MXPA03003144A - Anticuerpos humanizados anti-lt-??-r. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan los anticuerpos humanizados para LT-??-R y los metodos para utilizarlos.

Description

ANTICUERPOS HUMANIZAPOS ????-??-ß-? SOLICITUDES RELACIONADAS Es una continuación en parte de U.S.S.N. 60/299,987, presentada el día 21 de junio de 2001 que es una continuación en parte de U.S.S.N. 60/275,289, presentada el día 13 de marzo de 2001 que es una continuación en parte de U.S.N.N. 60/240,285, presentada el día 13 de octubre de 2000. La divulgación completa de todas estas solicitudes de patente se incorpora aquí por referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, en términos generales, a anticuerpos humanizados específicos para el receptor de linfotoxina beta (LT-ß-?) . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor de linfotoxina beta (conocido aquí como LT-ß-?) es un miembro de la familia de factores de necrosis tumoral que tiene una función bien descrita tanto en el desarrollo del sistema inmune como en el mantenimiento funcional de numerosas células en el sistema inmune incluyendo células dendríticas foliculares y numerosos tipos de células estromales (Matsumoto y colaboradores, Immunol. Rev. 156:137 (1997) . Ligandos conocidos para LT-ß-? incluyen y un segundo ligando llamado LIGHT (Mauri y colaboradores, Immunity 8:21 (1998)). La activación de LT~ - induce la muerte apoptótica de ciertas líneas de células cancerosas in vivo (PCT/US96/01386) . El tratamiento con agentes agonistas que activan ??-ß-R, como por ejemplo anticuerpos anti-LT-p-R humanizados específicos seria útil para el tratamiento o la reducción del avance, severidad o efectos de neoplasias en su etos (por ejemplo, seres humanos) . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece anticuerpos humanizados antireceptor de linfotoxina beta (LT-p-R) y métodos para utilizar estos anticuerpos para tratar o reducir, severidad o efectos de neoplasia en sujetos (por ejemplo, seres humanos) . Específicamente, la invención abarca un anticuerpo humanizado que se une específicamente a LT-p-R (por ejemplo, LT-p-R de ser humano) . Este anticuerpo comprende regiones determinantes complementarias de cadena ligera definidas por los residuos de aminoácidos 24 a 34, 50 a 56, y 89 a 97 de SEQ ID NO: 1, y/o regiones determinantes complementarias de cadena pesada definidas por los residuos de aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 2 y además por lo menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, ó 5) de los residuos siguientes en su cadena ligera: K3, W41, 146, Q69 y Y71; o por lo menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5) de los residuos siguientes de cadena pesada: F37, T40, A49, M89 y V93 (convención de numeración de Kabat) . El anticuerpo humanizado de esta invención puede comprender una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los residuos de aminoácidos 1 a 107 de SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los residuos de aminoácidos 1 a 120 de SEQ ID NO: 16. El anticuerpo humanizado puede comprender también las mismas secuencias de polipéptidos de cadena pesada y/o ligera que un anticuerpos producido por la linea de células E46.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) o linea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC 3765) . En otra modalidad, el anticuerpo humanizado de la presente invención conserva sustancialmente las propiedades de enlace del anticuerpo de origen. En una modalidad, el anticuerpo humanizado de esta invención se une a ???-ß-R con una afinidad funcional, como por ejemplo, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, alternativamente, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 20 pM, alternativamente, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 30 pM, alternativamente, de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 40 pM, alternativamente, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 50 pM, alternativamente, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 60 pM, alternativamente, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 70 pM, alternativamente, de aproximadamente 70 pM a aproximadamente 80 pM y alternativamente, de aproximadamente 80 pM aproximadamente 90 pM, en donde la afinidad funcional se mide por FACS de conformidad con el Ejemplo 8.

En otra modalidad, el anticuerpo humanizado de esta invención está unido a una inmunotoxina (por ejemplo, cadena A de resina y Pseudonomas toxin) . El anticuerpo humanizado de la invención puede también estar unido a un fármaco quimioterapéutico (por ejemplo, Adriamicina, 5FU, Vinblastina, Actinomicina D, Etopósido, Cisplatina, Metotrexato y doxorubicina) o bien un radioisótopo. La presente invención abarca también una terapia de combinación en la cual, por ejemplo, el anticuerpo humanizado de la presente invención unido a una inmunotoxina es utilizado en combinación con un anticuerpo humanizado de la presente invención unido a un fármaco quimioterapéutico. La presente invención abarca además una composición adecuada para su administración a un mamífero (por ejemplo ser humano) que tiene un tumor que sobre-expresa LTßR, que comprende a) un anticuerpo humanizado anti-LT3R ya sea solo o enlazado a un fármaco quimioterapéutico o a una inmunotoxina y b) un factor de citotóxico, cada uno presente en cantidades efectivas para reducir el volumen del tumor al ser administrado al mamífero. El factor citotóxico puede incluir, por ejemplo TNF-a, TNF-ß, IL-1, INF-?, IL-2. Alternativamente, el factor citotóxico puede ser un fármaco quimioterapéutico. El fármaco quimioterapéutico puede incluir, por ejemplo, Adriamicina, 5FU, Vinblastina, Actinomicina D, Etopósido, Cisplantina, Metotrexato y Doxorubicina.

El anticuerpo de esta invención, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo entero (es decir, con dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa) de cualquier isotipo y subtipo (por ejemplo, IgM, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl e IgA2) ; alternativamente, puede ser un fragmento de enlace con antigenos (por ejemplo, Fab, F(ab' )2/ y Fv) de un anticuerpo entero. Dentro del marco de la invención se encuentra también una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable; un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para SEQ ID NO: 8/ un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para SEQ ID NO: 16; un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora para la cadena ligera de un anticuerpo producido por la linea de células E46.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) o una línea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3765) ; un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la cadena de células E 6.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) ; o bien por la línea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3765) ; un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para los residuos 1-107 de SEQ ID NO: 8, y un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para los residuos 1-120 de SEQ ID NO: 16. Dentro del marco de la presente invención se encuentran también células provenientes de lineas de células que producen anticuerpo humanizado anti-I^R, incluyendo, como por ejemplo, linea de células E46.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) ; y linea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3765) . En una modalidad, la linea de células produce de aproximadamente 250 mg/L a aproximadamente 300 mg/L de dicho anticuerpo. Alternativamente, la linea de células produce de aproximadamente 300 mg/L a aproximadamente 350 mg/L de dicho anticuerpo, alternativamente, la linea de células produce de aproximadamente 350 mg/L a aproximadamente 400 mg/L de dicho anticuerpo, alternativamente, la linea de células produce de aproximadamente 400 mg/L a aproximadamente 450 mg/L de dicho anticuerpo, alternativamente, la linea de células produce de aproximadamente 450 mg/L a aproximadamente 500 mg/L de dicho anticuerpo, alternativamente, la linea de células produce de aproximadamente 500 mg/L a aproximadamente 550 mg/L de dicho anticuerpo, y alternativamente, la linea de células produce de aproximadamente 550 mg/L a aproximadamente 600 mg/L de dicho anticuerpo. La concentración del anticuerpo producido por las lineas de células se mide como un titulo de cosecha a partir de un cultivo en lotes alimentado de 10 días. La presente invención ofrece también un método para tratar o reducir el avance, severidad o efectos de neoplasias en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un anticuerpo de esta invención. Una cantidad efectiva de la composición puede ser administrada en una o varias dosificaciones . En otra modalidad, la presente invención ofrece un método para tratar o reducir el avance, severidad o efectos de neoplasias en un sujeto (por ejemplo, ser humano), que comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un anticuerpo de esta invención y un factor citotóxico. El factor citotóxico puede incluir por ejemplo, TNF-a, TNF-ß, IL-1, INF-y, IL-2. Alternativamente, el factor citotóxico puede ser un fármaco quimioterapeutico . El fármaco quimioterapéutico puede incluir, por ejemplo, Adriamicina, 5FU, Vinblastina, Actinomicina D, Etopósido, Cisplatina, Metotrexato y Doxorubicina. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una gráfica de la citotoxicidad en células WiDr. iuCBEll (murino) (rombo) , uCBEl 1#2 (anticuerpo humanizado anti-LT-^-R que comprende la versión 2 de la cadena ligera (VL#2) y versión 2 de la cadena pesada (VH#2) ) (circulo) , huCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT- -R que comprende la versión 3 de la cadena ligera (VL#3) y versión 4 de la cadena pesada (VH#4) ) (estrellas) . La Figura 2 muestra una gráfica de agonismo de IL-8 en células A375. mCBEll (rombos), huCBE#2 (murino) (rombo), huCBEl 1#2 (anticuerpo humanizado anti-LT-p-R que comprende la versión 2 de la cadena ligera (VL#2) y versión 2 de la cadena pesada (YH#2) ) (circulo), huCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT- -R que comprende la versión 3 de la cadena ligera (VL#3) y versión 4 de la cadena pesada (VH#4) ) (estrellas) . La Figura 3 muestra una gráfica de volumen tumoral versus días de administración. mCBEll (triángulos), huCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT-3-R que comprende la versión 3 de la cadena ligera (VL#3) y versión 4 de la cadena pesada (VH#4) ) (circuios) sin tratamiento (cuadrados) . La Figura 4 muestra una gráfica de la supervivencia porcentual de animales versus días de inyección después del tumor. mCBEll (triángulos), huCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT-^-R que comprende la versión 3 de la cadena ligera y la versión 4 de la cadena pesada) (circuios) sin tratamiento (cuadrados) . La Figura 5 muestra una gráfica del volumen tumoral versus días después de la inyección. HuCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT^-R que comprende la versión 3 de la cadena ligera (VL#3) y versión 4 de la cadena pesada (VH#4) ) (circuios) y control sin tratamiento (cuadrados) . La Figura 6 muestra una gráfica de volumen tumoral antes del cultivo versus días después del tratamiento. Control (cuadrado) ; huCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT-ß-?. que comprende la versión 3 de la cadena ligera (VL#3) y versión 4 de la cadena pesada (VH#4) ) en dosificaciones diferentes: 500ug (circuios), 100 ug (triángulos), y 20ug (rombos); mCBEll (cruces) . La Figura 7 muestra una gráfica del porcentaje de supervivencia de animales con tumores antes del cultivo versus días después de tratamiento. Control (cuadrado); huCBEll#4 (anticuerpo humanizado anti-LT-3-R que comprende la versión 3 de la cadena ligera (VL#3) y versión 4 de la cadena pesada (VH#4) ) en dosificaciones diferentes: 500ug (circuios) , 100 ug (triángulos) , y 20ug (rombos) ; mCBEll (cruces) . La Figura 8 muestra una gráfica de la intensidad media de la fluorescencia versus concentraciones de huCBEll#4 en una escala logarítmica. DESCRIPCIÓN DETALLADA Números de identificación de secuencias Secuencias de nucleótidos y aminoácidos mencionas en la especificación han recibido los siguientes números de identificación de secuencia: SEQ ID NO: 1 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de mCBEll. SEQ ID NO: 2 — Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de mCBEll.

