EA013118B1 - Антитела против интерферона-гамма и способы их применения - Google Patents

Антитела против интерферона-гамма и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA013118B1
EA013118B1 EA200701589A EA200701589A EA013118B1 EA 013118 B1 EA013118 B1 EA 013118B1 EA 200701589 A EA200701589 A EA 200701589A EA 200701589 A EA200701589 A EA 200701589A EA 013118 B1 EA013118 B1 EA 013118B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
antibody
region
antibodies
Prior art date
Application number
EA200701589A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200701589A1 (ru
Inventor
Уолтер Ферлэн
Николас Фишер
Грег Элсон
Оливье Лежер
Original Assignee
Новиммун С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новиммун С.А. filed Critical Новиммун С.А.
Publication of EA200701589A1 publication Critical patent/EA200701589A1/ru
Publication of EA013118B1 publication Critical patent/EA013118B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим антителам и их фрагментам, которые связываются с человеческим интерфероном-гамма (hIFNγ) и, тем самым, модулируют взаимодействие IFNγ с его рецептором, IFNγ-R и/или модулируют биологические активности IFNγ. Настоящее изобретение также относится к применению таких анти-IFNγ-антител для предупреждения или лечения иммунных расстройств и ослабления симптома, ассоциированного с иммунным расстройством.

Description

В общих чертах, настоящее изобретение относится к полностью человеческим антителам против интерферона-гамма, а также к способам их применения.
Предшествующий уровень техники
Человеческий интерферон-гамма (ΙΡΝγ, ΙΡΝ-гамма) представляет собой лимфокин, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами и природными клетками-киллерами. Он обладает антипролиферативной, противовирусной и иммуномодуляторной активностью, связывается с ΙΡΝγ-В, то есть с гетеродимерным рецептором, присутствующим на большинстве первичных клеток иммунной системы, и запускает каскад событий, приводящих к воспалению. Известно, что противовирусная и иммуномодуляторная активность ΙΡΝγ оказывает благоприятное действие при различных клинических состояниях. Однако известно, что существует множество клинических состояний, при которых активность ΙΡΝγ оказывает неблагоприятное действие. Так, например, аутоиммунные заболевания ассоциируются с высокими уровнями ΙΡΝγ в крови и с поражением ткани у пациентов, страдающих такими аутоиммунными заболеваниями. Активность ΙΡΝγ также ассоциируется с такими патологическими состояниями как кахексия и септический шок.
В соответствии с этим, необходимо разработать способ лечения, направленный на подавление активности ΙΡΝγ.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам против интерферона-гамма (ΙΡΝγ, также называемого здесь ΙΡΝ-гамма). Примерами моноклональных антител являются ΝΙ-0501; АС1.2В3Р2_А6 (также обозначаемое здесь А6); АС1.2В3Р2_В4 (также обозначаемое здесь В4); АИ1.4В4Р1_В9 (также обозначаемое здесь В9); АИ1.4В4Р2_С9 (также обозначаемое здесь С9); АС1.4В4Р2_С10 (также обозначаемое здесь С10); АС1.2В3Р7_И3 (также обозначаемое здесь И3); АИ1.2В2Р2_И6 (также обозначаемое здесь И6); АС1.2В2Р2_И8 (также обозначаемое здесь И8); АИ1.3В3Р6_В1 (также обозначаемое здесь Е1); АИ1.3В3Р5_Р8 (также обозначаемое здесь Ρ8); АИ1.3В3Р6_Р9 (также обозначаемое здесь Ρ9); АИ1.4В4Р2_67 (также обозначаемое здесь 07); АИ1.1В3Р3_69 (также обозначаемое здесь 09); и АИ1.3В3Р6_610 (также обозначаемое здесь 610), описанные в настоящей заявке. Альтернативно, моноклональным антителом является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, как и антитела ΝΙ-0501; АС1.2В3Р2_В4; АИ1.4В4Р1_В9; АИ1.4В4Р2_С9; АС1.4В4Р2_С10; АС1.2В3Р7_И3; АИ1.2В2Р2_И6; АС1.2В2Р2_И8; АИ1.3В3Р6_Е1; АИ1.3В3Р5_Р8; АВГ.3В3Р6_Е9; АИ1.4В4Р2_67; АИ1.1В3Р3_69 или АИ1.3В3Р6_610. Указанные антитела, соответственно, называются здесь антителами против ΙιιιΙΕΝγ.
Антитело против ΙιιιΙΕΝν содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность ЛЕО ΙΌ Ν0: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 или 103, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность ЛЕО ΙΌ Ν0: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 или 105. Предпочтительно три гипервариабельные области (комплементарность-определяющие области, СИВ) тяжелой цепи включают аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЛУАМЛ (8Ер ГО Ν0: 3); А1Л6Л66ЛТУУАИЛ\К6 (ЛЕО ГО Ν0: 4); (ЛЕО ΙΌ Ν0: 5); ИНЛЛ6\У\ГЛ6МИ\ (ЛЕО ГО Ν0: 13); ИЬТУббР^УУЕИУ (ЛЕО ГО Ν0: 21); 1)С1\\'УАРС1\\ТЕЛ (ЛЕО ГО Ν0: 29); 8ΝΛΜ8 (ЛЕО ГО Ν0: 43); ТЬТбЛббТАУУАИЛ\Е6 (ЛЕО ГО Ν0: 44); 6ТЕ^V666^^N (ЛЕО ГО Ν0: 45); ВЛРИЛООЛРЕУ (ЛЕО ГО Ν0: 64); \С,Л\\'УРЕ1)Р1)1 (ЛЕО ГО Ν0: 69); 66ΝΥ6ΌΥΕΌΥΕΌΥ (ЛЕО ГО Ν0: 76) и ΌΡ\νΙΤ86ΝΏΥ (ЛЕО ГО Ν0: 89); а легкая цепь имеет три СИВ, которые включают аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности ТВЛЛОЛГАЛЛУ νθ (ЛЕО ГО Ν0: 8); Е^N^ΒРЛ (ЛЕО ГО Ν0: 9); ρ§ΥΏ68ΝΒ\Μ (ЛЕО ГО Ν0: 10); ΤΒ8868ΙΆ8ΝΥνρ (ЛЕО ГО Ν0: 16); ЕИ^ВРЗ (ЛЕО ГО Ν0: 17); ОЛ\1)Л1)\\\' (ЛЕО ГО Ν0: 18); 1ГО1МЖРЛ (ЛЕО ГО Ν0: 25); ρδΥΏδδΝνν (ЛЕО ГО Ν0: 26); ΤΒ8668Ι68ΥΥνρ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 32); ИИККВРЛ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 33); ОЛУ1)Л\\Р\\' (ЛЕО ΙΌ Ν0: 34); ТВЛЛСТТАЛУААГ) (ЛЕО ΙΌ Ν0: 39); ОЛУ1)\Л\11\\А (ЛЕО ΙΌ Ν0: 40); ТС1ЛС1С1ЛЕ\Т\У\Т) (ЛЕО ΙΌ Ν0: 48); ОЛУ1)Л1)\1 II ΐνν (ЛЕО ΙΌ Ν0: 49); Τ6ЛЛ6ЛIАЛNΥV^ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 55); ^ЛΥ^ЛЛN^ЕVV (ЛЕО ГО Ν0: 56); ОЛУ1)Л\\Т\У\ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 61); ТВЛЛбЛЕАЛУАЛН (ЛЕО ΙΌ Ν0: 72); рЛЛВТТУНСЮ^ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 73); ОЛУРСР (ЛЕО ΙΌ Ν0: 79); ТСВ^МАЛБ^Р (ЛЕО ΙΌ Ν0: 84); ЕИИЖРЛ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 85); РЛЛИЛИВ\Ъ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 86); ОЛР1)ЛТ\Р\\ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 92); А6ЛЛ6Л1АЛИУ\Р (ЛЕО ΙΌ Ν0: 97); ОЛУЛУЛЛО\\ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 98); ТВЛЛ6ЛГ\Л1ЧУ\Р (ЛЕО ΙΌ Ν0: 106); ЕИИВВРЛ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 107). Указанное антитело связывается с ΙΡΝγ.
Антитела против ΗϋΓΡΝγ согласно изобретению включают ^-СИВИобласть, содержащую аминокислотную последовательность ЛУАМЛ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 3) или ЛNАΜЛ (ЛЕО ΙΌ Ν0: 43); VΗ-С^Β2-область, содержащую аминокислотную последовательность А1Л6Л66ЛТУУАИЛ\К6 (ЛЕО ΙΌ Ν0: 4) или ТЕТ6Л66ТАУУАИЛ\Е6 (ЛЕО ΙΌ Ν0: 44), а VΗ-С^Β3-область содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из И6ЛЛ6\У\РН\РИР (ЛЕО ΙΌ Ν0: 5);
- 1 013118
ΌΗδδΟ\ΥνΤδΟΜΌν (δΕΕ) ΙΌ N0: 13); ΌΕΤνΟΟΡ\ΥΥΕΌΥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 21); Ι)(.ι\\'\ΛΕ(.ι\\ΈΕ¥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 29); ΟΤΕΕνΟΟΟΕΌΝ (δΕΕ) ΙΌ N0: 45); ΚδΕΌδΟΟδΕΕΥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 64); νΟδ^ΥΌΕΌΕΌΙ (δΕΕ) ΙΌ N0: 69); С1(А'¥(Ю¥Е1)¥Е1)¥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 76) и (δΕΕ) ΙΌ N0: 89).
Анти-йиГЕ^-антитела включают ^-СВЮ-область. содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы. состоящей из ΤΚδδΟδIΑδNΥV^ (δΕΟ ΙΌ N0: 8); ΤΚδδΟδIΑδNΥV^ (δΕΟ ΙΌ N0: 16); ΤΚδΟΟδΙΟδΥΥνρ (δΕΕ) ΙΌ N0: 32); ТК^6Т^1\^Р (δΕΕ) ΙΌ N0: 39); ΤΟδΟΟδΙΑΤ(δΕΕ) ΙΌ N0: 48); ΤΟδδΟδIΑδNΥV^ (δΕΕ) ΙΌ N0: 55); ΤΚδδΟδIΑδNΥVΗ (δΕΕ) ΙΌ N0: 72); ΤΟΚNΟNIΑδNΥV^ (δΕΕ) ΙΌ N0: 84); ΑΟδδΟδIΑδNΥV^ (δΕΕ) ΙΌ N0: 97) и ΤΚδδΟδIVδNΥV^ (δΕΕ) ΙΌ N0: 106); ^-СОК.2-область. содержащую аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из ΕΌ^ΕΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 9); ΕΌ^ΕΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 17); ΩΩΩΟΡΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 25); ΌΌΚΚΚΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 33); ΕΩΤΟΡΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 85) и Ε^NΚΚΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 107); и νΣ^ΌΚ3область. содержащую аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из ΡδΥΌΟδΙΑΙΚ^Μ (δΕΕ) ΙΌ N0: 10); ^δN^δ^NVV (δΕΕ) ΙΌ N0: 18); ^δΥ^δδNVV (δΕΕ) ΙΌ N0: 26); ^δΥ^δNN^VV (δΕΕ) ΙΌ N0: 34); (δΕΕ) ΙΌ N0: 40); ^δΥ^δ^NΗΗVV (δΕΕ) ΙΌ N0: 49);
Ρδ^δδ^Ενν (δΕΕ) ΙΌ N0: 56); Е^З^АЕАА (δΕΕ) ΙΌ N0: 61); ρδδΌΤΤΥΗΟΟνν (δΕΕ) ΙΌ N0: 73); ΟδΥΈΕ,Ε (δΕΕ) ΙΌ N0: 79); ^δδ^δNΚV^ (δΕΕ) ΙΌ N0: 86); ^δΕ^δΤN^VV (δΕΕ) ΙΌ N0: 92) и Ε)δ4-δΥNN^VV (δΕΕ) ΙΌ N0: 98).
Анти-йиШ^-антитела включают. например. Ун-СОМ-область. содержащую аминокислотную последовательность δΥΑΜδ (δΕΟ ΙΌ N0: 3) или δNΑΜδ (δΕΟ ΙΌ N0: 43); ^-СОК2-область. содержащую аминокислотную последовательность ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΌδνΚΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 4) или ΤΌΤΟδΟΟΤΑΥΥΑΌδνΕΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 44); ^-СОЮ-область. содержащую аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из ΌΟδδΟ\ΥνΡΗ\ΕΌΡ (δΕΕ) ΙΌ N0: 5); ΌΗδδΟ\ΥνΙδΟΜΌν (δΕΕ) ΙΌ N0: 13); ΌΌΤνΟΟΡ^ΥΥΕΌΥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 21); ΌΟ\ΤΑΕΟ\ΕΕδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 29); ΟΤΕ^VΟΟΟ^^N (δΕΟ ΙΌ N0: 45); ΚδΕΌδΟΟδΕΕΥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 64); νθδ\ΥΌΕΌΕΌΙ (δΕΕ) ΙΌ N0: 69); ΟΟNΥΟ^ΥΕ^ΥΕΌΥ (δΕΕ) ΙΌ N0: 76) и 1)(^471^(..^1)4- (δΕΕ) ΙΌ N0: 89); ^-СОЮ-область. содержащую аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из ΤΚδδΟδIΑδNΥV^ (δΕΟ ΙΌ N0: 8); ^^Οδ^Ι^^Ρ (δΕΕ) ΙΌ N0: 16); ΤΡδ(..ι(..ιδΙ(..ιδ4-4-\-() (δΕ() ΙΌ N0: 32); ΤΚδδΟΤIΑδNΥV^ (δΕ() ΙΌ N0: 39); ΤΟδΟΟδIΑΤNΥV^ (δΕ() ΙΌ N0: 48); ΤΟδδΟδIΑδNΥV^ (δΕ() ΙΌ N0: 55); ΤΚδδΟδIΑδNΥVΗ (δΕΕ) ΙΌ N0: 72); ΤΟΚNΟNIΑδNΥV^ (δΕ() ΙΌ N0: 84); ΑΟδδΟδIΑδNΥV^ (δΕ() ΙΌ N0: 97) и ΤΚδδΟδIVδNΥV^ (δΕΟ ΙΌ N0: 106); ^-СОК2-область. содержащую аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из Ε^N^ΚΡδ (δΕΟ ΙΌ N0: 9); Ε^N^ΚΡδ (δΕΟ ΙΌ N0: 17); Ι)Ι)Ι)()ΚΡδ (δΕΕ) ΙΌ N0: 25); ΌΌΚΚΚΡδ (δΕ() ΙΌ N0: 33); ΕΙ)Τ()ΚΡδ (δΕ() ΙΌ N0: 85) и ΕΟΙ^ΙΚ^ (δΕ() ΙΌ N0: 107). и УюСОК3-область. содержащую аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из ρδΥΌΟδΙΑΙΚ^Μ (δΕΕ) ΙΌ N0: 10); ^δN^δ^NVV (δΕΕ) ΙΌ N0: 18); ^δΥ^δδNV (δΕΕ) ΙΌ N0: 26); ^δΥ^δNN^VV (δΕ() ΙΌ N0: 34); (δΕ() ΙΌ N0: 40); ^δΥ^δ^NΗΗVV (δΕΕ) ΙΌ N0: 49); ^δΥ^δδN^ΕVV (δΕ() ΙΌ N0: 56); (^44^^7^4- (δΕ() ΙΌ N0: 61); ρδδΌΤΤΥΗΟΟνν (δΕΕ) ΙΌ N0: 73); ()δ4-Ε(.,Ε- (δΕ() ΙΌ N0: 79); ^δδ^δNΚV^ (δΕ() ΙΌ N0: 86); (^4^474.74- (δΕΕ) ΙΌ N0: 92) и ^δΥδΥNN^VV (δΕ() ΙΌ N0: 98).
Тяжелая цепь анти-йиIΕNγ-антитела происходит от гена зародышевой линии ν (вариабельной области). такого. например. как ген зародышевой линии ΌΡ47 (ΙΟΗν3-23) (ΟеηΒаηк Леес55юп N0. Μ99660) или последовательность нуклеиновой кислоты. гомологичная генной последовательности человеческой зародышевой линии ΌΡ47. Последовательность нуклеиновой кислоты для гена зародышевой линии ΌΡ47 (ΙΟΗν 3-23) включает. например. последовательность нуклеиновой кислоты. представленную ниже: ΟΑΟΟΤΟСΑΟСΤΟΤΤΟΟΑΟΤСΤΟΟΟΟΟΑΟΟСΤΤΟΟΤΑСΑΟССΤΟΟΟΟΟΟΤСССΤΟΑΟΑСΤСΤСС ΤΟΤΟСΑΟССΤСΤΟΟΑΤΤСΑССΤΤΤΑΟСΑΟСΤΑΤΟССΑΤΟΑΟСΤΟΟΟΤССΟССΑΟΟСΤССΑΟΟΟ ΑΑΟΟΟΟСΤΟΟΑΟΤΟΟΟΤСΤСΑΟСΤΑΤΤΑΟΤΟΟΤΑΟΤΟΟΤΟΟΤΑΟСΑСΑΤΑСΤΑСΟСΑΟΑСΤСС ΟΤΟΑΑΟΟΟССΟΟΤΤСΑССΑΤСΤССΑΟΑΟΑСΑΑΤΤССΑΑΟΑΑСΑСΟСΤΟΤΑΤСΤΟСΑΑΑΤΟΑΑС ΑΟССΤΟΑΟΑΟССΟΑΟΟΑСΑСΟΟССΟΤΑΤΑΤΤΑСΤΟΤΟСΟΑΑΑΟΑ (δΕΕ) ΙΌ N0: 99).
Легкая цепь анти-йиIΕNγ-антитела происходит от гена зародышевой линии вариабельной области легкой цепи лямбда Ι§. такого. например. как ΙΟΌν6-57 или ν1-22 (СспВапк Αοοο^δίοη N0. Ζ73673) или последовательность нуклеиновой кислоты. гомологичная последовательности гена зародышевой линии человеческого ΙΟΌν6-57. Последовательность нуклеиновой кислоты для гена ΙΟΌν6-57 зародышевой линии включает. например. последовательность нуклеиновой кислоты. представленную ниже: ΑΑΤΤΤΤΑΤΟСΤΟΑСΤСΑΟССССΑСΤСΤΟΤΟΤСΟΟΑΟΤСΤССΟΟΟΟΑΑΟΑСΟΟΤΑΑССΑΤСΤСС ΤΟСΑСССΟСΑΟСΑΟΤΟΟСΑΟСΑΤΤΟССΑΟСΑΑСΤΑΤΟΤΟСΑΟΤΟΟΤΑССΑΟСΑΟСΟСССΟΟΟС ΑΟΤΤСССССΑССΑСΤΟΤΟΑΤСΤΑΤΟΑΟΟΑΤΑΑССΑΑΑΟΑСССΤСΤΟΟΟΟΤСССΤΟΑΤСΟΟΤΤС ΤСΤΟΟСΤССΑΤСΟΑСΑΟСΤССΤССΑΑСΤСΤΟССΤСССΤСΑССΑΤСΤСΤΟΟΑСΤΟΑΑΟΑСΤΟΑΟ ΟΑСΟΑΟΟСΤΟΑСΤΑСΤΑСΤΟΤСΑΟΤСΤΤΑΤΟΑΤΑΟСΑΟСΑΑΤСΑ (δΕΕ) ΙΌ N0: 108).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения. предупреждения или ослабления симптомов иммунного расстройства путем введения индивидууму анти-йиIΕNγантитела. Так. например. анти-йиIΕNγ-антитела могут быть использованы для лечения. предупреждения
- 2 013118 или ослабления симптомов, ассоциированных с иммунными расстройствами, такими как болезнь Крона, системная красная волчанка, псориаз, саркоидоз, ревматоидный артрит, васкулиты, атопический дерматит и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз. Затем, но необязательно, указанному индивидууму вводят второе средство, такое как, но не ограничивающееся ими, антитело против цитокина или хемокина, которое распознает цитокины, такие как интерлейкин-1 (ГБ-1), ГБ-2, ГБ-4, ГБ-6, 1Б-12. ГБ-13, ГБ15, ГБ-17, ГБ-18, ГБ-20, ГБ-21, ГБ-22, ГБ-23, ГБ-27 и ГБ-31, и/или хемокины, такие как МГР1-а, ΜΓΡ1-β, ΒΆΝΤΕ8, МСР1, ГР-10, ГТАС, МГ6, 8ΌΡ и фракталкин.
В соответствии с настоящим изобретением указанный индивидуум страдает иммунным расстройством, таким, например, как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, или имеет предрасположенность к развитию этих заболеваний.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиГР^-антител М-0501 и АС1.2В3Р2_А6. На фиг. 1А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи М-0501, а на фиг. 1В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1А. На фиг. 1В гипервариабельные области (СОВ) подчеркнуты. На фиг. 1С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи М-0501, а на фиг. 1Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1С. На фиг. 1Ό СОВ подчеркнуты. На фиг. 1Ε представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи АС1.2В3Р2_А6, а на фиг. 1Р представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1Ε. На фиг. 1Р СОВ подчеркнуты. На фиг. 1С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи АС1.2В3Р2_А6, а на фиг. 1Н представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 10. На фиг. 1Н СОВ подчеркнуты.
На фиг. 2 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиГР^-антитела АС1.2В3Р2_В4. На фиг. 2А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 2В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 2А. На фиг. 2В СОВ подчеркнуты. На фиг. 2С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 2Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 2С. На фиг. 2Ό СОВ подчеркнуты.
На фиг. 3 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиГР^-антитела АО1.4В4Р1_В9. На фиг. 3 А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 3В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 3А. На фиг. 3В СОВ подчеркнуты. На фиг. 3С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 3Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 3С. На фиг. 3Ό СОВ подчеркнуты.
На фиг. 4 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиГР^-антитела АО1.4В4Р2_С9. На фиг. 4А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 4В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 4А. На фиг. 4В СОВ подчеркнуты. На фиг. 4С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 4Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 4С. На фиг. 4Ό СОВ подчеркнуты.
На фиг. 5 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиГР^-антитела АС1.4В4Р2_С10. На фиг. 5А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 5В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 5А. На фиг. 5В СОВ подчеркнуты. На фиг. 5С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 5Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 5С. На фиг. 5Ό СОВ подчеркнуты.
На фиг. 6 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиГР^-антитела АС1.2В3Р7_О3. На фиг. 6А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 6В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последователь
- 3 013118 ностью, представленной на фиг. 6А. На фиг. 6В СЭК подчеркнуты. На фиг. 6С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 6Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 6С. На фиг. 6Ό СОК. подчеркнуты.
На фиг. 7 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела ΑΌ1.2Η2Ρ2_Ό6. На фиг. 7 А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 7В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 7А. На фиг. 7В СОК. подчеркнуты. На фиг. 7С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 7Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 7С. На фиг. 7Ό СОВ подчеркнуты.
На фиг. 8 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела АС1.2В2Р2_Э8. На фиг. 8А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 8В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 8А. На фиг. 8В СОК. подчеркнуты. На фиг. 8С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 8Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 8С. На фиг. 8Ό СОК. подчеркнуты.
На фиг. 9 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела ΑΌ1.3Κ.3Ρ6_Ε1. На фиг. 9А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 9В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 9А. На фиг. 9В СОК. подчеркнуты. На фиг. 9С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 9Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 9С. На фиг. 9Ό СОК подчеркнуты.
На фиг. 10 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела ΑΌ1.3Ρ.3Ρ5_Ε8. На фиг. 10А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 10В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 10А. На фиг. 10В СОВ подчеркнуты. На фиг. 10С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 10Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 10С. На фиг. 10Ό СОК подчеркнуты.
На фиг. 11 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела АП1.3К.3Р6_Е9. На фиг. 11А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 11В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 11 А. На фиг. 11В СОК подчеркнуты. На фиг. 11С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 11Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 11 С. На фиг. 11Ό СОК подчеркнуты.
На фиг. 12 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела АЭ1.4В4Р2_С7. На фиг. 12А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 12В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 12А. На фиг. 12В СОК подчеркнуты. На фиг. 12С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 12Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 12С. На фиг. 12Ό СОК подчеркнуты.
На фиг. 13 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела Α^1.1В3Ρ3_С9. На фиг. 13А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 13В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 13А. На фиг. 13В СОК подчеркнуты. На фиг. 13С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 13Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 13 С. На фиг. 13Ό СОК подчеркнуты.
На фиг. 14 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последователь
- 4 013118 ностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-йиШЫу-антитела АЭ1.3В3Р6_С10. На фиг. 14 А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 14В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 14А. На фиг. 14В СОВ подчеркнуты. На фиг. 14С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 14Ό представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 14С. На фиг. 14Ό СОВ подчеркнуты.
На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий ингибирование ΙΡΝγ-индуцированной экспрессии гена-репортера под действием периплазматических кеРу-экстрактов. Определенное количество кеРуэкстрактов ингибировало ΙΡΝγ-индуцируемую экспрессию гена-репортера в зависимости от дозы. Были протестированы различные концентрации (2,7, 0,68, 0,17, 0,043 и 0,011 нМ) для каждого кеРу-клона, название которого указано вверху в каждом столбце (по убывающей концентрации слева направо, см. также табл. 3, приведенную ниже).
На фиг. 16 на панелях 1-12 представлена серия графиков, иллюстрирующих ингибирование ΙΡΝγиндуцируемой экспрессии МНС класса II на клетках меланомы под действием кеРу-экстрактов. Очищенные полноразмерные человеческие кеРу ингибировали ΙΡΝγ-индуцируемую экспрессию МНС II на клетках меланомы. Представлены графики для кеРу-клонов (-) и для мышиных тАЬ против человеческого ^Νγ 16С3 (---).
На фиг. 17 на панелях 1-7 представлена серия графиков, иллюстрирующих ингибирование ΓΡΝγиндуцируемой экспрессии МНС класса II на клетках меланомы под действием кеРу-экстрактов, которые были преобразованы в каркас полностью человеческого ЦС. Очищенные тАЬ против полностью человеческих ЦС ингибировали ΓΡΝγ-индуцируемую экспрессию МНС II на клетках меланомы. Представлены графики для полностью человеческих ЦС-клонов (-Х-), мышиных тАЬ против человеческого ΓΡΝγ 16С3 (-▲-) и мышиных МАВ285 против человеческого ΣΕΝγ, Β&Ό 8ук1етк, йю. (М1пиеаройк, ΜΝ) (-•-).
На фиг. 18 представлен график, иллюстрирующий аффинность антитела №-0501 против человеческого ШЛу (йиШ^).
На фиг. 19 представлен график, иллюстрирующий сравнение активности антител, продуцируемых клонами А6 и №-0501 (также называемых здесь А6, подвергнутым обратной мутации с восстановлением зародышевой линии или обратно мутированным А6'').
На фиг. 20 представлен график, иллюстрирующий активность анти-йиГЕ^-антитела №-0501 против природного человеческого ΣΕΝγ.
На фиг. 21А-Р представлена серия графиков, иллюстрирующих связывание анти-йиШ^-антитела №-0501 с рекомбинантным ^Νγ, происходящим от различных видов.
На фиг. 22 представлен график, иллюстрирующий способность анти-йиIΕNγ-антитела №-0501 нейтрализовать активацию МНС класса II, индуцируемую нативным собакоподобных обезьян.
На фиг. 23 представлен график, иллюстрирующий способность анти-йиIΕNγ-антитела №-0501 блокировать Ш^-индуцируемое продуцирование ΤΡ-10 в цельной крови.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам против интерферона-гамма (ШПу). Эти антитела в целом называются здесь анти-йиIΕNγ-антителами.
Анти-йиIΡNγ-антителами являются, например, антагонисты или ингибиторы ^Νγ, модулирующие по меньшей мере одну биологическую активность ^Νγ. Биологическими активностями ΖΗΝγ являются, например, связывание с рецептором ΖΗΝγ (ШМу-В), модуляция, например снижение уровня или ингибирование экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II на клеточной поверхности, и модуляция, например снижение или ингибирование пролиферации клеток. Так, например, антийиIΡNγ-антитела полностью или частично ингибируют активность посредством частичного или полного блокирования связывания ΖΗΝγ с рецептором ΖΗΝγ (ШМу-В). Считается, что анти-IΕNγ-антитела конкурентно ингибируют активность ^Νγ, если уровень активности ΙΓΝγ в присутствии анти-йиIΕNγантитела снижается по меньшей мере на 95%, например на 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем активности ΖΗΝγ в отсутствие связывания с описанным здесь анти-йиIΕNγ-антителом. Считается, что анти-IΕNγ-антитела частично ингибируют активность ^Νγ, если уровень активности ΖΗΝγ в присутствии анти-йиIΡNγ-антитела снижается менее чем на 95%, например на 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 85 или 90% по сравнению с уровнем активности в отсутствие связывания с описанным здесь анти-йиIΕNγантителом.
Кроме того, анти-йиIΕNγ-антитела согласно изобретению ингибируют Ш^-индуцируемую экспрессию МНС класса II на клетках (см., например, примеры 4 и 5). Предпочтительно анти-йиIΡNγантитела более чем на 50% ингибируют Ш^-индуцируемую экспрессию МНС класса II в человеческой клеточной линии меланомы Ме67.8 при концентрации по меньшей мере 0,02 нМ. Так, например, указанные антитела более чем на 50% ингибируют Ш^-индуцируемую экспрессию МНС класса II в клеточной
- 5 013118 линии Ме67.8 при концентрации в пределах от 0,022 до 0,044 нМ, например при концентрации 0,022, 0,028 или 0,044 нМ.
Анти-йиШХу-антитела модулируют иммунный ответ у индивидуума, например у человека. Предпочтительно, указанные анти-йиШХу-антитела модулируют адаптивный иммунный ответ у индивидуума. Более предпочтительно анти-йиШХу-антитела модулируют клеточный или клеточно-опосредуемый иммунный ответ, также известный как ответ Тй1-типа или Тй1-опосредуемый ответ.
Так, например, описанные здесь анти-йиШХу-антитела модулируют, например снижают, ингибируют или предотвращают повышение Тй1-опосредуемого иммунного ответа, например повышение Тй1опосредуемого иммунного ответа, ассоциированного с аутоиммунным воспалительным расстройством, таким как болезнь Крона, системная красная волчанка, псориаз, саркоидоз, ревматоидный артрит, васкулиты, атопический дерматит и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз. Используемый здесь термин повышенный Тй1-опосредуемый иммунный ответ означает присутствие повышенного уровня Тй1-цитокинов, таких как 1Ь-2, 1Ь-3, ТХР-альфа (ТХР-α) и ΙΡΝγ, у индивидуума по сравнению с уровнем продуцирования Тй1-цитокинов у индивидуума, не страдающего заболеванием или расстройством, ассоциированным с повышенным иммунным Тй1-ответом. Для отнесения Тй1-опосредуемого иммунного ответа к категории повышенного ответа оценивают уровень продуцирования Тй1-цитокинов, например, путем измерения и оценки уровня секретируемых цитокинов с помощью ЕЫ8А или другого анализа.
Описанные здесь анти-йиШХу-антитела модулируют, например ингибируют, снижают или предотвращают переключение класса на изотип 1дО, такое как ШХу-индуцируемое переключение класса.
Такие анти-йиШХу-антитела модулируют, например ингибируют, предотвращают или снижают Тй1-опосредуемый ответ и, тем самым, подавляют 1РХу-индуцируемое переключение класса.
Анти-йиШХу-антитела согласно изобретению были продуцированы путем иммунизации животного ШХу, таким как мышиный или человеческий 1РХу (см., например, ОепЬапк Ассеккюп Хо. Х13274) или его иммуногенным фрагментом, производным или вариантом. Альтернативно, животное иммунизируют клетками, транфицированным вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую 1РХу, так, чтобы 1РХу экспрессировался на поверхности трансфицированных клеток и связывался с ними. Альтернативно, указанные антитела получают путем скрининга библиотеки, содержащей антитело или последовательности антигенсвязывающего домена, связывающиеся с ШХу. Эту библиотеку получают, например, в бактериофаге в виде белковых или пептидных гибридов с оболочечным белком бактериофага, который экспрессируется на поверхности собранных фаговых частиц, содержащих кодирующие последовательности ДНК (и такая библиотека называется библиотекой фагового представления).
