EA006945B1 - ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ЛИМФОТОКСИНА-β (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ, ТЯЖЕСТИ ИЛИ ПОСЛЕДСТВИЙ НЕОПЛАЗИИ У ЧЕЛОВЕКА, ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ), КЛЕТКА КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ (ВАРИАНТЫ) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к гуманизированным антителам против LT-β-R и способам их применения.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение в основном касается гуманизированных антител, специфических в отношении рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-β-Κ).

Уровень техники

Рецептор лимфотоксина-β (в данном контексте обозначаемый ЬТ-β-Κ) является представителем семейства фактора некроза опухолей, которое играет хорошо охарактеризованную роль как в развитии иммунной системы, так и в функциональной поддержке ряда клеток иммунной системы, включая фолликулярные дендритные клетки и некоторые типы стромальных клеток (см. статью МайнтоЮ и соавт., 1ттипо1. Кеу., 156:137, (1997)). Известные лиганды ЬТ-β-Κ включают в себя ЬТа1/в2 и второй лиганд, называемый ЬЮНТ (см. статью Маил и соавт., 1ттиш1у, 8:21, (1998)). Было показано, что активация ЬТ-β-Κ индуцирует апоптотическую гибель некоторых линий раковых клеток ίη νίνο (РСТ/ИБ96/01386). Воздействие агентов, активирующих агонист ЬТ-β-Κ, таких как специфические гуманизированные антитела против ЬТ-β-Κ, было бы, таким образом, эффективным для лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий новообразования у субъектов (например, человека).

Сущность изобретения

В данном изобретении представлены гуманизированные антитела против рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-β-Κ) и способы применения данных антител для лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъектов (например, человека).

В частности, изобретение охватывает гуманизированное антитело, которое специфически связывает ЬТ-β-Κ (например, человеческий ЬТ-β-Κ). Данное антитело содержит гипервариабельные участки (т.е. участки, определяющие комплементарность) легкой цепи, определенные остатками аминокислот 24-34, 50-56 и 89-97 последовательности БЕЦ Ш N0:1 и/или гипервариабельные участки тяжелой цепи, определенные остатками аминокислот 31-35, 50-66 и 99-109 последовательности БЕЦ Ш N0:2 и, кроме того, в своей легкой цепи содержит по меньшей мере один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих остатков: К3, \У4Е 146, 069 и Υ71, или в своей тяжелой цепи содержит по меньшей мере один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих остатков: Р37, Т40, А49, М89 и У93 (соглашение о нумерации КаЬа1).

Гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, может содержать последовательность вариабельного домена легкой цепи, определенного остатками аминокислот 1-107 последовательности БЕО Ш N0:8 и/или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, определенного остатками аминокислот 1-120 последовательности БЕО Ш N0:16. Гуманизированное антитело может также содержать такие же полипептидные последовательности тяжелой и/или легкой цепей, как у антитела, продуцируемого клеточной линией Е46.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3357) или клеточной линией Е77.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3765).

В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, практически сохраняет связывающие свойства исходного антитела. В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, связывает ЬТ-β-Κ с функциональной аффинностью, например от приблизительно 1 до приблизительно 10 пМ, альтернативно, от приблизительно 10 до приблизительно 20 пМ, альтернативно, от приблизительно 20 до приблизительно 30 пМ, альтернативно, от приблизительно 30 до приблизительно 40 пМ, альтернативно, от приблизительно 40 до приблизительно 50 пМ, альтернативно, от приблизительно 50 до приблизительно 60 пМ, альтернативно, от приблизительно 60 до приблизительно 70 пМ, альтернативно, от приблизительно 70 до приблизительно 80 пМ и, альтернативно, от приблизительно 80 до приблизительно 90 пМ, где функциональную аффинность измеряют с помощью ГАСБ (флуоресцентный способ разделения клеток лимфоцитов) в соответствии с примером 8.

В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, связывают с иммунотоксином (например, цепью рицина А и токсином Ркеиботопак). Гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, может быть также связано с химиотерапевтическим лекарственным веществом (например, адриамицином, 5ГИ (5-фторурацилом), винбластином, актиномицином Ό, этопозидом, цисплатином, метотрексатом и доксорубицином) или с радиоактивным изотопом. Данное изобретение охватываеттакже комбинированную терапию, например терапию, при которой гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, связанное с иммунотоксином, используют в комбинации с гуманизированным антителом, соответствующим данному изобретению, которое связано с химиотерапевтическим агентом. Кроме того, данное изобретение охватывает композицию, пригодную для введения млекопитающему (т.е. человеку), имеющему опухоль, которая характеризуется сверхэкспрессией ΕΎβΡ. Композиция содержит а) гуманизированное антитело против ΕΓΙ/Γ либо в виде монокомпонента, либо связанное с иммунотоксином или химиотерапевтическим лекарством, и б) цитотоксический фактор, при этом каждый из компонентов присутствует в количествах, эффективных для уменьшения объема опухоли при введении млекопитающему. Цитотоксический фактор может включать в себя, например, ТКЕ-α, ТКЕ-β, ИЛ-1, ЮТ-у, ИЛ-2. Альтернативно цитотоксический фактор может быть представлен химиотерапевтическим лекарственным веществом. Химиотерапевтическое лекарственное вещество может включать в себя, например, адриамицин, 5ГИ, винбла

- 1 006945 стин, актиномицин И, этопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин.

Антитело, соответствующее данному изобретению, может быть представлено, например, целым антителом (т.е. имеющим две легкие цепи полной длины и две тяжелые цепи полной длины) любого изотипа и подтипов (например, 1дМ, Ι§Ό, 1§С1, 1§С2, Ι§63, 1дС4. 1дЕ, 1дА1 и 1дА2); альтернативно оно может являться антиген-связывающим фрагментом (например, ЕаЬ, (Е(аЬ')₂ и Εν) целого антитела. Данным изобретением охвачена также композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель; выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую 8ЕЭ ΙΌ N0:8, выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую 8ЕЭ ΙΌ N0:16, выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, продуцируемого клеточной линией Е46.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3357), или клеточной линией Е77.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3765); выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, продуцируемого клеточной линией Е46.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3357), или клеточной линией Е77.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3765); выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую остатки 1-107 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0:8 и выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую остатки 1-120 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0:16.

Данное изобретение охватывает также клетки из клеточных линий, которые продуцируют гуманизированное антитело против ΕΓβΚ, включая, например, клеточную линию Е46.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3357) и клеточную линию Е77.4 (наименование патентного депозита АТСС РТА-3765). В одном варианте осуществления изобретения клеточная линия продуцирует от приблизительно 250 до приблизительно 300 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 300 до приблизительно 350 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 350 до приблизительно 400 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 400 до приблизительно 450 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 450 до приблизительно 500 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 500 до приблизительно 550 мг/л данного антитела и альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 550 до приблизительно 600 мг/л данного антитела. Концентрацию антитела, продуцируемого клеточными линиями, измеряют как титр при сборе из 10-суточной культуры с подпиткой.

В данном изобретении представляют также способ лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъекта (например, человека), предусматривающий введение субъекту эффективного количества антитела, соответствующего изобретению. Эффективное количество композиции может быть введено в одной или более дозах. В другом варианте осуществления данное изобретение представляет способ лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъекта (например, человека), предусматривающий введение субъекту эффективного количества антитела, соответствующего изобретению, и цитотоксического фактора. Цитотоксический фактор может включать в себя, например, Т№-а, ТОТ-в, ИЛ-1, Ι^Ε-γ, ИЛ-2. Альтернативно цитотоксический фактор может быть представлен химиотерапевтическим лекарственным веществом. Химиотерапевтическое лекарственное вещество может включать в себя, например, адриамицин, 5ЕИ, винбластин, актиномицин И, этопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин.

Перечень фигур чертежей и иных материалов

На фиг. 1 (связанные антитела) и 2 (растворимые антитела) представлены графики цитотоксичности в отношении клеток ^1Иг. На графиках показаны тСВЕ11 (мышиное антитело) (ромбы), 1иСВЕ11#2 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 2 легкой цепи (УЬ#2) и вариант 2 тяжелой цепи (УН#2)) (кружки), 1иСВЕ11#4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой цепи (УЬ#3) и вариант 4 тяжелой цепи (УН#4)) (звездочки).

На фиг. 3 (связанные антитела) и 4 (растворимые антитела) представлены графики, показывающие агонистический эффект ИЛ-8 в отношении клеток А375. На графиках показаны антитела тСВЕ11 (ромбы), 1шСВЕ11 #2 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 2 легкой цепи (УЬ#2) и вариант 2 тяжелой цепи (УН#2)) (кружки), 1шСВЕ11#4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой цепи (УЬ#3) и вариант 4 тяжелой цепи (УН#4)) (звездочки).

На фиг. 5 представлен график зависимости объема опухоли от дней введения. На графике показаны тСВЕ11 (треугольники), 1иСВЕ11#4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой цепи (УЬ#3) и вариант 4 тяжелой цепи (УН#4)) (кружки), а также группа, не получающая лечение (квадраты).

На фиг. 6 представлен график зависимости выживаемости животных (в процентах) от дней после прививания опухоли. На графике показаны тСВЕ11 (треугольники), 1шСВЕ11#4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой цепи и вариант 4 тяжелой цепи) (кружки), а также группа, не получающая лечение (квадраты).

На фиг. 7 представлен график зависимости объема опухоли от дней после прививания опухоли. На графике показаны 1шСВЕ11#4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой

- 2 006945 цепи (УЪ#3) и вариант 4 тяжелой цепи (УН#4)) (кружки) и контрольная группа, не получающая лечение (квадраты).

На фиг. 8 представлен график зависимости объема ранее выросшей опухоли от дней, прошедших после лечения. На графике показаны контрольная группа (квадраты), введение 1шСВЕ11 #4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой цепи (УЪ#3) и вариант 4 тяжелой цепи (УН#4)) в различных дозах: 500 мкг (кружки), 100 мкг (треугольники) и 20 мкг (ромбы) и тСВЕ11 (крестики).

На фиг. 9 представлен график зависимости выживаемости животных с ранее выросшими опухолями (в процентах) от дней, прошедших после лечения. На графике показаны контрольная группа (квадраты), введение 1шСВЕ11 #4 (гуманизированное антитело против ЬТ-β-Κ, содержащее вариант 3 легкой цепи (УЪ#3) и вариант 4 тяжелой цепи (УН#4)) в различных дозах: 500 мкг (кружки), 100 мкг (треугольники) и 20 мкг (ромбы) и тСВЕ11 (крестики).

На фиг. 10 представлен график зависимости средней интенсивности флуоресценции от концентрации 1шСВЕ11 #4 в логарифмическом масштабе.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Идентификационные номера последовательностей.

Последовательности нуклеотидов и аминокислот, упоминаемые в описании, получили следующие идентификационные номера последовательностей:

8ЕО ΙΌ N0:1 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи тСВЕ11.

8ЕО ΙΌ N0:2 - последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи тСВЕ11.

8ЕО ΙΌ N0:3 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела СВЕ11 (вариант 1-УЬ#1).

8Е0 ΙΌ N0:4 - последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 1-УЪ#1).

8Е0 ΙΌ N0:5 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 2-УЪ#2).

8Е0 ΙΌ N0:6 - последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 2-УЪ#2).

8Е0 ΙΌ N0:7 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 3-УЪ#3).

8Е0 ΙΌ N0:8 - последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 3-УЪ#3).

8Е0 ΙΌ N0:9 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 1-УН#1).

8Е0 ΙΌ N0:10 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 1-УН#1).

8Е0 ΙΌ N0:11 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 2-УН#2).

8Е0 ΙΌ N0:12 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 2-УН#2).

8Е0 ΙΌ N0:13 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 3-УН#3).

8Е0 ΙΌ N0:14 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 3-УН#3).

8Е0 ΙΌ N0:15 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 4-УН#4).

8Е0 ΙΌ N0:16 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ11 (вариант 4-УН#4).

8Е0 ΙΌ N0:17 - праймер ЕК1 для интродукции сайта В§ц361.

8Е0 ΙΌ N0:18 - праймер ЕК2 для интродукции сайтов N011 и Нра11.

8Е0 ΙΌ N0:19 - праймер ЕК3 для интродукции сайтов В§ц361 и Рз11.

8Е0 ΙΌ N0:20 - праймер ЕК2 для интродукции сайта 8та1.

8Е0 ΙΌ N0:21 - праймер ЕК.3 для интродукции сайта Руц1.

8Е0 ΙΌ N0:22 - праймер ЕК2 для интродукции сайтов 8та1 и Н1а1.

8Е0 ΙΌ N0:23 - праймер ЕК3 для интродукции сайтов Руц11 и Е§р1.

8Е0 ΙΌ N0:24 - праймер ЕК1 для интродукции сайтов НшП и N511.

8Е0 ΙΌ N0:25 - праймер ЕК2 для интродукции сайтов Нае11 и Н1а1.

8Е0 ΙΌ N0:26 - праймер ЕК3 для интродукции сайтов В§ц361, Эбе1 и РЩ.

8Е0 ΙΌ N0:27 - праймер ЕК1 для интродукции сайта ЕеоКУ.

8Е0 ΙΌ N0:28 - праймер ЕК3 для интродукции сайта К5а1.

8Е0 ΙΌ N0:29 - праймер ЕК1 для интродукции сайта ЕеоКУ.

- 3 006945

8ЕО ΙΌ N0:30 - праймер ЕЯ2 для интродукции сайта ΗίηάΙΙΙ.

8ЕО ΙΌ N0:31 - праймер ЕЯ3 для интродукции сайта Я§а1.

8Е0 ΙΌ N0:32 - полная легкая цепь 1шСВЕ11 (вариант 3), включающая константный домен.

8Е0 ΙΌ N0:33 - полная тяжелая цепь 1шСВЕ11 (вариант 4), включающая константный домен. Определения.

Термин гуманизированное антитело, как используют в данном контексте, относится в данном случае к антителу, полученному из нечеловеческого, как правило, мышиного антитела, которое сохраняет или практически сохраняет антиген-связывающие свойства исходного антитела, но которое менее иммуногенно для человека.

Термин гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность) (СОЯ), как используют в данном контексте, относится к последовательностям аминокислот, которые, взятые вместе, определяют аффинность и специфичность связывания природного Εν-фрагмента связывающего центра нативного иммуноглобулина, как это описано в работе КаЬа1 и соавт., (1991).

Термин каркасная (скелетная) область, как используют в данном контексте, относится к последовательностям аминокислот, расположенным между участками СОЯ. Данные фрагменты антитела служат для поддержания СОЯ в соответствующей ориентации (дают возможность СОЯ связывать антиген).

Термин константная область, как используют в данном контексте, относится к части молекулы антитела, которая определяет эффекторные функции. В данном изобретении мышиные константные области замещены человеческими константными областями. Константные области данных химерных или гуманизированных антител получены из человеческих иммуноглобулинов. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана из любого из пяти изотипов: α, δ, ε, γ или μ. Кроме того, тяжелые цепи различных подклассов (таких как подклассы тяжелых цепей 1дС) являются ответственными за различные эффекторные функции и, таким образом, можно получить антитела с желательной эффекторной функцией посредством выбора желательной константной области тяжелой цепи. Предпочтительными константными областями являются γ1 (Ι§01), γ3 (!дС3) и γ4 (Ι§04). Более предпочтительным является Есфрагмент изотипа γ-1 (ΙμΟ1). Константная область легкой цепи может быть представлена к- или λ-типом, предпочтительно κ-типом.

Термин химерное антитело, как используют в данном контексте, относится кантителу, содержащему последовательности, выделенные из двух различных антител, которые, как правило, принадлежат организмам разных видов. Чаще всего химерные антитела содержат фрагменты человеческого и мышиного антитела, обыкновенно, человеческую константную и мышиную вариабельную область.

Термин иммуногенность, как используют в данном контексте, относится к степени способности направленного белка или терапевтической молекулы вызывать иммунный ответ (гуморальный или клеточный) при введении реципиенту. Данное изобретение касается иммуногенности определенных гуманизированных антител.

Термин гуманизированные антитела с пониженной иммуногенностью относится к гуманизированным антителам, проявляющим пониженную иммуногенность относительно исходного антитела, например мышиного антитела.

Термин гуманизированное антитело, практически сохраняющее связывающие свойства исходного антитела, относится к гуманизированному антителу, которое сохраняет способность специфически связывать антиген, распознаваемый исходным антителом, используемым для получения данного гуманизированного антитела. Предпочтительно, если гуманизированное антитело будет проявлять такую же или практически такую же антигенсвязывающую аффинность и авидность, как у исходного антитела. В идеальном случае аффинность антитела не будет ниже, чем 10% аффинности исходного антитела, более предпочтительно не ниже, чем приблизительно 30%, и наиболее предпочтительно аффинность не будет ниже, чем приблизительно 50% от уровня аффинности исходного антитела. Способы анализа антигенсвязывающей аффинности хорошо известны в области техники и включают анализы полумаксимального связывания, конкурентные анализы и анализ по 8са1сйатб. Подходящие анализы связывания антигена описаны в данной заявке.

Данное изобретение направлено на гуманизированные моноклональные антитела, которые связывают человеческий ΕΤ-β-Я, и их применение в качестве терапевтических агентов. Кроме того, данное изобретение направлено на последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные гуманизированные антитела, и их экспрессию в рекомбинантных клетках-хозяевах. Более конкретно, данное изобретение направлено на гуманизированные антитела, полученные из мышиного СВЕ11, которое специфически связывает человеческий ΕΤ-β-Я.