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 1-VL#1) . SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 1-VL#1) . SEQ ID NO: 5 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 2-"VL#2) . SEQ ID NO: 6 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 2-VL#2) . SEQ ID NO: 7 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 3-VL#3) . SEQ ID NO: 3 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 3-VL#3) . SEQ ID NO: 9 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de CBE11 humanizado (versión 1-VH#1) . SEQ ID NO: 10 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 1-VH#1) . SEQ ID NO: 11 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de CBE11 humanizado (versión 2-VH#2) . SEQ ID NO: 12 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBE11 humanizado (versión 2-VH#2) . SEQ ID NO: 13 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de CBE11 humanizado (versión 3-VH#3) . SEQ ID NO: 14 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBEll humanizado (versión 3-vH#3) . SEQ ID NO: 15 - Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de CBEll humanizado (versión 4-VH#4) . SEQ ID NO: 16 - Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de CBEll humanizado (versión 4-VH#4) . SEQ ID NO: 17 - Cebador FRl para introducir un sitio Bsu36I. SEQ ID NO: 18 - Cebador FR2 para introducir sitios Ncil y Hpall SEQ ID NO: 19 - Cebador FR3 para introducir sitios Bsu36I y PstI. ' SEQ ID NO: 20 - Cebador FR2 para introducir sitio Sitial . SEQ ID NO: 21 - Cebador FR3 para introducir sitio Pvul . SEQ ID NO: 22 - Cebador FR2 para introducir sitios Sitial y Hhal. SEQ ID NO: 23 - Cebador FR3 para introducir sitios PvuII y Fspl. SEQ ID NO: 24 - Cebador FRl para introducir sitios Hinfl y Nsil . SEQ ID NO: 25 - Cebador FR2 para introducir sitios Haell y Hhal. SEQ ID NO: 26 - Cebador FR3 para introducir sitios Bsu36l, Ddel y PstI. SEQ ID NO: 27 - Cebador FRl para introducir sitio EcoRV. SEQ ID NO: 28 - Cebador FR3 para introducir sitio Rsal .

SEQ ID NO: 29 - Cebador FR1 para introducir sitio EcoRV. SEQ ID NO: 30 - Cebador FR2 para introducir sitio HindIII. SEQ ID NO: 31 - Cebador FR3 para introducir sitio Rsal . SEQ ID NO: 32 - Cadena ligera de huCBEll entera (versión 3) que incluye dominio constante. SEQ ID NO: 33 - Cadena pesada de huCBEll entera (versión 4) que incluye dominio constante. Definiciones El término anticuerpo humanizado, como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente murino, que conserva o conserva sustancialmente las propiedades de enlace con antígeno del anticuerpo de origen pero que es menos inmunogénico en seres humanos . El término región de determinación de complementaridad (CDR) , como se emplea aquí, se refiere a las secuencias de aminoácidos que conjuntamente definen la afinidad de enlace y la especificidad de la región de Fv natural de un sitio de enlace de inmunoglobulina nativa de conformidad con lo delineado por Kabat y colaboradores (1991) . El término región de estructura (FR) , como se emplea aquí, se refiere a las secuencias de aminoácido interpuestas entre las CDRs. Estas porciones del anticuerpo sirven para mantener las CDRs en orientación apropiada (permiten que las CDRs se unan a antígeno) . El término región constante (CR) , como se emplea aquí, se refiere a la porción de molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. En la presente invención, regiones constantes de murino están sustituidas por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos quiméricos humanizados sujetos son derivadas de inmunoglobulinas humanas. La región constante de cadena pesada puede ser seleccionada a partir de cualesquiera de los cinco isótopos: alfa, delta, epsilon, gamma, o mu. Además, cadenas pesadas de varias subclases (como por ejemplo las subclases IgG de cadenas pesadas) son responsables de diferentes cadenas efectoras y por consiguiente, mediante la selección de la región constante de cadena pesada deseada, se pueden producir anticuerpos con una función efectora deseada. Regiones constantes preferidas son gamma 1 (igGI) , gamma 3 (IgG3) y gamma 4 (IgG4) . Con mayor preferencia es una región Fe del isotipo gamma 1 (IgGI) . La región constante de cadena ligera puede ser kappa o lambda, de preferencia del tipo kappa. El término "anticuerpos quiméricos" como se emplea aqui, se refiere a un anticuerpo que contiene secuencias derivadas de dos anticuerpos diferentes que son típicamente de especies diferentes. Más típicamente los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpos humanos y de murino, generalmente región constante de ser humano y región variable de murino.

El término inmunogenicidad, como se emplea aquí, se refiere a la medición de la capacidad de una proteína de enfoque o porción terapéutica para provocar una respuesta inmunológica (humoral o celular) cuando se administra a un receptor. La presente invención se refiere a la inmunogenicidad de los anticuerpos humanizados sujetos. Un anticuerpo humanizado de inmunogenicidad reducida se refiere a un anticuerpo humanizado que presenta una inmunogenicidad reducida con relación al anticuerpo de origen, por ejemplo, anticuerpo de murino. Un anticuerpo humanizado que conserva sustancialmente las propiedades de enlace del anticuerpo de origen se refiere a una anticuerpo humanizado que conserva la capacidad de unirse específicamente con el antígeno reconocido por el anticuerpo de origen utilizado para producir dicho anticuerpo humanizado. De preferencia, el anticuerpo humanizado presenta la misma afinidad y avidez de enlace con antígeno que el anticuerpo de origen o bien sustancialmente la misma afinidad y avidez. Idealmente, la afinidad del anticuerpo no será inferior al 10% de la afinidad del anticuerpo de origen, con mayor preferencia dicha afinidad no será inferior a aproximadamente 30%, y con mayor preferencia dicha afinidad no será inferior al 50% de la afinidad despresada por el anticuerpo de origen. Métodos para ensayar la afinidad de enlace de antígeno son bien conocidos en la técnica e incluyen ensayos de unión semi-máxima, ensayos de competencia y análisis de Scatchard. Ensayos de enlace de antigenos adecuados se describen en esta solicitud. La presente invención se enfoca a anticuerpos monoclonales humanizados que se unen con LT- -R humanizado y a su uso como agentes terapéuticos . La presente invención se enfoca además hacia secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos humanizados, y a su expresión en células huéspedes recombinantes . Más específicamente, la presente invención se enfoca hacia anticuerpos humanizados derivados de CBE11 de murino que se unen específicamente a LT-p-R de ser humano . CBE11 de murino (mCBEll) es un anticuerpo capaz, IgGl de murino, aislado de un ratón inmunizado con una proteína de fusión humano ??-ß-R-Ig (Bro ning y colaboradores, J. Immunol. 154:33 (1995)). mCBEll activa funcionalmente L ^-R tanto in vitro como in vivo (PCT/US96/01386) y su asilamiento y propiedades antitumorales han sido descritos (Browning y colaboradores, J. Exp. Med. 183:867 (1996)). La línea de células de hibridoma que produce mCBEll ha sido previamente depositada ante la American Type Culture Collection (ATCC) según las disposiciones del Tratado de Budapest por los Solicitantes de la presente invención y recibió el número acceso ATCC HB 11793. (PCT/US96/01386) . Los solicitantes han mostrado también que la reticulación ,de receptor LT-ß con varios anticuerpos anti-LT-ß-?. agonistas activan el receptor de LT-ß (es decir, pueden imitar los efectos de los ligandos naturales) . (PCT/US96/01386. La activación de receptores a su vez inhibe el crecimiento tumoral en varios modelos de tumor in vivo para los cuales el receptor LT-ß es expresado. El receptor LT-ß es expresado en numerosasétulas cancerosas incluyendo como por ejemplo, células de cáncer pulmonar de células pequeñas (NSCLC) , células de cáncer colo-rectal (CRC) , células de cáncer de mama, asi como en células de cáncer de próstata, piel, estómago, esófago, vejiga y gástrico. Ejemplos no limitativos de tumores que los anticuerpos agonistas de LT-ß-? inhiben incluyen los siguientes tumores sólidos: adenocarcinoma de colon HT29, carcinoma cervical HT3, melanoma ?375, carcinoma de mama MDA-231 y tumores primarios de colon. Por consiguiente, anticuerpos agonista de LT-^-R poseen propiedades que los hacen útiles para el tratamiento de enfermedades en donde la activación de LT- -? y/o la modulación de la interacción LT-ß-R/ligando de LT- -? es deseable incluyendo por ejemplo, el tratamiento o la reducción del avance, severidad o efectos de neoplasias en un sujeto (por ejemplo, ser humano) . La humanización del anticuerpo monoclonal de mCBEll incluyendo el análisis de modelado retromutaciones que se requieren para conservar sustancialmente las propiedades de enlace del anticuerpo monoclonal mCBEll se describe aquí.

