RO114232B1

RO114232B1 - Molecule anticorp anti-cd3 cu afinitate pentru antigen cd3

Info

Publication number: RO114232B1
Application number: RO148281A
Authority: RO
Inventors: Linda Kay Jolliffe; Robert Allan Zivin; John Robert Adair; Diljeet Singh Athwal
Original assignee: Celltech Limited Slough
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1999-02-26
Also published as: US20050123534A1; EP0626390A1; EP0460178B1; GB2246570A; ATE124459T1; GB9318911D0; FI108776B; BG60462B1; DE69033857T2; US5929212A; RO114980B1; AU649645B2; EP0460178A1; AU6461294A; DE69031591T2; FI990875A0; NO316074B1; DE69033857D1; US20040202662A1; BG95018A

Description

Prezenta invenție se referă la molecule anticorp anti-CD3, cu afinitate pentru antigen CD3, deci la molecule de anticorp recombinant (RAM) și, în special, la o moleculă de anticorp umanizat (HAM), care are specificitate pentru un antigen prezent în complexul receptor CD3 T-celular.

în prezenta invenție termenul de “moleculă anticorp recombinant” (RAM) este utilizat pentru a descrie un anticorp produs printr-un procedeu care include utilizarea tehnologiei recombinante ADN, incluzând orice analogi ai imunoglobulinelor naturale sau a fragmentelor acestora. Termenul de “moleculă umanizată de anticorp” (HAM) este utilizat pentru a descrie o moleculă care are o legătură (o porțiune) antigenică derivată de la o imunoglobulină de la speciile neumane, iar părțile derivate de la imunoglobulină și rămase, fiind derivate de la o imunoglobulină umană. Partea de legătură antigenică poate cuprinde domenii variabile complete, fuzionate în domeniile constante sau una sau mai multe regiuni de determinare a complementarității grefate pe regiuni cadru corespunzătoare în domeniile variabile. Prescurtarea de “MAb” este utilizată pentru a indica un anticorp monoclonal.

Imunoglobulinele sunt cunoscute de mulți ani, care au diferite fragmente, cum ar fi, de exemplu, Fab, (Fab’]₂ și fragmentele Fc, care pot fi derivate prin clivaj enzimatic. Imunoglobulinele naturale cuprind o moleculă generală în formă de Y, având o parte de legătură antigenică către capătul fiecărui braț superior. Partea de structură rămasă, și, în special, tulpina acestui Y, mediază funcțiile efectoare asociate cu imunoglobulinele.

Imunoglobulinele naturale au fost utilizate în analize, în precizarea diagnosticului și cu o extindere mult mai limitată, în terapie. Cu toate acestea, astfel de utilizări - în special în scopul terapiei - au fost oprite datorită naturii policlonale a imunoglobulinelor naturale. Un pas semnificativ în ceea ce privește realizarea de imunoglobuline potențiale, ca agenți tera peutici, a fost făcut în tehnicile de preparare a anticorpilor monoclonali cu specificitate definită (așa cum se cunoaște din literatura de specialitate). Cu toate acestea, majoritatea MAbs sunt produse prin fuziunea celulelor splenice de rozătoare cu celule mieloma de rozătoare. Acestea sunt, deci, proteine de rozătoare esențiale. Sunt puține date raportate în ceea ce privește producerea de MAbs umani.

Deoarece majoritatea de MAbs corespunzătoare sunt de origine de la rozătoare, aceștia sunt antigeni umani și astfel pot duce la intensificarea unui răspuns imun nedezirabil, denumit HAMA (anticorp uman anti-șoarece). Utilizarea MAbs de la rozătoare, ca agenți terapeutici la oameni, este inerent limitată prin faptul că subiectul uman va conduce la obținerea unui răspuns imunologic la MAbs și va determina separarea acestuia în întregime sau cel puțin la reducerea eficacității acestuia. Astfel, în practică, MAbs de origine rozătoare nu pot fi utilizate la pacienți mai mult decât unul sau câteva tratamente ca un răspuns care se dezvoltă repede, redând infectivitatea MAb, ca și intensificarea reacțiilor care nu sunt dorite.

Au fost făcute propuneri pentru efectuarea de MABs neumani cu antigenitate mai mică la om. Astfel de tehnici pot fi denumite, în general, tehnici de “umanizare”. Aceste tehnici cuprind utilizarea unei tehnologii recombinante ADN pentru a manipula secvențele ADN, codificând catenele de peptide ale moleculei de anticorp. Metodele recente de umanizare MABs care includ producerea anticorpilor chimerici, în care un antigen cu porțiunea de legătură cuprinde domenii variabile complete ale unui anticorp, este legat de domeniile constante derivate de la alt anticorp. Metodele pentru efectuarea acestor procedee de chimerizare sunt descrise în literatura de specialitate. Astfel, se descrie un procedeu de preparare a moleculei de anticorp având domeniile variabile de la MAb la șoarece și domeniile constante de la imunoglobulină umană. Astfel de anticorpi chimerici conțin încă o proporție

RO 114232 Bl semnificativă din secvența de aminoacid neumană și astfel se reușește să se obțină unele răspunsuri HAMA, în special dacă acesta se adminsitrează pe o perioadă de timp prelungită, așa cum este menționat în literatura de specialitate.

în WO 86/01533 se descrie producția de moleculă anticorp, care cuprinde domeniile variabile de MAb de la șoarece, CH1 și CL ca domenii de imunoglobulină umană și proteina derivată de la imunoglobuline în locul porțiunii Fc a imunoglobulinei umane.

într-o altă alternativă convenabilă [în literatura de specialitate), se descriu regiunile de determinare complementare (CDRs) ale MAb de șoarece, care sunt grefate pe regiunile cadru ale domeniilor variabile ale imunoglobulinei umane prin mutageneza directă parțială, utilizânduse oligonucleotide lungi. Astfel, există trei CDRs (CDR1, CDR2 și CDR3) în fiecare din regiunile variabile cu catenă lungă și cu catenă scurtă. Astfel de anticorpi umanizați care sunt grefați pe CDR este mult mai puțin probabil să intensifice răspunsul la HAMA decât anticorpii chimerici umanizați, în vederea unei proporții mult mai mici de secvențe de aminoacizi ne-umane.

Cea mai recentă lucrare privind umanizarea MABs prin grefare pe CDR este efectuată pe MAbs identificând antigenii sintetici, ca, de exemplu, antigenii NP sau NIP. Cu toate acestea, exemplele în care un MAb de șoarece identificând lizozima și un MAb de șobolan identificând un antigen pe celulele T umane sunt umanizați prin grefare pe CDR, așa cum este arătat în literatura de specialitate.

Prepararea anticorpului grefat pe CDR la antigenul pe celule umane este descris în literatura de specialitate.

S-a descoperit că transferul numai al regiunilor CDR (așa cum s-a arătat de Kabat, în literatura de specialitate) nu este suficient de a arăta că este satisfăcătoare activitatea de legare antigenică în produsul grefat pe CDR. Sa descoperit că este necesar să se con4 vertească reziduul de serină la poziția 27 a secvenței umane la reziduul de fenilalanină corespunzător la șobolan, pentru a obține produsul grefat pe CDR având o activitate de legare antigenică satisfăcătoare. Acest reziduu, la poziția 27 a catenei lungi, se află în cadrul lanțului structural adiacent la CDR1. O altă construcție, care conține adițional o serină umană la schimbarea tirozinei la șobolan la poziția 30 a catenei lungi, nu are o semnificație privind activitatea de legare modificată la anticorpul umanizat cu serină, la schimbarea de fenilalanină la poziția 27. Aceste rezultate arată că schimbările de reziduuri ale secvenței umane în afara regiunilor CDR, în special în lanțul adiacent la CDR1, pot fi necesare pentru a obține o activitate de legare antigenică efectivă pentru anticorpii grefați pe CDR care identifică antigeni mult mai complecși. Chiar în acest fel, activitatea de legare a anticorpilor cei mai bine grefați pe CDR este obținută semnificativ mai slabă decât la MAb original. Recent, în literatura de specialitate, au fost descrise procedee de preparare a anticorpilor umanizați, care se leagă la receptorul de interleukină-2, prin combinația CDRs al MAb murinei (antiTac) cu cadrul imunoglobulinei umane și regiunile constante. Regiunile cadru umane sunt alese pentru a maximiza homologia cu secvența MAb anti-Tac. în plus, calcularea modelelor se utilizează pentru a identifica reziduurile cadru de aminoacizi,care,probabil interacționează cu CDRs sau antigenul și aminoacizii de șoarece sunt utilizați la aceste poziții în anticorpul umanizat.

în literatura de specialitate se propun patru criterii de denumire a imunoglobulinelor umanizate. Primul criteriu este să se utilizeze, ca acceptor uman, cadrul de la imunoglobulina umană specială,care este neobișnuit homoloagă cu imunoglobulina donoare neumană, pentru a fi umanizată,un consens cadru din anticorpii umani. Al doilea criteriu este de a utiliza mai degrabă donorul aminoacid, decât acceptorul, dacă reziduul acceptor uman este neRO 114232 Bl uzual și reziduul donor este tipic pentru secvențele umane la un reziduu specific cadru. Al treilea criteriu este utilizarea reziduului de aminoacid donor cadru față de acceptor la pozițiile imediat adiacente la DDRs. Al patrulea criteriu este utilizarea reziduului de aminoacid donor la pozițiile cadru la care aminoacidul este prevăzut să aibă un atom al catenei secundare în care aproximativ 3Â din CDR în modelul imunoglobulinic tridimensional este capabil să interacționeze cu antigenul sau cu CDRs din imunoglobulina umanizată. Se propune ca criteriul doi, trei sau patru să poată fi aplicate în adiție sau alternativ la criteriul unu, aplicarea fiind simplă sau sub formă de combinație.

în literatura de specialitate se descrie, în detaliu, prepararea unui singur anticorp grefat pe CDR umanizat, acest anticorp umanizat având specificitate pentru proteina Tac p55 a receptorului IL-2. Combinația celor patru criterii, așa cum s-a arătat mai sus, este utilizată pentru desemnarea acestui anticorp umanizat, cadrele regiunii variabile ale anticorpului uman Eu (așa cum se arată în literatura de specialitate) fiind utilizate ca acceptor. în anticorpul umanizat rezultant, donorii CDRs sunt așa cum au fost definiți în literatura din domeniul de specialitate, și în adiție reziduurile donoare de șoarece sunt utilizate în locul reziduurilor acceptoare umane, la pozițiile 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103, 104, 105 și 107 la catena lungă și la pozițiile 48, 60 și 63 la catena scurtă a regiunilor cadru variabile. Anticorpul umanizat anti-Tac care este obținut a fost raportat că are o afinitate pentru p55 a 3 x 10⁹M'¹, aproximativ o treime din cea a MAb murinic.

0KT3 este lgG2a/k MAb la șoarece, care identifică un antigen în complexul receptor-CD3 al celulelor T și care este admis pentru utilizare, în multe țări din lume, ca imunosupresant în tratamentul rejecției acute alografice, așa cum este menționat în literatura de specialitate. Du toate acestea, privitor la natura murinică a acestui MAb, un răs6 puns semnificativ HAMA, cu un component major anti-idiopatic, se poate constitui pentru utilizare. în mod clar, este mult de dorit ca să se scadă sau să se abolească acest răspuns nedezirabil HAMA, printr-o umanizare convenabilă sau altă manipulare recombinantă ADN a acestui anticorp foarte utilizat, și astfel se lărgește suprafața de utilizare. De asemenea, este de dorit să se aplice tehnicile tehnologiei recombinante ADN la acest anticorp folositor, la prepararea produselor RAM.

Mai mult decât atât, s-au făcut investigații pentru prepararea anticorpului umanizat care este grefat pe CDR sub formă de molecule și s-a identificat o ierarhie a pozițiilor în cadrul regiunilor variabile (de exemplu, în regiunile variabile cu lanțuri structurale și CDRs Kabat din exterior), la care identitățile de aminoacizi ale reziduurilor sunt importante pentru obținerea produselor grefate pe CDR cu afinitate de legare satisfăcătoare. Acestea au determinat pentru a se stabili un protocol pentru obținerea produselor grefate pe CDR, care poate fi aplicat pe o scară foarte largă, respectiv la nivelul de homologie între cadrele de imunoglobulină donoare și acceptoare. S-a stabilit că reziduurile care au fost identificate ca fiind de o mare importanță nu coincid cu reziduurile care sunt identificate și arătate în literatura de specialitate.

Este cunoscut, de asemenea din literatura de specialitate, un anticorp care prezintă specificitate față de limfocitele mature și care pot avea utilizări clinice. Mai concret, acest anticorp monoclonal se leagă de un epitop al unui receptor de celule-T α/β uman (TCR), care este distinct de epitopul CD3 recunoscut de anticorpul monoclonal 0KT3. Se cunoaște obținerea de anticorpi himerici, adică acel anticorp în care întreg domeniul variabil este derivat de la un anticorp donor. în literatura de specialitate, însă, nu există o prezentare a unui anticorp în care domeniile variabile cuprind o combinație de reziduuri donoare și acceptoare.