Анти-йиШХу-антитела согласно изобретению включают, например, гипервариабельные области тяжелой цепи (СЭЯ), представленные ниже в табл. 1, СЭК. легкой цепи, представленные в табл. 2, и их комбинации.
- 6 013118
Таблица 1
Последовательности УН клонов антител, которые связываются с ΙΤΝγ и нейтрализуют его
Наименование клона УН СЕК1 УН ΟϋΕ2 νΗ СЕЕЗ
N1-0501 ΞΥΑΜ3 (ЗЕО ΙΏ N0:3} ΑΙ 3Ο3Ο03ΤΎΥΑΏ3νΚ<3 (ΞΕΟ ТО N0:4) ΕΚ3330ΗΥνΡΗΝΡΟΡ (БЕО Ιϋ N0:5)
АС1.2ЕЗР2_Аб 3ΥΑΜ3 (ΞΕΟ ТО N0:3) ΑΙΞΟ30βεΤΥΥΑΟ3νκο (ЗЕО ΙΟ N014) оаззаиуурннрор (3Ε0 ΙΟ N0:5}
АС1.2НЗР2_Е8 3ΥΑΜ3 (8Е0 ΙΕ N0:3) ΑΙ£<3ΞΟΟ8ΤΥΥΑΟ5νΚΟ (ЗЕО Ιϋ N0:4) Ώσ35<3ΗΥνΡΗΗΓϋΡ (ΞΕΟ Ιϋ N0:5)
АС1.4К4Р2_С10 3ΥΑΜ3 (ЗЕО Ю N0:3) ΑΙ3Ο3003ΤΥΥΑΏ3νκα (3Ε0 ТО N0:4) №88σΜΥνΡΗΗΡ0Ρ (ΞΕΟ ΙΟ N0:5)
АС1КЗ₽2_В4 ΞΥΑΜ3 (ЗЕО 10 N0:3) ΑΙβ<33003ΤΥΥΑΟ3νκα (3Ε0 ΙΟ N0:4) ΓΗ330ΝΥνΐ3<3Ηϋν (ЗЕО ТО N0:13)
ΆΏ1.4Н4Р1_В9 3ΥΑΜ3 (ЗЕО Ю N0:3) ΑΙ3Ο5(3α8ΤΥΥΆϋ3νΚ<3 (ΞΕΟ ΙΟ N0:4) οοτνοΰΡΚΥΥΡΟΥ (3Ε0 ΙΟ N0:21}
АО1.ЗКЗР5_Р8 3ΥΑΜ3 (ЗЕО ТО N0:3) ΑΙ5<33σ<35ΤΥΥΑϋ5νκ<3 (ΞΕΟ ТО N0:4) УЗЗИУЪЕОЕО! (БЕО Ιϋ N0:69}
АО1.3КЗР6_Р9 3ΥΑΜ3 (ЗЕО ΙΕ N0:3) ΑΙ 3<3ΞΟΟ8ΤΥΥΑϋ3 νκα (ΞΕΟ Ιϋ N0:4) ΟΟΝΥΟϋΥΕΌΥΕΌΥ (ΞΕΟ ΙΟ N0:76)
Αϋ1.3Β3Ρ6_Ε1 8ΥΑΜ3 (ЗЕО ΙΕ N0:3) ΑΙ 3<33(303ΤΥΥΑΡ3νΚΟ (ΞΕΟ ТО N0:4) ЕЗГОЗОСЗРЕУ (ЗЕО ТО N0:64)
АЛ1.4К4Р2_С9 5ΥΑΜΞ (£Еф ΙΕ N0:3) αιξοξοοξτυυαεξνκο (ΞΕΟ ΙΟ N0:4) ООтАЪОИЬЕЗ (ЗЕО Ιϋ N0:29}
АО1.4И4Р2_С7 3ΥΑΜ3 (ЗЕО ТО N0:3) Αΐ£ΰ3©38ΤΥΥΆΕ8νΚΟ (ΞΕΟ ΙΟ N0:4) ООШАЪОИЬЕЗ (ЗЕО ΙΟ N0:29}
ΑΏ13Κ3Ρ6_σΐΟ 8ΥΑΜ3 (8Е0 10 N0:3) ΑΙ303Ο(33ΤΥΎΆϋ3νΚ<3 (ΞΕΟ ТО N0:4) ЕКЗНЯАЬОИЬЕЗ (ЗЕО Ιϋ N0:29}
АЛ1к2Р2_Б6 3ΥΑΜ3 (ЗЕО Ю N0:3) ΑΙеСЗОСЗТУУАОЗУКО (ΞΕΟ ΙΟ N0:4) ЕКЗНКАЬОИЦЕЗ (ЗЕО ГС N0:29}
АГ)1.1КЗРЗ_С9 3ΥΑΜ3 (ЗЕО 10 N0:3} ΑΙ ΞΟΞΟΟΞΤΥΥΑϋΞνκο (БЕО ТО N0:4) ορκνιτεοΝΏΥ (ЗЕО Ю N0:89)
АС1.2ВЗР7_ЕЗ 3ΝΑΜ3 (ЗЕф 10 N0:43) ΤΙΤΟ300ΤΑΥΥΑΙ>8νΕΟ (3Ε0 ТО N0:44) (ЗТЕЫКЗЭЗЬОЫ (ЗЕО Ю N0:45}
Таблица 2
Последовательности УЬ клонов антител, которые связываются с ΙΤΝγ и нейтрализуют его
Наименование клона УЪ ΟϋΕΐ УЬ С0К2 VI, СОЕЗ
N1-0501 ΤΒ££ΰΞΙΆΞΝΥνθ (ΞΕΟ Ιϋ N0:8) ΕϋΝΟΒΡΞ (ЗЕО 1С N0:9) 08ΥΚ33ΝΚΗΜ {ЗЕО Ш N0:10)
АС1.2ВЗР2_А6 ΤΕ5503ΐν5ΝΥνθ (ЗЕО ΙΌ N0:106) ЕСИВАРЕ (ЗЕО Ιϋ N0:107} 03ΥΙΧ53ΝΚΗΜ (ΞΕΟ Ιϋ N0:10)
Ασΐ.2Κ3Ρ2_Ώ8 ΤΚ£3θ$ΐν8ΝΥνθ (ΞΕΟ Ιϋ N0:8) ΕΟΝ0ΕΡ3 (ЗЕО ΙΠ N0:17) ΟΞΥΟΞΝΝΡΗν (ЗЕО Ιϋ N0:61}
АС1.4Е4Р2-С10 ΤΕ33ΟΤΙΑ3ΝΥνς (ΞΕΟ Ιϋ N0:39) ΕΌΝ0ΕΡ3 (ЗЕО 1С N0:17) 05ΥΠΝ8ΝΗ«ν ί8Ε0 Ιϋ N0:40)
АС1ЕЗЕ2_В4 ΤΚΞ30ΞΙΑΞΝΥνα (ЗЕО Ιϋ N0:16) ЕИЮЕРЗ (ΞΕΟ ΙΌ N0:17) 03ΝΌ3ϋΝνν (ΞΕΟ ΙΟ N0:18)
ΑΟ14Κ4Ρ1_Β9 ΤΕ3£<33ΐν5ΝΥνθ (3Ε0 Ιϋ N0:8) ΟΒΌ0ΕΡ3 (3Ε0 ΙΌ N0:25) 03ΥϋΞ3Ννν (ΞΕΟ ТО N0:26)
Α01.3Β3Ρ5_Γ8 ΤΕ33Ο3ΙΑ3ΝΥνΗ (3Ε0 Ιϋ N0:72) ΕΏΝΚΕΡ3 (ΞΕΟ Ιϋ N0:9) ΟΞΞϋΤΤΥΗΟβνν (3Ε0 Ιϋ N0:73)
Α01.3Ε3Ρ6__Γ9 ΤΕ3303ΙΑ3ΝΥνθ (ЗЕО Ιϋ N0:16) ΕΟΝ0ΕΡ3 (ЗЕО ТО N0:17) 03ΥΕ0Γ (ЗЕО ТО N0:79)
Άϋΐ.3Κ3Ρ3-Ε1 ΤΚ35<3νΐΑ5ΞΥνθ (3Ε0 Ιϋ N0:8) ΕϋϋΚΚΡΞ (ΞΕΟ ΙΕ N0:25} 03ΥϋΟΤΤΡΝν (3Ε0 ΙΟ N0:26)
АО14Е4Р2_С9 ΤΕ30Ο5ΙΟ3ΥΎνθ (ΞΕΟ ΙΟ N0:32) ΟΟΚΚΕΡΞ ΞΕΟ Ιϋ N0:33) ΟΞΥηεΝΝί,νν (ΞΕΟ ΙΕ НО;34}
ΑΟ14Ε4Ρ2_<37 ΤθΕΝβΝΪΆ£ΝΥνθ (ΞΕΟ Ιϋ N0:84) ΕΠΤ0ΚΡ3 (ΞΕΟ Ιϋ N0:85) 055Ε£ΝΚνΐι (3Ε0 ΙΕ N0:86)
АС1.3Ε3Ρ6_<310 ΑΟ3£Ο3ΙΑ£ΝΥν0 (ΞΕΟ Ιϋ N0:97) ΕΌΝ0ΕΡ3 (ΞΕΟ ΙΟ N0:17) 03Υ3ΥΝΝ0νν (ΞΕΟ ΙΓ> N0:98)
ΑΟ1Ε2Ρ2_Ώ6 ΤΟΞΞΟΞΙΑΞΝΥνΟ (3Ε0 Ιϋ N0:55) ΕΏΝ0ΕΡ3 (3Ε0 ΙΟ N0:17) 03ΥΌ83Ν0Ενν (ΞΕΟ ΙΕ N0:56)
АБ1.1ЕЗРЗ_С9 ΤΕ3Ξ03ΙΑ8ΝΥνθ (3Ε0 ΙΟ N0:16) Ε0ΝΗΚΡ3 (3Ε0 ΙΟ N0:9) ОЗРЕЗТЫЬУУ (ΞΕΟ ΙΕ N0:92}
АС1.2ЕЗР7_ПЗ ΤΟ3003ΙΑΤΝΥνο (3Ε0 Ιϋ N0:48} ΕϋΝΟΚΡΞ (3Ε0 ΙΟ N0:17) 03ΥΕ3ΕΝΗΗνν (ΞΕΟ ΙΟ N0:49)
- 7 013118
Репрезентативным моноклональным анти-йиШЫу-антителом является описанное здесь антитело N10501. Антитело N1-0501 представляет собой вариант антитела АС1.2Я3.Р2_А6, подвергнутый обратной мутации. Используемый здесь термин обратная мутация означает мутацию нуклеотида или аминокислотного остатка, которая приводит к восстановлению нуклеотида или аминокислотного остатка, присутствующего в соответствующем положении последовательности зародышевой линии. Антитело N1-0501 включает вариабельную область тяжелой цепи (8ЕО ГО N0: 2), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕО ГО N0: 1, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ПЭ N0: 7), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 6 (фиг. 1А1Ό).
Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области (СИЯ), определенные по Чотию и др. и по Кэбату и др. (Е.А. КаЬа!), подчеркнуты на фиг. 1В и 1Ό (см. Οιοίΐιία. С., е! а1., №Шгс 342:877-883 (1989); КаЬа!, Е.А., е! а1., 8сс.|испес5 οί Рго1сш οί 1ттиио1од1са1 ш1еге8!, ΕίΠΗ Εάίίίοη, И8 ОераПтеШ οί НеаПй аиё Нитаи 8егу1се5, И8 Οο\ΌΓηιικηΙ Ргшйид 0ГДсе (1991)). СИЯ тяжелой цепи антитела А6 имеет следующие последовательности: 8ΥΑΜ8 (8Е0 ΙΌ N0: 3); А18С8СС8ТУУАО8УКС (8Е0 ΙΌ N0:4) и О6886\УУРН\ЕОР (8Е0 ΙΌ N0: 5). СИЯ легкой цепи антитела А6 имеет следующие последовательности: ТЯ88681А8КУУР (8Е() ГО N0: 8); ЕВ^ЯРЗ (8Е() ГО N0: 9) и 08УП68\Я\М (8 ЕР) ГО N0: 10).
Другим репрезентативным моноклональным анти-йиШЫу-антителом является описанное здесь антитело АС1.2Я3.Р2_А6 (А6). Антитело А6 включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 103), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 102, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ГО N0: 105), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 104 (фиг. 1Е-1Н). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области (СИЯ) и определенные по Чотию и др. и по Кэбату и др. (Е.А. КаЬа!), подчеркнуты на фиг. 1Ε и 1Н (см. ОтоПча, С., е! а1., №1Шге 342:877-883 (1989); КаЬа!, Е.А., е! а1., 8е4иеисе5 οί Рго!ет οί 1ттиΐ'ΐοίοβχηΐ 1и1еге8!, ΕίΠΗ Еёйюи, И8 ОераПтеШ οί НеаПй аиё Нитаи 8егу1се5, И8 ΟολΌ/ΜΗΚι-ιΙ Рпийид 0Гйсс (1991)). СИЯ тяжелой цепи антитела А6 имеют следующие последовательности: 8УАМ8 (8Е0 ГО N0: 3); ΑI868668ТΥΥΑ^8VК6 (8 ЕС) ГО N0: 4) и 1)С188С1\\'¥\ТН\\'Е1)Р (8 ЕС) ГО N0: 5). СИЯ легкой цепи антитела А6 имеют следующие последовательности: ТЯ88С8Ш8ХУνρ (8Е0 ΙΌ N0: 106); ЕОИЯЯР8 (8ЕС) ΙΌ N0: 107) и Р8УО68ИЯ\М (8Е() ГО N0: 10).
Антитело АС1.2Я3Р2_В4 (также обозначаемое здесь В4) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ΙΌ N0: 12), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 11, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ΙΌ N0: 15), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 14 (фиг. 2Λ-2Ό). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОЯ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 2В и 20. СОЯ тяжелой цепи антитела В4 имеют следующие последовательности: 8УАМ8 (8Е() ГО N0: 3); АЕбЗбСЗТУУАОЗ^б (8Е() ГО N0: 4) и 1)1188С1\\'У\28С1\11)\ (8ЕС) ГО N0: 13). СОЯ легкой цепи антитела В4 имеют следующие последовательности: ТЯ88С8[А8ХУ\О (8Е0 ΙΌ N0: 16); ЕОЫрЯРЗ (8Е() ГО N0: 17) и р8ИО8ОИ\У (8Е() ГО N0: 18).
Антитело АО1.4Я4Р1_В9 (также обозначаемое здесь В9) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ΙΌ N0: 20), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ΙΌ N0: 23), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 22 (фиг. 3А-3О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОЯ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 3В и 3Ό. СОЯ тяжелой цепи антитела В9 имеют следующие последовательности: 8УАМ8 (8Е() ГО N0: 3); ΑI868668ТУΥΑ^8VК6 (8Е() ГО N0: 4) и 1)1.Т\С,С1Р\\'¥¥Е1)¥ (8ЕС) ГО N0: 21). СОЯ легкой цепи антитела В9 имеют следующие последовательности: ТЯ8868IV8NΥV^ (8Е0 ГО N0: 8); 1)1)1)('ЖР8 (8Е() ГО N0: 25) и р8УО88И\У (8ЕС) ГО N0: 26).
Антитело АО1.4Я4Р2_С9 (также обозначаемое здесь С9) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 28), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 27, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ГО N0: 31), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 30 (фиг. 4А-4О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОЯ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 4В и 4Ό. СОЯ тяжелой цепи антитела С9 имеют следующие последовательности: 8УАМ8 (8ЕС) ГО N0: 3); ΑI868668ТУΥΑ^8VК6 (8Е() ГО N0: 4) и 1)С1\\'\А1.С1\\'1.Е8 (8ЕС) ГО N0: 29). СОЯ легкой цепи антитела С9 имеют следующие последовательности: ТЯ8668№8УУ\р (8Е0 ГО N0: 32); ООККЯР8 (8Е() ГО N0: 33) и Р8УО8ИЫЕ\У (8Е() ГО N0: 34).
Антитело АС1.4Я4Р2_С10 (также обозначаемое здесь С10) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 36), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 35, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ГО N0: 38), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 37 (фиг. 5А-5О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОЯ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991),
- 8 013118 подчеркнуты на фиг. 5В и 5Ό. СГОВ тяжелой цепи антитела С10 имеют следующие последовательности: δΥΑΜδ (δΚΕ) ГО N0: 3); ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΟδνΚΟ (δΚΕ) ГО N0: 4) и Ι)ΟδδΟ\\'ΥΑ’Ρ1 Ι\\ΈΙ)Ρ (δΚΕ) ГО N0: 5). СОВ легкой цепи антитела С10 имеет следующие последовательности: ΤΒ880ΤΙΑ8ΝΥνθ (8Е0 ΙΌ N0: 39); ΕΌΝρΒΡδ (8ЕЦ ΙΌ N0: 17) и Ο8ΥΙ)Ν8ΝΉ\\Ύ (δΚΕ) ΙΌ N0: 40).
Антитело ΑΟΊ.2Ρ3Ρ7_Ό3 (также обозначаемое здесь Ό3) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 42), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 41, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ГО N0: 47), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 46 (фиг. 6А-6О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 6В и 6Ό. СОВ тяжелой цепи антитела Ό3 имеют следующие последовательности: δNΑΜδ (δΚΕ) ГО N0: 43); Τ^ΤΟδΟΟΤΑΥΥΑ^δVΕΟ (δΚΕ) ГО N0: 44) и ΟIΈ^VΟΟΟ^^N (δΚΕ) ГО N0: 45). СОВ легкой цепи антитела Ό3 имеет следующие последовательности: ΤΟδΟΟδIΑΤNΥV^ (8Е0 ГО N0: 48); ЕП^ВРЗ (δΚΕ) ГО N0: 17) и ^δΥ^δ^NΗΗVV (δΚΕ) ГО N0: 49).
Антитело ΑΌ1.2Ρ2Ρ2_Ό6 (также обозначаемое здесь Ό6) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 51), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 50, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ГО N0: 54), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 53 (фиг. 7Λ-7Ό). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 7В и 7Ό. СОВ тяжелой цепи антитела Ό3 имеют следующие последовательности: δΥΑΜδ (δΚΕ) ГО N0: 3); ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΟδνΚΟ (δΚΕ) ГО N0: 4) и 1)С1\\ЛАЕС1\\'ЕЕ8 (δΚΕ) ГО N0: 29). СОВ легкой цепи антитела Ό6 имеет следующие последовательности: ΤΟδδΟδIΑδNΥV^ (8Е0 ГО N0: 55); (δΚΕ) ГО N0: 17) и ^δΥ^δδN^ΕVV (δΚΕ) ГО N0: 56).
Антитело ΑΟΊ.2Ρ2Ρ2_Ό8 (также обозначаемое здесь Ό8) включает вариабельную область тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 58), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 57, и вариабельную область легкой цепи (8Е0 ГО N0: 60), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ГО N0: 59 (фиг. 8А-8О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 8В и 8Ό. СОВ тяжелой цепи антитела Ό8 имеют следующие последовательности: δΥΑΜδ (δΚΕ) ΙΌ N0: 3); ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΟδνΚΟ (δΚΕ) ΙΌ N0: 4) и Ό6δδ6\ΥνΡΗ\ΕΌΡ (δΚΕ) ΙΌ N0: 5). СОВ легкой цепи антитела Ό8 имеет следующие последовательности: ΤВδδΟδIVδNΥV^ (^ЕЦ ГО N0: 8); Ε^N^ВΡδ (8Ер ГО N0: 17) и ЕЮЗ^МАУУ (8ЕЦ ГО N0: 61).
Антитело Α^1.3В3Ρ6_Ε1 (также обозначаемое здесь Е1) включает вариабельную область тяжелой цепи (ЪЕЦ ГО N0: 63), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ΙΌ N0: 62, и вариабельную область легкой цепи (ЪЕЦ ГО N0: 66), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ГО N0: 65 (фиг. 9А-9О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 9В и 90. СОВ тяжелой цепи антитела Е1 имеют следующие последовательности: δΥΑΜδ (^ЕЦ ГО N0: 3); ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΌδνΚΟ (8Ер ГО N0: 4) и ВδΕ^δΟΟδΕΕΥ (8ЕЦ ГО N0: 64). СОВ легкой цепи антитела Е1 имеет следующие последовательности: ΤВδδΟδIVδNΥV^ (^ЕЦ ГО N0: 8); Ι)Ι)Ι)Ε)ΡΡδ (^ЕЦ ГО N0: 25) и ^δΥ^δδNVV (8ЕЦ ГО N0: 26).
Антитело ΑΌ1.3Ρ3Ρ5_Ε8 (также обозначаемое здесь Е8) включает вариабельную область тяжелой цепи (ЪЕЦ ГО N0: 68), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ΙΌ N0: 67, и вариабельную область легкой цепи (ЪЕЦ ГО N0: 71), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ΙΌ N0: 70 (фиг. 10А-100). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 10В и 10Ό. СОВ тяжелой цепи антитела Ε8 имеют следующие последовательности: δΥΑΜδ (^ЕЦ ГО N0: 3); ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΌδνΚΟ (8ЕЦ ГО N0: 4) и νΟδΧνΥΈΙΌΙΌΙ (8ЕЦ ГО N0: 69). СОВ легкой цепи антитела Е8 имеет следующие последовательности: ΤВδδΟδIΑδNΥVΗ (ЪЕЦ ГО N0: 72); Ε^NВВΡδ (8Ер ГО N0: 9) и ρδδΏΤΤΥΗΟΟνν (8ЕЦ ГО N0: 73).
Антитело ΑΌ1.3Ρ3Ρ6_Ε9 (также обозначаемое здесь Е9) включает вариабельную область тяжелой цепи (ЪЕО ГО N0: 75), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ΙΌ N0: 74, и вариабельную область легкой цепи (ЪЕЦ ГО N0: 78), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ΙΌ N0: 77 (фиг. 11А-11О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 11В и 1ΕΌ. СОВ тяжелой цепи антитела Е9 имеют следующие последовательности: δΥΑΜδ (^ЕЦ ГО N0: 3); ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΟδνΚΟ (8ЕЦ ГО N0:4) и ΟΟΙΥΓΥΟΟΥΕΟΥΕΟΥ (8Ер ГО N0: 76). СОВ легкой цепи антитела Е9 имеют следующие последовательности: ΤВδδΟδIΑδNΥV^ (^ЕЦ ГО N0: 16); Ε^N^ВΡδ (8ЕЦ ГО N0: 17) и Ε)δΥΤΧ.,1; (8Ер ГО N0: 79).
Антитело ΑΌ1.4Ρ4Ρ2-Ο7 (также обозначаемое здесь Ο7) включает вариабельную область тяжелой цепи (ЪЕО ГО N0: 81), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ГО N0: 80, и вариабельную область легкой цепи (ЪЕЦ ГО N0: 83), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в δΕ^ ГО N0: 82 (фиг. 12А-12О). Аминокислоты, состав
- 9 013118 ляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 12В и 12Ό. СОВ тяжелой цепи антитела С7 имеют следующие последовательности: 8ΥΑΜ8 (8ЕС ГО N0: 3); ΑΙ808008ΤΥΥΑ0δνΚ0 (8ЕС ГО N0: 4) и Ι)0ι\\'\Α1.0ι\\'1.Ε8 (8ЕС ΙΌ N0: 29). СОВ легкой цепи антитела 07 имеют следующие последовательности: ΤΟΚΝΟΝΙΑ8ΝΥνθ (НЕС) ΙΌ N0:84); ЕСТОВР8 (НЕС) ΙΌ N0: 85) и ρδδΌδΝΒνΕ (НЕС) ΙΌ N0: 86).
Антитело ΑΌ1.1Β3Ρ3_09 (также обозначаемое здесь 09) включает вариабельную область тяжелой цепи (8ЕЦ ГО N0: 88), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 87, и вариабельную область легкой цепи (8ЕЦ ГО N0: 91), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 90 (фиг. 13А-ЕТО). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СЭВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 13В и 13Ό. СЭВ тяжелой цепи антитела 09 имеют следующие последовательности: 8ΥΑΜ8 (НЕС) ГО N0:3); ΑΙ808008ΤΥΥΑ0δνΚ0 (НЕС) ΙΌ N0: 4) и ^ΕΑVIΤ80N^Υ (НЕС) ΙΌ N0: 89). СОВ легкой цепи антитела 09 имеют следующие последовательности: ΤΒ8808IΑ8NΥV^ (НЕС) ГО N0: 16); Е1)МШР8 (НЕС) ГО N0: 9) и ρδΕΟδΊΧΙΕνν (НЕС) ГО N0: 92).
Антитело ΑΌΕ3Ε3Ρ6_010 (также обозначаемое здесь 010) включает вариабельную область тяжелой цепи (8ЕЦ ΙΌ N0: 94), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 93, и вариабельную область легкой цепи (8ЕЦ ГО N0: 96), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 95 (фиг. 14А-14О). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области СОВ и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 14В и 140. СОВ тяжелой цепи антитела 010 имеют следующие последовательности: 8ΥΑΜ8 (НЕС) ГО N0: 3); ΑΙ808008ΤΥΥΑ0δνΚ0 (НЕС) ГО N0: 4) и ^0ΑNΑ^0Α^Ε8 (НЕС) ГО N0: 29). СОВ легкой цепи антитела 010 имеют следующие последовательности: Α0δδ0δIΑδNΥV^ (НЕС) ГО N0: 97); ЕО^ВРЗ (НЕС) ГО N0: 17) и ^8Υ8ΥNN^VV (НЕС) ГО N0: 98).
Анти-йиШ^-антителами согласно изобретению также являются антитела, которые включают аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 или 103 (фиг. 1-14), и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97 98, 99% или более идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 или 105 (фиг. 1-14).
Альтернативно, моноклональным антителом является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, как и антитело N00501, А6, В4, В9, С9, С10, Ώ3, Ό6, Ώ8, Е1, Е8, Е9, 07, 09 или 010.
Если это не оговорено особо, то используемые в настоящем описании научные и технические термины имеют общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области. Кроме того, если это не очевидно из контекста описания, то существительные, употребляемые в единственном числе, могут означать и существительные во множественном числе, а существительные, употребляемые во множественном числе, могут означать существительные в единственном числе. В общих чертах, номенклатура и способы культивирования тканей, методы молекулярной биологии, химии белков и олиго- или полинуклеотидов и их гибридизации, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Стандартными методами являются методы рекомбинантных ДНК, олигонуклеотидный синтез, а также культивирование и трансформация тканей (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителей или в соответствии со стандартными процедурами или процедурами, описанными в настоящей заявке. Вышеупомянутые способы и процедуры обычно осуществляют стандартными методами, хорошо известными специалистам и описанными в различных общих и специальных руководствах, цитируемых и обсуждаемых в настоящем описании. См., например, руководство 8атЬтоок е( а1. Мо1еси1аг С1ошид: Α ЬаЬогаФгу Мапиа1 (26 еб., Со16 8рппд НагЬог ЬаЬотаФгу Рте§8, Со16 8ргшд НагЬог, ΚΥ. (1989)). Используемая здесь номенклатура, лабораторные процедуры и методы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящей заявке, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Химический синтез, химические анализы, приготовление фармацевтических препаратов, составление композиций, их доставку и лечение пациентов осуществляют стандартными методами.
В описании настоящего изобретения используются указанные ниже термины, которые, если это не оговорено особо, имеют значения, определенные ниже.
Используемый здесь термин антитело означает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина (к|). то есть молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся (вступающий в иммунную реакцию) с антигеном. Такими антителами являются, но не ограничиваются ими, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело, ЕаЬ-, ЕаЬ1- и Е(аЬ')2-фрагменты и библиотека экспрессируемых ЕаЬ-фрагментов. Термин специфически связывается или вступает в иммунную реакцию означает, что указанное антитело реагирует с одной или несколькими антигенными детерминантами нужного антигена и не реагирует (то есть не связывается) с другими полипептидами или связывается с другими
- 10 013118 полипептидами с гораздо более низкой аффинностью (Кб>10-6).
Известно, что основную структурную единицу антитела составляет тетрамер. Каждый тетрамер состоит из идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну легкую цепь (примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область, состоящую примерно из 100-110 или более аминокислот, ответственных, главным образом, за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяется константной областью, ответственной, главным образом, за эффекторную функцию. Легкие цепи человеческого антитела классифицируются как легкие цепи κ и λ. Тяжелые цепи классифицируются как μ-, δ-, γ-, α- или ε-цепи и определяют изотип антитела, такой как 1дМ, 1дЭ, 1дА и 1дЕ соответственно. В легких и тяжелых цепях имеются вариабельные и константные области, присоединенные друг к другу Τ'-областью, состоящей примерно из 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает Ό -область, состоящую примерно из 10 или более аминокислот. В общих чертах, см. руководство Еиибатеи1а1 1ттипо1оду СЕ. 7 (Раи1, ^., еа., 2иб еб. Вауеи Ргекк, Ν.Υ. (1989)). Вариабельные области каждой пары легких/тяжелых цепей образуют антигенсвязывающий сайт.
Используемый здесь термин моноклональное антитело (МАЬ) или композиция моноклональных антител означает популяцию молекул антител, содержащих молекулы антител только одного вида, состоящие из одного генного продукта легкой цепи и одного генного продукта тяжелой цепи. В частности, гипервариабельные области (СИВ) моноклонального антитела являются идентичными у всех молекул данной популяции. МАЬ содержат антигенсвязывающий сайт, способный вступать в иммунную реакцию с конкретным эпитопом антигена, характеризующимся аффинностью специфического связывания с этим антителом.
В общих чертах, молекулы человеческих антител относятся к любому из классов 1дС. 1дМ, 1дА, 1дЕ и 1дЭ, которые отличаются друг от друга природой тяжелой цепи, присутствующей в данной молекуле. Некоторые классы также подразделяются на подклассы, такие как 1дС1, 1дО2 и т.п. Кроме того, у человека легкая цепь может представлять собой цепь κ или λ.
Термин антигенсвязывающий сайт или связывающая часть означает часть молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании с антигеном. Антигенсвязывающий сайт образован аминокислотными остатками Ν-концевых вариабельных (V) областей тяжелой цепи (Н) и легкой цепи (Ь). Три в высокой степени вариабельных фрагмента, присутствующих в ν-областях тяжелой и легкой цепей, называемых гипервариабельными областями, расположены между более консервативными фланкирующими фрагментами, известными как каркасные области или ЕВ. Таким образом, термин ЕВ означает аминокислотные последовательности, которые обычно расположены между гипервариабельными областями в иммуноглобулинах и являются смежными с этими гипервариабельными областями. В молекуле антитела указанные три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи локализованы напротив друг друга в трехмерном пространстве и образуют антигенсвязывающую поверхность. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связанного антигена, и указанные три гипервариабельные области каждой тяжелой и легкой цепей называются комплементарность-определяющими областями или СОВ. Присвоение аминокислот каждому домену белков, представляющих интерес с точки зрения иммунологии, осуществляют в соответствии с определениями последовательностей по Кэбату (№1бопа1 1и81йи1е8 оГ Неайй, ВеШекба, Мб. (1987 аиб 1991)) или по Чотию (С’1ю11иа & Ьекк 1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987); С’1ю11иа а! а1. №11иге 342:878-883 (1989)).
Используемый здесь термин эпитоп означает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином, 8сЕу или с Т-клеточным рецептором. Термин эпитоп включает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином или с Тклеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обычно имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Считается, что антитело специфически связывается с антигеном, если константа диссоциации составляет <1 мкМ, предпочтительно <100 нМ, а наиболее предпочтительно <10 нМ.