Análisis de Modelado de las Regiones Variables de Ratón Las CDRs contienen los residuos que presentan la mayor probabilidad de enlazarse con antigeno y deben conservarse en el anticuerpo re-formado. Las CDRs son definidas por secuencia según Kabat y colaboradores, Seqúense of Proteins of Immunological Interest [Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico] , 5a. Edición, El Departmento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos de América, Oficina de Impresión del Gobierno Norteamericano, 1991. Las CDRs caen en clases canónicas (Chothia y colaboradores, 1989 Nature, 342, 877-883) en donde residuos claves determinan en gran medida la conformación estructural del bucle de CDR. Estos residuos son casi siempre conservados en el anticuerpo reformado. La secuencia de polipéptidos del dominio variable de cadena ligera de mCBEll se muestra a continuación con las CDR' s subrayadas y los números de posiciones de residuos son designados de conformidad con el sistema de numeración de Kabat : 1 DIK TQSPSS MY7ASLGERVT ITCKAGQDIK SYLSWYQQKP 41 WKSPKILITY ATRLADGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLES 81 DDTATYYCLQ HGESPWTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 1) La secuencia de polipéptidos del dominio variable de cadena pesada de mCBEll se muestra abajo con las CDR' s subrayadas y los números de posición de residuos son designados de conformidad con el sistema de numeración de Kabat: 1... EVQLVESGGG LVKPGGSLKL SC7AASGFTFS DYYMYWFRQT 41 PEKRLEWVAT ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY 81.. LQMSSLKSED TAMYYCVREE NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2) Las cadenas variables pesadas y ligeras de mCBEll fueron comparadas con las secuencias de consensos para subgrupos de ratón y ser humano (Johnson, G. , Wu, T.T. Kabat Datábase and its applications: future directions Nucleic Acid Research, 29, 205-206, 2001; Wu y Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250 (1970) ) utilizando el programa FASTA. La cadena ligera variable de mCBEll es un miembro del subgrupo de ratón V con una identidad del 74% en un empalme de 110 aminoácidos y la cadena pesada variable de mCBEll es miembro de subgrupo de ratón Illd con una identidad del 79% en un empalme de 132 aminoácidos. La cadena ligera variable corresponde al subgrupo I humano con una identidad del 66% en un empalme de 113 aminoácidos. La cadena pesada variable corresponde al subgrupo humano III con una identidad del 71% en un empalme de 131 aminoácidos Las CDRs de la presente invención fueron clasificadas en clases canónicas. El bucle de Ll cayó en la clase canónica 2 (bucle de 11 residuos), el bucle L2 cayó en la clase 1 (7 residuos) y el bucle L3 cayó en la clase 1 (9 residuos) . El bucle Hl cayó en la clase 1 (5 residuos) y el bucle H2 cayó clase 3 (17 residuos) . El bucle H3 no perteneció a ninguna clase canónica. Los residuos en la interfaz entre las cadenas variables ligeras y pesadas han sido definidos (Chothia y colaboradores, 1985 J. Mol. Biol., 186, 651-663). Estos residuos son conservados habitualmente en el anticuerpo reformado. En mCBEll, varios de sus residuos son inhabituales en la interfaz, específicamente S34, 146, L89, H91 en VL y Y35, F37, V93, E95 en VH. Residuos de estructura no habituales fueron determinados por análisis de todas las secuencias de cadenas variables de ratón y de ser humano en la versión de septiembre de 1999 de la base de datos Kabat [NCBI, NIH] . Se cree que diferencias específicas para mCBEll pueden indicar mutaciones somáticas que incrementan la actividad de enlace si estas diferencias estuvieran cerca del sitio de enlace. Residuos de ratón no habituales más alejados del sitio de enlace y residuos humanos no habituales fueron removidos si pudieran crear epítopos inmunogenieos en el anticuerpo re-formado. Residuos de estructura no habituales encontrados en mCBEll fueron K3, Mil, Y12, W41, Q69, S72, D81, T83 en la cadena ligera; y F37, T40, E42, A49, N77 en la cadena pesada. Mientras que la mayoría de esos residuos no fueron conservados en los anticuerpos de CBE11 humanizados, algunos de estos residuos de estructura no habituales fueron conservados incluyendo pro ejemplo, F37 y A49 en las cadenas pesadas. Modelado de la Estructura de las Regiones Variables Las cadenas ligeras y pesadas de la presente invención fueron alineadas contra la base datos no redundante para determinar cuadros estructurales a utilizar para construir tres modelos dimensionales en las cadenas ligeras y pesadas de mCBEll. Utilizando BLAST, se encontró que la cadena ligera tenia una identidad de secuencia de 93% con el anticuerpo monoclonal de murino 5g9 (1AHW) , y la cadena pesada tenia una identidad de secuencia del 81% con el fragmento Fab de IGGA2 de murino (Fab 17/9) (1IFH) . Utilizando el paquete de modelado molecular Sybyl (Tripos Inc.), las estructuras tridimensionales de las cadenas ligeras y pesadas fueron construidas utilizando la cadena ligera de 5g9 y la cadena pesada del fragmento IGGA2 Fab, respectivamente. La integridad estructural de los modelos fue evaluada en la consola y se encontró que era razonable. Diseño de las Regiones Variables Re-formadas La correspondencia de homología fue utilizada para seleccionar estructuras de aceptador de ser humano para "aceptar" CDRs de mCBEll . Tanto la base de datos de Kabat como la base de datos no redundante de NCBI, ENTRZ (The National Institutes of Health) fueron investigadas utilizando el programa BLAST. La elección de estructuras de aceptador de ser humano fue efectuada con base en identidad de secuencia entre las estructuras de mCBEll y las estructuras humanas (excluyendo estructuras de anticuerpos previamente humanizados) . La elección eventual de estructuras humanas fue a partir de anticuerpo TNF-Al'CL ( abat ID 004770) contra el factor alfa de necrosis tumoral de ser humano (Griffiths y . colaboradores, 1993 EMBO J. 12:725-734) para la cadena ligera variable (VL) (subgrupo I kappa humano) y anticuerpo FLA-IgG'CL (kabat id 040003) de especificidad desconocida (Malisan y colaboradores, 1996 Blood 87:717-724) para la cadena pesada variable (VH) (subgrupo III humano) . Las estructuras VL y VH de ser humano tienen 15 y 11 diferencias de residuos en comparación con las secuencias de murino. Retromutaciones de las Estructuras de Ser Humano El procedimiento más impredecible en la humanización de anticuerpos monoclonales es la identificación de residuos de estructura críticos a partir del anticuerpo de origen (es decir, en el caso actual, el anticuerpo de origen es de ratón) que deben ser conservados con el objeto de retener sustancialmente las propiedades de enlace del anticuerpo de origen mientras se minimiza al mismo tiempo la inmunogenicidad potencial del anticuerpo resultante. Es especialmente importante conservar residuos canónicos, residuos de empaque de interfaz así como residuos de murino no habituales que están cerca del sitio de enlace. Además, residuos en la "Zona de Vernier" (que forma una plataforma en la cual se apoyan las CDRs) {Foote & Winter, 1992 J. Mol. Biol. 224, 487-499) y los residuos cercanos a CDR H3 se consideran. Mutaciones hacia atrás hacia el anticuerpo de origen (es decir, mutación hacia atrás desde los residuos de estructura de ser humano hasta ratón) se conocen a continuación como retromutaciones . Se efectuaron tres versiones de la cadena re-formada ligera variable (hu-CBEll VL) y cuatro versiones de la cadena re-formada pesada variable (hu-CBEll VH) . En general, la primera versión contiene la mayoría de las retromutaciones y la tercera versión contiene el menor número de retromutaciones (es decir, la más "humanizada") excepto en el paso de la cuarta versión de hu-CBEll VH. La presente invención contempla anticuerpos humanizados derivados de mCBEll que poseen una cadena ligera variable seleccionada entre las cadenas ligeras variables descritas abajo (es decir, VL#1, VL#2 o VL#3) y una cadena pesada variable seleccionada entre las cadenas pesadas variables descritas abajo (es decir, VH#1, VH#2, VH#2, o VH#4) en cualquier combinación. (?) . Cadena ligera: 3 Q (glutamina) ~>K (Usina) Se conserva en la primera versión puesto que experimentos de re-formación previos han mostrado (por ejemplo, olbinger y colaboradores, 1993 Prot. Eng., 6, 971-980) que puede ser importante para el enlace de antigeno o para conformación de CDR. 41 G (glicina) ->W (triptófano) Se conservó en la primera y segunda versiones. 46 L (leucina)->I (isoleucina) Se conservó en la primera y segunda versiones puesto que se trató tanto de un residuo en la interfaz como en la zona de vernier. Además, es un residuo no habitual que ocurre 9 veces en secuencias de ratón y una vez en el ser humano. Afecta probablemente el empaque de las cadenas variables y puede estar en contacto con CDRs. 69 T (treonina) ->Q (glutamina) Este residuo se encuentra en la zona de vernier y puede influenciar la conformación de CDR. El cambio de una T corta a una Q más larga puede también significar que está en contacto con antigeno. La Q ocurre habitualmente 58 veces en ratón y dos veces en el ser humano. Se conservó en la primera versión. 71 F (fenilalanina) ->Y (tirosina) Este residuo está en una posición canónica y fue conservada en todas las versiones . Es también relativamente no habitual en secuencias humanas ocurriendo solamente 25 veces. (B) . Cadena Pesada: 37 V (valina)->F (fenilalanina) Se conservó en la primera, segunda y cuarta versiones. La F en esta posición no es habitual, ocurriendo solamente 15 veces en ratón y 18 veces en el ser humano. Es también un residuo de interfaz. 40 A (alanina)->T (treonina) Se conservó en la primera versión. Mutación en esta posición ha sido ensayada en 5 experimentos de humanización previos aún cuando nunca el cambio A a T. Un ejemplo es el cambio de ? a S en el cubrimiento de BrE-3 (Couto y colaboradores, 1994 Hibridoma, 13, 215-219) en donde se incrementó la afinidad de enlace, aún cuando, la razón nunca fue determinada. En este caso, la cadena pesada fue también del subgrupo III humano. 49 S (seriña)->A {alanina) Este residuo se encuentra bajo las CDRs y en; la zona de vernier y fue conservado en. todas las versiones . : I 89 V (valina)->M (metionina) Fue conservado en la primera I versión. Esta posición ha sido retromutadá en varios i ; experimentos de humanización. Fue conservado en la primera versión. 93 A (alanina) ->V (valina) Esta posición se encuentra tanto en un residuo de interfaz como en la zona de vernier. Se conservó en la primera y segunda versiones. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de cada ;una versiones 'diferentes de las cadenas variables ligeras y pesadas fueron de conformidad con lo siguiente: Cadenas Ligeras Variables Re-formadas Í Cadena ligera variable re-formada de CBE11 - versión I cadena I ligera (VL#1) (Plásmido pAND066) 1 GATATTAAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 D I |K M T Q S P S S L S A S V G D R V T i 61 ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120 I T C A G Q D I K S Y L S W Y Q Q K P 121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 W K A P I L I Y Y A T R L A D G V P S aa41 aa 6 181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 2 0 R F S G S G S G Q D Y T L T I S S L Q P aa69 aa71 241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300 E D F A T Y Y C L Q H G E S P W T F G G 301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321 G T K L E I SEQ ID NO: 3 - representa la', secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera re-formada Vli#l arriba. SEQ ID NO: 4 - representa la; secuencia de aminoácidos de la cadena ligera re-formada VL#1.arriba. Cadena ligera variable re-formada de CBEll - versión 2 cadena ligera (VL#2) (Plásmido p¾ND0 0) 1 GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T 61 ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120 I T C A G Q D I S I Y L S W Y Q Q P 121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 W K A P K I L I Y Y A ;T R L A D G V P S aa41 aa46 181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 R F S G S G S G T D Y 'T L- T I S S L Q P aa7Í 241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300 E D F A T Y Y C L Q H 'G E S P W T F G G 301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321 ¡ G T K L E I K i SEQ ID NO: 5 - representa la j secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable re-formada VL#2 arriba. SEQ ID NO: 6 - representa la .secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable re-formada VL#2 arriba.