RO 114232 Bl

Moleculele anticorp anti-CD3, cu afinitate pentru antigen CDR, care conțin o catenă lungă compozită și o catenă scurtă complementară sau care conțin o catenă scurtă compozită și o catenă lungă complementară, în conformitate cu prezenta invenție, și în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, în catena lungă compozită cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58 și 95 până la 102 sunt reziduuri donoare, iar în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile aminoacide 24 până la 34,46, 48, 5Q până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare. Reziduurile de aminoacid 71,73 și 78 din catena lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare, iar reziduurile până la 30 și 59 până la 65 din catena lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Reziduurile de aminoacid 1, 3 și 76 din catena lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 36 [dacă nu este triptofan], 94 (dacă nu este arginină), 104 și 106 (dacă nu este glicină) și 107 (dacă nu este treonină), din catena lungă compozită este un reziduu donor suplimentar. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 46, 67 și 69 din catena lungă compozită este reziduu donor suplimentar. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 18, 20, 80, 82 și 86 din catena lungă compozită este reziduu donor suplimentar. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 37 (dacă nu este valină, dar este cu un volum al catenei laterale mai mare sau are o sarcină sau polaritate), 39 (dacă nu este glutamină), 45 (dacă nu este leucină) și 47 (dacă nu este triptofan], 91 (dacă nu este fenilalanină sau tirosină], 93 (dacă nu este alanină) și 103 (dacă nu este triptofan] din catena lungă compozită, este un reziduu donor suplimentar. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 9, 11, 41, 87, 108, 110 și 112 din catena lungă compozită este un reziduu donor suplimentar.

Catena scurtă complementară este o catenă scurtă cu un domeniu variabil, care conține predominant reziduuri cadru cu catenă scurtă de anticorp acceptor și reziduuri de legare antigen cu catenă de anticorp donor neuman, respectivul anticorp donor având afinitate față de respectivul antigen CD3, în care, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, din catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile aminoacide 24 până la 34,46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare. Reziduurile de aminoacid 1 și 3 și 60 și 70 (dacă reziduul 60 poate forma o punte de sare cu reziduul 54 și dacă reziduul 70 poate forma o punte de sare cu reziduul 24] din catena scurtă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 6 (dacă nu este glutamină], 65 (dacă nu este triptofan], 62 (dacă nu este fenilalanină sau tirosină), 64, 66, 68, 99 și 101 (dacă nu este glicină] și 102 (dacă nu este tironină) din catena scurtă compozită este un reziduu donor suplimentar. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 37, 45 și 47 din catena scurtă compozită este un reziduu donor suplimentar. Cel puțin unul dintre reziduurile 19, 21 și 73, din catena scurtă compozită, este un reziduu donor suplimentar. Reziduurile de aminoacid 36 (dacă nu este tirosină], 44 (dacă nu este prolină], 49 (dacă nu este tirosină), 85, 87 (dacă nu este tirosină] și 98 (dacă nu este fenilalanină], din catena scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 10, 12, 40, 80, 83, 103 și 105, din catena scurtă compozită este un reziduu donor suplimentar.

în conformitate cu prezenta invenție, sunt prevăzute regiuni de legătură antigenică cuprinse în RAM, derivate din regiuni variabile cu catene lungi și/sau scurte ale anticorpului anti-CD3 donor care au specificitate de legare anti-CD3 și ,de preferință, au afinitate de legare la anti-CD3 similară cu cea a 0KT3. „ în mod tipic, anticorpul donor antiRO 114232 Bl

CD3 este MAb de rozătoare. în conformitate cu prezenta invenție, RAM poate cuprinde legături antigenice, a unor regiuni, din orice anticorp anti-CD3 convenabil, tipic MAb anti-CD3 la rozătoare, de exemplu MAb anti-CD3 la șoarece sau la șobolan. RAM cuprinde așadar o versiune recombinantă a întregii secvențe sau a unei părți majore a secvenței de aminoacid a acestui MAb. Așadar, MAb poate cuprinde numai regiunea variabilă (VH/ și/sau VL) sau unul sau mai mulți CDRs, cum ar fi MAb. în special RAM poate cuprinde secvențele de aminoacizi ca regiuni variabile, CDR sau alte asemănătoare, care sunt derivate dintr-un anti-CD3 MAb (0KT3) specific, așa cum este descris în prezenta invenție, și, în mod specific, cu referire la fig. 1 și 2, care se vor prezenta în continuare.

□e preferință, în conformitate cu prezenta invenție, RAM este o moleculă de anticorp umanizat (HAM), care are specificitate pentru CD3 și având o porțiune de legătură antigenică la cel puțin una din regiunile de determinare a complementarității (CDRs) ale domeniului variabil, de obicei cel puțin două și, de preferință, toți CDRs sunt derivați de la un anticorp anti-CD3 neuman, de exemplu MAb anti-CD3 de rozătoare.

RAM poate fi un anticorp chimeric sau un anticorp grefat pe CDR.

în conformitate cu datele de mai sus, într-o întruchipare preferată a prezentei invenții se face referire la anticorpul grefat pe CDR anti-CD3 cu catenă lungă și având domeniul regiunii variabile cuprinzând cadrul acceptor al legăturii CD3 donoare, în care cadrul cuprinde reziduurile donoare cu cel puțin una din pozițiile 6, 23 și/sau 24, 48 și/sau 49, 71 și/sau 73, 75 și/sau 76 și/sau 78 și 88 și/sau 91.

Mult mai preferabil, conform unei întruchipări preferate a prezentei invenții, cadrul catenei lungi cuprinde reziduurile donoare la pozițiile 23, 24, 49,

71, 73 și 78 sau la pozițiile 23, 24 și

49. Reziduurile de la pozițiile 71, 73 și ale catenei lungi cadru sunt, de pre10 ferință, fie toate reziduurile acceptoare, fie toate reziduurile donoare.

Conform unor întruchipări speciale ale prezentei descrieri de invenție, cadrul catenei lungi adiționale cuprinde reziduurile donoare la una, câteva sau la toate pozițiile 6, 37, 48 și 94. Așadar, este de preferat ca toate reziduurile la pozițiile catenei cadru lungi, care, de obicei, sunt specii încrucișate păstrate, de exemplu, pozițiile 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 și 107, dacă nu se păstrează între donor și acceptor, să cuprindă adițional reziduurile donoare. Mult mai preferate sunt catenele lungi cadru adiționale care cuprind reziduurile donoare la pozițiile 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 și 107.

în plus, catena lungă cadru cuprinde opțional reziduurile donoare la una, câteva sau la toate pozițiile: 1 și 3; 72 și 76; 69 (dacă 48 este diferită între donor și acceptor); 38 și 46 (dacă 48 este un reziduu donor); 80 și 20 (dacă 69 este un reziduu donor); 67; 82 și 18 (dacă 67 este un reziduu donor); 91; 88 și oricare dintr-una sau mai multe din pozițiile 9, 11, 41, 87, 108, 110 si 112.

Conform unor întruchipări preferate ale prezentei invenții, se face referire la produsele grefate pe CDR-anticorpi, care cuprind regiunile de legătură antigenică donori și acceptori cadru. Este de apreciat că prezenta invenție se poate aplica, în general, la anticorpii anti-CD3 grefați pe CDR. Astfel, anticorpii donori și acceptori pot fi anticorpi derivați de la animalele din aceeași specie și chiar din aceleași clase sau subclase de anticorpi. Mult mai uzual, totuși, anticorpii donori și acceptori sunt derivați de la animalele din diferite specii. în mod tipic, anticorpul donor anti-CD3 este un anticorp ne-uman, cum ar fi, de exemplu, MAb de rozătoare, și anticorpul acceptor este un anticorp uman.

Produsele anticorp grefate pe

CDR, în conformitate cu prezenta descriere de invenție, conțin regiunea tipică

RO 114232 Bl de legătură CD3 donoare, care cuprinde cel puțin un CDR dintr-un anticorp donor. De obicei, regiunea de legătură antigenică donoare cuprinde cel puțin două, și, de preferință, toate cele trei, CDRs din fiecare din regiunile variabile cu catene lungi și/sau catene scurte. CDRs cuprind CDRs Kabat, CDRs cu lanțuri structurale și oricare altă combinație a acestora. De preferință, regiunile de legătură antigenică a domeniilor variabile cu catene lungi grefate pe CDR cuprind CDRs corespunzătoare la CDRs Kabat la CDR2 (reziduurile 50-65] și CDR3 (reziduurile 95-100) și o compoziție Kabat și CDRs cu lanț structural la CDR1 (reziduurile 26-35).

De asemenea, pentru reziduurile de mai sus, și acolo unde este prezentă, numerotația reziduurilor este în conformitate cu numerotarea Kabat (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Astfel, denumirea reziduurilor nu corespund totdeauna direct la numerotarea lineară a reziduurilor de aminoacizi. Secvența de aminoacid actuală lineară poate conține mai puțini acizi aminici adiționali, decât în conformitate cu stricta numerotare Kabat, corespunzător scurtării sau inserției într-un component structural cadru sau CDR conform structurii domeniului variabil bazic. De exemplu, regiunea variabilă cu catenă lungă a anticorpului anti-Tac care este descrisă de Queen (așa cum este prezentat în literatura de specialitate) conține o singură inserție de aminoacid (reziduul 52a) după reziduurile 52 ale CDR2 și o inserție de trei aminoacizi în număr de trei (reziduurile 82a, 82b și 82c) după reziduul cadru 82, în conformitate cu numerotarea Kabat. Numerotarea corectă a reziduurilor, în conformitate cu Kabat, poate fi determinată pentru un anticorp dat prin alinierea la homologia regiunilor secvenței anticorpului cu secvența standard în conformitate cu numerotarea Kabat.

Prezenta invenție, în conformitate cu o întruchipare preferată,prevede un anticorp care este grefat pe CDR cu o catenă scurtă, având domeniul regiunii variabile cuprinzând cadrul acceptor și regiunile de legătură donoare CD3, în care cadrul cuprinde reziduurile donoare la cel puțin una din pozițiile 1 și/sau 3 și 46 și/sau 47. De preferință, catena scurtă grefată pe CDR, conform cu acestă întruchipare preferată a invenției, cuprinde reziduurile donoare la pozițiile 46 și/sau 47.

Prezenta descriere de invenție prevede, așadar, conform unei alte întruchipări, un anticorp cu catenă scurtă grefată pe CDR, având un domeniu al regiunii variabile cuprinzând regiuni de cadru acceptor și regiunile de legare CD3 donoare, în care cadrul cuprinde reziduurile donoare la cel puțin una din pozițiile 46, 48, 58 și 71.

Mult mai preferabil, conform acestei ultime întruchipări, acest cadru cuprinde, în conformitate cu o întruchipare preferată, 46, 48, 58 și 71. în conformitate cu o întruchipare preferată, în special cu întruchipările prezentate mai sus, catena lungă cadru adițională cuprinde reziduurile donoare la pozițiile 36, 44, 47, 58 și 87. Poziții similare ale cadrului cu catenă scurtă, care sunt specii comune încrucișate conservate, ca, de exemplu, pozițiile 2, 4, 6, 35, 49, 62, 64-69, 98, 99,'lDO, 102, dacă nu se conservă între donor și acceptor, cuprind adițional reziduurile donoare. Mult mai preferabil, catena scurtă cadru adițională cuprinde reziduurile donoare la pozițiile 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 100 și 102.

în adiție, cadrul cu catenă scurtă, conform cu întruchipările preferate de mai sus, cuprinde opțional reziduurile donoare la una, câteva sau la toate pozițiile, astfel: 1 și 3; 63; 60 (dacă 60 și 54 sunt capabile de a forma o sare de legătură potențială); 70 (dacă 70 și 24 sunt capabile de a forma o sare de legătură potențială];73 și 21 (dacă 47 este diferit între donor și acceptor); 37 și 45 (dacă 47 este diferit între donor și acceptor) și oricare dintre una sau mai multe din 10, 12, 40, 80, 103 si 105.

De preferință, regiunile de legare antigenică din domeniul variabil cu caRO 114232 Bl tenă scurtă grefată pe CDR cuprinde

CDRs corespunzător la CDRs Kabat, la

CDR1 (reziduul 24-34], CDR2 (reziduurile 50-56] și CDR3 (reziduurile 89-97].

în continuare, prezenta descriere de invenție se referă la al patrulea aspect, și anume, la molecula de anticorp grefat pe CDR cuprinzând cel puțin o catenă lungă grefată pe CDR, așa cum s-a arătat mai sus.

Moleculele de anticorpi care sunt umanizate și cele grefate pe CDR și catenele acestora, în conformitate cu descrierea prezentei invenții pot cuprinde: o moleculă de anticorp completă,având catene scurte și catene lungi cu lungimi complete; un fragment al acestora, cum ar fi, de exemplu, Fab, (Fab’2] sau FV ca fragment; nomomeri sau dimeri cu catene scurte sau lungi, sau un anticorp cu catenă simplă, de exemplu o catenă simplă de FV, în care regiunile variabile cu catene lungi sau scurte sunt unite prin linkeri de peptide sau orice alt produs anticorp grefat pe CDR sau anticorp umanizat cu specificitate de legare anti-CDR. în mod similar, regiunea variabilă cu catenă lungă sau catenă scurtă care sunt grefate pe CDR pot fi combinate cu alte domenii corespunzătoare.