Мышиное СВЕ11 (тСВЕ11) представляет собой мышиное ^ОПк-антитело, выделенное у мыши, иммунизированной человеческим слитым белком ΕΤ-β-ЯЧд (см. статью ΒΐΌ\νηίημ и соавт., ί. Iттиηο1., 154:33, (1995)). тСВЕ11 функционально активирует ΕΤ-β-Я как ίη νΐνο, так и ίη νίίτο (РСТ/И896/01386), и были описаны его выделение и противоопухолевые свойства (см. статью ΒΓονηίημ и соавт., ί. Ехр. Меб., 183:867, (1996)). Гибридомная клеточная линия, которая продуцирует тСВЕ11, была предварительно депонирована заявителями данного изобретения в Американской коллекции клеточных культур

- 4 006945 (АТСС) в соответствии с условиями Будапештского договора и получила регистрационный номер АТСС НВ 11793. (РСТ/Ь896/01386). Заявители показали также, что перекрестное связывание рецептора ЬТ-β с различными агонистическими антителами против ЬТ-β-Ρ активирует рецептор ЬТ-β (т.е. может имитировать эффекты природных лигандов). (РСТ/Ь896/01386). Было показано, что активация рецептора, в свою очередь, подавляет рост опухоли в ряде моделей опухолей ίη νίνο, в которых происходит экспрессия рецептора ЬТ-β. Рецептор ЬТ-β, как было показано, экспрессируется на ряде раковых клеток, включая, например, клетки немелкоклеточного рака легкого (Ы8СЬС), клетки колоректального рака (СЯС), клетки рака молочной железы, а также на клетках рака простаты, желудка, кожи, пищевода и мочевого пузыря. Неограничивающие примеры опухолей, которые ингибируют агонистические антитела против ЬТ-β-Κ, включают в себя следующие солидные опухоли: аденокарциному толстой кишки НТ29, карциному шейки матки НТ3, меланому А375, карциному молочной железы МЭА-231 и первичные опухоли толстой кишки. Вследствие этого, агонистические антитела против ЬТ-β-Κ обладают свойствами, обусловливающими их эффективность при лечении заболеваний, при которых желательна активация ЬТ-β-Κ и/или модуляция взаимодействия ^Т-β-Κ/лиганда ЬТ-β-Κ, включая, например, лечение или уменьшение риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъектов (например, человека).

В данном контексте описана гуманизация моноклонального антитела тСВЕ11, включая анализ на модели и обратные мутации, необходимые для сохранения в значительной мере свойств связывания моноклонального антитела тСВЕ11.

Анализ на модели мышиных вариабельных областей.

Наиболее вероятно, что СОК содержат остатки, которые связывают антиген, и они должны быть сохранены в реконструированном антителе. СОК определяются последовательностью согласно работе КаЬа! и соавт., Последовательность белков, представляющих иммунологический интерес (Последовательность о£ Рто1еш8 о£ 1ттипо1одюа1 1п1сгс51) (5 изд., ТНс Ипксб 8!а!с§ ЬсраПтсЩ о£ Нса1(П апб Нитап 8сг\зсс5. ТНс ЬпНсб 8!а!с§ СотсгптсЩ Ρτίηΐίη§ Ойюс, 1991). СОК относятся к установленным классам (см. статью СНоОиа и соавт., Па1игс, 342: 877-883, (1989)), в которых ключевые остатки в значительной степени определяют структурную конформацию петли СОК. Данные остатки почти всегда остаются в реконструированном антителе. Ниже представлена полипептидная последовательность вариабельного домена легкой цепи тСВЕ11, где СОК выделены подчеркиванием и номера положений остатков указаны в соответствии с системой нумерации по КаЬа!

ОП<МТ08Р88 МУА8Ь6ЕКУТ 1ТСКАСОО1К 8УЬ8УУООКР \\'К8РКП.1¥¥ АТКЬАП6УР8 КР8О868ОрП У8ЬТ188ЬЕ8

РРТАТУУСЕР НСЕ8РУТЕОО 6ТКЬЕ1К (8ЕО ΙΌ N0:1).

Ниже представлена полипептидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи тСВЕ11, где СОК выделены подчеркиванием и номера положений остатков указаны в соответствии с системой нумерации по КаЬа!

ЕХ’ОЕМАССС ЬУКР668ЬКЬ 8САА8ОЕТЕ8 Р¥¥М¥\\ЫЮТ

РЕККЬЕУУАТ 18ПОС8УТУУ РП8УКСКЕТ1 81Ю\АК\\Е¥

ЬрМ88ЬК8ЕЬ ТАМУУСУКЕЕ ΝΟΝΕΥΥΕΌΥ\ СС)С1ТТ¥Т¥88 (8ЕО ΙΌ N0:2).

Вариабельные легкие и тяжелые цепи тСВЕ11 сравнивали с консенсусными последовательностями мышиной и человеческой подгрупп (см. работу 1оНп5оп С., XVи Т., Т. КаЬа!, База данных и ее применение перспективные направления исследований нуклеиновых кислот (Ьа1аЬа5с апб ίΐδ аррйсайопк: £и!игс бисс!юп§ М1с1с1с Ас1б КсксатсЬ), 29, 205-206, (2001); статью \и и КаЬа!, 1. Ехр. Мсб., 132:211-250, (1970)) при использовании программы ЕА8ТА. Вариабельная легкая цепь тСВЕ11 является членом мышиной подгруппы V с идентичностью 74% на участке перекрывания из 110 аминокислот и вариабельная тяжелая цепь тСВЕ11 является членом мышиной подгруппы ΙΙΙ6 с идентичностью 79% на участке перекрывания из 132 аминокислот. Вариабельная легкая цепь соответствует человеческой подгруппе Ι с идентичностью 66% на участке перекрывания из 113 аминокислот. Вариабельная тяжелая цепь соответствует человеческой подгруппе ΙΙΙ с идентичностью 71% на участке перекрывания из 131 аминокислоты.

СОК, соответствующие данному изобретению, были разделены на установленные классы. Петля Ь1 относится к установленному классу 2 (петля из 11 остатков), Ь2 - к классу 1 (7 остатков) и Ь3 - к классу 1 (9 остатков). Петля Н1 относится к классу 1 (5 остатков) и петля Н2 - к классу 3 (17 остатков). Петля Н3 не принадлежит к установленному классу.

Были определены остатки на границе вариабельных легкой и тяжелой цепей (см. статью СНоЙна и соавт., 1. МоЕ Вю1., 186:651-663, (1985)). Они, как правило, сохраняются в реконструированном антителе. В тСВЕ11 некоторые из данных остатков являются необычными для границы цепей, а именно 834, Ι46, Ь89, Н91 в V. и Υ35, Е37, ν93, Е95 в νΗ.

Необычные каркасные остатки определены путем анализа всех последовательностей мышиных и человеческих вариабельных цепей в версии базы данных КаЬа! от сентября 1999 г. [ΝΟΒΙ, ΝΙΗ]. Считают, что специфические отличия тСВЕ11, возможно, указывают на соматические мутации, которые по- 5 006945 вышают связывающую активность, если данные отличия находятся близко к центру связывания. Необычные для мышиной молекулы остатки, более удаленные от центра связывания, и необычные для человеческой молекулы остатки удаляли в случаях, когда они могли бы образовать иммуногенные эпитопы в реконструированном антителе. Необычные каркасные остатки, обнаруженные в тСВЕ11, представлены К3, М11, Υ12, \У41. рб9, 872, Ό81, Т83 в легкой цепи и Е37, Т40, Е42, А49, N77 в тяжелой цепи. Хотя большинство из данных остатков не сохраняются в гуманизированных антителах СВЕ11, некоторые из данных необычных каркасных остатков сохраняются, включая, например, Е37 и А49 в тяжелых цепях.

Моделирование структуры вариабельных областей.

Легкую и тяжелую цепи, соответствующие данному изобретению, сопоставляют с сокращенной базой данных, с целью установления структурных основ для применения при конструировании трехмерных моделей легких и тяжелых цепей тСВЕ11. При использовании программы ВБА8Т было обнаружено, что легкая цепь имеет последовательность, идентичную на 93% моноклональному мышиному антителу 5д9 (1АН^), и было обнаружено, что тяжелая цепь имеет последовательность, идентичную на 81% фрагменту ЕаЬ мышиного антитела ЮСА2 (ЕаЬ 17/9) (1 ГЕН). С помощью пакета по молекулярному моделированию 8уЬу1 (Тпрох 1пс.) были созданы трехмерные структуры легкой и тяжелой цепей при использовании легкой цепи 5д9 и тяжелой цепи фрагмента ЕаЬ ЮСА2, соответственно. Структурную целостность модели оценивали с помощью компьютерной программы и сочли приемлемой.

Разработка реконструированных вариабельных областей.

Гомологический анализ используют для выбора человеческих акцепторных каркасов, с целью присоединения участков СЭР тСВЕ11. Поиск как в базе данных КаЬаГ, так и в сокращенной базе данных из ΝΟΒΙ, ΕΝΤΒΖ (Национальные институты здоровья (ТПе Νηΐίοηηΐ ГпйГГиГек о£ НеаПй)) проводили с использованием программного обеспечения ВБА8Т. Выбор человеческих акцепторных каркасов делают на основе идентичности последовательностей каркасов тСВЕ11 и каркасов человеческих антител (за исключением каркасов ранее гуманизированных антител).

Человеческие каркасные (скелетные) области могут быть выбраны из антитела Т№-АГСЬ (каЬаГ Νο 004770) против человеческого α-фактора некроза опухолей (см. статью СпГГй115 и соавт., ΕΜΒΟ I., 12:725-734, (1993)) для вариабельной легкой (УЪ) цепи (κ-подгруппа I человека) и антитела ЕБА-ГдССЬ (КаЬаГ Νο 040003) неизвестной специфичности (см. статью МаШап и соавт., В1оой, 87:717-724, (1996)) для вариабельной тяжелой (УН) цепи (подгруппа III человека). Человеческие каркасные УЪ и УН отличаются по 15 и 11 остаткам по сравнению с мышиными последовательностями.

Обратные мутации человеческих каркасов.

Самой непредсказуемой процедурой гуманизации моноклональных антител является идентификация важных каркасных остатков исходного антитела (т.е. в данном случае родительского антитела мышиной природы), которые необходимо оставить, чтобы сохранить в значительной степени связывающие свойства исходного антитела и в то же самое время снизить до минимума потенциальную иммуногенность полученного антитела. Особенно важным является сохранение обязательных остатков, остатков упаковки границы цепей и необычных остатков мышиных молекул, которые находятся близко к центру связывания. Кроме того, принимают во внимание остатки в Зоне Уегшег (образующие платформу, на которой находятся СОВ) (см. статью ЕооГе и ХУйНег Г. Мо1. Вю1., 224:487-499, (1992)) и остатки, расположенные близко от Н3 СОВ. Мутации, возвращающие обратно к исходному антителу (т.е. обратный мутационный процесс от остатков человеческого каркаса к мышиному), обозначаются в данном контексте, как обратные мутации.

Было получено три варианта вариабельной легкой реконструированной цепи (ЙИ-СВЕ11 УЪ) и четыре варианта вариабельной тяжелой реконструированной цепи (ЙИ-СВЕ11 УН). Как правило, первый вариант содержит наибольшее количество обратных мутаций, а третий вариант - наименьшее (т.е. является наиболее гуманизированным), за исключением четвертого варианта ЙИ-СВЕ11 УН. Данное изобретение предусматривает гуманизированные антитела, выделенные из тСВЕ11, которые имеют вариабельную легкую цепь, выбранную из вариабельных легких цепей, описанных ниже (т.е. УЪ#1, УЪ#2 или УЪ#3) и вариабельную тяжелую цепь, выбранную из вариабельных тяжелых цепей, описанных ниже (т.е. УН#1, УН#2, УН#3 или УН#4) в любой комбинации.

(А) Легкая цепь:

О (глутамин)->К (лизин). Данная замена сохраняется в первом варианте, поскольку предшествующие эксперименты по реконструированию показали (см., например, статью Ко1Ьтдег и соавт., РгоГ. Епд., 6:971-980, (1993)), что она могла бы быть важной в плане связывания антигена или конформации СПВ.

С (глицин)->^ (триптофан). Данная замена сохраняется в первом и втором вариантах.

Ь (лейцин)->[ (изолейцин). Данная замена сохраняется в первом и втором вариантах, поскольку этот остаток является одновременно пограничным остатком и находится в Зоне Уегшег. Кроме того, он является необычным остатком, встречающимся 9 раз в мышиных последовательностях и один раз в человеческой. Вероятно, он влияет на упаковку вариабельных цепей и может контактировать с СОВ.

Т (треонин)->О (глутамин). Данный остаток находится в Зоне Уегшег и может влиять на кон

- 6 006945 формацию СЭК. Замена короткого остатка Т на более длинный остаток О может также означать, что он контактирует с антигеном. О является необычным остатком, встречающимся 58 раз в мышиной и два раза в человеческой последовательности. Он сохраняется в первом варианте.

Г (фенилаланин)->У (тирозин). Данный остаток находится в обязательном положении и сохраняется во всех вариантах. Он также является относительно необычным для человеческих последовательностей, где встречается только 25 раз.

(В) Тяжелая цепь:

V (валин)->Г (фенилаланин). Данная замена сохраняется в первом, втором и четвертом вариантах. Г в данном положении является необычным остатком и встречается только 15 раз в мышиной и 18 раз в человеческой последовательности. Он также является пограничным остатком.

А (аланин)->Т (треонин). Данная замена сохраняется в первом варианте. Мутация в данном положении была апробирована в 5 предшествующих экспериментах по гуманизации, хотя никогда не была представлена заменой А на Т. Один из примеров представлен заменой А на 8 в работе с ВгЕ-3 (см. статью Сои1о и соавт., НуЬыбоша, 13:215-219, (1994)), где была повышена аффинность связывания, хотя причина никогда не была установлена. В данном случае тяжелая цепь также принадлежала к подгруппе III человека.

8 (серин)->А (аланин). Данный остаток находится под СЭК и в Зоне νβΓηίβΓ и сохранен во всех вариантах.

V (валин)->М (метионин). Данная замена сохраняется в первом варианте. В данном положении в нескольких экспериментах по гуманизации произошла обратная мутация.

А (аланин)-^ (валин). Данное положение одновременно является пограничным остатком и находится в Зоне νβΓηίβΓ. Данная замена сохраняется в первом и втором вариантах.

Получены следующие последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот каждого из различных вариантов вариабельных легкой и тяжелой цепей:

Реконструированные вариабельные легкие цепи

Реконструированная вариабельная легкая цепь СВЕ11 - вариант 1 легкой цепи (νΕ#1) (Плазмида ρΆΝΏ066)

САТАТТААСАТСАСССАСТСТССАТСАТССТТетСТССАТСееТСССАСАСАСеСТСАСТ 60 01КМТ08₽38Ь8А5УСОЦУТ ааЗ

АТСАСТТ0САА6ССС66ТСА06АСАТТАААА0СТАТТТАА0СТО0ТАССА6СА6АААССА 120 1ТСКА60О1К8УЬ8ИУ00К₽

121 Т66ААА6ССССТАА0АТССТСАТСТАТТАТ6СААСАА60ТТ0ССАСАТС66(ЗТСССАТСА 180 ΚΚΑΡΚΙΙ,ΙΥΥΑΤ&ΙτΑΟΟνΡδ аа41 аа46

181 АОАТТСАеТОССАОТСеАТСТССбСААСАТТАТАСТСТААССАТСАССАбССТеСАеССТ 240 НГ8СЗС8СОО¥ТЬТ185ЬОР аа£9 аа71

241 САССАТТТСССААСТТАТТАСТСТСТАСАОСАТСОТСАСАСССССТОСАСбТТСЯСТССА 300 ЕОГАТУУСЬОНСВЗ РИТГ6С

301 СССАССААССТССАСАТСААА 321

Т К Ь Е I К

8Ε^ ГО N0:3 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной νΣ#1.

8Ε^ ГО N0:4 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной νΕ#1.

Реконструированная вариабельная легкая цепь СВЕ11 - вариант 2 легкой цепи (νΕ#2) (Плазмида ρΆΝΏ070)

6АТАТССА6АТСАСССА6ТСТССАТСАТССТТеТСТССАТСС6ТС66АСАСА5<30ТСАСТ 60 0Ι0ΜΤ0£Ρ55Ι,8Α8νοηκνΤ

АТСАСТТССААСЗССССТСАССАСАТТААААССТАТТТААССТССТАССАССАСАААССА 120 1ТСКА60О1К8УЬ5КТО2КР

121 ТССАААОСесСТААСАТССТЕАТСТАТТАТССААСАА5ОТГСССАСАТС<ЗССТСССАТСА 180

И К А ₽ К Ϊ Ь I Υ Υ А Т Й Ь А О С V Р 8 аа41 аа46

181 А^ТТСАОТОЙСАСТОСАТСТССТАСАСАТТАТАСТСТААССАТСАССАСССТССАСССТ 240 НРБС8<38СТВУТЬТ188ЬОР _ ___ аа71

241 САСМАТТТСССААСТТАТТАСТСТСТАСАССАТССТСАаАЗССССТССАССТТСССТССА 300 ВРРАТУУСЬОНСЕЗРНТРСС

301 СССАССААОСТООАСАТСААА 321 е т к ь в ι к

8Ε^ ГО N0:5 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной νΕ#2.

8Ε^ ГО N0:6 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной νΕ#2.

Реконструированная вариабельная легкая цепь СВЕ11 - вариант 3 легкой цепи (νΕ#3) (Плазмида ρ.·\\Ί)074)

- 7 006945

САТАТССАБАТСАСССАСТСТССАТСАТССТТСТСТССАТСССТСССАСАСАБББТСАСТ 60 ϋ I б Μ Τ б δ РЗВЬЗАЗУБОВУТ

АТСАСТТССААСОССССТСАССАСАТТААААОСТАТТТААССТСОТАССАЙСАОАААССА 120 1Т С КАС0О1К5УЬЗ*1У00КР

121 бССАААбСБССТААБССТСТСАТСТАТТАЮСААСААССТТСБСАСАТСССОТСССАТСА 180 БКАРКЬЬ1УУАТНЬА06УР5

181 АБАТТСАБТСССАОТБСАТСТБСТАСАСАТТАТАСТСТААССАТСАССАСССТССАСССТ 240 КР86868СТО¥ТЬТ183Ь0Р аа71

241 БАБСА'ПТСССААСТТАТТАСТбТСТАСАБСАТСБТСАБАСССССТССАСОТТСССТСОА 300 ΕΟΕΑΤΥΥΟΙιΟΗβΒδΡΗΤΡΟΟ

301 ОССАССААБСТСБАСАТСААА 321

Б Т К Ь В I К

8Ε^ ГО N0:7 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной УБ#3.

