KR20230062600A - 항-ceacam5 항체 및 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 CEACAM5 단백질에 결합하는 항체를 비롯하여, 상기 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 성장-억제제에 연결된 상기 항체를 포함하는 면역접합체, 및 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암의 치료 또는 진단 목적을 위한 항체, 면역접합체 및 약학 조성물의 용도를 제공한다.

Description

항-CEACAM5 항체 및 접합체 및 이의 용도
본 발명은 인간 CEACAM5 단백질에 결합하는 항체를 비롯하여, 상기 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 성장-억제제에 연결된 상기 항체를 포함하는 면역접합체, 및 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암의 치료 또는 진단 목적을 위한 본 발명의 항체, 면역접합체, 및 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
암-배아 항원 (CEA)은 세포 부착에 관여하는 당단백질이다. CEA는 임신 처음 6개월 동안 태아 장에서 정상적으로 발현되는 단백질로서 1965년에 최초로 확인되었고 (Gold and Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965), 직결장암 또는 최장암 등의 많은 암에서 발견되었다. CEA 패밀리는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속한다. CEA 패밀리는 18개 유전자로 이루어지며, 단백질의 2개 아군: 암-배아 항원-관련된 세포 부착 분자 (CEACAM) 아군 및 임신-특이적 당단백질 아군으로 세분된다 (Kammerer & Zimmermann, BMC Biology 2010, 8:12).
인간에서, CEACAM 아군은 다음의 7개 구성원으로 이루어진다: CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8. 본래 확인된 CEA와 동일한, CEACAM5는 암 세포 예컨대, 예를 들어, 직결장, 위, 폐, 및 췌장 종양 세포의 표면에서 고도로 발현되는 것으로 보고되었고, 정상 조직에서 발현은 소수의 정상 상피 세포 예컨대 결장 및 식도 상피 세포에 제한된다. 따라서, CEACAM5는 종양-특이적 표적화 접근법에 적합한 치료 표적, 예컨대 면역접합체를 구성할 수 있다.
CEACAM 패밀리 구성원의 세포외 도메인은 서열 상동성에 따라서, A, B, 및 N의 3개 유형으로 분류되는 반복된 면역글로불린-유사 (Ig-유사) 도메인으로 구성된다. CEACAM5는 7개의 이러한 도메인, 즉 N, A1, B1, A2, B2, A3 및 B3을 함유한다. 한편으로, CEACAM5 A1, A2 및 A3 도메인, 및 다른 한편으로 B1, B2 및 B3 도메인은 높은 서열 상동성을 보이고, 인간 CEACAM5의 A 도메인은 84 내지 87%의 쌍별 서열 유사성을 나타내고, B 도메인은 69 내지 80%를 나타낸다. 더 나아가서, 그들 구조에 A 및/또는 B 도메인이 존재하는 다른 인간 CEACAM 구성원, 즉 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8은 인간 CEACAM5와 상동성을 보인다. 특히, 인간 CEACAM6 단백질의 A 및 B 도메인은 각각 인간 CEACAM5의 A1 및 A3 도메인, 및 임의의 B1 내지 B3 도메인과 서열 상동성을 보이는데, 인간 CEACAM5의 A 도메인 및 B 도메인 중에서 관찰되는 것보다 훨씬 더 높다.
항-CEA 항체는 CEA-표적화된 진단 또는 치료 목적을 위해 생성되었다. 관련 항원에 대한 특이성은 예를 들어, Sharkey 등 (1990, Cancer Research 50, 2823)에 의해서, 이 분야에서 우려로서 항상 언급되었다. 상기 언급된 상동성으로 인해서, 이전에 기술된 항체의 일부는 예를 들어, 상이한 면역글로불린 도메인에 존재하는 CEACAM5의 반복 에피토프에 대한 결합을 입증할 수 있고, 다른 CEACAM 패밀리 구성원 예컨대 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7, 또는 CEACAM8과 교차 반응성을 보이므로, 따라서 CEACAM5에 대한 특이성이 결여된다. 그러나, 항-CEACAM5 항체의 특이성은 이것이 인간 CEACAM5-발현 종양 세포에 결합하지만 다른 CEACAM 패밀리 구성원을 발현하는 일정 정상 조직에는 결합하지 않게 되므로, CEA-표적화 요법에 바람직하다. CEACAM1, CEACAM6 및 CEACAM8은 인간 및 비-인간 영장류의 호중구에 의해 발현되는 것으로 기술된 바는 주목할만한데 (Ebrahimmnejad et al, 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao et al, 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), 거기서 그들이 과립구조혈을 조절하고 면역 반응에서 역할을 하는 것으로 확인되었다. 치료 목적을 위해서, 따라서 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7, 또는 CEACAM8과 항-CEACAM5 항체의 교차 반응성은 정상 조직에서 증가된 독성으로 인해서 화합물의 치료 지수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체 약물 접합체 (ADC)의 일부로서 사용하거나 또는 표적 세포의 사멸을 일으키는 임의의 다른 방식으로 사용을 위해서, CEACAM 패밀리의 다른 분자와 교차 반응하지 않는 CEACAM5에 대해 특이적으로 유도된 항체에 대한 요구가 존재한다.
게다가, CEACAM5는 일부 정상 세포 조직에서 발현되는 것으로 기술되어 있으므로, 인간 CEACAM5를 비롯하여 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) CEACAM5에 결합할 수 있는 항-CEACAM5 항체를 개발하는 것이 바람직하고, 이러한 항체는 그들 안전성 프로파일을 평가하기 위해 사이노몰거스 원숭이에서 전임상 독성학 연구로 쉽게 시험될 수 있다.
a) 종 교차 반응성과, b) 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5에 대한 특이성, 즉, 다른 마카카 파시쿨라리스 및 인간 CEACAM 패밀리 구성원과의 교차 반응성 없음에 대한 요구의 조합은 특히 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM 단백질 간 전체 서열 상동성 관점에서, 신규한 항-CEACAM5 항체의 개발에 추가의 복잡성 정도를 추가한다.
또한, CEACAM5는 문헌에서 불량하게 내재화되는 표면 단백질로서 기술되어 있어서 (참고: Schmidt et al, 2008, Cancer Immunol. Immunother. 57, 1879), 이러한 표적 단백질에 대한 항체 약물 접합체에 대한 추가 도전을 제시한다.
기지의 항-CEACAM5 항체는 Immunomedics의 라베투주맙 (hMN14로도 알려짐; Sharkey et al, 1995, Cancer Research 55, 5935)을 포함한다. 이러한 항체는 관련 항원에 결합하지 않는 것으로 확인되었지만, 또한 마카카 파시쿨라리스 유래 CEACAM5와 교차-반응하지도 않는다. 라베투주맙은 또한 항체-약물 접합체 (ADC)의 일부로서, 즉 라베투주맙 고비테칸으로서 사용되었다. 라베투주맙 고비테칸은 pH-민감성 카보네이트 및 짧은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬을 포함하는 링커 (CL2A라고 함)를 통해서 항-CEACAM5 항체 라베투주맙에 접합된 세포독성 약물 SN38로 구성된 ADC이다. 라베투주맙 고비테칸은 사용된 링커 구조의 상당한 불안정성을 특징으로 하여서, 그 결과로 비경구적 적용 이후 세포독성 페이로드의 조기 전신 손실을 야기한다. 이러한 분해 과정은 항종양 활성을 제한할 수 있고 부작용 위험을 증가시킨다. 다른 기지의 항-CEACAM5 ADC는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 부티레이트 (SPDB) 링커를 통해서, 세포독성제 DM4의, 강력한 마이크로튜불-탈안정화 마이탄시노이드에 공유적으로 연결된 항-CEACAM5 항체 SAR408377 (투사미타맙; huMab2-3이라고도 함)을 포함하는 Sanofi의 SAR408701 (투사미타맙 라브탄신)이다. SAR408701은 눈의 각막을 포함한 몇몇 장기 및 조직에 대한 독성 부작용 (각막염 및 각막병증 포함)과 연관된다. 또한, 마이크로튜불 억제제-기반 ADC의 유효성은 일정 암 적응증 예컨대 직결장암에서 제한적일 수 있다. 현재까지, 항-CEACAM5 항체 또는 ADC는 임상에서 임의의 치료적 용도에 대해 승인받지 못하였고, 일반적으로, 고형 종양의 치료에 대해 승인된 ADC는 거의 없다. 암, 예를 들어, CRC, 췌장암, 위암, NSCLC, 식도암 및 전립선암을 포함한, 예를 들어 상이한 고형 종양 적응증의 치료를 위한 신규하고 개선된 치료제에 대한 요구가 여전히 남아있다.
본 발명은 그 중에서도 CEACAM5에 대해 유도된 단일클론 항체 (인간 및 마카카 파시쿨라리스 단백질 둘 모두와 반응성)를 제공하고, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 (또한 본 명세서에서 항체-약물 접합체 (ADC)라고 함)를 제공하여서 당분야의 이러한 요구 및 다른 요구를 해결하며; 이들 면역접합체는 시험관내에서 종양 세포를 사멸시키고 생체내에서 종양 성장을 억제하는, 세포독성 효과를 갖는다. 본 발명은 청구항을 비롯하여 하기 본 명세서의 추가 설명에서 기술되는 구현예에 관한 것이다.
치료 목적을 위해 최적 특징을 갖는 CEACAM5에 대한 신규 항체를, 특히 면역접합체의 형태로, 생산하기 위해서, 본 발명자는 유리한 프로파일을 갖는 항체를 선택하고 그것을 기반으로 면역접합체를 개발하기 위한, 광범위한 연구 및 개발을 수행하였다.
본 발명자는 기대치 않게 몇몇 원하는 특성을 포함하는 최적화된 IgG를 선택하고 생산할 수 있었다. 이들 항체는 높은 친화성으로 인간 CEACAM5의 A2-B2 도메인에 결합하고 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8 단백질을 인식하지 않는다. 세포 환경에서, 이들 항체는 CEACAM5-발현 종양 세포에 대해 높은 친화성을 나타내고 내재화된다. 게다가, 이들 항체는 또한 서로의 10배 이내에서, 각각 원숭이 및 인간 단백질에 대한 친화성으로 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질에 결합한다. 본 발명의 항체는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5의 A2-B2 도메인에 결합하지만, 다른 마카카 파시쿨라리스 CEACAM 단백질, CEACAM6은 인식하지 못한다.
본 발명자는 또한 그들이 생산한 항체가 면역접합체에서 세포독성 약물과 조합될 때 시험관내에서 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다. 세포독성 약물에 접합된 항체 (즉, 본 발명의 면역접합체)는 또한 CEACAM5-발현 종양을 보유하는 마우스에서 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있다. 약물 및 항체를 연결하는 링커는 비경구적 적용 이후에 전신 안정성을 최대화하도록 디자인된다. 표적 세포 내에서 본 발명의 면역접합체로부터 엑사테칸의 방출은 매우 높은 역가 및 뛰어난 방관자 효과를 야기한다. 강력한 방관자 효과는 이종성 표적 발현을 갖는 환자의 치료에 유리할 수 있다.
도 1: ELISA 어세이에서 재조합 인간 (rh) CEACAM5 ECD 또는 이의 도메인 N-A1-B1, A2-B2, A3-B3 또는 재조합 마카마 파시쿨라리스 (mf) CEACAM5 ECD에 대한 mAb1의 결합.
도 2: MKN-45 세포에 대한 항 CEACAM5 항체 결합의 EC50: CEACAM5를 발현하는 MKN45 세포주 상에서 항체 huMab2-3 및 hmn-14와 비교된 mAb1의 세포 결합.
도 3: 세포의 후기 엔도솜 및 리소솜으로 pHrodo 표지된 항체의 내재화 (세포 당 형광 강도 합계, 3회 평균).
도 4: 곡선의 선형 부분인, 700 분 내지 1200 분에서 세포 당 형광 강도. 선형 기울기를 측정하고 샘플 간에 비교하였다 (실시예 1.6.5 참조).
도 5: FFPE 암 세포주에서 항체 rb8G4로 IHC 염색.
도 6: CEACAM5 mRNA 발현 및 104개 암 세포주에 대한 IHC 염색의 상관관계.
도 7: 정상 인간 조직에서 항체 rb8G4로 IHC 염색.
도 8: 정상 인간 조직에서 CEACAM5 mRNA 발현.
도 9: 인간 직결장 암 조직에서 항체 rb8G4로 IHC 염색.
도 10: 인간 위암 조직에서 항체 rb8G4로 IHC 염색.
도 11: 인간 식도암 조직에서 항체 rb8G4로 IHC 염색.
도 12: 인간 비-소세포 폐암 조직에서 항체 rb8G4로 IHC 염색.
도 13: 웨스턴 블롯으로 조사된 암 세포주 용해물 중 CEACAM5에 대한 mAb1 (도 13A) 및 rb8G4 (도 13B)의 결합.
도 14: 원액 mAb, UF 후 접합체 및 최종 BDS의 순도를 보여주는 전형적인 SEC 크로마토그램.
도 15: 경쇄 및 중쇄의 분리를 보여주는 전형적인 RP-HPLC 크로마토그램. 크로마토그램은 원액 mAb, 미정제 ADC 및 최종 BDS의 오버레이를 도시한다.
도 16: NAC 표준 및 최종 BDS의 자유-약물 수준을 보여주는 전형적인 크로마토그램.
도 17: 원액 mAb 및 최종 BDS의 순도를 보여주는 전형적인 SEC 크로마토그램.
도 18: 경쇄 및 중쇄의 분리를 보여주는 전형적인 RP-HPLC 크로마토그램. 크로마토그램은 원액 mAb 및 최종 BDS의 오버레이를 도시한다.
도 19: NAC 표준 및 최종 BDS의 자유-약물 수준을 보여주는 전형적인 크로마토그램.
도 20: 인간, 마우스 및 사이노몰거스 혈청에 대한 ADC 안정성. 접합된 엑사테칸 농도는 자유 엑사테칸을 사용해 계산되었다 (초기 용량 ∼10 μM)(정규화된 데이터).
도 21: 마우스 혈청 및 완충액에 대한 ADC3 대조군 안정성. 접합된 SN38 농도는 자유 SN38을 사용해 계산되었다 (초기 용량 50 μg/mL ADC 단백질 농도) (비정규화됨).
도 22: 인간 간 리소솜 (pH 5.0)에서 ADC1 및 ADC2에 대한 페이로드 유리 프로파일. 접합된 약물 농도는 예를 들어, 자유 엑사테칸을 사용해 계산되었다 (초기 농도 ∼10 μM 엑사테칸), 정규화된 데이터.
도 23: ADC 이화산물 프로파일링은 자유 엑사테칸을 리소솜 방출 생산물로서 확인한다.
도 24: 항원-음성 MDA-MB-231 (도 24C) 세포주와 비교된 항원-양성 SK-CO-1 (도 24A) 및 SNU-16 (도 24B) 세포주에 대한 ADC1, ADC2 및 자유 페이로드의 시험관내 역가. 1회 대표적인 실험이, 3회 평균 ±SD로 표시된다. 도 23C에 도시된 바와 같이, 각각 ADC1, ADC2 및 페이로드에 대한 3개의 상이한 일련의 데이터 지점을 지정한 범례가 도 24A 및 도 24B에도 적용된다.
도 25: SK-CO-1 세포주에서 각각의 이소타입 대조군과 ADC1 및 ADC2의 비교. 1회 대표적인 실험이, 3회 평균 ±SD로 표시된다.
도 26: 항원-음성 MDA-MB-231 (도 26B) 세포주와 비교된 항원-양성 SK-CO-1 (도 26A)에 대한 ADC1, ADC2, ADC SAR DM4, ADC mAb1 DM4 및 자유 페이로드의 시험관내 역가. 1회 대표적인 실험이, 3회 평균 ±SD로 표시되고, 도 26B에 도시된 범례가 도 26A에도 적용된다.
도 27: 항원-양성 SK-CO-1 세포와 공-배양된 항원-음성 MDA-MB-231 세포에 대한 ADC1 및 ADC2의 강력한 방관자 효과 (도 27A). MDA-MB-231 세포 단독에 대한 ADC1 또는 ADC2의 비특이적 효과는 없다 (도 27B). 1회 대표적 실험이, 2회 평균 ±SD로 표시된다.
도 28: 항원-양성 SK-CO-1 세포와 공-배양되는 항원-음성 MDA-MB-231 세포에 대한 ADC1 및 ADC2의 방관자 효과는 ADC SAR DM4에 대한 것보다 더 강력하다 (도 28A 및 도 28B). MDA-MB-231 세포 단독에 대해 시험된 ADC의 비-특이적 효과는 없다 (도 28C). 1회 대표적 실험이, 2회 평균 ±SD로 표시된다.
도 29: 단일 치료 후 CRC PDX 모델 (COPF217)에서 ADC 및 ADC2의 효능.
도 30: 단일 치료 후 NSCLC PDX 모델 (LUPF160151)에서 ADC1의 효능.
도 31: 단일 치료 후 위암 PDX 모델 (GAX066)에서 ADC1의 효능.
도 32: 췌장 이종이식 모델 (HPAF-II)에서 ADC3과 비교된 ADC1의 효능.
도 33: CRC PDX 모델 (COPF230)에서 ADC SAR DM4와 비교된 ADC1의 효능
도 34: CRC PDX 모델 (REPF210)에서 ADC SAR DM4와 비교된 ADC1의 효능
도 35: 위 PDX 모델, GAPF313에서 ADC SAR DM4와 비교된 ADC1의 효능 (진행 중인 실험의 중간 분석)
정의
본 명세서에서 사용되는 "CEACAM5"는 "CD66e" (Cluster of Differentiation 66e) 또는 CEA로도 알려진, "암-배아 항원-관련된 세포 부착 분자 5"를 표시한다. CEACAM5는 세포 부착에 관여하는 당단백질이다. CEACAM5는 예를 들어, 직결장암, 위암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 식도암, 전립선암 및 다른 고형 종양의 표면에서 특히 고도로 발현된다. 신호 펩티드 (위치 1-34) 및 프로펩티드 (위치 686-702)를 포함하는, 전체 길이 인간 CEACAM5의 기준 서열은 등록번호 AAA51967.1 하에 GenBank 데이터베이스에서 입수가능하고; 이 아미노산 서열은 다음과 같이 판독된다:
Figure pct00001
5개 비-동의 SNP가 백인 집단에서 2% 보다 높은 빈도로 확인되었고, 그들 중 4개는 인간 CEACAM5의 N 도메인 (위치 80, 83, 112, 113)에, 나머지 하나는 A2 도메인 (위치 398)에 위치된다. GenBank AAA51967.1은 주요 반수체형 (I80, V83, I112, I113 및 E398)을 함유한다.
"도메인" 또는 "영역"은 일반적으로 서열 상동성을 기반으로 한정되고 종종 특별한 구조적 또는 기능적 실체와 관련된, 단백질의 임의 영역일 수 있다. CEACAM 패밀리 구성원은 Ig-유사 도메인으로 구성된 것으로 알려져 있다. 용어 도메인은 이 문서에서 개별 Ig-유사 도메인, 예컨대 "N-도메인" 또는 연속 도메인의 그룹, 예컨대 "A2-B2 도메인"을 표시하는데 사용된다.
인간 CEACAM5의 도메인 구성은 다음과 같다 (GenBank AAA51967.1 서열 기반; SEQ ID NO: 1):
Figure pct00002
따라서, 인간 CEACAM5의 A2-B2 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 321-498로 이루어진다.
마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질의 기준 서열은 입수가능하고 (NCBI 기준 서열 XP_005589491.1), 이 아미노산 서열은 다음과 같이 판독된다:
Figure pct00003
(신호 펩티드는 이탤릭체; A2-B2 도메인은 굵은체; GPI 앵커는 밑줄표시됨; 신호 펩티드 및 A2-B2 도메인 사이에 일반 글꼴의 N-A1-B1 도메인; A2-B2 도메인 및 GPI 앵커 사이에 일반 글꼴의 A3-B3 도메인).
"코딩 서열" 또는 발현 생산물, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소를 "코딩하는" 서열은 발현될 때 그 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소의 생산을 일으키는 뉴클레오티드 서열이고, 즉, 뉴클레오티드 서열은 그 폴리펩티드, 단백질 또는 효소에 대한 아미노산 서열을 코딩한다. 단백질에 대한 코딩 서열은 출발 코돈 (일반적으로 ATG) 및 중지 코돈을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 특이적 단백질 (예를 들어, 항체)에 대한 언급은 천연 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 비롯하여, 그들 기원 또는 제조 방식과 무관하게 변이체 및 변형된 형태를 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열을 갖는 단백질은 자연으로부터 수득되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 이러한 천연 서열 단백질은 자연으로부터 단리될 수 있거나 또는 표준 재조합 및/또는 합성 방법을 사용해 제조될 수 있다. 천연 서열 단백질은 특히 천연 발생 절두형 또는 가용성 형태, 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 선택적 스플라이싱 형태), 천연 발생 대립유전자 변이체 및 번역후 변형을 포함하는 형태를 포괄한다. 천연 서열 단백질은 일부 아미노산 잔기의 번역후 변형 예컨대 글리코실화, 또는 인산화, 또는 다른 변형을 보유하는 단백질을 포함한다.
용어 "유전자"는 하나 이상의 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 코딩하거나, 또는 그에 상응하고, 예를 들어, 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 조건적 DNA 서열, 예컨대 프로모터 서열을 포함할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 DNA 서열을 의미할 수 있다. 구조적 유전자가 아닌, 일부 유전자는 DNA를 RNA로 전사시킬 수 있지만, 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 다른 유전자는 구조적 유전자의 조절인자로서 또는 DNA 전사의 조절인자로서 기능할 수 있다. 특히, 용어 유전자는 단백질을 코딩하는 게놈 서열, 즉 조절인자, 프로모터, 인트론, 및 엑손 서열을 포함하는 서열을 의도할 수 있다.
본 명세서에서 기준 서열과 "적어도 85% 동일한" 서열은 이의 전체 길이 상에서, 85% 이상, 예를 들어, 기준 서열의 전체 길이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열이다. 따라서, "서열 동일성"은 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. 48:443 (1970))을 사용하여, 예를 들어, 프로그램 Needle (EMBOSS)과 BLOSUM62 매트릭스 및 하기 매개변수를 사용하여, 전체 쌍별 정렬을 통해 그들 전체 길이 상에서 이러한 2개 서열을 비교하여 결정될 수 있다: 갭 개방=10, 갭 연장=0.5, 말단 갭 패널티=거짓, 말단 갭 개방=10, 말단 갭 확장=0.5 (모두 표준 설정임).
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하, 크기, 또는 소수성)을 갖는 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 보존성 아미노산 치환 기는 또한 아미노산 크기를 기반으로 정의될 수 있다.
"항체" ("면역글로불린"이라고도 함)는 예를 들어, 2개 중쇄가 서로 디술피드 결합에 의해 연결되고 각각의 중쇄는 디술피드 결합에 의해 경쇄에 연결되는 것인 항체의 천연 또는 통상적인 유형일 수 있다. 2개 유형의 경쇄, 람다 (I) 및 카파 (k)가 존재한다. 항체 분자의 기능적 활성의 측면을 결정하는 하기의 5개의 주요 중쇄 클래스 (또는 이소타입)가 존재한다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 항체 사슬은 별개의 서열 도메인 (또는 영역)을 함유한다. 전형적인 IgG 항체의 경쇄는 2개 영역, 가변 영역 (VL) 및 불변 영역 (CL)을 포함한다. 전형적인 IgG 항체의 중쇄는 4개 영역, 즉 가변 영역 (VH) 및 불변 영역 (CH)을 포함하고, 후자는 3개 불변 도메인 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원에 대한 결합 및 특이성을 결정한다. 경쇄 및 중쇄의 불변 영역은 중요한 생물학적 성질, 예컨대 항체 사슬 회합, 분비, 경-태반 이동성, 보체 결합, 및 Fc 수용체 (FcR)와의 결합을 부여할 수 있다. Fv 단편은 항체의 Fab 단편의 N-말단 부분이고, 1개 경쇄 및 1개 중쇄의 가변 부분으로 이루어진다.
