CN112584902A - 嵌合抗原受体（car）t细胞疗法和激酶抑制剂的组合疗法 - Google Patents

嵌合抗原受体（car）t细胞疗法和激酶抑制剂的组合疗法 Download PDF

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J·哈斯卡尔
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Abstract

提供了用于治疗患有癌症如某些B细胞恶性肿瘤的受试者的组合疗法，其包括免疫疗法例如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和使用激酶抑制剂例如BTK/lTK抑制剂，例如依鲁替尼；以及相关的方法、组合物、用途和制品。所述CAR T细胞疗法包括表达重组受体如抗CD19 CAR的细胞。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如复发性或难治性NHL或特定NHL亚型。

Description

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和激酶抑制剂的组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月3日提交的标题为“T细胞疗法和激酶抑制剂的组合疗法(COMBINATION THERAPY OF A T CELL THERAPY AND A KINASE INHIBITOR)”的美国临时申请号62/666,653的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年4月30日创建的标题为735042017540SeqList.txt的文件提供，其大小为34.4千字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
在一些方面，本公开文本涉及用于治疗患有疾病和病症(如某些B细胞恶性肿瘤)的受试者的组合疗法的方法、组合物、用途和制品，所述组合疗法包括免疫疗法(如过继细胞疗法，例如T细胞疗法)和使用激酶抑制剂(例如，BTK/ITK抑制剂)；以及相关的方法、组合物、用途和制品。T细胞疗法包括表达重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如复发性或难治性NHL或特定NHL亚型。
背景技术
多种策略可用于免疫疗法，例如施用工程化T细胞用于过继疗法。例如，策略可用于工程化表达基因工程化抗原受体(如CAR)的T细胞，以及向受试者施用含有此类细胞的组合物。需要改善的策略来改善所述细胞的功效，例如改善在向受试者施用之后细胞的持久性、活性和/或增殖。提供了满足此类需求的方法、组合物、试剂盒和系统。
发明内容
本文提供了涉及组合疗法的方法、组合物、用途、制品，所述组合疗法涉及向患有癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)的受试者施用免疫疗法(包括细胞疗法，如T细胞疗法)以及向所述受试者施用如本文所述的激酶抑制剂(如依鲁替尼)。在一些方面，所述B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如复发性或难治性NHL或特定NHL亚型。在一些方面，所提供的方法、用途和制品包括施用T细胞疗法，如包含与B细胞上表达的抗原结合的抗原结合结构域的CAR表达T细胞。
本文提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包括结构
Figure BDA0002857331390000021
以及向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法含有一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
本文提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包括结构
Figure BDA0002857331390000022
从所述受试者获得生物样品并加工所述样品的T细胞，从而产生含有表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物；以及向所述受试者施用含有一定剂量的所述基因工程化T细胞的自体T细胞疗法，其中所述激酶抑制剂的施用是按如下给药方案进行的，所述给药方案是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的所述抑制剂的施用。
本文提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂具有结构
Figure BDA0002857331390000031
其中所述受试者是用自体T细胞疗法治疗的候选者或将要用自体T细胞疗法治疗，所述T细胞疗法含有一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰；并且所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂持续一定的时间段，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用所述T细胞疗法。
在一些实施方案中，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。在一些方面，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些例子中，在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止所述激酶抑制剂的施用。
在一些实施方案中，所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法。在一些例子中，所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
本文提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂具有结构
Figure BDA0002857331390000041
向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法含有一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述重复施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述受试者获得所述生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生含有表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物。
在一些任何此类实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约4天、至少或至少约5天、至少为或6天、至少或至少约7天、至少或至少约14天或更长时间开始的。在一些例子中，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或为或约5天至7天开始的。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成的。
在一些实施方案中，所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长15天至29天。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。在一些任何此类实施方案中，将所述激酶抑制剂的施用在所述给药方案期间在施用其的每一天中每天进行一次。
在一些任何此类实施方案中，所述有效量包含在施用所述激酶抑制剂的每一天中从或从约140mg至或至约840mg或者从或从约140mg至或至约560mg。
在一些例子中，所述有效量包括在施用所述激酶抑制剂的每一天中从或从约140mg至或至约560mg。
本文提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述激酶抑制剂是或包括结构
Figure BDA0002857331390000051
以及向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法含有一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约5至7天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用；和进一步施用，其在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至或至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。在一些实施方案中，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。在一些情况下，所述方法还包括在施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。在一些例子中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成的。在一些情况下，所述给药方案包括在所述淋巴细胞清除疗法期间中止施用所述激酶抑制剂。
本文提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述激酶抑制剂具有结构
Figure BDA0002857331390000061
和向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及在完成所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天内向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约5至7天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂直至开始所述淋巴细胞清除疗法，在所述淋巴细胞清除疗法期间中止施用所述激酶抑制剂和进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至或至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述受试者获得所述生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物。在一些任何此类实施方案中，所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是从或从约280mg至或至约560mg。在一些方面，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前最少或最少约7天开始的。
在一些任何此类实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约30至或至约40天开始的；在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23至或至约38天从所述受试者获得所述样品；和/或所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天完成的。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约35天开始的；在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约28至或至约32天从所述受试者获得所述样品；和/或所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天完成的。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约200-400mg/m2、任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，包含端值；和/或为或约20-40mg/m2、任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天、任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为或约500mg/m2的环磷酰胺。在一些例子中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约140mg的量。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约280mg的量。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约420mg的量。在一些情况下，所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约560mg的量。
在一些实施方案中，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于四个月。在一些情况下，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于五个月。在一些实施方案中，所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段延长为或约或大于六个月。
在一些任何此类实施方案中，如果在所述时间段结束时所述受试者展现出所述治疗后的完全反应(CR)，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。在一些实施方案中，如果在所述时间段结束时所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。在一些情况下，所述时间段延长从或从为或约三个月至为或六个月。在一些例子中，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约三个月。
在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。在一些情况下，如果所述受试者已经在3个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。在一些例子中，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约六个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。在一些情形中，如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
在一些实施方案中，即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述进一步施用仍在所述时间段的持续时间内继续进行。在一些实施方案中，所述受试者在所述时间段期间且在所述时间段结束之前的某个时间实现完全反应(CR)。在一些实施方案中，所述方法还包括如果在所述时间段结束时所述受试者展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则在所述时间段结束之后继续进行所述进一步施用。在一些实施方案中，如果在为或约六个月时所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述进一步施用继续进行大于六个月。在一些情况下，所述进一步施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和/或抑制IL2诱导型T细胞激酶(ITK)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制ITK并且所述抑制剂抑制ITK或抑制ITK，其中半最大抑制浓度(IC50)为小于或小于约1000nM、900nM、800nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或更小。
在一些实施方案中，在所提供的方法中施用所述激酶抑制剂之前，先前已向所述受试者施用所述激酶抑制剂。在一些实施方案中，在所提供的方法中施用所述激酶抑制剂之前，先前尚未向所述受试者施用所述激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述受试者和/或所述癌症(a)对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性和/或(b)包括对被所述激酶抑制剂抑制有抗性的细胞群，任选地其中所述细胞群是或包括B细胞群和/或不包括T细胞；所述受试者和/或所述癌症含有编码BTK的核酸中的突变，任选地其中所述突变能够减少或防止所述激酶抑制剂对所述BTK的抑制，任选地其中所述突变是C481S；所述受试者和/或所述癌症含有编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845F；在开始施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗是难治性的；在开始施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展；和/或在开始施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。
在一些任何此类实施方案中，所述癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些情况下，所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。在一些情况下，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些例子中，所述NHL包括侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS、任选地转化惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)、任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
在一些实施方案中，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status，ECOG)状态。
在一些任何此类实施方案中，将所述激酶抑制剂口服施用。
在一些实施方案中，所述CD19是人CD19。在一些方面，所述嵌合抗原受体(CAR)包括与所述CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包括ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些情况下，所述细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)还含有共刺激信号传导区域。在一些情况下，所述共刺激信号传导区域包括CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域是或包括人4-1BB的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR含有对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包括4-1BB、任选地人4-1BB；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包括在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；所述CAR依次含有对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包括4-1BB信号传导结构域、任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；或者所述CAR依次含有对所述CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR含有间隔子并且所述间隔子是如下多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包括免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，或包括约15个或更少的氨基酸，并且不包括CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；(b)包括免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，和/或包括约15个或更少的氨基酸，并且不包括CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；或者(c)长度是为或约12个氨基酸，和/或包括免疫球蛋白铰链、任选地IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成；或者(d)具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体；或者(e)包括式X1PPX2P(SEQ ID NO:58)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸；和/或所述共刺激结构域包括SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的其变体；和/或所述初级信号传导结构域包括SEQ ID NO:13或14或15与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性；和/或所述scFv包括RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列、和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列，和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列、和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列，或者其中所述scFv包括FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与任何前述项结合相同的表位或与任何前述项竞争结合，并且任选地其中所述scFv依次包括VH、任选地包括SEQ ID NO:41的接头和VL，和/或所述scFv包括柔性接头和/或包括如SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列。
在一些任何此类实施方案中，所述剂量的基因工程化T细胞含有从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化T细胞含有至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。在一些情况下，所述剂量的基因工程化T细胞含有为或约5x107个总CAR表达T细胞。在一些情形中，所述剂量的基因工程化T细胞含有为或约1x108个CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化T细胞包括表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞，并且所述剂量的施用包括多种单独组合物的施用，所述多种单独组合物包括包含所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物以及包含所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。
在一些实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。在一些方面，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
在一些实施方案中，所述第一组合物含有所述CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物含有所述CD8+T细胞。在一些实施方案中，将所述第一组合物在所述第二组合物之前施用。在一些实施方案中，将所述剂量的细胞肠胃外、任选地静脉内施用。在一些任何此类实施方案中，所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞。在一些情况下，所述T细胞对于所述受试者是自体的。
在一些任何此类实施方案中，所述加工包括从获自所述受试者的样品分离T细胞、任选地CD4+和/或CD8+T细胞，从而产生含有原代T细胞的输入组合物；以及将编码所述CAR的核酸分子引入所述输入组合物的T细胞中。在一些情况下，所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
在一些实施方案中，所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
在一些实施方案中，在所述引入之前，所述过程包括在刺激条件下孵育所述输入组合物，所述刺激条件包括能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂的存在，从而产生经刺激的组合物，其中将编码所述CAR的核酸分子引入所述经刺激的组合物中。在一些例子中，所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性结合、任选地与CD3特异性结合的一级药剂。在一些情况下，所述刺激试剂还包括与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在一些例子中，所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
在一些情况下，所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。在一些例子中，所述固体支持物是或包括珠，任选地其中所述珠是磁性的或超顺磁性的。在一些实施方案中，所述珠包括大于或大于约3.5μm，但是不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。在一些例子中，所述珠包括为或约4.5μm的直径。
在一些实施方案中，所述引入包括用包括编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激的组合物的细胞。在一些情况下，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些例子中，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，所述过程还包括在所述引入之后培育所述T细胞，任选地其中所述培育是在导致细胞增殖或扩增的条件下进行的，以产生含有所述T细胞疗法的输出组合物。在一些情形中，在所述培育之后，所述方法还包括配制所述输出组合物的细胞用于冷冻保存所述T细胞疗法和/或用于向所述受试者施用所述T细胞疗法，任选地其中所述配制是在存在药学上可接受的赋形剂的情况下进行的。
在一些任何此类实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，根据所述方法治疗的受试者的至少35％、至少40％或至少50％实现完全反应(CR)，所述完全反应可持续或在实现所述CR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％中可持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或到六个月时实现CR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％保持反应、保持CR和/或存活或在没有进展的情况下存活持续为或大于3个月和/或为或大于6个月和/或为或大于九个月；和/或根据所述方法治疗的受试者的至少50％、至少60％或至少70％实现客观反应(OR)，任选地其中所述OR可持续或在实现所述OR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％中可持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或到六个月时实现OR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％保持反应或存活持续为或大于3个月和/或为或大于6个月。
在一些实施方案中，在施用所述剂量的细胞的时间或紧接其之前，所述受试者已经在用针对所述淋巴瘤、任选地所述NHL的一种或多种先前疗法、任选地除另一剂量的表达所述CAR的细胞之外的一种、两种或三种先前疗法治疗之后的缓解后复发，或者变得对于所述先前疗法是难治性的。在一些实施方案中，在施用含有所述剂量的细胞的T细胞疗法时或之前，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有化疗难治性淋巴瘤、任选地化疗难治性DLBCL；和/或所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全反应(CR)。
本文提供了试剂盒，所述试剂盒含有一个或多个单位剂量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure BDA0002857331390000141
以及进行本文提供的任何方法的说明书。
本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有一个或多个单位剂量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包括结构
Figure BDA0002857331390000142
以及用于向患有癌症的受试者施用所述一个或多个单位剂量的说明书，所述患有癌症的受试者是用自体T细胞疗法治疗的候选者或将要用自体T细胞疗法治疗，所述T细胞疗法含有一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，并且其中在施用所述T细胞疗法之前，从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述说明书指定在获得所述样品之前为或至少约3天并且按如下给药方案开始向所述受试者施用单位剂量的所述激酶抑制剂，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用一个或多个单位剂量，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
在一些情况下，所述说明书还指定向所述受试者施用所述T细胞疗法。在一些情形中，所述说明书还指定在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，所述说明书指定在施用所述淋巴细胞清除疗法期间应中止所述激酶抑制剂的施用。在一些情况下，所述说明书指定所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段至少延长直到开始所述淋巴细胞清除疗法。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。在一些实施方案中，所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约4天、至少或至少约5天、至少或至少约6天、至少或至少约7天、至少或至少约14天或更长时间开始的。在一些方面，所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约5天至7天开始的。在一些情况下，所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法的施用应在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成。在一些实施方案中，所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法的施用应在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述激酶抑制剂的进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。在一些实施方案中，所述说明书指定所述激酶抑制剂的每个单位剂量的施用在所述给药方案期间在施用其的每一天中每天进行一次。
在一些实施方案中，所述一个或多个单位剂量各自含有从或从约140mg至或至约840mg。在一些实施方案中，所述一个或多个单位剂量各自含有在施用所述激酶抑制剂的每一天中从或从约140mg至或至约560mg。在一些情况下，所述一个或多个单位剂量各自含有从或从约280mg至或至约560mg。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前最少或最少约7天开始的。在一些实施方案中，所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约30至或至约40天开始的；在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23至或至约38天从所述受试者获得所述样品；和/或所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天完成的。在一些实施方案中，所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约35天开始的；在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约28至或至约32天从所述受试者获得所述样品；和/或所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天完成的。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。在一些实施方案中，所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法的施用包括每天施用为或约200-400mg/m2、任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，包含端值；和/或为或约20-40mg/m2、任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天、任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为或约500mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约140mg和/或所述说明书指定将所述激酶抑制剂在施用其的每一天中以为或约140mg的量施用。在一些例子中，所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约280mg和/或所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约280mg的量。在一些情况下，所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约420mg和/或所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约420mg的量。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约560mg和/或所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约560mg的量。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于四个月。在一些情况下，所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于五个月。在一些实施方案中，所述说明书指定所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段延长为或约或大于六个月。
在一些实施方案中，所述说明书指定如果在所述时间段结束时所述受试者展现出所述治疗后的完全反应(CR)，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。在一些实施方案中，所述说明书指定如果在所述时间段结束时所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。在一些实施方案中，所述说明书指定所述时间段延长从或从为或约三个月至为或六个月。在一些情况下，所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约三个月。
在一些实施方案中，所述说明书指定如果所述受试者已经在为或约3个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。在一些实施方案中，所述说明书指定如果所述受试者已经在3个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约六个月。在一些实施方案中，所述说明书指定如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。在一些情况下，所述说明书指定如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
在一些实施方案中，所述说明书指定即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述进一步施用仍在所述时间段的持续时间内继续进行。在一些实施方案中，所述说明书指定如果在所述时间段结束时所述受试者展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则还包括在所述时间段结束之后继续进行所述进一步施用。在一些情况下，所述说明书指定如果在为或约六个月时所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述进一步施用继续进行大于六个月。在一些情况下，所述说明书指定所述进一步施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和/或抑制IL2诱导型T细胞激酶(ITK)。在一些例子中，所述激酶抑制剂抑制ITK并且所述抑制剂抑制ITK或抑制ITK，其中半最大抑制浓度(IC50)为小于或小于约1000nM、900nM、800nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或更小。
在一些实施方案中，所述说明书指定在施用所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂之前，先前已经或可能已经向所述受试者施用所述激酶抑制剂。在一些方面，所述说明书指定在施用所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂之前，先前尚未向所述受试者施用所述激酶抑制剂或者所述受试者是先前尚未施用所述激酶抑制剂的受试者。
在一些实施方案中，所述受试者和/或所述癌症(a)对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性和/或(b)含有对被所述激酶抑制剂抑制有抗性的细胞群，任选地其中所述细胞群是或含有B细胞群和/或不含有T细胞；所述受试者和/或所述癌症包括编码BTK的核酸中的突变，任选地其中所述突变能够减少或防止所述激酶抑制剂对所述BTK的抑制，任选地其中所述突变是C481S；所述受试者和/或所述癌症包括编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845F；在开始施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗是难治性的；在开始施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展；和/或在开始施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。
在一些实施方案中，所述癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些情形中，所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。在一些情况下，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些例子中，所述NHL包括侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS、任选地转化惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)、任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
在一些实施方案中，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。在一些实施方案中，所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂被配制用于口服施用和/或所述说明书还指定将所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂口服施用。
在一些实施方案中，所述CD19是人CD19。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)包括与所述CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包括ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些例子中，所述细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。在一些情况下，所述嵌合抗原受体(CAR)还包括共刺激信号传导区域。在一些例子中，所述共刺激信号传导区域包括CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。在一些情形中，所述共刺激结构域是或包括人4-1BB的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包括对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包括4-1BB、任选地人4-1BB；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包括在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；所述CAR依次包括对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包括4-1BB信号传导结构域、任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；或者所述CAR依次包括对所述CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包括间隔子并且所述间隔子是如下多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包括免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，或包括约15个或更少的氨基酸，并且不包括CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；(b)包括免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，和/或包括约15个或更少的氨基酸，并且不包括CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；或者(c)长度是为或约12个氨基酸，和/或包括免疫球蛋白铰链、任选地IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成；或者(d)具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体；或者(e)包括式X1PPX2P(SEQ ID NO:58)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸；和/或所述共刺激结构域包括SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的其变体；和/或所述初级信号传导结构域包括SEQ ID NO:13或14或15与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性；和/或所述scFv包括RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列、和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列，和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列、和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列，或者其中所述scFv包括FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与任何前述项结合相同的表位或与任何前述项竞争结合，并且任选地其中所述scFv依次包括VH、任选地包括SEQ ID NO:41的接头和VL，和/或所述scFv包括柔性接头和/或包括如SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化T细胞含有从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化T细胞含有至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。在一些情况下，所述剂量的基因工程化T细胞含有为或约5x107个总CAR表达T细胞。在一些情况下，所述剂量的基因工程化T细胞含有为或约1x108个CAR表达细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化T细胞包括表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞，并且所述说明书指定所述剂量的施用包括多种单独组合物的施用，所述多种单独组合物包括含有所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物以及含有所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。
在一些例子中，所述说明书指定将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。在一些情况下，所述说明书指定将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述第一组合物含有所述CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述说明书指定所述第一组合物含有所述CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述说明书指定将所述第一组合物在所述第二组合物之前施用。在一些实施方案中，所述说明书指定将所述剂量的细胞肠胃外、任选地静脉内施用。
在一些实施方案中，所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞。在一些情况下，所述T细胞对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，所述说明书还指定用于产生所述T细胞疗法的过程。在一些实施方案中，用于产生所述T细胞疗法的过程包括从获自所述受试者的样品分离T细胞、任选地CD4+和/或CD8+T细胞，从而产生含有原代T细胞的输入组合物；以及将编码所述CAR的核酸分子引入所述输入组合物中。
在一些情况下，所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。在一些例子中，所述生物样品是或含有全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
在一些实施方案中，在所述引入之前，所述过程包括在刺激条件下孵育所述输入组合物，所述刺激条件包括能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂的存在，从而产生经刺激的组合物，其中将编码所述CAR的核酸分子引入所述经刺激的组合物中。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性结合、任选地与CD3特异性结合的一级药剂。在一些例子中，所述刺激试剂还包括与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在一些情况下，所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
在一些实施方案中，所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。在一些例子中，所述固体支持物是或包括珠，任选地其中所述珠是磁性的或超顺磁性的。在一些情况下，所述珠包括大于或大于约3.5μm，但是不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。在一些例子中，所述珠包括为或约4.5μm的直径。
在一些实施方案中，所述引入包括用包括编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激的组合物的细胞。在一些情况下，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些情形中，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，所述过程还包括在所述引入之后培育所述T细胞，任选地其中所述培育是在导致细胞增殖或扩增的条件下进行的，以产生含有所述T细胞疗法的输出组合物。在一些例子中，在所述培育之后，所述过程还包括配制所述输出组合物的细胞用于冷冻保存所述T细胞疗法和/或用于向所述受试者施用所述T细胞疗法，任选地其中所述配制是在存在药学上可接受的赋形剂的情况下进行的。
在一些实施方案中，所述说明书指定所述受试者是人。
在一些实施方案中，所述说明书指定在施用包括所述剂量的细胞的T细胞疗法时或之前，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有化疗难治性淋巴瘤、任选地化疗难治性DLBCL；和/或所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全反应(CR)。
本文提供了一种含有本文提供的任何试剂盒的制品。
附图说明
图1A显示了在与CAR T细胞和依鲁替尼共培养的一式三份孔中评估靶标特异性细胞溶解活性的归一化靶细胞数量(平均值±SEM)的图。图1B显示了以2.5:1的效应子与靶标比率(E:T)与CAR T细胞共培养的靶细胞(NucLight Red K562.CD19细胞)在细胞毒性测定的开始和结束时的代表性图像。图1C显示了依鲁替尼对抗CD19 CAR T细胞的细胞溶解活性的剂量效应。所述图显示了来自三个独立供体的数据，并针对未处理的对照(100％)归一化。描绘了平均值±SEM，并且统计上显著的差异表示为P<0.00001(****)。
图2A显示了在存在或不存在所指示浓度的依鲁替尼的情况下培养CD4+和CD8+细胞后CD25、CD28、CD39和CD95的CAR T细胞表达。图2B显示了在存在依鲁替尼的情况下初始刺激之后四天中来自一个供体来源的细胞的CAR T细胞中TCM(CCR7+CD45RA-)和TEM(CCR7-CD45RA-)百分比的代表性结果。图2C和图2D显示了在存在或不存在所指示浓度的依鲁替尼的情况下分别培养CD4+和CD8+T细胞后CD69、CD107a和PD-1的CAR-T细胞表达。
图3A描绘了在存在或不存在依鲁替尼的情况下由一个供体产生的CAR-T细胞在4天中的细胞因子产生动力学的代表性图。图3B描绘了在2个独立实验中与不存在依鲁替尼的情况相比，在存在依鲁替尼的情况下刺激CAR-T细胞2天之后细胞因子产生的百分比变化。
图4A显示了在不存在依鲁替尼(对照)或存在50nM或500nM依鲁替尼的情况下在连续刺激测定中每轮再刺激之后CAR-T细胞数量的倍数变化。图4B显示了在连续刺激测定中在不存在依鲁替尼(对照)或存在50nM或500nM依鲁替尼的情况下每轮再刺激之后CAR-T细胞数量倍增的数量。图4C显示了在连续刺激测定中在存在或不存在依鲁替尼的情况下分别在1轮和5轮再刺激之后即第4天和第18天的细胞数量。
图5A显示了在存在依鲁替尼的情况下刺激T细胞之后TH1表面标记表达的代表性流式细胞图。图5B显示了对于在存在或不存在依鲁替尼的情况下培养的T细胞所观察到的随时间的TH1细胞百分比，如通过流式细胞术测定所测量的。图5C显示了在存在各种浓度的依鲁替尼的情况下经刺激的T细胞培养物中TH1细胞的百分比。图5D显示了在存在依鲁替尼的情况下在连续刺激的第0、11、18和21天CD25、CD38、CD39和CD45RO的表达。显示了来自一个供体来源的细胞的CAR T细胞的代表性结果。图5E显示了在存在依鲁替尼的情况下在连续刺激的第0、11、18和21天CD62L、CD69、CD107a和PD-1的表达。显示了来自一个供体来源的细胞的CAR T细胞的代表性结果。
图6A显示了在被鉴定为对BTK抑制有抗性的播散性肿瘤异种移植小鼠模型中，与媒介物处理相比，依鲁替尼处理对肿瘤负荷的影响。图6B显示了在存在或不存在依鲁替尼或媒介物对照的情况下在用来自两个不同供体来源的细胞的CAR+T细胞处理的小鼠中肿瘤注射后更长的时间点处的相同研究的结果。图6A和图6B中的结果描绘了随时间的肿瘤生长，如通过生物发光测量平均辐射亮度所指示的。图6C显示了Kaplan meier曲线，其描绘了在存在或不存在依鲁替尼的情况下施用了CAR-T细胞的荷瘤小鼠的存活率。图6D显示了在相同研究中在存在或不存在依鲁替尼或媒介物对照的情况下在用来自两个不同供体来源的细胞的CAR+T细胞处理的小鼠中肿瘤注射后更长的时间点处的存活率的结果。
图7A显示了Kaplan meier曲线，其描绘了施用了由两个不同供体产生的CAR-T细胞(单独地或与经由饮用水施用每日施用依鲁替尼组合)的荷瘤小鼠的所观察到的存活率。统计上显著的差异显示为P<0.001(***)。图7B显示了随时间的肿瘤生长，如通过来自施用了由两个不同供体产生的CAR-T细胞并用经由饮用水施用的依鲁替尼处理的小鼠的生物发光测量平均辐射亮度所指示的。统计上显著的差异显示为双因素ANOVA，P<0.05(*)，P<0.01(**)。图7C显示了用或未用依鲁替尼处理的小鼠的血液、骨髓和脾中CAR-T细胞的水平。图7D显示了在用或未用依鲁替尼处理之后CAR-T细胞转移后第19天血液中CAR-T细胞的水平。统计上显著的差异表示为*p<0.05。图7E显示了用或未用依鲁替尼处理的小鼠的血液、骨髓和脾中的肿瘤细胞计数。统计上显著的差异表示为P<0.001(***)和P<0.0001(****)。
图8A描绘了在与依鲁替尼或对照组合的CAR-T细胞转移后第12天从动物的骨髓收获的CAR工程化T细胞上的表面标记的T分布随机近邻嵌入(t-SNE)高维分析。图8B描绘了从对在CAR-T细胞与依鲁替尼或媒介物对照转移后第12天从动物的骨髓收获的CAR工程化T细胞的T分布随机近邻嵌入(t-SNE)高维分析得出的四个群体。图8C描绘了直方图，其显示了来自在总群体的表达(阴影直方图)上叠加的4门控t-SNE的CD4、CD8、CD62L、CD45RA、CD44和CXCR3的单独表达谱。图8D描绘了来自对照小鼠或用依鲁替尼处理的小鼠的每个t-SNE群体的百分比和倍数变化。
图9A显示了在不存在依鲁替尼(对照)或存在50nM或500nM依鲁替尼的情况下，在从患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的受试者获得的细胞产生的CAR工程化细胞的21天培养期中在连续刺激测定中群体倍增的数量。箭头指示每次再刺激的时间点，在该时间点对CAR T细胞进行计数，并添加新的靶细胞以及依鲁替尼。图9B显示了在存在或不存在依鲁替尼的情况下连续再刺激16天之后基因工程化CAR-T细胞对CD19表达靶细胞的细胞溶解活性。将杀伤百分比针对未处理的对照(100％)归一化。数据显示为来自重复孔的平均值±SEM。统计上显著的差异表示为P<0.001(***)，P<0.0001(****)。
图10A是火山图，其描绘了与对照相比，来自用500nM依鲁替尼处理的第18天连续刺激的CAR T细胞的差异表达的基因。显著差异上调的基因在右虚线的右侧，并且显著差异下调的基因在左虚线的左侧(FDR<0.05，abslog2FC>0.5)。图10B是热图，其描绘了对照组和500nM依鲁替尼组中来自图10A的23个差异表达的基因的归一化表达(每个供体+条件的平均每百万转录物(Transcripts per Million)，每个基因的归一化z得分)。图10C描绘了与对照相比来自用50nM依鲁替尼处理的第18天连续刺激的CAR T细胞的表达的基因的火山图。图10D描绘了对照组和50nM依鲁替尼处理组中来自第18天连续刺激的CAR T细胞的归一化基因表达变化(如图10B中所述归一化)的热图。
图11A-图11E描绘了与对照(Ctrl)相比来自用50nM(Ibr50)或500nM依鲁替尼(Ibr500)处理的连续刺激的CAR T细胞的跨越每种条件下的供体和实验所总结的所指示基因的表达(TPM，每百万转录物)箱形图谱。
图12A是在连续刺激18天之后来自一个供体来源的细胞的CAR T细胞中CD62L表达的代表性直方图，如通过流式细胞术所测量的。图12B描绘了针对对照归一化的在连续刺激18天之后来自一个供体来源的细胞的CD62L+CAR T细胞百分比的倍数变化，如通过流式细胞术所测量的。数据来自两个独立实验(平均值±SEM)。
具体实施方式
提供了工程化细胞(如T细胞(例如CAR表达T细胞))和TEC家族激酶的抑制剂(如BTK或ITK抑制剂)的方法和用途。在一些方面，所提供的实施方案涉及组合疗法，例如涉及向受试者施用TEC家族激酶的抑制剂(如BTK抑制剂，例如依鲁替尼)和施用过继细胞疗法(如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞))例如用于治疗患有癌症或增殖性疾病的受试者的组合疗法。
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞(例如CAR-T细胞))和激酶抑制剂以及它们的组合物用于治疗患有癌症或增殖性疾病的受试者的方法和用途，所述激酶抑制剂是依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物，所述依鲁替尼是具有结构
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的化合物。在一些方面，所述T细胞疗法是过继T细胞疗法，其包含特异性识别和/或靶向与癌症或增殖性疾病相关的抗原(如与B细胞恶性肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)或其亚型)相关的抗原)的T细胞。在一些方面，所述T细胞疗法包含用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞，所述嵌合抗原受体包含与抗原结合(如特异性结合)的抗原结合结构域。在一些情况下，所述T细胞疗法靶向的抗原是CD19。还提供了含有包含所述T细胞疗法的组合物和/或包含激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的组合物的组合和制品如试剂盒，以及此类组合物和组合用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症，如B细胞恶性肿瘤)的用途。
细胞疗法(如基于T细胞的疗法，例如过继T细胞疗法(包括涉及施用表达目的疾病或障碍所特有的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR)和/或其他重组抗原受体)的细胞的那些，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法))可以有效地治疗所述疾病和障碍(如B细胞恶性肿瘤)。T细胞表面上重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的工程化表达使得能够重定向T细胞特异性。在临床研究中，CAR-T细胞(例如抗CD19 CAR-T细胞)已在白血病患者和淋巴瘤患者二者中均产生了持久的完全反应(Porter等人(2015)Sci Transl Med.,7:303ra139；Kochenderfer(2015)J.Clin.Oncol.,33:540-9；Lee等人(2015)Lancet,385:517-28；Maude等人(2014)N Engl J Med,371:1507-17)。