8Б9 ГО N0:8 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной УБ#3.

Реконструированные вариабельные тяжелые цепи.

Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ11 - вариант 1 тяжелой цепи (УН#1) (Плазмида ρΑΝΏ067)

БАССТАСААСТССТССА0ТСТССССБАС5СТТАСТСААСССТ0САС0СТСССТСАС0СТС 60 БУ0ЬУЕ86БСЬуКР<Зв81»ЯЬ

ТССТСТССАОССТСГССАТТСАСТТТСАСТОАСТАТТАСАТСТАТТБСТТТСОССАСАСТ 120 8САА86ГТЕ8ОХУМУИРК0Т аа37 аа40

121 СССССАААСбОССТССАСТСССТСССААССАТТАСТСАТСБТСОТАСТТАСАССТАСТАТ 180 РБКБЬВИУАТХВОаСЗУТУУ

181 ССАБАСАСТСТСААОБББССАТТСАССАТСТССАСАБАСААТСССААСААСАБССТСТАС 240 ΡΟδνΚβΚΕΤΙδΚΟΝΑΚΝδΙιΥ

241 СТССАСАТСАССАСССТСАБСССТСАЗСАСАСАСССАТСТАТТАСТСТСТААСАСАССАС 300 Ь 0 М 8 8 Ь Я А ЕОТАМУУСУК Е В аа89 аа93

301 ААТСБТААСТТГТАСТАСТТТСАСТАСТСБССССААСССАССАСББТСАССБТСТССТСА 360 ΝΘΝΓΥΥΓϋϊΗΟΟΟΤΤντνδ δ

8Б9 ΙΌ N0:9 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной УН#1.

8Ε^ ГО N0:10 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной УН#1.

Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ11 - вариант 2 тяжелой цепи (УН#2) (Плазмида рАМ)07П (Л^АСААСТ®УГ00АСТСТСС6ССаМЙС17А(Л«ААеССТ(ЙАСМСТСССТБАССаГС 60 ЕУОЬУЕВСССЬУК Р 6 О 8 Ь К Ιι

ТССТ(ПХэСА(ХХ;ТСТССАТТСАСТТТСАСТС>АСТАТТАСАТСТАТТССТТТСС5ССА6(?СС 120 ЗСААЗБРТРЗОУУМУИГКОА аа37

121 ССайУиЛ®Э(^ТССА13ТетСТС<ЗСААССАТТА<^АтабТ<^АОТГАСАССТАСТАТ 180 р 6 к <3 ь в- κνΑΤίβηαβδΥΤΥΥ аа49

181 ССАСАСАСТСТОАА5СООССАТТСАССАТСТССАБАОАСААТБССААСААСАСССТСТАС 240 Р08УКСЯРТ18ЯОНАК»5ЬУ

241 СТ^АСАТСАСК:А(КСТ(^0®ЯГ«^СБАСАСАССТХМ^ТАТТАСТСТСТААБАСАСОАС 300 ЬСМ55ЬКАВОТАУУУСУВВВ аа93

301 ААТССТААСТТТТАСТАСТТТСАСТАСТбОООССААСзОСАССАСОСТСАСССТСТССТСА 360 Νουργγρογνσοσττντνδδ

8Ε^ ΙΌ N0:11 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной УН#2.

8Ε^ ГО N0:12 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной УН#2.

Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ11 - вариант 3 тяжелой цепи (УН#3) (Плазмида рАЖ075)

ОАССТАСААСТОСТССАСТСТССОССАСССТТАСТСААСССТОСАССбТСССТОАОССТС 60 Е70ЪУЕ5СССЬУКР(ЗСЗЬЯЬ

ТССТСТОСАСССТСТССАТТСАСТТТСАОТСАСТАТТАСАТСТАТТССОТСССССАОССС 120 зсаазсгтрзоуумуиуноа

121 СССООАААОС(^ТО(^СТССХЖ:(Х^ССАТТАОТСАТО(П<^АСТТАСАССТАСТАТ 180 ρακοΐιΒΗνΛτίδοοαδΥΤΥΥ аа 4 9

181 ССА(^САСТСТСАА5СССССАТТСАССАТСТССАСАСАСААТСССААСААСАСЗССТСТАС 240 ΡϋδνΚΟΗΕΤΧδηηΝΑΚΝΒΙιΥ

241 СТОСАСАТОАССАОССТСАОСССТОАССАСАСАОСТСТаТАТТАСТССССААСАОАООАС 300 ЬОМЗЗЬНАЕОТАУУУСАНЕЕ

301 ААТСОТААСТТТТАСТАСТтАСТАСТООССССААбОСАССАСОеТСАССбТСТССТСА 360 ΝΟΝΡΥΥΕϋΥΗΟζϊαττντνδε

8Ε^ ΙΌ N0:13 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной УН#3.

- 8 006945

51:0 ΙΌ N0:14 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной УН#3.

Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ11 - вариант 4 тяжелой цепи (УН#4) (Плазмида ρΑΝΏ090)

САССТАСААСТССТССАСТСТСССССАСССТТАСТСААСССТССАСССТСССТСАСССТС 60 БУОЬУЕЗСббЬУКРССЗЬКЬ

ТССТ6Т6САСССТСТССАТТСАСТТТСА6ТСАСТАТТАСАТСТАТТССТТТС6ССАООСС 120 ΕΟΑΑδδΓΤΡδΟΥΥΜΥΜΡΗΟΑ аа37

121 ССа^ААА0а06СТССАСТС60ТСССААССАТТАСтеАТССТ6СТА13ТТАСАССТАСТАТ 180

Ρ6Κ6Ι>ΒΝνΑΤΧ5Ο668ΥΤΥΥ аа49

181 ССАСАСАСТОТСААСС66ССАТТСАССАТСТССАСА6АСААТ6ССАА6ААСАСССТСТАС 240 ΡϋδνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝΑΚΝδ^Υ

241 СТССАЕАТСАССАСССТСАССКСТСАС5АСАСА0СТСТ6ТАТТАСТССССАА0АСАССАС 300

1> 0 М 5 ЗЬНАВОТАУУХСАНЕЕ

301 ААТССТААСТТТТАСТАСТТТСАСТАСТССООССААОбСАССАСССТСАСССТСТССТСА 360 ΝΟΝΡΥΥΕΕΥΜΟΟβΤΤντνδδ

51:0 ΙΌ N0:15 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной УН#4.

51:0 ΙΌ N0:16 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной УН#4.

Были получены и использованы в последующих исследованиях антитела, состоящие из различных вариантов легких и тяжелых цепей. Например, получено антитело, состоящее из реконструированного варианта 3 легкой вариабельной цепи (УЬ#3) йиСВЕ11 и реконструированного варианта 4 тяжелой вариабельной цепи (УН#4) йиСВЕ11, называемое ЪиСВЕ11#4 или ИСВЕ11. Клеточные линии Е46.4 и Е77.4, продуцирующие данное антитело, депонированы в коллекции АТСС (наименование патентных депозитов АТСС РТА-3357 и 3765, соответственно).

Далее изобретение касается эквивалентов и вариантов реконструированных последовательностей УН и УБ, т.е. последовательностей, содержащих одну или более замен консервативной аминокислоты, которая существенным образом не влияет на связывание БТ-β-Κ. Гуманизированные антитела против РТ-β-Ε, содержащие данные гуманизированные вариабельные последовательности тяжелых и легких цепей, могут быть получены рекомбинантными способами, как описано в примерах.

Применение

Гуманизированные антитела против БТ-β-Β, соответствующие данному изобретению, применяют для лечения болезненных состояний, при которых активация РТ-β-Ε является терапевтически эффективной. Данные состояния включают в себя лечение, предупреждение или снижение риска развития, тяжести или последствий неоплазии.

В одном из вариантов осуществления изобретения представлен способ лечения у млекопитающего (т. е. человека) состояния, ассоциированного с нежелательной пролиферацией клеток, посредством введения млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей гуманизированные антитела против РТ-β-Ε, соответствующие настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления изобретения представлен способ лечения млекопитающего (т.е. человека) с солидной опухолью (т.е. карциномой), которая характеризуется сверхэкспрессией БТ-β-Β, предусматривающий введениеданному млекопитающему гуманизированного антитела против РТ-β-Ε, которое связывает РТ-β-Ε, в количестве, эффективном для уменьшения объема опухоли. Примеры форм рака, пролиферация клеток которого модулируется посредством БТ-β-Β, могут быть обнаружены путем измерения ΐπ νότο уровня транскрипта БТ-β-Β и/или лиганда БТ-β-Β (т.е. ЕТа^2 или БЮНТ), экспрессирующегося в библиотеках опухолевых тканей. Подходящими были бы библиотеки опухолевых тканей, в которых транскрипт БТ-β-Κ и/или лиганда БТ-β-Κ (т.е. ЕТа^2 или БЮНТ) экспрессируется на высоком уровне. Типы опухолей, рассматриваемые в данном изобретении, содержат солидные опухоли, включающие в себя без ограничения перечисленным клетки немелкоклеточного рака легкого (N50,0), клетки колоректального рака (СВС), клетки рака молочной железы, а также рака простаты, желудка, кожи, пищевода и мочевого пузыря.

Гуманизированные антитела, соответствующие данному изобретению, которые используют для лечения состояний, ассоциированных с нежелательной пролиферацией клеток, в частности терапии опухолей, эффективно подавляют рост опухолевых клеток, что измерено, например, по снижению объема опухоли, больше, чем на приблизительно 10, 20, 30 или 40% и, что наиболее эффективно, больше, чем на 50%. Гуманизированные антитела получают путем скрининга (см., например, обсуждение в примере 3). Например, гуманизированные антитела для использования в данном изобретении можно выбрать на основе уменьшенного объема опухоли по сравнению с нелечеными раковыми клетками (например, более чем на приблизительно 10, 20, 30, 40 или 50%).

В данном изобретении представлены также фармацевтические композиции, содержащие гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Например, подходящие носители и их составы описаны в Справочнике по фармацевтическим нау

- 9 006945 кам Ремингтона (РсттЦоп' Рйаттасеи1ка1 8с1еисек), 16 изд., 1980, Маск РиЬйкй1ид Со., под ред. Ок1о и соавт. Как правило, чтобы сделать состав изотоническим, в составе используют соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли. Примеры носителя включают в себя буферы, такие как физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН раствора предпочтительно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 8 и более предпочтительно от приблизительно 7,4 до приблизительно 7,8. Кроме того, носители включают в себя препараты с задержанным выходом, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров. При этом данные матрицы представлены в виде частиц определенной формы, например липосом, пленок или микрочастиц. Для компетентных специалистов будет очевидным, что некоторые носители могут быть более предпочтительными, например, в зависимости от способа введения и концентрации вводимой фармацевтической композиции.

Введение может быть осуществлено путем инъекции (например, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной, внутримышечной) или другими способами, такими как инфузия, которая в эффективной форме обеспечивает доставку в кровоток.

Гуманизированные антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть введены в эффективной дозе, с целью лечения определенного клинического состояния, на которое оно направлено. Определение предпочтительного фармацевтического препарата и терапевтически эффективной схемы дозирования для данного варианта применения находится в компетенции квалифицированного специалиста, принимающего во внимание, например, массу тела и состояние больного, длительность желательного лечения и переносимость лечения больным. Например, эффективная доза будет лежать в интервале от приблизительно 0,05 до приблизительно 100 миллиграмм/килограмм массы тела/сутки. В частности, приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/сутки. Альтернативно приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 мг, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/неделю. Альтернативно, приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 мг, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/две недели. Альтернативно приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 миллиграмм, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/три недели. Альтернативно приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 мг, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/четыре недели.

При реализации данного изобретения будут использованы, если не указано иначе, традиционные методики клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белка и иммунологии, которые входят в компетенцию квалифицированного специалиста в данной области. Данные методики описаны в литературе. См., например, монографии Лабораторное руководство по молекулярному клонированию (Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1оту Маииа1), 2 изд., под ред. 8атЬтоок, Етйксй и Машайк, Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬога1оту Ргекк, 1989; Клонирование ДНК (ΌΝΑ С1ошид), тт. I и II (под ред. Ό.Ν. С1оует), 1985; Синтез олигонуклеотидов (Ойдоиис1еойбе 8уи1йеκίκ), (под ред. М.1. Сай), 1984; патент США №. 4683195, выданный МиШк и соавт.; монографии Гибридизация нуклеиновых кислот (№с1ек Ас1б НуЬпб17а1юи) под ред. В.Э. Натек и 8.1. Шддшк, 1984; Транскрипция и трансляция (ТтаикспрИои аиб Ттаик1айои) под ред. В.Э. Натек и 8.1. Шддшк, 1984; Культура клеток животных (СиЙите оГ Ашта1 Се11к) под ред. Κ.Ι. Ртекйиеу, А1аи В. Ыкк, 1ис., 1987; Иммобилизованные клетки и ферменты ([ттоЫНхеб Се11к аиб Епхутек). 1ВЬ Ргекк, 1986; В. РегЬа1, Практическое руководство по молекулярному клонированию (А Ртасбса1 Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошид), 1984; Методы энзимологии (Ме1йобк ш Еихутокду), тт. 154 и 155, под ред. \¥и и соавт., Асабетк Ргекк, №\у Уотк; Векторы для переноса генов для клеток млекопитающих (Сеие ТгаикГег Уес1отк Гог Матшайаи Се11к), под ред. 1.Н. Мй1ет и М.Р. Са1ок, 1987, Со1б 8рттд НагЬог ЬаЬога1огу; Иммунохимические методы в клеточной и молекулярной биологии (11П1пипосйе1шса1 Ме1йобк ш Се11 аиб Мо1еси1аг Вю1оду), под ред. Мауег и ^а1кет, Асабетк Ргекк, Ьоибои, 1987; Справочник по экспериментальной иммунологии (НаибЬоок оГ ЕхрептегИ [ттипокду) тт. Ι-ΐν, под ред. Э.М. \Уей и СС. В1аск\уе1к 1986; сборник Манипуляции с мышиными эмбрионами (Машри1а1шд 1йе Мойке ЕтЬгуо), Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотакгу Ргекк, 1986.

Следующие примеры представлены с целью иллюстрации данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование и экспрессия сйСВЕ11.

кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного СВЕ11, используют для конструирования векторов для экспрессии мышино-человеческих химер (сйСВЕ11), в которых вариабельные области тиСВЕ11 связаны с человеческим 1дС 1 и κ-константными областями. Для конструирования химерной тяжелой цепи фрагмент Рк11-Вк1ЕП размером 0,36 т.п.н. из субклона рЕАС970 тяжелой цепи СВЕ11 субклонируют в полученный при обработке фосфатазой векторный фрагмент РкбВк1Е[[ размером 2,82 т.п.н. из плазмиды рЬСВ7, кодирующей тяжелую цепь 5а8 (5а8 представляет собой молекулярным способом клонированное СЭ4-специфическое тАЬ (моноклональное антитело), ранее охарактеризованное Вюдеи), с целью добавления сигнальной последовательности мышиной тяжелой

- 10 006945 цепи и сплайс-донорного участка в вариабельную область тяжелой цепи тиСВЕ11. В данной плазмиде, названной рЕАС979, зрелый Ν-конец тяжелой цепи отличается по двум остаткам от Ν-концевой последовательности очищенной аутентичной тяжелой цепи СВЕ11, выделенной из продуктов деградации по Ейтап, поскольку она определяется праймером во время ПЦР. Для коррекции Ν-конца тяжелой цепи рЕАС979 подвергают мутагенезу с элиминацией уникального сайта (И8Е) при использовании набора для И8Е-мутагенеза фирмы Атегайат Рйагтас1а Вю1еск следуя протоколу, рекомендованному изготовителем. Мутантные плазмиды идентифицируют путем скрининга интродуцированных изменений Ауа11, РД1 и К§а1. Последовательность тяжелой цепи в полученной плазмиде рЕАС981 подтверждают секвенированием ДНК. Фрагмент вариабельного домена тяжелой цепи ΝοΐΙ-НшйШ размером 0,44 т.п.н. из рЕАС981 и фрагмент НтйШ-Νοΐί размером 1,21 т.п.н. из плазмиды рЕАС964, содержащий константную область человеческого 1дС1, субклонируют в сайт Νοΐί плазмиды рСН269, полученной на основе экспрессионного вектора ЕВУ рСЕР4 (1пуйгодеп), с образованием плазмиды рЕАС983.

Для конструирования химерной легкой цепи фрагмент ΝοΐΙ-ЕсоЯУ размером 0,11 т.п.н. из плазмиды рМЭК985 и фрагмент Ρ^Βν-Β^ηΗ! размером 0,37 т.п.н. из плазмиды рЕАС967 вариабельного домена легкой цепи СВЕ11 субклонируют в полученный при обработке фосфатазой векторный фрагмент ΝοΙΙ-ВатН! размером 2,94 т.п.н. из рВ1ие§спрШ8К фирмы 81га1адепе + вектор для клонирования, с целью добавления сигнальной последовательности мышиной легкой цепи и сайта 5'-Νοΐ1 в конечную плазмиду рЕАС978. Данную плазмиду подвергают И8Е-мутагенезу при использовании набора для И8Е-мутагенеза АтегФат РНагтаща Вю1еск следуя протоколу, рекомендованному изготовителем, с использованием мутагенных праймеров, кодирующих замену У3К, для получения соответствия Ν-концу легкой цепи аутентичного СВЕ11. При этом интродуцируют сайт ВдШ в З'-конец вариабельного домена легкой цепи. Мутантные плазмиды идентифицируют путем скрининга изменений интродуцированных сайтов ВдШ, Е^КУ и Мке1. Последовательность легкой цепи в конечной плазмиде рЕАС980 подтверждают секвенированим ДНК. Фрагмент вариабельного домена легкой цепи ΝοΙΙ-ВдШ размером 0,41 т.п.н. из рЕАС980 и фрагмент Βс11-Nοΐ1 размером 0,68 т.п.н. из плазмиды рЕАС963, содержащий константный домен κлегкой цепи человека, субклонируют в сайт Νοΐ1 плазмиды рСН269, полученной на основе экспрессионного вектора ЕВУ рСЕР4 ОпуЦгсщеп) с образованием плазмиды рЕАС982.