Используемые здесь термины иммунологическое связывание и иммунологические связывающие свойства означают нековалентные взаимодействия определенного типа, которые происходят между молекулой иммуноглобулина и антигеном, по отношению к которому данный иммуноглобулин является специфичным. Сила связывания или аффинность иммунологических взаимодействий могут быть определены таким термином как константа диссоциации (Кб) взаимодействия, при этом чем меньше Кб, тем больше аффинность. Иммунологические связывающие свойства выбранных полипептидов количественно определяют методами, хорошо известными специалистам. Один из таких методов позволяет измерять скорость образования и диссоциации комплекса антигенсвязывающий сайт/антиген, где указанная скорость зависит от концентрации партнеров данного комплекса, аффинности взаимодействия и геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, констнанта скорости ассоциации (Кои) и констнанта скорости диссоциации (КоГГ) могут быть опреде
- 11 013118 лены путем вычисления концентраций и фактических скоростей ассоциации и диссоциации (см. №1иге 361: 186-87 (1993)). Отношение Ко££/Коп позволяет исключить все параметры, не относящиеся к аффинности, и равно константе диссоциации Кб (см. в общих чертах Эау1е5 е! а1. (1990) Аппиа1 Кеу. Вюсйет. 59:439-473). Считается, что антитело согласно изобретению специфически связывается с эпитопом ΙΕΝγ, если константа равновесного связывания (КД составляет <1 мкМ, предпочтительно <100 нМ, более предпочтительно <10 нМ, а наиболее предпочтительно от <100 примерно до 1 пМ, как было измерено в анализах, таких как анализы на связывание с радиоактивным лигандом или аналогичные анализы, известные специалистам.
Специалистам в данной области известно, что без излишнего экспериментирования можно определить, обладает ли человеческое моноклональное антитело такой же специфичностью, как и человеческое моноклональное антитело согласно изобретению (например, моноклональное антитело ΝΙ-0501, А6, В4, В9, С9, С10, Ό3, Ό6, Ό8, Е1, Е8, Е9, 07, 09 или 610), путем установления способности первого из указанных антител предотвращать связывание второго из указанных антител с полипептидом антигена ΙΕΝγ. Если тестируемое человеческое моноклональное антитело конкурирует с человеческим моноклональным антителом согласно изобретению, на что будет указывать снижение уровня связывания с человеческим моноклональным антителом согласно изобретению, то эти два моноклональных антитела связываются с одним и тем же или с близкородственным эпитопом. Для того чтобы установить, обладает ли человеческое моноклональное антитело специфичностью человеческого моноклонального антитела согласно изобретению, может быть применен другой способ, включающий предварительное инкубирование человеческого моноклонального антитела согласно изобретению с полипептидом антигена ΙΕΝγ, с которым оно обычно реагирует, и последующее добавление тестируемого человеческого моноклонального антитела для того, чтобы определить, ингибируется ли способность тестируемого человеческого моноклонального антитела связываться с полипептидом антигена ΙΕΝγ. Если такое ингибирование тестируемого человеческого моноклонального антитела происходит, то, по всей вероятности, это антитело обладает такой же или функционально эквивалентной специфичностью к эпитопу, как и моноклональное антитело согласно изобретению.
Для продуцирования моноклональных антител против белка, такого как белок ΙΕΝγ, или против его производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов, применяются различные процедуры, известные специалистам (см., например, руководство АпйЬоФек: А БаЬогаЮгу Мапиа1, Наботе Е, апб Ьапе Ό, 1988, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу Рте88, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки). Полностью человеческими антителами являются молекулы антител, в которых все последовательности легкой и тяжелой цепей, включая СОВ, происходят от человеческих генов. Такие антитела называются здесь человеческими антителами или полностью человеческими антителами. Человеческие моноклональные антитела получают, например, в соответствии с процедурами, описанными ниже в разделе Примеры. Человеческие моноклональные антитела могут быть также получены триомным методом; методом с использованием человеческой В-клеточной гибридомы (см. КохЬог, е! а1., 1983 1ттипо1 Тобау 4: 72); и методом ЕВУ-гибридом с продуцированием человеческих моноклональных антител (см. Со1е, е! а1., 1985 1п: \1О\ОСЕО\АЕ ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8 ΑΝΏ СА\СЕВ ΤΗΕΒΑΡΥ, А1ап В. Б|55. Ею. рр. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут быть продуцированы с использованием человеческих гибридом (см. Со!е, е! а1., 1983. Ргос №111 Асаб 8с1 И8А 80: 2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейна-Барра ш уйго (см. Со1е, е! а1., 1985 Ιη МО\ОСЕО\АЕ ААТ/ВОЭПА А\Э СА^ЕВ ТНЕВАР^ А1ап В. Ь188, Шс., рр. 77-96).
Антитела очищают хорошо известными методами, такими как аффинная хроматография на белке А или белке 6, которая позволяет получать, главным образом, ЦС-фракцию в иммунной сыворотке. Затем или альтернативно, специфический антиген, который является мишенью для рассматриваемого иммуноглобулина, или его эпитоп могут быть иммобилизованы на колонке для очистки иммуноспецифического антитела с помощью иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, в работе Ό. ХУПкпъоп (опубликованной в Тйе 8с1еп!18!, Шс., РЫ1абе1рЫа РА, Уо1. 14, №. 8 (Артй 17, 2000), рр. 25-28).
Антитело согласно изобретению желательно модифицировать так, чтобы это приводило к усилению его эффекторной функции, например, к повышению его эффективности при лечении иммунных заболеваний. Так, например, цистеиновый(е) остаток(ки) может (могут) быть введен(ы) в Ес-область для образования в этой области межцепьевой дисульфидной связи. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать повышенной способностью к интернализации и/или к комплементопосредуемому клеточному лизису и повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) (см. Сагоп е! а1., 1. Ехр Меб., 176: 1191-1195 (1992) и 8йоре§, 1. ]ттипо1., 148: 2918-2922 (1992)). Альтернативно, антитело может быть сконструировано так, чтобы оно имело две Ес-области и, тем самым, обладало бы повышенной способностью к лизису комплемента и антителозависимой цитотоксичностью (АЭСС) (см. 8!еуеп§оп е! а1., Апб-Сапсет Эгид Эе^ди 3: 219-230 (1989)).
Настоящее изобретение также включает Εν-, ЕаЬ-, ЕаЬ'- и Е(аЬ')2-фрагменты анти-йиШ^-антитела, одноцепочечные анти-йиШ^-антитела, биспецифические анти-йиШ^-антитела и гетероконъюгаты ан
- 12 013118 ти-НиГЕМу-антител.
Биспецифическими антителами являются антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными антигенами. В настоящем изобретении одной из таких специфичностей связывания является специфичность к ΙΕΝγ. Второй мишенью связывания является любой другой антиген, а предпочтительно белок клеточной поверхности, рецептор или субъединица рецептора.
Методы получения биспецифических антител известны специалистам. Традиционный метод рекомбинантного продуцирования биспецифических антител основан на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (М1181еш аиб Сие11о, №1Шгс. 305:537-539 (1983)). В результате случайной реаранжировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют смесь из десяти возможных различных молекул антитела, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистку такой правильной молекулы обычно осуществляют путем проведения постадийной аффинной хроматографии. Аналогичные процедуры описаны, например, в заявке XVО 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 г., и в работе Тгаипескег е! а1., ЕМВО 1., 10:3655-3659 (1991).
Вариабельные домены антитела, обладающие нужной специфичностью связывания (имеющие сайты связывания с антигеном), могут быть присоединены к последовательностям константного домена иммуноглобулина. Такой гибрид предпочтительно имеет константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере часть шарнирной области, СН2-области и СН3-области. При этом предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из гибридов присутствовала первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью. ДНК, кодирующие гибриды тяжелых цепей иммуноглобулина и, если это необходимо, гибриды легких цепей иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессионные векторы и котрансфицируют в подходящий организм хозяина. Более подробное описание получения биспецифических антител можно найти, например, в публикации ЗитекН е! а1., Ме1йо6§ ίη Еп7уто1о§у, 121:210 (1986).
В соответствии с другим подходом, описанным в νθ 96/27011, пограничная область между парой молекул антител может быть сконструирована в целях максимизации процента содержания гетеродимеров, которые выделяют из рекомбинантной клеточной культуры. Предпочтительная пограничная область содержит по меньшей мере часть СН3-области константного домена антитела. В этом методе одну или несколько небольших аминокислот боковых цепей в пограничной области молекулы первого антитела заменяют более крупными аминокислотами боковых цепей (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие полости идентичного или аналогичного размера для крупных боковых цепей создают на пограничной области второй молекулы антитела путем замены крупных аминокислот боковых цепей более мелкими аминокислотами (например, аланином или треонином). Такая замена обеспечивает механизм увеличения выхода гетеродимеров по отношению к выходам других нежелательных побочных продуктов, таких как гомодимеры.
Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или их фрагментов (например, Е(аЬ')2-фрагментов биспецифических антител). Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител описаны в литературе. Так, например, биспецифические антитела могут быть получены посредством химического связывания. В работе Вгеппап е! а1., 8с1епсе 229:81 (1985) описана процедура протеолитического расщепления интактных антител с получением Е(аЬ')2-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, а именно арсенита натрия, для стабилизации соседних дитиолов и для предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные ЕаЬ'-фрагменты превращают в тионитробензоатные (ΤΝΒ) производные. После этого одно из производных ЕаЬ'-ΤΝΒ снова превращают в ЕаЬ'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного ЕаЬ'-ΤΝΒ, в результате чего получают биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.
Кроме того, ЕаЬ'-фрагменты могут быть непосредственно выделены из Е.соН и подвергнуты химическому связыванию с образованием биспецифических антител. В публикации 8На1аЬу е! а1., 1. Ехр. Меб. 175:217-225 (1992) описано продуцирование полностью гуманизированной молекулы Е(аЬ')2-фрагмента биспецифического антитела. Каждый ЕаЬ'-фрагмент был отдельно секретирован из Е.соН и подвергнут непосредственному химическому связыванию ш уйто с образованием биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладает способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ЕгЬВ2, и с нормальными человеческими Т-клетками, а также способностью индуцировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, направленную против опухоли-мишени молочной железы человека.
Были также описаны различные методы получения и выделения биспецифических фрагментов антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Так, например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием лейциновых молний. Ко§!е1пу е! а1., 1. 1ттипо1. 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии белков Ео§ и 1ип были присоединены к ЕаЬ'фрагментам двух различных антител путем лигирования их генов. Гомодимеры антител были восстанов
- 13 013118 лены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем снова окислены с образованием гетеродимеров антител. Этот метод может быть также применен для продуцирования гомодимеров антител. Техника диантител, описанная НоШпдег е! а1., Ргос. Хаб. Асаб. 8с1. И8А 90:6444-6448 (1993), представляет собой альтернативный метод получения фрагментов биспецифических антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (УН), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (Уь) посредством линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи. В соответствии с этим, домены УН и Уъ одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными доменами УН и Уъ другого фрагмента и, тем самым, образовывать два антигенсвязывающих сайта. Была также описана и другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, предусматривающая использование одноцепочечных Ру(§Ру)-димеров. См. СгиЬег е! а1., 1. 1ттипо1. 152:5368 (1994).
Рассматриваются также антитела, имеющие более чем две валентности. Так, например, могут быть получены триспецифические антитела. Тий е! а1., 1. 1ттипо1. 147:60 (1991).
Репрезентативные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами, по меньшей мере один из которых присутствует в антигене белка согласно изобретению. Альтернативно, антигенсвязывающий домен молекулы иммуноглобулина может быть присоединен к домену, который связывается со стимулирующей молекулой на лейкоцитах, такой как молекула Т-клеточного рецептора (например, ί.Ό2. 1РХу, СЭ28 или В7), или с Рс-рецепторами для 1дС (РсуЯ), такими как РсуК1 (СО64), РсуКЛ (1РХу11) и РсуКШ (СО 16), так, чтобы их механизм клеточной защиты был направлен на клетки, экспрессирующие конкретный антиген. Биспецифические антитела могут быть также использованы для направления цитотоксических агентов на клетки, которые экспрессируют конкретный антиген. Эти антитела имеют антигенсвязывающий домен и домен, который связывается с цитотоксическим агентом или с агентом, образующим хелатный комплекс с радионуклидом, таким как ЕОТИВЕ, ОРТА, ООТА или ТЕТА. Другое представляющее интерес биспецифическое антитело связывается с описанным здесь антигеном белка, а также связывается с тканевым фактором (ТР).
Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела используются, например, для направления клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекций (АО 91/00360; АО 92/200373; ЕР 03089).
Предполагается, что такие антитела могут быть получены ш νίίτο известными методами химического синтеза белков, включая методы с использованием перекрестносшивающих агентов. Так, например, иммунотоксины могут быть сконструированы путем проведения реакций дисульфидного обмена или образования тиоэфирной связи.
Примерами реагентов, подходящих для этих целей, являются иминотиолат и метил-4меркаптобутиримидат и реагенты, описанные, например, в патенте США № 4676980.
Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат).
Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, Ацепь экзотоксина (от Ркеиботопак аетидтока), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфасарцин, белки А1еитйек £отбн, белки диантины, белки фитолакки американской (Рйу!о1аса атепсапа) (РАР1, РАР11 и РАР-8), ингибитор Мототбка сйатапйа, курцин, кротин, ингибитор 8араопапа оШсшайк, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для продуцирования антител, конъюгированных с радионуклидом, могут быть использованы различные известные радионуклиды. Примерами являются 212В1, 131Ι, 1311п, 90Υ и 186Яе.
Конъюгаты антител и цитотоксических агентов получают с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как Х-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (8РОР), иминотиолан (1Т), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-НС1), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен как описано в работе УйеИа е! а1., 8аепсе 238: 1098 (1987). Репрезентативным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклида с антителом является 14С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен-триаминпента-уксусная кислота (МХОТРА). (См. АО 94/11026).
Среднему специалисту в данной области известно, что к полученным антителам или к другим молекулам согласно изобретению могут быть присоединены различные молекулы широкого ряда (см., например, публикацию Соп)ида!е Уасстек, СоШлЬиРопк ίο МютоЬю1оду апб 1ттипо1оду, Р М. Стике апб
- 14 013118
В.Е. Ьетак, 1г (еФк), Сагдег Ргекк, Νο\ν Уогк, (1989), полное содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Присоединение осуществляют посредством любой химической реакции связывания двух молекул, при условии, что указанное антитело и другая молекула будут сохранять свою активность. Такое связывание может происходить посредством многих химических механизмов, например посредством ковалентного связывания, аффинного связывания, интеркаляции, координированного связывания и образования комплексов. Однако предпочтительным связыванием является ковалентное связывание. Ковалентное связывание осуществляют либо путем прямой конденсации имеющихся боковых цепей, либо путем включения внешних молекул, образующих мостиковые связи. Для присоединения молекул белка, например антител согласно изобретению, к другим молекулам может быть использовано множество двухвалентных или поливалентных связывающих агентов. Так, например, репрезентативными связывающими агентами могут быть органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидоэфиры, диизоцианаты, глутаральдегид, диазобензолы и гексаметилендиамины. Этот список не является исчерпывающим списком связывающих агентов различных классов, известных специалистам, а просто включает примеры наиболее часто используемых связывающих агентов. (См. К111еи аиф ЫиФк!гот, 1оиг. Гттип. 133:1335-2549 (1984); .Таикеи е! а1., Гттиио1одюа1 Веу1е^8 62:185-216 (1982); и Уйейа е! а1. , 8с1еисе 238: 1098 (1987). Предпочтительные линкеры описаны в литературе. (См., например, Ватакгщйиаи, 8. е! а1., Саисег Век. 44:201-208 (1984), где описано использование МВ8 (М-малеимидобензоил-Νгидроксисукцинимидоэфира). См. также патент США № 5030719, где описано использование галогенированного производного ацетилгидразида, присоединенного к антителу посредством олигопептидного линкера. Наиболее предпочтительными линкерами являются: (1) ЕЭС (гидрохлорид 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида); (и) 8МРТ (4-сукцинимидилоксикарбонил-а-метил-а-(2пиридилдитио)толуол) (Р1егсе Сйет. Со., Са!. (215580); (ш) 8РЭР (сукцинимидил-6-[3-(2пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат) (Р1егсе Сйет. Со., Са! #216510); (ίν) сульфо-БС-8РЭР (сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамид]гексаноат) (Р1егсе Сйет. Со. Са!. #2165-0); и (ν) сульфо-NΗ8 (Ν-гидроксисульфосукцинимид: Р1егсе Сйет. Со., Са!. #24510), конъюгированные с ЕЭС.
Описанные выше линкеры содержат компоненты, имеющие различные признаки, позволяющие получать конъюгаты с различными физико-химическими свойствами. Так, например, сульфо-NΗ8-эфиры алкилкарбоксилатов являются более стабильными, чем сульфо-NΗ8-эфиры ароматических карбоксилатов. Линкеры, содержащие NΗ8-эфир, являются менее растворимыми, чем линкеры, содержащие сульфо-NΗ8-эфиры. Кроме того, указанный линкер 8МРТ содержит стерически затрудненную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с более высокой стабильностью. Дисульфидные связи обычно являются менее стабильными, чем другие связи, поскольку дисульфидная связь расщепляется ш уйго, что приводит к образованию менее доступного конъюгата. В частности, сульфо-ИН8 может повышать стабильность карбодиимидных связей. Карбодиимидные связи (такие как ЕЭС), если они используются в сочетании с сульфо-NН8, образуют сложные эфиры, которые являются более резистентными к гидролизу, чем связи, полученные только посредством реакции карбодиимидного связывания.
Используемый здесь термин выделенный полинуклеотид означает полинуклеотид, полученный от геномной ДНК, кДНК или путем синтеза, или их некоторых комбинаций, где указанный выделенный полинуклеотид по своей природе (1) не ассоциирован со всеми полинуклеотидами или с частью полинуклеотидов, с которыми он ассоциируется в природе, (2) функционально присоединен к другому полинуклеотиду, с которым он не ассоциируется в природе или (3) не встречается в природе как часть более крупной последовательности.
Используемый здесь термин выделенный белок означает белок, продуцируемый кДНК, рекомбинантной РНК, или синтезированный белок, или их комбинацию, где указанный выделенный белок, по своему происхождению или источнику происхождения, (1) не ассоциируется с природными белками, (2) изолирован от других белков, происходящих от того же источника, например от мышиных белков, (3) экспрессируется клетками различных типов или (4) не встречается в природе.
Используемый здесь термин полипептид представляет собой общее понятие, означающее нативный белок или фрагменты или аналоги полипептидной последовательности. Следовательно, фрагменты нативного белка, а также его аналоги представляют собой молекулы типа полипептидов. Предпочтительные полипептиды согласно изобретению включают молекулы тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, представленные на фиг. 1В, 2В, 3В и 4В, и молекулы легкой цепи человеческого иммуноглобулина, представленные на фиг. 1Ό, 2Ό, 3Ό и 4Ό, а также молекулы антитела, образованные комбинациями, содержащими молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина и молекулы легкой цепи иммуноглобулина, такие как молекулы легкой цепи к иммуноглобулина, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги.
Используемый здесь термин природный, относящийся к определенному объекту, означает, что данный объект может существовать в природе. Так, например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), может считаться природной, если она выделена из ее природного источника и если она не была специально модифицирована человеком в лабораторных или в каких-либо других условиях.
- 15 013118
Используемый здесь термин функционально присоединенный относится к положениям описанных здесь компонентов, присоединенных друг к другу способом, обеспечивающим их правильное функционирование. Так, например, регуляторная последовательность, функционально присоединенная к кодирующей последовательности, связана с этой последовательностью так, чтобы могла осуществляться экспрессия кодирующей последовательности в условиях, пригодных для функционирования данных регуляторных последовательностей.
Используемый здесь термин регуляторная последовательность означает полинуклеотидые последовательности, необходимые для осуществления экспрессии и процессинга или для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. Природа таких регуляторных последовательностей варьируется в зависимости от организма-хозяина; причем в прокариотах такие регуляторные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания с рибосомой и последовательность терминации транскрипции; а в эукариотах такими регуляторными последовательностями обычно являются промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин регуляторные последовательности включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых является необходимым для осуществления экспрессии и процессинга, а также он может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например лидерные последовательности и последовательности, являющиеся партнерами для гибридных последовательностей. Используемый здесь термин полинуклеотид означает полимерную форму нуклеотидной последовательности длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, либо рибонуклеотидной или дезоксинуклеотидной последовательности, либо модифицированную форму, состоящую из нуклеотидов любого типа. Этот термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК.
Используемый здесь термин олигонуклеотид означает природные и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом природными и неприродными олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотидную подпоследовательность, имеющую длину обычно в 200 нуклеотидов или менее. Предпочтительно олигонуклеотиды имеют длину в 10-60 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно в 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 нуклеотидов. Обычно олигонуклеотиды являются одноцепочечными, например олигонуклеотиды, используемые в качестве зондов, хотя иногда они могут быть двухцепочечными, например олигонуклеотиды, используемые для конструирования генных мутантов. Олигонуклеотиды по изобретению могут быть смысловыми или антисмысловыми.
Используемый здесь термин природные нуклеотиды означает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый здесь термин модифицированные нуклеотиды означает нуклеотиды с модифицированными или с замещенными сахарными группами и т.п. Используемый здесь термин олигонуклеотидные связи включает такие олигонуклеотидные связи, как фосфортиоат, фосфордитиоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и т.п. См., например, ЬаР1аисЬе е! а1., Иис1. Аабк. Кек. 14:9081 (1986); 8!ес е! а1., 1. Ат. СЬет. Зое. 106:6077 (1984); 8!еш е! а1., Иис1. Ас1бк. Кек. 16:3209 (1988); Ζοη е! а1., Αηΐί-Саисег Эгид Эеидп 6:539 (1991); Ζοη е! а1., ОНдопис1еойбек апб Лпа1одие8: Α Ргасбса1 ЛрргоасН. рр. 87-108 (Т. Ескк!ет Ε6., ОхГогб ИшуегыГу Ргекк, ОхГогб Епд1апб (1991)); 8!ес е! а1., патент США № 5151510; ИЫтаип & Реутаи Скетюа1 Кеу1е^к, 90:543 (1990). Если необходимо, олигонуклеотид может включать метку для детекции.
Используемый здесь термин селективная гибридизация относится к детектируемому и специфическому связыванию. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты согласно изобретению селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в таких условиях гибридизации и промывки, которые значительно минимизируют количество детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Для обеспечения селективной гибридизации, известной специалистам и обсуждаемой в настоящей заявке, могут быть использованы условия высокой жесткости. В общих чертах, гомология между последовательностями полинуклеотидов, олигонуклеотидов и фрагментов согласно изобретению и последовательностью представляющей интерес нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 80%, а более предпочтительно по меньшей мере 85, 90, 95, 99 и 100%. Две аминокислотные последовательности являются гомологичными, если их последовательности являются частично или полностью идентичными. Так, например, 85%-ная гомология последовательностей означает, что при выравнивании этих двух последовательностей для сопоставления на их максимальное соответствие, 85% аминокислот являются идентичными. Пробелы (в любой из двух сопоставляемых последовательностей) позволяют максимизировать соответствие; при этом предпочтительная длина пробела составляет 5 аминокислот или менее, а более предпочтительно 2 аминокислоты или менее. Альтернативно и предпочтительно, две последовательности белка (или полипептидные последовательности, происходящие от этих последовательностей и имеющие длину по меньшей мере в 30 аминокислот) считаются гомологичными в общепринятом смысле этого слова, если они имеют цену выравнивания более чем 5 (в единицах стандартного отклонения) при сопоставлении, осуществляемом с использованием программы ΑΕΙΟΝ с матрицей данных по мутации и со штрафом за пробел 6 или более. См. публикацию Наукой, М.О., ΑίΓΐδ оГ Рго!еш 8есщенсе апб 8!гис!иге, рр 101-110 (Уо1ите 5, ИаГюпа1 Вютебюа1 Кекеагск ЕоипбаГюп, 1972)) и приложение 2 к этому тому (8ирр1етеп! 2 !о !Ык уо1ите, рр. 1-10). Две последовательности или их части являются более предпочтительными гомологами, если их аминокислоты идентичны на 50% или более при их оп
- 16 013118 тимальном сопоставлении путем выравнивания с использованием программы АЬЮЫ. Используемый здесь термин соответствует означает, что полинуклеотидная последовательность является гомологичной (т.е. идентичной, но не является строго эволюционно родственной) всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности, либо этот термин означает, что данная полипептидная последовательность идентична эталонной полипептидной последовательности. В противоположность этому, используемый здесь термин комплементарный означает, что комплементарная последовательность гомологична всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности. Так, например, нуклеотидная последовательность ТАТАС соответствует эталонной последовательности ТАТАС и комплементарна эталонной последовательности СТАТА.
Для описания сходства между двумя или более полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями используются следующие термины: эталонная последовательность, окно сравнения, идентичность последовательностей, процент идентичности последовательностей и значительная идентичность. Термин эталонная последовательность означает последовательность, которая используется в качестве основы для сравнения последовательностей; эталонная последовательность может представлять собой подпоследовательность более крупной последовательности, например, сегмент полноразмерной кДНК или генной последовательности, имеющейся в списке последовательностей, либо эта последовательность может содержать полноразмерную кДНК или генную последовательность. Вообще говоря, эталонная последовательность имеет длину по меньшей мере в 18 нуклеотидов или 6 аминокислот, обычно по меньшей мере 24 нуклеотида или 8 аминокислот, а чаще всего по меньшей мере 48 нуклеотидов или 16 аминокислот. Поскольку каждая из двух полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей (1) может содержать последовательность (то есть часть полноразмерной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), которая является сходной у этих двух молекул, и (2) может, кроме того, содержать последовательность, которая отличается у этих двух полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей, то сравнение последовательностей двух (или более) молекул обычно осуществляют путем сопоставления последовательностей этих двух молекул по окну сравнения для идентификации и сравнения локальных областей гомологии последовательностей. Используемый здесь термин окно сравнения означает концептуальный сегмент, состоящий по меньшей мере из 18 смежных нуклеотидов или из 6 аминокислот, где полинуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность могут сравниваться с эталонной последовательностью, состоящей по меньшей мере из 18 смежных нуклеотидов или из 6 аминокислот, и где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления, делеции, замены и т.п. (то есть пробелы), которые составляют 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью (не содержащей добавлений или делеций) и которые используются для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей, осуществляемое для их сопоставления по окну сравнения, может быть осуществлено с использованием алгоритма локальной гомологии (8ιηί11ι аиб Аа1егшаи Абу. Арр1. Ма1й. 2:482 (1981)), алгоритма выравнивания областей гомологии (№сб1стап аиб Аипксй, 1. Мо1. Βίο1. 48:443 (1970)), методом поиска сходства (Реагкоп апб Ыртап. Ргос. №111. Асаб. 8е1. (И8А) 85:2444 (1988)) путем компьютерной реализации этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА в Аксопкш СепеДск 8ой^аге Раскаде Ре1еаке 7.0 (СепеДск СотрШег Сгоир, 575 8с1епсе Иг., Маб15оп, А15.), Сепе\\'огкк или пакеты программ МасУеСог) или с использованием программы контроля и построения наилучшего выравнивания (то есть получения наиболее высокого процента гомологии по окну сравнения), достигаемого различными методами.
Термин идентичность последовательностей означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности являются идентичными (то есть на нуклеотидном или аминокислотном уровне) в окне сравнения. Термин процент идентичности последовательностей означает процент, который вычисляют путем сравнения двух оптимально выравниваемых последовательностей по окну сравнения; определения числа положений идентичных оснований нуклеиновых кислот (например, А, Т, С, С, и или Ι) или остатков в обеих последовательностях с получением числа соответствующих положений; деления этого числа соответствующих положений на общее число положений в окне сравнения (то есть на размер окна) и умножения полученного результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Используемый здесь термин значительная идентичность означает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, где указанный полинуклеотид или указанная аминокислота составляют последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, а более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична эталонной последовательности в окне сравнения, составляющем по меньшей мере 18 нуклеотидов (6 аминокислот), а чаще всего составляющем по меньшей мере 24-48 нуклеотидов (8-16 аминокислот), где процент идентичности последовательностей вычисляют путем сравнения эталонной последовательности с последовательностью, которая может включать делеции или добавления, которые в целом составляют 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью, в окне сравнения. Эталонная последовательность может представлять собой подпоследовательность более крупной последовательности.
Используемые здесь двадцать главных аминокислот имеют общепринятые аббревиатуры. См. публикацию 1ттипо1оду - А 8уп111ек1к (2пб Ебйюп, Ε.8. Со1иЬ апб Ό.Β Сгеп. Ебк., 8шаиег Аккоаа1ек, 8ипбег
- 17 013118
1ап6, Ма§8. (1991)). Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати главных аминокислот, неприродных аминокислот, таких как α,α-дизамещенные аминокислоты; Ν-алкилзамещенных аминокислот, молочной кислоты и других редких аминокислот могут также служить подходящими компонентами полипептидов согласно изобретению. Примерами редких аминокислот являются 4-гидроксипролин, укарбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Νформилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемой здесь системе обозначения полипептидов в соответствии с общепринятой практикой и с принятым соглашением о терминологии левый конец аминокислоты называется аминоконцом, а правый конец аминокислоты называется карбоксиконцом.
Аналогичным образом, если это не оговорено особо, левым концом одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей является 5'-конец, а направлением слева направо для двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей считается 5'-направление (5'^·). Направление присоединения растущих РНК-транскриптов 5'^3' называется направлением транскрипции, при этом области последовательностей на ДНК-цепи, имеющей такую же последовательность, как и РНК-цепь, которые находятся со стороны 5'-конца по отношению к 5'-концу РНК-транскрипта, называются предшествующими последовательностями (то есть расположенными выше по ходу транскрипции), а области последовательностей на ДНК-цепи, имеющей такую же последовательность, как и РНК-цепь, которые находятся со стороны 3'-конца по отношению к 3'-концу РНК-транскрипта, называются последующими последовательностями (то есть расположенными ниже по ходу транскрипции).
Термин в основном идентичный, используемый по отношению к полипептидам, означает, что две пептидных последовательности, при их оптимальном выравнивании, например, с помощью программ САР или ВЕ8ТЕ1Т с использованием весов пробелов по умолчанию, имеют по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей, а наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательностей.
При этом предпочтительно, чтобы положения остатков, которые не являются идентичными, отличались в результате консервативных аминокислотных замен.
Термин консервативные аминокислотные замены означает взаимозаменяемые остатки, составляющие сходные боковые цепи. Так, например, группу аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, составляют глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группу аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, составляют серин и треонин; группу аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, составляют аспарагин и глутамин; группу аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, составляют фенилаланин, тирозин и триптофан; группу аминокислот, имеющих основные боковые цепи, составляют лизин, аргинин и гистидин; а группу аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, составляют цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными аминокислотными заменами являются замены в пределах таких групп, как валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота и аспарагин-глутамин.
Как обсуждается в настоящей заявке, небольшие изменения в аминокислотных последовательностях молекул антител или иммуноглобулинов рассматриваются как изменения, входящие в объем настоящего изобретения, при условии, что при таких изменениях аминокислотная последовательность описанных здесь молекул антител или иммуноглобулинов будет сохраняться по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95%, а наиболее предпочтительно на 99%. В частности, рассматриваются также консервативные аминокислотные замены. Консервативными заменами являются замены, которые входят в семейство аминокислот, являющихся родственными по их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты обычно подразделяются на следующие семейства: (1) кислотные аминокислоты = аспартат, глутамат; (2) основные аминокислоты = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные аминокислоты = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и (4) незаряженные полярные аминокислоты = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Гидрофильными аминокислотами являются аргинин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. Гидрофобными аминокислотами являются аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, финилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин. Аминокислотами, принадлежащими к другим семействам, являются (ί) серин и треонин, принадлежащие к семейству алифатических оксикислот; (ίί) аспарагин и глутамин, принадлежащие к семейству амидсодержащих кислот; (ίίί) аланин, валин, лейцин и изолейцин, принадлежащие к семейству алифатических аминокислот, и (ίν) фенилаланин, триптофан и тирозин, принадлежащие к семейству ароматических аминокислот. Так, например, следует ожидать, что отдельная замена лейцина изолейцином или валином, замена аспартата глутаматом, замена треонина серином или аналогичная замена какой-либо аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет оказывать значительного влияния на функцию связывания или свойства полученной молекулы, особенно, если эта замена не является аминокислотной заменой в каркасном уча
- 18 013118 стке. Продуцирование функционального пептида в результате такой аминокислотной замены может быть легко установлено путем анализа на удельную активность полипептидного производного. Такие анализы подробно описаны в настоящей заявке. Фрагменты или аналоги молекул антител или иммуноглобулинов могут быть легко получены средним специалистом в данной области. Предпочтительно, чтобы амино- и карбоксиконцы этих фрагментов или аналогов находились вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных о нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностях с данными о последовательностях, имеющихся в известных общедоступных базах данных или в базах данных, находящихся в частной собственности. Предпочтительно для идентификации мотивов последовательностей или конформационных доменов предсказанных белков, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией, применяются методы компьютерного сравнения. Методы идентификации последовательностей белка, которые образуют известную трехмерную структуру, известны специалистам. Во\\зе е! а1., 8аеисе 253:164 (1991). Так, например, описанные ранее примеры продемонстрировали, что специалист в данной области может легко выявить мотивы последовательностей и структурные конформации, которые могут быть использованы для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с приведенным здесь описанием.