在某些情况下，过继细胞疗法的可行途径可能并不总是完全令人满意。例如，尽管在许多患有淋巴瘤的受试者中可以检测到CAR T细胞持久性，但是与患有ALL的受试者相比，在患有NHL的受试者中观察到较少的完全反应(CR)。更具体地，尽管已报告在CAR T细胞输注之后高达80％(CR率47％至60％)的较高总反应率，但在一些人中反应是短暂的，并且受试者已显示出在存在持久性CAR T细胞的情况下复发(Neelapu,58th Annual Meetingof the American Society of Hematology(ASH):2016；美国加利福尼亚州圣地亚哥文献号LBA-6.2016；Abramson,Blood.2016年12月1日；128(22):4192)。另一项研究报告长期CR率为40％(Schuster,Ann Hematol.2016年10月；95(11):1805-10)。
在一些方面，对此的解释是循环CAR表达T细胞的免疫衰竭和/或T淋巴细胞群的变化。这是因为，在一些情况下，最佳功效可能取决于所施用细胞具有以下性能的能力：被激活，扩增，发挥各种效应子功能(包括细胞毒性杀伤和分泌各种因子，如细胞因子)，持续存在(包括长期)，分化、转换或参与重编程为某些表型状态(如长期记忆、较低分化和效应子状态)，避免或减少疾病局部微环境中的免疫抑制条件，在清除并重新暴露于靶配体或靶抗原后提供有效且稳健的回忆反应，以及避免或减少衰竭、无反应性、外周耐受、终末分化和/或分化为抑制状态。
在一些情况下，可以通过施用淋巴细胞清除疗法或用淋巴细胞清除疗法进行预调理来改善反应，在一些方面与未进行预调理或使用不同淋巴细胞清除疗法预调理的方法相比，所述淋巴细胞清除疗法增加了在施用后的细胞的持久性和/或功效。所述淋巴细胞清除疗法通常包括施用氟达拉滨，典型地与另一种化疗或其他药剂(如环磷酰胺)组合施用，它们可以以任一顺序依序或同时施用。在最近的I/II期临床研究中，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中的完全反应(CR)分别为94％、47％和50％，并且与接受环磷酰胺但未接受氟达拉滨的患者相比，在接受环磷酰胺和氟达拉滨淋巴细胞清除的患者中的无病存活率更高(Cameron等人(2016)J Clin Oncol,34(增刊；摘要102)。然而，在一些方面，即使采用淋巴细胞清除疗法，CAR-T细胞疗法也不总是在所有受试者中始终有效。
在一些实施方案中，在向所述受试者施用之后工程化细胞的暴露、持久性和功能降低或下降。然而，观察结果表明，在一些情况下，所施用的表达所述重组受体的细胞(例如，随时间增加的细胞数量或持续时间)可以在体内再扩增和/或被重新激活以改善过继细胞疗法的功效和治疗结果。
所提供的方法是基于以下观察结果：激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)改善工程化T细胞疗法的T细胞功能，包括与T细胞的扩增、增殖和持久性有关的功能。在一些实施方案中，所述方法凭借施用T细胞疗法(如包括用于过继细胞疗法(例如如T细胞疗法)的细胞(例如CAR表达T细胞)的组合物)与激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的组合是有利的。在一些方面，与某些替代方法相比，所提供的方法和用途提供或实现改善的或更持久的反应或功效。在一些方面，所提供的方法增强或调节与所述T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)的施用相关的T细胞的增殖和/或活性。
在一些方面，与某些替代方法相比，所提供的方法和用途提供或实现如在所治疗的特定受试者组中改善的或更持久的反应或功效。在一些实施方案中，所述方法凭借施用免疫疗法或免疫治疗剂(如包括用于过继细胞疗法(例如如T细胞疗法)的细胞(例如CAR表达T细胞)的组合物)和TEC家族激酶的抑制剂(例如BTK抑制剂或ITK抑制剂，例如依鲁替尼)是有利的。
所提供的方法是基于以下观察结果：TEC家族激酶的抑制剂(例如依鲁替尼)改善T细胞功能，包括与T细胞的扩增、增殖和持久性有关的功能。依鲁替尼是不可逆的小分子抑制剂(SMI)，其阻断布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的活性并且也对ITK展现出活性。依鲁替尼被批准用于复发性难治性环境中的套细胞淋巴瘤(MCL)和华氏巨球蛋白血症(Davids等人(2014)Future Oncol.,10:957-67)。在一些情况下，B细胞受体(BCR)信号传导途径的异常激活是潜在的B细胞恶性肿瘤(如MCL和CLL)的主要机制，借此慢性BTK信号传导可以通过促进B细胞存活和异常激活的核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)引发磷酸化级联反应。因此，采用TEC家族激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的现有方法被用于治疗B细胞恶性肿瘤。
所提供的发现表明，在涉及T细胞(如涉及施用过继T细胞疗法)的方法中的所述抑制剂的组合疗法实现所述T细胞疗法的改善的功能。在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，工程化T细胞的施用)与所述激酶抑制剂(例如BTK抑制剂和/或ITK抑制剂(如这种激酶的选择性和/或不可逆抑制剂))的组合改善或增强所述T细胞疗法的一种或多种功能和/或作用，如持久性、扩增、细胞毒性和/或治疗结果(例如杀伤肿瘤或其他疾病或靶细胞或者减轻肿瘤或其他疾病或靶细胞的负荷的能力)。在一些实施方案中，本文的观察结果表明TEC家族激酶抑制剂(如BTK抑制剂和/或ITK抑制剂，例如依鲁替尼)可能在较高浓度下抑制CART激活，而在较低浓度下增加激活。
在一些方面，尽管所述肿瘤或疾病或靶细胞本身对所述抑制剂、对靶向所述抑制剂对其具有选择性的激酶的抑制剂不敏感、有抗性和/或不然反应不足，和/或对TEC家族激酶的抑制有抗性，任选地对TEC家族激酶被所述抑制剂的抑制有抗性，和/或对另一种TEC家族激酶的抑制有抗性和/或对TEC家族激酶(任选地与由所述抑制剂靶向(或作为所述抑制剂的主要靶标)的一种或多种相比不同的TEC家族激酶)的另一种抑制剂有抗性，但也观察到此类作用。例如，在一些实施方案中，所述癌症对所述抑制剂或对TEC家族激酶被所述抑制剂和/或另一种抑制剂的抑制不敏感或已变得有抗性。
在一些实施方案中，所提供的方法、用途和组合疗法包括在如下情况下在已经施用所述抑制剂或另一种激酶抑制剂的受试者中施用所述激酶抑制剂与T细胞疗法(如CAR+T细胞)的组合，在所述情况中这样的受试者已被认为对于所述抑制剂是难治性的或有抗性，和/或对用先前施用这种抑制剂的治疗反应不足。在一些实施方案中，所述组合疗法、方法和用途包括在如下受试者中继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)与T细胞疗法(例如CAR+T细胞)的组合，所述受试者先前已接受所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用，但不存在T细胞疗法(或不与其组合)的情况下和/或不存在工程化T细胞疗法的情况下，和/或不存在针对与所提供的疗法、方法或用途所靶向的疾病或靶标相同的疾病或靶标的工程化T细胞疗法的情况下。
在一些实施方案中，所述方法和组合导致所述T细胞疗法的T细胞的T细胞功能或表型(例如固有T细胞功能性和/或固有T细胞表型)的改善。在一些方面，此类改善不会导致损害或不会导致实质上损害功能性(例如CAR-T功能性)的一种或多种其他所需的特性。在一些实施方案中，与所述抑制剂的组合在改善T细胞的一种或多种结果或功能属性的同时，不降低细胞被激活、分泌一种或多种所需细胞因子、扩增和/或持续存在的能力，例如如在体外测定中所测量的，与在其他方面相同的条件但不存在所述抑制剂的情况下培养的此类细胞相比较。
在一些实施方案中，所提供的实施方案包括在施用所述T细胞疗法之前开始施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)并继续进行直到开始施用所述T细胞疗法或在开始施用所述T细胞疗法之后开始施用所述激酶抑制剂。在一些方面，所提供的实施方案包括用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的延长治疗，如用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的延长预治疗。在一些方面，所提供的实施方案(例如涉及用激酶抑制剂例如依鲁替尼的延长治疗)可以帮助恢复T细胞功能、降低肿瘤负荷、破坏肿瘤微环境、减少骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的产生，从而减轻或克服肿瘤微环境(TME)特异性免疫抑制。在一些方面，未观察到BTK或磷脂酶C-γ2(PLCγ2)突变对某些细胞疗法的功效有不利影响。
在一些方面，所提供的实施方案包括在开始施用所述T细胞疗法之后继续、恢复和/或进一步施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些方面，所提供的实施方案(例如涉及在开始施用所述细胞疗法之后继续、恢复和/或进一步施用)可以降低所施用的细胞衰竭的可能性，降低毒性(如细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT))的风险，通过正交双重靶向降低抗性突变的风险，以及抑制肿瘤微环境(例如抵消肿瘤微环境中的免疫抑制活性)。在一些方面，所提供的实施方案的优点还包括根据所述受试者中的耐受性调节所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的给药或施用或者去除或中止所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用的能力。
在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)可以增强所施用的细胞的固有功能，从而导致改善的细胞性能。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的作用通过脱靶共价和非共价抑制来调节。在一些方面，抑制ITK可以导致Th1有偏向的极化。在一些方面，在患有CLL的受试者中施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)可以恢复T细胞功能性。在一些实施方案中，淋巴细胞增多作用可以破坏TME，并且可以有助于改善所施用的细胞对肿瘤的接近。在一些方面，可以通过限制急性髓样反应性来降低毒性(如细胞因子释放综合征(CRS))。在一些方面，组合施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)可以导致所施用的工程化细胞的增强的增殖、存活和/或扩增，并导致增强的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，可以在来自可能未展现出最佳活性的受试者细胞中观察到此类改善。在一些实施方案中，观察到用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的治疗增加了在连续刺激之后表达与工程化细胞的记忆样亚群相关的标记的细胞，并且观察到基因表达谱被修饰。此外，在与激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的组合疗法中观察到所施用的CAR+T细胞的增加的体内功效。由于依鲁替尼的抑制ITK的脱靶活性，因此在一些情况下依鲁替尼治疗已被认为对于T细胞活性是重要的。在一些方面，观察到与依鲁替尼治疗组合施用的T细胞的改善的活性和/或效应子功能为改善T细胞疗法提供了出乎意料的优点。在一些方面，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂(例如，依鲁替尼))的施用可以恢复T细胞功能性，改善所施用的T细胞疗法的效应子功能，限制肿瘤环境介导的免疫功能障碍，以及导致使用所述组合治疗的受试者的肿瘤负荷降低、肿瘤清除率改善和存活延长。
在一些实施方案中，所提供的方法可以增强CAR-T细胞疗法，这在一些方面可以改善患有如下癌症的受试者的治疗结果，所述癌症对其他疗法具有抗性或是难治性的，是侵袭性或高风险癌症，和/或与另一种类型的癌症相比，在没有所述抑制剂的情况下对所施用的CAR-T细胞疗法可能展现出相对较低的反应率。
在所提供的方法的一些实施方案中，与所施用的参考组合物的细胞相比，所施用的基因工程化细胞的一种或多种特性可以被改善或增加或更大，如在所述受试者中此类施用的细胞的增加或更长时间的扩增和/或持久性或用抗原再刺激后增加或更大的回忆反应。在一些实施方案中，所述增加可以是这种特性或特征与使用其他方法(例如，未在存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下孵育或施用)施用细胞疗法时的相同特性或特征相比的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、最后3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍增加。在一些实施方案中，在施用所述基因工程化细胞之后的一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或12个月内可以观察到或存在一种或多种此类特性或特征的增加。
所提供的方法包括施用可展现出T细胞调节作用的有效量的激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的特定剂量和/或给药方案可以增加或增强T细胞疗法(例如CAR-T细胞疗法)的T细胞功能。在一些方面，可以在施用所述T细胞疗法(例如CAR-T细胞疗法)之前开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，可以在从所述受试者获得用于基因工程化的细胞之前开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，基于特定方案在特定的时间段内继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)直到开始所述T细胞疗法(例如CAR-T细胞疗法)，如在所述T细胞疗法开始之后继续特定的时间段。在一些方面，长期施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，长期施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)(包括在若干个施用周期内)可以导致所施用的T细胞的改善的增殖、存活和/或激活。在一些方面，根据所提供的方法施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)可以通过恢复工程化T细胞的T细胞功能和活性增加CAR表达细胞用于治疗癌症(例如B细胞恶性肿瘤，如NHL，例如DLBCL)的活性，并且在一些方面还可能展现出其细胞自主抗肿瘤作用。在一些方面，由DLBCL受试者产生的CAR+T细胞在连续刺激之后在存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下展示出增加的细胞溶解功能。在一些方面，观察到所施用的CAR+T细胞对套细胞淋巴瘤(MCL)的抗肿瘤活性得到改善，并且在某些情况下观察到细胞因子释放综合征(CRS)的减轻。
在一些实施方案中，所提供的方法包括每天向受试者施用有效量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)以调节所述T细胞疗法的活性和/或功能。在一些实施方案中，所述有效量在为或约140mg/天与为或约560mg/天之间。在一些实施方案中，每天施用所述量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用进行一定的时间段，如通常大于一周，如为或大于一个月、为或大于两个月、为或大于三个月、为或大于四个月、为或大于五个月、为或大于六个月、为或大于七个月、或为或大于八个月。本文中描述了示例性的给药方案。
在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用工程化T细胞之前的时间开始的。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得有待工程化的T细胞之前(例如在所述受试者的单采术或白细胞单采术之前)开始的。在一些方面，在单采术或白细胞单采术之前至少7、6、5、4、3、2或1天开始施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用继续进行直到施用工程化T细胞之后。在一些实施方案中，如果所述受试者在所述细胞疗法的施用后没有展现出严重的毒性，则继续施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法或免疫调节药物方案相比，所提供的方法未导致高比率或可能性的毒性或毒性结果，或者降低毒性或毒性结果(如神经毒性(NT)、细胞因子释放综合征(CRS)或血液毒性(如嗜中性粒细胞减少症))的比率或可能性。
在一些实施方案中，所述方法不导致以下事件或不增加以下事件的风险：严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的CRP血浆水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出严重毒性结果(例如严重CRS或严重神经毒性)，如未展现出3级或更高级的神经毒性和/或未展现出严重CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。
在一些情况下，将激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)在其可以高效地/有效地促进或引发细胞时施用。在一些实施方案中，所提供的方法可以增强T细胞疗法(例如CAR-T细胞疗法)，这在一些方面可以改善治疗结果。在一些实施方案中，所述方法在其中在所述受试者中所述T细胞疗法的细胞展现出弱扩增、已变得衰竭、展现出降低或减小的持久性的受试者中和/或在患有如下癌症的受试者中尤其有利，所述癌症对其他疗法具有抗性或是难治性的和/或是侵袭性或高风险癌症。
在一些实施方案中，对已经接受T细胞疗法(例如CAR-T细胞)的施用的受试者监测所述受试者中(如在所述受试者的生物样品中，例如在所述受试者的血液中)疗法的T细胞的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，所提供的方法导致了这样的基因工程化细胞，在其所施用的受试者中具有增加的持久性和/或更好的效力。在一些实施方案中，在所述受试者中基因工程化细胞(如CAR表达T细胞)的持久性与通过替代方法(如涉及所述T细胞疗法的施用但不存在激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用的方法)实现的持久性相比更大。在一些实施方案中，持久性增加至少或约至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
在一些实施方案中，可以在施用至受试者之后对所施用细胞的持久性的程度或范围进行检测或定量。例如，在一些方面，使用定量PCR(qPCR)来评估在所述受试者的血液或血清或器官或组织(例如，疾病部位)中表达所述重组受体的细胞(例如，CAR表达细胞)的量。在一些方面，持久性被定量为每微克DNA(例如从样品获得的总DNA)中编码受体(例如，CAR)的DNA或质粒的拷贝，或者被定量为每微升样品(例如，血液或血清)中受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)的数量或每微升样品中外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数。在一些实施方案中，还可以进行检测表达所述受体的细胞的流式细胞术测定，其通常使用对所述受体具有特异性的抗体。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，所述功能细胞是例如能够结合至和/或中和所述疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的细胞，和/或能够诱导针对所述疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞。在任何此类实施方案中，与所述重组受体(例如CAR表达细胞)相关的另一种标记的表达范围或水平可以用于区分受试者体内的所施用细胞与内源细胞。
在一些实施方案中，将激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)施用一定的时间段以增强、增加或优化反应的持久性。在一些方面，所提供的方法是基于以下观察结果：在开始施用所述T细胞疗法之后3个月(如通常6个月)实现或处于完全缓解或完全反应(CR)的受试者更可能长期维持反应，如在结束治疗之后或在施用组合疗法后首次实现完全反应(CR)之后存活或无进展存活大于或大于约三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月。在一些方面，进行所述方法以在开始施用所述T细胞疗法之后例如按如所述的特定循环方案施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)持续一定的时间段，所述时间段是至少3个月，如至少四个月、至少五个月或至少六个月。在一些实施方案中，将激酶抑制剂(例如依鲁替尼)例如按所述的特定循环方案在开始施用所述T细胞疗法之后施用至少六个月或至少180天。在一些实施方案中，在所述时间段结束时，如果所述受试者展现出CR或如果在接受所述治疗(组合疗法)之后的缓解后所述受试者的所述疾病或病症已经进展或复发，则结束或停止激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些方面，可以在所述时间段(例如为或约6个月)结束时展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)的受试者中继续进行激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在其他方面，所述时间段是固定的持续时间，并且不进行激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的进一步施用。
在一些方面，与某些替代方法相比，所提供的方法和用途提供或实现了改善的或更持久的反应或功效，所述替代方法是例如如下方法，其包括将所述T细胞疗法或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)作为单一疗法施用或不作为如本文所述的组合疗法一起施用，如在所治疗的特定受试者组中。在一些实施方案中，所述方法凭借施用T细胞疗法(如包括用于过继细胞疗法(例如如T细胞疗法)的细胞(例如CAR表达T细胞)的组合物)与激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是有利的。在一些实施方案中，在具有不良预后的高风险患者(如患有高风险疾病(例如高风险NHL)的患者)中观察到此类反应。在一些方面，所述方法治疗患有某种形式的侵袭性和/或预后较差B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)(如对于标准疗法是复发性或难治性(R/R)的或具有不良预后的NHL)的受试者。在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或滤泡性淋巴瘤(FL)。
在一些实施方案中，至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％或更多的根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者实现完全反应(CR)。在一些实施方案中，所述受试者处于CR并且展现出微小残留病(MRD)。在一些实施方案中，所述受试者处于CR并且是MRD-。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者实现部分(PR)的客观反应。在一些实施方案中，在开始施用所述细胞疗法之后六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或一年，根据所提供的方法和/或用所提供的制品或组合物治疗的受试者的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多实现CR或PR。
在一些实施方案中，到开始施用所述细胞疗法之后三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月或更长时间，根据所提供的方法和/或用所提供的制品或组合物治疗的受试者的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多保持反应，如保持CR或客观反应(OR)。在一些实施方案中，这样的反应(如CR或OR)可持续至少三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月或更长时间，如在根据所提供的方法治疗的受试者的至少或约至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多中或在到三个月、四个月、五个月或六个月时实现CR的此类受试者中。在一些实施方案中，根据所提供的方法和/或用所提供的制品或组合物治疗的受试者的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多或者到三个月、四个月、五个月或六个月时实现CR的此类受试者存活或无进展存活大于或大于约六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月或更长时间。
还提供了用于工程化、制备和产生所述细胞的方法；含有所述细胞和/或抑制剂的组合物；以及用于例如根据所提供的组合疗法方法使用、产生和施用所述细胞和/或抑制剂的试剂盒和制品。
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本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.组合疗法
本文提供了用于治疗疾病或障碍(例如癌症或增殖性疾病)的组合疗法的方法，其包括向受试者施用1)激酶抑制剂和2)细胞疗法(例如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞))的组合疗法。还提供了工程化细胞(如T细胞(例如CAR表达T细胞)和TEC家族激酶(布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK))的抑制剂的方法和用途。在一些方面，所述抑制剂是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和/或IL-2诱导型T细胞激酶(ITK)的抑制剂，如依鲁替尼。在一些方面，所述抑制剂具有结构
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或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物(包括它们的组合物)，用于治疗患有癌症的受试者。
所述组合疗法(例如包括表达重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的工程化细胞和激酶抑制剂(例如依鲁替尼)或包含所述工程化细胞和/或所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的本文所述的组合物)可用于多种治疗、诊断和预防适应症。例如，所述组合可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如涉及将工程化细胞、激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和/或含有一者或两者的组合物施用至患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，将所述工程化细胞、激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和/或含有一者或两者的组合物以有效量施用以实现对所述疾病或障碍的治疗。用途包括所述工程化细胞、激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和/或含有一者或两者的组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者施用所述工程化细胞、激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和/或含有一者或两者的组合物来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法从而治疗所述受试者的所述疾病或病症或障碍。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有B细胞恶性肿瘤的受试者。在一些方面，所述方法用于治疗白血病或淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些方面，与某些替代方法相比，例如在所治疗的特定受试者组中，所述方法和用途提供或实现了改善的反应和/或更持久的反应或功效。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括施用特异性识别和/或靶向与疾病或障碍(例如癌症或增殖性疾病)相关的抗原的T细胞。还提供了含有包含所述T细胞疗法的组合物和/或包含所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的组合物的组合和制品如试剂盒，以及此类组合物和组合用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括1)向所述受试者施用T细胞疗法，所述T细胞疗法包括表达基因工程化细胞表面受体(例如重组抗原受体)的细胞，所述基因工程化细胞表面受体通常是嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，所述嵌合受体识别由所述B细胞恶性肿瘤(如白血病或淋巴瘤(例如NHL)和/或其所来源的细胞类型)表达、与其相关和/或其特有的抗原；以及2)向所述受试者施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。所述方法通常包括向所述受试者施用一个或多个剂量的所述细胞和多于一个剂量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些实施方案中，所提供的组合疗法方法包括向所述受试者施用治疗有效量的激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)和所述细胞疗法(如T细胞治疗(例如CAR表达T细胞))。在一些实施方案中，所提供的组合疗法方法包括在开始所述细胞疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)之前、之后、期间、过程中、同时、几乎同时、依序、与其并行和/或间歇地开始激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用。
在一些实施方案中，所提供的实施方案包括在施用所述T细胞疗法之前开始施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)并继续进行直到开始施用所述T细胞疗法或在开始施用所述T细胞疗法之后开始施用所述激酶抑制剂。在一些方面，所提供的实施方案包括用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的延长治疗，如用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的延长预治疗。在一些实施方案中，所述方法包括继续施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，继续施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)包括施用多个剂量的所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在开始所述T细胞疗法之后不继续或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述剂量时间表包括在开始所述T细胞疗法之前和之后施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述剂量时间表包括与施用所述T细胞疗法同时施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些方面，所述方法包括施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)，所述施用激酶抑制剂是在从所述受试者获得包含T细胞的样品例如以用于产生施用的T细胞疗法之前为或至少约3天或者最少或最少约3天开始的。在一些方面，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子引入包含T细胞的组合物中。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)按如下给药方案施用，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括：(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂，例如具有结构
Figure BDA0002857331390000401
的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐；以及(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍相关的抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，例如通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括：(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂，例如具有结构
Figure BDA0002857331390000402
的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐；(2)从所述受试者获得生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含基因工程化T细胞的组合物，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍相关的抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)；以及(3)向所述受试者施用包含一定剂量的基因工程化T细胞的自体T细胞疗法。在一些方面，所述激酶抑制剂的施用是按如下给药方案进行的，所述给药方案是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述化合物，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的所述化合物的施用。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括：(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂，例如具有结构
Figure BDA0002857331390000411
的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐；以及(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍相关的抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，所述T细胞疗法是通过以下过程产生的，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品并将编码CAR的核酸分子引入包含T细胞的组合物中，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天或者最少或最少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。
在一些方面，所提供的方法和用途包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂(例如具有结构
Figure BDA0002857331390000412
的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐)，其中所述受试者是用T细胞疗法治疗的候选者或将要用T细胞疗法对所述受试者进行治疗。在一些方面，所述T细胞疗法包括一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍相关的抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子引入包含T细胞的组合物中。在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天或者最少或最少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。在一些方面，所述方法和用途还包括向所述受试者施用所述T细胞疗法，例如包含从已引入编码CAR的核酸分子的受试者获得的T细胞的组合物。在一些实施方案中，从所述受试者获得样品包括获得如下样品，所述样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，从所述受试者获得样品也被称为单采术或白细胞单采术。
在一些方面，在开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。在一些方面，所述淋巴细胞清除疗法是或包括本文中例如在第I.C节中所述的任何淋巴细胞清除疗法。在一些方面，所述方法和用途包括在开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后并且在施用所述T细胞疗法之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，用于施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到开始淋巴细胞清除疗法。
在所述方法和用途的一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法期间中止或暂停所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，所述中止可以是暂时中止，例如施用的暂停或暂时停止。在所述方法和用途的一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用可以任选地在淋巴细胞清除疗法之后恢复。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法之后，进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)或恢复所述施用。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法和/或中止或暂停之前，开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的剂量量、频率、时间表或方案与淋巴细胞清除疗法和/或中止或暂停之后进一步施用或恢复施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的剂量量、频率、时间表或方案是相同的。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法和/或中止或暂停之前，开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的剂量量、频率、时间表或方案与淋巴细胞清除疗法和/或中止或暂停之后进一步施用或恢复施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的剂量量、频率、时间表或方案是不同的或与之相比是经修改的。
在一些方面，用于施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的给药方案包括施用所述激酶抑制剂直至开始淋巴细胞清除疗法，在淋巴细胞清除疗法期间中止施用所述激酶抑制剂，以及进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天，如至少15、30、60、90、120、150或180天。
在一些实施方案中，所述细胞疗法是过继细胞疗法。在一些实施方案中，所述细胞疗法是或包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)疗法、转基因TCR疗法或表达重组受体的细胞疗法(任选T细胞疗法)，所述表达重组受体的细胞疗法任选地是表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞疗法。在一些实施方案中，所述疗法靶向CD19或是B细胞靶向疗法。在一些实施方案中，所述细胞和用于施用所述细胞的剂量方案可以包括本文所述的任何一种。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如TEC家族激酶抑制剂)抑制TEC家族的一种或多种激酶，包括布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、IL-2诱导型T细胞激酶(ITK)、tec蛋白酪氨酸激酶(TEC)、染色体X蛋白(BMX)非受体酪氨酸激酶(也称为上皮和内皮酪氨酸激酶；ETK)中的骨髓酪氨酸激酶基因以及TXK酪氨酸激酶(TXK)。在一些实施方案中，所述抑制剂是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞和用于施用所述抑制剂的剂量方案可以包括本文所述的任何一种。
在一些实施方案中，所述免疫疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)和抑制剂是作为用于向所述受试者施用的药物组合物来提供。在一些实施方案中，药物组合物含有治疗有效量的用于组合疗法的一种或两种药剂，例如，用于过继细胞疗法的T细胞和如所述的抑制剂。在一些实施方案中，所述药剂被配制用于以单独的药物组合物来施用。在一些实施方案中，本文提供的任何药物组合物可以按适合于每种施用途径的剂型来配制。
在一些实施方案中，将所述组合疗法(其包括施用所述免疫疗法(例如包括工程化细胞的T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)和所述抑制剂)施用至患有要治疗的疾病或病症(例如癌症)或有风险患上所述疾病或病症(例如癌症)的受试者或患者。在一些方面，所述方法治疗所述疾病或病症(例如改善其一种或多种症状)，如通过减少在表达由免疫疗法或免疫治疗剂识别(例如由工程化T细胞识别)的抗原的癌症中的肿瘤负荷来治疗。
在一些实施方案中，所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性或炎性疾病、或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。示例性抗原(其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原)包括本文所述的任何抗原。在特定实施方案中，在组合疗法的工程化细胞上表达的重组受体(包括嵌合抗原受体或转基因TCR)特异性结合至与所述疾病或病症相关的抗原。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤，如实体瘤、淋巴瘤、白血病、血液肿瘤、转移性肿瘤或者其他癌症或肿瘤类型。
在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至患有特定B细胞恶性肿瘤的受试者。所治疗的B细胞恶性肿瘤可以是其中抗原的表达与所述B细胞恶性肿瘤的病因相关和/或参与所述B细胞恶性肿瘤的病因(例如引起、加重或以其他方式参与所述B细胞恶性肿瘤)的任何一种。示例性B细胞恶性肿瘤可以包括与细胞的恶性肿瘤或转化相关的疾病或病症(例如癌症)。本文描述了示例性抗原，其包括与可进行治疗的各种B细胞恶性肿瘤相关的抗原。在特定实施方案中，所述嵌合抗原受体特异性结合至与所述疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知的B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原由B细胞(包括人B细胞)表达或在B细胞上表达。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，所述抗原是CD19并且所述嵌合抗原受体特异性结合CD19。在一些实施方案中，所述CD19抗原是人CD19。
在一些实施方案中，要治疗的B细胞恶性肿瘤包括白血病和淋巴瘤，例如急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B))。
在一些实施方案中，所述方法包括通过施用抗原受体表达细胞(例如CAR表达细胞)和激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)治疗患有淋巴瘤或白血病(如非霍奇金淋巴瘤(NHL))的受试者。在一些实施方案中，在施用重组受体表达细胞(例如CAR表达细胞)之前，如在开始施用重组受体表达细胞(例如CAR表达细胞)之前开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些实施方案中，NHL可以基于卢加诺(Lugano)分类进行分期(参见例如，Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。在一些情况下，各阶段通过罗马数字I至IV(1-4)来描述，并且影响淋巴系统外器官(结节外器官)的局限期(I或II)淋巴瘤指示为E。I期表示涉及一个结节或一组相邻结节，或不涉及结节的单一结节外病灶(IE)。2期表示涉及膈同侧的两个或更多个结节组，或者依据结节程度具有有限的连续结节外受累的I期或II期(IIE)。III期表示涉及膈两侧的结节或膈上方的结节且脾脏受累。IV期表示涉及另外的非连续淋巴外受累。另外，“巨大肿块(bulkydisease)”可以用于描述胸腔中的大型肿瘤，特别是对于II期肿瘤。疾病程度是通过用于亲嗜性(avid)淋巴瘤的正电子发射断层成像(PET)-计算机断层成像(CT)以及用于非亲嗜性组织学的CT来确定。
在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。在一些实施方案中，所述受试者的ECOG状态小于或等于1。ECOG体能状态量表描述患者在其自理能力、日常活动和体能(例如，步行、工作等)方面的机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0指示，受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现体力活动中的一些限制，但是所述受试者能完全走动。在一些方面，ECOG体能状态为2的患者能大于50％走动。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如，
Figure BDA0002857331390000451
等人,(1993)Br J Cancer 67(4)773-775。反映ECOG体能状态的标准描述于下表1中：
Figure BDA0002857331390000461
在一些实施方案中，所述受试者患有或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤或双/三打击分子亚型的淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是双重命中淋巴瘤，其特征为存在MYC(髓细胞瘤病致癌基因)、BCL2(B细胞淋巴瘤2)和/或BCL6(B细胞淋巴瘤6)基因重排(例如，易位)。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是三打击淋巴瘤，其特征为存在MYC、BCL2和BCL6基因重排；参见例如，Aukema等人,(2011)Blood 117:2319-2331。在此类实施方案的一些方面，所述受试者是ECOG 0-1。在多个方面中，所述疗法被指示用于此类受试者和/或所述说明书指示施用这个群体内的受试者。在一些实施方案中，基于2016 WHO标准(Swerdlow等人,(2016)Blood 127(20):2375-2390)，可以将双/三打击淋巴瘤视为高级B细胞淋巴瘤，其具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学(双/三打击)。
在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者，所述受试者对于使用细胞疗法(例如CAR+T细胞)的治疗是或可能是或被预测为是较差反应者，和/或所述受试者不反应，可能不反应和/或被预测为不反应或在某一时间内和/或在某一程度上不反应。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者，所述受试者如在开始施用所述细胞疗法后1个月内、在两个月内或在三个月内不展现或不可能展现或被预测为不展现完全反应或总体反应。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者，所述受试者如在施用所述细胞疗法后1个月、两个月或三个月内展现或可能展现或被预测为展现疾病进展(PD)。在一些实施方案中，基于如此治疗或先前用所述细胞疗法治疗的多名类似情况的受试者，受试者可能或被预测为不展现反应或某一反应。
在一些实施方案中，所提供的方法包括治疗特定的受试者组或亚组，例如，被鉴定为患有高风险疾病(例如，高风险NHL)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有某种形式的侵袭性和/或预后较差B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)(如对于标准疗法是复发性或难治性(R/R)具有较差预后的NHL)的受试者。在一些情况下，对于所述疗法所指示的疾病和/或患者群体，对可用疗法、对护理标准、或对参考疗法的总反应率(ORR)小于40％和/或完全反应(CR)小于20％。在一些实施方案中，在化疗难治性DLBCL中，采用参考或可用治疗或护理标准疗法的ORR为约26％，并且CR为约8％(Crump等人Outomes in refractory aggressivediffuse large B-cell lymphoma(DLBCL):Results from the international SCHOLARstudy.ASCO 2016[摘要7516])。在一些方面，所提供的方法、组合物、用途和制品实现改善的且优越的对可用疗法的反应。
在一些实施方案中，用于治疗本文所述受试者的方法和用途包括例如基于特定疾病类型、诊断标准、先前治疗和/或对先前治疗的反应，选择或鉴定特定的受试者组或亚组。在一些实施方案中，所述方法包括治疗在用一种或多种先前疗法治疗后在缓解后复发或变得对于所述一种或多种先前疗法难以治疗的受试者；或对一种或多种先前疗法(例如，一个或多个标准治疗线，包括本文所述的那些)是复发性或难治性(R/R)的受试者。
在一些实施方案中，所述受试者已经经受多于一种、两种、三种、四种、五种或六种先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经经受一种先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经经受约两至四种先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经经受约五至六种先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经经受多于六种先前疗法。
在一些实施方案中，在施用表达所述重组受体的细胞之前，所述受试者先前已经用靶向所述B细胞恶性肿瘤(例如，NHL)的疗法或治疗剂来治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用细胞疗法(例如，CAR+T细胞)治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)来治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用标准疗法治疗后具有较差预后和/或一个或多个先前治疗线已失败。在一些实施方案中，所述受试者已经进行治疗或先前已经接受除了淋巴细胞清除疗法以外的至少或约至少或约1、2、3、4、5、6或7种用于治疗NHL的其他疗法。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用化学疗法或放射疗法治疗。在一些方面，所述受试者对于其他疗法或治疗剂是难以治疗的或无反应的。在一些实施方案中，所述受试者例如在用另一种疗法或治疗性干预(包括化学疗法或放射)治疗后患有持续性或复发性疾病。
在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至在先前治疗中已进展的受试者。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至已经对先前疗法停止反应的受试者。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至在先前治疗之后的缓解后已复发的受试者。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至对先前治疗难治性的受试者。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至对先前疗法具有小于最佳反应(例如，完全反应、部分反应或疾病稳定)的受试者。
在一些实施方案中，所述受试者对最后的先前疗法是难治性的。在一些实施方案中，所述受试者对于最后的先前疗法已复发。如果受试者对最后的先前疗法实现小于部分反应，则状态是难治性的。在一些实施方案中，所述受试者具有先前化疗。在一些实施方案中，所述受试者对所述先前化疗是化疗难治性的。在一些实施方案中，所述受试者对先前疗法是化疗敏感的。化疗难治性的状态是受试者实现对于含最后的化疗的方案的疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)，或在自体干细胞移植之后小于12个月复发。否则，状态为化疗敏感的。
在一些实施方案中，所述方法可以用于治疗B细胞恶性肿瘤或血液恶性肿瘤，并且特别是如下此类恶性肿瘤，其中对单独的或不共同作为如本文提供的组合疗法的T细胞疗法(如CAR-T细胞)或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的治疗的反应(例如完全反应)并不完全令人满意或与其他B细胞恶性肿瘤的类似治疗相比或在其他受试者中相对较低。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是这样的B细胞恶性肿瘤，其中当单独施用或以另一种组合(其不同于如本文提供的组合疗法和/或不是与基于激酶抑制剂的疗法(例如基于依鲁替尼的疗法)的组合)施用时，用免疫疗法或免疫治疗剂(如包括用于过继细胞疗法的细胞(例如CAR表达T细胞)的组合物)的治疗在如此治疗的受试者的小于或小于约60％、小于约50％或小于约45％中导致CR。在一些实施方案中，所述受试者和/或所述B细胞恶性肿瘤是这样的受试者和/或B细胞恶性肿瘤，其对用所述抑制剂和/或用激酶抑制剂疗法(例如依鲁替尼疗法)的治疗无反应和/或已被认为是难治性的或有抗性，是侵袭性或高风险癌症和/或此外具有指示用所述抑制剂和/或激酶抑制剂疗法(例如依鲁替尼疗法)治疗后不良预后和/或不良结果的一种或多种特征(例如标记)。
在一些实施方案中，本文提供的组合疗法用于患有癌症的受试者中，其中在所提供的组合疗法时，如在施用所述T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)时和在施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时，所述受试者对用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗没有反应和/或被认为对所述先前治疗是难治性的或有抗性。在一些实施方案中，所提供的与所述抑制剂和免疫疗法的组合疗法是在患有疾病或病症(例如B细胞恶性肿瘤)的受试者中进行的，其中在开始所述组合疗法时，所述受试者患有如下疾病，所述疾病在施用这种先前的抑制剂但不存在包括T细胞(例如CAR-T细胞)的疗法后进展，如所述受试者具有疾病进展(PD)作为最佳的反应；或者所述疾病在先前的反应之后进展。
在一些实施方案中，所提供的与激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和T细胞疗法(例如CAR-T细胞)的组合疗法是在患有疾病或病症(例如B细胞恶性肿瘤)的受试者中进行的，其中在开始所提供的组合疗法时，所述受试者在先前接受所述抑制剂和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后具有小于完全反应(CR)的反应，持续至少6个月。
在一些方面，用所提供的组合疗法治疗的受试者正展现出或被鉴定为展现出所述疾病或病症的一种或多种高风险特征和/或展现出侵袭性疾病或与不良预后或结果相关的疾病。在一些方面，B细胞恶性肿瘤(如淋巴瘤或白血病，例如CLL或SLL)的高风险特征包括指示所述疾病的严重程度或预后的一种或多种分子标记(如一种或多种遗传标记)的存在(参见例如Parker和Strout(2011)Discov.Med.,11:115-23)。在一些实施方案中，所述受试者患有B细胞恶性肿瘤，所述B细胞恶性肿瘤具有或被鉴定为具有一种或多种细胞遗传学异常，如两个或三个或更多个染色体异常(如17p缺失、11q缺失、12三体和/或13q缺失)，例如如通过荧光原位杂交(FISH)所检测的。在一些实施方案中，所述受试者患有B细胞恶性肿瘤，所述B细胞恶性肿瘤具有或被鉴定为具有一个或多个基因突变(如TP53突变、NOTCH1突变、SF3B1突变和BIRC3突变)，如使用基于单核苷酸阵列(SNP)-阵列的方法、变性高效液相色谱法(DHPLC)、酵母中分离的等位基因的功能分析(FASAY)或通过测序(包括直接测序或下一代测序方法)评估的。在一些实施方案中，所述受试者患有B细胞恶性肿瘤，所述B细胞恶性肿瘤具有或被鉴定为具有未突变的免疫球蛋白重链可变区(IGHV)。IGH可变区的突变状态具有预后价值，其中未突变(与种系相比，<2％)与侵袭性疾病相关(Hamblin,BestPract.Res.Clin.Haematol.20:455-468(2007))。如通过流式细胞术所评估的CD38和ZAP70表达被认为是IGH突变状态的替代物。在一些实施方案中，所述受试者患有展现出高风险特征的B细胞恶性肿瘤，所述高风险特征包括3个或更多个染色体异常、17p缺失、TP53突变和/或未突变的IGHV。
在一些实施方案中，本文提供的组合疗法用于患有癌症的受试者中，其中所述受试者和/或所述癌症对BTK的抑制有抗性或包含对被所述抑制剂抑制有抗性的细胞群。在一些实施方案中，所述受试者在靶激酶(如BTK)中或在靶激酶的途径的下游分子中展现出突变，从而使所述受试者对用所述抑制剂和/或BTK抑制剂疗法的治疗有抗性。使所述受试者对BTK抑制剂或TEC家族激酶的另一种抑制剂的治疗有抗性或是难治性的突变是已知的(参见例如Woyach等人(2014)N Engl J.Med.370:2286-94和Liu等人(2015)Blood,126:61-8)。在一些实施方案中，本文提供的组合疗法用于患有癌症的受试者中，其中所述受试者和/或所述癌症包含编码BTK的核酸中的突变或破坏，如能够减少或预防由所述抑制剂(例如依鲁替尼)抑制BTK的突变。在一些实施方案中，所述受试者含有BTK的C481S突变。在一些实施方案中，本文提供的组合疗法用于患有癌症的受试者中，其中所述受试者和/或所述癌症包含编码PLCγ2的核酸中的突变或破坏，如可导致自主信号传导的功能突变的增加。在一些实施方案中，所述受试者含有PLCγ2中的R665W和/或L845F突变。
在一些情况下，在用于治疗癌症的一种或多种先前疗法(如至少两种或三种先前疗法)的治疗后，所述受试者未实现完全反应(CR)，患有疾病稳定或疾病进展和/或在对一种或多种先前疗法的反应后复发。在一些实施方案中，至少一种先前疗法是用所述抑制剂或BTK抑制剂疗法(如依鲁替尼)的先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者正在接受所述抑制剂或BTK抑制剂疗法持续至少六个月，其中反应小于CR，和/或展现出高风险特征(如复杂的细胞遗传学异常(3个或更多个染色体异常)、17p缺失、TP53突变或未突变的IGHV)。
在一些实施方案中，某些癌症(如NHL，例如高风险或侵袭性NHL(如DLBCL)和/或慢性淋巴细胞白血病(CLL))可能与固有T细胞功能性的缺陷或降低相关，所述固有T细胞功能性在一些情况下受到疾病本身的影响。例如，许多癌症的发病机制(如CLL和NHL，例如DLBCL)可能与免疫缺陷从而导致促进肿瘤生长和免疫逃逸(如由于例如由肿瘤微环境中的一种或多种因子驱动的T细胞的免疫抑制所致)相关。在一些情况下，减轻从此类患者的癌症获得的固有T细胞缺陷与过继细胞疗法组合使用可以提供对过继T细胞疗法(例如CAR-T细胞疗法)的更有效的反应。