Экспрессионными векторами (вектор тяжелой цепи сНСВЕ11 плазмиды рЕАС983 и вектор легкой цепи сНСВЕ11 рЕАС982) котрансфицируют клетки 293-ЕΒNА и тестируют трансфицированные клетки на секрецию и специфичность антитела (в качестве контроля служат клетки, трансфицированные сН5с8 (молекулярным способом клонированное СИ154-специфическое шАЬ, ранее охарактеризованное Вюдеп) и ненагруженным вектором). Анализ способом вестерн-блоттинга (проведенный с использованием антител против человеческой тяжелой и легкой цепей) образования иммунопреципитатов белка А из лизатов целых клеток и кондиционированной среды показывает, что клетки, трансфицированные сНСВЕ11, синтезируют и эффективно секретируют тяжелые и легкие цепи на уровне, близком к уровню клеток, трансфицированных сН5с8. Анализ с помощью ЕАС8 (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) экспрессирующих ЬТ-β-Κ клеток НТ-29, окрашенных кондиционированной средой, полученной из трансфицированных клеток, показывает, что антитело сНСВЕ11 связывает и образует образцы окрашивания, близкие к образцам, полученным для тиСВЕ11, тогда как кондиционированная среда, полученная из псевдо- и сй5с8-трансфицированных клеток, не окрашивает ЬТ-β-Κ на клетках НТ-29. Химерное СВЕ11, полученное в результате временной трансфекции, очищают и демонстрируют его способность индуцировать секрецию ИЛ-8 (интерлейкина-8) клетками меланомы А375, экспрессирующими ЬТ-β-Κ, и ингибировать рост клеток аденокарциномы АЮРг у голых мышей.

Пример 2. Конструирование и экспрессия НиСВЕ11.

Создание реконструированных вариабельных доменов, с целью получения гуманизированного СВЕ11 (НиСВЕ11), проводят, как описано кирга. Выбор человеческих акцепторных каркасов основан на анализе гомологии тАЬ ΤΝΕ-А1 из человеческой κ-подгруппы I для легкой цепи (см. работу СпГГй115 и соавт., 1993) и тАЬ ЕЬА-ЦС из человеческой подгруппы III для тяжелой цепи (см. работу МаШап и соавт., 1996). Разрабатывают три варианта каждой из вариабельных легких и четыре варианта вариабельных тяжелых реконструированных цепей. Как правило, первый вариант содержит больше всего обратных мутаций к последовательностям мышиного донора, тогда как последний вариант содержит наименьшее количество обратных мутаций (т.е. является наиболее гуманизированным).

Вариабельные области 1шСВЕ11 получают путем мутагенеза с элиминацией уникального сайта (И8Е) при использовании набора для И8Е-мутагенеза АтегеНат РНагтааа Вю1есЬ следуя протоколу, рекомендованному изготовителем, и используя плазмиды вариабельного домена с1 СВЕ11 в качестве исходных матриц. Ниже описаны мутагенные праймеры для изменений каркаса (ЕК). Используют последовательность кДНК человеческих акцепторных каркасов (база данных КаЬа1 #004770 для легкой цепи и КаЬа1 #040003 для тяжелой цепи) с молчащими мутациями, интродуцированными для получения изменений сайтов рестрикции, с целью облегчения идентификации мутантных плазмид. Полученные мутантные плазмиды идентифицируют путем скрининга интродуцированных изменений сайтов рестрикции. Последовательности кДНК вариабельных цепей подтверждают секвенированием ДНК.

- 11 006945

Для УН#1 используют рЕАС981 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер РК1 5' ОСС ТСС АСС СТС ССТ САС ОСТ СТС СТС ТСС АСС СТС 3' (8ЕО ΙΌ N0:17), который интродуцирует сайт В§и361; праймер РК2 5' СТТ ТСС ССА САС ТСС ССС ААА ССС ССТ ССА СТС ССТ ССС ААС 3' (8Еф ΙΌ N0:18), который интродуцирует сайты ΝοίΙ и Нра11 и праймер РК3 5' САС АСА САА ТСС САА САА САС ССТ СТА ССТ ССА САТ САС САС ССТ САС ССС ТСА ССА САС АСС САТ С 3' (8Еф ΙΌ N0:19), который интродуцирует сайты В§и361 и Рз11 и удаляет сайт К§а1. Полученную плазмиду УН #1 называют ΡΛΝΩ067.

Для УН#2 используют рАN^067 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер РК2 5' САТ СТА ТТС СТТ ТСС ССА ССС ССС ССС ААА ССС ССТ СС 3' (8ЕО ΙΌ N0:20), который интродуцирует сайт 8та1 и праймер РК3 5' ССС СТС АСС АСА САС СТС ТСТ АТТ АСТ СТС ТАА САС 3' (8Еф ΙΌ N0:21), который интродуцирует сайт Руи11. Полученную УН#2 плазмиду называют рАN^071.

Для УН#3 используют плазмиду рАN^067 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер РК2 5' СТС АСТ АТТ АСА ТСТ АТТ ССС ТСС ССС АСС ССС ССС САА АСС ССС ТСС АС 3' (8Еф ΙΌ N0:22), который интродуцирует сайты 8та1 и Н1а1 и праймер РК3 5' САС ССС ТСА ССА САС АСС ТСТ СТА ТТА СТС ССС ААС АСА ССА САА ТСС ТАА С 3' (8ЕО ΙΌ N0:23), который интродуцирует сайты Руи11 и Р§р1. Полученную плазмиду УН#3 называют рАN^075.

Экспрессионные векторы для тяжелых цепей ЬиСВЕ11 получают путем субклонирования фрагментов вариабельного домена тяжелой цепи №11-Нш4Ш размером 0,44 т.п.н. из рАN^067, рАN^071 или рАN^075, и фрагмента НтШП-ШЬ размером 1,21 т.п.н. из плазмиды рЕАС964, несущей константный домен человеческого ^СЦ субклонируют в сайт N011 плазмиды рСН269, полученной на основе экспрессионного вектора ЕВУ рСЕР4, с образованием векторов для экспрессии тяжелой цепи рАN^069 (УН#1), рАМ)073 (УН#2), и рАN^077 (УН#3).

Для УЪ#1 используют плазмиду рЕАС980 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер РК1 5' СТТ ССААСТ САТ АСТ САС ССТ СТС ТСС САС ССА ТСС АСА САА ССА ТСА ТСС аСа СТС ССТ САТ С 3' (8Еф ΙΌ N0:24), который удаляет сайты Нш1 и N§11; праймер РК2 5' САТ ААТ АСАТСА ССА ТСТ ТАС ССС СТТ ТСС АТС СТТ ТСТ ССТ С 3' (8ЕО ΙΌ N0:25), который интродуцирует сайты Нае11 и Н1а1, и праймер РК3 5' СТА САС АСТ ААТ ААС ТТС ССА ААТ ССТ САС ССТ ССА ССС ТСС ТСА ТСС ТТА САС ТАТ ААТ СТТ ССС САС АТС 3' (8ЕО ΙΌ N0:26), который интродуцирует сайты В§и361, Э4е1 и РШ. Полученную плазмиду УЪ#1 называют рАN^066.

Для УЪ#2 используют плазмиду рАN^066 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер РК1 5' САТ ССА САС ТСС СТС АТС ТСС АТА ТСА ССТ СТС ССА ССТ С 3' (8ЕО ΙΌ N0:27), который интродуцирует ЕсоКУ, и праймер РК3 5' САТ ССТ ТАС АСТ АТА АТС ТСТ АСС АСА ТСС АСТ ССС АСТ С 3' (8Еф ΙΌ N0:28), который интродуцирует сайт К§а1. Полученную плазмиду УЪ#2 называют рАN^070.

Для УЪ#3 используют плазмиду рАN^066 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер РК 5' САТ ССА САС ТСС СТС АТС ТСС АТА ТСА ССТ СТС ССА ССТ С 3' (8ЕО ΙΌ N0:29), который интродуцирует сайт ап ЕсоКУ; праймер РК2 5' САА ССТ ТСТ ТСС АТА АТА САТ САС ААС СТТ АСС ССС ТТТ ССС ТСС ТТТ СТС СТС СТА СС 3' (8ЕО ΙΌ N0:30), который интродуцирует сайт Нш4111 и удаляет сайты №о1 и 81у1. и праймер РК3 5' САТ ССТ ТАС АСТ АТА АТС ТСТ АСС АСА ТСС АСТ ССС АСТ С 3' (8Еф ΙΌ N0:31), который интродуцирует сайт К§а1. Полученную плазмиду УЪ#3 называют РАN^074.

Экспрессионные векторы для легких цепей 1шСВЕ11 получают субклонированием фрагментов вариабельного домена легкой цепи №И-ВдШ размером 0,41 т.п.н. из рАN^066, рАN^070 или рАN^074, и фрагмента Вс11-№11 размером 0,68 т.п.н. из плазмиды рЕАС963, содержащей константный домен человеческой κ-легкой цепи, субклонируют в сайт N011 плазмиды рСН269, полученной на основе экспрессионного вектора ЕВУ рСЕР4, с образованием векторов для экспрессии легкой цепи рАN^068 (УЪ#1), рАМ)072 (УЪ#2) и рАN^076 (УЪ#3).

Экспрессионными векторами котрансфицируют клетки 293-ЕВNА и трансфицированные клетки тестируют на секрецию и специфичность антитела (клетки, трансфицированные ненагруженным вектором, служат отрицательным контролем). Анализ способом вестерн-блоттинга (проведенный с использованием антител против человеческой тяжелой и легкой цепей) образования иммунопреципитатов белка А из лизатов целых клеток и кондиционированной среды показывает, что клетки, трансфицированные 1шСВЕ11. синтезируют и эффективно секретируют тяжелые и легкие цепи на уровне, близком к уровню клеток, трансфицированных с1СВЕ11. Анализ с помощью РАС8 экспрессирующих ЬТ-β-Κ клеток НТ29, окрашенных кондиционированной средой, полученной из трансфицированных клеток, показывает, что тАЬ 1111СВЕ11 #3 связывает хуже, чем тАЬ ЬиСВЕ11#1 и ЬиСВЕ11#2 по сравнению с с1СВЕ11 (см. табл. 1 ниже), где показаны ЬиСВЕ11#1 (УЪ#1 в сочетании с УН#1); ЬиСВЕ#2 (УЪ#2 в сочетании с УН#2) и 1шСВЕ11#3 (УЪ#3 в сочетании с УН#3). Результаты смешанных и соответствующих котрансфекций позволяют предполагать, что снижение могло было быть связано с вариантом УН#3, который отличается от УН#2 двумя каркасными остатками: РК2 Р37У и РК3 У93А. Для исследования отдельных вкладов каждого из данных изменений конструируют векторы для экспрессии новых тяжелых цепей.

- 12 006945

Плазмиду ΡΑΝΏ089, вариант Е37У УН #2, получают посредством субклонирования фрагмента Νοΐΐ-Ρδΐΐ размером 311 п.н. из ρΑΝΏ075, фрагмента Ρδΐΐ-ΗΐηάΙΙΙ размером 126 п.н. из ρΆΝΏ071 и фрагмента ΗΐηάΙΙΙ-Νοΐΐ размером 1,21 т.п.н. из плазмиды рЕАО964 в сайт Νοΐΐ плазмиды рСН269, полученной на основе экспрессионного вектора ЕВУ рСЕР4. Плазмиду ρΑΝΏ090, вариант У93А УН#2, получают посредством субклонирования фрагмента Νοΐΐ-Ρδΐΐ размером 311 п.н. из ρΑΝΏ071, фрагмента ΡδΐΙ-ΗΐηάΙΙΙ размером 126 п.н. из ρΑΝΏ075 и фрагмента ΗΐηάΙΙΙ-ΝοΐΙ размером 1,21 т.п.н. из плазмиды ρΕΑΘ964 в сайт Νοΐΐ плазмиды рСН269, полученной на основе экспрессионного вектора ЕВУ рСЕР4. Данными химерными тяжелыми цепями Н2/Н3 котрансфицируют клетки 293-ΕΒΝΑ, несущие УБ#2 или УБ#3. Анализ с помощью ЕАС8 показывает, что у варианта Н2 У93Α восстанавливается связывание БТ-β-Κ в паре с УБ#3 (см. таблицу, δυρία). Вариант с использованием пары ρΑΝΏ076 и ρΑΝΏ090 называют БиСВЕ11#4 (см. таблицу).

Котрансфекции клеток 293-1-ΒΝΑ вариантами еБСВЕ11 и ЕиСВЕ11 #Б-4 масштабируют и собирают кондиционированную среду. Антитело очищают на Белок А-Сефарозе. Проводят анализ активности очищенных шАЬ.

Окрашивание с помощью РАС8 клеток НТ-29 сНСВЕ11 и ЬиСВЕ!1

Легкая цепь Тяжелая цепь Относительный МП (среднекратный прирост)

СПСВЕ11	РЕАО982	ΡΕΑΘ983	1,00
НиСВЕ11#1	ρΑΝϋΟ68	ρΑΝϋΟ69	1,00
НиСВЕ11#2	ρΑΝϋ072	ρΑΝϋΟ73	1,00
НиСВЕ11#3	ρΑΝϋΟ76	ρΑΝϋ077	0,62
1_2/НЗ	ρΑΝϋΟ72 Легкая цепь	ρΑΝϋΟ77 Тяжелая цепь	0,42 Относительный ΜΗ

(среднекратный прирост)

Ι_3/Η2	ρΑΝϋ076	ρΑΝϋΟ73	1,00
Ι_2/Ε37ν Η2	ρΑΝϋΟ72	ρΑΝϋΟ89	0,65
Ь2Д/93А Н2	ρΑΝϋ072	ρΑΝϋ090	0,75
ЬЗ/Е37У Н2	ρΑΝϋΟ76	ρΑΝϋΟ89	0,80
НиСВЕ11#4	ρΑΝϋΟ76	ρΑΝϋ090	1,00

Кондиционированную среду, полученную из временно трансфицированных клеток, используют для окрашивания клеток НТ-29 путем инкубирования в течение 30 мин на льду, промывания клеток два раза в буфере для ЕΑС8 ^В8 (физиологический раствор, забуференный фосфатом) с добавлением 5% ЕВ8 (сыворотка телячьих эмбрионов) и 0,05% азида натрия), окрашивания с использованием РЕконъюгированного Ι§Θ против человека (Н + Б) (ΙαοΕδοη IттиηοΚе8еа^сй Εα6οΓαΐοΓΪ08, Ιηο.) в течение 30 мин на льду в буфере для ΕΑС8, промывания клеток два раза буфером для ΕΑС8 и ресуспендирования в буфере для ΕΑС8, с целью проведения анализа. Относительный ΜΕΙ означает среднее значение ΜΕΙ, нормализованное относительно значения, полученного для еБСВЕ11. Показанные данные представляют среднее значение по двум независимым экспериментам с трансфекцией.

Пример 3. Агонизм ИЛ-8 на клетках А375.

Анализируют активность очищенных тΑЬ. Результаты анализа выхода ИЛ-8 на клетках человеческой меланомы А375 представлены на фиг. 1 (связанные антитела) и 2 (растворимые антитела), где измеряют количество ИЛ-8, которое выделилось при связывании антитела против ΕΤ-β-Κ с ΕΤ-β-Κ, экспрессирующегося на поверхности человеческих клеток меланомы А375. Клетки А375 помещают при густоте 10⁵/мл в 96-луночные планшеты, содержащие либо растворимые антитела, либо антитела, иммобилизованные на лунках, покрытых козьим Ее Ι§Θ против человека (ΙαοΕδοη ^ши^^зеишЕ ΕπΕοΓαΐοΓίβδ). Планшеты для культивирования инкубируют в течение ночи. Кондиционированную среду собирают и анализируют на присутствие ИЛ-8 с помощью Ε^I8Α (твердофазный иммуноферментный анализ).

Пример 4. Цитотоксичность в отношении клеток ШЮг.

- 13 006945

Результаты анализа цитотоксичности при использовании клеток рака толстой кишки \У1)г с растворимыми антителами против БТ-β-Κ в лунках, покрытых Ре 1дО против человека, демонстрируют, что антитела против БТ-β-Κ повышают цитотоксичность раковых клеток, как показано на фиг. 3 (связанные антитела) и 4 (растворимые антитела). Клетки ΑιΟγ помещают при густоте 6х10⁴/мл в присутствии 80 единиц/мл йи1РЫ-у в 96-луночные планшеты, содержащие либо растворимые антитела, либо антитела, иммобилизованные на лунках, покрытых козьим Рс 1дО против человека (1аскзоп 1тшипоКе8еагсй БаЬога£ог1ез). Планшеты для культивирования инкубируют в течение 5 дней. На 4 ч добавляют МТТ, полученный преципитат растворяют посредством инкубирования в течение ночи с 10% 8Ώ8 (додецилсульфат натрия) в 10 мМ НС1 и читают Θ.Ώ. (оптическую плотность) с помощью ридера для микропланшет.

Пример 5.

Получают антитело, состоящее из реконструированного варианта 3 легкой вариабельной цепи (УБ#3) и реконструированного варианта 4 тяжелой вариабельной цепи йиСВЕ11, названное йиСВЕ11 #4 или НСВЕ11, и клеточную линию, продуцирующую антитело, депонируют в коллекции культур АТСС (наименование патентного депозита АТСС РТА-3357). Полные полипептидные последовательности каждой из легкой и тяжелой цепей, включая константные домены, являются следующими:

Последовательность варианта 3 легкой цепи зрелого йиСВЕП (8Εν ΙΌ N0:32):

^I^МТ^8Р88 Б8А8УОПКУТ 1ТСКАООП1К 8УБ8^УООКР ОКАРКББ1УУ

АТКБАПОУР8 КР8О8О8ОТП ΥТ^ТI88^^Р ЕОРАТУУСБО НОЕ8Р^ТРОО

101 ОТКБЕ1К [КТУ ААР8УР1РРР 8^Ε^^К8σТА 8\\'С1.1ΛΛΤΎ РРЕАКУОАКУ

151 ^NА^^8ΘN8^ Ε8УТΕ^^8К^ 8ТУ8Б88ТБТ Б8КАПУЕКНК УУАСЕУТНрО

201 1.88Р\УК8Е\ КОЕС]

СОК выделены подчеркиванием; обратная мутация Ρ71Υ выделена жирным шрифтом; константный домен выделен скобками.