항체의 특이성은 항체 결합 부위 및 항원성 결정자 간 구조적 상보성에 존재한다. 항체 결합 부위는 주로 소위 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기로 구성된다. 그러므로, 상보성 결정 영역 (CDR)은 항체의 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 의미한다. 항체의 경 (L)쇄 및 중 (H)쇄는 각각이 개별적으로 CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L 및 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H로 표시되는 3개 CDR을 갖는다. 그러므로, 통상의 항체의 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 각각으로부터 CDR 세트를 포함하는, 6개 CDR을 포함한다.
"프레임워크 영역" (FR)은 CDR 사이에 개재된 아미노산 서열, 즉 동일한 종에서 상이한 면역글로불린 간에 상대적으로 보존된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 일부를 의미한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각이 개별적으로 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 및 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 표시되는, 4개 FR을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는, "인간 프레임워크 영역"은 천연 발생 인간 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 동일한 (약 85% 이상, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 프레임워크 영역이다.
본 발명의 상황에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 CDR/FR 정의는 IMGT 정의를 기반으로 결정된다 (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1 ):55-77; www.imgt.org).
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 통상의 항체 및 이의 단편을 비롯하여, 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 예컨대 단일 도메인 항체의 가변 중쇄를 포함하고; 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 키메라, 인간화, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 비롯하여, 다른 유형의 조작된 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 단일클론 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 특별한 항원에 대해 유도된, 단일 아미노산 서열의 항체를 의미하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단일클론 항체는 예를 들어, B 세포 또는 하이브리도마의 단일 클론에 의해 생산될 수 있지만, 또한 예를 들어 유전자 또는 단백질 조작을 포함한 방법을 통해서 생산되는 재조합체일 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 이의 가장 넓은 의미에서, 한 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 조작된 항체를 의미한다. 일 구현예에서, 키메라 항체는 인간 항체인 다른 항체의 CH 및 CL과 회합된, 비-인간 동물로부터 유래하는 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 비-인간 동물로서, 임의 동물 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등이 사용될 수 있다. 키메라 항체는 또한 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 항체를 의미할 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 인간에서 면역 반응을 피하거나 또는 최소화하기 위해서, 예를 들어, VH 및 VL의 프레임워크 영역에서, 일정 아미노산을 치환시키도록 변형되었고 전체적으로 또는 부분적으로 비-인간 기원인 항체를 의미한다. 인간화 항체의 불변 영역은 전형적으로 인간 CH 및 CL 영역이다.
(예를 들어, 통상적인 항체의) 항체의 "단편"은 온전한 항체 예컨대 IgG의 일부, 특히 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디를 비롯하여, 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 및 다중특이적 항체를 포함한다. 통상적인 항체의 단편은 또한 단일 도메인 항체, 예컨대 중쇄 항체 또는 VHH일 수 있다.
용어 "Fab"는 약 50,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미하는데, 중쇄의 N-말단 측면의 약 절반 및 전체 경쇄가 함께 디술피드 결합을 통해서 결합된다. 일반적으로, 프로테아제, 파파인으로 IgG를 처리하여 단편들 중에서 획득된다.
용어 "F(ab')2"는 힌지 영역의 디술피드 결합을 통해서 결합된 2개의 동일한 Fab 단편보다 약간 더 큰, 약 100,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로 프로테아제, 펩신으로 IgG를 처리하여 단편들 중에서 수득된다.
용어 "Fab' "은 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단하여 수득되는, 약 50,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미한다.
단쇄 Fv ("scFv")는 일반적으로 펩티드-코딩 링커를 통해서 연결된 VH 및 VL 코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현되는 공유적으로 연결된 VH::VL 이종이량체이다. 본 발명의 인간 scFv 단편은 예를 들어 유전자 재조합 기술을 사용하여, 적절한 입체구성으로 유지되는 CDR을 포함한다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv의 회합을 통해서 자발적으로 형성될 수 있거나, 또는 펩티드 링커를 통해서 1가 scFv를 커플링하여 생성될 수 있고, 예컨대 2가 sc(Fv)2일 수 있다. "dsFv"는 디술피드 결합을 통해서 안정화된 VH::VL 이종이량체이다. "(dsFv)2"는 펩티드 링커를 통해서 커플링된 2개 dsFv를 의미한다.
용어 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 의미한다. 따라서, BsAb는 예를 들어 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다. 유전자 조작은 예를 들어, EP 2 050 764 A1에 기술된 바와 같이 이펙터 기능 및 결합 성질의 바람직한 세트를 갖는 항체 또는 항체 유도체를 디자인하고, 변형, 및 생산하기 위해서 증가된 빈도로 사용되어 왔다.
용어 "다중특이적 항체"는 둘 이상의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 의미한다.
용어 "디아바디"는 2개 항원 결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 의미하고, 이러한 단편은 동일한 펩티드 사슬 (VH-VL)로 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 사슬의 2개 도메인 간에 쌍형성을 허용할 수 없는 링커를 사용하여, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되어서 2개의 항원-결합 부위를 생성한다.
용어 "하이브리도마"는 항원으로 비-인간 포유동물을 면역화하여 제조된 B 세포에 대해서 항원 특이성을 갖는 바람직한 단일클론 항체를 생산하는 마우스 등으로부터 유래된 골수종 세포와 세포 융합을 수행하여 수득된, 세포를 의미한다.
폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, "정제된" 또는 "단리된"이란, 표시된 분자가 동일 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에서 존재하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "정제된"은 동일 유형의 생물학적 거대분자의, 중량 기준으로, 적어도 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 또는 98%가 존재하는 것을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 대상체 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 의미하지만, 분자는 조성물의 기본 특징에 유해하게 영향을 미치지 않는 일부 추가적인 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "대상체"는 포유동물, 예컨대 설치류, 고양잇과, 갯과, 영장류 또는 인간을 의미한다. 본 발명의 구현예에서, 대상체 (또는 환자)는 인간이다.
본 발명의 항체
본 발명자는 특히 면역접합체 (항체-약물 접합체)의 일부로서, 암 요법에서 사용을 위해 그들을 이상적으로 만드는 몇몇 특징의 조합을 놀랍게도 나타내는, 특이적 항-CEACAM5 항체를 생성, 스크리닝 및 선택하는데 성공하였다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질에 대해 높은 친화성을 나타내고, 그들은 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8 단백질, 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM6 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는다. 본 발명자는 본 발명에 따른 이러한 단일클론 항체의 아미노산 서열을 결정하였다.
본 발명자는 인간 CEACAM5 단백질에 결합하고, 아미노산 서열 DGSVSRGGYY (SEQ ID NO: 3)로 이루어지는 CDR1-H, 아미노산 서열 IYYSGST (SEQ ID NO: 4)로 이루어지는 CDR2-H, 아미노산 서열 ARGIAVAPFDY (SEQ ID NO: 5)로 이루어지는 CDR3-H, 아미노산 서열 QSVRSN (SEQ ID NO: 6)로 이루어지는 CDR1-L, 아미노산 서열 AAS (SEQ ID NO: 7)로 이루어지는 CDR2-L, 및 아미노산 서열 QQYTNWPFT (SEQ ID NO: 8)로 이루어지는 CDR3-L을 포함하는, 단리된 항체를 제공한다. 이러한 항체는 또한 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질에 결합할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 상기 언급된 6개 CDR 서열을 갖는 항체는 아미노산 서열
Figure pct00004
(CDR을 굵은체로 표시됨)과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 아미노산 서열
Figure pct00005
(CDR은 굵은체로 표시됨)과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 상기 언급된 6개 CDR 서열을 갖는 항체는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 항체는 아미노산 서열
Figure pct00006
과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH) 및 아미노산 서열
Figure pct00007
과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역 (CL)을 더 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH) 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다.
더 특별한 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 CEACAM5 단백질에 결합하고, 아미노산 서열
Figure pct00008
과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 아미노산 서열
Figure pct00009
과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함하는 단리된 항체이다. 본 발명의 보다 더 특별한 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함한다. 본 발명의 보다 더 특별한 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 동일한 중쇄 (HC) 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 동일한 경쇄 (LC)로 이루어진다.
일부 구현예, 본 발명의 항체의 하나 이상의 개별 아미노산은 CDR 서열을 포함하여, 상기 언급된 서열 중 하나 이상에서, 치환, 특히 보존성 치환에 의해 변경될 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 항체의 인간화와 관련하여, 예를 들어 글리코실화 부위 또는 탈아미드화 부위를 제거하고자 의도될 수 있다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 인간 CEACAM5 단백질에 결합하고, SEQ ID NO: 13의 아미노산으로 이루어진 2개의 동일한 중쇄 (HC) 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열로 이루어진 2개의 동일한 경쇄 (LC)로 이루어진 단리된 항체이고; 이러한 특정 항체는 또한 본 명세서에서 "mAb1"이라고 한다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5의 A2-B2 도메인에 결합된다. 본 발명은 또한 인간 및/또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질의 A2-B2 도메인과의 결합에 대해서 mAb1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (즉, 각각 SEQ ID NO: 9 및 10에 상응하는 VH 및 VL)을 포함하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.
mAb1의 VH 및 VL을 포함하는 항체 (이하, 후보 항체와 경쟁 상황에서, "기준" 항체라고 함)와 인간 및/또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질의 A2-B2 도메인과의 결합에 대해 경쟁하는 후보 항체의 능력은 예를 들어, 항원 (즉, 인간 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5의 A2-B2 도메인, 또는 A2-B2 도메인을 포함하는 인간 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5의 단편, 특히 인간 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5의 세포외 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 폴리펩티드)이 고형 지지체에 결합되고, 각각 후보 항체 및 기준 항체를 함유하는 2개 용액을 첨가하고 나서, 항체가 항원과의 결합에 대해 경쟁하도록 허용하는 경쟁적 ELISA를 통해서 쉽게 어세이될 수 있다. 항원에 결합된 기준 항체의 양을 이후 측정할 수 있고, 음성 대조군 (예를 들어, 항체를 함유하지 않는 용액)에 대해서 측정되었을 때 항원에 결합하는 기준 항체의 양과 비교할 수 있다. 후보 항체의 존재 하에서 결합된 기준 항체의 양이 음성 대조군의 존재 하에서 결합된 기준 항체의 양과 비교하여 감소된 것은 후보 항체가 기준 항체와 경쟁하였다는 것을 의미한다. 편리하게, 기준 항체는 결합된 기준 항체의 검출을 용이하게 하기 위해서 (예를 들어, 형광으로) 표지될 수 있다. 후보 및/또는 기준 항체의 연속 희석물을 사용해 반복 측정을 수행할 수 있다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 인간 CEACAM1, 인간 CEACAM6, 인간 CEACAM7, 인간 CEACAM8 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM6 단백질에 결합하지 않거나, 또는 유의하게 교차-반응하지 않는다. 일부 구현예, 항체는 CEACAM5 이외의 상기 언급된 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM 단백질의 세포외 도메인에 결합하지 않거나, 또는 유의하게 교차-반응하지 않는다.
"친화성"은 이론적으로 전체 항체 및 항원 간 평형 회합으로 정의된다. 이것은 예컨대 표면 플라스몬 공명으로 회합 및 해리를 측정하거나 또는 면역화학 어세이 (ELISA, FACS)에서 EC50　(또는 겉보기 KD)을 측정하는, 다양한 기지 방법을 통해서 실험적으로 평가될 수 있다. 이들 어세이에서, EC50　은 ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay)에 의해 정해진 농도의 항원에 대한 일부 명시된 노출 시간 후 최대 및 기준점 간 중간 반응을 유도하는 항체 또는 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)에 의해 항체를 발현하는 세포의 농도이다.
항원 1 (Ag1)에 결합하는 단일클론 항체는 EC50 이 양쪽 항원에 대해 유사한 범위에 있을 때 항원 2 (Ag2)와 "교차-반응성"이다. 본 출원에서, Ag1에 결합하는 단일클론 항체는 Ag2에 대한 이의 친화성이 Ag1의 이의 친화성으로부터 10배 이하 이내 (예를 들어, 5배 이내)일 때 Ag2와 교차-반응성이고, 친화성은 양쪽 항원에 대해 동일한 방법으로 측정된다.
친화성이 2개 항원에 대해 매우 상이할 때 Ag1에 결합하는 단일클론 항체는 "Ag2와 "유의하게 교차-반응성이 아니다". Ag2에 대한 친화성은 결합 반응이 너무 낮으면 측정가능하지 않을 수 있다. 본 출원에서, Ag1에 결합하는 단일클론 항체는 Ag2에 대한 단일클론 항체의 결합 반응이 동일한 실험 설정 및 동일한 항체 농도에서 Ag1에 대한 동일한 단일클론 항체의 결합 반응의 5% 미만일 때, Ag2에 대해 유의하게 교차-반응성이 아니다. 실제로, 사용된 항체 농도는 Ag1를 사용해 수득된 포화 평탄역에 도달하는데 요구되는 EC50　또는 농도일 수 있다. 단일클론 항체는 Ag2에 대해 유의하게 교차-반응성이 아닐때 Ag1에 "특이적으로 결합한다" (또는 "특이적이다").
일부 구현예, 본 발명에 따른 항체는 인간 CEACAM5에 대한 이의 친화성으로부터 10배 이하 이내 (예를 들어, 5배 이내)인, 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5에 대한 친화성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 원숭이에서 수행된 독성학 연구에서 사용될 수 있는데, 원숭이에서 관찰된 독성 프로파일이 인간에서 예상되는 잠재적인 부작용과 관련되기 때문이다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 인간 CEACAM5 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5, 또는 둘 모두에 대해서, ≤ 10 nM인, 친화성을 갖고; 예를 들어, 본 발명의 항체는 1 내지 10 nM인, 인간 CEACAM5에 대한 친화성, 예컨대 약 6 nM의 인간 CEACAM5에 대한 친화성을 가질 수 있다.
인간 CEACAM5 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5에 대한 친화성은 가용성 재조합 CEACAM5를 포획 항원으로 사용하는 ELISA에서 예를 들어, EC50 값으로서 결정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체 경우, 겉보기 해리 상수 (겉보기 KD)는 예를 들어, 종양 세포주 MKN45 (DSMZ, ACC 409)에 대해 FACS 분석을 통해서 결정될 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 냉동 및 포르말린-고정 및 파라핀 포매 (FFPE) 조직 절편에서, 면역조직화학을 통해서 CEACAM5 발현을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
상기 및 하기 본 명세서에 기술된 구현예의 임의 조합은 본 발명의 일부를 형성한다.
일부 구현예, 본 발명에 따른 항체는 통상의 항체, 예컨대 통상의 단일클론 항체, 또는 항체 단편, 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다.
일부 구현예, 본 발명에 따른 항체는 IgG, 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 예를 들어, 쥣과동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 항체 서열의 인간화를 위한 수많은 방법이 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 CDR 그라프팅, 또는 항체 재형성으로서, 상이한 특이성의 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드에, 도너 항체, 일반적으로 마우스 항체의 CDR 서열의 그라프팅을 포함한다. CDR 그라프팅이 CDR 그라프팅된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화성, 및 따라서 생물학적 활성을 감소시킬 수 있으므로, 부모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 유지하기 위해서 CDR 그라프팅된 항체의 선택된 위치에 역 돌연변이를 도입할 수 있다. 가능한 역 돌연변이에 대한 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 입수가능한 정보를 사용해 수행될 수 있다. 역 돌연변이에 대한 후보인 아미노산 잔기는 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치된 것인 한편, 표면 노출 정도가 낮거나 또는 매장된 잔기는 보통 변경되지 않는다. CDR 그라프팅 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기술은 재표면화로서, 비-인간 기원의 비-표면 노출 잔기는 유지하면서, 표면 잔기는 인간 잔기로 변경시킨다. 다른 대안적인 기술은 "유도 선택"으로 알려져 있으며 (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899), 쥣과동물 항체로부터 부모 항체의 에피토프 및 결합 특징을 보존하는 완전한 인간 항체를 유도시키는데 사용될 수 있다.
키메라 항체 경우, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 변형을 포함한다.
CDR의 일부인 아미노산 잔기는 전형적으로 인간화와 관련하여 변경되지 않지만, 일부 경우에 예를 들어, 글리코실화 부위, 탈아미드화 부위 또는 원치않는 시스테인 잔기를 제거하기 위해, 개별 CDR 아미노산 잔기를 변경하는 것이 바람직할 수 있다. N-연결된 글리코실화는 삼중펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr (여기서, X는 Pro를 제외한 임의 아미노산일 수 있음)의 아스파라긴 잔기에 올리고당 사슬의 부착에 의해 일어난다. N-글리코실화 부위의 제거는 예를 들어, 보존성 치환을 통해서 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 다른 잔기로 돌연변이시켜서 획득될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 예컨대 pH 및 표면 노출 같은 인자에 의존하여 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기는 서열 Asn-Gly에 주로 존재할 때, 탈아미드화에 특히 감수성이고, 다른 이중펩티드 서열, 예컨대 Asn-Ala에서는 그 정도가 덜하다. 이러한 탈아미드화 부위, 예를 들어, Asn-Gly이 CDR 서열에 존재하는 경우에, 따라서, 전형적으로 연루된 잔기 중 하나를 제거하도록 보존성 치환을 통해서 그 부위를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 연루된 잔기 중 하나를 제거하기 위해 CDR 서열 중 치환은 또한 본 발명에 포괄하고자 한다.
인간화 항체 또는 이의 단편에서, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 인간 억셉터 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 존재하는 경우에, 인간 불변 중쇄 및 경쇄 도메인을 더 포함할 수 있다.
일부 구현예, 본 발명에 따른 항체는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편 (예를 들어, 인간화 항체 단편)일 수 있다.
일부 구현예, 본 발명에 따른 항체는 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있고, 적어도 하나의 항체 단편은 본 발명에 따른 항체의 단편이다. 다중특이적 항체는 예를 들어, EP 2 050 764 A1 또는 US 2005/0003403 A1에 기술된 바와 같은 다가 단백질 복합체이다.
본 발명에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 (a) 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질 및 (b) 적어도 하나의 다른 항원에 대해 특이성을 가질 수 있다. 일부 구현예, 적어도 하나의 다른 항원은 인간 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM 패밀리 구성원이 아니다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 다른 항원은 mAb1에 의해 표적화되는 에피토프 이외의 인간 또는 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 상의 에피토프일 수 있다.
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 임의 기술을 통해서 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 단리된 (예를 들어, 정제된) 형태로 사용될 수 있거나, 또는 벡터, 예컨대 막 또는 지질 소포체 (예를 들어, 리포솜)에 함유될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 숙주 세포
본 발명의 추가 양태는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산에 관한 것이다.
전형적으로, 상기 핵산은 임의의 적합한 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있는, DNA 또는 RNA 분자이다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시켜서 도입된 서열의 발현 (예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진하도록, DNA 또는 RNA 서열 (예를 들어, 외래 유전자)을 숙주에 도입시킬 수 있는 비히클을 의미한다.
따라서, 본 발명의 추가 양태는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
이러한 벡터는 대상체에게 투여 시 상기 폴리펩티드의 발현을 초래하거나 또는 유도하기 위해, 조절 구성요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결자 등을 포함할 수 있다. 동물 세포에 대한 발현 벡터에서 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서 (Mizukami T. et al. 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서 (Kuwana Y et al. 1987), 면역글로불린 H 사슬의 프로모터 (Mason JO et al. 1985) 및 인핸서 (Gillies SD et al. 1983) 등을 포함한다.
동물 세포를 위한 임의의 발현 벡터는 인간 항체 C 영역을 코딩하는 유전자를 삽입시키고 발현할 수 있으면, 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981 ), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등을 포함한다.
플라스미드의 다른 예는 복제 기원을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예컨대, 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등을 포함한다.
바이러스 벡터의 다른 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 예컨대 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스로 일시적 형질감염에 의해서 또는 패키징 세포를 형질감염시켜서, 당분야에 공지된 기술을 통해서 생산될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 이러한 복제-결합성 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어, WO 95/14785, WO 96/22378, US 제5,882,877호, US 제6,013,516호, US 제4,861,719호, 제US 5,278,056호 및 WO 94/19478에서 확인할 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염, 또는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
용어 "형질전환"은 숙주 세포가 원하는 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생산하도록 도입된 유전자 또는 서열을 발현하도록, 숙주 세포에 "외래" (즉, 외부) 유전자, DNA 또는 RNA 서열의 도입을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아서 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"된 것이다.
본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 위해 적합한 조건 하에 있는 숙주 세포 및 상용성 벡터를 의미한다.
일반 발현 시스템은 이. 콜라이 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 배큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는 제한없이, 원핵생물 세포 (예컨대, 박테리아) 및 진핵생물 세포 (예컨대, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함한다. 특별한 예는 이. 콜라이 (E. coli), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주 (예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등)를 비롯하여 초대 또는 확립된 포유동물 세포 배양물 (예를 들어, 림프아세포, 섬유아세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등)을 포함한다. 예는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포 (ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 (이하 "DHFR 유전자")가 결함성인 CHO 세포 (Urlaub G et al; 1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 (ATCC CRL1662, 이하 "YB2/0 세포"라고 함) 등을 포함한다. 일부 구현예, YB2/0 세포가 사용되는데, 키메라 또는 인간화 항체의 ADCC 활성이 이러한 세포에서 발현될 때 증강되기 때문이다.
인간화 항체의 발현을 위해서, 발현 벡터는 항체 중쇄를 코딩하는 유전자 및 항체 경쇄를 코딩하는 유전자가 별개 벡터에 존재하는 유형일 수 있거나 또는 이들 양쪽 유전자가 동일한 벡터에 존재하는 유형 (직렬 유형)일 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포로 도입의 용이성, 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준 간 균형과 관련하여, 인간화 항체 발현 벡터는 직렬 유형의 것이다 (Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan. 3;167(1-2):271-8). 직렬 유형 인간화 항체 발현 벡터의 예는 pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (i) 적격한 숙주 세포에 상기 기술된 바와 같은 재조합 핵산 또는 벡터를 시험관내 또는 생체외에서 도입시키는 단계, (ii) 수득된 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양시키는 단계, 및 (iii) 임의로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하는 단계로 이루어진 단계를 포함한다.
이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체의 생산을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 항체를 제조하는 방법
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 임의 기술, 예컨대, 제한없이, 임의의 화학적, 생물학적, 유전학적 또는 효소적 기술을, 단독으로 또는 조합하여 생산될 수 있다.
원하는 항체의 아미노산 서열이 공지되어 있으면, 당업자는 폴리펩티드의 생산을 위한 표준 기술을 사용하여 상기 항체 또는 면역글로불린을 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 펩티드 합성 장치 (예컨대, Applied Biosystems (Foster City, California)에서 제조)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라서 충분히 공지된 고체상 방법을 사용해 합성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 면역글로불린 사슬은 당분야에 충분히 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 통해서 생산될 수 있다. 예를 들어, 이들 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)는 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 발현 벡터로의 도입 및 원하는 폴리펩티드를 발현하게 되는 적합한 진핵생물 또는 원핵생물 숙주로 이러한 벡터의 도입 이후에 DNA 발현 생산물로서 수득될 수 있고, 이후에 그들은 충분히 공지된 기술을 사용해 단리될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 항체 mAb1를 코딩하는 하기 DNA 서열을 제공한다:
mAb1 중쇄 뉴클레오티드 서열
여기서, mVk 신호 펩티드는 밑줄 표시되고,
출발 및 중지 코돈은 이탤릭체이고,
VH 영역 서열은 굵은체이고,
CDR은 이중 밑줄 표시된다:
Figure pct00010
Figure pct00011
mAb1 경쇄 뉴클레오티드 서열
여기서, uPA 신호 펩티드는 밑줄 표시되고,
출발 및 중지 코돈은 이탤릭체이고,
VL 영역 서열은 굵은체이고,
CDR은 이중 밑줄 표시된다:
Figure pct00012
Figure pct00013
본 발명은 또한, 본 발명의 항체를 제조하는 방법에 관한 것이고, 이러한 방법은 (i) 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; (ii) 항체를 발현시키는 단계; 및 (iii) 발현된 항체를 회수하는 단계로 이루어진 단계를 포함한다.
본 발명의 항체는 통상의 면역글로불린 정제 절차 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피를 통해서 배양 배지로부터 적합하게 분리될 수 있다.