Предпочтительными аминокислотными заменами являются замены, которые приводят: (1) к снижению чувствительности к протеолизу, (2) к снижению чувствительности к окислению, (3) к изменению аффинности связывания для образования белковых комплексов, (4) к изменению аффинности связывания и (5) к сообщению или модификации других физико-химических или функциональных свойств таких аналогов. Указанными аналогами могут быть различные мутеины с последовательностью, отличающейся от природной пептидной последовательности. Так, например, в природную последовательность (предпочтительно в ту часть полипептида, которая расположена за пределами доменобразующих межмолекулярных контактов) могут быть внесены одна или множество аминокислотных замен (предпочтительно, консервативных аминокислотных замен). Консервативная аминокислотная замена не должна значительно влиять на структурные свойства родительской последовательности (например, аминокислотная замена не должна приводить к разрушению спирали, присутствующей в родительской последовательности, или к нарушению вторичной структуры других типов, которая характеризует родительскую последовательность). Примеры известных вторичных и третичных структур полипептида описаны в работах Рго!ет, 8!гис!игек аиб Мо1еси1аг Рттс1р1ек (Сте1дй!ои еб., \У.Н. Егеетаи аиб Сотраиу, №\ν Υо^к 1984); 1и!гобисйои !о Рго!ет 8(гис1иге (С. Вгаибеи & Е Тоохе ебк., 6аг1аиб РиЬНкЫид, №\ν Υо^к, Ν.Υ. (1991)) и в работе ТкогиФи е! а1., №1иге 354:105 (1991).
Используемый здесь термин фрагмент полипептида означает полипептид, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию, но в котором остальная аминокислотная последовательность в соответствующих положениях аминокислот идентична природной аминокислотной последовательности, происходящей, например, от полноразмерной кДНК-последовательности. Фрагменты обычно имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот, а предпочтительно по меньшей мере 14 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, обычно по меньшей мере 50 аминокислот, а еще более предпочтительно по меньшей мере 70 аминокислот. Используемый здесь термин аналог означает полипептиды, которые состоят из сегмента, имеющего по меньшей мере 25 аминокислот, в основном, идентичных части выведенной аминокислотной последовательности, и которые обладают по меньшей мере одним из нижеследующих свойств, а именно, они (1) специфически связываются с ΙΕΝγ в подходящих условиях связывания; (2) способны блокировать соответствующее связывание с ΙΕΝγ или (3) способны ингибировать рост ΙΕΝγ-экспрессирующих клеток 1и νίΙΐΌ или ш у1уо. Обычно полипептидные аналоги по сравнению с природной последовательностью содержат консервативную аминокислотную замену (добавление или делецию). Аналоги обычно имеют длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот или более, а чаще всего они имеют такую же длину, как и полноразмерный природный полипептид.
Пептидные аналоги обычно используются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств, обладающих свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Непептидные соединения этого типа называются пептидными миметиками или пептидомиметиками. См. публикации ЕаисЕете, I. Абу. Эгид. Век. 15:29 (1986); VеЬе^ & Ете1бтдет, ΤΙΝ8 р.392 (1985) и Еуаик е! а1., I. Меб. С’Еет. 30:1229 (1987). Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютерной программы молекулярного моделирования. Пептидные миметики, структурно сходные с терапевтически ценными пептидами, могут быть использованы для достижения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики являются структурно сходными с репрезентативным полипептидом (то есть с полипептидом, который обладает биохимическими свойствами или фармакологической активностью), таким как человеческое антитело, и они обычно имеют одну или несколько пептидных связей, которые могут быть заменены, но необязательно, связью, выбранной из группы, состоящей из -СН2ЫН-, -СН28-, -СН2-СН2-, -СН=СН- (цис и транс), СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН28О-, в соответствии с хорошо известной методикой. Системная замена одной или нескольких аминокислот кон
- 19 013118 сенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же типа (например, замена Ь-лизина на Ό-лизин) может быть использована для генерирования более стабильных пептидов. Кроме того, пептиды с конформационными ограничениями, содержащие консенсусную последовательность или вариант последовательности, в основном идентичный консенсусной последовательности, могут быть генерированы известными методами (Βίζο & Щегаксй, Апп. Веу. Вюсйет. 61:387 (1992)), например, путем присоединения внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют данный пептид.
Используемый здесь термин агент означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов.
Используемый здесь термин метка или меченый относится к включению в полипептид детектируемого маркера, например радиоактивно меченной аминокислоты или присоединения к полипептиду биотинильной группы, которая может быть детектирована с использованием меченого авидина (например стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые могут быть детектированы оптическими или калориметрическими методами). В некоторых случаях такая метка или маркер могут быть также терапевтическими. Могут быть применены различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, известные специалистам. Примерами меток, используемых для мечения полипептидов, являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15Ν, 358, 90Υ, 94Тс, 'Ап, 12Т 131Ц, флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, комплекс лантанид-фосфор), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные метки, биотинильные группы, и предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторым репортером (например, пара последовательностей лейциновой молнии, сайты связывания для вторых антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах изобретения метки присоединяют посредством спейсерных групп различной длины для предотвращения возможных стерических затруднений. Используемый здесь термин фармацевтическое средство или лекарственное средство означает химическое соединение или композицию, которые способны индуцировать желательный терапевтический эффект при их соответствующем введении пациенту.
Другие общепринятые химические термины, используемые в настоящей заявке, описаны в руководстве Тйе МсСга\\-НП1 ОгеЕопагу οί Сйетюа1 Тегтк (Рагкег 8. ЕЕ, МсСга\\-НП1. 8ап ЕгапсЕсо (1985)).
Используемый здесь термин противоопухолевое средство означает средство, которое обладает функциональным свойством ингибировать развитие или прогрессирование опухоли у человека, а в частности злокачественной (раковой) опухоли, такой как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Таким свойством противоопухолевых средств часто является способность ингибировать развитие метастазов.
Используемый здесь термин в основном чистый относится к рассматриваемой молекуле, которая является преобладающей молекулой (то есть присутствует в более высокой молярной концентрации по сравнению с любыми другими отдельными молекулами, имеющимися в данной композиции), а предпочтительно этот термин означает в основном очищенную фракцию, то есть композицию, в которой рассматриваемая молекула составляет по меньшей мере примерно 50% (на молярном уровне) от всех присутствующих макромолекул данного вида.
Обычно в основном чистая композиция составляет примерно более 80% от всех макромолекул, присутствующих в данной композиции, а более предпочтительно примерно более 85, 90, 95 и 99%. Наиболее предпочтительно, чтобы рассматриваемая молекула была очищена почти до полной гомогенности (где примеси, присутствующие в данной композиции, не могут быть детектированы стандартными методами детекции) так, чтобы указанная композиция состояла, в основном, из макромолекул одного вида.
Термин пациент включает человека и животных. Термин индивидуум включает человека и других млекопитающих.
Человеческие антитела и гуманизация антител.
Анти-йиIΡNγ-антитело продуцируют, например, в соответствии с процедурами, описанными ниже в разделе Примеры. Анти-йиIΡNγ-антитело типа ЦС продуцируют, например, путем превращения ксРуклона в ЦС-формат (см., например, пример 6). Альтернативно, такое анти-йиIΡNγ-антитело получают, например, методами фагового представления с использованием антител, содержащих только человеческие последовательности. Такие методы хорошо известны специалистам и описаны, например, в заявке \νϋ 92/01047 и в патенте США № 6521404, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В этом методе комбинаторную фаговую библиотеку, несущую рандомизированные пары легких и тяжелых цепей, скринируют с использованием природного или рекомбинантного источника ΞΕΝγ или их фрагментов.
Анти-йиIΡNγ-антитело получают способом, в котором по меньшей мере одна стадия включает иммунизацию трансгенного животного, не являющегося человеком, человеческим белком ΕΕΝγ. Некоторые эндогенные локусы тяжелой и/или легкой цепи каппа указанного ксеногенного животного были блокированы, а поэтому они были неспособны к реаранжировке, требуемой для генерирования генов, кодирующих иммуноглобулины в ответ на антиген. Кроме того, животному стабильно трансфицируют по
- 20 013118 меньшей мере один локус человеческой тяжелой цепи и по меньшей мере один локус человеческой легкой цепи. Таким образом, в ответ на введение антигена, человеческий локус подвергается реаранжировке с генерированием генов, кодирующих человеческие вариабельные области, обладающие иммуноспецифичностью к данному антигену. Поэтому после иммунизации у мыши Хепотоике продуцируются Вклетки, которые секретируют полностью человеческие иммуноглобулины.
Существует ряд хорошо известных методов получения ксеногенных животных, не являющихся человеком. Так, например, см. патенты США № 6075181 и № 6150584. В одной из стратегий ксеногенные (человеческие) гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина вводят в зародышевую линию хозяина (например, в сперму или ооциты), и в отдельных стадиях соответствующие гены хозяина делают нефункциональными путем инактивации посредством гомологичной рекомбинации. Человеческие гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина реконструируют в соответствующем эукариотическом или прокариотическом микроорганизме, и полученные ДНК-фрагменты вводят соответствующему хозяину, например, в пронуклеус оплодотворенных ооцитов или в эмбриональные стволовые клетки мыши. Инактивацию эндогенного локуса иммуноглобулина хозяина осуществляют путем нацеленной дизрупции соответствующего локуса посредством гомологичной рекомбинации в клетках-хозяевах, а в частности, в эмбриональных стволовых клетках или в пронуклеусе оплодотворенных ооцитов мыши. Такая нацеленная дизрупция может включать введение мутации или делеции в нужный локус, либо делецию в нужном локусе с последующей инсерцией в этот локус, например, селективного маркера. В случае эмбриональных стволовых клеток, получают химерных животных, которые частично развиваются из модифицированных эмбриональных стволовых клеток и которые способны передавать генетические модификации через зародышевую линию. В результате скрещивания хозяев, несущих введенные локусы человеческого иммуноглобулина, с животными, у которых имеется инактивированный эндогенный локус, получают животных, у которых продуцируется полностью ксеногенное антитело, например человеческое антитело.
В альтернативной стратегии по меньшей мере часть локусов тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина используют для прямой замены соответствующего эндогенного локуса иммуноглобулина путем гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках. Эта процедура приводит к одновременной инактивации и к замене эндогенного иммуноглобулина. В результате этого продуцируются химерные животные, у которых в зародышевые линии входят клетки, происходящие от эмбриональных стволовых клеток.
Так, например, у ксеногенного животного, не являющегося человеком, выделяют В-клеточный клон, который экспрессирует человеческое анти-Ш^-антитело, и подвергают иммортализации различными методами, известными специалистам. Такими В-клетками, которые могут быть непосредственно выделены из крови и из лимфоидных тканей животного, являются, но не ограничиваются ими, клетки селезенки, миндалин, лимфоузлов и костного мозга. Полученные иммортализованные В-клетки могут быть размножены и культивированы ш νίΙΐΌ с получением большого количества клинически ценного анти-йиШ^-антитела.
Альтернативно, гены, кодирующие иммуноглобулины, содержащие одну или несколько человеческих вариабельных областей, могут быть выделены и экспрессированы в клетках различных типов, включая, но не ограничиваясь ими, систему клеточных культур млекопитающих, в целях получения самих антител или их отдельных цепей, состоящих из одноцепочечных Εν-молекул.
Кроме того, весь набор полностью человеческих анти-ΙΕΝγ антител, продуцируемых у ксеногенного животного, не являющегося человеком, может быть скринирован для идентификации одного такого клона с оптимальными свойствами. Такими свойствами являются, например, аффинность связывания с человеческим белком ΙΕΝγ, стабильность взаимодействия, а также принадлежность к изотипу полностью человеческого анти-Ш^-антитела. Затем клоны, полученные от всего набора антител с нужными свойствами, используют в качестве источника нуклеотидных последовательностей, кодирующих нужные вариабельные области, для проведения последующих манипуляций в целях генерирования антител с такими свойствами, с применением в альтернативных клеточных системах стандартных методов рекомбинантных или трансгенных ДНК.
Указанная общая стратегия, которая была продемонстрирована в комбинации с продуцированием первых штаммов ХепоМоике™, была описана в 1994 г. См. 6гееп е! а1. №Ииге Сепебск 7: 13-21 (1994). Этот подход также обсуждается и описывается в следующих заявках на патент США: в заявке рег. № 07/466008, поданной 12 января 1990г., 07/610515, поданной 8 ноября 1990 г., 07/919297, поданной 24 июля 1992 г., 07/922649, поданной 30 июля 1992 г., 08/031801, поданной 15 марта 1993 г., 08/112848, поданной 27 августа 1993 г., 08/234145, поданной 28 апреля 1994 г., 08/376279, поданной 20 января 1995 г., 08/430938, поданной 27 апреля 1995 г., 08/464584, поданной 5 июня 1995 г., 08/464582, поданной 5 июня 1995 г., 08/463191, поданной 5 июня 1995 г., 08/462837, поданной 5 июня 1995 г., 08/486853, поданной 5 июня 1995 г., 08/486857, поданной 5 июня 1995 г., 08/486859, поданной 5 июня 1995 г., 08/462513, поданной 5 июня 1995 г., 08/724752, поданной 2 октября 1996 г. и 08/759620, поданной 3 декабря 1996 г.; в патентах США №№ 6162963, 6150584, 6114598, 6075181 и 5939598 и в японских патентных заявках №№ 3068180 В2, 3068506 В2 и 3068507 В2. См. также Мепбех е! а1. №Ииге Сепебск 15:146-156 (1997) и 6гееп
- 21 013118 апб 1акоЬоуЙ8 1. Ехр. Меб.: 188:483-495 (1998). См. также европейский патент № ЕР 0463151 В1, выданный и опубликованный 12 июня 1996 г., международную патентную заявку № \0 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 г., международную патентную заявку № XV0 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 г., заявку \0 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 г., и заявку \0 00/76310, опубликованную 21 декабря 2000 г.
В альтернативном методе другие исследователи использовали минилокусы. В этом подходе с использованием минилокусов был имитирован локус экзогенного Ιβ путем включения фрагментов (отдельных генов) локуса Ιβ. Таким образом, из одного или нескольких генов νΗ, одного или нескольких генов ЭН, одного или нескольких генов 1Н, константной μ-области и второй константной области (предпочтительно константной γ-области) была создана конструкция для введения животному. Этот метод описан в патенте США № 5545807, Зигаш е! а1. и в патентах США №№ 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5877397, 5874299 и 6255458, ЬопЬег§ & Кау, в патентах США №№ 5591669 и 6023010, Кптрепйй & Ветя, в патентах США №№ 5612205, 5721367 и 5789215, Вегпя е! а1., и в патенте США № 5643763, С1ю1 & Эипп, и в международных заявках на патент США 0епРйагт; в заявке рег. № 07/574748, поданной 29 августа 1990 г., заявке 07/575962, поданной 31 августа 1990 г., заявке 07/810279, поданной 17 декабря 1991 г., заявке 07/853408, поданной 18 марта 1992 г., заявке 07/904068, поданной 23 июня 1992 г., заявке 07/990860, поданной 16 декабря 1992 г., заявке 08/053131, поданной 26 апреля 1993 г., заявке 08/096762, поданной 22 июля 1993 г., заявке 08/155301, поданной 18 ноября 1993 г., заявке 08/161739, поданной 3 декабря 1993 г., заявке 08/165699, поданной 10 декабря 1993 г., и заявке 08/209741, поданной 9 марта 1994 г. См. также европатент № 0546073 В1, международные патентные заявки №№ \0 92/03918, \0 92/22645, \0 92/22647, \0 92/22670, \0 93/12227, \0 94/00569, \0 94/25585, \0 96/14436, \0 97/13852 и \0 98/24884, и патент США № 5981175. См. также публикации Τау1о^ е! а1., 1992, Сйеп е! а1., 1993, ^аИ^п е! а1., 1993, С1ю1 е! а1., 1993, ЬопЬегд е! а1. (1994), Τау1о^ е! а1. (1994) и ^аИ^п е! а1. (1995), ΡΪ81^ΐ16 е! а1. (1996).
Преимуществом метода минилокусов является быстрота генерирования и введения животным конструкций, включающих части Ιβ-локусов. Однако при этом указанный метод минилокусов имеет существенный недостаток, который заключается в том, что, теоретически, при введении животному небольшого числа генов ν, Ό и 1, у него вырабатывается недостаточное разнообразие антител. Действительно, этот недостаток обсуждается в опубликованных работах. В соответствии с этим размножение В-клеток и генерирование антител у животных, продуцированных методом минилокусов, были прекращены. Поэтому для достижения большего разнообразия и для восстановления репертуара антител у животных исследования, проводимые при разработке настоящего изобретения, были соответственно направлены на введение крупных фрагментов Ιβ-локусов.
Было продемонстрировано продуцирование человеческих антител у мышей, которым путем слияния микроклеток вводили большие сегменты хромосом или целые хромосомы. См. заявки на европатент № 773288 и 843961.
Вырабатывание человеческих антимышиных антител (НАМА) послужило стимулом к целой индустрии продуцирования химерных или как-либо иначе гуманизированных антител. Поскольку химерные антитела имеют человеческую константную область и иммуновариабельную область, то предполагается, что в данном случае будут продуцироваться некоторые ответы в виде вырабатывания человеческих антител против химерных антител (НАСА), в частности, при постоянном или многократном введении этого антитела. Таким образом, для устранения этих недостатков и/или предотвращения эффектов НАМА- или НАСА-ответов желательно получить полностью человеческие антитела против ΙΕ^.
Продуцирование антител с пониженной иммуногенностью также осуществляют методами гуманизации и представления с использованием соответствующих библиотек. Следует отметить, что мышиные антитела или антитела, происходящие от других видов, могут быть гуманизированы или приматизированы методами, хорошо известными специалистам. См., например, \т!ег и Натя, Iттиηо1 Шбау 14:43-46 (1993) и \\пд111 е! а1. Сгй, Веу1е^я т Iттиηо1. 12125-168 (1992). Представляющее интерес антитело может быть сконструировано методами рекомбинантных ДНК для замены СН1, СН2, СН3, шарнирных доменов и/или каркасных доменов соответствующими человеческими последовательностями (см. \0 92102190 и патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). Специалистам также известно применение кДНК Ιβ для конструирования химерных генов иммуноглобулина (Ьш е! а1. Ρ.ΚΑ.8. 84:3439 (1987) апб 1. ^типок 139:3521 (1987)). мРНК выделяют из гибридом или других клеток, продуцирующих антитело, и используют для продуцирования кДНК. Представляющая интерес кДНК может быть амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров (патенты США №№ 4683195 и 4683202). Альтернативно, для выделения представляющей интерес последовательности получают и скринируют библиотеку. Затем последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, присоединяют к последовательностям человеческой константной области. Описание последовательностей генов человеческих константных областей можно найти у Кэбата и др. (1991) Зесщепсея о£ Рго!етя о£ 1ттипо1одюа1 БИегеяк публикация МН № 91-3242. Гены человеческой С-области могут быть легко выделены из известных клонов. Изотип может
- 22 013118 быть выбран с учетом нужных эффекторных функций, таких как фиксация комплемента или антителозависимая клеточная цитотоксичность. Предпочтительными изотипами являются 1дС1, 1дС3 и 1дС4. Могут быть использованы человеческие константные области легкой цепи κ или λ. Затем химерное гуманизированное антитело экспрессируют стандартными методами.
Фрагменты антител, такие как Γν, Р(аЬ')2 и РаЬ, могут быть получены путем расщепления интактного белка, например протеазного или химического расщепления. Альтернативно, может быть сконструирован усеченный ген. Так, например, химерный ген, кодирующий часть Р(аЬ')2-фрагмента, должен включать последовательности ДНК, кодирующие СН1-домен и шарнирную область Н-цепи, за которыми следует кодон терминации трансляции, в результате чего может быть получена усеченная молекула.
Консенсусные последовательности Н- и Ь-1-областей могут быть использованы для конструирования олигонуклеотидов в целях их применения в качестве праймеров для введения нужных рестрикционных сайтов в 1-область и последующего присоединения сегментов У-области к сегментам человеческой С-области. кДНК С-области может быть модифицирована с помощью сайт-направленного мутагенеза для введения рестрикционного сайта в аналогичное положение человеческой последовательности.
Экспрессионными векторами являются плазмиды, ретровирусы, ΥАС, ЕВУ-эписомы и т.п. Подходящим вектором является вектор, кодирующий функционально полноразмерную последовательность СН- или СЬ-области человеческого иммуноглобулина с соответствующими рестрикционными сайтами, сконструированными в целях облегчения инсерции и экспрессии любой последовательности УН- или УЬ-31. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между донорным сайтом сплайсинга во встроенной 1-области и акцепторным сайтом сплайсинга, за которым находится человеческая С-область, а также в областях сплайсинга, которые присутствуют в человеческих СН-экзонах. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в природных участках хромосом, расположенных ниже кодирующих областей. Полученное химерное антитело может быть присоединено к любому сильному промотору, включая БТК ретровирусов, например ранний промотор 8У-40 (Окауата е! а1. Мо1. Се11. Вю. 3:280 (1983)), БТК вируса саркомы Рауса (Согтап е! а1. Р.КА.8. 79:6777 (1982)) и БТК вируса мышиного лейкоза Молони (Сгокксйеб1 е! а1. Се11 41:885 (1985)). Следует также отметить, что могут быть также использованы нативные промоторы 1д и т.п.
Кроме того, человеческие антитела или антитела других видов могут быть получены с применением технологии представлений, включая, но не ограничиваясь ими, фаговое представление, ретровирусное представление, рибосомное представление и другие хорошо известные методы, а затем полученные молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, такому как аффинное созревание, например, методами, хорошо известными специалистам. Апдй! & Натк, см. выше; Напек & Р1ис!йаи РЕА8 И8А 94:4937-4942 (1997), (рибосомное представление), Рагт1еу апб 8тйй Сепе 73:305-318 (1988) (фаговое представление), 8сой Т1В5 17:241-245 (1992), Стей1а е! а1. РХА8 И8А 87:6378-6382 (1990), Яикке1 е! а1. Хис1. Ас1бк Кекеагсй 21:1081-1085 (1993), НодапЬоот е! а1. 1ттипо1. Ке\ае\ук 130:43-68 (1992), Сй1ктее11 апб МсСаГГейу Т1ВТЕСН; 10:80-8А (1992), и патент США 5733743. Если технологии представления применяются для продуцирования антител, которые не являются человеческими, то такие антитела могут быть гуманизированы как описано выше.
С применением таких технологий могут быть генерированы антитела против 1РХуэкспрессирующих клеток, против самих 1РХу, против некоторых форм 1РХу, их эпитопов или пептидов, и экспрессирующих их библиотек (см., например, патент США 5703057), которые затем могут быть скринированы на вышеуказанные активности, как описано выше.
Разработка и получение других терапевтических средств.
В соответствии с настоящим изобретением и исходя из активности антител против 1РХу, которые были продуцированы и охарактеризованы в настоящей заявке, помимо способов с использованием описанных молекул антител, могут быть легко разработаны и другие терапевтические способы. Такими способами являются, но не ограничиваются ими, улучшенные терапевтические методы с применением антител, таких как биспецифические антитела, иммунотоксины и радиоактивно меченные терапевтические средства, методы получения пептидных терапевтических средств, методы генотерапии, а в частности, методы с применением телец включения, антисмысловых терапевтических молекул и малых молекул.
Так, например, что касается биспецифических антител, то могут быть получены биспецифические антитела, которые включают (1) два антитела, одно из которых обладает специфичностью к 1РХу, а другое обладает специфичностью ко второй молекуле, где указанные два антитела являются конъюгированными, (ίί) одно антитело, которое имеет одну цепь, специфичную к 1РХу, и вторую цепь, специфичную ко второй молекуле, или (ίίί) одноцепочечное антитело, которое обладает специфичностью к 1РХу и к другой молекуле. Такие биспецифические антитела получают методами, хорошо известными специалистам; так, например, получение антител по пунктам (1) и (ίί) описано, например, Рапдег е! а1. 1ттипо1 Ме!йобк 4:72-81 (1994) и Апдй! апб Натк, см. выше, а получение антитела по пункту (ίίί) описано, например, Тгаипескег е! а1. 1п!. 1. Сапсег (8ирр1.) 7:51-52 (1992).
Что касается иммунотоксинов, то путем модификации методами, хорошо известными специалистам, могут быть получены антитела, которые действуют как иммунотоксины. См., например, У1!е!!а
- 23 013118
1ттипо1 Тобау 14:252 (1993). См. также патент США № 5194594. Что касается радиоактивно меченных антител, то такие модифицированные антитела могут быть легко получены методами, хорошо известными специалистам. См., например, ЕнщНапк е! а1. в Сапсег СйетоШетару апб Вю!йетару 655-686 (26 ебШоп, Сйакпет апб Ьопдо, ебк., ЫрршсоИ Вауеп (1996)). См. также патенты США № 4681581, 4735210, 5101827, 5102990 (КЕ 35500), 5648471 и 5697902. Каждый из иммунотоксинов и каждая из радиоактивно меченных молекул, вероятно, будут разрушать клетки, экспрессирующие ΙΕΝγ, а в частности клетки, для которых антитела согласно изобретению являются эффективными.
Что касается генерирования терапевтических пептидов, то с использованием информации о структуре молекул ΙΕΝγ и антител против этих молекул, таких как антитела согласно изобретению, или с применением скрининга пептидных библиотек могут быть получены терапевтические пептиды против ΙΕΝγ. Получение и скрининг пептидных терапевтических средств обсуждается в публикациях НоидЫеп е! а1. Вю1ес1шк.|иек 13:412-421 (1992), НоидЫеп ΡΝΑ8 И8А 82:5131-5135 (1985), Рша11а е! а1. Вю1ес1шк.|иек 13:901-905 (1992), В1аке апб ЬйИ-Эаущ ВюСопщда!е С1ет. 3:510-513 (1992). Иммунотоксины и радиоактивно меченные молекулы могут быть также получены способом, аналогичным способу получения пептидных молекул, обсуждаемых выше для получения антител. Если предположить, что молекула ΙΕΝγ (или ее форма, такая как вариант сплайсинга или альтернативная форма) является функционально активной при данном заболевании, то может быть также сконструирован ген и его антисмысловые терапевтические последовательности с применением стандартных методов. Такие методы могут быть осуществлены для модуляции функции ΙΕΝγ. В соответствии с этим, с помощью антител согласно изобретению могут быть легко разработаны и применены функциональные анализы, связанные с применением этих антител. Протоколы и стратегия получения антисмысловых терапевтических последовательностей подробно обсуждаются в международной патентной заявке № АО 94/29444. Протоколы и стратегии проведения генотерапии хорошо известны специалистам. Однако, в частности, было подтверждено, что особенно предпочтительными являются методы генотерапии, включающие использование телец включения. См., например, С1еп е! а1. Нитап Сепе Тйетару 5:595-601 (1994) и Магаксо Сепе Тйетару 4:11-15 (1997). Общие протоколы и обсуждение методов генотерапии можно также найти в международной патентной заявке № АО 97/38137.
Информация о структуре молекулы ΙΕΝγ и ее взаимодействиях с другими молекулами согласно изобретению, такими как антитела согласно изобретению и т.п., может быть использована для рациональной разработки других терапевтических методов. В этой связи, рациональные методы разработки лекарственных средств, такие как рентгеновская кристаллография, компьютерное (или с применением компьютера) молекулярное моделирование (САММ), установление количественной или качественной взаимосвязи структура-активность (О8АК). и аналогичные методы могут быть направлены на обнаружение новых лекарственных средств. Рациональный план исследований позволяет предсказывать структуры белков или синтетических молекул, способных взаимодействовать с данной молекулой или с ее конкретными формами, которые могут быть использованы для модификации или модуляции активности ΙΕΝγ. Такие структуры могут быть химически синтезированы или экспрессированы в биологических системах. Такой подход описан в публикации Саркеу е! а1. Сепебса11у Епдшеетеб Нитап Тйегареибс Итадк (8!оск!оп Ргекк, ΝΥ (1988)). Кроме того, могут быть сконструированы и синтезированы комбинаторные библиотеки, и такие библиотеки могут быть использованы в программах скрининга, таких как высокоэффективный скрининг.
Терапевтическое введение и композиции.
Следует отметить, что терапевтические средства согласно изобретению могут быть введены вместе с подходящими носителями, наполнителями и другими средствами, включенными в данные препараты для улучшения их переноса и доставки, и повышения толерантности и т.п. Химикам-фармацевтам известны различные фармацевтические препараты, которые можно найти в известном реестре лекарственных средств: Ветшд!оп'к Рйагтасеи11са1 ЗОепсек (15111 еб, Маск РиЫЫппд Сотрапу, Еак!оп, РА (1975)), а в частности, в гл. 87, В1аид, Зеутоиг. Такими препаратами являются, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, везикулы, содержащие липиды (катионогенные или анионогенные) (такие как липофектин™), ДНК-конъюгаты, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии типа масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсионный карбовакс (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Для лечения и терапии согласно изобретению могут быть использованы любые вышеупомянутые смеси, при условии, что активный ингредиент в данной композиции не будет инактивироваться, и что данная композиция будет физиологически совместимой и будет хорошо переноситься при выбранном способе введения. См. также публикации Ва1бпск Р. Рйагтасеи!юа1 ехс1р1еп! беуе1ортеп!: !1е пееб кот ртес11шса1 дшбапсе. Кеди1. Тохюо1. Р1агтасо1. 32(2):210-8 (2000), Аапд А. ЬуорЫН/абоп апб беуе1ортеп! ок койб рго!еш Рйаттасеи!1са1к. Ιπί. 1. Рйатт. 203(1-2): 1-60 (2000), Сйаттап ΑΝ Ь1р1бк, НрорЫНс бгидк, апб ога1 бгид бекуету-коте етегдшд сопсер!к. Е Рйатт. 8ск 89(8):967-78 (2000), Ро\ге11 е! а1. Сотрепбшт ок ехс1р1еп!к ког рагеп!ега1 когти1а!юпк РОА Е Рйагт. 8ск Тес1шо1. 52:238-311 (1998) и указанную в них дополнительную информацию, относящуюся к лекарственным препаратам, наполнителям и носителям, хорошо известным химикам-фармацевтам.
- 24 013118
Терапевтические препараты согласно изобретению, включающие анти-НШЕШ-антитела согласно изобретению, используются для лечения или ослабления симптомов, ассоциированных с иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство.
Так, например, введение анти-НШЕЮ-антитела индивидууму, страдающему болезнью Крона (БК), может воздействовать непосредственно на клетки, вызывающие данное заболевание, и, тем самым, обеспечивать быстрый эффект с минимальной супрессией иммунной системы. Введение анти-ЬиШ^антитела индивидууму, страдающему системной красной волчанкой, является другим медицинским показанием, которое позволяет модифицировать иммунные клетки, ответственные за развитие этого заболевания. Введение анти-НШЕШ-антитела. полноразмерного человеческого белка индивидууму, страдающему псориазом, позволяет избежать необходимости лечения пациентов более агрессивными лекарственными средствами (например, метотрексатом), которые дают хорошо известные нежелательные побочные эффекты (например, поражение печени). Введение анти-НШЕШ-антитела индивидууму, страдающему ревматоидным артритом, является другим медицинским показанием, которое позволяет модулировать последующее продуцирование и осуществление функции ΤΜ-опосредуемого ответа, индуцирующего данным заболеванием.
