的方法，所述方法包括向受试者施用经遗传工程改造以表达本文公开的CAR的细胞。在一些方面，细胞是T细胞。在一些方面，细胞是自体T细胞。在一些方面，受试者是人受试者。
本公开还提供了一种改进CAR疗法的一种或多种性质的方法，其包括将CAR间隔物插入到CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，其中CAR间隔物是本文公开的多核苷酸中所述的间隔物。还提供了一种改进CAR疗法的一种或多种性质的方法，其包括将CAR间隔物插入到CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，其中CAR间隔物是本文公开的多核苷酸中所述的间隔物，其中间隔物位于配体结合结构域和跨膜结构域之间。在一些方面，CAR间隔物是本文公开的多核苷酸中所述的间隔物。在一些方面，CAR疗法的一种或多种改进性质是一种或多种细胞因子的分泌增加。在一些方面，相对于在施用包含参考间隔物的对应CAR后观察到的分泌，CAR诱导的细胞因子分泌增加。在一些方面，细胞因子是白介素。在一些方面，白介素是白介素-2。在一些方面，细胞因子是干扰素。在一些方面，干扰素是干扰素-γ。
本公开还提供了一种设计CAR间隔物的方法，其包括测量靶表位和靶细胞表面之间的距离，其中间隔物的序列是Ig铰链序列、其子序列或其组合。
附图说明
图1.示出了其结构域组织的CAR的示意图。本公开涉及工程改造CAR的细胞外间隔物组分。结合结构域可以是例如VH-VL或VL-VH取向的单链可变片段(scFv)、或抗体的任何抗原结合部分、或其组合。胞外域包含抗原结合结构域和CAR间隔物。胞内域也可以称为细胞内或胞质内结构域，并且包含ITAM和任选的共刺激模块。
图2.示出了不同代CAR之间的结构差异的示意图。第一代CAR包含经由跨膜区与ITAM直接连接的抗原结合结构域(例如，scFv)。第二代CAR包含插置在ITAM和跨膜结构域之间的共刺激分子(CM1)。第三代CAR包括额外的共刺激分子(CM2)。在第四代CAR中，共刺激分子已经被IL-12诱导物取代。第五代CAR基于第二代CAR，但它们含有截短的细胞质IL-2受体β链结构域。
图3.人免疫球蛋白结构的示意图。
图4.示出了IgA1和IgA2的结构域结构的示意图。
图5.IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的示意图。
图6.在不同的IgG3同种异型中存在(+)或不存在(-)的序列重复(a或b)。唯一天然存在的序列是ab、abb和abbb。
图7.间隔物长度、靶表位与靶细胞膜表面之间的距离、以及信号传导突触宽度之间的关系的示意图。
图8.IgG3铰链的模块化结构、以及来源于IgG3铰链的具有不同长度和组成的模块化间隔物的文库的示意图。
图9.实施例中使用的免疫球蛋白衍生的间隔物的列表(间隔物1-11和间隔物13-31)。每个间隔物可以包含任选的Gly-Ser柔性接头序列(示出了SEQ ID NO:4818的示例性GLy-Ser接头序列；在一些方面，接头可以是SEQ ID NO:5088)。表格示出了以氨基酸为单位的每个间隔物的长度和以埃为单位的理论扩展的构象长度(仅间隔物，或间隔物加上接头)。表格还表明是否存在半胱氨酸。
图10.定量了在不存在靶抗原的情况下，表达具有指定间隔物ROR1 CAR的T细胞和模拟(未转导)T细胞在24小时之后的IFN-γ分泌水平的条形图。用R12CAR-P2A-EGFRt转导R12 CART细胞。R12CAR：针对人ROR1的CAR。P2A：自切割肽。EGFRt：截短的人EGFR，含有EGFR细胞外结构域III和IV以及EGFR跨膜结构域，但缺少EGFR结构域I和II以及EGFR细胞内序列。“短”参考间隔物意指SEQ ID NO:4911的IgG4间隔物。
图11A.总结了在与表达人ROR1的H1975细胞共培养24小时期间，指定间隔物对R12CART细胞的IL-2和IFN-γ分泌的影响的图表。用R12CAR-P2A-EGFRt转导R12 CART细胞。
图11B.总结了在与表达人ROR1的H1975细胞共培养24小时期间，指定间隔物长度对R12 CART细胞的IL-2和IFN-γ分泌的影响的图表。用R12CAR-P2A-EGFRt转导R12 CART细胞。
图11C.总结了在与表达人ROR1的H1975细胞共培养期间，表达R12 CAR的T细胞的靶标裂解能力和细胞因子释放曲线之间的相关性的图表。通过对归一化靶细胞杀伤曲线下的面积(即，曲线下面积，或AUC)进行积分来测量靶标裂解能力。用R12 CAR-P2A-EGFRt转导R12 CART细胞。
图12A、12B、12C和12D.总结了在重复暴露于表达人ROR1的Jeko1细胞之后，由间隔物起源的抗体家族分开的指定间隔物对R12 CART细胞的长期细胞毒性活性的影响的图表。模拟(未转导)T细胞活性包括在每个图中用于比较。将与R12 CART细胞共培养3轮期间剩余的Jeko1细胞的数量归一化为每轮的第一个时间点(即，0小时、68小时和148小时)。用R12CAR-P2A-EGFRt转导R12 CART细胞。
图12E.基于图12A、12B、12C和12D中测量的长期细胞毒性活性来选择前五个间隔物(间隔物1、11、13、14和短)的长度。
图13A和13B.通过供体D3868(图13A)和D4869(图13B)中的原代T细胞上转导标志物EGFRt的表面表达测量的转导细胞百分比。
图13C和13D.供体D3868(图13C)和供体D4869(图13D)中的活转导细胞(EGFRt+细胞)上的结合的抗FMC63蛋白的中值荧光强度(MFI)。三角形表示给定免疫球蛋白类型内的间隔物长度减少。
图14A-14E.在供体D3868中表达人CD19靶抗原的NucLight Red标记的Raji(Raji-NLR)靶细胞的存在下，指定间隔物对FMC63CAR-T诱导的细胞毒性的影响。图14A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图14B示出了计算的图14A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图14C-14E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图14C)、IL-2(图14D)和TNFα(图14E)的浓度的条形图。“短”参考间隔物是SEQ ID NO:4911的IgG4铰链衍生的间隔物。“中”参考间隔物是SEQ ID NO:4912的IgG4铰链衍生的间隔物。“长”参考间隔物是SEQ ID NO:4913的IgG4铰链衍生的间隔物。所有IncuCyte动力学杀伤曲线都表示NucLight Red信号随时间的变化。未转导的原代T细胞在本图中和所有图中都表示为“NTC”。
图15A-15E.在供体D4869中表达人CD19靶抗原的Raji-NLR靶细胞的存在下，指定间隔物对FMC63 CAR-T诱导的细胞毒性的影响。图15A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图15B示出了计算的图14A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图15C-15E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图15C)、IL-2(图15D)和TNFα(图15E)的浓度的条形图。
图16A-16E.在供体D3868中表达人CD19靶抗原的NucLight Red标记的Nalm6(Nalm6-NLR)靶细胞的存在下，指定间隔物对FMC63 CAR-T诱导的细胞毒性的影响。图16A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图16B示出了计算的图14A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图16C-16E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图16C)、IL-2(图16D)和TNFα(图16E)的浓度的条形图。
图17A-17E.在供体D4869中表达人CD19靶抗原的Nalm6-NLR靶细胞的存在下，指定间隔物对FMC63 CAR-T诱导的细胞毒性的影响。图17A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图17B示出了计算的图14A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图17C-17E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图17C)、IL-2(图17D)和TNFα(图17E)的浓度的条形图。
图18A-18E.在供体D3868中具有CD19敲除的NucLight Red标记的Raji靶细胞(Raji_CD19_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对FMC63 CAR-T诱导的细胞毒性的影响。图18A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图18B示出了计算的图14A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图18C-18E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图18C)、IL-2(图18D)和TNFα(图18E)的浓度的条形图。
图19A-19E.在供体D4869中具有CD19敲除的NucLight Red标记的Raji靶细胞(Raji_CD19_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对FMC63 CAR-T诱导的细胞毒性的影响。图19A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图19B示出了计算的图14A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图19C-19E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图19C)、IL-2(图19D)和TNFα(图19E)的浓度的条形图。
图20A-20C.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D3868的表达指定间隔物的FMC63 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。具有间隔物的CAR-T在靶细胞不存在的情况下表现出升高的细胞因子产生被认为是表现出强直信号。
图21A-21C.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D4869的表达指定间隔物的FMC63 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。具有间隔物的CAR-T在靶细胞不存在的情况下表现出升高的细胞因子产生被认为是表现出强直信号。
图22A-22B.总结了与Raji-NLR细胞共培养时，FMC63CAR-T(间隔物由标记指示)细胞的靶标依赖性细胞因子分泌与杀伤AUC的散点图。图22A是供体D3868。图22B是供体D4869。表现最佳的间隔物位于图的左上角(高IFN-γ、高IL-2和低AUC)。
图23A-23D.总结了与表达人CD19的靶细胞共培养24小时后，指定间隔物长度对FMC63 CAR-T细胞的IL-2和IFNγ分泌的影响的散点图。阴影框表示导致最大细胞因子产生的间隔物长度的近似窗口。图23A示出了来源于供体D3868的与Raji细胞共培养的FMC63CAR-T。图23B示出了来源于供体D3868的与Nalm6细胞共培养的FMC63 CAR-T。图23C示出了来源于供体D4869的与Raji细胞共培养的FMC63 CAR-T。图23D示出了来源于供体D4869的与Nalm6细胞共培养的FMC63 CAR-T。
图24A和24B.总结了当表达人CD19的Raji细胞分别与来源于供体D3868(图24A)和供体D4869(图24B)的FMC63 CAR-T细胞共培养时，指定间隔物长度对杀伤AUC的影响的散点图。间隔物名称由标记指示。圆圈代表导致最快杀伤动力学的间隔物长度的近似窗口。
图25A-25D.总结了重复暴露于来源于供体D3868的表达人CD19的靶细胞后，指定间隔物对FMC63 CAR-T细胞的长期细胞毒性活性的影响的图表。图25A示出了Nalm6-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的FMC63 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图25B突出显示了在重复暴露于Nalm6细胞期间最具有长期细胞毒性的FMC63 CAR-T细胞的亚群。图25C示出了Raji-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的FMC63 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图25D突出显示了在重复暴露于Raji细胞期间最具有长期细胞毒性的FMC63 CAR-T细胞的亚群。
图26A-26D.总结了重复暴露于来源于供体D4869的表达人CD19的靶细胞后，指定间隔物对FMC63 CAR-T细胞的长期细胞毒性活性的影响的图表。图26A示出了Nalm6-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的FMC63 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图26B突出显示了在重复暴露于Nalm6细胞期间最具有长期细胞毒性的FMC63 CAR-T细胞的亚群。图26C示出了Raji-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的FMC63 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图26D突出显示了在重复暴露于Raji细胞期间最具有长期细胞毒性的FMC63 CAR-T细胞的亚群。
图27A和27B.通过供体D13814(图27A)和D15842(图27B)中的活原代T细胞上转导标志物EGFRt的表面表达测量的转导细胞百分比。
图27C和27D.供体D13814(图27C)和供体D15842(图27D)中的活转导细胞(EGFRt+细胞)上的结合的蛋白质L的MFI。三角形表示给定免疫球蛋白类型内的间隔物长度减少。
图28A-28E.在表达人Her2(人表皮生长因子受体2)靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对抗Her2 CAR-T诱导的细胞毒性的影响(使用来自供体D13814的T细胞)。图28A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图28B示出了计算的图28A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图28C-28E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图28C)、IL-2(图28D)和TNFα(图28E)的浓度的条形图。
图29A-29E.在表达人Her2(人表皮生长因子受体2)靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对抗Her2 CAR-T诱导的细胞毒性的影响(使用来自供体D15842的T细胞)。图29A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图29B示出了计算的图29A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图29C-29E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图29C)、IL-2(图29D)和TNFα(图29E)的浓度的条形图。
图30A-30E.在表达人Her2(人表皮生长因子受体2)靶抗原的NucLight Red标记的T47D靶细胞(T47D-NLR)的存在下，指定间隔物对抗Her2 CAR-T诱导的细胞毒性的影响(使用来自供体D13814的T细胞)。图30A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图30B示出了计算的图30A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图30C-30E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图30C)、IL-2(图30D)和TNFα(图30E)的浓度的条形图。
图31A-31E.在表达人Her2(人表皮生长因子受体2)靶抗原的NucLight Red标记的T47D靶细胞(T47D-NLR)的存在下，指定间隔物对抗Her2 CAR-T诱导的细胞毒性的影响(使用来自供体D15842的T细胞)。图31A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图31B示出了计算的图31A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图31C-31E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图31C)、IL-2(图31D)和TNFα(图31E)的浓度的条形图。
图32A-32E.在具有Her2敲除的NucLight Red标记的T47D靶细胞(T47D_Her2_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对抗Her2 CAR-T诱导的细胞毒性的影响(使用来自供体D13814的T细胞)。图32A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图32B示出了计算的图32A中的每条杀伤曲线计算的AUC。图32C-32E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图32C)、IL-2(图32D)和TNFα(图32E)的浓度的条形图。
图33A-33E.在具有Her2敲除的NucLight Red标记的T47D靶细胞(T47D_Her2_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对抗Her2 CAR-T诱导的细胞毒性的影响(使用来自供体D15842的T细胞)。图33A示出了具有指定间隔物的每个CAR变体的IncuCyte动力学杀伤曲线。图.33B示出了计算的图33A中的每条杀伤曲线计算的AU)。图33C-33E是示出了共培养24小时后共培养培养基中的IFN-γ(图33C)、IL-2(图33D)和TNFα(图33E)的浓度的条形图。
图34A-34C.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D13814的表达指定间隔物的抗Her2(人表皮生长因子受体2)CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图(IFNg，图34A；IL-2，图34B；TNFa，图34C)。具有间隔物的CAR-T在靶细胞不存在的情况下表现出升高的细胞因子产生被认为是表现出强直信号。
图35A-35C.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D15842的表达指定间隔物的抗Her2 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图(IFNg，图35A；IL-2，图35B；TNFa，图35C)。具有间隔物的CAR-T在靶细胞不存在的情况下表现出升高的细胞因子产生被认为是表现出强直信号。
图36A-36D.总结了与表达人Her2的靶细胞共培养时，抗Her2CAR-T(间隔物由标记指示)细胞的靶标依赖性细胞因子分泌与杀伤AUC的散点图。图36A：来源于供体D13814的抗Her2 CAR-T与A549细胞共培养。图36B：来源于供体D13814的抗Her2 CAR-T与T47D细胞共培养。图36C：来源于供体D15842的抗Her2 CAR-T与A549细胞共培养。图36D：来源于供体D15842的抗Her2 CAR-T与T47D细胞共培养。表现最佳的间隔物位于图的左上角(高IFN-γ、高IL-2和低AUC)。
图37A-37D.总结了与表达人Her2的靶细胞共培养24小时后，指定间隔物长度对抗Her2 CAR-T细胞的IL-2和IFNg分泌的影响的散点图。阴影框表示导致最大细胞因子产生的间隔物长度的近似窗口。图37A：来源于供体D13814的抗Her2 CAR-T与A549细胞共培养。图37B：来源于供体D13814的抗Her2 CAR-T与T47D细胞共培养。图37C：来源于供体D15842的抗Her2 CAR-T与A549细胞共培养。图37D：来源于供体D15842的抗Her2 CAR-T与T47D细胞共培养。
图38A-38D.总结了当表达人Her2的靶细胞与抗Her2CAR-T细胞共培养时，指定间隔物长度对杀伤AUC的影响的散点图。图38A：来源于供体D13814的抗Her2 CAR-T与A549细胞共培养。图38B：来源于供体D13814的抗Her2 CAR-T与T47D细胞共培养。图38C：来源于供体D15842的抗Her2 CAR-T与A549细胞共培养。图38D间隔物名称由标记指示。圆圈代表导致最快杀伤动力学的间隔物长度的近似窗口。
图39A-39D.总结了重复暴露于表达人Her2的靶细胞之后，指定间隔物对来自供体D13814的抗Her2 CAR-T细胞的长期细胞毒性活性的影响的图表。图39A示出了A549-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的抗Her2 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图39B突出显示了在重复暴露于A549细胞期间最具有长期细胞毒性的抗Her2 CAR-T细胞的亚群。图39C示出了T47D-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的抗Her2 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图39D突出显示了在重复暴露于T47D细胞期间最具有长期细胞毒性的抗Her2 CAR-T细胞的亚群。
图40A-40D.总结了重复暴露于表达人Her2的靶细胞之后，指定间隔物对来自供体D15842的抗Her2 CAR-T细胞的长期细胞毒性活性的影响的图表。图40A示出了A549-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的抗Her2 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图40B突出显示了在重复暴露于A549细胞期间最具有长期细胞毒性的抗Her2 CAR-T细胞的亚群。图40C示出了T47D-NLR靶细胞在与表达包含指定间隔物的CAR的抗Her2 CAR-T细胞共培养四轮期间的杀伤曲线。图40D突出显示了在重复暴露于T47D细胞期间最具有长期细胞毒性的抗Her2 CAR-T细胞的亚群。
图41.Ig折叠的三维结构(A)，以及折叠中结构元素的拓扑结构(B)。示出了β链二级结构元件的位置和连接β链的环区的位置。如下文所公开的，来自人或鼠免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定结构域(例如，CH1、CH2、CH3或CL恒定结构域)的每个环区或其片段(任选地包含来自相邻β链的一个或多个氨基酸)可以用作本公开的CAR间隔物。
图42.免疫球蛋白重链的多重序列比对，示出了叠加在序列比对上的二级结构(构象)。如本说明书中所公开的，具有螺旋二级结构或富含具有螺旋二级结构的氨基酸残基的子序列可以用作本公开的CAR间隔物。突出显示了具有高浓度脯氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的区域。
图43.免疫球蛋白轻链的多重序列比对，示出了叠加在序列比对上的二级结构(构象)。如本说明书中所公开的，具有螺旋二级结构或富含具有螺旋二级结构的氨基酸残基的子序列可以用作本公开的CAR间隔物。
图44A和44B.通过供体D7811(图44A)和供体D5018(图44B)中的活原代T细胞上转导标志物EGFRt的表面表达测量的转导细胞百分比。图44C和44D示出了供体D7811(图44C)和供体D5018(图44D)中的活转导细胞(EGFRt+细胞)上的结合的hROR1-Fc的MFI。
图45A-45C.在供体D7811中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对R11-CAR诱导的细胞毒性的影响。图45A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。未生成体外功能数据的间隔物在此图和下图中表示为“nd”(未确定)。图45B-C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图46A-46C.在供体D5018中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对R11-CAR诱导的细胞毒性的影响。图46A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图46B-C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图47A-47C.在供体D7811中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的H1975靶细胞(H1975-NLR)的存在下，指定间隔物对R11-CAR诱导的细胞毒性的影响。图47A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图47B-C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图48A-48B.在供体D5018中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的H1975靶细胞(H1975-NLR)的存在下，指定间隔物对R11-CAR诱导的细胞毒性的影响。图48A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图48B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。
图49A-49B.在供体D7811中具有ROR1敲除的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549_ROR1_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对R11-CAR诱导的细胞毒性的影响。图49A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图49B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。一小群ROR1+细胞存在于A549_ROR1_KO-NLR细胞系中，这解释了此测定中明显的杀伤(A)和细胞因子产生(B)。
图50A-50B.在供体D5018中具有ROR1敲除的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549_ROR1_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对R11-CAR诱导的细胞毒性的影响。图50A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图50B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。一小群ROR1+细胞存在于A549_ROR1_KO-NLR细胞系中，这解释了此测定中明显的杀伤(A)和细胞因子产生(B)。
图51.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D7811的表达具有指定间隔物的CAR的R11 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。在没有靶细胞的情况下，没有间隔物导致细胞因子产生升高，被认为是强直信号。
图52.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D5018的表达具有指定间隔物的CAR的R11 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。在没有靶细胞的情况下，没有间隔物导致细胞因子产生升高，被认为是强直信号。
图53A-53B.总结了当与表达人ROR1的靶细胞共培养时，指定间隔物长度对R11CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的影响的散点图。图53A：来源于供体D7811的R11 CAR-T与A549细胞共培养。图53B：来自供体D7811的R11CAR-T与H1975细胞共培养。
图54A-54B.总结了当与靶细胞共培养时，指定间隔物长度对R11 CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的影响的散点图。图54A：来源于供体D5018的R11 CAR-T与A549细胞共培养。图54B：来源于供体D5018的R11 CAR-T与H1975细胞共培养。
图55A和55B.通过供体D2735(图55A)和供体D5018(图55B)中的活原代T细胞上转导标志物EGFRt的表面表达测量的转导细胞百分比。
图55C和55D.供体D2735(图55C)和供体D5018(图55D)中的活转导细胞(EGFRt+细胞)上的结合的hROR1-Fc的MFI。
图56A-56C.在供体D2735中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对R12-CAR诱导的细胞毒性的影响。图56A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图56B和56C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图57A-57C.在供体D5018中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对R12-CAR诱导的细胞毒性的影响。图57A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图57B和57C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。
图58A-58C.在供体D2735中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的H1975靶细胞(H1975-NLR)的存在下，指定间隔物对R12-CAR诱导的细胞毒性的影响。图58A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图58B和58C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图59A-59C.在供体D5018中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的H1975靶细胞(H1975-NLR)的存在下，指定间隔物对R12-CAR诱导的细胞毒性的影响。图59A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图59B和59C是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g(B)和IL-2(C)的浓度的条形图。
图60A-60B.在供体D2735中具有ROR1敲除的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549_ROR1_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对R12-CAR诱导的细胞毒性的影响。图60A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图60B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。一小群ROR1+细胞存在于A549_ROR1_KO-NLR细胞系中，这解释了此测定中明显的杀伤(A)和细胞因子产生(B)。
图61A-61B.在供体D5018中具有ROR1敲除的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549_ROR1_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对R12-CAR诱导的细胞毒性的影响。图61A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图61B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。一小群ROR1+细胞存在于A549_ROR1_KO-NLR细胞系中，这解释了此测定中明显的杀伤(A)和细胞因子产生(B)。
图62.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D2735的表达具有指定间隔物的CAR的R12 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。在没有靶细胞的情况下，没有间隔物导致细胞因子产生升高，被认为是强直信号。
图63.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D5018的表达具有指定间隔物的CAR的R12 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。在没有靶细胞的情况下，没有间隔物导致细胞因子产生升高，被认为是强直信号。
图64A-64B.总结了当与表达人ROR1的靶细胞共培养时，指定间隔物长度对R12CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的影响的散点图。图64A：来源于供体D2735的R12 CAR-T与A549细胞共培养。图64B：来源于供体D2735的R12CAR-T与H1975细胞共培养。
图65A-65B.总结了当与靶细胞共培养时，指定间隔物长度对R12 CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的影响的散点图。图65A：来源于供体D5018的R12 CAR-T与A549细胞共培养。图65B：来源于供体D5018的R12 CAR-T与H1975细胞共培养。
图66A和66B.通过供体D2089(图66A)和供体D5018(图66B)中的活原代T细胞上转导标志物EGFRt的表面表达测量的转导细胞百分比。
图66C和66D示出了供体D2089(图66C)和供体D5018(图66D)中的活转导细胞(EGFRt+细胞)上的结合的hROR1-Fc的MFI。
图67A-67B.在供体D2089中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对2A2-CAR诱导的细胞毒性的影响。图67A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图67B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。
图68A-68B总结了在供体D5018中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549-NLR)的存在下，指定间隔物对2A2-CAR诱导的细胞毒性的影响。图68A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图68B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。
图69A-69B总结了在供体D2089中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的H1975靶细胞(H1975-NLR)的存在下，指定间隔物对2A2-CAR诱导的细胞毒性的影响。图69A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图69B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图70A-70B总结了在供体D5018中表达人ROR1靶抗原的NucLight Red标记的H1975靶细胞(H1975-NLR)的存在下，指定间隔物对2A2-CAR诱导的细胞毒性的影响。图70A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图70B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。空心条表示测定线性动态范围之外的测量值，因此不应进行定量解释。
图71A-71B.在供体D2089中具有ROR1敲除的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549_ROR1_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对2A2-CAR诱导的细胞毒性的影响。图71A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图71B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。一小群ROR1+细胞存在于A549_ROR1_KO-NLR细胞系中，这解释了此测定中明显的杀伤(A)和细胞因子产生(B)。
图72A-72B总结了在供体D5018中具有ROR1敲除的NucLight Red标记的A549靶细胞(A549_ROR1_KO-NLR)的存在下，指定间隔物对2A2-CAR诱导的细胞毒性的影响。图72A示出了计算的具有指定间隔物的每个CAR变体IncuCyte动力学杀伤曲线的AUC。图72B是示出了共培养后24小时后共培养培养基中的IFN-g的浓度的条形图。一小群ROR1+细胞存在于A549_ROR1_KO-NLR细胞系中，这解释了此测定中明显的杀伤(A)和细胞因子产生(B)。
图73.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D2089的表达具有指定间隔物的CAR的2A2 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。在没有靶细胞的情况下，没有间隔物导致细胞因子产生升高，被认为是强直信号。
图74.示出了在不存在靶细胞的情况下，来源于供体D5018的表达具有指定间隔物的CAR的2A2 CAR-T细胞的细胞因子分泌曲线的条形图。在没有靶细胞的情况下，没有间隔物导致细胞因子产生升高，被认为是强直信号。
图75A-75B.总结了当与表达人ROR1的靶细胞共培养时，指定间隔物长度对2A2CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的影响的散点图。图75A：来源于供体D2089的2A2 CAR-T与A549细胞共培养。图75B：来源于供体D2089的2A2CAR-T与H1975细胞共培养。
图76A-76B.总结了当与靶细胞共培养时，指定间隔物长度对2A2 CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的影响的散点图。图76A：来源于供体D5018的2A2 CAR-T与A549细胞共培养。图76B：来源于供体D5018的2A2 CAR-T与H1975细胞共培养。
图77A-77E.总结了当与表达人CAR的靶细胞共培养时，指定间隔物长度对FMC63、Her、R11、R12和2A2 CAR-T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌(点大小IFN-g)和杀伤AUC的不同影响的散点图。散点图表明了R12(图77A)、2A2(图77B)、FMC63(图77C)、Her(图77D)和R11(图77E)CAR的最佳间隔物长度。
图78A.用2,000,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长随时间的变化。
图78B.用2,000,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的体重随时间的变化。
图79A.用500,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长随时间的变化。
图79B.用500,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的体重随时间的变化。
图80.用2,000,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的存活百分比随时间的变化。
图81.用500,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的存活百分比随时间的变化。
图82.T细胞给药后第1天每毫升血液中的CD3+细胞的数量。高剂量代表2,000,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞。低剂量代表500,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞。
图83.T细胞给药后第1天每毫升血液中的CD3+EGFR+细胞(即CAR T细胞)的数量。高剂量代表2,000,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞。低剂量代表500,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞。
图84A-84L.用2,000,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的每毫升血液中的T细胞数量随时间的变化。图84A示出了CD3+细胞(所有T细胞)的血液PK，图84B示出了CD3+EGFR+细胞(所有CAR T细胞)的血液PK，图84C示出了CD3+CAR+细胞(所有CAR T细胞)的血液PK，图84D示出了CD8+细胞(所有CD8+ T细胞)的血液PK，图84E示出了CD8+EGFR+细胞(CD8+CAR T细胞)的血液PK，图84F示出了CD8+CAR+细胞(CD8+CAR T细胞)的血液PK，图84G示出了CD8+CD4+细胞(所有CD8+CD4+ T细胞)的血液PK，图84H示出了CD8+CD4+EGFR+细胞(CD8+CD4+CAR T细胞)的血液PK，图84I示出了CD8+CD4+CAR+细胞(CD8+CD4+CAR T细胞)的血液PK，图84J示出了CD4+细胞(所有CD4+ T细胞)的血液PK，图84K示出了CD4+EGFR+细胞(CD4+CAR T细胞)的血液PK，并且图84L示出了CD4+CAR+细胞(CD4+CAR T细胞)的血液PK。
图85A-85L.用500,000个具有指定R12间隔物构建体的CAR阳性T细胞治疗的小鼠中的每毫升血液中的T细胞数量随时间的变化。图85A示出了CD3+细胞(所有T细胞)的血液PK，图85B示出了CD3+EGFR+细胞(所有CAR T细胞)的血液PK，图85C示出了CD3+CAR+细胞(所有CAR T细胞)的血液PK，图85D示出了CD8+细胞(所有CD8+ T细胞)的血液PK，图85E示出了CD8+EGFR+细胞(CD8+CAR T细胞)的血液PK，图85F示出了CD8+CAR+细胞(CD8+CAR T细胞)的血液PK，图85G示出了CD8+CD4+细胞(所有CD8+CD4+ T细胞)的血液PK，图85H示出了CD8+CD4+EGFR+细胞(CD8+CD4+CAR T细胞)的血液PK，图85I示出了CD8+CD4+CAR+细胞(CD8+CD4+CART细胞)的血液PK，图85J示出了CD4+细胞(所有CD4+ T细胞)的血液PK，图85K示出了CD4+EGFR+细胞(CD4+CAR T细胞)的血液PK，并且图85L示出了CD4+CAR+细胞(CD4+CAR T细胞)的血液PK。
具体实施方式
本公开涉及包含来源于免疫球蛋白(Ig)铰链和/或恒定区序列的间隔物的CAR、编码这种CAR的多核苷酸、表达所述CAR的细胞和它们使用方法。本公开中示出了各个方面的非限制性实例。在一些方面，本公开的CAR间隔物是IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM铰链和/或恒定区的片段。在一些方面，CAR间隔物包含来自IgM铰链和/或来自恒定区的子序列，并且还含有来自其他区域的短末端序列，例如，CAR间隔物可以包含铰链子序列和CH1和/或CH2子序列。在一些方面，CAR间隔物可以包含连接两个恒定区的序列。
在一些方面，来源于恒定区(例如，重链恒定区和/或轻链恒定区)的CAR间隔物对应于具有高含量脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸或其组合的非结构化序列，并且通常对应于溶剂可及环。参见例如图41和图42。例如，间隔物15对应于连接IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2区域的β链A和β链B的柔性环的N末端区域。因此，在一些方面，本公开的CAR间隔物包含连接IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM人免疫球蛋白二级结构元件(例如，α螺旋、β链或其组合)的非结构化柔性环或这种环的片段、由其组成、或基本上由其组成。在一些方面，环序列从非人免疫球蛋白获得。适合用作本公开的CAR间隔物的环序列的位置可以由本领域技术人员识别，例如，经由使用程序(诸如DSSP、P-SEA、DEFINE_S、SSTRUC、STRIDE、PROSS或PALSSE)的PDB文件中的氨基酸残基的结构归属。在一些方面，适合作为本公开的CAR间隔物的序列是包含至少1、2、3、4、5或6个脯氨酸残基的免疫球蛋白结构域环序列。在一些方面，适合作为本公开的CAR间隔物的序列是免疫球蛋白结构域环序列，其中至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％的氨基酸残基是脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸或其组合。
在一些方面，本公开的CAR间隔物是基于例如测量CAR结合部分靶向的表位和靶细胞的质膜表面之间的距离和/或信号传导突触中的膜间距离而合理设计的。在一些方面，本公开的CAR间隔物是模块化序列，其包含至少一种来源于IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM铰链和/或恒定区的多核苷酸序列。