일부 구현예, 본 발명의 인간화 키메라 항체는 이전에 기술된 바와 같은 인간화 VL 및 VH 영역을 코딩하는 핵산 서열을 수득하는 단계, 그들을 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포에 대한 발현 벡터에 삽입하여서 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하는 단계, 및 동물 세포에 발현 벡터를 도입시켜서 코딩 서열을 발현시키는 단계를 통해서 생산될 수 있다.
인간 키메라 항체의 CH 도메인으로서, 인간 면역글로불린 중쇄에 속하는 임의 영역, 예를 들어, IgG 클래스의 것이 적합하고 IgG 클래스에 속하는 서브클래스 중 어느 하나, 예컨대 lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4가 사용될 수 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL 로서, 인간 면역글로불린 경쇄에 속하는 임의 영역이 사용될 수 있고, 카파 클래스 또는 람다 클래스의 것이 사용될 것이다.
인간화 또는 키메라 항체를 제조하기 위한 방법은 통상의 재조합 DNA를 포함할 수 있고, 유전자 형질감염 기술은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Morrison SL. et al. (1984) 및 특허 문서 US 제5,202,238호; 및 US 제5,204, 244호).
통상의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술을 기반으로 하는 인간화 항체를 제조하기 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). 항체는 예를 들어, 출원 WO2009/032661에 개시된 기술, CDR-그라프팅 (EP 239,400; PCT 공개번호 WO91/09967; US 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 재표면화 (EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), 및 사슬 셔플링 (US 특허 제5,565,332호)을 포함한, 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용해 인간화될 수 있다. 이러한 항체의 제조를 위한 일반 재조합 DNA 기술이 또한 공지되어 있다 (참조: 유럽 특허 출원 EP 125023 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/02576).
본 발명의 Fab는 프로테아제, 예컨대 파파인으로, 본 발명의 항체 (예를 들어, IgG)를 처리하여 수득될 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab의 양쪽 사슬을 코딩하는 DNA 서열을 원핵생물 발현, 또는 진핵생물 발현을 위한 벡터에 삽입시키고, 원핵생물 또는 진핵생물 세포 (적절한 경우)에 벡터를 도입시켜 Fab를 발현시켜서 생산될 수 있다.
본 발명의 F(ab')2는 프로테아제, 펩신으로 본 발명의 항체 (예를 들어, IgG)를 처리하여 수득될 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 통해서 하기 기술되는 Fab'을 결합시켜서 생산될 수 있다.
본 발명의 Fab'은 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 본 발명의 F(ab')2를 처리하여 수득될 수 있다. 또한, Fab'은 항체의 Fab' 사슬을 코딩하는 DNA 서열을 원핵생물 발현을 위한 벡터, 또는 진핵생물 발현을 위한 벡터에 삽입시키고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 세포 (적절한 경우)에 도입시켜서 이의 발현을 수행하여 생산될 수 있다.
본 발명의 scFv는 본 발명의 항체에 대해서 이전에 기술된 바와 같은 CDR 또는 VH 및 VL 도메인의 서열을 취하고 나서, scFv 단편을 코딩하는 DNA를 구축하고, DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입시키고 나서, 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 세포 (적절한 경우)에 도입시켜 scFv를 발현시켜서 생산될 수 있다. 인간화 scFv 단편을 생성시키기 위해서, 본 발명에 따른 상보성 결정 영역 (CDR)을 선택하고, 공지된 3차 구조의 인간 scFv 단편 프레임워크 상에 그들을 그라프팅시키는 단계를 포함하는, CDR 그라프팅이라고 하는 충분히 공지된 기술이 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, W098/45322; WO 87/02671; US 제5,859,205호; US 제5,585,089호; US 제4,816,567호; EP 제0173494호).
본 발명의 항체의 변형
본 명세서에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다.
변형 및 변화는 본 발명의 항체의 구조, 및 그들을 코딩하는 DNA 서열에 만들어 질 수 있고, 여전히 바람직한 특징을 갖는 기능성 항체 또는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다.
폴리펩티드의 아미노 서열에 변화를 만들기 위해서, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질의 상호작용적 생물학적 기능에 대한 소수성 아미노산 지수의 중요성은 당분야에서 일반적으로 이해된다. 아미노산의 상대적 소수성 특징은 최종 단백질의 2차 구조에 기여하고, 그 다음에 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 정의한다고 받아들여진다. 각각의 아미노산은 그들의 소수성 및 전하 특징을 기반으로 다음과 같은 소수성 지수로 지정되었다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8) ; 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
본 발명의 추가 양태는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 기능-보존성 변이체를 포괄한다.
예를 들어, 일정 아미노산은 상당한 활성 손실없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 성질은 이의 생물학적 기능적 활성을 한정하므로, 일정 아미노산 치환이 단백질 서열, 및 물론 이를 코딩하는 DNA 서열에 만들어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 성질을 갖는 단백질이 수득된다. 따라서, 그들의 생물학적 활성의 상당한 손실없이, 본 발명의 항체 서열, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 DNA 서열에 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것을 고려한다.
일정 아미노산이 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성시키고, 다시 말해서, 여전히 생물학적으로 기능적으로 동등한 단백질을 수득한다는 것은 당분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드에서, 항원에 대한 결합의 유의한 상실없이, 치환될 수 있는 모든 아미노산을 확인하기 위해, 충분히 확립된 기술, 예컨대 알라닌-스캐닌 접근법을 사용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 잔기는 중성일 수 있는데, 그들은 항체의 구조를 유지하거나 또는 항원 결합에 관여하지 않기 때문이다. 이들 중성 위치 중 하나 이상은 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 주요 특징을 변화시키지 않고 알라닌 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
중성 위치는 임의의 아미노산 치환이 도입될 수 있는 위치로서 확인될 수 있다. 실제로, 알라닌-스캔의 원리에서, 알라닌은 이 잔기가 특별한 구조적 또는 화학적 특성을 보유하지 않기 때문에 선택된다. 알라닌이 단백질의 성질을 변화시키지 않고 특정 아미노산을 치환시킬 수 있다면, 전부는 아니지만, 많은 다른 아미노산 치환이 역시 중성일 가능성이 있다고 일반적으로 인정된다. 알라닌이 야생형 아미노산인 반대 경우에, 특정 치환이 중성으로 확인되면, 다른 치환도 역시 중성일 가능성이 있다.
상기 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들 소수성, 친수성, 크기 등을 기반으로 한다. 임의의 전술한 특징이 고려되는 예시적인 치환은 당업자에게 충분히 공지되어 있고, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
예를 들어, 항체의 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 증강시키거나, 또는 예를 들어 Fc 수용체와의 결합을 변경시키기 위해서, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입시켜서 획득될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입시켜서, 이 영역에 사슬간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및/또는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 (Caron PC. et al. 1992; 및 Shopes B. 1992). 일부 구현예, 본 발명의 항체는 대부분의 Fcγ 수용체에 대해 감소되거나 또는 제거된 결합을 일으켜서, 이러한 수용체를 발현하는 정상 세포 및 조직, 예를 들어, 마크로파지, 간 동양혈관 세포 등에서 흡수 및 독성을 감소시킬 수 있는 변형된 아미노산 서열을 갖는 항체일 수 있다. 이러한 항체의 예는 위치 234 및 235에서 2개 류신 (L) 잔기의 알라닌 (A)으로의 치환 (즉, LALA)을 포함하는 것으로서, 이러한 이중 치환은 FcγR에 대한 결합을 감소시키고 결과적으로 ADDC를 감소시킬뿐만 아니라 보체 결합/활성화를 감소시키는 것으로 입증되었다. 이러한 항체의 다른 예는 LALA 이중 치환 이외에도 치환 P329G을 포함하는 것 (즉, PG-LALA; 참조, 예를 들어, Schlothauer et al., Novel human IgG1 and IgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effector functions, Protein Engineering, Design and Selection, Volume 29, Issue 10, October 2016, Pages 457-466)이 있다. 일부 구현예, 따라서, 본 발명의 항체는 (i) 예를 들어, LALA 또는 PG-LALA 치환 세트를 함유하고, (ii) 그외 달리 개별 SEQ ID NO를 참조하여 상기 본 명세서에 기술된 본 발명의 항체 중 하나의 아미노산 서열과 동일한, 아미노산 서열을 갖는 항체일 수 있다.
본 발명의 항체의 아미노산 변형의 다른 유형은 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경시키는데 유용할 수 있는데, 다시 말해서 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나, 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것에 의한다. 아스파라긴-X-세린, 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의 아미노산임)의 삼중펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. 항체에 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 상기 기술된 삼중펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위 경우)을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시켜서 편리하게 수행될 수 있다.
다른 유형의 변형은 잠재적으로 항체 조제물의 불균질성 또는 분해 생산물을 초래하는 것으로서, 인 실리코에서 또는 실험적으로 확인된 서열의 제거를 포함한다. 예로서, 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미노화는 pH 및 표면 노출같은 인자들에 의존하여 발생될 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때, 탈아미노화에 특히 감수성이고, 다른 디펩티드 서열 예컨대 Asn-Ala에서는 정도가 덜하다. 이러한 탈아미노화 부위, 특히 Asn-Gly이 항체 또는 폴리펩티드에 존재할 때, 따라서 전형적으로 연루된 잔기 중 하나를 제거하도록 보존성 치환을 통해, 그 부위를 제거하는 것을 고려할 수 있다. 연루된 잔기 중 하나 이상을 제거하기 위해 서열에서 이러한 치환은 또한 본 발명에 포괄하고자 한다.
공유 변형의 다른 유형은 항체에 화학적으로 또는 효소적으로 글리코시드를 커플링시키는 것을 포함한다. 이들 절차는 그들이 N- 또는 0-연결된 글리코실화에 대한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 항체의 생산을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용되는 커플링 방식에 의존하여, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실 기, (c) 유리 설프히드릴 기 예컨대 시스테인의 것, (d) 유리 히드록실 기 예컨대 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 WO87/05330에 기술된다.
항체에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 대한 항체의 노출을 요구한다. 이러한 처리는 항체를 온전한 상태로 남겨 둔 채로, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분 또는 모든 당의 절단을 야기한다. 화학적 탈글리코실화는 하기 문헌에 기술된다: Sojahr H. et al. (1987) 및 Edge, AS. et al. (1981). 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 [Thotakura, NR. et al. (1987)]에 기술된 바와 같이 다양한 엔도-글리코시다제 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 획득될 수 있다.
항체의 공유 변형의 다른 유형은 예를 들어, US 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 기재된 방식으로, 다양한 비-단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 항체를 연결시키는 것을 포함한다.
당분야에 공지된 다른 아미노산 서열 변형은 본 발명의 항체에 또한 적용될 수 있다.
본 발명의 면역접합체
본 발명은 본 명세서에서 항체-약물 접합체, 또는 보다 간략하게, 접합체라고도 하는 면역접합체를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 모든 이들 용어는 동일한 의미를 가지며, 상호교환적이다. 면역접합체를 제조하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 면역접합체는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 시험관내 방법을 통해서 제조될 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 성장 억제제에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 본 발명의 항체 (예컨대, 예를 들어, mAb1, 또는 mAb1과 동일한 6개 CDR을 갖는 항체)를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
용어 "성장 억제제" ("항-증식제"라고도 함)는 세포, 예컨대 종양 세포의 성장을 시험관내 및/또는 생체내에서 억제하는 분자 또는 화합물 또는 조성물을 의미한다.
일부 구현예, 성장 억제제는 세포독성 약물 (세포독성제라고도 함)이다. 일부 구현예, 성장 억제제는 방사성 모이어티이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포독성 약물"은 간접적으로 또는 직접적으로 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나, 세포의 파괴를 초래하는 물질을 의미한다. 용어 "세포독성 약물"은 예를 들어, 화학요법제, 효소, 항생제, 독소 예컨대 소형 분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 톡소이드, 빈카, 탁산, 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유사체, 토마이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, 크립토파이신 유도체, 렙토마이신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체, 프로드러그, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, DNA 알킬화제, 항-튜불린제, CC-1065 및 CC-1065 유사체를 포함한다.
토포이소머라제 I 억제제는 DNA의 단일 가닥의 일시적 파괴 및 재결합을 촉매하여 DNA의 토폴로지를 변경시키는데 관여되는 인간 효소 토포이소머라제 I을 억제하는 분자 또는 화합물이다. 토포이소머라제 I 억제제는 예를 들어, 포유동물의 분열 세포에 고도로 독성이다. 적합한 토포이소머라제 I 억제제의 예는 캄프토테신 (CPT) 및 이의 유사체 예컨대 토포테칸, 이리노테칸, 실라테칸, 코시테칸, 엑사테칸, 루토테칸, 기마테칸, 벨로테칸 및 루비테칸을 포함한다.
일부 구현예, 본 발명의 면역접합체는 성장 억제제로서 세포독성 약물 엑사테칸을 포함한다. 엑사테칸은 화학명 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-1,2,3,9,12,15-헥사히드로-9-히드록시-4-메틸-10H,13H-벤조(데)피라노(3',4':6,7)인돌리지노(1,2-b)퀴놀린-10,13-디온을 갖는다. 엑사테칸은 하기 화학식 (I)로 표시된다:
Figure pct00014
본 발명의 추가 구현예에서, 예를 들어, 상기 열거된 바와 같은, 다른 CPT 유사체 및 다른 세포독성 약물이 사용될 수 있다. 일부 세포독성 약물 및 접합 방법의 예는 참조로 편입되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2008/010101에 더욱 제공된다.
용어 "방사성 모이어티"는 암 치료에 적합한 방사성 동위원소, 예컨대 At211, Bi212, Er169, I131, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89, 또는 Lu의 방사성 동위원소를 포함하거나 또는 그로 이루어진 화학적 독립체 (예컨대, 분자, 화합물, 또는 조성물)를 의미한다. 이러한 방사성 동위원소는 일반적으로 주로 베타-방사선을 방출한다. 일부 구현예, 방사성 동위원소는 알파-방출제 동위원소, 예를 들어, 알파-방사선을 방출하는 토륨 227이다. 면역접합체는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2004/091668에 기술된 대로 제조될 수 있다.
본 발명의 면역접합체에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 성장 억제제에 링커를 통해서 공유적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용되는, "링커"는 항체를 성장 억제제에 공유적으로 부착시키는 원자의 임의 사슬 및/또는 공유 결합을 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다. 링커는 당분야에서 충분히 공지되어 있고, 예를 들어, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 및 에스터라제 불안정성 기를 포함한다. 세포독성 약물 또는 다른 성장 억제제와 본 발명의 항체의 접합은 예를 들어, N-숙신이미딜 피리딜디티오부티레이트 (SPDB), 부탄산 4-[(5-니트로-2-피리디닐)디티오]-2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르 (니트로-SPDB), 4-(피리딘-2-일디술파닐)-2-술포-부티르산 (술포-SPDB), N-숙신이미딜 (2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜 (N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수버레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스 (p-아지도벤조일)-헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 [Vitetta et al (1987)]에 기술된 대로 제조될 수 있다. 탄소 표지된 1-이소티오시아나토벤질 메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다 (WO 94/11026).
본 발명의 구현예에서, 링커는 세포, 예를 들어, 종양 세포의 내부 또는 그 근처에서 세포독성 약물 또는 다른 성장 억제제의 방출을 촉진할 수 있는, "절단가능한 링커"일 수 있다. 일부 구현예, 링커는 포유동물 세포의 엔도솜 내에서 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 에스터라제 불안정성 링커, 광불안정성 링커, 또는 디술피드-함유 링커 (예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 참조)를 사용할 수 있다.
면역접합체를 나타내는 구조식을 언급할 때, 하기 명명법이 또한 사용된다: 성장 억제제 및 링커는 함께, 또한 [(링커)-(성장 억제제)] 모이어티라고 하고; 예를 들어, 엑사테칸 분자 및 링커는 함께, 또한 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티라고 한다.
본 발명의 일부 특정 구현예에서, 링커는 인간 효소 글루쿠로니다제에 의해 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 따라서, 본 발명의 면역접합체는 글루쿠로니다제에 의해 절단가능한 링커를 포함하는 하기 화학식 II의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00015
식에서, 항체는 본 발명의 항체이고, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(성장 억제제)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고, 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다. 일부 구현예, S는 항체의 시스테인의 황 원자이다. 일부 구현예, 항체는 mAb1이다.
숫자 n은 또한 "약물 대 항체 비율"(또는 "DAR")이고; 이러한 숫자 n은 항상 임의의 소정 면역접합체 (이의 조제물)에 대한 평균 수로서 이해해야 한다.
본 발명의 다른 특정 구현예에서, 링커는 인간 효소 레구마인에 의해 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 따라서, 본 발명의 면역접합체는 레구마인에 의해 절단가능한 링커를 포함하는 하기 화학식 (III)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00016
식에서, 항체는 본 발명의 항체이고, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(성장 억제제)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다. 일부 구현예, S는 항체의 시스테인의 황 원자이다. 일부 구현예, 항체는 mAb1이다.
상기 화학식 (II) 및 (III)의 각각에서, 항체의 황 원자 및 성장 억제제 간 화학적 구조는 링커이다. 이들 링커 중 하나는 또한 하기 더욱 도시되는 화학식 (IV) 내지 (IX)의 각각에 함유된다.
상기 기술된 바와 같이, 글루쿠로니다제 또는 레구마인에 의해 절단가능한 링커를 사용하는 구현예 중 어느 하나에서, 성장 억제제는 예를 들어, 엑사테칸일 수 있다.
따라서, 일부 구현예, 본 발명은 엑사테칸에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하고, 접합체는 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00017
식에서, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다. 일부 구현예, 항체는 mAb1이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 엑사테칸에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하고, 접합체는 하기 화학식 (V)의 구조를 갖는다:
Figure pct00018
식에서, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다. 일부 구현예, 항체는 mAb1이다.
일부 구현예, 본 발명의 면역접합체에서, 예컨대 상기 기술된 글루쿠로니다제- 또는 레구마인-절단가능한 링커와 접합된 엑사테칸에서, 링커는 항체의 시스테인 잔기의 황 원자에서 항체에 공유적으로 부착된다. 예를 들어, 항체의 이러한 시스테인 잔기는 사슬간 디술피드 결합 (본 명세서에서 사슬간 디술피드 가교라고도 함)을 형성할 수 있는 시스테인 잔기 중 하나일 수 있다. 총 8개 시스테인 잔기가 관여되는, IgG1 항체에서의 4개 사슬간 디술피드 결합이 존재하므로, 이러한 시스테인 잔기의 황 원자에서 항체에 대한 링커의 부착은 DAR이 최대 8일 수 있다는 것을 제공하고, 이러한 경우에, DAR은 전형적으로 7 내지 8, 예컨대 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이고, 단 항체는 IgG1이거나 또는 IgG1과 동일한 개수의 사슬간 디술피드 결합을 갖는다.
따라서, 일부 구현예, 본 발명은 엑사테칸에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하고, 접합체는 하기 화학식 (VI)의 구조를 갖는다:
Figure pct00019
식에서, S는 항체의 시스테인의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 엑사테칸에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하고, 접합체는 하기 화학식 (VII)의 구조를 갖는다:
Figure pct00020
식에서, S는 항체의 시스테인의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다.
상기 기술된 임의의 면역접합체에서, 본 발명의 임의의 항체 (상기 및 하기 본 명세서에 기술된 바와 같음)가 사용될 수 있다. 일부 구현예, 본 발명의 면역접합체는 항체로서 mAb1을 포함한다.
따라서, 일부 구현예, 본 발명은 엑사테칸에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 mAb1 를 포함하는 면역접합체를 제공하고, 접합체는 하기 화학식 (VIII)의 구조를 갖는다:
Figure pct00021
식에서, S는 항체 mAb1의 시스테인의 황 원자이고, n은 mAb1에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다. 일부 구현예, S는 사슬간 디술피드 가교를 형성할 수 있는 mAb1의 시스테인의 황 원자이고, DAR은 약 8이다. 이러한 면역접합체 (즉, "ADC1")의 예는 실시예에서 더욱 기술된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 엑사테칸에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 mAb1을 포함하는 면역접합체를 제공하고, 접합체는 하기 화학식 (IX)의 구조를 갖는다:
Figure pct00022
식에서, S는 항체 mAb1의 시스테인의 황 원자이고, n은 mAb1에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수이다. 숫자 n (DAR이라고도 함)은 예를 들어, 1 내지 10일 수 있고; 더 특별한 구현예에서, n은 7 내지 8이고; 보다 더 특별한 구현예에서, n은 7.5 내지 8.0 (즉, 약 8)이다. 일부 구현예, S는 사슬간 디술피드 가교를 형성할 수 있는 mAb1의 시스테인의 황 원자이고, DAR은 약 8이다. 이러한 면역접합체 (즉, "ADC2")의 예는 실시예에서 더욱 기술된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 링커는 "비-절단가능한 링커" (예를 들어, SMCC 링커)일 수 있다. 항체로부터 성장 억제제의 방출은 항체의 리소솜 분해 시 발생될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 면역접합체는 본 발명의 항체 및 세포독성 또는 성장 억제성 폴리펩티드 (성장 억제제로서)를 포함하는 융합 단백질일 수 있고; 이러한 융합 단백질은 재조합 기술 또는 펩티드 합성, 즉 당분야에 충분히 공지된 방법을 통해서 만들어질 수 있다. DNA를 코딩하는 분자는 서로 인접하거나 또는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 접합체의 2개 부분 (각각 항체 및 세포독성 또는 성장 억제성 폴리펩티드)을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 프로드러그 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)를 활성 세포독성 약물로 전환시키는 프로드러그-활성화 효소에 항체를 접합시켜서 항체-유도된 효소 프로드러그같은 유도 효소 프로드러그 요법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, WO 88/07378 및 US 특허 제4,975,278호 참조). ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 보다 활성적인, 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로, 프로드러그에 대해 작용할 수 있는 임의 효소를 포함할 수 있다. 이러한 상황에서 유용한 효소는 포스페이트-함유 프로드러그를 자유 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 술페이트-함유 프로드러그를 자유 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 플루오로시토신을 항암 약물 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 프로드러그를 자유 약물로 전환시키는데 유용한, 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 프로드러그를 전환시키는데 유용한, D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 프로드러그를 자유 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소 예컨대 O-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; P-락탐으로 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 P-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 그들 아민 질소에서 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한, 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 효소는 당분야에 충분히 공지된 기술, 예컨대, 상기 논의된 링커의 사용을 통해서 본 발명의 항체에 공유적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 면역접합체를 제조하기 위한 적합한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Hermanson G. T., Bioconjugate Techniques, Third Edition, 2013, Academic Press). 예를 들어, 항체의 사슬간 디술피드 가교의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 링커를 통해서 항체에 세포독성 약물을 접합시키는 방법은 충분히 공지되어 있다.
일반적으로, 본 발명의 면역접합체는 예를 들어, 하기 단계를 포함하는 방법을 통해서 수득될 수 있다:
(i) 본 명세서에서 "약물-링커 화합물"이라고도 하는, 링커 및 성장 억제제 (예를 들어, 세포독성 약물)를 포함하는 화합물을 제조하는 단계;
(ii) 본 발명에 따른 항체의 임의로 완충된 수용액을 약물-링커 화합물의 용액과 접촉시키는 단계;
(iii) 다음으로, 임의로, (ii)에서 형성된 접합체를 미반응된 항체 및/또는 약물-링커 화합물로부터 분리시키는 단계.
항체의 수용액은 완충제 예컨대 예를 들어, 히스티딘, 포타슘 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 또는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (Hepes 완충액)로 완충될 수 있다. 완충제는 항체의 성질에 의존하여 선택될 수 있다. 약물-링커 화합물은 예를 들어, 유기 극성 용매 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO) 또는 디메틸아세타미드 (DMA)에 용해될 수 있다.
항체의 시스테인 잔기에 접합을 위해서, 항체에 대해서 단계 (ii) 전에 환원 (예를 들어, TCEP 사용)을 수행한다. 오직 사슬간 디술피드 결합만을 환원시키기 위해 적합한 환원 조건은 당분야에 공지되어 있다.
접합을 위한 반응 온도는 일반적으로 20 내지 40℃이다. 반응 시간은 다양할 수 있고, 전형적으로 1 내지 24시간이다. 항체 및 약물-링커 화합물 간 반응은 굴절계 및/또는 UV 검출기와 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해서 모니터링될 수 있다. 접합 수율이 너무 낮으면, 반응 시간을 연장시킬 수 있다.