Cadena ligera variable re-formada de CBVE11 - versión 3 cadena ligera (VL#3) (Plásmido pAND074) 1 GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T 61 ATCACTTGCAAGGCGGGTCAG3ACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120 I T C K A G Q D I K S Y L S W Y Q Q P 121 GGGAAAGCGCCTAAGCCTCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 G A P K L L I Y Y A T R L A D G V P S 181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 R F S G S G S G T D Y T . L T I S S L Q P aa7X 241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300 E D F A T Y Y C L Q H G ; E S P W T F G G 301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321 I G T K L E I K SEQ ID NO: 7 - representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable re-formada VL#3 arriba. SEQ ID NO: 8 - representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable re-formada VL#3 arriba. Cadenas Pesadas Variables Re-formadas Cadena pesada variable: reformada de CBE11 - versión 1 cadena pesada (VH#1) (Plásmido pADNQ67) 1 GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGC C 60 E V Q L V E S G G G L V K P G G S IJ R L 61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGACT 120 S C A A S G F T P S D Y Y M Y W F R Q T aa37 aa40 121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180 P G K G L E W V A T I S D G G S Y T Y Y : aa49 181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 2 0 P D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y 2 1 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300 L Q M S S L R A E D T A M Y Y C V R E E aa89 aa93 301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S S SEQ ID NO: 9 - representa la secúencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable re-formada VH#1 arriba. SEQ ID NO: 10 - representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable re-formada VH#1 arriba. Cadena pesada variable re-formada de CBE11 - versión 2 cadena pesada (VH#2) (Plásmido pADND071) i 1 GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGÁAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 E V Q L V S S G G G L V k P G G S L K L 61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120 S C A A S G F T F S D Y Y M Y W F R Q A a&37 121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCÍACTAT 180 P G K G L E W V A T I S D G G S T Y Y aa49 j 181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240 P D S V G R F T I S R D N A K N S L Y 1 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300 L Q M S S L R A E D T A V Y Y C V R E E aa93 301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S S SEQ ID NO: 11 - representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable re-formada VH#2 arriba. SEQ ID NO: 12 - representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable re-formada VH#2; arriba. Cadena pesada variable re-formada de CBE11 - versión 3 cadena pesada (VH#3) (Plásmido pADN075) 1 GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 E V Q L V E S G G G L V K P G G S L R L 61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTGCGCCAGGCC 120 S C A A S G F T F S D Y Y M Y, W V R Q A 121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180 P G G L E W V A T I S D G G S Y T Y Y aa 181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240 P D S V G R F T , I S D N A N S L Y 241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG 300 L Q M S S L R A E D T A V Y Y C A R E E 301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 N G N F Y Y F D Y 'W G Q G- T T V T V S S SEQ ID NO: 13 - representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable re-!-formada VH#3 arriba. SEQ ID NO: 14 - representa la secuencia de aminoácidos de la i cadena pesada variable re-formada VH#3 arriba. Cadena pesada variable re-formada de CBE11 - versión 4 cadena pesada (VH#4) (Plásmido pADNQ90) 1 GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCT AGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 - E V Q L V E S G G G L V P G G S L R L 61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTC^GTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120 S C A A S G F T F S D Y Y M Y W F R Q A aa37 121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAA.CCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180 P G K G L E W V A Ij l S D G G S Y T Y Y aa 9 ' 181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240 P D S V K G R F T Í S R D N A K N S L Y 241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG 300 li Q S S L R A E D T A V Y Y C A R E E 301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S S SEQ ID NO: 15 - representa l'a secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable re-formada VH#4 arriba. 1 SEQ ID NO: 16 - representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable re-formada VH#4 arriba. Anticuerpos que consisten de versiones diferentes de las cadenas ligera y pesada fueron elaborados y utilizados para estudios adicionales. Por ejemplo, el anticuerpo que consiste de la cadena variable ligera versión 3 de huCBEll reformada (VL#3) y de la cadena variable pesada versión 4 de huCBEll re-formada (VH#4) , que se conoce como huCBEll#4 o hCBEll, fue elaborado y lineas de células, E46.4 y E77.4, que producen el anticuerpo fueron depositadas ante A. T.C.C. (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357 y 3765, respectivamente) - La invención contempla además equivalente y variantes de las secuencias de VH y VL re-formadas, es decir, las que contienen una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan sustancialmente la unión de LT-ß-R. Anticuerpos de LT-ß-? humanizados que contienen estas secuencias pesada y ligera variables humanizadas pueden ser obtenidos por métodos reco binantes de conformidad con lo descrito en los Ejemplos. Usos Los anticuerpos anti- LT-p-R humanizados de la presente invención tienen uso en el tratamiento de condiciones de enfermedad en donde la activación de LT-ß-? es terapéuticamente benéfica. Tales condiciones incluyen el tratamiento, la prevención o la reducción del avance, severidad o efectos de neoplasias.