Așadar, catenele scurte și lungi umanizate sau moleculele de anticorpi, în conformitate cu prezenta invenție, pot fi atașate la o moleculă reportoare sau la o moleculă efectoare. De exemplu, acestea pot avea un macrociclu pentru chelarea unui atom de metal greu sau a unei toxine, cum ar fi ricinul, care este legat printr-o legătură cu structură covalentă. în mod alternativ, procedeele de tehnologie recombinantă ADN pot fi utilizate pentru a produce o moleculă de imunoglobulină în care fragmentul Fc sau domeniul CD3 al moleculei de imunoglobulină completă este înlocuit, sau este legat la aceasta printr-o legătură peptidică, o proteină funcțională neimonoglobulinică, cum ar fi, de exemplu, o moleculă de enzimă sau o moleculă de toxină. Pentru produsele anticorpi grefate pe CDR, orice secvențe cadru din regiunea variabilă acceptoare corespunzătoare poate fi utilizată, având în vedere clasa/tipul anticorpului donor de la care este derivată regiunea de legătură antigenică. De preferință, tipul de acceptor cadru utilizat este de aceeași clasă sau tip cu anticorpul donor. Convenabil, cadrul poate fi ales pentru a maximiza sau pentru a optimiza homologia cu secvențele de anticorp donor, în special la pozițiile închise sau adiacente la CDRs. Totuși, un nivel ridicat de homologie între secvenețele donoare și acceptoare nu este important pentru aplicarea prezentei invenții.

Prezenta descriere de invențieidentifică o ierarhie a pozițiilor reziduului cadru, la care reziduurile donoare pot fi importante sau dezirabile pentru obținerea unui produs anticorp grefat pe CDR, care are proprietăți de legare satisfăcătoare.

în conformitate cu prezenta invenție, se pot prepara în mod avantajos produși anticorp grefați pe CDR care au afinități de legare similare la, și chiar, în unele cazuri, mai bine, ca pentru produsul anticorp donor corespunzător, de exemplu produsul DTK3. De preferință, produșii anticorpi grefați pe CDR, în conformitate cu prezenta invenție, au afinități de legare de cel puțin aproximativ 10⁵Μ'¹, de preferință la cel puțin aproximativ 1O^SM'¹ și, în special, în intervalele de la 1D^a-10¹² M'¹. în principiu, prezenta invenție este aplicabilă la orice combinație de anticorpi donori și, respectiv, acceptori la un nivel de homologie între secvențele acestora. Un protocol pentru aplicarea invenției la orice pereche de anticorpi, în special donoriacceptori, va fi prezentat în continuarea descrierii. Exemple de anticorpi cadru umani care sunt utilizați, sunt următorii: KOL, NEWM, REI, EU, LAY și POM (așa cum este prezentat în literatura de specialitate]; de exemplu, KOL și NEWM pentru catena lungă și REI pentru catena scurtă, iar EU și LAY și POM pentru ambele catene lungi și scurte.

Așadar, domeniile regiunii constante ale produselor care sunt prezenRO 114232 Bl tate de invenție sunt selectate având în considerație funcția propusă a anticorpului, în special funcțiile efectoare care pot fi necesare. De exemplu, domeniile regiunii constante pot fi domenii umane IgA, IgE, IgG și IgM. în special, domeniile regiunii constante umane IgG pot fi utilizate, și ,în special, izotopii lgG1 și lgG3, când se intenționează ca molecula anticorp umanizată să fie folosită în scop teraputic, și funcțiile de anticorp efectoare sunt necesare. în mod alternativ, izotopii lgG2 și lgG4 pot fi utilizați, când molecula umanizată de anticorp se intenționează să fie utilizață pentru scopuri terapeutice și funcțiile de anticorp efector nu sunt necesare, de exemplu prin simpla blocare a complexului receptor CD3 Tcelular.

Totuși, moleculele de anticorp care rămân nu sunt necesare să conțină numai secvențe de proteine din imunoglobuline. De exemplu, o genă poate fi construită, în care secvența ADN codificând secvența de aminoacid a polipeptidei efectoare sau a moleculei reportoare.

De preferință, produsele formate din molecule de anticorpi și catenele lungi și scurte grefate pe CDR sunt produse care se obțin prin tehnologia recombinantă a ADN.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenții include secvențele de ADN codificate pentru RAMs, HAMs și catenele lungi și scurte grefate pe CDR, clonizarea și exprimarea vectorilor conținând secvența de ADN, celulele gazdă transformate cu secvențele ADN și procedeele de producere a moleculelor de anticorpi grefate pe CDR cuprinzând exprimarea secvențelor de ADN în celulele gazdă transformate.

Metodele generale prin care vectorii pot fi construiți, metodele de transfectare și metodele de cultură sunt bine cunoscute și nu sunt în cadrul prezentei invenții. Astfel de metode sunt prezentate în materialele din literatura de specialitate.

Secvența ADN care codifică secvența de aminoacid donoare anti-CD3 par, de asemenea, să fie obținute prin metode care se cunosc în domeniul de specialitate. De exemplu, secvențele care codifică anti-CD3 pot fi obținute prin clonizare genomică sau cADN cloniazte din linii celulare hibridoma convenabile, ca, de exemplu,linia celulară DKT3, sșa cum s-a descris în prezenta invenție. Clonele pozitive pot fi ecranate, utilizându-se probe corespunzătoare pentru genele cu catene lungi și catene scurte menționate. De asemenea, se poate utiliza metoda de clonizare prin reacția polimerazei în lanț (PCR).

Codificarea ADN pentru acceptor, de exemplu acceptor uman, în care secvențele pot fi obținute pe orice cale convenabilă. De exemplu, secvențele de ADN codificând pentru anticorpi cadru acceptori umani preferați, ca.de exemplu, KOL, REI, EU și NEWM, sunt convenabili pe scară largă pentru persoanele care lucrează în domeniu.

Tehnicile standard pentru biologie moleculară pot fi utilizate pentru prepararea secvențelor de ADN, codificând produsele chimerice și produsele grefate pe CDR. Secvențele de ADN pot fi sintetizate complet sau parțial, utilizându-se tehnici de sinteză a nucleotidelor. Mutageneza directă parțială și reacția în lanț a polimerazei (PCR) sunt tehnici care se pot utiliza în mod corespunzător. De exemplu, sinteza directă a oligonucleotidei se poate efectua în conformitate cu cele cunoscute din literatura de specialitate. Așadar, sinteza prin mutageneză directă a oligonucleotidelor în regiunea variabilă preexistentă, ca, de exemplu, cea care este descrisă în literatura de specialitate, se poate utiliza când este nevoie. Se mai poate utiliza metoda de completare enzimatică în oligonucleotidele deschise, utilizându-se polimerază T4 ADN, așa cum este descris de către Queen și cunoscut din literatura de specialitate.

Orice sistem care este format din celula gazdă și vector, convenabil, poate fi utilizat pentru exprimarea secvențelor

ADN codificând catenele lungi și catenele scurte grefate pe CDR. De exemplu,

RO 114232 Bl bacteriile, cum ar fi, Escherichia coli și alte bacterii, pot fi utilizate în special pentru exprimarea fragmentelor de anticorpi, ca, de exemplu, Fab și (Fab’)2 ca fragmente și, în special FV și fragmente de anticorpi cu catenă simplă, ca, de exemplu, catena simplă FVs. Se pot utiliza sisteme de exprimare a celulelor gazdă la mamifere, eucariotice, în special pentru producerea produselor anticorp grefate pe CDR, incluzând molecule anticorp complete. Celule gazdă de la mamifere, convenabil includ celule CHO și linii celulare mieloma și hibridoma.

Astfel, conform unui alt aspect al prezentei invenții, se face referire la un procedeu de producere a unui RAM antiCD3, procedeu care cuprinde următoarele faze: (a) producerea într-un vector de exprimare a unui operon care are secvențe de ADN care codifică un anticorp cu catenă lungă și în care cel puțin un CDR al unui domeniu variabil este derivat dintr-un anticorp donor anti-CD3, iar părțile derivate de imunoglobulină care rămân ale catenei de anticorp sunt derivate de la un acceptor imunoglobulinic; și/sau (b) producerea unui vector de exprimare care codifică un anticorp cu catenă lungă și în care cel puțin un CDR al domeniului variabil este derivat dintr-un anticorp donor anti-CD3 și părțile derivate de imunoglobulină ale catenei de anticorp rămase sunt derivate de la un acceptor de imunoglobulină; (c) transformarea unei celule gazdă cu fiecare vector și [d] cultura liniei celulare transfectate pentru a produce RAM.

RAM cuprinde numai polipeptida derivată de la catene scurte sau catene lungi, în care caz numai polipeptida cu catene lungi sau scurte cu secvență codificată este utilizată pentru transfectarea celulelor gazdă.

Pentru producerea de RAMs, cuprinzând atât catene lungi, cât și catene scurte, linia celulară poate fi transfectată cu doi vectori. Primul vector poate conține un operon care codifică o polipeptidă derivată de la o catenă scurtă și al doilea vector poate conține un operon codificând o polipeptidă cu catenă lungă deri18 vată. De preferință, vectorii sunt identici, însă, exceptând cazul în care secvențele codificate și markerii selectabili sunt astfel încât pot asigura cât mai departe posibil fiecare catenă de polipeptidă care este exprimată la fel. în mod alternativ, un simplu vector poate fi utilizat; vectorii incluzând secvențele care codifică polipeptidele derivate atât de la catena lungă, cât și de la catena scurtă.

ADN în secvențele codificate pentru catenele lungi și catenele scurte poate cuprinde cADN sau ADN genomic, sau pe ambii. Cu toate acestea, este de preferat ca secvența de ADN codificând catena lungă și catena scurtă, cel puțin parțial aADN genomic. Mult mai preferabil, secvențele codificate cu catenă lungă și catenă scurtă cuprind o fuziune a cADN și a ADN genomic.

Prezenta descriere de invenție cuprinde, așadar, compozițiile terapeutice și compozițiile folosite la diagnosticare, care cuprind RAMs, HAMs, molecule, catene lungi și catene scurte grefate pe CDR.

Conform unui alt aspect al prezentei descrieri de invenție, se face referire la compoziția terapeutică sau la compoziția de diagnosticare care cuprinde RAM, HAM sau anticorpul grefat pe CDR cu catenă lungă sau scurtă, sau molecule de anticorp conform precedentelor aspecte ale invenției, în combinație cu un vehicul sau diluant sau un excipient care este acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Conform cu prezenta invenție, se face referire la o metodă de terapie sau o metodă de diagnosticare care cuprinde administrarea unei cantități efective de RAM, HAM sau anticorpul grefat pe CDR cu catenă lungă sau scurtă, sau molecule de anticorp care sunt prezentate în conformitate cu cele de mai sus, adminsitrarea făcându-se la animal sau la om.

RAM, HAM sau produsele grefate pe CDR, în conformitate cu prezenta invenție, pot fi utilizate pentru orice administrare terapeutică și pentru care anticorpii anti-CD3, ca, de exemplu, 0KT3,

RO 114232 Bl au fost utilizați - sau pot fi utilizați în viitor. De exemplu, produsele pot fi utilizate ca imunosupresanți, de exemplu în tratamentul rejecției alografe acute.

Un protocol preferat pentru obținerea anticorpului CDR grefat cu catene lungi și catene scurte, în conformitate cu prezenta invenție, este prezentat în cele ce urmează, împreună cu formula de structură. Acest protocol și formula de structură sunt date fără prejudicii la partea generală.

Protocolul este următorul:

Mai întâi este necesar să se secvențeze ADN codificat pentru regiunile cu catene lungi și catene scurte ale anticorpului donor, pentru a determina secvențele aminoacide. Este, de asemenea, necesar să se aleagă un acceptor convenabil din regiunile variabile cu catene scurte și catene lungi din secvențele de aminoacizi cunoscuți. Catena grefată pe CDR este apoi desemnată ca plecând de la baza secvenței acceptor. Este de apreciat că, în unele cazuri, reziduurile de aminoacizi donoare și acceptoare pot fi identice la poziția specială, și astfel nici o schimbare a reziduului cadru acceptor nu este necesară.

1. Ca o primă fază, reziduurile donoare sunt substituite ca reziduuri acceptoare în CDRs. Pentru acest scop, CDRs ,de preferință, sunt definite după cum urmează:

Catena lungă: CDR1, reziduurile 26-35; CDR2, reziduurile 50-65 și reziduurile CDR3, reziduurile 95-102.

Catena scurtă: CDR1, reziduurile 24-34; CDR2, reziduurile 50-56 și CDR3, reziduurile 89-97.

Pozițiile la care reziduurile donoare trebuie substituite pentru acceptor în cadru sunt alese după cum urmează, mai întâi cu referire la catena lungă și la un aspect secundar cu referire la catena lungă.

2. Catena lungă.

Reziduurile donoare alese la toate pozițiile 23, 24, 49, 71, 73 și 78 cu catenă lungă sau toate pozițiile 23, 24 și (71, 73 și 78 sunt fie toate donoare, fie toate acceptoare).