단계 (iii)의 분리를 수행하기 위해서 당업자는 다수의 상이한 크로마토그래피 방법을 사용할 수 있고, 접합체는 예를 들어, SEC, 흡착 크로마토그래피 (예컨대 이온 교환 크로마토그래피, IEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 친화성 크로마토그래피, 혼합 지지체 크로마토그래피 예컨대 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 또는 고성능 액상 크로마토그래피 (HPLC) 예컨대 역상 HPLC를 통해서 정제될 수 있다. 투석 또는 여과 또는 정용여과에 의한 정제가 또한 사용될 수 있다.
단계 (ii) 및/또는 (iii) 이후에, 접합체-함유 용액은 예를 들어, 크로마토그래피, 한외여과 및/또는 정용여과를 통해서, 추가의 정제 단계 (iv)가 수행될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피, 한외여과 및/또는 정용여과를 통한, 이러한 추가의 정제 단계는 또한 접합 전에 환원이 수행되는 경우에, 환원 반응 이후 항체-함유 용액으로 수행될 수 있다.
접합체는 수용액 중에서 이러한 방법의 종료 시에 회수된다. 약물 대 항체 비율 (DAR)은 접합에 사용되는 실험 조건 (예컨대, (약물-링커 화합물)/(항체) 비율, 반응 시간, 용매 및 있다면 공용매의 속성)과 함께, 사용되는 약물-링커 화합물 및 항체의 속성에 따라서 다양할 수 있는 숫자이다. 따라서, 항체 및 약물-링커 화합물 간 접촉은 상이한 약물 대 항체 비율에 의해서 서로 상이한 몇개의 접합체를 포함하는 혼합물을 초래할 수 있다. 따라서, 결정되는 DAR은 평균 값이다.
당분야에 충분히 공지된 방법인, 4개 사슬간 디술피드 가교를 갖는 항체 (예를 들어, mAb1 또는 임의의 IgG1 항체)를 사용하여 사슬간 디술피드 가교의 시스테인 잔기에서 접합의 수행은 약 8의 상대적으로 균질한 DAR이, 접합 완료 (또는 적어도 거의 완료)까지 진행되도록 허용하는 반응 조건을 선택하여 획득될 수 있다는 장점을 제공한다.
DAR을 결정하는데 사용될 수 있는 예시적인 방법은 λD　및 280 nm에서 정제된 접합체의 용액의 흡광도 비율을 분광광도적으로 측정하는 단계로 이루어진다. 280 nm는 단백질 농도, 예컨대 항체 농도를 측정하는데 일반적으로 사용되는 파장이다. 파장 λD　는 즉, 당업자에게 쉽게 공지된 바와 같이, 항체와 약물을 구별할 수 있도록 선택되고, λD　는 약물이 높은 흡광도를 갖는 파장이고, λD　는 약물 및 항체의 흡광 피크에서 실질적인 중첩을 피하기 위해서 280 nm로부터 충분히 떨어져있다. 예를 들어, λD　는 엑사테칸 (또는 캄프토테신 또는 다른 캄프토테신 유사체) 경우 370 nm, 또는 마이탄시노이드 분자 경우 252 nm로서 선택될 수 있다.
DAR 계산 방법은 예를 들어, 문헌 [Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science]으로부터 도출할 수 있다. λD　(AλD) 및 280 nm (A280)에서 접합체에 대한 흡광도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석의 단량체 피크 ("DAR(SEC)" 매개변수를 계산할 수 있게 함) 상에서 또는 고전적인 분광광도계 장치 ("DAR(UV)" 매개변수를 계산할 수 있게 함)를 사용하여 측정된다. 흡광도는 다음과 같이 표시될 수 있다:
AλD　= (CD　X εDλD) + (CA　X εAλD)
A280　= (CD　X εD280) + (CA　X εA280)
상기 식에서,
. CD　및 CA　는 각각 약물 및 항체의 용액 중에서의 농도이고,
. εDλD　및 εD280　은 각각 λD　및 280 nm에서 약물의 몰 소광 계수이고,
. εAλD　및 εA280　은 각각 λD　및 280 nm에서 항체의 몰 소광 계수이다.
2개 미지수를 갖는 이들 2개 방정식의 해는 하기 방정식으로 이어진다:
CD　= [(εA280　X AλD) - (εAλD　X A280)] / [(εDλD　X εA280) - (εAλD　X εD280)]
CA　=　[A280　- (CD　X εD280)] / εA280
다음으로, 평균 DAR은 약물 농도 대 항체 농도의 비율로부터 계산된다: DAR = CD　/ CA.
본 발명의 면역접합체를 제조하기 위한 예시적인 방법은 실시예에 기술된다.
약물-링커 화합물
본 발명은 또한 본 명세서에서 "약물-링커 화합물"이라고도 하는, 링커 및 성장 억제제 (예를 들어, 세포독성 약물)을 포함하는 화합물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 하기 화학식 (X)의 화합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 제공하고, 이 화합물은 또한 본 명세서에서 "약물-링커 화합물 1", "화합물 DL1" 또는 "DL1"이라고 한다:
Figure pct00023
본 발명은 또한 하기 화학식 (XI)의 화합물, 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 제공하고; 이 화합물은 또한 본 명세서에서 "약물-링커 화합물 2", "화합물 DL2" 또는 "DL2"라고 한다.
Figure pct00024
약물-링커 화합물은 상기 및 하기 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약물-링커 화합물 (예를 들어, 상기 도시된 화학식 (X) 또는 (XI)의 것)은 예를 들어, 하기 실시예에서 더욱 기술되는 바와 같은, 화학 합성을 통해서 제조될 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제, 및 임의로 제한없이 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 지질 또는 당의 부류를 포함하는 지속-방출형 매트릭스와 조합되어서 약학 조성물을 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항체 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
약학" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 포유동물, 특히 인간에게, 적절하게 투여될 때, 유해한, 알레르기 또는 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는 분자적 실체 및 조성물을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화제 또는 임의 유형의 제제 보조제를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제 등을 포함한다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 하나 이상의 물, 아미노산, 염수, 포스페이트 완충 염수, 완충제 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트; 아미노산 및 유도체 예컨대 히스티딘, 아르기닌, 글리신, 프롤린, 글리실글리신; 무기 염 예컨대 NaCl 또는 칼슘 클로라이드; 당 또는 다가알콜 예컨대 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 수크로스, 트레할로스, 만니톨; 계면활성제 예컨대 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20, 폴록사머 188 등을 비롯하여, 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 많은 경우에, 등장화제, 예컨대 당, 다가알콜, 또는 소듐 클로라이드가 약학 조성물에 포함되는 것이 유용할 수 있고, 제제는 또한항산화제 예컨대 트립타민 및/또는 안정화제 예컨대 Tween 20을 함유할 수 있다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 용량 및 용법은 자연적으로, 치료하려는 병태, 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 및 성별 등에 의존적이다.
본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안구내 투여 등을 위해 제제화될 수 있다.
일 구현예에서, 약학 조성물은 주사용 제제를 위해 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 등장성, 멸균, 염수 용액 (모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 혼합물)일 수 있거나, 또는 경우에 따라서, 멸균수 또는 생리적 염수의 첨가 시에, 주사가능한 용액의 구성을 허용하는, 건조, 특히 냉동-건조 조성물일 수 있다.
약학 조성물은 약물 조합 장치를 통해서 투여될 수 있다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개변수의 함수에 따라서, 예를 들어, 사용되는 투여 방식, 관련 병리학, 또는 대안적으로 원하는 치료 지속기간의 함수에 따라서 적정될 수 있다.
약학 조성물을 제조하기 위해서, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 유효량은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액; 참깨유, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함하고; 모든 이러한 경우에, 형태는 멸균되어야 하고 분해없이 전달을 위한 적절한 장치 또는 시스템을 사용해 주사가능해야 하며, 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해서 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물, 및 오일 중에 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에서, 이들 조제물은 미생물의 성장을 방지하도록 보존제를 함유할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 중성 또는 염 형태의 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 무기산, 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가 염 (단백질의 유리 아미노 기와 형성)을 포함한다. 유리 카르복실 기와 형성된 염은 또한 무기 염기 예컨대, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 철 히드록시드, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 글리신, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티머로산 등에 의할 수 있다. 일부 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 상기 열거된 임의의 다른 성분과 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시키고, 필요에 따라, 이어서 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시켜서 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말 경우에, 제조 방법은 이전에 이의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 바람직한 성분이 더해진 활성 성분의 분말을 산출하는 진공-건조 및 냉동-건조 기술을 포함한다.
직접 주사를 위해 더 농축되거나, 또는 고도로 농축된 용액의 조제물이 또한 고려되는데, 용매로서 DMSO의 사용은 작은 종양 영역으로 고농도의 활성제를 전달하는 매우 빠른 침투를 초래하는 것으로 고려된다.
제제화 시에, 용액은 치료적으로 유효한 양 및 용량 제제와 상용성인 방식으로 투여될 수 있다. 제제는 다양한 제형, 예컨대 상기 기술된 주사용 용액의 유형으로 쉽게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등이 또한 적용될 수 있다.
수용액 중 비경구 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 필요하면 적합하게 완충될 수 있고, 먼저 액상 희석제는 충분한 염수 또는 포도당으로 등장성이 된다. 이들 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 적용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시의 관점에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 용량은 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고, 1000 mL의 피하주사액에 첨가되거나 또는 제안된 주입 부위에 주입될 수 있다 (참조: 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 치료되는 대상체의 병태에 따라서 용량의 일부 변동이 필연적으로 일어날 것이다. 투여 담당자는 임의 경우에, 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 예를 들어, 용량 당 약 0.01 내지 100 밀리그램을 포함하도록 치료 혼합물 내에 제제화될 수 있다.
비경구 투여, 예컨대 정맥내 또는 근육내 주사를 위해 제제화된 항체 또는 면역접합체 이외에도, 다른 약학적으로 허용가능한 형태는 예를 들어, 정제 또는 다른 경구 투여용 고체, 시간 방출 캡슐, 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.
일부 구현예, 리포솜 및/또는 나노입자의 사용이 숙주 세포로 폴리펩티드의 도입을 위해 고려된다. 리포솜 및/또는 나노입자의 형성 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해서, 이러한 초미세 입자 (대략 0.1 μm 크기)는 일반적으로 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 디자인된다. 이들 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자, 또는 생분해성 폴리락티드 또는 폴리락티드 코글리콜리드 나노입자는 본 발명에서 사용을 위해 고려되고, 이러한 입자는 당업자가 쉽게 만들 수 있다.
리포솜은 수성 매질에 분산되어서 다층 동심 이중층 소포체 (다층 소포체 (MLV))를 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성될 수 있다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파 처리는 코어에 수용액을 함유하는, 200 내지 500 A 범위의 직경을 갖는 소형 단층 소포체 (SUV)의 형성을 야기한다. 리포솜의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다.
상기 언급된 예 이외에도, 추가의 약학적 형태, 예컨대 나노입자, 마이크로입자 및 -캡슐, 임플란트 (예를 들어, 지질 임플란트), 또는 자기-고화 또는 자기-유화 시스템이 또한 고려된다.
치료 방법 및 용도
본 발명자는 본 발명의 항체 (예를 들어, mAb1)가 결합 이후에 CEACAM5-항체 복합체의 일부로서 내재화될 수 있다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 그들은 세포독성 약물 (엑사테칸)에 접합된, 이러한 항체는 시험관내에서 종양 세포에 대한 세포독성 효과를 매개하는 것을 확인하였다. 본 발명자는 또한 본 발명의 이들 면역접합체는 단일 주사로, 10 mg/kg의 용량으로 사용될 때, 생체내에서, 예를 들어, 환자로부터 유래된 인간 직결장 암종의 쥣과동물 이종이식 모델에서 현저한 항-종양 활성을 유도한다는 것을 확인하였다. 사실, 본 발명의 면역접합체는 시험관내 및 생체내 모델의 큰 세트에서 광범위한 활성을 보인다. 세포독성 역가는 표적 (CEACAM5) 발현과 충분히 상관있고 표적-음성 세포에서 훨씬 더 낮다. 상이한 암 유형의 몇몇 세포주-유래 이종이식 (CDX) 및 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델에서, 매우 양호한 항종양 활성이 입증되었다. 면역접합체는 토포이소머라제-I 억제제 화학요법에 전형적인 부작용 프로파일을 갖는 비-인간 영장류 용량-범위 발견 연구에서 충분히 내약성이 있었다. 전임상 데이터는 이후 임상 시험을 위한 양호한 치료창을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항체, 면역접합체 및 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 약물로서 사용을 위한 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 암의 치료에서 사용을 위한 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암을 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항체, 면역접합체, 또는 약학 조성물로 치료하려는 암은 바람직하게 CEACAM5를 발현하는 암, 보다 바람직하게 동일 조직 기원의 정상 (즉, 비-종양) 세포와 비교하여 CEACAM5를 과발현하는 암이다. 세포에 의한 CEACAM5의 발현은 예를 들어 본 발명에 따른 항체 (또는 상업적으로 입수가능한 항-CEACAM5 항체)를 사용하여, 예를 들어, 하기 섹션 "진단 용도"에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 면역조직화학 방법을 통해서 쉽게 어세이될 수 있다.
일부 구현예, 본 발명의 항체, 면역접합체, 또는 약학 조성물로 치료하려는 암은 직결장암, 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 식도암 (예를 들어, 식도 선암종), 담관암종, 유방암, 전립선암, 난소암, 요로상피암, 방광암, 또는 위, 자궁, 자궁내막, 갑상선 또는 피부의 암이다. 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 면역접합체, 또는 약학 조성물로 치료하려는 암은 직결장암, 위암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 식도암 또는 전립선암이다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 암 요법 단독으로 또는 임의의 적합한 성장 억제제와 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 기술된 바와 같이, 성장 억제제에 접합 (연결)될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 그들 표면 상에서 CEACAM5를 발현하거나 또는 과발현하는 암성 세포로 상기 성장 억제제를 표적화하는데 유용할 수 있다.
치료적 단일클론 항체는 항체에 의해서 특이적으로 인식되는 항원을 보유하는 세포의 고갈을 야기할 수 있다는 것은 역시 충분히 공지되어 있다. 이러한 고갈은 하기 적어도 3개 기전을 통해서 매개될 수 있다: 항체 매개된 세포의 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 용해, 및 항체에 의해 표적화되는 항원에 의해 매개되는 신호를 통한 종양 성장의 직접 억제.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 일정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 마크로파지)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 항체가 이들 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여서 이후 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 의미한다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 시험관내 ADCC 어세이, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기술된 것들이 수행될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 그들 동족 항원에 결합하는 항체에 보체계의 제1 성분의 결합을 통해서 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al. (Journal of Immunological Methods. 1997 Mar;202(2):163-171)]에 기술된 바와 같은, CDC 어세이가 수행될 수 있다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 대부분의 Fcγ 수용체에 대해 감소되거나 또는 제거된 결합을 일으켜서, 이러한 수용체를 발현하는 정상 세포 및 조직, 예를 들어, 마크로파지, 간 동양혈관 세포 등에서 흡수 및 독성을 감소시킬 수 있는 변형된 아미노산 서열을 갖는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 작용되는 장애 또는 병태, 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 반전시키거나, 경감시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "암을 치료하는"이란, 종양의 악성 세포의 성장 및/또는 상기 종양으로부터 전이의 진행의 억제를 의미한다. 이러한 치료는 또한 종양 성장의 퇴행, 즉 측정가능한 종양 크기의 감소를 야기할 수 있다. 예를 들어, 이러한 치료는 종양 또는 전이의 완전한 퇴행을 야기할 수 있다.
본 발명의 치료적 적용 상황에서, 용어 "대상체" 또는 "환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체" 또는 "이를 필요로 하는 환자"는 종양에 의해 영향을 받거나 또는 영향을 받을 가능성이 있는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물)를 의미한다. 예를 들어, 상기 환자는 CEACAM5를 표적화하는 치료제, 특히 본 발명에 따른, 예를 들어 하기 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따른 항체 또는 면역접합체에 감수성인 것으로 결정된 환자일 수 있다.
"치료적 유효량"이란, 임의의 의학적 치료에 적용가능한 타당한 이익/위험 비율에서 상기 암 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 항체, 면역접합체 및 약학 조성물 (집합적으로 "치료제"라고 함)의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 참관 의사가 결정할 것임을 이해할 것이다. 임의의 특정한 환자에 대한 특별한 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특별한 치료제의 활성; 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; 적용되는 특별한 치료제의 투여 시기, 투여 경로, 및 배설률; 치료 지속기간; 적용되는 특별한 치료제와 병용하여 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에 충분히 공지된 유사 인자들을 포함하여, 다양한 인자들에 의존적일 것이다. 예를 들어, 원하는 치료적 효과를 획득하는데 필요한 것보다 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 점진적으로 용량을 증가시키는 것은 당업계에 충분히 공지되어 있다.
본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학 조성물은 또한 암의 전이의 진행을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학 조성물은 또한 암을 치료 (예를 들어, 보조 요법)하고/하거나 전이성 암의 성장을 감소시키기 위해 임의의 다른 치료적 중재술과 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 병용을 위한 다른 치료적 중재술은 치료하려는 암에 대한 치료 표준 (SOC) 치료제일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체 또는 약학 조성물을 사용한 치료의 효능은 생체내에서, 예를 들어, 암의 마우스 모델에서, 예를 들어,치료 및 대조 그룹 간 종양 부피 변화, % 종양 퇴행, 부분 퇴행 또는 완전 퇴행을 측정하여, 쉽게 어세이될 수 있다.
진단 용도
CEACAM5는 암세포 예컨대 예를 들어, 직결장, 위, 폐, 및 췌장 종양 세포의 표면에서 고도로 발현되는 것으로 보고되었고, 정상 조직에서 발현은 소수의 정상 상피 세포 예컨대 결장 및 식도 상피 세포로 제한된다.
그러므로, CEACAM5는 암 마커를 구성하고, 예를 들어, 항-암 요법의 유효성을 표시하거나 또는 질환의 재발을 검출하기 위해 사용될 잠재성을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 치료제에 대한 환자의 감수성을 결정하거나, 항-암 요법의 유효성을 모니터링하거나, 또는 치료 후 질환의 재발을 검출하기 위해서, CEACAM5 발현 종양을 표적화하는 요법의 상황에서 어세이의 성분으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예, 본 발명의 동일 항체는 치료제의 성분 및 진단 어세이의 성분으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 양태는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중에서 생체외 CEACAM5 발현을 검출하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 대상체에서 생체내 CEACAM5 발현을 검출하기 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. CEACAM5의 검출을 위해 사용될 때, 항체는 검출가능한 분자 예컨대, 예를 들어, 형광단 또는 효소로 표지될 수 있다.
CEACAM5의 검출은 예를 들어, 종양 세포 상에서 표면 단백질 CEACAM5의 발현을 검출하여,
a) 대상체에서 암의 존재를 진단하거나, 또는
b) CEACAM5를 표적화하는 치료제, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체에 대한 암을 갖는 환자의 감수성을 결정하거나, 또는
c) 항-CEACAM5 암 요법의 유효성을 모니터링하거나 또는 항-CEACAM5 암 요법 이후 암 재발을 검출하는 것이 의도될 수 있고, 특히 상기 요법은 본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체를 사용한 요법이다.
구현예에서, 항체는 시험관내 또는 생체외 진단 용도에 의도된다. 예를 들어, CEACAM5는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중에서 시험관내 또는 생체외에서 본 발명의 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명에 따른 용도는 또한 생체내 용도일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 대상체에게 투여될 수 있고, 항체-세포 복합체를 검출 및/또는 정량할 수 있고, 그리하여 상기 복합체의 검출은 암을 의미한다.
본 발명은 또한 대상체에서 암의 존재를 검출하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것으로서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터의 생물학적 샘플을 특히 상기 생물학적 샘플과 복합체를 형성하기 위해 항체에 적합한 조건 하에서, 본 발명에 따른 항체와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 결합된 항체의 측정된 수준을 대조군과 비교하여 암의 존재를 검출하는 단계로서, 대조군과 비교하여 결합된 항체의 증가된 수준은 암을 의미하는 것인 단계.
본 발명은 또한 CEACAM5를 표적화하는 치료제, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체에 대한 암을 갖는 환자의 감수성을 결정하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것으로서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 암을 갖는 환자로부터의 생물학적 샘플을, 특히 상기 생물학적 샘플과 복합체를 형성하기 위해 항체에 적합한 조건 하에서, 본 발명에 따른 항체와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 측정된 수준을 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하는 단계로서, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 증가된 수준은 CEACAM5를 표적화하는 치료제에 감수성인 환자를 의미한다.
상기 방법에서, 상기 대조군은 동일한 유형의 정상 생물학적 샘플에서 항체 결합 수준을 의미하는 것으로 결정된 기준 값, 또는 동일 유형의 정상, 비암성 생물학적 샘플일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 CEACAM5 발현 암, 예컨대 직결장암, 위암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 식도암, 전립선암, 또는 CEACAM5를 발현하는 다른 고형 종양을 진단하는데 유용하다.
본 발명은 또한 항-CEACAM5 암 요법의 유효성을 모니터링하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것으로서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 항-CEACAM5 암 요법을 받고있는 대상체로부터의 생물학적 샘플을, 특히 상기 생물학적 샘플과 복합체를 형성하기 위해 항체에 적합한 조건 하에서, 본 발명에 따른 항체와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군에 결합된 항체의 수준과 결합된 항체의 측정된 수준을 비교하는 단계;
대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 감소된 수준은 상기 항-CEACAM5 암 요법의 유효성을 의미한다. 상기 방법에서, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 증가된 수준은 상기 항-CEACAM5 암 요법의 비유효성을 의미한다. 유효성을 모니터링하는 이러한 방법의 일 구현예에서, 상기 대조군은 분석이 수행되었지만, 항-CEACAM5 암 요법의 과정 동안 더 이른 시점에 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플과 동일 유형의 생물학적 샘플이다.
본 발명은 또한 항-CEACAM5 암 요법 이후 암 재발을 검출하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것으로서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체, 항-CEACAM5 암 요법이 완료된 대상체로부터의 생물학적 샘플을, 특히 상기 생물학적 샘플과 복합체를 형성하기 위해 항체에 적합한 조건 하에서, 본 발명에 따른 항체와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군에 결합된 항체의 수준과 결합된 항체의 측정된 수준을 비교하는 단계;
대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에 결합된 항체의 증가된 수준은 항-CEACAM5 암 요법 이후 암 재발을 의미한다. 상기 대조군은 특히, 분석이 수행되지만, 이전에, 즉 항-CEACAM5 암 요법의 완료 시 또는 그 이후에, 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플과 동일한 유형의 생물학적 샘플이다.
상기 항-CEACAM5 암 요법은 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체를 사용하는 요법이다. 상기 항-CEACAM5 암 요법은 CEACAM5 발현 암, 예컨대 직결장암, 위암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 식도암, 전립선암 또는 CEACAM5를 발현하는 다른 고형 종양을 표적화한다.
일부 구현예, 본 발명의 항체는 검출가능한 분자 또는 물질, 예컨대 형광 분자 또는 형광단, 방사성 분자, 효소 또는 (직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 당분야에 공지된 임의의 다른 표지에 의해 표지될 수 있다.
본 발명에 따른 항체와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "표지된"은 검출가능한 물질, 예컨대 방사능제 또는 형광단 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 파이코에리쓰린 (PE) 또는 인도시아닌 (Cy5))을 폴리펩티드에 커플링 (즉, 물리적으로 연결)시키는 항체의 직접 표지화를 비롯하여, 검출가능한 물질과 반응성에 의한 폴리펩티드의 간접 표지화를 포괄하고자 한다.
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 임의 방법을 통해 방사성 분자로 표지될 수 있다. 예를 들어, 방사성 분자는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예컨대 I123, I124, In111, Re186, Re188, Tc99 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 또한 핵 자기 공명 (NMR) 이미지화 (자기 공명 이미지화, MIR로서 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철로 표지될 수 있다.