Una modalidad de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un mamífero (es decir, un ser humano) para una condición asociada con una proliferación celular indeseada por administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende anticuerpos LT-p-R humanizado de la presente invención. En otra modalidad de la invención se trata de un método para el tratamiento de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene un tumor sólido (por ejemplo, carcinoma) que sóbreexpresa ???-ß-R, que comprende la administración a dicho mamífero de un anticuerpo ???-ß-R humanizado que se une a LT-ß-R en una cantidad efectiva para reducir el volumen del tumor. Ejemplos de cánceres cuya proliferación celular es modulada por LT-p-R pueden ser tamizados por la medición in vitro del nivel de mensaje de LT-p-R y/o ligando de LT-^-R (es decir, Ltoflp2 o LIGHT) expresado en bibliotecas de tejido tumoral. Bibliotecas de tejido tumoral en las cuales mensaje de ?,?-ß-R y/o ligando de ?,?-ß-R (es decir LTcd^2 o LIGHT) es altamente expresado serían candidatos. Losa tipos de tumores contemplados en la presente invención incluyen tumores sólidos incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, cáncer pulmonar no de células pequeñas (NSCLC) , cáncer colo-rectal (CRC) , cáncer de mama, así como cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de piel, de estómago, de esófago y de vejiga.

Los anticuerpos humanizados de la presente invención que son utilizados en el tratamiento de condiciones asociadas con la proliferación indeseadas de células en particular terapia tumoral, inhiben de manera provechosa el crecimiento de células tumorales, de conformidad con lo medido, por ejemplo, por la disminución del volumen del tumor mayor que aproximadamente 10%, 20%, 30% ó 40% y con mayor provecho mayor que aproximadamente 50%. Los anticuerpos humanizados son obtenidos a través de tamizado (véase, por ejemplo, los comentarios en el Ejemplo 3) . Por ejemplo, anticuerpos humanizados para uso en la presente invención pueden ser seleccionados con base en un volumen tumoral disminuido versus células cancerosas no tratadas (es decir, mayor que aproximadamente 10%, 20%, 30% 40% ó 50%) . La presente invención ofrece también composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humanizado de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados, por ejemplo, y sus formulaciones, se describen en Remington' Pharmaceutical Sciences, 16a edición, 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y colaboradores. Típicamente, una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable se utiliza en la formulación para que la formulación sea isotónica. Ejemplos del vehículo incluyen amortiguador, como por ejemplo, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa.

El pH de la solución es de preferencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y con mayor preferencia de aproximadamente 7.4 a aproximadamente 7.8. Vehículos adicionales incluyen preparaciones de liberación prolongada como por ejemplo, matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, liposomas, películas o micropartículas . Será aparente a los expertos en la materia que ciertos vehículos pueden ser más preferibles según la vía de administración y la concentración de la composición farmacéutica administrada. La administración puede lograrse por inyección (inyección intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular) o bien por otros métodos tales como infusión que aseguran la entrega al torrente sanguíneo de manera efectiva. Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden ser administrados en una dosis efectiva para tratar la condición clínica particular en cuestión. La determinación de una formulación farmacéutica preferida y un régimen de dosificación terapéuticamente eficiente para una aplicación dada está dentro del alcance de la técnica tomando en cuenta, por ejemplo, el peso y la condición del paciente la magnitud del tratamiento deseado y la tolerancia del paciente con relación al tratamiento. Por ejemplo, una dosificación efectiva estará dentro de un rango de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal por día. Más particularmente, aproximadamente 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, o 25 mg, por kilogramo de peso corporal por día. Alternativamente, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 miligramos, más particularmente, aproximadamente 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, ó 25 mg, por kilogramo de peso corporal por semana. Alternativamente, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 miligramos, más particularmente, aproximadamente, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, ó 25 mg, kilogramo de peso corporal por dos semanas. Alternativamente, de aproximadamente 0.0.5 a aproximadamente 100 miligramos, con mayor particularidad, aproximadamente 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.67 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mb, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg ó 25 mg, kilogramo de peso corporal por tres semanas. Alternativamente, aproximadamente 0.0.5 a aproximadamente 100 miligramos, más particularmente, aproximadamente 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.67 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mb, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg ó 25 mg, kilogramo de peso corporal por cuatro semanas . La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo siguiente, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteína, e inmunología, que se encuentra dentro del alcance de la técnica. Tales técnicas se describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio], 2a edición. (Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning [Clonación de AND], Volúmenes I y II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis [Síntesis de Oligonucleótidos] , (M.J. Gait, ed. ) , 1984; Patente Norteamericana No. 4,683,195 (Mullís y colaboradores); Nucleic Acid Hybridization [Hibridación de Ácido Nucleico] (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcripción y traducción (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells [Cultivo de Células Animales] (R.I. Freshney, ed.). Alan R. Liss, Inc. 1987; Immobilized Cells and Enzymes [de Células y Enzimas Inmovilizadas], IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning [Una Guía Práctica de la Clonación Molecular] (B. Perbal) , 1984; Methods in Enzymology [Métodos en Enzimologías] , Volúmenes 154 y 155 (Wu y colaboradores eds.), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells [Vectores de Transferencia de Genes para Células de Mamíferos] (J.H. Miller y M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor laboratory; Imiaunochemical Methods in Cell and Molecular Biology [Métodos inmunoquimicos en Biología Celular y Molecular] (Mayer y Walker, eds.)f Academic Press, Londres 1987; Handbook of Experiment Immunology [Manual de Inmunología Experimental], Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Emgbryo [Manipulación del Embrión de Ratón], Cold Spring Harbor laboratory Press, 1986. Los siguientes Ejemplos se ofrecen para ilustrar la presente invención y no deben considerarse como limitativos de la misma. EJEMPLOS: E emplo 1 Construcción y Expresión de chCBEll 7ADNc que codifican las regiones variables de CBE11 de murino de las cadenas pesada y ligera fueron utilizados para construir vectores para la expresión de quimeras murino-ser humano (chCBEll) en donde las regiones variables de muCBEll fuero unidas a las regiones constantes kappa IgGl de ser humano . Para la construcción de las quimeras de cadena pesada, se sub-clonó un fragmento PstI-BstEII de 0.36 kb a partir del sub-clon de cadena pesada CBE11, pEAG970, en el fragmento de vector PstI-BstEII de 2.82 kb fosfatado a partir de los plásmidos de cadena pesada 5a8 pLCB7 (5a8 es un mAb específico para CD4 clonado moleculármente previamente caracterizado en Biogen) , para agregar una secuencia de señal de cadena pesada de murino y empalmar el sitio de donador a la región variable de cadena pesada de muCBEll. En este plásmido, que se conoce como pEAG979, el extremo N maduro de cadena pesada difiere por dos residuos de la secuencia N-terminal de cadena pesada de CBE11 auténtica purificada derivada de degradación de Edman, puesto que fue determinada por cebador durante una reacción en cadena de polimerasa. Para corregir el extremo N de cadena pesada, pEAG979 fue sometida a mutagénesis por eliminación de sitio único (USE) empleando un kit de mutagénesis USE de Amersham Pharmacia Biotech siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los plásmidos sometidos a mutación fueron identificados por tamizado para determinar la presencia de cambios Avall, PstI, y Rsal introducidos. La secuencia de cadena pesada en el plásmido resultante pEAG 81 fue confirmada por secuenciamiento de ADN. El fragmento de dominio variable de cadena pesada Notl-HindIII de 0.44 kb proveniente de pEAG981 y el fragmento HindIII-Notl de 1.21 kb del plásmido pEAG964, que contiene una región constante de IgGl de ser humano, fueron sub-clonados en el sitio Notl del plásmido derivado de vector de expresión EBV de pCEP4 (Invitrogen) , pCH269, produciendo el plásmido pEAG983.