Последовательность варианта 4 тяжелой цепи зрелого йиСВЕ11 (8Ε^ II) N0:33):

У37Е 549А

I ЕУЦЬУЕБОСО ЕУКРСС81.КЕ8САА5СРТЕ8 ΡΥΥΜΥν/ГЙОА Р0КС.ЬЕ\УУА1

Ι8ΡΟΟ8ΥΤΥΎ РР8УКОКЕТ18ΚΡΝΑΚΝ8ΕΥ Ь<2М88ЬВАЕР ТАУУУСАР££

101 ΝΟΝΤΥΥΡΡΥίΥ С0СТТУТУ88 [А8ТКОР8УРР ЬАР88К8Т8О СТААЬССЬУК

151 ΡΥΡΡΕΡνΤΥδ νΥΝ80ΑΕΤ80ν НТЕРАУ1Х288 ОЬУ8Ь88УУТ УР888ЫЗТ(УГ

201 ΥΙΟΝνΝΗΚΡδ ИТКУРККУЕР К8СРКТНТСР РСРАРЕШЗО РЗУГЬРРРКР

251 КРТЬМ18КТР БУТСУ УУР У8 НЕРРЕУКРШУ УУРОУЕУНМΑ ΚΤΚΡΒΕΕΡΥΝ зо1 δτγκννβνυτ уьнрруокж еукскузика ьрапектш ΚΑκαςρκΕΡς

351 УПЪРРЗЯРЕ ЬТЮЧЦУЗЬТС ЬУК6РУР8Р1 ΑνΕ\¥Ε8ΝΟ<2Ρ ΕΝΝ ΥΚΤΤΡΡν

401 ЬР8РС8РНЛ 8КЪТУРК8ЮУ ОЦОИУРЗСЗУ ΜΗΕΑΤΗΝΗΥΤ 0К8Е8Ь8РО]

СОК выделены подчеркиванием; обратная мутация Ρ71Υ выделена жирным шрифтом; константный домен выделен скобками.

Голым мышам в возрасте 6 недель делают внутрибрюшинную инъекцию 100 мкг антитела против БРА3 (1Е6), 100 мкг антитела против БТВК (йиСВЕ11 #4) или им не делают инъекцию (контроль). Затем животным делают подкожную инъекцию 1х10⁶ клеток аденокарциномы толстой кишки АПЖ. Мышей, леченных йиСВЕ11 #4, повторно лечат еженедельным введением 100 мкг антитела, а животных, леченных шСВЕ11, повторно лечат введением только на день 14. Размер опухоли измеряют еженедельно и вычисляют объем сферической опухоли (см. фиг. 5). Животных умерщвляют, когда объем их опухолей достигает 2,0 см³ (диаметр 16 мм) и их гибель отмечают на графике выживаемости (см. фиг. 6).

Пример 6.

Голым мышам в возрасте 6 недель либо делают внутрибрюшинную инъекцию 100 мкг антитела против БТВК (йиСВЕ11#4), либо им не делают инъекцию (контроль). Затем всем животным делают подкожную инъекцию 1х10⁶ клеток аденокарциномы толстой кишки АПЖ. Мышей, леченных йиСВЕ11#4, повторно лечат еженедельным введением 100 мкг антитела йиСВЕ11 #4. Размер опухоли измеряют еженедельно и вычисляют объем сферической опухоли. Представленные объемы опухолей представляют среднее значение по 10 контрольным животным и 8 животным, леченным йиСВЕ11#4 (см. фиг. 7). Еженедельное введение йиСВЕ11#4 в значительной степени подавляет рост опухоли АПЖ, имплантированной подкожно голым мышам. Животные, леченные антителом, до дня 21 продолжают демонстрировать пониженную скорость роста опухоли в течение двух недель после прекращения лечения.

Пример 7.

йиСВЕ11#4 замедляет рост ранее выросших опухолей АПЖ и повышает выживаемость у голых мышей, несущих опухоль АПЖ. 10⁶ клеток АПЖ предварительно выращивают подкожно в течение 10 дней у голых мышей. Мышам делают подкожные инъекции РВ8 либо йиСВЕ11 #4 еженедельно, или тСВЕ11 через неделю. Массы опухолей рассчитывают, исходя из измерений ширины и длины, и животных с опухолями массой более 2000 мг умерщвляют, массы их опухолей в момент умерщвления продол

- 14 006945 жают учитывать в статистическом усреднении. Границы ошибки представляют стандартную ошибку. Массы опухолей вычисляют с помощью формулы: (Ширина х Ширина х Длина)/2 = масса опухоли в мг. Результаты представляют в виде графика на фиг. 8 и показывают, что 1шСВЕ11 #4 обладает способностью замедлять развитие ранее выросших опухолей ίη νίνο.

Кроме того, опухоли культивируют и лечат, как описано выше и измеряют процент выживаемости животных. Результаты в виде графика представляют на фиг. 9 и показывают, что 1шСВЕ11 #4 обладает способностью индуцировать более длительную выживаемость ίη νίνο у мышей с ранее выросшими опухолями.

Пример 8. Измерение аффинности антитела.

Клетки НТ-29 культивируют в среде ΌΜΕΜ (модифицированная среда Дульбекко-Игла) с добавлением Ь-глутамина, не-незаменимых аминокислот, пирувата натрия и 10% сыворотки телячьих эмбрионов. Клетки однократно промывают в РВ8 и удаляют из планшета путем инкубирования при комнатой температуре с течение 5 мин с РВ8 с добавлением 20 мМ ΕΌΤΆ (этилендиаминтетрауксусной кислоты). Клетки центрифугируют при 1000 об/мин. (110 х д) в течение пяти минут и ресуспендируют в РВ8 до получения густоты 1 х 10⁷ клеток/мл.

Антитело 1шСВЕ11 #4 против-ΕΤβΚ. и гуманизированное антитело против СЭ40Е в качестве отрицательного контроля разводят в РВ8 и делают 12-кратное серийное разведение 1:4 до получения конечной концентрации, лежащей в интервале 2,37 пМ - 10 мкМ. 100 мкл суспензии клеток и 100 мкл разведения антитела вместе вносят в каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрования с У-образной формой дна. Антитело и клетки инкубируют при 4 С в течение 2 ч. Планшет центрифугируют при 1000 об/мин. (110 х д) в течение 10 мин при 4°С. Супернатант отбрасывают и шесть раз промывают клеточный остаток холодным РВ8.

Конъюгат козьего 1дС против человека и фикоэритрина (1аск§оп 1ттипогс5сагс11) разводят 1:100 в РВ8 и добавляют по 200 мкл в каждую лунку. Клетки инкубируют с данным вторичным антителом в течение одного часа при 4°С, центрифугируют, как описано выше, и однократно промывают в холодном РВ8. Затем клетки переносят в полистирольные тест-пробирки. Интенсивность флуоресценции измеряют на приборе ГАС8 СаЛЬиг (Всск1оп Оюкпъоп).

Строят график зависимости средних значений интенсивности флуоресценции окрашивания для контроля неспецифического связывания антитела против СО40Ь от концентрации антитела с помощью программы Эс11а СгарЛ.

Данные значения соответствуют прямой линии и теоретические значения неспецифического связывания для каждой концентрации антитела вычитают из результата для каждой точки в серии разведений ЛиСВЕ11 #4.

Затем строят график зависимости данных значений интенсивности специфической флуоресценции от концентраций 1шС'.ВЕ11#4 в логарифмическом масштабе. Полученная в результате кривая имеет форму колокола и является симметричной, она отражает самоингибирование связывания антитела при высоких концентрациях. Левая половина данной кривой соответствует уравнению с четырьмя параметрами, которое позволяет определить функциональную аффинность антитела. Соответствие полученной в результате кривой дает значение ЕС₅₀ 60 пМ для связывания 1шСВЕ11 #4 с клетками НТ-29.

Для компетентных специалистов в данной области очевидна возможность различных модификаций и вариантов в полипептидах, композициях и способах, соответствующих изобретению, не выходя за рамки сущности и объема притязаний изобретения. Вследствие этого предусматривают, что данное изобретение охватывает модификации и варианты, соответствующие данному изобретению, при условии, что они входят в объем прилагаемых пунктов формулы изобретения и эквивалентных им решений.

- 15 006945

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ < 110> БАЙОДЖЕН, ИНК.

ГАРБЕР, Эллен

ЛАЙН, Пол

САЛЬДАНА, Хосе, У.

<120> Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина-/? (варианты), композиция, способ лечения или снижения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у человека, выделенная нуклеиновая кислота (варианты), клетка клеточной линии <130> А100 РСТ <150> 60/240,285 <151> 2000-10-13 <150> 60/275,289 <151> 2001-03-13 <150> 60/299,987 <151> 2001-06-21 <160> 33 <170> Еа51БЕС> Гог ХУшботе Уегйоп 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> РКТ <213> мышиный <400> 1

Азр

Не

Ьуз

МеЬ

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

МеЬ

Туг

А1а

Зег

Ьеи

<31у

1

5

10

15

<31и

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

<Э1у

(31п

Азр

11е

Ьуз

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

С1п

(31п

Ьуз

Рго

Тгр

Ьуз

Зег

Рго

Ьуз

Не

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

(31у

50

55

60

5ег

С1у

Зег

С1у

αΐη

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1и

Зег

65

70

75

80

Азр

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

Θΐη

ΗΪ3

С1у

61и

Зег

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

<31у

<31у

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100 105 <210> 2 <211> 120 <212> РКТ <213> мышиный <400> 2

С1и

\7а1

<31п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

(31у

С1у

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

<31у

О1у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

20

25

30

Туг

МеЬ

Туг

Тгр

РЬе

Агд

61п

ТЬг

Рго

СЛи

Ьуз

Агд

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

ТЬг

Не

Зег

Азр

С1у

С1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

- 16 006945

Ьуз

<31у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд Азр Азп А1а

Ьуз

Азп

Азп

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЬ

Зег

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

(31и

Азр

ТЬг

А1а

МеЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

О1и

О1и

Азп

О1у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

100

105

110

61у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 3 <211> 321 <212> ΏΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 3 даЪаЬЬаада ЬдасссадЪс ЬссаЬсаЬсс ЬЬдЬсЬдсаЬ сддЬдддада садддЬсасЬ аЬсасЬЕдса аддсдддЬса ддасаЬЬааа адсЬаЬЬЪаа дсЬддйасса дсадааасса Ъддааадсдс сЪаадаЬссЬ даЪсЬаЬЬаЕ дсаасааддЬ ЬддсадаЬдд ддЪсссаЬса адаЪЕсадЬд дсадЬддаЬс ЬдддсаадаЬ ЕаЬасЬсЬаа ссаЬсадсад ссйдсадссЬ даддаЪЬЬсд саасЬЬаЬЬа сЬдЬсЬасад сайддЬдада дсссдЬддас дСЪсддйдда ддсассаадс ЬддадаЪсаа а <210> 4 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп <400> 4

120 180 240 300 321

Азр

11е

Ьуз

МеЬ

Ткг

61п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

С1у

С1п

Азр

Не

Ьуз

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

С1п

О1п

Ьуз

Рго

Тгр

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

11е

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

(31у

(31п

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Рго

65

70

75

80

61и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

(31п

ΉΪ3

С1у

С1и

Зег

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

61у

<31у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 5 <211> 321 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 5 даЬайссада аЬсасЬЬдса Ьддааадсдс адагссадсд даддаЬЬЬсд ддсассаадс

ЬдасссадЬс аддсдддЬса сЬаадаЬссЬ дсадсддасс саасЬЬаЬСа ЬддадаЬсаа

ЬссаЬсаЬсс ддасаЬЪааа даЬсЬаЬЬаЪ сддсасадас сЬдйсЬасад а

ЪЬдЬсЬдсаЬ адсйаЬЬЬаа дсаасааддЬ сасассссаа саЬддЬдада сддЬдддада дсЬддЬасса ЬддсадаЬдд ссассадсад дсссдЬддас садддСсасЬ дсадааасса ддЪсссаЬса сссдсадссс дЬЬсддЬдда

120

180

240

300

321 <210> 6 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп <400> 6

- 17 006945

Азр	11е (31п МеС	ТЬг	О1П	Зег	Рго
1				5
Азр	Агд	Уа1	ТЬг 20	11е	ТЬг	Суз	Ьуз
Ьеи	Зег	Тгр 35	Туг	Θΐη	(31п	Ьуз	Рго 40
Туг	Туг 50	А1а	ТЬг	Агд	Ьеи	А1а 55	Азр
Зег 65	<31у	Зег	<31у	ТЬг	Азр 70	Туг	ТЬг
О1и	Δ ατΊ	ρΗθ	АХн	Τΐιχ	- 2		Πίζα
				85	*2 -	—
ТЬг	РЬе	О1у	О1у 100	С1у	ТЬг	Ьуз	Ьеи

Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1	СЯу
10	15
А1а 25	61у	61п	Азр	11е	Ьуз 30	Зег	Туг
Тгр	Ьуз	А1а	Рго	Ьуз 45	11е	Ьеи	11е
СЯу	Уа1	Рго	Зег 60	Агд	РЬе	Зег	СЯу

Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго

	75	80
Ьеи ОХп	Η1ξ О1у С1и	Зег Рго Тг’'
90		95 Г

С1и 11е Ьуз

105 <210> Ί <211> 321 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 7 дакаЪссада аСсасЬСдса дддааадсдс адаеесадед даддаееесд ддсассаадс

Ьдасссадес аддсдддСса сеаадссесе дсадЬддаес саасЬЬаееа еддадаесаа

ЪссаесаЬсс ддасаееааа даесеаееае ЪддРасадае седЪсСасад а еедеседсае адсеаеееаа дсаасаадде еаСасЬсСаа саЪддЪдада сддЬдддада дседдЪасса СддсадаЬдд ссаесадсад дсссдЬддас садддЬсасе дсадааасса ддЬсссаеса сскдсадссе деесддедда

120

180

240

300

321 <210> 8 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп <400> 8

Азр

11е

С1п

Мее

ТЬг

СЯп

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

СЯу

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

О1у

(31п

Азр

11е

Ьуз

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

(31п

Θΐη

Ьуз

Рго

СЯу

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

СЯу

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СЯу

50

55

60

Зег

О1у

Зег

СЯу

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

СЯп

Нхз

О1у

О1и

Зег

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

СЯу

СЯу

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

<31и

11е

Ьуз

100

105

<210> 9 <211> 360 <212> ΏΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 9 даддРасаас еддеддадЬс Ьдддддаддс ееадедаадс седдадддес сскдаддсСс есседедсад ссесЬддаее сасЬЬесадЬ дасеаееаса едеаееддее есдссадасе ссдддааадд ддсЬддадЬд ддРсдсаасс аееадедаед деддеадееа сассеасеае ссадасадед едааддддсд аеесассаес ессададаса аедссаадаа садссесеас сЪдсадаЪда дсадсседад ддскдаддас асадссаеде аееаседеде аадададдад ааЪддЪаасЪ еееасеасее едасеасЬдд ддссааддда ссасддЬсас сдесессеса

120

180

240

300

360 <210> 10

- 18 006945 <211> 120 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп

<400> 10

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

<31и

Зег

С1у

О1у

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61у

61у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Мер

Туг

Тгр

РЬе

Агд

(31п

ТЬг

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

ТЬг

Не

Зег

Азр

(31у

С1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

(31п

МеР

Зег

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Мер

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

С1и

С1и

Азп

<31у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 11 <211> 360 <212> ΏΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 11 даддРасаас РддРддадРс Едддддаддс РРадРдаадс сРддадддРс ссРдаддсРс60

РссРдРдсад ссРсРддаРР сасРРРсадР дасРаРРаса РдРаРРддРР Рсдссаддсс120 ссдддааадд ддсРддадРд ддРсдсаасс аРРадРдаРд дРддРадРРа сассРасРаР180 ссадасадрд Рдааддддсд аРРсассаРс Рссададаса аРдссаадаа садссРсРас240 сРдсадаРда дсадссРдад ддсРдаддас асадсРдРдР аРРасРдРдР аадададдад300 ааРддРаасР РРРасРасРР РдасРасРдд ддссааддда ссасддРсас сдРсРссРса360 <210> 12 <211> 120 <212> РКТ <213> Ното Зархеп <400> 12

(31и

Уа1

<31п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

О1у

О1у

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

С31у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Мер

Туг

Тгр

РЬе

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

\7а1

35

40

45

А1а

ТЬг

11е

Зег

Азр

С1у

О1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

ΠΊ »»·

74

Р11О

τΈι-νX XXX

Т1 л

74 ч^/-т лх у

74 гчч-ι ЛО11

74 Ί -ч ЛХС4

хду^З

Азп

О лч/.