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定组合物或过程步骤，因此当然可以变化。本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的个别方面中的每一个具有离散的组分和特征，所述组分和特征可容易地与其他若干方面中任一个的特征分离或组合而不脱离本公开的范围或精神。任何叙述的方法均都可以以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序进行。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书整体来限定。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求限制。
因此，如下直接定义的术语通过参考说明书全文来更充分地定义。
I.术语
为了使本描述可以更容易被理解，首先定义某些术语。除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个都应当具有下文所述的含义。额外的定义在整个具体实施方案中列出。
应当注意，术语“一个(种)(a/an)”实体是指所述实体的一个(种)或多个(种)；例如”一个(种)核苷酸序列”应当理解为表示一个(种)或多个(种)核苷酸序列。因此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。还应注意，权利要求可以被草拟为排除任何可选元素。因此，此陈述旨在用作与权利要求要素的描述结合使用此类排他性术语如“单独地”、“仅”等或使用否定限制的先行基础。
此外，当在本文使用时，“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分的每一者的具体公开。因此，如本文中诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解，每当在本文中以措辞“包含”描述方面的情况下，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外类似方面。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，给技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用字典。
单位、前缀和符号都以其国际单位制(Système International de Unites,(SI))接受的形式表示。数值范围包括限定所述范围的数值。在列举值的范围的情况下，应当理解，还具体公开了在该范围的所列举的上限与下限之间的每个居间整数值及其每个分数，以及在此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限都可以独立地包括在该范围内或从该范围中排除，并且其中包括任一个限值、两个限值都不包括或包括两个限值的每个范围也涵盖于本公开中。因此，本文列举的范围被理解为所述范围内所有值(包括所列举端点)的简写。例如，1至10的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组中的任何数值、数值组合或子范围。
在明确列举值的情况下，应当理解，与所列举的值大致相同的数量或量的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，还具体公开了该组合的元素的每个子组合，并且所述子组合在本公开的范围内。相反，在分别公开不同元素或元素组的情况下，也公开了其组合。在本公开的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，特此还公开了其中每个替代方案单独地或与其他替代方案组合被排除在外的本公开的实例；本公开的多于一个要素可以具有此类排除，并且特此公开了具有此类排除的要素的所有组合。
核苷酸由其普遍接受的单字母代码提及。除非另外指明，否则核苷酸序列以5'至3'取向从左至右书写。核苷酸在本文中由其众所周知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。因此，‘a’表示腺嘌呤，‘c’表示胞嘧啶，‘g’表示鸟嘌呤，‘t’表示胸腺嘧啶，并且‘u’表示尿嘧啶。
氨基酸序列以氨基至羧基的取向从左至右书写。氨基酸在本文中由其众所周知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号来提及。
术语“约”在本文中用于表示近似、大致、左右或在该区域内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过使边界延伸高于和低于列出的数值来修饰该范围。一般来讲，术语“约”可以通过向上或向下(升高或降低)变化例如10％来将数值修饰为高于和低于陈述值。
术语“施用(administration)”、“施用(administering)”及其语法变体是指经由药学上可接受的途径将本公开的组合物(例如，编码CAR的多核苷酸或表达CAR的细胞)引入到受试者中。将本公开的组合物(例如，编码CAR的多核苷酸或表达CAR的细胞)引入到受试者中通过任何合适的途径来进行，包括瘤内、口服、经肺、鼻内、肠胃外(静脉内、动脉内、肌内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、鞘内、眼周或局部。
施用包括自我施用和通过另外的人施用。合适的施用途径允许组合物或剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内途径，则通过将组合物或剂引入到受试者的静脉内来施用所述组合物。
术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本或参考序列(例如，野生型序列)中的氨基酸残基。可以例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法取代亲本或参考序列(例如，野生型多肽序列)中的氨基酸。提及“位置X处的取代”是指在存在于位置X处的氨基酸被替代氨基酸残基取代。可以根据图式AnY描述取代模式，其中A是对应于天然或最初存在于位置n处的氨基酸的单字母代码，并且Y是取代氨基酸残基。在其他方面，可以根据图式An(YZ)描述取代模式，其中A是对应于取代天然或最初存在于位置n处的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且Y和Z是可以替代A的替代性取代氨基酸残基。
如本文所用，在应用于一个或多个感兴趣的值时，术语“大约”是指类似于所述参考值的值。术语“大约”是指在所述参考值的任一方向上的(大于或小于)10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这种数值将超过可能值的100％的情况)。
如本文所使用，术语“保守的”是指分别在所比较的两个或更多个序列的相同位置上未发生改变的多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在较为相关的序列之间比出现于序列的其他地方的核苷酸或氨基酸保守的那些核苷酸或氨基酸。
在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有100％同一性，则称它们为“完全保守的”或“同一的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性，则称它们为“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有约70％同一性、约75％同一性、约80％同一性、约85％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则称它们为“保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有至少约30％同一性、至少约35％同一性、至少约40％同一性、至少约45％同一性、至少约50％同一性、至少约55％、至少约60％同一性、至少约65％同一性、至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性，则称它们为“保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约35％同一性、约40％同一性、约45％同一性、约50％同一性、约55％同一性、约60％同一性、约65％同一性、约70％同一性、约75％同一性、约80％同一性、约85％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则称它们为“保守的”。序列的保守性可以应用于多核苷酸或多肽的全长，或者可以应用于其一部分、区域或特征。
如本文所用的术语“来源于”表示第一分子和第二分子之间的关系(例如，结构相似性)。例如，在本公开的包含来源于人免疫球蛋白的氨基酸序列(例如，铰链和/或恒定区序列)的CAR间隔物的情况下，来源于人免疫球蛋白序列(例如，铰链和/或恒定区序列)的序列可以包含或由以下组成：完整铰链、铰链片段、完整铰链或铰链片段加上与野生型免疫球蛋白中的铰链相邻的额外残基(例如，来自恒定结构域(诸如CH1或CH2)的一个或多个氨基酸)，或可以包含或由以下组成：环区的完整序列、环区片段或环区片段加上与野生型免疫球蛋白中的环相邻的额外残基(例如，来自与CH1、CH2或CH3结构域中的环区相邻的二级结构元件(例如，β折叠)的一个或多个氨基酸)。在一些方面，来源于恒定结构域的间隔物可以来源于轻链恒定结构域(CL)。
如本文所用的术语“环区域”是指连接两个区域的氨基酸残基一级序列，所述两个区域包含来自环区域的一级结构的直接N末端和C末端方向中的二级结构(诸如α螺旋或β折叠)。环区域的实例包括但不限于CH2或CH3环区域。免疫球蛋白折叠包含7-9条反平行β链的2层夹层结构，所述β链排列在两个具有希腊键拓扑结构(Greek key topology)的β折叠中。参见图41。因此，本公开的恒定结构域衍生的CAR间隔物可以包含连接免疫球蛋白结构域(例如，恒定免疫球蛋白结构域(例如，CH1、CH2、CH3或CL))中的β折叠A和β折叠B、β折叠B和β折叠C、β折叠C和β折叠C'、β折叠C'和β折叠C”、β折叠C”和β折叠D、β折叠D和β折叠E、β折叠E和β折叠F或β折叠F和β折叠G的环序列(或其片段)、由其组成、或基本上由其组成。
本文公开的来源于人Ig免疫球蛋白(例如，铰链和/或恒定区序列)的CAR间隔物还涵盖通过肽键共价连接生成的序列。如上文所述的铰链区衍生的序列(即，间隔物)可以是包含完整铰链、其片段或其组合的多个重复的聚合物。
在一些方面，来源于第二核酸序列的核酸序列可以包括与所述第二核酸序列的核苷酸序列同一或基本相似的核苷酸序列。在核苷酸或多肽的情况下，衍生的物种可以通过例如天然存在的诱变、人工定向诱变或人工随机诱变获得。用于衍生核苷酸或多肽的诱变可以是有意定向的或有意随机的，或是两者的混合。产生来源于第一核苷酸或多肽的不同核苷酸或多肽的核苷酸或多肽的诱变可以是随机事件(例如，由聚合酶失真导致)并且衍生的核苷酸或多肽的鉴定可以通过适当的筛选方法(例如，如本文所述)来进行。多肽的诱变通常需要对编码所述多肽的多核苷酸进行操作。
在一些方面，来源于第二核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列分别与所述第二核苷酸或氨基酸序列具有至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的序列同一性，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物活性。
术语“互补的”和“互补性”是指通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对规则彼此相关的两种或更多种低聚物(即，各自包含核碱基序列)，或在低聚物与靶基因之间。例如，核碱基序列“T-G-A(5'→3')”与核碱基序列“A-C-T(3'→5')”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则，给定核碱基序列的少于所有核碱基与另一个核碱基序列匹配。例如，在一些方面，给定核碱基序列与另一个核碱基序列之间的互补性可以是约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。或者，在给定核碱基序列与另一个核碱基序列之间可以存在“完全”或“完美”(100％)互补性以继续所述实例。核碱基序列之间的互补性程度对序列之间杂交的效率和强度具有显著影响。
术语“下游”是指位于参考核苷酸序列3’的核苷酸序列。在某些方面，下游核苷酸序列涉及转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5’的核苷酸序列。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”和“抗体”涵盖无论是天然产生的还是部分或全部合成产生的免疫球蛋白及其抗原结合部分。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗原结合结构域”和“抗体”还包括包含来自免疫球蛋白基因或其部分的框架区的多肽，所述多肽特异性地结合并识别抗原，并且包含至少一个CDR。术语“抗原结合结构域”和“抗体”的使用意图包括完整抗体、多克隆、单克隆和重组抗体、其部分，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、小鼠-人抗体、小鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体构建体，诸如，例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd、二硫键连接的Fv(dsFc)以及抗体相关多肽。
在一些方面，“抗原结合部分”是指与抗原接触的多肽序列，包括但不限于来源于抗体的CDR。
抗原结合部分还可以掺入到单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology23:1126-1136,2005)。抗原结合部分还可以移植到基于多肽(诸如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。因此，术语“抗原结合结构域”和“抗体”还包括基于III型纤连蛋白结构域的支架的抗体模拟物(单体抗体)、其中移植了一个或多个CDR的其他支架系统(例如，腱生蛋白)、适体等。
术语“抗原结合结构域”和“抗体”还包括可以根据本公开使用的其他合适的抗原结合结构域，例如，纳米抗体、VHH抗体、DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)、亲和体、单体抗体、adnectin、α体、白蛋白结合结构域、Adhiron、Affilin和其他γ-B晶状体蛋白衍生的人工蛋白、Affimer、Affitin(NANOFITINTM)、Anticalin、犰狳重复蛋白(ARM重复蛋白，诸如，例如，β连环蛋白、a-importing、斑珠蛋白(plakoglobin)、腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposis coli)、ARMC4、ARMCX3等)、Atrimer(例如，四连接素和衍生的蛋白质)、Avimer/Maxibody、Centyrin、Fynomer和其他Fyn SH3结构域衍生的蛋白质、Kunitz结构域、Obody/OB折叠、Pronectin、Repebody或任何合成和/或计算设计的结合蛋白或支架。
抗体的模块化结构已被利用来产生超过60种不同的双特异性或多特异性抗体形式。因此，在一些方面，抗体可以处于选自以下的形式：例如，crossMab、DAF(双重作用Fab)(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、普通杵臼LC(Knobs-in-holes common LC)、杵臼组件(Knobs-in-holes assembly)、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、三功能单抗(triomab)、LUZ-Y(具有诱导2个HC的异二聚化的亮氨酸拉链的双特异性抗体)、Fcab、Kλ体、正交Fab、DVD-IgG(双可变结构域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG(四合一)、纳米抗体、纳米抗体-HSA、BiTE(双特异性T细胞衔接剂)、双体抗体、DART(双亲和性再靶向)、TandAb(串联抗体)、sc双体抗体、sc双体抗体-CH3、三重抗体(Triple Body)、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HC Ab、sc双体抗体-Fc、双体抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体、Dock and Locck、ImmTAC、HSAbody、sc双体抗体-HSA、串联scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-Body和scFv1-PEG-scFV2。
“抗原结合结构域”和“抗体”还包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性或功能即可。在一些方面，本公开的CAR包含细胞外抗原结合结构域，例如scFv。
术语“scFv”是指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体部分和至少一个包含重链可变区的抗体部分，其中轻链和重链可变区是连续连接的，例如经由合成接头(例如，短柔性多肽接头)，并且能够被表达为单链多肽，并且其中所述scFv保留衍生所述scFv的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以具有任何顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，scFv可以包含VL接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的氨基酸序列，其赋予抗原特异性和结合亲和力。例如，一般来讲，每个重链可变区中有三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，包括Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些或其组合。在Kabat编号方案下，在一些实施方案中，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia编号方案下，在一些实施方案中，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于作为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；以及VL(例如，哺乳动物VL，例如，人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
术语“抗原”是指激发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)都可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体分子特异性相互作用的抗原部分。此类部分在本文中被称为表位决定簇，通常包含诸如氨基酸侧链或糖侧链的元件，或者是所述元件的一部分。表位决定簇可以例如通过本领域已知的方法来定义，例如通过结晶学或通过氢-氘交换。抗体分子上的与表位决定簇特异性相互作用的部分中的至少一个或一些通常位于CDR中。通常，表位具有特定的三维结构特征。通常，表位具有特定的电荷特征。一些表位是线性表位，而其他表位是构象表位。
术语“自体”是指来源于同一个体的任何材料，之后将所述材料重新引入到所述个体中。
术语“嵌合抗原受体”或替代的“CAR”是指一组多肽，通常是最简单形式的两种多肽，当在免疫效应细胞中时，CAR为细胞提供对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且提供细胞内信号生成。在一些方面，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(也称为“细胞内信号传导结构域”)，所述细胞质信号传导结构域包含来源于下文定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，所述组的多肽在相同的多肽链中，例如，包含嵌合融合蛋白。在一些方面，所述组的多肽彼此不连续，例如，在不同的多肽链中。在一些方面，所述组的多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链(CD3ζ)。在一些方面，细胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如，CD3ζ的初级信号传导结构域)。在一些方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个来源于至少一种下文定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如，4-1BB、CD27和/或CD28。
在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来源于刺激分子的功能性信号传导结构域，其中抗原结合结构域和跨膜结构域通过CAR间隔物连接。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含经由CAR间隔物连接的抗原结合结构域和跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来源于共刺激分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含经由CAR间隔物连接的抗原结合结构域和跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来源于一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含经由CAR间隔物连接的抗原结合结构域和跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来源于一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，CAR包含CAR的氨基末端(N末端)处的任选的前导序列。在一些方面，CAR还包含抗原结合结构域的N末端处的前导序列，其中在CAR的细胞加工和定位到细胞膜期间，前导序列任选地从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。
术语“癌症”是指以异常细胞不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且所述实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语都涵盖实体瘤和液体瘤，例如弥漫性或循环性肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括癌前病变以及恶性癌症和肿瘤。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”或其变体可互换地指代与正常细胞相比，优先在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(通常是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于将药理学药剂优先靶向癌细胞。在一些方面，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在某些方面，肿瘤抗原来源于包括但不限于以下的癌症：原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾脏癌和腺癌，诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
在一些方面，肿瘤抗原是特定增殖性疾病共有的抗原。在一些方面，癌症相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多倍过表达。在一些方面，癌症相关抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些方面，癌症相关抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。
如本文所用，“抗肿瘤作用”是指可以通过各种方式表现的生物学作用，包括但不限于，例如，肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。
“抗癌作用”也可以通过本文所述的CAR、编码CAR的多核苷酸、载体和细胞首先预防癌症发生的能力来表现。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种方式表现的生物学作用，包括但不限于，例如，肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被另一个来自相同侧链家族的氨基酸替代，则所述取代被认为是保守的。在另一个方面，氨基酸串可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上相似的串保守替代。
非保守氨基酸取代包括其中(i)具有带正电侧链的氨基酸残基(例如Arg、His或Lys)被取代成或被带负电残基(例如Glu或Asp)取代的那些取代；(ii)亲水残基(例如Ser或Thr)被取代成或被疏水残基(例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代的那些取代；(iii)半胱氨酸或脯氨酸被取代成或被任何其他残基取代的那些取代；或(iv)具有大量疏水或芳香族侧链的残基(例如Val、His、Ile或Trp)被取代成或被具有较小侧链的残基(例如Ala或Ser)或无侧链的残基(例如Gly)取代的那些取代。
还可以使用其他氨基酸取代。例如，对于氨基酸丙氨酸，取代可以取自D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任一种。对于赖氨酸，替代物可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸中的任一种。一般来讲，功能重要区域中的可以预期诱导分离的多肽的性质变化的取代是其中(i)极性残基(例如丝氨酸或苏氨酸)被取代成疏水残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸)(或被其取代)的那些取代；(ii)半胱氨酸残基被取代成任何其他残基(或被其取代)的那些取代；(iii)具有带正电侧链的残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被取代成具有带负电侧链的残基(例如谷氨酸或天冬氨酸)(或被其取代)的那些取代；或(iv)具有大量侧链的残基(例如苯丙氨酸)被取代成不具有这种侧链的残基(例如甘氨酸)(或被其取代)的那些取代。前述非保守取代之一可以改变蛋白质的功能性质的可能性还与取代相对于蛋白质的功能重要区域的位置相关：因此，一些非保守取代对生物性质的影响很小或没有影响。
在本公开的内容中，如上定义的术语“突变”和“氨基酸取代”(有时简称为“取代”)被认为是可互换的。
在本公开的上下文中，取代(即使当它们被称为氨基酸取代时)在核酸水平下进行，即，使用替代氨基酸残基取代氨基酸残基通过用编码第二氨基酸的密码子取代编码第一氨基酸的密码子来进行。
如本文中所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。一般来讲，术语“同源性”表示两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性两者。
在一些方面，如果聚合物分子中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的单体是同一的(完全相同的单体)或相似的(保守取代)，则所述聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
如本文中所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多肽分子或多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间的整体单体保守性。没有任何额外限定符的术语“同一的”，例如蛋白A与蛋白B同一，表示序列是100％同一的(100％序列同一性)。将两个序列描述为例如“70％同一”等同于将它们描述为具有例如“70％序列同一性”。
例如，可以通过出于最佳比较的目的比对(例如，可以在第一多肽序列和第二多肽序列之一或两者中引入缺口以实现最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同一的序列)两个序列来执行两个多肽序列的同一性百分比的计算。在某些方面，出于比较的目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较对应氨基酸位置处的氨基酸。
当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸占据时，则所述分子在该位置处是同一的。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以获得两个序列的最佳比对的缺口的数量和每个缺口的长度的情况下，由序列共享的相同位置的数量的函数。可以使用数学算法来实现序列比较以及确定两个序列之间的同一性百分比。
合适的软件程序可以从各种来源获得，并用于比对蛋白质和核苷酸序列。用于确定序列同一性百分比的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国家生物技术信息中心BLAST网址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法执行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序为，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
序列比对可以使用本领域已知的方法(诸如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等)进行。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶向序列内的不同区域可以各自具有其自身的序列同一性百分比。应当注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14被舍到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19被入到80.2。还应当注意，长度值将总是整数。
在某些方面，第一氨基酸序列(或核苷酸序列)与第二氨基酸序列(或核苷酸序列)的同一性百分比(％ID)计算为％ID＝100x(Y/Z)，其中Y为在第一和第二序列比对(如通过目测或特定的序列比对程序进行比对)中被评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)数，并且Z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
本领域的技术人员将理解，用于计算百分比序列同一性而生成的序列比对不限于仅通过一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。还应理解，序列比对可以通过将序列数据与来自异构源的数据(诸如结构数据(例如，结晶学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据)整合而生成。整合异源数据以生成多重序列比对的合适程序是可以在www.tcoffee.org获得并且或者可以例如从EBI获得的T-Coffee。还应当理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动进行(curated)。
如本文中所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此的相似性百分比的计算可以以与计算同一性百分比相同的方式执行，不同之处在于相似性百分比的计算考虑了本领域已知的保守取代。应当理解，相似性的百分比取决于所使用的比较标准，即，是否例如根据氨基酸的进化接近度、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳香性、等电点、抗原性或其组合来比较氨基酸。
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”、“提取的”及其语法变体可互换使用,并且指代已经历一个或多个纯化过程的本公开的期望组合物(例如本公开的CAR)的制剂状态。在一些方面，如本文所用的分离或纯化是从含有污染物的样品中除去、部分除去(例如，一部分)本公开的组合物(例如本公开的CAR)的过程。
在一些方面，分离的组合物不具有可检测的不期望的活性，或者替代地，不期望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其他方面，分离的组合物的本公开的期望组合物的量和/或浓度处于或高于可接受的量和/或浓度和/或活性。在其他方面，与从其中获得组合物的起始材料相比，分离的组合物得到富集。与起始材料相比，这种富集可以是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于99.9999％。
在一些方面，分离的制剂基本上不含残留生物产物。在一些方面，分离的制剂100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何污染性生物物质。残留生物产物可以包括非生物材料(包括化学物质)或不想要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。
“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”及其语法变体可互换使用，并且是指呈单链形式或双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯。单链核酸序列是指单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，并且特别是DNA或RNA分子，仅指代分子的一级和二级结构，并且不将其限于任何特定三级形式。因此，这个术语包括尤其见于线性或环状DNA分子(例如限制片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中的双链DNA。在讨论特定的双链DNA分子的结构中，本文可以根据仅给出沿DNA的非转录链(即，所述链具有与mRNA同源的序列)5'至3'方向的序列的标准惯例来描述序列。
“重组DNA分子”是已经经历分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本公开的“核酸组合物”包含一种或多种如本文所述的核酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物)的聚合物。这个术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。更特别地，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)和聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括mRNA(无论是剪接的还是未剪接的)、为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的任何其他类型的多核苷酸，以及含有正常核骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和多吗啉代聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，前提条件是所述聚合物含有以允许碱基配对和碱基堆积的构型存在的核碱基，诸如存在于DNA和RNA中的碱基。
在一些方面，本文公开的多核苷酸包含DNA，例如插入载体中的DNA。在其他方面，本文公开的多核苷酸包含mRNA。在一些方面，mRNA是合成mRNA。在一些方面，合成mRNA包含至少一种非天然核碱基。在一些方面，某一类的所有核苷碱基已被非天然核苷碱基替代(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷都可以被非天然核苷碱基(例如，5-甲氧基尿苷)替代)。
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列作为生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列以及由其导致的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
除非另有说明，否则“编码”氨基酸序列的核苷酸序列，例如，“编码”本公开的CAR的多核苷酸，包括彼此为简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以包含修饰的氨基酸。所述术语还涵盖已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所用，术语“多肽”是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直向同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单一的多肽或可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可以应用于氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面，“肽”的长度可以少于或等于50个氨基酸，例如，长度为约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸。
“重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。出于本公开的目的而分离的在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是已通过任何合适的技术被分离、分级分离或部分或基本上被纯化的天然或重组多肽。可以使用本领域已知的方法重组产生本文公开的多肽。在一些方面，本公开的CAR是重组产生的。在一些方面，本公开的CAR由细胞(例如T细胞)在用编码本公开的CAR的至少一种多核苷酸o载体转染后产生。
如本文所用，术语多肽的“片段”(例如，Ig铰链)是指短于天然存在的序列的多肽的氨基酸序列，其与天然存在的多肽相比N末端和/或C末端缺失或者多肽的任何部分缺失。因此，片段不必需要仅具有N末端和/或C末端氨基酸缺失。相对于天然存在的序列，其中内部氨基酸已经缺失的多肽也被认为是片段。
如本文所用，术语“功能片段”是指保留多肽功能的多肽片段。因此，在一些方面，Ig铰链的功能片段保留将CAR中的抗原结合结构域(例如，scFv)定位在距离靶表位(例如，肿瘤抗原)一定距离处的能力，使得抗原结合结构域(例如，scFv)可以有效地与靶表位(例如，肿瘤抗原)相互作用。
Ig铰链片段是否是功能片段可以通过本领域已知的任何方法来评估，以确定包含间隔物的CAR与靶抗原的结合和T细胞活化，所述方法包括例如蛋白质印迹、FACS分析、细胞因子分泌分析、细胞存活分析等。在某些方面，Ig铰链功能片段是当用作CAR中的间隔物时，导致CAR具有参考CAR的例如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％活性的片段。如本文所用，术语“参考CAR”是指包含与测试的CAR相同的结构组分但包含不同的间隔物(“参考间隔物”)的对应CAR。在一些方面，参考间隔物是例如IgG1间隔物，即对应于IgG1的铰链区的间隔物。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可以生成变体来改进或改变多肽的特性。例如，可以从分泌的蛋白质的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸，而基本不损失生物功能。以引用方式整体并入本文的Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)报道了即使在缺失3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，从这种蛋白质的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基后，干扰素γ表现出至多高十倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，以引用方式整体并入本文)。
此外，大量证据表明，变体通常保留与天然存在的蛋白质的生物活性相似的生物活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem268:22105-22111(1993)，以引用方式整体并入本文)对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们使用随机诱变生成了超过3,500单独的IL-1a突变体，所述突变体在分子的整个长度上平均每个变体具有2.5个氨基酸变化。在每个可能的氨基酸位置检查到多个突变。研究人员发现“所述分子的大部分可以被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响”。(参见摘要)。实际上，在所检查的超过3,500个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生活性与野生型显著不同的蛋白质。
如上所述，变体或衍生物包括例如修饰的多肽。在一些方面，变体或衍生物(例如多肽、多核苷酸、脂质、糖蛋白)是化学修饰和/或内源修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体内修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体外修饰的结果。在其他方面，变体或衍生物是生产者细胞(例如T细胞)中细胞内修饰的结果。
存在于变体和衍生物中的修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人，Blood 116:270-79(2010)以引用方式整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯基化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸至蛋白质的添加，诸如精氨酰化和遍在蛋白化。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递信息来发挥作用，通过限定的信号通路、通过生成第二信使或通过响应此类信使而充当效应子来调控细胞活动。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以生成促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号。例如，CART细胞中的免疫效应子功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一些方面，细胞内信号结构域是转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可以用于替代完整的链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意图包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些结构域。例如，在CAR T的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含信号传导基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于来源于CD3ζ、FcRγ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些。
术语“共价连接的”、“融合的”及其语法变体可互换使用，并且是指第一部分(例如，第一氨基酸序列或核苷酸序列)分别共价或非共价地连接至第二部分(例如，第二氨基酸序列或核苷酸序列)。所述第一部分可以直接连接至或并列于所述第二部分，或者替代地，居间部分可以将所述第一部分共价连接至所述第二部分。术语“连接的”不仅意指第一部分与第二部分在C末端或N末端处的融合，还包括将整个第一部分(或第二部分)插入到第二部分(或相应地，第一部分)中的两个点(例如，氨基酸)之间。在一些方面，第一部分通过肽键或接头与第二部分连接。第一部分可以通过磷酸二酯键或接头与第二部分连接。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽或多核苷酸链或任何化学分子)。
如本文中所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种其他化学组分(诸如药学上可接受的载体和赋形剂)混合或掺混或悬浮于其中的本文所述的化合物中的一种或多种，诸如，例如本公开的CAR或本公开的表达CAR的细胞。药物组合物的一个目的是促进向受试者施用例如本公开的表达CAR的细胞的制剂。
术语“赋形剂”和“载体”可互换使用，并且是指添加至药物组合物中以进一步促进施用化合物(例如本公开的CAR)的惰性物质。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”及其语法变体涵盖美国联邦政府的监管机构批准的或美国药典中列出的用于包括人在内的动物的任何剂，以及不导致产生以至于禁止向受试者施用所述组合物的程度的不期望的生理效应并且不消除所施用的化合物的生物活性和性质的任何载体或稀释剂。包括可用于制备药物组合物并且通常是安全、无毒且期望的赋形剂和载体。
术语“受试者”、“患者”、“个体”和“宿主”及其变体在本文中可互换使用，并且是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，包括但不限于人、家养动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)，特别是人。本文描述的方法适用于人疗法和兽医应用。
如本文所用，短语“有需要的受试者”包括将受益于施用本公开的CAR以例如改善止血的受试者，诸如哺乳动物受试者。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指例如疾病或疾患的严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈所述疾病或疾患。所述术语还包括疾病或疾患或其症状的防治或预防。在一些方面，术语“治疗”或“治疗”是指在受试者中诱导针对抗原的免疫反应。