Para la construcción de la quimera de cadena ligera, un fragmento Notl-EcoRV de 0.11 kb del plásmido pMDR985 y un fragmento EcoVR-BamHI de 0.37 kb proveniente del plásmido de dominio variable de cadena ligera de CBE11, pEAG967, fueron sub-clonados en el fragmento de vector Notl-BamHI de 2.94 kb fosfatado del vector de clonación pBluescriptIISK+ de Stratagene, para agregar una secuencia de señal de cadena ligera de murino y un sitio 5' Notl en el plásmido resultante, pEAG978. Este plásmido fue sometido a mutagénesis USE utilizando un kit de mutagénesis de USE de Amersham Pharmacia Biotech siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, con cebadores mutagénicos que codificaron una sustitución V3K para corresponder al extremo N de cadena ligera CBE11 auténtico, y que introdujo un sitio BglII en el extremo 3' del dominio variable de cadena ligera. Plásmidos mutados fueron identificados por tamizado para determinar la presencia de cambio de sitio BglII, EcoRV, y Msel introducidos . La secuencia de cadena ligera en el plásmido resultante pEGA980 fue confirmada por secuenciamiento de ADN. El fragmento de dominio variable de cadena ligera Not-BglII de 0.41 kb de pEAG980 y el fragmento Bcll-Notl de 0.68 kb del plásmido pEAG963, que contiene el dominio constante de cadena ligera kappa de ser humano, fueron sub-clonados en el sitio Notl del plásmido derivado del vector de expresión de EBV pCEP4 (Invitrogen) , pCH269, produciendo el plásmido de pEAG982. Vectores de expresión (vector de cadena pesada de ChCBEll, pEAG983 y vector de cadena ligera de chCBEll, pEAG982) fueron co-transfectados en células 293-EBNA y células transfectadas fueron probadas para determinar la secreción de anticuerpos y la especificidad (vector vacio - y ch5c8 (un mAb especifico para CD154 clonado molecularmente previamente caracterizado en Biogen) - células transfectadas sirvieron como controles) . Un análisis Western blot (desarrollado con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humano) de inmunoprecipitados de proteina A de Usados de células enteras y medio acondicionado indicaron que células transfectadas por chCBEll sintetizaron y secretaron eficientemente cadenas pesadas y ligeras a niveles similares a las células transfectadas con ch5c8. Un análisis FACS de células ?,?-ß-R que expresan HT-29 teñidas con medio acondicionado de células transfectadas indicaron que el anticuerpo de chCBEll se unió y produjo patrones de tinción similares a los de muCBEll, mientras que el medio acondicionado de células transfectadas con ch5c8 y ficticia no tiñeron LT-ß-?. en células HT-29. CBE11 quimérico producido a partir de transfección transiente fue purificado y demostró que inducía la secreción de IL-8 por células de melanoma A375 que expresa ???-ß-R y que inhibió el crecimiento de células de adenocarcinoma de WiDRr en ratones desnudos . Ejemplo 2 Construcción y Expresión de huCBEll El diseño de los dominios variables reformados para producir CBE11 humanizado (huCBEll) se efectuó de conformidad con lo descrito arriba. La elección de estructuras de aceptador de ser humano fue por correspondencia de homología: sub-grupo kappa humano I mftb TNF-A1 para la cadena ligera (Griffiths y colaboradores, 1993) , y subgrupo de ser humano III mAb FLA-IgG para la cadena pesada (Malisan y colaboradores, 1996) . Se diseñaron tres versiones de cada una de las cadenas reformadas ligeras variables y cuatro versiones de las cadenas reformadas pesadas variables. En general, la primer versión contiene la mayor cantidad de retromutaciones a las secuencias de donador de murino, mientras que la última versión contiene el menor número de dichas retromutaciones (es decir, es la versión más "humanizada") . Las regiones variables de huCBEll fueron elaboradas por mutagénesis de eliminación de sitio único (USE) empleando un kit de mutagénesis USE de Amersham Pharmacia Biotech siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, empleando los plásmidos de dominio variable de chCBEll como templados de inicio. Los cebadores mutagénicos para los cambios de estructura (FR) se describen a continuación. La secuencia ADNc de las estructuras de aceptadores de ser humano (base de datos de Kabat #004770 para la cadena ligera y Kabat #040003 para la cadena pesada) fue utilizada, con mutaciones silenciosas introducidas para producir cambios de sitio de restricción para facilitar la identificación de los plásmidos mutados. Los plásmidos mutados fueron identificados por tamizado de los cambios introducidos de sitios de restricción. Las secuencias de ADNc de región variable en los plásmidos resultantes fueron confirmadas por secuenciamiento de ADN. VH#1 utilizó el templado de pEAG981 con los cebadores siguientes: cebador de FR1 5' GCC TGG AGG GTC CCT GAG GCT CTC CTG TGC AGC CTC 3' (SEQ ID NO: 17), que introdujo un sitio Bsu36I, cebador FR2: 5' GTT TCG CCA GAC TCC GGG AAA GGG GCT GGA GTG GGT CGC AAC 3' (SEQ ID NO: 18), que introdujo sitios Ncil y Hpall; y cebador FR3: 5'CAG AGA CAA TGC CAA GAA CAG CCT CTA CCT GCA GAT GAG CAG CCT GAG GGC TGA GGA CAC AGC CAT G 3' (SEQ ID NO: 19) , que introdujo sitios Bsu361 y PstI y remueve un sitio Rsal. El plásmido VH#1 resultante fue designado pADN067. VH#2 utilizó el templado pAND067 con los cebadores siguientes: cebador FR2 5' CAT GTA TTG GTT TCG CCA GGC CCC GGG AAA GGG GCT GC 3r (SEQ ID NO: 20), que introdujo un sitio Smal; y cebador FR3: 5' GGG CTG AGG ACA CAG CTG TGT ATT ACT GTG TAA GAG 3' (SEQ ID NO: 21), que introdujo un sitio PvuII. El plásmido VH#2 resultante fue designado pADN071. VH#3 utilizó el templado de pAND067 con los cebadores siguientes: cebador FR2: 5' GTG ACT ATT ACA TGT ATT GGG TGC GCC AGG CCC CGG GAA AGG GGC TGG AG 3' (SEQ ID NO: 22), que introdujo sitios Smal y Hhal; y cebador FR3: 5' GAG GGC TGA GGA CAC AGC TGT GTA TTA CTG CGC AAG AGA GGA GAA TGG TAA C 3' (SEQ ID NO: 23), que introdujo los sitios Pv II y Fspl. El plásmido VH#3 resultante fue designado pAND075. Los vectores de expresión para las cadenas pesadas de huCBEll fueron elaborados mediante la sub-clonación de los fragmentos de dominio variable de cadena pesada Notl-HindIII de 0.44 kb de pAND067, pAND071, o pAND075, y el fragmento HindIII-Notl de 1.21 kb a partir del plásmido pEAG964, que contiene una región constante de IgGl de ser humano, fueron sub-clonados en el sitio Notl del plásmido pCH269 derivado del vector de expresión de EBV pCEP4, produciendo vectores de expresión de cadena pesada pAND069 (VH#1) , pADN073 (VH#2), y pAND077 (VH#3) . VL#1 utilizó el templado de pEAG980 de plásmido con los cebadores siguientes: FR1: cebador 5' CTT GCA AGT GAT AGT GAC CCT GTC TCC CAC CGA TGC AGA CAA GGA TGA TGG AGA CTG GGT CAT C 3' (SEQ ID NO: 24), que removió los sitios Hinfl y Nsil; FR2 : cebador 5f CAT AAT AGA TCA GGA TCT TAG GCG CTT TCC ATG GTT TCT GCT G 3' (SEQ ID NO: 25) , que introdujo sitios Haell y Hhal; y cebador FR3 : 5' GTA GAC AGT AAT AAG TTG CGA AAT CCT CAG GCT GCA GGC TGC TGA TGG TTA GAG TAT AAT CTT GCC CAG ATC 3' (SEQ ID NO: 26), que introdujo sitios Bsu361, Ddel, y PstI. El plásmido "VL#1 resultante fue designado pAND066.