Т лч, иси

ГПч X У х

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Мер

Зег

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

С1и

С1и

Азп

(31у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

<31у

О1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 13 <211> 360 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп

- 19 006945 <400> 13 даддРасаас ЬддРддадЬс Ьдддддаддс РРадРдаадс сЬддадддЬс ссЬдаддсЬс ЬссЬдЬдсад ссРсРддаРР сасЬРЬсадЬ дасЬаЬЬаса РдЬаЬРддЬР Рсдссаддсс ссдддааадд ддсЬддадЬд ддСсдсаасс аРЬадРдаЬд дЬддРадСЬа сассРасРаЬ ссадасадрд Ьдааддддсд аЬЬсассаЬс Ьссададаса аРдссаадаа садссЬсЬас сЬдсадаЬда дсадссЬдад ддсЬдаддас асадсЬдЬдЬ аРРасЬдЬдЬ аадададдад ааЬддЬаасЬ ЬССасЬасЬЬ ЬдасРасЬдд ддссааддда ссасддЬсас сдЬсЬссЬса

120 180 240 300 360 <210> 14 <211> 120 <212> РВТ <213> Ното 8ар1еп

<400> 14

01и

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

О1у

61у

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

С1у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Мер

Туг

Тгр

Уа1

Агд

Θΐη

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

(31и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

ТЬг

Не

Зег

Азр

61у

С1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

(31у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

Θ1Π

Мер

Зег

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

О1и

О1и

Азп

С1у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

О1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 15 <211> 360 <212> ΏΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 15 даддЬасаас РддЬддадЬс Ьдддддаддс ЬЬадРдаадс сЬддадддРс ссЬдаддсЬс60

РссЬдЬдсад ссЬсЬддаЬР сасЬРЬсадР дасЬаЬРаса РдРаЬРддЬЬ Ьсдссаддсс120 ссдддааадд ддсЬддадЬд ддЬсдсаасс аЬЬадЬдаЬд дЬддЬадЬЬа сассЬасЬаЬ180 ссадасадЬд Рдааддддсд аЬРсассаЬс Рссададаса аРдссаадаа садссРсРас240 сРдсадаРда дсадссРдад ддсРдаддас асадсРдРдР аРРасРдсдс аадададдад300 ааРддРаасР РРРасРасРР РдасРасРдд ддссааддда ссасддРсас сдРсРссРса360 <210> 16 <211> 120 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп <400> 16

<31и

Уа1

СЛп

Ьеи

Уа1

О1и

Зег

О1у

<31у

б1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

С1у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Мер

Туг

Тгр

РЬе

Агд

С1п

А1а

Рго

(31у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

ТЬг

11е

Зег

Азр

С1у

С1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

(31у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

СПп

Мер

Зег

Зег

Ьеи

Агд

А1а

(31и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

С1и

О1и

Азп

О1у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

<31п

100

105

но

- 20 006945 <31у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210> 17 <211> 36 <212> ΏΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 17 дссЕддаддд ЕсссЕдаддс

ЕсЕссЕдЕдс адссЕс <210> 18 <211> 42 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 18 дЕЕЕсдссад асЕссдддаа аддддсЕдда дЕдддЕсдса ас <210> 19 <211> 67 <212> ϋΝΆ <213> Ното 8ар1еп <400> 19 сададасааЕ дссаадааса адссаЕд дссЕсЕассЕ дсадаЕдадс адссЕдаддд сЕдаддасас <210> 20 <211> 38 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 20 саЕдЕаЕЕдд ЕЕЕсдссадд ссссдддааа ддддсЕдд <210> 21 <211> 36 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 21 дддсЕдадда сасадсЕдЕд

ЕаЕЕасЕдЕд

Еаадад <210> 22 <211> 50 <212> ΟΝΑ <213> Ното 8аргеп <400> 22 дЕдасЕаЕЕа саЕдЕаЕЕдд дЕдсдссадд ссссдддааа ддддсЕддад <210> 23 <211> 52 <212> ΏΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 23

- 21 006945 дадасЬдддк дадддсЕдад дасасадсЬд

ЪдЪаЕЬасЬд сдсаададад дадааЬддЪа ас <210> 24 <211> 64 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 24 сЬСдсаадЬд аЬадЪдассс са±с <210> 25 <211> 43 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп

ЬдСсЬсссас сдаЬдсадас ааддаЪдаЬд <400> 25 саЬааЬадаЕ саддаксСЬа ддсдсЬЬЪсс аЕддЬЬЪсЬд с±д <210> 26 <211> 72 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 26 дЬадасадЪа а±аад±±дсд сЕЪдсссада ±с аааЪссЕсад дсЬдсаддсЕ дс±да±дд±± ададЬаЬааЪ <210> 27 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 27 даЬддадаск дддЬсаЪсСд даЬа±сасс± сйддсассЪд <210> 28 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 28 дакддЪЪада дЪаЬааЪсЪд

ЪассадаЬсс асЪдссасЬд <210> 29 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 29 даЬддадасЕ дддЕсаЕсСд даЬаЕсассЬ сСддсассЬд <210> 30 <211> 59 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 30 саасс±±д±± дсаЬаакада

ЬсадаадсЬЬ аддсдсЬЬЕс ссЪддЬСЬсЪ дсйддЬасс

- 22 006945 <210> 31 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1еп <400> 31 даЕддЕЕада дЕаЕааЕсЕд ЕассадаЕсс асЕдссасЕд 40 <210> 32 <211> 663 <212> РЯТ <213> Ното 8ар1еп <400> 32

Азр 1

Не

61п

МеЕ ТЬг 61п Зег Рго Зег Зег

Ьеи

Зег А1а

Зег

Уа1 15

61у

5

10

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

<31у

61п

Азр

11е

Ьуз

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

61п

61п

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Туг

А1а

Ткг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

61у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

б1у

Зег

61 у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Рго

65

70

75

80

61и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

61п

Н13

61у

61и

Зег

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

Рке

61у

О1у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

61и

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

61у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

61п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61п

Зег

61у

Азп

Зег

61п

145

150

155

160

<31и

Зег

Уа1

ТЬг

61и

61п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

61и

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

61 и

Уа1

ТЬг

Н13

61п

61у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

61у

61и

Суз

61и

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61и

Зег

61у

61у

61у

210

215

220

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61у

61у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

225

230

235

240

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

Туг

МеЕ

Туг

Тгр

РЬе

Агд

61п

А1а

Рго

61у

245

250

255

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

11е

Зег

Азр

61у

61у

Зег

Туг

ТЬг

260

265

270

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

61у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

275

280

285

А1а

Βνβ

Азп

Ъви

Тхл-г

Ъэи

61п

МеЕ

Зег

βθτ

Т.АГ1

Вггг

АХн

61и

Δ ат*»

- —

·“ э

290

295

300

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

61и

С1и

Азп

61у

Азп

РЬе

Туг

Туг

305

310

315

320

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

61 у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

325

330

335

ТЬг

Ьуз

61у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

340

345

350

Зег

61у

61у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

61у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

355

360

365

<31и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

61у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

61у

Уа1

370

375

380

Нхз

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

61п

Зег

Зег

61у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

385

390

395

400

- 23 006945

Зег Уа1 Уа1

ТЬг

Уа1 405

Рго

Зег

Зег Зег Ьеи 410

(31у ТЬг (31η ТЬг Туг 415

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Нхз

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

420

425

430

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Нхз

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

435

440

445

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

С1у

<31у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

450

455

460

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеС

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

(31и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

465

470

475

480

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нхз

О1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

485

490

495

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Нхз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

(31и

(31и

(31п

500

505

510

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Нхз

<31п

515

520

525

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

б1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

530

535

540

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

<31и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

<31п

Рго

545

550

555

560

Агд

<31и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

565

570

575

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

<31у

РЬе

Туг

Рго

Зег

580

585

590

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

(31у

Θΐη

Рго

<31и

Азп

Азп

Туг

595

600

605

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

610

615

620

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

Θΐη

С31п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

625

630

635

640

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеС

Нхз

<31и

А1а

Ьеи

Нхз

Азп

Нхз

Туг

ТЬг

(31п

Ьуз

645

650

655

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

(31у

660 <210> 33 <211> 4852 <212> РК.Т <213> Ното Зархеп <400> 33

Рго

Азр

Не

Ьуз

МеС

ТЬг

(31п

Зег

Рго

Зег

Зег

МеС

Туг

А1а

Зег

Ьеи

1

5

10

15

С1у

С1и

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

<31у

С1п

Азр

11е

Ьуз

Зег

20

25

30

Туг

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

<31п

(31п

Ьуз

Рго

Тгр

Ьуз

Зег

Рго

Ьуз

11е

Ьеи

35

40

45

11е

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

<31у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

(31у

Зег

О1у

Зег

(31у

<31п

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1и

65

70

75

80

Зег

Азр

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

(31п

Нхз

О1у

С1и

Зег

Рго

85

90

95

Тгр

ТЬг

РЬе

О1у

<31у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

(31и

11е

Ьуз

Рго

С1и

Уа1

С1п

100

105

110

Ьеи

Уа1

61и

Зег

С31у

(31у

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

<31у

<31у

Зег

Ьеи

Ьуз

115

120

125

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

<31у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

Туг

МеС

Туг

130

135

140

Тгр

РЬе

Агд

Θΐη

ТЬг

Рго

(31и

Ьуз

Агд

Ьеи

(31и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

11е

145

150

155

160

Зег

Азр

О1у

С31у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

165

170

175

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Азп

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

МеС

180

185

190

Зег

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

01и

Азр

ТЬг

А1а

МеС

Туг

Туг

Суз

Уа1

Агд

С1и

195 200 205

- 24 006945

СЯи Азп 210

СЯу

Азп РЬе

Туг

Туг РЬе 215

Азр Туг Тгр

СЯу СЯп СЯу ТЬг 220

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

Азр

<31у

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

СЯу

А1а

225

230

235

240

ТЬг

СЯу

А1а

Суз

Суз

Суз

А1а

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

245

250

255

А1а

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

ТЬг

СЯу

ТЬг

Суз

ТЬг

С1у

Суз

А1а

ТЬг

Суз

СЯу

260

265

270

С1у

ТЬг

СЯу

С1у

С1у

А1а

<31у

А1а

Суз

А1а

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Суз

А1а

275

280

285

Суз

ТИг

А1а

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

С1у

Суз

А1а

А1а

СЯу

С1у

Суз

290

295

300

С1у

С1у

СЯу

ТЬг

Суз

А1а

СЯу

СЯу

А1а

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

А1а

305

310

315

320

А1а

СЯу

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

С1у

Суз

ТЬг

С1у

<31у

ТЬг

325

330

335

А1а

Суз

Суз

А1а

<31у

Суз

А1а

(31у

А1а

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

СЯу

340

345

350

С1у

А1а

А1а

А1а

С1у

Суз

СЯу

Суз

Суз

ТЬг

А1а

А1а

СЯу

А1а

ТЬг

Суз

355

360

365

Суз

ТЬг

С1у

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

С1у

Суз

А1а

А1а

370

375

380

Суз

А1а

А1а

С1у

<31у

ТЬг

ТЬг

б1у

С1у

Суз

А1а

С31у

А1а

ТЬг

С1у

СЯу

385

390

395

400

<31у

<31у

ТЬг

Суз

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

А1а

А1а

СЯу

А1а

ТЬг

ТЬг

Суз

405

410

415

А1а

С1у

ТЬг

С1у

СЯу

Суз

А1а

О1у

ТЬг

СЯу

СЯу

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

СЯу

420

425

430

С1у

(31у

Суз

А1а

А1а

С1у

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

435

440

445

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

А1а

СЯу

Суз

А1а

С1у

Суз

Суз

ТЬг

61у

450

455

460

Суз

А1а

СЯу

Суз

Суз

ТЬг

С31у

А1а

С1у

СЯу

А1а

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

(31у

465

470

475

480

Суз

А1а

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

485

490

495

А1а

Суз

А1а

С1у

Суз

А1а

ТЬг

СЯу

С1у

ТЬг

С1у

А1а

С1у

А1а

СЯу

Суз

500

505

510

Суз

Суз

<31у

ТЬг

С1у

СЯу

А1а

Суз

О1у

ТЬг

ТЬг

Суз

СЯу

С1у

ТЬг

С1у

СЯу

А1а

СЯу

С1у

Суз

А1а

Суз

Суз

А1а

А1а

С1у

Суз

ТЬг

СЯу

СЯу

А1а

530

535

540

О1у

А1а

ТЬг

Суз

А1а

А1а

А1а

Рго

Азр

11е

Ьуз

МеЬ

ТЬг

СЯп

Зег

Рго

545

550

555

560

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

565

570

575

А1а

<31у

О1п

Азр

11е

Ьуз

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

СЯп

(31п

Ьуз

Рго

580

585

590

Тгр

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

11е

Ьеи

11е

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

595

600

605

СЯу

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

(31у

Зег

СЯу

Зег

СЯу

СЯп

Азр

Туг

ТЬг

610

615

620

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

625

630

635

640

Ьеи

О1п

ΗΪ5

С1у

С1и

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

РЬе

С1у

СЯу

(31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

645

650

655

С1и

Не

Ьуз

Азр

СЯу

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

Суз

А1а

СЯу

А1а

ТЬг

СЯу

660

665

670

А1а

Суз

Суз

Суз

А1а

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

А1а

ТЬг

675

680

685

Суз

Суз

ТЬг

ТЬг

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

СЯу

Суз

А1а

ТЬг

Суз

СЯу

СЯу

ТЬг

690

695

700

61у

С1у

О1у

А1а

С1у

А1а

Суз

А1а

О1у

СЯу

С1у

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

705

710

715

720

А1а

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

СЯу

Суз

А1а

А1а

СЯу

СЯу

Суз

СЯу

СЯу

725 730 735

- 25 006945

(Яу

ТЬг

Суз

А1а

(Яу

(Яу

А1а

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

А1а

А1а

(Яу

740

745

750

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

С1у

Суз

ТЬг

(Яу

СЯу

ТЬг

А1а

Суз

755

760

765

Суз

А1а

(Яу

Суз

А1а

СЯу

А1а

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

(Яу

О1у

А1а

770

775

780

А1а

А1а

(Яу

Суз

О1у

Суз

Суз

ТЬг

А1а

А1а

СЯу

А1а

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

785

790

795

800

(Яу

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

01у

Суз

А1а

А1а

Суз

А1а

805

810

815

А1а

(Яу

(Яу

ТЬг

ТЬг

(Яу

(Яу

Суз

А1а

01у

А1а

ТЬг

(Яу

(Яу

(Яу

С1у

820

825

830

ТЬг

Суз

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

А1а

А1а

(Яу

А1а

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

(Яу

835

840

845

ТЬг

С1у

(Яу

Суз

А1а

(Яу

ТЬг

СЯу

С1у

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

(Яу

(Яу

ТЬг

850

855

860

А1а

Суз

А1а

(Яу

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

А1а

865

870

875

880

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

А1а

61у

Суз

А1а

(Яу

Суз

Суз

ТЬг

(Яу

Суз

А1а

885

890

895

01у

Суз

Суз

ТЬг

(Яу

А1а

(Яу

СЯу

А1а

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

(Яу

Суз

А1а

900

905

910

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

(Яу

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

Суз

915

920

925

А1а

(Яу

Суз

А1а

ТЬг

01у

(Яу

ТЬг

СЯу

А1а

(Яу

А1а

61у

Суз

Суз

Суз

930

935

940

С1у

ТЬг

01у

(Яу

А1а

Суз

(Яу

ТЬг

ТЬг

Суз

О1у

СЯу

ТЬг

(Яу

(Яу

А1а

945

950

955

960

(Яу С1у

Суз

А1а

Суз

Суз

А1а

А1а

СЯу

Суз

ТЬг

(Яу (Яу

А1а

(Яу

А1а

965

970

975

ТЬг

Суз

А1а

А1а

А1а

Рго

Азр

11е

Θΐη

МеЬ

ТЬг

СЯп

Зег

Рго

Зег

Зег

980

985

990

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

(Яу

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

(Яу

995

1000

1005

О1п

Азр

11е

Ьуз

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

(Яп

(Яп

Ьуз

Рго

Тгр

Ьуз

1010

1015

1020

А1а

Рго

Ьуз

11е

Ьеи

11е

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

(Яу

\7а1

1025

1030

1035

1040

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

(Яу

Зег

СЯу

Зег

СЯу

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

1045

1050

1055

11е

Зег

Зег

Ьеи

Θΐη

Рго

(Яи

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

(Яп

1060

1065

1070

ΗΪ3

О1у

(Яи

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

РЬе

(Яу

С1у

(Яу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

01и

11е

1075

1080

1085

Ьуз

Азр

(Яу

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

Суз

А1а

(Яу

А1а

ТЬг

(Яу

А1а

Суз

1090

1095

1100

Суз

Суз

А1а

(Яу

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

А1а

ТЬг

Суз

Суз

1105

1110

1115

1120

ТЬг

ТЬг

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

СЯу

Суз

А1а

ТЬг

Суз

(Яу

(Яу

ТЬг

(Яу

(Яу

1125

ИЗО

1135

(Яу

А1а

(Яу

А1а

Суз

А1а

СЯу

С1у

СЯу

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

1140

1145

1150

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

(Яу

Суз

А1а

А1а

С1у

(Яу

Суз

(Яу

(Яу

01у

ТЬг

1155

1160

1165

Суз

А1а

О1у

(Яу

А1а

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

А1а

А1а

(Яу

Суз

ТЬг

1170

1175

1180

А1а

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

СЯу

Суз

ТЬг

С1у

01у

ТЬг

А1а

Суз

Суз

А1а

1185

1190

1195

1200

(Яу

Суз

А1а

01у

А1а

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

(Яу

01у

(Яу

А1а

А1а

А1а

1205

1210

1215

(Яу

Суз

(Яу

Суз

Суз

ТЬг

А1а

А1а

С1у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

(Яу

А1а

1220

1225

1230

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

СЯу Суз

А1а

А1а

Суз

А1а

А1а

(Яу

1235

1240

1245

(Яу

ТЬг

ТЬг (Яу (Я у

Суз

А1а

СЯу А1а

ТЬг

С1у

(Яу

О1у (Яу ТЬг

Суз

1250

1255

1260

- 26 006945

Суз Суз А1а ТЬг Суз А1а А1а С1у А1а ТЬг ТЬг Суз А1а (31у ТЬг 61у

1265 1270 1275 1280

С1у Суз А1а <31у ТЬг 61у (31у А1а ТЬг Суз ТЬг <31у 61у ТЬг А1а Суз

1285 1290 1295

А1а

61у

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

А1а

Суз

Суз

1300

1305

1310

А1а

ТЬг

Суз

А1а

61у

Суз

А1а

61у

Суз

Суз

ТЬг

61у

Суз

А1а

61у

Суз

1315

1320

1325

Суз

ТЬг

61у

А1а

61у

61у

А1а

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

61у

Суз

А1а

А1а

Суз

1330

1335

1340

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

61у

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

Суз

А1а

61у

1345

1350

1355

1360

Суз

А1а

ТЬг

61у

61у

ТЬг

61у

А1а

61у

А1а

61у

Суз

Суз

Суз

61у

ТЬг

1365

1370

1375

61у

61у

А1а

Суз

61у

ТЬг

ТЬг

Суз

61у

61у

ТЬг

61у

61у

А1а

61у

61у

1380

1385

1390

Суз

А1а

Суз

Суз

А1а

А1а

61 у

Суз

ТЬг

61у

61у

А1а

61у

А1а

ТЬг

Суз

1395

1400

1405

А1а

А1а

А1а

Рго

Азр

Не

61п

Меб

ТЬг

61п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

1410

1415

1420

А1а

Зег

Уа1

61у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

61у

61п

Азр

1425

1430

1435

1440

Не

Ьуз

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

61п

61п

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

1445

1450

1455

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

61у

Уа1

Рго

Зег

1460

1465

1470

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

Тпг

Не

3βϊ'