Аутоиммунными заболеваниями являются, например, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, который представляет собой вирусное заболевание с аутоиммунным компонентом), гнездная аллопеция, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЛПС), аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (АТП), болезнь Бехчета, кардиомиопатия, кишечная спру, герпетиформный дерматит; синдром хронической усталости, ассоциированный с расстройством иммунной системы ^ΡΙΌδ), хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДПН), рубцовый пемфигоид, болезнь холодовых агглютининов, СВΕδΤ-синдром, болезнь Крона, болезнь Дегоса, ювенильный дерматомиозит, дискоидная волчанка, первичная смешанная криоглобулинемия, фибромиалгия-фибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический фиброз легких, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), ^Л-нефропатия, инсулинзависимый сахарный диабет, ювенильный хронический артрит, (болезнь Стилла), ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительных тканей, рассеянный склероз, тяжелая миастения, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный биллиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, синдром Рейно, синдром Райтера, ревматическая лихорадка, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия (прогрессирующий системный склероз) (ПСС), также известный как системный склероз (СС)), синдром Шегрена, синдром негнущегося человека, системная красная волчанка, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, витилиго и гранулематоз Вегенера.
Воспалительными расстройствами являются, например, хронические и острые воспалительные расстройства. Примерами воспалительных расстройств являются болезнь Альцгеймера, астма, атопическая аллергия, аллергия, атеросклероз, бронхиальная астма, экзема, гломерулонефрит, реакция трансплантат против хозяина, гемолитическая анемия, остеоартрит, сепсис, инсульт, заболевания, вызываемые трансплантацией тканей и органов, васкулиты, диабетическая ретинопатия и поражение легких, индуцированное вентиляцией легких.
Анти-йиГЕ^-антитела модулируют иммунный ответ у индивидуума, например, у человека. Так, например, анти-1шIΕNγ-антитела. описанные в настоящей заявке, модулируют, например, снижают, ингибируют или предупреждают увеличение ΤΜ-опосредуемого иммунного ответа, такого как повышенный ΤΜ-опосредуемый иммунный ответ, ассоциированный с аутоиммунным или воспалительным расстройством, таким, например, как болезнь Крона, системная красная волчанка, псориаз, саркоидоз, ревматоидный артрит, васкулиты, атопический дерматит и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз. При повышенном ΤΜ-опосредуемом иммунном ответе ΤΗ1-цитокины, такие как ΙΕ-2, ΙΤ-3, Г№альфа (Τ№-α) и ^N7, присутствуют у индивидуума на уровне, превышающем уровень ΤН1-цитокинов у индивидуума, не страдающего заболеванием или расстройством, ассоциированным с повышенным иммунным ΤΜ-ответом. Для отнесения ΤΗ1 -опосредуемого иммунного ответа к категории повышенного ответа оценивают уровень продуцирования ΤΜ-цитокинов, например, путем измерения и оценки уровня секретируемых цитокинов с помощью Ε^IδΛ или другого анализа.
Описанные здесь анти-НШЕЮ-антитела используются для модуляции, например, ингибирования, снижения или предотвращения переключения класса на изотип Ι§Ο, такого как Ш^-индуцируемое переключение класса. Указанные анти-йиIΡNγ-антитела модулируют, например, ингибируют, предотвращают или снижают Τ111-опосредуемый ответ и, тем самым, подавляют Ш^-индуцированное переключение класса.
В одном из вариантов изобретения композиции анти-1шIΕNγ-антител. используемые для лечения иммунного расстройства, вводят в комбинации с любыми различными антицитокиновыми или антихе- 25 013118 мокиновыми средствами. Подходящие антицитокиновые или антихемокиновые реагенты распознают, например, цитокины, такие как интерлейкин-1 (1Ь-1), 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-15, 1Ь-17, 1Ь-18, 1Ь20, 1Ь-21, 1Ь-22, 1Ь-23, 1Ь-27 и 1Ь-31, и/или хемокины, такие как М1Р1-а, М1Р1-в, ΚΑΝΙΈ8, МСР1, 1Р-10, 1ТАС, М1С, 8ΌΕ и фракталкин.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения или ослабления симптомов, ассоциированных с иммунным расстройством. Так, например, композиции согласно изобретению используют для лечения или ослабления симптомов любого из описанных здесь аутоиммунных заболеваний и воспалительных расстройств. Симптомами, ассоциированными с иммунными расстройствами, являются, например, воспаление, высокая температура, потеря аппетита, потеря веса, абдоминальные симптомы, например, боли в области брюшины, диарея или запор, боли в суставах или головные боли (артралгия), усталость, сыпь, анемия, сильная чувствительность к холоду (синдром Рейно), мышечная слабость, мышечная усталость, изменения кожного или тканевого тонуса, одышка или другие патологические формы дыхания, боли в области грудной клетки или сокращение мышц грудной клетки, нарушение частоты сердечных сокращений (например, увеличение или снижение частоты сердечных сокращений), светочувствительность, неясность зрения или другие нарушения зрения, и снижение функции органов.
Терапевтические композиции анти-1ш1Е№/-антител вводят индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство. Наличие у индивидуума аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства определяют методами, известными специалистам. Так, например, наличие у индивидуума аутоиммунного заболевания, такого как болезнь Крона, волчанка или псориаз, определяют с помощью любых различных клинических и/или лабораторных тестов, таких как физическое обследование, рентгенологическое исследование и анализ крови, мочи и кала для оценки иммунного статуса. Так, например, пациентов, страдающих волчанкой, выявляют, например, с помощью теста на антиядерные антитела (АЯА), позволяющего определить наличие в крови пациента аутоантител против клеточных ядер. Пациентов, страдающих болезнью Крона, выявляют, например, путем исследования верхних отделов желудочно-кишечного тракта и/или колоноскопии, например, для исследования тонкой и толстой кишки соответственно. Пациентов, страдающих псориазом, выявляют, например, путем исследования ткани, взятой из пораженных участков кожи, под микроскопом, а пациентов, страдающих ревматоидным артритом, выявляют, например, с помощью анализов крови и/или рентгеновского анализа или других визуализирующих исследований.
Введение анти-1ш1Е№/-антитела индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, осуществляют в том случае, если достигается любой из различных лабораторных или клинических результатов. Так, например, введение анти1ш1Е№/-антитела индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, считается успешным, если один или несколько из симптомов, ассоциированных с указанным расстройством, ослабляется, подавляется, ингибируется или не прогрессирует, то есть не переходит в более тяжелую форму. Введение анти-1ш1Е№/-антитела индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, считается успешным, если, например, наблюдается ремиссия аутоиммунного расстройства, либо это расстройство не прогрессирует, то есть не переходит в более тяжелую форму.
Диагностические и профилактические композиции.
Полностью человеческие анти-ΙΕΝγ МАЬ согласно изобретению используют для получения диагностических и профилактических препаратов. В одном из вариантов изобретения анти-1ш1Е№/ МАЬ согласно изобретению вводят пациентам, подверженным риску развития у них одного из вышеупомянутых аутоиммунных заболеваний. Предрасположенность пациента к одному или нескольким вышеупомянутым аутоиммунным заболеваниям может быть определена с использованием генотипических, серологических или биохимических маркеров.
В другом варианте изобретения анти-НиГЕМу-антитело вводят человеку, у которого были диагностированы одно или несколько вышеупомянутых аутоиммунных заболеваний. После установления диагноза пациенту вводят анти-1ш1Е№/-антитело для ослабления или предотвращения развития у него аутоиммунного заболевания.
Антитела согласно изобретению могут быть также использованы для детекции ΙΕΝγ в образцах, взятых у пациента, то есть они могут быть использованы в качестве диагностических средств. Так, например, анти-1ш1Е№/-антитела согласно изобретению используют в ш νίΐΐΌ-анализах, например ЕЬ18А, для детекции уровней ΙΕΝγ в образце, взятом у пациента.
В одном из вариантов изобретения анти-1ш1Е№/-антитело согласно изобретению иммобилизуют на твердом носителе (например, на лунке(ах) микротитрационного планшета).
Иммобилизованное антитело служит в качестве антитела для захвата любого ΙΕΝγ, который может присутствовать в тест-образце. Перед контактированием иммобилизованного антитела с образцом, взятым у пациента, твердый носитель промывают и обрабатывают блокирующим агентом, таким как белок норки или альбумин для предупреждения неспецифической адсорбции аналита.
Затем лунки обрабатывают тест-образцом, который предположительно содержит антиген, или рас
- 26 013118 твором, содержащим стандартное количество антигена. Таким образцом является, например, проба сыворотки, взятая у индивидуума с подозрением на наличие у него определенных уровней циркулирующего антигена, которые рассматриваются как диагностические индикаторы данной патологии. После промывки тест-образца или стандарта твердый носитель обрабатывают вторым антителом, которое является детектируемо меченным. Указанное меченое второе антитело служит в качестве детектирующего антитела. Затем измеряют уровень детектируемой метки и определяют концентрацию антигена ΙΡΝγ в тест-образце путем сравнения со стандартной кривой, построенной по данным, полученным для стандартных образцов.
Следует отметить, что на основании результатов, полученных с использованием анти-1ш1Е№/антител согласно изобретению в диагностическом анализе ίη νίίτο, может быть определена стадия заболевания (например, аутоиммунного или воспалительного расстройства) индивидуума, исходя из уровней экспрессии антигена ΙΡΝγ. Для этого у индивидуумов, у которых проводят диагностику, берут пробы крови на различных стадиях течения заболевания и/или в различные периоды терапевтического лечения заболевания. С использованием набора образцов, которые дают статистически значимые результаты для каждой стадии течения заболевания или терапии, определяют интервалы концентраций антигена, которые могут рассматриваться как характерные для каждой стадии заболевания.
Все цитируемые здесь публикации и патентные документы вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая такая публикация или документ были конкретно и отдельно введены в настоящее описание посредством ссылки. При этом подразумевается, что цитируемые здесь публикации и патентные документы не относятся к предмету изобретения, и предполагается, что они не входят в объем настоящего изобретения и не датированы таким же числом, как и настоящее изобретение. Настоящее изобретение было представлено здесь в виде описания заявки, однако, для специалистов очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено в различных вариантах и что представленное здесь описание и нижеследующие примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема изобретения, определенного в представленной ниже формуле изобретения.
Примеры
Нижеследующие примеры, включающие описание проводимых экспериментов и полученных результатов, приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.
Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка человеческого интерферона-γ.
Клонирование.
Последовательность, соответствующую зрелой последовательности человеческого интерферонагамма (ΙΙΡΝγ, ΙιιιΙΕΝγ). амплифицировали из человеческой кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических олигонуклеотидов. Продукт амплификации подвергали гель-очистке и клонировали в экспрессионный вектор рЕТ41с (Νονα^οη, Лап Э1едо СА). Затем этот вектор модифицировали с введением метки АуЦад™ (Аνίό,ίίν, Όοηνβτ С0) и окта-гистидиновой метки в Сконец ΙιΙΡΝγ для биотинилирования белка ίη νίνο и очистки с помощью 1МАС (аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла).
Экспрессия.
Клетки ВЬ21 Е.со11 подвергали котрансформации вектором ρЕΤ41с-ЫΡNγ и вектором рАСУС184В1гА, кодирующим фермент В1гА, необходимый для ίη νίνο биотинилирования последовательности А\з1ад™. Моноколонии, резистентные к канамицину (50 мкг/мл) и к хлорамфениколу (10 мкг/мл), отбирали и использовали для инокуляции исходной культуры в среде ЬВ (Καη, 50 мкг/мл, Ст, 10 мкг/мл), а затем культивировали в течение ночи при 37°С.
На следующий день культуру использовали для инокуляции (разведение 1: 100) 400 мл культуры ЬВ (Καη, 50 мкг/мл; Ст, 10 мкг/мл), в которую было добавлено 50 мкМ биотина. Затем культуру выращивали при 37°С со встряхиванием (240 об./мин) до достижения 0Ό600=0,6. На этой стадии добавляли изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид (1РТС) до конечной концентрации 1 мМ, и эту культуру инкубировали еще в течение 3 ч в тех же условиях. Клетки центрифугировали при 4000 об./мин в течение 20 мин и осадок замораживали при -20°С. В этих условиях, по существу, все 1ΙΡΝγ были нерастворимыми и находились в тельцах включения.
Очистка.
Бактериальные штаммы оттаивали и ресуспендировали в 8 мл реагента ВцдЬи^ет, содержащего 8 мкл бензоназы (Nονадеη), и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали в течение 30 мин при 15000хд при 4°С. Осадок, содержащий тельца включения, ресуспендировали в 7 мл буфера для солюбилизации (50 мМ трис-НС1, рН 7,4, 300 мМ №С1, 20 мМ имидазол, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, 6М гуанидин-НС1). Ресуспендированный материал центрифугировали при 4°С в течение 30 мин при 15000хд.
Две 5-миллилитровые колонки с хелатообразующим агентом Н1Тгар (АтегаБат, ВисктдЬаткЫге, Е^^пй), загруженные №Л04 и уравновешенные буфером для солюбилизации, подсоединяли в соответствии с инструкциями производителей. После стадии центрифугирования супернатант фильтровали на
- 27 013118
0,45 мкм-мембране и наносили на колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/мин. Затем колонки помещали в первую хроматографическую систему АКТА для рефолдинга белка и его элюирования. Иммобилизованный белок промывали 35 мл буфера для солюбилизации при скорости 1 мл/мин. Затем на колонку наносили линейный градиент буфера для солюбилизации с возрастающими концентрациями буфера для рефолдинга (50 мМ трис-НС1, рН 7,4, 300 мМ №1С1) со скоростью 1 мл/мин в течение 1 ч до тех пор, пока объем буфера для рефолдинга не достигал 100%. После этого колонку снова промывали 25 мл буфера для рефолдинга. Затем белок, подвергнутый рефолдингу, элюировали с колонки элюирующим буфером (50 мМ трис-НС1, 300 мМ №С1, 400 мМ имидазола). Фракции, содержащие белок, объединяли и обессоливали на колонках РЭ10 (Атегкйат), уравновешенных РВ8. Затем обессоленный белок разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.
Пример 2. Экспрессия интерферона-γ на клеточной поверхности.
Клетки яичника китайского хомячка (СНО) (взятые из АТСС) стабильно трансфицировали с-тусмеченной кДНК человеческого ^Νγ. кДНК субклонировали в плазмиды ρί'ΌΝΛ 3.1 (Г^йгодеи, Саг1кйаФ СА), содержащие гены резистентности к неомицину. Трансфектанты отбирали с использованием этого антибиотика, а затем проводили клеточный сортинг с помощью проточной цитометрии с использованием анти-6хН1к-антитела (81дта). Экспрессию человеческого ^Νγ на клеточной поверхности подтверждали с помощью проточной цитометрии с использованием анти-ГР^ тАй (клон В27, Вес!ои П1скшкои, Ргаикйи Ьакек ΝΙ).
Пример 3. Скрининг библиотек человеческих ксйх.
Общие процедуры конструирования и обработки библиотек человеческих ксйх описаны в публикации Уаидйаи е! а1. (Ν!. В1о!есй. 1996, 14:309-314), которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Скрининг библиотек человеческих ксйх против ΜΕΝγ проводили в соответствии с нижеследующей процедурой.
Отбор в жидкой фазе.
Аликвоты ксРу-фаговых библиотек (1012 б.о.е.), полученных от фирмы СатйпФде АиййоФу Тесйио1оду (СатйпФде, ИК), блокировали РВ8, содержащим 3% (мас./об.) сепарированного молока, в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. После этого блокированный фаг отделяли от покрытых стрептавидином магнитных сфер (Пуиа1 М-280) в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. Затем выделенный фаг инкубировали с ш νί\Ό биотинилированным ΜΕΝγ (100 нМ) в течение 2 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. Сферы собирали с использованием магнитного стенда, а затем четыре раза промывали РВ8/0,1% твин 20 и 3 раза - РВ8. Затем сферы непосредственно добавляли к 10 мл клеток Т01 в фазе экспоненциального роста и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с медленным перемешиванием (100 об./мин). Аликвоту инфицированных клеток Т01 серийно разводили для титрования продукта отбора. Остальные инфицированные клетки Т01 центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин, ресуспендировали в 0,5 мл 2хТУ-А0 (в среде 2хТУ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы) и наносили на планшеты с агаром 2хТУА0 Вюаккау. После инкубирования в течение ночи при 30°С в планшеты добавляли 10 мл 2хТУА0, и клетки соскабливали с поверхности и переносили в 50-миллилитровую полипропиленовую пробирку. К клеточной суспензии добавляли среду 2хТУА0, содержащую 50% глицерин, до конечной концентрации глицерина 17%. Аликвоты продукта цикла отбора хранили при -80°С.
Отбор на клеточной поверхности.
Аликвоты ксРх-фаговых библиотек (1012 б.о.е.), полученных от фирмы СатйпФде АиййоФу Тесйио1оду (СатйпФде, ИК), блокировали РВ8, содержащим 3% (мас./об.) сепарированное молоко, в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. После этого блокированный фаг отделяли от клеток СНО, трансфицированных пустым вектором рО1кр1ау (в колбах Т75 при конфлюэнтности 80%), в течение 1 ч при 37°С/5% СО2 и подвергали предварительному блокированию РВ8, содержащим 2% (мас./об.) сепарированное молоко. Выделенный фаг инкубировали с клетками СН0-рП1кр1ау-йГР^ в течение 1 ч при комнатной температуре с легким помешиванием. Затем клетки десять раз промывали РВ8. Связанный фаг элюировали путем прямого добавления в колбу Т75 10 мл клеток Т01 в фазе экспоненциального роста и инкубировали при 37°С в течение 1 ч при медленном перемешивании. Аликвоту инфицированных клеток Т01 серийно разводили для титрования продукта отбора. Инфицированные клетки Т01 центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин, ресуспендировали в 0,5 мл 2хТУ-А0 (в среде 2хТУ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы) и наносили на планшеты с агаром 2хТУА0 Вюаккау. После инкубирования в течение ночи при 30°С в планшеты добавляли 10 мл 2хТУА0 и клетки соскабливали с поверхности и переносили в 50-миллилитровую полипропиленовую пробирку. К клеточной суспензии добавляли среду 2хТУА0, содержащую 50% глицерин, до конечной концентрации глицерина 17%. Аликвоты продукта цикла отбора хранили при -80°С.
Спасение фага.
100 мкл клеточной суспензии, полученной в предыдущих циклах отбора, добавляли к 20 мл 2хТУА0 и культивировали при 37°С с перемешиванием (240 об./мин) до тех пор, пока ΟΌ600 не достигал 0,3-0,5. Затем культуру суперинфицировали 3,3х1010 хелперного фага МК13К07 и инкубировали в тече
- 28 013118 ние 1 ч при 37°С (150 об./мин). После этого среду заменяли путем центрифугирования культуры при 2000 об./мин в течение 10 мин, а затем среду удаляли и осадок ресуспендировали в 20 мл 2хТΥ-АК (100 мкг/мл ампициллина; 50 мкг/мл канамицина). Культуру выращивали в течение ночи при 30°С (240 об./мин).
Спасение моноклонального фага для анализа ЕЫ8А.
Одиночные клоны высевали в микротитрационный планшет, содержащий 150 мкл среды 2xТΥАС (2% глюкозы) на лунку, и культивировали при 37°С (100-120 об./мин) в течение 5-6 ч. В каждую лунку добавляли хелперный фаг М13К07 до получения множественности заражения (т.о.1.) 10 (то есть 10 фагов на каждую клетку в культуре) и инкубировали при 37°С (100 об./мин) в течение 1 ч. После культивирования планшеты центрифугировали при 3200 об./мин в течение 10 мин. Супернатант осторожно удаляли и клетки ресуспендировали в 150 мкл среды 2xТΥАК, а затем культивировали в течение ночи при 30°С (120 об./мин). Для проведения ЕЫ8А фаг блокировали добавлением 150 мкл 2хРВ8, содержащего 5% сепарированное сухое молоко, а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин и супернатант, содержащий фаг, использовали для ЕЫ8А.
ЕЫ8А фага.
ЕЫ8А-планшеты (Мах1когЬ, NυNС) сенсибилизировали в течение ночи 2 мкг/мл ΜΕΝ',' в РВ8. Контрольные планшеты сенсибилизировали 2 мкг/мл В8А. Затем планшеты блокировали 3% сепарированным молоком/РВ8 при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты 3 раза промывали РВ 8/0,05% твин 20, после чего переносили в супернатанты, содержащие предварительно блокированный фаг, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты 3 раза промывали РВ8/0,05% твин 20. В каждую лунку добавляли 50 мкл 3% сепарированного молока/РВ8, содержащего ПХ-конъюгированное анти-М13-антитело (Атегкйат, разведенное 1:10000). После инкубирования при комнатной температуре в течение 1 ч планшеты 5 раз промывали РВ8/0,05% твином 20. Затем ЕЫ8А-планшеты проявляли путем добавления 50 мкл ТМВ (8щта) и реакцию завершали добавлением 50 мкл 2н. Н28О4. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм.
Секвенирование фагового клона.
Одиночные клоны высевали в микротитрационный планшет, содержащий 15 мкл среды 2хТΥАС (2% глюкозы) на лунку, и культивировали при 30°С (120 об./мин) в течение ночи. На следующий день 5 мкл культуры переносили в другой планшет, содержащий 45 мкл ЕН2О, и перемешивали. Затем планшеты замораживали при -20°С. После оттаивания 1 мкл этой суспензии использовали для ПЦРамплификации в соответствии со стандартными ПЦР-протоколами с использованием праймера, специфичного для рСАЭТАВ6: тускед, 5'-СТСТТСТСАСАТСАСТТТТТС-3' (81 А) ГО ΝΟ: 100) и депе31еаЕег, 5'-ТТАТТАТТСССААТТССТТТАСТТСТТССТ-3' ( 8ЕС) ГО ΝΟ: 101).
Продукты ПЦР-реакции очищали в 96-луночном планшете с использованием системы МопЦще РСРц96 (М1Шроге). 5 мкл элюированной ДНК секвенировали с использованием праймеров тускед и депе31еаЕег.
Получение периплазматического 8сРу для проведения тестов на функциональность.
Отдельные клоны инокулировали в микротитрационном планшете с глубокими лунками, содержащими 0,9 мл среды 2хТΥАС (0,1% глюкозы) на лунку, и культивировали при 37°С в течение 5-6 ч (250 об./мин). Затем добавляли 100 мкл на лунку 0,2 мМ ЕРТС в среде 2хТΥ до конечной концентрации 0,02 мМ ГОТО. Планшеты инкубировали в течение ночи при 30°С со встряхиванием при 250 об./мин. Планшеты с глубокими лунками центрифугировали при 2500 об./мин в течение 10 мин и супернатант осторожно удаляли. Осадок ресуспендировали в 150 мкл буфера ТЕ8 (50 мМ трис/НС1 (рН 8), 1 мМ ЕЭТА (рН 8), 20% сахарозы, с добавлением полного набора ингибиторов протеазы, Восйе). Гипотонический шок индуцировали добавлением 150 мкл разведенного буфера ТЕ8 (1:5 разведение ТЕ8:вода) и смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем планшеты центрифугировали при 4000 об./мин в течение 10 мин для удаления клеток и дебриса. Затем супернатант осторожно переносили в другой микротитрационный планшет и выдерживали на льду для непосредственного тестирования в функциональных анализах или ЕЫ8А.
Крупномасштабная очистка ксРу.
Исходную культуру 1 мл 2хТΥАС инокулировали одной колонией, взятой из планшета с агаром 2хТΥАС со свежезасеянной штриховой культурой, и инкубировали со встряхиванием (240 об./мин) при 37°С в течение 5 ч. 0,9 мл этой культуры использовали для инокуляции 400 мл культуры той же самой среды и культивировали в течение ночи при 30°С при интенсивном перемешивании (300 об./мин).
На следующий день культуру индуцировали путем добавления 400 мкл 1М [РТС и инкубирование продолжали еще 3 ч. Клетки собирали путем центрифугирования при 5000 об./мин в течение 10 мин при 4°С. Осажденные клетки ресуспендировали в 10 мл охлажденного льдом буфера ТЕ8, в который были добавлены ингибиторы протеазы, как описано выше. Осмотический шок вызывали путем добавления 15 мл разведенного 1:5 буфера ТЕ8 и инкубирования в течение 1 ч на льду. Клетки центрифугировали при 10000 об./мин в течение 20 мин при 4°С для осаждения клеточного дебриса. Супернатант осторожно пе
- 29 013118 реносили в свежую пробирку. К этому супернатанту добавляли имидазол до конечной концентрации 10 мМ. В каждую пробирку добавляли 1 мл смолы Νί-ΝΤΑ (Р1адеп), уравновешенной в РВ8, и инкубировали на ротационном смесителе при 4°С (20 об./мин) в течение 1 ч.
Пробирки центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин и супернатант осторожно удаляли. Осажденную смолу ресуспендировали в 10 мл холодного (4°С) промывочного буфера 1 (50 мМ ИаН2РО4, 300 мМ ИаС1, 10 мМ имидазол, рН до 8,0). Полученную суспензию наносили на колонку Ро1ургер (Вюгаб). Для промывки колонки самотеком использовали 8 мл холодного промывочного буфера 2 (50 мМ ИаН2РО4, 3 00 мМ ИаС1, 20 мМ имидазол, рН до 8,0). ксРу элюировали с колонки с использованием 2 мл элюирующего буфера (50 мМ ИаН2РО4, 300 мМ ИаС1, 250 мМ имидазол, рН до 8,0). Фракции анализировали путем измерения оптической плотности при 280 нм, и фракции, содержащие белок, объединяли, а затем подвергали буферному обмену на обессоливающей колонке РЭ10 ^тега^ат), уравновешенной РВ8. ксРу в РВ8 анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и количественно оценивали путем измерения оптической плотности при 280 нм. Очищенные ксРу разделяли на аликвоты и хранили при -20°С и при 4°С.
Пример 4. Ингибирование ксРу-экстрактами экспрессии гена-репортера, индуцированной интерфероном-гамма.
Периплазматические ксРу-экстракты различных анти-ЬиГРИу-антител получали как описано выше. Для идентификации одноцепочечного вариабельного фрагмента (ксРу), блокирующего активность ГРИу, проводили высокоэффективный клеточный скрининг-анализ. Репортерный ген (люциферазы светляка), регулируемый ГРИу-индуцибельным промотором ОВР1, трансфицировали в человеческую клеточную линию меланомы, Ме67.8. В клеточную культуру одновременно добавляли ксРу и ГРИу. После 6часового инкубирования проводили анализ на ген-репортер люциферазы. ксРу, который, как было обнаружено, ингибировал индуцирование люциферазы светляка, сохраняли для дальнейшего подтверждения.
Несколько ксРу-экстрактов ингибировали ГРИу-индуцируемый ген-репортер в зависимости от дозы (фиг. 15). Для каждого ксРу-клона, название которого указано вверху в каждом столбце (по убывающей концентрации слева направо), были протестированы различные концентрации (2,7, 0,68, 0,17, 0,043 и 0,011 нМ). Проценты ингибирования каждым ксРу-экстрактом в указанных концентрациях представлены ниже в табл. 3.
Таблица 3
Проценты ингибирования ГРИу-индуцированной экспрессии гена-репортера периплазматическими ксРУ-эктрактами
[зсРу] нМ Аб Н8 А8 Ώ8 СЮ В4 В9 В9 А4 Е1 С9 С7 610 Ό6 Об С9 Ό3 Р8
2,7 82 80 85 60 63 63 62 68 36 43 56 75 47 82 73 52 69 64
0,68 92 75 86 60 50 49 53 32 1 68 67 73 44 73 66 12 55 64
0,17 100 65 87 40 53 21 56 3 0 38 58 24 0 31 25 0 36 48
0,043 87 26 65 10 34 5 0 0 0 10 33 38 0 11 0 0 28 0
0,011 0 0 13 0 19 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 20 0
Пример 5. ксРу-Ингибирование экспрессии МНС класса П, индуцированной интерфероном-у.
Для идентификации полностью человеческих антител ГдО или их фрагментов, способных блокировать экспрессию ГРИу-индуцированных молекул МНС класса ГГ, проводили проточный цитометрический анализ. После высевания клеток Ме67.8 в культуры добавляли 5 нг/мл рекомбинантного человеческого ГРИу в присутствии различных концентраций полностью человеческих моноклональных антителкандидатов против ГРИу. После культивирования в течение 48 ч клетки окрашивали флуоресцентно меченным антителом человеческого МНС класса И (ΗΕΑ-ΌΡ.) и анализировали на устройстве РЛС8Са1^Ьиг®. Таким образом, для каждого антитела-кандидата определяли ГС50 (то есть 50%-концентрацию, при которой происходит 50%-ное ингибирование ГРИу-индуцированной экспрессии МНС класса И).
Очищенный полностью человеческий ксРу получали, как описано выше в примере 1. Воздействие ксРу на ГРИу-индуцированную экспрессию молекул МНС класса П, присутствующих на клетках меланомы, оценивали с помощью описанного выше проточного цитометрического анализа. Указанные ксРу ингибировали ГРИу-индуцированную экспрессию МНС класса ГГ на клетках меланомы (фиг. 16, панели 112). Способность этих ксРу-клонов ингибировать ГРИу-индуцированную экспрессию молекул МНС И на клетках меланомы сравнивали с соответствующей способностью мышиного тΑЬ против человеческого ГРИу, обозначаемого здесь 16С3. ксРу-клоны (-) и мышиное тΑЬ против человеческого ГРИу, 16С3 (····) представлены на фиг. 16.
Пример 6. Превращение ксРу в формат ГдО.
Очищенный полностью человеческий ксРу получали, как описано выше в примере 1. Последовательности УН и Уъ отобранных ксРу амплифицировали с использованием специфических олигонуклео
- 30 013118 тидов, вводящих лидерную последовательность и рестрикционный НтбШ-сайт в 5'-конец. Ара1- или АугП-сайт вводили в 3'-конец последовательности тяжелой и легкой цепей соответственно. Амплифицированные ^-последовательности гидролизовали ферментами НшбШ/Ара! и клонировали в экспрессионный вектор рСои_датта1 (ΕΟΝΖΆ, Ваке1, 8\\йхег1аг1б). Амплифицированные V,-последовательности гидролизовали ферментами НтбШ/АугП и клонировали в экспрессионный вектор рСои_1атЬба2 (ΕΟΝΖΛ). Эти конструкции подтверждали путем секвенирования с последующей трансфекцией в клетки млекопитающих.
Последовательности кДНК V и VI, в их соответствующих экспрессионных векторах трансфицировали в клетки млекопитающих с использованием реагента для трансфекции Еидеие 6 (Воске, Ваке1, 8\νΕхеНаиб). Вкратце, собранные клетки культивировали в 6-луночных планшетах при концентрации 6х105 клеток на лунку в 2 мл культуральной среды, содержащей фетальную бычью сыворотку. Экспрессионные векторы, кодирующие последовательности-кандидаты ν4 И котрансфицировали в клетки с использованием реагента для трансфекции Еидеие 6 в соответствии с инструкциями производителя. На следующий день после трансфекции культуральную среду отсасывали, а затем в клетки добавляли 3 мл свежей бессывороточной среды и культивировали в течение трех дней при 37°С. После трехдневного культивирования супернатант собирали для очистки 1дС на колонках с С-белком.
Реконструированный полностью человеческий 1дС выделяли из бессывороточных супернатантов от трансфицированных клеток на колонках Еак! Е1о\т с С-белком - Сефарозой 4В (81дта, 8!. Ьошк, МО) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, супернатанты от трансфицированных клеток инкубировали в течение ночи при 4°С с буфером для связывания с 1дС 1ттииоРиге (С) (Р1егсе, ВоскГогб 1Б). Затем образцы пропускали через колонки Еак! Е1о\т с С-белком-Сефарозой 4В, и 1дС очищали с использованием элюирующего буфера. После этого элюированную 1дС-фракцию диализовали против РВ8, и содержание 1дС количественно оценивали путем определения оптической плотности при 280 нм. Чистоту и целостность 1дС подтверждали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.
Пример 7. Ингибирование индуцированной интерфероном-γ экспрессии МНС класса II реконструированным ксЕу.