如本文所用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”及其变体是指部分或完全延迟疾病、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟从特定疾病、病症和/或疾患的进展；和/或降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。在一些方面，通过防治性治疗来实现预防结果。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以对有需要的受试者产生期望的治疗作用、药理学和/或生理学作用的包含本公开的CAR的试剂或药物化合物的量。
在防治可以被认为是疗法时，治疗有效量可以是“防治有效量”。如本文所用，“防治性(prophylactic)”是指用于预防疾病或疾患的发作或用于预防或延迟与疾病或疾患相关的症状的治疗或作用过程。如本文所用，“防治(prophylaxis)”是指为维持健康和预防疾病或疾患的发作或预防或延迟与疾病或疾患相关的症状而采取的措施。
II.具有Ig衍生的间隔物的CAR
本公开提供了免疫球蛋白(Ig)衍生的CAR间隔物(例如，来源于铰链区或环区)，其可用于表达一种或多种嵌合抗原受体的细胞。这些CAR间隔物包含例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM铰链区、其片段(单独或被例如CH1或CH2区域序列的额外序列加帽)或来自IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM铰链区的片段的组合。在一些方面，CAR间隔物包含例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM恒定结构域环区、其片段(单独或被例如来自相邻β链的额外的序列加帽)或来自IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM环区的片段的组合。在一些方面，本公开的CAR间隔物包含铰链区衍生序列、环区衍生序列或其组合。
因此，本公开提供了编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含例如(i)抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，(iii)细胞内结构域，和(iv)包含来源于人免疫球蛋白(Ig)铰链和/或环区的氨基酸序列的CAR间隔物(即，本公开的CAR间隔物)，以及任选的接头(例如，富含gly-ser的接头)，其中间隔物位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些方面，本公开提供了一种重组核酸构建体，其包含编码本公开的CAR的转基因。本公开还提供了一种由本文公开的多核苷酸序列或载体中的一种或多种编码的CAR。在一些方面，本公开的CAR被设计为标准CAR、分体CAR、关闭CAR、开启CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR、第四代CAR或第五代CAR。
如本文所用的术语“CAR间隔物”是指能够将两个间隔部分(即CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域)共价连接在一起的多肽序列。
术语“本公开的CAR间隔物”和“Ig衍生的CAR间隔物”可互换用于指代
(i)“铰链区衍生的CAR间隔物”，即包含来源于位于人免疫球蛋白(例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM)的CH1和CH2恒定结构域之间的铰链区的氨基酸序列和任选的来自相邻CH1和/或CH2结构域的一个或多个氨基酸或其组合的CAR间隔物(例如，若干个连续的铰链区衍生的CAR间隔物)；
(ii)“环区衍生的CAR间隔物”，即包含来源于人免疫球蛋白(例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM)的恒定区的环区的氨基酸序列和任选的来自相邻β链的一个或多个氨基酸或其组合的CAR间隔物(例如，若干个连续的环区衍生的CAR间隔物)；或
(iii)它们的组合(例如，两个或更多个连接的铰链区衍生的CAR间隔物和环区衍生的CAR间隔物)。
在一些方面，术语本公开的CAR间隔物是指选自由以下组成的组的免疫球蛋白重链的子序列：人IgA1(Uniprot:P01876，IGHA1_人，免疫球蛋白重恒定α1；SEQ ID NO:4994)、人IgA2(Uniprot P01877，IGHA2_人，免疫球蛋白重恒定α2；SEQ ID NO:4995)、鼠IgG2A(Uniprot P01665，GCAM_鼠，免疫球蛋白γ2A链C区；SEQ ID NO:4993)、人IgG1(UniprotP01857，IGHG1_人，免疫球蛋白重恒定γ1；SEQ ID NO:4998)、人IgG2(Uniprot P01859，IGHG2_人，免疫球蛋白重恒定γ2；SEQ ID NO:4999)、人IgG3(Uniprot P01860，IGHG3_人，免疫球蛋白重恒定γ3；SEQ ID NO:5000)、人IgG4(Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重恒定γ4；SEQ ID NO:5001)、人IgD(Uniprot P01880，IGHD_人，免疫球蛋白重恒定δ；SEQ IDNO:4996)、人IgE(Uniprot P01854，IGHE_人，免疫球蛋白重恒定链ε；SEQ ID NO:4997)或IgM(Uniprot P01871，IGHM_人，免疫球蛋白重恒定μ；SEQ ID NO:5002)，其中所述子序列包含CH1-CH2铰链区或其部分。在一些方面，子序列还包含CH1和/或CH2恒定结构域的相邻部分。
在一些方面，术语本公开的CAR间隔物是指选自由以下组成的组的免疫球蛋白重链的子序列：人IgA1(Uniprot:P01876，IGHA1_人，免疫球蛋白重恒定α1；SEQ ID NO:4994)、人IgA2(Uniprot P01877，IGHA2_人，免疫球蛋白重恒定α2；SEQ ID NO:4995)、鼠IgG2A(Uniprot P01665，GCAM_鼠，免疫球蛋白γ2A链C区；SEQ ID NO:4993)、人IgG1(UniprotP01857，IGHG1_人，免疫球蛋白重恒定γ1；SEQ ID NO:4998)、人IgG2(Uniprot P01859，IGHG2_人，免疫球蛋白重恒定γ2；SEQ ID NO:4999)、人IgG3(Uniprot P01860，IGHG3_人，免疫球蛋白重恒定γ3；SEQ ID NO:5000)、人IgG4(Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重恒定γ4；SEQ ID NO:5001)、人IgD(Uniprot P01880，IGHD_人，免疫球蛋白重恒定δ；SEQ IDNO:4996)、人IgE(Uniprot P01854，IGHE_人，免疫球蛋白重恒定链ε；SEQ ID NO:4997)或IgM(Uniprot P01871，IGHM_人，免疫球蛋白重恒定μ；SEQ ID NO:5002)，其中所述子序列包含来自恒定结构域的环区或其部分。在一些方面，子序列还包含β链的相邻部分。
在一些方面，CAR间隔物包含由来自SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的铰链区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含由来自SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的铰链区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列，其中所述子序列还包含来自与铰链区子序列相邻的CH1区的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含由来自SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的铰链区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列，其中所述子序列还包含来自与铰链区子序列相邻的CH2区的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含由来自SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的铰链区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列，其中所述子序列还包含来自与铰链区子序列相邻的CH1区的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸和来自与铰链区子序列相邻的CH2区的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含铰链区衍生的间隔物并且还包含甘氨酸-丝氨酸柔性接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser。
在一些方面，CAR间隔物包含由SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的恒定结构域(例如，CH1、CH2或CH3)的环区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含由SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的恒定结构域(例如，CH1、CH2或CH3)的环区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列，其中所述子序列还包含来自与环区子序列的C末端相邻的β链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含由SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的恒定结构域(例如，CH1、CH2或CH3)的环区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列，其中所述子序列还包含来自与环区子序列的N末端相邻的β链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；或其组合。
在一些方面，CAR间隔物包含由SEQ ID NO:4993-5002的免疫球蛋白的恒定结构域(例如，CH1、CH2或CH3)的环区的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的子序列，其中所述子序列还包含来自与环区子序列的C末端相邻的β链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；和来自与环区子序列的C末端相邻的β链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸。
在一些方面，CAR间隔物包含环区衍生的间隔物并且还包含甘氨酸-丝氨酸柔性接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser。
在一些方面，来源于本文公开的铰链区的CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4830-4842和4844-4859组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列，由其组成，或基本上由其组成。
在一些方面，来源于本文公开的环区的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4843中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列，由其组成，或基本上由其组成(间隔物15)。
II.A.IgD衍生的CAR间隔物
免疫球蛋白D(IgD)是一种抗体同种型，其占未成熟B淋巴细胞的质膜中蛋白质的约1％，在B淋巴细胞中通常与称为IgM的另一种细胞表面抗体共表达。在结构上，IgD与IgG相似。
如本文所用，术语“IgD铰链”是指位于IgD重链的CH1区和CH2区之间的氨基序列。IgD重链含有长铰链区，所述长铰链区由位于氨基酸位置99和162之间的两个外显子编码。一个外显子编码铰链亚区1(SEQ ID NO:861)，而第二个外显子编码铰链亚区2(SEQ ID NO:1287)。在本公开的一些方面，“IgD铰链”是延伸的IgD，其包含，即，包含64个氨基酸的IgD铰链核心(亚区1和2)加上SEQ ID NO:2143的13个氨基酸长的C末端CH2片段的序列。因此，如本申请中所定义的“全长IgD铰链”包含SEQ ID NO:1的77个氨基酸长的序列。
如本文所用，术语“IgD铰链衍生的CAR间隔物”包含例如包含SEQ ID NO:1的IgD铰链亚区1及其片段、IgD铰链亚区2及其片段、全长IgD铰链的片段的间隔物，以及其包含1、2、3、4、5或更多个CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。
在一些方面，本公开的IgD铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:1的至少五个、六个或七个连续的氨基酸。在一些方面，IgD铰链衍生的间隔物包含SEQ ID NO:861、SEQ IDNO:1287和/或SEQ ID ON:2143的至少五个、六个或七个连续的氨基酸。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgD铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgD铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。如本文所用，术语“参考间隔物”是指在通过用本文公开的间隔物替代原始间隔物进行优化之前存在于CAR中的间隔物。在一些方面，参考间隔物是IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物)。在一些方面，参考间隔物可以是本领域已知的任何间隔物，例如，在本公开中以引用方式并入的任何文件中公开的间隔物。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgD铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，本公开的IgD铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:1中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，IgD铰链衍生的间隔物包含与SEQ ID NO:861、SEQ ID NO:1287和/或SEQ ID ON:2143具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgD铰链衍生的CAR间隔物包含表1中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表1：IgD衍生的间隔物。SEQ ID NO:1是全长IgD铰链。
Figure BDA0004043865630000711
Figure BDA0004043865630000721
在一些方面，间隔物包含与选自由SEQ ID NO:2015；SEQ ID NO:1889；SEQ ID NO:1768；SEQ ID NO:1；及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:2015中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:1889中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:1中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物包含与SEQ ID NO:1768中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgD铰链衍生的CAR间隔物包含表1中公开的序列或本公开任何地方示出的序列，所述序列还包含N末端子序列或本公开任何地方示出的序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表1的IgD序列的N末端共价结合的表2的IgD CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgD铰链衍生的CAR间隔物包含表1中公开的序列或本公开任何地方示出的序列，所述序列还包含C末端子序列或本公开任何地方示出的序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表1的IgD序列的C末端共价结合的表2的IgD CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgD铰链衍生的CAR间隔物包含表1中公开的序列或本公开任何地方示出的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列或本公开任何地方示出的序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表1的IgD序列的N末端共价结合的表2的IgD CH1 C末端结构域氨基酸；和(ii)C末端子序列或本公开任何地方示出的序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表1的IgD序列的C末端共价结合的表2的IgD CH2 N末端结构域氨基酸。
可以附加到表1的IgD铰链衍生的CAR间隔物序列或本公开任何地方示出的序列的N和/或C末端的IgD CH1和CH2序列呈现在表2中。
表2：IgD。CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列(来自Uniprot P01880-1的序列，包含SEQ ID NO:1的完整IgD铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000741
II.B.IgA铰链衍生的CAR间隔物
IgA是一种在粘膜的免疫功能中发挥关键作用的抗体，占全身产生的总免疫球蛋白的至多15％。IgA具有两个亚类：IgA1和IgA2。在IgA2中，重链和轻链不是通过二硫键连接的，而是通过非共价键连接的。
铰链区在两种IgA同种型之间显著不同。IgA1的铰链区由23个残基(SEQ ID NO:2560)和5个O-糖基化位点组成，而IgA2的铰链区由10个残基(SEQ ID NO:2713)组成并且没有糖基化位点。两个铰链区都位于Ch1链上的Cys220并且在Ch2的Pro244结束。
如本文所用，“IgA1铰链”是指位于IgA1的CH1和CH2区之间的铰链区，其具有SEQID NO:2560中列出的序列。
如本文所用，术语“IgA1铰链衍生的CAR间隔物”包括，例如，包含SEQ ID NO:2560的完整IgA1铰链及其片段的间隔物，以及其包含1、2、3、4、5或更多个CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。
因此，在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2560的至少五个、六个或七个连续氨基酸。因此，在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2560的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:2560中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgA1衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgA1铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgA1铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
如本文所用，术语“IgA2铰链”是指位于IgA2的重链的CH1恒定结构域的C末端处的Cys220和IgA2的重链的CH2恒定结构域的N末端处的Pro244之间的IgA2序列。在一些方面，完整的IgA2铰链由SEQ ID NO:2713中列出的序列组成。如本文所用，术语“IgA2铰链”涵盖不同IgA2同种异型(例如IgA2m、IgA2(m1)、IgA2(m2)或IgA2(n))的铰链。上文公开的SEQ IDNO:2713的规范IgA2铰链中的第一个Pro是IgA2(m2)同种异型铰链中的Arg(即，它以RV而不是PV开始)。因此，本公开的IgA2 CAR间隔物还涵盖其中对应于SEQ ID NO:2713的位置1的脯氨酸氨基酸(例如，存在于IgA2片段或任何IgA2衍生序列中的对应氨基酸)被精氨酸置换的形式。
如本文所用，术语“IgA2衍生的CAR间隔物”包含例如，包含SEQ ID NO:2713的完整IgA2铰链及其片段的间隔物，以及其包含1、2、3、4、5或更多个CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。在一些方面，IgA2衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4848的至少五、六或七个连续氨基酸。在一些方面，IgA2衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4848中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgA2铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgA2铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgA2铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，本公开的IgA2衍生的CAR间隔物可以例如具有SEQ ID NO:4523(即，具有CH1的N末端VPC序列的IgA2铰链序列)、SEQ ID NO:4850、SEQ ID NO:4524(即，具有CH1的N末端VPC序列和CH2的C末端PR序列的IgA2间隔物序列)或SEQ ID NO:4525(即，具有CH1的N末端PC序列和CH2的C末端P序列的IgA2间隔物序列)中列出的序列，其中SEQ ID NO:3523、4524和4525的VCP和PC N末端子序列来自CH1区，而SEQ ID NO:4524和4525的C末端PR和P子序列来自IgA2免疫球蛋白的CH2区。
在一些方面，本公开的IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含表3中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表3：IgA1衍生的间隔物
长度 SEQ ID 长度 SEQ ID 长度 SEQ ID
23 2560 22 2561-2562 21 2563-2665
20 2566-2569 19 2570-2574 18 2575-2580
17 2581-2587 16 2588-2595 15 2596-2604
14 2605-2614 13 2615-2625 12 2626-2637
11 2638-2650 10 2651-2644 9 2665-2679
8 2680-2695 7 2696-2712  
在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4845；SEQ IDNO:4846；SEQ ID NO:4847；SEQ ID NO:4848；SEQ ID NO:4849；SEQ ID NO:4850；SEQ IDNO:4851；SEQ ID NO:2560；SEQ ID NO:4844；及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4847中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4845中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4846中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:2560中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4844中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含表3中公开的序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，还包含N末端子序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，所述N末端子序列包含1、2、3、4或5个与表3的IgA1序列的N末端共价结合的表4的IgA1 CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含表3中公开的序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，还包含C末端子序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，所述C末端子序列包含1、2、3、4或5个与表3的IgA2序列的C末端共价结合的表4的IgA1 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含表3中公开的序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，还包含(i)N末端子序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，所述N末端子序列包含1、2、3、4或5个与表3的IgA1序列的N末端共价结合的表4的IgA1 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物，所述C末端子序列包含1、2、3、4或5个与表3的IgD序列的C末端共价结合的表4的IgA1 CH2 N末端结构域氨基酸。
可以附加到表3的IgA1衍生的CAR间隔物序列或本文公开的任何IgA1铰链衍生的CAR间隔物的N末端和/或C末端的IgA1 CH1和CH2序列呈现在表4中。
表4：IgA1。CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列
(来自Uniprot P01876的序列，包含SEQ ID NO:2560的完整IgA1铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000791
在一些方面，本公开的IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2713中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，本公开的IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:2713中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的“IgA2铰链衍生的CAR间隔物”包含表5中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表5：IgA2衍生的间隔物
长度 SEQ ID 长度 SEQ ID
10 2713 9 2714-2715
8 2716-2718 7 2719-2722
在一些方面，本公开的IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含表5中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表5或本公开任何地方的IgA2序列的N末端共价结合的表6的IgA2 CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含表5中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表5或本公开任何地方的IgA2序列的C末端共价结合的表6的IgA2 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含表5或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表5或本公开任何地方的IgA2序列的N末端共价结合的表6的IgA2 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表5或本公开任何地方的IgA2序列的C末端共价结合的表6的IgA2 CH2 N末端结构域氨基酸。
可以附加到表5或本公开任何地方的IgA2衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgA2 CH1和CH2序列呈现在表6中。
在一些方面，SEQ ID NO:2713的全长IgA2铰链的N末端脯氨酸可以用精氨酸替代(参见，例如，Uniprot P01877)。因此，在一些方面，本文公开的全长IgA2铰链具有SEQ IDNO:4530中列出的序列。
表6：IgA2。CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列
(来自Uniprot P01877的序列，包含SEQ ID NO:2713的完整IgA2铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000811
在一些方面，IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4848中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4849中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4850中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4851中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
II.C.IgG铰链衍生的CAR间隔物
在五种免疫球蛋白同种型中，免疫球蛋白G(IgG)在人血清中最丰富。高度保守的四个亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区不同，特别是它们的铰链和上CH2结构域。这些区域参与结合IgG-Fc受体(FcγR)和C1q。因此，不同的亚类具有不同的效应子功能，包括触发FcγR表达细胞，导致吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，以及激活补体。
IgG1的铰链外显子涵盖非常灵活的铰链(SEQ ID NO:2723)。IgG2的铰链比IgG1短(SEQ ID NO:2768)。IgG2的下铰链区(实际上由CH2区编码)还具有一个氨基酸缺失(缺乏在IgG1下铰链的235-6位置处发现的双甘氨酸之一)，从而导致IgG2具有所有IgG亚类中最短的铰链。此外，由于聚脯氨酸螺旋，IgG2的铰链更加具有刚性，由至多四个(除了下文讨论的一些例外)额外的重链间二硫桥稳定。这些性质限制了IgG2分子的柔性。类似地，IgG4的铰链区(SEQ ID NO:4453)也短于IgG1铰链区。IgG4的铰链区的柔性介于IgG1和IgG2之间。与IgG2铰链不同，IgG4铰链含有在IgG1下铰链的235-6位置处发现的双甘氨酸。
IgG3的铰链区比任何其他IgG亚类或Ig人同种型都长得多，即，大约是IgG1铰链的四倍，含有至多62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，从而形成柔性有限的聚脯氨酸螺旋(SEQ ID NO:2813)。铰链的确切长度因IgG3的同种异型而异，所述IgG3显然比其他亚类经历了更多的进化辐射。在IgG3中，Fab片段距离Fc片段相对较远，从而给予分子更大的柔性。这种IgG3的长铰链是由于铰链外显子复制，所述长铰链在IgG1、IgG2和IgG4中由一个外显子编码，但在IgG3中由至多四个外显子编码。这些外显子中的一个是IgG3同种异型共有的，但它还具有IgG3铰链外显子的同源第二类的1-3个拷贝。IgG3中的延长的铰链也是其与其他亚类相比分子量更高的原因。铰链柔性的差异影响IgG抗体的Fab臂和Fc尾的相对取向和运动。
在IgG2中，由于重链铰链区中的半胱氨酸与参与轻链和重链之间二硫键形成的那些半胱氨酸之间的二硫键的交替形成，已经观察到结构化铰链异构体。这些异构体特别存在于具有κ轻链的IgG2抗体中，但对于λ轻链则少的多。主要形式是在两条IgG2重链之间有四个二硫键的经典A形式，以及其中一个铰链半胱氨酸与轻链形成二硫键的B形式。然而，存在其他构型，因为这些同种型显然彼此独立形成，从而产生A/A、B/B、但还有A/B同种型。
铰链半胱氨酸的二硫键不同的两种IgG4异构体共存。IgG的核心铰链由CXXC基序形成，所述基序还存在于氧化还原反应性蛋白(诸如硫氧还蛋白)中。与具有相对刚性CPPC(SEQ ID NO:4531)基序的IgG1相比，链内二硫键更容易在存在于IgG4中位置226和229处的这些半胱氨酸之间形成，所述IgG4具有CPSC(SEQ ID NO:4532)核心铰链。结果是除了共价连接的链间异构体之外，还有可观察量的非共价连接的半分子(由一条重链和一条轻链组成，HL，与H2L2的经典构型相反)。因此具有IgG1核心铰链的IgG4的S228P突变体不形成半分子，这与这个物种不存在于IgG1中的发现一致。
如本文所用，术语“IgG1铰链”是指IgG1铰链的核心铰链加上铰链，即，SEQ ID NO:2723中列出的序列。在一些方面，IgG1铰链还包含下铰链(SEQ ID NO:4533)或其子序列。在一些方面，附加到SEQ ID NO:2723的IgG1铰链的C末端或其N末端截短物(即，SEQ ID NO:2723的片段，其中一个或多个氨基酸残基已经从其N末端区域去除)的IgG1下铰链的子序列选自由以下组成的组：A、AP、APE、APEL(SEQ ID NO:4534)、APELL(SEQ ID NO:4535)、APELLG(SEQ ID NO:4536)、APELLGG(SEQ ID NO:4537)和APELLGGP(SEQ ID NO:4533)。
在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2723或SEQ ID NO:4839中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:2723中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG1衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG1铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG1铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，IgG1铰链衍生的间隔物不是SEQ ID NO:2723中列出的序列。在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2723的至少五个、六个或七个连续氨基酸，但不是SEQ ID NO:2723。
如本文所用，术语“IgG1铰链衍生的CAR间隔物”包括，例如，包含SEQ ID NO:2723的IgG1铰链(上铰链加上核心铰链)、SEQ ID NO:4538的IgG1铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。在一些方面，术语IgG1衍生的CAR间隔物是指SEQ ID NO:4538的IgG1铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:4538中列出的多肽序列的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续氨基酸。
在一些方面，本公开的“IgG1铰链衍生的CAR间隔物”包含表7中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表7：IgG1衍生的间隔物
Figure BDA0004043865630000851
在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4840中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4839中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4843中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含表7中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表7或本公开任何地方的IgG1序列的N末端共价结合的表8的IgG1 CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含表7中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表7或本公开任何地方的IgG1序列的C末端共价结合的表8的IgG1 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含表7或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表7或本公开任何地方的IgG1序列的N末端共价结合的表8的IgG1 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表7或本公开任何地方的IgG1序列的C末端共价结合的表8的IgG1 CH2 N末端结构域氨基酸。
可以附加到表7或本公开任何地方的IgG1铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgG1 CH1和CH2序列呈现在表8中。
表8：IgG1.CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列(来自Uniprot P01857的序列，包含SEQ ID NO:2723的完整IgG1铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000861
Figure BDA0004043865630000871
如本文所用，术语“IgG2铰链”是指IgG2铰链的核心铰链加上铰链，即，SEQ ID NO:2768中列出的序列。在一些方面，IgG2铰链还包含下铰链，即SEQ ID NO:4453中列出的序列或其子序列。在一些方面，附加到SEQ ID NO:2768的IgG2铰链的C末端或其N末端截短物(即，SEQ ID NO:2768的片段，其中一个或多个氨基酸残基已经从其N末端区域去除)的IgG2下铰链的子序列选自由以下组成的组：A、AP、APE、APEL(SEQ ID NO:4534)、APELL(SEQ IDNO:4535)、APELLG(SEQ ID NO:4536)、APELLGG(SEQ ID NO:4537)和APELLGGP(SEQ ID NO:4533)。
在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2768中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ IDNO:2768中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG2衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG2铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG2衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2768中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸，但不是SEQ ID NO:4985。
在一些方面，术语“IgG2衍生的CAR间隔物”是指例如包含SEQ ID NO:2768的人IgG2铰链(上铰链加上核心铰链)、SEQ ID NO:4541的人IgG2铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。在一些方面，术语IgG2衍生的CAR间隔物是指SEQ ID NO:4541的人IgG2铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:4541中列出的多肽序列的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续氨基酸。
在一些方面，本公开的“IgG2铰链衍生的CAR间隔物”包含表9A中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表9A：人IgG2延伸的间隔物
长度 SEQ ID 长度 SEQ ID 长度 SEQ ID
11 2768 10 2769-2770 9 2771-2773
8 2774-2777 7 2778-2782  
在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4842中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:2768中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，本公开的包含人IgG2铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG2铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4986中列出的序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG2衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，本公开的人IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含表9A中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9A或本公开任何地方的IgG2序列的N末端共价结合的表10A的IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的人IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含表9A中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9A或本公开任何地方的IgG2序列的C末端共价结合的表10A的IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的人IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含表9A或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9A或本公开任何地方的IgG2序列的N末端共价结合的表10A的IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9A或本公开任何地方的IgG2序列的C末端共价结合的表10A的IgG2 CH2N末端结构域氨基酸。
可以附加到表9A的IgG2铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgG2CH1和CH2序列呈现在表10A中。
表10A：人IgG2.CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列(来自UniprotP01859的序列，包含SEQ ID NO:2768的完整IgG2铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000901
在一些方面，术语“IgG2衍生的CAR间隔物”是指例如包含SEQ ID NO:4926的鼠IgG2铰链(上铰链加上核心铰链)、SEQ ID NO:4992的人IgG2铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。在一些方面，术语IgG2衍生的CAR间隔物是指SEQ ID NO:4992的鼠IgG2铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:4992中列出的多肽序列的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续氨基酸。
在一些方面，本公开的“IgG2铰链衍生的CAR间隔物”是“鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物”，其包含表9B中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表9B：小鼠IgG2A铰链衍生的CAR间隔物
长度 SEQ ID 长度 SEQ ID 长度 SEQ ID
16 4926 15 4927-4928 14 4929-4931
13 4932-4935 12 4936-4940 11 4941-4946
10 4947-4953 9 4954-4961 8 4962-4970
7 4971-4980  
在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4830中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ IDNO:4831中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4832中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。