1475

1480

1485

Зег

Ьеи

61п

Рго

61и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

61П

ΗΪ3

61у

1490

1495

1500

61и

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

РЬе

61у 61у 61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

Не

Ьуз

Азр

1505

1510

1515

1520

61у

А1а

61у

61у

ТЬг

А1а

Суз

А1а

А1а

Суз

ТЬг 61у

61у

ТЬг

61у

61у

1525

1530

1535

А1а

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

61у

61у

61у

61у

61у А1а 61у

О1у

Суз

ТЬг

ТЬг

1540

1545

1550

А1а

О1у

ТЬг

61у

А1а

А1а

61у

Суз

Суз

ТЬг

61у С1у

А1а

61у 61у 61у

1555

1560

1565

ТЬг

Суз

Суз

Суз

ТЬг

61у

А1а

61у

61у

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

1570

1575

1580

61 у

ТЬг

61у

Суз

А1а

61 у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг 61у

61у

А1а

ТЬг

ТЬг

1585

1590

1595

1600

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

61у

ТЬг

О1у

А1а

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

1605

1610

1615

ТЬг

А1а

Суз

А1а

ТЬг

61у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

61у

61у

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

1620

1625

1630

61у

Суз

Суз

А1а

61у

А1а

Суз

ТЬг

Суз

Суз

61у

61у

61у

А1а

А1а

А1а

1635

1640

1645

61у

С1у

61у 61у

Суз

ТЬг

О1у 61у

А1а

61у

ТЬг

61у

61у

<31у

ТЬг

Суз

1650

1655

1660

<31у

Суз

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

61у

ТЬг

(31у

А1а

ТЬг

61у

1665

1670

1675

1680

61у

ТЬг

61у 61у

ТЬг

А1а

61у

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

А1а

Суз

Суз

ТЬг

А1а

1685

1690

1695

Суз ТЬг А1а ТЬг Суз Суз А1а 61у А1а Суз А1а 61у ТЬг б1у ТЬг 61у 1700 1705 1710

А1а А1а 61у С1у 61у С1у Суз <31у А1а ТЬг ТЬг Суз А1а Суз Суз А1а 1715 1720 1725

ТЬг Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а 61у

А1а

61у

А1а

Суз А1а

А1а

ТЬг

61у

Суз

1730

1735

1740

Суз А1а

А1а

61у

А1а

А1а Суз

А1а

61у

Суз

Суз ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

Суз

1745

1750

1755

1760

Суз ТЬг

61у

Суз

А1а

<31у А1а

ТЬг

61у

А1а

61у Суз

А1а

61у

Суз

Суз

1765

1770

1775

ТЬг О1у

А1а

61у

01у 01у Суз

ТЬг

61 у А1а С1у 61 у

А1а

Суз

А1а

Суз

1780

1785

1790

- 27 006945

А1а 61у Суз Суз

А1а ТЬг 61у ТЬг А1а ТЬг ТЬг А1а Суз ТЬг 61у ТЬг

1795

1800

1805

61у

ТЬг

А1а

А1а

61у

А1а

61у А1а

61у 61у

А1а

61у А1а

А1а

ТЬг

61у

1810

1815

1820

61у

ТЬг

А1а

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

1825

1830

1835

1840

ТЬг 61у

А1а

Суз

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

61у

61у

61у

61у

Суз

Суз

А1а

А1а

1845

1850

1855

61у О1у

61у

А1а

Суз

Суз

А1а

Суз

61у

61у

ТЬг

Суз

А1а

Суз

Суз

61у

1860

1865

1870

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

Суз

А1а

Рго

61и

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61и

Зег

1875

1880

1885

61у

61у

О1у

Ьеи

\7а1

Ьуз

Рго

О1у 61у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

1890

1895

1900

А1а

Зег

<31у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

Туг

МеФ

Туг

Тгр

РЬе

Агд

61п

1905

1910

1915

1920

ТЬг

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

11е

Зег

Азр

61у

61у

1925

1930

1935

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

61у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

1940

1945

1950

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

Ьеи

61п

МеФ

Зег

Зег

Ьеи

Агд

1955

1960

1965

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

МеФ

Туг

Туг

Суз

Уа1

Агд

61и

61и

Азп

61у

Азп

1970

1975

1980

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

61у

ТЬг

ТЬг

\7а1

ТЬг

Уа1

Зег

1985

1990

1995

2000

Зег

Азр

О1у

А1а

61у 61у

ТЬг

А1а

Суз

А1а

А1а

Суз

ТЬг

61у

61у

ТЬг

2005

2010

2015

61у

61у

А1а

61у

ТЬг

Суз

ТЬг

61у

61у 61у

61у

61у

А1а

61у

61у

Суз

2020

2025

2030

ТЬг

ТЬг

А1а

61у

ТЬг

61у

А1а

А1а

61у

Суз

Суз

ТЬг

61у

61у

А1а

61у

2035

2040

2045

61у

61у

ТЬг

Суз

Суз

Суз

ТЬг

61у

А1а

61у

О1у

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

2050

2055

2060

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

61у

Суз

А1а

61у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

61у

61у

А1а

2065

2070

2075

2080

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

61у

ТЬг

61у

А1а

Суз

ТЬг

2085

2090

2095

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

А1а

ТЬг

61у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

61у

61у

ТЬг

ТЬг

2100

2105

2110

ТЬг

Суз

С1у

Суз

Суз

А1а

61у

61у

Суз

Суз

Суз

Суз

61у

61у

61у

А1а

2115

2120

2125

А1а

А1а

61у

(31у

61у

61у

Суз

ТЬг

61у

61у

А1а

61у

ТЬг

61у

61у

61у

2130

2135

2140

ТЬг

Суз

О1у

Суз

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

61у

ТЬг

61у

А1а

2145

2150

2155

2160

ТЬг

61у

(31у

ТЬг

61у

61у

ТЬг

А1а

61у

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

А1а

Суз

Суз

2165

2170

2175

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

Суз

А1а

61у

А1а

Суз

А1а

61у

ТЬг

61у

2180

2185

2190

ТЬг

С1у

А1а

А1а

61у

61у

61у

61у

Суз

61у

А1а

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

Суз

2195

2200

2205

Суз

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а

61у

А1а

61у

А1а

Суз

А1а

А1а

ТЬг

2210

2215

2220

61у

Суз

Суз

А1а

А1а

61у

А1а

А1а

Суз

А1а

61у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

2225

2230

2235

2240

А1а

Суз

Суз

ТЬг

61у

Суз

А1а

61у

А1а

ТЬг

61у

А1а

61у

Суз

А1а

61у

2245

2250

2255

Суз

Суз

ТЬг

61 у

А1а

61у

61у

О1у

Суз

ТЬг

61у

А1а

61у

61у

А1а

Суз

2260

2265

2270

А1а

Суз

А1а

61у

Суз

ТЬг

61у

ТЬг

61у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

2275

2280

2285

61у

ТЬг

<31 у ТЬг

А1а

А1а

61у А1а 61у

А1а

61у

61у А1а 61у

А1а

А1а

2290

2295

2300

ТЬг

61у 61у ТЬг

А1а

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

А1а

Суз

2305

2310

2315

2320

- 28 006945

ТЬг ТЬг

ТЬг

С1у А1а Суз 2325

ТЬг А1а

Суз ТЬг С1у С1у <31у <31у Суз Суз

2330

2335

А1а

А1а

О1у

С1у С1у

А1а

Суз

Суз

А1а

Суз

С1у

61у

ТЬг

Суз

А1а

Суз

2340

2345

2350

Суз

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

Суз

А1а

Рго

С1и

Уа1

(31п

Ьеи

Уа1

2355

2360

2365

(31и

Зег

С1у

С1у

(31у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

2370

2375

2380

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

Туг

МеБ

Туг

Тгр

РЬе

2385

2390

2395

2400

Агд

С1п

А1а

Рго

(31у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

11е

Зег

Азр

2405

2410

2415

<31у

С1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у Агд

РЬе

ТЬг

2420

2425

2430

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

Ьеи

Θΐη

МеБ

Зег

Зег

2435

2440

2445

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

Уа1

Агд

(31и

С1и

Азп

2450

2455

2460

<31у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

(31п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

2465

2470

2475

2480

Уа1

Зег

Зег

Азр

(31у

А1а

(31у

О1у

ТЬг

А1а

Суз

А1а

А1а

Суз

ТЬг

С1у

2485

2490

2495

61у

ТЬг

О1у С1у

А1а

С1у

ТЬг

Суз

ТЬг

С1у

С1у

О1у

С1у

С1у

А1а

С1у

2500

2505

2510

(31у

Суз

ТЬг

ТЬг

А1а

<31у

ТЬг

С1у

А1а

А1а

(31у

Суз

Суз

ТЬг

О1у

С1у

2515

2520

2525

А1а

С1у

С1у

О1у

ТЬг

Суз

Суз

Суз

ТЬг

С1у

А1а

О1у

С1у

Суз

ТЬг

Суз

2530

2535

2540

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

61у

Суз

А1а

О1у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

С1у

2545

2550

2555

2560

О1у

А1а

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

С1у

ТЬг

61у

А1а

2565

2570

2575

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

А1а

ТЬг

О1у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

О1у

(31у

2580

2585

2590

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

61у

Суз

Суз

А1а

61у (31у

Суз

Суз

Суз

Суз

(31у

С1у

2595

2600

2605

С1у

А1а

А1а

А1а

(31у

(31у

(31у

С1у

Суз

ТЬг

С1у <31у

А1а

С1у

ТЬг

О1у

2610

2615

2620

<31у

<31у

ТЬг

Суз

О1у

Суз

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

С1у

ТЬг

2625

2630

2635

2640

31у

А1а

ТЬг

С1у

С1у

ТЬг

<31у

<31у

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

А1а

2645

2650

2655

Суз

Суз

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

Суз

А1а

С1у

А1а

Суз

А1а

С1у

2660

2665

2670

ТЬг

С1у

ТЬг

С1у

А1а

А1а

<31у

С1у

СПу

С1у

Суз

С1у

А1а

ТЬг

ТЬг

Суз

2675

2680

2685

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а

С1у

А1а

(31у

А1а

Суз

А1а

2690

2695

2700

А1а

ТЬг

О1у

Суз

Суз

А1а

А1а

С1у

А1а

А1а

Суз

А1а

С1у

Суз

Суз

ТЬг

2705

2710

2715

2720

Суз

ТЬг

А1а

Суз

Суз

ТЬг

С1у

Суз

А1а

О1у

А1а

ТЬг

С1у

А1а

О1у

Суз

2725

2730

2735

А1а

С1у

Суз

Суз

ТЬг

(31у

А1а

(31у

С1у

(31у

Суз

ТЬг

С1у

А1а

С1у С1у

2740

2745

2750

А1а

Суз

А1а

Суз

А1а

<31у

Суз

ТЬг

(Э1у

ТЬг

(31у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

2755

2760

2765

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

С1у

ТЬг

А1а

А1а

С1у

А1а

С1у

А1а

С1у

С1у

А1а

С1у

2770

2775

2780

А1а

А1а

ТЬг

С1у

(31у

ТЬг

А1а

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

2785

2790

2795

2800

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

<31у

А1а

Суз

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

(31у

С1у

С1у

О1у

2805

2810

2815

Суз

Суз

А1а

А1а

<31у О1у

С1у

А1а

Суз

Суз

А1а

Суз

С1у 31у

ТЬг

Суз

2820

2825

2830

А1а

Суз

Суз

<31у ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

Суз

А1а

Рго

О1и

Уа1

С1п

2835

2840

2845

- 29 006945

Ьеи νβΐ С1и Зег С1у

01у

О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у Зег Ьеи Агд

2850

2855

2860

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег Азр

Туг

Туг

МеЬ

Туг

2865

2870

2875

2880

Тгр

Уа1

Агд

01п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

11е

2885

2890

2895

Зег

Азр

01у 01у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

О1у Агд

2900

2905

2910

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

Ьеи

О1п

МеЬ

2915

2920

2925

Зег

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

О1и

2930

2935

2940

О1и

Азп

О1у

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

СЯу

О1п

С1у

ТЬг

ТЬг

2945

2950

2955

2960

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

Азр

О1у

А1а

С1у

О1у

ТЬг

А1а

Суз

А1а

А1а

Суз

2965

2970

2975

ТЬг

О1у

01 у

ТЬг

01у

О1у

А1а

О1у

ТЬг

Суз

ТЬг

01 у

О1у

01 у

О1у

01 у

2980

2985

2990

А1а

О1у

01у

Суз

ТЬг

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

О1у

А1а

А1а

О1у

Суз

Суз

ТЬг

2995

3000

3005

О1у

С1у

А1а

01у

01у

О1у

ТЬг

Суз

Суз

Суз

ТЬг

О1у

А1а

О1у

О1у

Суз

ЗОЮ

3015

3020

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

О1у

ТЬг

О1у

Суз

А1а

О1у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

3025

3030

3035

3040

ТЬг С1у

01у

А1а

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

А1а

О1у

ТЬг

3045

3050

3055

О1у А1а

Суз

ТЬг

А1а

Тпг

Тпг

А1а

Суз

А1а

ТЬг

О1у

Тпг

А1а

Тпг

Тпг

3060

3065

3070

О1у О1у

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

О1у

Суз

Суз

А1а

О1у

О1у

Суз

Суз

Суз

Суз

3075

3080

3085

О1у О1у

01у

А1а

А1а

А1а

О1у

О1у

О1у

О1у

Суз

ТЬг

О1у

О1у

А1а

О1у

3090

3095

3100

ТЬг О1у

01у

01у

ТЬг

Суз

О1у

Суз

А1а

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

3105

3110

3115

3120

О1у

ТЬг

01у

А1а

ТЬг

С1у

О1у

ТЬг

О1у

О1у

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

ТЬг

А1а

3125

3130

3135

Суз

А1а

Суз

Суз

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

Суз

А1а

О1у

А1а

Суз

3140

3145

3150

А1а

01у

ТЬг

01у

ТЬг

О1у

А1а

А1а

С1у

О1у

О1у

О1у

Суз

О1у

А1а

ТЬг

3155

3160

3165

ТЬг

Суз

А1а

Суз

Суз

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

А1а

О1у

А1а

С1у

А1а

3170

3175

3180

Суз

А1а

А1а

ТЬг

01у

Суз

Суз

А1а

А1а

О1у

А1а

А1а

Суз

А1а

О1у

Суз

3185

3190

3195

3200

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

Суз

Суз

ТЬг

С1у

Суз

А1а С1у

А1а

ТЬг

О1у

А1а

3205

3210

3215

О1у

Суз

А1а

01у

Суз

Суз

ТЬг

СЯу

А1а

С1у

О1у <31у

Суз

ТЬг

С1у

А1а

3220

3225

3230

О1у

01у

А1а

Суз

А1а

Суз

А1а

б1у

Суз

ТЬг

О1у

ТЬг

О1у

ТЬг

А1а

ТЬг

3235

3240

3245

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

С1у

Суз

О1у

Суз

А1а

А1а

С1у

А1а

О1у

А1а

О1у

О1у

3250 3255 3260

А1а О1у А1а А1а ТЬг О1у О1у ТЬг А1а А1а Суз ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг А1а