ксЕу Реконструировали в формат 1дС, как описано выше. Воздействие 1дС-клонов на ΙΕΝγиндуцированную экспрессию молекул МНС класса ΙΙ, присутствующих на клетках меланомы, оценивали с помощью проточного цитометрического анализа, описанного выше в примере 2. Как показано на фиг. 17, на панелях 1-7, указанные ^С-клоны ингибировали ΙΕΝγ-индуцированную экспрессию МНС класса ΙΙ на клетках меланомы. Способность этих ^С-клонов ингибировать ΙΕΝγ-индуцированную экспрессию молекул МНС ΙΙ на клетках меланомы сравнивали с соответствующей способностью мышиного тАЬ против человеческого ΙΕΝγ, 16С3, и мышиного антитела против человеческого ΙΕΝγ МАВ285 В & Ό 8ук!етк. Также представлены графики для полноразмерных ^С-клонов (-х-), мышиных тАЬ против человеческого ΙΕΝγ 16С3 (-▲-) и мышиного МАВ285 против человеческого ΙΕΝγ, В&Э 8ук!етк, Ею. (Мшиеаро118, МЩ (-•-).
Величины ГС50 для этих ЦС-клонов представлены ниже в табл. 4.
Таблица 4
Анализ для определения Ιί.\0 полностью человеческих моноклональных анти-ΙΕΝγ антител
тАЬ ТдС Клеточный анализ на ингибирование МНС IX, 1С5о
16СЗ 100 пм
МАВ285 400 пМ
АС1.2КЗР2_Аб 41 лМ
АО14Е4Р1_В9 322 пМ
АС1.4К4Р2_С10 203 пМ
АС1·2Κ3Ρ2_ϋ8 708 пМ
АЫ .ЗКЗР5_Р8 1525 пМ
Αϋ1.3Κ3Ρ6_Ρ9 185 пМ
АЫ4В4Р2_(37 233 пМ
Пример 8. Обратная мутация клона анти-ЕШЕШ-антитела с восстановлением последовательности зародышевой линии.
В описанных здесь исследованиях нуклеотиды и аминокислотные остатки в последовательности нуклеиновой кислоты и в аминокислотной последовательности клона А6 были мутированы так, чтобы
- 31 013118 они соответствовали нуклеотидам или аминокислотным остаткам, присутствующим в последовательности зародышевой линии. Такой процесс называется здесь обратной мутацией.
Тяжелая цепь А6. Ген вариабельной области тяжелой цепи антитела А6 имеет 100%-ную гомологию с геном человеческой зародышевой линии ЭР-47 или 1СНУ3-23 (СепВапк Ассеккюп питЬег М99660). Область соединения тяжелой цепи иммуноглобулина (1СШ) А6 сравнивали с шестью человеческими функциональными областями 1СШ. Область 1СШ А6 была идентифицирована как 1СШ2 (табл. 5А, см. ниже), но она имела большую гомологию с 1СШ5-02 (табл. 5В, см. ниже). Поэтому исходная область 1СШ А6 была подвергнута мутации так, чтобы ее последовательность соответствовала последовательности 1СШ5-02, но только для последовательности, находящейся за пределами СЭЯ3. В табл. 5А и 5В мутированные нуклеотиды и аминокислотные остатки обозначены рамками, а области СЭЯ подчеркнуты.
Таблица 5А
Сравнение генов А6 и генов человеческого функционального 1СШ2 ^С^^ф^ТТССЗА§СЙСТООООСС<3§оеСАСССТОатСАС§СТСТС^М^ Аб (ЗЕЦ ю N0:109)
Н 5 (два и κο,ιιο)
СТАСТОСТАСТТСОАТСТСТОСООСССТСЗаСАСССТОСТСАСТОТСТССТСА 1СНД2 (8В0 Ιϋ МО; 111} у и γ р о I· иокатъутуз з (зва ю ю,цг) аж з
Таблица 5В
Сравнение генов А6 и генов человеческого функционального 1СШ5-02 ^^СТОаТТСОАССССТСЗСО<ЗССШзС@АСССТСКЭТСАССИТСТС^^ Аб (ЭВО ю НО: 113) § ирприсдстъутузз <зва ю »5ιμ>
АСААСТОСТТСОАССССТСООбССАСОСААСССТСОТСАССеТСТССТСА ΙΟΗΤ5-02 (два го ню; 115)
N И Р Р Р Ηβοατρντν 3 3 (два го мо.ие) .СРК 3
Легкая цепь А6. Ген вариабельной области λ иммуноглобулина (УЬ) антитела А6 принадлежит к подгруппе 1СЬУ6-57 или к подгруппе У1-22 (СепВапк Ассеккюп ЫитЬег Ζ73673). УЬ А6 имеет 7 мутаций по сравнению с 1СЬУ6-57, три из которых находятся в СЭЯ и четыре в каркасных областях (табл. 6, см. ниже). В табл. 6 мутированные нуклеотиды и аминокислотные остатки обозначены рамками, а области СЭЯ подчеркнуты.
Четырьмя мутациями в каркасных областях являются замена 8ег на А1а в каркасной области 2 в положении 43 по Кэбату; замена 8ег на ТЬг в каркасной области 3 в положении 72 по Кэбату; замена Ьук на С1и и ТЬг на А1а в каркасной области 3 в положениях 79 и 80 по Кэбату соответственно. Сначала были сделаны четыре отдельные мутации в каркасных областях, а затем сразу были сделаны обратные мутации так, чтобы они соответствовали остаткам последовательности человеческой зародышевой линии. Обратные мутации в этих четырех остатках с получением последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии, не оказывали какого-либо влияния на аффинность связывания антитела N1-0501, также называемого здесь А6 с обратной мутацией, с его антигеном-мишенью, по сравнению с антителом А6. Мутации вводили в последовательность УЬ А6 так, чтобы они соответствовали остаткам зародышевой линии в СЭЯ1 (замена А1а на Уа1) и СЭЯ2 (замена С1п на Агд), и было показано, что они не влияют на общую аффинность связывания анти-1ш1Р№,'антитела N1-0501 (антитела А6 с обратной мутацией) по сравнению с антителом А6.
Таблица 6 Сравнение генов А6 и человеческого функционального 1СНУ6-57 сок 1 [Й] сок 2
1ЩЛ6-57 ПЯЧЬТОРИ5У5ЕЗРеКТУТХЗСТКаЗС8зЯ8НУУй№ГООКРС8|8[р,ГТУ1¥ЕР1!|ВаР5СУР 60 ΜΡΜΒΤ0ΡΗ8ν5Ε5Ρ5ΚΓνΤΙ3αΤΒ53α3ΐ|ϊ?|3ίίΥν0ΗΎ00ΚΡ5^ΡΤΤνΐΤΒΡΪ^ΚΡ5ανΡ 60 ***************************************************** ; ****** |7Э,80| СПЯ 3 чммм»ий1В1,У6-57 ΡΚΡ563ΙΡ888Ιί|51Α8ίΤΙ5αΐ^(Τ|ΕΡΚΑΡΐΥ0081ίΙ1[^8Κ--------------98 (ВЕС) Ю К0;117)
РКРдО81Р383МЙА8ЬТГ5<яИЕРВАРХТСдВ,а1|[в|5НКИМРОаСТКЬТУЬС 112 (ЗЕа ΙΟ .
ЫО:118| *** *********!********> « ************ г**
Полноразмерные последовательности тяжелых и легких цепей антитела N1-0501 представлены на фиг. 1А-1Э. Нуклеотиды и аминокислотные остатки, которые были подвергнуты обратной мутации с продуцированием антитела N1-0501 (т.е. нуклеотиды и аминокислотные остатки, которые отличались от нуклеотидов и аминокислотных остатков в результате замены в исходной последовательности А6), под
- 32 013118 черкнуты и выделены курсивом на фиг. 1А и 1 С.
Пример 9. Аффинность и кинетика связывания анти-йиШ^-антитела.
Аффинность и кинетику связывания анти-йиШ^-антитела ΝΙ-0501 оценивали на устройстве В1асоге 2000 (В1асоге АВ, Иррка1а, 8теебеп). 200 единиц отклика (ВИ) ΝΙ-0501 были иммобилизованы на чипе С1 В1асоге с использованием химических реагентов ЕЭС/ΝΗδ. Уровень связывания определяли путем пропускания ΙιΙΕΝγ (В&О 8ук!етк) в буфере НВ8-ЕР при концентрациях 200-1 нм. Скорость потока составляла 100 мкл/мин, а температура была установлена на 25°С. Эти данные соответствовали 1:1 лангмюровской модели; и были определены величины Коп, Ко££ и Кс (фиг. 18).
Пример 10. Активность анти-йиШ^-антитела.
Активность анти-йиШ^-антитела ΝΙ-0501 сравнивали с активностью антитела, продуцированного клоном А6 (то есть анти-йиШ^-антителом А6). В этом исследовании оценивали способность каждого анти-йиШ^-антитела ингибировать индуцированную рекомбинантным человеческим ΙΕΝγ (ιΊιιιΙΕΝγ) активацию МНС класса ΙΙ на клеточной линии человеческой меланомы, Ме67.8. Вкратце, клетки меланомы Ме67.8 инкубировали с ΓΐιιιΙΕΝγ в присутствии ΝΙ-0501 или анти-йиIΕNγ-антитела А6 в течение 4872 ч. Активацию МНС класса ΙΙ определяли как описано выше в примере 5. Два этих антитела обладали аналогичной активностью, что указывает на то, что обратные мутации в анти-йиШ^-антителе ΝΙ-0501 не влияют на активность данного антитела (фиг. 19).
Затем анализировали активность анти-йиIΕNγ-антиτела ΝΙ-0501 по отношению к нативному ΙΕΝγ. В этом исследовании человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) активировали 1 мкг/мл митогена РНА в течение 48 ч, и супернатанты анализировали с помощью ЕЫ8А на присутствие нативного ΙΕΝγ. Затем супернатант использовали для стимуляции активации МНС класса ΙΙ на клетках Ме67.8. Антитело ΝΙ-0501 обладало способностью нейтрализовать активацию МНС класса ΙΙ, индуцированную нативным человеческим ΙΕΝγ (фиг. 20).
Пример 11. Перекрестная реактивность анти-йиIΕNγ-антиτела.
Анализ на связывание.
Антитело ΝΙ-0501 анализировали на его способность связываться с ΙΕΝγ с помощью анализа в формате сэндвич''-ЕЫ8А. Вкратце, ΙΕΝγ от видов, указанных для каждого графика на фиг. 21, иммобилизовывали на чипах, предварительно покрытых антителом ΝΙ-0501 (-▲-) или контрольным тАЬ против ΙΕΝγ других видов (--). ΙΕΝγ каждого вида детектировали с использованием поликлонального антитела, специфичного для ΙΕΝγ в этом анализе. Как показано на фиг. 21, антитело ΝΙ-0501 связывалось с крысиным ΙΕΝγ так же, как и контрольное антитело, но не связывалось с ΙΕΝγ других видов, за исключением ΙΕΝγ собакоподобных обезьян.
Нейтрализация активности ΙΕΝγ.
Антитело ΝΙ-0501 анализировали на его способность нейтрализовать или ингибировать рекомбинантные белки ΙΕΝγ от некоторых различных видов. Вкратце, рекомбинантный ΙΕΝγ от различных тестируемых видов помещали на 48-72 ч в культуры клеток Ме67.8 в присутствии или в отсутствие ΝΙ-0501. Активацию МНС класса ΙΙ оценивали, как описано выше в примере 5. Перекрестная реактивность с ΙΕΝγ собакоподобных обезьян или его нейтрализация были продемонстрированы путем ингибирования активации МНС класса ΙΙ на человеческой клеточной линии меланомы, Ме67.8 (фиг. 21). Антитело ΝΙ-0501 обладало способностью ингибировать ΙΕΝγ собакоподобных обезьян, но было неспособно нейтрализовать ΙΕΝγ от других тестируемых видов, что указывало на отсутствие перекрестной реактивности указанного антитела с ΙΕΝγ этих видов (табл. 7).
Таблица 7
Перекрестная реактивность ΝΙ-0501
N1-501 ηίιιιΙΡΝγ гЪиТРЙу ηΟΥΙΕΝγ г су ΙΕΝγ ΓάΙΡΝγ ΓαΙΡΝγ ΓΓίΡΝγ ΓπιΙΡΝγ
Связывание + + + + - -
нейтрализация + + + + ★ * Λ ★
п1ш = нативный человеческий ΙΕΝγ гйи = рекомбинантный человеческий ΙΕΝγ псу = нативный ΙΕΝγ собакоподобных обезьян гсу = рекомбинантный ΙΕΝγ собакоподобных обезьян гб = рекомбинантный собачий ΙΕΝγ гс = рекомбинантный кошачий ΙΕΝγ гг = рекомбинантный крысиный ΙΕΝγ гт = рекомбинантный мышиный ΙΕΝγ + = перекрестная реактивность
- = отсутствие перекрестной реактивности
- 33 013118 * = не тестировали
Кроме того, МКПК собакоподобных обезьян активировали 1 мкг/мл митогена РНА в течение 48 ч и супернатанты анализировали с помощью ЕЫ8А на присутствие нативного ГЕПу. Затем этот супернатант использовали для стимуляции активации МНС класса ΙΙ на клетках Ме67.8. Антитело М-0501 обладало способностью нейтрализовать активацию МНС класса ΙΙ, индуцированную нативным ШЛу собакоподобных обезьян (фиг. 22).
Пример 12. Биологическая активность анти-ЬиIΕNу-антитела.
Исследования, описанные в настоящей заявке, проводили для оценки биологической активности М-0501 после его введения собакоподобным обезьянам. Антитело М-0501 было выбрано для оценки его безопасности и проведения описанных здесь фармакокинетических (ФК) исследований, поскольку было обнаружено, что указанное анти-ЬиIΕNу-антитело способно перекрестно реагировать с ΣΕΧγ собакоподобных обезьян, как описано выше. Для оценки побочных клинических эффектов после многократных внутривенных вливаний обезьянам делали вливания в следующих дозах: 30, 100 и 200 мг/кг.
У мышей с разрушенным геном ΖΕΧγ наблюдались пониженные уровни ^023 и повышенные уровни Ι§01 в ответ на КЬН-иммунизацию, что свидетельствовало о корреляции между уровнем ΖΕΧγ и Ι§0ответом. Во время основных токсикологических исследований, проводимых в течение 13 недель, обезьян иммунизовали КЬН в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). У обезьян, кообработанных плацебо, наблюдался типичный иммунный ответ на иммунизацию КЕН/ША с вырабатыванием КЬН-специфических Ι§Μ и Ι§0, обнаруженных в сыворотке. Эти исследования были разработаны для того, чтобы определить, может ли нейтрализация ΖΕΧγ у М-0501-обработанных обезьян, которые были иммунизованы КЬН в ША, приводить к изменению титра КЬН-специфического Iд^-титра.
Пример 13. Модуляция активности ΖΕΧγ с использованием анти-ЬиШЛу антител.
Продуцирование хемокина №-10 в некоторых клеточных линиях стимулируется ΙΕ^. На основании этих наблюдений был разработан анализ цельной крови. В этом анализе цельной крови пробы цельной крови, взятые от нескольких доноров, смешивали с фиксированной концентрацией ΙΕ^ и с различными концентрациями М-0501. После инкубирования уровни ТР-10 измеряли с помощью ЕЫ8А, используемого для оценки способности анти-ЬиIΕNу-антитела блокировать продуцирование ТР-10 (фиг. 23).
Другие варианты осуществления изобретения
Хотя настоящее изобретение было подробно описано в представленной здесь заявке, однако, настоящее описание приводится лишь в иллюстративных целях и не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. В указанную формулу изобретения входят и другие аспекты, преимущества и модификации.
- 34 013118
Список последовательностей <110> Коу1т1пипе 5.А.
<120> Антитела против интерферона-гамма и способы их применения <130> 23135-409-061 <140> РСТ/1В2006/001514 <141> 2006-01-27 <150> 03 60/648,219 <151> 2005-01-27 <160> 119 <170> РабепЫп νθΓΕΪοη 3.2 <210> 1 <211> 369 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 1
даддбдсадс бдтбддадЬс бдддддаддс ббддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
ЕссбдЬдсад ссбсЬддабб сассбЬЬадс адсбабдсса бдадсГдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадЬд ддбсЬсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 160
дсадасбссд бдаадддссд дЬбсассабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбаб аббасСдЬдс дааадабддб 300
адсадбддсб ддбасдбасс асасЬддббс дассссбддд дссадддсас ссбддбсасс 360
дбсСссСса 369
<210> 2
<211> 123
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400 2
й!и Уа1 С1п Ьеи Кеи б1и Зег 31у <31у 61у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Меб Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 01и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не Зег С1у Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг 11 е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
- 35 013118
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Э5 Ьеи Агд А1а
А1а Ьуз Азр С1у 100 Зег Зег С1у Тгр
Тгр С1у С1п 115 С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг 120
<210> <211> <212> <213> 3 5 РКТ Ното зархепз
<400> 3
Зег Туг 1 А1а МеИ Зег 5
С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
Туг Уа1 Рго Н1з Тгр РЬе Азр Рго
105 110
Уа1 Зег Зег
<210 <211> <212> <213> 4 17 РКТ Ното зарЬепз
<400 4
А1а Не Зег 31у Зег <51у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
1015
Ьуз
61у
<210> <211> <212> <213> 5 14 РКТ Ното зарЬепз
<400> 5
Азр С1у Зег Зег С1у Тгр Туг Уа1 Рго (Из Тгр РЬе Азр Рго 1510 <210> 6 <211>333 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 6
ааМ££а11дс ‘Ьдас’Ьсадсс ссасбсЬдЬд ЬсддадбсСс сддддаадас ддЬаасса1:с 60
Ьсс^дсасЪс дсадсад^дд садсаЫздсс адсаасЬаСд ЬдСадСддба ссаасадсдс 120
ссдддсад-Ы: сссссассас ЬдбсаЬсЬаЬ даддаЬаасс ададасссЬс ЬддддЬсссЬ 130
даБсдд^Ъс!: с£ддс£.сса£ сдасадсЬсс ЬссааЬбс^д ссРсссбсас саЬсЬс-Ьддд 240
- 36 013118 сЬдаадасРд аддасдаддс ЬдасЬасЬас Дд^садЬсНЬ аНдаЬддсад сааЬсдЬНдд 300 аЬдЬ-Ьсддсд дадддассаа дсЬдассдЬс сна333 <210>7 <211> 111 <212> РЕТ <213> Ното зар1епз <400>7
Азп 1 РЬе МеЬ Ьеи ТЬг 5 С1п Рго Мз Зег 7а1 Зег 10 С1и Зег Рго С1у 15 Ьуз
ТЬг Уа1 ТНг Не Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег С1у Зег Не А1а Зег Азп
20 25 30
Туг Уа1 С1п Тгр Туг С1п С1п Асд Рго С1у Зег Зег Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
11е Туг 61и Азр Азп С1п Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег 11е Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТЬг Не Зег С1у
65 70 75 80
Ьеи Ьуз ТЬг 61и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз 61п Зег Туг Азр 61у
85 90 95
Зег Азп Агд Тгр МеЬ РЬе С1у С1у 31 у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
100 105 110 <2Ю> е <211>13 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> Θ
ТЬг Агд Зег Зег (31у Зег Не А1а Зег Азп Туг Уа1 С1п
1510 <210>9 <211>7 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400>9
61и Азр Азп С1п Агд Рго Зег <210> 10
- 37 013118 <211> 10 <212> РР.Т <213> Ното заргепз <400> 10
61п Зег Туг Азр С1у Зег Азп Агд Тгр Меб 15 10
<210> 11
<211> 369
<212> ДНК
<213> Ното зарбепз
<400> 11
даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс Ьбддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
бссбдбдсад ссбсбддабб сассбббадс адсбабдсса бдадсбдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 180
дсадасбссд бдаадддссд дббсассабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбаб аббасбдбдс дааадабсаб 300
адсадбддсб ддбасдбааб сбссддбабд дасдбсбддд дссдадддас аабддбсасс 360
дбсбсдадб 369
<210> <211> <212> <213> 12 123 РЕТ Ното зархепз
<400> 12
(31и Уа1 1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег 61у
Зег Ъеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а
А1а Меб Зег 35 Тгр Уа1 Агд 61п А1а 40
Зег А1а 50 Не Зег 61у Зег 61 у 55 С1у
Ьуз С1у 65 Агд РНе ТНг 11е 70 Зег Агд
Ьеи С1п Меб Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а
61у 61у 10 Ьеи Уа1 61п Рго 61у 15 61у
Зег 25 61у РНе ТНг РЬе Зег 30 Зег Туг
Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег ТНг Туг Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 80
61и Азр 90 ТНг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
- 38 013118
А1а Ьуз Азр Ηί3 Зег Зег 61у Тгр Туг Уа1 Не Зег С1у МеЕ Азр Уа1
100 105 110
Тгр С1у Агд СНу ТЬг МеЕ Уа1 ТЬг 120 Уа1 Зег Зег
115
<210> 13
<211> 14
<212> РКТ
<213> Ното эардепз
<40О> 13
Азр ΗΪ3 Зег 5ег С1у Тгр Туг Уа1 11е Зег С1у МеЕ Азр Уа1
1 5 10
<210>14 <211>333 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 14
ааЕЕЕЕаЕдс ЕдасЕсадсс ссасЕсЕдЕд ЕсддадЕсЕс сддддаадас ддЕаассаЕс ЙО
ЕссЕдсассс дсадсадЕдд садсаЕЕдсс адсаасЕаЕд ЕдсадЕддЕа ссадсадсдс 120
ссдддсадЕЕ сссссассас ЕдЕдаЕсЕсЕ даддаЕаасс ааадасссЕс ЕддддЕсссЕ 180
даЕсддЕЕсЕ сЕддсЕссдЕ сдасадсЕсс ЕссаасЕсЕд ссЕсссЕсас саЕЕЕсЕдда 240
сЕдаддасЕд аддасдаддс ЕдасЕаЕЕас ЕдЕсадЕсЕа аЕдаЕЕссда сааЕдЕддЕЕ 300
ЕЕсддсддад ддассаадсЕ дассдЕссЕа ддЕ 333
<210>15 <211> 111 <212> РЕТ <213> Ното эарЁепз <400>15
Азп 1 РЬе МеЕ Ьеи ТЬг 5 С1п Рго Н1з Зег Уа1 10 Зег С1и Зег Рго (Пу 15 Ьуз
ТЬг Уа1 ТЬг 11е Зег Су5 ТЬг Агд Зег Зег СНу Зег Не А1а Зег Абп
20 25 30
Туг Уа 1 С1п Тгр Туг С1п С1п Агд Рго С1у Зег Зег Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
Не Зег С1и Азр Азп С1п Агд Рго Зег 61у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег Уа1 Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТЬг Не Зег С1у
65 70 75 80
- 39 013118
Ьеи Агд ТЪг С1и Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Азп Азр Зег
85 90 95
Азр Азп Уа1 Уа1 РЬе С1у С1у 61у ТНг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи С1у
100 105 110
<210> 16
<211> 13
<212> РЕТ
<213> Ното зархепз
<4 0 0> 16
ТЬг Агд Зег Зег б1у Зег 11е А1а Зег Азп Туг Уа1 С1п
10 <210>17 <211>7 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400>17
С1и Азр Азп С1п Агд Рго Зег <210> 18 <211>9 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400>18
Е1п Зег Азп Азр Зег Азр Азп Уа1 Уа1 <210>19 <211>366 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 19
даддбдсадс СдЬЬддадСс бдддддаддс СГддЬасадс сЬддддддЬс сс5дадасСс 60
ЬссЬдЪдсад ссСссддахд сассбб^адс адсбаЬдсса Ьдадс^ддд’Ь ссдссаддсЬ 120
ссадддаадд ддсЬддадСд ддЬсРсадсЬ аЬСадбддба дбддЬддЬад сасабасбас 180
дсадасЬссд бдаадддссд д^Рсассабс 5ссададаса аЬсссаадаа сасдсбдбаЬ 240
сГдсаааСда асадссбдад адссдаддас асддссдЬд1 аЬЪасбдЬдс дааддассба 300
асадбдддбд дЪсссЪддЪа сЬас655дас ГасЬддддсс ааддаассс!: дд-ЬсассдСс 360
ГсдадЪ 366 <210> 20
- 40 013118 <211> 122 <212> РКТ
<213> Ното зар1епз
<400> 20
С1и Уа1 51п Ьеи Ьеи (31и Зег С1у Й1у Й1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег Е1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Меб Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не Зег (31 у Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Рго Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Меб Азп Зег Ьеи Агд АЬа С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
65 90 95
А1а Ьуз Азр Ьеи ТЬг Уа1 С1у (31у Рго Тгр Туг Туг РЬе Азр Туг Тгр
100 105 110
31у <31п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 21
<211> 13
<212> РКТ
<213> 1 Ното зархепз
<4оо> : 21
Азр Ьеи ТЬг Уа1 (31 у С1у Рго Тгр Туг Туг РЬе Азр Туг
10 <210> 22 <211> 333 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400 22
ааббббабдс £дас1:садсс ссасбсбдбд бсддадбсбс сддддаадас ддбаассабс 60
бссбдсассс дсадсад^дд садсаббдбс адсаасбабд ^дсад^дд^а ссадсадсдс 120
ссдддсадбд сссссассас бдбдабсббб дасдабдасс ааадасссЪс бддддбсссб 160
ддбсддббсб сБддсГсссБ сдасадсбсс бссаасбсбд ссБссс£сас сабсбсбддд 240
сбдсадасбд аддасдаддс бдасбасбас бдбсадбсбб аБдаБадсад саабдбддба 300
- 41 013118
ЬЕсддсдддд ддассааддЬ сассдЪссЬа ддЬ333 <210>23 <211> 111 <212> РРТ <213> Нолю зарЬепз <400>23
Азп 1 РЬе МеЬ Ьеи ТЬг С1п 5 Рго ΗΪ3 Зег УаЬ 10 Зег СЬи Зег Рго СЬу 15 Ьуз
ТЬг Уа1 ТЬг Не Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег СЬу Зег ЬЬе УаЬ Зег Азп
20 25 30
Туг УаЬ СЬп Тгр Туг СЬп СЬп Агд РГО СЬу Зег АЬа Рго ТЬг ТЬг УаЬ
35 40 45
Не РЬе Азр Азр Азр СЬп Агд Рго Зег СЬу Уа1 Рго С1у Агд РЬе Зег
50 55 60
СЬу Зег Ьеи Аэр Зег Зег Зег Азп Зег АЬа Зег Ьеи ТЬг Не Зег СЬу
65 70 75 80
Ьеи СЬп ТЬг С1и Азр СЬи АЬа Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег
85 90 95
Зег Азп УаЬ УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг УаЬ Ьеи СЬу
100 105 110
<210> . 24
<211> 60
<212> : РРТ
<213> : Ното зар1еп5
<400> . 24
Азп РЬе МеЬ Ьеи ТЬг СЬп Рго НЬз Зег УаЬ Зег СЬи Зег Рго СЬу Ьуз
1 5 10 15
ТЬг УаЬ ТЬг Не Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег СЬу Зег Не АЬа Зег Азп
20 25 30
Туг УаЬ СЬп Тгр Туг СЬп СЬп Агд Рго СЬу Зег Зег Рго ТЬг ТЬг УаЬ
35 40 45
Ие Туг С1и Азр Азп С1п Агд Рго Зег СЬу УаЬ Рго
50 55 60
<210>25
- 42 013118 <211>7 <212> РРТ <213> Ното зарЬепз <400>25
Азр Азр Азр 61п Агд Рго Зег <210> 26 <211>9 <212> РКТ <213> Ното зараепз <400>26
С1п Зег Туг Азр Зег Зег Азп Уа1 Уа1 <210>27 <211>360 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 27
даддбдсадс ЬдЬЬддадЬс бдддддаддс «ддЪасадс ссддддддЬе ссСдадасбс 60
ЬссЬдбдсад ссбсЬддаЫ: сассЬЬСадс адсьабдсса ЬдадсЬддд-Ь ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсЬддадЬд ддЬсЬсадсЬ аЬ6ад6дд1;а дСдд^ддрад сасаЬасбас 180
дсадассссд Сдаадддссд дЬЬсассаЬс Сссададаса аГгссаадаа сасдсЬдЬаЬ 240
сЬдсааабда асадсссдад адссдаддас асддссд^дЬ а5гас+дсдс дааада'Ьдда 300
Ъддааодсдс ЬдддаЬддсЬ ьдаабссбдд ддссддддса сссЬддЬсас сдСсЬсдадЬ 360
<210> 28 <211> 120 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 28
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у С1у СЬу 10 Ьеи Уа1 С1п Рго 01 у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Μθΐ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз 51у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не Зег С1у Зег 61у 31у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
- 43 013118
Ьуз 65 С1у Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз 75 Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи <31п меь Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр <31у Тгр Азп А1а Ьеи Б1у Тгр Ьеи <31и Зег Тгр С1у Агд
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210>29 <211> 11 <212> РР.Т <213> Ното зарЬепз <40029
Азр С1у Тгр Азп А1а Ьеи С1у Тгр Ьеи С1и Зег
1510 <210>30 <211>336 <212> ДНК' <213> Ното зарЬепз <400>30 ааЬЬЬЬаЬдс ЬдасЬсадсс ссасЬсЬдЬд ЬсддадЬсЬс сддддаддас даЬаассаЬс60
ЬссЬдсассс дсадЬддЬдд садсаЬЬддс адсЬасЬаЬд ЬдсадЬддЬа ссадсадсдс120 ссдддсасЬд сссссассас ЬдЬдаЬсЬаЬ дасдаЬаааа ааадасссЬс ЬддддЬсссЬ160 даЬсддЬЬсЬ сЬддсЬссаЬ сдасадсЬсс ЬссаасЬсЬд ссЬсссЬсас саЬсЬсЬдда240 сЬдаадасЬд аддасдаддс ЬдасЬасЬаЬ ЬдСсадЬсЬС аьдасадсаа сааЬсьЬдЬд300 дьыседдед дадддассаа ддьсассдъс сеаддь336 <21031 <211> 112 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400>31
Азп 1 РЬе МеЬ Ьеи ТЬг 5 <31п Рго ΗΪ3 Зег Уа1 10 Зег С1и Зег Рго С1у 15 Агд
ТЫ 11е ТЬг 11е Зег Суз ТЬг Агд Зег С1у (31 у Зег 11е С1у Зег Туг
20 25 30
Туг Уа1 С1п Тгр Туг С1п С1п Агд Рго С1у ТЬг А1а Рго ты ТЫ Уа1
35 40 45
- 44 013118
Не Туг 50 Азр Азр Ьуз Ьуз Агд 55 Рго
С1у 65 Зег 11е Азр Зег Зег 70 Зег Азп
Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр 85 С1и А1а Азр
Азп Азп Ьеи Уа1 100 Уа1 Рпе С1у С1у
<210> <211> <212> <213> 32 13 РКТ Ното
<400> 32
ТЬг 1 Агд Зег С1у С1у 5 Зег 11е С1у
Зег Туг Туг 7а1 С1п
Зег С1у Уа1 Рго 60 Азр Агд РНе Зег
Зег А1а Зег Ьеи ТЬг 11е Зег С1у
75 80
Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег
90 95
СЬу ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи С1у
105 110
<210> <211> <212> <213> 33 7 РКТ Ното зараепз
<400> 33
Азр Азр Ьуз Ьуз Агд Рго Зег
<210> <211> <212> <213> 34 10 РКТ Ното зараепз
<400> 34