Se controlează dacă următoarele secvențe de aminoacizi donoare și acceptoare sunt, și dacă nu, este preferabil să se aleagă donorul; 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 și 107.

Pentru o altă afinitate de optimizare, se consideră alese reziduurile donoare la una, câteva sau la toate din următoarele; i, 1,3; ii, 72, 76; iii, dacă 48 este diferit între secvențele donoare și acceptoare, se consideră 69; iv, dacă la 48 reziduul donor este ales, se consideră 38 și 46; v, dacă la 69 reziduul donor este ales, se consideră 80 și apoi 20; vi, 67; vii, dacă la 67 reziduul donor este ales, se consideră 82 și apoi 18; viii, 91; ix, 88 și x, 9, 11,41,87, 108, 110, 112.

3. Catena scurtă.

Donorul ales la 46, 48, 58 și 71.

Se controlează dacă următoarele au aceleași secvențe de aminoacizi donoare și acceptoare, dacă nu, se preferă alegerea donorul; 2, 4, 6, 35, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, inclusiv 85, 87, 98, 99, 101 și 102.

Pentru o altă afinitate de optimizare, se consideră alegerea reziduurilor donoare la una, câteva sau oricare dintre următoarele: i, 1, 3; ii, 63; iii, dacă 60 dacă 60 și 54 sunt capabile să forme o sare de legătură potențială; iv, 70, dacă 70 și 24 sunt capabile să forme o sare de legătură potențială; v, 73 și 21, dacă 47 este diferit între donor și acceptor; vi, 37 și 45, dacă 47 este diferit între donor și acceptor; vii,10,12, 40, 80, 103, 105.

Formula de structură este:

în vederea transferării părții de legătură a anticorpului într-un cadru acceptor diferit, este necesar să fie considerat un număr de factori, astfel:

Extensia CDRs:

DCRs (regiunile de determinare complementară) sunt definite de către

Wu și Kabat (așa cum se arată în literatura de specialitate), pe baza analizei variabilității regiunilor diferite ale regiunilor variabile ale anticorpilor. Aceste regiuni sunt recunoscute în domeniu. în

RO 114232 Bl secvențele cu catenă scurtă sunt 24-34,

50-56, 89-97 (numerotare Kabat, în conformitate cu cele cunoscute], iar în secvențele cu catenă lungă sunt: 31-35,

50-65 și 95-102 inclusiv.

Când structurile de anticorp devin corespunzătoare, este aparent că aceste regiuni CDR corespund, în principal, la regiuni cu lanțuri care se extind de la cadrul β-barrel al domeniilor scurte și lungi. Pentru H1 există o discrepanță, în sensul că lanțul este de la 26 la 32 inclusiv, pentru H2 lanțul este de la 5256 și pentru L2 de la 50 la 53. Totuși, cu excepția lui H1, regiunile CDR cuprind regiunile lanț și acestea se extind în cadrul β de filament. în reziduul H1, 26 tinde de a fi serină și 27 este o fenilalanină sau tirozină, reziduul 29 este fenilalanină în majoritatea cazurilor. Reziduurile 28 și 30, care sunt reziduuri de suprafață expuse la solvent, ar putea fi incluse în legătura antigenică. O definiție prudentă a H1 CDR ar include reziduurile 26-35, pentru a include atât regiunea de lanț, cât și reziduurile hipervariabile 3335.'

Este interesant să se arate că în domeniul de specialitate ,se utilizează reziduul 31-35 ales pentru CDR-H1. în vederea producerii reziduului de legătură antigenică eficientă 27, este necesar ca acesta să fie ales din anticorpul donor (la șobolan].

Reziduurile de CDR care contribuie la legătura antigenică:

Prin examinarea structurilor cu raze X s-au identificat reziduuri care pot avea un efect asupra legăturii antigenice nete și care poate fi demonstrat prin experiment. Aceste reziduuri pot fi subdivizate într-un număr de grupe.

Reziduurile de suprafață aproape de CDR (toate numerotările sunt în conformitate cu Kabat, așa cum este prezentat în literatura de specialitate). Reziduurile cu catenă cheie sunt 23, 71 și 73. Alte reziduuri care pot contribui la o extindere mai mică sunt 1, 3 și 76. în final, reziduul 25 este uzual conservat, dar reziduul murinic ar putea fi utilizat dacă există o diferență.

Reziduurile cu multe catene închise la CDRs, de exemplu, 63, 65, 67 și 69, sunt conservate. Dacă nu este nici o conservare la reziduurile de suprafață în catena scurtă, este posibil să aibă un efect major. Totuși, dacă reziduurile murinice la aceste poziții este neuzual, ar fi folositor să se analizeze contribuția probabilă mult mai închisă. Alte reziduuri care pot contribui la legare sunt 1 și 3 și, de asemenea, 60 și 70, dacă reziduurile la aceste poziții și la pozițiile 54 și 24, respectiv, sunt potențial capabile să formeze o sare de legătură, de exemplu 60+54; 70+24.

Reziduurile de grupare apropiată de CDRs:

Reziduurile cu catenă cheie sunt 24, 49 și 78. Alte reziduuri ar fi 36, dacă nu este triptofan, 94 dacă nu este arginină, 104 și 106 dacă nu sunt glicină și 107 dacă nu este treonină. Reziduurile care pot contribui în continuare la o grupare stabilă a catenei lungi și, de aici, o afinitate îmbunătățită, sunt 2, 4, 6, 38, 46, 67 și 69. S-a observat că ar putea fi 67 grupări față de reziduul CDR 63, și aceste perechi ar putea fi atât pentru șoarece, cât și pentru om. în final, reziduurile care contribuie la grupare în această regiune, dar la o serie mai lungă, sunt 18, 20, 80, 82, 86. Reziduul 86 se grupează față de 67 și în schimb 18 se grupează față de 82, reziduul 80 se grupează față de 69 și în schimb 20 se grupează față de 80, Reziduul 86 formează o legătură H cu 38 și 46. Multe diferențe șoarece-om apar ca fiind minore, de exemplu Leu-lle, dar ar putea avea un impact minor pe gruparea corectă care ar realiza translația în poziționarea schimbată a CDRs.

Reziduurile cu catenă scurtă cheie sunt 48, 58 și 71. Alte reziduuri ar fi 6, dacă nu este glutamină, 35 dacă nu este triptofan, 62 dacă nu este fenilalanină sau tirozină, 64, 66, 99 și 101, dacă nu este glicină, și 102, dacă nu este treonină. Reziduurile care aduc o contribuție ulterioară sunt 2, 4, 37, 45 și 47. Reziduurile finale 73 și 21 și 19 pot parcurge o lungă distanță în ceea ce

RO 114232 Bl privește contribuția de grupare minoră.

Reziduurile la interfața domeniului variabil între catenele lungi și catenele scurte: în ambele catene lungi și scurte, majoritatea reziduurilor interfaței nonCDR sunt conservate. Dacă un reziduu conservat este înlocuit cu un reziduu cu caracter diferit, de exemplu dimensiunea și sarcina, acesta ar fi considerat pentru retenție ca reziduu murinic.

Reziduurile cu catenă lungă: Este necesar să fie considerat 37, dacă nu este valină, dar este un volum mai mare cu catenă secundară sau are o sarcină sau are o polaritate. Alte reziduuri sunt 39, dacă nu este glutamină, 45, dacă nu este leucină, 47, dacă nu este triptofan, 91, dacă nu este fenilalanină sau tirozină, 93, dacă nu este alanină, și 103, dacă nu este triptofan. Reziduul 89 ,de asemenea, la interfață, dacă nu este într-o poziție în care catena secundară ar putea fi cel mai mare impact.

Reziduurile cu catenă scurtă care necesită a fi considerate sunt 36, dacă nu este tirozină, 38, dacă nu este glutamină, 44, dacă nu este prolină, 46 49, dacă nu sunt tirozină, reziduul 85, reziduul 87, dacă nu este tirozină, și reziduul 98, dacă nu este fenilalanină.

Interfața regiunii constant-variabile: Porțiunea cotită între regiunile variabile și constante, care pot fi afectate de modificări privind gruparea reziduurilor cheie în regiunea variabilă față de regiunea constantă, poate fi afectată în poziția V_L și V_H cu referire la una față de cealaltă. De aceea, este important de notat reziduurile care vin probabil în contact cu regiunea constantă. în catena lungă, reziduurile potențiale de suprafață în contact cu regiunea variabilă sunt conservate între anticorpii umani și cei de la șoarece, de aceea reziduurile de contact din regiunea variabilă pot influența interacțiunea V-C. în catena scurtă, aminoacizii sunt găsiți la un număr de puncte de contact ale regiunii constante care variază, și regiunile V și C nu sunt într-o astfel de proximitate închisă ca cele ale catenei lungi. De aceea, influențele interfeței C-V cu catena scurtă pot fi mi24 nore.

Reziduurile de contact cu catenă lungă sunt 7, 11,41, 87, 108, 110 și 112.

Reziduurile potențiale de contact cu catenă scurtă sunt 10, 12, 40, 80, 83, 103 și 105.

Analiza care a fost arătată mai sus și cuplată cu experiența din practică în ceea ce privește grefarea pe CDR a unui număr de diferiți anticorpi a condus la efectuarea protocolului care a fost prezentat mai sus.

Se dă în continuare un exemplu de realizare, în legătură cu fig. 1...13, care reprezintă:

- fig.1, secvențele de ADN și de aminoacizi ale 0KT3 cu catenă scurtă;

- fig.2, secvențele de ADN și de aminoacizi ale 0KT3 cu catenă lungă;

- fig. 3, alinierea secvențelor de aminoacizi în regiunea variabilă cu catene scurte ale anticorpului uman REI;

- fig.4,alinierea regiunii variabile cu catenă lungă 0KT3 cu cea din regiunea variabilă cu catene lungi, ambele secvențe de aminoacizi ale anticorpului uman KOL;

- fig.5, secvențele de aminoacizi din regiunea variabilă cu catene lungi ale 0KT3, KOL și altele, corespunzătoare grefărilor pe CDR;

- fig.6, secvențele de aminoacizi din regiunea variabilă cu catene scurte ale 0KT3, REI și altele, corespunzătoare grefărilor pe CDR;

- fig.7 arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de legare pentru diferiți anticorpi grefați DKT3;

- fig.8 arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de blocare pentru diferiți anticorpi grefați 0KT3;

- fig.9 arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de blocare;

- fig. 10 arată reprezentările grafice similare pentru rezultatele analizelor de legare, atât pentru legare, cât și pentru blocare;

- fig. 11 arată o altă reprezentare grafică similară, pentru rezultatele analizelor de legare și blocare;

- fig. 12 arată o reprezentare graRO 114232 Bl fică a rezultatelor analizei de competiție pentru anticorpul minimal grefat 0KT3, cu referințe standard murinice 0KT3;

- fig. 13 arată o reprezentare grafică similară a rezultatelor analizei de competiție, comparând anticorpul 0KT3 complet grefat cu standardul de referință murinic.

Pentru realizarea exemplului de realizare sunt necesare următoarele etape de lucru:

Materiale și metode:

Celule ereditare: Celulele hibridoma care produc anticorpii 0KT3 sunt cunoscute din stadiul tehnicii (Ortho) și acestea se dezvoltă în mediu Dulbecco, modificat Eagles ,care nu conține antibiotice (DMEM), suplimentat cu glutamină și 5% ser fetal de vițel, acesta este divizat pentru a se obține atât supernatant supradezvoltat pentru evaluare, cât și celule pentru extracția RNA. Supernatantul supradezvoltat conține 250 pg/ml de anticorp kappa lgG2a murinic. Supernatantul este negativ pentru catena scurtă lambda murinică și pentru lgG1, lgG2b, lgG3, IgA și IgM cu catenă lungă. în continuare, 20 ml din supernatant se analizează pentru a se confirma că anticorpul prezent este □KT3.

Procedee de biologie moleculară:

Procedeele de biologie moleculară de bază au fost descrise în literatura de specialitate și au unele modificări minore, în unele cazuri. Secvența ADN este realizată, de asemenea, cum este cunoscut din literatura de specialitate. De asemenea, mutageneza directă parțială este descrisă în literatura de specialitate. Exprimarea celulară COS și studiile metabolice marcate sunt, de asemenea, descrise în literatura de specialitate.

Analize de cercetare:

Analize generale: analizele generale sunt efectuate pe supernatantele din celulele COS transfectate, pentru a determina cantitatea de IgG intactă care este prezentă.

Celulele transfectate cu gene

0KT3 la șoarece: Analiza de ansamblu pentru IgG intact la șoarece în celulele

COS din supernatante se face prin metoda ELISA, astfel: O placă de microtitrare cu 96 de godeuri este acoperită cu F(ab’)2 de capră anti-uman IgG Fc. Discurile sunt spălate cu apă, probele adăugate și ținute timp de o oră la temperatura camerei. Se spală discurile, după care se adaugă F(ab’)2 de capră anti-șoarece IgG Fc (HRPO conjugat). Substratul este adăugat pentru inițierea reacției. Ca standard, se utilizează UPC10, mielom lgG2a de șoarece.