VL#2 utilizó el templado de pAND066 de plásmido con. los cebadores siguientes: F 1: cebador 5' GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3' (SEQ ID NO: 27), que introdujoun sitio EcoRV; y cebador FR3: 5' GAT GGT TAG AGT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G 3' (SEQ ID NO: 28), que introdujo un sitio Rsal. El plásmido VL#2 resultante fue designado pAND070. VL#3 utilizó el templado de plásmido pAND066 con los cebadores siguientes: cegador FR1 5' GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3' (SEQ ID NO: 29) , que introdujo un sitio EcoRv; cebador FR2 5f CAA CCT TGT TGC ATA ATA GAT CAG AAG CTT AGG CGC TTT CCC TGG ??? CTG CTG GTA CC 3' (SEQ ID NO: 30) , que introdujo un sitio HindIII y removió los sitios Ncol y Styl ; y el cebador FR3 5' GAT GGT TAG AGT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G3' (SEQ ID NO: 31); que introdujo un sitio Rsal. El plásmido VL#3 resultante fue designado pAND074. Vectores de expresión para las cadenas ligeras de huCBEll fueron formados mediante la sub-clonación de los fragmentos de dominio variable de cadena ligera Notl-BglII de 0.41 kb a partir de pAND066, pAND070, o pAND07 y el fragmento de Bell-Notl de 0.68 kb del plásmido pEAG963, que contiene un dominio constante de cadena ligera kappa de ser humano, fueron sub-clonados en el sitio Notl del plásmido derivado del vector de expresión pCEP4 EBV, pCH269, produciendo vectores de expresión de cadena ligera pAND068 (VL#1), pAND072 (VL#2) , y pAND076 (VL#3) . Vectores de expresión fueron co-transfectados en células 293-EBNA y células transfectadas fueron probadas para secreción de anticuerpos y especificidad (las células transfectadas con vector vacio sirvieron como control negativo) . Un análisis Western blot (desarrollado con anticuerpos de cadena pesada y ligera antihumanos) de proteina A inmunoprecipitó a partir de lisado de células enteras y medio acondicionado lo que indica que células transfectadas con huCBEll sintetizadas y secretadas eficientemente cadenas pesadas y ligeras en niveles similares a células transfectadas con chCBEll. Un análisis FACS de células HT-29 que expresan LT-p-R se tiñeron con medio acondicionado a partir de células transfectadas lo que indicó que mAb de huCBEll#3 se une menos que mAbs de huCBE#l y huCBEll#2 en comparación chCBEll (Tabla 1 abajo) en donde huCBE#l (VL#1) ; huCBE#2 (VL#2 con VH#2) y huCBEll#3 (VL#3 con VH#3) . Co-transfecciones mixtas y correspondientes sugieren que la reducción podria ser atribuida a VH#3, que se deferencia de VH#2 en dos residuos de estructura: FR2 F37V y FR3 V97A. Para examinar las contribuciones individuales de cada uno de estos cambios, se construyeron nuevos vectores de expresión de cadena pesada. El plásmido pAND089, la variante F37V de VH#2, fue elaborado mediante la sub-clonación del fragmento Notl-PstI de 311 pares de bases a partir de pAND075, el fragmento PstI-HindIII de 126 pares de bases de pAND071, y el fragmento HindIII-Notl de 1.21 kb del plásmido pEAG964 en el sitio Notl del plásmido derivado del vector de expresión pCEP4 EBV, pCH269. El plásmido pAND090, la variante V93A de VH#2, fue elaborado mediante la sub-clonación del fragmento Notl-PstI de 311 pares de bases de pAND0717 el fragmento PstI-HindIII de 126 pares de bases de pAND075, y el fragmento HindIII-Notl de 1.21 kb del plásmido pEAG964 en el sitio Wotl del plásmido derivado de vector de expresión pCEP4 EBV, pCH269. Estas cadenas pesadas quiméricas H2/H3 fueron co-transfectadas en células de 293-EBNA con VL#2 o VL#3. Un análisis FACS indicó que la variante V93A H2 restauró la unión LT-ß-? cuando fue aparada con VL#3 (Tabla 1, supra) . El acoplamiento de pAND076 y pAND090 fue designado huCBEll#4 (Tabla 1, supra) . Co-transfecciones de células 293-EBNA con chCBEll y huCBEll versiones #1-4 fueron incrementadas y se cosechó el medio acondicionado. El anticuerpo fue purificado en Protein A-Sepharose. mAbs purificados fueron ensayados para actividad. TABLA 1. Tinción FACS de células HT-29 por chCBEll y huCBEll Cadena Pesada Cadena Ligera Con relación a MFI ChCBEll pEAG982 pEAG983 1.00 HuCBEll#1 PAMD068 pAND069 1.00 HuCBEll#2 pAND072 pAND073 1.00 HuCBEll#3 pAND076 pAND077 0.62 L2/H3 pAND072 p7AND077 0.42 L3/H2 pAND076 pAD073 1.00 L2/F37V H2 pAND072 pAND089 0.65 L2/V93A H2 pAND072 pAND090 0.75 L3/F37V H2 pAND076 pAND089 0.80 HuCBEll#4 pANDO76 pAD090 1.00 El medio acondicionado a partir de células pasa eramente transíectadas fue utilizado para teñir células HT-29 mediante incubación durante 30 minutos en hielo, lavando las células dos veces con amortiguador de FACS (PBS con FBS al 5% y azida de sodio al 0.05%), tiñendo con IgG anti-humana conjugada con PE (H + L) , Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., durante 30 minutos en hielo en amortiguador de FACS, lavando las células dos veces con amortiguador de FACS, y resuspendiendo en amortiguador de FACS para análisis. MFI relativo se refiere a MFI medio normalizado al observador para chCBEll. Los datos muestran el promedio de dos transíecciones independientes. EJEMPLO 3 Agonismo de IL-8 en células A375 mAbs purificados fueron ensayados para determinar su actividad. Los resultados de un ensayo de liberación de IL-8 sobre células de melanoma de ser humano A375 como se muestra en la Figura 1 que mide la cantidad de IL-8 liberado al unirse anticuerpos anti-LT- -R con un LT-^-R expresado en la superficie de células de melanoma de ser humano A375. Las células A375 fueron colocadas en platos a 10°/mi en placas de 96 pozos que contenían ya sea anticuerpos solubles o bien anticuerpos capturados en pozos revestidos con IgG Fe antihumana de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . Las placas de cultivo fueron incubadas durante la noche. El medio condicionado fue cosechado y analizado por IL-8 a través de ELISA. EJEMPLO 4 Cítotoxicidad en células WiDr Los resultados de un ensayo de citotoxicidad empleando células de cáncer de colon WiDr con anticuerpos anti-LT-p-R solubles en pozos revestidos con IgG Fe anti-humana que demuestran que los anticuerpos anti-LT-p-R incrementan la toxicidad en células cancerosas como se muestra en la Figura 2. Células WiDr fueron colocadas en placas a 6xl0Vml en presencia de 80 unidades/ml de -huIF -gamma en placas de 96 pozos que contenían ya sea anticuerpos solubles o bien anticuerpos capturados en pozos revestidos con IgG Fe antihumana de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . Las placas de cultivo fueron incubadas durante 5 días. Se agregó MTT durante 4 horas y el precipitado resultante fue disuelto por incubación durante la noche con SDS al 10% en HCl 10 mM y se leyó la densidad óptica en un lector de microplacas. EJEMPLO 5 El anticuerpo que consiste de cadena variable ligera versión 3 de . huCBEll reformada (VL#3) y cadena variable pesada versión 4 de huCBEll reformada, que se conoce como huCBEll#4 o hCBEll, fue elaborado y la línea de células que produce el anticuerpo fue depositada ante A.T.C.C. (designación a depósito de patente ante ATCC PTA-3357) . Las: secuencias de polipéptidos enteras de cada una de las ; cadenas ligeras y pesadas, incluyendo los dominios constantes de conformidad con l siguiente: \ Secuencia de cadena ligera versión 3 de huCBEll madura ;(SEQ ID NO:; 32) : I ' 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKAGODI SYLSWYOO P GKAPKLLIYY ' 51 ATRLADGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCLQ HGESPWTFGG ! 101 GTKLEI |RTV AAPSVFIFPP SDEQL SGTA SWCLLNNFY PREA VQW V i 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDS D STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG ' 201 LSSPVT SFN RGEC] Las CDRs son subrayadas; la retro-mutación F71Y se presenta en negritas; el dominio constante está entre corchetes. Secuencia de cadena pesada versión 4 de huCBEll madura (SEQ ID NO:, 33) : V37F S49A 1 EVQLVESGGG LV PGGSLRL SCAASGFTFS DYYMYWFRQA PGKGLEWVAT . 51 1SDGGSYTYY PDSVKGRFT1 SRDNA NSLY LOMSSLRAED TAVYYCAREE 101 NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS [ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 201 YICNVNHKPS' NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP 251 KDTLM1SRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 301 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ 351 VYTLPPSRDE'LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV HEALHNHYT QKSLSLSPGJ Las CDRs son subrayadas; las retro-mutaciones V37F y; S4 A se presentan en negritas; el dominio constante se encuentra indicado entre corchetes . ' i Ratones desnudos de 6 semanas de edad fueron inyectados de i . 1 manera intraper^toneal con 100 ug de anticuerpo ahti-LFA3 i (1E6), 100 ug de anticuerpo anti-LTBR (h CBEll#4) o ' bien no fueron inyectados (control) . Los animales fueron después I inyectados subcutáneamenté con lxl06 de células de adenocarcinoma de colon WIDR. Los ratones tratados con huCBEll#4 fueron! tratados de nuevo semanalmente con 100 ug de anticuerpo y los' animales mCBEll fueron tratados de nuevo el dia 14 solamente,. El tamaño del tumor fue medido semanalmente y se calculó el .volumen de la esfera tumoral (Figura 3) . Los animales fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron el volumen de 2.01 cmá (16 mm de diámetro) y su muerte, fue anotada en la gráfica de supervivencia (Figura 4) . - EJEMPLO 6 Ratones desnudos de 6 semanas de edad fueron ya sea inyectados intraperitonealmente con 100 ug de anticuerpo anti-LTBR (huCBEll#4) o bien no fueron inyectados (control) . Los animales fueron después inyectados subcutáneamente con lxlO6 de células de adenocarcinoma de colon WIDR. Los ratones tratados con huCBEll#4 fueron tratados de nuevo semanalmente con 100 ug de huCBEll#4. El tamaño del tumor fue medido semanalmente y el volumen de la esfera de tumor fue calculado . Volúmenes tumorales mostrados representan el promedio de 10 animales de control y 8 animales tratados con huCBEll#4 (Figura 5) . El tratamiento semanal con huCBEll#4 inhibió significativamente la velocidad de crecimiento de tumores WIDR implantados subcutáneamente en ratones desnudo . Los animales tratados con anticuerpo hasta el día 21 siguen presentando velocidades reducidas de crecimiento tumoral dos semanas después de la suspensión del tratamiento. EJEMPLO 7 huCBEll#4 Disminuye el Crecimiento de Tumores de WIDR de Pre-cultívo e Incrementa la Supervivencia en Ratones Desnudos que llevan tumor WIDR 10° células WIDR fueron pre-cultivadas subcutáneamente durante 10 días en ratones desnudos. Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas ya sea de. PBS o bien huCBEll#4 semanalmente o bien mCBEll una semana si una semana no. Los pesos de los tumores fueron calculados a partir de las mediciones de ancho y longitud y los animales con tumores mayores de 2000 mg fueron sacrificados, los pesos de sus tumores al momento del sacrificio contribuyeron al promedio estadístico. Barras de error representan el error estándar. Se calcularon los pesos de los tumores empleando la fórmula: (Ancho x Ancho x Longitud) /2- peso del tumor en mg. Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 6 y muestran que huCBEll#4 puede reducir el crecimiento de tumores pre-crecidos in vivo. Además, tumores fueron cultivados y tratados de conformidad con lo descrito arriba y se determinó la supervivencia porcentual de los animales. Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 7 y muestran que huCBEll#4 puede inducir una supervivencia prolonga in vivo en ratones con tumores pre-crecidos . EJEMPLO 8 Medición de afinidad de anticuerpo Células HT-29 fueron cultivadas en DMEM complementado con L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio y suero bovino fetal al 10%. Las células fueron lavadas una vez con PBS y removidas de la placa mediante incubación a temperatura ambiente durante cinco minutos con PBS más 20 mM EDTA. Las células fueron centrifugadas a 1000 rpm (110 x g) durante cinco minutos y resuspendidas a una densidad de 1 x 107 células/mL en PBS.