С1п Зег Туг Азр Зег Азп Азп Ьеи Уа1 νβΐ
1510 <210>35 <211>369 <212> ДНК <213> Ното заргепэ <400> 35
дадд^дсадс ЕдЕЕддадЕс Едддддаддс ЕЕддЕасадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс 60
^ссИд^дсад ссЕсЕддаЕЕ сассЕЕЕадс адсЕаЕдсса ЕдадсЕдддЕ ссдссаддсЕ 120
ссадддаадд ддсЕддадЕд ддЕсЕсадсЕ аЕЕадЕддЕа дЕддЕддЕад сасаЕасЕас 180
дсадасБссд Едаадддссд дЕЕсассаЕс Ессададаса аЕЕссаадаа сасдсЕдЕаЕ 240
- 45 013118 сЬдсаааЬда асадссЬдад адссдаддас асддссдЬаЬ аЫасЬдЬдс дааадаЬддЬ300 адсадЬддсЬ ддЬасдЬасс асасЬддЬЬс дассссЬддд дсадддддас ааЬддЬсасс360 дЬсЬсдадЬ369 <210>36 <211>123 <212> РР.Т <213> Ното зархепз <400>36
С1и Уа1 1 61п Ьеи Ьеи 5 61и Зег 61у 61у 61у Ьеи 10 Уа1 61п Рго С1у 15 С1у
Зех Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз 61у Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не Зег 61 у Зег 61у 61у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр 61у Зег Зег 61 у Тгр Туг Уа1 Рго Ηί3 Тхр РЬе Азр Рго
100 105 110
Тгр 61 у Агд 61у ТЬг МеЬ Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210>37 <211>336 <212> ДНК <213> Ното зарьепз <400> 37
ааЬЬЬЬаЬдс ЪдасЪсадсс ссасьсьдьд ЬсддадЬсЬс сддддаадас ддЬаассаЬс 60
ЬссЬдсассс дсадсад1:дд сассаЬЬдсс адсаасЬаЬд ЬдсадЬддЬа ссадсадсдс 120
ссдддсадЫ сссссассас ЬдЬдаЬсЬаЬ даддаьаасс ааадасссЬс ЬддддЬсссЬ 180
даЬсддЬЬсЬ с^ддс^сса·!: сдасадсЬсс СссаасЬсЬд ссЬсссЬсас саЬсЬсЬдда 240
сЬдаадасЬд аддасдаддс ЬдасЬасЬас ЬдЬсадЬсЬЬ аЬдаЬаасад сааЬсаЬЬдд 300
дЬдЬЬсддсд дадддассаа ддЬсассдЬс сЬаддЬ 336
- 46 013118 <210>33 <211> 112 <212> РАТ <213> Ното зарЬепз <400>38
Азп 1 РЬе Ме! Ьеи ТЬг С1п 5 Рго Н1з Зег Уа1 10 Зег С1и Зег Рго С1у 15 Ьуз
ТЬг νβΐ ТЬг Не Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег С1у ТЬг Не А1а Зег Азп
20 25 30
Туг Уа1 С1п Тгр Туг С1п Е1п Агд Рго С1у Зег Зег Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
11е Туг <31и Азр Азп С1п Агд Рго Зег С1у ν3ι Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег Не Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТЬг Не Зег С1у
65 70 75 80
Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр б1и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Азп
85 90 95
Зег Азп Ηίε Тгр Уа1 РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи С1у
100 105 но
<210> <211> <212> <213> 39 13 РАТ Ното зарЬепз
<400> 39
ТЬг Агд Зег Зег С1у ТЬг Не А1а Зег Азп Туг Уа1 С1п 1510
<210> <211> <212> <213> 40 10 РАТ Ното заргепз
<4 00> 40
С1п Зег Туг Азр Азп Зег Азп НЬз Тгр 7а1
1510
<210> <211> <212> <213> 41 360 ДНК Ното заргепз
<400> 41
- 47 013118
даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс ббддбасадс саддддддбс ссбдааасбс 60
бссбдбдсад ссбсбддабб сассбббадс адсаабдсса бдадббдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсаасб сббасбддба дбддбддбас сдсабасбас 180
дсадасбссд бддадддссд дббсадсабс бссададаса аббссаадаа сасасбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбаб аббасбдбдс даадддсасд 300
даасбсдбдд даддаддасб бдасаасбдд ддссааддса сссбддбсас сдбсбсдадб 360
<210>42 <211> 120 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>42
61 и 1 Уа1 61п Ьеи Ьеи 61и 5 Зег 61у 61у 61у Ьеи 10 Уа1 61п Рго 61у 15 61у
Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Азп
20 25 30
А1а Меб Бег Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 51и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ТЬг Ьеи ТЬг 61 у Зег 61у 61у ТЬг А1а Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
61ц С1у Агд РЬе Зег Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Меб Азп Зег Ъеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз 61 у ТЬг 61и Ьеи Уа1 С1у 61у 61у Ьеи Азр Азп Тгр 61у 61п
100 105 НО
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210>43 <211>5 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>43
Зег Азп А1а Меб Зег <210>44
- 48 013118
<211> 17
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400> 44
ТЬг Ьеи ι ТЬг <31у Зег С1у 31у ТЬг А1а Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 С1и
1 5 10 15
С1у
<210> 45
<211> 11
<212> РКТ
<213> Нот<
<400> 45
С1у ТЬг С1и Ьеи Уа1 С1у С1у 61у Ьеи Азр Азп
1510 <210>46 <211>339 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 46
ааиирраидс ЪдасЪсадсс ссасРсЬсид СсддадисРс сддддаадас ддидасдаРс 60
ЬссЬдсассд дсадсддадд садсаРРдсс ассаасЬаРд ЬдсадРддЬа Рсадсадсдс 120
ссдддсадрд сссссассас ЬдЬдаиссаР даддаСаасс ааадасссРс РддддРсссР 180
даЬсддиис!: с^ддс^сса^ сдасддсРсс РссаасисРд ссЬсссРсас саРсЬсидда 240
сРдсадссид аддасдаддс РдаиРасиас идРсадисЬЬ аидаиадида сааРсаРсаи 300
диддиаРРсд дсддадддас саадсидасс дРссРадди 339
<210>47 <211>113 <212> РКТ <213> Ното зарЬеп5 <400>47
Азп 1 РЬе Мер Ьеи ТЬг С1п 5 Рго Ηίβ Зег Ьеи 10 Зег С1и Рго С1у 15 Ьуз
ТЬг νβΐ ТЬг 11е Зег Суз ТЬг С1у Зег С1у <31у Зег 11е А1а ТЬг Азп
20 25 30
Туг Уа1 С31п Тгр Туг 61п С1п Агд Рго 01 у Зег А1а Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
11е Н15 50 61и Азр Азп 61п Агд 55 Рго Зег 61у Уа1 Рго 60 Азр Агд РНе Зег
61 у Зег Не Азр 61у Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТНг 11е Зег 61у
65 70 75 ео
Ьеи 61п Рго 61и Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз 61п Зег Туг Азр Зег
85 90 95
Азр Азп Н13 НЬз Уа1 Уа1 РНе 61у 61у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи
100 105 НО
61у <210>48 <211>13 <212> РЕТ <213> Ното эаргепз <400>48
ТНг С1у Зег С1у С1у Зег Не А1а ТЬг Азп Туг Уа1 61п
1510 <210>49 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400>49
61п Зег Туг Азр Зег Азр Азп Н1з Нгз Уа1 Уа1
1510
<210> 50 <211> 360 <212> ДНК <213> Ното заргепз
<400> 50 даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс ббддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
бссбдбдсад ссНсбддабб сассбббадс адсбабдсса бдадсбдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 180
дсадасбссд бдаадддссд дббсассабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбдб аббасбдбдс дааадабдда 300
бддаасдсдс бдддабддсб бдаабссбдд ддсаадддда саабддбсас сдбсбсдадб 3 60
<210> 51 <211> 120 <212> РЕТ
- 50 013118 <213> Ното зардепз <400> 51
61 и 1 Уа1 61п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а
А1а Мер Зег 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40
Зег А1а 50 Не Зег 61у Зег С1у 55 61у
Ьуз 65 61 у Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд
Ьеи 61п Мер Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а
А1а Ьуз Азр 61у 100 Тгр Азп А1а Ьеи
С1у ТЬг Мер 115 Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 120
<210> 52 <211> 60 <212> РЕТ <213> Ното зархепз
<400> 52
Азп 1 РЬе Мер Ьеи ТЬг 5 С1п Рго Н1з
ТЬг УаЬ ТЬг Не 20 Зег Суз ТЬг Агд
Туг Уа1 С1п 35 Тгр Туг С1п 61п Агд 40
Не Туг 50 61и Азр Азп Агд Агд 55 Рго
<210> 53 <211> 339 <212> ДНК <213> Нотс зардепз
Зег 61у Уа1 Рго
61у 61 у 10 Ьеи Уа1 61п Рго 61 у 15 61у
Зег 25 61у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег ТЬг Туг Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
С1и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
<31у 105 Тгр Ьеи 61и Зег Тгр 110 61у Ьуз
£ег Уа1 Зег 61и Зег Рго 61у Ьуз
10 15
Зег Зег 61у Зег 11е Уа1 Зег Азп
25 30
Рго 61у Зег А1а Рго ТЬг ТЬг Уа1
45
- 51 013118 <4О0>53 ааСЬЬГаЬдс ЬдасСсадсс ссасбсЬдЬд 1сддадЬсЬс сддддаадас ддЪаассаСс60
ЬссЬдсассд дсадсадбдд садсаб^дсс адсаасЬабд бдсадЬддЬа ссадсадсдс120 ссдддсадЬд сссссассас ЬдСда^сГаР даддабаасс ааадасссЬс ЬддддЬсссЬ180 даЬсддЬЬсЬ сЬддсЬссаЬ сдасадсГсс ЬссаасЬсЬд ссСсссЬсас саЬсЬсЬдда240 сЬдаадасЪд аддасдаддс ЬдасЬасЬас ЬдЬсадЬсЫ; аЬдаЬадсад сааЬсаадад300 дЬддЬаЬГсд дсддадддас саадсЬдасс дЬссЬаддЬ339 <210>54 <211>113 <212> ΡΡ.Ί <213> Ното зархепз <40054
Азп 1 РЬе Меи Ьеи ТЬг '5 СЬп Рго НЬз Зег Уа1 10 Зег СЬи Зег Рго СЬу 15 Ьуз
ТЬг УаЬ ТЬг Пе Зег Суз ТЬг СЬу Зег Зег СЬу Зег Ие АЬа Зег Азп
20 25 30
Туг УаЬ СЬп Тгр Туг СЬп СЬп Агд Рго 31 у Зег А1а Рго ТЬг ТЬг УаЬ
35 40 45
11е Туг СЬи Азр Азп СЬп Агд Рго Зег СЬу УаЬ Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
<31 у Зег Ие Азр Зег Зег Зег Азп Зег АЬа Зег Ьеи ТЬг Ие Зег СЬу
65 70 75 80
Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр СЬи АЬа Азр Туг Туг Суз СЬп Зег Туг Азр Зег
85 90 95
Зег Азп СЬп СЬи УаЬ УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи
100 105 110
СЬу <210>55 <2Ы>13 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>55
ТЬг С1у Зег Зег С1у Зег 11е А1а Зег Азп Туг Уа1 СЬп 1510
- 52 013118
<210> 56
<211> И
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400 56 (31η Зег Туг Азр Зег Зег Азп СЬп С1и Уа1 Уа1
10 <210> 57 <211> 369 <212> ДНК
<213> Ното зархепз
<400> 57 даддЕдсадс ЕдЕЕддадЕс Едддддаддс ееддеасадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс 60
ЕссЕдЕдсад ссЕсЕддаЕЕ сассЕЕЕадс адсЕаЕдсса ЕдадсЕдддЕ ссдссаддсЕ 120
ссадддаадд ддседдадЕд ддЕсЕсадсЕ аЕЕадЕддЕа дЕддЕддЕад сасаеасбас 180
дсадасЕссд Едаадддссд деесассаес ессададаса аеессаадаа сасдседеае 240
сЕдсаааЕда асадссЕдад адссдаддас асддссдеае аееаседедс дааадаЕддЕ 300
адсадЕддсЕ ддЕасдЕасс асасЕддЕЕс дасссседдд дссадддаас ссЕддЕсасс 360
дЕсЕсдадЕ 369
<210> 58 <211> 123 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз
<400> 58
С1и 1 УаЬ СЬп Ьеи Ьеи СЬи Зег С1у 5 С1у С1у 10 Ьеи УаЬ СЬп Рго СЬу 15 СЬу
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Мее Зег Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз С1у Ьеи С1 и Тгр УаЬ
35 40 45
Зег АЬа Ие Зег СЬу Зег СЬу С1у Зег ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Ие Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп МеЕ Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
- 53 013118
115
120
10> <211> <212
13>
336 ДНК
Ното зархепз
<400
ааЕЕЕЕаЕдс ЪдасЪсадсс ссасЕсЕдЕд ЕсддадЕсЕс сддддаадас ддЕЕассаЕс 60
ЕссЕдсассс дсадсадЕдд садсаЕЕдЕс адсаасЕаЕд ЕасадЕддЕа ссадсадсдс 120
ссдддсадЕЕ сссссассас ЕдЕдаЕсЕаЕ даддаЕаасс ааадасссЕс ЕддддЕсссЕ 130
даЕсддЕЕсЕ с1зддс1:сса£ сдасадсЕсс ЕссаасЕсЕд ссЕсссЕсас саЕсЕсЕдда 240
сЕдаадасЕд аддасдаддс ЕдасЕасЕас ЕдЕсадЕсЕЕ аЕдаЕадсаа сааЕЕЕЕЕдд 300
дЕдЕЕсддсд дадддасааа дсЕдассдЕс сЕаддЕ 336
<210> 60 <211> 112 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 60
Азп 1 РЬе МеЕ Ьеи ТЬг С1п 5 Рго ΗΪ3 Зег Уа1 Зег 10 <31и Зег Рго С1у 15 Ьуз
ТЬг Уа1 ТЬг 11е Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег С1у Зег 11е Уа1 Зег Азп
20 25 30
Туг Уа1 С1п Тгр Туг С1п С1п Агд Рго С1у Зег Зег Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
11е Туг С1и Азр Азп С1п Агд Рго Зег 51у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у 8ег 11е Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи- ТЬг 11е Зег Й1у
65 70 75 80
Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег
35 90 95
Азп Азп РЬе Тгр Уа1 РЬе 31 у С1у 31у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи С1у
100 105 но
<210> 61 <211> 10
- 54 013118 <212> ΡΗΤ <213> Ното зархепз <400>61
61п Зег Туг Азр Зег Азп Азп РЬе Тгр Уа1
1510 <210> 62 <211>360 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 62
даддСдсадс СдССддадСс Сдддддаддс ССддЬасадс сЬддддддСс ссЬдадасЬс 60
СссСдСдсад ссЬсСддаСЬ сассССЬадс адсСаедсса СдадсСдддС ссдссаддсЬ 120
ссадддаадд ддсЬддадЬд ддЬсЬсадсЬ аСЬадЬддЬа дЬддЬддЬад сасаСасСас 130
дсадасСссд Ьдаадддссд дЬСсассаСс Сссададаса аЬЬссаадаа сасдсСдЬаЬ 240
сЬдсаааСда асадссСдад адссдаддас асддссдСдС аСЬасСдСдЬ дааааддьсс 300
ЬЬЬдаЬадЬд дЬдддЬссЬЬ ЬдадЬасЬдд ддссадддда сааЬддЬсас сдСсСсдадС 360
<210> <211> <212> <213> <400> 63 120 РКТ Ното 63 С1п зардела
С1и 1 Уа1 Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а
А1а МеС Зег 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40
Зег А1а 50 11е Зег С1у Зег 61 у 55 61 у
Дув 65 51у Агд РЬе ТЬг Пе 70 Зег Агд
Ьеи С1п МеС Азп Зег 35 Ьеи Агд А1а
Уа1 ьуз Агд Зег 100 РЬе Азр Зег 61 у
С1у Б1у 10 Ьеи Уа1 Б1п Рго С1у 15 С1у
Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег ТЬг Туг Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
61и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
61 у 105 Зег РЬе С1и Туг Тгр 110 61у 61п
С1у
115
120 <210>64 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>64
Агд Зег РЬе Азр Зег СЬу С1у Зег РЬе С1и Туг
1510 <210>65 <211>336 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 65
ааЕЕЕЕаЕдс ^дасЪсадсс ссасЕсЕдЕд ЕсддадЕсЕс сддддаадас ддЕсассаЕс 60
ЕссЕдсассс дсадсадЪдд сЕасаЕЕдсс адсЕссЕаЕд ЕдсадЕддЕа ссадсадсдс 120
ссдддсадЕЕ сссссассас ЕдЕааЕсЕЕЕ даддаЕдасс ддадасссЕс ЕддддЕсссЕ 100
даЕсддЕЕсЕ с^ддс^сса!: сдасддсЕсс ЕссаасЕсЕд ссЕсссЕсас саЕсЕсЕдда 240
сЕдаддасЕд аддасдаддс ЕдасЕасЕас ЕдЕсадЕсЕЕ аЕдаЕдасас сасЕсссЕдд 300
дЕдЕЕсддсд дадддассаа дсЕдассдЕс сЕаддЕ 336
<210> <211> <212> <213> 66 112 РКТ Ното зараепз
<400> 66
Азп РЬе 1 МеЕ Ьеи ТЬг 5 СЬп Рго НЬз
ТЬг Уа1 ТЬг Не 20 Зег Суз ТЬг Агд
Туг Уа1 С1п 35 Тгр Туг С1п СЬп Агд 40
11е РЬе 50 СЬи Азр Азр Агд Агд 55 Рго
С1у Зег 65 11е Азр СЬу Зег 70 Зег Азп
Ьеи Агд ТЬг СЬи Азр 35 СЬи А1а Азр
Зег Уа1 10 Зег С1и Зег Рго 61у 15 Ьуз
Зег 25 Зег 61 у Туг 11е АЬа 30 Зег Зег
Рго С1у Зег Зег Рго 45 ТЬг ТЬг Уа1
Зег СЬу Уа1 Рго 60 Азр Агд РЬе Зег
Зег АЬа Зег 75 Ьеи ТЬг Не Зег 51 у 80
Туг Туг 90 Суз С1п Зег Туг Азр 95 Азр
- 56 013118
ТЬг ТЬг Рго Тгр Уа1 РЬе С1у 61у 61у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи С1у
100 105 110
<210> 67
<211> 360
<212> ДНК
<213> Ното заргепз
<400> 67
даддЬдсадс ЬдССддадСС Сдддддаддс ССддСасадс сСддддддСс ссьдадасСс 60
ЬссЬдСдсад ссСсЬддаЬС сассЬЬЬадс адсЬаЬдсса ЬдадсЬдддЬ ссдссаддс! 120
ссадддаадд ддсСддадСд ддСсЬсадсС аЬСадЬддСа дЬддЬддЬад сасаЬасЬас 130
дсадасСссд Ьдаадддссд дСЬсассаЬс Сссададаса аССссаадаа сасдсСдСаЬ 240
сСдсаааСда асадссСдад адссдаддас асддссдСдС аССасСдСдс дададСсддс 300
адсСддЬасс ЬддаадаСЬЬ СдаСаСсСдд ддссддддда сааСддЬсас сдЬсСсдадЬ 360
<210>63 <211> 120 <212> РАТ <213> Ното заргепв <400>63
Е1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 Е1и Зег С1у 61у Е1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 Е1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Ме! Зег Тгр Уа1 Агд Е1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а 11е Зег Е1у Зег Е1у 61у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз Е1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 30
Ьеи Е1п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Сув
35 90 95
А1а Агд Уа1 Е1у Зег Тгр Туг Ьеи Е1и Азр РЬе Азр 11е Тгр Е1у Агд
100 105 110
С1у ТЬг Ме! Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210>69
- 57 013118 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400>69
Уа1 61у Зег Тгр Туг Ьеи С1и Азр РЬе Азр 11е
1510 <210>70 <211>342 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 70
аасНЬа'.дс Ьдасбсадсс ссасбсЬдЬд ЬсддадЬсбс сддддаадас ддЬЬассабс 60
Ьссбдсассс дсадсадСдд садсаЬЬдсс адсаасЬабд ЬИса^ддба Ссадсадсдс 120
ссдддсадН: сасссассас ЬдЬдабсЬаЬ даддабаасс даадасссбс еддддЬсссС 180
дсСсддС1:сС сСддсЬсса! сдасадсбсс ЬссаасбсЬд сс^сссЬсас сабсбсЬдда 240
сКддадасСд асдасдаддс ЬдасЬасбас ЬдЬсадбсЫ: с^дабассас сбагсаьдда 300
ддСд^дд^аб Ьсддсддадд дассаадсЬд ассдЬссбад д-ь 342
<210>71 <211>114 <212> РРТ <213> Ното зарДепз <400>71
Азп 1 РЬе Меб Ьеи ТЬг 5 С1п Рго НЬз Зег Уа1 10 Зег 61и Зег Рго 61у 15 Ьуз
ТЬг Уа1 ТЬг 11е Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег 61 у Зег 11е А1а Зег Азп
20 25 30
Туг Уа1 Н1з Тгр Туг 61п С1п Агд Рго (Ну Зег Зег Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
11е Туг С1и Азр Азп Агд Агд Рго Зег 61у Ча1 Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег 11е Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТЬг Не Зег 61у
65 70 75 80
Ьеи 61и ТЬг Азр Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз 61п Зег Зег А5р ТЬг
85 90 95
ТЬг Туг ΗΪ3 С1у С1у 7а1 Уа1 РЬе 61 у 61у 61у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1
100 105 110
- 58 013118
Ьеи СЬу
<2Ь0> <211?· <212> <213> 72 13 РКТ Ното зарЬепз
<400> 72
ТЬг Агд Зег 8ег С1у Зег 11е АЬа Зег Азп Туг УаЬ НЬз 1 510
<210> <211> <212> <213> 73 12 РКТ Ното зарЬепз
<400> 73
СЬп Зег Зег Азр ТЬг ТЬг Туг НЬз СЬу СЬу УаЬ УаЬ 1510 <210>74 <211>366 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 74
даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс ббддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
бссбдбдсад ссбсбддабб сассбббадс адсбабдсса бдадсбдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 180
дсадасбссд бдаадддссд дббсассабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбдб аббасбдбдс даааддсддб 300
аасбасддбд аббасббсда сбасбббдас басбддддса дадддасааб ддбсассдбс 360
бсдадб 366 <210>75 <2И>122 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400>75
бЬи УаЬ 1 СЬп Ьеи Ьеи 5 61 и Зег С1у СЬу СЬу 10 Ьеи УаЬ С1п Рго СЬу 15 СЬу
5ег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АЬа Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Меб Зег Тгр УаЬ Агд С1п АЬа Рго СЬу Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
- 59 013118
Зег АХа 50 Не Зег 51у Зег <31у 61у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61 п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1у С1у Азп Туг 61у Азр Туг РЬе Азр Туг РЬе Азр Туг Тгр
100 105 110
61у Агд 61у ТЬг Меб Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210>76 <211>13 <212> РВ.Т <213> Ното зархепз <400>76
61у 61у Азп Туг 51у Азр Туг РЬе Азр Туг РЬе Азр Туг
1510 <210>
ДНК
Ното <212>
13>
зархепз
ааббббабдс бдасбсадсс ссасбсбдбд бсддадбсбс сддддаадас ддбаассабс 60
бссбдсассс дсадсадбдд садсаббдсс адсааббабд бдсадбддба ссадсадсдс 120
ссдддсадбд сссссассаб бдбдабсбаб даадабаасс ааадасссбс бддддбсссб 180
сабсддббсб сбддсбссаб сдасадсбсс бссаасбсбд ссбсссбсас сабсбсбдда 240
сбдаадасбд аддасдаддс бдасбасбас бдбсадбсбб абдаддддбб сддсддаддд 300
ассаадсбда ссдбссбадд б 321
<210>76 <211>107 <212> РКТ <213> Нотс зархепз <400> 78
Азп РЬе Меб Ьеи ТЬг 61п Рго Нхз Зег Уа1 Зег С1и Зег Рго 61у Ьуз
1015
- 60 013118
ты Уа1 ТНг Не 20 Зег Суз ТНг Агд Зег Зег 25 б1у Зег Не А1а 30 Зег Азп
Туг Уа1 С1п Тгр Туг <31п 61п Агд Рго С1у Зег А1а Рго ТНг Не Уа1
35 40 45
Не Туг 61и Азр Азп 61п Агд Рго Зег 61у Уа1 Рго Ηί3 Агд РНе Зег
50 55 60
С1у Зег Не Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТНг Не Зег С1у
65 70 75 80
Ьеи Ьуз ТНг С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз 61п Зег Туг С31и С1у
85 90 95
РНе 61у 61у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи 31у
100 105
<210> 79
<211> 6
<212> РЕТ
<213> Ното
<4 00> 79
/-> б <П . 1 _ , Γιΐ .. ГЧ и клан ύΐ=ι дух ихи иху л-ис 1 5 <210> 80 <211> 360 <212> ДНК <213> Ното зариепз <400> 80
даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс ббддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
бссбдбдсад ссбсбддабб сассбббадс адсбабдсса бдадсбдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 180
дсадасбссд бдаадддссд дббсасбабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбдб аббасбдбдс дааадабдда 300
бддаасдсдс бдддабддсб бдаабссбдд ддссадддда саабддбсас сдбсбсдадб 360
<210> 81 <211> 120 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 81
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег 61у С1у 01у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
10 15
- 61 013118
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 61 у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
А1а Мер Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не Зег 61 у Зег 61 у 61у Зег ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Аар Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а ЬуЗ Азр С1у Тгр Азп А1а Ьеи 61у Тгр Ьеи 61и Зег Тгр 61у 61п
100 105 но
С1у ТНг Мер νβΐ ТНг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 82 <211> 333 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 82
ааРРРРаРдс РдасРсадсс ссасдсРдрд РсддадРсРс сддддаадас ддРдассаРР 60
рссрдсассд дсадаааРдд саасаРРдсс адсаасРаРд РдсадРддРа ссадсадсдс 120
ссддасадрд сссссасссР РаРааРсРЬР даадаРассс ааадасссРс рддддрссср 180
асРсддсРсР саддсРссаР сдасассРсс РссааРРсРд ссРсссРсаР саРсРсРРса 240
РРдаддасРд аддасдаддс рдаРРасРас РдРсааРсРР сЬдаРРссаа садддрдсрд 300
РРсддсддад ддассааддР сассдРссРа ддр 333
<210> 83 <211> 111 <212> РР.Т <213> Ното заргепз
<400> 83
Азп РЬе Мер Ьеи ТЬг 61п Рго Наз А1а Уа1 Зег 61и Зег Рго С1у Ьуз
1 5 10 15
ТНг 7а1 ТНг Не 5ег Суз ТНг С1у Агд Азп 61у Азп Не А1а Зег Азп
25 30
- 62 013118
Туг Уа1 С1п 35 Тгр Туг С1п 61п Ахд Рго 40 Азр Зег А1а Рго 45 ТЬх Ьеи Не
Не РЬе С1и Азр ТЬГ 61П Ахд Рго Зех С1у Уа1 Рхо ТЬг Агд Ьеи Зег
50 55 60
61у Зех Не Азр ТЬг Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи Не Не Зег Зег
65 70 75 80
Ьеи Ахд ТЬг С1и Азр 61и А1а Аэр Туг Тух Суз С1п Зех Зег Азр Зег
85 90 95
Азп Ахд Уа1 Ьеи РЬе <31у е1у С1у ТЬх Ьуз Уа1 ТЬх Уа1 Ьеи 61у
100 105 110
<210> 84
<211> 13
<212> РРТ
<213> Ното зарьепз
<400> 84
ТЬг С1у Агд Азп С1у Азп не А1а Зег Азп Тух Уа1 С1п
10 <210>85 <211>7 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400>85
51и Азр ТЬг 61п Агд Рго Зех <210> 86 <211>9 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400>86
С1п Зег Зех Азр Зех Азп Агд Уа1 Ьеи
<210> 87
<211> 360
<212> ДНК
<213> Ното зархепз
<400> 87
даддХдсадс ЬдЬЬддадЬс Хдддддаддс хьддиасадс сбддддддЬс ссЬдадасХс 60
ЬссЬдЬдсад ссЬсЬддаЬЬ сассНЬадс адсЬаХдсса ЬдадсЬдддЬ ссдссаддсС 120
ссадддаадд ддсХддадХд ддХсХсадсХ аХХадХддьа дЬддХддСад сасаЬасЬас 180
- 63 013118 дсадасЬссд кдаадддссд дРЬсассаЬс ьссададаса аЬЬссаадаа сасдсЬдЬаЬ240 сЬдсаааЬда асадссЬдад адссдаддас асддссдЬдЬ аЬЬасЬдЬдс дааадаЬЬЬЬ300
ЬдддЬЬаЬЬа сдадЬдддаа ЬдасЬасЬдд дддсддддда ссасддЬсас сдЬсЬсдадЬ360
<210> <21Ь> <212> <213> <400> 88 120 РКТ Ното зарЬепз
88 СЬи Зег СЬу
СЬи 1 УаЬ СЬп Ьеи Ьеи 5
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а АЬа
АЬа МеЬ Зег 35 Тгр νβΐ Агд СЬп АЬа 40
Зег А1а 50 11е Зег СЬу Зег СЬу 55 СЬу
Ьуз 65 СЬу Агд РЬе ТЬг 1Ье 70 Зег Агд
Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег 85 Ьеи Агд АЬа
АЬа Ьуз Азр РЬе 100 Тгр УаЬ 11е ТЬг
СЬу ТЬг ТЬг 115 УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег Ь20
СЬу СЬу Ьеи УаЬ СЬп Рго СЬу СЬу
ЬО 15
Зег 25 СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи 45 СЬи Тгр УаЬ
Зег ТЬг Туг Туг 60 АЬа Азр Зег УаЬ
Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
СЬи Азр 90 ТЫ АЬа УаЬ Туг Туг 95 Суз
Зег Ь05 СЬу Азп Азр Туг Тгр 110 СЬу Агд
<2Ь0> <2И> <212> <2ЬЗ> 89 1Ь РКТ Ното зарЬепз
<400> 89
Аар РЬе Тгр Уа]. 1Ье ТЬг Зег СЬу Азп Азр Туг
10
<2Ь0> <21Ь> <2Ь2> <213> 90 336 ДНК Ното зарЬепз
<400> 90
ааСЬСЬаЬдс Ъдасксадсс ссасЬсбдЬд ЬсддадЬсЬс сддддаадас ддЬдассаЬс 60
ЬссЬдсассс дсадсадЪдд садсаЫдсС адсааииаЬд ЬдсадЪддЬа ссадсадсдс 120
ссдддсадЬи сссссассас идьдаьсиьс даадаЬаасс даадасссЬс ЬддддЬсссЬ 180
дабсддьиьь с£ддс£сса£ сдасассЬсс бссаасЬсЬд ссЬсссЬсас саЬсЬсЬдда 240
сЬдаадасЬд аддасдаддс идасЬасиас ЬдЬсадЬсиЬ ЬЬдаЬадсас сааисиидид 300
дЬдиьсддсд дадддассаа дсьдассдбс сЬаддб 336
<2Ь0> 91
<211> 112
<212> РЕТ
<213> Ното зарАепз
<400> 91
Аап РЬе МеГ Ьеи ТЬг СЬп Рго НЬз
1 5
ТЬг УаЬ ТЬг Ие Зег Суз ТЬг Агд
20
Туг Уа1 СЬп Тгр Туг СЬп СЬп Агд
35 40
Ие РЬе СЬи Азр Азп Агд Агд Рго
50 55
СЬу Зег 1Ье Азр ТЬг Зег Зег Азп
65 70
Ьеи Ьуз ΐ ТЬг СЬи Азр СЬи АЬа Азр
85
ТЬг Азп Ьеи УаЬ УаЬ РЬе СЬу СЬу
100
<210> 92
<211> 10
<212> РЕТ
<213> Ното заргепз
<400> 92
СЬп Зег РЬе Азр Зег ТЬг Азп Ьеи
1 5
<210> 93
<211> 360
<212> ДНК
<213> Ното зар1 епз
УаЬ УаЬ
Зег УаЬ Зег С1и Зег Рго СЬу Ьуз
10 15
Зег 25 Зег СЬу Зег 1Ье АЬа 30 Зег Азп
Рго СЬу Зег Зег Рго 45 ТЬг ТЬг УаЬ
Зег СЬу УаЬ Рго 60 Азр Агд РЬе Зег
Зег АЬа Зег 75 Ьеи ТЬг 1Ье Зег СЬу 80
Туг Туг 90 Суз СЬп Зег РЬе Азр 95 Зег
СЬу 105 ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ 110 Ьеи СЬу
- 65 013118 <400> 93
даддЕдсадс ЕдЕЕддадЕс Едддддаддс ЕЕддЕасадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс 60
ЕссЕдЕдсад ссЕсЕддаЕЕ сассЕЕЕадс адсЕаЕдсса ЕдадсЕдддЕ ссдссаддсЕ 120
ссадддаадд ддсЕддадЕд ддЕсЕсадсЕ аЕЕадЕддЕа дЕддЕддЕад сасаЕасЕас 180
дсадасЕссд Едаадддссд дЕЕсассаЕс Ессададаса аЕЕссаадаа сасдседеае 240
сЕдсаааЕда асадссЕдад адссдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дааадаЕдда 300
Еддаасдсдс ЕдддаЕддсЕ ЕдааЕссЕдд дддаадддда ссасддЕсас сдЕсЕсдадЕ 360
<210>94 <211> 120 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400>94
С1и 1 УаЬ СЬп Ьеи Ьеи 5 СЬи Зег СЬу С1у С1у Ьеи 10 УаЬ СЬп Рго СЬу 15 СЬу
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а МеЕ Зег Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи С1и Тгр УаЬ
35 40 45