在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4830中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4831中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4832中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，本公开的包含鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含本文公开的鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。在一些方面，鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4986中列出的序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含鼠IgG2衍生的CAR间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，本公开的鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含表9B中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9B或本公开任何地方的IgG2序列的N末端共价结合的表10B的IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含表9B中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9B或本公开任何地方的IgG2序列的C末端共价结合的表10B的IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的鼠IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含表9B或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9B或本公开任何地方的IgG2序列的N末端共价结合的表10B的IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表9B或本公开任何地方的IgG2序列的C末端共价结合的表10B的IgG2 CH2N末端结构域氨基酸。
可以附加到表9B的IgG2铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgG2CH1和CH2序列呈现在表10B中。
表10B：鼠IgG2A.CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列(来自UniprotP01865的序列，包含SEQ ID NO:4926的完整鼠IgG2A铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000931
如本文所用，术语“IgG3铰链”是指IgG3铰链的核心铰链加上铰链，即，SEQ ID NO:2813中列出的序列。在一些方面，IgG3铰链还包含下铰链(APELLGGP；SEQ ID NO:4533)。
IgG3的长铰链是由于铰链外显子复制，所述长铰链在IgG1、IgG2和IgG4中由一个外显子编码，但在IgG3中由至多四个外显子编码。这些外显子中的一个是IgG3同种异型共有的，但它还具有IgG3铰链外显子的同源第二类的1-3个拷贝。根据序列重复的数量，不同IgG3同种异型的铰链区可以为27到83个氨基酸残基不等(参见图6)。如图6所示，鉴定的不同IgG3同种异型包括具有对应于a、ab、abb或abbb的模式的铰链，其中“a”是SEQ ID NO:3848中列出的序列，而“b”是SEQ ID NO:3958中列出的序列。在一些方面，“b”序列是SEQ IDNO:4546(人变体)、SEQ ID NO:4547(黑猩猩(Pan troglodytes))、SEQ ID NO:4548(黑猩猩)、SEQ ID NO:4549(婆罗洲猩猩(Pongo pygmaeus))、SEQ ID NO:4550(大猩猩(Gorillagorilla))或SEQ ID NO:4551(苏门答腊猩猩(Pongo abelii))中列出的序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:2813中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG3铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG3铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG3衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:2813。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:2813中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“IgG3铰链衍生的CAR间隔物”包含，例如，包含SEQ ID NO:2813的IgG3铰链(上铰链加上核心铰链)、SEQ ID NO:4552的人IgG3铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。
在一些方面，所公开的IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含替代SEQ ID NO:4553中列出的子序列中的苏氨酸(T)的一个或多个突变。这些苏氨酸容易糖基化，并且还是胰蛋白酶和蛋白酶K的底物。因此，它们的替代可以降低CAR间隔物导致的免疫原性并且增加对蛋白酶的抗性，从而提高CAR在体内的稳定性。
在一些方面，本公开的IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含表11中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表11：IgG3衍生的间隔物
Figure BDA0004043865630000951
Figure BDA0004043865630000961
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4833；SEQ IDNO:4834；SEQ ID NO:4835；SEQ ID NO:4836；SEQ ID NO:4837；SEQ ID NO:4838；SEQ IDNO:4841；及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4833中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4834中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4835中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4836中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4837中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4838中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4841中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含表11中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表11或本公开任何地方的IgG3序列的N末端共价结合的表12的IgG3 CH1 C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含表11中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表11或本公开任何地方的IgG3序列的C末端共价结合的表12的IgG3 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含表11或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表11或本公开任何地方的IgG3序列的N末端共价结合的表12的IgG3 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表11或本公开任何地方的IgG3序列的C末端共价结合的表12的IgG3 CH2N末端结构域氨基酸。
可以附加到表11或本公开任何地方的IgG3铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgG3 CH1和CH2序列呈现在表12中。
表12：IgG3.CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列(来自Uniprot P01860的序列，包含SEQ ID NO:2813的完整IgG3铰链侧翼的1至5个氨基酸)
Figure BDA0004043865630000981
如本文所用，术语“IgG4铰链”是指IgG4铰链的核心铰链加上铰链，即，SEQ ID NO:4353中列出的序列。在一些方面，IgG4铰链还包含下铰链(APEFLGGP；SEQ ID NO:4556)或其子序列。在一些方面，附加到SEQ ID NO:4353的IgG4铰链的C末端或其N末端截短物(即，SEQID NO:4353的片段，其中一个或多个氨基酸残基已经从其N末端区域去除)的IgG4下铰链的子序列选自由以下组成的组：A、AP、APE、APEF(SEQ ID NO:4557)、APEFL(SEQ ID NO:4558)、APEFLG(SEQ ID NO:4559)、APEFLGG(SEQ ID NO:4560)和APEFLGGP(SEQ ID NO:4556)。
如本文所用，术语“IgG4铰链衍生的CAR间隔物”包含，例如，包含SEQ ID NO:4353的IgG4铰链(上铰链加上核心铰链)、SEQ ID NO:4561的人IgG4铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的CH1区和/或CH2区氨基酸的变体。在一些方面，术语IgG4衍生的CAR间隔物是指SEQ ID NO:4561的IgG4铰链(上铰链、核心铰链和下铰链)的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:4561中列出的多肽序列的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续氨基酸。
在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4353中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ IDNO:4353中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG4铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgG4铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4987。在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4988。在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4989。在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4990。在一些方面，IgG4铰链衍生的CAR间隔物不是SEQ ID NO:4991。
在一些方面，本公开的“IgG4铰链衍生的CAR间隔物”包含表13中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表13：Ig G4衍生的间隔物
长度 SEQ ID 长度 SEQ ID 长度 SEQ ID
9 4353 11 4354-4355 10 4356-4358
8 4359-4362 8 4363-4367 7 4368-4373
在一些方面，本公开的IgG4铰链衍生的CAR间隔物包含表13中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表13或本公开任何地方的IgG4序列的N末端共价结合的表14的IgG4 CH1 C末端结构域氨基酸。在一些方面，本公开的IgG4铰链衍生的CAR间隔物包含表13中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表13或本公开任何地方的IgG4序列的C末端共价结合的表14的IgG4 CH2 N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgG4铰链衍生的CAR间隔物包含表13或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表13或本公开任何地方的IgG4序列的N末端共价结合的表14的IgG4 CH1 C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表13或本公开任何地方的IgG4序列的C末端共价结合的表14的IgG4 CH2N末端结构域氨基酸。
可以附加到表13或本公开任何地方的IgG4铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgG4 CH1和CH2序列呈现在表14中。
表14：IgG4.CH1和CH2任选的N末端CH1序列和C末端CH2序列(来自Uniprot P01861的序列，包含SEQ ID NO:4353的完整IgG4铰链侧翼的1至5个氨基酸)。
Figure BDA0004043865630001011
II.D.IgE铰链衍生的CAR间隔物
免疫球蛋白E(IgE)是一种免疫球蛋白(Ig)同种型，其包含两条重链(ε链)和两条轻链，所述ε链含有4个Ig样恒定结构域(Cε1-Cε4)。IgE的独特之处在于它缺乏实际的铰链区，并被Cε2结构域替代。
如本文所用，术语“IgE铰链”是指位于Cε1的C末端和Cε2的N末端之间的序列，即位于氨基酸241和260之间的序列。因此，如本文所定义，全长“IgE铰链”将对应于SEQ ID NO:4374中列出的序列。
如本文所用，术语“IgE铰链衍生的CAR间隔物”包括，例如，包含SEQ ID NO:4374中列出的序列的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的Cε1区和/或Cε2区氨基酸的变体。
在一些方面，IgE铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4374中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，IgE铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4374中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgE铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgE铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，本文公开的包含IgE铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，本公开的IgE铰链衍生的CAR间隔物包含表15中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表15：IgE衍生的间隔物
长度 SEQ ID 长度 SEQ ID 长度 SEQ ID
19 4374 18 4375-4376 17 4377-4379
16 4380-4383 15 4384-4388 14 4389-4394
13 4395-4401 12 4402-4409 11 4410-4418
10 4419-4428 9 4429-4439 8 4440-4451
7 4452-4464  
在一些方面，IgE铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4856中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgE铰链衍生的CAR间隔物包含表15中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表15或本公开任何地方的IgE序列的N末端共价结合的表16的IgE Cε1C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgE铰链衍生的CAR间隔物包含表15中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表15或本公开任何地方的IgE序列的C末端共价结合的表16的IgE Cε2N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgE铰链衍生的CAR间隔物包含表15或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表15或本公开任何地方的IgE序列的N末端共价结合的表16的IgE Cε1C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表15或本公开任何地方的IgE序列的C末端共价结合的表16的IgE Cε2N末端结构域氨基酸。
可以附加到表15或本公开任何地方的IgE铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgE Cε1和Cε2序列呈现在表16中。
表16：IgE.Cε1和Cε2任选的N末端Cε1序列和C末端Cε2序列(来自Uniprot P01854的序列，包含SEQ ID NO:4374的完整IgGE铰链侧翼的1至5个氨基酸)。
Figure BDA0004043865630001031
Figure BDA0004043865630001041
为简单起见，IgE Cε1区被认为是CH1区，而IgE Cε2区被认为是CH2区。因此，在整个说明书中提及IgM的CH1是指IgE Cε1。类似地，在整个说明书中提及IgE的CH2是指IgE Cε2。
II.E.IgM铰链衍生的CAR间隔物
免疫球蛋白M(IgM)是最大的抗体，并且它是在对初始暴露于抗原的反应中第一个出现的抗体。IgM包括轻链和重链。轻链(λ或κ)是约220个氨基酸的蛋白质，由可变结构域VL(约110个氨基酸的片段)和恒定结构域CL(也约110个氨基酸长)组成。IgM的μ重链是约576个氨基酸的蛋白质，并且包括一个可变结构域(约110个氨基酸的VH)、四个不同的恒定区结构域(Cμ1、Cμ2、Cμ3、Cμ4，每个约110个氨基酸)和一个约20个氨基酸的“尾部”。Cμ1和Cμ2通过SEQ ID NO:4727中列出的连接器序列连接。
出于本公开的目的，术语“IgM铰链”被定义为围绕Cμ1-Cμ2连接器的延伸序列。因此，如本文所定义，本公开的全长“IgM铰链”将对应于SEQ ID NO:4465中列出的序列。
如本文所用，术语“IgM铰链衍生的CAR间隔物”包含，例如，包含SEQ ID NO:4465中列出的序列的间隔物、其片段、以及其包含1、2、3、4、5或更多个额外的Cμ1区和/或Cμ1区氨基酸的变体。在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物是具有SEQ ID NO:4727中列出的序列的Cμ1-Cμ2连接器。
在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4465中列出的序列的至少五个、六个或七个连续氨基酸。在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4465中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgM铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导干扰素γ水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgM铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导白介素-2水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，与包含参考间隔物(例如，参考IgG4间隔物(例如，SEQ ID NO:4911的间隔物))的CAR相比，包含IgM铰链衍生的间隔物的CAR能够诱导TNF-α水平增加例如至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％。
在一些方面，本公开的IgM铰链衍生的CAR间隔物包含表17中公开的序列、由其组成、或基本上由其组成。
表17：IgM衍生的间隔物
Figure BDA0004043865630001051
在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4857；SEQ IDNO:4858；SEQ ID NO:4859；及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4857中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4858中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4859中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的IgM铰链衍生的CAR间隔物包含表17中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表17或本公开任何地方的IgM序列的N末端共价结合的表18的IgM Cμ1C末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgM铰链衍生的CAR间隔物包含表17中或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表17或本公开任何地方的IgM序列的C末端共价结合的表18的IgM Cμ2N末端结构域氨基酸。
在一些方面，本公开的IgM铰链衍生的CAR间隔物包含表17或本公开任何地方公开的序列，所述序列还包含(i)N末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表17或本公开任何地方的IgM序列的N末端共价结合的表18的IgN Cμ1C末端结构域氨基酸，和(ii)C末端子序列，所述子序列包含1、2、3、4或5个与表17或本公开任何地方的IgM序列的C末端共价结合的表18的IgM Cμ2N末端结构域氨基酸。
可以附加到表17或本公开任何地方的IgM铰链衍生的CAR间隔物序列的N末端和/或C末端的IgM Cμ1和Cμ2序列呈现在表18中。
表18：IgM.Cμ1和Cμ2任选的N末端Cμ1序列和C末端Cμ2序列(来自Uniprot P01871的序列，包含SEQ ID NO:4465的完整IgM铰链侧翼的1至5个氨基酸)。
Figure BDA0004043865630001071
为简单起见，IgM Cμ1区被认为是CH1区，而IgM Cμ2区被认为是CH2区。因此，在整个说明书中提及IgM的CH1是指IgM Cμ1。类似地，在整个说明书中提及IgM的CH2是指IgM Cμ2。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15、17或其组合中列出的序列。在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15、17或其组合中列出的序列，并且还包含表2、4、6、8、10A、10B、12、14、16、18或其组合中列出的N末端序列。在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15、17或其组合中列出的序列，并且还包含表2、4、6、8、10A、10B、12、14、16、18或其组合中列出的C末端序列。在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15、17或其组合中列出的序列，并且还包含(i)表2、4、6、8、10A、10B、12、14、16、18或其组合中列出的N末端序列和(ii)表2、4、6、8、10A、10B、12、14、16、18或其组合中列出的C末端序列。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399或400个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度小于400个氨基酸、小于约390个氨基酸、小于约385个氨基酸、小于约380个氨基酸、小于约375个氨基酸、小于约370个氨基酸、小于约365个氨基酸、小于约360个氨基酸、小于约355个氨基酸、小于约350个氨基酸、小于约345个氨基酸、小于约340个氨基酸、小于约335个氨基酸、小于约330个氨基酸、小于约325个氨基酸、小于约320个氨基酸、小于约315个氨基酸、小于约310个氨基酸、小于约305个氨基酸、小于约300个氨基酸、小于约295个氨基酸、小于约290个氨基酸、小于约285个氨基酸、小于约280个氨基酸、小于约275个氨基酸、小于约270个氨基酸、小于约265个氨基酸、小于约260个氨基酸、小于约255个氨基酸、小于约250个氨基酸、小于约245个氨基酸、小于约240个氨基酸、小于约235个氨基酸、小于约230个氨基酸、小于约225个氨基酸、小于约220个氨基酸、小于约215个氨基酸、小于约210个氨基酸、小于约205个氨基酸、小于约200个氨基酸、小于约195个氨基酸、小于约190个氨基酸、小于约185个氨基酸、小于约180个氨基酸、小于约175个氨基酸、小于约170个氨基酸、小于约165个氨基酸、小于约160个氨基酸、小于约155个氨基酸、小于约150个氨基酸、小于约145个氨基酸、小于约140个氨基酸、小于约135个氨基酸、小于约130个氨基酸、小于约125个氨基酸、小于约120个氨基酸、小于约115个氨基酸、小于约110个氨基酸、小于约105个氨基酸、小于约100个氨基酸、小于约95个氨基酸、小于约90个氨基酸、小于约85个氨基酸、小于约80个氨基酸、小于约75个氨基酸、小于约70个氨基酸、小于约65个氨基酸、小于约60个氨基酸、小于约55个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于约45个氨基酸、小于约40个氨基酸、小于约35个氨基酸、小于约30个氨基酸、小于约25个氨基酸、小于约20个氨基酸、小于约15个氨基酸、小于约10个氨基酸或小于约5个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度为4至8个氨基酸、4至9个氨基酸、4至10个氨基酸、5至8个氨基酸、5至9个氨基酸、5至10个氨基酸、4至12个氨基酸、4至13个氨基酸、4至14个氨基酸、4至15个氨基酸、4至16个氨基酸、5至14个氨基酸、5至15个氨基酸、5至16个氨基酸、6至12个氨基酸、6至13个氨基酸、6至14个氨基酸、6至15个氨基酸、6至16个氨基酸、7至9个氨基酸、7至10个氨基酸、7至11个氨基酸、7至12个氨基酸、7至13个氨基酸、7至14个氨基酸、7至15个氨基酸、7至16个氨基酸、10至15个氨基酸、15至20个氨基酸、20至25个氨基酸、25至30个氨基酸、30至35个氨基酸、35至40个氨基酸、40至45个氨基酸、45至50个氨基酸、50至55个氨基酸、55至60个氨基酸、60至65个氨基酸、65至70个氨基酸、70至75个氨基酸、75至80个氨基酸、80至85个氨基酸、85至90个氨基酸、90至95个氨基酸、95至100个氨基酸、100至105个氨基酸、105至110个氨基酸、110至115个氨基酸、115至120个氨基酸、120至125个氨基酸、125至130个氨基酸、130至135个氨基酸、135至140个氨基酸、140至145个氨基酸、145至150个氨基酸、150至155个氨基酸、155至160个氨基酸、160至165个氨基酸、165至170个氨基酸、170至175个氨基酸、175至180个氨基酸、180至185个氨基酸、185至190个氨基酸、190至195个氨基酸、195至200个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度为约400至约390个氨基酸、390至约380个氨基酸、约380至约370个氨基酸、约370至约360个氨基酸、约360至约350个氨基酸、约350至约340个氨基酸、约340至约330个氨基酸、约330至约320个氨基酸、约320至约310个氨基酸、约310至约300个氨基酸、约300至约290个氨基酸、约290至约280个氨基酸、约280至约270个氨基酸、约270至约260个氨基酸、约260至约250个氨基酸、约250至约240个氨基酸、约240至约230个氨基酸、约230至约220个氨基酸、约220至约210个氨基酸、约210至约200个氨基酸、约200至约190个氨基酸、约190至约180个氨基酸、约180至约170个氨基酸、约170至约160个氨基酸、约160至约150个氨基酸、约150至约140个氨基酸、约140至约130个氨基酸、约130至约120个氨基酸、约120至约110个氨基酸、约110至约100个氨基酸、约100至约90个氨基酸、约90至约80个氨基酸、约80至约70个氨基酸、约70至约60个氨基酸、约60至约50个氨基酸、约50至约40个氨基酸、40至约30个氨基酸、约30至约20个氨基酸或约20至约10个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度为约400至约380个氨基酸、约380至约360个氨基酸、约360至约340个氨基酸、约340至约320个氨基酸、约320至约300个氨基酸、约300至约280个氨基酸、约280至约260个氨基酸、约260至约240个氨基酸、约240至220个氨基酸、约220至约200个氨基酸、约200至约180个氨基酸、约180至约160个氨基酸、约160至约140个氨基酸、约120至约100个氨基酸、约100至约80个氨基酸、约80至约60个氨基酸、约60至约40个氨基酸、约40至20个氨基酸、约20至约10个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度为约400至约350个氨基酸、约350至约300个氨基酸、约300至约250个氨基酸、约250至200个氨基酸、约200至约150个氨基酸、约150至约100个氨基酸、100至约50个氨基酸、50至约1个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物的长度为约400至约300个氨基酸、约300至约200个氨基酸、约200至约100个氨基酸、或约100至约1个氨基酸。
在一些方面，本公开的CAR间隔物(例如表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中公开的CAR间隔物)的长度为约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175、约180、约185、约190、约195、约200、约205、约210、约215、约220、约225、约230、约235、约240、约245或约250埃。
在一些方面，本公开的CAR间隔物(例如表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中公开的CAR间隔物)的长度为约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约35、约35至约40、约40至约45、约45至约50、约50至约55、约55至约60、约60至约65、约65至约70、约70至约75、约75至约80、约80至约85、约85至约90、约90至约95、约95至约100、约100至约105、约105至约110、约110至约115、约115至约120、约120至约125、约125至约130、约130至约135、约135至约140、约140至约145、约145至约150、约150至约155、约155至约160、约160至约165、约165至170、约170至约175、约175至约180、约180至约185、约185至约190、约190至约195、约195至约200、约200至约205、约205至约210、约210至约215、约215至约220、约220至约225、约225至约230、约230至约235、约235至约240、约240至约245或约245至约250埃。
在一些方面，本公开的CAR间隔物(例如，表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中公开的CAR间隔物)的长度为约10至约20、约20至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约60、约60至约70、约70至约80、约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约130至约140、约140至约150、约150至约160、约160至约170、约170至约180、约180至约190、约190至约200、约200至约210、约210至约220、约220至约230、约230至约240、或约245至约250埃。
在一些方面，本公开的CAR间隔物(例如，表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中公开的CAR间隔物)的长度为约5至约25、约25至约50、约50至约75、约75至约100、约100至约125、约125至约150、约150至约175、约175至约200、约200至约225或约225至约250埃。
在一些方面，本公开的CAR间隔物(例如，表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中公开的CAR间隔物)的长度小于约250、小于约240、小于约230、小于约220、小于约210、小于约200、小于约190、小于约180、小于约170、小于约160、小于约150、小于约140、小于约130、小于约120、小于约110、小于约100、小于约90、小于约80、小于约70、小于约60、小于约50、小于约40、小于约30、小于约20或小于约10埃。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含与表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中列出的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含相对于表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中列出的序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些方面，半胱氨酸氨基酸被丙氨酸替代。在一些方面，所有的氨基酸取代都是保守氨基酸取代。在一些方面，至少一个氨基酸取代是保守的。在一些方面，至少一个氨基酸取代是非保守的。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中列出的序列，其中N末端氨基酸是天然存在的铰链的N末端氨基酸，并且其中表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中的序列被延长了一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸到对应的CH1区(即，天然存在的CH1区)中。换句话说，本公开的所得CAR间隔物包含对应CH1区(例如，来源于IgD铰链的CAR间隔物的IgD的CH1区)的C末端的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸，所述氨基酸附加到表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17的序列的N末端。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中列出的序列，其中C末端氨基酸是天然存在的铰链的C末端氨基酸，并且其中表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中的序列被延长了一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸到对应的CH2区(即，天然存在的CH2区)中。换句话说，所得CAR间隔物包含对应CH2区(例如，来源于IgD铰链的CAR间隔物的IgD的CH2区)的N末端的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸，所述氨基酸附加到表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17的序列的C末端。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17中列出的序列，其中(i)N末端氨基酸是天然存在的铰链的N末端氨基酸，并且C末端氨基酸是天然存在的铰链的C末端氨基酸，并且(ii)表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17的序列被延长了一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸到对应的CH1区(即，天然存在的CH1区)中，并且被延长了一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸到对应的CH2区(即，天然存在的CH2区)中。换句话说，所得CAR间隔物包含对应CH1区(例如，来源于IgD铰链的CAR间隔物的IgD的CH1区)的C末端的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸，所述氨基酸附加到表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17的序列的N末端，和对应CH2区(例如，来源于IgD铰链的CAR间隔物的IgD的CH2区)的C末端的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸，所述氨基酸附加到表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15或17的序列的C末端。
在一些具体方面，本公开的CAR间隔物包含图9中列出的序列，由其组成，或基本上由其组成。所述表包括本公开的示例性间隔物的序列、它们的SEQ ID NO、长度(包括任选的柔性接头)、Ig铰链源以及用于本说明书的附图和实施例部分中每个铰链的标识符(“间隔物”列)。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgA1铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物16(SEQ ID NO:4844)、间隔物17(SEQ ID NO:4845)、间隔物18(SEQ ID NO:4846)或间隔物19(SEQ ID NO:4847))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgA1铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgA2铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物20(SEQ ID NO:4848)、间隔物21(SEQ ID NO:4849)、间隔物22(SEQ ID NO:4850)或间隔物23(SEQ ID NO:4851))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgA2铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgD铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物24(SEQ ID NO:4852)、间隔物25(SEQ ID NO:4853)、间隔物26(SEQ ID NO:4854)或间隔物27(SEQ ID NO:4855))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgD铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgE铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物28(SEQ ID NO:4856))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgE铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgG1铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物11(SEQ ID NO:4840)或间隔物10(SEQ ID NO:4839))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgG1铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ IDNO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgG2(例如，人IgG2铰链)衍生的CAR间隔物(例如，间隔物14(SEQ ID NO:4842))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgG2铰链(例如，鼠IgG2A铰链)衍生的CAR间隔物(例如，间隔物1(SEQ ID NO:4830)、间隔物2(SEQ ID NO:4831)、间隔物3(SEQID NO:4832))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgG2铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgG2铰链(例如，鼠IgG2A铰链)衍生的CAR间隔物(例如，间隔物1(SEQ ID NO:4830)、间隔物2(SEQ ID NO:4831)、间隔物3(SEQID NO:4832))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示，其中IgG2铰链是IgG2A的铰链区(Uniprot P01865)。在一些方面，CAR间隔物包含SEQ ID NO:4860(EPRGPTIKPCPPC)的鼠IgG2A铰链的6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体或13聚体氨基酸子序列。在一些方面，来源于SEQ ID NO:4860的鼠IgG2A铰链的CAR间隔物还包含铰链序列下游的鼠IgG2A的1、2、3、4或5个CH1氨基酸(即，SEQ ID NO:4861的VDKKI序列或其子序列)和/或铰链序列下游的鼠IgG2A的1、2、3、4或5个CH2氨基酸(即，SEQ ID NO:4862的KCPAP序列或其子序列)。在一些方面，来源于SEQ ID NO:4860的鼠IgG2A铰链的CAR间隔物包含IgG2A铰链的KPCPPC(SEQ ID NO:4863)子序列和鼠IgG2A的CH2区的连续KPC子序列，即，CAR间隔物具有间隔物1的序列。在一些方面，IgG2铰链(例如，鼠IgG2A铰链)衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgG3铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物4(SEQ ID NO:4844)、间隔物5(SEQ ID NO:4834)、间隔物6(SEQ ID NO:4835)、间隔物7(SEQ ID NO:4836)、间隔物8(SEQ ID NO:4837)、间隔物9(SEQ ID NO:4838)或间隔物13(SEQ ID NO:4841))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgG3铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些具体的方面，本公开的CAR间隔物包含IgM铰链衍生的CAR间隔物(例如，间隔物29(SEQ ID NO:4857)、间隔物30(SEQ ID NO:4858)或间隔物31(SEQ ID NO:4859))的序列，由其组成，或基本上由其组成，如图9所示。在一些方面，IgM铰链衍生的CAR间隔物包含Gly-Ser接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的接头。
在一些方面，本公开的CAR间隔物与图9中列出的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些方面，本公开的CAR间隔物包含与图9中列出的序列中的任一个同一的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代除外。在一些方面，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代包括至少一个非保守氨基酸取代。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含图9中公开的SEQ ID NO:4830-4859的间隔物(间隔物1至31)中任一个的序列，其中间隔物序列还包含任选的柔性接头(例如，图9及其图例中列出的SEQ ID NO:4818或5088的接头)。因此，在一些方面，本公开的CAR间隔物包含图9中公开的间隔物序列和任选的C末端或N末端柔性接头。例如，在一些方面，本公开的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4882中列出的序列，即，间隔物1加上SEQ ID NO:4818的C末端接头；SEQ ID NO:4883中列出的序列，即，间隔物1加上SEQ ID NO:4818的N末端接头；或SEQ IDNO:4884中列出的序列，即，间隔物1加上SEQ ID NO:4818的C末端接头和N末端接头。例如，在一些方面，本公开的CAR间隔物包含间隔物1加上SEQ ID NO:5088的C末端接头的序列；间隔物1加上SEQ ID NO:5088的N末端接头的序列；或间隔物1加上SEQ ID NO:5088的C末端接头和N末端接头的序列。在一些方面，本文公开的任何任选的柔性接头(例如，富含gly/ser的接头)可以附加到图9中公开的任何间隔物序列的C末端和/或N末端。
在一些方面，本公开的CAR间隔物包含人免疫球蛋白铰链区的功能片段，其包含：
(a)IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2(例如，人IgG2或鼠IgG2A)、IgG3、IgG4或IgM的铰链区(例如，SEQ ID NO:4993-5002的铰链区)的内部子序列；
(b)IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2(例如，人IgG2或鼠IgG2A)、IgG3、IgG4或IgM的铰链区(例如，SEQ ID NO:4993-5002的铰链区)的C末端子序列；