"생물학적 샘플"은 진단 또는 모니터링 어세이에서 사용할 수 있는 대상체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포괄한다. 생물학적 샘플은 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 고체 조직 샘플 예컨대 생검 시료 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포, 및 이의 자손을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 그러므로, 생물학적 샘플은 임상 샘플, 배양 중인 세포, 세포 상등액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플, 예컨대 종양 샘플을 포괄한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 포르말린-고정 및 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플일 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 암의 존재를 검출하기 위한 생체내 방법에 관한 것으로서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 본 발명에 따른 항체를 환자에게 투여하는 단계로서, 항체는 검출가능한 분자로 표시된 것인 단계;
b) 이미지화를 통해서, 예를 들어, 검출가능한 분자를 검출하여서 환자에서 상기 항체의 국재화를 검출하는 단계.
상기 방법에서, 암은 CEACAM5 발현 암, 예컨대 직결장암, 위암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 식도암, 전립선암, 또한 CEACAM5를 발현하는 다른 고형 종양일 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 암의 병기 결정 (예를 들어, 방사성 이미지화에서)에 유용할 수 있다. 그들은 단독으로 또는 다른 암 마커와 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "검출" 또는 "검출된"은 대조군에 대한 기준 존재 또는 부재에서 정성적 및/또는 정량적 검출 (즉, 측정된 수준)을 포함한다.
본 발명의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은 다수의 수집된 데이터를 기반으로, 대상체에게 영향을 미치는 병리를 확인하기 위해 위도된, 의학적 상태의 속성의 결정을 의미한다.
키트
마지막으로, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 항체를 함유하는 키트는 표면 단백질 CEACAM5의 검출, 또는 치료 또는 진단 어세이에서 용도를 찾을 수 있다. 본 발명의 키트는 고형 지지체, 예를 들어, 조직 배양 플레이트 또는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항체를 함유할 수 있다. 시험관내, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서, 표면 단백질 CEACAM5의 검출 및 정량을 위한 항체를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 검출에 유용한 이러한 항체는 표지 예컨대 형광 또는 방사성 표지가 제공될 수 있다.
서열의 간략한 설명
아미노산 서열:
SEQ ID NO: 1 GenBank 등록 번호 AAA51967.1에 따른 인간 CEACAM5 단백질 서열
SEQ ID NO: 2 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5 단백질 서열 (NCBI 기준 서열 XP_005589491.1)
SEQ ID NO: 3 mAb1의 CDR1-H
SEQ ID NO: 4 mAb1의 CDR2-H
SEQ ID NO: 5 mAb1의 CDR3-H
SEQ ID NO: 6 mAb1의 CDR1-L
SEQ ID NO: 7 mAb1의 CDR2-L
SEQ ID NO: 8 mAb1의 CDR3-L
SEQ ID NO: 9 mAb1의 VH
SEQ ID NO: 10 mAb1의 VL
SEQ ID NO: 11 mAb1의 CH
SEQ ID NO: 12 mAb1의 CL
SEQ ID NO: 13 mAb1의 HC
SEQ ID NO: 14 mAb1의 LC
핵산 서열:
SEQ ID NO: 15 mAb1의 HC를 코딩하는 DNA 서열
SEQ ID NO: 16 mAb1의 LC를 코딩하는 DNA 서열
아미노산 서열:
SEQ ID NO: 17 항체 hu8G4의 HC
SEQ ID NO: 18 항체 hu8G4의 LC
SEQ ID NO: 19 최적화된 항체 변이체 1의 HC
SEQ ID NO: 20 최적화된 항체 변이체 1의 LC
SEQ ID NO: 21 최적화된 항체 변이체 2의 LC
SEQ ID NO: 22 최적화된 항체 변이체 4의 LC
SEQ ID NO: 23 최적화된 항체 변이체 5의 LC
SEQ ID NO: 24 최적화된 항체 변이체 6의 HC
SEQ ID NO: 25 huMab2-3 (알로타입)의 HC
SEQ ID NO: 26 huMab2-3의 LC
SEQ ID NO: 27 hmn-14의 HC
SEQ ID NO: 28 hmn-14의 LC
SEQ ID NO: 29 rb8G4의 HC
SEQ ID NO: 30 rb8G4의 LC
실시예
실시예 1: 항-CEACAM5 항체
1.1 유전자이식 래트의 면역화 및 하이브리도마의 단리
인간 CEACAM5 단백질 (암-배아 항원-관련된 세포 부착 분자 5; CD66e)에 대한 단일클론 항체를 생성시키기 위해서, 인간 면역글로불린 유전자 유전자이식 래트 (OmniRatTM)는 CHARLES RIVER LABORATORIES INTERNATIONAL INC. (WILMINGTON, MA)에서 입수하였다. 5마리 동물은 Aldevron 독점 면역화 벡터 (pB8-CEA-hum-MC)에 클로닝되었고 유전자 총을 사용하여 OMT 래트 세포에 일시적으로 형질감염된 CEACAM5 cDNA (UniProt ID no. P06731의 인간 CEACAM5 단백질 서열의 아미노산 35-675을 코딩함; P06731의 서열은 SEQ ID NO: 1의 E398가 K398로 치환된 것을 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일함)를 사용해 4회 면역화되었다.
항-CEACAM5 적정가는 그들 세포막 상에서 CEACAM5를 발현하는 세포를 사용하는 세포-기반 ELISA (CELISA) 어세이를 통해 평가되었다 (적정가 결과는 하기 표시됨). 면역화된 동물 혈청은 4 라운드의 유전 물질 면역화 이후에 면역화 프로토콜의 31일에 채취되었다 (IS31d-4). PBS + 3% FBS에 희석된 혈청은 Aldevron 독점 발현 벡터 (pB1-CEA-hum-MC)에 클로닝된 CEACAM5 cDNA가 일시적으로 형질감염된 포유동물 세포에 대한 유세포측정을 통해서 시험되었다. 염소 항-래트 IgG R-파이코에리스린 접합체 (Southern Biotech, #3030-09)는 10 μg/mL로 2차 항체로서 사용되었다.
모든 동물을 희생시켰고, 림프절로부터 림프구를 풀링하고 향후 사용을 위해 냉동 보존하였다. 세포는 Ag8 마우스 골수종 세포주와 융합되어서 생존 하이브리도마를 생성시켰다. 이러한 융합으로부터 하이브리도마 세포는 이후 10개의 96웰 플레이트로 옮겨졌다.
1.2 CEACAM5 특이성
하이브리도마 상청액은 CEACAM1 (BGP), CEACAM3 (CGM1a), CEACAM4 (CGM7), CEACAM6 (NCA) 및 CEACAM8 (NCA-95)에 결합하지 않은 항-CEACAM5 항체의 검출을 위해 세포-기반 ELISA (CELISA) 어세이를 사용해 스크리닝되었다. 염소 항-래트 IgG R-파이코에리스린 접합체 (Southern Biotech, #3030-09)는 10 μg/mL로 2차 항체로서 사용되었다.
인간 CEACAM5에 대한 특이성을 보이고 이의 관련 단백질에는 그렇지 않은 클론을 1개 96웰 플레이트로 옮겼고 하이브리도마 상청액을 ELISA 어세이에서 특이성 및 교차 반응성에 대해 평가하였다. 이러한 어세이에서, 8G4 하이브리도마 클론 및 이의 서브클론은 인간 CEACAM5에 대한 특이성 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5에 대한 교차 반응성을 보였다.
1.3 항체 서열의 검출 및 클로닝
전체 RNA는 RNeasy 96 Protocol, Qiagen에 따라서 각 하이브리도마로부터 제조되었다. 이후에 전체 RNA는 Random Hexamers 및 SuperScriptⓒIII를 사용해 cDNA로 전사되었다.
최종 cDNA는 qPCR을 통해서 품질-제어되었고 VH 및 Vk는 PCR을 통해 증폭되었다. PCR 생산물은 KingFisher 장비와 조합하여 AMpure XP PCR 클린-업 키트를 사용해 정제되었다.
8G4 서브클론의 VH 및 Vk 유전자는 상동성 재조합 (소위 "Lucigen-Cloning")의 절차를 사용하여, 각각 목적 벡터 hi00_pTT5_VH_ccdB 및 hh00_pTT5_Vk_ccdB에 클로닝되었다. 반응 믹스는 One Shot® Mach1™-T1R 화학적 적격 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 올바르게 재조합된 클론은 Sanger 시퀀싱을 통해서 확인하였다.
1.4 히트의 인간화 및 생물학적 특징규명, 및 후보 선택
8G4 및 다른 클론은 재형식화하였고 인간 IgG1 분자로서 발현시켰다. 그들은 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 선택성, 친화성, 세포 결합 및 역가를 통해서 평가되었다. 결과를 기반으로, hu8G4로 명명된 하나의 인간화 후보 항체가 제조가능성 및 친화성을 개선시키기 위해 아미노산 서열 최적화에 선택되었다.
인간화 후보 항체 hu8G4의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00025
Figure pct00026
1.5 특히 mAb1을 유도하는 hu8G4에 대한 생물리학적 개선 전략
hu8G4의 가변 영역 서열의 평가는 경쇄 프레임워크에서 6개 비-배선 아미노산 잔기 및 중쇄 프레임워크에서 2개 비-배선 아미노산 잔기를 확인하였다. 번역후 변형, 예컨대 탈아미노화 모티프, 표면-접근가능한 메티오닌, 및 유리 시스테인이 잠재적으로 일어나기 쉬운 아미노산 및 서열 모티프의 평가는 책임이 증가된 임의의 아미노산 잔기를 확인하지 못하였다. 몇몇 디자인된 항체 서열은 일정 아미노산이 그 위치에서 배선-연관 아미노산으로 치환된 것이 생성되었다. 상이한 VH 및 VL 최적화 디자인은 이후 HEK 293 6E 세포에서 Fab 및 전체 IgG1 분자로서 공-배양되었고, 정제되고, 시험되었다 (예를 들어, 하기 최적화된 변이체 1-10 참조).
전체 IgG1 형식의 10개의 최적화된 항체 변이체의 아미노산 서열은 하기와 같았다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
모든 최적화된 변이체 1 내지 10은 크기 배제 크로마토그래피를 통한 응집체 백분율을 통해서 어세이되는 바와 같이 품질의 유지 측면에서 유사하게 수행되었고, FMTU (Fluorescence Monitored Thermal Unfolding)을 기반으로 안정성이 유지되었으며, MKN-45 암 세포주에 대한 결합을 보유하였고, 표적에 대한 선택성을 유지하였다. 변이체 8 (즉, VH1.02 및 VL1.02을 포함하는 변이체)은 특히 배선과 유사한 서열을 갖는 최적화된 변이체로서 추가 개발을 위해 선택되었다.
선택된 변이체 8의 추가 서열 최적화는 이후 특히 IgG Fc 이펙터 기능을 감소시키기 위해서 수행되었다. 부모 클론과 비교하여, so8G4 (본 명세서에서 mAb1이라고도 함)로 지정된, 결과적인 최종 서열-최적화된 (그러한) 클론은 개선된 친화성 및 개선된 제조가능성을 보이고, 또한, CEACAM5 및 FcRn에 대한 친화성은 유지하면서, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIa/복합체, C1q, FcγRIIb 및 FcγRIIIb에 대한 감소된 결합을 보이거나 전혀 결합을 보이지 않는다. 이러한 최종 서열-최적화된 항체 so8G4 (본 명세서에서 mAb1이라고도 함)의 서열은 다음과 같다:
중쇄 (HC): SEQ ID NO: 13 (상기 본 명세서에 정의된 바와 같음)
경쇄 (LC): SEQ ID NO: 14 (상기 본 명세서에 정의된 바와 같음)
1.6 mAb1의 시험관내 특징규명
항체 mAb1은 결합 친화성, 선택성, 및 내재화를 포함한 몇몇 성질에 대해서 시험관내 어세이로 특징규명되었다.
1.6.1 결합 친화성
. 포획된 표적 단백질 CEACAM5 (인간 또는 사이노몰거스 원숭이 마카카 파시쿨라리스)에 대한 가용성 항체 분석물의 결합 친화성을 결정하기 위해. 하기 실험 조건이 Octet Red 장비에서 사용되었다:
· 스트렙타비딘으로 코팅된 바이오센서.
. 바이오틴화된 표적 단백질 농도 (여기서, ECD는 세포외 도메인을 의미함):
。인간_CEACAM5_ECD-his-바이오틴 R&D 시스템 (통상의 방법을 사용해 바이오틴화됨)은 2.5 μg/mL로 900초 동안 1000 rpm에서 포획되었다.
。Syngene에서 수득된 재조합 마카카 파시쿨라리스 CEACAM5_ECD-His-바이오틴 (통상의 방법으로 바이오틴화됨)은 5 μg/mL로 900초 동안 1000rpm에서 포획되었다.
· 분석물 항체 농도: 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nM.
· 결합 친화성 KD (평형 해리 상수) 값은 Octet Evaluation 소프트웨어를 사용하여 측정된 결합 동역학 결합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수로부터 결정되었고, 여기서 KD = kd/ka이다.
· 항체는 Fab 형식으로 사용되었다.
mAb1로부터 생성된 Fab에 대한 결과:
인간 CEACAM5에 대한 결합 친화성 KD는 6.3 ± 1.98　nM이었다.
사이노몰거스_원숭이_CEACAM5에 대한 결합 친화성 KD는 14.1 ± 2.53　nM이었다.
1.6.2. 선택성
a) 종 및 도메인
mAb1에 대한 선택성 결정은 4 nM 내지 0.25 pM에서 항체를 적정하고, ELISA 어세이에서, 모두 Syngene에서 입수된, 1 μg/mL의 결합된 재조합 인간 (rh) CEACAM5 ECD 또는 이의 도메인 N-A1-B1, A2-B2, A3-B3 또는 결합된 재조합 마카카 파시쿨라리스 (mf) CEACAM5 ECD에 대해 적용하여서 수행되었다. 결과는 도 1에 도시되고, 하기에 요약하였다:
rhCEACAM5에 대한 결합 EC50은 153.4 pM이다.
rhA2-B2 도메인에 대한 결합 EC50은 166.9 pM이다.
mfCEACAM5에 대한 결합 EC50은 324.3 pM이다.
rhN-A1-B1 또는 rhA3-B3 또는 BSA (소 혈청 알부민, 음성 대조군으로서 제공)에 대한 결합은 검출되지 않았다.
b) 상이한 CEACAM 단백질
인간 CEACAM5 및 다른 인간 CEACAM 패밀리 구성원에 대한 mAb1의 Fab에 대한 선택성 결정은 ELISA 어세이에서 수행하였다. 단백질은 96-웰 어세이 플레이트에 코팅되었다: huCEACAM5-His6 (R&D Systems # 4128-CM), huCEACAM6-His6 (3934-CM R&D Systems, 및 재조합 단백질은 Syngene에서 수득), huCEACAM1-His6 (2244-CM R&D Systems), huCEACAM3-His6 (C449 Novoprotein), huCEACAM7-His6 (C926 Novoprotein), huCEACAM8-His6 (C583 Novoprotein), huPSG1-His6 (CC66 Novoprotein), 각 단백질은 12 nM 농도로 코팅되었다.
결과:
mAb1의 Fab는 인간 CEACAM5 (3.04 nM의 EC50)에 결합하였지만, 인간 CEACAM5와의 결합에 대한 EC50에 비해서 300배 초과로 더 높은 농도인 1000 nM의 mAb1의 Fab를 사용했을 때에도 ELISA 어세이에서 다른 인간 CEACAM 패밀리 구성원에 결합하지 않았다.
mAb1의 Fab는 또한 시험된 모든 농도에서, ELISA 어세이에서 미관련 단백질 (BSA)에 결합하지 않았다.
1.6.3 mAb1의 세포 결합
세포 상에서 이의 표적 단백질에 결합하는 항체의 능력은 표적 (예를 들어, 인간 CEACAM5)을 발현하는 세포 상에서 항체를 적정하고 세포의 형광 MFI를 측정하여 결정되었다. 항체 결합 비교를 위한 모델 세포는 인간 CEACAM5를 발현하는 MKN45 세포주를 비롯하여, mfCEACAM5를 발현하는 CHO 세포주였다. 적정은 10-지점 x4 희석으로 수행하였고, 곡선은 어세이 완충제 (1% BSA를 함유하는 PBSx1) 중 2000 nM 농도에서 출발하였다.
예시적인 데이터:
mAb1은 EC50 = 10.62 ± 1.6 nM으로 인간 CEACAM5-발현 MKN-45 세포주에 결합한다.
mAb1은 EC50 = 4.8 ± 0.6 nM으로 mfCEACAM5-발현 CHO 세포주에 결합한다.
1.6.4 기지 항체에 대한 세포 결합 비교
우리의 선두 항체 mAb1의 세포 결합은 CEACAM5를 발현하는 MKN45 세포주 상에서 ADC-관련된 기지 항체 huMab2-3 (기지의 ADC SAR408701에서와 같음) 및 hMN14 (본 명세서에서 hmn-14라고도 함) (기지의 ADC 라베투주맙 고비테칸 또는 IMMU-130에서와 같음)와 비교하였다.
하기 아미노산 서열은 하기 본 명세서에 기술된 실험에서 상기 언급된 기지 항체에 대해 사용되었다:
Figure pct00030
Figure pct00031
리툭시맙이 대조군으로서 비교에 포함되었다. 세포에 대한 항체 결합의 결과는 도 2에 도시되고, 하기에 요약된다:
mAb1 (so8G4) = 8.3nM
huMab2-3 = 6nM
hmn-14 = 11.8nM
몇몇 실험의 평균 (EC50):
mAb1 (so8G4) = 10.4nM ± 1.6nM (n=12)
huMab2-3 = 4.9nM ± 1.6nM (n=3)
hmn-14 = 16nM (n=2)
MKN45 세포주에 대한 항 CEACAM5 항체의 세포 결합은 mAb1 및 기지 항체의 결합이 유사하다는 것을 보여준다.
1.6.5 Cell Discoverer를 사용한 내재화 어세이
ADC의 관련 특징은 표적-발현 세포 및 리소솜으로 이의 내재화이고, 따라서, 내제화는 ADC의 일부로서 사용하려는 항체의 관련 성질이다. 후기 엔도솜 및 리소솜 (저 pH 소포체)으로 항체 내재화 속도는 여기 시에 6.0 보다 낮은 pH에서 강력한 형광을 방출하는 pH-민감성 염료 (pHrodo)로 항체를 직접 표지화하여 모니터링될 수 있다. 이러한 형광은 Cell-Discoverer7 (Zeiss) 상에서 이미지화하였고 내재화 속도를 계산할 수 있다.
몇몇 항체의 내재화 속도를 측정하기 위해서, MKN45 세포는 25,000 세포/웰로 96웰의 어두운, 편평 투명 바닥 플레이트 (Cellvis)에 파종하였다. 세포는 100 μl/웰의 RMPI-1640 + 10% FBS (Thermo)에서 밤새 배양하였다. 세포 배지를 제거하였고, 세포는 PBS x 1에 희석된 100 μl의 10 μg/mL Hoechst 염료를 사용해 15분 동안 실온 (RT)에 암실에서 염색되었다. 다음으로 세포는 PBS x 1로 2회 세척되었다.
항-CEACAM5 인간 IgG 항체 (so8G4 (즉, mAb1), humab2-3, hmn-14), 및 항-MerTK 항체 (Merck)는 pHrodo로 직접 표지되었고, 100 nM의 농도까지 페놀 레드가 없는 따뜻한 RPMI1640 + 10% FBS에 희석되었고, 그들 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트는 Cell Discoverer에 37℃, 5% CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션되었고, 하기 더욱 기술된 바와 같이 20분 마다 이미지를 획득하였다.
세포의 후기 엔도솜 및 리소솜으로 pHrodo 표지된 항체의 내재화는 567 nm 의 여기에서 형광 및 592/25 nm의 방출 검출기를 사용하여 Cell-Discoverer7 (Zeiss)에서 이미지화하였다. 세포 핵은 Hoechst로 표지하였고 385 nm의 여기 및 425/30 nm의 방출 검출기에서 이미지화하였다.
각 웰의 형광은 20시간 동안 20분 마다 기록하였다. 총합 세포 당 형광 강도 (SFI)의 분석은 Zen 소프트웨어 (ZEN3.1) 및 선형 회귀의 Excel 분석을 통해서 계산되었다.
결과는 도 3 및 도 4에 도시되고, 곡선의 선형 부분의 기울기 (도 4 참조)는 또한 하기 표에 요약된다:
Figure pct00032
결론:
1. so8G4 (mAb1)는 humab2-3 (18917±1416) 및 hmn-14 (22268±3060)에 비해서 더 높은 평균 결합 속도 (28958±766)를 갖는다.
2. so8G4 (mAb1)는 또한 humab2-3 및 hmn-14와 비교하여 더 높은 내재화 강도를 갖는다.
1.7 예를 들어, 약물-링커 화합물과의 접합에 사용을 위한, mAb1를 제조하는 예시적인 방법
항-CEACAM5 항체 mAb1은 재조합 CHO-K1Sv 세포주에서 생산하였다. 세포 배양물은 200 ℓ 일회용 생물반응기에서 배치식으로 수행되었다. 세포는 37℃에서 포도당이 보충된 독점 CHO 유가식 성장 배지에서 성장시켰다. 배양물은 접종 후 3일, 5일, 7일 및 10일에 독점 공급 성분의 혼합물이 공급되었다.
생물반응기 가동으로부터 미정제의 조건화된 배지는 3x1.1 ㎡　Millistak+ Pod DOHC (Millipore MD0HC10FS1) 및 1.1 ㎡ Millistak+ Pod XOHC (Millipore #MX0HC01 FS1) 필터를 사용해 청징화시켰고, 이후 Millipore Opticap XL3 0.5 / 0.2 μm 필터 (Millipore #KHGES03HH3)를 사용해 최종 여과하였다.
청징화 후에, 항체 mAb1은 단백질 A 포획 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 단계로 이루어진 표준 항체 정제 과정을 사용해 정제되었다. 항-CEACAM5 항체 mAb1은 ADC 분자의 생성을 위한 중간체로서 제공되었다.
1.8 mAb1의 인간/토끼 키메라 변이체의 발현 및 정제 및 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 세포주 및 인간 종양 조직에 대한 면역조직화학 (IHC)에서 이의 용도
mAb1의 인간/토끼 키메라 변이체는 통상의 재조합 방법으로 생성되었다. mAb1의 인간/토끼 키메라 변이체 (본 명세서에서 "rb8G4"라고도 함)는 하기 아미노산 서열을 가졌다:
Figure pct00033
rb8G4는 일시적 형질감염을 통해서 HEK 세포 (Expi 293 현탁 세포)에서 발현되었고, MabSelect SuRe 및 시트레이트 완충제를 사용하여 정제되었다. 다음으로, rb8G4는 포름알데히드 고정 파라핀 포메된 세포주 및 인간 종양 조직 상에서 IHC에 사용되었다:
재료 및 방법
세포주 및 조직
인간 암 세포주는 Merck 세포 은행에서 배양하였고, 4% 완충된 포름알데히드에 고정시키고, 파라핀 포매 (FFPE)하였다. 파라핀 포매된 세포주를 세포주 마이크로어레이 (CMA) (Zytomed)에 배열시켰다. 인간 장기를 사용한 조직 마이크로어레이 (TMA)의 FFPE 조직 절편은 amsbio (FDA 표준 조직 어레이, T8234701)로부터 유래하였다. FFPE 인간 종양 샘플은 BioIVT 및 Indivumed GmbH가 제공하였다.
방법
항-CEACAM-5 항체 rb8G4로 ICH 염색을 위해서, 포름알데히드 고정된 파라핀 포매(FFPE) 암 세포주 마이크로어레이 (CMA) 및 인간 종양 조직으로부터의 4 μm 의 절편을 하전된 슬라이드 (SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific or TOMO, Matsunami) 상에 고정시켰다. 염색 절차는 TDiscovery XT (Roche Diagnostics) 염색 플랫폼 상에서 수행되었다. 탈파라핀화 이후에, 절편은 Tris-EDTA 완충제 pH 8 (CC1, Roche Diagnostics) 중에서 에피토프 검색을 위해 가열되었다. 절편은 포스페이트-완충 염수 (PBS) 또는 항체 희석제 완충액 (DCS)에 0.5 또는 0.7 μg/mL로 희석된 1차 단일클론 항체 rb8G4와 인큐베이션되었다. 클론 DA1E (토끼 단일클론 IgG, NEB)는 이소타입 대조군 항체로서 제공되었다. 1차 항체는 HQ 항-토끼 IgG 검출 키트 (Roche Diagnostics)에 따라 사용하였다. 슬라이드는 헤마톡실린으로 대조 염색하였고, 수돗물로 세척하고, 탈수하고 나서, Entellan Neu (VWR) 영구 장착 매체의 유리 커버슬립 상에 장착하였다.