在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗受试者的癌症，其中与参考T细胞群或参考或阈值水平(例如来自未患有或怀疑患有癌症的受试者(如来自健康或正常受试者)的T细胞)相比，此类受试者的T细胞显示或已经被观察到显示指示T细胞功能、健康或活性的因子的水平降低。在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗如下受试者，所述受试者被鉴定为患有高风险NHL和/或侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)。例如，如本文所示，在存在示例性BTK抑制剂依鲁替尼的情况下，从患有DLBCL的受试者工程化的T细胞展现出更大的T细胞功能活性，这表明在存在所述抑制剂的情况下T细胞的功能被增强。在所提供的方法的一些实施方案中，所施用的工程化T细胞对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，所述受试者患有DLBCL。在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)的受试者。在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗患有小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)的受试者。
本文所提供的方法包括用于治疗CLL的方法，所述CLL是特征在于在血液、骨髓和淋巴组织中逐渐积累克隆来源的B淋巴细胞(例如CD19+)的血液恶性肿瘤。尽管被认为是与CLL相同的疾病，但在一些情况下，小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)用于指以淋巴结病(在淋巴结中发现的癌细胞)为特征时的疾病，而在CLL中癌细胞主要发现于血液和骨髓中。出于本文的目的，除非另有说明，否则对CLL的提及可以包括SLL。在一些实施方案中，CLL包括已经患有根据IWCLL标准(Hallek(2008)Blood,111:5446-5456)记录的CLL、可测量的疾病(例如淋巴细胞增多>5x109/L，可测量的淋巴结、肝和/或脾肿大)的受试者。在一些实施方案中，SLL包括在经诊断患有可测量的疾病时患有淋巴结病和/或脾肿大并且外周血中<5x109个CD19+CD5+克隆B淋巴细胞/L(<5000/μL)的受试者，如通过至少一个病灶(其活检证实为SLL)的最大横径>1.5cm所确定的。如一些研究中所报告，进行性CLL的患者通常具有不良预后，其中总存活期(OS)小于1年(Jain等人(2016)Expt.Rev.Hematol.,9:793-801)。
用BTK抑制剂疗法、并且尤其是依鲁替尼治疗CLL是目前批准用于CLL患者的一线疗法。尽管部分反应(PR)可以维持长的持续时间，但研究发现约25％的先前治疗的CLL患者中止依鲁替尼(Jain等人(2015)Blood,125:2062-2067；Maddocks(2015)JAMA Oncol.,1:80-87；Jain等人(2017)Cancer,123:2268-2273)。在一些情况下，依鲁替尼的中止是由于CLL进展或Richter转化所致。因疾病进展(PD)中止依鲁替尼的大多数患者是具有高风险特征(如del(17p)(17p缺失)、复杂的核型或细胞遗传学异常和未突变的免疫球蛋白重链可变区(IGHV))的患者。此外，BTK或下游效应子磷脂酶Cγ2(PLCγ2)中的突变可能在依鲁替尼治疗期间出现，并且与依鲁替尼抗性相关并最终复发(Woyach等人(2014)N.Engl.J.Med.,370:2286-2294)。在关于依鲁替尼复发的CLL患者的87％中观察到此类突变。此类受试者需要替代疗法。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)在T细胞疗法(例如CAR-T细胞)之前开始施用。在一些方面，与开始施用T细胞疗法(例如CAR-T细胞)并行和/或在其之后继续施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)和/或进一步施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些方面，将所述抑制剂每天施用。在一些方面，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用(如每天施用)是在开始施用T细胞疗法(例如CAR-T细胞)之前开始的，并且继续进行直至预定的天数。在一些方面，预定的天数是在开始施用所述T细胞疗法之后的预定天数。在一些实施方案中，施用(如每天施用)所述抑制剂直到所述受试者的血液或疾病部位中所述T细胞疗法(CAR-T细胞)的水平在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)后达到水平峰值或最大值(例如Cmax)时，或者直到所述受试者的血液或疾病部位中所述T细胞疗法(CAR-T细胞)的水平在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)后达到水平峰值或最大值(例如Cmax)之后的时间。在一些方面，所述抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后继续进行至少或至少约14天、至少或至少约30天、至少或至少约60天、至少或至少约90天、至少或至少约120天或至少或至少约180天。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述T细胞疗法(例如CAR-T细胞)之后继续进行至少或至少约或约90天。在一些方面，在终止所述抑制剂的施用时，观察到所述受试者中所述T细胞疗法的持久性。在一些实施方案中，在终止所述抑制剂的施用时，可以对所述受试者进行评价以评估所述受试者是否正在从所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用中获益。在一些实施方案中，在终止所述抑制剂的施用时，对所述受试者进行评价以评估所述受试者是否已经实现反应或指示反应(如在一些实施方案中为CR)的特定程度或结果。在一些此类实施方案中，如果受试者已经实现CR或指示反应或指示CR或其他结果的可能性的其他结果，则所提供的方法、组合物、制品或用途允许指定或包括所述抑制剂或其施用的中止。在一些这样的实施方案中，如果所述受试者尚未实现CR，则所提供的方法允许继续施用所述抑制剂。因此，在一些方面，所提供的方法和其他实施方案避免或减少所述抑制剂的延长或过度延长的施用。在一些方面，这种延长的施用原本可能导致一种或多种不期望的结果或增加一种或多种不期望的结果的可能性，所述一种或多种不期望的结果是例如对于正在施用所述疗法的受试者(如患者)的副作用或生活质量的破坏或降低。在一些方面，施用的所设定的预定时间段(如最短的时间段)可以增加患者依从性的可能性或所述抑制剂将按说明书或根据所述方法(特别是在每日施用的情况下)进行施用的可能性。
在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性的受试者和/或癌症和/或所述组合疗法包含对被所述抑制剂抑制有抗性的细胞群。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者和/或癌症，所述受试者和/或癌症包含编码BTK的核酸中的突变，任选地其中所述突变能够减少或防止BTK被所述抑制剂和/或被依鲁替尼的抑制，其中所述突变是C481S。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者和/或癌症，所述受试者和/或癌症包含编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者和/或癌症，其中在开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时以及在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的治疗是难治性的。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者和/或癌症，其中在开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时以及在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者和/或癌症，其中在开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时以及在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。
在一些实施方案中，施用所述组合疗法(i)所述受试者和/或所述癌症(a)对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性和/或(b)包含对被所述抑制剂抑制有抗性的细胞群；(ii)所述受试者和/或所述癌症包含编码BTK的核酸中的突变，所述突变能够减少或防止BTK被所述抑制剂和/或被依鲁替尼抑制，任选地其中所述突变是C481S；(iii)所述受试者和/或所述癌症包含编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845F；(iv)在开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时以及在开始施用包含T细胞的组合物时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗是难治性的；(v)在开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时以及在开始施用包含T细胞的组合物时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展；和/或(vi)在开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)时以及在开始施用包含T细胞的组合物时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。在一些实施方案中，所述受试者是先前已经接受激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用，随后中止用所述激酶抑制剂治疗的受试者。
在一些实施方案中，所述方法、用途和制品包括或用于治疗受试者，包括例如基于特定疾病类型、诊断标准、先前治疗和/或对先前治疗的反应选择或鉴定特定的受试者组或亚组(如本文所述的任何受试者组)。在一些实施方案中，所述方法包括治疗在用一种或多种先前疗法治疗后在缓解后复发或变得对于所述一种或多种先前疗法难以治疗的受试者；或对一种或多种先前疗法(例如，一个或多个标准治疗线，例如细胞疗法(例如CAR+T细胞))是复发性或难治性(R/R)的受试者。在一些实施方案中，所述方法包括治疗患有以下疾病的受试者：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)非特指型(NOS；从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B))、EBV阳性DLBCL或EBV阳性NOS。在一些实施方案中，所述方法包括治疗具有小于1(如0-1)的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)的受试者。在一些实施方案中，所述方法治疗通常对疗法或特定参考疗法反应差的DLBCL患者或其受试者的预后不良群体，如具有一种或多种(如两种或三种)染色体易位(如所谓的“双打击”或“三打击”淋巴瘤，其是具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤；具有易位MYC/8q24基因座，通常与t(14；18)(q32；q21)bcl-2基因或/和BCL6/3q27染色体易位组合；参见例如，Xu等人(2013)Int JClin Exp Pathol.6(4):788-794)的预后不良群体，和/或已经复发、任选地在12个月内复发的预后不良群体，和/或已被认为是化疗难治性的预后不良群体。
在一些实施方案中，所述受试者患有DLBCL，其是生发中心样(GCB)DLBCL。在一些实施方案中，所述受试者患有非生发中心样(非GCB)DLBCL。在一些实施方案中，所述受试者患有双打击淋巴瘤(DHL)。在一些实施方案中，所述受试者患有三打击淋巴瘤(THL)。在一些实施方案中，所述受试者对于指示用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的治疗的反应性的基因的表达是阳性的。在一些实施方案中，所述受试者对所述基因的表达是阴性的。参见Blood 2017 130:4118。
在一些实施方案中，抗原受体(例如CAR)特异性结合至与所述疾病或病症相关(如与NHL相关)的靶抗原。在一些实施方案中，与所述疾病或病症相关的抗原选自CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，所述CD19抗原是人CD19。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞疗法和激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)施用至患有或有风险患上或怀疑患有B细胞恶性肿瘤的受试者。
在一些实施方案中，所述方法包括将细胞施用至被选择或被鉴定为具有NHL的某一预后或风险的受试者。非霍奇金淋巴瘤(NHL)可以是多变的疾病。一些患有NHL的受试者可以在不进行治疗的情况下存活，而其他受试者可能需要立即干预。在一些情况下，可以将患有NHL的受试者分类为可以告知疾病预后和/或推荐的治疗策略的组。在一些情况下，这些组可能是“低风险”、“中度风险”、“高风险”和/或“极高风险”，并且可以根据多种因素将患者如此分类，所述因素包括但不限于遗传异常和/或形态或身体特征。在一些实施方案中，基于NHL的风险对根据所述方法和/或用所述制品或组合物治疗的受试者进行分类或鉴定。在一些实施方案中，所述受试者是具有高风险NHL的受试者。
在一些实施方案中，要治疗的受试者包括患有如下疾病的受试者组：侵袭性NHL，特别是患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)非特指型(NOS；从头的和从惰性转化的)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B))、EBV阳性DLBCL、EBV阳性NOS、或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(“双打击”或“三打击”淋巴瘤)。在一些实施方案中，所述受试者的疾病已经复发或对至少两个先前治疗线是难治性的。在一些实施方案中，所述先前疗法包括靶向CD20的药剂和/或蒽环类药物。在一些实施方案中，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。在一些实施方案中，所述受试者在筛选时的ECOG得分为0-1。在一些实施方案中，根据卢加诺分类(Cheson,2014)，所述受试者患有正电子发射断层扫描(PET)阳性疾病。在一些实施方案中，所述受试者可以任选地先前已经用同种异体干细胞移植(SCT)治疗。
在一些实施方案中，所述受试者是成人。在一些实施方案中，所述受试者是男性。在一些实施方案中，所述受试者是女性。在一些实施方案中，所述受试者在向他们施用所述组合疗法时(例如，在向他们施用所述细胞疗法时)为至少40岁。在一些实施方案中，所述受试者在向他们施用所述组合疗法时(例如，在向他们施用所述细胞疗法时)小于40岁。在一些实施方案中，所述受试者在向他们施用所述组合疗法时(例如，在向他们施用所述细胞疗法时)为约40-65岁。在一些实施方案中，所述受试者在向他们施用所述组合疗法时(例如，在向他们施用所述细胞疗法时)为至少65岁。
在所提供的方法的一些实施方案中，与所施用的参考组合物的细胞相比，所施用的基因工程化细胞的一种或多种特性可以被改善或增加或更大，如在所述受试者中此类施用的细胞的增加或更长时间的扩增和/或持久性或用抗原再刺激后增加或更大的回忆反应。在一些实施方案中，所述增加可以是这种特性或特征与施用参考细胞组合物时的相同特性或特征相比的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、最后3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍增加。在一些实施方案中，在施用所述基因工程化细胞之后的一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或12个月内可以观察到或存在一种或多种此类特性或特征的增加。
在一些实施方案中，参考细胞组合物可以是来自未患有或不被怀疑患有所述癌症的受试者的血液的T细胞的组合物，或者是在相同或基本相同的条件(不同之处是没有在存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下孵育或施用)下获得的、分离的、生成的、产生的、孵育的和/或施用的T细胞群。在一些实施方案中，所述参考细胞组合物含有基本相同的基因工程化细胞，包括相同重组受体(例如CAR)的表达。在一些方面，对此类T细胞进行相同或基本相同的处理，如类似地制造、类似地配制、以相同或大致相同的剂量量和其他相似因素施用。
A.激酶抑制剂的施用
所提供的组合疗法方法、组合物、组合、试剂盒和用途包括激酶抑制剂(如TEC家族激酶抑制剂，例如依鲁替尼)的施用，所述激酶抑制剂可以在施用所述T细胞疗法(例如施用表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞)之前、之后、期间、同时或几乎同时、依序和/或间歇地施用，和/或所述激酶抑制剂的施用可以在施用所述T细胞疗法之前开始并继续进行直到开始施用所述T细胞疗法或在开始施用所述T细胞疗法之后开始。
在一些实施方案中，所述组合疗法中的激酶抑制剂是酪氨酸激酶(如TEC家族激酶的成员)的抑制剂，在一些情况下，所述激酶参与细胞因子受体、淋巴细胞表面抗原、异三聚体G蛋白偶联受体和整联蛋白分子的细胞内信号传导机制。在一些实施方案中，所述组合疗法中的激酶抑制剂是TEC家族激酶的一个或多个成员的抑制剂，所述激酶包括布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、IL-2诱导型T细胞激酶(ITK)、tec蛋白酪氨酸激酶(TEC)、染色体X蛋白(BMX)非受体酪氨酸激酶(也称为上皮和内皮酪氨酸激酶；ETK)中的骨髓酪氨酸激酶基因以及TXK酪氨酸激酶(TXK)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是IL-2诱导型T细胞激酶(ITK)抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(如依鲁替尼)既是BTK抑制剂又是ITK抑制剂。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是一种或多种TEC家族激酶的不可逆抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是BTK的不可逆抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是ITK的不可逆抑制剂。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制BTK，其中半最大抑制浓度(IC50)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂与BTK结合，其中平衡解离常数(Kd)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂对BTK的抑制常数(Ki)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制ITK，其中半最大抑制浓度(IC50)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂与ITK结合，其中平衡解离常数(Kd)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂对ITK的抑制常数(Ki)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制BTK和ITK二者。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂抑制BTK和ITK二者，其中半最大抑制浓度(IC50)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂与BTK和ITK二者结合，其中平衡解离常数(Kd)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂对BTK和ITK二者的抑制常数(Ki)小于或小于约1000nM、小于或小于约900nM、小于或小于约800nM、小于或小于约700nM、小于或小于约600nM、小于或小于约500nM、小于或小于约400nM、小于或小于约300nM、小于或小于约200nM、小于或小于约100nM、小于或小于约90nM、小于或小于约80nM、小于或小于约70nM、小于或小于约60nM、小于或小于约50nM、小于或小于约40nM、小于或小于约30nM、小于或小于约20nM、小于或小于约10nM、小于或小于约9nM、小于或小于约8nM、小于或小于约7nM、小于或小于约6nM、小于或小于约5nM、小于或小于约4nM、小于或小于约3nM、小于或小于约2nM、小于或小于约1nM、小于或小于约0.9nM、小于或小于约0.8nM、小于或小于约0.7nM、小于或小于约0.6nM、小于或小于约0.5nM、小于或小于约0.4nM、小于或小于约0.3nM、小于或小于约0.2nM、或小于或小于约0.1nM。
在一些实施方案中，使用体外测定来测量或确定IC50、Kd和/或Ki。用于评估或定量或测量如本文所述的蛋白酪氨酸激酶抑制剂的活性的测定是本领域已知的。此类测定可以在体外进行，并且包括用于评估药剂抑制特定生物或生化功能的能力的测定。在一些实施方案中。在一些实施方案中，可以进行激酶活性研究。蛋白酪氨酸激酶催化末端磷酸基团从三磷酸腺苷(ATP)转移至激酶本身或另一种蛋白质底物的酪氨酸残基的羟基基团。在一些实施方案中，可以通过在存在ATP的情况下将激酶与所述底物(例如抑制剂)一起孵育来测量激酶活性。在一些实施方案中，可以通过包括比色检测、放射性检测和荧光检测的若干种报告系统评估特定激酶对磷酸化底物的测量。(Johnson,S.A.&T.Hunter(2005)Nat.Methods 2:17。)在一些实施方案中，可以例如通过使用竞争配体结合测定来评估抑制剂对一种或多种特定激酶的亲和力(Ma等人,Expert Opin Drug Discov.2008年6月；3(6):607-621)。从这些测定中，可以计算半最大抑制浓度(IC50)。IC50是将生物或生化反应或功能降低至最大值的50％的浓度。在一些情况下，如在激酶活性研究中，IC50是抑制靶激酶活性50％所需的化合物的浓度。在一些情况下，可以另外地或替代地确定平衡解离常数(Kd)和/或抑制常数(Ki值)。IC50和Kd可以通过本领域已知的许多手段来计算。抑制常数(Ki值)可以根据Cheng-Prusoff方程：Ki＝IC50/(1+L/Kd)从IC50和Kd值计算，其中L是激酶抑制剂的浓度(Biochem Pharmacol 22:3099-3108,1973)。Ki是未标记的抑制剂导致在不存在配体或其他竞争物的情况下存在的50％的结合位点被占据的浓度。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是小分子。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂，其在酪氨酸激酶的活性位点附近具有可接近的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，一种或多种TEC家族激酶的激酶抑制剂与蛋白酪氨酸激酶上的半胱氨酸残基形成共价键。在一些实施方案中，所述半胱氨酸残基是Cys 481残基。在一些实施方案中，所述半胱氨酸残基是Cys 442残基。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是与Cys 481结合的不可逆的BTK抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是与Cys 442结合的ITK抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂包含与酪氨酸激酶的适当半胱氨酸残基形成共价键的迈克尔(Michael)受体部分。在一些实施方案中，相对于也含有可评估的-SH部分的其他生物分子，迈克尔受体部分优先与酪氨酸激酶蛋白的适当半胱氨酸侧链结合。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是如下文献中描述的ITK抑制剂化合物：PCT申请号WO 2002/0500071、WO 2005/070420、WO 2005/079791、WO 2007/076228、WO 2007/058832、WO 2004/016610、WO 2004/016611、WO 2004/016600、WO 2004/016615、WO 2005/026175、WO 2006/065946、WO 2007/027594、WO 2007/017455、WO 2008/025820、WO 2008/025821、WO 2008/025822、WO 2011/017219、WO 2011/090760、WO 2009/158571、WO 2009/051822、WO 2014/082085、WO 2014/093383、WO 2014/105958和WO 2014/145403，将其各自通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是在美国申请号US20110281850、US 2014/0256704、US 20140315909和US 20140303161中描述的ITK抑制剂化合物，将其各自通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是在美国专利号8,759,358中描述的ITK抑制剂化合物，将其通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)具有选自以下的结构：
Figure BDA0002857331390000641
BTK和/或ITK的示例性抑制剂是本领域已知的。在一些实施方案中，所述抑制剂是如在以下文献中描述的抑制剂：Byrd等人,N Engl J Med.2016；374(4):323-32；Cho等人,JImmunol.2015,doi:10.4049/jimmunol.1501828；Zhong等人,J.Biol.Chem.,2015,290(10):5960-78；Hendriks等人,Nature,2014,14:219-232；Akinleye等人,Journal ofHematology&Oncology 2013,6:59；Wang等人,ACS Med Chem Lett.2012年7月26日；3(9):705-9；Howard等人,J Med Chem.2009年1月22日；52(2):379-88；Anastassiasdis等人,NatBiotechnol.2011年10月30日；29(11):1039-45；Davis,等人,Nat Biotechnol,2011；29:1046-51；Bamborough等人,J Med Chem.2008年12月25日；51(24):7898-914；Roth等人,JMed Chem.2015；58:1053-63；Galkin等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104:270-5；Singh等人,J Med Chem.2012；55:3614-43；Hall等人,J Med Chem.2009年5月28日；52(10):3191-204；Zhou等人,Nature.2009年12月24日；462(7276):1070-4；Zapf等人,J MedChem.2012；55:10047-63；Shi等人,Bioorg Med Chem Lett,2014；24:2206-11；Illig,等人,J Med Chem.2011；54:7860-83；和美国专利申请公开号20140371241。
激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)的非限制性例子包括依鲁替尼(PL-32765)；PRN694；司培替尼(CC-292或AVL-292)；PCI-45292；RN-486；化合物2c；AT9283；BML-275；多韦替尼(TKI258)；弗瑞替尼(GSK1363089)；
Figure BDA0002857331390000652
GSK-3抑制剂IX；GSK-3抑制剂XIII；Hesperadin；IDR E804；K-252a；来他替尼(CEP701)；尼达尼布(BIBF 1120)；NVP-TAE684；R406；SB218078；星形孢菌素(AM-2282)；舒尼替尼(SU11248)；Syk抑制剂；WZ3146；WZ4002；BDBM50399459(CHEMBL2179805)；BDBM50399460(CHEMBL2179804)；BDBM50399458(CHEMBL2179806)；BDBM50399461(CHEMBL2179790)；BDBM50012060(CHEMBL3263640)；BDBM50355504(CHEMBL1908393)；BDBM50355499(CHEMBL1908395::CHEMBL1908842)。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)是或包含依鲁替尼。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂具有或包含以下结构：
Figure BDA0002857331390000651
或其对映体或对映体的混合物；或它们的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是依鲁替尼并且具有或包含以下结构：
Figure BDA0002857331390000661
或其对映体或对映体的混合物；或它们的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物。
在一些实施方案中，所述抑制剂是如在以下美国专利号中描述的抑制剂：US2014/0371241；US 2015/0140085；US 2015/0238490；US 2015/0352116；US 2015/0361504；US 2016/0022683；US 2016/0022684；US 2016/0038495；US 2016/0038496；US 2016/0287592；US 2017/0002009；US 2017/0079981；US 2017/0128448；US 2017/0209462；US2017/0226108；US 2017/0226114；US 2017/0305914；US 2017/0360796；US 2017/0368173；US 2018/0009814；US 2018/0028537；US 2018/0051026；US 2018/0071293；US 2018/0071295；US 2018/0072737；US 7514444；US 8008309；US 8476284；US 8497277；US8697711；US 8703780；US 8735403；US 8754090；US 8754091；US 8957079；US 8999999；US9125889；US 9181257；US 9296753；US 9545407；US 9655857；US 9717731；US 9725455；US9730938；US 9751889；和US 9884869。在一些实施方案中，所述抑制剂是或包含依鲁替尼。在一些实施方案中，所述抑制剂是或包含依鲁替尼或1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮(也称为1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮；1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮；1-((3R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并(3,4-d)嘧啶-1-基)-1-哌啶基)-2-丙烯-1-酮；936563-96-1；PCI-32765；IMBRUVICA；UNII-1X70OSD4VX；PCI32765；CRA-032765；1X70OSD4VX；或CHEBI:76612)。在一些方面，所述抑制剂是或包含1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮(也称为1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮；1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮；1-((3R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并(3,4-d)嘧啶-1-基)-1-哌啶基)-2-丙烯-1-酮；936563-96-1；PCI-32765；IMBRUVICA；UNII-1X70OSD4VX；PCI32765；CRA-032765；1X70OSD4VX；或CHEBI:76612)。
在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮的对映体或对映体的混合物或1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物。在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮的溶剂化物。在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮的水合物。在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮的药学上可接受的盐。在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂)是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮。在一些实施方案中，化合物1具有式I的结构。在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是固体。在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是水合的。在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是溶剂化的。在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是无水的。在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是不吸湿性的。
在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是无定形的。在某些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是结晶的。在某些实施方案中，所述固体激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是在美国专利号9,751,889中描述的结晶形式，将其通过引用以其整体并入本文。
激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的固体形式可以根据以下文献的披露内容中描述的方法或任一种或组合的可用方法来制备：WO 2016/151438,US 9884869,US 2017/0226108；WO 2016/151438；WO 2017/134684；WO 2015/145415；WO 2017/137446；WO 2016/088074；WO2017/134684；WO 2015/145415；WO 2017/085628；和WO 2017/134588。
在一些实施方案中，本文提供的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)含有一个手性中心，并且可以以对映体的混合物(例如外消旋混合物)的形式存在。本公开内容包括这种化合物的立体异构纯形式的用途以及那些形式的混合物的用途。例如，本文提供的包含相等或不等量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的对映体的混合物可以用于本文公开的方法和组合物中。这些异构体可以不对称地合成或使用标准技术如手性柱或手性拆分剂拆分。参见例如，Jacques,J.等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley-Interscience,纽约,1981)；Wilen,S.H.等人,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.,Stereochemistry ofCarbon Compounds(McGraw-Hill,纽约,1962)；和Wilen,S.H.,Tables of ResolvingAgents and Optical Resolutions第268页(E L.Eliel编辑,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,印第安那州,1972)。
应当注意，如果所描绘的结构与给予该结构的名称之间存在差异，则以所描绘的结构为主。另外，如果未用例如粗线或虚线指示结构或结构的一部分的立体化学，则所述结构或所述结构的一部分应解释为包括所述结构的所有立体异构体。
1.组合物和配制品
在本文提供的组合疗法方法、组合物、组合、试剂盒和用途的一些实施方案中，所述组合疗法可以以一种或多种组合物(例如含有激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的药物组合物)的形式来施用。
在一些实施方案中，所述组合物(例如含有激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的药物组合物)可以包括载体(如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物)，将激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)和/或所述细胞与所述载体一起施用。合适的药物载体的例子描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。此类组合物将含有治疗有效量的激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼，通常呈纯化形式)以及合适量的载体以提供用于向患者适当施用的形式。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。药物组合物可以含有一种或多种稀释剂、一种或多种佐剂、一种或多种抗粘附剂、一种或多种粘合剂、一种或多种涂层、一种或多种填充剂、一种或多种调味剂、一种或多种颜料、一种或多种润滑剂、一种或多种助流剂、一种或多种防腐剂、一种或多种洗涤剂、一种或多种吸附剂、一种或多种乳化剂、一种或多种药物赋形剂、一种或多种pH缓冲剂、或一种或多种甜味剂中的任何一种或多种及其组合。在一些实施方案中，药物组合物可以是液体、固体、冻干粉末、呈凝胶形式和/或其组合。在一些方面，载体的选择部分取决于特定抑制剂和/或施用方法。
药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)；稳定剂和/或防腐剂。含有激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的组合物也可以是冻干的。
在一些实施方案中，可以将药物组合物配制成用于通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括肌内、静脉内、真皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、肿瘤内、硬膜外、经鼻、口服、经阴道、经直肠、外用(topical)、局部(local)、经耳、吸入、经颊(例如，舌下)以及透皮施用或任何途径。在一些实施方案中，还考虑其他施用方式。在一些实施方案中，施用是通过推注输注，通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、眼球筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方案中，施用是通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过例如在不超过3天的时间段内多次推注施用或通过连续输注施用来施用。
在一些实施方案中，根据治疗位点，施用可以是局部的、外用的或全身的。在一些实施方案中，局部施用至需要治疗的区域可以通过例如但不限于在手术期间局部输注、外用施用(例如，与手术后的伤口敷料结合)、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物来实现。在一些实施方案中，组合物还可以与其他生物活性剂一起依序、间歇或在同一组合物中施用。在一些实施方案中，施用还可以包括控释系统，包括控释配制品和装置控释，如借助泵。在一些实施方案中，施用是口服的。
在一些实施方案中，通常将激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)以单位剂型或多种剂型配制并施用。每个单位剂量含有预定量的足以产生所需治疗效果的治疗活性激酶抑制剂(例如依鲁替尼)与所需的药物载体、媒介物或稀释剂的组合。在一些实施方案中，单位剂型包括但不限于含有适量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液或悬浮液以及口服溶液或悬浮液和油水乳液。单位剂型可以容纳在安瓿和注射器中或单独包装的片剂或胶囊中。单位剂型可以以其分数或倍数施用。在一些实施方案中，多剂型是包装在单一容器中的要以分离(segregated)的单位剂型施用的多个相同的单位剂型。多剂型的例子包括小瓶、片剂或胶囊瓶或者品脱或加仑瓶。
2.给药
在一些实施方案中，所提供的组合疗法方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一个或多个剂量的激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)和所述细胞疗法(如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞))。在一些实施方案中，所提供的组合疗法方法包括在开始所述细胞疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)之前、之后、期间、过程中、同时、几乎同时、依序、与其并行和/或间歇地开始激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)的时间段之前、期间、过程中、和/或之后以规则间隔以多个剂量施用。在一些实施方案中，所提供的实施方案包括在施用所述T细胞疗法之前开始施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)并继续进行直到开始施用所述T细胞疗法或在开始施用所述T细胞疗法之后开始施用所述激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在施用所述T细胞疗法之前施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述方法包括在施用所述T细胞疗法之后继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述方法包括在开始施用所述T细胞疗法之前开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法期间中止或暂停之后，进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)，如直到开始所述T细胞疗法之后。在一些实施方案中，继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)包括施用多个剂量的所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在开始所述T细胞疗法后，不进一步施用和/或不继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述剂量时间表包括在开始所述T细胞疗法之前和之后继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述剂量时间表包括与施用所述T细胞疗法同时施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用继续进行和/或进一步施用一定的时间段，例如直到确定的时间点或直到实现特定的结果。在一些实施方案中，在特定的时间段或持续时间内(例如在淋巴细胞清除疗法期间)中止或暂停所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)以多个剂量多次施用。在一些实施方案中，将激酶抑制剂(例如依鲁替尼)在一定的时间段内多次施用，例如直到确定的时间点或直到实现特定的结果。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)施用一次。在一些实施方案中，在开始施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之前或之后，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用六次、每天施用五次、每天施用四次、每天施用三次、每天施用两次、每天施用一次、每隔一天施用、每三天施用、每周施用两次、每周施用一次或每个月施用一次。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)的时间段之前、期间、过程中、和/或之后以规则间隔以多个剂量施用。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之前以规则间隔以一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之后以规则间隔以一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，一个或多个剂量的所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)可以与一定剂量的所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)的施用同时发生。在一些实施方案中，此类方法可以包括在施用(例如开始施用)所述T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)之前、同时、期间、过程中(包括在过程中一次和/或定期)和/或之后，施用所述抑制剂。在一些实施方案中，所述施用可以包括所述抑制剂和/或所述细胞疗法(例如T细胞疗法)的依序或间歇施用。
在一些实施方案中，施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的剂量、频率、持续时间、时间安排和/或顺序是基于筛选步骤和/或本文中(例如在以下第III节和第IV节中)所述治疗结果的评估的结果的特定阈值或标准来确定的。
在一些实施方案中，所述方法包括向先前已施用治疗有效量或一个或多个剂量的所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的受试者施用所述细胞疗法。在一些实施方案中，在将一定剂量的表达重组受体的细胞施用至受试者之前将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)施用至所述受试者。在一些实施方案中，在开始施用所述剂量的细胞的同时施用一个或多个剂量的所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在开始施用所述剂量的细胞之后施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在细胞疗法之前的充分的时间施用所述抑制剂，使得增加所述组合疗法的治疗效果。在一些实施方案中，所述方法包括在施用所述T细胞疗法之前施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述方法包括在施用所述T细胞疗法之后施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述方法包括在开始施用所述T细胞疗法之前开始施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法期间中止或暂停之后，继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)，如直到开始所述T细胞疗法之后。在一些实施方案中，所述方法包括继续施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)包括施用多个剂量的所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在开始所述T细胞疗法之后不继续或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述剂量时间表包括在开始所述T细胞疗法之前和之后施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述剂量时间表包括与施用所述T细胞疗法同时施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些方面，所述方法包括施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)，所述施用激酶抑制剂是在从所述受试者获得包含T细胞的样品例如以用于产生施用的T细胞疗法之前为或至少约3天或者最少或最少约3天开始的。在一些方面，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含T细胞的组合物中。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)按如下给药方案施用，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天或者最少或最少约3天(如在从所述受试者获得样品之前至少3、4、5、6或7天)开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括：(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼或其药学上可接受的盐)；以及(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍(例如本文所述的任何一种)相关的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含T细胞的组合物中。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天或者最少或最少约3天(如在从所述受试者获得样品之前至少3、4、5、6或7天)开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。
在一些方面，所提供的方法和用途包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂(例如依鲁替尼或其药学上可接受的盐)，其中所述受试者是用T细胞疗法治疗的候选者或将要用T细胞疗法对所述受试者进行治疗。在一些方面，所述T细胞疗法包括一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍(例如本文所述的任何一种)相关的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含T细胞的组合物中。在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天或者最少或最少约3天(如在从所述受试者获得样品之前至少3、4、5、6或7天)开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。在一些方面，所述方法和用途还包括向所述受试者施用所述T细胞疗法，例如包含从已引入编码CAR的核酸分子的受试者获得的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼或其药学上可接受的盐)；(2)向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及(3)向所述受试者施用自体T细胞疗法。在一些方面，所述T细胞疗法包括一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍(例如本文所述的任何一种)相关的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含T细胞的组合物中。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在获得样品之前至少3天(如至少3、4、5、6或7天)开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂直至开始淋巴细胞清除疗法，在淋巴细胞清除疗法期间中止或暂停施用所述激酶抑制剂，以及恢复或进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天，如在开始施用所述T细胞疗法之后延长15、30、60、90、120、150或180天或更长时间。
在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天、为或至少约4天、为或至少约5天、为或至少6天、最少或最少约7天、为或至少14天或更长时间开始的。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约5天至7天开始的。在一些方面，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前最少或最少约3天、最少或最少约4天、最少或最少约5天、最少或最少约6天、最少或最少约7天、最少或最少约14天或更长时间开始的。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约4天、为或至少约5天、为或至少6天、最少或最少约7天、为或至少14天或更长时间开始的。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约或最少或最少约5天至7天开始的。
在一些方面，在开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括本文中例如在第I.C节中所述的任何一种。在一些方面，所述方法和用途包括在开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后并且在施用所述T细胞疗法之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。在所述方法和用途的一些实施方案中，在淋巴细胞清除疗法期间中止所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些方面，用于施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到开始淋巴细胞清除疗法。在一些方面，用于施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的给药方案包括施用所述激酶抑制剂直至开始淋巴细胞清除疗法，在淋巴细胞清除疗法期间中止施用所述激酶抑制剂，以及恢复和/或进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天，如在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少或至少约15、30、60、90、120、150或180天或更长时间。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天(如约2、3、4、5、6或7天内)完成的。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。
在一些实施方案中，在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之前和/或与其同时，和/或在开始施用所述细胞疗法之后，施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述细胞疗法之前从或从约21天至为或约49天开始的，如在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约25至为或约35天、从为或约28至约35天、从为或约28至为或约31天、或为或约21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49天开始的。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约14至为或约35天开始的。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约21至为或约35天开始的。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约21至为或约28天开始的。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约14天、为或约15天、为或约16天、为或约17天、为或约18天、为或约19天、为或约20天、为或约21天、为或约22天、为或约23天、为或约24天、为或约25天、为或约26天、为或约27天、为或约28天、为或约29天、为或约30天、为或约31天、为或约32天、为或约33天、为或约34天、或为或约35天开始的。
在一些实施方案中，在开始施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之前，施用所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)如下持续时间或时间段：至少或至少约12天、至少或至少约14天、至少或至少约15天、至少或至少约21天、至少或至少约24天、至少或至少约28天、至少或至少约30天、至少或至少约35天、至少或至少约42天、或至少或至少约49天。
在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之前，如在从所述受试者获得用于细胞工程化的样品之前(例如在获得样品之前至少或至少约3、4、5、6、7天或更长时间)，开始施用所提供的组合疗法方法中的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，从所述受试者获得用于细胞工程化的样品，以生成或产生用于T细胞疗法的组合物。在一些方面，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)(如与CD19特异性结合的CAR)的基因工程化T细胞，其中所述T细胞疗法通过如下过程产生，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，以及将编码CAR的核酸分子引入包含所述T细胞的组合物中。在一些实施方案中，在从所述受试者获得样品之前，如紧接在从所述受试者获得样品之前或在从所述受试者获得样品之前至少或至少约3、4、5、6、7天，开始进行所提供的组合疗法方法中的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后或以后，继续施用所提供的组合疗法方法中的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些实施方案中，从所述受试者获得样品包括获得如下样品，所述样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些方面，可以从所述受试者的样品获得T细胞(如CD4+和/或CD8+T细胞)。在一些实施方案中，从所述受试者获得样品也被称为单采术或白细胞单采术。在一些方面，根据本文中(例如在第II.C节中)所述的过程进行从所述受试者获得样品和/或随后对所述细胞工程化，例如通过将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含从所述受试者获得的样品中的细胞的组合物中进行工程化。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23天至为或约38天，如为或约28天至为或约32天或为或约23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38天，从所述受试者获得样品。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23天至为或约38天，如为或约28天至为或约32天或为或约23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38天，进行单采术或白细胞单采术。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约3天和/或最少或最少约3天开始的，如在从所述受试者获得样品(例如单采术或白细胞单采术)之前至少或至少约3、4、5、6或7天或更长时间开始的。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用一定的时间段，所述时间段至少延长直到从所述受试者获得样品。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约26天至约45天(如约28天至约35天或为或约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45天)开始的。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)在所述给药方案期间每天施用若干次、每天施用两次、每天施用、每隔一天施用、每周施用三次、每周施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用两次。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用三次。在其他实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每隔一天施用。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂的施用在所述给药方案期间在施用其的每一天中每天进行一次。