(c)IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2(例如，人IgG2或鼠IgG2A)、IgG3、IgG4或IgM的铰链区(例如，SEQ ID NO:4993-5002的铰链区)的N末端子序列；
(d)IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2(例如，人IgG2或鼠IgG2A)、IgG3、IgG4或IgM的铰链区(例如，SEQ ID NO:4993--5002的铰链区)，其向N末端CH1结构域和/或C末端CH2结构域延伸1至10个氨基酸；
(e)向N末端CH1结构域延伸1至10个氨基酸的IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2(例如，人IgG2或鼠IgG2A)、IgG3、IgG4或IgM的铰链区(例如，SEQ ID NO:4993-5002的铰链区)的子序列；
(f)向C末端CH2结构域延伸1至10个氨基酸的IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2(例如，人IgG2或鼠IgG2A)、IgG3、IgG4或IgM的铰链区(例如，SEQ ID NO:4993-5002的铰链区)的子序列；
(g)包含(a)-(f)的2个或更多个重复的序列；
(h)对应于相同铰链区的(a)-(g)的组合；
(h)对应于不同铰链区的(a)-(g)的组合；或
(i)其任何组合。
在一些方面，铰链区是鼠铰链区。
在一些方面，本文公开的CAR间隔物包含SEQ ID NO:4831中列出的序列、基本上由其组成或由其组成，所述序列能够将特异性结合ROR1的抗原结合结构域与跨膜结构域连接。
在一些方面，本公开提供一种抗ROR1 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗ROR1CAR构建体的细胞或由包含scFv、CDR或VH和VL链的ROR1结合CAR编码的细胞，其中抗ROR1CAR包含本公开的CAR间隔物。抗ROR1 CAR表达细胞(例如CART)可以通过将包含ROR1结合结构域和本公开的CAR间隔物的ROR1CAR工程改造到细胞(例如T细胞或NK细胞)中来生成，例如，以向有需要的受试者施用。
在一些方面，ROR1 CAR包含SEQ ID NO:5070中列出的序列，其中间隔物(SEQ IDNO:4867中列出的位置268和281之间的子序列)已经被本文公开的间隔物序列取代。在一些方面，替代了SEQ ID NO:5070中的位置268和281之间的子序列的间隔物选自由SEQ IDNOS:4830至4859(间隔物1至间隔物31)组成的组。在一些方面，SEQ ID NO:4830至4859的间隔物序列还包含任选的SEQ ID NO:4818的N末端和/或C末端接头序列。在一些方面，SEQ IDNO:5070中位置268和281之间的子序列被间隔物1(SEQ ID NO:4830)替代。在一些方面，ROR1 CAR包含表21中公开的CAR序列。在一些方面，ROR1CAR-T包含表21中公开的CAR序列。在一些方面，ROR1 CAR包含SEQ ID NO:5072、5073、5074或5075中任一个中列出的CAR序列。在一些方面，ROR1 CAR-T包含SEQ ID NO:5072、5073、5074或5075中任一个中列出的CAR序列。
非限制性示例性ROR1结合结构域可见于表19，例如R12抗体。因此，在一些方面，ROR1 CAR包含来源于抗体R12、R11或2A2的结合部分(参见表19)。在一些方面，ROR1 CAR包含来源于R12抗体的结合部分和本文公开的间隔物，例如间隔物1或图9中公开的任何间隔物。在一些方面，ROR1 CAR包含来源于R11抗体的结合部分和本文公开的间隔物，例如间隔物1或图9中公开的任何间隔物。在一些方面，ROR1 CAR包含来源于2A2抗体的结合部分和本文公开的间隔物，例如间隔物1或图9中公开的任何间隔物。
在一些方面，本公开提供一种抗CD19 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD19CAR构建体的细胞或由包含scFv、CDR或VH和VL链的CD19结合CAR编码的细胞，其中抗CD19CAR包含本公开的CAR间隔物。抗CD19 CAR表达细胞(例如CART)可以通过将包含CD19结合结构域和本公开的CAR间隔物的CD19CAR工程改造到细胞(例如T细胞或NK细胞)中来生成，例如，以向有需要的受试者施用。
在一些方面，本公开提供了一种包含本文公开的间隔物的抗CD19 CAR。在一些方面，FMC63 CAR包含SEQ ID NO:5076中列出的序列，其中间隔物(SEQ ID NO:4876中列出的位置266至277的子序列)已经被本文公开的间隔物序列取代。在一些方面，替代了SEQ IDNO:5076中的位置266和277之间的子序列的间隔物选自由SEQ ID NOS:4830至4859(间隔物1至间隔物31)组成的组。在一些方面，SEQ ID NO:4830至4859的间隔物序列还包含任选的SEQ ID NO:4818的N末端和/或C末端接头序列。在一些方面，SEQ ID NO:5076中位置266和277之间的子序列被间隔物1(SEQ ID NO:4830)替代。在一些方面，抗CD19 CAR包含表23中公开的CAR序列。在一些方面，抗CD19 CAR-T包含表23中公开的CAR序列。在一些方面，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO:4918、4919、4920、4921、4922、4923、4924或4925中的任一个中列出的CAR序列。在一些方面，抗CD19 CAR包含CAR间隔物序列，其包含SEQ ID NO:4836、4837、4838、4839、4840、4842、4844或4856中列出的序列，由其组成，或基本上由其组成。
在一些方面，本公开提供一种抗Her2 CAR表达细胞，例如CAR-T，例如表达抗Her2CAR构建体的细胞或由包含scFv、CDR或VH和VL链的Her2结合CAR编码的细胞，其中抗Her2CAR包含本公开的CAR间隔物。抗Her2 CAR表达细胞(例如CART)可以通过将包含Her2结合结构域和本公开的CAR间隔物的Her2 CAR工程改造到细胞(例如T细胞或NK细胞)中来生成，例如，以向有需要的受试者施用。
在一些方面，本公开提供了一种包含本文公开的间隔物的抗Her2CAR。在一些方面，抗Her2 CAR包含表24中公开的CAR序列。在一些方面，抗Her2 CAR包含SEQ ID NO:5005、5006、5007或5008中列出的序列。在一些方面，抗Her2 CAR包含SEQ ID NO:5005、5006、5007或5008中列出的序列，其中SEQ ID NO:5003的scFv接头序列被SEQ ID NO:5004的scFv接头序列替代。在一些方面，抗Her2 CAR包含CAR间隔物序列，其包含SEQ ID NOs:4835、4836、4837或4844中列出的序列，由其组成，或基本上由其组成。
在一些方面，CAR(例如，本文公开的抗ROR1 CAR、抗CD19CAR或抗Her2 CAR)包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)、细胞外抗原结合结构域、本公开的CAR间隔物(例如，本文所述的铰链区衍生的CAR间隔物)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。
在一些方面，示例性CAR构建体(例如，本文公开的抗ROR1CAR、抗CD19 CAR或抗Her2 CAR)包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域、本公开的CAR间隔物(例如，本文所述的铰链或铰链和恒定区衍生的CAR间隔物)、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域(例如，本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
在一些方面，本公开涵盖重组核酸构建体，其包含编码CAR(例如，本文公开的抗ROR1 CAR、抗CD19 CAR或抗Her2 CAR)的核酸分子，其中核酸分子包含编码结合结构域(例如，本公开的抗ROR1CAR中的ROR1结合结构域，或本文公开的抗CD19 CAR中的CD19结合结构域，或本公开的抗Her2 CAR中的Her2结合结构域)的核酸序列，例如，所述核酸序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并处于同一阅读框中。可以用于CAR的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3ζ、CD28、4-1BB等的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些方面，CAR(例如，本文公开的抗ROR1CAR、抗CD19 CAR或抗Her2 CAR)可以包含CD3ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
在一些方面，结合结构域(例如，本公开的抗ROR1 CAR中的ROR1结合结构域，或本文公开的抗CD19 CAR中的CD19结合结构域，或本文公开的抗Her2 CAR中的Her2结合结构域)的特征在于抗体或抗原结合抗体片段的特定功能特征或性质。例如，在一些方面，本公开的CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性地结合人抗原或其片段(例如，本公开的抗ROR1 CAR中的人ROR1结合结构域，或本文公开的抗CD19 CAR中的人CD19结合结构域，或本文公开的抗Her2 CAR中的Her2结合结构域)。在某些方面，scFv与前导序列相邻并且处于相同的阅读框中。
在一些方面，结合结构域(例如，本公开的抗ROR1 CAR中的ROR1结合结构域，或本文公开的抗CD19 CAR中的CD19结合结构域，或本文公开的抗Her2 CAR中的Her2结合结构域)是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一些方面，结合结构域(例如，本公开的抗ROR1CAR中的ROR1结合结构域，或本文公开的抗CD19 CAR中的CD19结合结构域，或本文公开的抗Her2 CAR中的Her2结合结构域)是Fv、Fab、(Fab′)2或双功能(例如，双特异性)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一些方面，本公开的用于生成本公开的CAR的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合它们的靶蛋白(例如，ROR1、CD19或Her2)或其片段。在一些情况下，用于本公开的CAR中的人scFv可以来源于展示文库。
模块化Ig衍生的间隔物
本公开还提供了一种编码“模块化CAR间隔物”(即包含若干个重复的多肽单元的CAR间隔物)的多肽。本公开的这种特定类型的CAR间隔物允许调整间隔物的长度以相对于在靶细胞上表达的肿瘤抗原的表位最佳定位CAR抗原结合结构域。本文公开的模块化CAR间隔物可以通过连接两个或更多个本文公开的多肽(例如，铰链区衍生的CAR间隔物、环区衍生的CAR间隔物，或其组合)来生成。在特定方面，模块化CAR可以通过连接来源于IgG3铰链区的序列和/或包含在IgG3铰链区中鉴定的基序的多肽序列来生成。
因此，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)本公开的模块化CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中本公开的CAR间隔物包含式CN-(X1PRX2P)m-[L-(X1PRX2P)]n-CC的氨基酸序列，其中(i)模块化CAR间隔物位于CAR的配体结合结构域和跨膜结构域之间；(ii)模块化CAR间隔物具有至少15个氨基酸的长度；(iii)m为选自0或1的整数；(iv)n为1至20的整数；(v)L为接头多肽序列；(vi)CN为任选的N末端加帽序列；(vii)CC为任选的C末端加帽序列；以及(viii)X1和X2独立地选自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
在一些方面，模块化CAR间隔物包含两个、三个、四个、五个或六个X1PRX2P基序。在一些方面，X1PRX2P包含至少一个半胱氨酸。在一些方面，X1PRX2P是SEQ ID NO:4749(CPRCP)。在一些方面，L包含SEQ ID NO:4185的多肽或其片段或变体。在一些方面，当n>1时，所有L都是相同的。在一些方面，当n>1时，至少一个L与其他L不同。在一些方面，CN包含SEQ ID NO:4088的多肽或其片段或变体。在一些方面，CC包含SEQ ID NO:4453的多肽或其片段或变体。
在一些方面，模块化CAR间隔物包含式(CPRCP)o(EPKSCDTPPPCPRCP)p的序列，其中o是0或1的整数，并且p是1、2或3的整数。
在一些方面，模块化CAR间隔物包含选自由SEQ ID NO:2903；2983；3358；3728；和3958组成的组的氨基酸序列。
在一些方面，模块化CAR间隔物包含CC加帽序列，所述CC加帽序列包含SEQ ID NO:4453的多肽或其片段或变体。在一些方面，SEQ ID NO:4453的多肽的子序列是N末端AP。在一些方面，模块化CAR间隔物包含选自由SEQ ID NO:4750；4751；4752；4753；和4754组成的组的氨基酸序列。
在一些方面，模块化CAR间隔物包含CN加帽序列，所述CN加帽序列包含SEQ ID NO:4088的多肽或其片段或变体。在一些方面，模块化CAR间隔物包含SEQ ID NO:4811的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)模块化CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中间隔物包含式(EX3KX4X5X6X7DTX8X9X10TCPRCP)q(SEQ ID NO:4812)的氨基酸序列，其中q是1至10的整数，并且其中：X3为L或P；X4为T或S；X5为P或C；X6为L或不存在；X7为G或不存在；X8为T或P；X9为H或P；并且X10为T或P。
本公开还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)模块化CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中模块化CAR间隔物包含SEQ ID NO:4466的至少一个氨基酸序列A和/或SEQ ID NO:4477的至少一个氨基酸序列B，其中CAR间隔物的氨基酸序列对应于例如式AB、ABB、ABBB、ABBBB、A、B、BA、AA、BAB、BAA、AAA、ABA、BBB、AABB、AAAB。在一些方面，模块(序列A和序列B)经由模块中的C末端氨基酸和随后模块中的N末端氨基酸之间的氨基键连接。
在一些方面，本公开的模块化CAR间隔物对应于式{[A/B]-(L1)-[A/B]-(L2)]}n，其中A/B是SEQ ID NO:4466的氨基酸序列A或SEQ ID NO:4477的氨基酸序列B；L1和L2是任选的接头(例如，Gly-Ser接头，诸如SEQ ID NO:4818或5088的接头)；并且，n是1至100的整数。
来源于IgG3的包含SEQ ID NO:4466中列出的序列A和/或SEQ ID NO:4477中列出的序列B的组合的示例性模块化CAR间隔物在SEQ ID NO:4466-4518中列出。
在一些方面，L1和/或L2任选的接头是肽接头。在一些方面，L1和/或L2任选的接头可以包含至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个氨基酸。在一些方面，L1和/或L2任选的接头是如下所述的甘氨酸/丝氨酸(Gly-Ser)接头。
在一些方面，本公开的模块化CAR间隔物的长度为约15个氨基酸、约30个氨基酸、约45个氨基酸、约60个氨基酸、约75个氨基酸、约90个氨基酸、约105个氨基酸、约120个氨基酸、约135个氨基酸、约150个氨基酸、约165个氨基酸、约180个氨基酸、约195个氨基酸、约210个氨基酸、约225个氨基酸、约240个氨基酸、约255个氨基酸、约270个氨基酸、约285个氨基酸、约300个氨基酸。
在一些方面，本公开的模块化CAR间隔物的长度为约10至约15个、约15至约20个、约20至25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约70至约75个、约75至约80个、约80至约85个、约85至约90个、约95至约100个、约100至约105个、约105至约110个、约110至约115个、约115至约120个、约120至约125个、约125至约130个、约130至约135个、约135至约140个、约140至约145个、约145至约150个、约150至约155个、约155至约160个、约160至约165个、约165至约170个、约170至约175个、约175至180个、约180至约185个、约185至约190个、约190至约196个、约195至约200个、约200至约205个、约205至约210个、约210至约215个、约215至约220个、约220至约225个、约225至约230个、约230至约235个、约235至约240个、约240至约245个、约245至约250个、约250至约255个、约255至约260个、约260至约265个、约265至约270个、约270至约275个、约275至约280个、约280至约285个、约285至约290个、约290至约295个或约295至约300个氨基酸。
接头
在一些方面，本公开的任何CAR间隔物(例如，表1、3、5、7、9A、9B、11、13、15、或17中公开的任何CAR间隔物，其任选地包含表2、4、6、8、10A、10B、12、14、16、或18中公开的N末端和C末端序列，或本文公开的任何模块化CAR间隔物)可以包含任选的N末端接头和/或任选的C末端接头。本领域已知的柔性接头序列可用作任选的接头。在一些方面，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。如本文所用，术语“甘氨酸/丝氨酸”与术语“Gly/Ser”可互换使用，并且是指如下文举例说明的包含氨基酸甘氨酸(G，Gly)和/或丝氨酸(S，Ser)的重复的接头序列。
在一些方面中，任选的接头是根据式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO:4813)的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n为1至100的任何整数，并且m为1至100的任何整数。在其他方面，所述甘氨酸/丝氨酸接头根据式[(Gly)x-Sery]z(SEQ ID NO:4814)，其中x为1至4的整数，y为0或1，并且z为1至50的整数。在一些方面，任选的接头包含序列Gn(SEQ ID NO:4815)，其中n可以为1至100的整数。在一些方面，任选的接头可以包含序列(GlyAla)n(SEQ ID NO:4816)，其中n为1至100的整数。
在一些方面，任选的接头的序列具有SEQ ID NO:4817中列出的序列。在一些方面，任选的接头的序列是GGGSG(SEQ ID NO:4818)。在一些方面，任选的接头的序列是GGGGSG(SEQ ID NO:5088)。
在其他方面，任选的接头包含SEQ ID NO:4819中列出的序列。在其他方面，任选的接头包含SEQ ID NO:4820中列出的序列。在其他方面，任选的接头可以包含SEQ ID NO:4821中列出的序列。在其他方面，任选的接头可以包含SEQ ID NO:4822中列出的序列。在这些情况下，n可以是1至100的整数。在其他情况下，n可以是1至20的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些方面，n是1至100的整数。
任选的接头的实例包括但不限于例如SEQ ID NO:4823、4824、4825、4826、4827、4828或4829中列出的序列。
在一些方面，任选的接头包含序列PGG。在一些方面，任选的接头包含除甘氨酸和丝氨酸之外的额外氨基酸。在一些方面，任选的接头包含1、2、3、4或5个非gly/非ser氨基酸。在一些方面，Gly/Ser接头包含至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少95％的甘氨酸或丝氨酸氨基酸。
在一些具体的方面，任选的接头长度在为1至10个氨基酸。在一些方面，任选的接头的长度为约5至约10、约10至约20、约20至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约60、约60至约70、约70至约80、约80至约90或约90至约100个氨基酸。
Ig衍生CAR间隔物的合理设计
在一些方面，本公开提供了Ig衍生的CAR间隔物，其被选择用于将CAR的抗原结合部分定位在最佳距离或最佳位置，以与位于靶蛋白上的表位相互作用。如图7示意性地表示，可以估计CAR间隔物的最佳长度，例如，通过估计或测量表位和靶细胞表面之间的距离，以及估计或测量信号传导突触，即，表达CAR的细胞(例如，CART细胞)的表面和靶细胞表面之间的距离。
在一些方面，计算可以假设信号传导突触的宽度大约为150埃。在一些方面，可以例如使用X射线结晶学、NMR或cryo-EM结构来估计表位和靶细胞膜表面之间的距离。在一些方面，可以例如使用光谱技术(例如使用荧光共振能量转移(FRET))来估计表位和靶细胞膜表面之间的距离。
在一些方面，估计值可以用于选择用于筛选的候选CAR间隔物序列的子集。随后可以如本申请的实施例部分所述筛选这些序列，以便确定例如哪个间隔物(并且，因此，间隔物的长度)导致细胞因子分泌或靶细胞裂解增加。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)本公开的CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中
(a)本公开的CAR间隔物的长度为约150个氨基酸至约125个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001291
(b)本公开的CAR间隔物的长度为约125个氨基酸至约100个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001292
(c)本公开的CAR间隔物的长度为约100个氨基酸至约75个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001293
(d)本公开的CAR间隔物的长度为约75个氨基酸至约36个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013018
(e)本公开的CAR间隔物的长度为约35个氨基酸至约21个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013019
至约
Figure BDA00040438656300013020
(f)本公开的CAR间隔物的长度为约20个氨基酸至约16个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013015
至约
Figure BDA00040438656300013016
(g)本公开的CAR间隔物的长度为约15个氨基酸至约11个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013013
至约
Figure BDA00040438656300013014
或者
(h)本公开的CAR间隔物的长度为约10个氨基酸至约5个氨基酸；并且表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300013017
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)本公开的CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中
(a)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001301
至约
Figure BDA0004043865630001302
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001303
(b)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001304
至约
Figure BDA0004043865630001305
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001306
(c)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001307
至约
Figure BDA0004043865630001308
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001309
(d)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013010
至约
Figure BDA00040438656300013011
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013012
(e)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001311
至约
Figure BDA0004043865630001312
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA0004043865630001313
至约
Figure BDA0004043865630001314
(f)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001315
至约
Figure BDA0004043865630001316
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA0004043865630001317
至约
Figure BDA0004043865630001318
(g)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001319
至约
Figure BDA00040438656300013110
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013111
至约
Figure BDA00040438656300013112
或者
(h)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013113
至约
Figure BDA00040438656300013114
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300013115
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013116
并且间隔物的长度为125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013117
并且间隔物的长度为约500、约510、约520、约530、约540、约550、约560、约570、约580、约590或约
Figure BDA00040438656300013118
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013119
并且间隔物的长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013120
并且间隔物的长度为约400、约410、约420、约430、约440、约450、约460、约470、约480、约490或约
Figure BDA00040438656300013121
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013122
并且间隔物的长度为75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013123
并且间隔物的长度为约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390或约
Figure BDA0004043865630001321
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001322
并且间隔物的长度为36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001323
并且间隔物的长度为约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约
Figure BDA0004043865630001324
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA0004043865630001325
至约
Figure BDA0004043865630001326
Figure BDA0004043865630001327
并且间隔物的长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA0004043865630001328
至约
Figure BDA0004043865630001329
并且间隔物的长度为约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140或约
Figure BDA00040438656300013210
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013211
至约
Figure BDA00040438656300013212
Figure BDA00040438656300013213
并且间隔物的长度为16、17、18、19或20个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013214
至约
Figure BDA00040438656300013215
并且间隔物的长度为约60、约65、约70、约75或约
Figure BDA00040438656300013216
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013217
至约
Figure BDA00040438656300013218
Figure BDA00040438656300013219
并且间隔物的长度为11、12、13、14或15个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013220
至约
Figure BDA00040438656300013221
并且间隔物的长度为约40、约45、约50、约55或约
Figure BDA00040438656300013222
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300013223
并且间隔物的长度为5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300013224
并且间隔物的长度为约20、约25、约30、约35或约
Figure BDA00040438656300013225
还提供了一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；(ii)跨膜结构域；(iii)细胞内结构域；和(iv)本公开的CAR间隔物，其位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，其中
(a)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001331
至约
Figure BDA0004043865630001332
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001333
(b)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001334
至约
Figure BDA0004043865630001335
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001336
(c)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001337
至约
Figure BDA0004043865630001338
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001339
(d)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013310
至约
Figure BDA00040438656300013311
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013312
(e)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013313
至约
Figure BDA00040438656300013314
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013315
至约
Figure BDA00040438656300013316
(f)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013317
至约
Figure BDA00040438656300013318
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013319
至约
Figure BDA00040438656300013320
(g)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013321
至约
Figure BDA00040438656300013322
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013323
至约
Figure BDA00040438656300013324
或者
(h)本公开的CAR间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013325
至约
Figure BDA00040438656300013326
并且表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300013327
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013328
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013329
约
Figure BDA00040438656300013330
约
Figure BDA00040438656300013331
、约
Figure BDA00040438656300013332
约
Figure BDA00040438656300013333
约
Figure BDA00040438656300013334
约
Figure BDA00040438656300013335
约
Figure BDA00040438656300013336
或约
Figure BDA00040438656300013337
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA0004043865630001341
并且间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630001342
约
Figure BDA0004043865630001343
约
Figure BDA0004043865630001344
约
Figure BDA0004043865630001345
约
Figure BDA0004043865630001346
约
Figure BDA0004043865630001347
约
Figure BDA0004043865630001348
约
Figure BDA0004043865630001349
Figure BDA00040438656300013410
或约
Figure BDA00040438656300013411
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013412
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013413
约
Figure BDA00040438656300013414
约
Figure BDA00040438656300013415
约
Figure BDA00040438656300013416
约
Figure BDA00040438656300013417
、约
Figure BDA00040438656300013418
约
Figure BDA00040438656300013419
约
Figure BDA00040438656300013420
或约
Figure BDA00040438656300013421
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离小于约
Figure BDA00040438656300013422
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013423
约
Figure BDA00040438656300013424
约
Figure BDA00040438656300013425
约
Figure BDA00040438656300013426
约
Figure BDA00040438656300013427
约
Figure BDA00040438656300013428
约
Figure BDA00040438656300013429
约
Figure BDA00040438656300013430
约
Figure BDA00040438656300013431
约
Figure BDA00040438656300013432
约
Figure BDA00040438656300013433
约
Figure BDA00040438656300013434
约
Figure BDA00040438656300013435
Figure BDA00040438656300013436
或约
Figure BDA00040438656300013437
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013438
Figure BDA00040438656300013439
至约
Figure BDA00040438656300013440
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013441
约
Figure BDA00040438656300013442
约
Figure BDA00040438656300013443
约
Figure BDA00040438656300013444
约
Figure BDA00040438656300013445
、约
Figure BDA00040438656300013446
约
Figure BDA00040438656300013447
约
Figure BDA00040438656300013448
或约
Figure BDA00040438656300013449
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013450
至约
Figure BDA00040438656300013451
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013452
约
Figure BDA00040438656300013453
约
Figure BDA00040438656300013454
和约
Figure BDA00040438656300013455
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离为约
Figure BDA00040438656300013456
至约
Figure BDA00040438656300013457
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013458
约
Figure BDA00040438656300013459
约
Figure BDA00040438656300013460
或约
Figure BDA00040438656300013461
在一些方面，表位和靶细胞膜表面之间的距离大于约
Figure BDA00040438656300013462
并且间隔物的长度为约
Figure BDA00040438656300013463
约
Figure BDA00040438656300013464
约
Figure BDA00040438656300013465
或约
Figure BDA00040438656300013466
抗原结合结构域
在一些方面，编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链区衍生的CAR间隔物、环区衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多肽包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含特异性地结合肿瘤抗原上的表位的抗体或其抗原结合片段(例如ScFv)，例如，蛋白激酶，诸如酪氨酸蛋白激酶。
在一些方面，肿瘤抗原选自由以下组成的组：ROR1、HER2、AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺素、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分、及其任何组合。
在一些方面，本公开的CAR的抗原结合结构域是lg NAR、Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、微抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、胞内抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单抗体或纳米抗体。在一些情况下，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见，例如，Bird等人，(1988)Science242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。ScFv分子可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果采用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，链内折叠则被阻止。还需要链间折叠将两个可变区结合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和尺寸的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，所述文献和专利以引用方式并入本文。
scFv可以包含例如其VL和VH区之间的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的序列。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个方面，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复，诸如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:81)。在一些方面，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:82)或(Gly4Ser)3(SEQID NO:83)，或上文公开的任何富含gly-ser的接头。
在一些方面，接头可以是例如抗CD19 scFv(诸如基于FMC63的scFv)中的GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:4885)。在其他方面，接头可以是例如基于抗Her2的GSTSGSGKPGSGEGS(SEQ ID NO:4886)。
接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些方面，可以修饰抗原结合结构域或其他部分或整个CAR的氨基酸序列，例如可以修饰本文所述的氨基酸序列，例如通过保守取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一些具体方面，肿瘤抗原是酪氨酸蛋白激酶跨膜受体“ROR1”，其也被称为神经营养性酪氨酸酶激酶受体相关1(NTRKR1)。人氨基酸和核酸序列可见于公共数据库，诸如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人ROR1的同种型1和2前体的氨基酸序列分别可见于登录号NP_005003.2和NP_001077061.1，并且编码它们的mRNA序列分别可见于登录号NM_005012.3和NM_001083592.1。如本文所用，“ROR1”包括包含突变(例如,全长野生型ROR1的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。在一些方面，CAR的抗原结合部分识别并结合ROR1蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一些方面，ROR1蛋白在癌细胞上表达。
ROR1是受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族的成员。在人中，ROR1由ROR1基因编码。由这个基因编码的蛋白质是一种调节中枢神经系统的生长并在癌细胞的转移中发挥作用的受体酪氨酸激酶。ROR1被认为是一种假激酶，其缺乏显著的催化活性并且与不规范的Wnt信号传导途径相互作用。ROR1的表达增加与例如B细胞慢性淋巴细胞白血病有关。ROR1在循环肿瘤细胞中高度表达，并且促进胰腺癌细胞的侵袭(Xu等人，2018,Mol.Med.Rep.18:5087-5094)。ROR1似乎还促进子宫内膜癌的肿瘤进展，这与它在卵巢癌中的作用类似(Henry等人，2018,Gynecol.Oncol.148:576-584)。ROR1在上皮肿瘤中表达，并且在卵巢癌、三阴性乳腺癌和肺癌的子集上均匀表达(Balakrishnan等人，2017,Clin,Cancer Res.23:3061-3071)。ROR1表达还与结直肠癌患者的淋巴结转移呈正相关(Zhou等人，2017,Oncotarget 8:32864-32872).