Зег АЬа Не Зег СЬу Зег СЬу СЬу Зег ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Ьуз Азр С1у Тгр Азп АЬа Ьеи СЬу Тгр Ьеи СЬи Зег Тгр СЬу Ьуз
100 105 110
01у ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115 120
<210>95 <211>336 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 95
ааЕЕЕЕаЕдс ЕдасЕсадсс ссасЕсЕдЕд ЪсддадЪсЪс сдддд^адас ддЕаассаЕс 60
ЕссЕдсдссд дсадсадЕдд садсаЕЕдсс адсаас1:а1:д ЕдсадЕддЕа ссадсадсдс 120
ссдддсадЕд сссссассдс ЕдЕдаЕ сЕаЕ даддагаасс ааадасссЕс ЕддддЕсссЕ 1Θ0
- 66 013118
даЕсдаЕЕсЕ с^ддсИссаИ сдасадсЕсс ЕссаасЕсЕд ссЕсссЕсас саЕсЕсЕдда 2 4 0
сЕдаадасЕд аддасдаддс ЕдасЕасЕас ЕдЕсааЕсЕЕ асЕсЕЕасаа сааЕсаддЕс 300
дЕдЕЕсддсд дадддассаа ддЕсассдЕс сЕаддЕ 336
<210>96 <211> 112 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>96
Азп РЬе МеЕ 1 Ьеи ТЬг 5 С1п Рго ΗΪ3 Зег УаХ 10 Зег 61и Зег Рго 61 у 15 Ьуз
ТЬг Уа1 ТЬг 11е Зег Суз А1а 61 у Зег Зег 61у Зег 11е А1а Зег Азп
20 25 30
Туг Уа1 61 п Тгр Туг 61п 61п Агд Рго 61у Зег А1а Рго ТЬг А1а Уа1
35 40 45
11е Туг 61и Азр Азп 61п Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег 11е Азр Зег Зег Зег Азп Зег А1а Зег Ьеи ТЬг Не Зег С1у
65 70 75 80
Ьеи Ьуз ТЬг 61и Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз 61П Зег Туг Зег Туг
85 90 95
Азп Азп б!п Уа1 Уа1 РЬе 61у 61у 61 у ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи 61у
100 105 но
<210>97 <211>13 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400>97
А1а С1у Зег Зег 61у Зег 11е А1а Зег Азп Туг Уа1 С1п
1510 <210>98 <211> 10 <212> РКТ <213> Ното зардепз <400>98
61п Зег Туг Зег Туг Азп Азп 61п Уа1 Уа1
1510
- 67 013118 <210> 99 <211> 296 <212> ДНК <213> Ното зарбепз <400> 99
даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс ббддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
бссбдбдсад ссбсбддабб сассбббадс адсбабдсса бдадсбдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 180
дсадасбссд бдаадддссд дббсассабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбаб аббасбдбдс дааада 296
<210> 100 <211> 21 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <220>
<223> Химически синтезированный праймер <400>100 сбсббсбдад абдадббббб д21 <210> 101 <211>30 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химически синтезированный праймер <400>101 ббаббаббсд сааббссббб адббдббссб30 <210> 102 <211>369 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 102
даддбдсадс бдббддадбс бдддддаддс ббддбасадс сбддддддбс ссбдадасбс 60
бссбдбдсад ссбсбддабб сассбббадс адсбабдсса бдадсбдддб ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсбддадбд ддбсбсадсб аббадбддба дбддбддбад сасабасбас 180
дсадасбссд бдаадддссд дббсассабс бссададаса аббссаадаа сасдсбдбаб 240
сбдсааабда асадссбдад адссдаддас асддссдбаб аббасбдбдс дааадабддб 300
адсадбддсб ддбасдбасс асасбддббс дассссбддд дссддддсас ссбддбсасс 360
дбсбсдадб 369 <210>103
- 68 013118 <211>123 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>103
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи <31и Зег С1у 01у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
5 10
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а Меб Зег Тгр Уа1 Агд ст А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а 11е Зег С1у Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 01 у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а 01и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр С1у Зег Зег 01 у Тгр Туг Уа1 Рго Н1з Тгр РЬе Азр Рго
1 Л ιυυ 105 110
Тгр О1у Агд 01у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210>104 <211>336 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 104
ааббббабдс ЕдасЕсадсс ссасбсбдбд Ссддадбсбс сддддаадас ддбаассабс 60
бссбдсасбс дсадсадЕдд садсаббдбс адсаасбабд бдсадбддба ссаасадсдс 120
ссдддсадбд сссссассае бдбсабсбаб даддабаасс ддадасссбс бддддбсссб 180
дабсддббсб сЕддсЕссаЕ сдасадсбсс бссаабасбд ссбсссбсас сабсбсбддд 240
сбддаддсбд аддаедаддс бдасбасбас бдбсадбсбб абдабддсад саабсдббдд 300
абдббсддсд дадддассаа дсбдассдбс сбаддб 336
<210> <211> <212> <213> 105 112 РКТ Ното зархепз
<400> 105
- 69 013118
Азп РЬе МеЕ 1 Деи ТЬг 5 С1п Рго Ηίβ Зег νβΐ 10 Зег 61и Зег Рго С1у 15 Дуз
ТЬг Уа1 ТЬг Не Зег Суз ТЬг Агд Зег Зег <31у Зег 11е Уа1 Зег Азп
20 25 30
Туг Уа1 61п Тгр Туг С1п С1п Агд Рго С1у Зег А1а Рго ТЬг ТЬг Уа1
35 40 45
11е Туг С1и Азр Азп Агд Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег Не Азр Зег Зег Зег Азп ТЬг А1а Зег Деи ТЬг 11е Зег С1у
65 70 75 80
Деи С1и А1а С1и Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр 61у
85 90 95
Зег Азп Агд Тгр МеЕ РЬе 61у 61у 61у ТЬг Дуз Деи ТЬг Уа1 Деи С1у
100 105 НО
<210> 106 <211>13 <212> РКТ <213> Ното зарЕепз <400>106
ТЬг Агд Зег Зег С1у Зег 11е 7а1 Зег Азп Туг Уа1 61п 1510 <210>107 <211>7 <212> РКТ <213> Ното зараепз <400>107
С1и Азр Азп Агд Агд Рго Зег <210> 108 <211>296 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 108
ааЕЕЕЕаЕдс ЕдасЕсадсс ссасЕсЕдЕд ЕсддадЕсЕс сддддаадас ддЕаассаЕс 60
ЕссЕдсассс дсадсадЕдд садсаЕЕдсс адсаасЕаЕд ЕдсадЕддЕа ссадсадсдс 120
ссдддсадЕЕ сссссассас СдЕдаЕсЕаЕ даддаЕаасс ааадасссЕс ЕддддЕсссЕ 180
даЕсддЕЕсЕ сЕддсЕссаЕ сдасадсЕсс ЕссаасЕсЕд ссЕсссЕсас саЕсЕсЕдда 240
- 70 013118
сРдаадасЬд аддасдаддс ЬдасЬасЪас ЬдЬсадЬсЫ: аЬдаЬадсад сааРса 296
<210> 109
<211> 52
<212> ДНК
<213> Ното зархепз
<400> 109
ассасасСдд Ё^сдассссЬ ддддссдддд сасссЬддЬс ассдЬсЬсда дЪ 52
<210> но
<211> 17
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 110
Рго НЬз Тгр РЬе Азр Рго Тгр С1у Агд С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег
1 5 10 15
Зег
<210> 111
<211> 52
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 111
сЬасЬддЬас ЫсдаЬсЬсЬ ддддссдЬдд сасссЬддЬс асЬдЬсЬссЬ са 52
<210> 112
<211> 17
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 112
Туг Тгр > Туг РЬе Азр Ьеи Тгр С1у Агд С1у ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг Уа1 Зег
1 5 10 15
Зег
<210> 113
<211> 50
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 113
сасасРддЬЬ сдасссс^дд ддссддддса сссЪддЪсас сдЪсЪсдадЪ
<210> <211> <212> <213> 114 16 РКТ Ното зарЬепз
- 71 013118 <400> 114
Н13 Тгр РНе Азр Рго Тгр С1у Агд С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг 7а1 Зег Зег
1 5 10 15
<210> 115
<211> 50
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 115
асаасЬддЬЬ сдассссЬдд ддссадддаа сссЬддСсас сдЬсЬссЬса 50 <210> 116 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното зарьепз <400> 116
Азп Тгр РНе 1 Азр Рго Тгр 5 С1у СЬп Б1у ТНг Ьеи Уа1 10 ТНг УаЬ Зег Зег 15
<210> 117
<211> за
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400> 117
Азр Агд РЬе Зег С1у Зег Не Азр Зег Зег Зег Азп Зег АЬа Зег Ьеи
1 5 10 15
ТЬг Не Зег С1у Ьеи Ьуз ТНг С1и Азр 51и АЬа Азр Туг Туг Суз СЬп
20 25 30
Зег Туг Азр Зег Зег Азп
35
<210> 113
<211> 52
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 118
Азр Агд РНе Зег СЬу Зег Не Азр Зег Зег Зег Азп ТНг АЬа Зег Ьеи
1 5 10 15
ТЬг Не Зег СЬу Ьеи С1и А1а Б1и Азр СЬи А1а Азр Туг Туг Суз СЬп
20 25 30
Зег Туг Азр С1у Зег Азп Агд Тгр МеЬ РЬе С1у СЬу С1у ТНг Ьуз Ьеи
35 40 45
ТЬг Уа1 Ьеи С1у

Claims (23)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное полностью человеческое моноклональное антитело против ШЫу или его фрагмент, где указанное антитело содержит:
    (a) УН-СЭЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность 8УАМ8 (8ЕО ΙΌ N0: 3) или ^АМ8 (8ЕО ΙΌ N0: 43);
    (b) УН-СЭЯ2-область, содержащую аминокислотную последовательность А!8С8СС8ТУУАЭ8УКС (8ЕО Ш N0: 4) или ТЕТС8ССТАУУАЭ8УЕС (8ЕО ΙΌ N0: 44), и (c) УН-СЭЯ3-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЭС88САУУРНАРПР (8 ЕС) ΙΌ N0: 5); ВН88ОАУУ18ОМОУ (8 ЕС) ΙΌ N0: 13);
    - 72 013118
    ОЬТУООР^УУРОУ (8 ЕС) ΙΌ N0: 21); 1)01\\'\АЕ01\\'ЕЕ8 (8ЕО ΙΌ N0: 29); 0ιΊΈΕν0,0ι0ιΕΙ)\ (8ЕО ΙΌ N0: 45); Ρ8ΕΙ)8ΟΟ8ΕΡ¥ (8ЕС) ΙΌ N0: 64); \Ο8\¥ΕΒΟΕΟΙ (8ЕС) ΙΌ N0: 69); 0ι0ι\ν0ιΙ)νΕΙ)νΕΙ)ν (8ЕС) ΙΌ N0: 76) и ^Ε\VV[Т8СN^У (8Еф ΙΌ N0: 89), где указанное антитело связывается с ШЛу.
  2. 2. Антитело по п.1, где указанное антитело дополнительно содержит:
    (ё) \ь-СОЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ТЯ8808IΑ8N¥У^ (8ЕС) ГО N0: 8); ТΚ8808IΑ8N¥У^ (8ЕС) ГО N0: 16); ТК8008Ю8УУУО (8 ЕС) ΙΌ N0: 32); Т^ОТ^КУУр (8 ЕС) ГО N0: 39); Т08008IΑТN¥У^ (8 ЕС) ГО N0: 48); Т08808IΑ8N¥У^ (8ЕС) ГО N0: 55); ТЯ8808IΑ8N¥VΗ (8ЕС) ГО N0: 72); Т0ЯN0NIΑ8N¥У^ (8ЕС) ГО N0: 84); Α08808IΑ8N¥У^ (8ЕС) ГО N0: 97) и ТЯ8808IУ8N¥У^ (8ЕС) ГО N0: 106);
    (е) \ь-СОК2-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЕОКрКРЗ (8ЕО ГО N0: 9); ЕОХОЯР8 (8 ЕС) ГО N0: 17); 1)1)1)СЖР8 (8ЕС) ГО N0: 25); ООККЯР8 (8ЕС) ГО N0: 33); Е1)Т('ЖР8 (8ЕС) ГО N0: 85) и ЕОМКЯР8 (8ЕС) ГО N0: 107); и (ί) \ь-СОЯ3-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из С)8У1)С18\Я\\А1 (8ЕС) ГО N0: 10); С)8\1)81)ХАА’ (8ЕС) ГО N0: 18); С)8У1)88ХАА (8ЕС) ГО N0: 26); ^8¥^8NN^VУ (8ЕС) ГО N0: 34); ^8¥^N8\Η\У (8ЕС) ГО N0: 40); ^8¥^8^\ΗΗУУ (8ЕС) ГО N0: 49); ^8¥^88N^ЕVУ (8ЕС) ГО N0: 56); ^8¥^8NNΕ\У (8ЕС) ГО N0: 61); Р88ОТТ¥НООУУ (8ЕС) ГО N0: 73); СЖУЕСШ (8ЕС) ГО N0: 79); ^88^8\ΚV^ (8ЕС) ГО N0: 86); ^8Ε^8Т\^VУ (8ЕС) ГО N0: 92) и ^8V8V\\^VV (8ЕС) ГО N0: 98).
  3. 3. Антитело по п.1, имеющее ^С-изотип.
  4. 4. Антитело по п.2, где указанное антитело содержит \Н-СОЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность 8УАМ8 (8Еф ГО N0: 3); \Н-СОЯ2-область, содержащую аминокислотную последовательность ΑI808008ТУ¥Α^8VК0 (8Еф ГО N0: 4), \Н-СОЯ3-область, содержащую аминокислотную последовательность ΌΟ88Ο\¥ УРН\ГОР (8Еф ГО N0: 5); \ь-СОЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8808^8^ νθ (8Еф ГО N0: 8); \ь-СОЯ2-область, содержащую аминокислотную последовательность Е^N^ЯΡ8 (8Еф ГО N0: 9); и \ъ-СОЯ3-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8У^08\Ε\VΜ (8Еф ГО N0: 10).
  5. 5. Антитело по п.1, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 7.
  6. 6. Выделенное полностью человеческое моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 или 103, и где указанное антитело связывается с ПКу.
  7. 7. Антитело по п.6, где указанное антитело дополнительно содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 или 105, и где указанное антитело связывается с ГОЛу.
  8. 8. Антитело по п.7, где указанное антитело содержит \Н-СОЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность 8УАМ8 (8Еф ГО N0: 3); \Н-СОЯ2-область, содержащую аминокислотную последовательность АКСЗССЗТУУАО^УКС (8Еф ГО N0: 4), \Н-СОЯ3-область, содержащую аминокислотную последовательность ΌΟ88Ο\¥ УРН\ГОР (8Еф ГО N0: 5); \ь-СОЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8808^8^ νθ (8Еф ГО N0: 8); \ъ-СОЯ2-область, содержащую аминокислотную последовательность Е^N^ЯΡ8 (8Еф ГО N0: 9); и Уь-СОЯ3-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8У^08\Ε\VΜ (8Еф ГО N0: 10).
  9. 9. Антитело по п.4, имеющее ^С-изотип.
  10. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.1 и носитель.
  11. 11. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.4 и носитель.
  12. 12. Способ ослабления симптома аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства, предусматривающий введение антитела по п.1 индивидууму, нуждающемуся в этом, в количестве, достаточном для ослабления у указанного индивидуума симптома аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства.
  13. 13. Способ по п.12, где указанным индивидуумом является человек.
  14. 14. Способ по п.12, где указанное антитело содержит УН-СОЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность 8УАМ8 (8Еф ГО N0: 3); УН-СОЯ2-область, содержащую аминокислотную последовательность ΑI808008ТУ¥Α^8VК0 (8Еф ГО N0: 4), УΗ-С^Я3-область, содержащую аминокислотную последовательность ОС88С\¥УРН\ГОР (8Еф ГО N0: 5); У^-С^Я1-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8808^8^ νθ (8Еф ГО N0: 8); У^-С^Я2-область, содержащую аминокислотную последовательность Е^N^ЯΡ8 (8Еф ГО N0: 9); и У^-С^Я3-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8У^08\Ε\VΜ (8Еф ГО N0: 10).
  15. 15. Способ по п.14, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 7.
    - 73 013118
  16. 16. Способ по п.12, где указанное аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Крона, системной красной волчанки, псориаза, ревматоидного артрита, васкулита, атопического дерматита и вторичного прогрессирующего рассеянного склероза.
  17. 17. Способ по п.12, где указанное антитело вводят внутривенно.
  18. 18. Способ по п.12, где указанное антитело вводят вместе со вторым средством, выбранным из группы, состоящей из:
    (a) антицитокинового средства, которое распознает один или несколько цитокинов, выбранных из интерлейкина 1 (ΙΌ-1), ΙΌ-2, ΙΌ-4, ΙΌ-6, ΙΌ-12, ΙΌ-13, ΙΌ-15, ΙΌ-17, ΙΌ-18, ΙΌ-20, ΙΌ-21, ΙΌ-22, ΙΌ-23, ΙΌ-27 и Ш-31;
    (b) антихемокинового средства, которое распознает один или несколько цитокинов, выбранных из ΙΌ-1, ΙΌ-2, ΙΌ-4, ΙΌ-6, Ш-12, ΙΌ-13, ΙΌ-15, ΙΌ-17, ΙΌ-18, ΙΌ-20, ΙΌ-21, ΙΌ-22, ΙΌ-23, ΙΌ-27 и ΙΌ-31;
    (c) хемокинов, выбранных из ΜΙΡ1-α, ΜΙΡ1-β, ΚΑΝΤΕ8, МСР1, ΙΡ-10, 1ТАС, ΜΙΟ, 8ΌΡ и фракталкина.
  19. 19. Способ снижения экспрессии молекул МНС класса ΙΙ на клетке, предусматривающий контактирование клетки с антителом по п.1 в количестве, достаточном для снижения уровня экспрессии МНС класса ΙΙ на указанной клетке.
  20. 20. Способ по п.19, где указанной клеткой является клетка человеческой меланомы.
  21. 21. Способ по п.19, где указанное антитело содержит УН-СЭЯ1-область, содержащую аминокислотную последовательность 8ΥΑΜ8 (8ЕЦ ΙΌ N0: 3); УН-СОК2-область, содержащую аминокислотную последовательность ΑΙδΟδΟΟδΤΥΥΑΟδνΚΟ (8ЕЦ ΙΌ N0: 4), УН-СОК3-область, содержащую аминокислотную последовательность ОС88СГСУУРНГСРОР (8ЕЦ Ш N0: 5); Уь-СОК1-область, содержащую аминокислотную последовательность ΤΡ88Ο8ΙΑ8ΝΥУЦ (8ЕЦ ΙΌ N0: 8); Уъ-С0К2-область, содержащую аминокислотную последовательность Ε^N^ΚΡ8 (8ЕЦ Ш N0: 9); и Уь-СОК3-область, содержащую аминокислотную последовательность ^8У^С8NЯ\VΜ (8ЕЦ Ш N0: 10).
  22. 22. Способ по п.21, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 7.
  23. 23. Способ по п.19, где указанная клетка контактирует со вторым средством, выбранным из группы, состоящей из:
    (a) антицитокинового средства, которое распознает один или несколько цитокинов, выбранных из интерлейкина 1 (ΙΌ-1), ΙΌ-2, ΙΌ-4, ΙΌ-6, ΙΌ-12, ΙΌ-13, ΙΌ-15, ΙΌ-17, ΙΌ-18, ΙΌ-20, ΙΌ-21, ΙΌ-22, ΙΌ-23, ΙΌ-27 и Ш-31;
    (b) антихемокинового средства, которое распознает один или несколько цитокинов, выбранных из Ш-1, Ш-2, Ш-4, ΙΌ-6, ΙΌ-12, ΙΌ-13, ΙΌ-15, ΙΌ-17, ΙΌ-18, ΙΌ-20, ΙΌ-21, ΙΌ-22, ΙΌ-23, ΙΌ-27 и ΙΌ-31;
    (c) хемокинов, выбранных из ΜΙΡ1-α, ΜΙΡ1-β, ΚΑΚΤΕδ, МСР1, ΙΡ-10, ΙΤΑΟ ΜΙΟ, 8ΌΡ и фракталкина.
EA200701589A 2005-01-27 2006-01-27 Антитела против интерферона-гамма и способы их применения EA013118B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64821905P 2005-01-27 2005-01-27
PCT/IB2006/001514 WO2006109191A2 (en) 2005-01-27 2006-01-27 Human anti-interferon gamma antibodies and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200701589A1 EA200701589A1 (ru) 2008-02-28
EA013118B1 true EA013118B1 (ru) 2010-02-26

Family

ID=37087400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701589A EA013118B1 (ru) 2005-01-27 2006-01-27 Антитела против интерферона-гамма и способы их применения

Country Status (21)

Country Link
US (4) US7700098B2 (ru)
EP (1) EP1848744B1 (ru)
JP (1) JP5173437B2 (ru)
KR (1) KR101380570B1 (ru)
CN (1) CN101151277B (ru)
AT (1) ATE541859T1 (ru)
AU (1) AU2006233353B2 (ru)
BR (1) BRPI0607238B8 (ru)
CA (1) CA2595276C (ru)
DK (1) DK1848744T3 (ru)
EA (1) EA013118B1 (ru)
ES (1) ES2381203T3 (ru)
HK (1) HK1110601A1 (ru)
IL (1) IL184749A0 (ru)
MX (1) MX2007008719A (ru)
NO (1) NO340445B1 (ru)
PL (1) PL1848744T3 (ru)
PT (1) PT1848744E (ru)
UA (1) UA92337C2 (ru)
WO (1) WO2006109191A2 (ru)
ZA (1) ZA200706169B (ru)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275227B (zh) * 2007-11-12 2015-02-11 U3制药有限公司 Axl抗体
ATE497978T1 (de) * 2008-06-27 2011-02-15 Theranor Sprl Pharmazeutische zusammensetzungen von antikörpern von viruserkrankungen
WO2010041145A2 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Novimmune Sa Il-17-mediated transfection methods
WO2011109452A1 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Bayer Healthcare Llc Optimized Monoclonal Antibodies against Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
CN104159919A (zh) * 2011-11-23 2014-11-19 安姆根有限公司 使用抗干扰素γ抗体的治疗方法
CN104662044B (zh) 2012-08-24 2018-10-30 加利福尼亚大学董事会 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
EA037532B1 (ru) 2015-05-07 2021-04-08 Новиммун Са Способы и композиции для диагностики и лечения заболеваний у пациентов, имеющих повышенные уровни cxcl9 и других биомаркеров
US11091543B2 (en) 2015-05-07 2021-08-17 Swedish Orphan Biovitrum Ag Methods, compositions and dosing regimens for treating or preventing interferon-gamma related indications
US11840564B2 (en) 2015-06-09 2023-12-12 Children's Hospital Medical Center Dosing algorithm for complement inhibitor
CN105695405A (zh) * 2016-03-29 2016-06-22 深圳爱生再生医学科技有限公司 Cik细胞扩增方法
MX2018016330A (es) 2016-06-27 2020-02-17 Univ California Combinaciones para tratamiento del cáncer.
BR112019008156A2 (pt) * 2016-10-24 2019-07-02 Novimmune Sa métodos, composições e regimes de dosagem no tratamento ou prevenção de indicações relacionadas com interferon-gama
TWI797124B (zh) * 2017-05-05 2023-04-01 香港商安立璽榮生醫(香港)有限公司 抗干擾素-γ之抗體及其應用
EP3672488A4 (en) * 2017-08-23 2021-07-14 Wayne State University IN VIVO IMMUNOIMAGING OF INTERFERON GAMMA
CA3095585C (en) * 2018-03-29 2022-05-03 Elixiron Immunotherapeutics (hong Kong) Limited Methods for treatment of hbv infection
JP2022502079A (ja) * 2018-09-19 2022-01-11 トーシェント，インコーポレーテッド がん関連抗体組成物および使用方法
WO2021185832A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Swedish Orphan Biovitrum Ag New therapeutic treatment
WO2022132710A1 (en) * 2020-12-15 2022-06-23 Vanderbilt University Human hendra virus and nipah virus antibodies and methods of use therefor
PE20240689A1 (es) * 2021-01-08 2024-04-10 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos y peptidos de union a antigenos para inhibidores del factor xia y uso de los mismos
CN112794903B (zh) * 2021-04-14 2021-06-25 广州市雷德生物科技有限公司 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用
JP7359457B2 (ja) * 2021-10-11 2023-10-11 タグシクス・バイオ株式会社 自己免疫性疾患治療薬
WO2023235830A1 (en) * 2022-06-02 2023-12-07 Elixiron Immunotherapeutics (Hong Kong) Method of treating vitiligo with interferon-gamma antibody
JP2024021165A (ja) * 2022-08-03 2024-02-16 タグシクス・バイオ株式会社 ＩＦＮ－γへ選択的に結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するドライアイ治療薬
JP2024021164A (ja) * 2022-08-03 2024-02-16 タグシクス・バイオ株式会社 ＩＦＮ－γへ選択的に結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するハンナ型間質性膀胱炎治療薬

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003097082A2 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Protein Design Labs Treatment of crohn's disease or psoriasis using anti-inteferon gamma antibodies
WO2004035747A2 (en) * 2002-10-16 2004-04-29 Amgen Inc. Human anti-ifn-ϝ neutralizing antibodies as selective ifn-ϝ pathway inhibitors
WO2004046306A2 (en) * 2001-10-05 2004-06-03 Amgen Inc. Fully human antibody fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5096705A (en) 1981-10-19 1992-03-17 Genentech, Inc. Human immune interferon
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1994014467A1 (en) 1992-12-29 1994-07-07 Genentech, Inc. Treatment of inflammatory bowel disease with ifn-gamma inhibitors
US20030059428A1 (en) * 1993-02-26 2003-03-27 Boris Skurkovich Treatment of autoimmune diseases
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
EP1135415B1 (en) 1998-12-01 2010-08-11 Facet Biotech Corporation Humanized antibodies to gamma-interferon
US6861056B2 (en) 2001-06-05 2005-03-01 Advanced Biotherapy, Inc. Compositions and methods for treating hyperimmune response in the eye
US6534059B2 (en) 2001-06-05 2003-03-18 Advanced Biotherapy, Inc. Compositions and methods for treating hyperimmune response in the eye
JP4150719B2 (ja) 2002-06-27 2008-09-17 インターデイジタル テクノロジー コーポレーション 無線ネットワークコントローラによるユーザ機器測定情報のピアツーピア交換
GB0314461D0 (en) * 2003-06-20 2003-07-23 Isis Innovation Suppression of transplant rejection
US7504106B2 (en) 2006-03-14 2009-03-17 Boris Skurkovich Method and composition for treatment of renal failure with antibodies and their equivalents as partial or complete replacement for dialysis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046306A2 (en) * 2001-10-05 2004-06-03 Amgen Inc. Fully human antibody fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
WO2003097082A2 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Protein Design Labs Treatment of crohn's disease or psoriasis using anti-inteferon gamma antibodies
WO2004035747A2 (en) * 2002-10-16 2004-04-29 Amgen Inc. Human anti-ifn-ϝ neutralizing antibodies as selective ifn-ϝ pathway inhibitors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIGIDIN Y.A. ET AL.: "RANDOMIZED, DOUBLE-BLIND TRIAL OF ANTI-INTERFERON-GAMMA ANTIBODIES IN RHEUMATOID ARTHRITIS" SCANDINAVIAN JOURNAL OF RHEUMATOLOGY, ALMQVIST & WIKSELL PERIODICAL CO., STOCKHOLM, SE, vol. 30, no. 4, 2001, pages 203-207, XP008071740 the whole document *
SKURKOVICH B. ET AL.: "ANTI-INTERFERON-GAMMA ANTIBODIES IN THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES" CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS, CURRENT DRUGS, LONDON, GB, vol. 5, no. 1, 2003, pages 52-57, XP008043742 ISSN: 1464-8431 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101151277A (zh) 2008-03-26
US20060263363A1 (en) 2006-11-23
WO2006109191A2 (en) 2006-10-19
JP2008528569A (ja) 2008-07-31
DK1848744T3 (da) 2012-03-19
US20170291943A1 (en) 2017-10-12
BRPI0607238B1 (pt) 2019-10-15
EP1848744A2 (en) 2007-10-31
CA2595276A1 (en) 2006-10-19
EA200701589A1 (ru) 2008-02-28
US20100158922A1 (en) 2010-06-24
PT1848744E (pt) 2012-04-24
US9682142B2 (en) 2017-06-20
EP1848744B1 (en) 2012-01-18
KR20070102566A (ko) 2007-10-18
UA92337C2 (ru) 2010-10-25
PL1848744T3 (pl) 2012-06-29
JP5173437B2 (ja) 2013-04-03
NO20073882L (no) 2007-10-24
MX2007008719A (es) 2007-09-11
HK1110601A1 (en) 2008-07-18
ES2381203T3 (es) 2012-05-24
AU2006233353A1 (en) 2006-10-19
BRPI0607238B8 (pt) 2021-05-25
AU2006233353B2 (en) 2011-12-15
NO340445B1 (no) 2017-04-24
IL184749A0 (en) 2007-12-03
WO2006109191A3 (en) 2007-04-26
BRPI0607238A2 (pt) 2009-08-25
CN101151277B (zh) 2013-11-13
KR101380570B1 (ko) 2014-04-01
US20140186362A1 (en) 2014-07-03
CA2595276C (en) 2014-03-11
US7700098B2 (en) 2010-04-20
ATE541859T1 (de) 2012-02-15
ZA200706169B (en) 2008-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013118B1 (ru) Антитела против интерферона-гамма и способы их применения
TWI803523B (zh) Ｔｉｇｉｔ抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
EA010350B1 (ru) Антитела против cd3 и способы их применения
CN102939305B (zh) 对cd122的抗体
JP2021502810A (ja) Ｃｄ１３７およびｐｓｍａに結合する分子
JP5385159B2 (ja) ヒト抗ｉｐ−１０抗体およびその使用
JP5624884B2 (ja) 抗ｒａｎｔｅｓ抗体およびその使用の方法
EA029793B1 (ru) Антитела к ох40 и способы их применения
EA015589B1 (ru) Антитела против миостатина и их применение
EA022759B1 (ru) Связывающие элементы для пептида c5a с высоким ингибирующим действием
EA006945B1 (ru) ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ЛИМФОТОКСИНА-β (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ, ТЯЖЕСТИ ИЛИ ПОСЛЕДСТВИЙ НЕОПЛАЗИИ У ЧЕЛОВЕКА, ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ), КЛЕТКА КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ (ВАРИАНТЫ)
CN110183534A (zh) 抗cd47抗体及其使用方法
EA030777B1 (ru) Анти-альфа-синуклеинсвязывающие молекулы
US11359021B2 (en) PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA015903B1 (ru) Моноклональное антитело против миостатина и его применение
CN103408661A (zh) 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
EA017303B1 (ru) Модифицированные гуманизированные антитела против интерлейкина-18 и их применение
CN103339146A (zh) 人抗tau抗体
EA007471B1 (ru) Растворимый рецептор br43x2 и способы его применения
EA029954B1 (ru) Анти-muc1 антитела
CN102753578A (zh) 增加肌肉生长的组合物和方法
JP2010520203A5 (ru)
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
KR102412805B1 (ko) 세포 면역 요법을 위한 조성물 및 방법