在一些实施方案中，施用有效量的所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，当施用多个剂量的所述激酶抑制剂时，每个剂量都施用有效量的所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的有效量包括本文所述的任何剂量量，其以单剂量或分成2、3、4、5或6个剂量施用。在一些实施方案中，将每个剂量每天施用若干次、每天施用两次、每天施用、每隔一天施用、每周施用三次、每周施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，将所述剂量量每天施用。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)以如下剂量量施用：从或从约25mg至为或约2000mg、从为或约25mg至为或约1000mg、从为或约25mg至为或约500mg、从为或约25mg至为或约200mg、从为或约25mg至为或约100mg、从为或约25mg至为或约50mg、从为或约50mg至为或约2000mg、从为或约50mg至为或约1000mg、从为或约50mg至为或约500mg、从为或约50mg至为或约200mg、从为或约50mg至为或约100mg、从为或约100mg至为或约2000mg、从为或约100mg至为或约1000mg、从为或约100mg至为或约500mg、从为或约100mg至为或约200mg、从为或约200mg至为或约2000mg、从为或约200mg至为或约1000mg、从为或约200mg至为或约500mg、从为或约500mg至为或约2000mg、从为或约500mg至为或约1000mg或从为或约1000mg至为或约2000mg，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量量可以包括每天施用的任何前述剂量量。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)以如下剂量量施用：从或从约50mg至为或约560mg、从为或约50mg至为或约420mg、从为或约50mg至为或约400mg、从为或约50mg至为或约380mg、从为或约50mg至为或约360mg、从为或约50mg至为或约340mg、从为或约50mg至为或约320mg、从为或约50mg至为或约300mg、从为或约50mg至为或约280mg、从为或约100mg至为或约560mg、从为或约100mg至为或约420mg、从为或约100mg至为或约400mg、从为或约100mg至为或约380mg、从为或约100mg至为或约360mg、从为或约100mg至为或约340mg、从为或约100mg至为或约320mg、从为或约100mg至为或约300mg、从为或约100mg至为或约280mg、从为或约100mg至为或约200mg、从为或约140mg至为或约560mg、从为或约140mg至为或约420mg、从为或约140mg至为或约400mg、从为或约140mg至为或约380mg、从为或约140mg至为或约360mg、从为或约140mg至为或约340mg、从为或约140mg至为或约320mg、从为或约140mg至为或约300mg、从为或约140mg至为或约280mg、从为或约140mg至为或约200mg、从为或约180mg至为或约560mg、从为或约180mg至为或约420mg、从为或约180mg至为或约400mg、从为或约180mg至为或约380mg、从为或约180mg至为或约360mg、从为或约180mg至为或约340mg、从为或约180mg至为或约320mg、从为或约180mg至为或约300mg、从为或约180mg至为或约280mg、从为或约200mg至为或约560mg、从为或约200mg至为或约420mg、从为或约200mg至为或约400mg、从为或约200mg至为或约380mg、从为或约200mg至为或约360mg、从为或约200mg至为或约340mg、从为或约200mg至为或约320mg、从为或约200mg至为或约300mg、从为或约200mg至为或约280mg、从为或约220mg至为或约560mg、从为或约220mg至为或约420mg、从为或约220mg至为或约400mg、从为或约220mg至为或约380mg、从为或约220mg至为或约360mg、从为或约220mg至为或约340mg、从为或约220mg至为或约320mg、从为或约220mg至为或约300mg、从为或约220mg至为或约280mg、从为或约240mg至为或约560mg、从为或约240mg至为或约420mg、从为或约240mg至为或约400mg、从为或约240mg至为或约380mg、从为或约240mg至为或约360mg、从为或约240mg至为或约340mg、从为或约240mg至为或约320mg、从为或约240mg至为或约300mg、从为或约240mg至为或约280mg、从为或约280mg至为或约560mg、从为或约280mg至为或约420mg、从为或约300mg至为或约560mg、从为或约300mg至为或约420mg、从为或约300mg至为或约400mg，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量量可以包括每天施用的任何前述剂量量。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)以如下总每日剂量量施用：至少或至少约50mg/天、100mg/天、140mg/天、150mg/天、175mg/天、200mg/天、250mg/天、280mg/天、300mg/天、350mg/天、400mg/天、420mg/天、440mg/天、460mg/天、480mg/天、500mg/天、520mg/天、540mg/天、560mg/天、580mg/天、600mg/天、700mg/天、750mg/天、800mg/天、850mg/天或960mg/天。在一些实施方案中，将所述抑制剂以为或约420mg/天的量施用。在一些实施方案中，将所述抑制剂以小于或小于约560mg/天且至少约或至少140mg/天的量施用。在一些实施方案中，将所述抑制剂以小于或小于约420mg/天且至少约或至少280mg/天的量施用。在一些实施方案中，将所述抑制剂以为或约或至少或至少约140mg/天、280mg/天、420mg/天或560mg/天的量施用。在一些实施方案中，将所述抑制剂以为或约或至少或至少约420mg/天或560mg/天的量施用。在一些实施方案中，将所述抑制剂以不超过140mg/天、280mg/天、420mg/天或560mg/天的量施用。在一些实施方案中，将所述抑制剂以不超过420mg/天或560mg/天的量施用。在一些实施方案中，所述有效量包含在施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的每一天中从或从约140mg至为或约840mg。在一些实施方案中，所述有效量包含在施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的每一天中从或从约140mg至或至约560mg。
在一些实施方案中，所述方法或用途包括(1)向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼或其药学上可接受的盐)；以及(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法。在一些方面，所述T细胞疗法包括一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍(例如本文所述的任何一种)相关的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含T细胞的组合物中。
在一些方面，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约5天至为或约7天(如为或约5、6或7天)开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂至少直到从所述受试者获得样品，以及继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂，所述继续和/或进一步施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)在所述给药方案期间以从或从约140mg至或至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。在一些实施方案中，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述激酶抑制剂之后并且在施用所述T细胞疗法之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约2至为或约7天(如为或约7天)内完成的。在一些实施方案中，所述给药方案包括在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或暂停施用所述激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述给药方案包括在完成所述淋巴细胞清除疗法之后恢复或进一步施用所述激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述方法或用途包括：(1)向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼或其药学上可接受的盐)；和(2)向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及(3)在完成所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天内向所述受试者施用自体T细胞疗法。在一些方面，所述T细胞疗法包括一定剂量的基因工程化T细胞，所述基因工程化T细胞表达特异性结合至与疾病或障碍(例如本文所述的任何一种)相关的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，通过以下过程产生所述T细胞疗法，所述过程包括从所述受试者获得包含T细胞的样品，并将编码CAR的核酸分子(如本文中例如在第II.B节中所述的任何核酸分子)引入包含T细胞的组合物中。在一些方面，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得样品之前为或至少约5至7天(如7天)开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂直至开始所述淋巴细胞清除疗法，在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或暂停施用所述激酶抑制剂，以及恢复或进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至或至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是从或从约280mg至或至约560mg。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前为或至少约7天开始的。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约30至约40天开始的；在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23天至约38天从所述受试者获得所述样品；和/或所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天(如7天)完成的。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约35天开始的；在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约28天至约32天从所述受试者获得所述样品；和/或所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前约5至约7天(如7天)完成的。
在所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之前给予TEC家族激酶的抑制剂的一些任何此类实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用以规则间隔持续进行直到开始所述细胞疗法为止，和/或在开始所述细胞疗法后持续进行一定时间。
在一些任何此类上述实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)是在开始施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之前和之后施用。在一些实施方案中，在施用所述细胞疗法之后施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)或继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂。在一些实施方案中，与开始施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法)同时，或在开始施用所述细胞疗法之后在或在约1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时、96小时、4天、5天、6天或7天、14天、15天、21天、24天、28天、30天、36天、42天、60天、72天、90天、120天、180天、210天、240天、270天、300天、330天、360天或720天内施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所提供的方法包括在开始施用所述细胞疗法之后，如以规则间隔在开始所述T细胞疗法之后的任何前述时间段的持续时间内继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。
在一些实施方案中，在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之后，继续和/或进一步施用(如每天施用)所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)长达或长达约1天、长达或长达约2天、长达或长达约3天、长达或长达约4天、长达或长达约5天、长达或长达约6天、长达或长达约7天、长达或长达约12天、长达或长达约14天、长达或长达约21天、长达或长达约24天、长达或长达约28天、长达或长达约30天、长达或长达约35天、长达或长达约42天、长达或长达约60天、或长达或长达约90天、长达或长达约120天、长达或长达约180天、长达或长达约240天、长达或长达约360天、或长达或长达约720天或更长时间。在一些实施方案中，在施用所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)之后，继续和/或进一步施用(如每天施用)所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)长达或长达约1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年或2年或更长时间。在一些实施方案中，继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于四个月。在一些实施方案中，继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于五个月。在一些实施方案中，继续施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于六个月。
在一些实施方案中，用于施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的给药方案在开始施用所述T细胞疗法之后进行一定的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长大于一周的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长约或至少约一个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长约或至少约两个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长约或至少约三个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长约或至少约四个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长约或至少约五个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长约或至少约六个月的时间段。
在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用延长至少三个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约90天、为或约100天、为或约105天、为或约110天、为或约115天、为或约120天、为或约125天、为或约130天、为或约135天、为或约140天、为或约145天、为或约150天、为或约155天、为或约160天、为或约165天、为或约170天、为或约175天、为或约180天、为或约185天、为或约190天、为或约195天、为或约200天或更长时间的时间段。
在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)之后延长为或约90天或为或约三个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)之后延长为或约120天或四个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)之后延长为或约150天或五个月的时间段。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在开始施用所述T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)之后延长为或约180天或六个月的时间段。
在一些方面，在施用所述细胞疗法之后，施用(如每天施用)所述激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)长达或长达约180天。在一些实施方案中，继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长15天至29天。在一些实施方案中，继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。
在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在开始施用所述T细胞疗法(例如CAR T细胞疗法)之后的所述时间段(例如为或约3、4、5或6个月)结束时结束或停止激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，所述时间段具有固定的持续时间，使得即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用仍在所述时间段内继续进行。在一些实施方案中，所述受试者具有伴有微小残留病(MRD)的CR。在一些实施方案中，所述受试者具有呈MRD-的CR。
在一些实施方案中，如果所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用在所述时间段结束之后继续进行，例如在开始施用所述T细胞疗法(例如CAR T细胞)之后继续进行长于或长于约3、4、5或6个月。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法(例如CAR T细胞疗法)之后，继续施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)大于6个月。在一些实施方案中，对于在初始时间段结束时展现出PR或SD的受试者，继续施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)直到所述受试者在所述治疗后已经实现完全反应(CR)或直到所述癌症(例如B细胞恶性肿瘤，如NHL，例如DLBCL)已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
在一些实施方案中，在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时，所述受试者未展现出在施用所述T细胞疗法(例如CAR T细胞)后的严重毒性。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，所述细胞疗法(如CAR表达T细胞)包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些实施方案中，在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时，所述受试者未展现出在施用所述细胞疗法后的严重毒性。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在所述时间段结束时或大致结束时实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则结束或停止激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用仍在所述时间段内继续进行。在一些实施方案中，如果在开始施用所述T细胞疗法之后，所述受试者展现出所述治疗后的部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则在所述初始时间段结束之后继续激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，重复激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，所述T细胞疗法(如CAR表达T细胞)包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法(如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞))之后(以后)，继续和/或恢复或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)一定的时间段或持续时间直到特定的终止时间点。所述终止时间点可以是上述任何定义的时间点，或在观察到或实现特定标准、结果(results)或结果(outcome)的时间点。
在一些方面，如果在所述时间段结束时所述受试者展现出所述治疗后的完全反应(CR)，则在所述时间段结束时停止继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，如果在所述时间段结束时所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在所述时间段结束时停止继续和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述时间段延长从或从为或约三个月至为或六个月。在一些实施方案中，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约三个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在3个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。在一些实施方案中，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约六个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。在一些实施方案中，即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述继续和/或进一步施用仍在所述时间段的持续时间内继续进行。在一些实施方案中，所述受试者在所述时间段期间且在所述时间段结束之前的某个时间实现完全反应(CR)。
在一些实施方案中，如果在所述时间段结束时所述受试者展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述方法和用途还包括在所述时间段结束之后继续和/或进一步施用。在一些实施方案中，如果在为或约六个月时所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述继续和/或进一步施用继续进行大于六个月。在一些实施方案中，所述继续和/或进一步施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
在一些实施方案中，继续施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)直到在所述受试者的血液中可检测到所述T细胞疗法的细胞的水平峰值或最大值。在一些情况下，在以下项之后一周时或一周内(如在1、2或3天内)开始进行激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用：(i)在所述受试者的血液中可检测到所述T细胞疗法的细胞的水平峰值或最大值时；(ii)在血液中已经可检测到之后，在血液中可检测的所述T细胞疗法的细胞数量不可检测或降低，任选地与施用所述T细胞疗法之后的在先时间点相比降低；(iii)与在开始施用所述T细胞疗法之后在所述受试者的血液中可检测的所述T细胞疗法的细胞数量峰值或最大值相比，血液中可检测的所述T细胞疗法的细胞数量减少或减少超过1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；(iv)在所述受试者的血液中可检测到所述T细胞疗法的细胞水平峰值或最大值之后的时间，所述受试者的血液中可检测的细胞的细胞数量或源自所述细胞的细胞数量是所述受试者的血液中总外周血单核细胞(PBMC)的小于10％、小于5％、小于1％或小于0.1％；(v)在用所述T细胞疗法治疗后，所述受试者展现出疾病进展和/或在缓解后已经复发；和/或(iv)与在施用细胞之前或之后以及在开始施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之前的时间的肿瘤负荷相比，所述受试者展现出增加的肿瘤负荷。在某些方面，在如下受试者中进行所提供的方法以增强、增加或加强T细胞疗法：在所述受试者中已经观察到对所述T细胞疗法的峰值反应，但是其中所述反应(例如T细胞的存在和/或肿瘤负荷的降低)已经变得降低或者不再可检测。
在一些实施方案中，在第一次向所述受试者施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时，和/或在开始所述施用之后的任何随后的时间，所述受试者未展现出严重毒性(如严重的细胞因子释放综合征(CRS)或严重毒性)的体征或症状。在一些实施方案中，在所述受试者未展现出严重CRS的体征或症状和/或未展现出3级或更高级CRS(如延长的3级CRS或4或5级CRS)时，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些实施方案中，在所述受试者未展现出严重神经毒性的体征或症状和/或未展现出3级或更高级的神经毒性(如延长的3级神经毒性或4级或5级神经毒性)时，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)。在一些方面，在开始施用所述T细胞疗法时与施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时之间，所述受试者尚未展现出严重CRS和/或尚未展现出3级或更高级CRS(如延长的3级CRS或4级或5级CRS)。在一些情形中，在开始施用所述T细胞疗法时与施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时之间，所述受试者尚未展现出严重的神经毒性和/或尚未展现出3级或更高级神经毒性(如延长的3级神经毒性或4级或5级神经毒性)。
在一些实施方案中，以一定的量施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)，所述量在口服施用之后(如在口服施用之后为或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内)在血液中实现了在如下范围内的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)最大浓度(Cmax)：为或约10ng/mL至为或约100ng/mL、为或约20ng/mL至为或约100ng/mL、为或约30ng/mL至为或约100ng/mL、为或约40ng/mL至为或约100ng/mL、为或约50ng/mL至为或约100ng/mL、为或约60ng/mL至为或约100ng/mL、为或约70ng/mL至为或约100ng/mL、为或约80ng/mL至为或约100ng/mL、为或约90ng/mL至为或约100ng/mL、为或约10ng/mL至为或约80ng/mL、为或约20ng/mL至为或约80ng/mL、为或约30ng/mL至为或约80ng/mL、为或约40ng/mL至为或约80ng/mL、为或约50ng/mL至为或约80ng/mL、为或约60ng/mL至为或约80ng/mL、为或约70ng/mL至为或约80ng/mL、为或约10ng/mL至为或约60ng/mL、为或约20ng/mL至为或约60ng/mL、为或约30ng/mL至为或约60ng/mL、为或约40ng/mL至为或约60ng/mL、为或约50ng/mL至为或约60ng/mL、为或约10ng/mL至为或约40ng/mL、为或约20ng/mL至为或约40ng/mL、为或约30ng/mL至为或约40ng/mL，如为或约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、或100ng/mL。在一些实施方案中，以一定的量施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)，所述量在血液中实现了如下激酶抑制剂(例如依鲁替尼)Cmax：约或至少约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、或100ng/mL。在一些实施方案中，以一定的量施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)，所述量使Cmax维持在所述范围内至少约30分钟或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时。
在一些实施方案中，按如下给药方案进行激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用，所述给药方案包括在开始施用所述T细胞疗法(例如CAR T细胞疗法)之后，以从或从约140mg至约560mg/天的量施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)，持续约或大于三个月的时间段(例如，持续为或约三个月、四个月、五个月或六个月的时间段)。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用是在开始施用所述细胞疗法之后大于约14至约35天(例如约28至约35天，例如为或约31、32、33、34或35天)开始的。在一些实施方案中，在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时，所述受试者未展现出在施用所述细胞疗法后的严重毒性。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在开始施用所述T细胞疗法之后为或约6个月结束或停止激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述循环方案仍在所述整个时间段内继续进行。在一些实施方案中，如果在为或约六个月时所述受试者展现出所述治疗之后的部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则在所述时间段结束之后激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用进一步继续，如在开始施用所述细胞疗法之后继续进行大于6个月。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。在一些实施方案中，所述细胞疗法(如CAR表达T细胞)包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些情况下，所述给药方案可以在任何时间中断和/或中断一次或多次。在一些情况下，如果所述受试者发生一个或多个不良事件、剂量限制性毒性(DLT)、嗜中性粒细胞减少症或发热性嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症、细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)(如第IV节中所述的那些)，则中断或修改所述给药方案。在一些实施方案中，在所述受试者发生一个或多个不良事件、剂量限制性毒性(DLT)、嗜中性粒细胞减少症或发热性嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症、细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)(如第IV节中所述的那些)之后，改变一周的特定天数中的每次施用或每天的激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的量。
在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用，持续7、14、21、28、35或42天的周期。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用两次，持续7、14、21、28、35或42天的周期。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每天施用三次，持续7、14、21、28、35或42天的周期。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)每隔一天施用，持续7、14、21、28、35或42天的周期。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)在多个周期(例如多于一个周期)中施用。在一些方面，每个周期可以具有大约7、14、21、28、35或42天。在一些实施方案中，将所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个或更多个周期。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和所述细胞疗法(例如T细胞疗法，如CAR-T细胞疗法)同时或几乎同时施用。
在一些实施方案中，以如下剂量量施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)：从或从约0.2mg/kg受试者体重(mg/kg)至200mg/kg、0.2mg/kg至100mg/kg、0.2mg/kg至50mg/kg、0.2mg/kg至10mg/kg、0.2mg/kg至1.0mg/kg、1.0mg/kg至200mg/kg、1.0mg/kg至100mg/kg、1.0mg/kg至50mg/kg、1.0mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至200mg/kg、10mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至50mg/kg、50mg/kg至200mg/kg、50mg/kg至100mg/kg或100mg/kg至200mg/kg。在一些实施方案中，以如下剂量施用所述抑制剂：约0.2mg/kg受试者体重(mg/kg)至50mg/kg、0.2mg/kg至25mg/kg、0.2mg/kg至10mg/kg、0.2mg/kg至5mg/kg、0.2mg/kg至1.0mg/kg、1.0mg/kg至50mg/kg、1.0mg/kg至25mg/kg、1.0mg/kg至10mg/kg、1.0mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至50mg/kg、5mg/kg至25mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、或10mg/kg至25mg/kg。
在任何前述实施方案中，可以口服施用所述依鲁替尼。
在一些实施方案中，剂量如(每日剂量)是以一个或多个分次剂量(如2、3或4个剂量)或以单一配制品来施用。可以单独地、在存在药学上可接受的载体的情况下、或者在存在其他治疗剂的情况下施用所述抑制剂。
本领域技术人员将认识到，例如根据特定药剂和施用途径，可以使用更高或更低剂量的所述抑制剂。在一些实施方案中，可以单独施用或以药物组合物的形式施用所述抑制剂，其中所述化合物与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂掺合或混合。在一些实施方案中，可以将所述抑制剂全身或局部施用至要治疗的器官或组织。示例性施用途径包括但不限于外用、注射(如皮下、肌内、真皮内、腹膜内、肿瘤内和静脉内)、口服、舌下、经直肠、透皮、鼻内、经阴道和吸入途径。在一些实施方案中，施用途径是口服、肠胃外、经直肠、经鼻、外用或眼部途径，或者通过吸入。在一些实施方案中，所述抑制剂是口服施用的。在一些实施方案中，将所述抑制剂以固体剂型(如胶囊、片剂和粉剂)或以液体剂型(如酏剂、糖浆剂和悬浮液)口服施用。
一旦患者的疾病得到改善，便可以调整剂量用于预防或维持治疗。例如，施用剂量或频率或两者可以根据症状减少至维持所需治疗或预防效果的水平。如果症状已经缓解到适当的水平，可以停止治疗。然而，在任何症状复发后，患者可能需要长期间歇治疗。患者可能还需要长期慢性治疗。
B.细胞疗法的施用
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法、组合物和制品以及试剂盒组合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如授予Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)。参见例如，Themeli等人(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，用于所提供的方法中或与所提供的方法结合施用的细胞含有或被工程化以含有工程化受体，例如工程化抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR))或T细胞受体(TCR)。所述组合物包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供了用于根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将所述细胞和组合物施用至受试者(例如，患者)的治疗方法。
所述细胞通常表达重组受体如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体如转基因T细胞受体(TCR)。所述受体还包括其他嵌合受体。在第II节中描述了在所提供的方法中作为细胞疗法施用的示例性工程化细胞。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受所述细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和加工后将所述细胞施用至同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)是通过同种异体转移进行，其中细胞是从要接受或最终接受所述细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备。在此类实施方案中，然后将细胞施用至相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
所述T细胞疗法的细胞可以在配制用于施用的组合物中施用，或者在配制用于单独施用的多于一种组合物(例如两种组合物)中施用。所述一个或多个剂量的细胞可以包括特定数量或相对数量的细胞或所述工程化细胞，和/或所述组合物内两种或更多种亚型(如CD4与CD8 T细胞)的限定比率或组合物。
可以将所述细胞通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射(例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞的多次推注给药例如在不超过3天的时间段内来施用，或通过细胞的连续输注给药。在一些实施方案中，所述细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的施用是通过门诊递送进行的。
对于疾病的治疗，适当的剂量可取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、先前疗法、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将所述组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗施用至所述受试者。
在一些方面，用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在开始所述细胞疗法之前将预调理剂施用至受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在开始所述细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向所述受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化的细胞群的生物学活性。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。
1.组合物和配制品
在一些实施方案中，所述剂量的细胞疗法(如包含用重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化的细胞的T细胞疗法)的细胞是作为组合物或配制品(如药物组合物或配制品)来提供。此类组合物可以根据所提供的方法和/或与所提供制品或组合物一起使用，如用于B细胞恶性肿瘤的治疗。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈如下形式以允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且其不含对会被施用所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(如工程化T细胞(例如CAR T细胞))是用药学上可接受的载体来配制。在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞或药剂和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
所述配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可以含有可用于用细胞或药剂治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，其中相应活性彼此没有不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括其他药学活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。
在一些实施方案中，所述药物组合物含有有效治疗所述疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗功效。对于数天或更长时间的重复施用，根据病症，重复所述治疗直到出现疾病症状的所需抑制为止。然而，其他剂量方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物、或通过连续输注施用组合物来递送。
所述细胞可以使用标准施用技术、配制品和/或装置来施用。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置，如注射器和小瓶。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答性细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并施用至同一受试者或不同但相容的受试者。外周血衍生的免疫应答性细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。在施用治疗组合物(例如，含有经基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，所述药剂或细胞群是肠胃外施用的。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，将所述药剂或细胞群通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送施用至受试者。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH)提供。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
2.给药
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞施用至受试者。在一些实施方案中，根据所述受试者的特定疾病或病症(例如癌症，例如B细胞恶性肿瘤)确定剂量的大小或时间安排。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含在为或约2x105个细胞/kg与为或约2x106个细胞/kg之间，如在为或约4x105个细胞/kg与为或约1x106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含不超过2x105个细胞(例如抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg、或不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，将以下范围内的细胞或细胞的亚型的单独群体施用至所述受试者：为或约一百万至为或约1000亿个细胞和/或所述量的细胞/公斤体重，例如像100万至为或约500亿个细胞(例如为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约50000万个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或任何两个前述值所定义的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约50000万个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或任何两个前述值所定义的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或任何两个前述值所定义的范围)，并且在一些情况下，为或约10000万个细胞至为或约500亿个细胞(例如为或约12000万个细胞、为或约25000万个细胞、为或约35000万个细胞、为或约45000万个细胞、为或约65000万个细胞、为或约80000万个细胞、为或约90000万个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据所述疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗所特有的属性而变化。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含从为或约1x105至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量是细胞的平坦剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量与受试者的体表面积或体重无关或不基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括少于或少于约5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在为或约1x106至为或约5x108个此类细胞的范围内，如为或约2x106、5x106、1x107、5x107、1x108、2x108、3x108、4x108或5x108个总此类细胞，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括在为或约1x106与为或3x108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如在为或约1x107至为或约2x108个此类细胞的范围内，如为或约1x107、5x107、1x108或1.5x108个总此类细胞，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包括施用从为或约1x105至为或约5x108个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、从为或约1x105至为或约1x108个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、从为或约5x105至为或约1x107个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、或从为或约1x106至为或约1x107个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量(包括在包括CD4+和CD8+T细胞的剂量中)的CD8+T细胞包括在为或约1x106与为或约1x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如在为或约5x106至为或约1x108个此类细胞的范围内，如为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、或5x108个总此类细胞，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包括施用从为或约1x107至为或约0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总重组受体表达CD8+T细胞、从为或约1x107至为或约0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、或5x108个总重组受体表达CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量(包括在包括CD4+和CD8+T细胞的剂量中)的CD4+T细胞包括在为或约1x106与为或约1x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD4+细胞，例如在为或约5x106至1x108个此类细胞的范围内，如为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、或5x108个总此类细胞，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包括施用从为或约1x107至为或约0.75x108个总重组受体表达CD4+T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总重组受体表达CD4+T细胞、从为或约1x107至为或约0.75x108个总重组受体表达CD4+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107 7.5x107、1x108、1.5x108、或5x108个总重组受体表达CD4+T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量是作为单剂量施用至所述受试者的，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。
在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是在单一时间点给予或起始的指定数量的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情况下，所述剂量是在不超过三天的时间段中以多次注射或输注来施用，如每天一次持续三天或持续两天，或者在单日时间段中多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指这样分割的剂量，使其在超过一天的时间内施用。这种类型的给药包括在本发明方法中并且被认为是单剂量。
因此，所述剂量的细胞可以作为分割剂量施用，例如随时间施用的分割剂量。例如，在一些实施方案中，所述剂量可以在2天内或在3天内施用至所述受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，所述分割剂量的分布不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多个组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每个组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包括富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达所述重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，其包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞；以及施用第二组合物，其包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的施用(例如，所述多种细胞组合物的施用)包括分开施用所述细胞组合物。在一些方面，分开施用同时或按任何顺序依序进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且将所述第一组合物和第二组合物相隔从为或约0至为或约12小时、相隔从为或约0至为或约6小时或相隔从为或约0至为或约2小时施用。在一些实施方案中，开始施用第一组合物和开始施用第二组合物相隔不超过为或约2小时、不超过为或约1小时或不超过为或约30分钟，相隔不超过为或约15分钟、不超过为或约10分钟或不超过为或约5分钟进行。在一些实施方案中，开始和/或完成施用第一组合物和完成和/或开始施用第二组合物相隔不超过为或约2小时、不超过为或约1小时或不超过为或约30分钟，相隔不超过为或约15分钟、不超过为或约10分钟或不超过为或约5分钟进行。
在一些实施方案中，在向所述受试者施用之前将所述第一组合物和所述第二组合物混合。在一些实施方案中，在所述施用之前不久(例如，在为或约6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1.5小时、1小时或0.5小时内)将所述第一组合物和所述第二组合物混合，在一些实施方案中，紧接在所述施用之前将所述第一组合物和所述第二组合物混合。
在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，将所述第一组合物在所述第二组合物之前施用。
在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括限定的或目标比率的表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1，或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(例如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的施用包括施用含有一个所述群体的细胞组合物，和随后施用包含另一所述群体的单独细胞组合物，其中所述施用是以或大约以目标或所需比率来进行。在一些方面，以限定比率施用细胞的剂量或组合物导致改善的T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，所述受试者接受细胞的多个剂量，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，在第一剂量之后大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，所述受试者接受连续剂量(例如第二剂量)。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用所述连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量施用至所述受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，所述另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，所述第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如所述受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、所述受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或所述受试者发生毒性结果(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，所述第一剂量的施用与所述连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，施用所述连续剂量是在施用所述第一剂量后大于约14天且在施用所述第一剂量后小于约28天的某个时间点进行。在一些方面，所述第一剂量与所述连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天施用所述另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用所述另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞(例如，重组受体表达细胞)包含两个剂量(例如，双剂量)，包含第一剂量的T细胞和连续剂量的T细胞，其中第一剂量和第二剂量中之一或两者包括施用分割剂量的T细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，将所述细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括细胞或一种或多种细胞类型的所需剂量或数目和/或细胞类型的所需比率。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的数量)和单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于单独群体中的细胞或单独细胞类型的所需总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，所述剂量是基于此类特征的组合，如总细胞的所需数量、所需比率和单独群体中细胞的所需总数。