인간 장기 조직이 존재하는 CMA 및 TMA은 염색하였고, NanoZoomer (Hamamatsu)를 사용해 0.46 μm/픽셀의 해상도로 스캔하였다. 인간 종양 절편을 염색하였고, AxioScan.Z1 (Zeiss) 장치를 사용하여 0.44 μm/픽셀의 해상도에서 스캐닝하였다. CMA의 스캔은 이미지 분석 소프트웨어 HALO (Indica Labs, USA)를 사용해 분석하였다. 존재하는 항원의 양의 결정을 위해서, 양성 갈색 염색 영역은 생존 조직 영역의 백분율 영역으로서 계산하였다. 염색 (임의 단위)은 다음과 같이 계산되었다:
항체 염색 (AU) = %양성 조직 영역 * 갈색의 평균 광학 밀도 (OD는 0 내지 1 범위임). 항체 염색의 최대 값은 100 = 조직 영역의 100%는 검은색이다 (회색 척도 OD 값은 1임).
암 세포주의 CEACAM-5 mRNA 데이터는 Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; Broad Institute of MIT & Harvard)에서 수득되었다.
결과
암 세포주 및 인간 정상 조직에 대한 검증
항체 rb8G4는 FFPE 암 세포주에 대해서 세포질 및 원형질막에서 신호를 보였다 (도 5).
FFPE 조직/세포 상에서 항체 rb8G4의 특이성은 이들 세포주의 mRNA 발현 (CCLE 데이터세트)과 10개 암 세포주 상에서 염색 신호를 비교하여 확인하였다. r=0.88의 최종 Pearson 상관 계수는 항체 rb8G4 (SO8G4AB323라고도 함)가 FFPE 조직/세포 상에서 CEACAM-5 에피토프를 검출한 결과를 뒷받침한다 (도 6). 이러한 암 세포주 마이크로어레이 및 개별적으로 선택된 양성 및 음성 세포주는 인간 정상 및 종양 조직으로 염색 실행에서 대조군 매트릭스로서 제공되었다.
정상 인간 조직에서 항체 rb8G4에 의한 염색 (도 7)은 CEACAM-5 mRNA 발현과 일치 (도 8) (소스: http://www.proteinatlas.org/ENSG00000105388-CEACAM5/tissue)되어서, CEACAM-5에 대한 항체의 특이성을 더욱 뒷받침한다.
인간 종양 조직
항체 rb8G4는 직결장암 (도 9), 위암 (도 10), 식도암 (도 11), 및 비-소세포 폐암 (도 12)에 도시된 바와 같이, 몇몇 인간 종양 적응증에서 양성으로 염색되었다. 신호는 세포질 및 원형질막에 국재화된다.
1.9 mAb1 및 rb8G4를 사용한 유세포측정 및 웨스턴 블롯
mAb1, rb8G4 및 상업적으로 입수 가능한 항-CEACAM5 항체의 CEACAM5-양성 및 CEACAM5-음성 세포주에 대한 결합을 비교하였다.
사용된 방법: 5E5 내지 1E6 세포는 5　mL 폴리스티렌 튜브 중 BD FACSCanto II (BD Biosciences)를 사용한 유세포측정 분석에 사용되었다. 10　μg/mL 1차 항체 (mAb1, rb8G4, 마우스 단일클론 Agilent Dako #M7072 클론 #IL7) 및 개별적인 형광 표지된 2차 항체 (당나귀 항-인간 IgG Jackson-Dianova #709-116-149; 당나귀 항-마우스 IgG Jackson ImmunoResearch #715-116-150, 당나귀 항-토끼 IgG Jackson-Dianova #711-116-152)에 의한 염색은 50　μL 1% PBS/BSA에서 20분 내지 30분 동안 4℃에서 수행되었다. 염색 단계 사이에, 그리고 이후에, 세포는 3회 1% PBS/BSA로 세척되었고, 유세포측정 분석을 위해서, 500　μL 1% PBS/BSA (생존 세포 게이팅을 위해 0.2　μg/mL DAPI 포함)에 재현탁되었다. 데이터 평가를 위해서, FlowJo 소프트웨어 (BD Biosciences)가 사용되었다.
결과: mAb1 및 rb8G4는 CEACAM5-양성 세포주 단독에서 mRNA 발현 수준 데이터에 상응하는 결과를 보였다 (하기 표 1; MKN-45, NCI-H441). 대조적으로, 상업적 항체 경우에, 결합은 더 약하고 CEACAM5-high 세포주에 제한되었다 (하기 표 1; MKN-45). 결론적으로, mAb1 및 rb8G4는 CEACAM5-양성 암 세포를 특이적으로 검출하고 검출제로서 이용될 수 있다.
표 1. CEACAM5-양성 및 CEACAM5-음성 세포주에 대한 상이한 항체의 결합. 2차 항체 단독 대조군의 MFI로 나눈 개별 항체의 중앙 형광 강도 (MFI)의 지수가 세포주당 열거된다.
Figure pct00034
CEACAM5-양성 및 CEACAM5-음성 세포주 용해물에 대한 인간 mAb1 및 rb8G4의 결합은 또한 웨스턴 블롯으로 조사되었다.
사용된 방법: 웨스턴 블롯은 표준 프로토콜에 따라 수행되었다 (Sambrook, J. & Russell, D.W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 1, CSHL Press). SDS-PAGE에 이어서 막 습식 블롯팅을 위해서, BCA 키트 (Thermo Scientific, #23227)에 의해 정량된 RIPA 세포 용해물 중 15　μg 총 단백질이 레인 당 로딩되었다. MOPS 러닝 완충제 (Bio-Rad #1610788)를 사용한 Criterion XT 4-12% 겔 (Bio-Rad, #3450125)이 Criterion 전기영동 셀 (Bio-Rad, #1656001)에 사용되었다. 단백질의 전달은 퐁소 염색으로 수행되었다. 막은 0.5　μg/mL 내지 1　μg/mL 1차 (mAb1 또는 rb8G4) 및 2차 항체 (항-인간 IgG, Jackson ImmunoResearch #109-035-098 또는 항-토끼 IgG, CellSignaling #7074)를 사용한 염색이 수행되기 전 및 그 사이에 세척되었다. 염색 막은 Fusion FX 이미지화 시스템 (Vilber)을 사용해 ECL 검출 시약을 통해 가시화되었다.
결과는 도 13A 및 도 13B에 도시된다: 양쪽 항체는 고도로 글리코실화된 CEACAM5의 예상되는 이동 속도에 상응하는 비슷한 패턴으로 결합되었다. mAb1 (도 13A) 및 rb8G4 (도 13B)에 의한 CEACAM5 검출은 CEACAM5-양성 세포주에 특이적이었고, 강도는 mRNA 발현 수준과 상관있었다. 더 낮은 강도로 관찰된 2차 밴드는 이전에 기술된 잠재적인 제2 이소폼에 상응한다 (Hatakeyama et al.: Novel protein isoforms of carcinoembryonic antigen are secreted from pancreatic, gastric and colorectal cancer cells. BMC Research Notes 2013 6:381).
실시예 2: 글루쿠로니드-기반 링커를 사용한 약물-링커 화합물의 합성: 약물-링커 화합물 1 (DL1)
Figure pct00035
화합물 9 (본 명세서에서 약물-링커 화합물 1 (DL1)이라고도 함)에 대한 합성 경로.
화학 제조의 프로토콜
단계 1: 화합물 1
Figure pct00036
아세토니트릴 (83.00 ml; 10.00 V) 중 (2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-트리아세톡시-6-브로모-테트라히드로-피란-2-카르복실산 메틸 에스테르 (8.30 g; 20.90 mmol; 1.00 eq.) 및 4-히드록시-3-니트로-벤즈알데히드 (5.24 g; 31.35 mmol; 1.50 eq.)의 교반 용액에 은(I) 옥시드 (9.69 g; 41.80 mmol; 2.00 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 celite를 통해서 여과되었다. 여과물은 진공 하에 농축되어 고체를 얻었다. 고체는 EtOAc에 용해되었고, NaHCO3 의 10% 수용액으로 세척하여 과량의 4-히드록시-3-니트로-벤즈알데히드를 제거하였다. 유기층을 진공 하에 농축하여서 화합물 1 을 모래색 고체로서 얻었다.
수율: 9.0 g
수율 백분율: 89.1%
분석 데이터:
Figure pct00037
단계 2: 화합물 2
Figure pct00038
프로판-2-올 (33.00 ml; 3.67 V) 및 CHCl3 (167.00 ml; 18.56 V) 중 화합물 1 (9.00 g; 18.62 mmol; 1.00 eq.)의 교반 용액에 실리카 겔 60-120 (3.60 g; 112.09 mmol; 6.02 eq.)에 이어서, 소듐 소듐 보로하이드리드 (1.80 g; 46.55 mmol; 2.50 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 1시간 동안 RT에거 교반하였다. 완료 후에, 반응 혼합물은 냉각 H2O로 켄칭하였고 celite를 통해 여과하였다. 여과물은 디클로로메탄으로 추출하였고, Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 농축하여 화합물 2 를 회백색 분말로서 얻었다.
수율: 8.70 g
수율 백분율: 92.4%
분석 데이터
LCMS: 컬럼: ATLANTIS dC18 (50x4.6mm) 5 μm; 이동층 A: H2O: ACN (95:5) 중 0.1% HCOOH; B: ACN
RT (min): 2.05; M+H: 503.2, 순도: 96.6%
단계 3: 화합물 3
Figure pct00039
에틸 아세테이트 (100.00 ml; 11.49 V) 및 THF (100.00 ml; 11.49 V) 중 화합물 2 (8.70 g; 17.21 mmol; 1.00 eq.)의 교반 용액에 탄소 상 팔라듐 (10% w/w) (2.50 g; 2.35 mmol; 0.14 eq.)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 수소 분위기 하에서 3시간 동안 RT에서 교반하였다. 완료 후에, 반응 혼합물은 celite를 통해서 여과되었다. 용매는 진공 하에 농축되어서 화합물 3 을 회백색 고체로서 얻었다.
수율: 8.5 g
수율 백분율: 100%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: ATLANTIS dC18 (50x4.6mm) 5 μm; 이동층 A: H2O: ACN (95:5) 중 0.1% HCOOH; B: ACN
RT (min): 1.73; M+H: 456.10, 순도: 95.1%
단계 4: 화합물 4
Figure pct00040
DCM (250.00 ml; 25.00 V) 중 화합물 3 (10.00 g; 20.89 mmol; 1.00 eq.) 및 (9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-아세트산 (7.60 g; 25.06 mmol; 1.20 eq.)의 교반 용액에 0℃에서 2-에톡시-2H-퀴놀린-1-카르복실산 에틸 에스테르 (15.65 g; 62.66 mmol; 3.00 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 16시간 동안 RT에서 교반하였다. 완료 후에, 용매는 감압 하에 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물은 컬럼 크로마토그래피 (56% EtOAc:페트롤륨 에테르)를 통해 정제하여 순도 80%의 화합물을 얻었다. 화합물은 30% EtOAc 및 pet 에테르로 세척하여 더욱 정제하여서 화합물 4 를 백색 고체로서 얻었다.
수율: 8.5 g
수율 백분율: 50.7%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: ATLANTIS dC18 (50x4.6mm) 5 μm; 이동층 A: H2O: ACN (95:5) 중 0.1% HCOOH; B: ACN
RT (min): 3.03; M+H: 735.2, 순도: 81.9 %
단계 5: 화합물 5
Figure pct00041
0℃에서 THF (40.00 ml; 20.00 V) 중 화합물 4 (2.00 g; 2.49 mmol; 1.00 eq.)의 교반 용액에, 카본산 비스-(4-니트로-페닐) 에스테르 (3.06 g; 9.97 mmol; 4.00 eq.) 및 DIPEA (4.40 ml; 24.92 mmol; 10.00 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 RT에서 12시간 동안 교반하였다. 반응의 완료 후에, 반응 혼합물은 진공 하에 농축되었다. 미정제 생산물은 용리액으로서 pet 에테르/에틸 아세테이트 및 실리카 겔 (230-400)을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 화합물 5 을 연노란색 고체로서 얻었다.
수율: 2.0 g
수율 백분율: 84.6%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: X-Bridge C8(50X4.6) mm, 3.5μm; 이동층: A: MilliQ 물 중 0.1% TFA; B: ACN
RT (min): 3.24; M+H: 900.20, 순도: 94.9%
단계 6: 화합물 6
Figure pct00042
화합물 5 (1,369 g; 1,00 eq.)는 N,N-디메틸포름아미드 (15,00 ml)에 용해되었고, 엑사테칸 메실레이트 (679,7 mg; 1,00 eq.), 합성을 위한 4-메틸모르폴린 (0,422 ml; 3,00 eq.) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (172,8 mg; 1,00 eq.)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 밤새 교반되었다. 교반 시간 후에 반응 현탁액은 갈색 용액으로 변하였다. 반응은 LC-MS를 통해 모니터링하여서, 출발 물질의 완전한 전환을 확인하였다. 반응 혼합물은 RP 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 생산물을 함유하는 분획을 조합하였고, 진공 농축하고, 밤새 동결건조하여서 화합물 6 을 노란색 고체로서 얻었다.
수율: 1.59 g
수율 백분율: 87.5%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: Chromolith HR RP-18e (50-4,6 mm); 이동층 A: H2O 중 0.05% HCOOH; B: ACN 중 0.04% HCOOH 및 1% H2O; T: 40℃; 유속: 3,3 mL/분; MS: 100-2000, amu 양성; 1% ->100% B: 0 ->2,0분; 100% B: 2,0 ->2,5분.
RT (min): 1.95; M+H: 1196.40, 순도: 84.4%.
단계 7: 화합물 7
Figure pct00043
화합물 6 (1,586 g; 1,00 eq.)은 테트라히드로퓨란 (50,00 ml)에 용해하였고, LiOH (수 (67,100 ml) 중 리튬 히드록시드 수화물 (281,77 mg; 6,00 eq.) 함유)의 용액 (0.1M)을 0℃에서 적가하였다. pH 값은 첨가 동안 검토되었다. pH는 10을 넘어서는 안된다. LiOH의 용액의 첨가는 1.5 시간 후에 완료되었다. 반응을 LC-MS로 모니터링하여, 출발 물질의 완전한 전환을 확인하였다. 반응은 시트르산 용액으로 켄칭하였고, pH는 5로 조정되었다. 반응 혼합물은 감압 하에 농축되었다. 미정제물은 prep. HPLC를 통해 정제되었다. 생산물을 함유하는 분획을 조합하였고 동결건조하여서 화합물 7 을 진노란색 고체로서 얻었다.
수율: 728 mg
수율 백분율: 54.8%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: Chromolith HR RP-18e (50-4,6 mm); 이동층 A: H2O 중 0.05% HCOOH; B: ACN 중 0.04% HCOOH 및 1% H2O; T: 40℃; 유속: 3,3 mL/분; MS: 100-2000, amu 양성; 1% ->100% B: 0 ->2,0분; 100% B: 2,0 ->2,5분
RT (min): 1.68; M+H: 1056.30, 순도: 98.5%.
단계 8: 화합물 8
Figure pct00044
화합물 7 (728,000 mg; 1,00 eq.)은 N,N-디메틸포름아미드 (20,00 ml)에 용해하였다. 피페리딘 (136,513 μl; 2,00 eq.)을 첨가하였고, 용액을 RT에서 총 4시간 동안 교반하였다. 반응은 LC-MS로 모니터링하였고, 출발 물질의 완전한 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하였고 미정제 생성물은 RP 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 생산물을 함유하는 분획을 조합하였고, 용매는 부분적으로 제거하였으며, 밤새 동결건조하여 화합물 8 을 노란색 고체로서 얻었다.
수율: 706 mg
수율 백분율: 100%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: Chromolith HR RP-18e (50-4,6 mm); 이동층 A: H2O 중 0.05% HCOOH; B: ACN 중 0.04% HCOOH 및 1% H2O; T: 40℃; 유속: 3,3 mL/분; MS: 100-2000, amu 양성; 1% ->100% B: 0 ->2,0분; 100% B: 2,0 ->2,5분
RT (min): 1.22; M+H: 834.30, 순도: 97.6%.
단계 9: 화합물 9
Figure pct00045
디메틸포름아미드 (30,00 ml) 중 화합물 8 (854 mg; 1,00 eq.)의 용액에 N-에틸디이소프로필아민 (149,234 μl; 1,00 eq.) 및 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피온산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (233,61 mg; 1,00 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 RT에서 3시간 동안 교반되었다. 반응은 LC-MS로 모니터링되어, 출발 물질의 완전한 전환을 확인하였다. 반응 혼합물은 감압 하에 농축하였고, 미정제 생성물은 RP 플래시 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 생산물을 함유하는 분획을 조합하였고, 농축 및 동결건조하여서 91% 순도의 원하는 생성물을 얻었다. 이 물질은 다시 RP 크로마토그래피를 통해 정제하여 화합물 9 를 노란색 고체로서 얻었다.
수율: 580 mg
수율 백분율: 60.1%
분석 데이터:
LCMS: 컬럼: Chromolith HR RP-18e (50-4,6 mm); 이동층 A: H2O 중 0.05% HCOOH; B: ACN 중 0.04% HCOOH 및 1% H2O; T: 40℃; 유속: 3,3 mL/분; MS: 100-2000, amu 양성; 1% ->100% B: 0 ->2,0분; 100% B: 2,0 ->2,5분
RT (min): 1.38; M+H: 985.30, 순도: 90% (이성질체의 나머지 10%는 HPLC를 통해 제거될 수 있음)
Figure pct00046
Figure pct00047
실시예 3: 레구마인-절단가능한 링커를 사용한 약물-링커 화합물의 합성: 약물-링커 화합물 2 (DL2)
Figure pct00048
단계 1
{4-[(2S)-3-카바모일-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)프로판아미도]프로판아미도]프로판아미도]페닐}메틸 4-니트로페닐 카보네이트 (400 mg; 0,52 mmol; 1,00 eq.) [Levena Biopharma US에서 상업적으로 입수가능]를 N,N-디메틸포름아미드 (5,00 ml)에 희석하였다. 엑사테칸 메실레이트 (277,30 mg; 0,52 mmol; 1,00 eq.), N-에틸디이소프로필아민 (0,27 ml; 1,57 mmol; 3,00 eq.) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBT) (3,52 mg; 0,03 mmol; 0,05 eq.)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 밤새 교반되었다. LC/MS는 완전한 전환을 표시하였다.
미정제 반응 혼합물 HPLC를 통해 정제하고 동결건조하여서 365 mg (0.343 mmol)의 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-(((S)-4-아미노-1-((4-(((((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1,4-디옥소부탄-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)카바메이트를 산출하였다.
LC/MS: [M+H] = 1064.2
Prep HPLC:
컬럼: sunfire prep c18 obd - 75.0 g (250 bar)
용매 A : Wasser 0.1%TFA 용매 C:
용매 B : 아세토니트릴 0.1%TFA
Figure pct00049
단계 2
(9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-(((S)-4-아미노-1-((4-(((((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1,4-디옥소부탄-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)카바메이트 (365 mg; 0,34 mmol; 1,00 eq.)를 N,N-(4,00 ml)에 용해하였다. 합성을 위한 피페리딘 (0,07 ml; 0,69 mmol; 2,00 eq.)을 첨가하였고, 반응 용액을 rt에서 1시간 동안 교반하였다.
반응 혼합물은 prep HPLC 를 통해 정제하여 300 mg (0.314 mmol)의 4-((S)-4-아미노-2-((S)-2-((S)-2-아미노프로판아미도)프로판아미도)-4-옥소부탄아미도)벤질 ((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카바메이트를 산출하였다.
LC/MS: [M+H]: 841.3
정제를 위한 Prep HPLC:
RediSep 컬럼: C18 130g
SN: E0410A0D24BE1 Lot: 262118923W
유속: 75 mL/분
조건 - 부피: 390,0 ml
용리액: A1 물 0.1%TFA
용리액: B1 아세토니트릴 0.1%TFA
Figure pct00050
단계 3
N,N-디메틸포름아미드 (20 ml) 중 4-((S)-4-아미노-2-((S)-2-((S)-2-아미노프로판아미도)프로판아미도)-4-옥소부탄아미도)벤질 ((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카바메이트 (571mg; 0,60 mmol; 1,00 aq.)의 용액에 N-에틸디이소프로필아민 (203 μl; 1,20 mmol; 2,00 eq.) 및 N-숙신이미딜 3-말레이미도프로피오네이트 (162 mg; 0,60 mmol; 1,00 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 10분 동안 교반하였고, LC/MS를 통해 모니터링하였다.
반응 혼합물은 prep HPLC를 통해 정제하여 378 mg (0.35 mmol)의 DL2를 산출하였다.
LC/MS: [M+H]: 992.4
정제용 Prep HPLC:
RediSep 컬럼: C18 86g
SN: E0410A8B46130 Lot: 281729189W
유속: 60 mL/분
조건 - 부피: 264,0 ml
용리액 1: A1 물 0.1%TFA
용리액 2: B1 아세토니트릴 0.1%TFA
서열에 대한 분석:
방법 정보: A: H2O + 0,05% HCOOH | B: MeCN + 0,04% HCOOH + 1% H2O
T: 40℃ | 유속: 3,3 mL/분 | MS: 100-2000 amu 양성
컬럼: Chromolith HR RP-18e 50-4,6 mm
0% -> 100% B: 0 -> 2,0분 | 100% B: 2,0 -> 2,5분
실시예 4: 면역접합체의 제조: mAb1의 글루쿠로니드-기반 접합체 (ADC1이라고 함)
4.1 접합 과정
항체 제조
항체 mAb1 (상기 본 명세서에 정의된 바와 같음)는 접합 전에 최대 3일 까지 2 - 8℃에서 해동하였고, 사용까지 2 - 8℃에 저장하였다. mAb (> 10 g)는 사용 전 접합 당일에 실온에서 평형화되었다. mAb (9.6 mg/mL)를 분취 (10.0 g, 1041.7 mL)하였고, 접합 완충액 (200 mM 히스티딘, pH 6.5)을 사용해 5.59 mg/mL로 희석하였다. mAb 용액은 3 L Chemglass 자켓형 반응기에 첨가하였고, 50 rpm으로 교반하면서 25 ± 2℃로 설정하였다.
항체의 환원
7.0 mol eq. (9.7 mL)의 50 mM TCEP 용액 (접합 완충액 중 50 mM TCEP )을 mAb 용액 바이알에 첨가하고 반응이 3시간 동안 25 ± 2℃에서 진행되도록 하였다.
접합
화학식 (X) 의 약물-링커 화합물 1 (DL1)을 칭량하였고 DMSO에 용해하여서 20 mM 용액을 제조하였다. 90% (148.6 mL)의 필요한 DMSO를 반응기에 첨가하였다. DMSO 첨가 직후에, 10.0 mol 당량 (38.2 mL)의 20 mM 약물-링커 용액을 반응기에 첨가하였다. 다음으로, 나머지 필요한 DMSO의 10% (18.2 mL)를 사용하여 약물-링커 바이알을 세정하여서 전체 전달을 보장하였다. 최종 첨가 후에, 반응은 1시간 동안 25 ± 2℃에서 진행되도록 하였다. 접합 동안 총 부피는 1997.0 mL이었다.
주: 반응의 전체 DMSO 농도는 10% (v/v) (DMSO + 약물 링커 용액)이었다.
켄칭
35 mol eq. (48.5 mL)의 50 mM NAC를 반응기에 첨가하였고 반응이 30분 동안 25 ± 2℃에서 진행되도록 하였다.