Anticuerpo anti-I^R de huCBEll#4 y anti-CD40L humanizado como control negativo fueron diluidos en PBS y se efectuó una dilución 1:4 en serie de 12 puntos hasta obtener un rango de concentraciones de 2.37 pM - 10 uM. 100 L de suspensión de células y 100 pL de dilución de anticuerpos fueron agregados juntos a cada pozo de una placa de microtitulación en fondo de V de 96 pozos. El anticuerpo y las células fueron incubados a una temperatura de 4°C durante 2 horas. La placa fue sometida a centrifugación a 1000 rpm (110 x g) durante 10 minutos a una temperatura de 4°C. El sobrenadante fue desechado y la pella de célula fue lavada con PBS frió seis veces . Se diluyó un conjugado de IgG antihumano de cabra-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch) 1:100 en PBS y se agregaron 200 pL a cada pozo. Las células fueron incubadas con este anticuerpo secundario durante una hora a 4°C, centrifugadas de conformidad con lo descrito arriba, y lavadas una vez en PBS frió. Las células fueron después transferidas a tubos de ensayo de poliestireno. La intensidad de fluorescencia fue medida en un instrumento FACS Calibur (Beckton Dickinson) . Los valores de intensidad de fluorescencia medios de la tinción para control de enlace no especifico anti-CD40L fueron representados gráficamente contra la concentración de anticuerpo en Delta Graph. Los valores fueron ajustados a una linea recta y se restaron los valores de enlace no especifico teóricos para cada concentración de anticuerpo a partir de cada punto de dato para la serie de diluciones de huCBEll#4. Estos valores de intensidad de fluorescencia específicos fueron después representados gráficamente contra concentraciones de huCBEll#4 en una escala logarítmica. La curva resultante tiene una forma de campana y es simétrica, y refleja la auto-inhibición del enlace de anticuerpo en altas concentraciones . La mitad izquierda de esta curva fue ajustada a una ecuación de cuatro parámetros para encontrar la afinidad funcional del anticuerpo. El ajuste de curva resultante proporciona un valor EC50 de 60 pM para la unión de uCBEll#4 con células HT-29. Será aparente a los expertos en la materia que varias modificaciones y variaciones pueden efectuarse a los polipéptidos, composiciones y métodos de la invención sin salirse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, se contempla que la presente invención abarque las modificaciones y variaciones de esta invención a condición que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

LISTA DE SECUENCIAS <110> BIOGEN, INC. GARBEE., Ellen LYNE, Paul SALDHANA, Jose W. <120> ANTICUERPOS HUMANIZADOS ANTI—LT—ß-R <130> A100 PCT <150> 60/240,285 <151> 2000-10-13 <150> 60/275,289 <151> 2001-03-13 <150> 60/299,987 <151> 2001-06-21 <160> 33 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> murino <400> 1 Asp lie Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp lie Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys lie Leu lie Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> raurino <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyx Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr He Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 321 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 3 gatattaaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60 atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120 tggaaagcgc ctaagatcct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct 240 gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Asp lie Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp lie Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ala Pro Lys lie Leu lie 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg P e Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 5 <211> 321 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 5 gatatccaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60 atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120 tggaaagcgc ctaagatcct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tggtacagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct 240 gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp lie Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ala Pro Lys lie Leu lie 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 7 <211> 321 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 7 gatatccaga tgacccagtc tccatcatcc fctgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60 atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120 gggaaagcgc ctaagcctct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tggtacagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct 240 gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp lie Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211> 360 <212> ANA <213> Homo Sapiens <400> 9 gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccagact 120 ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac 240 ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagccatgt attactgtgt aagagaggag 300 aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp 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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 4690 4695 4700 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 4705 4710 4715 4720 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 4725 4730 4735 Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 4740 4745 4750 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 4755 4760 4765 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 4770 4775 4780 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 4785 4790 4795 4800 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 4805 4810 4815 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 4820 4825 4830 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 4835 4840 4845 Leu Ser Pro Gly 4850

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un anticuerpo humanizado anti receptor de linfotoxina-beta (???-ß-R) cuyas regiones de determinación complementarias de cadena ligera son definidas por los residuos de aminoácidos 24 a 34, 50 a 56, y 89 a 97 de SEQ ID NO: 1, y cuyas regiones de determinación complementarias de cadena pesada son definidas por los residuos de aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 2., y en donde el anticuerpo comprende por lo menos uno de los residuos siguientes en su cadena ligera: K3, W41, 146, Q69 e Y71; o por lo menos uno de los residuos siguientes en su cadena pesada: F37, T40, A49, M89 y V93 (convención de numeración de Kabat) . Un anticuerpo humanizado anti receptor de linfotoxina-beta (???-ß-R) cuyas regiones de determinación complementarias de cadena ligera son definidas por los residuos de aminoácidos 24 a 34, 50 a 56, y 89 a 97 de SEQ ID NO: 1, y cuyas regiones de determinación complementarias de cadena pesada son definidas por los residuos de aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 2, y en donde el anticuerpo comprende el residuo Y71 en su cadena ligera (convención de numeración de Kabat) . Un anticuerpo humanizado anti receptor de linfotoxina-beta (LT^-R) cuyas regiones de determinación complementarias de cadena ligera son definidas por los residuos de aminoácidos 24 a 34, 50 a 56, y 89 a 97 de SEQ ID NO: 1, y cuyas regiones de determinación complementarias de cadena pesada son definidas por los residuos de aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 2, y en donde el anticuerpo comprende los residuos F37 a A49 en su cadena pesada (convención de numeración de Kabat) . El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los residuos de aminoácidos 1 a 107 de SEQ ID NO: 8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los residuos de aminoácidos 1 a 120 de SEQ ID NO: 16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo comprende además una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los residuos de aminoácidos 1 a 120 de SEQ ID NO: 16. Un anticuerpo que comprende las mismas secuencias de polipéptidos de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la linea de células E46.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) o linea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3765) . 8. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo conserva sustancialmente las propiedades de unión del anticuerpo de origen. 9. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo está unido además a una inmunotoxina. 10. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo está unido adicionalmente a un fármaco quimioterapéutico . 11. Una composición que comprende un anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 12. Un método para el tratamiento o la reducción del avance, severidad o efectos de neoplasia en un ser humano, que comprende la administración de la composición de la reivindicación 11. 13. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para la cadena ligera de un anticuerpo producido por la línea de células E46.4 ((designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) o una línea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3765) . 14. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la linea de células E46.4 ((designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) o linea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3765) . 15. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para residuos 1 a 107 de SEQ ID NO: 8. 16. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificadora para residuos 1 a 120 de SEQ ID NO: 16. 17. Una célula de linea de células E46.4 (designación de depósito de patente ATCC PTA-3357) o linea de células E77.4 (designación de depósito de patente ATCC 3765).