在一些实施方案中，以总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)的耐受差异或在所述耐受差异内施用细胞的群体或亚型(如CD8+和CD4+T细胞)。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量(例如细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数或每单位体重的最小细胞数。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+的比率)存在，例如在这种比率的一定耐受差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞以所需剂量的一种或多种单独细胞群或亚型(如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内施用。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数量(例如细胞/kg)。在一些方面，所述所需剂量等于或高于群体或亚型的最小细胞数或每单位体重的所述群体或亚型的最小细胞数。
因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于所需的总细胞固定剂量和所需比率，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如，其中每一种)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量是基于T细胞的所需固定或最小剂量和CD4+与CD8+细胞的所需比率，和/或是基于CD4+和/或CD8+细胞的所需固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率或在其耐受范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率或者可以是比率范围。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指所施用的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，所述剂量的大小是基于一个或多个标准来确定，所述标准是例如所述受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、所述受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或所述受试者发生毒性结果(例如CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或宿主针对所施用的细胞和/或重组受体的免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高，如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低，如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的施用：所述受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、所述受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或所述受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
C.淋巴细胞清除治疗
在一些方面，所提供的方法还可以包括如在开始施用免疫疗法(如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞))之前或同时施用一种或多种淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用磷酰胺，如环磷酰胺。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法可以包括施用氟达拉滨。
在一些方面，用免疫细胞清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。用淋巴细胞清除剂(包括环孢菌素和氟达拉滨的组合)预调理已经有效地改善转移的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)在细胞疗法中的功效，包括改善转移细胞的反应和/或持久性。参见例如，Dudley等人,Science,298,850-54(2002)；Rosenberg等人,Clin Cancer Res,17(13):4550-4557(2011)。同样，在CAR+T细胞的情境下，几项研究已经掺入淋巴细胞清除剂，最常见的是环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀或其组合，有时伴随低剂量辐照。参见Han等人Journal of Hematology&Oncology,6:47(2013)；Kochenderfer等人,Blood,119:2709-2720(2012)；Kalos等人,Sci Transl Med,3(95):95ra73(2011)；临床试验研究记录号：NCT02315612；NCT01822652。
可以进行这种预调理，目标是降低可能减弱疗法功效的一种或多种不同结果的风险。这些结果包括被称为“细胞因子吸收(cytokine sink)”的现象，通过所述现象，T细胞、B细胞、NK细胞与TIL竞争稳态的和激活的细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15；通过调节性T细胞、NK细胞或免疫系统的其他细胞抑制TIL；负调节物对肿瘤微环境的影响。Muranski等人,Nat Clin Pract Oncol.12月；3(12):668-681(2006)。
因此，在一些实施方案中，所提供的方法还包括将淋巴细胞清除疗法施用至所述受试者。在一些实施方案中，所述方法包括在开始施用所述剂量的细胞之前将淋巴细胞清除疗法施用至所述受试者。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法含有化学治疗剂，如氟达拉滨和/或环磷酰胺。在一些实施方案中，所述细胞和/或所述淋巴细胞清除疗法的施用是通过门诊递送来进行。
在一些实施方案中，所述方法包括在开始施用所述剂量的细胞之前向受试者施用预调理剂，如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在第一剂量或后续剂量之前至少2天，如之前至少3、4、5、6或7天，向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在开始施用所述剂量的细胞之前不超过7天，如之前不超过6、5、4、3或2天，向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在开始施用所述剂量的细胞之前2与7天之间(包含端值)，如在2、3、4、5、6或7天，向所述受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对所述受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对所述受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天一次施用环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，向所述受试者施用如下剂量的环磷酰胺：在或在约100mg/m2与为或约500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与为或约400mg/m2之间或在为或约250mg/m2与为或约350mg/m2之间(包含端值)。在一些情形中，向所述受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始所述细胞疗法之前，每天向所述受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，向所述受试者施用如下剂量的氟达拉滨：在或在约1mg/m2与为或约100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、在为或约15mg/m2与为或约50mg/m2之间、在为或约20mg/m2与为或约40mg/m2之间、在为或约24mg/m2与为或约35mg/m2之间、20mg/m2与为或约30mg/m2、或在为或约24mg/m2与为或约26mg/m2之间。在一些情形下，向所述受试者施用25mg/m2的氟达拉滨。在一些情形中，向所述受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始所述细胞疗法之前，每天向所述受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂组合可以包括任何剂量或施用时间表(如上文所述的那些)的环磷酰胺，以及任何剂量或施用时间表(如上文所述的那些)的氟达拉滨。例如，在一些方面，在所述剂量的细胞之前向所述受试者施用60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。在一些实施方案中，每天向所述受试者施用约300mg/m2环磷酰胺和约30mg/m2氟达拉滨，持续3天。在一些实施方案中，预调理施用时间表在开始施用所述剂量的细胞之前2与7天之间(包含端值)，如在2、3、4、5、6或7天结束。
在一个示例性剂量方案中，在接受第一剂量之前，受试者在施用细胞之前1天接受激酶抑制剂，并且接受环磷酰胺和氟达拉滨(CY/FLU)的淋巴细胞清除预调理化学疗法，所述淋巴细胞清除预调理化学疗法是在第一剂量的CAR表达细胞之前至少两天并且通常在施用细胞之前不超过7天施用。在一些情况下，例如，环磷酰胺是在施用BTK抑制剂之后24至27天给予的。在预调理治疗后，向受试者施用如上所述的CAR表达T细胞的剂量。
在一些实施方案中，在输注所述剂量的细胞之前施用预调理剂改善治疗的结果。例如，在一些方面，预调理以所述剂量改善治疗功效，或者增加所述重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞，如CAR表达T细胞)在所述受试者中的持久性。在一些实施方案中，预调理治疗增加无疾病存活，如在所述剂量的细胞后的给定时间段之后存活并且没有展现出微小残留病或可分子检测的疾病的受试者的百分比。在一些实施方案中，到中值无疾病存活的时间增加。
在将细胞施用至所述受试者(例如，人)后，在一些方面，通过多种已知方法中的任何一种来测量工程化细胞群的生物活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或者离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子(如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量所述细胞的生物活性。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。在一些方面，评估毒性结果、细胞的持久性和/或扩增和/或宿主免疫应答的存在或不存在。
在一些实施方案中，在输注所述剂量的细胞之前施用预调理剂改善了治疗结果(例如通过改善用剂量治疗的功效)或者增加了表达所述重组受体的细胞(例如，表达CAR的细胞，如表达CAR的T细胞)在所述受试者体内的持久性。因此，在一些实施方案中，在作为用BTK抑制剂和细胞疗法的组合疗法的方法中给予的预调理剂的剂量高于在不用BTK抑制剂的方法中给予的剂量。
II.细胞疗法和工程化细胞
在一些实施方案中，用于根据所提供的组合疗法方法使用的细胞疗法(例如T细胞疗法)包括施用表达重组受体的工程化细胞，所述重组受体被设计用于识别和/或特异性结合至与所述疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，与所述抗原的结合导致反应，如针对此类抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述细胞含有或被工程化以含有工程化受体或重组受体(例如工程化抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR))。所述重组受体(如CAR)通常包括(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些方面，所述工程化细胞作为适于向受试者施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品来提供。还提供了用于向受试者(例如，患者)施用所述细胞和组合物的治疗方法。
在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
A.嵌合抗原受体
在所提供的方法和用途的一些实施方案中，所述工程化细胞(如T细胞)表达嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合受体含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域将提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是激活性细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，从而提供初级激活信号。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061；美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337；美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物是例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，所述工程化细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在所述疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在工程化的细胞上表达。
在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在特定方面，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，任何此类抗原是在人B细胞上表达的抗原。
所述嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，其是抗体分子的一个或多个抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是抗体分子的一部分，通常是所述抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)，如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性识别抗原(如CD19)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段源自与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段或是与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段的变体。在一些实施方案中，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括源自FMC63的VH和/或VL，所述VH和/或VL在一些方面可以是scFv。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含分别在SEQ ID NO:38和39所示的CDR-H1和CDR-H2，和SEQ IDNO:40或54所示的CDR-H3；以及SEQ ID NO:35所示的CDR-L1和SEQ ID NO:36或55所示的CDR-L2和SEQ ID NO:37或56所示的CDR-L3序列。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDR-L1序列、SEQ ID NO:36的CDR-L2序列和SEQ ID NO:37的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDR-H1序列、SEQ ID NO:39的CDR-H2序列和SEQ ID NO:40的CDR-H3序列的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41所示的FMC63可变重链区和SEQ ID NO:42所示的FMC63可变轻链区，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:59所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ IDNO:57所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:57展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括源自SJ25C1的VH和/或VL，所述VH和/或VL在一些方面可以是scFv。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:47-49所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及分别在SEQ ID NO:44-46所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，svFv包含含有SEQ ID NO:44的CDR-L1序列、SEQID NO:45的CDR-L2序列和SEQ ID NO:46的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDR-H1序列、SEQ ID NO:48的CDR-H2序列和SEQ ID NO:49的CDR-H3序列的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ IDNO:50所示的SJ25C1可变重链区和SEQ ID NO:51所示的SJ25C1可变轻链区，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:52所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，CAR是双特异性CAR，例如含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在一些情况下是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是已知的，在一些情况下是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。
下表2列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
表2.根据各种编号方案的CDR边界。
Figure BDA0002857331390001141
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，规定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的具体氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(例如参见，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性的单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR，并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
在一些方面，所述重组受体(例如嵌合抗原受体)包括细胞外部分，其含有一个或多个配体(例如抗原)结合结构域(如抗体或其片段)；和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些方面，所述重组受体(例如CAR)还包括间隔子和/或跨膜结构域或部分。在一些方面，所述间隔子和/或跨膜结构域可以连接含有配体(例如抗原)结合结构域的细胞外部分和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域。
在一些实施方案中，所述重组受体(例如CAR)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，例如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，所述重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，所述恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞反应性。在一些例子中，所述间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括仅IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125-135或国际专利申请公开号WO 2014031687。
在一些实施方案中，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:1所示且由SEQ ID NO:2所示的序列编码的仅铰链间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4所示。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任何一个展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，或(c)长度为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成；或(d)由以下项组成或包含以下项：SEQ ID NO:1、3-5、27-34或58所示的氨基酸序列或前述任一项的具有与前述任一项的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，或(e)包含式X1PPX2P(其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸)或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，所述抗原识别结构域(例如细胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟在CAR的情况下通过抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或通过另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含在细胞外结构域(例如scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一种或多种跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用与受体(例如，CAR)中的一个结构域天然地缔合的跨膜结构域。在一些情形下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，所述结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即包含其至少一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域(例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域)或其变体，或是包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重组受体(例如CAR)包括至少一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区域或结构域。在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。细胞内信号传导区域包括模拟或接近以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个氨基酸之间的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些背景下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域(例如，包含一个或多个细胞内结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景中与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在一些实施方案中，例如包含一个或多个细胞内结构域的细胞内信号传导区域包括参与提供共刺激信号的区域或结构域的胞质序列。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，所述细胞内(或胞质)信号传导区域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14或15展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在相同细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些实施方案中，CAR包括CD28或4-1BB(如人CD28或人4-1BB)的共刺激区域或结构域。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域或结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41氨基酸结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域和/或结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10或11展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42氨基酸胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，同一CAR包括初级(或激活)胞质信号传导区域和共刺激信号传导组分二者。
在一些实施方案中，所述激活结构域被包括在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括激活或刺激CAR、共刺激CAR，它们均在同一细胞上表达(参见WO 2014/055668)。在一些方面，所述细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，所述细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与所述疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，借此通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应)。
在一些实施方案中，这两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，这种策略可以用于例如降低在如下背景下的脱靶效应的可能性，在所述背景中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在所述疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，所述嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共同刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，所述工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包括这样的抑制性分子的信号传导结构域或源自这样的抑制性分子的信号传导结构域，使得其起到减弱细胞的应答(例如，由激活和/或共刺激性CAR诱导)的作用。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述抗原受体还包括标记，和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括替代标记如细胞表面标记，所述替代标记可以用于确认细胞被转导或工程化以表达受体。在一些方面，所述标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记以及任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。
截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:6或17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6或17展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是并非在T细胞上天然发现的或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记不起治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，所述细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD3-ζ链是人CD3-ζ链。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域还包含与CD3ζ细胞内结构域连接的CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CD28是人CD28。在一些实施方案中，所述4-1BB是人4-1BB。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任何一种)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28来源的跨膜结构域的全部或一部分的跨膜结构域、CD28来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如Ig4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任何一种)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28来源的跨膜结构域、4-1BB来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ来源的信号传导结构域。
B.用于基因工程化的核酸、载体和方法
在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码所述重组受体的多核苷酸来进行工程化。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。
在一些情况下，编码所述重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，所述信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，所述信号序列可以编码异源或非天然信号肽，如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码所述重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ IDNO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26所示的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，编码所述重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制所述重组受体的表达。在一些例子中，所述多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。
在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码所述重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码所述重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码所述重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码所述重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子操作性地连接。在一些实施方案中，所述核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码所述重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码所述重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。ORF由此编码单一多肽，所述多肽在翻译期间(在2A的情况下)或在翻译后被加工为单独蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，从而导致2A序列末端与下游的下一个肽之间的分离(参见例如，deFelipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码所述重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码所述重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。
在一些实施方案中，所述载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
在一些实施方案中，所述标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可以用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，所述转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，所述替代标记是制备以在细胞表面上与所述重组受体(例如CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经被修饰以具有极小活性或不具有活性的表面蛋白。在某些实施方案中，所述替代标记在编码所述重组受体的相同多核苷酸上编码。在一些实施方案中，编码所述重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽(如2A序列，如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化的细胞结合用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短的形式，如如下截短的形式，其是非功能性的，并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号，和/或不内化或不能内化。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，SEQ ID NO:7或16所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有由抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002857331390001271
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，所述标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。
在一些实施方案中，所述标记是或包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，所述标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，所述标记是选择标记。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其经修饰形式。
在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记不起治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687)。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是或包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，所述标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，所述标记是选择标记。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其经修饰形式。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy,2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp.Hematol.,28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol.Ther.Nucl.Acids.,2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.,2011年11月29(11):550-557)。
在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human GeneTherapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,纽约州纽约市中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，用于引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cellbased therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间将细胞工程化。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，例如通过促进转移细胞的活力和/或功能；提供用于选择和/或评价细胞的遗传标记的基因，例如以评估体内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如LuptonS.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了使用源自将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
C.用于基因工程化的细胞和细胞的制备
在一些实施方案中，所述核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中被发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自各种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
所述细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。所述细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于要治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试者分离细胞、将其制备、处理、培养和/或工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者体内。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，所述核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中被发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自各种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化的细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品分离，所述样品是例如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的样品。在一些实施方案中，分离出所述细胞的受试者是患有所述疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如所分离、加工和/或工程化的细胞所用于的过继细胞疗法)的人。
因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自所述受试者的组织、流体和其他样品，以及从一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)得到的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，细胞所来源的或分离出细胞的样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的情境下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞从异种来源(例如，从小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪)获得。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或并非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下进行洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分，针对所需组分进行富集，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除了红细胞和血小板以外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从所述受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或多种或全部二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是根据制造商的说明书在半自动化“流通式”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)中完成的。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明书完成的。在一些实施方案中，在洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，所述缓冲液如例如不含Ca++/Mg++的PBS。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，所述分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与和此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致全部此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，如之后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单一分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的各种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择各种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群(如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞))通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002857331390001341
M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过以下方式进行分离：通过阳性选择富集特定细胞群，或通过阴性选择耗尽特定细胞群。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育完成的，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助T细胞与CD8+细胞毒性T细胞。可以通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标记进行阳性或阴性选择，将此类CD4+和CD8+群体进一步分选为亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood,1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富含TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，对所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依序进行的。在一些方面，将用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性两种级分。然后使阴性级分经受基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择和基于中枢记忆T细胞所特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任一顺序进行的。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法来获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-且CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002857331390001361
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将要分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如，如Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的存在于一种或多种细胞或细胞群上的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。存在多种熟知的用于磁分离方法的磁响应材料。合适的磁粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述文献通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698和Liberti等人,美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。
通常在如下条件下进行孵育，借此附着至磁粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与样品内细胞上的细胞表面分子(如果存在)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且附着有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或使其经历进一步的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒经由对一种或多种标记具有特异性的一抗的包被而附着至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着至用于施用至患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)来进行。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择具有附着至其上的磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个的系统、装置或设备进行分离或分开。在一些方面，使用所述系统在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以使错误、用户操作和/或污染降至最低。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。
在一些方面，所述分离和/或其他步骤是使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)来进行的，例如用于在封闭且无菌的系统中以临床规模水平自动化分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的全部部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹紧阀一起确保经过所述系统的缓冲液的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌、无热原溶液中供应的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁粒标记细胞之后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，系统将细胞样品自动施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群未被标记并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群在去除磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，将外周血自动分离为红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培育室，其实现细胞培养方案，如例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如,Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82以及Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中流体流中携载针对多种细胞表面标记染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(荧光激活细胞分选，FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标记来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化孵育和/或培养所述细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和设计用于激活细胞的任何其他药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活或刺激TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，如对TCR具有特异性的那些，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括能够刺激共刺激受体的一种或多种药剂(例如配体)，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/mL的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，孵育可以还包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。
III.示例性治疗结果及其评估方法
在本文所提供的方法、组合物、组合、用途、试剂盒和制品的一些实施方案中，所提供的组合疗法产生一种或多种治疗结果，如与任何一种或多种与疗法或治疗相关的参数相关的特征，如下文所述。在一些实施方案中，所述方法包括评估T细胞(例如基于T细胞的疗法所施用的T细胞)的暴露、持久性和增殖。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量细胞(例如免疫疗法(例如T细胞疗法)所施用的细胞)的暴露、或延长的扩增和/或持久性，和/或所述细胞的细胞表型或功能活性的变化。在一些实施方案中，此类测定可以用于确定或确认在施用本文所提供的组合疗法之前、期间或之后，T细胞(例如T细胞疗法)的功能。
在一些实施方案中，组合疗法还可以包括一个或多个筛选步骤以鉴定用组合疗法治疗和/或继续组合疗法的受试者，和/或评估治疗结果和/或监测治疗结果的步骤。在一些实施方案中，评估治疗结果的步骤可以包括评价和/或监测治疗和/或鉴定受试者用于施用疗法的其他或剩余步骤和/或用于重复疗法的步骤。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结果的评估可以用于确定本文所提供的组合疗法的剂量、频率、持续时间、时间安排和/或顺序。
在一些实施方案中，可以在施用所提供组合疗法的一个或多个步骤(例如施用所述T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼))之前、期间、过程中或之后使用本文所述的任何筛选步骤和/或对治疗结果的评估。在一些实施方案中，在进行本文所提供的任何方法之前、期间、过程中或之后进行评估。在一些实施方案中，在进行本文所提供的方法之前进行评估。在一些实施方案中，在进行本文所提供的方法的一个或多个步骤之后进行评估。在一些实施方案中，在施用所提供的组合疗法的一个或多个步骤之前进行评估，例如，以筛选并鉴定适合于和/或易于接受所述组合疗法的患者。在一些实施方案中，在施用所提供组合疗法的一个或多个步骤期间、过程中或之后进行评估，例如，以评估中间或最终治疗结果，例如，以确定治疗功效和/或确定是否继续或重复治疗和/或确定是否施用所述组合疗法的剩余步骤。
在一些实施方案中，治疗结果包括改善的免疫功能，例如基于细胞的疗法所施用的T细胞的免疫功能和/或体内内源T细胞的免疫功能。在一些实施方案中，示例性治疗结果包括但不限于增强的T细胞增殖、增强的T细胞功能活性、免疫细胞表型标记表达的变化，如与施用至所述受试者的工程化T细胞(例如CAR-T细胞)相关的此类特征。在一些实施方案中，示例性治疗结果包括降低的疾病负荷(例如，肿瘤负荷)、改善的临床结果和/或增强的疗法功效。
在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结果的评估包括评估基于细胞的疗法所施用的T细胞的存活和/或功能。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结果的评估包括评估细胞因子或生长因子的水平。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结果的评估包括评估疾病负荷和/或改善，例如评估肿瘤负荷和/或临床结果。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结果的评估中的任一者可以包括本文所述和/或本领域已知的任何评估方法和/或测定，并且可以进行一次或多次，例如，在施用组合疗法的一个或多个步骤之前、期间、过程中或之后进行。可以在本文所提供的方法的一些实施方案中评估的与治疗结果相关的示例性参数集包括外周血免疫细胞群谱和/或肿瘤负荷。
在一些实施方案中，所述方法影响所述细胞疗法在所述受试者体内的功效。在一些实施方案中，与通过不施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的方法所实现的相比，在施用所述方法中所述剂量的细胞和激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)之后，所述受试者体内表达重组受体(例如，表达CAR)的细胞的持久性、扩增和/或存在更大。在一些实施方案中，评估了与其中在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用所述T细胞疗法的方法相比所施用的T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)在所述受试者中的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，与在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用所述T细胞疗法的方法相比，所述方法导致所施用的T细胞在所述受试者体内展现出增加或延长的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，与在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用所述剂量的表达所述重组受体的细胞的方法相比，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)降低所述受试者的疾病负荷(例如，肿瘤负荷)。在一些实施方案中，与在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用所述剂量的表达所述重组受体的细胞的方法相比，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)减少所述受试者的骨髓原始细胞。在一些实施方案中，与在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用所述剂量的表达所述重组受体的细胞的方法相比，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)导致改善的临床结果，例如，客观反应率(ORR)、无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。
在一些实施方案中，可以在施用组合疗法的一个或多个步骤之前筛选所述受试者。例如，可以在施用组合治疗之前针对疾病特征和/或疾病负荷(例如肿瘤负荷)筛选所述受试者，以确定施用组合疗法的适合性、反应性和/或易感性。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结果的评估可以用于确定本文所提供的组合疗法的剂量、频率、持续时间、时间安排和/或顺序。
在一些实施方案中，可以在施用组合疗法的一个步骤之后筛选所述受试者，以确定并鉴定所述受试者以接受组合疗法的剩余步骤和/或监测治疗功效。在一些实施方案中，在施用γ分泌酶抑制剂之前和/或在施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)之后评估所施用的T细胞的数量、水平或量和/或所施用的T细胞的增殖和/或活性。
在一些实施方案中，确定或评估与不同的评估时间点、不同条件、参考点和/或不同受试者的相同参数或结果的水平、值或测量值相比，参数或结果的水平、值或测量值的变化和/或改变(例如，增加、升高、降低或减少)。例如，在一些实施方案中，可以确定与不同条件(例如，在施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)之前或之后)的相同参数相比，特定参数(例如，样品中工程化T细胞的数量)的倍数变化(例如，增加或降低)。在一些实施方案中，确定两个或更多个参数的水平、值或测量值，并比较相对水平。在一些实施方案中，将所确定的参数的水平、值或测量值与来自对照样品或未处理样品的水平、值或测量值进行比较。在一些实施方案中，将所确定的参数的水平、值或测量值与在不同时间点来自同一受试者的样品的所述水平进行比较。出于疾病评估的目的，可以将在单独参数的定量中获得的值组合，例如通过使用多参数分析对参数的水平、值或测量值形成算术或逻辑运算。在一些实施方案中，可以计算两个或更多个特定参数的比率。
可以在不同时间点评估与T细胞健康、功能、活性和/或结果(如反应、功效和/或毒性结果)相关的参数的评估和确定。在一些方面，可以在如下多个时间点进行所述评估：例如在施用所述细胞疗法之前，在制造所述细胞之前、期间或之后，和/或在开始施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)时，在继续、恢复和/或进一步施用所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)期间，在开始施用所述细胞疗法时，和/或在开始施用所述细胞疗法之前、期间或之后。
在一些实施方案中，所施用的细胞和/或细胞组合物的功能属性包括监测药代动力学(PK)参数、所述细胞的扩增和持久性，细胞功能测定(例如，本文所述的任何一种，如细胞毒性测定、细胞因子分泌测定和体内测定)，高维T细胞信号传导评估以及所述T细胞的衰竭表型和/或特征的评估。在一些方面，可以评估或监测的其他属性包括监测和评估微小残留病(MRD)。在一些方面，可以评估或监测的其他属性包括所述激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的药效动力学参数。在一些方面，可以使用活动位点占用测定(例如BTK占用测定或ITK占用测定)来评估此类参数。