3265 3270 3275 3280

Суз ТЬг А1а Суз ТЬг ТЬг ТЬг <31у А1а Суз ТЬг А1а Суз ТЬг О1у О1у

3285 3290 3295

О1у О1у Суз Суз А1а

А1а О1у С1у

О1у А1а Суз 3305

Суз А1а

Суз С1у 3310

О1у

3300

ТЬг

Суз

А1а

Суз

Суз

О1у

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

Суз

ТЬг

Суз

А1а

Рго

С1и

3315

3320

3325

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

О1у

О1у

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

О1у

О1у

Зег

3330

3335

3340

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Туг

Туг

3345

3350

3355

3360

МеЬ

Туг

Тгр

РЬе

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у Ьеи О1и

Тгр

Уа1

А1а

3365

3370

3375

- 30 006945

ТЬг Не Зег Азр СЛу <31у Зег Туг ТЬг Туг Туг

Рго Азр Зег Уа1 Ьуз 3390

3380

3385

О1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

Ьеи

3395

3400

3405

Θΐη

Ме±

Зег

Зег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

3410

3415

3420

Агд

С1и

С1и

Азп

СЛу

Азп

РЬе

Туг

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр СЛу

СЛп

С1у

3425

3430

3435

3440

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

Азр

СЛу

Суз

Суз

ТЬг

С1у СЛу

А1а

СЛу

3445

3450

3455

С1у

СЛу

ТЬг

Суз

Суз

Суз

ТЬг

СЛу

А1а

СЛу

СЛу

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

3460

3465

3470

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

(Пу

Суз

А1а

С1у

Суз

Суз

ТЬг

Суз

Зег

С1и

СЛп

Азр

3475

3480

3485

С1у

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

СЛу

Суз

Суз

А1а

С1у

А1а

Суз

ТЬг

Суз

Суз

СЛу

3490

3495

3500

СЛу

С1у

А1а

А1а

А1а

СЛу

(Яу

СЛу

СЛу

Суз

ТЬг

б1у СЛу

А1а

С1у

ТЬг

3505

3510

3515

3520

СЛу

С1у

С1у

ТЬг

Суз

СЛу

Суз

А1а

А1а

Суз

Зег

(31 и

С1п

Азр

Суз

А1а

3525

3530

3535

С1у

А1а

С1у

А1а

Суз

А1а

А1а

ТЬг

С1у

Суз

Суз

А1а

А1а

<31у

А1а

А1а

3540

3545

3550

Суз

А1а

СЛу

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

Суз

Суз

ТЬг

СЛу

Суз

А1а

С1у

3555

3560

3565

А1а

ТЬг

С1у

А1а

С1у

Суз

А1а

СЛу

Суз

Суз

ТЬг

СЛу

А1а

СЛу

СЛу

СЛу

3570

3575

3580

Суз

ТЬг

С1у

А1а

СЛу

СЛу

А1а

Суз

А1а

Суз

А1а

СЛу

Суз

Суз

А1а

ТЬг

3585

3590

3595

3600

С1у Азр

Суз

А1а

ТЬг

С1у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

СЛу

СЛу

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

3605

3610

3615

СЛу

Суз

Суз

А1а

СЛу

С1у

Суз

Суз

Суз

Суз СЛу

<31у

(31у

А1а

А1а

А1а

3620

3625

3630

С1у

С1у

СЛу

О1у

Суз

ТЬг

С1у

СЛу

Азр

<31у С1у

(31у

Суз

ТЬг

СЛу

А1а

3635

3640

3645

С1у

СЛу

А1а

Суз

А1а

Суз

А1а

О1у

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

СЛу ТЬг

А1а

ТЬг

3650

3655

3660

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

СЛу

ТЬг

СЛу

ТЬг

А1а

А1а

СЛу

А1а

(31у Азр

СЛу

ТЬг

3665

3670

3675

3680

СЛу

А1а

Суз

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

А1а

ТЬг

С1у

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

3685

3690

3695

СЛу

СЛу

СЛу

ТЬг

СЛу Суз

СЛу

Суз

Суз

А1а

СЛу

СЛу

Суз

Суз

Суз

Суз

3700

3705

3710

С1у

С1у

О1у

А1а

А1а

А1а

О1у

СЛу

61у

С1у

Суз

ТЬг

СЛу

(31у

А1а

СЛу

3715

3720

3725

Азр

СЛу

А1а

СЛу СЛу СЛу

Суз

ТЬг

О1у

А1а

(31у

С1у

А1а

Суз

А1а

Суз

3730

3735

3740

А1а

СЛу

Суз

ТЬг

С1у ТЬг

СЛу

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Суз

ТЬг

(31 у

Суз

3745

3750

3755

3760

СЛу

Суз

А1а

А1а

61у А1а

С1у

А1а

слу

СЛу

А1а

СЛу

А1а

А1а

ТЬг

С31у

3765

3770

3775

<31у

ТЬг

А1а

А1а

Суз

Азр

Суз

ТЬг

ТЬг

СЛу

Суз

А1а

А1а

О1у

ТЬг

С31у

3780

3785

3790

А1а

ТЬг

А1а

СЛу

ТЬг

С1у

А1а

Суз

Суз

Суз

ТЬг

СЛу

ТЬг

Суз

ТЬг

Суз

3795

3800

3805

Суз

Суз

А1а

Суз

Суз

СЛу

А1а

ТЬг

С1у

Суз

А1а

СЛу

А1а

Суз

А1а

А1а

3810

3815

3820

СЛу

СЛу

А1а

ТЬг

СЛу

А1а

ТЬг

СЛу

СЛу

А1а

СЛу

А1а

Суз

ТЬг

СЛу

СЛу

3825

3830

3835

3840

СЛу

ТЬг

Суз

А1а

ТЬг

Суз

Азр

Суз

А1а

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

А1а

СЛу

А1а

3845

3850

3855

ТЬг

Суз

А1а

СЛу

О1у

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

ТЬг

А1а

С1у

(31у

Суз

С1у

Суз

3860

3865

3870

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

Суз

А1а

ТЬг

СЛу

СЛу ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

ТЬг СЛу

Суз

3875

3880

3885

ТЬг

С1у

Азр

СЛу ТЬг

А1а

СЛу

А1а

Суз

А1а

СЛу

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

А1а

3890 3895 3900

- 31 006945

А1а (31у ТЬг

ТЬг

О1у Суз (31у А1а А1а А1а

ТЬг Суз Суз ТЬг

Суз

А1а

3905

3910

3915

3920

<31у

О1у

Суз

ТЬг

О1у Суз

А1а

О1у

С1у

Суз

ТЬг

О1у

Суз

ТЬг

О1у А1а

3925

3930

3935

ТЬг

С1у

С1у

ТЬг

ТЬг

А1а

О1у

А1а

□1у

ТЬг

А1а

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

Суз

3940

3945

3950

ТЬг

ТЬг

С1у

Суз

Суз

Суз

А1а

01у

А1а

ТЬг

Суз

Азр

61у

А1а

ТЬг

О1у

3955

3960

3965

Сх1у

А1а

О1у

А1а

Суз

ТЬг

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Суз

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

С1у

3970

3975

3980

61у

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

А1а

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

О1у

О1у

Суз

А1а

3985

3990

3995

4000

Суз

Суз

ТЬг

<31у

Азр

С1у

А1а

ТЬг

О1у

С1у

ТЬг

ТЬг

А1а

С1у

А1а

<31у

4005

4010

4015

ТЬг

А1а

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

<31у

ТЬг

А1а

Суз

Суз

А1а

<31у

А1а

4020

4025

4030

ТЬг

Суз

Суз

А1а

Суз

ТЬг

О1у

Суз

Суз

А1а

Суз

ТЬг

С1у

Азр

<31у

А1а

4035

4040

4045

ТЬг

С1у

С1у

А1а

<31у

А1а

Суз

ТЬг

01у

С1у

С1у

ТЬг

Суз

А1а

ТЬг

Суз

4050

4055

4060

ТЬг

С1у

О1у

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг

Суз

А1а

Суз

Суз

ТЬг

Суз

ТЬг

С1у

С1у

4065

4070

4075

4080

Суз

А1а

Суз

Суз

ТЬг

<31у

Азр

Суз

А1а

А1а

Суз

Суз

ТЬг

ТЬг

С1у

ТЬг

4085

4090

4095

ТЬг

<31у

Суз

А1а

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

А1а

<31у

А1а

ТЬг

Суз

А1а

С1у

А1а

4100

4105

4110

А1а

<31у

Суз

ТЬг

ТЬг

А1а

61у

О1у

Суз

С1у

Суз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

Суз

4115

4120

4125

Суз

ТЬг

О1у

<31у

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Суз

ТЬг

О1у

Суз

ТЬг

С1у

С1у

ТЬг

А1а

4130

4135

4140

Суз

Суз

Азр

С1у

А1а

ТЬг

С1у

С1у

ТЬг

ТЬг

А1а

С1у

А1а

(31у

ТЬг

А1а

4145

4150

4155

4160

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

Суз

ТЬг

<31у

ТЬг

А1а

Суз

Суз

А1а

<31у

А1а

ТЬг

Суз

4165

4170

4175

Суз

А1а

Суз

ТЬг

О1у

Суз

Суз

А1а

Суз

ТЬг

01у

Рго

Азр

11е

С1п

МеЬ

4180

4185

4190

ТЬг

<31п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

(31у Азр

Агд

Уа1

ТЬг

4195

4200

4205

11е

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

С1у

Θΐη

Азр

11е

Ьуз

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

4210

4215

4220

О1п

Θΐη

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Туг

А1а

ТЬг

4225

4230

4235

4240

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

О1у

Зег

С1у

4245

4250

4255

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

01п

Рго

О1и

Азр

РЬе

А1а

4260

4265

4270

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

<31п

ΗΪ8

01у

01и

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

РЬе

С1у <31у

4275

4280

4285

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

4290

4295

4300

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

<31и

Θΐη

Ьеи

Ьуз

Зег

<31у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

4305

4310

4315

4320

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

4325

4330

4335

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Зег

<31у

Азп

Зег

<31п

(31и

Зег

Уа1

ТЬг

4340

4345

4350

С1и

Θΐη

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

4355

4360

4365

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

ΗΪ8

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

4370

4375

4380

ТЬг

ΗΪ3

Θΐη

01у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

(31у

4385

4390

4395

4400

61и

Суз

Рго

(31и

Уа1

(31п

Ьеи

Уа1

<31и

Зег

О1у О1у

61у

Ьеи

Уа1

Ьуз

4405

4410

4415

Рго <31у

С1у

Зег

Ьеи Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе

4420

4425

4430

- 32 006945

Зег Азр Туг Туг	МеР	Туг	Тгр РЬе Агд 01п А1а Рго (31у Ьуз	(31у	Ьеи
	4435	4440	4445
С1и	Тгр Уа1 А1а	ТЬг	11е	Зег Азр С1у О1у Зег	Туг ТЬг Туг	Туг	Рго
	4450			4455	4460
Азр	Зег Уа1 Ьуз	<31у	Агд	РЬе ТЬг 11е Зег Агд	Азр Азп А1а	Ьуз	Азп
4465		4470 4475		4480
Зег	Ьеи Туг Ьеи	<31п	МеР	Зег Зег Ьеи Агд А1а	б1и Азр ТЬг	А1а	Уа1
		4485	4490		4495
Туг	Туг Суз А1а	Агд	С1и	<31и Азп <31у Азп РЬе	Туг Туг РЬе	Азр	Туг
	4500		4505	4510
Тгр	<31у С1п С1у	ТЬг	ТЬг	Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег	А1а Зег ТЬг	Ьуз	<31у
	4515			4520	4525
Рго	Зег Уа1 РЬе	Рго	Ьеи	А1а Рго Зег Зег Ьуз	Зег ТЬг Зег	(31у	(31у
	4530			4535	4540
ТЬг	А1а А1а Ьеи	О1у	Суз	Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг	РЬе Рго <31и	Рго	Уа1
4545		4550 4555		4560
ТЬг	Х7а1 Зег Тгр	Азп	Зег	<31у А1а Ьеи ТЬг Зег	(31у Уа1 Ηί3	ТЬг	РЬе
		4565	4570		4575
Рго	А1а Уа1 Ьеи	С1п	Зег	Зег (31у Ьеи Туг Зег	Ьеи Зег Зег	Уа1	Уа1
	4580		4585	4590
ТЬг	Уа1 Рго Зег	Зег	Зег	Ьеи С1у ТЬг <31п ТЬг	Туг 11е Суз	Азп	Уа1
	4595			4600	4605
Азп	ΗΪ8 Ьуз Рго	Зег	Азп	ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз	Ьуз Уа1 61и	Рго	Ьуз
	4610			4615	4620
Зег	Суз Азр Ьуз	ТЬг	ΗΪ5	ТЬг Суз Рго Рго Суз	Рго А1а Рго	(31и	Ьеи
4625		4630 4635		4640
Ьеи	<31у С1у Рго	Зег	Уа1	РЬе Ьеи РЬе Рго Рго	Ьуз Рго Ьуз	Азр	ТЬг
		4645	4650		4655
Ьеи	Мер 11е Зег	Агд	ТЬг	Рго <31и Уа1 ТЬг Суз	Уа1 Уа1 Уа1	Азр	Уа1
	4660		4665	4670
Зег	ΗΪ3 С1и Азр	Рго	С1и	Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр	Туг Уа1 Азр	<31у	Уа1
	4675			4680	4685
С1и	Уа1 Н13 Азп	А1а	Ьуз	ТЬг Ьуз Рго Агд С1и	<31и Θΐη Туг	Азп	Зег
	4690			4695	4700
ТЬг	Туг Агд Уа1	Уа1	Зег	Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи	ΗΪ5 <Э1п Азр	Тгр	Ьеи
4705		4710 4715		4720
Азп	<31 у Ьуз 31 и	Туг	Ьуз	Суз Ьуз Уа1 Зег Азп	Ьуз А1а Ьеи	Рго	А1а
		4725	4730		4735
Рго	11е (31и Ьуз	ТЬг	11е	Зег Ьуз А1а Ьуз О1у	<31п Рго Агд	61и	Рго
	4740		4745	4750
С1п	Уа1 Туг ТЬг	Ьеи	Рго	Рго Зег Агд Азр (31и	Ьеи ТЬг Ьуз	Азп	(31п
	4755			4760	4765
Уа1	Зег Ьеи ТЬг	Суз	Ьеи	Уа1 Ьуз (31 у РЬе Туг	Рго Зег Азр	11е	А1а
	4770			4775	4780
Уа1	<31и Тгр С1и	Зег	Азп	01у (31п Рго (31и Азп	Азп Туг Ьуз	ТЬг	ТЬг
4785		4790 4795		4800
Рго	Рго Уа1 Ьеи	Азр	Зег	Азр (31у Зег РЬе РЬе	Ьеи Туг Зег	Ьуз	Ьеи
		4805	4810		4815
ТЬг	Уа1 Азр Ьуз	Зег Агд	Тгр С1п (31п С1у Азп	Уа1 РЬе Зег	Суз	Зег
	4820		4825	4830
Уа1	Мер ΗΪ8 (31и	А1а	Ьеи	ΗΪ3 Азп ΗΪ8 Туг ТЬг	О1п Ьуз Зег	Ьеи	Зег
	4835			4840	4845

Ьеи Зег Рго <31у

4850

Claims (28)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина-β (БТ-β-Κ) или его антигенсвязывающий фрагмент, у которых гипервариабельные участки легкой цепи определены остатками аминокислот 24-34, 50-56 и 89-97 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:1, а гипервариабельные участки тяжелой цепи определены остатками аминокислот 31-35, 50-66 и 99-109 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:2, при этом антитело содержит в легкой цепи по меньшей мере один остаток, выбранный из группы, включающей в себя К3, Ш41, Ι46, ^69 и Υ71, или содержит в тяжелой цепи по меньшей мере один остаток, выбранный из группы, включающей в себя Е37, Т40, А49, М89 и У93.
2. 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи, определенную остатками аминокислот 1-107 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:8.
3. 3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, определенную остатками аминокислот 1-120 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:16.
4. 4. Антитело по п.2, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, определенную остатками аминокислот 1-120 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:16.
5. 5. Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина-β (БТ-β-Κ) или его антигенсвязывающий фрагмент, у которых гипервариабельные участки легкой цепи определены остатками аминокислот 24-34, 50-56 и 89-97 последовательности 8 ЕС) ΙΌ N0:1, гипервариабельные участки тяжелой цепи определены остатками аминокислот 31-35, 50-66 и 99-109 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:2, и содержащее остаток Υ71 в легкой цепи.
6. 6. Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина-β (БТ-β-Κ) или его антигенсвязывающий фрагмент, у которых гипервариабельные участки легкой цепи определены остатками аминокислот 24-34, 50-56 и 89-97 последовательности 8 ЕС) ΙΌ N0:1, гипервариабельные участки тяжелой цепи определены остатками аминокислот 31-35, 50-66 и 99-109 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:2, и содержащее остатки Е37 и А49 в тяжелой цепи.
7. 7. Антитело, содержащее такие же полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, как антитело, продуцируемое клеточной линией Е46.4 (АТСС РТА-3357) или клеточной линией Е77.4

   - 33 006945 (АТСС РТА-3765).
8. 8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что оно в значительной степени сохраняет связывающие свойства исходного антитела.
9. 9. Гуманизированное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п.5, дополнительно содержащие в легкой цепи остатки \У41, Ι46 или замену их консервативных аминокислот; или остатки К3, \У41, Ι46, 069, или замену их консервативных аминокислот.
10. 10. Гуманизированное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п.6, дополнительно содержащие в тяжелой цепи остаток У93 или замену его консервативной аминокислоты; или остатки Т40, М89, У93, или замену их консервативных аминокислот.
11. 11. Гуманизированное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-7, 9, 10, представляющие собой ΙβΟ1 или его антиген-связывающий фрагмент.
12. 12. Гуманизированное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-7, 9, 10, где антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, включающей фрагменты ЕаЬ, Е(аЬ')₂ или Εν.
13. 13. Антитело по любому из пп.1-7, 9, 10, отличающееся тем, что оно далее присоединено к иммунотоксину.
14. 14. Антитело по любому из пп.1-7, 9, 10, отличающееся тем, что оно далее присоединено к химиотерапевтическому лекарственному веществу.
15. 15. Композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-7, 9, 10, и фармацевтически приемлемый носитель.
16. 16. Способ лечения или снижения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у человека, отличающийся тем, что вводят композицию по п.15.
17. 17. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, продуцируемого клеточной линией Е46.4 (АТСС РТА-3357) или клеточной линией Е77.4 (АТСС РТА-3765).
18. 18. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, продуцируемого клеточной линией Е46.4 (АТСС РТА-3357) или клеточной линией Е77.4 (АТСС РТА-3765).
19. 19. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕР ГО N0:4, 8ЕР ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:32 и 8Ер ГО N0:8.
20. 20. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8 Ер ГО N0:10, 8ЕР ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:14, 8ЕО ГО N0:33 и 8ЕО ГО N0:16.
21. 21. Клетка клеточной линии Е46.4, депонированная в Американской коллекции культур (АТСС) под номером РТА-3357.
22. 22. Клетка клеточной линии Е77.4, депонированная в Американской коллекции культур под номером РТА-3765.
23. 23. Применение гуманизированного антитела против рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-в-Я) или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-7, 9 и 10 в приготовлении фармацевтической композиции для уменьшения объема опухоли или для лечения солидной опухоли у человека.
24. 24. Применение по п.23 для уменьшения объема или для лечения опухоли, выбранной из группы, включающей немелкоклеточный рак легкого Щ8СЬС), колоректальный рак (СЯС), рак простаты, рак желудка, рак кожи, рак пищевода, рак мочевого пузыря, аденокарциному толстой кишки, карциному шейки матки, меланому, карциному молочной железы и первичные опухоли толстой кишки.
25. 25. Применение по любому из пп.23-24 в приготовлении композиции, предназначенной для использования в сочетании или в связи с агентом, выбранным из группы, включающей химиотерапевтическое средство, цитотоксический фактор или иммунотоксин.
26. 26. Применение по п.25 в приготовлении композиции, предназначенной для использования в сочетании или в связи с химиотерапевтическим средством, выбранным из группы, включающей адриамицин, 5ЕИ (5-фторурацил), винбластин, актиномицин Ό, этопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин.
27. 27. Применение по п.26 в приготовлении композиции, предназначенной для использования в сочетании или в связи с цитотоксическим фактором, выбранным из группы, включающей ГЕЛ-у, ТЛЕ-α, ТЛЕβ, ГО-1 и ГО-2.
28. 28. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.19 или/и 20.