在一些方面，抗ROR1抑制剂(例如，本公开的CAR或表达那些CAR的细胞)可以用于治疗B细胞恶性肿瘤(例如白血病，诸如CLL和B细胞淋巴瘤，诸如套细胞淋巴瘤；ALL；小淋巴细胞淋巴瘤；边缘细胞B细胞淋巴瘤；以及伯基特淋巴瘤(Burkett's Lymphoma))或上皮癌(例如，乳腺癌、肾细胞癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌和黑色素瘤)。
示例性抗ROR1 CAR在Hudecek等人Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64中有所描述，所述文献以引用方式并入本文。在一些方面，本公开的CAR包含Hudecek等人中描述的抗ROR1 CART(例如，如Hudecek等人的第3155页第一完整段落中所述生成，所述文献以引用方式并入本文)，其中Hudecek中公开的间隔物已经被本公开的CAR间隔物替代。在其他方面，本公开的抗ROR1 CAR包括抗体或其片段，所述抗体或其片段包含Hudecek等人的桥接页3154-55；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；和Yang等人PLoS ONE6(2011):e21018中描述的2A2、R11和R12抗-ROR1单克隆抗体中的VH和/或VL序列，所述文献以引用方式并入本文。
在一些方面，本公开的抗原结合结构域能够与抗ROR1抗体(例如R11、R12或2A2抗体)交叉竞争。R11、R12和2A2抗体序列在表19中示出。在一些方面，可用于本公开的抗原结合结构域结合R11抗体、R12抗体或2A2抗体的相同表位。
表19.R11、R12和2A2抗体CDR
Figure BDA0004043865630001381
Figure BDA0004043865630001391
在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R11抗体的VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R11抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R11抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域(例如R11 scFv)包含R11抗体的VH和VL。在一些方面，R11 scFv通过IgG2接头(例如间隔物1(SEQ ID NO:4830)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R11 scFv通过IgG1接头(例如间隔物11(SEQ IDNO:4840)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R11scFv通过IgG3接头(例如间隔物13(SEQ ID NO:4841)和任选的SEQ ID NO:4818的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R11 scFv通过IgG2接头(例如间隔物14(SEQ ID NO:4842)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。
在一些方面，R11 scFv通过IgG3接头(例如间隔物4(SEQ ID NO:4833)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R11 scFv通过IgG3接头(例如间隔物5(SEQ ID NO:4834)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R11 scFv通过IgG3接头(例如间隔物6(SEQ ID NO:4835)和任选的SEQ IDNO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。
在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域(例如R12 scFv)包含R12抗体的VH和VL。在一些方面，R12 scFv通过IgG2接头(例如间隔物1(SEQ ID NO:4830)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R12 scFv通过IgG1接头(例如间隔物11(SEQ IDNO:4840)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R12scFv通过IgG3接头(例如间隔物13(SEQ ID NO:4841)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，R12 scFv通过IgG2接头(例如间隔物14(SEQ ID NO:4842)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。
在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含2A2抗体的VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含2A2抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含2A2抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域(例如2A2 scFv)包含2A2抗体的VH和VL。在一些方面，2A2 scFv通过IgG2接头(例如间隔物1(SEQ ID NO:4830)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，2A2 scFv通过IgG1接头(例如间隔物11(SEQ IDNO:4840)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，2A2scFv通过IgG3接头(例如间隔物13(SEQ ID NO:4841)和任选的SEQ ID NO:4818的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，2A2 scFv通过IgG2接头(例如间隔物14(SEQ ID NO:4842)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。
在一些方面，2A2 scFv通过IgG3接头(例如间隔物9(SEQ ID NO:4838)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。在一些方面，2A2 scFv通过IgG3接头(例如间隔物10(SEQ ID NO:4839)和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头)连接至跨膜结构域。
在其他方面，本公开的靶向ROR1的CAR包括靶向ROR1的抗体或其片段(例如,单链可变片段(scFv))，包括2017年9月12日公布的美国专利号US9316646B2或2016年4月19日公布的US9758586B2中描述的那些，所述专利以引用方式并入本文。
在一些方面，本公开的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域和跨膜结构域通过本公开的CAR间隔物连接，其中间隔物包含SEQ IDNO:4830中列出的序列和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头，并且其中抗原结合结构域包含R11抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，例如R11抗体的VH和VL。在一些方面，间隔物包含SEQ ID NO:4840、SEQ ID NO:4841或SEQ ID NO:4842中列出的序列和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头。在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001411
至约
Figure BDA0004043865630001412
在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001413
在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001414
约
Figure BDA0004043865630001415
约
Figure BDA0004043865630001416
约
Figure BDA0004043865630001417
约
Figure BDA0004043865630001418
约
Figure BDA0004043865630001419
约
Figure BDA00040438656300014110
或约
Figure BDA00040438656300014111
在一些方面，本公开的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域和跨膜结构域通过本公开的CAR间隔物连接，其中间隔物包含SEQ IDNO:4830中列出的序列和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头，并且其中抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，例如R12抗体的VH和VL。在一些方面，间隔物包含SEQ ID NO:4840、SEQ ID NO:4841或SEQ ID NO:4842中列出的序列和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头。在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA00040438656300014112
至约
Figure BDA00040438656300014113
在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA00040438656300014114
在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA00040438656300014115
约
Figure BDA00040438656300014116
约
Figure BDA00040438656300014117
约
Figure BDA00040438656300014118
或约
Figure BDA00040438656300014119
在一些方面，本公开的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域和跨膜结构域通过本公开的CAR间隔物连接，其中间隔物包含SEQ IDNO:4830中列出的序列和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头，并且其中抗原结合结构域包含2A2抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，例如2A2抗体的VH和VL。在一些方面，间隔物包含SEQ ID NO:4840、SEQ ID NO:4841或SEQ ID NO:4842中列出的序列和任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头。在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001421
至约
Figure BDA0004043865630001422
在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001423
在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818或5088的接头和间隔物的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001424
约
Figure BDA0004043865630001425
约
Figure BDA0004043865630001426
约
Figure BDA0004043865630001427
或约
Figure BDA0004043865630001428
在一些方面，抗ROR1抗原结合抗体片段(例如，scFv)缀合或融合至生物活性分子例如以形成指导免疫细胞(例如，T细胞)响应ROR1表达细胞的本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)。
在一些方面，本公开的抑制ROR1的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)包括被称为UC-961(Cirmtuzumab)的抗ROR1单克隆抗体或其抗原结合部分。参见，例如，临床试验标识符NCT02222688。Cirmtuzumab可以用于治疗癌症，诸如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、卵巢癌和黑色素瘤。参见，例如，Hojjat-Farsangi等人PLoS One.8(4):e61167；和NCT02222688。
在一些方面，本公开的抑制CD19的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)包括抗CD19抗体或其抗原结合部分。
在一些方面，本公开的抑制Her2的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)包括抗Her2抗体或其抗原结合部分。
信号传导、跨膜、共刺激结构域
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的细胞内结构域是来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号传导结构域。在一些方面，CAR还包含来源于2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、ICOS(CD278)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的共刺激结构域。在一些方面，CAR还包含4-11BB共刺激结构域。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:4869。
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。跨膜结构域可以来源于天然来源或来源于重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。在一些方面，每当本公开的CAR已经结合靶标时，跨膜结构域能够向细胞内结构域发信号。
在一些方面，跨膜结构域可以至少包括例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19的跨膜结构域。
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)还包含编码共刺激结构域(例如本文所述的共刺激结构域)的序列。在一些方面，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。在一些方面，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及特异性结合CD83的配体。在一些方面，共刺激结构域包含4-1BB、CD27、CD28或ICOS。
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)还包含编码细胞内结构域(例如本文所述的细胞内结构域)的序列。在一些方面，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一些方面，细胞内信号传导结构域包含CD27的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)还包含前导序列。在一些方面，细胞内信号传导结构域包含有包含SEQ ID NO:4870的CD3z。
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)、细胞外抗原结合结构域、本公开的CAR间隔物、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。
在一些方面，本公开的示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域(例如，本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
在一些方面，本公开的CAR(例如，靶向ROR1、CD19或Her 2的CAR)的跨膜结构域包含通过接头连接至CAR的细胞内结构域的跨膜结构域。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物1，其包含或由SEQ ID NO:4830组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物15，其包含或由SEQ ID NO:4843组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物21，其包含或由SEQ ID NO:4849组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物4，其包含或由SEQ ID NO:4833组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物5，其包含或由SEQ ID NO:4834组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物6，其包含或由SEQ ID NO:4835组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物13，其包含或由SEQ ID NO:4841组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物21，其包含或由SEQ ID NO:4889组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物28，其包含或由SEQ ID NO:4856组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001482
至
Figure BDA0004043865630001483
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001481
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001491
至
Figure BDA0004043865630001492
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001495
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001493
至
Figure BDA0004043865630001494
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001501
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:5049至5063中列出的序列，由其组成，或基本上由其组成。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R12scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物1，其包含或由SEQ ID NO:4830组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R12scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物15，其包含或由SEQ ID NO:4843组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R12scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物21，其包含或由SEQ ID NO:4849组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R11scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物4，其包含或由SEQ ID NO:4833组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R11scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物5，其包含或由SEQ ID NO:4834组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R11scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物6，其包含或由SEQ ID NO:4835组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)2A2scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物13，其包含或由SEQ ID NO:4841组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)2A2scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物21，其包含或由SEQ ID NO:4889组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)2A2scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物28，其包含或由SEQ ID NO:4856组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R12scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001531
至
Figure BDA0004043865630001532
在一些方面，CAR包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R12scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001533
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R11scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001534
至
Figure BDA0004043865630001535
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)R11scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001536
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)2A2scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001541
至
Figure BDA0004043865630001542
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含(i)2A2scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001543
在一些方面，CAR还包含(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含SEQ IDNO:5049至5063中列出的序列，由其组成，或基本上由其组成。
双特异性CAR
在一些方面，本公开的CAR是双特异性CAR。因此，在一些方面，编码本公开的CAR的多核苷酸至少编码双特异性CAR(例如，靶向第一抗原和第二抗原的CAR)的多肽。
在一些方面，本公开的CAR的抗原结合结构域是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些方面，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一些方面，第一和第二表位重叠。在其他方面，第一和第二表位不重叠。在一些方面，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。
在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些方面，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些方面，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于生成双特异性或异二聚体抗体分子的方案是本领域已知的。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗原结合抗体片段(例如，scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些方面，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成其VH(VH1)在其VL(VL1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成其VL(VL2)在其VH(VH2)上游，使得整个双特异性抗体分子具有VH1-VL1-VL2-VH2排列。在其他方面，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成其VL(VL1)在其VH(VH1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成其VH(VH2)在其VL(VL2)上游，使得整个双特异性抗体分子具有VL1-VH1-VH2-VL2排列。任选地，接头设置在两个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间，例如，如果构建体排列为VH1-VL1-VL2-VH2，则设置在VL1和VL2之间，或者如果构建体排列为VL1-VH1-VH2-VL2，则设置在VH1和VH2之间。接头可以是本文所述的接头，例如(Gly4Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，例如4(SEQ ID NO:83)。一般来讲，两个scFv之间的接头应该足够长，以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头设置在第一scFv的VL和VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL和VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或多个可以相同或不同。因此，在一些方面，双特异性CAR包含VL、VH和任选地一个或多个呈如本文所述的排列的接头。
在一些方面，抗体分子是双特异性抗体分子，其具有位于第一肿瘤抗原(例如，ROR1)上的第一表位和位于第二抗原(例如，CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)上的第二表位。在一些方面，双特异性抗体结合第一表位，其中第一表位位于CD19上，并且结合第二表位，其中第二表位位于CD20上。在一些方面，双特异性抗体结合第一表位，其中第一表位位于CD19上，并且结合第二表位，其中第二表位位于CD22上。在一些方面，双特异性抗体结合第一表位，其中第一表位位于CD20上，并且结合第二表位，其中第二表位位于CD22上。在某些方面，抗体分子是双特异性抗体分子，其对第一B细胞表位具有第一结合特异性并且对另一个B细胞抗原具有第二结合特异性。例如，在一些实施方案中，双特异性抗体分子对第一B细胞表位(例如，ROR1)具有第一结合特异性，并且对CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a B细胞表位中的一个或多个具有第二结合特异性。
诱导型CAR
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的表达受组成型启动子调控，例如立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸生长因子-1α(EF-1α)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、罗斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。然而，本公开的CAR表达的调控不限于使用组成型启动子。
因此，在一些方面，由本文公开的多核苷酸编码的本公开的CAR是诱导型CAR。术语“诱导型”是指“诱导型启动子”(即一种启动子，当其与编码或指定基因产物(例如，本公开的CAR)的多核苷酸可操作地连接时，其基本上仅当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才导致在细胞中产生基因产物)的存在。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，其能够在期望这种表达时开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望这种表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在其他方面，编码本公开的CAR的多核苷酸包含“组织特异性”启动子，即一种启动子，当其与编码或指定基因产物(例如，本公开的CAR)的多核苷酸可操作地连接时，其基本上仅当细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时，才导致基因产物在细胞中产生。
载体
本公开还提供了一种载体，其包含编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至调控元件。在一些方面，编码本公开的CAR的多核苷酸是DNA分子或RNA分子。
在一些方面，载体是转移载体。术语“转移载体”是指包含分离的核酸(例如，本公开的多核苷酸)并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体在本领域是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应当解释为还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
在一些方面，载体是表达载体。术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸(例如，本公开的多肽)的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些载体，包括掺入到重组多核苷酸中的粘粒、质粒(例如，裸质粒或脂质体中含有的质粒)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在一些方面，载体是细菌载体、哺乳动物载体或细菌载体。在一些方面，载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦巴尔病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杂交载体和AAV载体。
在一些方面，腺病毒载体是第三代腺病毒载体。ADEASYTM是目前最流行的用于产生腺病毒载体构建体的方法。所述系统由两种类型的质粒组成：穿梭(或转移)载体和腺病毒载体。将感兴趣的转基因克隆到穿梭载体中，验证并用限制酶PmeI线性化。然后将此构建体转化到ADEASIER-1细胞中，所述细胞是含有PADEASYTM的BJ5183大肠杆菌细胞。PADEASYTM是含有病毒生产所必需的腺病毒基因的约33Kb的腺病毒质粒。穿梭载体和腺病毒质粒具有匹配的左和右同源臂，这有助于转基因同源重组到腺病毒质粒中。也可以将具有超螺旋PADEASYTM的标准BJ5183和穿梭载体共同转化，但这种方法导致非重组腺病毒质粒的背景较高。然后验证重组腺病毒质粒的大小和适当的限制性消化模式，以确定转基因已插入到腺病毒质粒中，并且没有发生其他重组模式。一旦验证，就将重组质粒用PacI线性化，以产生由ITR侧接的线性dsDNA构建体。将293或911细胞用线性化构建体转染，并且约7-10天后可收获病毒。除了此方法之外，在提交本申请时本领域中已知的用于产生腺病毒载体构建体的其他方法可以用于实践本文公开的方法。
在其他方面，病毒载体是逆转录病毒载体，例如，慢病毒载体(例如，第三代或第四代慢病毒载体)。术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞方面是逆转录病毒中独特的；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。术语“慢病毒载体”是指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453--1464(2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可以用于临床的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0004043865630001591
基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的并且是本领域技术人员已知的。
慢病毒载体通常在瞬时转染系统中产生，其中用三种单独的质粒表达系统转染细胞系。这些包括转移载体质粒(HIV原病毒的部分)、包装质粒或构建体以及具有不同病毒的异源包膜基因(env)的质粒。将载体的三种质粒组分放入包装细胞中，然后将所述包装细胞插入HIV外壳中。载体的病毒部分含有插入序列，使得病毒不能在细胞系统内复制。当前的第三代慢病毒载体仅编码九种HIV-1蛋白中的三种(Gag、Pol、Rev)，它们从单独质粒中表达，以避免重组介导的有复制能力的病毒的生成。在第四代慢病毒载体中，逆转录病毒基因组被进一步减少(参见例如，
Figure BDA0004043865630001592
LENTI-XTM第四代包装系统)。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)间隔物1，其包含或由SEQ ID NO:4830组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vi)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)间隔物11，其包含或由SEQ ID NO:4840组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vi)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)间隔物13，其包含或由SEQ ID NO:4841组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vi)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)间隔物14，其包含或由SEQ ID NO:4842组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vi)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物1，其包含或由SEQ ID NO:4830组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物15，其包含或由SEQ ID NO:4843组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物21，其包含或由SEQ ID NO:4849组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物4，其包含或由SEQ ID NO:4833组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物5，其包含或由SEQ ID NO:4834组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物6，其包含或由SEQ ID NO:4835组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物13，其包含或由SEQ ID NO:4841组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物21，其包含或由SEQ ID NO:4889组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)间隔物28，其包含或由SEQ ID NO:4856组成，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ IDNO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001631
在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R12 scFv，其包含SEQ ID NO:4875；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001641
在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001642
在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)R11 scFv，其包含SEQ ID NO:5048；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001643
在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为
Figure BDA0004043865630001651
在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)2A2 scFv，其包含SEQ ID NO:5047；(ii)SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头，(iii)来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的间隔物或其功能片段，(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4868，以及任选的(v)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4869，其中接头(ii)和间隔物(iii)的组合长度为约
Figure BDA0004043865630001652
在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(vi)CD3z，其包含SEQ ID NO:4870；(vii)P2A，其包含SEQ ID NO:4871；(viii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4872，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码CAR的多核苷酸序列，所述CAR包含SEQ ID NO:5049至5063中列出的序列，由其组成，或基本上由其组成。在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物7，其包含或由SEQ ID NO:4836组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQ ID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物8，其包含或由SEQ ID NO:4837组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物9，其包含或由SEQ ID NO:4838组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物10，其包含或由SEQ ID NO:4939组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物11，其包含或由SEQ ID NO:4840组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物14，其包含或由SEQ ID NO:4842组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物16，其包含或由SEQ ID NO:4844组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物28，其包含或由SEQ ID NO:4856组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种慢病毒载体，其包含编码以下的多核苷酸序列：(i)FMC63 scFv，其包含SEQ ID NO:4866；(ii)间隔物28，其包含或由SEQ ID NO:4856组成，和任选的SEQ ID NO:4818或5088的Gly-Ser接头；(iii)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:4877，以及任选的(iv)4-1BB共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:4878。在一些方面，慢病毒载体还包含编码以下的多核苷酸序列：(v)CD3z，其包含SEQ ID NO:4879；(vi)P2A，其包含SEQID NO:4880；(vii)EGFRt，其包含SEQ ID NO:4881，或其任何组合。
在一些方面，可以使用非病毒方法将包含编码本公开的CAR的多核苷酸的核酸递送到受试者的细胞或组织中。在一些方面，非病毒方法包括使用转座子。在一些方面，使用非病毒递送方法允许细胞(例如，T细胞或NK细胞)的重新编程和将细胞直接输注到受试者中。在一些方面，包含编码本公开的CAR的多核苷酸的核酸序列可以通过使用CRISPR/Cas系统和基因组编辑替代方案(诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶(MN))来插入到靶细胞(例如，T细胞)或宿主细胞(例如，用于CAR多肽的重组表达的细胞)的基因组中。
在一些方面，本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)可以使用双顺反子或多顺反子表达载体在细胞中表达。在一些方面，双顺反子或多顺反子载体包括但不限于：(1)融合至多个CAR的开放阅读框的多个启动子；(2)CAR的单元之间的剪接信号的插入；表达由单个启动子驱动的CAR的融合；(3)CAR(自切割肽)的单元之间的蛋白水解切割位点的插入；(iv)内部核糖体进入位点(IRES)的插入。
在一些方面，多个CAR单元在单个开放阅读框(ORF)中表达，从而产生具有多个CAR单元的单个多肽，其中所述CAR中的至少一个是本公开的CAR。在一些方面，含有高效切割位点的氨基酸序列或接头设置在每个CAR单元之间。如本文所用，高切割效率定义为超过50％、超过70％、超过80％或超过90％的翻译蛋白被切割。切割效率可以通过蛋白质印迹分析来测量。
高效切割位点的非限制性实例包括猪捷申病毒-1 2A(porcine teschovirus-12A，P2A)、FMDV 2A(本文缩写为F2A)；马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)；和明脉扁刺蛾病毒2A(Thoseaasigna virus 2A，T2A)、质型多角体病毒2A(cytoplasmic polyhedrosis virus2A，BmCPV2A)和软化病病毒2A(flacherie Virus 2A，BmIFV2A)，或其组合。在一些方面，高效切割位点是P2A。高效率切割位点在Kim等人(2011)High Cleavage Efficiency of a 2APeptide Derived from Porcine Teschovirus-1in Human Cell Lines,Zebrafish andMice.PLoS ONE 6(4):el8556中有所描述，所述文献的内容以引用方式并入本文。
在一些方面，多个CAR单元在单个开放阅读框(ORF)中表达，表达受强启动子的控制。
在一些方面，本公开的载体还包含辅助基因。在一些方面，辅助基因是非免疫原性选择工具、追踪标志物或自杀基因。在一些方面，辅助基因是截短的EGFR基因(EGFRt)。可以根据本文所述的实施方案使用的截短的EGFR(EGFRt)基因的实例包括SEQ ID NO:4872(包括SEQ ID NO:4865中列出的GMCSF信号肽)或SEQ ID NO:5064(无信号肽)。
多核苷酸修饰
在一些方面，编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸可以包含至少一种化学修饰的核碱基、糖、骨架或其任何组合。因此，编码本公开的CAR的多核苷酸可以包含一个或多个修饰。在一些方面，编码本公开的CAR的多核苷酸包含至少一种核苷酸类似物。在一些方面，通过使用IVT(体外转录)或化学合成引入的至少一种核苷酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE-RNA)单体、2'-氟-DNA单体、2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、锁核酸(LNA)单体、cEt单体、cMOE单体、5'-Me-LNA单体、2'-(3-羟基)丙基-RNA单体、阿拉伯核酸(arabino nucleic acid，ANA)单体、2'-氟-ANA单体、无水己糖醇核酸(anhydrohexitol nucleic acid，HNA)单体、嵌入核酸(intercalating nucleic acid，INA)单体以及所述核苷酸类似物中的两种或更多种的组合。在一些方面，优化的核酸分子包含至少一个骨架修饰，例如，硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，编码本公开的CAR的多核苷酸可以在末端位置处进行化学修饰，例如通过在相对于5'和/或3'末端的位置1、2、3处引入M(2'-O-甲基)、MS(2'-O-甲基3'硫代磷酸酯)或MSP(2'-O-甲基3'硫代PACE、膦酰基乙酸酯)修饰或其组合。
编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的修饰的多核苷酸不需要沿着分子的整个长度被均匀地修饰。不同的核苷酸修饰和/或骨架结构可以存在于核酸的不同位置。本领域的普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他修饰可以位于核酸的任何位置，使得核酸的功能不显著降低。修饰还可以是5'或3'末端修饰。核酸可以含有至少一个修饰的核苷酸和至多100％的修饰的核苷酸，或任何中间百分比，诸如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的修饰的核苷酸。
在一些方面，编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸可以包括修饰以防止被核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用修饰的碱基、稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩增的配偶体库碱基配对的碱基、或缀合碱基替代；(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖的替代；以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代。
可以用于本文所述的方法的、编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的合成、修饰的多核苷酸的具体实例包括但不限于编码本公开的CAR的、含有修饰的或非天然核苷间键的多核苷酸。编码本公开的CAR的、具有修饰的核苷间键的合成、修饰的多核苷酸包括在核苷间键中不具有磷原子的那些。在一些方面，编码本公开的CAR的合成、修饰的多核苷酸在其核苷间键中具有磷原子。
修饰的核苷间键的非限制性实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、膦酸甲基酯和其他膦酸烷基酯(包括膦酸3'亚烷基酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯、具有正常3'-5'键的硼磷酸酯、这些的T-5'连接的类似物、和具有反向极性的那些，其中相邻的核苷单元对以3'-5'连接至5'-3'或以T-5'连接至5'-T。还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。
其中不包括磷原子的修饰的核苷间键具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的核苷间键。这些包括具有以下的那些：吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰氨骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。
在一些方面，编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸可以通过引入一个或多个同义密码子改变来优化密码子。如本文所用，术语“密码子优化”、“密码子优化的”及其语法变体指通过替代同义密码子来修饰核酸的一级序列以便提高其翻译效率。因此，密码子优化包括转换编码本公开的CAR的多核苷酸中使用的密码子而不改变密码子编码的氨基酸序列，这通常显著增加密码子优化的基因编码的蛋白质的丰度，因为它通常去除“稀有”密码子并用丰富的密码子替代它们，或者用具有高tRNA补给速率的密码子去除具有低tRNA补给速率的密码子。这种密码子优化可以例如(i)提高重组蛋白表达中的蛋白产量，或(ii)提高编码本文公开的结合分子的mRNA或DNA的稳定性、半衰期或其他期望性质，其中将此类mRNA或DNA施用于有需要的受试者。
在一些方面，编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸的序列可以使用提交本申请时本领域已知的任何方法来优化密码子。
在一些方面，编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸的序列已经被优化。如本文所用，术语“序列优化的”是指通过以下方式进行的核酸序列的修饰：引入提高核酸序列的翻译效率的特征，去除降低核酸序列的翻译效率的特征，或总体上改善与体内施用后的表达功效相关的性质。此类性质包括但不限于：提高核酸稳定性(例如，mRNA稳定性)、提高靶组织中的翻译效率、减少表达的截短蛋白的数量、改进折叠或防止表达蛋白的错误折叠、降低表达产物的毒性、减少由表达产物引起的细胞死亡，或增加和/或减少蛋白质聚集。
本公开考虑了整个CAR构建体的修饰，例如CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以便生成功能等同的分子。CAR构建体可以修饰为保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。本公开还考虑了CAR的具体区域的修饰，例如CAR构建体的一个或多个CDR的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以便生成功能等同的分子。
细胞
本公开还提供了一种遗传修饰的细胞，其包含编码本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)的多核苷酸。在一些方面，CAR由经遗传修饰以表达CAR的细胞重组表达，其中细胞包含编码本公开的CAR的多核苷酸序列或载体中的一种或多种。
在一些方面，本文公开的遗传修饰的细胞已经用编码本公开的CAR的多核苷酸或载体转染。术语“转染的”(或等效术语“转化的”和“转导的”)是指将外源核酸(例如，编码本公开的CAR的多核苷酸或载体)转移或引入到宿主细胞(例如，T细胞)的基因组中的过程。“转染的”细胞是已经用外源核酸(例如,编码本公开的CAR的多核苷酸或载体)转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
在一些方面，细胞(例如，T细胞)用本公开的载体(例如,AAV载体或慢病毒载体)转染。在一些此类方面，细胞可以稳定地表达本公开的CAR。
在一些方面，细胞(例如，T细胞)用编码本公开的CAR的核酸(例如，mRNA、cDNA、DNA)转染。在一些此类方面，细胞可以瞬时表达本公开的CAR。例如，可以将RNA构建体直接转染到细胞中。用于生成用于转染的mRNA的方法涉及使用专门设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后添加聚A，以产生含有3'和5'非翻译序列(UTR)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和聚A尾的构建体，其长度通常为50-2000个碱基。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一些方面，模板包括本公开的CAR的序列。一方面，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到T细胞中。