A.T细胞暴露、持久性和增殖
在一些实施方案中，与疗法或治疗结果相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结果和/或监测治疗结果的参数)是或包括对T细胞(例如，基于T细胞的疗法所施用的T细胞)的暴露、持久性和增殖的评估。在一些实施方案中，可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量本文所提供方法中细胞(例如免疫疗法(例如T细胞疗法)施用的细胞)的增加的暴露或延长的扩增/或持久性，和/或细胞的细胞表型或功能活性的变化。在一些实施方案中，在施用本文所提供组合疗法的一个或多个步骤之前或之后，可以使用此类测定来确定或确认用于免疫疗法(例如T细胞疗法)的T细胞的功能。
在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用被设计为促进所述受试者对细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的T细胞)的暴露，如通过促进所述细胞随时间的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，与在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用所述T细胞疗法的方法相比，所述T细胞疗法在所述受试者体内展现出增加或延长的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，所提供的方法增加所述受试者对所施用的细胞的暴露(例如增加的细胞数量或随时间的持续时间)和/或改善免疫疗法(例如T细胞疗法)的功效和治疗结果。在一些方面，与其他方法相比，所述方法的有利之处在于，对表达所述重组受体的细胞(例如，CAR表达细胞)的更大和/或更长程度的暴露改善治疗结果。即使在具有严重肿瘤负荷的个体中，此类结果也可以包括患者的存活和缓解。
在一些实施方案中，与在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下单独施用T细胞相比，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)可以增加所述受试者体内对细胞(例如基于T细胞的疗法施用的T细胞)的最大暴露、总暴露和/或暴露的持续时间。在一些方面，在高疾病负荷(因此抗原量较高)和/或更具侵袭性或抗性的B细胞恶性肿瘤的情境下，与在相同情境下在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下单独施用T细胞(这可能导致免疫抑制、无反应性和/或衰竭，从而可能阻止细胞的扩增和/或持久性)相比，施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)增强功效。
在一些实施方案中，检测在施用T细胞后且在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之前、期间和/或之后，所述受试者中表达所述重组受体的细胞(例如，用于基于T细胞的疗法施用的CAR表达细胞)的存在和/或数量。在一些方面，使用定量PCR(qPCR)评估表达所述重组受体的细胞(例如，基于T细胞的疗法所施用的CAR表达细胞)在所述受试者的血液或血清或器官或组织样品(例如，疾病部位，例如肿瘤样品)中的量。在一些方面，持久性被定量为每微克的DNA中编码受体(例如，CAR)的DNA或质粒的拷贝，或者定量为每微升的样品(例如，血液或血清)中表达受体的(例如，表达CAR的)细胞的数量，或者每微升的样品中外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数量。
在一些实施方案中，在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)后在或至少在4、7、10、14、18、21、24、27或28天，在所述受试者中检测细胞。在一些方面，在施用所述T细胞后，在或至少在2、4或6周，或之后3、6或12、18或24或30或36个月，或1、2、3、4、5年或更长时间，检测所述细胞。
在一些实施方案中，与通过替代方法(如涉及在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下单独施用免疫疗法，例如施用T细胞(例如CAR表达T细胞)的那些方法)所实现的持久性相比，在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)后，通过所述方法在所述受试者体内实现的受体表达细胞(例如CAR表达细胞)的持久性更大。
指示扩增和/或持久性的细胞(例如T细胞疗法所施用的T细胞)的暴露(例如数量)可以根据以下方面来陈述：所述受试者所暴露的细胞的最大数量、可检测细胞或高于某一数量或百分比的细胞的持续时间、细胞数量相对于时间的曲线下面积和/或其组合和其指示物。此类结果可以使用已知方法来评估，所述已知方法是例如qPCR，其用于检测与特定样品(例如血液、血清、血浆或组织，如肿瘤样品)中核酸或DNA的总量相比，编码所述重组受体的核酸的拷贝数；和/或流式细胞术测定，其通常使用对受体具有特异性的抗体来检测表达受体的细胞。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，所述功能细胞是例如能够结合至和/或中和所述疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的细胞，和/或能够诱导针对所述疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞。
在一些方面，增加的受试者对细胞的暴露包括增加的细胞扩增。在一些实施方案中，在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)后和/或在施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)后，受体表达细胞(例如CAR表达细胞)在所述受试者体内扩增。在一些方面，与其他方法(如涉及在不施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下施用T细胞(例如，CAR表达T细胞)的那些方法)相比，所述方法导致更大的细胞扩增。
在一些方面，所述方法导致所施用的细胞的高体内增殖，例如如通过流式细胞术所测量。在一些方面，检测到细胞的高峰值比例。例如，在一些实施方案中，在所述受试者的血液或疾病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分或T细胞级分)中，在施用T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后的水平峰值或最大值，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞表达所述重组受体(例如，CAR)。
在一些实施方案中，所述方法导致所述受试者的血液或血清或其他体液或器官或组织中的最大浓度是至少100、500、1000、1500、2000、5000、10,000或15,000个拷贝的编码受体(例如，CAR)的核酸/微克DNA，或者是每个外周血单核细胞(PBMC)总数、单核细胞总数、T细胞总数或总微升数的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9个受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)。在一些实施方案中，表达受体的细胞被检测为所述受试者血液中总PBMC的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后在这种水平下持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或52周，或者在这种施用之后持续1、2、3、4或5年或更多年。
在一些方面，所述方法导致例如所述受试者的血清、血浆、血液或组织(例如肿瘤样品)中，每微克DNA中编码所述重组受体(例如CAR)的核酸的拷贝数的至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍增加。
在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，CAR表达T细胞)后或在施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)后至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天或更长时间，例如通过指定方法(如qPCR或基于流式细胞术的检测方法)，在所述受试者的血清、血浆、血液或组织(例如，肿瘤样品)中可检测到表达受体的细胞，在施用T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后持续至少或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周或更长时间。
在一些方面，在所述受试者或其体液、血浆、血清、组织或隔室中，如在其血液(例如，外周血)或疾病部位(例如，肿瘤)中，可检测到或存在至少约1x102、至少约1x103、至少约1x104、至少约1x105、或至少约1x106、或至少约5x106、或至少约1x107、或至少约5x107、或至少约1x108个重组受体表达细胞(例如CAR表达细胞)，和/或至少10、25、50、100、200、300、400或500或1000个受体表达细胞/微升，例如至少10个受体表达细胞/微升。在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，CAR表达T细胞)后和/或在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后至少约20天、至少约40天、或至少约60天，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年中，在所述受试者中可检测到这种数量或浓度的细胞。此类细胞数量可以如通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法来检测，并使用已知方法外推至总细胞数量。参见例如，Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)；Park等人,Molecular Therapy 15(4):825-833(2007)；Savoldo等人,JCI 121(5):1822-1826(2011)；Davila等人,(2013)PLoSONE 8(4):e61338；Davila等人,Oncoimmunology 1(9):1577-1583(2012),Lamers,Blood2011 117:72-82；Jensen等人,Biol Blood Marrow Transplant 2010年9月；16(9):1245-1256，Brentjens等人,Blood 2011 118(18):4817-4828。
在一些方面，如通过免疫组织化学、PCR和/或流式细胞术所测量的，在施用细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK，例如依鲁替尼)后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周或至少约6周、或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或至少2或3年，例如在外周血或骨髓或其他区室中，每100个细胞中编码所述重组受体的核酸的拷贝数(例如载体拷贝数)是至少0.01、至少0.1、至少1或至少10。在一些实施方案中，在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后约1周、约2周、约3周或至少约4周的时间，或在这种施用后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或者至少2或3年，每微克基因组DNA中表达受体(例如CAR)的载体的拷贝数为至少100、至少1000、至少5000、或至少10,000、或至少15,000或至少20,000。
在一些方面，在施用细胞后(例如在开始施用T细胞(例如CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后)至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年或超过3年的时间，在所述受试者、其血浆、血清、血液、组织和/或疾病部位(例如肿瘤部位)中，通过定量PCR(qPCR)或通过流式细胞术可检测到细胞表达的受体(例如CAR)。
在一些实施方案中，与通过替代给药方案(其中在不施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的情况下向所述受试者施用T细胞(例如CAR表达T细胞))所实现的曲线下面积相比，在施用T细胞(例如CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后，在所述受试者的体液、血浆、血清、血液、组织、器官和/或疾病部位(例如肿瘤部位)中，受体(例如CAR)表达细胞的浓度相对于时间的曲线下面积(AUC)更大。
在一些方面，所述方法导致所施用的细胞的高体内增殖，例如如通过流式细胞术所测量。在一些方面，检测到细胞的高峰值比例。例如，在一些实施方案中，在所述受试者的血液、血浆、血清、组织或疾病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分或T细胞级分)中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后，在水平峰值或最大值时，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞表达所述重组受体(例如，CAR)。
在一些方面，在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的受试者体内，所述剂量的细胞的增加或延长的扩增和/或持久性与所述受试者体内肿瘤相关结果的益处相关。在一些实施方案中，肿瘤相关结果包括所述受试者体内肿瘤负荷的降低或骨髓原始细胞的减少。在一些实施方案中，在施用所述方法后，肿瘤负荷减少或者减少％至少或至少约10％、20、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与已经用不包括施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的方法治疗的受试者相比，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积在所述剂量的细胞后降低至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
B.T细胞功能活性
在一些实施方案中，与疗法或治疗结果相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结果和/或监测治疗结果的参数)包括T细胞的活性、表型、增殖或功能中的一种或多种。在一些实施方案中，可以使用本领域中用于评估T细胞(例如，T细胞疗法施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能的任何已知测定。在施用细胞和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)之前和/或之后，在一些实施方案中，例如通过多种已知方法中的任何一种测量工程化细胞群的生物活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或者离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，可以使用本领域中已知的任何合适的方法测量工程化细胞破坏靶细胞的能力，所述方法如例如以下文献中所述的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2、GM-CSF和TNFα)的表达和/或分泌，和/或通过评估细胞溶解活性，测量细胞的生物活性。
在一些实施方案中，用于监测细胞健康、活性表型和/或功能(例如信号传导功能)的测定可以包括使用电感耦合等离子体质谱法和飞行时间质谱法基于大量细胞计数法(CyTOF)的T细胞信号传导评估、T细胞表型分析、免疫表型分析(例如，使用一组抗体)和其他功能测定(如本文所述的任何一种)。
在一些实施方案中，对T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能的测定包括但不限于ELISPOT、ELISA、细胞增殖、细胞毒性淋巴细胞(CTL)测定、与T细胞表位、抗原或配体的结合、或细胞内细胞因子染色、增殖测定、淋巴因子分泌测定、直接细胞毒性测定和有限稀释测定。在一些实施方案中，可以测量T细胞的增殖反应，例如通过将3H-胸苷、BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)或2'-脱氧-5-乙炔基尿苷(EdU)掺入T细胞的DNA中或使用诸如羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)、CellTrace Violet或膜染料PKH26等染料的染料稀释测定。
在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能包括测量T细胞的细胞因子产生，和/或测量来自所述受试者的生物样品(例如血浆、血清、血液和/或组织样品，例如肿瘤样品)中的细胞因子产生。在一些情况下，此类所测量的细胞因子可以包括但不限于白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD107a和/或TGF-β(TGFβ)。测量细胞因子的测定是本领域所熟知的，并且包括但不限于ELISA、多路化细胞因子测定、细胞内细胞因子染色、细胞计数珠阵列、RT-PCR、ELISPOT、流式细胞术和生物测定，在所述生物测定中测试对相关细胞因子有反应的细胞在存在测试样品的情况下的反应性(例如增殖)。
在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能包括评估细胞表型，例如特定细胞表面标记的表达。在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)中T细胞激活标记、T细胞衰竭标记和/或T细胞分化标记的表达。在一些实施方案中，在施用之前评估细胞表型。在一些实施方案中，在施用细胞疗法和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)期间或之后评估细胞表型。用于评估的T细胞激活标记、T细胞衰竭标记和/或T细胞分化标记包括本领域已知用于特定T细胞子集的任何标记，例如CD25、CD38、人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、CD69、CD44、CD137、KLRG1、CD62L低、CCR7低、CD71、CD2、CD54、CD58、CD244、CD160、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)和/或基于T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)(参见例如，Liu等人,Cell Death andDisease(2015)6,e1792)。在一些实施方案中，所评估的细胞表面标记是CD25、PD-1和/或TIM-3。在一些实施方案中，所评估的细胞表面标记是CD25。
在一些方面，检测表达水平包括进行体外测定。在一些实施方案中，体外测定是免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定或mRNA表达水平测定。在一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧流免疫测定、抑制测定或亲合力测定来检测一种或多种因子、效应子、酶和/或表面标记中每一种的一种或多种的一个或多个参数。在一些实施方案中，细胞因子和/或表面标记的检测是使用与至少一种生物标记特异性结合的结合试剂来确定。在一些情况下，结合试剂是抗体或其抗原结合片段、适体或核酸探针。
在一些实施方案中，激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用增加了循环CAR T细胞的水平。
C.反应、功效和存活
在一些实施方案中，与疗法或治疗结果相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结果和/或监测治疗结果的参数)包括肿瘤或疾病负荷。免疫疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用可以降低或预防所述受试者中所述疾病或病症的扩大或负荷。例如，在所述疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的B细胞恶性肿瘤，和/或改进预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
在一些方面，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物的施用通常降低或预防所述受试者中所述疾病或病症的扩大或负荷。例如，在所述疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的B细胞恶性肿瘤，和/或改进预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
在一些实施方案中，与在不施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的情况下给予免疫疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)的替代方法相比，所提供的方法导致所治疗受试者的降低的肿瘤负荷。肿瘤负荷不一定在接受组合疗法的所有受试者中都实际上降低，但是如基于临床数据，肿瘤负荷在所治疗受试者中平均地降低，其中用这种组合疗法治疗的大多数受试者展现出降低的肿瘤负荷，如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的用所述组合疗法治疗的受试者展现出降低的肿瘤负荷。
疾病负荷可以涵盖所述受试者中或所述受试者的器官、组织或体液(如肿瘤或例如可指示转移的另一位置的器官或组织)中疾病细胞的总数。例如，在某些血液恶性肿瘤的情境下，可以在血液、淋巴或骨髓中对肿瘤细胞进行检测和/或定量。在一些实施方案中，疾病负荷可以包括肿瘤的质量、转移的数量或程度和/或骨髓中存在的原始细胞的百分比。
在一些实施方案中，所述受试者患有骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残留白血病来确定。在一些实施方案中，所述受试者患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))。在一些实施方案中，所述受试者患有MM或DBCBL。在一些实施方案中，所述受试者患有白血病。在一些实施方案中，所述白血病是CLL或SLL。
在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准。(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.4(1):5)。在一些方面，反应评估利用任何临床、血液学和/或分子方法。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应包括视情况使用正电子发射断层成像(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，在使用PET-CT评估嗜FDG组织学的反应的情况下，可以使用5分量表。在一些方面，所述5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取中度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应包括在不同可测量位点的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或激活的韦氏环(Waldeyer’s ring)或结节外位点中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累位点的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外位点，并且靶淋巴结/淋巴结肿块的病灶的最长横径(LDi)必须复原至≤1.5cm。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态，如果不确定则应是IHC阴性。其他位点可以包括对器官肿大的评估，其应复原至正常。在一些方面，评估未测量的病灶和新病灶，它们在CR的情况下应不存在(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.4(1):5)。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的部分反应(PR)包括在不同可测量位点的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些位点包括淋巴结和淋巴外位点，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残余肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残留疾病。在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外位点的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量值进行计算。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评价应指示残余摄取，所述残余摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情境下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他位点可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经复原>50％。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，其在PR的情况下应不存在/正常，已复原但没有增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.,4(1):5)。
在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为在疾病(如B细胞恶性肿瘤)治疗期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总存活期(OS)被描述为从诊断或开始治疗疾病(如B细胞恶性肿瘤)的日期到被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活时的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在B细胞恶性肿瘤治疗结束后，所述受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括B细胞恶性肿瘤的复发或某些症状的发作，所述症状如已经扩散到骨骼的B细胞恶性肿瘤引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从开始治疗起时间段之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始治疗后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应可持续大于3个月或大于6个月。
在一些方面，使用RECIST标准确定客观肿瘤反应。(Eisenhauer等人,EuropeanJournal of Cancer 45(2009)228-247.)在一些方面，使用RECIST标准确定靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面中，如使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减少至<10mm。在其他方面中，如使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线总直径为参考，靶病灶的直径总和减小至少30％。在其他方面中，疾病进展(PD)被描述为以研究中的最小总和(如果基线总和在研究中最小，则这个最小总和包括基线总和)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，所述总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面中，疾病稳定(SD)被描述为以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
在MM的情况下，评估疾病负荷程度的示例性参数包括诸如以下等参数：克隆血浆细胞数量(例如，在骨髓活检中>10％或在来自其他组织的活检中呈任何量；浆细胞瘤)、单克隆蛋白(副蛋白)在血清或尿液中的存在、感觉与浆细胞障碍相关的终末器官损害的证据(例如，高钙血症(校正钙>2.75mmol/l)；可归因于骨髓瘤的肾功能不全；贫血(血红蛋白<10g/dl)；和/或骨病灶(溶解性病灶或骨质疏松伴压缩性骨折))。
在DLBCL的情况下，评估疾病负荷程度的示例性参数包括诸如以下等参数：细胞形态(例如，中心母细胞、免疫母细胞和间变细胞)、基因表达，miRNA表达和蛋白质表达(例如，BCL2、BCL6、MUM1、LMO2、MYC和p21的表达)。
在一些方面，受试者(如患有CLL的受试者)的反应率是基于国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(IWCLL)反应标准(Hallek等人,Blood 2008年6月15日；111(12):5446-5456)。在一些方面，这些标准描述如下：完全缓解(CR)，其在一些方面要求依据免疫表型分析不存在外周血克隆淋巴细胞、不存在淋巴结病、不存在肝肿大或脾肿大、不存在全身症状和令人满意的血细胞计数；完全缓解伴随不完全骨髓恢复(CRi)，其在一些方面被描述为上述CR，但没有正常的血细胞计数；部分缓解(PR)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数下降≥50％、淋巴结病减少≥50％或肝或脾减小≥50％，以及外周血细胞计数改善；疾病进展(PD)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数增加≥50％至>5x109/L、淋巴结病增加≥50％、肝或脾大小增加≥50％、Richter转化或由于CLL所致的新的血细胞减少；以及疾病稳定，其在一些方面被描述为不符合CR、CRi、PR或PD的标准。
在一些实施方案中，如果在施用所述剂量的细胞的1个月内，所述受试者的淋巴结大小小于或小于约20mm，大小小于或小于约10mm或大小小于或小于约10mm，则所述受试者展现CR或OR。
在一些实施方案中，在所述受试者的骨髓中(或在大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的根据所述方法治疗的受试者的骨髓中)没有检测到CLL的指标克隆。在一些实施方案中，通过IgH深度测序评估CLL的指标克隆。在一些实施方案中，在施用细胞之后等于或约或者至少为或至少约1、2、3、4、5、6、12、18或24个月的时间未检测到指标克隆。
在一些实施方案中，如果例如如通过光学显微术检测，骨髓中存在大于或等于5％原始细胞，如骨髓中大于或等于10％原始细胞、骨髓中大于或等于20％原始细胞、骨髓中大于或等于30％原始细胞、骨髓中大于或等于40％原始细胞或骨髓中大于或等于50％原始细胞，则受试者展现形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，受试者可以展现完全缓解，但存在小部分形态学上(通过光学显微术技术)不可检测的残余白血病细胞。如果受试者展现出在骨髓中小于5％原始细胞并且展现出可分子检测的B细胞恶性肿瘤，则称所述受试者展现出微小残留病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的B细胞恶性肿瘤可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任何一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定通过染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定B细胞恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤的分子检测可以检测100,000个正常细胞中的少至1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中的至少或大于1个白血病细胞，则受试者展现出可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术无法检测到所述受试者中的白血病细胞。
在白血病的情况下，可以通过评估血液或骨髓中残留的白血病来确定疾病负荷程度。在一些实施方案中，如果骨髓中存在大于或等于5％的原始细胞(例如，如通过光学显微术检测)，则受试者展现出形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，对于白血病，受试者可展现出完全缓解，但是存在小部分形态上不可检测(通过光学显微术技术)的残留白血病细胞。如果受试者展现出在骨髓中小于5％原始细胞并且展现出可分子检测的B细胞恶性肿瘤，则称所述受试者展现出微小残留病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的B细胞恶性肿瘤可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任何一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定通过染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定B细胞恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤的分子检测可以检测100,000个正常细胞中的少至1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中的至少或大于1个白血病细胞，则受试者展现出可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术无法检测到所述受试者中的白血病细胞。
在一些实施方案中，与紧接在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之前的时间的疾病负荷相比，所述方法和/或细胞疗法(如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞))和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的施用降低疾病负荷。
在一些方面，免疫疗法(例如T细胞疗法)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用可以预防疾病负荷的增加，并且这可以通过疾病负荷无变化来证实。
在一些实施方案中，与使用替代疗法(如其中所述受试者接受免疫疗法，例如在不存在激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用的情况下单独的T细胞疗法的方法)通过可比较方法会观察到的降低相比，所述方法降低所述疾病或病症的负荷(例如肿瘤细胞数、肿瘤大小、患者存活或无事件存活的持续时间)至更大程度和/或持续更长时间段。在一些实施方案中，与通过单独施用每一种药剂(例如向未接受过免疫疗法(例如T细胞疗法)的受试者施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)；或向未接受过激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的受试者施用免疫疗法(例如T细胞疗法))所实现的降低相比，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的组合疗法后，在更大程度上或在更长的持续时间内降低了疾病负荷。
在一些实施方案中，检测、评估或测量所述受试者的疾病或病症的负荷。在一些方面，可以通过检测所述受试者中或所述受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中疾病细胞或疾病相关细胞(例如肿瘤细胞)的总数来检测疾病负荷。在一些实施方案中，通过测量转移的数量或程度来评估疾病负荷(例如肿瘤负荷)。在一些方面，评估所述受试者的存活、特定时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估所述疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，指定疾病或病症负荷的量度。在一些实施方案中，用于确定的示例性参数包括指示疾病或病症(例如肿瘤)的改善(amelioration)或改良(improvement)的特定临床结果。此类参数包括：疾病控制的持续时间，所述疾病控制包括完全反应(CR)、部分反应(PR)或疾病稳定(SD)(参见例如，实体瘤中的反应评价标准(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors，RECIST)指南)、客观反应率(ORR)、无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。可以设定参数的具体阈值以确定本文所提供的组合疗法方法的功效。
在一些方面，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)之前，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)后但在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之前，和/或在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和激酶抑制剂(例如依鲁替尼)二者后，测量或检测疾病负荷。在多次施用组合疗法的一个或多个步骤的情况下，在一些实施方案中，可以在施用任何步骤、剂量和/或施用周期之前或之后，或者在施用任何步骤、剂量和/或施用周期之间的时间，测量疾病负荷。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用进行至少两个周期(例如28天周期)，并且在每个周期之前、期间和/或之后测量或检测疾病负荷。
在一些实施方案中，与紧接在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)和免疫疗法(例如T细胞疗法)之前相比，通过所提供的方法，负荷的降低量为或至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与紧接在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和/或激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之前相比，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和激酶抑制剂(例如依鲁替尼)后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积降低至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，通过所述方法降低疾病负荷包括诱导形态学完全缓解，例如如在施用(例如，开始)组合疗法后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、或多于6个月时所评估。
在一些方面，例如如通过多参数流式细胞术所测量，对微小残留病的测定是阴性的，或者微小残留病的水平小于约0.3％、小于约0.2％、小于约0.1％或小于约0.05％。
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法提高所述受试者的无事件存活率或总体存活率。例如，在一些实施方案中，在本文所提供的组合疗法方法后6个月时，通过所述方法治疗的受试者的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总体存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用所述方法治疗的受试者展现出至少6个月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年的无事件存活、无复发存活或存活。在一些实施方案中，进展的时间得到改善，如进展的时间大于或大于约6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方案中，与其他方法相比，在通过所述方法治疗后，复发概率降低。例如，在一些实施方案中，在组合疗法方法后6个月时，复发概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
在一些情况下，确定所施用细胞(例如，过继转移细胞)的药代动力学，以评估利用度，例如，所施用细胞的生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被施用工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)、蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)、表位标签(如Strep-Tag序列，将其直接引入CAR中的特定位点，借此使用Strep-Tag的结合试剂直接评估CAR)(Liu等人(2016)NatureBiotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)和与CAR多肽特异性结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(例如CAR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002857331390001591
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。
在一些实施方案中，可以在施用所述细胞疗法后的时间段确定从患者获得的生物样品(例如，血液)中CAR+T细胞的数量，例如，以确定所述细胞的药代动力学。在一些实施方案中，在所述受试者的血液中或在通过所述方法如此治疗的大多数所述受试者中可检测的CAR+T细胞(任选地CAR+CD8+T细胞和/或CAR+CD4+T细胞)的数量是大于1个细胞/μL、大于5个细胞/μL或大于10个细胞/μL。
IV.毒性和不良结果
在所提供的方法的实施方案中，在施用了所提供的组合疗法(其包含细胞疗法(例如，T细胞疗法)和激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼))的受试者中，监测所述受试者的毒性或其他不良结果，包括治疗相关的结果，例如嗜中性粒细胞减少症、细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)的发生。在一些实施方案中，进行所提供的方法以降低毒性结果或症状、促进毒性的特征、因子或特性(如与严重嗜中性粒细胞减少症、严重的细胞因子释放综合征(CRS)或严重的神经毒性相关或指示其的症状或结果)的风险。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不导致高比率或可能性的毒性或毒性结果，或者降低毒性或毒性结果(如严重神经毒性(NT)或严重细胞因子释放综合征(CRS))的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不导致以下事件或不增加以下事件的风险：严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的CRP血浆水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现出高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出严重毒性结果(例如严重CRS或严重神经毒性)，如未展现出3级或更高级的神经毒性和/或未展现出严重CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不导致高比率或可能性的毒性或毒性结果，或者降低毒性或毒性结果(如严重神经毒性(NT)或严重细胞因子释放综合征(CRS))的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不导致以下事件或不增加以下事件的风险：严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的CRP血浆水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现出高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出严重毒性结果(例如严重CRS或严重神经毒性)，如未展现出3级或更高级的神经毒性和/或未展现出严重CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。
A.细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性
在一些方面，毒性结果是细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物产品后可能发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509-1518(2013)；和Kochenderfer等人,Blood 119,2709-2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。
通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症应答和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。严重的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他严重的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如抗IL-6抗体，例如托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。
CRS的结果、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或施用实现或不实现给定的CRS相关结果、体征或症状的情况下，可以指定特定结果、体征和症状和/或其量或程度。
在施用CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注表达CAR的细胞后6-20天时发生。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。
与CRS相关的示例性结果包括发热、寒颤、恶寒、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结果包括疲劳、恶心、头痛、癫痫、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、转氨酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。
在一些实施方案中，与CRS相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。
示例性CRS相关结果包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结果还包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)进行。
在一些实施方案中，CRS相关的血清因子或CRS相关的结果包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述因子或结果包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平(如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。
在一些实施方案中，在CAR治疗和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)治疗之前、期间或之后监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面，一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。
已经研发出CRS标准，其显现出与CRS的发作相关联，以预测哪些患者更可能有发生sCRS的风险(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状二者密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95)。在一些实施方案中，反映CRS等级的标准是下表3中详述的那些。
Figure BDA0002857331390001641
在一些实施方案中，认为受试者响应或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“严重CRS”(“sCRS”)，条件是在施用后所述受试者展示：(1)在至少38摄氏度发热至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少两种的至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5，和/或(b)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少一种的至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5；和(c)至少一种毒性临床体征，如低血压(需要至少一种静脉内血管作用加压药)或缺氧(PO2<90％)或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和/或癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括3级或更高级CRS，如表3所示。
在一些实施方案中，与严重CRS或3级CRS或更高级的CRS(如4级或更高级的CRS)相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，CRS(如严重CRS)包括以下的组合：(1)持续发热(至少38摄氏度的发热至少三天)和(2)CRP的血清水平为至少或至少约20mg/dL。在一些实施方案中，所述CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续施用中增加血管加压药的剂量。
在一些实施方案中，严重CRS或3级CRS涵盖丙氨酸转氨酶的增加、天冬氨酸转氨酶的增加、恶寒、发热性嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。
可以指定测量或检测各种结果的方法。
在一些方面，疗法(如细胞疗法)的毒性结果是神经毒性或严重的神经毒性或与神经毒性或严重的神经毒性相关或指示神经毒性或严重的神经毒性。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫(任选地如通过脑电图[EEG]确认)、β淀粉样蛋白(Aβ)水平升高、谷氨酸水平升高和氧自由基水平升高。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见例如，Guido Cavaletti&Paola MarmiroliNature Reviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。
在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经病学变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，神经病学变化的恢复是在sCRS的其他症状消退后发生。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会加速神经病学变化消退的时间或程度。
在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“严重神经毒性”，条件是在施用后所述受试者展示以下中的限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的症状：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(如感官知觉失真，导致异常和不适感)、神经痛(如沿神经或神经组的剧烈疼痛感)，和/或感觉异常(如感觉神经元的功能紊乱，导致在没有刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和温的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，严重神经毒性包括3级或更高级神经毒性，如表4所示。在一些实施方案中，如果症状或3级神经毒性持续10天或更长时间，则认为严重的神经毒性为延长的3级。
Figure BDA0002857331390001661
Figure BDA0002857331390001671
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结果或因素，包括与严重CRS或3级或更高级的CRS相关的症状、结果或因素。例如，根据本方法治疗的受试者可能缺少可检测的CRS(例如严重CRS或3级或更高级的CRS)的症状、结果或因素和/或具有减少的所述症状、结果或因素，如所述的(例如表3中陈述的)任何症状、结果或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。
在一些实施方案中，所述方法减轻与神经毒性相关的结果，包括对神经系统和/或脑的损伤，如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子(如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基)的水平。
在一些实施方案中，所述毒性结果是剂量限制性毒性(DLT)。在一些实施方案中，毒性结果是剂量限制性毒性的不存在。在一些实施方案中，剂量限制性毒性(DLT)被定义为任何3级或更高级的毒性，如通过任何已知或公开的用于评估特定毒性的指南所描述或评估，如上述任何指南并且包括国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CommonTerminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)4.0版。在一些实施方案中，当在施用所述细胞疗法(例如，T细胞疗法)和/或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)后发生以下讨论的任何事件时，定义了剂量限制性毒性(DLT)，所述事件包括a)发热性嗜中性粒细胞减少症；b)4级嗜中性粒细胞减少症持续约或超过约7天；c)3级或4级血小板减少症伴有临床上显著的出血；和d)4级血小板减少症持续超过24小时。
在一些实施方案中，所提供的实施方案导致毒性(例如CRS或神经毒性或严重CRS或神经毒性，例如3级或更高级的CRS或神经毒性)的发生率或发生风险低，如通过根据所提供的组合疗法施用一定剂量的T细胞观察到的和/或通过所提供的制品或组合物观察到的。在一些情况下，这允许在门诊基础上施用所述细胞疗法。在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)是在门诊基础上进行，或者不需要使所述受试者住院，如需要过夜停留的住院。
在一些方面，在施用所述细胞剂量之前或与其同时没有向根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)施用用于治疗任何毒性的干预，除非或直到所述受试者展现毒性(如神经毒性或CRS)的体征或症状。
在一些实施方案中，如果施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)展现发热，则给予所述受试者治疗或指示所述受试者接受或施用治疗，以减轻发热。在一些实施方案中，将所述受试者的发热表征为所述受试者的体温等于或高于某一阈值温度或水平(或在所述阈值温度或水平下测量)。在一些方面，所述阈值温度是与至少低度发热、与至少中度发热和/或与至少高度发热相关的温度。在一些实施方案中，所述阈值温度是特定的温度或范围。例如，所述阈值温度可以是为或约或至少或至少约38、39、40、41或42摄氏度，和/或可以是为或约38摄氏度至为或约39摄氏度的范围、为或约39摄氏度至为或约40摄氏度的范围、为或约40摄氏度至为或约41度的范围、或为或约41摄氏度至为或约42摄氏度的范围。
在一些实施方案中，被设计为减轻发热的治疗包括用退热药治疗。退热药可以包括降低发热的任何药剂、组合物或成分，如已知具有退热作用的许多药剂中的一种，如NSAID(如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、水杨酸盐(如阿司匹林、水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛、对乙酰氨基酚、安乃近、萘丁美酮、Phenaxone、安替比林、解热药。在一些实施方案中，所述退热药是对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，可以长达每四小时以12.5mg/kg的剂量口服或静脉内施用对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，所述退热药是或包含布洛芬或阿司匹林。
在一些实施方案中，如果所述发热是持续发热，则向所述受试者施用用于治疗毒性的替代性治疗。对于在门诊基础上治疗的受试者，如果所述受试者已经和/或被确定为患有或患有持续发热，则指示所述受试者返回医院。在一些实施方案中，如果所述受试者展现等于或高于相对阈值温度的发热，并且在指定治疗(如被设计为减轻发热的治疗，如使用退热药(例如NSAID或水杨酸盐，例如，布洛芬、对乙酰氨基酚或阿司匹林)的治疗)后，所述受试者的发热或体温不下降，或者不下降指定量或超过指定量(例如超过1℃，并且通常不会变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃)的情况下，所述受试者已经和/或被确定为或认为患有持续发热。例如，如果所述受试者展现或被确定为展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热即使在用诸如对乙酰氨基酚的退热药治疗后，在6小时时间段中、在8小时时间段中、或在12小时时间段中、或在24小时时间段中，没有降低或没有降低超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，或降低或降低约1％、2％、3％、4％或5％，则受试者被认为患有持续发热。在一些实施方案中，所述退热药的剂量是通常在这种受试者中有效减轻发热或特定类型的发热的剂量，所述特定类型的发热如与细菌或病毒感染(例如，局部或全身感染)相关的发热。
在一些实施方案中，如果所述受试者展现等于或高于相对阈值温度的发热，并且在所述受试者的发热或体温没有变动约或超过约1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃的情况下，所述受试者患有和/或被确定为或认为患有持续发热。所述高于或等于某一量的变动的不存在通常是在给定时间段中测量(如在24小时、12小时、8小时、6小时、3小时或1小时时间段中，其可以从首次发热体征或体温首次高于所指示阈值测量)。例如，在一些实施方案中，如果受试者展现至少或至少约或至少或至少约38或39摄氏度的发热，在6小时时间段中、在8小时时间段中、或在12小时时间段中、或在24小时时间段中，所述发热的温度没有变动超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，则认为或确定所述受试者展现持续发热。
在一些实施方案中，所述发热是持续发热；在一些方面，有可能诱导所述毒性的初始疗法(如所述细胞疗法，如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)后，在已经确定受试者患有持续发热时，如在这种确定或首次这种确定的1、2、3、4、5、6小时或更短时间内，治疗所述受试者。
在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，施用用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，施用所述一种或多种靶向毒性的疗法。