여과
여과된 미정제 접합 용액을 반응기로부터 옮긴 다음에 Millipak Gamma Gold 60 (MPGL06GH2)를 사용해 여과하여서 1993.6 mL (필터 로드: 324.7 g/m2 [단백질], 66.5 L/m2 [용액])의 여과된 미정제 접합체를 얻었다.
정용여과
여과된 미정제 접합체 용액은 Pellicon 3 (30 kDa) Biomax 막 (1 x 0.11 m2, 300 LMH (550 mL/분), 16 psi TMP, 실제 로딩 88.5 g/m2)을 사용해 완충액 교환하였다 (DV= 1993.6 mL). 정용여과 완충액 (10 mM 히스티딘, pH 5.5)을 사용하여 16 투석부피로 미정제 접합체를 완충액 교환하였다. 완충액 교환 후에, 용액은 ≥ 25 mg/mL로 농축하였고, 병으로 옮기고, 막을 정용여과 완충액으로 플러싱하였다. UF/DF로부터 회수된 총 부피는 361.5 mL이었다.
제제
농축된 ADC (즉, ADC1)는 20.0 mg/mL 까지 112.1 mL의 정용여과 완충액 (10 mM 히스티딘, pH 5.5)을 사용해 희석하였다. 최종 용액은 15.0 mg/mL의 최종 표적 대량 약물 물질 (BDS)을 위해 15.0 mg/mL 까지 157.6 mL의 4X 제제 완충제 (10 mM 히스티딘, 12% (w/v) 트레할로스 이수화물, 400 mM NaCl, pH 5.5)를 사용하여 희석하였다.
여과
최종 제제화된 ADC는 0.2 μm Millipak Gamma Gold 40 (MPGL04GH2) 필터를 사용해 여과하여 619.6 mL (필터 로드: 464.6 g/m2 [단백질], 31.0 L/m2 [용액])의 ADC1 BDS를 산출하였다. 물질은 HDPE 병에 포장하였고, ≤ -65℃에 저장하였다.
4.2 방법: 약물 물질 특징규명: ADC1
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 방법
SEC 방법 매개변수
파장 280 nm
컬럼 Tosoh TSKgel 7.8 mm x 300 mm, 5 μm (P/N 0008541)
이동층 0.14 M 포타슘 포스페이트 일염기성
50 mM 소듐 포스페이트 일염기성
0.06 M 포타슘 포스페이트 이염기성
0.25 M 포타슘 클로라이드
5% IPA
주입 부피 20 μL
온도 25℃
유속 0.5 mL/분
실행 시간 30분
원액 mAb, UF 후 접합체 및 최종 BDS의 순도를 표시한 전형적인 SEC 크로마토그램: 도 14.
상기 표시된 BDS 물질 경우에, 1.7% HMWS 및 96.9%의 단량체 순도가 기록되었다.
역상 HPLC (RP HPLC) 방법
RP HPLC 방법 매개변수
파장 280 nm
컬럼 PLRP-S 1000 Å (50 x 2.1 mm, 8 μm) 컬럼, Agilent (P/N PL1912-1802)
이동층 A 수 중 0.1% 포름산과 0.01% TFA
이동층 B ACN 중 0.1% 포름산과 0.01% TFA
구배
Figure pct00051
주입 부피 10 μL
컬럼 온도 80℃
유속 1.0 mL/분
실행 시간 30분
샘플 제조 샘플을 2 mg/mL로 희석하였고, 40 μL를 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하였다. 60 μL의 ∼8 M 구아니딘 HCl, ∼130 mM Tris, ∼1mM EDTA, pH 7.6 완충제를 첨가하였다. 2 μL의 500 mM DTT를 첨가하였고, 와류하여 혼합하였다. 샘플을 30 ± 2분 동안 37 ± 2℃에서 인큐베이션하였다.
경쇄 및 중쇄의 분리를 보여주는 전형적인 RP-HPLC 크로마토그램: 도 15. 크로마토그램은 원액 mAb, 미정제 ADC 및 최종 BDS의 중첩을 보여준다.
상기 ADC1 BDS 물질 경우에, 7.9의 DAR이 기록되었다.
자유-약물 방법
자유-약물 방법 매개변수
파장 254 nm
컬럼 Phenomenex Gemini, C18, 2 x 150 mm, 3 μm (P/N 00F-4439-B0)
이동층 A 수 중 0.1% 포름산
이동층 B 아세토니트릴 중 0.1% 포름산
구배
Figure pct00052
주입 부피 10.00 μL
컬럼 온도 50℃
유속 0.75 mL/분
샘플 제조 단백질 액적: 100 μL의 약물 물질 + 250 μL의 냉 MeOH + 50 μL의 3 M MgCl2. 20,000 rpm에서 10분간 스핀다운한다.
표준 제조 20 μL의 20 mM DL1 (DMSO 중 약물-링커 화합물 1) + 20 μL DMSO + 40 μL MeOH + 20 μL의 200 mM NAC를 정용여과 완충액에 혼합한다. 밤새 인큐베이션하여 4 mM DL-NAC를 제공한다. 4 mM DL-NAC를 MeOH에 희석하여 4 μM DL-NAC 표준을 얻는다.
NAC 표준 및 최종 BDS의 자유-약물 수준을 보여주는 전형적인 크로마토그램: 도 16.
상기 표시된 ADC1 BDS 물질 경우에, 2.4% (몰 비율에 의함) 미만의 잔류 자유-약물 수준이 기록되었다.
실시예 5: 면역접합체의 제조: mAb1의 펩티드-기반 접합체 (ADC2라고 함)
5.1 접합 과정
항체 제조
항체 mAb1 (상기 본 명세서에 정의된 바와 같음)는 접합 전에 최대 3일까지 2 - 8℃에서 해동하였고 사용까지 2 - 8℃에 저장하였다. mAb (> 9.5 g)는 사용 전에 접합 당일에 실온에서 평형화하였다. mAb (9.6 mg/mL)는 분취 (9.5 g, 989.6 mL)하였고, 5.59 mg/mL 까지 접합 완충액 (200 mM 히스티딘, pH 6.5)으로 희석하였다. mAb 용액을 3 L Chemglass 자켓형 반응기에 첨가하였고, 50 rpm에서 교반하면서 25 ± 2℃로 설정하였다.
항체의 환원
8.0 mol eq. (10.5 mL)의 50 mM TCEP 용액 (접합 완충액 중 50 mM TCEP)을 mAb 용액 바이알에 첨가하였고, 반응이 3시간 동안 25 ± 2℃에서 진행되도록 하였다.
정용여과
환원된 mAb 용액은 Pellicon 3 (30 kDa) Biomax 막 (1 x 0.11 m2, 300 LMH (550 mL/분), 16 psi TMP, 실제 로딩 86.3 g/m2을 사용하여 6 DV (DV= 1706.9 mL)에 대해 완충액 교환하였다. 접합 완충액 (200 mM 히스티딘, pH 6.5)을 사용하여 환원된 항체를 완충액 교환하였다. 완충액 교환 후에, 감소된 mAb 용액은 반응기로 다시 회수하였고 막은 접합 완충액으로 플러싱하였다.
접합
화학식 (XI) 의 약물-링커 화합물 2 (DL2)를 칭랑하였고 DMSO에 용해하여서 20 mM 약물-링커 용액을 제조하였다. 필요한 DMSO의 90% (142.6 mL)를 반응기에 첨가하였다. DMSO 첨가 직후에, 9.5 mol 당량 (31.2 mL)의 20 mM 약물-링커 용액을 반응기에 첨가하였다. 다음으로, 잔류 필요 DMASO 중 10% (15.8 mL)를 사용하여 약물-링커 바이알을 세정하여 전체 전달을 보장하였다. 최종 첨가 후에, 반응은 2시간 동안 25 ± 2℃에서 진행되도록 하였다. 접합 반응 동안 전체 부피는 1894.5 mL이었다.
켄칭
35 mol eq. (46 mL)의 50 mM NAC를 반응기에 첨가하였고, 반응은 45분 동안 25 ± 2℃에서 진행되도록 하였다.
여과
미정제 접합체 용액을 반응기로부터 옮기고 Millipak Gamma Gold 60 (MPGL06GH2)을 사용해 여과하여 1897.3 mL (필터 로드: 308.9 g/m2 [단백질], 63.2 L/m2 [용액])의 여과된 미정제 접합체를 얻었다.
정용여과
여과된 미정제 접합체 용액은 Pellicon 3 (30 kDa) Biomax 막 (1 x 0.11 m2, 300 LMH (550 mL/분), 16 psi TMP, 실제 로딩 84.2 g/m2)을 사용해 완충액 교환하였다 (DV = 1897.3 mL). 초기 12 DV를 접합 완충액 (200 mM 히스티딘, pH 6.5)을 사용해 수행한 다음에 8 추가 DV로 표준 정용여과 완충액 (10 mM 히스티딘, pH 5.5)으로 교환하였다. 완충액을 완충액 교환 완료 후에, 용액을 ≥ 25 mg/mL 까지 농축하였고, 병으로 옮기고, 정용여과 완충액으로 막을 플러싱하였다. UF/DF로부터 회수된 전체 풀링된 부피는 335.7 mL이었다.
제제
농축된 ADC (즉, ADC2)는 20.0 mg/mL 까지 84.7 mL의 정용여과 완충액 (10mM 히스티딘, pH 5.5)으로 희석하였다. 최종 용액은 15.0 mg/mL의 최종 표적 BDS 농도를 위해 138.6 mL의 4X 제제 완충액 (10 mM 히스티딘, 12% (w/v) 트레할로스 이수화물, 400 mM NaCl, pH 5.5)으로 희석하였다.
여과
최종 제제화된 ADC는 Millipak Gamma Gold 60 (MPGL06GH2)을 사용해 무균적으로 여과하여 549.3 mL (필터 로드: 411.4 g/m2 [단백질], 27.5 L/m2 [용액])의 ADC2 BDS를 산출하였다. 물질은 HDPE 병에 포장하였고 ≤ -65°C에 저장하였다.
5.2 방법: 약물 물질 특징규명: ADC2
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 방법
SEC 방법 매개변수
파장 280 nm
컬럼 Tosoh TSKgel 7.8 mm x 300 mm, 5 μm (P/N 0008541)
이동층 50 mM 소듐 포스페이트 일염기성
0.4 M 소듐 퍼클로레이트
pH 6.3
주입 부피 1 μL
컬럼 온도 25℃
유속 0.5 mL/분
실행 시간 30분
원액 mAb 및 최종 BDS의 순도를 보여주는 전형적인 SEC 크로마토그램: 도 17.
상기 도시된 ADC2 BDS 물질 경우에, 4.2% HMWS 및 95.8%의 단량체 순도가 기록되었다.
역상 HPLC (RP HPLC) 방법
RP HPLC 방법 매개변수
파장 280 nm
컬럼 PLRP-S 1000 Å (50 x 2.1 mm, 8 μm) 컬럼, Agilent (P/N PL1912-1802)
이동층 A 수 중 0.1% 포름산과 0.01% TFA
이동층 B ACN 중 0.1% 포름산과 0.01% TFA
구배
Figure pct00053
주입 부피 10 μL
컬럼 온도 80℃
유속 1.0 mL/분
실행 시간 30분
샘플 제조 샘플을 2 mg/mL로 희석하고 40 μL을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가한다. 60 μL의 ∼8 M 구아니딘 HCl, ∼130 mM Tris, ∼1 mM EDTA, pH 7.6 완충제를 첨가한다. 2 μL의 500 mM DTT를 첨가하고 와류시켜 혼합한다. 샘플을 30 ± 2분 동안 37 ± 2℃에서 인큐베이션시킨다.
경쇄 및 중쇄의 분리를 보여주는 전형적인 RP-HPLC 크로마토그램: 도 18. 크로마토그램은 원액 mAb 및 최종 BDS의 중첩을 보여준다.
상기 ADC2 BDS 물질 경우에, 7.6의 DAR이 기록되었다.
자유-약물 방법
자유-약물 방법 매개변수
파장 254 nm
컬럼 Phenomenex Gemini, C18, 2 x 150 mm, 3 μm (P/N 00F-4439-B0)
이동층 A 수 중 0.1% 포름산
이동층 B 아세토니트릴 중 0.1% 포름산
구배
Figure pct00054
주입 부피 10.00 μL
컬럼 온도 50℃
유속 0.75 mL/분
샘플 제조 단백질 액적: 100 μL의 약물 물질 + 250 μL의 냉 MeOH + 50 μL의 3 M MgCl2. 20,000 rpm에서 10분 동안 스핀다운한다.
표준 제제 20 μL의 20 mM DL2 (DMSO 중 약물-링커 화합물 2) + 20 μL DMSO + 40 μL MeOH + 20 μL의 200 mM NAC를 정용여과 완충액에서 혼합한다. 밤새 인큐베이션하여 4 mM DL-NAC를 얻는다. 4 mM DL-NAC를 MeOH에 희석하여 4 μM DL-NAC 표준을 얻는다.
NAC 표준 및 최종 BDS의 자유-약물 수준을 보여주는 전형적인 크로마토그램: 도 19.
상기 표시된 ADC2 BDS 물질 경우에, 1.9% (몰 비율에 의함) 미만의 잔류 정ㅍ-약물 수준이 기록되었다.
실시예 6: ADC SAR408701의 유사체
6.1 항체
추가 비교 실험의 목적을 위해서, Sanofi의 항-CEACAM5 ADC SAR408701의 유사체를 하기 서열을 갖는 단일클론 항체를 기반으로 제조하였다:
중쇄: SEQ ID NO: 25
경쇄: SEQ ID NO: 26
6.2 약물-링커 화합물
상기 언급된 항체에 접합시키려는 약물-링커 분자로서, SPDB-DM4 (Levena Biopharma에서 수득)가 사용되었다:
제품명: SPDB-DM4
구조:
Figure pct00055
예상 질량: 994.35
관측 평균 질량: 995.5 (Ms+H+)
질량 스펙트럼 분석: 일관되고, 정확한 MW를 보임
HPLC 분석: 순도 > 95%
외관: 백색 분말
6.3 접합
항체는 접합 전에 최대 3일까지 2 - 8℃에서 해동시켰고, 사용까지 2 - 8℃에 저장하였다. 항체 (175 mg)는 사용 전에 접합 당일에 실온에서 평형화되었다. 항체 (7.9 mg/mL)는 5 mg/mL 까지 접합 완충액 (PBS pH 7.4) 및 SPDB-DM4 (Levena Biopharma)의 5 mM DMSO 용액 (항체에 대해 8 mol 당량)을 사용해 희석되었다. 반응 용액을 혼합하고 4시간 동안 25℃에서 인큐베이션하였다.
6.4 분취용 크기 배제 크로마토그래피, 탈염 및 여과
반응 혼합물은 분취용 크기-배제 크로마토그래피를 사용해 정제되었다. Superdex 200　pg (50/60) 컬럼을 Akta Avant 25 시스템 (GE Healthcare)에 연결하였고 제조사 설명서에 따라서 PBS pH 7.4로 평형화시켰다. 후속하여, 반응 혼합물을 주입하였고, 10 mL/분의 유속 및 러닝 완충액으로서 PBS pH 7.4를 사용하여 컬럼을 통해 흘려주었다. ADC 함유 분획은 280 nm에서 UV 광 흡수를 통해 결정하였고, 풀링하였고 농축하였다. ADC 물질은 제조사 설명서에 따라서 15 ml Amicon Ultra 50 kDa 컷오프 원심분리 장치 (Merck Millipore)를 사용해 농축하였다. 농축된 ADC 물질은 제조사 설명서에 따라서 Akta Avant 25 시스템 (GE Healthcare) 상에서 10　mL/분의 유속으로 HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 제제 완충액 (10 mM 히스티딘, 130 mM 글리신, 5% 수크로스. pH 5.5)으로 옮겼다. 최종 ADC 물질은 0.2 μm 필터 (Merck Millipore)를 사용해 여과하고, 분취하고 원액을 액체 질소에 냉동시켰다. ADC 물질의 최종 농도는 5.82 mg/ml 이었고, 물질은 추가 사용까지 -80℃에 유지시켰다. 이러한 작업으로 얻은 ADC는 또한 본 명세서에서 "ADC SAR DM4" 또는, 간략하게, "ADC SAR"이라고 하고; 이러한 ADC는 SAR408701의 유사체이다.
실시예 7: mAb1 및 SPDB-DM4 기반 ADC
다른 ADC는 항체 mAb1 (상기 본 명세서에 기술된 바와 같음) 및 약물-링커 화합물 SPDB-DM4, 즉, 상기 기술된 ADC SAR DM4와 동일한 약물-링커 화합물을 기반으로 제조하였다. 이러한 작업으로 얻은 ADC는 본 명세서에서 "ADC mAb1 DM4"라고 하고 하기와 같이 제조되었다:
7.1 사용된 물질:
. 항체: mAb1, 10 mM HEPES, pH 5.8 중 1 mg/mL
. 접합 완충액: 10 mM HEPES, pH 5.8
. 약물-링커 화합물: SPDB-DM4, DMF 중 2 mg/mL
7.2 방법:
. 접합: 약 30배 몰 과량의 약물-링커 분자가 접합에 사용되었고 (75 mL 항체 + 7.1 mL SPDB-DM4 약물-링커), 실온에서 5시간 동안 서서히 흔들면서 인큐베이션하였다.
. 정제: ADC는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0으로 완충액 교체하여 자유 약물을 제거하였다.
. 제제 완충액: 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0
7.3 정제된 ADC 분석 상세사항:
. 최종 수율: 40 mg
. 농도: 2.2 mg/mL
. DAR: 4.4
실시예 8: ADC1 및 ADC2로부터 약물 방출의 특징규명
8.1 재료 및 방법
8.1.1 시험 물품
Figure pct00056
8.1.2 재료
모든 시약 및 완충액은 제조사 설명서에 따라서 저장하였고 배치 유효 기간 전에 사용되었다.
Figure pct00057
8.1.3 장비
Figure pct00058
8.1.4 절차
8.1.4.1 혈청 샘플 제조
2 M HEPES 용액: 52.1 g HEPES를 75 mL MiliQ-물 및 15 mL HCl 25%에 용해하였고, pH 7.55로 조정하고, 최대 100 mL 까지 첨가하였다. 이러한 용액을 15% v/v 로서 혈청과 혼합하여 pH 7.3 - 7.4로 안정화된 혈청을 수득하였다. Biowest의 인간 혈청 (Lot.no. S15594S4200)을 해동하였다. 100 mL 혈청을 15 mL 2 M HEPES 완충액과 혼합하였다. Biowest의 마우스 혈청 (Lot.no. S18169S2160)을 해동하였다. 100 mL 혈청을 15 mL 2 M HEPES 완충액과 혼합하였다. 사이노몰거스 혈청을 해동하였고 8.5 mL 혈청을 1.5 mL 2 M HEPES 완충액과 혼합하였다. pH를 측정하였고 (7.37), 혈청을 멸균 여과하였다. 2 mL 분취액을 -20℃에 냉동하였다.
제조된 혈청은 RT에서 해동하였다. 바람직한 ADC 단백질 농도는 LC-MS를 통해 후속 자유 페이로드 분석을 위해서 180 μg/mL으로 삼중으로 제조하였다. ADC를 혈청에 첨가한 후에, 개별 배치를 혼합하였고 20 μL 분취액으로 분리하였다. 추가로, 각각의 ADC에 대해 20 μL가 존재하는 1개 96시간 샘플을 파이펫팅하였고, 회수율을 측정하기 위해 전체 작업 분석에 사용하였다. 0시 샘플은 -80℃에 직접 냉동시켰고, 나머지 샘플은 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였고, 반응은 -80℃에 저장을 통해서 2/ 4/ 6/ 24/ 48/ 72, 96시간 인큐베이션에서 중지하였다.
8.1.4.2 인간 간 리소솜 샘플 제조
pH는 어세이 완충액을 사용해 pH 5.0 또는 pH 4.0으로 조정하였다. 리소솜 안정성 조제물: 80 μL 인간 간 리소솜은 ADC1에 대해 표시된 예시처럼 삼중 측정을 위해 제조되었다 (n=3): 2.76 μL ADC1 + 6 μL 인간 간 리소솜 + 71.2 μL 레구마인 어세이 완충제. MeOH + PIC (1:200)의 제조: 10μL PIC III + 1990 μL MeOH. 반응은 37℃로 예열된 Thermomix에 에펜도르프 튜브를 옮길 때 시작되었다. 후속하여, 10 μL 분취액은 0, 1, 2, 4, 24 및 48시간 후에 채취하였고 40μL PIC III (1:200)과 혼합하였다.
8.2 결과
인간, 마우스 및 사이노몰거스 혈청에 대한 ADC 안정성 (도 20). 접합된 엑사테칸 농도는 자유 엑사테칸 (정규화된 데이터)을 사용해 계산되었다 (초기 용량 ∼10 μM). 유사한 프로파일이 인간, 사이노몰거스 및 마우스 혈청에 대해 수득되었다. 오직 미미한 탄소 방출만이 관찰되었고, ADC2 (96시간에 초기 접합 페이로드의 5.9% 유리됨) 및 ADC1 (1.4%)에 대해 마우스 혈청에서 가장 현저하였다.
마우스 혈청 및 완충액에 대한 ADC3 대조군 안정성 (도 21). 접합된 SN38 농도는 자유 SN38 (비정규화)을 사용해 계산되었다 (초기 용량 50 μg/mL ADC 단백질 농도). 양쪽 매트릭스 경우에, 현저한 SN-38 방출이 관찰되었다.
인간 간 리소솜 (pH 5.0)에서 ADC1 및 ADC2에 대한 페이로드 유리 프로파일 (도 22). 접합된 약물 농도는 예를 들어, 자유 엑사테칸 (초기 농도 ∼10 μM 엑사테칸), 정규화된 데이터를 사용해 계산되었다. 중간 수준의 페이로드 방출이 ADC1- 및 ADC2-절단 매개 페이로드 유리 (둘 모두 초기 전체 접합 페이로드의 ∼40%)에 대해 관찰되었다.
ADC 이화산물 프로파일링은 리소솜 방출 생산물로서 자유 엑사테칸을 확인하였다 (도 23). 주요 방출 생산물로서 엑사테칸을 확인하기 위해서, ADC1 이화산물 프로파일링 연구가 인간 리소솜 추출물에서 수행되었다. 이때, 다양한 시점에 TIC-MS 및 추출된 이온 크로마토그램의 비교는 예상되는 엑사테칸 이화산물이 이후에 인큐베이션 동안 (0시, 4시, 24시) ADC1로부터 방출되었다는 것을 보여주었다. 검출된 이화산물의 9.33분 체류 시간, 검출된 질량 m/z 436.1671 ([M+H]+, C24H23O4N4 F) 및 MS/MS 스펙트럼은 엑사테칸의 것과 일치된다.
실시예 9: ADC1 및 ADC2는 높은 역가로 시험관내에서 암 세포를 특이적으로 사멸시킨다
인간 암 세포주는 암 세포를 사멸시키는 ADC1 및 ADC2의 잠재성을 평가하는데 사용되었다. ADC1 및 ADC2는 상이한 CEACAM5-양성 세포주에 대해 나노몰 이하의 시험관내 역가 및 CEACAM5-음성 세포주에 대해 미미한 효과를 보였다 (하기 표 2). 예시적인 용량-반응 곡선 (도 24A/B)에 도시된 바와 같이, ADC1 및 ADC2는 CEACAM5-양성 세포주 SK-CO-1 및 SNU-16에 대해 매우 강력하였다. 대조적으로, 항원-음성 MDA-MB-231에 대한 ADC1 및 ADC2의 효과는 시험된 최고 농도에 제한되었다 (도 24C).
ADC1 및 ADC2와 동일한 링커 페이로드를 이용하는 이소타입 대조군 ADC는 SK-CO-1 세포주에 대해서 훨씬 더 낮은 효과를 보였다 (도 25).
결론적으로, ADC1 및 ADC2는 CEACAM5를 발현하는 인간 암 세포주를 시험관내에서 높은 역가로 특이적으로 사멸시킨다.