COS și celulele CHO transfectate cu gene 0KT3 chimerice sau grefate pe CDR: Analiza generală pentru anticorpul chimeric sau anticorpul grefat pe CDR în supernatantele cu celule COS este realizată prin metoda ELISA, cu următorul format: 96 discuri microtitrate sunt acoperite cu F(ab’]2 de capră anti-uman IgG Fc. Discurile sunt spălate și probele sunt incubate timp de o oră la temperatura camerei. Discurile sunt spălate și catena kappa anti-umană monoclonală de șoarece este adăugată, timp de o oră,la temperatura camerei. Discurile sunt iarăși spălate și se adaugă F(ab’)2 de capră anti-șoarece IgG Fc (HRPO conjugat). Substratul enzimatic este adăugat pentru inițierea reacției. Compusul B72,3 (lgG4) chimeric se utilizează ca standard (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Utilizarea catenei anti-kappa monoclonale în această analiză permite anticorpilor grefați să fie citiți din standardul chimeric.

Analiza pentru activitatea de legare antigenică: Materialele de la supernatantele celulare COS sunt analizate în ceea ce privește activitatea de legare antigenică 0KT3 pe celulele pozitive CD3, în analiza directă. Procedeul este următorul: HUT celule 78 (linia celulară T umană, CD3 pozitive] sunt menținute în cultură. Monostraturile de celule HUT 78 sunt preparate pe 96 discuri ELISA, utilizându-se poli-L-lizină și glutaraldehidă. Probele sunt adăugate la monostraturi timp de o oră și la temperatura camerei. Discurile sunt apoi spălate ușor, utilizându-se PBS. în continuare F(ab’]2 de capră anti-uman IgG Fc (HRPO conjugat]

RO 114232 Bl sau F(ab’]2 de capră anti-șoarece (HRPO conjugat) este adăugat ca fiind convenabil pentru probele umanizate sau pentru probele de șoarece. Substratul este adăugat pentru a iniția reacția. Controlul negativ pentru analiză este pe bază de celule B72,3 chimeric. Controlul pozitiv este CKT3 Orthomune la șoarece sau □KT3 chimeric, când este convenabil. Această analiză pe bază de celule este dificil de realizat, și, ca urmare, o altă analiză alternativă este efectuată,care este mult mai sensibilă și ușor de efectuat, pentru 0KT3 grefat pe CDR. în acest sistem, OKT grefat pe CDR este produs de către celulele COS testate în ceea ce privește abilitatea lor de a se lega la CD3 pozitiv HPB-ALL (leucemie limfocitică acută în sângele periferic uman în linia celulară. Acesta a fost testat pentru abilitatea de blocare a legăturii 0KT3 murinice la aceste celule. Legarea este măsurată prin următorul procedeu: celulele HPB-ALL sunt recoltate din cultura tisulară și sunt incubate la temperatura de 4°C, timp de o oră, și cu diferite diluții din anticorpul de testat, din anticorpul de control pozitiv și control negativ. Celulele sunt spălate o dată și apoi incubate la temperatura camerei timp de o oră cu FlTC-marcat de capră anti-uman IgG (Fc-specific absorbit la șoarece). în continuare, celulele se spală de două ori și apoi sunt analizate prin citofluorografie. 0KT3 chimerice sunt utilizate drept control potiziv pentru legarea directă. Celulele sunt incubate cu supernatant celular COS stimulattransfectat, după care este marcat FITC anti-uman IgG de capră, conducând la obținerea unui control negativ. Pentru a testa abilitatea 0KT3 grefat pe CDR pentru blocarea legăturii 0KT3 murinice, celulele HPB-ALL sunt incubate la temperatura de 4°C, timp de o oră, și cu diferite diluții ale anticorpului de testat sau anticorpul de control. Se adaugă o cantitate fixă de soluție saturată de 0KT3 FITC. Mostrele sunt incubate timp de o oră la temperatura de 4°C. Se spală de două ori și se analizează prin citofluorografie. 0KT3 marcat FITC este utilizat ca control potiziv .pentru a determina legătura maximă. 0KT3 murinic, care este nemarcat, este folosit ca referință standard pentru blocare. Controalele negative sunt celulele necolorate, cu sau fără supernatant celular stimulat-transfectat. Abilitatea catenei scurte grefate pe CDR pentru legarea celulelor pozitive CD3 și blocarea legăturii DKT3 murinice este inițial testată în combinație cu catena lungă OKT3 chimerică. Catena lungă chimerică OKT3 este compusă din regiunea variabilă murinică și regiunea constantă umană, pentru genele grefate pe CDR. Vectorul de exprimare cu catenă scurtă grefat pe CDR și vectorul de exprimare cu catenă lungă chimerică sunt co-transfectați în celule COS. Anticorpul 0KT3 chimeric complet (catenă chimerică scurtă și catenă chimerică lungă) este găsit a fi capabil de legare la celulele CD3 pozitive și de blocare a legăturii OKT3 murinic, în aceste celule.

Determinarea afinității de legare relativă: afinitățile de legare relative ale anticorpilor monoclonali anti-CD3 grefați pe CDR sunt determinate prin legătura de competiție (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate) utilizându-se linia celulară T umană HPB-ALL, ca sursă de antigen CD3 și OKT3 murinică fluorescein-conjugată ca anticorp trasor. Afinitatea de legare a anticorpului trasor FI-0KT3 este detrminată prin analiza de legare directă, în care cantități crescute de FI-0KT3 sunt incubate cu HPB-ALL (5 x 1O⁵) în PBS care conține 5% ser fetal de vițel, pe o perioadă de o oră și la temperatura de 4°C. Celulele sunt spălate, și, în continuare, intensitatea de fluorescență este determinată cu un citometru cu debit FACScan calibrat cu standarde microbiene cantitative [cunoscut din literatura de specialitate). Intensitatea de fluorescență per moleculă de anticorp (F/P raport) este determinată prin utilizarea microstraturilor care au un număr predeterminat de porțiuni de legare pentru anticorpul IgG la șoarece. F/P egalează intensitatea de fluorescență a straturilor cu FI-0KT3 divizat

RO 114232 Bl prin numărul de porțiuni legătură per strat. Cantitatea de FI-0KT3 libere și legate este calculată din intensitatea fluorescenței per celulă și raportul liber/legat este calculat față de numărul de moli ai anticorpului legat. Adaptarea lineară a fost utilizată pentru determinarea afinității de legare (valoarea absolută a pantei). Pentru legare competitivă, cantitățile crescute ale anticorpului competitor sunt adăugate la doza de subsaturare a FI-OKT3 și incubate cu HPB-ALL (5 x 1O⁵) în 20 O ml de PBS care conține 5% ser fetal de vițel, timp de o oră și la temperatura de 4°C. Intensitățile de fluorescență ale celulelor sunt măsurate pe un citometru cu debit FACSca, calibrat cu standarde microbiene cantitative. Concentrațiile de Fl0KT3 legați și liberi sunt calculate, și afinitățile anticorpilor de competiție se calculează în conformitate cu ecuația (X)(0KT3)=(1/Kx)-(1/Ka), în care Ka este afinitatea 0KT3 murinic, Kx este afinitatea competitorului X, [] este concentrația anticorpului competitor la care raportul legătură/legătură liberă este R/2 și este legătura maximală legat/ liber.

Construcția colecției cADN:

Prepararea mRNA și sinteza cADN: Celulele care produc de 0KT3 sunt dezvoltate așa cum s-a descris mai sus, și 1,2 x 10⁹ celule recoltate au fost extrase printr-un procedeu în care s-a folosit guanidina/LiCI. CADN au fost preparate prin primingul de la Cligo-dT pentru generarea cADN de lungime completă.

Construcția colecției: Colecția cADN este legată de vectorul pSP65 ADN. care a fost fragmentat de grupările 5' fosfat, îndepărtate prin fosfatazele intestinale de vită (EcoR1/C1P). Legarea este utilizată pentru transformarea cu eficiență maximă de transformare de Escherichia coli [E.coli] HB101. în continuare, este preparată o colecție de cADN. Un număr de 3600 colonii sunt ecranate pentru catena scurtă și 10000 colonii sunt ecranate pentru catena lungă.

Screening:

Coliniile de E.coli pozitive pentru probele cu catene lungi și catene scurte sunt identificate prin screeningul oligonucleotidelor și se utilizează următoarele oligonucleotide: 5'TCCAGATGTTAACTG CTCAC pentru catena scurtă, care este complementară la o secvență în regiunea constantă kappa la șoarece, și 5'CAGGG GCCAGTGGATGGATAGAC pentru catena lungă, care este complementară la o secvență în regiunea din domeniul constant CH1 lgG2a la șoarece. Clonele cu 12 catene scurte și 9 catene lungi sunt identificate și folosite pentru a doua serie de screeninguri. Clonele pozitive de la a doua serie de screeninguri sunt dezvoltate și este preparat ADN. Dimensiunile inserțiilor de gene sunt estimate prin gel de electroforeză și se inserează ca dimensiune capabilă să conțină o lungime completă cADN, care este subclonizată în M13 pentru secventarea ADN.

Secvențarea ADN:

Clonele care reprezintă patru clase de dimensiuni pentru ambele catene lungi și scurte sunt obținute în M13. Secvența ADN pentru regiunile 5' netranslate, secvențele semnal, regiunile variabile și regiunile 3' netranslate cu cADNs având lungimi complete (fig. 1 a și 2b) sunt obținute, și secvențele de aminoacizi corespunzătoare sunt prevăzute în fig. 1b și 2b. în fig. 1a, regiunile ADN netranslate se arată că, în cazul superior și în ambele fig. 1 și 2, secvențele semnal sunt subliniate.

Construcția vectorilor de exprimare cADN:

Vectorii de exprimare Celltech se bazează pe plasmidul pEE6hCMV (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Un polilinker pentru inserția genelor care trebuie exprimate a fost introdus după promotorul/agentul de dezvoltare major imediat a Cytomegalovirusului uman (hCMV). Genele marcker pentru selecția plasmidelor în celulele encariotice trasnfectate pot fi inserate ca, casete BamHI în unica porțiune BamHI a pEE6 hCMV; de exemplu:

RO 114232 Bl marckerul nou prevede pEE6 hCMV nou. Practic, este uzuală inserția genei de interes, în care marckerul GS este inserat ultimul, deoarece sunt prezente în casete părțile interne EcoRi. Marckerii se- 5 lectabili sunt exprimați din ultimul promotor SV40, care prevede o origine a replicației, astfel ca vectorii să poată fi utilizați pentru exprimare în sistemul COS, de exprimare transient celular. io Secvențele la șoarece sunt excizate din vectori bazați pe M13 descriși mai sus ca fragmente EcoRi și clonizați în neo pEE6 hCMV pentru catena lungă și în EE6-hCI\/l\/-gpt pentru catena scurtă, 15 pentru a produce vectorii pJA136 și pJA135.

Exprimarea celulelor cADNs În COS:

Plasmidele pJA135 și pJA136 20 sunt co-transfectate în celule COS și supernatantul din experimentul de exprimare transient este demonstrat că conține anticorpul ansamblat care este legat la limfocitele T celulare îmbogățite. 25 Experimentele metabolice de marcare care utilizează S³⁵metionina arată exprimarea și asamblarea catenelor lungi și scurte.

Construcția genelor chimerice: 30 Construcția genelor chimerice este următoare unei strategii descrise în literatura de specialitate. Astfel, o porțiune de restricție apropiată de capătul 3' al secvenței domeniului variabil este 35 identificată și utilizată pentru atașarea oligonucleotidelor adaptoare codificate, pentru regiunea variabilă care rămâne la șoarece, și o porțiune de restricție convenabilă pentru legare la regiunea 40 constantă de selecție.

Construcția genei cu catenă scurtă: Secvența de cADN care conține o parte Aval aproape de capătul 3' al regiunii variabile (fig. 1a). Majoritatea secvenței regiunii variabile este izolată ca fragment 396 bp EcoR1-Aval. Un adaptor de oligonucleotidă este desemnat să înlocuiască regiunea care rămâne 3' din regiunea variabilă din partea Aval și să includă reziduurile 5' din regiunea constantă umană peste aceasta și incluzând o parte unică Nari, care a fost în prealabil energizată în regiunea constantă. O porțiune Hindi 11a fost introdusă să acționeze ca marcker pentru inserția linckerului. Linckerul este legat la fragmentul V_L și fragmentul 413 bp Eco-Narl adaptat este purificat din amestecul de legare. Regiunea constantă este izolată ca fragment Narl-E3amH1 din clona M13.NW361 și este legată cu o regiune variabilă ADN în vectorul tratat EcoRi/BamHI/C1P pSP65, într-o reacție pe trei căi, pentru producerea plasmidului JA143. Clonele sunt izolate după transformarea în E.coli și secvențele linckeri și de joncțiune sunt confirmate prin prezența porțiunii Hindi 11 și prin secvențarea ADN.