在一些方面，宿主细胞是免疫效应子细胞。如本文所用，术语“免疫效应子细胞”是指参与免疫反应(例如，参与促进免疫效应反应)的细胞。“免疫效应子功能”或“免疫效应子反应”是指例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的免疫效应细胞的功能或反应。例如，免疫效应子功能或反应是指促进靶细胞的杀伤或抑制靶细胞的生长或增殖的T细胞或NK细胞的性质。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或反应的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。CAR的细胞内信号传导结构域可以生成促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号。例如，CART细胞中的免疫效应子功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一些方面，细胞内信号结构域是转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的CAR部分。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可以用于替代完整的链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意图包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一些方面，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些结构域。在一些方面，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些结构域。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含信号传导基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于来源于CD3ζ、FcRγ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些。
免疫效应子细胞的实例包括例如T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。先天性淋巴样细胞(ILC)是一组来源于共同淋巴祖细胞(CLP)并且属于淋巴谱系的先天性免疫细胞。由于缺乏重组激活基因(RAG)，这些细胞被定义为不存在抗原特异性B或T细胞受体。ILC不表达骨髓或树突状细胞标志物。ILC具有不同的生理功能；一些功能类似于辅助T细胞，而所述组还包括细胞毒性NK细胞。因此，在一些方面，经遗传修饰以表达本公开的CAR的细胞是例如T细胞、NK细胞、NKT细胞或ILC细胞。
T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
药物组合物
本公开还提供了适合向受试者施用的药物组合物，其包含本文公开的组合物，例如编码本公开的CAR的多核苷酸、包含编码本公开的CAR的多核苷酸的载体、或包含编码本公开的CAR的多核苷酸或载体的遗传修饰的细胞。
药物组合物通常包含编码或包含本公开的CAR的多核苷酸、载体或细胞，以及呈适合向受试者施用的形式的药学上可接受的赋形剂或载体。药学上可接受的赋形剂或载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用所述组合物的特定方法来确定。
存在包含本公开的CAR的药物组合物的多种合适制剂(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18th ed.(1990))。药物组合物通常被配制为无菌的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
在某些方面，将药物组合物与一种或多种额外的治疗剂在药学上可接受的载体中共施用。在一些方面，包含本公开的CAR的药物组合物在施用额外的治疗剂之前施用。在其他方面，包含本公开的CAR的药物组合物在施用额外的治疗剂之后施用。在另外的方面，包含本公开的CAR的药物组合物与额外的治疗剂同时施用。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或化合物与本公开的组合物(例如，多核苷酸、载体或细胞)不相容，否则可考虑将其在组合物中使用。
VI.文库和使用方法
本公开还提供了包含Ig铰链、其片段及其组合(例如，两个或更多个连接的Ig铰链片段)的文库。可以筛选本公开的文库以鉴定待用作CAR间隔物的具有最佳长度和组成的多肽，即，导致CAR相对于包含参考间隔物(例如，包IgG1铰链的间隔物)的对应CAR具有增强的活性的间隔物。
在一些方面，间隔物文库可以通过连接本文公开的免疫球蛋白铰链的片段来生成(参见上文关于模块化间隔物的公开内容)。图8提供了由IgG3模块生成的小型文库的示意图。在一些方面，本公开的间隔物文库包含图9中公开的间隔物1至间隔物31。在一些方面，本公开的间隔物文库包含图9中公开的间隔物1至间隔物31和/或其变体，例如对应于间隔物1至间隔物31的间隔物，其还包含柔性接头，例如SEQ ID NO:4818或5088的柔性接头，所述接头连接至图9中列出的间隔物1至间隔物31的氨基序列的N末端和/或C末端。
本公开还提供了包含例如CAR的变体的CAR文库，其中间隔物被来自本公开的间隔物文库(例如，包括图9中公开的间隔物或其变体的文库)的间隔物替代。还提供了CAR文库，其包含有例如包含本文公开的间隔物(例如，图9中公开的间隔物)的CAR的变体，其中其他CAR组分(例如，信号肽、结合(例如，scFv)、跨膜结构域、共刺激结构域、信号传导结构域或其任何组合)被取代。
VII.适应症
在一些方面，本文公开的组合物(例如，编码本公开的CAR的多核苷酸、包含编码本公开的CAR的多核苷酸的载体、本公开的CAR、或表达本公开的CAR的细胞，例如CART细胞)可以用于治疗疾病或疾患，例如，增殖性疾病，诸如癌症或恶性肿瘤，或癌前疾患，诸如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期。
“癌症”是指广泛的一组各类增殖性疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织，并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。如本文所用，术语“增殖性”病症或疾病是指多细胞生物体中一个或多个细胞亚群的不需要的细胞增殖，其导致对多细胞生物体的伤害(即不适或预期寿命缩短)。例如，如本文所用，增殖性病症或疾病包括赘生性病症和其他增殖性病症。如本文所用，“赘生性”是指导致异常组织生长的任何形式的失调(dysregulated)或不受调控(unregulated)的细胞生长，无论恶性或良性。因此，“赘生性细胞”包括细胞生长失调或不受调控的恶性和良性细胞。在一些方面，癌症是肿瘤。如本文所用，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。
在一些方面，疾病是实体瘤或液体瘤。在一些方面，癌症是胰腺癌。在一些方面，疾病是血液学癌症。在一些方面，血液学癌症是白血病。在一些方面，癌症选自由以下组成的组：一种或多种急性白血病，其包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)(例如，复发性和难治性ALL)；一种或多种慢性白血病，其包括但不限于慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。额外的血液学癌症或疾患包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖性疾患、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)和白血病前期。白血病前期涵盖由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合产生的多种血液学疾患。在一些方面，适应症是是不典型(atypical)和/或非典型癌症、恶性肿瘤、癌前疾患或增殖性疾病；及其任何组合。
在一些方面，疾病是淋巴瘤，例如，MCL或霍奇金淋巴瘤。在一些方面，疾病是白血病，例如，SLL、CLL和/或ALL。在一些方面，与肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)相关的疾病选自增殖性疾病，诸如癌症或恶性肿瘤，或癌前疾患，诸如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或者是与本文所述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在一些方面，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。
在一些方面，癌症选自AML、ALL、B-ALL、T-ALL、B细胞幼淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、CML、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、肥大细胞病症、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤或其组合。
在一些方面，本文公开的组合物(例如，编码本公开的CAR的多核苷酸、包含编码本公开的CAR的多核苷酸的载体、本公开的CAR、或表达本公开的CAR的细胞，例如CART细胞)用于降低或减少有需要的受试者的肿瘤尺寸或抑制有需要的受试者的肿瘤生长。在一些方面，肿瘤是癌(即，上皮来源的癌症)。在一些方面，肿瘤例如选自由以下组成的组：胃癌、胃食管结合部癌(GEJ)、食管癌(esophageal cancer)、结直肠癌、肝癌(肝细胞癌，HCC)、卵巢癌、乳腺癌、NSCLC、膀胱癌癌症、肺癌、胰腺癌、头颈癌、淋巴瘤、子宫癌、肾(renal)癌或肾脏(kidney)癌、胆道癌、前列腺癌、睾丸癌、尿道癌、阴茎癌、胸癌、直肠癌、脑癌(神经胶质瘤和胶质母细胞瘤)、宫颈癌、腮腺癌、喉癌、甲状腺癌、腺癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤和默克尔细胞癌(Merkel Cell carcinoma)。
“癌症”或“癌组织”可以包括各个阶段的肿瘤。在某些方面，癌症或肿瘤处于0期，使得例如癌症或肿瘤发展非常早并且还没有转移。在一些方面，癌症或肿瘤处于I期，使得例如癌症或肿瘤尺寸相对较小，尚未扩散到附近组织中，并且尚未转移。在其他方面，癌症或肿瘤处于II期或III期，使得例如癌症或肿瘤大于0期或I期，并且它已经生长到相邻组织中，但它尚未转移，除非可能转移到淋巴结。在其他方面，癌症或肿瘤处于IV期，使得例如癌症或肿瘤已经转移。IV期也可以称为晚期或转移性癌症。
在一些方面，癌症可以包括但不限于：肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发性不明癌症、卡斯尔曼氏病(Castleman disease)、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌(esophagus cancer)、尤文家族肿瘤(Ewing family of tumor)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌肿瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms tumor)、以及癌症治疗导致的继发性癌症。
在一些方面，实体瘤是实体瘤“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑色素瘤、癌或其他实体瘤癌症。“肉瘤”通常是指由类似于胚胎结缔组织的物质组成并且通常由嵌入纤维状或同形物质中的密集堆积的细胞组成的肿瘤。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝迈斯肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着性出血肉瘤(idiopathic multiplepigmented hemorrhagic sarcoma)、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹森肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cellsarcoma)、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、或毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑色素瘤”是指由皮肤和其他器官的黑色素系统产生的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端-雀斑样痣性黑色素瘤(acra-lentiginous melanoma)、无黑色素性黑色素瘤(amelanotic melanoma)、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑色素瘤、恶性雀斑样痣性黑色素瘤(lentigo maligna melanoma)、恶性黑色素瘤、转移性黑色素瘤、结节状黑色素瘤、指甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌”是指由趋于浸润周围组织并产生转移的上皮细胞组成的恶性的新生长。示例性癌包括例如：腺泡细胞癌、腺泡癌、腺样癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底细胞样癌、鳞状基底细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶质性癌(colloidcarcinoma)、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬癌(carcinomadurum)、胚胎性癌、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniforni carcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、侵蚀性溃疡、库尔契茨基细胞癌、大细胞癌、透镜状癌、豆状癌、脂瘤样癌、淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前期癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施耐德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鳞癌、鳞状细胞癌、串癌(string carcinoma)、毛细管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌或绒毛状癌。
可以用本文公开的组合物(例如，编码本公开的CAR的多核苷酸、包含编码本公开的CAR的多核苷酸的载体、本公开的CAR或表达本公开的CAR的细胞(例如，CART细胞))治疗的额外的癌症包括例如白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、甲状腺乳头状癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、苗勒氏癌(Mülleriancancer)、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。
方法
本公开还提供了用于使用本公开的CAR和CAR表达细胞用于过继疗法的方法。在一些方面，本公开提供了一种刺激受试者的T细胞介导的对靶细胞群或组织的免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的表达本公开的CAR的细胞。还提供了一种在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的表达本公开的CAR的细胞。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的表达本公开的CAR的细胞。本公开还提供了一种制备用于治疗的细胞(例如，CART细胞)群的方法，其包括用本公开的多核苷酸或载体转导从受试者分离的细胞群。在一些方面，转导包括在合适的条件下培养细胞。
本公开还提供了一种在经诊断患有癌症的受试者中生成持续存在的遗传工程细胞群的方法，所述方法包括向受试者施用经遗传工程改造以表达本公开的CAR的细胞。
本公开还提供了一种在经诊断患有癌症的受试者中扩增遗传工程细胞(例如，T细胞)群的方法，所述方法包括向受试者施用经遗传工程改造以表达本公开的CAR的细胞(例如，T细胞)。在一些方面，细胞是T细胞，例如自体T细胞。在其他方面，T细胞是异源T细胞。在本文公开的方法的一些方面，受试者是人受试者。
本公开还提供了一种改进CAR疗法的一种或多种性质的方法，其包括将本公开的CAR间隔物插入到CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，其中间隔物位于配体结合结构域和跨膜结构域之间。
在一些方面，CAR疗法的一种或多种改进性质是一种或多种细胞因子的分泌增加。在一些方面，由本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物的CAR)诱导的细胞因子分泌相对于在施用包含参考间隔物(例如，IgG1铰链间隔物)的对应CAR后观察到的分泌增加。在一些方面，细胞因子是白介素，例如白介素-2。在一些方面，细胞因子是干扰素，例如干扰素-γ。
在一些方面，与施用包含参考间隔物(例如，IgG1铰链CAR间隔物)或“短”参考间隔物(SEQ ID NO:4911)而不是本公开的CAR间隔物的对应CAR之后观察到的白介素分泌相比，施用本公开的CAR导致白介素(例如，白介素-2)分泌增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些方面，与施用包含参考间隔物(例如，IgG1铰链CAR间隔物)或“短”参考间隔物(SEQ ID NO:4911)而不是本公开的CAR间隔物的对应CAR之后观察到的干扰素(例如，干扰素-γ)分泌相比，施用本公开的CAR导致干扰素(例如，干扰素-γ)分泌增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些方面，与施用包含参考间隔物(例如，IgG1铰链CAR间隔物)或“短”参考间隔物(SEQ ID NO:4911)而不是本公开的CAR间隔物的对应CAR之后观察到的TNFα分泌相比，施用本公开的CAR导致TNFα分泌增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些方面，本公开提供了一种选择最佳CAR间隔物的方法，其包括比较杀伤动力学(曲线下面积)与所用间隔物(例如，间隔物是来自图9中提供的文库的间隔物或本文公开的任何间隔物)不同的CAR文库中的细胞因子(例如，IL-2和/或IFNg)和选择具有最低AUC和/或最高细胞因子的CAR。还提供了一种优化或改进CAR的方法，其包括使用本文公开的间隔物(例如，来自图9中提供的文库的间隔物或本文公开的任何间隔物)替代CAR的原始间隔物，比较杀伤动力学(曲线下面积)和细胞因子产生(例如，IL-2和/或IFNg)，以及选择具有最低AUC和/或最高细胞因子产生的CAR。
本公开还提供了一种选择最佳间隔物的方法，其包括生成所用间隔物(例如，间隔物是来自图9中提供的文库的间隔物或本文公开的任何间隔物)不同的CAR的文库并执行顺序杀伤实验，其中CAR T细胞连续传送到新的靶细胞中，直到CAR T细胞停止增殖和杀伤。最好的CAR间隔物将是存在于将具有更长时间的增殖和杀伤活性的CAR T细胞中的那些间隔物。
在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、药盒、细胞或药物组合物，其用作药物。在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、药盒、细胞或药物组合物，其用作用于治疗有需要的受试者的癌症的药物。在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、药盒、细胞或药物组合物，其用于治疗有需要的受试者的癌症。在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、药盒、细胞或药物组合物用于制造药物的用途。在一些方面，本公开提供了本公开的多核苷酸、载体、CAR、组合物、药盒、细胞或药物组合物用于制造用于治疗有需要的受试者的癌症的药物的用途。
本公开还提供了一种组合物，其包含：编码CAR的多核苷酸、包含编码CAR的多核苷酸的载体、或包含编码CAR的多核苷酸或载体的遗传修饰细胞，所述组合物用于治疗需要CAR疗法的患者。本公开还提供了一种组合物，其包含：编码CAR的多核苷酸、包含编码CAR的多核苷酸的载体、或包含编码CAR的多核苷酸或载体的遗传修饰细胞，所述组合物用作药物。还提供了一种组合物，其包含：编码CAR的多核苷酸、包含编码CAR的多核苷酸的载体、或包含编码CAR的多核苷酸或载体的遗传修饰细胞，所述组合物用作用于需要CAR疗法的受试者的癌症的治疗。还提供了一种组合物，其包含：编码CAR的多核苷酸、包含编码CAR的多核苷酸的载体、或包含编码CAR的多核苷酸或载体的遗传修饰细胞，所述组合物用于制造用于治疗需要CAR疗法的受试者的癌症的药物。
药盒
本公开还提供了药盒或制造产品，其包含(i)本公开的CAR(即，包含本公开的CAR间隔物(即，铰链衍生的CAR间隔物、环衍生的CAR间隔物或其组合)的CAR)、编码本公开的CAR的一种或多种多核苷酸、编码本公开的CAR的一种或多种载体、或包含多核苷酸或载体的组合物，以及任选的(ii)使用说明书，例如根据本文公开的方法的使用说明书。
本公开还提供了一种药盒，其包含(i)经遗传修饰以表达本公开的CAR的细胞，即，包含编码本公开的CAR的一种或多种多核苷酸或编码本公开的CAR的一种或多种载体的细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或ILC细胞)或包含所述细胞的药物组合物，以及任选的(ii)使用说明书。
在一些方面，药盒或制造产品在一个或多个容器中至少包含编码本公开的CAR的多核苷酸或载体、经遗传修饰以表达本公开的CAR的细胞、或包含本文公开的多核苷酸、载体、或细胞的组合物(例如，药物组合物)。
在一些方面，药盒或制造产品至少包含编码本公开的CAR的多核苷酸或载体、经遗传修饰以表达本公开的CAR的细胞、或包含本文公开的多核苷酸、载体、或细胞的组合物(例如，药物组合物)以及任选的小册子。
本领域技术人员将容易地认识到，本公开的多核苷酸、载体、细胞和组合物、包含本公开的多核苷酸、载体、或细胞的药物组合物、或其组合可以容易地掺入本领域众所周知的已确定的药盒形式之一中。
在一些方面，药盒或制造产品包含例如在容器(例如，玻璃小瓶)中呈干燥形式的编码本公开的CAR的多核苷酸或载体、或包含多核苷酸、载体的组合物(例如，药物组合物)，以及任选的具有溶剂的小瓶。
在一些方面，药盒或制造产品包含例如至少一个容器中的编码本公开的CAR的多核苷酸或载体或、包含多核苷酸、载体的组合物(例如，药物组合物)，以及另一个或更多个具有转染试剂的容器。
***
除非另外指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术人员的技术之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。文献中详尽地说明了此类技术。参见，例如，Sambrook等人，编辑(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人，编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs HarborLaboratory,NY)；D.N.Glover编辑，(1985)DNA Cloning，第I卷和第II卷；Gait，编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美国专利号4,683,195；Hames和Higgins，编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins，编辑(1984)Transcription AndTranslation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical GuideTo Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(ColdSpring Harbor Laboratory)；Wu等人，编辑，Methods In Enzymology，第154卷和第155卷；Mayer和Walker，编辑(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell，编辑，(1986)Handbook Of ExperimentalImmunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；)；Crooke,Antisense drugTechnology:Principles,Strategies and Applications，第2版CRC Press(2007)以及在Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,Baltimore,Md.)中。
通过说明而不是通过限制的方式提供以下实例。
实施例
材料和方法
为了测量CAR表达和转导效率，在转导后培养6天后沉淀将大约0.5x106个细胞沉淀以用于流式细胞术分析。将细胞重悬于PBS中的Fixable Viability Dye eFluor 780(Invitrogen，目录号65-0865-14)中，持续10分钟，然后用细胞染色缓冲液(BioLegend，目录号420201)洗涤。
使用在细胞染色缓冲液中以1:2000稀释的抗ID-AF647(Lyell)检测FMC63 CARscFv表面表达。通过使用在细胞染色缓冲液中以1:40稀释的抗hEGFR-BV421(BioLegend，目录号352911)对转导标志物EGFRt进行表面染色来确定转导效率。在黑暗中孵育20分钟后沉淀细胞，然后用细胞染色缓冲液洗涤2次。所有流式细胞术分析都在ZE5细胞分析仪(Biorad)上进行，并使用FlowJo(Tree Star)进行分析。
使用在细胞染色缓冲液中以1:6000稀释的蛋白质L-生物素(Thermo Scientific，目录号29997)，然后使用在细胞染色缓冲液中以1:400稀释的链霉亲和素-BV421(BioLegend，目录号405226)，来检测Her CAR scFv表面表达。通过在细胞染色缓冲液中使用以1:40稀释的抗hEGFR-PE(BioLegend，目录号252903)对转导标志物EGFRt进行表面染色来确定转导效率。
使用在细胞染色缓冲液中以1:50稀释的hROR1-Fc-AF647(Lyell)来检测R11、R12和2A2 CAR scFv表面表达。通过在细胞染色缓冲液中使用以1:40稀释的抗hEGFR-PE(BioLegend，目录号252903)对转导标志物EGFRt进行表面染色来确定转导效率。
实施例1
ROR1 CAR-T细胞的间隔物依赖性活性
本研究描述了各种间隔物对诱导自身激活以及ROR1指导的细胞因子释放和表达R12 CAR的T细胞的效力的影响。用于测试不同间隔物长度的参考CAR序列及其组成元素在下表20中示出。
在本文公开的实验中使用了短、中和长参考间隔物。“短”参考间隔物是SEQ IDNO:4911的IgG4铰链衍生的间隔物。“中”参考间隔物是SEQ ID NO:4912的IgG4铰链衍生的间隔物。“长”参考间隔物是SEQ ID NO:4913的IgG4铰链衍生的间隔物。
表20：R12参考CAR序列
Figure BDA0004043865630001891
Figure BDA0004043865630001901
Figure BDA0004043865630001902
方法：所有测定均在补充有10％ FBS的无细胞因子RPMI1640培养基(细胞测定培养基)中进行。H1975、Jeko1、Nalm6、Raji、A549和T47D细胞系购自ATCC。为了经由IncuCyte活细胞分析成像系统促进靶细胞成像，这些细胞系通过使用IncuCyte NucLight Red慢病毒试剂(Sartorius)进行慢病毒转导，用核mKate2稳定地标记。曲线下面积(AUC)值通过对归一化靶细胞杀伤曲线下的面积进行积分来计算。
表达构建体：慢病毒构建体用双顺反子表达盒生成。(i)ROR1特异性R12 CAR、(ii)P2A自切割肽、和(iii)EGFRt(仅具有结构域III和IV以及跨膜结构域的截短EGFR；SEQ IDNO:4868)的编码序列在框内连接并且置于MND启动子的控制下。R12 CAR来源于R12抗ROR1抗体(Yang等人，PLoS One.(2011)6:e21018)并且含有指定间隔物之一、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
间隔物长度的估计：在可能的情况下，间隔物的长度使用分子可视化软件(例如，PyMOL)中的测量工具从RCSB PDB(蛋白质数据库；http://www.rcsb.org)上可用的晶体结构测量。具有未解析晶体坐标的残基、缺失密度的连续片段或没有公开可用的晶体结构的间隔物各自被建模为延伸结构，每个残基跨越
Figure BDA0004043865630001911
即β构象中的Ni–Ni+1距离。
细胞培养和慢病毒转导：来自正常供体的预选、冷冻保存的原代人CD4+和CD8+ T细胞从Bloodworks(Seattle WA)获得。人T细胞在补充有以下的OpTmizer培养基(ThermoFisher)中培养：免疫细胞血清替代物(Thermo Fisher)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、2mMGlutamax(Gibco)、200IU/ml IL-2(R&D系统)、120IU/ml IL-7(R&D systems)和20IU/mlIL-15(R&D系统)。对于慢病毒转导，T细胞用T细胞TransAct(Miltenyi)的1:100稀释刺激30小时。然后将病毒添加到T细胞中，持续24小时。然后通过添加7体积的不含TransAct的新鲜培养基来终止刺激和病毒感染，并且将细胞在Grex-24板(Wilson Wolf)中额外培养7天，然后在CryoStor CS10(STEMCELL Technologies)中以3x107细胞/ml冷冻保存。通过在测定设置之前将模拟(未转导)T细胞添加到适当的样品中，将所有新鲜解冻的T细胞都归一化为CAR+和总T细胞的百分比。
经由流式细胞术测量CAR表达：为了测量CAR表达水平和转导效率，在慢病毒转导后6天的生产期后沉淀大约0.5x106个细胞以用于流式细胞术分析。将细胞重悬于PBS中的Fixable Viability Dye eFluor 780(Invitrogen，目录号65-0865-14)中，持续10分钟，然后用细胞染色缓冲液(BioLegend，目录号420201)洗涤。
使用在细胞染色缓冲液中以1:500稀释的用DyLightTM 650微尺度抗体标记试剂盒(ThermoFisher，目录号84536)预标记的重组人ROR1-Fc嵌合蛋白(R&D，目录号9490-RO-050)来检测R12 CAR scFv表面表达。通过使用在细胞染色缓冲液中以1:40稀释的抗hEGFR-BV421(BioLegend，目录号352911)对转导标志物EGFRt进行表面染色来确定转导效率。在黑暗中孵育20分钟后沉淀细胞，然后用细胞染色缓冲液洗涤2次。所有流式细胞术分析都在ZE5细胞分析仪(Biorad)上进行，并使用FlowJo(Tree Star)进行分析。
测定设置-靶标非依赖性细胞因子分泌：将表达R12 CAR的、具有指定间隔物的冷冻保存、转导的原代T细胞各自解冻、计数并且在细胞测定培养基中重悬至细胞密度等于0.5x106个CAR+细胞/ml。将100μl体积或50,000个CAR+细胞添加到平底96孔板中，并在37℃孵育箱中孵育。24小时后，收集每个孔的上清液样品以根据制造商的方案(Meso ScaleDiscovery)进行IFNγ测量。
测定设置-靶标依赖性细胞因子分泌：将表达R12 CAR的、具有指定间隔物的冷冻保存、转导的原代T细胞各自解冻、计数并且在细胞测定培养基中重悬至细胞密度等于0.5x106个CAR+细胞/ml，并且将100μl体积或50,000个CAR+细胞添加到含有50,000个H1975细胞的平底96孔板中，并且在IncuCyte活细胞分析系统(Sartorius)中在37℃下孵育。每4小时对每个孔成像一次，以量化H1975细胞的数量，从而评估T细胞细胞毒性的动力学。24小时后，收集每个孔的上清液以根据制造商的方案(Meso Scale Discovery)进行IL-2和IFNγ测量。在4天内跟踪靶细胞裂解。
测定设置-系列杀伤：将表达R12 CAR的、具有指定间隔物的冷冻保存、转导的原代T细胞各自解冻、计数并且在细胞测定培养基中重悬至细胞密度等于2x106个CAR+细胞/ml，并且将1毫升体积或0.2x106个CAR+细胞添加到1ml细胞测定培养基中的含有0.2x106个Jeko1细胞的24孔板中，并且在IncuCyte活细胞分析系统(Sartorius)中在37C下孵育。每4小时对每个孔成像一次，以量化Jeko1细胞的数量，从而评估T细胞细胞毒性的动力学。在68小时和148小时的时间点，将0.5ml从先前的共培养板转移到1.5ml细胞测定培养基中的含有0.2x106个新鲜Jeko1细胞的新24孔板中。跟踪与R12 CART细胞共培养3轮中剩余的Jeko1细胞的数量，并将其归一化为每轮的第一个时间点(即，0小时、68小时和148小时)。
结果：结果显示了表达不同间隔物作为CAR设计的组分的T细胞的靶标非依赖性IFN-γ分泌的不同水平(图10)。间隔物20和23特别诱导R12 CART细胞以明显的自身激活方式表现，导致IFN-γ检测水平增加。在没有靶抗原人ROR1的情况下，基准间隔物“短”也分泌了升高水平的IFN-γ。剩余的指定间隔物在R12 CART细胞中表现出低水平的靶标非依赖性激活。
结果还表明
表达不同间隔物作为CAR设计的组分的T细胞的靶标依赖性IFN-γ和IL-2分泌的不同水平(图11A)。间隔物1特别引起R12 CART细胞分泌最高水平的IL-2，而间隔物14特别导致它们分泌最高水平的IFN-γ。在间隔物长度的上下文中，当CAR间隔物的长度为
Figure BDA0004043865630001931
至
Figure BDA0004043865630001932
时，T细胞输出的IFN-γ和IL-2最高(图11B)。使用R12 CAR测试的间隔物长度的完整范围为
Figure BDA0004043865630001933
至
Figure BDA0004043865630001934
在暴露于H1975细胞后也分泌高水平的IFN-γ和IL-2的具有基准间隔物“短”的R12 CART含有
Figure BDA0004043865630001935
长的间隔物。R12 CART细胞的细胞因子输出与它们的靶标裂解能力相关，如通过它们相关的AUC值测量的(图11C)。
细胞因子分泌曲线与R12 CART细胞的延长的细胞毒性能力相关，因为长度为
Figure BDA0004043865630001936
至
Figure BDA0004043865630001937
的间隔物中的五种(间隔物1、11、13、14和短)能在3轮靶标暴露中维持有效的靶标裂解活性(图12A、12B、12C、12D和12E)。使用R12 CAR测试的间隔物长度的完整范围为
Figure BDA0004043865630001938
至
Figure BDA0004043865630001939
具有基准间隔物“短”的、也表现出针对Jeko1细胞的持续细胞毒性活性的R12 CART含有
Figure BDA00040438656300019310
长的间隔物。
表21：完整的ROR1 CAR序列。每个ROR1 CAR中使用的间隔物在第一列中指示。间隔物编号遵循图9编号。
Figure BDA0004043865630001941
表21A：具有间隔物1的R12 CAR序列的组分
Figure BDA0004043865630001942
Figure BDA0004043865630001943
表21B：具有间隔物2的R12 CAR序列的组分
Figure BDA0004043865630001951
Figure BDA0004043865630001952
表21C：具有间隔物3的R12 CAR序列的组分
Figure BDA0004043865630001953
Figure BDA0004043865630001961
Figure BDA0004043865630001962
实施例2
CD19 CAR-T细胞的间隔物依赖性活性
本研究描述了各种Ig衍生的间隔物对诱导CAR-T自身激活以及人CD19指导的细胞因子释放和效力的影响。用于测试不同间隔物长度的参考CAR序列及其组成元素在下表22中示出。本实施例使用与实施例1相同的实验方法。
表22：FMC63参考CAR序列
Figure BDA0004043865630001963
Figure BDA0004043865630001971
Figure BDA0004043865630001972
使用编码双顺反子表达盒的慢病毒构建体递送CD19特异性FMC63 CAR。(i)CD19特异性FMC63 CAR、(ii)P2A自切割肽、和(iii)EGFRt(仅具有结构域III和IV以及跨膜结构域的截短EGFR；SEQ ID NO:4877)的编码序列在框内连接并且置于MND启动子的控制下。FMC63CAR来源于FMC63抗CD19抗体，并且含有指定间隔物之一、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。示例性CAR构建体，例如具有间隔物1、间隔物2和间隔物3的构建体，在下文示出。
表23：完整的CD19 CAR序列。每个CD19 CAR中使用的间隔物在第一列中指示。间隔物编号遵循图9编号。
Figure BDA0004043865630001973
Figure BDA0004043865630001981
表23A：具有间隔物1的FMC63 CAR序列的组分
Figure BDA0004043865630001982
Figure BDA0004043865630001991
表23B：具有间隔物2的FMC63 CAR序列的组分
Figure BDA0004043865630001992
Figure BDA0004043865630001993
Figure BDA0004043865630002001
表23C：具有间隔物3的FMC63 CAR序列的组分
Figure BDA0004043865630002002
Figure BDA0004043865630002003
使用在细胞染色缓冲液中以1:2000稀释的抗ID-AF647(Lyell)检测FMC63 CARscFv表面表达。通过使用在细胞染色缓冲液中以1:40稀释的抗hEGFR-BV421(BioLegend，目录号352911)对转导标志物EGFRt进行表面染色来确定转导效率。在黑暗中孵育20分钟后沉淀细胞，然后用细胞染色缓冲液洗涤2次。所有流式细胞术分析都在ZE5细胞分析仪(Biorad)上进行，并使用FlowJo(Tree Star)进行分析。
基于EGFRt染色，用编码包含Ig衍生的间隔物的FMC63 CAR的慢病毒将健康供体T细胞转导至40％和80％之间的转导水平(图13A、图13C)，并且它们的CAR表达水平通过用缀合至AlexaFluor647的抗FMC63抗体染色来评估(图13B、图13D)。CART细胞用Raji-NLR(图13A-D、14A-E)、Nalm6-NLR(图15A-E、16A-E)和Raji_CD19_KO-NLR(图18A-E、19A-E)攻击以确定杀伤动力学和靶标依赖性细胞因子产生。CART细胞也在不存在靶细胞的情况下培养，以评估靶标非依赖性细胞因子产生，这是自身激活的指示。靶标非依赖性细胞因子分泌通常较低(图20A-C、21A-C)。共培养后24小时后细胞因子产生的量与更快的杀伤动力学相关，间隔物7、8、9、10、11、14、16和28表现得特别好(图22A-B)。当CAR间隔物的长度为
Figure BDA0004043865630002011
至
Figure BDA0004043865630002012
时，IFN-γ和IL-2的产生最高(图23A-D)。类似地，当间隔物的长度为
Figure BDA0004043865630002013
至
Figure BDA0004043865630002014
时，短期细胞毒性是有效的(图24A-B)。观察到包含间隔物7、8、9、10、14、16和28的FMC63 CART细胞能够在若干轮靶标暴露中维持有效的靶标裂解活性(图25A-D、26A-D)。
实施例3
Her2 CAR-T细胞的间隔物依赖性活性
本研究描述了各种Ig衍生的间隔物对诱导CAR-T自身激活以及Her2指导的细胞因子释放和效力的影响。本实施例使用与实施例1相同的实验方法。
使用编码双顺反子表达盒的慢病毒构建体递送抗Her2衍生的CAR。(i)抗Her2衍生的CAR、(ii)P2A自切割肽、和(iii)EGFRt(仅具有结构域III和IV以及跨膜结构域的截短EGFR)的编码序列在框内连接并且置于MND启动子的控制下。抗Her2 CAR包含来源于曲妥珠单抗(trastuzumab)抗Her2的scFv，并且含有指定间隔物之一、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
使用在细胞染色缓冲液中以1:6000稀释的蛋白质L-生物素(Thermo Scientific，目录号29997)，然后使用在细胞染色缓冲液中以1:400稀释的链霉亲和素-BV421(BioLegend，目录号405226)，来检测抗Her2 CAR scFv表面表达。通过在细胞染色缓冲液中使用以1:40稀释的抗hEGFR-PE(BioLegend，目录号252903)对转导标志物EGFRt进行表面染色来确定转导效率。
基于EGFRt染色，用编码包含Ig衍生的间隔物的抗Her2 CAR的慢病毒将健康供体T细胞转导至20％和70％之间的转导水平(图27A、图27C)，并且它们的CAR表达水平通过用蛋白质L-生物素，然后用链霉亲和素-BV421染色来评估(图27B、图27D)。CART细胞用A549-NLR(图28A-E、29A-E)、T47D-NLR(图30A-E、31A-E)和T47D-Her2KO-NLR(图32A-E、33A-E)攻击以确定杀伤动力学和靶标依赖性细胞因子产生。CAR-T细胞也在不存在靶细胞的情况下培养，以评估靶标非依赖性细胞因子产生，这是自身激活的指示。靶标非依赖性细胞因子分泌通常较低(图34A-C、35A-C)。共培养后24小时后细胞因子产生的量与更快的杀伤动力学相关，间隔物6、7、8、11、16和中表现得特别好(图36A-D)。当CAR间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630002021
至约
Figure BDA0004043865630002022
时，IFN-γ和IL-2的产生最高(图37A-D)。类似地，当间隔物的长度为约
Figure BDA0004043865630002023
至约
Figure BDA0004043865630002024
时，短期细胞毒性是有效的(图38A-D)。观察到包含间隔物6、7、8、16和中的抗Her2衍生的CART细胞最能够在重复轮次的靶标暴露中维持靶标裂解活性(图39A-D、图40A-D)。
表24：完整抗Her2 CAR序列。每个Her2 CAR中使用的间隔物在第一列中指示。间隔物编号遵循图9编号。SEQ ID NO:5003的scFv接头可以任选地用SEQ ID NO:5004替代。
Figure BDA0004043865630002031
表25：实施例4中使用的对应于图44A-77E的间隔物。
Figure BDA0004043865630002032
*在一些方面，任选的SEQ ID NO:4818的接头可以用SEQ ID NO:5088的接头替代
实施例4
ROR1 CAR-T细胞的间隔物依赖性活性
R11 CAR：本研究描述了各种Ig衍生的或细胞外结构域衍生的间隔物对诱导CAR-T自身激活以及人ROR1指导的细胞因子释放和效力的影响。使用编码双顺反子表达盒的慢病毒构建体递送ROR1特异性R11 CAR。(i)ROR1特异性R11 CAR、(ii)P2A自切割肽、和(iii)EGFRt(仅具有结构域III和IV以及跨膜结构域的截短EGFR；SEQ ID NO:26)的编码序列在框内连接并且置于MND启动子的控制下。R11CAR来源于R11抗ROR1抗体，并且每个包含指定间隔物之一、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
结果表明了表达R11 CAR(具有不同的间隔物作为CAR设计的组分)的CAR-T细胞的靶标依赖性IFN-γ和IL-2分泌的不同水平。间隔物4(ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPP CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAP；SEQ ID NO:4833，或当包括SEQ ID NO:5088的接头时，GGGGSGELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDT PPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAP；SEQ IDNO:5039)、5(CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEP KSCDTPPPCPRCPAP；SEQ IDNO:4834；或当包括SEQ ID NO:5088的接头时，GGGGSGCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAP；SEQ ID NO:5040)和6(EPKSCD TPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAP；SEQ IDNO:4835；或当包括SEQ ID NO:5088的接头时，GGGGSGEPKSC DTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAP；SEQ ID NO:5041)在两个供体中特别引起R11CAR-T细胞分泌最高水平的细胞因子和最高的杀伤(IncuCyte动力学杀伤曲线中最低的AUC)。在任何CAR-T细胞中都未观察到强直信号传导。在间隔物长度的上下文中，当CAR间隔物长度范围为
Figure BDA0004043865630002041
时，T细胞的IFN-γ和IL-2输出均最高。参见图44A-44D、45A-45C、46A-46C、47A-47C、48A-48B、49A-49B、50A-50B、51、52、53A-53B和54A-54B。
R12 CAR：本研究描述了各种Ig衍生的或细胞外结构域衍生的间隔物对诱导CAR-T自身激活以及人ROR1指导的细胞因子释放和效力的影响。使用编码双顺反子表达盒的慢病毒构建体递送ROR1特异性R12 CAR。(i)ROR1特异性R12 CAR、(ii)P2A自切割肽、和(iii)EGFRt(仅具有结构域III和IV以及跨膜结构域的截短EGFR；SEQ ID NO:26)的编码序列在框内连接并且置于MND启动子的控制下。R12CAR来源于R12抗ROR1抗体，并且每个包含指定间隔物之一、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
结果表明了表达R12 CAR(具有不同的间隔物作为CAR设计的组分)的CAR-T细胞的靶标依赖性IFN-γ和IL-2分泌的不同水平。间隔物1(KPCPPCKCP；SEQ ID NO:4830；或当包括SEQ ID NO:4818的接头时，GGGSGKPCPPCKCP；SEQ ID NO:5042)、15(PPKPKDT；SEQ ID NO:4843；或当包括SEQ ID NO:4818的接头时，GGGSGPPKPKDT；SEQ ID NO:5043)和21(VPCPVPP；SEQ ID NO:4849；或当包括SEQ ID NO:4818的接头时，GGGSGVPCPVPP；SEQ ID NO:5044)在两个供体中特别引起R12 CAR-T细胞分泌最高水平的细胞因子和最高的杀伤(IncuCyte动力学杀伤曲线中最低的AUC)。在任何CAR-T细胞中都未观察到强直信号传导。在间隔物长度的上下文中，当CAR间隔物长度大约为
Figure BDA0004043865630002051
时，T细胞的IFN-γ和IL-2输出均最高。参见图55A-55D、56A-56C、57A-57C、58A-58C、59A-59B、60A-60B、61A-61B、62、63、64A-64B和65A-65B。
2A2 CAR：本研究描述了各种Ig衍生的或细胞外结构域衍生的间隔物对诱导CAR-T自身激活以及人ROR1指导的细胞因子释放和效力的影响。使用编码双顺反子表达盒的慢病毒构建体递送ROR1特异性2A2 CAR。(i)ROR1特异性2A2 CAR、(ii)P2A自切割肽、和(iii)EGFRt(仅具有结构域III和IV以及跨膜结构域的截短EGFR；SEQ ID NO:26)的编码序列在框内连接并且置于MND启动子的控制下。2A2CAR来源于2A2抗ROR1抗体，并且每个包含指定间隔物之一、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
结果表明了表达不同间隔物作为CAR设计的组分的CAR-T细胞的靶标依赖性IFN-γ和IL-2分泌的不同水平。间隔物13(PCPRCPAP；SEQ ID NO:4841；或当包括SEQ ID NO:5088的接头时，GGGGSGPCPRCPAP；SEQ ID NO:5045)、21(VPCPVPP；SEQ ID NO:4849；或当包括SEQ ID NO:5088的接头时，GGGGSGVPCPVPP；SEQ ID NO:5044)和28(SVCSRDFTPP；SEQ IDNO:4856；或当包括SEQ ID NO:5088的接头时，GGGGSGSVCSRDFTPP；SEQ ID NO:5046)在两个供体中特别引起2A2 CAR-T细胞分泌最高水平的细胞因子和最高的杀伤(IncuCyte动力学杀伤曲线中最低的AUC)。如图30和31所示，在任何CAR-T细胞中都未观察到强直信号传导。在间隔物长度的上下文中，当CAR间隔物长度为大约
Figure BDA0004043865630002062
时，T细胞的IFN-γ和IL-2输出均最高。参见图66A-66D、67A-67C、68A-68C、69A-69C、70A-70B、71A-71B、72A-72B、73、74、75A-75B和76A-76B。
表26：鉴定的最活跃CAR的序列
Figure BDA0004043865630002061
实施例1-4的总结
结果表明，最佳间隔物因粘合剂而异。一般来讲，靶向针对近膜表位的CAR优选长间隔物，而靶向针对远膜表位的CAR优选短间隔物。图77A-77E分别示出了R12、2A2、FMC63、Her和R11 CAR的最佳间隔物长度。具有根据本文公开的方法鉴定的最佳CAR间隔物的CAR的完整序列在下文的表27中提供。结果表明，所公开的间隔物集合具有产生高活性CAR的适当生物物理性质(例如，形状、柔性/刚性)，并且整个集合可用于根据经验确定给定CAR/靶抗原对的最佳间隔区，或者通过使用所公开的间隔物作为筛选文库，或者可用于基于间隔子的尺寸、结合基团和抗原相对于信号突触的位置进行合理设计(参见图77A-77E)。
表27：靶向ROR1(包含R11、R12和2A2粘合剂的CAR)、CD19(包含FMC63粘合剂的CAR)和Her2(包含4D5粘合剂的CAR)的CAR的完整CAR序列。
Figure BDA0004043865630002071
Figure BDA0004043865630002081
Figure BDA0004043865630002091
Figure BDA0004043865630002101
Figure BDA0004043865630002111
Figure BDA0004043865630002121
Figure BDA0004043865630002131
Figure BDA0004043865630002141
Figure BDA0004043865630002151
Figure BDA0004043865630002161
Figure BDA0004043865630002171
Figure BDA0004043865630002181
Figure BDA0004043865630002191
Figure BDA0004043865630002201
Figure BDA0004043865630002211
Figure BDA0004043865630002221
表28：所选CAR的性质总结
Figure BDA0004043865630002222
Figure BDA0004043865630002231
Figure BDA0004043865630002241
*Her2间隔物的长度计算不包括SEQ ID NO:4818的GGGSG接头
Figure BDA0004043865630002242
Figure BDA0004043865630002251
Figure BDA0004043865630002261
*Her2间隔物的长度计算不包括SEQ ID NO:4818的GGGSG接头
实施例5
R12 CAR的体内抗肿瘤活性
方法：将NCI-H1975肿瘤细胞植入小鼠体内，取率为100％。肿瘤植入后11天，根据肿瘤体积将动物随机分成5只动物的治疗组，平均肿瘤尺寸为101.91mm3+/-1.24mm3。所有组都在第12天接受适当的静脉内T细胞治疗。每周2次通过卡尺收集肿瘤测量值并通过数字秤收集体重。T细胞给药后24小时经由颏下区域收集血液用于PK分析，此后每周一次，持续5周。当肿瘤体积达到2000mm3、体重损失超过20％或濒临死亡时处死动物。
结果：研究成功进行并证明R12-1(包含间隔物1；SEQ ID NO:5049的CAR)在所有测试的产品中具有最高的抗肿瘤活性，这表现为在两个剂量水平下，第14天时肿瘤体积最小、存活延长、以及外周CAR+ T细胞计数(对于CD4+和CD8+T细胞)显著增加(参见图82A至85L；PK图示出了采样时所有存活动物的平均值的平均值+/-标准误差)。R12-IgG4(具有SEQ IDNO:4911的“短”参考间隔物的CAR)是第二强的CAR T细胞产品，它也延长了存活，但不在血液中扩增T细胞。R12-CD8a(具有CD8a间隔物的CAR)组中的一只动物有延迟但强烈的抗肿瘤反应，这与第28天CAR T细胞在血液中的强烈扩增相吻合。该组中没有其他动物具有抗肿瘤反应，因此R12-CD8a组被认为无效。R12-5(包含间隔物5的CAR)和R12-16(包含间隔物16的CAR)产品在任何测试剂量水平下都未显示显著的抗肿瘤活性。参见图78A至图85L。
***
应当理解，具体实施方式部分，而不是发明内容和摘要部分，旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述本发明人所设想的本公开的一个或多个但不是所有的示例性实施方案，因此，并不旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。
上文已经借助于说明指定功能的实施及其关系的功能构建块描述了本公开。为了方便描述，本文已对这些功能构建块的边界进行任意界定。也可限定替代边界，只要指定功能及其相互关系被适当地执行。