B.其他毒性
在一些方面，在施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)后，毒性结果是一种或多种非血液毒性或与一种或多种非血液毒性相关或指示一种或多种非血液毒性。非血液毒性的例子包括但不限于燃瘤反应、感染、肿瘤溶解综合征、心脏实验室异常、一个或多个血栓栓塞事件(如深静脉血栓形成和肺栓塞)和/或肺炎。
在一些方面，所述非血液毒性是燃瘤反应(TFR)(有时也称为假性进展)。TFR是携带疾病部位(包括淋巴结、脾和/或肝)的大小突然增加，通常伴有低烧、压痛和肿胀、弥散性皮疹以及在一些情况下外周血淋巴细胞计数的增加。在一些实施方案中，根据不良事件通用术语标准(3.0版；美国国家癌症研究所，美国马里兰州贝塞斯达)对TFR进行分级。在一些实施方案中，TFR分级如下：1级，轻度疼痛，不妨碍功能；2级，中度疼痛，疼痛或镇痛药，妨碍功能但不妨碍日常生活活动(ADL)；3级，重度疼痛，疼痛或镇痛药，妨碍功能并且妨碍ADL；4级，残疾；5级，死亡。在一些实施方案中，可以向所述受试者施用一种或多种药剂(如皮质类固醇、NSAID和/或麻醉性镇痛药)以治疗、改善或减少与TFR相关的一种或多种症状。
在一些方面，所述非血液毒性是肿瘤溶解综合征(TLS)。在一些实施方案中，可以根据由Cairo-Bishop分级系统(Cairo和Bishop(2004)Br J Haematol,127:3-11)规定的标准对TLS进行分级。在一些实施方案中，可以向受试者给予静脉补液(hydration)以减少高尿酸血症。
在一些实施方案中，可以例如通过监测ECGS、LVEF以及监测肌钙蛋白-T和BNP的水平来监测受试者的心脏毒性。在一些实施方案中，如果观察到在一种或多种心脏症状的情况下肌钙蛋白-T和/或BNP水平升高，则可能发生潜在地可能需要控制或暂停激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的心脏毒性。
在所提供的方法的一些实施方案中，如果确定受试者展现出非血液毒性(如TFR或其他非血液毒性或其特定等级)，则可以改变使用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的循环治疗。在一些方面，如果在施用激酶抑制剂(例如依鲁替尼)之后所述受试者具有3级或更高级的非血液毒性(如3级或更高级TFR)，则改变所述循环疗法。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用被永久停止或暂停直到毒性的体征或症状得到缓解、减少或降低。可以对所述受试者进行持续监测以评估毒性的一种或多种体征或症状。在一些情况下，如果毒性得到缓解或降低，则可以在暂停循环疗法之前以相同剂量或给药方案，以较低或降低的剂量和/或按包括较不频繁的给药的给药方案重新开始激酶抑制剂(例如依鲁替尼)的施用。在一些实施方案中，在重新开始循环疗法的情况下，将所述剂量减少或降低至少或至少约或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或60％。在一些实施方案中，如果在暂停所述细胞疗法之前的剂量是2mg(例如给予5/7天)，则将所述剂量降低至1mg(给予5/7天)。在一些实施方案中，如果即使在降低剂量后仍再次发生3级毒性，则可以进一步降低剂量。在一些实施方案中，如果即使在降低剂量后仍再次发生4级毒性，则可以永久中止循环疗法。在一些方面，如果血液毒性的严重程度使得循环疗法的暂停大于4周，则可以永久中止循环疗法。
V.制品和试剂盒
还提供了制品，所述制品含有激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)以及用于免疫疗法的组分(例如抗体或其抗原结合片段或T细胞疗法，例如工程化细胞)和/或其组合物。所述制品可以包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，容器容纳组合物本身或组合物与可有效治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物的组合。在一些实施方案中，容器具有无菌入口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶(包括具有可被注射用针刺穿的塞子的那些)或用于口服施用药剂的瓶子或小瓶。标签或包装说明书可以指示所述组合物用于治疗疾病或病症。
所述制品可以包括(a)在其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括用于免疫疗法(例如T细胞疗法)的工程化细胞；和(b)在其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)。
在一些实施方案中，所述第一容器包含第一组合物和第二组合物，其中所述第一组合物包含用于免疫疗法的工程化细胞的第一群体(例如CD4+T细胞疗法)，并且所述第二组合物包含工程化细胞的第二群体，其中所述第二群体可以与所述第一群体分开进行工程化(例如CD8+T细胞疗法)。在一些实施方案中，所述第一和第二细胞组合物含有确定比率的工程化细胞(例如CD4+和CD8+细胞)(例如，1:1比率的CD4+:CD8+CAR+T细胞)。
所述制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指示所述组合物可以用于治疗特定病症。可替代地或另外地，制品还可以包括另一个或相同容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液。它可以还包括其他材料，如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和/或注射器。
VI.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不利影响或结果、或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一种或多种影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如B细胞恶性肿瘤)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可以延迟晚期B细胞恶性肿瘤，如转移的发生。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目的条件或参数以外其他都相同的条件相比时，或者可替代地如与另一种条件相比，降低功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低肿瘤的生长速率。
在施用的情境下，药剂(例如，工程化细胞或抗PD-L1或抗原结合片段或其药物配制品或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，工程化细胞或抗PD-L1或抗原结合片段或其药物配制品或组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下等因素而变化：疾病状态、所述受试者的年龄、性别和体重、以及所施用的免疫调节多肽或工程化细胞。在一些实施方案中，所提供的方法包括以有效量(例如治疗有效量)施用激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)、工程化细胞(例如细胞疗法)或组合物。
“预防有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或在疾病较早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈如下形式以允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且其不含对会被施用所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。应理解，本文所述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所述)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导，鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导与它们操作性连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变型后代。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常是表面标记)在细胞上或在细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下可通过流式细胞术检测，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常是表面标记)在细胞上或在细胞中不存在实质可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下通过流式细胞术没有被检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比基本上相似。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如抗体)和针对所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能包括将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能包括将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或激酶抑制剂(如BTK/ITK抑制剂，例如依鲁替尼)(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
VII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure BDA0002857331390001771
以及
(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，
其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
2.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure BDA0002857331390001772
(2)从所述受试者获得生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物；
(3)向所述受试者施用包含一定剂量的基因工程化T细胞的自体T细胞疗法，
其中所述激酶抑制剂的施用是按如下给药方案进行的，所述给药方案是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的所述化合物的施用。
3.一种治疗方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂具有结构
Figure BDA0002857331390001781
其中所述受试者是用自体T细胞疗法治疗的候选者或将要用自体T细胞疗法治疗，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中：
在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰；并且
所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂持续一定的时间段，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
4.根据实施方案3所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用所述T细胞疗法。
5.根据实施方案1、2和实施方案4中任一项所述的方法，其中在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。
6.根据实施方案1、2和实施方案4中任一项所述的方法，所述方法还包括在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
7.根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止所述激酶抑制剂的施用。
8.根据实施方案5-7中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法。
9.根据实施方案5-7中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
10.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂具有结构
Figure BDA0002857331390001791
(2)向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及
(3)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，
其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述方法还包括从所述受试者获得所述生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物。
12.根据实施方案中1-11中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约4天、至少或至少约5天、至少为或6天、至少或至少约7天、至少或至少约14天或更长时间开始的。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或为或约5天至7天开始的。
14.根据实施方案5-13中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。
15.根据实施方案5-14中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成的。
16.根据实施方案9-15中任一项所述的方法，其中所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长15天至29天。
17.根据实施方案9-16中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中将所述激酶抑制剂的施用在所述给药方案期间在施用其的每一天中每天进行一次。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述有效量包含在施用所述激酶抑制剂的每一天中从或从约140mg至约840mg或140mg至约560mg。
20.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure BDA0002857331390001801
以及
(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，
其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约5至7天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用；和进一步施用，其在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。
21.根据实施方案20所述的方法，其中在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。
22.根据实施方案20所述的方法，所述方法还包括在施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。
24.根据实施方案20-23中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成的。
25.根据实施方案22-24中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂。
26.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述激酶抑制剂具有结构
Figure BDA0002857331390001811
和
(2)向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及
(3)在完成所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天内向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，
其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约5至7天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述重复施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。
27.根据实施方案20-26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述受试者获得所述生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是从或从约280mg至560mg。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约7天开始的。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中：
所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约30至40天开始的；
在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23至38天从所述受试者获得所述样品；和/或
所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前5至7天完成的。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中：
所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约35天开始的；
在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约28至32天从所述受试者获得所述样品；和/或
所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前5至7天完成的。
32.根据实施方案5-31中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。
33.根据实施方案5-32中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约200-400mg/m2、任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，包含端值；和/或为或约20-40mg/m2、任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天、任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为或约500mg/m2的环磷酰胺。
34.根据实施方案5-33中任一项所述的方法，其中：
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约140mg的量。
36.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约280mg的量。
37.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约420mg的量。
38.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约560mg的量。
39.根据实施方案9-38中任一项所述的方法，其中所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于四个月，或者在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于五个月。
40.根据实施方案9-39中任一项所述的方法，其中所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段延长为或约或大于六个月。
41.根据实施方案9-40中任一项所述的方法，其中：
如果在所述时间段结束时所述受试者展现出所述治疗后的完全反应(CR)，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用；或者
如果在所述时间段结束时所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。
42.根据实施方案9-41中任一项所述的方法，其中所述时间段延长从或从为或约三个月至为或六个月。
43.根据实施方案9-42中任一项所述的方法，其中所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约三个月。
44.根据实施方案9-42中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约3个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
45.根据实施方案44所述的方法，其中如果所述受试者已经在3个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
46.根据实施方案9-42中任一项所述的方法，其中所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约六个月。
47.根据实施方案9-42中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
48.根据实施方案47所述的方法，其中如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
49.根据实施方案9-48中任一项所述的方法，其中即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述进一步施用仍在所述时间段的持续时间内继续进行。
50.根据实施方案9-49中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述时间段期间且在所述时间段结束之前的某个时间实现完全反应(CR)。
51.根据实施方案9-40、42、43、44、46和47中任一项所述的方法，所述方法还包括如果在所述时间段结束时所述受试者展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则在所述时间段结束之后继续进行所述进一步施用。
52.根据实施方案9-40、42、43、44、46、47和51中任一项所述的方法，其中如果在为或约六个月时所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述进一步施用继续进行大于六个月。
53.根据实施方案51或实施方案52所述的方法，其中所述进一步施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和/或抑制IL2诱导型T细胞激酶(ITK)。
55.根据实施方案1-54中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂抑制ITK并且所述抑制剂抑制ITK或抑制ITK，其中半最大抑制浓度(IC50)为小于或小于约1000nM、900nM、800nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或更小。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中在(1)中施用所述激酶抑制剂之前，先前已向所述受试者施用所述激酶抑制剂。
57.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中在(1)中施用所述激酶抑制剂之前，先前尚未向所述受试者施用所述激酶抑制剂。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的方法，其中：
(i)所述受试者和/或所述癌症(a)对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性和/或(b)包含对被所述激酶抑制剂抑制有抗性的细胞群，任选地其中所述细胞群是或包含B细胞群和/或不包含T细胞；
(ii)所述受试者和/或所述癌症包含编码BTK的核酸中的突变，任选地其中所述突变能够减少或防止所述激酶抑制剂对所述BTK的抑制，任选地其中所述突变是C481S；
(iii)所述受试者和/或所述癌症包含编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845F；
(iv)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗是难治性的；
(v)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展；和/或
(vi)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
62.根据实施方案61所述的方法，其中所述NHL包含侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS、任选地转化惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)、任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为或已被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中将所述激酶抑制剂口服施用。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述CD19是人CD19。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含与所述CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和含有ITAM的细胞内信号传导结构域。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。
68.根据实施方案66或实施方案67所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区域。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。
70.根据实施方案68或实施方案69所述的方法，其中所述共刺激结构域是或包含人4-1BB的信号传导结构域。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中：
所述CAR包含对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包含4-1BB、任选地人4-1BB；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；
所述CAR依次包含对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含4-1BB信号传导结构域、任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；或者
所述CAR依次包含对所述CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域。
72.根据实施方案71所述的方法，其中
所述CAR包含间隔子并且所述间隔子是如下多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包含免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；(b)包含免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；或者(c)长度是为或约12个氨基酸，和/或包含免疫球蛋白铰链、任选地IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成；或者(d)具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体；或者(e)包含式X1PPX2P(SEQ ID NO:58)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸；和/或
所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的其变体；和/或
所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:13或14或15与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性；和/或
所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列、和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列，和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列、和/或YAMDYWG(SEQ IDNO:40)的CDRH3序列，或者其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与任何前述项结合相同的表位或与任何前述项竞争结合，并且任选地其中所述scFv依次包含VH、任选地包含SEQ ID NO:41的接头和VL，和/或所述scFv包含柔性接头和/或包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
73.根据实施方案1-72中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。
74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。
76.根据实施方案1-75中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含为或约1x108个CAR表达细胞。
77.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞，并且所述剂量的施用包括多种单独组合物的施用，所述多种单独组合物包含含有所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物和含有所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。
78.根据实施方案77所述的方法，其中：
将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或
所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
79.根据实施方案77或实施方案78所述的方法，其中将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
80.根据实施方案77-79中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
81.根据实施方案77-79中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
82.根据实施方案77-81中任一项所述的方法，其中将所述第一组合物在所述第二组合物之前施用。
83.根据实施方案1-82中任一项所述的方法，其中将所述剂量的细胞肠胃外、任选地静脉内施用。
84.根据实施方案1-83中任一项所述的方法，其中所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞。
85.根据实施方案1-82中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
86.根据实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述加工包括：
从获自所述受试者的样品分离T细胞、任选地CD4+和/或CD8+T细胞，从而产生包含原代T细胞的输入组合物；以及
将编码所述CAR的核酸分子引入所述输入组合物的T细胞中。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
88.根据实施方案1-87中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
89.根据实施方案86-88中任一项所述的方法，其中在所述引入之前，所述加工包括在刺激条件下孵育所述输入组合物，所述刺激条件包括能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂的存在，从而产生经刺激的组合物，其中将编码所述CAR的核酸分子引入所述经刺激的组合物中。
90.根据实施方案89所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性结合、任选地与CD3特异性结合的一级药剂。
91.根据实施方案90所述的方法，其中所述刺激试剂还包含与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
92.根据实施方案90或实施方案91所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包含抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
93.根据实施方案90-92中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠，任选地其中所述珠是磁性的或超顺磁性的。
95.根据实施方案94所述的方法，其中所述珠包含大于或大于约3.5μm，但是不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。
96.根据实施方案94或实施方案95所述的方法，其中所述珠包含为或约4.5μm的直径。
97.根据实施方案1-96中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激的组合物的细胞。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
99.根据实施方案97或实施方案98所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
100.根据实施方案86-99中任一项所述的方法，其中所述加工还包括在所述引入之后培育所述T细胞，任选地其中所述培育是在导致细胞增殖或扩增的条件下进行的，以产生包含所述T细胞疗法的输出组合物。
101.根据实施方案100所述的方法，其中在所述培育之后，所述方法还包括配制所述输出组合物的细胞用于冷冻保存所述T细胞疗法和/或用于向所述受试者施用所述T细胞疗法，任选地其中所述配制是在存在药学上可接受的赋形剂的情况下进行的。
102.根据实施方案1-101中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
103.根据实施方案1-102中任一项所述的方法，其中：
根据所述方法治疗的受试者的至少35％、至少40％或至少50％实现完全反应(CR)，所述完全反应可持续或在实现所述CR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％中可持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中到六个月时实现CR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％保持反应、保持CR和/或存活或在没有进展的情况下存活持续为或大于3个月和/或为或大于6个月和/或为或大于九个月；和/或
根据所述方法治疗的受试者的至少50％、至少60％或至少70％实现客观反应(OR)，任选地其中所述OR可持续或在实现所述OR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％中可持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中到六个月时实现OR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％保持反应或存活持续为或大于3个月和/或为或大于6个月。
104.根据实施方案60-103中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞的时间或紧接其之前，所述受试者已经在用针对所述淋巴瘤、任选地所述NHL的一种或多种先前疗法、任选地除另一剂量的表达所述CAR的细胞之外的一种、两种或三种先前疗法治疗之后的缓解后复发，或者变得对于所述先前疗法是难治性的。
105.根据实施方案60-104中任一项所述的方法，其中在施用包含所述剂量的细胞的T细胞疗法时或之前：
所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；
所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有化疗难治性淋巴瘤、任选地化疗难治性DLBCL；和/或
所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全反应(CR)。
106.一种试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个单位剂量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure BDA0002857331390001921
以及用于向患有癌症的受试者施用所述一个或多个单位剂量的说明书，所述患有癌症的受试者是用自体T细胞疗法治疗的候选者或将要用自体T细胞疗法治疗，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，并且其中在施用所述T细胞疗法之前，从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸引入所述T细胞中进行基因修饰，
其中所述说明书指定在获得所述样品之前为或至少约3天并且按如下给药方案开始向所述受试者施用单位剂量的所述激酶抑制剂，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用一个或多个单位剂量，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
107.根据实施方案106所述的试剂盒，其中所述说明书还指定向所述受试者施用所述T细胞疗法。
108.根据实施方案106或实施方案107所述的试剂盒，其中所述说明书还指定在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
109.根据实施方案108所述的试剂盒，其中所述说明书指定在施用所述淋巴细胞清除疗法期间应中止所述激酶抑制剂的施用。
110.根据实施方案108或实施方案109所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段至少延长直到开始所述淋巴细胞清除疗法。
111.根据实施方案108-110中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
112.根据实施方案中106-111中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约4天、至少或至少约5天、至少或至少约6天、至少或至少约7天、至少或至少约14天或更长时间开始的。
113.根据实施方案106-112中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约5天至7天开始的。
114.根据实施方案108-113中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法的施用应在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成。
115.根据实施方案108-1114中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法的施用应在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成。
116.根据实施方案111-115中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述激酶抑制剂的进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。
117.根据实施方案106-116中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述激酶抑制剂的每个单位剂量的施用在所述给药方案期间在施用其的每一天中每天进行一次。
118.根据实施方案106-117中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个单位剂量各自包含从或从约140mg至约840mg。
119.根据实施方案106-118中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个单位剂量各自包含在施用所述激酶抑制剂的每一天中从或从约140mg至约560mg。
120.根据实施方案106-119中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个单位剂量各自包含从或从约280mg至560mg。
121.根据实施方案106-120中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前最少或最少约7天开始的。
122.根据实施方案106-121中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定：
所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约30至40天开始的；
在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23至38天从所述受试者获得所述样品；和/或
所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前5至7天完成的。
123.根据实施方案106-122中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定：
所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约35天开始的；
在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约28至32天从所述受试者获得所述样品；和/或
所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前5至7天完成的。
124.根据实施方案108-123中任一项所述的试剂盒，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。
125.根据实施方案108-124中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述淋巴细胞清除疗法的施用包括每天施用为或约200-400mg/m2、任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，包含端值；和/或为或约20-40mg/m2、任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天、任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为或约500mg/m2的环磷酰胺。
126.根据实施方案108-125中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定：
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
127.根据实施方案106-126中任一项所述的试剂盒，其中所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约140mg和/或所述说明书指定将所述激酶抑制剂在施用其的每一天中以为或约140mg的量施用。
128.根据实施方案106-127中任一项所述的试剂盒，其中所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约280mg和/或所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约280mg的量。
129.根据实施方案106-128中任一项所述的试剂盒，其中所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约420mg和/或所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约420mg的量。
130.根据实施方案106-129中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的每个单位剂量是或是约560mg和/或所述说明书指定所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约560mg的量。
131.根据实施方案111-130中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于四个月。
132.根据实施方案111-131中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于五个月。
133.根据实施方案111-132中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段延长为或约或大于六个月。
134.根据实施方案111-133中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果在所述时间段结束时所述受试者展现出所述治疗后的完全反应(CR)，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。
135.根据实施方案111-134中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果在所述时间段结束时所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。
136.根据实施方案111-135中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述时间段延长从或从为或约三个月至为或六个月。
137.根据实施方案111-136中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约三个月。
138.根据实施方案111-136中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果所述受试者已经在为或约3个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
139.根据实施方案138所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果所述受试者已经在3个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
140.根据实施方案111-136中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约六个月。
141.根据实施方案111-136中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
142.根据实施方案141所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
143.根据实施方案111-142中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述进一步施用仍在所述时间段的持续时间内继续进行。
144.根据实施方案111-133、136、137、138、140和141中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果在所述时间段结束时所述受试者展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则还包括在所述时间段结束之后继续进行所述进一步施用。
145.根据实施方案111-133、136、137、138、140、141和144中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定如果在为或约六个月时所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述进一步施用继续进行大于六个月。
146.根据实施方案144或实施方案144所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述进一步施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
147.根据实施方案106-146中任一项所述的试剂盒，其中所述激酶抑制剂抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和/或抑制IL2诱导型T细胞激酶(ITK)。
148.根据实施方案106-147中任一项所述的试剂盒，其中所述激酶抑制剂抑制ITK并且所述抑制剂抑制ITK或抑制ITK，其中半最大抑制浓度(IC50)为小于或小于约1000nM、900nM、800nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或更小。
149.根据实施方案106-148中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定在施用所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂之前，先前已经或可能已经向所述受试者施用所述激酶抑制剂。
150.根据实施方案106-148中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定在施用所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂之前，先前尚未向所述受试者施用所述激酶抑制剂或者所述受试者是先前尚未施用所述激酶抑制剂的受试者。
151.根据实施方案106-150中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定：
(i)所述受试者和/或所述癌症(a)对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性和/或(b)包含对被所述激酶抑制剂抑制有抗性的细胞群，任选地其中所述细胞群是或包含B细胞群和/或不包含T细胞；
(ii)所述受试者和/或所述癌症包含编码BTK的核酸中的突变，任选地其中所述突变能够减少或防止所述激酶抑制剂对所述BTK的抑制，任选地其中所述突变是C481S；
(iii)所述受试者和/或所述癌症包含编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845F；
(iv)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗是难治性的；
(v)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展；和/或
(vi)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。
152.根据实施方案106-151中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。
153.根据实施方案152所述的试剂盒，其中所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。
154.根据实施方案153所述的试剂盒，其中所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
155.根据实施方案154所述的试剂盒，其中所述NHL包含侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS、任选地转化惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)、任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
156.根据实施方案106-155中任一项所述的试剂盒，其中所述受试者被鉴定为或已被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。
157.根据实施方案106-156中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂被配制用于口服施用和/或所述说明书还指定将所述一个或多个单位剂量的所述激酶抑制剂口服施用。
158.根据实施方案106-157中任一项所述的试剂盒，其中所述CD19是人CD19。
159.根据实施方案106-158中任一项所述的试剂盒，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含与所述CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和含有ITAM的细胞内信号传导结构域。
160.根据实施方案159所述的试剂盒，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。
161.根据实施方案159或实施方案160所述的试剂盒，其中所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区域。
162.根据实施方案161所述的试剂盒，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。
163.根据实施方案161或实施方案162所述的试剂盒，其中所述共刺激结构域是或包含人4-1BB的信号传导结构域。
164.根据实施方案106-163中任一项所述的试剂盒，其中：
所述CAR包含对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包含4-1BB、任选地人4-1BB；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；
所述CAR依次包含对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含4-1BB信号传导结构域、任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；或者
所述CAR依次包含对所述CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域。
165.根据实施方案164所述的试剂盒，其中
所述CAR包含间隔子并且所述间隔子是如下多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包含免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；(b)包含免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；或者(c)长度是为或约12个氨基酸，和/或包含免疫球蛋白铰链、任选地IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成；或者(d)具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体；或者(e)包含式X1PPX2P(SEQ ID NO:58)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸；和/或
所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的其变体；和/或
所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:13或14或15与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性；和/或
所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列、和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列，和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列、和/或YAMDYWG(SEQ IDNO:40)的CDRH3序列，或者其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与任何前述项结合相同的表位或与任何前述项竞争结合，并且任选地其中所述scFv依次包含VH、任选地包含SEQ ID NO:41的接头和VL，和/或所述scFv包含柔性接头和/或包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
166.根据实施方案106-165中任一项所述的试剂盒，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。
167.根据实施方案106-166中任一项所述的试剂盒，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
168.根据实施方案106-167中任一项所述的试剂盒，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。
169.根据实施方案106-168中任一项所述的试剂盒，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含为或约1x108个CAR表达细胞。
170.根据实施方案106-169中任一项所述的试剂盒，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞，并且所述说明书指定所述剂量的施用包括多种单独组合物的施用，所述多种单独组合物包含含有所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物和含有所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。
171.根据实施方案170所述的试剂盒，其中所述说明书指定：
将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或
所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
172.根据实施方案170或实施方案171所述的试剂盒，其中所述说明书指定将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
173.根据实施方案170-172中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
174.根据实施方案170-172中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
175.根据实施方案170-174中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定将所述第一组合物在所述第二组合物之前施用。
176.根据实施方案106-175中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定将所述剂量的细胞肠胃外、任选地静脉内施用。
177.根据实施方案106-176中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞。
178.根据实施方案106-177中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
179.根据实施方案106-178中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指定用于产生所述T细胞疗法的过程。