Construcția genei cu catenă scurtă - versiunea 2:

Construcția primei gene chimerice cu catenă scurtă produce o fuziune a secvențelor chimerice cu catene lungi și catene scurte la joncțiunea regiunii variabile cu joncțiunea constantă. în cazul catenei scurte 0KT3 de aminoacizi la joncțiunea chimerică sunt:

Leu-Glu-lle-Asn-Arq/ - /Thr-Val-Ala variabilă

-Ala canstant

Acest aranjament al secvenței introduce 45 o porțiune potențială legată pentru Asparagină (Asn), (N-legată) prin glicolizare la joncțiunea V-C. De aceea, a doua versiune a adaptorului oligonucleotidă chimeric cu catenă scurtă desemnată, în 50 care treonina (Thr), prima regiune constantă umană de aminoacizi este înlocuită cu echivalentul de aminoacid din regiunea constantă la șoarece, Alanina (Ala). O porțiune internă Hindi 11 nu este inclusă în acest adaptor, pentru a diferenția cele două gene chimerice cu catenă scurtă. Fragmentul din regiunea

RO 114232 Bl variabilă este izolat ca fragment 376 bp EcoR 1-Aval. Linckerul oligonucleotidă este izolat ca fragment 376 bp EcoR1Aval. Linckerul oligonucleotidă este legat la Nari fragmentat pNW361 și apoi regiunea constantă 396 bp adaptată este izolată după refragmentarea pNW361 modificat cu EcoR1. Fragmentul din regiunea variabilă și fragmentul din regiunea constantă modificată sunt legate direct la EcoR1/C1P tratat pEE6h CMVneo, pentru a produce pJA137. Inițial, clonele exprimate au inserția în orientare incorectă. De aceea, inserția este re-izolată și clonizată, pentru a returna inserția înapoi și a produce plasmidul pJA141. Diferitele clone cu inserția în orientare corectă sunt obținute și secvența adaptor a unei inserții este confirmată prin secvențarea ADN.

Construcția genei cu catenă lungă:

Alegerea unui izotop al genei cu catenă lungă se face astfel: izotopul din regiunea constantă ales pentru catena lungă este lgG4 uman.

Construcția genei:

Secvențarea cADN cu catenă lungă arată o parte Bani aproape de capătul 3' al regiunii variabile (fig.2a], Majoritatea secvențelor din regiunea variabilă sunt izolate ca un fragment 426bp.EcoR1/C1 P/Ban1. 0 oligonucleotidă adaptor este desemnată pentru a înlocui regiunea 3' rămasă din regiunea variabilă din porțiunea Bani și incluzând o unică porțiune Hindi 11, care a fost în prealabil energizată în primii doi aminoacizi ai regiunii constante. Linckerul este legat la fragmentul V_H și EcoR 1-Hindi 11, ca fragment adaptat, este purificat din amestecul de legare. Regiunea variabilă a fost legată la regiunea constantă prin fragmentarea pJA91 cu EcoR1 și Hindi 11, prin îndepărtarea fragmentului intron și înlocuirea acestuia cu V_H, pentru a se produce pJA142. Clonele sunt izolate după transformarea în E.co//JM101, și secvențele de linckeri și secvențele joncțiunii sunt confirmate prin secvențarea ADN (porțiunea Hin111 este lipsită de clone).

Construcția vectorilor de exprimare chimerici:

Neovectorii și vectorii gpt: Catena scurtă chimerică (versiunea 1) este separată din pJA143 ca fragment EcoR1 și clonizată în EcoR1/C1P tratată cu pEE6hCMVneo ca vector de exprimar, pentru a produce pJA145. Clonele cu inserția în orientarea corectă sunt identificate prin desenul de restricție. Catena chimerică scurtă (versiunea 2) este descrisă mai înainte, în ceea ce privește construcția acesteia. Gena chimerică cu catenă lungă este izolată din pJA142 ca un fragment 2,5 Kbp EcoR 1/BamHI și clonizată în EcoR1/Bc11/C1P ca fragment de vector tratat al derivatului pEE6hCMVgpt, pentru a produce plasmidul pJA144.

Vectorii GS de separare: Versiunile GS ale pJA141 sunt construite prin înlocuirea casetelor neo și gpt prin BamHI/Sa11/C1P, tratament al plasmidelor, izolarea fragmentului vector și legarea la fragmentul care conține GS din plasmidul pR049, pentru a produce vectorul cu catenă scurtă pJA179 și vectorul cu catenă lungă pJA180.

Construcția vectorului simplu Gs: Construcțiile vectorului simplu conținând cL (chimeric cu catenă scurtă), cH (chimeric cu catenă lungă) și Gs gene pe un palsmid, în ordinea cL-cH-GS sau cH-cLGS și cu transcrispția genelor fiind de la capăt la coadă, de exemplu cL>cH>GS, sunt construite. Aceste plasmide sunt realizate prin tratarea pJA179 sau pJA180 cu BamHi/C1P și prin legarea în promotorul Bg111/Hindi 11 hCMV a casetei, împreună cu alte fragmente Hindi 11/BamHI din pJA141 în pJA180, pentru a da plasmidul cH-cL-GS pJA182 cu fragmentul Hindi 11/BamHI din pJA144în pJA179 pentru a da cL-cHGS plasmidul pJA181.

Exprimarea genelor chimerice:

Exprimarea în celule COS: Anticorpul chimeric cu plasmidul pJA145(cL) și pJA144(cH) este co-transfectat în celulele COS și supernatantul din experimentul de exprimare transient este arătat că conține anticorpul asamblat,

RO 114232 Bl care este legat la linia celulară T HUT 78 umană. Experimentele de marcare metabolice care utilizează S³⁵ metionina arată exprimarea și asamblarea catenelor lungi și scurte. Totuși, se observă mobilitatea catenelor scurte asupra gelurilor reduse, sugerând că partea de glicolizare potențială este glicozilată. Exprimarea celulelor COS în prezența tunicamicinei arată o reducere ca mărime a catenei scurte față de cea arătată pentru controlul anticorpilor chimerici și catena scurtă 0KT3 la șoarece. De aceea, JA141 sunt construite și exprimate. în acest caz, catena scurtă nu arată o mobilitate aberantă sau o dimensiune specială în prezența sau în absența tunicamicinei. în această a doua versiune, a catenei scurte chimerice, când este exprimată în asociere cu catena lungă chimerică [cH], se produce anticorpul care arată o bună legare la celulele HUT 78. în ambele cazuri, legătura antigenică este echivalentă la cea a anticorpului la șoarece.

Exprimarea în cazul celulelor din ovarul de hamster chinezesc (CHO): Liniile celulare stabile au fost preparate din plasmidele pJA141/pJA144 și din pJA179/pJA18O, pJA181 și pJA'l82, prin transfectarea în celule CHO.

Grefarea pe CDR:

Măsura luată a fost de a începe să se introducă reziduuri suficiente la șoarece, în cadrul regiunii variabile umane, pentru a genera activitatea de legătură antigenică comparabilă cu cea a anticorpilor chimerici și de șoarece.

Analizele regiunii variabile: Dintr-o exprimare a structurilor de baze de date înguste ale anticorpilor și complecșilor anticorp-antigen, reiese clar că numai un număr mic de reziduuri de anticorpi vine în contact direct cu antigenul. Alte reziduuri pot contribui la legarea antigenului, prin poziționarea reziduurilor de contact în configurațiile favorabile și astfel, prin inducerea unei grupări stabile a domeniilor variabile cu catene lungi și catene scurte. Reziduurile alese pentru transfer pot fi identificate printr-un număr de căi, astfel: (a) Prin exprimarea structurilor de anticorp cristal cu raze X la suprafața de legare antigenică, care poate fi predominant localizată pe o serie de lanțuri, trei pe fiecare domeniu, care se extind de la cadrul β-barell; (b) Prin analiza secvențelor regiunilor din domeniul variabil al anticorpului, a hipervariabilității (termenul fiind: regiunile de determinare a complementarității, CDRs, prin Wu și Kabat, care pot fi identificate și care sunt prezentate în literatura de specilitate). în majoritatea cazurilor, dar nu în toate cazurile, aceste CDRs corespund la (dar se extind după o scurtă cale) regiunile de lanțuri care au fost arătate mai sus; (c) Reziduurile neidentificate prin (a) și (b) pot contribui la legarea directă a antigenului sau la legarea indirectă a acestuia, prin topologia părții de legătură antigenică sau prin inducerea unei grupări stabile a domeniilor variabile individuale și de stabilizare a interacțiunii domeniului intervariabil. Aceste reziduuri pot fi identificate prin superimpozarea secvențelor pentru un anticorp dat pe o structură cunoscută și privind la reziduurile cheie pentru contribuția acestora sau prin analiza secvenței de aliniere și notarea reziduurilor “idiosincratice”, urmată de examinarea localizării structurale și a efectelor probabile.

Catene scurte: Fig. 3 arată o aliniere a secvențelor pentru regiunea cadru umană REI și regiunea variabilă cu catene scurte 0KT3. Lanțurile structurale (LOOP) și (Kabat) s-ar părea că corespund la regiunea de legătură antigenică și sunt marcate. De asemenea, marcate sunt și un număr de alte reziduuri care pot contribui, de asemenea, la legătura antigenică, așa cum s-a descris mai sus. Secvența de mai sus, din fig.3, tipul de reziduu indică localizarea spațială a fiecărui reziduu cu catenă secundară, derivat prin exprimarea structurilor rezolvate prin analiză cristalografică cu raze X. Cheia acestor tipuri de reziduuri este desemnată după cum urmează: N - aproape de CDR (structurile cu raze X); P - grupare; B cufundat, negrupat; S - suprafață; E RO 114232 Bl expus; I - interfață; * - interfață; - gruparea/expus parțial; ? - reziduuri non CDR, care pot fi îndepărtate ca secvență la șoarece. Reziduurile subliniate din fig.3 sunt aminoacizi. REI este ales ca un 5 cadru uman, deoarece catena scurtă este catena kappa și regiunile variabile arată homologie mai mare cu secvențe de șoarece față de regiunea variabilă lambda cu catenă scurtă, de exemplu io KOL (așa cum se va prezenta mai jos). REI este ales, de preferință, la alte catene scurte kappa, deoarece structura cu raxe X a catenei scurte a fost determinată, astfel că o examinare struc- 15 turală a reziduurilor individuale ar putea fi realizată.

Catena lungă: în mod similar, fig. 4 arată o aliniere a secvențelor pentru regiunea cadru umană KOL și regiunea 20 variabilă 0KT3 cu catenă grea. Lanțurile srtucturale și CDRs se crede că corespund la regiunea de legare antigenică și sunt marcate. Așadar, este marcat un număr de alte reziduuri care pot să 25 contribuie la legarea antigenică, așa cum s-a descris mai sus. Tipul de reziduu cheie și alți indicatori care sunt utilizați (arătat în fig.4) sunt aceiași ca și cei utilizați și arătați în fig.3. KOL este ales 30 ca o catenă cadru lungă, deoarece structura cu raze X a fost determinată la o mai bună rezoluție decât, de exemplu, NEWM, și, așadar, secvența se aliniază la regiunea variabilă cu catenă lungă 35 0KT3 și arată o mai slabă homologie la KOL decât NEWM.

Desemnarea genelor variabile: Domeniile regiunii variabile sunt desemnate cu regiunea variabilă la șoarece cu utilizarea codonului optimal (așa cum este arătat în literatura de specialitate) și se utilizează secvențele semnal B72,3 (de asemenea, cunoscut din literatura de specialitate). Secvențele sunt desemnate a fi legate la regiunea constantă în același mod ca și pentru genele chimerice descrise mai sus. Linele construcții conțin “secvențe consens Kozac” (așa cum este arătat în literatura de specialitate) și se leagă direct la secvența semnal 5' genă. Această secvență motiv se crede a avea un rol folositor în inițierea translației în encariote.

Construcția genei: Pentru a construi regiunile variabile, sunt convenabile diferitele strategii. Secvența poate fi asamblată prin utilizarea oligonucleotidelor, într-o manieră similară celei cunoscute din literatura în domeniu, sau prin înlocuirea tuturor CDRs sau regiunilor lanț prin oligonucleotide prin mutageneză specifică parțială și într-o manieră care, de asemenea, este cunoscută din literatura de specialitate. Sunt utilizate ambele strategii, iar o listă de construcții este prezentată în tabelul 1 care urmează și tabelul 2, precum și în fig.4 și 5. Este de notat, în diferite cazuri, că mutageneza conduce corespunzător la deteriorări, iar aranjamentul în genă este remodelat, în timp de succesul unui ansamblu convenabil este sensibil la calitatea oligonucleotidelor.