표 2. 다수 인간 세포주에 대한 ADC1, ADC2 및 자유 페이로드의 역가. 최고 시험 화합물 농도에서 미처치 대조군과 비교한 최대 효과는 괄호 안에 표시된다. 각 세포주에 대해서, CEACAM5 발현을 표시한다.
Figure pct00059
방법 - 생존능 어세이:
암 세포주에 대한 ADC의 세포독성 효과는 세포 생존능 어세이를 통해 측정되었다. 세포는 처치 전 날에 90　μL의 부피로 96-웰 플레이트에 파종되었다. 시험 화합물 (ADC 또는 자유 페이로드)은 세포 배양 배지에서 출발 농도의 10배에서 제제화되었다. 시험 화합물은 연속 희석되었고 (1:4), 각 희석물의 10　μL는 삼중으로 세포에 첨가되었다. 플레이트는 6일 동안 37℃에 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션되었다. 세포 생존능 측정을 위해서, Cell Titer-Glo® 시약 (Promega™ Corp, Madison, WI)이 각 웰에 첨가되었고, 플레이트는 제조사 설명서에 따라서 처치되었다. 발광 신호는 Varioskan 플레이트 판독기 (Thermo Fisher)를 사용해 측정되었다. 발광 판독치는 미처치 세포에 대한 % 생존능으로 전환되었다. 데이터는 log (억제제) vs. 반응, 가변 기울기, GraphPad Prism을 사용한 4-매개변수 적합 방정식을 사용하여, 비-선형 회귀 분석으로 적합화하였다. 데이터는 % 상대 세포 생존능 vs. 화합물 몰 농도로서 표시되고, 오차 막대는 삼중물의 표준 편차 (SD)를 표시한다. 다수 실험으로부터 유래된 IC50의 기하 평균 값을 계산하였다.
상기와 동일한 방법을 사용하여, ADC1 및 ADC2는 또한 항원-양성 SK-CO-1 및 항원-음성 MDA-MB-231 세포주에 대한 그들 세포독성 효과 관점에서 ADC SAR DM4와 비교하였다. ADC1 및 ADC2는 각각 SK-CO-1 암 세포에 대해서 ADC SAR DM4에 비해 2.9배 및 2.7배 더 높은 역가를 보였다 (도 26A). 항원-음성 MDA-MB-231에 대한 비-특이적 효과는 ADC1 및 ADC2와 비교하여 ADC SAR DM4에 대해 약간 더 높았다 (도 26B). ADC SAR DM4 및 ADC mAb1 DM4는 ADC mAb1 DM4의 더 높은 역가에 대한 약간의 경향과 함께, SK-CO-1에 대해 비슷한 역가를 보였다 (도 26A).
실시예 10: ADC1 및 ADC2는 항원-양성 세포와 공-배양되는 항원-음성 세포에 대한 강력한 방관자 효과를 매개한다
항원-양성 세포와 매우 근접한 항원-음성 세포에 대한 방관자 효과를 매개하는 ADC1 및 ADC2의 잠재성을 방관자 어세이에서 평가하였다. ADC1 및 ADC2는 CEACAM5-양성 SK-CO-1의 존재 하에서 CEACAM5-음성 MDA-MB-231 세포에 대해 강력한 방관자 효과를 보였다 (도 27A). 단일-배양 생존능 어세이에서 1E-9　M의 시험된 농도에서, ADC1 및 ADC2 처치는 SK-CO-1 세포에 대해서 최대 효과를 일으켰지만 (도 26A), MDA-MB-231에 대한 효과는 관찰되지 않았다 (도 26B). 이들 발견에 따라서, ADC1 또는 ADC2의 비-특이적 효과는 MDA-MB-231 단독 대조군에 대한 방관자 어세이 설정에서 관찰되지 않았다 (도 27B).
결론적으로, ADC1 및 ADC2는 항원-양성 세포와 공-배양되는 항원-음성 암 세포에 대해 강력한 방관자 효과를 매개한다. 이들 발견은 불균질한 표적 발현의 종양을 효과적으로 표적화하는 잠재성을 의미한다.
ADC SAR과 비교하여, ADC1 및 ADC2는 항원-양성 세포와 공-배양되는 항원-음성 세포에 대한 훨씬 더 강력한 방관자 효과를 매개하였다 (도 28A, 도 28B). ADC SAR DM4 (즉, SPDB-DM4)에서 이용되는 약물-링커 분자와 ADC1 및 ADC2에서와 동일한 항체 (즉, mAb1)를 이용하는 ADC mAb1 DM4는 또한 ADC SAR DM4에 비해서 훨씬 더 현저한 방관자 효과를 보였다 (도 28A, 도 28B). 이것은 mAb1 가 상이한 항체를 이용하는 ADC SAR과 비교하여 ADC1 및 ADC2에 대해 관찰된 더 높은 방관자 효과에 기여한다는 것을 의미한다.
시험된 모든 ADC 경우에, 방관자 효과의 정도는 항원-음성 세포의 일정한 수에 첨가된 항원-양성 세포의 수가 증가함에 따라서 증가되었다 (도 28A 및 도 28B를 비교). 이것은 더 많은 ADC가 항원-음성 세포에 대한 방관자 효과를 담당하는 자유 페이로드를 방출하도록 항원-양성 세포에 의해 처치된다는 것을 의미한다.
시험된 ADC의 비-특이적 효과는 MDA-MB-231 세포 단독에서 관찰되지 않았다 (도 28C).
방법 - 방관자 어세이
항원-양성 암 세포주와 공-발현되는 항원-음성 암 세포주에 대한 ADC의 세포독성 효과는 방관자 어세이를 통해 측정되었다. 1,000개 CEACAM5-음성 MDA-MB-231 세포는 웰 당 750 또는 3000 CEACAM5-양성 SK-CO-1 세포와 함께 공-배양 실험에서 파종되었다. 대조군으로서, 1000 MDA-MB-231 세포 단독이 동시에 파종되었다. 세포는 처치 전 날에 90　μL의 전체 부피로 96-웰 플레이트에 파종되었다. 시험 화합물은 세포 배양 배지 중 1E-9 M의 최종 농도의 10배로 제제화되었고, 10　μL이 이중으로 세포에 첨가되었다. 플레이트는 6일 동안 37℃에 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션되었다.
면역형광 염색 전에, 배지를 제거하였고, 세포를 100% 메탄올 (-20℃)로 30분 동안 처치하였다. 메탄올 제거 및 1회 PBS 세척 단계 이후에, 세포는 2.5% 파라포름알데히드 (PFA)와 PBS 중 0.2% Triton X-100으로 15분 동안 실온에서 처치되었다. 용액 제거 및 1회 PBS 세척 단계 이후에, 세포는 PBS 중 1% BSA / 0.1% Tween / 0.1% 소듐 아지드로 적어도 1시간 동안 실온에서 처치되었다. 항원-양성 및 항원-음성 세포는 10 μg/mL 인간 항-CEACAM5 (mAb1) 1차 항체 및 당나귀 항-인간 IgG 형광 (파이코에리쓰린) 표지된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch #709-116-149)의 1:2000 희석물로 면역형광 염색을 통해 구별하였다. 세포는 1 μg/mL Hoechst 33342 (Life technologies, cat# H3570) 염료를 사용한 핵 염색을 통해 확인하였다. 염색은 1% BSA / 0.1% 소듐 아지드 PBS 용액에서 30분 동안 실온에서 수행되었다. 2차 항체 염색은 Hoechst 염료 염색과 조합하였다. 염색 단계 사이 및 그 이후에, 세포는 3회 PBS로 세척되었다.
플레이트는 공초점 정량적 이미지 사이토미터 CQ1 (Yokogawa® Electric Corporation, Tokyo, Japan)을 사용해 이미지화하였다. 분석은 CQ1 소프트웨어 (Yokogawa) 템플릿 "Nucleus and pseudo-Cell body"로부터 적합화되었고, FCS 내보내기 파일은 FlowJo (BD)를 사용해 분석되었다. 핵 주변에 형광 표지된 항체를 사용한 염색 또는 그 염색의 부재를 기반으로, 항원-양성 및 항원-음성 세포를 구별하고 정량하였다. 막대 그래프는 처치 조건에 따라서 확인된 항원-양성 및 항원-음성 세포의 수를 보여준다.
실시예 11: 직결장암 (CRC) 환자-유래 이종이식 (PDX) 마우스 모델에서 ADC1 및 ADC2의 효능
생체내 항-종양 효능은 인간 환자-유래 CRC 이종이식 모델 COPF217에서 평가되었다 (Shanghai LideBiotech CO., LTD). COPF217 종양 단편은 6주령 내지 8주량 면역결핍 암컷 마우스 (NU-Foxn1nu, Charles River)의 우측 옆구리에 피하로 이식되었다. 종양이 165 ㎣의 평균 부피에 도달했을 때, 6마리 마우스/그룹은 비히클 (염수 용액) 또는 ADC1 또는 ADC2 (각각 10 mg/kg의 용량; 0일)가 정맥내로 1회 처치되었다. 종양 길이 (L) 및 너비 (W)는 칼리퍼로 측정되었고 종양 부피는 식 LХ(W^2)/2를 사용해 계산되었다.
10 mg/kg의 용량에서 ADC1 또는 ADC2로 단일 처치는 유의한 항-종양 효과를 야기하였다. 2개 물질은 종양 정체를 야기하는 비슷한 효과를 보인다 (도 29). ADC1 또는 ADC2의 처치는 체중에 유의한 영향을 갖지 않았다 (데이터 미도시).
다른 CRC PDX 모델을 사용한 추가 실험:
COPF217에 대해 상기 기술된 것에 상응하는 추가 실험에서, ADC1에 의한 단일 처치는 또한 CEACAM5 발현이 높은 12개 다른 CRC PDX 모델에서 종양 정체 또는 종양 퇴행을 일으켰다.
실시예 12: 비-소세포 폐암 (NSCLC) PDX 마우스 모델에서 ADC1의 효능
생체내 항-종양 효능은 인간 환자-유래NSCLC 이종이식 모델 LUPF160151에서 평가하였다 (Shanghai LideBiotech CO., LTD). LUPF160151 종양 단편은 6주령 내지 8주량 면역결핍 암컷 마우스 (NU-Foxn1nu, Charles River)의 우측 옆구리에 피하 이식되었다. 종양이 180 ㎣의 평균 부피에 도달했을 때, 5마리 마우스/그룹은 비히클 (염수 용액) 또는 ADC1 (6 mg/kg; 0일)로 정맥내에 1회 처치되었다. 종양 길이 (L) 및 너비 (W)는 칼리퍼로 측정되었고, 종양 부피는 식 LХ(W^2)/2을 사용해 계산되었다.
6 mg/kg의 용량에서 ADC1로 단일 처치는 체중에 영향없이 (데이터 미도시) 유의한 항-종양 효과를 야기하였다 (도 30). 모델 LUPF160151은 CEACAM5 양성 종양 세포에 인접한 CEACAM5 음성 종양 세포와 함께 이종성 CEACAM5 발현을 보였다. 따라서 이 모델에서 ADC1의 양호한 효능은 ADC의 강력한 방관자 효과를 의미한다.
실시예 13: 위암 PDX 마우스 모델에서 ADC1의 효능
생체내 항-종양 효능은 인간 환자-유래위암 이종이식 모델 GAX066 (Shanghai ChemPartner Co., Ltd)에서 평가되었다. 종양 단편은 면역걸핍 암컷 마우스 (Nu/Nu mice, Beijing Vital River Lab Animal Technology Co. Ltd, 18-22g)의 우측 옆구리에 피하로 이식되었다. 종양이 220 ㎣의 평균 부피에 도달했을 때, 6마리 마우스/그룹은 비히클 (염수 용액) 또는 ADC1 (3 또는 10 mg/kg; 0일)이 정맥내로 1회 처치되었다. 종양 길이 (L) 및 너비 (W)는 칼리퍼로 측정되었고, 종양 부피는 식 LХ(W^2)/2을 사용해 계산되었다.
3 또는 10 mg/kg ADC1로 단일 처치는 체중에 영향없이 (데이터 미도시), 유의한 항-종양 효과 (도 31)를 야기하였다. 6개 종양 중 5개에서, 10 mg/kg 처치는 완전 종양 퇴행을 일으켰다.
실시예 14: 췌장 세포주 유래 종양 모델에서 ADC3과 비교한 ADC1의 효능
ADC3과 비교하여 ADC1의 효능은 인간 췌장 세포주 유래 이종이식 모델 HPAF-II (ATCC,　CRL-1997)에서 평가되었다. 5x106 HPAF-II 세포는 6주령 내지 8주령 면역결핍 암컷 마우스 (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, Envigo)의 우측 옆구리에 피하로 주사되었다. 종양이 150 ㎣의 평균 부피에 도달했을 때, 10마리 마우스/그룹은 비히클 (염수 용액) 또는 ADC1 (1 mg/kg 또는 6 mg/kg; 0일) 또는 ADC3 (1 mg/kg 또는 6 mg/kg; 0일)이 정맥내로 1회 처치되었다. 종양 길이 (L) 및 너비 (W)는 칼리퍼로 측정되었고 종양 부피는 LХ(W^2)/2를 사용해 계산되었다.
6 mg/kg의 용량에서 ADC1의 단일 처치는 유의한 항-종양 효과를 야기하였다. 효과는 용량-의존적인데, 1 mg/kg의 단일 처치만이 경미하지만 유의한, 일시적 항-종양 효과를 야기하였다. 대조적으로, ADC3의 동일 용량으로 단일 처치는 어떠한 용량에서도 유의한 항-종양 효과를 보이지 않았다 (도 32). 모든 처치는 체중에 대해 유의한 효과를 갖지 않았다 (데이터 미도시).
실시예 15: 2개 CRC PDX 마우스 모델에서 ADC SAR DM4와 비교한 ADC1의 효능
생체내 항-종양 효능은 인간 환자-유래 CRC 이종이식 모델 COPF230 및 REPF210 (Shanghai LideBiotech CO., LTD)에서 평가되었다. 종양 단편은 6주령 내지 8주령 면역결핍 암컷 마우스 (NU-Foxn1nu, Charles River)의 우측 옆구리에 피하로 이식되었다. 종양이 약 170 ㎣ 의 평균 부피에 도달했을 때, 6마리 마우스/그룹은 비히클 (염수 용액), ADC1 (6 mg/kg) 또는 ADC SAR DM4 (6 mg/kg)이 정맥내로 1회 (0일) 처치되었다. 종양 길이 (L) 및 너비 (W)는 캘리퍼로 측정되었고, 식 LХ(W^2)/2를 사용해 계산되었다.
ADC1로 단일 처치는 PDX 모델 COPF230 (도 33) 및 REPF210 (도 34) 둘 모두에서 유의한 항-종양 효과를 야기하였다. 대조적으로, ADC SAR DM4의 동일 용량으로 단일 처치는 어떠한 CRC PDX 모델에서도 항-종양 효과를 보이지 않았다 (도 33, 도 34). 어떠한 처치 그룹에서도 체중에 대해 유의한 효과가 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).
실시예 16: 위 PDX 마우스 모델 (GAPF313)에서 ADC SAR DM4와 비교된 ADC1의 효능
생체내 항-종양 효능은 인간 환자-유래 위 이종이식 모델 GAPF313 (Shanghai LideBiotech CO., LTD)에서 평가되었다. 종양 단편은 6주령 내지 8주령 면역결핍 암컷 마우스(NU-Foxn1nu, Charles River)의 우측 옆구리에 피하로 이식되었다. 종양이 약 180 ㎣의 평균 부피에 도달했을 때, 6마리 마우스/그룹은 비히클 (염수 용액), ADC1 (4 mg/kg 또는 7mg/kg Q2Wx3) 또는 ADC SAR DM4 (4.7 mg/kg Q2Wx3)로 정맥내에 0일에 시작하여 2주마다 3회 처치되었다. 종양 길이 (L) 및 너비 (W)는 캘리퍼로 측정되었고 종양 부피는 식 LХ(W^2)/2을 사용해 계산되었다.
진행중인 실험의 중간 데이터 분석은 이 모델에서 ADC1의 분명한 항-종양 효능 및 ADC SAR DM4의 효과 없음을 입증하였다 (도 35). 모든 처치는 충분히 내약성이 있었다 (데이터 미도시).
실시예 17: ADC1의 안전성 프로파일 - 사이노몰거스 원숭이에서 파일럿 독성 연구
안전성 프로파일을 조사하기 위해서, ADC1은 0, 3, 10, 및 30 mg/kg의 용량으로, 3-주 간격 (1일, 22일, 및 43일)으로, 3회, 사이노몰거스 원숭이에게 30분 i.v. 주입을 통해 투여되었고, 동물은 육안 및 조직병리학적 검사를 위해서 50일에 희색되었다. 그 결과로, ADC1이 기지의 ADC의 독성 부작용에 의해 영향받는 일정 장기에서 독성이 결여되었다는 점에서 ADC1은 비교적 양호한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Merck Patent GmbH <120> ANTI-CEACAM5 ANTIBODIES AND CONJUGATES AND USES THEREOF <130> P20-166 WO-PCT <150> EP20195559.8 <151> 2020-09-10 <150> EP20194711.6 <151> 2020-09-04 <160> 30 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 702 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CEACAM5 protein sequence according to GenBank accession number AAA51967.1 <400> 1 Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly 50 55 60 Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile 65 70 75 80 Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95 Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile 100 105 110 Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp 115 120 125 Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln 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Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arg Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Glu Val Leu Leu Leu Ala His Asn Val Ser Gln Asn Leu Phe Gly 50 55 60 Tyr Ile Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Ala Ser Arg Arg Ile Gly 65 70 75 80 Ser Cys Val Ile Arg Thr Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro Ala His Ser 85 90 95 Gly Arg Glu Thr Ile Asp Phe Asn Ala Ser Leu Leu Ile His Asn Val 100 105 110 Thr Gln Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Gln Val Ile Lys Glu Asp 115 120 125 Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 140 Pro Lys Pro Tyr Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr 165 170 175 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Glu 180 185 190 Leu Ser Ser Asp Asn Arg Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro Arg Asn 195 200 205 Asp Thr Thr Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Val Arg 210 215 220 Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of huMab2-3 <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 27 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC of hmn-14 <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 28 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of hmn-14 <400> 28 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC of rb8G4 <400> 29 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Gly Ser Val Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Leu Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ile Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser 180 185 190 Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr 260 265 270 Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His 290 295 300 Glu Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys 305 310 315 320 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln 325 330 335 Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val 405 410 415 Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 30 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of rb8G4 <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asn Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Asp Pro Val Ala 100 105 110 Pro Ser Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu Glu Leu Thr Thr Gly 115 120 125 Thr Ala Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 130 135 140 Thr Val Thr Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr Gln Gln Ser Gly Ile Glu 145 150 155 160 Asn Ser Lys Thr Pro Gln Ser Pro Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Ser Leu Thr Ser Ala Gln Tyr Asn Ser His Ser Val Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Val Val Gln Gly Ser Ala Ser Pro Ile Val Gln Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Asp Cys 210

Claims (42)

  1. 인간 CEACAM5 단백질에 결합하고, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1-H, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2-H, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3-H, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1-L, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2-L, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3-L을 포함하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH) 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH) 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함하는 것인 항체.
  7. SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체와 인간 CEACAM5 단백질의 A2-B2 도메인에 대한 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체.
  8. 제7항에 있어서, 항체는 또한 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체와 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis) CEACAM5 단백질의 A2-B2 도메인에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것인 항체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 항체는 인간 CEACAM1, 인간 CEACAM6, 인간 CEACAM7, 인간 CEACAM8 및 마카카 파시쿨라리스 CEACAM6과 유의하게 교차 반응하지 않는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체는 항체 단편인 항체.
  11. 제10항에 있어서, 항체는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 항체.
  13. 인간 CEACAM5 단백질에 결합하고, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 동일한 중쇄 (HC) 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 동일한 경쇄 (LC)로 이루어지는 것인 단리된 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  15. 제14항에 따른 핵산으로 형질전환된 숙주 세포.
  16. 적어도 하나의 성장 억제제에 링커를 통해서 공유적으로 연결된 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 포함하는 면역접합체.
  17. 제16항에 있어서, 성장 억제제는 세포독성 약물 또는 방사성 모이어티인 면역접합체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 성장 억제제는 화학요법제, 효소, 항생제, 독소 예컨대 소형 분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 톡소이드, 빈카, 탁산, 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유사체, 토마이마이신 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, 크립토파이신 유도체, 렙토마이신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체, 프로드러그, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, DNA 알킬화제, 항-튜불린제, CC-1065 및 CC-1065 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성장 억제제는 엑사테칸인 면역접합체.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 면역접합체.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 포유동물 세포의 엔도솜에서 절단가능한 링커인 면역접합체.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 글루쿠로니다제 및 레구마인으로부터 선택되는 인간 효소에 의해 절단가능한 링커인 면역접합체.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역접합체는 하기 화학식 (II)를 갖는 것인 면역접합체:
    Figure pct00060

    (식에서, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(성장 억제제)] 모이어티의 개수임).
  24. 제16항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역접합체는 하기 화학식 (III)을 갖는 것인 면역접합체:
    Figure pct00061

    (식에서, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(성장 억제제)] 모이어티의 개수임).
  25. 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역접합체는 하기 화학식 (IV)를 갖는 것인 면역접합체:
    Figure pct00062

    (식에서, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수임).
  26. 제16항 내지 제22항, 및 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역접합체는 하기 화학식 (V)를 갖는 것인 면역접합체:
    Figure pct00063

    (식에서, S는 항체의 황 원자이고, n은 항체에 공유적으로 연결된 [(링커)-(엑사테칸)] 모이어티의 개수임).
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, S는 항체의 시스테인의 황 원자인 면역접합체.
  28. 제27항에 있어서, 항체의 시스테인은 사슬간 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 중 하나인 면역접합체.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, n은 7 내지 8인 면역접합체.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, n은 7.5 내지 8.0인 면역접합체.
  31. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 제16항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 따른 면역접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
  32. 약물로서 사용을 위한 것인, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 제16항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 따른 면역접합체 또는 제31항에 따른 약학 조성물.
  33. 암의 치료에서 사용을 위한 것인, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 제16항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 따른 면역접합체 또는 제31항에 따른 약학 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 암은 CEACAM5 발현 암인 항체, 면역접합체, 또는 약학 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 암은 직결장암, 위암, 폐암, 췌장암, 식도암 또는 전립선암인 항체, 면역접합체, 또는 약학 조성물.
  36. 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 제16항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 따른 면역접합체 또는 제31항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 치료 방법.
  37. 제36항에 있어서, 암은 CEACAM5 발현 암인 치료 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 암은 직결장암, 위암, 폐암, 췌장암, 식도암 또는 전립선암인 치료 방법.
  39. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 사용하여 대상체로부터의 생물학적 샘플 중에서 생체외 CEACAM5 발현을 검출하기 위한 방법.
  40. 제39항에 있어서, 항체는 검출가능한 분자로 표지되는 것인 검출 방법.
  41. 대상체로부터의 생물학적 샘플 중에서 생체외 CEACAM5 발현을 검출하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 항체의 용도.
  42. 제41항에 있어서, 항체는 검출가능한 분자로 표지되는 것인 용도.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023137026A1 (en) * 2022-01-12 2023-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
WO2023172968A1 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Merck Patent Gmbh Anti-gd2 antibodies, immunoconjugates and therapeutic uses thereof
WO2024091437A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived adc linker-payloads, pharmaceutical compositions, and uses thereof
WO2024108053A1 (en) * 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024110905A1 (en) * 2022-11-24 2024-05-30 Beigene, Ltd. Anti-cea antibody drug conjugates and methods of use

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
AU6248994A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Rockefeller University, The Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
JP3946256B2 (ja) 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
JP2001522241A (ja) 1997-04-10 2001-11-13 ロイヤル ネザーランズ アカデミー オブ アーツ アンド サイエンシズ 診断方法および試薬
GB0308731D0 (en) 2003-04-15 2003-05-21 Anticancer Therapeutic Inv Sa Method of radiotherapy
AU2004232928A1 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
USRE47123E1 (en) 2006-07-18 2018-11-13 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
KR101599704B1 (ko) 2007-08-29 2016-03-07 사노피 인간화된 항-ｃｘｃｒ5 항체, 이의 유도체 및 이들의 용도
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
WO2011034660A1 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof

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