具体实施方案的前述描述将充分地揭示本公开的一般特性，以使得其他人通过应用本领域中的知识，在无过度实验且不背离本公开的一般概念的情况下，可容易地针对各种应用对此类具体实施方案进行修改和/或改变。因此，基于本文所呈现的教导内容以及指导内容，此类改编以及修改意图在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语目的在于说明而非限制，因此技术人员将会根据教导内容以及指导内容来对本说明书的术语或措词进行解释。
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。
可在整篇本申请中引用的所有引用参考文献(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容特此出于任何目的以引用方式明确整体并入本文，所述参考文献中引用的参考文献也是如此。

Claims (154)

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述CAR包括
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中
(a)所述间隔物的长度为约150个氨基酸至约125个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA0004043865620000011
(b)所述间隔物的长度为约125个氨基酸至约100个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA0004043865620000012
(c)所述间隔物的长度为约100个氨基酸至约75个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA0004043865620000013
(d)所述间隔物的长度为约75个氨基酸至约36个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA0004043865620000014
(e)所述间隔物的长度为约35个氨基酸至约21个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000015
至约
Figure FDA0004043865620000016
(f)所述间隔物的长度为约20个氨基酸至约16个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000021
至约
Figure FDA0004043865620000022
(g)所述间隔物的长度为约15个氨基酸至约11个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000023
至约
Figure FDA0004043865620000024
或
(h)所述间隔物的长度为约10个氨基酸至约5个氨基酸；并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离大于约
Figure FDA0004043865620000025
2.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中
(a)所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000026
至约
Figure FDA0004043865620000027
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA0004043865620000028
(b)所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000029
至约
Figure FDA00040438656200000210
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000211
(c)所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000212
至约
Figure FDA00040438656200000213
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000214
(d)所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000215
至约
Figure FDA00040438656200000216
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000217
(e)所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000031
至约
Figure FDA0004043865620000032
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000033
至约
Figure FDA0004043865620000034
(f)所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000035
至约
Figure FDA0004043865620000036
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000037
至约
Figure FDA0004043865620000038
(g)所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000039
至约
Figure FDA00040438656200000310
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA00040438656200000311
至约
Figure FDA00040438656200000312
或
(h)所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000313
至约
Figure FDA00040438656200000314
并且所述表位与所述靶细胞膜的表面之间的距离大于约
Figure FDA00040438656200000315
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中
(a)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000319
并且所述间隔物的长度为125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个氨基酸；
(b)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000316
并且所述间隔物的长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸；
(c)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000317
并且所述间隔物的长度为75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸；
(d)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000318
并且所述间隔物的长度为36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸；
(e)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000041
至约
Figure FDA0004043865620000042
并且所述间隔物的长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸；
(f)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000043
至约
Figure FDA0004043865620000044
并且所述间隔物的长度为16、17、18、19或20个氨基酸；
(g)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000045
至约
Figure FDA0004043865620000046
并且所述间隔物的长度为11、12、13、14或15个氨基酸；或
(h)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离大于约
Figure FDA0004043865620000047
并且所述间隔物的长度为5、6、7、8、9或10个氨基酸。
4.如权利要求2所述的多核苷酸，其中
(a)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA0004043865620000048
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000049
约
Figure FDA00040438656200000410
约
Figure FDA00040438656200000411
约
Figure FDA00040438656200000412
约
Figure FDA00040438656200000413
约
Figure FDA00040438656200000414
约
Figure FDA00040438656200000415
约
Figure FDA00040438656200000416
或约
Figure FDA00040438656200000417
(b)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000418
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000419
约
Figure FDA00040438656200000420
约
Figure FDA00040438656200000421
约
Figure FDA00040438656200000422
约
Figure FDA00040438656200000423
约
Figure FDA00040438656200000424
约
Figure FDA00040438656200000425
约
Figure FDA00040438656200000426
或约
Figure FDA00040438656200000427
(c)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000428
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000429
约
Figure FDA00040438656200000430
约
Figure FDA00040438656200000431
约
Figure FDA00040438656200000432
约
Figure FDA00040438656200000433
约
Figure FDA00040438656200000434
约
Figure FDA00040438656200000435
约
Figure FDA00040438656200000436
或约
Figure FDA00040438656200000437
(d)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离小于约
Figure FDA00040438656200000438
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000439
约
Figure FDA00040438656200000440
约
Figure FDA00040438656200000441
约
Figure FDA00040438656200000442
约
Figure FDA00040438656200000443
约
Figure FDA00040438656200000444
约
Figure FDA00040438656200000445
约
Figure FDA00040438656200000446
约
Figure FDA00040438656200000447
约
Figure FDA00040438656200000448
约
Figure FDA00040438656200000449
Figure FDA00040438656200000450
约
Figure FDA00040438656200000451
约
Figure FDA00040438656200000452
或约
Figure FDA00040438656200000453
(e)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA0004043865620000051
至约
Figure FDA0004043865620000052
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA0004043865620000053
约
Figure FDA0004043865620000054
约
Figure FDA0004043865620000055
约
Figure FDA0004043865620000056
约
Figure FDA0004043865620000057
约
Figure FDA0004043865620000058
约
Figure FDA0004043865620000059
约
Figure FDA00040438656200000510
或约
Figure FDA00040438656200000511
(f)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA00040438656200000512
至约
Figure FDA00040438656200000513
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000514
约
Figure FDA00040438656200000515
约
Figure FDA00040438656200000516
和约
Figure FDA00040438656200000517
(g)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离为约
Figure FDA00040438656200000518
至约
Figure FDA00040438656200000519
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000520
约
Figure FDA00040438656200000521
约
Figure FDA00040438656200000522
或约
Figure FDA00040438656200000523
或
(h)所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离大于约
Figure FDA00040438656200000524
并且所述间隔物的长度为约
Figure FDA00040438656200000525
约
Figure FDA00040438656200000526
约
Figure FDA00040438656200000527
或约
Figure FDA00040438656200000528
5.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含下式的氨基酸序列
CN-(X1PRX2P)m-[L-(X1PRX2P)]n-CC
其中(i)所述间隔物位于所述CAR的所述配体结合结构域和所述跨膜结构域之间；(ii)所述间隔物的长度为至少15个氨基酸；(iii)m为选自0或1的整数；(iv)n是1至20的整数；(v)L是接头多肽序列；(vi)CN是任选的N末端加帽序列；(vii)CC是任选的C末端加帽序列；以及(viii)X1和X2独立地选自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含两个、三个、四个、五个或六个X1PRX2P基序。
7.如权利要求5所述的多核苷酸，其中X1PRX2P包含至少一个半胱氨酸。
8.如权利要求6所述的多核苷酸，其中X1PRX2P是SEQ IDNO:4749(CPRCP)。
9.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述L包含SEQ IDNO:4223的多肽或其片段或变体。
10.如权利要求5所述的多核苷酸，其中当n>1时，所有L是相同的。
11.如权利要求5所述的多核苷酸，其中当n>1时，至少一个L与其他L不同。
12.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述CN包含SEQ ID NO:4088的多肽或其片段或变体。
13.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述CC包含SEQ ID NO:4533的多肽或其片段或变体。
14.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含下式的序列
(CPRCP)o(EPKSCDTPPPCPRCP)p，
其中o是0或1的整数，并且p是1、2或3的整数，其中CPRCP是SEQ ID NO:4740中列出的序列，并且EPKSCDTPPPCPRCP是SEQ ID NO:4477中列出的序列。
15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:2813、2903、2983、3358、3728和4477组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含CC加帽序列，所述CC加帽序列包含SEQ ID NO:4533的多肽的子序列或其片段或变体。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中SEQ ID NO:5的多肽的所述子序列是所述N末端AP。
18.如权利要求17所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4833、4834、4835、4836、4837和4838组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求15至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含CN加帽序列，所述CN加帽序列包含SEQ ID NO:4088的多肽的子序列或其片段或变体。
20.如权利要求19所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含与SEQ ID NO:4833的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
21.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含SEQ ID NO:4841的氨基酸序列。
22.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含与SEQ ID NO:4839具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
23.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含下式的氨基酸序列
(EX3KX4X5X6X7DTX8X9X10TCPRCP)q SEQ ID NO:4812
其中q是1和10之间的整数，并且其中：X3为L或P；X4为T或S；X5为P或C；X6为L或不存在；X7为G或不存在；X8为T或P；X9为H或P；并且X10为T或P。
24.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含SEQ ID NO:4466的至少一个氨基酸序列A和/或SEQ ID NO:4477的至少一个氨基酸序列B，其中所述CAR间隔物的所述氨基酸序列对应于式A、B、AB、ABB、ABBB、ABBBB、ABBBBB、AA、AAA、AAAA、AAAAA、BB、BBB、BBBB或BBBBB。
25.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含选自表11中的序列的氨基酸序列或与表11中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求5至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG3 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG3 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
27.如权利要求26所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgG3 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgG3 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表12中的序列的氨基酸序列。
28.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:1的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与选自由SEQ ID NO:2015、1889、1768和4852及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
30.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含选自表1中的序列的氨基酸序列或与表1中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求28至30中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物还包含(i)包含1、2、3、4或5个IgD CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或(ii)包含1、2、3、4或5个IgD CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
32.如权利要求31所述的多核苷酸，其中所述IgD CH1和CH2序列C末端结构域氨基酸和/或IgD CH1和CH2序列N末端结构域氨基酸包含选自表2中的序列的氨基酸序列。
33.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:2560的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
34.如权利要求33所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表3中的序列的氨基酸序列或与表3中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
35.如权利要求33所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4847、4845、4846、2560和4844及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
36.如权利要求33至35中任一项所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgA1 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgA1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
37.如权利要求36所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgA1 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgA1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表4中的序列的氨基酸序列。
38.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:4848的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
39.如权利要求38所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4523、4850、2713、4524和4525及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
40.如权利要求38或39所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表5中的序列的氨基酸序列或与表5中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
41.如权利要求38至40中任一项所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgA2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgA2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
42.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgA2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgA2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表6中的序列的氨基酸序列。
43.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:2723或SEQ ID NO:4843的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
44.如权利要求43所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4839、4840和4843及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
45.如权利要求43或44所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表7中的序列的氨基酸序列或与表7中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
46.如权利要求43至45所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG1 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
47.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgG1 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgG1 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表8中的序列的氨基酸序列。
48.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:2768或SEQ ID NO:4842的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
49.如权利要求48所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与SEQ ID NO:4842具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
50.如权利要求48或49所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表9A中的序列的氨基酸序列或与表9A中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
51.如权利要求47或48所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
52.如权利要求51所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表10A中的序列的氨基酸序列。
53.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:4926的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
54.如权利要求53所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4830、4831和4832及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
55.如权利要求53或54所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表9B中的序列的氨基酸序列或与表9B中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
56.如权利要求53至55所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
57.如权利要求56所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgG2 CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgG2 CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表10B中的序列的氨基酸序列。
58.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:4374的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
59.如权利要求58所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与SEQ ID NO:4856具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
60.如权利要求58或59所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表15中的序列的氨基酸序列或与表15中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
61.如权利要求50至60中任一项所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgE CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgE CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
62.如权利要求61所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgE CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgE CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表16中的序列的氨基酸序列。
63.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含
(i)抗原结合结构域，其与靶细胞上表达的肿瘤抗原上的表位结合；
(ii)跨膜结构域；
(iii)细胞内结构域；和，
(iv)CAR间隔物，其位于所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间，包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，
其中所述间隔物包含有包含SEQ ID NO:4857的至少五个、六个或七个连续氨基酸的氨基酸序列。
64.如权利要求63所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含与选自由SEQ ID NO:4858、4959和4857及其任何组合组成的组的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
65.如权利要求63或64所述的多核苷酸，其中所述间隔物包含选自表17中的序列的氨基酸序列或与表17中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
66.如权利要求63至65中任一项所述的多核苷酸，其中所述间隔物还包含：包含1、2、3、4或5个IgM CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或包含1、2、3、4或5个IgM CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列。
67.如权利要求68所述的多核苷酸，其中所述包含1、2、3、4或5个IgM CH1 C末端结构域氨基酸的N末端子序列和/或所述包含1、2、3、4或5个IgM CH2 N末端结构域氨基酸的C末端子序列包含选自表18中的序列的氨基酸序列。
68.如权利要求1至67所述的多核苷酸，其中所述CAR间隔物包含任选的L1接头和/或任选的L2接头。
69.如权利要求1至67所述的多核苷酸，其中任选的L1接头和/或任选的L2接头是柔性接头。
70.如权利要求68或69所述的多核苷酸，其中所述任选的L1接头和/或任选的L2接头的长度为1个至100个氨基酸。
71.如权利要求70所述的多核苷酸，其中所述L1接头的长度为1个至10个氨基酸。
72.如权利要求68或71所述的多核苷酸，其中所述L1接头包含Gly-Ser接头。
73.如权利要求72所述的多核苷酸，其中所述L1接头包含序列GGGSG(SEQ ID NO:4818)或序列GGGGSG(SEQ ID NO:5088)。
74.如权利要求68至73中任一项所述的多核苷酸，其中所述L2接头的长度为1个至10个氨基酸。
75.如权利要求68至74中任一项所述的多核苷酸，其中所述L2包含序列PGG。
76.如权利要求1至75所述的多核苷酸，其中所述人免疫球蛋白铰链区来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3或IgM。
77.如权利要求1至76所述的多核苷酸，其中人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的所述功能片段包含
(a)铰链和/或恒定区的内部子序列；
(b)铰链和/或恒定区的C末端子序列；
(c)铰链和/或恒定区的N末端子序列；
(d)向N末端CH1结构域和/或C末端CH2结构域延伸1至10个氨基酸的铰链区；
(e)向N末端CH1结构域延伸1至10个氨基酸的铰链区的子序列；
(f)向C末端CH2结构域延伸1至10个氨基酸的铰链区的子序列；
(g)包含(a)-(f)的2个或更多个重复的序列；
(h)对应于相同铰链和/或恒定区的(a)-(g)的组合；
(i)对应于不同铰链和/或恒定区的(a)-(g)的组合；或
(j)其任何组合。
78.如权利要求1至77中任一项所述的多核苷酸，其中使用x射线结晶学、NMR或cryo-EM结构来估计所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离。
79.如权利要求1至78中任一项所述的多核苷酸，其中使用荧光共振能量转移来估计所述表位和所述靶细胞膜的表面之间的距离。
80.如权利要求1至79中任一项所述的多核苷酸，其中与包含参考间隔物的对应CAR相比，所述CAR诱导IFNγ和/或IL-2表达增加。
81.如权利要求1至80中任一项所述的多核苷酸，其中与包含参考间隔物的对应CAR相比，所述CAR诱导IFNγ表达增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍。
82.如权利要求1至81中任一项所述的多核苷酸，其中与包含参考间隔物的对应CAR相比，所述CAR诱导IL-2表达增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍。
83.如权利要求1至82中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含与肿瘤抗原上的表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
84.如权利要求1至84中任一项所述的多核苷酸，其中所述肿瘤抗原包括ROR1、HER2、AFP、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺素、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分、及其任何组合。
85.如权利要求1至84中任一项所述的多核苷酸，其中所述肿瘤抗原包括ROR1、CD19或Her2。
86.如权利要求1至85中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含抗ROR1抗体或其抗原结合部分。
87.如权利要求86所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域与所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体交叉竞争。
88.如权利要求86或87所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域结合与所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体相同的表位。
89.如权利要求86或87所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体的重链可变区(VH)CDR3。
90.如权利要求89所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域还包含VH CDR1和VHCDR2。
91.如权利要求90所述的多核苷酸，其中所述VH CDR1包括所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体的所述VH CDR1，和/或所述VH CDR2包括所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体的所述VHCDR2。
92.如权利要求89至91中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域还包含轻链可变区(VL)CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
93.如权利要求92所述的多核苷酸，其中所述VL CDR1包括所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体的所述VL CDR1，所述VL CDR2包括所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体的所述VL CDR2，和/或所述VL CDR3包括所述R11抗体、R12抗体或2A2抗体的所述VL CDR3。
94.如权利要求87或88所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含：
(i)SEQ ID NO:4888的VH CDR1；SEQ ID NO:4889的VH CDR2；和SEQ ID NO:4890的VHCDR3；和/或SEQ ID NO:4892的VL CDR1；SEQ ID NO:4893的VL CDR2；和SEQ ID NO:4894的VL CDR3；
(ii)SEQ ID NO:4896的VH CDR1；SEQ ID NO:4897的VH CDR2；和SEQ ID NO:4898的VHCDR23；和/或SEQ ID NO:4900的VL CDR1；SEQ ID NO:4901的VL CDR2；和SEQ ID NO:4902的VL CDR3；或
(iii)SEQ ID NO:4904的VH CDR1；SEQ ID NO:4905的VH CDR2；和SEQ ID NO:4906的VHCDR23；和/或SEQ ID NO:4908的VL CDR1；SEQ ID NO:4909的VL CDR2；和SEQ ID NO:4910的VL CDR3。
95.如87或88所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中：
(i)所述VH包含SEQ ID NO:4887；或所述VL包含SEQ ID NO:4891；
(ii)所述VH包含SEQ ID NO:4895；或所述VL包含SEQ ID NO:4899；或
(iii)所述VH包含SEQ ID NO:4903；或所述VL包含SEQ ID NO:4907。
96.如权利要求87或88中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含有包含SEQ ID NO:4895的VH和包含SEQ ID NO:4899的VL；并且其中所述间隔物由SEQ ID NO:4830组成。
97.如权利要求1至96中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR被设计为标准CAR、分体CAR、关闭CAR、开启CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。
98.如权利要求1至97中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是lg NAR、Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、微抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、胞内抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单抗体、纳米抗体、亲和体、DARPin、单体抗体、adnectin、α体、或设计的粘合剂。
99.如权利要求1至98中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR的所述细胞内结构域是来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号传导结构域。
100.如权利要求1至99中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR还包含来源于2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、ICOS(CD278)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的共刺激结构域。
101.如权利要求1至100中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA分子或RNA分子。
102.如权利要求1至101中任一项所述的多核苷酸，其中所述跨膜结构域通过接头连接至所述细胞内结构域。
103.如权利要求1至102中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR是双特异性CAR。
104.如权利要求1至102中任一项所述的多核苷酸，其中所述CAR是诱导型CAR。
105.一种载体，其包含可操作地连接至调控元件的如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸。
106.如权利要求105所述的载体，其是病毒载体、哺乳动物载体或细菌载体。
107.如权利要求105或106所述的载体，其是逆转录病毒载体。
108.如权利要求105至107中任一项所述的载体，其选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦巴尔病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杂交载体和腺相关病毒(AAV)载体。
109.如权利要求108所述的载体，其是慢病毒。
110.一种组合物，其包含如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸或如权利要求105至109中任一项所述的载体。
111.一种药盒，其包含如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸、如权利要求105至109中任一项所述的载体、或如权利要求110所述的组合物。
112.一种CAR，其由如权利要求1至104中任一项所述的一种或多种多核苷酸序列或如权利要求105至109中任一项所述的载体编码。
113.一种经遗传修饰以表达CAR的细胞，其包含如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸或如权利要求105至109中任一项所述的载体。
114.如权利要求113所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、ILC细胞、巨噬细胞或抗原呈递细胞。
115.一种组合物，其包含如权利要求112所述的CAR或如权利要求113或114所述的细胞。
116.如权利要求110或115所述的组合物，其用于治疗需要CAR疗法的受试者。
117.一种药物组合物，其包含如权利要求113或114所述的细胞或如权利要求110或115所述的组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的受试者的癌症。
118.一种药盒，其包含如权利要求112所述的CAR、如权利要求113或114所述的细胞、如权利要求110或115所述的组合物或如权利要求117所述的药物组合物。
119.如权利要求1至104任一项所述的多核苷酸、如权利要求105至109任一项所述的载体、如权利要求110所述的组合物、如权利要求111所述的药盒、如权利要求112所述的CAR、如权利要求113或114所述的细胞、如权利要求115或116所述的组合物、如权利要求117所述的药物组合物或如权利要求118所述的药盒用于制造用于治疗有需要的受试者的癌症的药物的用途。
120.一种刺激受试者的T细胞介导的对靶细胞群或组织的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求113或114所述的细胞。
121.一种在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求113或114所述的细胞。
122.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求113或114所述的细胞。
123.一种制备用于疗法的细胞群的方法，其包括用如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸或如权利要求105至109中任一项所述的载体转导从受试者分离的细胞群。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述转导包括在合适的条件下培养所述细胞。
125.一种在经诊断患有癌症的受试者中生成持续存在的遗传工程细胞群的方法，所述方法包括向所述受试者施用经遗传工程改造以表达如权利要求112所述的CAR的细胞。
126.一种在经诊断患有癌症的受试者中扩增遗传工程细胞群的方法，所述方法包括向所述受试者施用经遗传工程改造以表达如权利要求112所述的CAR的细胞。
127.如权利要求120至126中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
129.如权利要求120至128中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
130.一种改进CAR疗法的一种或多种性质的方法，其包括将CAR间隔物插入到CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，其中所述CAR间隔物是如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸中所述的间隔物。
131.一种改进CAR疗法的一种或多种性质的方法，其包括将CAR间隔物插入到CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，其中所述CAR间隔物是如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸中所述的间隔物，其中所述间隔物位于所述配体结合结构域和所述跨膜结构域之间。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述CAR间隔物是如权利要求1至104中任一项所述的多核苷酸中所述的间隔物。
133.如权利要求131或132所述的方法，其中所述CAR疗法的所述一种或多种改进的性质是增加一种或多种细胞因子的分泌。
134.如权利要求133所述的方法，其中相对于在施用包含参考间隔物的对应CAR后观察到的所述分泌，所述CAR诱导的所述细胞因子分泌增加。
135.如权利要求133或134所述的方法，其中所述细胞因子是白介素。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述白介素是白介素-2。
137.如权利要求133至136中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是干扰素。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述干扰素是干扰素-γ。
139.一种设计CAR间隔物的方法，其包括测量靶表位和靶细胞表面之间的距离，其中所述间隔物的序列是Ig铰链序列、其子序列或其组合。
140.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含SEQ ID NO:5049、5050或5051中列出的氨基酸序列。
141.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含氨基酸序列，所述氨基酸序列从N末端到C末端包含(i)SEQ ID NO:4874的信号肽，(ii)SEQ ID NO:4875的scFv，(iii)SEQ ID NO:4818的接头，(iv)间隔物，其选自由间隔物1(SEQ ID NO:4830)、间隔物15(SEQ ID NO:4843)和间隔物21(SEQ ID NO:4849)组成的组，(v)SEQ ID NO:4868的跨膜结构域，(vi)SEQID NO:4869的4-1BB共刺激结构域，(vii)SEQ ID NO:4870的CD3z结构域，(viii)SEQ IDNO:4871的P2A结构域，和(ix)SEQ ID NO:4872的EGFRt结构域。
142.一种编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含氨基酸序列，所述氨基酸序列从N末端到C末端包含(i)SEQ ID NO:4874的信号肽，(ii)SEQ ID NO:4875的scFv，(iii)SEQ ID NO:4818的接头，(iv)CAR间隔物，其包含来源于人免疫球蛋白铰链和/或恒定区的氨基酸序列或其功能片段，(v)SEQ ID NO:4868的跨膜结构域，(vi)SEQ IDNO:4869的4-1BB共刺激结构域，(vii)SEQ ID NO:4870的CD3z结构域，(viii)SEQ ID NO:4871的P2A结构域，和(ix)SEQID NO:4872的EGFRt结构域，其中所述接头(iii)和CAR间隔物(iv)的组合长度为约
Figure FDA0004043865620000301
至约
Figure FDA0004043865620000302
143.如权利要求142所述的多核苷酸，其中所述接头(iii)和CAR间隔物(iv)的组合长度为约
Figure FDA0004043865620000303
约
Figure FDA0004043865620000304
约
Figure FDA0004043865620000305
约
Figure FDA0004043865620000306
或约
Figure FDA0004043865620000307
144.如权利要求142所述的多核苷酸，其中所述接头(iii)和CAR间隔物(iv)的组合长度为约
Figure FDA0004043865620000308
至约
Figure FDA0004043865620000309
145.如权利要求142所述的多核苷酸，其中所述接头(iii)和CAR间隔物(iv)的组合长度为约
Figure FDA00040438656200003010
146.一种载体，其包含如权利要求140至145中任一项所述的多核苷酸。
147.一种组合物，其包含如权利要求140至145中任一项所述的多核苷酸或如权利要求146所述的载体。
148.一种药盒，其包含如权利要求140至145中任一项所述的多核苷酸、如权利要求146所述的载体、或如权利要求147所述的组合物。
149.一种CAR，其由一个或多个多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含如权利要求140至145中任一项所述的多核苷酸或如权利要求146所述的载体。
150.一种经遗传修饰以表达CAR的细胞，其包含如权利要求140至145中任一项所述的多核苷酸或如权利要求146所述的载体。
151.一种组合物，其包含如权利要求149所述的CAR或如权利要求150所述的细胞。
152.如权利要求147或151所述的组合物，其用于治疗需要CAR疗法的受试者。
153.一种药物组合物，其包含如权利要求150所述的细胞或如权利要求151或152所述的组合物，所述药物组合物用于治疗有需要的受试者的癌症。
154.一种药盒，其包含如权利要求149所述的CAR、如权利要求150所述的细胞、如权利要求151或152所述的组合物或如权利要求153所述的药物组合物。
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