Tabelul 1

Construcții genetice grefate pe CDR

Codul	Secvența la șoarece conținut	Metoda de construcție	Secvența Kozak +
Catena	lungă Cadrele umane REI
212	26-32, 50-56, 91-96 inclusiv	SDM și ansamblul genei	+	n.d.
121A	26-32, 50-56, 91-96 inclusiv + 1,3, 46, 47	Ansamblul parțial al genei	n.d.	+

RO 114232 Bl

40

Tabelul 7 [continuare)

121B	26-32, 50-56, 91-96 inclusiv + 46, 47	Ansamblul parțial al genei	n.d.	+
221	24-24, 50-56, 91-96 inclusiv	Ansamblul parțial al genei	+	+
221A	24-34, 50-56, 91-96 inclusiv + 1,3, 46, 47	Ansamblul parțial al genei	+	+
221B	24-34, 50-56, 91-96 inclusiv + 1,3	Ansamblul parțial al genei	+	+
2210	24-24, 50-56, 91-96 inclusiv	Ansamblul parțial al genei	+	+
Catena lungă Cadrele umane KOL
121	26-32, 50-56, 95-1OOB inclusiv	Ansamblul genei	n.d.	+
131	26-32, 50-58, 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul genei	n.d.	+
141	26-32, 50-65, 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul parțial al genei	+	n.d.
321	26-35, 50-56, 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul parțial al genei	+	n.d.
331	26-35, 50-56, 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul parțial al genei Ansamblul genei	+	+
341	26-35, 50-56, 95-1 OOB inclusiv	SMD Ansamblul parțial al genei	+	+
341A	26-35, 50-56, 95-1 OOB inclusiv +6, 23, 24, 48, 49, 71, 73, 76, 78, 88, 91 (+63 - uman]	Ansamblul genei	n.d.	+
341B	26-35, 50-56, 95-1 OOB inclusiv + 48, 49, 71, 73, 76, 78, 88, 91 (+63 + uman)	Ansamblul genei	n.d.	+

Cheia:

n.d. = nedeterminat;

SDM = mutageneză directă parțială;

Ansamblul genei = regiunea variabilă asamblată întreg din oligonucleotide;

Ansamblul parțial al genei = regiunea variabilă asamblată prin combinarea fragmentelor de restricție, fie din alte gene original create din SMD și ansamblul genei sau din ansamblul oligonucleotidei a unei părți din regiunea variabilă și reconstrucția cu fragmente de restricție din alte gene original create din SMD și ansamblul genei.

rezonabile de anticorp. Inserția secvenței consens KozaK la poziția 5' la ATG (construcții kgL) conduce la o îmbunătățire de 2 - 5 ori în exprimarea netă. □ serie extinsă a experimentelor nivelurilor de exprimare sunt crescute de la aproximativ 200 ng/ml la aproximativ 500

Exprimarea genelor grefate pe 45 CDR:

Producerea anticorpului constituit din catene scurte (gL) cu catene lungi la șoarece (mM) sau catene lungi chimerice (cH): Toate catenele gL, în asociere 50 cu mH sau cu cH, produc cantități

RO 114232 Bl ng/ml pentru kgL/cH sau combinațiile kgL/mM. Când legarea directă la antigen pe celulele HUT 78 este măsurată, o construcție este desemnată să includă secvența bazată pe lungimea lanțului (gL121 ] la anticorpi activi, în asociere cu mH sau cH. □ construcție desemnată pentru a include secvența de șoarece pe CDRs Kabat (gL221) demonstrează unele legături slabe în asociere cu mM sau cH. Totuși, când reziduurile cadru 1, 3, 46, 47 sunt schimbate de la echivalenții 0KT3 umani la echivalenții murinici bazați pe argumentele subliniate mai sus, legătura antigenică este demonstrată când ambele construcții sunt noi și sunt denumite 121A și 221A și sunt co-exprimate cu cH. Când efectele acestor reziduuri sunt exprimate într-un detaliu mai mare, se pare că reziduurile 1 și 3 nu sunt reziduuri cu o contribuție majoră ca produs al genei gL221B și arată o activitate de legare puțin detectabilă în asociere cu cH. Produsul cu catenă scurtă al gL221C, în care secvențele la șoarece sunt prezente la 46 și 47, arată o activitate de legare bună în asociere cu cH.

Producția de anticorpi care constau din catenele lungi grefate [gH] cu catene scurte la șoarece (mL) sau catene scurte chimerice (cL): Exprimarea genelor gH s-a dovedit a fi mult mai dificilă decât gL. Mai întâi, incluziunea secvenței Kozak pare a nu avea un efect marcat privind exprimarea genelor gH. Exprimarea pare a fi slab îmbunătățită, dar nu în același grad așa cum s-a observat pentru catena scurtă grefată. Așadar, s-a arătat că este dificil să se demonstreze producția cantităților așteptate de material când lanțul ales (aminoacizii de la 26 la 32] pentru CDR1 este utilizat, ca, de exemplu, gH121, 131, 141, și nu poate fi trasă nici o concluzie despre aceste construcții. Mai mult, coexprimarea genei gH341 cu cL sau mL a fost variabilă și are tendința de a produce cantități mai mici de anticorp față de cH/cL sau mH/mL ca combinații. Modificările gH341 pentru a produce gH341A și gH341B conduc la niveluri îmbunătățite de exprimare. Aceasta se poate datora fie creșterii generale în fracțiunea secvenței la șoarece în regiunea variabilă sau pentru modificarea la poziția 63, unde reziduul este returnat la aminoacidul uman Valină (Val) din Fenilalanină (Phe), pentru evitarea posibilelor probleme de grupare internă cu restul de cadru uman. Acest aranjament produce, așadar, gH331 și gH321. C2nd gH321 sau hG331 sunt exprimați în asociere cu cL anticorpul este produs, dar activitatea de legare a anticorpului nu este detectată. Când gena gH341 mai conservativă este utilizată, legătura antigenică ar putea fi detectată în asociere cu cL sau mL, dar activitatea este numai marginală peste nivelul de bază. Când reziduurile de șoarece sunt substituite în continuare pe baza unor argumente care au fost arătate mai sus, legarea antigenului ar putea fi clar demonstrată pentru anticorpul produs când kgH341A și kgH341B sunt exprimate în asociere cu cL.

Producerea anticorpului complet grefat pe CDR: Gena kgL221A este coexprimată cu kgH341, kgH341A sau kgH341B. Pentru combinația kgL221A/ kgH341 este produs foarte puțin material într-o exprimare normală a celulelor COS. Pentru combinațiile kgL221 A/ kgH341A sau kgL221 A/kgH341 B, cantități de anticorp similare la gH/cH sunt produse. în diferite experimente, activitatea de legare antigenică ar putea fi detectată cu kgL221 A/kgH341 sau combinații de kgL221 A/kgH341, care exprimă niveluri foarte scăzute. Legătura de antigen este detectată când kgL221A/ kgH341A sau kgL221A/ kgH341B sunt exprimate. în cazul anticorpului produs din combinația kgL221 A/kgH341 A, legătura antigenică este foarte similară cu cea a anticorpului chimeric. □ analiză a rezultatelor de mai sus este prezentată mai jos.

Discutarea rezultatelor de grefare pe CDR:

în desemnarea anticorpului umanizat complet, scopul a fost de a transfera numărul minim de aminoacizi la

RO 114232 Bl șoarece, care ar putea conferi legătura antigenică pe cadrul anticorpului uman.

Extinderea CDRs: Pentru reziduurile cu catenă scurtă, care definesc lanțurile cunoscute din studiile structurale ale anticorpilor care conțin reziduurile de contact antigenice și acele secvențe hipervariabile definite de către Kabat (așa cum este cunoscut din literatura din domeniu], Regiunile de Determinare a Complementarității (CDRs] sunt echivalente pentru CDR2. Pentru CDR1, regiunea hipervariabilă se extinde de la reziduurile 24-34 inclusiv, în timp ce lanțul structural se extinde de la 26 la 32 inclusiv. în cazul 0KT3 există numai o diferență de aminoacizi între două opțiuni, la aminoacidul 24, la care secvența la șoarece este o serină și cadrul uman REI este glutamina. Pentru CDR3, lanțul se extinde de la reziduurile 91 la 96 inclusiv, în timp ce hipervariabilitatea Kabat se extinde de la reziduurile 89 la 97 inclusiv. Pentru aminoacizii 0KT3, 89, 90 și 97 sunt aceiași între 0KT3 și REI (fig.3). Când construcțiile bazate pe lanțul ales pentru CDR1 (gL121) și alegerea Kabat (gL221) sunt efectuate și co-exprimate cu mH sau cH, nici o evidență pentru activitatea antigenică nu ar putea fi găsită pentru gL121, dar urmele de activitate s-ar putea detecta pentru gL221, sugerând că un singur reziduu extra de șoarece în regiunea variabilă grefată ar putea avea vreun efect detectabil. Ambele construcții de gene sunt exprimate rezonabil în sistemul de exprimare pasager.

Reziduurile cadru: Reziduurile cadru care au rămas sunt examinate în continuare, în special aminoacizii cunoscuți din analiza cu raze X a altor anticorpi care trebuie închiși la CDRs, care arată diferența 0KT3 din consensul cadru pentru subgrupa de șoareci (subgrupa VI] la care 0KT3 arată cea mai mare homologie. Pentru poziții 1, 3, 46 și 47 sunt identificate și contribuția posibilă a acestora este exprimată prin substituirea aminoacizilor la șoarece pentru aminoacidul uman la fiecare poziție. De aceea, s-a realizat gL221A (gL221 +

D1Q, Q3V, L46R, L47W, așa cum este în fig.3 și tabelul 1], clonizate în EE6h CMVneo și co-exprimate cu cH (pJA 44], Anticorpul rezultat este bine exprimat și arată o bună activitate de legare. Când genele menționate gL221B(gL221 + D1Q, Q3V] și gL22C(gL221 + L46R, L47W] sunt realizate și testate în mod si milar, ambele gene care produc anticorpii sunt co-exprimate cu cH, numai combinația gL21C/cH este arătată o legătură antigenică bună. Când genele gL121A (gL221 + D1Q, Q3V, L46R, L47W] sunt realizate și co-exprimate cu genele cH, anticorpul este produs și este legat așadar la antigen.

Catena lungă. Extinderea CDRs: Pentru lanțul cu catene lungi, analizele de hipervariabilitate sunt numai în CDR. Pentru CDR1, regiunea lanțurilor se extinde de la reziduurile 26 la 32 inclusiv, în care CDR Kabat se extinde de la reziduurile 31-35 inclusiv. Pentru CDR2, regiunea lanțurilor este formată din reziduurile 50-58 inclusiv, în timp ce regiunea hipervariabilă acoperă aminoacizii 50-65 inclusiv. De aceea, catenele lungi umanizate sunt construite prin utilizarea cadrului de la anticorpul KOL și cu diferite combinații ale acestor CDR alese, inclusiv o combinație mai scurtă pentru CDR2 de 50-56 inclusiv, așa cum au fost unele nesigure, ca, de exemplu, definiția punctului final pentru reziduurile din jurul lanțurilor CDR2 56 până la 58. Genele sunt co-exprimate cu ml_ sa cL. în cazul genelor gH cu lanțuri alese pentru CDR 1, de exemplu gH121, gH131, gH141, anticorpul foarte mic este produs în cultura supernatanților. Deoarece nu s-a detectat nici o catenă scurtă liberă, s-a presupus că anticorpul a fost realizat și analizat în interiorul celulei, însă catena lungă este multiplicată posibil incorect și de aceea anticorpul este degradat intern. în câteva experimente, cantitățile de urme de anticorp ar putea fi detectate în S³⁵ marcat. Deoarece nici un anticorp nu este produs, analiza acestor construcții nu este continuată mai departe. Când, totuși, o combinație de lanțuri alese și de sortimente Kabat penRO 114232 Bl tru CDR1 sunt testate (aminoacizii 2635 inclusiv la șoarece) și în care reziduurile 31 (Ser până la Arg), 33 (Ala până la Thr) și 35 (Tyr până la His) sunt schimbate din reziduurile umane la re- 5 ziduurile de șoarece și comparate cu primele serii, anticorpul este produs pentru gH321, gH331, gH341 când este coexprimat cu cL. Exprimarea este în general joasă și n-ar putea fi marcat îm- io bunătățită prin inserția secvenței consens Kozak 5' la ATG al secvenței de semnal a genei, așa cum a fost distinct în cazul genelor gL, și în care astfel de inserții conduc la o creștere de 2-5 ori în 15 producția netă de anticorpi. Totuși, numai în cazul gH341 /mL sau kgH341 /cL s-ar putea demonstra activitatea de legătură antigenică marginală. Când gena kgH341 este co-exprimată cu kgL221A, 20 producția netă de anticorp este tot mai mică, pentru a da un semnal deasupra nivelului de bază în analiza de legare antigenică.

Reziduurile cadru: Ca și în cazul 25 cu catene scurte, sunt examinate. Aceasta este posibil întrucât există o homologie inițială mai joasă între domeniile variabile umane și cele de șoarece, comparate cu catenele scurte, mulți amino- 30 acizi având pozițiile probate ca fiind de interes. Două gene kgH341A și kgH341B sunt constituite cu 11 sau 8 reziduuri umane, respectiv substituite prin reziduuri la șoarece, comparate cu gH341 35 și cu reziduul CDR2 63 returnat la aminoacidul uman potențial pentru îmbunătățirea domeniului de grupare. Ambele cazuri arată gruparea de legare antigenică când se combină cu cL sau 40 kgL221A, gena kgH341A cu toate 11 schimbări părând a fi superior aleasă.