180.根据实施方案106-179中任一项所述的试剂盒，其中用于产生所述T细胞疗法的过程包括：
从获自所述受试者的样品分离T细胞、任选地CD4+和/或CD8+T细胞，从而产生包含原代T细胞的输入组合物；以及
将编码所述CAR的核酸分子引入所述输入组合物中。
181.根据实施方案180所述的试剂盒，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
182.根据实施方案106-181中任一项所述的试剂盒，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
183.根据实施方案180-182中任一项所述的试剂盒，其中在所述引入之前，所述过程包括在刺激条件下孵育所述输入组合物，所述刺激条件包括能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂的存在，从而产生经刺激的组合物，其中将编码所述CAR的核酸分子引入所述经刺激的组合物中。
184.根据实施方案183所述的试剂盒，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性结合、任选地与CD3特异性结合的一级药剂。
185.根据实施方案184所述的试剂盒，其中所述刺激试剂还包含与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
186.根据实施方案184或实施方案185所述的试剂盒，其中所述一级和/或二级药剂包含抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
187.根据实施方案184-186中任一项所述的试剂盒，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
188.根据实施方案187所述的试剂盒，其中所述固体支持物是或包含珠，任选地其中所述珠是磁性的或超顺磁性的。
189.根据实施方案188所述的试剂盒，其中所述珠包含大于或大于约3.5μm，但是不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。
190.根据实施方案188或实施方案189所述的试剂盒，其中所述珠包含为或约4.5μm的直径。
191.根据实施方案106-190中任一项所述的试剂盒，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激的组合物的细胞。
192.根据实施方案191所述的试剂盒，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
193.根据实施方案191或实施方案192所述的试剂盒，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
194.根据实施方案180-193中任一项所述的试剂盒，其中所述过程还包括在所述引入之后培育所述T细胞，任选地其中所述培育是在导致细胞增殖或扩增的条件下进行的，以产生包含所述T细胞疗法的输出组合物。
195.根据实施方案194所述的试剂盒，其中在所述培育之后，所述过程还包括配制所述输出组合物的细胞用于冷冻保存所述T细胞疗法和/或用于向所述受试者施用所述T细胞疗法，任选地其中所述配制是在存在药学上可接受的赋形剂的情况下进行的。
196.根据实施方案106-195中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述受试者是人。
197.根据实施方案106-196中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定在施用包含所述剂量的细胞的T细胞疗法时或之前：
所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；
所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有化疗难治性淋巴瘤、任选地化疗难治性DLBCL；和/或
所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全反应(CR)。
198.一种试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个单位剂量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure BDA0002857331390002031
以及用于进行根据权利要求1-105中任一项所述的方法的说明书。
199.一种制品，所述制品包含根据实施方案106-198中任一项所述的试剂盒。
VIII.实施例
仅出于说明性目的包括以下实施例，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：在存在依鲁替尼的情况下CAR表达T细胞表型和功能的评估
在体外研究中对在存在Btk抑制剂依鲁替尼(具有结构：
Figure BDA0002857331390002041
)的情况下CAR表达T细胞的特性进行了评估。
为了产生CAR表达T细胞，通过基于免疫亲和力的富集从三个健康的人供体受试者分离T细胞，并且将来自每个供体的细胞激活并用编码抗CD19 CAR的病毒载体转导。CAR含有抗CD19 scFv、Ig来源的间隔子、人CD28来源的跨膜结构域、人4-1BB来源的细胞内信号传导结构域和人CD3ζ来源的信号传导结构域。编码CAR的核酸构建体还包括用作转导标记的截短的EGFR(tEGFR)序列，其通过自切割T2A序列与CAR序列分开。
对于每个供体，单独地将CAR表达CD4+细胞和CAR表达CD8+细胞1:1混合，并在多种条件下在体外评估每个供体的合并细胞。
A.细胞溶解活性
将如上所述产生的CAR T细胞一式三份铺板在聚D-赖氨酸板上，然后与依鲁替尼抗性CD19表达靶细胞(被转导以表达CD19的K562细胞，K562-CD19)以2.5:1的效应子与靶标(E:T)比率共培养。用NucLight Red(NLR)标记靶细胞以允许通过显微术追踪靶细胞。将依鲁替尼以5000、500、50、5和0.5nM的浓度添加至培养物中，所述浓度反映了涵盖观察为超生理(500nM)和Cmax(227nM)的剂量的剂量范围。在不存在依鲁替尼的情况下在存在靶细胞的情况下孵育的CAR-T细胞用作“未处理的”对照。通过测量如通过红色荧光信号(使用
Figure BDA0002857331390002042
活细胞分析系统，Essen Bioscience)所确定的在四天的时间段内活靶细胞的损失来评估细胞溶解活性。通过以下方式评估靶标杀伤的百分比(％)：测量随时间的归一化靶细胞计数的曲线下面积(AUC)，并通过定义0％值(仅靶细胞)和100％值(在媒介物对照中与靶细胞共培养的CAR+T细胞)将AUC倒数(1/AUC)值归一化。
如通过显微术所示的，在靶细胞生长的初始时间段之后，观察到来自所有供体的抗CD19 CAR T细胞在四天的时间段内减少靶细胞数量，从而证明了在测定中的有效杀伤(图1A)。在细胞毒性测定的开始和结束时与CAR T细胞共培养的靶细胞的代表性图像显示在图1B中。如图1C中所示，使用曲线下面积(AUC)计算得到的通过用依鲁替尼处理的CAR-T细胞导致的靶细胞杀伤针对未处理的对照的归一化显示，对于两个供体，即使浓度增加至超生理水平(500nM)，依鲁替尼并没有显著在该测定中影响抗CD19CAR表达T细胞的细胞溶解活性。在共培养期间测试的所有浓度下，依鲁替尼的添加均不抑制抗CD19 CAR T细胞的细胞溶解功能。然而，对于用依鲁替尼处理的一个供体观察到适度增加的靶细胞杀伤(P<0.0001)(图1C)。
B.CAR-T细胞表面标记的表达。
为了评估在存在依鲁替尼的情况下培养的抗CD19 CAR T细胞的多种表型标记，在用表达CD19的经辐照的K562靶细胞刺激后的4天内追踪CAR+、CD4+和CD8+细胞(来自三个供体)上的一组激活标记。将如上所述产生的CAR-T细胞以100,000个细胞/孔铺板在96孔聚D-赖氨酸包被的板上。以2.5:1的效应子与靶标比率添加经辐照的K562-CD19靶细胞。持续培养的持续时间，在不存在依鲁替尼的情况下或在存在浓度为5000、500、50、5和0.5nM的依鲁替尼的情况下将细胞培养最多4天。在第1、2、3和4天收获细胞，并通过流式细胞术分析细胞的T细胞激活和分化表面标记CD69、CD107a、PD-1、CD25、CD38、CD39、CD95、CD62L、CCR7、CD45RO以及截短的EGFR(CAR转导细胞的替代标记)。
在3个不同的抗CD19 CAR T细胞供体中，浓度为5000、500、50、5和0.5nM的依鲁替尼对截短的EGFR替代标记的表达，激活标记CD25、CD38、CD39、CD95和CD62L中的任一种，或该研究中评估的T细胞表型标记(CCR7、CD62L和CD45RO)中的任一种没有显著影响，这与以下结论一致，即依鲁替尼在该测定中不显著影响T细胞的激活状态和/或分化/亚型。图2A描绘了示例性标记的结果。图2B中的结果显示用依鲁替尼处理不影响细胞(如中枢记忆(TCM)或效应记忆(TEM)子集)的表型，如通过CCR7和CD45RA的表达所评估的。如图2C和图2D中所示，当在存在依鲁替尼的情况下分别培养CD4+或CD8+细胞时，CD69、CD107a或PD-1的表达水平有不易察觉的降低。在所测试的抑制剂的最高(超生理)浓度下观察到表达此类标记的抗CD19 CAR T细胞的百分比的不易察觉的降低。
C.细胞因子产生
通过评估CAR-T细胞和经辐照的K562-CD19靶细胞的共培养物的上清液中的细胞因子水平来评估在存在或不存在依鲁替尼的情况下培养的抗CD19 CAR T细胞的细胞因子的产生。将如上所述产生的CAR-T细胞以100,000个细胞/孔铺板在以2.5:1的效应子与靶标比率添加了经辐照的靶细胞(K562-CD19)的96孔聚D-赖氨酸包被的板上。持续最多4天的培养的持续时间，在不存在依鲁替尼的情况下或在存在0.5、5、50或500nM依鲁替尼的情况下将细胞培养最多4天。在第1、2、3和4天每24小时收获一次培养物上清液，并使用来自MesoScale Discovery(MSD)的细胞因子试剂盒从培养物上清液测量IFNγ、IL-2、TNFa、IL-4和IL-10。
图3A描绘了由供体2产生的CAR-T细胞在4天中的细胞因子产生动力学的代表性图。图3B描绘了在2个独立实验中刺激2天后细胞因子产生的绝对变化。如图3A和图3B中所示，生理浓度的依鲁替尼没有显著降低细胞因子浓度。响应于50nM依鲁替尼，观察到IFN-γ和IL-2有所增加。50nM的依鲁替尼在一些供体中适度增加了细胞因子产生，并且在500nM依鲁替尼的情况下观察到IL-2平均降低了19.6％或1200pg/mL(P<0.05)(图3B)。
D.连续再刺激
在一些方面，在重复刺激后细胞离体扩增的能力可以指示CAR-T细胞持续存在的能力(例如，在初始激活后)和/或指示在体内的功能和/或适应性(Zhao等人(2015)CancerCell,28:415-28)。将如上所述产生的抗CD19 CAR+T细胞以100,000个细胞/孔一式三份铺板在96孔聚D-赖氨酸包被的板上，并以2.5:1的效应子与靶标比率添加经辐照的靶细胞(K562-CD19)。将细胞在存在500和50nM依鲁替尼的情况下进行刺激，每3-4天收获一次，计数，并在每一轮将细胞数量重置为初始接种密度之后使用相同的培养条件和添加浓度的依鲁替尼进行培养以供用新的靶细胞再刺激。在25天培养期期间进行总共7轮刺激。
对于每一轮刺激，确定细胞数量的倍数变化(图4A)和倍增数量(图4B)。如图4A和图4B中所示，依鲁替尼的存在不影响(例如，不抑制)抗CD19 CAR T细胞的初始生长，如细胞数量的倍数变化或群体倍增的数量所观察到的。如图4B中所示，然而，到刺激的第18天，在多轮再刺激后，观察到两种评估浓度的依鲁替尼导致通过工程化源自所评估的三个供体中的两个的T细胞产生的抗CD19 CAR T细胞的细胞数量和群体倍增增加。与源自另一个供体的细胞相比，源自这两个供体的细胞总体上在不存在依鲁替尼的情况下在连续再刺激测定中表现较差。图4C总结了这三个供体的在存在依鲁替尼的情况下刺激后第4天(1轮再刺激)和第18天(5轮再刺激)培养物中的细胞数量的结果。如所示，在连续刺激测定的18天后观察到细胞数量的统计上显著的增加。特别地，在五轮刺激后(第18天)，相对于对照细胞，来自用最高浓度的依鲁替尼处理的供体2的CAR T细胞具有显著(P<0.05)增加的细胞计数。在测试的最高浓度下，还观察到用依鲁替尼处理的供体3的非显著的增加的细胞计数。在这种情况下，增加的细胞计数可能指示优越的增殖能力或存活，并且无法进行区分。当评估跨越对照条件的细胞计数时，在该测定中，源自供体2和3的细胞展现出逊于供体1细胞的表现。另外，与源自另一个供体的细胞相比，源自观察到这些差异的两个供体的细胞总体上在不存在依鲁替尼的情况下在连续再刺激测定中表现较差。值得注意的是，在该测定中，这些表现较差的供体受益于依鲁替尼的处理。结果表明，在指示存活和/或增殖能力或对于存活和/或增殖能力重要的一种或多种因子方面受损的T细胞可能受益于与激酶抑制剂(例如TEC家族激酶抑制剂或BTK/ITK抑制剂，如依鲁替尼)的组合。例如，此类T细胞与激酶抑制剂(如依鲁替尼)的组合可以改善在抗原遭遇后的T细胞功能和/或持久性。
E.TH1表型
进行测定，其证明了当在存在依鲁替尼的情况下培养时抗CD19 CAR T细胞偏向于TH1表型。已观察到依鲁替尼通过抑制ITK限制TH2 CD4 T细胞激活和增殖(Honda,F.等人(2012)Nat Immunol,13(4):369-78)。如上所述进行连续再刺激测定，并在不同时间收获细胞并通过流式细胞术对其进行分析以评估TH1表型(评估为CD4+CXCR3+CRTH2-)T细胞或TH2表型(评估为CD4+CXCR3-CRTH2+)的百分比。分别在具有和不具有所指示浓度的依鲁替尼的情况下培养的细胞的代表性图显示在图5A中，并且在连续再刺激过程中以及在各种浓度的依鲁替尼下培养后的TH1细胞的百分比分别显示在图5B和图5C中。
在连续刺激之后，观察到该测定中依鲁替尼的存在增加了所观察到的展现TH1表型的CAR+T细胞的百分比，并且观察到随着依鲁替尼浓度的增加影响越大。在18天连续刺激期期间，CAR T TH1细胞的百分比在源自三个不同供体中的每一个的细胞中均增加(图5B)。500nM依鲁替尼进一步提高了TH1细胞的百分比(P<0.01)(图5C)。
在从连续刺激测定分离的CAR T细胞中未观察到依鲁替尼对另外的CAR T激活或记忆标记的显著影响(图5D和图5E)。
F.基因表达分析
在如上所述连续刺激18天期间，在存在或不存在依鲁替尼(50nM或500nM)的情况下培养的抗CD19 CAR T细胞中评估多个基因的表达。在连续刺激之后第18天，从抗CD19CAR T细胞分离RNA，并跨越594个基因运行了Nanostring Immune V2组套测试。将每个基因的log2(倍数变化)相对于-log10(原始p值)(源自针对处理与对照的计数数据归一化的非标定管家基因的ANOVA检验)作图。结果表明在连续再刺激期间用依鲁替尼处理未显著改变基因表达。
实施例2：在存在布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂的情况下CAR表达T细胞的抗肿瘤活 性的增强
通过向NOD/Scid/gc-/-(NSG)小鼠注射CD19+Nalm-6播散性肿瘤细胞系来产生播散性肿瘤异种移植小鼠模型，其被鉴定为对BTK抑制有抗性。
在第零(0)天，向NSG小鼠静脉内注射5x105个表达萤火虫萤光素酶的Nalm-6细胞。在第4天开始并且持续研究的持续时间的每天，用媒介物对照处理小鼠或用依鲁替尼处理小鼠，在每种情况下均通过每日口服强饲(P.O.)25mg/kg每天一次。为了允许评估与抑制剂的组合疗法的效果，在第5天将来自两个不同供体的次最佳剂量的抗CD19 CAR T细胞(基本如上所述通过转导源自人供体受试者的样品的细胞产生的)以5x105个CAR+T细胞/小鼠的浓度静脉内注射至每只小鼠中。向对照组中的小鼠施用媒介物对照或依鲁替尼，但不施用CAR-T细胞。监测每组中的八只(N＝8)小鼠。
在如上所述的处理后，通过生物发光成像测量随时间的肿瘤生长，并且测量平均辐射亮度(p/s/cm2/sr)。还评估了经处理的小鼠随时间的存活率。
来自用依鲁替尼和CAR T细胞处理的小鼠的随时间的肿瘤生长的结果显示在图6A中。对监测在来自两个不同供体的肿瘤注射后更长时间点处的肿瘤生长的相同研究的结果的分析显示在图6B中。如所示，与媒介物处理相比，单独的依鲁替尼处理在这种依鲁替尼抗性模型中对肿瘤负荷没有影响。相比之下，与用CAR-T细胞和媒介物对照处理的小鼠相比，施用CAR-T细胞和依鲁替尼的小鼠展现出显著降低的肿瘤生长(p<0.001，***；p<0.0001.***)。
CAR T和依鲁替尼的组合提高了荷瘤小鼠的存活率，如通过Kaplan Meier曲线所示的，其显示了用依鲁替尼和CAR T细胞处理的荷瘤小鼠的存活率。.如图6C中所示，代表性结果显示，与接受次最佳抗CD19 CAR T细胞剂量+媒介物的组相比，用CAR-T细胞和依鲁替尼处理的小鼠展现出提高的中位存活率。在重复研究中看到了类似的效果，所述重复研究使用通过转导从其他供体受试者血液分离的T细胞产生的抗CD19 CAR T细胞。对监测在来自两个不同供体的肿瘤注射后更长时间点处的存活率的相同研究的结果的分析显示在图6D中，其显示与CAR T和媒介物条件相比，也观察到CAR T和依鲁替尼的组合施用导致显著提高的存活率(p<0.001，***)。
实施例3：在存在TEC家族激酶抑制剂的情况下CAR表达T细胞表型、功能和体内抗 肿瘤活性的评估
在第0天，向实施例2中描述的NSG小鼠静脉内注射5x105个表达萤火虫萤光素酶的Nalm-6细胞。在第4天开始并且持续研究的持续时间的每天，用媒介物对照处理小鼠或每天用在饮用水(D.W.)中的依鲁替尼以25mg/kg/天处理小鼠。桥接实验确认，通过饮用水施用依鲁替尼等同于口服强饲施用(数据未显示)。为了允许评估与抑制剂的组合疗法的效果，在第5天将次最佳剂量的抗CD19 CAR T细胞以5x105/小鼠静脉内注射至小鼠中。作为对照，在未施用CAR-T细胞或抑制剂的情况下向小鼠施用媒介物对照。
在如上所述的处理之后，确定经处理的小鼠的肿瘤生长和存活率。如图7A中所示，与接受次最佳抗CD19 CAR T细胞剂量+媒介物的组相比，用抗CD19 CAR-T细胞和依鲁替尼处理的小鼠展现出提高的中位存活率(p<0.001)。与仅与媒介物一起施用的CAR T相比，与CAR T组合施用的依鲁替尼也显著(P<0.001)降低了肿瘤生长(图7B)。使用通过工程化源自两个不同供体的T细胞产生的抗CD19 CAR-T细胞时结果是类似的。
分析了在来自已接受来自一个供体来源的细胞的抗CD19CAR+T细胞并已用媒介物或依鲁替尼处理的小鼠(每组3只小鼠)的血液、骨髓和脾中的CAR+T细胞的药代动力学分析。在CAR+T细胞转移后第7、12、19和26天分析样品以评估CAR T细胞(使用抗EGFR抗体基于替代标记的表达)和/或肿瘤细胞的存在和水平。如图7C中所示，与用CAR+T细胞和媒介物处理的小鼠相比，在用依鲁替尼处理的小鼠中观察到循环CAR+T细胞显著增加，这与在存在依鲁替尼的情况下血液中CAR-T细胞的更大扩增一致。在CAR-T细胞转移后第19天，在用依鲁替尼处理之后观察到血液中细胞数量的显著增加(图7D：*p<0.05)。如图7E中所示，与仅用媒介物相比，在CAR+细胞处理与依鲁替尼处理组合的小鼠中的血液、骨髓或脾中检测到显著更少的肿瘤细胞。
还对在CAR T施用后第12天从已接受CAR+T细胞并已用媒介物或依鲁替尼处理的小鼠(每组n＝3只小鼠)收获的血液、骨髓和脾细胞进行离体免疫表型分析。通过流式细胞术评估细胞的表面标记CD44、CD45RA、CD62L、CD154、CXCR3、CXCR4和PD-1，并使用FlowJo软件进行T分布随机近邻嵌入(t-SNE)高维分析。如图8A中所示，与仅用载体(对照)相比，在从已接受CAR-T细胞与依鲁替尼组合的动物的骨髓分离的CAR+T细胞中观察到表型变化。使用基于来自每组三只小鼠的合并分析的多变量t-SNE流式细胞术分析，鉴定出4个不同的群体簇(图8B)。在图8C中显示了流式细胞术直方图，其显示了来自在图8B中在总群体的表达(阴影)上叠加的4门控t-SNE的CD4、CD8、CD62L、CD45RA、CD44和CXCR3的单独表达谱。
对照小鼠或用依鲁替尼处理的小鼠中每个t-SNE群体的百分比和倍数变化显示在图8D中。统计上显著的差异表示为P<0.95(*)、P<0.01(**)、P<0.001(***)、P<0.0001(****)。
在CAR T转移后第12天，与对照小鼠相比，在还施用了依鲁替尼的经CAR T处理的小鼠的骨髓中观察到CD8+CD44hi CXCR3hi CD45RAlo CD62Lhi(群体2)和CD4+CD44hi CXCR3intCD45RAhi CD62Lhi(群体4)的增加(图8A-图8C)。在经依鲁替尼处理的动物中观察到群体4更大的增加(CAR-T细胞为15.2％相比于4.4％)(图8C)。
实施例4：布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂增强由弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) 患者制造的CAR表达T细胞的细胞溶解功能
基本上如实施例1中所述产生抗CD19 CAR-T细胞，不同之处在于从患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的两个不同的人受试者分离T细胞。通过在存在500和50nM依鲁替尼的情况下将CAR-T细胞与K562-CD19靶细胞以2.5:1的效应子与靶标比率共培养，每3-4天收获一次细胞并在重置细胞数量之后在相同条件下再刺激，如实施例1.D中所述对细胞进行连续再刺激。在21天培养期内对细胞进行连续再刺激，并监测细胞扩增和细胞毒性活性。如图9A中所示，在21天培养期期间，观察到源自每个单独受试者的细胞的细胞扩增，如通过细胞倍增的数量所确定的。依鲁替尼不抑制源自任何一名患者的CAR T细胞的增殖(图9A)，这一观察结果与来自健康供体来源的CAR T细胞的先前数据一致。如图9B中所示，在连续刺激16天之后，在存在500nM依鲁替尼的情况下，由源自每个单独受试者的细胞制造的CAR-T细胞展示出细胞溶解功能的增加(图9B)。在源自一名患者的细胞中，在50nM依鲁替尼的情况下观察到在连续刺激16天之后细胞溶解活性增加(P<0.01)(图9B)。细胞溶解活性的这种增加与来自健康供体细胞的结果一致(图1C-图1D)。
实施例5：通过RNA-Seq对用依鲁替尼处理的CAR表达T细胞进行分子特征评估
从源自三个不同供体的单独CAR表达细胞分离RNA，所述细胞在存在依鲁替尼(50nM、500nM)或对照(0nM)的情况下在连续刺激测定中已被处理18天。使用RNEasy MicroKit(Qiagen)进行RNA分离。对样品进行测序，并将RNASeq读段映射到人基因组(GRCh38)，并与GENCODE release 24基因模型进行比对。产生并评价RNAseq质量衡量指标，以确认样品之间的一致性。通过施加log2倍数变化截断值0.5和Benjamini-Hochberg调整的伪发现率(FDR)截断值0.05来鉴定差异表达的基因。
如图10A中的火山图所示，500nM依鲁替尼显著(FDR<0.05，absLog2FC>0.5)改变了23个蛋白质编码基因的表达。图10B显示了图10A中鉴定的23个基因的基因表达变化的热图。尽管不显著，但在50nM的情况下观察到相似的趋势(图10C和图10D)。在用不同浓度的抑制剂(50nM或500nM)或对照处理后示例性基因的基因表达的箱形图显示在图11A-图11E中。在差异表达的基因中，基因(如颗粒酶A(图11A)和CD38(图11C))的减少以及SELL/CD62L的增加(图11A)与依鲁替尼抑制末端效应子样基因同时增强与记忆发育相关的基因的作用一致。此外，RNA-Seq揭示依鲁替尼改变了与促进TH1分化相关的基因，包括上调MSC(已知抑制TH2编程)(Wu,C.等人(2017)Nat Immunol,18(3):344-353)以及下调与被鉴定为抑制TH1发育的ATRA/视黄酸信号传导途径相关的HES6、HIC1、LZTFL1、NRIP1、CD38和RARRES3(Britschgi,C.等人(2008)Br J Haematol,141(2):179-87；Jiang,H.等人(2016)JImmunol,196(3):1081-90；Heim,K.C.等人(2007)Mol Cancer,6:57；Nijhof,I.S.等人(2015)Leukemia,29(10):2039-49；Zirn,B.等人(2005)Oncogene,24(33):5246-51)(图11E、图11B和图11D)。支持RNA-Seq结果，在供体2和3中，在连续刺激18天之后，通过流式细胞术观察到CD62L表达的显著增加(图12A和图12B)。综上所述，这些结果支持长期依鲁替尼处理可能导致CAR T中TH1和记忆样表型增加。
实施例6：将抗CD19 CAR表达细胞与化合物1组合施用至患有复发性和难治性非霍 奇金淋巴瘤(NHL)的受试者
基本上如实施例1中所述产生抗CD19 CAR表达T细胞组合物，并且将产生的CD4+CAR表达T细胞组合物和CD8+CAR表达T细胞组合物分别与依鲁替尼(具有结构：
Figure BDA0002857331390002121
)的施用组合施用至患有复发性/难治性(R/R)B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者。选择用于治疗的受试者组包括患有如下疾病的受试者：从头或从惰性淋巴瘤转化的(NOS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击淋巴瘤)；滤泡性淋巴瘤3b级(FLG3B)；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；EBV阳性DLBCL NOS型；和原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。经治疗的受试者还包括如下受试者，其在至少两种先前线的治疗(包括CD20靶向药剂和蒽环类药物)后已复发或对于其是难治性的并且在筛选时东部肿瘤协作组(ECOG)得分小于或等于1。
为了产生CAR表达T细胞，通过单采术或白细胞单采术获得包含来自人受试者的循环血液的细胞的样品，并通过基于免疫亲和力的富集分离T细胞。在CAR+T细胞输注之前28天(±7天)获得细胞。将分离出的细胞激活并用编码抗CD19 CAR的病毒载体转导。
在CAR+T细胞输注之前，受试者接受使用氟达拉滨(flu，30mg/m2/天)和环磷酰胺(Cy，300mg/m2/天)的淋巴细胞清除化疗持续三(3)天。
在单采术或白细胞单采术之前7天(在CAR+T细胞输注之前35天(±7天))开始每天以140mg、280mg、420mg或560mg剂量/天向受试者口服施用依鲁替尼，直到开始淋巴细胞清除化疗。在受试者接受淋巴细胞清除化疗的期间，不施用依鲁替尼。在完成淋巴细胞清除化疗之后，恢复施用依鲁替尼。
受试者在淋巴细胞清除之后2-7天接受CAR表达T细胞。向受试者施用单剂量的1x108个CAR表达T细胞(每个单剂量分别经由以1:1比率的CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞的单独输注)。在完成淋巴细胞清除化疗和输注工程化CAR表达细胞之后，继续施用依鲁替尼。
在治疗之前的基线处和在治疗后的不同时间，基于通过正电子发射断层扫描(PET)和/或计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)扫描的放射影像学肿瘤评估来评估对治疗的反应(例如基于卢加诺分类，参见例如Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067)。还评估了治疗后治疗紧急不良事件(TEAE)的存在或不存在。还评估并监测受试者的神经毒性(神经系统并发症，包括以下症状：意识错乱、失语、脑病、肌阵挛癫痫、惊厥、嗜睡和/或精神状态改变)，根据国家癌症研究所—常见毒性标准(CTCAE)量表4.03版(NCI-CTCAEv4.03)，按1-5标度进行分级。常见毒性标准(CTCAE)量表4.03版(NCI-CTCAE v4.03)。参见美国卫生和公共服务部的不良事件通用术语(CTCAE)第4版，公开于：2009年5月28日(v4.03：2010年6月14日)；和Guido Cavaletti&Paola Marmiroli Nature ReviewsNeurology 6,657-666(2010年12月)。还确定并监测细胞因子释放综合征(CRS)，基于严重程度进行分级。参见Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95。还评估受试者用依鲁替尼治疗前和治疗后的抗CD19 CAR+T细胞的药代动力学(PK)以及依鲁替尼的PK和药效动力学(PD)参数。
在第180天(CAR+T细胞输注后6个月)之后，停止依鲁替尼的给药，除非受试者实现部分反应(PR)，在这种情况下，依鲁替尼的进一步施用可以继续进行直到疾病进展。
本发明在范围上并不旨在受限于具体公开的实施方案，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。此类变化可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践，并且旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0002857331390002151
Figure BDA0002857331390002161
Figure BDA0002857331390002171
Figure BDA0002857331390002181
Figure BDA0002857331390002191
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
S·R·弗兰克尔
J·哈斯卡尔
J·A·杜博夫斯基
<120> T细胞疗法和激酶抑制剂的组合疗法
<130> 735042017540
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 62/666,653
<151> 2018-05-03
<160> 59
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 4-1BB
<300>
<308> UniProt Q07011.1
<309> 1995-02-01
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复五次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 α信号肽
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 58
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (113)

1.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure FDA0002857331380000011
以及
(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
2.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure FDA0002857331380000012
(2)从所述受试者获得生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物；
(3)向所述受试者施用包含一定剂量的基因工程化T细胞的自体T细胞疗法，
其中所述激酶抑制剂的施用是按如下给药方案进行的，所述给药方案是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的所述化合物的施用。
3.一种治疗方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂具有结构
Figure FDA0002857331380000021
其中所述受试者是用自体T细胞疗法治疗的候选者或将要用自体T细胞疗法治疗，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中：在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰；并且
所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括以一定的给药间隔重复施用所述抑制剂持续一定的时间段，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用所述T细胞疗法。
5.根据权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。
6.根据权利要求1、2和权利要求4中任一项所述的方法，所述方法还包括，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止所述激酶抑制剂的施用。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
10.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用有效量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂具有结构
Figure FDA0002857331380000031
(2)向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及
(3)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约3天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法还包括从所述受试者获得所述生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约4天、至少或至少约5天、至少为或6天、至少或至少约7天、至少或至少约14天或更长时间开始的。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或为或约5天至7天开始的。
14.根据权利要求5-13中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。
15.根据权利要求5-14中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成的。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长15天至29天。
17.根据权利要求9-16中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将所述激酶抑制剂的施用在所述给药方案期间在施用其的每一天中每天进行一次。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述有效量包含在施用所述激酶抑制剂的每一天中从或从约140mg至或至约840mg或者从或从约140mg至或至约560mg。
20.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure FDA0002857331380000041
以及
(2)向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约5至7天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用；和进一步施用，其在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至或至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行预调理。
22.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括，在施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前7天内完成的。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前2至7天完成的。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂。
26.一种治疗方法，所述方法包括：
(1)向患有癌症的受试者施用激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述激酶抑制剂具有结构
Figure FDA0002857331380000051
和
(2)向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法；以及
(3)在完成所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天内向所述受试者施用自体T细胞疗法，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，其中在施用所述T细胞疗法之前，已从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸分子引入所述T细胞中进行基因修饰，
其中所述激酶抑制剂的施用是在所述样品的获得之前至少或至少约5至7天开始的，并且是按如下给药方案进行的，所述给药方案包括以一定的给药间隔重复施用所述激酶抑制剂，所述重复施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或大于三个月，其中将所述激酶抑制剂在所述给药方案期间以从或从约140mg至或至约560mg的量在施用其的每一天中每天施用一次。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述受试者获得所述生物样品并对所述样品的T细胞进行加工，从而产生包含表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的组合物。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是从或从约280mg至或至约560mg。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用是在从所述受试者获得所述样品之前至少或至少约7天开始的。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中：
所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约30至或至约40天开始的；
在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约23至或至约38天从所述受试者获得所述样品；和/或
所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天完成的。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中：
所述激酶抑制剂的施用是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约35天开始的；
在开始施用所述T细胞疗法之前从或从约28至或至约32天从所述受试者获得所述样品；和/或
所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用所述T细胞疗法之前为或约5至7天完成的。
32.根据权利要求5-31中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。
33.根据权利要求5-32中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约200-400mg/m2、任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，包含端值；和/或为或约20-40mg/m2、任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天、任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为或约500mg/m2的环磷酰胺。
34.根据权利要求5-33中任一项所述的方法，其中：
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约140mg的量。
36.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约280mg的量。
37.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约420mg的量。
38.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂的施用在施用其的每一天是为或约560mg的量。
39.根据权利要求9-38中任一项所述的方法，其中所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于四个月，或者在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约或大于五个月。
40.根据权利要求9-39中任一项所述的方法，其中所述进一步施用持续一定的时间段，所述时间段延长为或约或大于六个月。
41.根据权利要求9-40中任一项所述的方法，其中：
如果在所述时间段结束时所述受试者展现出所述治疗后的完全反应(CR)，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用；或者
如果在所述时间段结束时所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则在所述时间段结束时停止所述激酶抑制剂的进一步施用。
42.根据权利要求9-41中任一项所述的方法，其中所述时间段延长从或从为或约三个月至为或六个月。
43.根据权利要求9-42中任一项所述的方法，其中所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约三个月。
44.根据权利要求9-42中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约3个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
45.根据权利要求44所述的方法，其中如果所述受试者已经在3个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约3个月。
46.根据权利要求9-42中任一项所述的方法，其中所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约六个月。
47.根据权利要求9-42中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约6个月之前实现所述治疗后的完全反应(CR)或者所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
48.根据权利要求47所述的方法，其中如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
49.根据权利要求9-48中任一项所述的方法，其中即使所述受试者在所述时间段结束之前的某个时间点已经实现完全反应(CR)，所述进一步施用仍在所述时间段的持续时间内继续进行。
50.根据权利要求9-49中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述时间段期间且在所述时间段结束之前的某个时间实现完全反应(CR)。
51.根据权利要求9-40、42、43、44、46和47中任一项所述的方法，所述方法还包括如果在所述时间段结束时所述受试者展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则在所述时间段结束之后继续进行所述进一步施用。
52.根据权利要求9-40、42、43、44、46、47和51中任一项所述的方法，其中如果在为或约六个月时所述受试者在所述治疗后展现出部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述进一步施用继续进行大于六个月。
53.根据权利要求51或权利要求52所述的方法，其中所述进一步施用继续进行直到所述受试者已经实现所述治疗后的完全反应(CR)或者直到所述癌症已经进展或在所述治疗之后的缓解后复发。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)和/或抑制IL2诱导型T细胞激酶(ITK)。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述激酶抑制剂抑制ITK并且所述抑制剂抑制ITK或抑制ITK，其中半最大抑制浓度(IC50)为小于或小于约1000nM、900nM、800nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或更小。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中在(1)中施用所述激酶抑制剂之前，先前已向所述受试者施用所述激酶抑制剂。
57.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中在(1)中施用所述激酶抑制剂之前，先前尚未向所述受试者施用所述激酶抑制剂。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中：
(i)所述受试者和/或所述癌症(a)对布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制有抗性和/或(b)包含对被所述激酶抑制剂抑制有抗性的细胞群，任选地其中所述细胞群是或包含B细胞群和/或不包含T细胞；
(ii)所述受试者和/或所述癌症包含编码BTK的核酸中的突变，任选地其中所述突变能够减少或防止所述激酶抑制剂对所述BTK的抑制，任选地其中所述突变是C481S；
(iii)所述受试者和/或所述癌症包含编码磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的核酸中的突变，任选地其中所述突变导致组成型信号传导活性，任选地其中所述突变是R665W或L845F；
(iv)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始施用所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗之后的缓解后复发，或者已经被认为对于用所述激酶抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗是难治性的；
(v)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者已经在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法的先前治疗后进展，任选地其中所述受试者展现出疾病进展作为对所述先前治疗的最佳反应，或者在对所述先前治疗的先前反应之后展现出进展；和/或
(vi)在开始在(1)中施用所述激酶抑制剂时，以及任选地在开始所述T细胞疗法时，所述受试者在用所述抑制剂和/或用BTK抑制剂疗法持续至少6个月的先前治疗后展现出小于完全反应(CR)的反应。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述NHL包含侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS、任选地转化惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)、任选地滤泡性淋巴瘤3B级(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为或已被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中将所述激酶抑制剂口服施用。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述CD19是人CD19。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含与所述CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。
68.根据权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区域。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的方法，其中所述共刺激结构域是或包含人4-1BB的信号传导结构域。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中：
所述CAR包含对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包含4-1BB、任选地人4-1BB；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；
所述CAR依次包含对所述CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含4-1BB信号传导结构域、任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是CD3ζ信号传导结构域、任选地人CD3ζ信号传导结构域；或者
所述CAR依次包含对所述CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，其任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域。
72.根据权利要求71所述的方法，其中
所述CAR包含间隔子并且所述间隔子是如下多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包含免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；(b)包含免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域；或者(c)长度是为或约12个氨基酸，和/或包含免疫球蛋白铰链、任选地IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式的全部或一部分或由其组成；或者(d)具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体；或者(e)包含式X1PPX2P(SEQ ID NO:58)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸；和/或
所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的其变体；和/或
所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:13或14或15与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性；和/或
所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列、和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列，和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列、和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列，或者其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与任何前述项结合相同的表位或与任何前述项竞争结合，并且任选地其中所述scFv依次包含VH、任选地包含SEQ ID NO:41的接头和VL，和/或所述scFv包含柔性接头和/或包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含为或约1x108个CAR表达细胞。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述剂量的基因工程化T细胞包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞，并且所述剂量的施用包括多种单独组合物的施用，所述多种单独组合物包含含有所述CD4+ T细胞和所述CD8+ T细胞中的一种的第一组合物和含有所述CD4+ T细胞或所述CD8+ T细胞中的另一种的第二组合物。
78.根据权利要求77所述的方法，其中：
将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或
所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的方法，其中将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+ T细胞。
81.根据权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+ T细胞。
82.根据权利要求77-81中任一项所述的方法，其中将所述第一组合物在所述第二组合物之前施用。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中将所述剂量的细胞肠胃外、任选地静脉内施用。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞。
85.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述加工包括：
从获自所述受试者的样品分离T细胞、任选地CD4+和/或CD8+ T细胞，从而产生包含原代T细胞的输入组合物；以及
将编码所述CAR的核酸分子引入所述输入组合物的T细胞中。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其中在所述引入之前，所述加工包括在刺激条件下孵育所述输入组合物，所述刺激条件包括能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂的存在，从而产生经刺激的组合物，其中将编码所述CAR的核酸分子引入所述经刺激的组合物中。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性结合、任选地与CD3特异性结合的一级药剂。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述刺激试剂还包含与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
92.根据权利要求90或权利要求91所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包含抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠，任选地其中所述珠是磁性的或超顺磁性的。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述珠包含大于或大于约3.5μm，但是不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。
96.根据权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述珠包含为或为约4.5μm的直径。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激的组合物的细胞。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
99.根据权利要求97或权利要求98所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
100.根据权利要求86-99中任一项所述的方法，其中所述加工还包括在所述引入之后培育所述T细胞，任选地其中所述培育是在导致细胞增殖或扩增的条件下进行的，以产生包含所述T细胞疗法的输出组合物。
101.根据权利要求100所述的方法，其中在所述培育之后，所述方法还包括配制所述输出组合物的细胞用于冷冻保存所述T细胞疗法和/或用于向所述受试者施用所述T细胞疗法，任选地其中所述配制是在存在药学上可接受的赋形剂的情况下进行的。
102.根据权利要求1-101中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
103.根据权利要求1-102中任一项所述的方法，其中：
根据所述方法治疗的受试者的至少35％、至少40％或至少50％实现完全反应(CR)，所述完全反应可持续或在实现所述CR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％中可持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中到六个月时实现CR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％保持反应、保持CR和/或存活或在没有进展的情况下存活持续为或大于3个月和/或为或大于6个月和/或为或大于九个月；和/或
根据所述方法治疗的受试者的至少50％、至少60％或至少70％实现客观反应(OR)，任选地其中所述OR可持续或在实现所述OR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％中可持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中到六个月时实现OR的受试者的至少60％、70％、80％、90％或95％保持反应或存活持续为或大于3个月和/或为或大于6个月。
104.根据权利要求60-103中任一项所述的方法，其中，在施用所述剂量的细胞的时间或紧接其之前，所述受试者已经在用针对所述淋巴瘤、任选地所述NHL的一种或多种先前疗法、任选地除另一剂量的表达所述CAR的细胞之外的一种、两种或三种先前疗法治疗之后的缓解后复发，或者变得对于所述先前疗法是难治性的。
105.根据权利要求60-104中任一项所述的方法，其中，在施用包含所述剂量的细胞的T细胞疗法时或之前：
所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；
所述受试者被鉴定为或已被鉴定为患有化疗难治性淋巴瘤、任选地化疗难治性DLBCL；和/或
所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全反应(CR)。
106.一种试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个单位剂量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure FDA0002857331380000161
以及用于向患有癌症的受试者施用所述一个或多个单位剂量的说明书，所述患有癌症的受试者是用自体T细胞疗法治疗的候选者或将要用自体T细胞疗法治疗，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞，并且其中在施用所述T细胞疗法之前，从所述受试者获得生物样品并对其进行加工，所述加工包括将来自所述样品的T细胞进行基因修饰，任选地通过将编码所述CAR的核酸引入所述T细胞中进行基因修饰，其中所述说明书指定在获得所述样品之前为或至少约3天并且按如下给药方案开始向所述受试者施用单位剂量的所述激酶抑制剂，所述给药方案包括在一定的时间段内以一定的给药间隔重复施用一个或多个单位剂量，所述时间段至少延长以包括从所述受试者获得所述样品的当天或之后的施用。
107.根据权利要求106所述的试剂盒，其中所述说明书还指定向所述受试者施用所述T细胞疗法。
108.根据权利要求106或权利要求107所述的试剂盒，其中所述说明书还指定在开始施用所述激酶抑制剂之后且在施用所述T细胞疗法之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述说明书指定在施用所述淋巴细胞清除疗法期间应中止所述激酶抑制剂的施用。
110.根据权利要求108或权利要求109所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述给药方案包括施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段至少延长直到开始所述淋巴细胞清除疗法。
111.根据权利要求108-110中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书指定所述给药方案包括在一定的时间段内施用所述激酶抑制剂，所述施用包括施用直至开始所述淋巴细胞清除疗法；接着在所述淋巴细胞清除疗法期间中止或停止施用所述激酶抑制剂；然后进一步施用所述激酶抑制剂持续一定的时间段，所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长至少15天。
112.一种试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个单位剂量的激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述激酶抑制剂是或包含结构
Figure FDA0002857331380000171
以及用于进行根据权利要求1-105中任一项所述的方法的说明书。
113.一种制品，所述制品包含根据权利要求106-112中任一项所述的试剂盒。
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