Concluziile interimare: S-a demonstrat pentru 0KT3 că, pentru a transfera abilitatea de legare antigenică la 45 anticorpul umanizat, reziduurile din afara regiunii CDR definite prin hipervariabilitatea Kabat sau prin alegeri de lanțuri structurale sunt necesare pentru ambele tipuri de catene, lungi și scurte. Câteva reziduuri extra sunt necesare pentru catena scurtă, posibil datorită unei homologii inițiale înalte între regiunile variabile kappa umane și cele de șoarece, □in cele șapte schimbări (1 și 3 din catena scurtă și 6, 23, 71, 73 și 76 din catena lungă) sunt prevăzute din cunoașterea altor structuri de anticorpi a fi parțial expuse sau pe suprafața de anticorp. S-a arătat, de asemenea, că reziduurile 1 și 3 în catena scurtă nu sunt absolut necesare a fi secvențate de șoarece; și pentru catenele lungi, catena lungă gH341B, în combinație cu catena scurtă 221 A, generează numai o activitate de legare slabă. De aceea, prezența schimbărilor 6 și 23 și 24 este importantă pentru menținerea unei afinități de legătură similară cu cea a anticorpului murinic. Este important să se studieze, în continuare, contribuția individuală a altor 8 reziduuri de șoarece a genei kgH341A, în comparație cu kgH341.

Experimentele de grefare pe CDR, În continuare:

Genele cu catene lungi grefate pe CDR adiționale sunt preparate așa cum s-a descris mai sus. Cu referire la tabelul 2 care urmează, următoarele gene cu catene grele bazate pe gH341 (plasmidul pJA178) și gH341A (plasmidul pJA185) cu 0KT3 de șoarece sau reziduuri KOL umane la 6, 23, 24, 48, 49, 63, 71,73, 78, 88 și 91, așa cum s-a arătat. Genele cu catenă scurtă grefate pe CDR și utilizate în următoarele experimente sunt gL221, gL221A, gL221B, gL221C, așa cum s-a descris mai sus.

Tabelul 2

Grefare pe CDR a 0KT3 cu catene lungi

1. GH341 și derivații acestuia

RES NUM 6 23 24 48 49 63 71 73 76 78 88 91 □KT3vh QKA IGF TKSAAY gH341 ESSVAF RNNLGFJA178

RO 114232 Bl

47

48 Tabelul 2 (continuare)

gH341A

Q

K

A

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA185

gH341E

Q

K

A

I

G

V

T

K

S

A

G

JA198

gH341*

Q

K

A

I

G

V

T

K

N

A

G

F

JA2O7

gH341*

Q

K

A

I

G

V

R

N

A

G

F

JA209

gH341D

Q

K

A

I

G

V

T

K

N

L

G

F

JA197

gH341*

Q

K

A

I

G

V

R

N

L

G

F

JA199

gH341C

Q

K

A

V

A

F

R

N

L

G

F

JA184

gH341*

Q

s

A

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA203

gH341*

E

s

A

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA205

gH34B

E

s

S

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA183

gH341*

□

s

A

I

G

V

T

K

S

A

G

F

JA204

gH341*

E

s

A

I

G

V

T

K

S

A

G

F

JA206

gH341*

Q

s

A

I

G

V

T

K

N

A

G

F

JA208

KOL

E

s

S

V

A

R

N

L

G

F

gH341*

Q

s

A

I

G

V

T

K

S

A

G

F

JA204

gH341*

E

s

A

I

G

V

T

K

S

A

G

F

JA206

gH341*

Q

s

A

I

G

V

T

K

N

A

G

F

JA208

KOL

E

s

S

V

A

R

N

L

G

F

Grefarea pe CDR a 0KT3 cu catene scurte

2. gL221 și derivații acestuia
RES NUM	1	3	46	47
0KT/v1	Q	V	R	W
gL221	D	Q	L	L	DA221
gL221A	Q	V	R	W	DA221A
gL221B	Q	V	L	L	□A221B
gL221C	D	Q	R	W	DA221C
REI	D	Q	L	L

Reziduurile murinice sunt subli- 30 niate.

Genele cu catene scurte și cu catene lungi grefate pe CDR sunt coexprimate în celule COS, fie cu una sau alta din diferitele combinații, dar și cu 35 genele cu catene lungi și catene scurte mirinice și chimerice substanțial descrise mai sus. Produsele de anticorpi care au rezultat sunt analizate prin analizele de blocare cu celulele HPB-ALL descrise 4 o mai sus.

Rezultatele analizelor pentru diferite catene lungi grefate și co-exprimate cu catena scurtă gL221C sunt prezentate în fig.7 și 8 (pentru JA148, JA185, 45 JA197 și JA198 ca construcții și conform tabelului 2), în fig.9 (pentru JA183, JA184, JA185 și JA197 ca construcții), în fig. 10 (pentru construcțiile chimerice JA185, JA199, JA204, 50 JA2D5, JA207, JA208 și JA209) și fig. 11 (pentru construcțiile JA183,

JA184, JA185, JA198, JA2G3, JA205 și JA206).

Produsul bazic grefat fără vreo schimbare umană în schimbări murinice în cadrul variabil, de exemplu gL221 coexprimat cu gh341(JA178) și produsul astfel grefat complet, având majoritatea schimbărilor umane către cele murinice în cadrul cu catenă lungă grefată, de exemplu gL221C co-exprimat cu gH341A (JA185), sunt analizate pentru afinitatea de legătură relativă într-o analiză competitivă față de referința standard murinică 0KT3, utilizându-se celule HPB-ALL. Analiza efectuată este așa cum s-a descris mai sus. Rezultatele obținute sunt prezentate în fig. 12 pentru produsul bazic grefat și în fig. 13 pentru produsul complet grefat. Aceste rezultate arată că produsul complet grefat de bază are o abilitate de legare slabă în comparație cu referințele standard murinice 0KT3; prin aceasta, produsul “grefat complet” are o

RO 114232 Bl abilitate de legătură foarte similară cu cea a standardului de referință murinic

0KT3.

Rezultatele analizei de blocare și legare arată următoarele rezultate: construcțiile JA198 și JA2O7 par a avea cele mai bune caracteristici de legare și abilități de legare similară, ambele fiind substanțial aceleași ca și produsele gH341A complet grefate și produsele chimerice. Aceasta arată că pozițiile 88 și 91 și poziția 76 nu sunt superior critice pentru menținerea abilității de legare a cel puțin câteva din pozițiile 6, 23, 24, 48, 49, 71, 73, 78 sunt mult mai importante.

La aceasta se mai adaugă și faptul că s-a descoperit că JA2O9 și JA199 au, de asemenea, abilitatea de legătură similară una față de alta și au o abilitate de legătură joasă față de JA198 și construcția JA2O7. Acesta arată importanța unor reziduuri de șoarece existente la pozițiile 71, 73 și 78, care sunt fie complet umane, fie parțial umane în construcțiile JA199 și, respectiv, JA2O9.

Mult mai mult, prin compararea rezultatelor obținute pentru construcțiile JA2O5 și JA183, s-a observat că există o descreștere în legătura care provine de la JA2O5 și JA183. Aceasta arată importanța reziduului de șoarece reținut la poziția 23, singura poziție schimbată între JA2O5 și JA183. Aceste rezultate, și altele, au condus la concluzia că cele 11 reziduuri cadru la șoarece și utilizate în construcția gH341 A(JA185) este important a se reține reziduurile de șoarece la toate pozițiile 6, 23, 24, 48 și 49 și posibil, pentru o maximă afinitate, la pozițiile 71, 73 și 78.

Claims

1. Molecule anticorp anti-CD3, cu afinitate pentru antigen CD3, care conțin o catenă lungă compozită și o catenă scurtă complementară, sau care conțin o catenă scurtă compozită și o catenă lungă complementară, numita catenă lungă compozită având un domeniu variabil, care conține reziduuri cadru cu catenă lungă de anticorp acceptor predominant uman și reziduuri de legare antigenă cu catenă lungă de anticorp donor neuman, respectivul anticorp donor având afinitate față de respectivul antigen CD3, iar numita catenă scurtă compozită având un domeniu variabil, care conține reziduuri cadru cu catenă scurtă de anticorp acceptor predominant uman și reziduuri de legare antigen cu catenă scurtă de anticorp donor neuman, respectivul anticorp donor având afinitate față de respectivul antigen CD3, caracterizate prin aceea că, în conformitate cu cu sistemul de numerotare Kabat, în catena lungă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58 și 95 până la 102 sunt reziduuri donoare, iar în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile aminoacide 24 până la 34, 46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare.

2. Molecule anticorp anti-CD3, cu afinitate pentru antigen CD3, care conțin o catenă lungă compozită și o catenă scurtă complementară, numita catenă lungă compozită având un domeniu variabil, care conține reziduuri cadru cu catenă lungă de anticorp acceptor predominant uman și reziduuri de legare antigenă cu catenă lungă de anticorp donor neuman, respectivul anticorp donor având afinitate față de respectivul antigen CD3, caracterizate prin aceea că, în conformitate cu cu sistemul de numerotare Kabat, în catena lungă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58 și 95 până la 102 sunt reziduuri donoare.

3. Molecule anticorp conform revendicărilor 1 și 2, caracterizate prin aceea că, reziduurile de aminoacid 71, 73 și 78 din catena lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.

4. Molecule anticorp conform revendicărilor 1, 2 și 3, caracterizate prin aceea că, reziduurile de aminoacid 26 până la 30 și 59 până la 65 din catena lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.

RO 114232 Bl

5. Molecule anticorp conform cu revendicările 1 până la 4, caracterizate prin aceea că, reziduurile de aminoacid

I, 3 și 76 din catena lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.

6. Molecule anticorp conform cu oricare dintre revendicările precedente, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 36 (dacă nu este triptofan), 94 (dacă nu este arginină), 104 și 106 (dacă nu este glicină) și 107 (dacă nu este treonină), din catena lungă compozită este un reziduu donor suplimentar.

7. Molecule anticorp conform revendicării 6, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 46, 67 și 69 din catena lungă compozită este reziduu donor suplimentar.

8. Molecule anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 1 la 7, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 18, 20, 80, 82 și 86 din catena lungă compozită este reziduu donor suplimentar.

9. Molecule anticorp conform cu oricare dintre revendicările precedente de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 37 (dacă nu este valină, dar este cu un volum al catenei laterale mai mare sau are o sarcină sau polaritate), 39 (dacă nu este glutamină), 45 (dacă nu este leucină) și 47 (dacă nu este triptofan), 91 (dacă nu este fenilalanină sau tirosină), 93 (dacă nu este alanină) și 103 (dacă nu este triptofan) din catena lungă compozită, este un reziduu donor suplimentar.

1 □. Molecule anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 1 la 9, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 9,

II, 41, 87, 108, 110 și 112 din catena lungă compozită este un reziduu donor suplimentar.

11. Molecule anticorp anti-CD3, cu afinitate pentru antigen CD3, care conțin o catenă scurtă compozită și o catenă lungă complementară, numita catenă scurtă compozită având un domeniu variabil, care conține reziduuri cadru cu catenă scurtă de anticorp acceptor predominant uman și reziduuri de legare antigenă cu catenă scurtă de anticorp donor neuman, respectivul anticorp donor având afinitate față de respectivul antigen CD3, caracterizate prin aceea că, în conformitate cu cu sistemul de numerotare Kabat, în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile aminoacide 24 până la 34, 46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare.

12. Molecule anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 1 la 10, caracterizate prin aceea că, catena scurtă complementară este o catenă scurtă cu domeniu variabil, care conține predominant reziduuri cadru cu catenă scurtă de anticorp acceptor și reziduuri de legare antigen cu catenă de anticorp donor neuman, respectivul anticorp donor având afinitate față de respectivul antigen CD3, în care, în conformitate cu cu sistemul de numerotare Kabat, în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid 24 până la 34, 46, 48, 50 până I a 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare.

13. Molecule anticorp conform revendicărilor 11 sau 12, caracterizate prin aceea că, reziduurile aminoacide 1 și 3 și 60 și 70 (dacă reziduul 60 poate forma o punte de sare cu reziduul 54 și dacă reziduul 70 poate forma o punte de sare cu reziduul 24) , din catena scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

14. Molecule anticorp conform revendicărilor 11 la 13, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 6 (dacă nu este glutamină), 35 (dacă nu este triptofan), 62 (dacă nu este fenilalanină sau tirosină), 64, 66, 68, 99 și 101 (dacă nu este glicină) și 102 (dacă nu este treonină), din catena scurtă compozită, este un reziduu donor suplimentar.

15. Molecule anticorp conform revendicării 14, caracterizate prin

RO 114232 Bl aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 37, 45 și 47, din catena scurtă compozită, este un reziduu donor suplimentar.

16. Molecule anticorp conform 5 revendicării 15, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 19, 21 și 73, din catena scurtă compozită, este un reziduu donor suplimentar. io

17. Molecule anticorp conform revendicărilor 11 până la 16, caracterizate prin aceea că, reziduurile de aminoacid 36 (dacă nu este tirosină), 44 (dacă nu este prolină), 49 (dacă nu este tirosină), 85, 87 (dacă nu este tirosină] și 98 (dacă nu este fenilalanină], din catena scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

18. Molecule anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 11 la 17, caracterizate prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 10, 12, 40, 80, 83, 103 și 105, din catena scurtă compozită, este un reziduu donor suplimentar.